CN111432635A - 具有经工程改造的免疫球蛋白λ轻链的非人动物以及所述非人动物的用途 - Google Patents

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Abstract

提供了非人动物(和/或非人细胞)以及使用所述非人动物(和/或非人细胞)的方法，所述非人动物(和/或非人细胞)具有包含编码人抗体的序列(即免疫球蛋白基因)的基因组。本文所述的非人动物表达含有免疫球蛋白(Ig)轻链的抗体，所述免疫球蛋白轻链的特征为存在人Vλ结构域。在一些实施方案中，本文提供的非人动物的特征为表达含有人Vλ轻链的抗体，所述人Vλ轻链由插入所述非人动物的内源性Igκ轻链基因座的编码人Igλ轻链的序列编码。还提供了由非人动物产生抗体的方法，所述抗体含有人可变区和小鼠恒定区。

Description

具有经工程改造的免疫球蛋白λ轻链的非人动物以及所述非 人动物的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月5日提交的美国临时申请号62/594,944；2017年12月5日提交的美国临时申请号62/594,946；2017年12月21日提交的美国临时申请号62/609,241；以及2017年12月21日提交的美国临时申请号62/609,251的优先权；所述临时申请各自以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。创建于2018年12月3日的ASCII副本被命名为2010794-1440_SL.txt并且大小为30,059字节。
背景技术
人抗体为进展最快的一类治疗剂。在目前用于抗体产生的技术中，用编码人抗体(全部或部分)的遗传物质工程改造的经遗传工程改造的动物(例如啮齿动物)的开发已彻底改变了用于治疗各种疾病的人治疗性单克隆抗的体领域。目前仍然需要开发用于产生人单克隆抗体的改进的体内系统，所述人单克隆抗体使经遗传工程改造的宿主动物中的人抗体库最大化。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供一种啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)一个或多个Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述一个或多个Cλ基因，并且其中所述啮齿动物在所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，所述一个或多个Cλ为Cλ基因。在一些实施方案中，Cλ基因为或包括啮齿动物Cλ基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因具有与小鼠Cλ1、小鼠Cλ2或小鼠Cλ3基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括小鼠Cλ1基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括大鼠Cλ基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因具有与大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3或大鼠Cλ4基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段代替一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段置换一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段置换所有功能性啮齿动物Vκ基因区段和/或所有功能性啮齿动物Jκ基因区段。
在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3以及Vλ3-1。
在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6以及Jλ7。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包括一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现。例如，参照图20，第一示例性内源性人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的Vλ3-12基因区段出现(并且在所述Vλ3-12基因区段的3′端出现)。包含所述第一示例性内源性人Vλ非编码序列的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座可在邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ3-12基因区段(并且优选所述Vλ3-12基因区段的3′端)的位置处包含所述非编码序列。包含所述第一示例性内源性人Vλ非编码序列的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还可在邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ2-11基因区段(并且优选所述Vλ2-11基因区段的5′端)的位置处包含所述非编码序列。在一些实施方案中，包含所述第一示例性内源性人Vλ非编码序列的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还可在邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ3-12基因区段(并且优选所述Vλ3-12基因区段的3′端)且邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ2-11基因区段(优选所述Vλ2-11基因区段的5′端)的位置处包含所述非编码序列。在一些实施方案中，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者为或包含内含子。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jκ非编码序列，所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Jκ基因区段出现。例如，参照图21，第一示例性内源性人Jκ非编码序列天然地出现在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中。包含所述第一示例性内源性人Jκ非编码序列的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座在邻近于经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ基因区段(例如，Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7)的位置处可为非编码序列。在一些实施方案中，所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者为或包含内含子。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为包含一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含κ轻链非编码序列，所述κ轻链非编码序列位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间。在一些实施方案中，κ轻链非编码序列为人κ轻链非编码序列。在一些实施方案中，人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列。
在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物对于经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。κ在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物对于经工程改造的内源性免疫球蛋白轻链基因座为杂合的。在一些实施方案中，啮齿动物的种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
在一些实施方案中，所述啮齿动物的基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。在一些实施方案中，所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。在一些实施方案中，TdT为人TdT。在一些实施方案中，TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物在其种系基因组中包含编码可操作地连接至转录控制元件地外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；并且表现出相对于在其种系基因组中不包含可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的可比较的小鼠(例如，同窝小鼠)在连接多样性方面增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的轻链(例如，表达包含其的轻链可变结构域)。在一些实施方案中，连接多样性通过独特CDR3/10,000读数的数值来测量。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含编码所述啮齿动物的种系基因组中可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列，并且至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％的由所述啮齿动物产生的轻链(例如，λ和/或κ轻链)表现出非模板添加。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物的种系基因组包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2以及VH6-1。
在一些实施方案中，一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26以及DH7-27。
在一些实施方案中，一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5以及JH6。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者为或包含内含子。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物对于经工程改造的内源化免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
在一些实施方案中，啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区为内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，内源性Vλ基因区段、内源性Jλ基因片区段和内源性Cλ基因全部或部分缺失。在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链可变结构域。在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白κ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。在一些实施方案中，啮齿动物种系基因组包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，(例如，在雄性生殖系统的细胞中，例如睾丸细胞)表达一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。在一些实施方案中，第一人VH基因区段为VH1-2，并且第二人VH基因区段为VH6-1。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含表达抗体的B细胞群体，所述抗体包含各自包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域的免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列编码，所述重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列包含(i)一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，和(ii)一个或多个人Jλ基因区段的一者或其体细胞超突变的变体。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含表达抗体的B细胞群体，所述抗体包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链各自包含人免疫球蛋白重链可变结构域。在一些实施方案中，人免疫球蛋白重链可变结构域由重排的人免疫球蛋白重链可变区序列编码，所述排的人免疫球蛋白重链可变区序包含(i)一个或多个人VΗ基因区段的一者或其体细胞超突变的变体，(ii)一个或多个人DΗ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及(ii)一个或多个人JΗ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物响应于用包含一个或多个表位的抗原进行免疫而产生B细胞群体。在一些实施方案中，啮齿动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合(例如，特异性地结合)至目标抗原的一个或多个表位的抗体。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域的重链，和/或具有由如本文所述人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域的λ轻链。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；和/或κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述的人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，啮齿动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合至目标抗原的一个或多个表位的抗体，其中由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含：(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域；(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域编码；或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，如本文所述的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列为体细胞超突变的。在一些实施方案中，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％的响应于抗原而产生的B细胞群体的B细胞包含人重链可变区序列、λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的κ轻链可变区序列。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物为小鼠或大鼠。
在一些实施方案中，本文描述了从啮齿动物提供的细胞和/或组织(例如，分离的细胞和/或组织)。在一些实施方案中，所提供的细胞和组织包括例如淋巴组织、脾细胞、B细胞、干细胞和/或生殖细胞。在一些实施方案中，分离所提供的细胞。在一些实施方案中，分离的细胞为或包括祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟初始B细胞、活化的B细胞、记忆B细胞、B谱系淋巴细胞和/或浆细胞。在一些实施方案中，分离的细胞包括干细胞(例如胚胎干细胞)和/或生殖细胞(例如，精子、卵母细胞)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的啮齿动物细胞，所述啮齿动物的种系基因组包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因。
在一些实施方案中，本文所述的分离的啮齿动物细胞在经工程改造的内源性免疫球蛋白κ基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，本文描述的分离的啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
在一些实施方案中，本公开提供一种由本文描述的啮齿动物ES细胞产生的啮齿动物胚胎。
在一些实施方案中，本公开提供一种由本文所述的分离的啮齿动物细胞产生的永生化细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种制备种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将一个或多个DNA片段引入啮齿动物ES细胞的所述种系基因组中，其中所述一个或多个DNA片段包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)一个或多个Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述一个或多个Cλ基因在所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处引入所述啮齿动物ES细胞的种系基因组中，并且其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述一个或多个Cλ基因可操作地连接；以及
(b)使用(a)中产生的所述啮齿动物ES细胞产生啮齿动物。
在一些实施方案中，制备种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物的方法包括将κ轻链非编码序列引入所述啮齿动物ES细胞的种系基因组中的步骤，以使得所述κ轻链非编码序列位于所述啮齿动物ES细胞的种系基因组中的一个或多个人Vλ基因区段与一个或多个人Jλ基因区段之间。
在一些实施方案中，本公开提供了一种制备种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述种系基因组中的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)一个或多个Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述一个或多个Cλ基因，并且
其中插入所述一个或多个Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ基因座处的啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，Cλ基因置换所述内源性免疫球蛋白κ基因座处的啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3以及Vλ3-1。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3以及Vλ3-1。
在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6以及Jλ7。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jκ非编码序列，所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Jκ基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者为或包含内含子。
在一些实施方案中，Cλ基因为或包括啮齿动物Cλ基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因具有与小鼠Cλ1、小鼠Cλ2或小鼠Cλ3基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括小鼠Cλ1基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括大鼠Cλ基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因具有与大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3或大鼠Cλ4基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
在一些实施方案中，一个或多个DNA片段包含至少一种选择标记。在一些实施方案中，一个或多个DNA片段包含至少一个位点特异性重组位点。
在一些实施方案中，啮齿动物的种系基因组包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，工程改造种系基因组中的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的步骤在啮齿动物ES细胞中进行，所述啮齿动物ES细胞的种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者为或包含内含子。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现。在一些实施方案中，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者为或包含内含子。
在一些实施方案中，本公开提供了一种在啮齿动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)用目标抗原对啮齿动物进行免疫，
其中所述啮齿动物具有种系基因组，所述种系基因组包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座述包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)一个或多个Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述一个或多个Cλ基因代替所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因；
将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
从所述啮齿动物、所述啮齿动物的细胞或源自所述啮齿动物的细胞的细胞回收结合所述目标抗原的抗体。
在一些实施方案中，响应于所述免疫步骤，啮齿动物产生B细胞，所述B细胞表达结合所述目标抗原的抗体。在一些实施方案中，由B细胞表达的抗体包含重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；和/或λ轻链，所述λ轻链具有由人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域，如本文所述。在一些实施方案中，由B细胞表达的抗体包含(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域；(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域，或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，响应于所述免疫步骤，所述啮齿动物产生B细胞，所述B细胞表达结合所述目标抗原的抗体。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域的重链和/或具有由如本文所述人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域的λ轻链。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体所表达的抗体包含(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，响应于所述免疫步骤，啮齿动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合至目标抗原的一个或多个表位的抗体，其中由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含：(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域，(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域，(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述的人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域，或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，如本文所述的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列是体细胞超突变的。在一些实施方案中，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％的响应于抗原而产生的B细胞群体的B细胞包含人重链可变区序列、λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的κ轻链可变区序列。
在一些实施方案中，结合目标抗原的抗体从啮齿动物的B细胞中分离、回收或鉴定。在一些实施方案中，结合目标抗原的抗体从用啮齿动物的B细胞制备的杂交瘤中分离、回收或鉴定。
在一些实施方案中，抗原包含一个或多个表位，并且结合目标抗原的抗体结合至所述一个或多个表位中的表位。
在一些实施方案中，Cλ基因为或包括啮齿动物Cλ基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因具有与小鼠Cλ1、小鼠Cλ2或小鼠Cλ3基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括小鼠Cλ1基因。在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括大鼠Cλ基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因具有与大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3或大鼠Cλ4基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3以及Vλ3-1。在一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3以及Vλ3-1。
在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6以及Jλ7。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
在一些实施方案中，啮齿动物具有种系基因组，所述种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2以及VH6-1。
在一些实施方案中，一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26以及DH7-27。
在一些实施方案中，一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5以及JH6。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人VH非编码序列，其中所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中的VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2或VH6-1，并且其中所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座的VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2或VH6-1。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人DH非编码序列，其中所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中的DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26或DH7-27，并且其中所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座的DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26或DH7-27出现。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人JH非编码序列，其中所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中的JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6，并且其中所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座的JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6出现。在一些实施方案中，所回收的啮齿动物的细胞为B细胞。在一些实施方案中，源自啮齿动物的细胞的细胞为杂交瘤。
在一些实施方案中，编码人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列的核苷酸序列获自B细胞。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。在一些实施方案中，啮齿动物的种系基因组包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，(例如，在雄性生殖系统的细胞，例如睾丸细胞中)表达一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。在一些实施方案中，第一人VH基因区段为VH1-2，并且第二人VH基因区段为VH6-1。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。在一些实施方案中，编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠或大鼠。
在一些实施方案中，本公开提供了一种啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含纯合的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述纯合的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，以及
(iii)啮齿动物Cλ基因；
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因，
其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(b)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，并且
其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列。
在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为小鼠Cλ1基因。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含啮齿动物免疫球蛋白κ轻链增强子Eκi和Eκ3'。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个啮齿动物Vκ基因区段和/或一个或多个Jκ基因区段的缺失。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含所有功能性啮齿动物Vκ和/或Jκ基因区段的缺失。
在一些实施方案中，本公开提供了一种啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)纯合的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述纯合的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链各自包含人重链可变结构域序列和啮齿动物重链恒定结构域序列，
(b)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性啮齿动物Cκ区基因的一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个Jκ基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含人κ轻链可变结构域序列和啮齿动物κ轻链恒定结构域序列，以及
(c)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，以及
(iii)啮齿动物Cλ基因；
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因，
其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(b)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，并且
其中所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列；
以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含人λ轻链可变结构域序列和啮齿动物λ轻链恒定结构域序列。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为杂合的。在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的。
在一些实施方案中，所述啮齿动物的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。在一些实施方案中，所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。在一些实施方案中，TdT为人TdT。在一些实施方案中，TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含编码所述啮齿动物的种系基因组中可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；并且表现出相对于在其种系基因组中不包含可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的可比较的小鼠(例如，同窝小鼠)在连接多样性方面增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的轻链(例如，表达包含其的轻链可变结构域)。在一些实施方案中，连接多样性通过独特的CDR3/10,000读数来进行测量。在一些实施方案中，连接多样性通过独特的CDR3/10,000读数来进行测量。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含编码所述啮齿动物的种系基因组中可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列，并且至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％的由啮齿动物产生的轻链(例如，λ和/或κ轻链)表现出非模板添加。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物为大鼠或小鼠。
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过包括以下步骤的方法制备的抗体：
(a)提供本文所述的啮齿动物；
(b)用目标抗原对所述啮齿动物进行免疫；
(c)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(d)从所述啮齿动物或所述啮齿动物的细胞或源自所述啮齿动物的细胞的细胞回收结合所述目标抗原的抗体，
其中(d)的所述抗体包含人重链可变结构域和人λ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过包括以下步骤的方法制备的抗体：
(a)用目标抗原对本文所述的啮齿动物进行免疫；
(b)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(c)从所述啮齿动物或所述啮齿动物的细胞或源自所述啮齿动物的细胞的细胞回收结合所述目标抗原的抗体，
其中(c)的所述抗体包含人重链可变结构域和人λ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白κ轻链可变结构域。在一些实施方案中，啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本文所述的啮齿动物响应于用包含一个或多个表位的抗原进行免疫而产生B细胞群体。在一些实施方案中，啮齿动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合(例如，特异性地结合)至目标抗原的一个或多个表位的抗体。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域的重链和/或具有由如本文所述人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域的λ轻链。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域；(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述的人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域；或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，啮齿动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合至目标抗原的一个或多个表位的抗体，其中由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含：(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域；(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域；和/或(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述的人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，如本文所述的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列为体细胞超突变的。在一些实施方案中，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％的响应于抗原而产生的B细胞群体的B细胞包含人重链可变区序列、λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的κ轻链可变区序列。
在一些实施方案中，本公开提供一种制备抗体的方法，所述方法包括：
(i)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白重链的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含人重链可变区序列；
(ii)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白λ轻链的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列包含人λ轻链可变区序列，所述人λ轻链可变区序列从种系基因组包含以下的啮齿动物鉴定(例如表达和/或分离)：
经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)一个或多个Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述一个或多个Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；
(iii)培养所述宿主细胞，以使得表达免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链并形成抗体；以及
(iv)从所述宿主细胞和/或宿主细胞培养物获得所述抗体。
在一些实施方案中，第一核苷酸序列包含人重链恒定区。在一些实施方案中，抗体为完全人抗体。
在一些实施方案中，第二核苷酸包含人λ轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，抗体为反式嵌合抗体。在一些实施方案中，第一核苷酸序列包含啮齿动物重链恒定区。在一些实施方案中，第二核苷酸序列包含啮齿动物λ轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，本公开提供一种啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；以及
(b)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
在一些实施方案中，Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，所述啮齿动物的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。在一些实施方案中，所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。在一些实施方案中，编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。在一些实施方案中，TdT为人TdT。在一些实施方案中，TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
在一些实施方案中，所述啮齿动物的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。在一些实施方案中，所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。在一些实施方案中，编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。在一些实施方案中，TdT为人TdT。在一些实施方案中，TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含编码所述啮齿动物的种系基因组中可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；并且表现出相对于在其种系基因组中不包含可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的可比较的小鼠(例如，同窝小鼠)在连接多样性方面增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的轻链(例如，表达包含其的轻链可变结构域)。在一些实施方案中，连接多样性通过独特的CDR3/10,000读数来进行测量。在一些实施方案中，连接多样性通过独特的CDR3/10,000读数来测量。
在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物包含编码所述啮齿动物的种系基因组中可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列，并且至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％的由啮齿动物产生的轻链(例如，λ和/或κ轻链)表现出非模板添加。
在各种实施方案中，如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织为啮齿动物、啮齿动物细胞或啮齿动物组织；在一些实施方案中，为小鼠、小鼠细胞或小鼠组织；在一些实施方案中，为大鼠、大鼠细胞或大鼠组织。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠、小鼠细胞或小鼠组织包含遗传背景，所述遗传背景包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合的129xC57BL/6品系或它们的组合。
附图说明
由以下附图组成的本文包括的附图仅用于说明目的并且不用于限制。
图1A和1B示出用于构建在产生根据本公开的啮齿动物的实施方案中使用的靶向载体的策略(描述于实施例1.1中)的示例性实施方案的不按比例的图示。
图2A示出将靶向载体插入啮齿动物胚胎干细胞(ES)克隆的经工程改造的Igκ轻链基因座中(描述于实施例1.1中)的示例性实施方案的不按比例的图示，其中ES细胞克隆用于产生根据本公开的实施方案。
图2B示出由插入在产生根据本公开的啮齿动物的实施方案中使用的靶向载体(描述于实施例1.1中)引起的经工程改造的Igκ轻链基因座中重组酶介导的一个或多个选择盒的移除的示例性实施方案的不按比例的图示。
图3示出用于构建在产生根据本公开的啮齿动物的实施方案中使用的靶向载体的策略(描述于实施例1.2中)的示例性实施方案的不按比例的图示。
图4A示出靶向载体插入(描述于实施例1.2中)啮齿动物胚胎干细胞(ES)克隆的经工程改造的Igκ轻链基因座中的不按比例的图示，所述ES细胞克隆用于产生根据本公开的啮齿动物的实施方案。
图4B示出由插入在产生根据本公开的啮齿动物的实施方案中使用的靶向载体(描述于实施例1.2中)引起的经工程改造的Igκ轻链基因座中重组酶介导的一个或多个选择盒的移除的示例性实施方案的不按比例的图示。。
图5示出源自根据本公开的代表性实施方案的结果，示出从野生型(WT)和6558HO(LiK，纯合的)小鼠收获的单细胞门控的脾细胞，顶行示出CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达，并且底行示出表达免疫球蛋白D(IgD，y-轴)和免疫球蛋白M(IgM，x-轴)的CD19+-门控脾细胞。
图6示出源自根据本公开的代表性实施方案的结果，包括从野生型(WT)和6558HO(LiK，纯合的)小鼠收获的代表性单细胞门控的骨髓，顶行示出CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达，并且底行示出免疫球蛋白M(IgD，y轴)和B220(x轴)的表达。
图7示出源自根据本公开的代表性实施方案的结果，包括从野生型(WT)和6558HO(LiK，纯合的)小鼠收获的代表性CD19+门控的脾细胞，说明含有小鼠Igλ(y轴)或小鼠Igκ(x轴)恒定区的免疫球蛋白轻链的表达。
图8示出源自根据本公开的代表性实施方案的结果，包括从各种指定的人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的脾细胞，说明CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达。HOH/LiK/λ-/-小鼠–对于人源化免疫球蛋白重链为纯合的(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940)、对于LiK基因座为纯合的且对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的小鼠；HOH/KoK/LiK/λ-/-小鼠–对于人源化免疫球蛋白重链为纯合(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940)、对于包含LiK基因座的一个κ基因座和包含人源化免疫球蛋白κ轻链基因座的第二κ基因座为半合子且对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的小鼠；HOH/KoK小鼠-对于人源化免疫球蛋白重链为纯合的且对于人源化免疫球蛋白κ轻链为纯合的对照小鼠。
图9示出由根据本公开的代表性实施方案得到的结果，包括从各种指定的人源化小鼠收获的代表性CD19+门控的脾细胞，说明含有小鼠Igλ(y-轴)或小鼠Igκ(x-轴)恒定区的免疫球蛋白轻链的表达。
图10示出由根据本公开的代表性实施方案得到的结果，包括从各种指定的人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的骨髓，说明免疫球蛋白M(IgD，y-轴)和B220(x轴)的表达。
图11示出由根据本公开的代表性实施方案得到的结果，包括从各种指定的人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的骨髓中，说明未成熟(顶行)和成熟(底行)B细胞中含有小鼠Igλ(y-轴)或小鼠Igκ(x-轴)恒定区的免疫球蛋白轻链的表达。
图12示出如本文所述的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座和重排基因座以形成mRNA分子的根据本公开的示例性实施方案不按比例的示意性图示。
图13示出由根据本公开的代表性实施方案获得的结果，包括使用从野生型(WT)和6558纯合的(LiK HO)小鼠中分离的血清的代表性SDS-PAGE蛋白质免疫印迹法(蛋白质印迹)，如实施例3.3中所述。
图14示出测试根据本公开的实施方案的结果，显示从人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的脾细胞，说明CD19(y轴)和CD3(x轴)的表达。HOH/LiK/λ-/-/TdT小鼠–对于人源化免疫球蛋白重链为纯合的(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940)、对于LiK基因座为纯合的且对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的小鼠，所述小鼠包含编码外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；和HOH/KoK/LiK/λ-/-/TdT小鼠–对于人源化免疫球蛋白重链为纯合的(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940)、对于包含LiK基因座的一个κ基因座和包含人源化免疫球蛋白κ轻链基因座的第二κ基因座而言为半合子的且对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的小鼠，所述小鼠包含编码外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
图15示出测试根据本公开的实施方案的结果，显示从各种指定的人源化小鼠收获的代表性CD19+门控的脾细胞，说明含有小鼠Igλ(y-轴)小鼠Igκ(x-轴)的恒定区的免疫球蛋白轻链的表达。
图16示出测试根据本公开的实施方案的结果，显示从各种指定的人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的骨髓，说明免疫球蛋白M(IgM，y轴)和B220(x-轴)的表达。
图17示出测试根据本公开的实施方案的结果，显示从各种指定的人源化小鼠收获的代表性单细胞门控的骨髓，说明未成熟(顶行)和成熟(底行)B细胞中含有小鼠Igλ(y-轴)或小鼠Igκ(x-轴)的免疫球蛋白轻链的表达。
图18示出测试根据本公开的实施方案的结果，显示使用蛋白质免疫原免疫化后，LiK/VI-3、LiK/VI-3/TdT与VI-3/TdT小鼠品系的免疫应答比较图。
图19显示本发明实施方案的测试结果，显示在用与HIS标签融合的不相关蛋白抗原进行免疫后，LiK/VI-3、LiK/VI-3/TdT和VI-3/TdT小鼠品系中，比较针对His标签的免疫应答的图。
图20示出内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的一部分的不按比例的图示。图20包括第一箭头，其指向内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的第一示例性内源性人Vλ非编码序列的表示。如图所示，内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的第一示例性内源性人Vλ非编码序列(由线条表示)天然地邻近于内源性人免疫球蛋白Igλ轻链基因座中的人Vλ3-12基因区段(由深灰色方块表示)和人Vλ2-11基因区段(由深灰色方块表示)出现。图20还包括第二箭头，其指向内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的第二示例性内源性人Vλ编码序列的表示。如所示，内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的第二示例性内源性人Vλ非编码序列(由线条表示)天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ2-11基因区段(由深灰色方块表示)和人Vλ3-10基因区段(由深灰色方块表示)出现。
图21示出内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的一部分的未按比例的图示。图21包括第一箭头，其指向内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的第一示例性内源性人Jκ非编码序列的表示。如所示，内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的第一示例性内源性人Jκ非编码序列(由线条表示)天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Jκ1基因区段(由深灰色方块表示)和人Jκ2基因区段(由深灰色方块表示)出现。图21还包括第二箭头，其指向内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的第二示例性内源性人Jκ非编码序列的表示。如所示，内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的第二示例性内源性人Jκ非编码序列(以线条表示)天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Jκ2基因区段(由深灰色方块表示)和人Jκ3基因区段(由深灰色方块表示)出现。
序列表中选测序列的简要说明
以下为小鼠、大鼠或人λ基因的各种免疫球蛋白恒定区的代表性核酸和氨基酸序列。免疫球蛋白基因和多肽的核酸序列和氨基酸序列可获自国际免疫遗传学信息系统网站www.imgt.org。
小鼠Cλ1DNA(SEQ ID NO:1):
GCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAAGGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCC
小鼠Cλ1氨基酸(SEQ ID NO:2):
GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS
小鼠Cλ2DNA(SEQ ID NO:3):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACTCTCACCGTGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGGAAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCCAACTTTTCCCCGAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGGCAACAAGTTCATGGCCAGCAGCTTCCTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGTCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
小鼠Cλ2氨基酸(SEQ ID NO:4):
GQPKSTPTLTVFPPSSEELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEGNKFMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL
小鼠Cλ3DNA(SEQ ID NO:5):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACCATGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGGAAAACAAAGCCACACTCGTGTGTCTGATTTCCAATTTTTCCCCAAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGACAACAAGTACATGGCCAGCAGCTTCTTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATG TCTC
小鼠Cλ3氨基酸(SEQ ID NO:6):
GQPKSTPTLTMFPPSPEELQENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEDNKYMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTH EGDTVEKSLSPAECL
大鼠Cλ1DNA(SEQ ID NO:7):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTGTC
大鼠Cλ1氨基酸(SEQ ID NO:8):
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
大鼠Cλ2DNA(SEQ ID NO:9):
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
大鼠Cλ2氨基酸(SEQ ID NO:10):
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
大鼠Cλ3DNA(SEQ ID NO:11):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAAAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAGTGTGTC
大鼠Cλ3氨基酸(SEQ ID NO:12):
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
大鼠Cλ4DNA(SEQ ID NO:13):
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
大鼠Cλ4氨基酸(SEQ ID NO:14):
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
人Cλ1DNA(SEQ ID NO:15):
CCCAAGGCCAACCCCACGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACGACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
人Cλ1氨基酸(SEQ ID NO:16):
PKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人Cλ2DNA(SEQ ID NO:17):
GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
人Cλ2氨基酸(SEQ ID NO:18):
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人Cλ3DNA(SEQ ID NO:19):
CCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTTGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGGGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTTGCCCCTACGGAATGTTCATAG
人Cλ3氨基酸(SEQ ID NO:20):
PKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人Cλ6DNA(SEQ ID NO:21):
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCATCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGCCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGAAAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAACACGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGTTCATAG
人Cλ6氨基酸(SEQ ID NO:22):
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS
人Cλ7DNA(SEQ ID NO:23):
GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT
人Cλ7氨基酸(SEQ ID NO:24):
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
定义
本发明的范围由所附权利要求限定，且不受本文描述的某些实施方案的限制。阅读本说明书的本领域技术人员将意识到各种修饰可等效于此类描述的实施方案，或另外落入权利要求的范围内。一般来说，除非另有明确说明，否则本文使用的术语与本领域中理解的含义一致。下文提供了某些术语的明确定义；本领域技术人员从上下文中将清楚本说明书中特定实例中的这些和其他术语的含义。在整个说明书中阐述了以下和其他术语的另外定义。本说明书中引用的专利和非专利参考文献或其相关部分以引用的方式整体并入本文。
在权利要求中使用顺序术语，如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素本身并不意味一个权利要求要素超过另一个的任何优先、居先或次序或执行方法的动作所依的时序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求要素与(如果不使用顺序术语，那么将)具有相同名称的另一要素以区分所述权利要求要素的标记。
如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等效形式使用。在本申请中与或不与约或大约一起使用的任何数字意欲涵盖由相关领域普通技术人员了解的任何正常波动。
除非明确相反地指出，否则说明书和权利要求中的冠词“一个/种(a/an)”应理解为包括复数指示物。除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产物或方法，则认为包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到了满足。本发明包括其中恰有组中的一个成员出现于、被用于或以其他方式关联于给定的产品或过程的实施方案。本发明还包括其中多于一个或全部组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定产物或方法的实施方案。此外，应该理解，本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入依附于同一个基础权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中的所有变体、组合和排列，除非另有说明或者除非对于本领域的技术人员显而易见会出现矛盾或不一致。在要素以(例如马库西组(Markushgroup)或类似格式)列表证明的情况下，应了解，还公开了所述要素的各个亚组，并且可以从所述组中除去任何要素。应理解，一般来说，在本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特征等时，本发明或本发明的方面的某些实施方案由此类要素、特征等组成，或基本上由其组成。为简单起见，那些实施方案并未在本文中在任何情况下都以如此多的词语具体阐述。还应理解，无论是否在说明书中叙述了具体排除，本发明的任何实施方案或方面都可明确地从权利要求中排除。
施用：如本文所用，包括向受试者或系统(例如，细胞、器官、组织、生物体或其相关成分或组分组)施用组合物。本领域技术人员将理解，施用途径可根据例如施用组合物的受试者或系统、组合物的性质、施用目的等变化。例如，在某些实施方案中，向动物受试者(例如，向人或啮齿动物)施用可为支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、肠内、皮间、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、粘膜、经鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部，气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道和/或玻璃体施用。在一些实施方案中，施用可包括间歇给药。在一些实施方案中，施用可包括连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。
改善：如本文所用，包括状态的预防、减轻或缓和，或受试者状态的改善。改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、病症或疾患。
大约：在应用于一个或多个目标数值时，包括与所陈述参考值类似的数值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入所陈述参考值的±10％内(大于或小于)的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
具有生物活性：如本文所用，是指在生物系统中、体外或体内(例如，生物体内)具有活性的任何剂的特性。例如，当存在于生物体内时，在所述生物体内具有生物学效应的剂被认为具有生物活性。在特定实施方案中，其中蛋白质或多肽具有生物活性，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的蛋白质或多肽的一部分通常被称为“具有生物活性的”部分。
可比较的：如本文所用，是指两种或更多种剂、实体、情况、条件组等，它们可能彼此不相同但足够相似，以允许它们之间进行比较，以使得可基于所观察到的差异性或相似性合理地得出结论。在上下文中，本领域普通技术人员将理解，在任何特定情况下，要认为两种或更多种此类剂、实体、情况、条件组等为可比较的，需要某种程度的等同性。
保守性：如本文所用，是指描述保守性氨基酸取代的实例，包括用具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一氨基酸残基取代氨基酸残基。一般而言，保守性氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的目标功能特性，例如，受体与配体结合的能力。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：脂肪族侧链如甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)以及异亮氨酸(Ile，I)；脂肪族羟基侧链，如丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)；含酰胺的侧链，如天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；芳香族侧链，如苯丙氨酸(Phe，F)、酪氨酸(Tyr，Y)和色氨酸(Trp，W)；碱性侧链，如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和组氨酸(His，H)；酸性侧链，如天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)；以及含硫侧链，如半胱氨酸(Cys，C)和甲硫氨酸(Met，M)。保守性氨基酸取代基团包括，例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸(Val/Leu/Ile，V/L/I)、苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr，F/Y)、赖氨酸/精氨酸(Lys/Arg，K/R)、丙氨酸/缬氨酸(Ala/Val，A/V)、谷氨酸/天冬氨酸(Glu/Asp，E/D)，以及天冬酰胺/谷氨酰胺(Asn/Gln，N/Q)。在一些实施方案中，保守性氨基酸取代可为用丙氨酸取代蛋白质中的任何天然残基，例如用于丙氨酸扫描诱变。在一些实施方案中，进行保守性取代，所述保守性取代在PAM250对数似然矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中具有正数值，如Gonnet,G.H.等人,1992,Science 256:1443-1445中所公开，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，取代为中度保守性取代，其中所述取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。
对照：如本文所使用的，是指“对照”的本领域理解的含义，其为与结果进行比较的标准。通常，使用对照以便通过分离变量来增强实验的完整性，从而得到关于这些变量的结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行的反应或测定以提供比较物。“对照”还包括“对照动物。”“对照动物”可具有如本文所述的修饰、不同于本文所述的修饰，或无修饰(即野生型动物)。在一个实验中，应用“测试”(即，正在测试的变量)。在第二个实验中，“对照”，未应用正在测试的变量。在一些实施方案中，对照为历史性对照(即，先前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照为或包括打印出或以其他方式保存的记录。对照可为阳性对照或阴性对照。
破坏：如本文所使用，是指与DNA分子的同源重组事件的结果(例如，具有内源性同源序列，如基因或基因座)。在一些实施方案中，破坏可实现或代表DNA序列的插入、缺失、取代、置换、错义突变或框移或它们的任何组合。插入可包括插入完整基因或基因片段，例如外显子，其可具有除内源序列以外的来源(例如，异源序列)。在一些实施方案中，破坏可增加基因或基因产物(例如由基因编码的多肽)的表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可降低基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可改变基因或经编码的基因产物(例如，经编码的多肽)的序列。在一些实施方案中，破坏可截短或片段化基因或经编码的基因产物(例如，经编码的多肽)。在一些实施方案中，破坏可延伸基因或经编码的基因产物。在一些此类实施方案中，破坏可实现融合多肽的组装。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的水平，但不影响活性。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的活性，但不影响水平。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的水平没有显著影响。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的活性没有显著影响。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的水平或活性没有显著影响。
确定、测量、评价、评估、测定和分析：在本文中可互换使用，以指称任何形式的测量，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。测定可为相对性或绝对性。“测定其存在”可确定某物存在的量，和/或确定它是否存在。
内源性启动子：如本文所用，是指与内源性基因天然相关的启动子，例如在野生型生物中。
经工程改造的：如本文所用，一般是指人为操纵的方面。例如，在一些实施方案中，当人为操纵并非以天然顺序连接在一起的两个或更多个序列以在经工程改造的多核苷酸中彼此连接时，多核苷酸可被视为“经工程改造的”。在一些实施方案中，经工程改造的多核苷酸可包含在自然界中发现的调控序列，所述调控序列与第一编码序列可操作地缔合但不与第二编码序列可操作地缔合，通过人为连接，以使得其与第二编码序列可操作地缔合。或者或另外，在一些实施方案中，各自编码自然界中彼此不连接的多肽元件或结构域的第一和第二核酸序列可在单一经工程改造的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操作以使得它的遗传信息被改变(例如，先前未存在的新遗传物质已被引入，或者，先前存在的遗传物质已被改变或移除)，则可认为所述细胞或生物体为“经工程改造的”。如本领域普通技术人员所理解的，经工程改造的多核苷酸或细胞的后代通常仍被称为“经工程改造的”，即使实际操作在先前实体上进行。此外，如本领域技术人员将理解的，可使用各种方法，通过所述方法可实现如本文所述的“工程改造”。例如，在一些实施方案中，“工程改造”可涉及通过使用编程为执行分析或比较的计算机系统来筛选或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体)，或以其他方式分析、建议和/或选择序列、改变等)。或者或另外地，在一些实施方案中，“工程改造”可涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术，例如像核酸扩增(例如，经由聚合酶链式反应)杂交、突变、转化、转染等，和/或各种受控配对法中的任一者。如本领域技术人员所理解的，各种已建立的此类技术(例如，用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染等))为本领域所熟知，并且描述于本说明书中引用和/或讨论的各种一般和更具体的参考文献中。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989以及Principles ofGene Manipulation:An Introduction to Genetic Manipulation,第5版,Old,R.W.和S.B.Primrose编,Blackwell Science,Inc.,1994,以引用的方式整体并入本文。
功能性：如本文所用，是指表现出特定性质(例如，形成编码序列的一部分)和/或活性的实体(例如，基因或基因区段)的形式或片段。例如，在免疫球蛋白的情况下，可变区由独特的基因区段(即V、D和/或J)编码，所述基因区段被组装(或重组)以形成功能性编码序列。当存在于基因组中时，基因区段以聚簇形式组构，尽管确实发生了变化。“功能性”基因区段为在表达的序列(即可变区)中表示的基因区段，其中相应的基因组DNA已被分离出(即复制)并通过序列鉴定。一些免疫球蛋白基因区段序列患有开放阅读框，且被认为具有功能性，尽管未在表达库中存在，而其他免疫球蛋白基因区段序列则含有导致终止密码子的突变(例如点突变、插入、缺失等)和/或截短序列，其随后使得此类基因区段序列不能发挥与一个或多个非突变序列相关的一种或多种性质和/或一种或多种活性。此类序列不在表达序列中表示，并且因此归类为假基因。
基因：如本文所用，是指染色体中编码产物(例如RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列。在一些实施方案中，基因可包括一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列，所述一个或多个调控序列和/或内含子序列例如可控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)。为了清楚起见，注意到，如在本公开中使用的，术语“基因”通常是指编码多肽或其片段的核酸的一部分；所述术语可任选地包括调控序列，如本领域普通技术人员将由上下文而清楚。此定义并不意图排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是澄清在大多数情况下，本文件中使用的术语是指编码多肽的核酸。
异源性：如本文所用，是指来自不同来源的剂或实体。例如，当用于提及存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物时，所述术语阐明相关的多肽、基因或基因产物：1)通过人工工程改造；2)通过人工(例如，经由工程改造)引入细胞或生物体(或其前体)；和/或3)并非由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)天然产生或存在于相关细胞或生物体中。“异源性”还包括通常存在于特定天然细胞或生物体中、但已被改变或修饰，例如，通过在非天然缔合的且在一些实施方案中非内源性的调控元件(例如，启动子)控制下的突变或置入。
宿主细胞：如本文所用，是指已引入核酸或蛋白质的细胞。本领域技术人员阅读本公开内容时将理解，此类术语不仅是指特定的受试者细胞，而且用于指这种细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后代中发生，因此这种后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包含在术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞为或包括原核或真核细胞。通常，宿主细胞是适合接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，不论细胞属于生命界中的哪一界。示例性细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉斑夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物，例如像杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞为人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为真核细胞并选自以下细胞：CHO(如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞托利细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，
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细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞为或包含分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为组织的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞为生物体的一部分。
同一性：如在本文中与序列比较结合使用，是指如通过本领域中已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法而确定的同一性。在一些实施方案中，使用ClustalWv.1.83(慢)比对确定如本文所述的同一性，使用10.0的开放空位罚分、0.1的延伸空位罚分以及使用Gonnet相似度矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)。
代替：如本文所用，是指位置性取代，其中第一核酸序列位于染色体中第二核酸序列的位置上(例如，其中所述第二核酸序列先前(例如，最初)位于染色体中，例如，位于第二核酸序列的内源性基因座处)。短语“代替”并非要求自例如基因座或染色体中移除第二核酸序列。在一些实施方案中，所述第二核酸序列和所述第一核酸序列彼此可比较，在于例如，所述第一和第二序列彼此同源，含有相应的元件(例如，蛋白质编码元件、调控元件等)，和/或具有相似或相同的序列。在一些实施方案中，第一和/或第二核酸序列包含一个或多个启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)；在一些实施方案中，第一和/或第二核酸序列包含一个或多个编码序列。在一些实施方案中，第一核酸序列为第二核酸序列的同源物或变体(例如，突变体)。在一些实施方案中，第一核酸序列为第二序列的直向同源物或同源物。在一些实施方案中，第一核酸序列为或包括人核酸序列。在一些实施方案中，包括其中第一核酸序列为或包括人核酸序列，第二核酸序列为或包括啮齿动物序列(例如，小鼠或大鼠序列)。在一些实施方案中，包括其中第一核酸序列为或包括人核酸序列，第二核酸序列为或包括人序列。在一些实施方案中，第一核酸序列为第二序列的变体或突变体(即，与第二序列相比，含有一个或多个序列差异(例如取代)的序列)。如此放置的核酸序列可包括一个或多个调控序列，所述调控序列为用于获得如此放置的序列的来源核酸序列的一部分(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在各种实施方案中，第一核酸序列为用异源序列取代内源序列，所述异源序列导致由如此放置(包含所述异源序列)的核酸序列产生基因产物，但不表达内源序列；第一核酸序列具有内源性基因组序列，所述内源性基因组序列具有编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与由内源序列编码的多肽相似的功能(例如，所述内源性基因组序列编码非人可变区多肽(全部或部分)，并且所述DNA片段编码一个或多个人可变区多肽(全部或部分))。在各种实施方案中，人免疫球蛋白基因区段或其片段代替内源性非人免疫球蛋白基因区段或片段。
体外：如本文所用，是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不在多细胞生物体内。
体内：如本文所用，是指在多细胞生物体内发生的事件，如人和/或非人动物。在基于细胞的系统的上下文中，所述术语可用于指在活细胞内发生的事件(例如，与体外系统相反)。
分离的：如本文所用，是指物质和/或实体(1)与最初产生时(无论为在自然界中还是在实验设备中)，与其缔合的至少一些组分分离，和/或(2)由人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂与10％-100％、15％-100％、20％-100％、25％-100％、30％-100％、35％-100％、40％-100％、45％-100％、50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、95％-100％、96％-100％、97％-100％、98％-100％或99％-100％的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂与10％-100％、10％-99％、10％-98％、10％-97％、10％-96％、10％-95％、10％-90％、10％-85％、10％-80％、10％-75％、10％-70％、10％-65％、10％-60％、10％-55％、10％-50％、10％-45％、10％-40％、10％-35％、10％-30％、10％-25％、10％-20％或10％-15％的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂与11％-99％、12％-98％、13％-97％、14％-96％、15％-95％、20％-90％、25％-85％、30％-80％、35％-75％、40％-70％、45％-65％、50％-60％或55％-60％的最初与其缔合的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯。在一些实施方案中，分离的剂为80％-99％、85％-99％、90％-99％、95％-99％、96％-99％、97％-99％或98％-99％纯。在一些实施方案中，分离的剂为80％-99％、80％-98％、80％-97％、80％-96％、80％-95％、80％-90％或80％-85％纯。在一些实施方案中，分离的剂为85％-98％、90％-97％或95％-96％纯。在一些实施方案中，如果物质基本上不含其他组分，则所述物质为“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员将理解的，物质在与某些其他组分，例如像一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)组合后，仍可被视为“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，计算在不包括此类载体或赋形剂的情况下物质的百分比或纯度。仅用于举例，在一些实施方案中，在以下情况下，生物性聚合物，如天然存在的多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：当a)其来源或衍生来源并非与其自然状态下所伴随的组分的一部分或全部相关；b)其基本上不含与自然界中产生它的相同物种的其他多肽或核酸；或c)由细胞或其他表达系统(其并非天然产生其的物种)表达，或者与来自所述细胞或其他表达系统的组分缔合。因此，举例而言，在某些实施方案中，经化学合成或在与产生其的天然细胞系统不同的系统中合成的多肽被认为是"分离的"多肽。或者或另外地，在一些实施方案中，经受一种或多种纯化技术的多肽可视为“分离的”多肽，其某种程度上与其它组分分开：a)天然与之缔合者；和/或b)最初产生时与之缔合者。
基因座(Locus)或基因座(loci)：如本文所用，是指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽-编码序列在生物体基因组的染色体上的位置(location)或位置(position)。例如，“免疫球蛋白基因座”可指免疫球蛋白基因区段(例如，V、D、J或C)、免疫球蛋白基因区段DNA序列、免疫球蛋白基因区段-编码序列或免疫球蛋白基因区段在生物体基因组染色体上的位置，其已鉴定出此序列所在位置。“免疫球蛋白基因座”可包含免疫球蛋白基因区段的调控元件，包括但不限于增强子、启动子、5'和/或3'调控序列或区域或它们的组合。“免疫球蛋白基因座”可包含基因间DNA，例如通常位于或出现在野生型基因座中的基因区段之间的DNA。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，染色体可含有数百或甚至数千个基因，并且当在不同物种之间进行比较时证明相似遗传基因座的物理性共定位。这种遗传基因座可被描述为具有共享的同线性。
天然地出现：如本文所用，关于生物学元件(例如，核酸序列)意指生物学元件可在特定背景和/或位置中发现，而在细胞或生物体(例如动物)中尚未进行工程改造(例如，遗传工程改造)。换言之，天然出现在指定的背景和/或位置中的序列并不在作为工程改造(例如，遗传工程改造)的结果的指定背景和/或位置中。例如，在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中天然邻近于人Jκ1基因区段出现的序列为可邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座(无遗传工程改造)中的人Jκ1基因区段发现。在一些实施方案中，序列可由其天然出现的细胞或生物体中获得、得到和/或分离出。在一些实施方案中，细胞或生物体并非天然出现于细胞或生物体中的序列的直接来源。例如，可鉴定细胞或生物体中的对应序列，且然后通过本领域已知的机制产生或复制。
非人动物：如本文所用，是指任何非人的脊椎动物生物体。在一些实施方案中，非人动物为圆口类动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如鲨鱼或鳐鱼)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟。在一些实施方案中，非人动物为哺乳类动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，如大鼠或小鼠。
核酸：如本文所用，是指并入或可并入至寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”为化合物和/或物质，所述化合物和/或物质经由磷酸二酯键联并入或可并入寡核苷酸链中。从上下文可清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单独核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”为或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”为或包含DNA。在一些实施方案中，“核酸”为、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，“核酸”为、包含一种或多种核酸类似物或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与“核酸”的不同的处在于其不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，“核酸”为、包含一种或多种“肽核酸”或由一种或多种“肽核酸”组成，所述一种或多种“肽核酸”为本领域已知的并具有肽键，而非主链中的磷酸二酯键。或者或另外地，在一些实施方案中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键联，而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，“核酸”为、包含一种或多种天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)或由所述一种或多种天然核苷组成。在一些实施方案中，“核酸”为、包含一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷，O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基以及它们的组合)或由所述一种或多种核苷类似物组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，“核酸”包含一种或多种经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖)。在一些实施方案中，“核酸”具有核苷酸序列，所述核苷酸序列编码功能性基因产物，如RNA或多肽。在一些实施方案中，“核酸”包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，“核酸”包含一个或多个外显子。在一些实施方案中，“核酸”通过以下一种或多种方法来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中进行繁殖以及化学合成。在一些实施方案中，“核酸”的长度为至少，例如但不限于3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，“核酸”为单链；在一些实施方案中，“核酸”为双链。在一些实施方案中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或为编码多肽的序列的互补序列。在一些实施方案中，“核酸”具有酶活性。
可操作地连接：如本文所用，是指其中所描述的组分处于允许它们以其预定的方式起作用的关系的并置。“可操作地连接”至编码序列的控制序列是以使得在与所述控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。“可操作地连接”的序列包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式或隔开一定距离起作用以控制目标基因(或目标序列)的表达控制序列两者。术语“表达控制序列”包括影响与它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。“表达控制序列”包括：适当转录起始序列、终止序列、启动子序列和强化子序列；高效RNA加工信号，如剪接信号和聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强多肽稳定性的序列；以及在需要时增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，这类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括包括其存在对于表达和加工必需的组分，并且还可包括其存在有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
生理条件：如本文所用，是指本领域理解的关于细胞或生物体生存和/或复制的条件。在一些实施方案中，所述术语包括对于生物体或细胞系统而言可天然发生的外部或内部条件。在一些实施方案中，生理条件为存在于人或非人动物体内的条件，尤其为存在于手术部位和/或手术部位内的条件。生理条件通常包括，例如，温度范围20℃-40℃、1大气压、pH值6-8、葡萄糖浓度1-20mM、大气水平的氧浓度以及在地球上的重力。在一些实施方案中，实验室中的条件被操纵和/或维持于生理条件下。在一些实施方案中，生理条件在生物体中遇到。
多肽：如本文所用，是指任何氨基酸聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列含有在自然界中彼此分开的部分(即，来自两种或更多种不同生物体，例如人和非人部分)。在一些实施方案中，多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列被工程改造为通过人为设计和/或产生。在一些实施方案中，多肽具有由自然界中不存在的序列编码的氨基酸序列(例如，通过人为设计和/或产生以编码所述多肽的经工程改造的序列)。
重组：如本文所用，是指经由重组方式设计、工程改造、制备、表达、创造或分离的多肽，如使用重组表达载体转染到宿主细胞中而表达的多肽、分离自重组性、组合式人多肽库的多肽((Hoogenboom,H.R.,1997,TIB Tech.15:62-70；Azzazy,H.和W.E.Highsmith,2002,Clin.Biochem.35:425-45；Gavilondo,J.V.和J.W.Larrick,2002,BioTechniques29:128-45；Hoogenboom H.,和P.Chames,2000,Immunol.Today 21:371-8，以引用的方式整体并入本文)、从动物(例如小鼠)分离的已经遗传工程改造以包括人免疫球蛋白基因的抗体(参见例如Taylor,L.D.等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-95；Kellermann,S-A.和L.L.Green,2002,Curr.Opin.Biotechnol.13:593-7；Little,M.等人,2000,Immunol.Today21:364-70；Osborn,M.J.等人,2013,J.Immunol.190:1481-90；Lee,E-C.等人,2014,Nat.Biotech.32(4):356-63；Macdonald,L.E.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5147-52；Murphy,A.J.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-8，以引用的方式整体并入本文)，或通过涉及将所选序列元件彼此剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，在自然界中发现一种或多种此类选择的序列元件。在一些实施方案中，在计算机上设计一种或多种此类选择的序列元件。在一些实施方案中，一种或多种此类选择的序列元件来自已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)，例如来自天然或合成(例如人造)来源。例如，在一些实施方案中，重组多肽由目标来源生物体(例如人、小鼠等)的基因组中发现的序列组成。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变产生的氨基酸序列(例如，体外或体内，例如，在非人动物中)，以使得所述重组多肽的氨基酸序列(当源自于并相关于多肽序列)可能不天然存在于非人动物体内的基因组中。
参考物：如本文所用，是指标准或对照剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值，所述剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值相比。在一些实施方案中，参考剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值基本上同时与所述待测试或待测定的目标剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值进行测试和/或测定。在一些实施方案中，参考剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值为经验值参考，任选地在有形介质中具体化。在一些实施方案中，参考物是指对照组。“参考物”还包括“参考动物”。“参考动物”可具有如本文所述的修饰、不同于本文所述的修饰，或无修饰(即野生型动物)。通常，如本领域技术人员所理解的，参考剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或数值为于在测定或鉴定目标剂、动物(如哺乳动物)、群组、个体、群体、样品、序列或数值的可比较条件下测定或鉴定。
置换：如本文所用，是指在宿主基因座(例如，在基因组中)中发现的“被置换的”核酸序列(例如，基因)，从所述基因座中移除并在其位置上放置了不同的“置换用”核酸的过程。在一些实施方案中，被置换的核酸序列和置换用核酸序列彼此相当，在于，例如，它们彼此同源、含有相应的元件(例如，蛋白质-编码元件、调控元件等)和/或具有相似或相同的序列。在一些实施方案中，被置换的核酸序列包含启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一者或多者；在一些实施方案中，置换用核酸序列包含一个或多个编码序列。在一些实施方案中，置换用核酸序列为被置换核酸序列的同源物或变体(如突变体)。在一些实施方案中，置换用核酸序列为被置换序列的直向同源物或同源物。在一些实施方案中，置换用核酸序列为或包含人核酸序列。在一些实施方案中，包括其中置换用核酸序列为或包含人核酸序列，被置换的核酸序列为或包含啮齿动物序列(例如，小鼠或大鼠序列)。在一些实施方案中，包括其中置换用核酸序列为或包含人核酸序列，被置换的核酸序列为或包含人序列。在一些实施方案中，置换用核酸序列为被置换序列的变体或突变体(即，与被置换序列相比含有一个或多个序列差异(例如置换)的序列)。如此放置的核酸序列可包含一个或多个调控序列，所述一个或多个调控序列为用于获得如此放置的序列的来源核酸序列的一部分(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在各种实施方案中，置换为用异源序列取代内源序列，所述置换导致由如此放置的核酸序列(包含异源序列)产生基因产物，但不表达内源序列；置换物为具有核酸序列的内源基因组序列，所述核酸序列编码与由内源序列编码的多肽具有相似功能的多肽(例如，内源性基因组序列编码非人可变区多肽(整体或部分)，并且所述DNA片段编码一个或多个人可变区多肽(整体或部分))。在各种实施方案中，内源性非人免疫球蛋白基因区段或其片段被人免疫球蛋白基因区段或其片段置换。
基本上：如本文所用，是指表现出所有或接近所有或某些程度的目标特征或性质的定性条件。生物学领域的一般技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成，和/或完全进行或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”用于涵盖许多生物和化学现象中固有的完整性的潜在缺乏。
基本相似性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域一般技术人员所理解的，如果两个序列在相应位置具有相似的残基(例如氨基酸或核苷酸)，则通常认为它们为“基本上相似的”。如本领域所理解的，尽管类似的残基可为相同的残基(也参见下文的基本同一性)，但类似的残基还可具有适当可比较的结构和/或功能特征的非相同残基。例如，如本领域一般技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。将一种氨基酸取代为相同类型的另一种氨基酸通常视为“保守性”取代。典型的氨基酸分类总结于下表中。
Figure BDA0002524439450000621
Figure BDA0002524439450000622
Figure BDA0002524439450000631
如本领域所熟知的，氨基酸序列或核酸序列可使用各种算法中的任一种进行比较，所述算法包括在商业计算机程序中可用的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-10；Altschul,S.F.等人,1996,Meth.Enzymol.266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)Bioinformatics Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,第132卷,Humana Press,1998中，所述文献以引用的方式整体并入本文。除了鉴定类似序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基的至少例如但不限于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关段残基上相似(例如，相同或包含保守性取代)，则两个序列被视为基本上相似。在一些实施方案中，所述相关段为完整序列(例如基因序列、基因区段、编码结构域的序列、多肽或结构域)。在一些实施方案中，所述相关段为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个残基。在一些实施方案中，所述相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。在一些实施方案中，所述相关段包括沿着完整序列的连续残基。在一些实施方案中，所述相关段包括沿着完整序列的不连续残基，例如，通过多肽或其一部分的折叠构象聚集在一起的非连续残基。
基本同一性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域一般技术人员所理解的，如果两个序列在对应位置含有相同的残基(例如氨基酸或核苷酸)，则通常认为它们为“基本上相同的”。如本领域众所周知的，氨基酸或核酸序列可使用各种算法中的任何一种进行比较，包括商业计算机程序中可用的那些，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-10；Altschul,S.F.等人,1996,Meth.Enzymol.266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)Bioinformatics Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,第132卷,Humana Press,1998中，所述文献以引用的方式整体并入本文。除了鉴定相同序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关段残基上相同，则所述两个序列被认为是基本上相同的。在一些实施方案中，相关段残基为完整序列。在一些实施方案中，相关段残基为例如但不限于，至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个残基。
靶向构建体或靶向载体：如本文所用，是指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本上相同的序列，并且经由同源重组将所述靶向构建体整合到所述细胞、组织或动物的基因组内的位置中。本文还包括并描述了使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)靶向的靶向区域。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含特定目标核酸序列或基因、选择性标记、控制序列和/或调控序列，以及允许经由外源性添加蛋白质重组介导的其他核酸序列，所述蛋白质帮助或促进涉及此类序列的重组。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含全部或部分目标基因，其中所述目标基因为编码多肽的异源性基因，其全部或部分具有与由内源序列编码的蛋白质相似的功能。在一些实施方案中，如本文所述的靶向构建体还包含全部或部分目标人源化基因，其中所述人源化目标基因全部或部分地编码具有与由内源序列编码的多肽相似的功能。在一些实施方案中，靶向构建体(或靶向载体)可包含由人工操作的核酸序列。例如，在一些实施方案中，可构建靶向构建体(或靶向载体)，以含有经工程改造的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸包含两个或更多个序列，所述序列在自然界中不以所述顺序连接在一起，而为人为操作，以使所述工程改造或重组的多核苷酸彼此直接连接。
转基因或转基因构建体：如本文所用，是指通过人为操作，例如通过本文所述的方法引入细胞中的核酸序列(其编码例如目标多肽(整体或部分))。转基因相对于其引入的遗传工程改造的动物或细胞而言，可为部分或完全异源性，即外来的。转基因可包含一种或多种转录调控序列和任何其他核酸，例如内含子或启动子，其可能是表达选定的核酸序列所必需的。
经遗传修饰的非人动物或经遗传工程改造的非人动物：在本文中可互换使用并且是指任何非天然存在的非人动物，其中非人动物的一种或多种细胞含有异源核酸和/或编码目标多肽(全部或部分)的基因。例如，在一些实施方案中，“经遗传修饰的非人动物”或“经遗传工程改造的非人动物”是指含有转基因或转基因构建体的非人动物，如本文所述。在一些实施方案中，异源核酸和/或基因直接或间接地通过有意的遗传操作，例如通过显微注射或通过重组病毒感染引入其前体细胞而引入细胞中。术语遗传操作不包括典型的育种技术，而是涉及重组DNA分子的引入。所述分子可整合在染色体内，或者它可为染色体外复制DNA。短语“经遗传修饰的非人动物”或“经遗传工程改造的非人动物”是指对于异源核酸和/或基因为杂合的或纯合的动物，和/或具有异源核酸和/或基因的单个拷贝或多个拷贝的动物。
载体：如本文所用，是指能够转运另一核酸至与其缔合者的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够进行它们在宿主细胞(如真核和/或原核细胞)中所连接的核酸的染色体外复制和/或表达。能够引导可操作地连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体。”
野生型：如本文所用，是指具有在“正常”状态或背景下，在自然界中发现的结构和/或活性的实体(相对于突变体、患病、改变等)。本领域一般技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
具体实施方式
本公开提供尤其经工程改造的非人动物，所述经工程改造的非人动物具有编码人Vλ结构域的异源遗传物质，所述异源遗传物质包含人Vλ和Jλ基因序列(即基因区段)，以及提供具有包含人部分和非人部分的Igλ轻链的抗体或具有完全人的Igλ轻链的抗体的适当重排和表达的其他人序列(例如，重组信号序列(RSS))。例如，在各种实施方案中，当人基因区段存在于经工程改造的非人动物的基因组中时，还可存在相应的重组信号序列(例如，VλRSS与Vλ基因区段、JλRSS与Jλ基因区段、VκRSS与Vκ基因区段、JκRSS与Jκ基因区段等)。在各种实施方案中，所提供的经工程改造的非人动物含有以一种方式插入的异源遗传物质，所述方式使得含有具有人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域的轻链的抗体表达于非人动物的抗体库中。此外，所提供的经工程改造的非人动物含有以一种方式插入的异源遗传物质，所述方式使得含有具人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域的轻链的抗体由经工程改造的Igκ轻链基因座表达，所述基因座包含人和非人Igλ基因序列(例如，基因区段)，并且在一些实施方案中，在非人动物的种系基因组中表达人Igκ轻链序列。
不希望受任何特定理论的束缚，预期如本文所述的非人动物可提供改进的体内系统，所述系统利用表达含有人Vλ结构域的抗体用于产生治疗性抗体。在一些实施方案中，还预期如本文所述的非人动物提供含有异源遗传物质的替代工程改造形式的轻链基因座(例如，Igκ轻链基因座)用于开发基于人抗体的治疗剂(例如，人单克隆抗体、多特异性结合剂、scFv、融合多肽等)，用于使与偏移抗体应答(例如，以κ或λ轻链的绝大部分为特征的抗体应答)相关的靶标患病。因此，所提供的非人动物特别适用于开发针对与部分由于抗体库和/或应答偏斜所致的不良免疫原性相关的靶标(例如病毒)的人抗体和基于人抗体的分子(例如，多特异性结合剂、scFv、融合多肽等)。
本公开尤其描述免疫球蛋白κ轻链基因座，所述疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段以及Cλ基因。这种基因座被称为“在κ中的λ”基因座或“LiK”。
特别地，本公开描述具有种系基因组的非人动物(例如啮齿动物)的产生，所述种系基因组含有经工程改造的Igκ轻链基因座，在一些实施方案中，所述经工程改造的Igκ轻链基因座的特征为引入多个人Vλ和Jλ基因区段以及引入非人或人Cλ基因代替非人Cκ基因，以使得所述多个人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述非人或人Cλ基因。如本文所述，这种经工程改造的Igκ轻链基因座的产生导致含有轻链的抗体表达，所述轻链包含来自所述非人动物的种系基因组中的经工程改造的Igκ轻链基因座的人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域。在一些实施方案中，所提供的非人动物的种系基因组包含Igκ轻链基因座，所述Igκ轻链基因座包含人Igλ轻链序列。在一些实施方案中，所提供的非人动物的种系基因组包含(i)Igκ轻链基因座，所述Igκ轻链基因座包含人Igλ轻链序列，以及(ii)(a)Igκ轻链基因座，所述Igκ轻链基因座包含人Igλ轻链序列，或(ii)(b)Igκ轻链基因座，所述Igκ轻链基因座包含人Igκ轻链序列。在一些实施方案中，所提供的非人动物的种系基因组包含如本文所述的Igκ轻链基因座，并且还包含(i)人源化IgH基因座或(ii)人源化IgH基因座，以及功能性沉默或以其他方式成为非功能性的内源性Igλ轻链基因座。如本文所述，所提供的非人动物表达含有包含人Vλ结构域的Igλ轻链的抗体库。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在Igκ轻链基因座内含有人Igλ轻链序列。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在Igκ轻链基因座内含有人和非人Igλ轻链序列。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在Igκ轻链基因座内含有人Igλ和人Igκ轻链序列。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在Igκ轻链基因座内含有人Igλ、人Igκ和鼠类Igκ，和/或鼠类Igλ轻链序列。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在Igκ轻链基因座内含有人Igλ轻链序列、非人Igλ轻链序列、人Igκ轻链序列、非人Igκ轻链序列或它们的组合。在如本文所述的非人动物的许多实施方案中，非人序列为或包括鼠类序列(例如，小鼠或大鼠)。
在一些实施方案中，Igκ和/或Igλ轻链序列包含具有人和/或鼠类来源的基因间DNA。在一些实施方案中，Igκ和/或Igλ轻链序列包含基因间DNA，所述基因间DNA被工程改造且基于具有人或鼠类来源的来源序列。在一些实施方案中，所述基因间DNA具有相同的免疫球蛋白基因座，其中所述基因间DNA经放置、插入、定位或工程改造(例如Igκ轻链基因座中的Igκ基因间DNA)。在一些实施方案中，所述基因间DNA具有不同的免疫球蛋白基因座，其中所述基因间DNA经放置、插入、定位或工程改造(例如Igκ轻链基因座中的Igλ基因间DNA)。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物含有经工程改造的Igκ轻链基因座，所述经工程改造的Igκ轻链基因座含有基因间DNA，所述基因间DNA包含Igκ轻链序列、Igλ轻链序列和/或它们的组合。
在各种实施方案中，人源化免疫球蛋白重链基因座含有可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区(例如，包含一个或多个免疫球蛋白重链恒定区基因的内源性非人免疫球蛋白重链恒定区，例如IgM、IgD、IgG、IgE、IgA等)的至少一个人VH、至少一个人DH以及至少一个人JH基因区段，例如可操作地连接到非人免疫球蛋白重链恒定区的多个人VH、DH和JH基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物具有种系基因组，所述种系基因组包含附图中描绘的一个或多个免疫球蛋白基因座。此类经工程改造的非人动物提供人抗体和人抗体片段的来源，并且提供适于利用人Vλ序列产生人治疗性抗体的改进的体内系统。
如下文实施例部分所述，提供非人动物，所述非人动物具有基因组，所述基因组含有代替内源性免疫球蛋白基因座处的非人可变区基因区段的每个人重链(即VH、DH和JH)和轻链(例如，内源性κ基因座处的Vλ和Jλ)可变区基因区段中的至少一个，例如多个人重链(即VH、DH和JH)和轻链(例如，内源性κ基因座处的Vλ和Jλ)可变区基因区段，并且包括人可变区基因区段之间的人非编码基因间DNA。此类基因间DNA包括，例如，启动子、前导序列和重组信号序列，所述启动子、前导序列和重组信号序列允许在抗体的可变结构域的背景下适当重组和表达人基因区段。技术人员应了解，非人免疫球蛋白基因座还含有此类非编码基因间DNA。在阅读本发明后，本领域技术人员将理解，可使用其他人或非人基因间DNA构建此类基因座，从而在非人动物中的抗体的背景下产生人可变结构域的相同表达。此类相似的基因座仅需要含有所需人基因区段的人编码序列(即外显子)，以实现含有人可变结构域的抗体的表达。
在以下部分中详细描述了某些实施方案的各种方面，其中的每一者都可应用于如本文所述的任何方面或实施方案。部分的用途并非用于限制。
非人动物中的抗体库
免疫球蛋白(也称为抗体)为由宿主免疫系统的B细胞产生以中和病原体(例如，病毒，细菌等)的大的(约150kD)、Y形糖蛋白。每个免疫球蛋白(Ig)由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，所述重链和轻链各自具有两种结构组分：可变结构域和恒定结构域。重链和轻链可变区在由不同B细胞产生的抗体中为不同的，但对于由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体则为相同的。每种抗体的重链和轻链可变区共同包含所述抗原结合区(或抗原结合位点)。免疫球蛋白可以基于它们所含有的重链恒定区(或结构域)称为同种型或类别的不同变体形式存在。重链恒定区在相同同种型的所有抗体中为相同的，但在不同同种型的抗体中不同。下表总结小鼠和人的九种抗体同种型。
Figure BDA0002524439450000701
已在其他物种中发现了另外的同种型。由于不同同种型之间的不同结构特征，同种型赋予抗体特定的生物学性质，并且在动物体内的不同位置(细胞、组织等)中发现。最初，B细胞产生具有相同抗原结合区的IgM和IgD。在活化后，B细胞通过称为类别转换的过程转换为不同的同种型，其涉及由B细胞产生的抗体恒定区的变化，而可变区则保持相同，从而保留原始抗体的抗原特异性(B细胞)。
两个分离的基因座(Igκ和Igλ)含有基因区段，所述基因区段在重排后编码抗体的轻链，并且表现出等位基因和同种型排除。κ+与λ+B细胞的表达比例在各物种之间不同。例如，人展现约60:40(κ:λ)的比例。在小鼠和大鼠中，观察到95:5(κ:λ)的比例。令人感兴趣地，在猫中观察到的κ：λ比例(5:95)与小鼠和大鼠相反。已进行了若干研究以阐明这些观察到的比例背后的可能原因，并且已提出基因座的复杂性(即，基因区段的数量，特别是V基因区段)和基因区段重排的效率作为基本原理。人Igλ轻链基因座延伸超过1,000kb，并且含有组构成三个聚簇的约70个Vλ基因区段(29至33个功能性)和7个Jλ-Cλ基因区段对(4至5个功能性)(参见例如美国专利号9,006,511的图1，所述专利以引用的方式整体并入本文)。所表达的抗体库中观察到的Vλ区大多数由最近端聚簇(称为聚簇A)内包含的基因区段编码。小鼠Igλ轻链基因座与人基因座显著不同，并且取决于品系，仅含有组构成两个不同基因聚簇的少数Vλ和Jλ基因区段(参见例如美国专利号9,006,511中的图2，所述专利以引用的方式整体并入本文)。
用于治疗各种人疾病的治疗性抗体的开发主要集中于经工程改造的非人动物为的产生，特别为在其基因组中含有与人免疫球蛋白基因相应的不同量的遗传物质的经工程改造的啮齿动物品系(综述于如Brüggemann,M.等人,2015,Arch.Immunol.Ther.Exp.63:101-8，其以引用的方式整体并入本文)。产生此类经遗传工程改造的啮齿动物品系的最初努力集中于整合人免疫球蛋白基因座的部分，所述部分本身可支持基因区段的重组以及产生完全人重链和/或轻链，同时使内源性免疫球蛋白基因座失活(参见例如Brüggemann,M.等人,1989,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.86:67-09-13；Brüggemann,M.等人,1991,Eur.J.Immunol.21:1323-6；Taylor,L.D.等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Davies,N.P.等人,1993,Biotechnol.11:911-4；Green,L.L.等人,1994,Nat.Genet.7:13-21；Lonberg,N.等人,1994,Nature368:856-9；Taylor,L.D.等人,1994,Int.Immunol.6:579-91；Wagner,S.D.等人,1994,Eur.J.Immunol.24:2672-81；Fishwild,D.M.等人,1996,Nat.Biotechnol.14:845-51；Wagner,S.D.等人,1996,Genomics35:405-14；Mendez,M.J.等人,1997,Nat.Genet.15:146-56；Green,L.L.等人,1998,J.Exp.Med.188:483-95；Xian,J.等人,1998,Transgenics2:333-43；Little,M.等人,2000,Immunol.Today 21:364-70；Kellermann,S.A.以及L.L.Green,2002,Cur.Opin.Biotechnol.13:593-7，所述文献以引用的方式整体并入本文)。特别地，一些努力包括整合人Igλ轻链序列(参见例如美国专利申请公布号2002/0088016A1、2003/0217373A1和2011/0236378A1；美国专利号6,998,514和7,435,871；Nicholson,I.C.等人,1999,J.Immunol.163:6898-906；Popov,A.V等人,1999,J.Exp.Med.189(10):1611-19，所述文献以引用的方式整体并入本文)。此类努力集中于含有人Vλ、Jλ和Cλ序列的酵母人工染色体的随机整合，从而产生表达完全人Igλ轻链的小鼠品系(即人Vλ和Cλ结构域)。最近的努力采用了类似的策略，所述策略使用还含有人Vλ、Jλ和Cλ序列的构建体(Osborn,M.J.等人,2013,J.Immunol.190:1481-90；Lee,E-C.等人,2014,Nat.Biotech.32(4):356-63，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
然而，其他努力包括将人Vλ和Jλ基因区段特异性插入内源性啮齿动物Ig轻链基因座(κ和λ)，以使得所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至内源性Ig轻链恒定区基因(参见例如美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092；所述专利全部以引用的方式整体并入本文)。在此类动物中，来自聚簇A和B所有人Vλ基因区段以及一个或四个人Jλ基因区段插入内源性Igκ和Igλ轻链基因座中。结果，若干不同的人Vλ和Jλ基因区段在两个经工程改造的啮齿动物Ig轻链基因座处都展现适当的重排，以形成表达于啮齿动物抗体库中的功能性轻链，所述轻链在内源性Cκ和Cλ区域背景下包括人Vλ结构域(参见例如，美国专利号9,006,511的表7和图11-13，所述专利以引用的方式整体并入本文)。特别地，具有包含人Vλ和Jλ基因区段的经工程改造的Igκ轻链基因座的小鼠在脾隔室中展现人λ与内源性λ比例(通过IgCκ与IgCλ比例)为约1：1(参见例如，美国专利号9,006,511的表4，所述专利以引用的方式整体并入本文)。实际上，两种经工程改造的小鼠品系(即经工程改造的Igκ或经工程改造的Igλ轻链基因座)都证明，人Vλ结构域可由啮齿动物中的内源性Ig轻链基因座表达，这通常在轻链表达上展示很大的偏差(参见上文)。本公开提供了以下认识：可产生另一经工程改造的Ig轻链基因座结构，以最大化抗体库中的人Vλ和Jλ基因区段用于非人动物的治疗靶标用途，特别为，与包含Igλ轻链基因座的非人动物相比，所述轻链基因座缺乏通常与人Igλ轻链基因座(即，出现在人体细胞中的此类基因座)相关的复杂性和稳健质量(例如，小鼠和大鼠)。此类替代经工程改造的Ig轻链基因座结构提供由其设计产生的独特抗体库的能力。
本公开例示非人动物的成功产生，所述啮齿动物的种系基因组含有经工程改造的内源性Igκ轻链基因座，所述经工程改造的内源性Igκ轻链基因座包含多个人Vλ和Jλ基因区段，所述多个人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人或人Igλ轻链恒定区基因，其中所述非人或人Igλ轻链恒定区基因为插入内源性Igκ轻链基因座的非人Igκ轻链恒定区基因位置。特别地，本发明特别证明成功产生(1)表达具有人可变区和非人恒定区的抗体的经工程改造的非人动物，其中所述抗体包括含有人Vλ结构域和非人Cλ结构域的轻链，以及(2)表达具有人可变区和人恒定区的抗体的经工程改造的非人动物，其中所述抗体包括含有人Vλ和Cλ结构域的轻链。如本文具体举例说明的，通过将所述多个人Vλ和Jλ基因区段插入内源性Igκ轻链基因座(或等位基因)中来实现此类轻链的表达。在一些实施方案中，所提供的非人动物进行工程改造，以使内源性Igλ轻链可变区的表达失活(例如经由基因缺失)。
在一些实施方案中，所提供的非人动物进行工程改造，以使得内源性Igκ轻链可变区的表达失活(例如，通过置换或取代)。在一些实施方案中，将所提供的非人动物将所提供的非人动物进行工程改造，使非人动物表达来自经工程改造的内源性Igκ轻链基因座的人Igλ轻链可变区，以及来自经工程改造的内源性人Igκ轻链基因座的Igκ轻链可变区。因此，在至少一些实施方案中，本发明包括开发用于产生人抗体的改进的体内系统，通过提供含有另一工程改造Igκ轻链基因座的经工程改造的非人动物，其可表达包含人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域的抗体库。
核酸构建体
通常，含有人Igλ轻链序列(例如，人Vλ和Jλ基因区段)的多核苷酸分子或其部分与载体(优选为DNA载体)连接(例如插入)，以在宿主细胞中复制所述多核苷酸分子。
人Igλ轻链序列可直接由已知序列或来源(例如，文库)中克隆，或基于可从GenBank或其他公开可用数据库(例如，IMGT)获得的公开序列由计算机设计的种系序列合成。此外，细菌人工染色体(BAC)文库可提供目标免疫球蛋白DNA序列(例如，人Vλ和Jλ序列以及它们的组合)。BAC文库可含有100-150kb的插入片段大小，并且能够具有大至300kb的插入片段(Shizuya,等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:8794-8797；Swiatek,等人,1993,Genes and Development7:2071-2084；Kim,等人,1996,Genomics 34 213-218；所述文献以引用的方式整体并入本文)。例如，已描述了具有164-196kb的平均插入片段大小的人BAC文库(Osoegawa,K.等人,2001,Genome Res.11(3):483-96；Osoegawa,K.等人,1998,Genomics 52:1-8,文章编号GE985423，所述文献以引用的方式整体并入本文)。人和小鼠基因组BAC文库已被构建并可商购获得(例如，ThermoFisher)。基因组BAC文库还可充当免疫球蛋白DNA序列以及转录控制区的来源。
或者，可从酵母人工染色体(YAC)分离、克隆和/或转移免疫球蛋白DNA序列。例如，已确定人Igλ轻链基因座的核苷酸序列(参见例如Dunham,I.等人,1999,Nature 402:489-95，所述文献以引用的方式整体并入本文)。此外，YAC先前已用于组装人Igλ轻链基因座转基因(参见例如Popov,A.V.等人,1996,Gene 177:195-201；Popov,A.V.等人,1999,J.Exp.Med.189(10):1611-19，所述文献以引用的方式整体并入本文)。完整Igλ轻链基因座(人或啮齿动物)可被克隆并包含在若干YAC中。如果使用多个YAC并包含相似性重叠的区域，则它们可在酵母宿主菌株内重组，以产生代表整个基因座或基因座必要部分的单一构建体(例如，以靶向载体所靶向的区域)。YAC臂可通过工程改造方式，以哺乳动物选择盒额外修饰，以帮助通过本领域已知和/或本文描述的方法将构建体引入胚胎干细胞或胚胎中。
用于构建如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座的人Igλ轻链基因区段的DNA和氨基酸序列可由公开的数据库(例如，GenBank、IMGT等)和/或公开的抗体序列获得。在一些实施方案中，含有人Igλ轻链基因区段的核酸构建体包含J区(即，包含多个轻链J基因区段的基因组序列)，其中所述J区包含人Jλ基因区段的编码序列以及其相应的12RSS，其中所述12RSS已于非编码基因间DNA中定位，通常与人Jκ基因区段的编码序列以及其相应的23RSS缔合。
在一些实施方案中，这种序列可称为经工程改造的轻链J区。在一些实施方案中，含有人Igλ轻链基因区段的核酸构建体包含可操作地连接至人或非人Igλ轻链恒定区(Cλ)基因的人Vλ和Jλ序列。在一些实施方案中，含有人Igλ轻链基因区段的核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个非人Igκ轻链增强子区(或增强子序列)的人Vλ和Jλ序列。在某些实施方案中，含有人Igλ轻链基因区段的核酸构建体包含可操作地连接至非人或人Cλ区基因和非人Igκ轻链增强子区(或增强子序列)的人Vλ和Jλ序列。
在一些实施方案中，含有人Vλ和Jλ序列的核酸构建体还包含具有人和/或鼠类来源的基因间DNA。在一些实施方案中，基因间DNA为或包含非编码鼠类Igκ轻链序列、非编码人Igκ轻链序列、非编码鼠类Igλ轻链序列、非编码人Igλ轻链序列或它们的组合。
可使用本领域已知的方法制备核酸构建体。例如，核酸构建体可制备为较大质粒的一部分。这种制备允许以本领域已知的有效方式克隆和选择正确的构建体。如本文所述，含有人Igλ轻链序列的核酸构建体(全部或部分)可位于质粒上的限制性位点之间，以使得它们可从剩余的质粒序列中分离出，以并入所需的非人动物中。
用于制备核酸构建体(例如质粒)和转化宿主生物体的各种方法为本领域所已知。关于原核和真核细胞的其他适合表达系统以及一般重组程序，参见Principles of GeneManipulation:An Introduction to Genetic Manipulation,第5版,Old,R.W.和S.B.Primrose编,Blackwell Science,Inc.,1994以及Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Sambrook,J.等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
靶向载体
靶向载体可用于将核酸构建体引入基因组靶基因座中并且包含核酸构建体，以及位于所述核酸构建体侧翼的同源臂；本领域技术人员将意识到通常适用于靶向载体的设计、结构和/或用途的各种选择和特征。例如，靶向载体可呈线性形式或环状形式，且它们可为单链或双链。靶向载体可为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。为了便于参考，同源臂在本文中称为5'和3'(即上游和下游)同源臂。这一术语涉及同源臂与靶向载体内的核酸构建体的相对位置。5'和3'同源臂对应于靶向基因座内的区域或另一靶向载体内的区域，它们在本文中分别称为“5'靶序列”和“3’靶序列”。在一些实施方案中，同源臂还可作为5'或3'靶序列。
在一些实施方案中，本文描述的方法使用能够彼此重组的两种、三种或更多种靶向载体。在各种实施方案中，靶向载体为如本文其他地方所述的大靶向载体(LTVEC)。在此类实施方案中，第一、第二和第三靶向载体各自包含5'和3'同源臂。第一靶向载体的3'同源臂包含与第二靶向载体的5'同源臂重叠的序列(即重叠序列)，其允许第一LTVEC与第二LTVEC之间的同源重组。
在双重靶向方法中，第一靶向载体的5'同源臂和第二靶向载体的3'同源臂可类似于靶基因组基因座内的相应片段(即，靶序列)，其可促进第一靶向载体和第二靶向载体与相应的基因组片段的同源重组，并且修饰靶基因组基因座。
在三重靶向方法中，第二靶向载体的3'同源臂可包含与第三靶向载体的5'同源臂重叠的序列(即重叠序列)，其可允许第二LTVEC与第三LTVEC之间的同源重组。第一靶向载体的5'同源臂和第三靶向载体的3'同源臂类似于靶基因组基因座内的相应片段(即靶序列)，其可促进第一靶向载体和第三靶向载体与相应的基因组片段的同源重组，并且修饰靶基因组基因座。
同源臂和靶序列或两个同源臂在所述两个区域与彼此共享足够水平的序列同一性时“对应(correspond)”或“对应于(corresponding)”彼此以充当同源重组反应的底物。在靶向载体(即重叠序列)上或在两个同源臂之间发现的给定靶序列与相应的同源臂之间的序列同一性可为允许发生同源重组的任何程度的序列同一性。仅用于举例，靶向载体(或其片段)的同源臂与另一靶向载体的靶序列，或靶基因组基因座(或其片段)的靶序列共有的序列同一性可为，例如但不限于，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，以使得序列可进行同源性重组。
此外，同源臂与相应的靶序列之间的相应相似性(例如，同一性)区域可具有足以促进靶基因组基因座处的同源重组的任何长度。例如，给定同源臂和/或相应的靶序列可包含相应的相似性区域，所述似性区域的长度为例如但不限于，约5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb，或200-300kb(如本文其他地方所述)，以使得同源臂具有足够的相似性，以与细胞的靶基因组基因座内或另一靶向载体内的相应靶序列进行同源重组。在一些实施方案中，给定同源臂和/或相应的靶序列包含相应的相似性区域，所述相似性区域的长度例如但不限于，约10-100kb、15-100kb、20-100kb、25-100kb、30-100kb、35-100kb、40-100kb、45-100kb、50-100kb、55-100kb、60-100kb、65-100kb、70-100kb、75-100kb、80-100kb、85-100kb、90-100kb或95-100kb(如本文其他地方所述)，以使得同源臂具有足够的相似性，以与细胞的靶基因组基因座内或另一靶向载体内的相应靶序列进行同源重组。
第一靶向载体的3'同源臂和第二靶向载体的5'同源臂的重叠序列，或第二靶向载体的3'同源臂和第三靶向载体的5'同源臂的重叠序列可具有足以促进所述靶向载体之间同源重组的任何长度。例如，同源臂的给定重叠序列可包含相应的重叠区域，所述重叠区域的长度为约1-5kb、5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb或200-300kb，以使得同源臂具有足够的相似性，以与细胞的靶基因组基因座内或另一靶向载体内的相应靶序列进行同源重组。在一些实施方案中，同源臂的给定重叠序列包含重叠区域，所述重叠区域的长度为约1-100kb、5-100kb、10-100kb、15-100kb、20-100kb、25-100kb、30-100kb、35-100kb、40-100kb、45-100kb、50-100kb、55-100kb、60-100kb、65-100kb、70-100kb、75-100kb、80-100kb、85-100kb、90-100kb或95-100kb，以使得同源臂的重叠序列具有足够的相似性，以与细胞的靶基因组基因座内或另一靶向载体内的相应靶序列进行同源重组。在一些实施方案中，重叠序列为1-5kb(包括端值)。在一些实施方案中，重叠序列为约1kb至约70kb(包括端值)。在一些实施方案中，重叠序列为约10kb至约70kb(包括端值)。在一些实施方案中，重叠序列为约10kb至约50kb(包括端值)。在一些实施方案中，重叠序列为至少10kb。在一些实施方案中，重叠序列为至少20kb。例如，重叠序列可为约1kb至约5kb(包括端值)、约5kb至约10kb(包括端值)、约10kb至约15kb(包括端值)、约15kb至约20kb(包括端值)、约20kb至约25kb(包括端值)、约25kb至约30kb(包括端值)、约30kb至约35kb(包括端值)、约35kb至约40kb(包括端值)、约40kb至约45kb(包括端值)、约45kb至约50kb(包括端值)、约50kb至约60kb(包括端值)、约60kb至约70kb(包括端值)、约70kb至约80kb(包括端值)、约80kb至约90kb(包括端值)、约90kb至约100kb(包括端值)、约100kb至约120kb(包括端值)、约120kb至约140kb(包括端值)、约140kb至约160kb(包括端值)、约160kb至约180kb(包括端值)、约180kb至约200kb(包括端值)、约200kb至约220kb(包括端值)、约220kb至约240kb(包括端值)、约240kb至约260kb(包括端值)、约260kb至约280kb(包括端值)，或约280kb至约300kb(包括端值)。仅用于举例，重叠序列可为约20kb至约60kb(包括端值)。此外，重叠序列可为至少1kb、至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少45kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少120kb、至少140kb、至少160kb、至少180kb、至少200kb、至少220kb、至少240kb、至少260kb、至少280kb，或至少300kb。在一些实施方案中，重叠序列可为至多400kb、至多350kb、至多300kb、至多280kb、至多260kb、至多240kb、至多220kb、至多200kb、至多180kb、至多160kb、至多140kb、至多120kb、至多100kb、至多90kb、至多80kb、至多70kb、至多60kb或至多50kb。
在一些实施方案中，同源臂对应于对于细胞而言天然的基因座(例如，靶向基因座)，或者可替代地它们对应于整合至细胞的基因组中的异源或外源DNA片段，包括例如转基因、表达盒，或DNA的异源或外源区。在一些实施方案中，同源臂可对应于细胞中靶向载体上的一个区域。在一些实施方案中，靶向载体的同源臂可对应于酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人工染色体，或适当宿主细胞中包含的任何其他工程改造区域。此外，靶向载体的同源臂可对应于或衍生自BAC文库、粘粒库，或P1噬菌体库的区域。在一些实施方案中，靶向载体的同源臂对应于原始、异源或外源于原核生物、酵母菌、鸟类(例如鸡)、非人哺乳动物、啮齿动物、人、大鼠、小鼠、仓鼠、兔子、猪、牛、鹿、羊、山羊、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猿、恒河猴)、家养哺乳动物、农业哺乳动物，或任何其他目标生物体。在一些实施方案中，同源臂对应于细胞的基因座，所述基因座在没有由核酸酶剂(例如Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下显示使用常规方法靶向的灵敏度有限或显示在靶向位点相对低水平的成功整合，和/或显著水平的脱靶整合。在一些实施方案中，同源臂被设计为包含经工程改造的DNA。
在一些实施方案中，靶向载体的5'和3'同源臂对应于靶向基因组。或者，同源臂对应于相关基因组。例如，靶向基因组为第一品系的小鼠基因组，并且靶向臂对应于第二品系的小鼠基因组，其中第一品系和第二品系不同。在某些实施方案中，同源臂对应于同一动物的基因组，或来自同一品系的基因组，例如，靶向基因组为第一品系的小鼠基因组，并且靶向臂对应于来自同一小鼠或同一品系的小鼠基因组。
靶向载体的同源臂可具有足以促进与相应靶序列的同源重组事件的任何长度，包括例如长度1-5kb(包括端值)、5-10kb(包括端值)、5-15kb(包括端值)、5-20kb(包括端值)、5-25kb(包括端值)、5-30kb(包括端值)、5-35kb(包括端值)、5-40kb(包括端值)、5-45kb(包括端值)、5-50kb(包括端值)、5-55kb(包括端值)、5-60kb(包括端值)、5-65kb(包括端值)、5-70kb(包括端值)、5-75kb(包括端值)、5-80kb(包括端值)、5-85kb(包括端值)、5-90kb(包括端值)、5-95kb(包括端值)、5-100kb(包括端值)、100-200kb(包括端值)或200-300kb(包括端值)。在一些实施方案中，靶向载体的同源臂具有足以促进与相应靶序列的同源重组事件的长度，所述长度为长度1-100kb(包括端值)、5-100kb(包括端值)、10-100kb(包括端值)、15-100kb(包括端值)、20-100kb(包括端值)、25-100kb(包括端值)、30-100kb(包括端值)、35-100kb(包括端值)、40-100kb(包括端值)、45-100kb(包括端值)、50-100kb(包括端值)、55-100kb(包括端值)、60-100kb(包括端值)、65-100kb(包括端值)、70-100kb(包括端值)、75-100kb(包括端值)、80-100kb(包括端值)、85-100kb(包括端值)、90-100kb(包括端值)或95-100kb(包括端值)。如本文所述，大靶向载体可采用具有更大长度的靶向臂。
核酸酶剂(例如，CRISPR/Cas系统)可与靶向载体组合使用，以促进靶基因座的修饰(例如，修饰Igκ轻链基因座，或修饰先前已修饰的或已工程改造的Igκ轻链基因座)。此类核酸酶剂可促进靶向载体与靶基因座之间的同源重组。当核酸酶剂与靶向载体组合使用时，靶向载体可包含5'和3'同源臂，所述5'和3'同源臂对应于位于足够接近核酸酶裂解位点的5'和3'靶序列，以在核酸酶裂解位点处的切口或双链断裂促进靶序列与同源臂之间的同源重组事件的发生。术语“核酸酶裂解位点”包括DNA序列，在所述DNA序列处(例如，Cas9裂解位点)通过核酸酶剂产生切口或双链断裂。靶向基因座内对应于靶向载体的5'和3'同源臂的靶序列“足够接近”核酸酶裂解位点，如果所述距离在识别位点处的切口或双链断裂上，促进5’和3’靶序列与同源臂之间的同源重组事件的发生。因此，在某些实施方案中，对应于靶向载体的5'和/或3'同源臂的靶序列在给定识别位点的至少一个核苷酸内，或在给定识别位点的至少10个核苷酸至约14kb内。在一些实施方案中，核酸酶裂解位点紧邻所述靶序列的至少一者或两者。
对应于靶向载体和核酸酶裂解位点的同源臂的靶序列的空间关为可变化。例如，靶序列可位于核酸酶裂解位点的5'、靶序列可位于识别位点的3'，或靶序列可位于核酸酶裂解位点的侧翼。
与单独使用靶向载体相比，靶向载体(包括例如大靶向载体)与核酸酶剂组合使用可使靶向效率增加。例如，与仅使用靶向载体时相比，当靶向载体与核酸酶剂结合使用时，靶向载体的靶向效率可增加至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍，或在由这些整数形成的范围内，如2-10倍。
一些靶向载体为“大靶向载体”或“LTVEC”，所述靶向载体包括靶向载体，包含对应于并源自于核酸序列(大于通常由意图在细胞中进行同源重组的其他方法使用的那些)的同源臂。LTVEC的长度可为如至少10kb，或者5'同源臂和3'同源臂的总和可为例如至少10kb。LTVEC还包括靶向载体，所述靶向载体包含大于通常由在细胞中进行同源重组的其他方法所用的核酸构建体的核酸构建体。例如，由于LTVEC的大小限制，LTVEC可使传统基于质粒的靶向载体无法容纳的大基因座修饰成为可能。例如，靶向基因座可为(即，5'和3'同源臂可对应于)细胞的基因座，在由核酸酶剂(例如Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂不存在下所述基因座不能使用常规方法靶向，或仅可被错误地靶向或以显著的低效率靶向。
在一些实施方案中，本文描述的方法使用能够在三向或四向重组事件中彼此重组并与靶基因组基因座重组的两种或三种LTVEC。此类方法使得使用单一LTVEC不能实现的大基因座修饰成为可能。
LTVEC的实例包括源自细菌人工染色体(BAC)、人工人染色体或酵母人工染色体(YAC)的载体。LTVEC可呈线性形式或圆形形式。LTVEC的实例和制备它们的方法描述于例如美国专利号6,586,251、6,596,541和7,105,348；以及国际专利申请公布号WO 2002/036789中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
提供非人动物、细胞和组织
提供了表达(例如，其B细胞表达)抗体的非人动物，所述抗体含有轻链，所述轻链包含由对应于人Igλ轻链基因座(即，人Vλ和Jλ基因区段的至少一部分)的至少一部分的遗传物质的整合而产生的人Vλ结构域，并且所述轻链编码人Vλ结构域(即重排的人Vλ-Jλ序列)，位于非人动物的种系基因组中相应的非人Igκ轻链可变区序列处。本文描述的适合实例包括但不限于啮齿动物，特别是小鼠。
本公开提供用于鉴定和开发例如，可用于治疗影响人的各种疾病的新抗体、抗体组分(例如，抗原结合部分和/或包含它们的组合物或形式)和/或基于抗体的治疗剂的改进的体内系统。此外，本公开还涵盖认识到具有经工程改造的免疫球蛋白基因座，如经工程改造的免疫球蛋白(Ig)κ(κ)轻链基因座和/或以其他方式表达、产生或含有抗体库的非人动物(例如，啮齿动物)是有用的，所述非人动物的特征在于具有人Vλ(λ)区的轻链。例如，在一些实施方案中，此类非人动物可用于在鉴定和开发出新的基于抗体的治疗剂中利用人Vλ序列的多样性。在一些实施方案中，本文所述的非人动物提供用于开发用于施用至人的抗体和/或基于抗体的治疗剂的改进的体内系统。在一些实施方案中，本文所述的非人动物提供用于开发抗体和/或基于抗体的治疗剂的改进的体内系统，所述抗体或基于抗体的治疗剂含有人Vλ结构域，特征在于与从含有人Vλ区序列的现有体内系统获得的抗体和/或基于抗体的治疗剂相比性能(例如，于抗原特异性抗体库中表达和/或证明)改进。
本公开尤其提供了具有Igκ轻链基因座的非人动物，所述Igκ轻链基因座含有经工程改造的免疫球蛋白轻链可变区和经工程改造的免疫球蛋白轻链恒定区基因。如本文所述，所提供的非人动物在它们的种系基因组中含有免疫球蛋白κ轻链基因座，所述免疫球蛋白κ轻链基因座包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链可变区，所述经工程改造的免疫球蛋白κ轻链可变区的特征在于存在一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段，所述一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至免疫球蛋白λ轻链恒定区(Cλ)基因，所述免疫球蛋白λ轻链恒定区(Cλ)基因位于所述非人动物的内源性免疫球蛋白κ基因座的非人免疫球蛋白κ轻链恒定区(Cκ)基因处。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含Igκ轻链基因座，所述Igκ轻链基因座含有基因间DNA，所述基因间DNA的起源为免疫球蛋白λ轻链和/或免疫球蛋白κ轻链以及它们的组合。
在许多实施方案中，经工程改造的免疫球蛋白κ轻链可变区还包含免疫球蛋白κ轻链序列，所述免疫球蛋白κ轻链序列定位或插入在所述一个或多个人Vλ基因区段与一个或多个人Jλ基因区段之间。在一些实施方案中，所述定位或插入在所述一个或多个人Vλ基因区段与一个或多个人Jλ基因区段之间的免疫球蛋白κ轻链序列为或包含鼠类(例如，大鼠或小鼠)序列。在一些实施方案中，所述定位或插入在所述一个或多个人Vλ基因区段与一个或多个人Jλ基因区段之间的免疫球蛋白κ轻链序列为或包含人序列。例如，在一些实施方案中，人免疫球蛋白κ轻链序列为或包含基因组序列，所述基因组序列天然地在人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现。
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24或至少25个功能性人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含5至25、5至24、5至23、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、5至7或5至6个功能性人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含6至25、7至25、8至25、9至25、10至25、11至25、12至25、13至25、14至25、15至25、16至25、17至25、18至25、19至25、20至25、21至25、22至25、23至25或24至25个功能性人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含6至24、7至23、8至22、9至21、10至20、11至19、12至18、13至17、14至16或15至16个功能性人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含6至24、7至23、8至22、9至21、10至20、11至19、12至18、13至17或14至16个功能性人Vλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含总共10至70、10至65、10至60、10至55、10至50、10至45、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20或10至15个人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含总共15至70、20至70、25至70、30至70、35至70、40至70、45至70、50至70、55至70、60至70或65至70个人Vλ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物包含总共15至65、20至60、25至55、20至50、25至45、30至40、30至35或35至40个人Vλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人动物含有呈天然或种系构型的人Vλ和/或Jλ基因区段(例如，含有多个人Vλ和/或Jλ基因区段编码序列、其间散布有非编码人免疫球蛋白λ轻链序列的DNA序列)。在一些实施方案中，所提供的非人动物含有呈远离或偏离天然或种系构型的构型的人Vλ和/或Jλ基因区段(例如，含有多个人Vλ和/或Jκ基因区段编码序列、其间散布有非编码免疫球蛋白κ轻链序列(例如人或鼠类)的DNA序列)。在一些实施方案中，所提供的非人动物含有呈并非天然出现在人细胞的种系基因组的人免疫球蛋白λ轻链基因座中的构型的人Vλ和/或Jλ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人动物在内源性非人Igκ轻链基因座处含有DNA序列，所述DNA序列包含多个人Vλ和Jλ编码序列，其间散布(或并置、缔合等)有非编码人免疫球蛋白轻链序列(例如，κ，λ以及它们的组合)。在一些实施方案中，所提供的非人动物在内源性非人Igλ轻链基因座处包含DNA序列，所述DNA序列包含多个人Vλ和Jλ编码序列，其间散布有非编码非人(例如鼠类)免疫球蛋白λ轻链序列。
在一些实施方案中，所提供的非人动物的特征在于从所述非人动物的种系基因组中的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座表达抗体，所述抗体含有(1)人Vλ结构域和(2)非人或人Cλ结构域。在一些实施方案中，所提供的非人动物的特征在于与一种或多种参考经工程改造的非人动物相比，来自经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vλ区域的利用率改进(例如，但不限于约2倍)。
在一些实施方案中，提供一种非人动物、非人细胞或非人组织，所述非人动物、非人细胞或非人组织的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：(a)一个或多个人Vλ基因区段，(b)一个或多个人Jλ基因区段和(c)Cλ基因，其中(a)和(b)可操作地连接至(c)，并且其中所述啮齿动物在所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
在一些实施方案中，提供一种非人动物、非人细胞或非人组织，所述非人动物、非人细胞或非人组织的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段和Cλ基因，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且所述Cλ基因插入于所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的非人Cκ基因处。在非人动物、非人细胞或非人组织的许多实施方案中，插入于内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的非人Cκ基因处的Cλ基因为非人或人Cλ基因。在一些实施方案中，非人Cλ基因为或包括选自由以下组成的组的哺乳动物Cλ基因：灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物Cλ基因。
在一些实施方案中，非人Cλ基因为或包括啮齿动物Cλ基因。
在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包括小鼠Cλ基因。在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自由以下组成的组的小鼠Cλ基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列：小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3。在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自由小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3组成组的小鼠Cλ基因基本上相同或相同的序列。在一些实施方案中，小鼠Cλ1基因为或包含SEQ ID NO:1。在某些实施方案中，小鼠Cλ2基因为或包含SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，小鼠Cλ3基因为或包含SEQ ID NO:5。在某些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与小鼠Cλ1基因相同的序列。
在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自由以下组成的组的小鼠Cλ基因80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％相同的序列：小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3。在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自由以下组成的组的小鼠Cλ基因80％至98％、80％至95％、80％至90％或80％至85％相同的序列：小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3。在一些实施方案中，小鼠Cλ基因包含与选自由以下组成的组的小鼠Cλ基因85％至98％、90％至95％或88％至93％相同的序列：小鼠Cλ1、小鼠Cλ2和小鼠Cλ3。
在一些实施方案中，啮齿动物Cλ基因为或包含大鼠Cλ基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自由以下组成组的大鼠Cλ基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列：大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自由大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因组成组的大鼠Cλ基因基本上相同或相同的序列。在某些实施方案中，大鼠Cλ1基因为或包含SEQ ID NO:7。在某些实施方案中，大鼠Cλ2基因为或包含SEQ ID NO:9。在某些实施方案中，大鼠Cλ3基因为或包含SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，大鼠Cλ4基因为或包含SEQ ID NO:13。
在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自由以下组成组的大鼠Cλ基因80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％相同的序列：大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自由以下组成组的大鼠Cλ基因80％至98％、80％至95％、80％至90％或80％至85％相同的序列：大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因。在一些实施方案中，大鼠Cλ基因包含与选自由以下组成组的大鼠Cλ基因85％至98％、90％至95％，或88％至93％相同的序列：大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3和大鼠Cλ4基因。
在一些实施方案中，人Cλ基因包含与选自由以下组成组的人Cλ基因至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列：人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因。在一些实施方案中，人Cλ基因包含与选自由以下组成组的人Cλ基因基本上相同或相同的序列：人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因。在一些实施方案中，人Cλ基因包含一序列，其相同于选自由人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因组成组的人Cλ基因。在某些实施方案中，人Cλ1基因为或包含SEQ ID NO:15。在某些实施方案中，人Cλ2基因为或包含SEQID NO:17。在某些实施方案中，人Cλ3基因为或包含SEQ ID NO:19。在某些实施方案中，人Cλ6基因为或包含SEQ ID NO:21。在某些实施方案中，人Cλ7基因为或包含SEQ ID NO:23。在某些实施方案中，人Cλ基因为或包含人Cλ2基因。
在一些实施方案中，人Cλ基因包含与选自由以下组成组的人Cλ基因80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％相同的序列：人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因。在一些实施方案中，人Cλ基因包含与选自由以下组成组的人Cλ基因80％至98％、80％至95％、80％至90％或80％至85％相同的序列：人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因。在一些实施方案中，人Cλ基因包含与选自由以下组成组的人Cλ基因85％至98％、90％至95％或88％至93％相同的序列：人Cλ1、人Cλ2、人Cλ3、人Cλ6和人Cλ7基因。
在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段的插入置换内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的非人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，插入包括天然地出现在人Vλ基因区段与Jλ基因区段之间的人非编码DNA以及它们的组合。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段的插入代替或置换内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的非人Vκ和Jκ基因区段。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入至少24个、至少34个、至少52个、至少61个或至少70个人Vλ基因区段，以及至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个人Jλ基因区段。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入39个人Vλ基因区段和至少5个人Jλ基因区段。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，以及人J Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。在一些实施方案中，插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及人非编码DNA(全部或部分)，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。在一些实施方案中，插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人κ轻链基因座中的人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。在一些实施方案中，人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合的插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，并且人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合的插入包括人非编码DNA(整体或部分)，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7出现。在一些实施方案中，人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合的插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，并且人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合的插入包括人非编码DNA(整体或部分)，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人κ轻链基因座中的人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，如本文所述的免疫球蛋白κ轻链基因座还包含人免疫球蛋白κ轻链序列，所述人免疫球蛋白κ轻链序列位于一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段、一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段以及它们的组合之间。在一些实施方案中，如本文所述的人免疫球蛋白κ轻链序列为或包含天然地在免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的基因组序列。
在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，所述非人动物、非人细胞或非人组织的种系基因组还包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含插入一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至内源性免疫球蛋白重链基因座处的非人免疫球蛋白重链恒定区(参见例如，美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，插入一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段代替或置换(全部或部分地)非人VH、DH和JH基因区段(例如，用人VH、DH合JH基因区段的编码序列定位性地代替或置换非人VH、DH合JH基因区段的编码序列)。在某些实施方案中，插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地出现在位于人VH、DH和JH基因区段以及它们的组合之间。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区为或包含内源性非人免疫球蛋白重链恒定区。在许多实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区(例如，内源性)包含一个或多个非人免疫球蛋白重链恒定区基因或基因区段(例如，IgM、IgD、IgG、IgE、IgA等)。在某些实施方案中，如本文所述的免疫球蛋白重链基因座包含插入人VH基因区段VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，人DH基因区段DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，以及人JH基因区段JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。在某些实施方案中，插入包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性重链基因座中的人VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2，或VH6-1出现；人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于人DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26或DH7-27出现；以及人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性重链基因座中的人JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH出现。
在一些实施方案中，本文描述的非人动物在其基因组(例如，其种系基因组)中包含Adam6基因，所述Adam6基因编码ADAM6多肽、其功能性直向同源物，功能性同源物或功能性片段(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段由Adam6基因表达。在一些实施方案中，Adam6基因并非源自包含Adam6基因的非人动物(例如，包含大鼠Adam6基因或从另一小鼠品系获得的小鼠Adam6基因的小鼠)。在一些实施方案中，本文描述的非人动物包括异位Adam6基因。如本文所用，“异位”Adam6基因是指在与野生型非人动物中出现的Adam6基因处于不同背景中的Adam6基因。例如，Adam6基因可位于不同的染色体上、位于不同的基因座处或者位于不同序列附近。示例性异位Adam6基因为位于人免疫球蛋白序列(例如，人重链可变区基因区段)内的小鼠Adam6基因。在一些实施方案中，本文描述的非人动物包括插入或整合的Adam6基因。
在一些实施方案中，本文描述的非人动物包括在其基因组(例如，其种系基因组)中插入编码一种或多种非人Adam6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文描述的非人动物在其基因组(例如，其种系基因组)中包含编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，本文描述的非人动物在其基因组(例如其种系基因组)中包含小鼠Adam6a基因和/或小鼠Adam6b基因。在一些实施方案中，本文描述的非人动物包含编码小鼠ADAM6a、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段和/或小鼠ADAM6b、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于内源性免疫球蛋白重链基因座的同一染色体上。在一些实施方案中，编码非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于使得所述编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与人免疫球蛋白重链可变区基因区段邻接的位置中。在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于使得所述编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列邻近于人免疫球蛋白重链可变区基因区段的位置中。在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于使得所述编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人免疫球蛋白重链可变区基因区段之间的位置中。在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于第一与第二人VH基因区段之间。在一些实施方案中，第一人VH基因区段为人VH1-2，并且第二人VH基因区段为人VH6-1。在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入和/或位于人Adam6假基因处。在一些实施方案中，编码一种或多种非人ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列插入人VH基因区段与人DH基因区段之间。
在一些实施方案中，本文描述的非人动物包括恢复或增强ADAM6活性的Adam6基因。在一些实施方案中，Adam6基因将ADAM6活性恢复至包含功能性、内源性Adam6基因的可比较的非人动物的水平。在一些实施方案中，Adam6基因将ADAM6活性增强至为不包含功能性Adam6基因的可比较非人动物的ADAM6活性的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的水平。
在一些实施方案中，本文描述的非人动物包括恢复或增强雄性非人动物生育力的Adam6基因。在一些实施方案中，Adam6基因将雄性非人动物的生育力恢复至包含功能性、内源性Adam6基因的可比较非人动物的水平。在一些实施方案中，Adam6基因恢复雄性非人动物的生育力，以使得所述雄性非人动物通过交配产生的幼崽数量为由不包含所述功能性Adam6基因的可比较雄性非人动物的可比较交配产生的幼崽数量的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。在一些实施方案中，Adam6基因增强雄性非人动物的生育力，以使得所述雄性非人动物通过交配产生的幼崽数量为由不包含所述功能性Adam6基因的可比较雄性非人动物的可比较交配产生的幼崽数量的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
在一些实施方案中，如本文所述的非人免疫球蛋白重链基因座缺乏至少一个内源性非人Adam6基因。在一些实施方案中，缺乏至少一个内源性非人Adam6基因降低缺乏内源性非人Adam6基因的雄性小鼠的ADAM6活性和/或生育力。在一些实施方案中，如本文所述的非人免疫球蛋白重链基因座包括至少一个内源性非人Adam6基因的破坏。在一些实施方案中，至少一个内源性非人Adam6基因的破坏降低缺乏内源性非人Adam6基因的雄性小鼠的ADAM6活性和/或生育力。
在非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，所述非人动物、非人细胞或非人组织对于内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的或杂合的，如本文所述。
在非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，所述非人动物、非人细胞或非人组织对于内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的或杂合的，如本文所述。
在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座完全或部分缺失。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，内源性免疫球蛋白λ轻链基因座功能性沉默或以其他方式不具功能性(例如，通过基因靶向)。在所提供的非人动物、非人细胞或非人组织的一些实施方案中，所述非人动物、非人细胞或非人组织对于功能性沉默或以其他方式不具功能的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的或杂合的，如本文所述。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织不会可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链、内源性免疫球蛋白κ轻链或内源性免疫球蛋白λ轻链以及内源性免疫球蛋白κ轻链。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织具有基因组，所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
在一些实施方案中，转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
在一些实施方案中，编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
在一些实施方案中，所述TdT为人TdT。在一些实施方案中，所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
在一些实施方案中，人Igλ轻链序列包含来自(例如，分离或获自)人Igλ轻链基因座或与人Igλ轻链基因座相同的遗传物质，其中所述人Igλ轻链序列编码Ig轻链，所述Ig轻链包含来自人Igλ轻链基因座的遗传物质的编码部分。在一些实施方案中，如本文所述的人Igλ轻链序列包含至少一个人Vλ基因区段和至少一个人Jλ基因区段，以及促进所述至少一个人Vλ基因区段与所述至少一个人Jλ基因区段重排以形成编码人Vλ结构域的功能性重排的人Vλ-Jλ序列所必需的一个或多个序列(例如，重组信号序列)。在许多实施方案中，人Igλ轻链序列包含多个人Vλ和Jλ基因区段，以及促进所述人Vλ基因区段与Jλ基因区段的重排所必需的一个或多个序列。在许多实施方案中，人Igλ轻链序列包含一个或多个人Vλ基因区段的至少编码序列(例如，外显子)，以及一个或多个人Jλ基因区段的至少编码序列(例如，外显子)。在一些实施方案中，如本文所述的人Igλ轻链序列为人Igλ轻链基因座的基因组序列(例如，从细菌人工染色体分离和/或克隆)，并且含有多个呈种系构型的人Vλ基因区段。在一些实施方案中，人Igλ轻链序列包含呈种系构型的人Vλ和Jλ序列(即基因区段)(即，通过干预DNA而分离的多个人Vλ基因区段，所述DNA包含重组所必需和促进重组的序列；以及通过干预DNA而分离的多个Jλ基因区段，所述DNA包含重组所必需和促进重组的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的人Igλ轻链序列为经工程改造的序列，并且包含构型不同于在人细胞中的人Igλ轻链基因座中出现的构型的多个人Jλ基因区段。在一些实施方案中，如本文所述的人Igλ轻链序列为经工程改造的序列，并且包含构型相似于或类似于在野生型鼠类或人细胞的Igκ轻链基因座中出现的构型的多个人Vλ和Jλ基因区段。在一些实施方案中，人Igλ轻链序列包含经工程改造的人Jλ序列(即，通过从头DNA合成制备的人Jλ基因区段的编码序列，所述编码序列包含与一个或多个人Vλ基因区段重组所必需和促进所述重组的序列。在一些实施方案中，人Igλ轻链序列包含分别天然地在Igκ与Igλ基因组序列中分开出现的Igκ和Igλ序列。在某些实施方案中，人Igλ轻链序列包含Igκ序列，特别为Jκ区域(即，含有编码和非编码序列的序列，所述编码和非编码序列出现在含有多个Jκ基因区段的区域中)，所述Igκ序列天然地出现在Igκ轻链基因座中，除了所述Igκ序列分别在Jκ基因区段和Jκ23RSS的相应编码序列的位置上含有Jλ基因区段和Jλ12RSS的编码序列之外。在某些实施方案中，人Igλ轻链序列在Jκ区域序列的Jκ基因区段和Jκ23RSS的位置中包含多个Jλ基因区段和Jλ12RSS。在各种实施方案中，包含重组所必需和促进重组的序列的干预(或基因间)DNA包含人Igκ和/或人Igλ基因组序列。或者，并且在一些实施方案中，包含重组所必需和促进重组的序列的干预(或基因间)DNA包含鼠类Igκ和/或鼠类Igλ基因组序列。
在某些实施方案中，人Igλ轻链序列为或包含出现在附图中的序列。在一些实施方案中，人Igλ轻链序列编码或能够编码(例如，在人基因区段重排后)Vλ结构域多肽，所述Vλ结构域多肽出现在免疫球蛋白中，特别是由人B细胞表达的免疫球蛋白。还提供了用于制备非人动物、非人胚胎和细胞的非人动物、胚胎、细胞和靶向构建体，所述非人动物、非人胚胎和细胞在相应非人Igκ轻链序列(例如，内源性啮齿动物Igκ轻链基因座)的位置中含有所述人Igλ轻链序列。
在一些实施方案中，人Igλ轻链序列插入非人动物的种系基因组内的相应非人Igκ轻链序列的位置中。在一些实施方案中，人Igλ轻链序列插入非人Igλ轻链序列(例如，非人Igλ轻链恒定区基因序列)的上游，所述非人Igλ轻链序列位于非人Igκ轻链序列的位置中(例如，非人Igκ轻链恒定区基因序列)。在一些实施方案中，人Igκ轻链序列插入所述人Igλ轻链序列的中间段(即，介于人Vλ与Jλ基因区段之间)，以使得所述人Igκ轻链序列与人Igλ轻链序列并置。
在一些实施方案中，非人Igκ轻链基因座处的所有或基本上所有的可变区被一个或多个人Igλ轻链序列(如本文所述)代替或置换，并且所述一个或多个人Igλ轻链序列可操作地连接至非人或人Igλ轻链恒定区基因。在一些实施方案中，非人Igκ轻链恒定区基因在包括如本文所述的人Igλ轻链序列的非人动物中缺失或被取代。在一个非限制性实例中，在插入非人Igκ轻链基因座的人Igλ轻链序列的情况下，所述插入为以保持插入点(例如，非人Igκ内含子增强子，和/或非人Igκ3'增强子)附近的非人Igκ轻链增强子区(或增强子序列)的完整性的方式进行。因此，此类非人动物具有可操作地连接至人和非人Igλ轻链序列(例如，人Vλ和Jλ基因区段以及非人Cλ区域基因)或可操作地连接至人Igλ轻链序列(例如人Vλ和Jλ基因区段以及人Cλ区域基因)的野生型Igκ轻链增强子区域(或增强子序列)。在一些实施方案中，用如本文所述的一个或多个人Igλ轻链序列改变、置换、破坏、缺失、取代或工程改造的非人Igκ轻链基因座为鼠类Igκ轻链基因座。在一些实施方案中，如本文所述的一个或多个人Igλ轻链序列插入所述非人Igκ轻链基因座的两个拷贝的非人Igκ轻链基因座的一个拷贝(即等位基因)中，从而产生非人动物，所述非人动物关于人Igκ轻链序列为杂合的。在关于人Igκ轻链序列为杂合的非人动物的一些实施方案中，所述非人动物包含插入所述非人Igκ轻链基因座的另一个拷贝(即，等位基因)中的一个或多个人Igκ轻链序列。在一些实施方案中，提供了一种非人动物，所述非人动物对于Igκ轻链基因座为纯合的，所述Igκ轻链基因座包含如本文所述的一个或多个人Igλ轻链序列。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的非人Igκ轻链基因座包含人Vλ基因区段和Jλ基因区段，所述人Vλ基因区段和Jλ基因区段可操作地连接至非人或人Igλ轻链恒定区基因，其中所述非人或人Igλ轻链恒定区基因位于非人Igκ轻链恒定区基因处，所述非人Igκ轻链恒定区基因出现在同一物种的非人动物的野生型Igκ轻链基因座中。
在一些实施方案中，内源性非人Igλ轻链基因座的一个或多个内源性非人Igλ轻链序列(或其部分)未缺失。在一些实施方案中，内源性非人Igλ轻链基因座的一个或多个内源性非人Igλ轻链序列(或其部分)缺失。在一些实施方案中，内源性非人Igλ轻链基因座的一个或多个内源性非人Igλ轻链序列(例如，V、J和/或C或它们的任何组合)被改变、置换、破坏、缺失或取代，以使得所述非人Igλ轻链基因座为功能性沉默。在一些实施方案中，内源性非人Igλ轻链基因座的一个或多个内源性非人Igλ轻链序列(例如，V、J和/或C或它们的任何组合)被改变、置换、破坏、缺失或用靶向载体取代，以使得所述非人Igλ轻链基因座为功能性失活(即，不能产生在非人动物的抗体库中表达和/或可检测的抗体的功能性轻链)。例如美国专利号9,006,511(参见例如图2)中提供了内源性非人Igλ轻链基因座失活的指南，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，非人动物含有如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座，所述经工程改造的Igκ轻链基因座随机整合至其基因组中(例如，作为随机整合的人Igλ轻链序列的一部分)。因此，此类非人动物可被描述为具有人Igλ轻链转基因，所述人Igλ轻链转基因含有多可操作地连接至非人或人Igλ轻链恒定区基因，以及非人Igκ轻链增强子区域(或增强子序列)的个人Vλ和Jλ基因区段，以使得所述人Vλ和Jλ基因区段能够重排并编码非人动物表达库中的抗体的Ig轻链，其中所述Ig轻链包含人Vλ结构域和非人Cλ结构域，或所述Ig轻链包含人Vλ和Cλ结构域。可使用多种方法检测如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座或转基因，包括如PCR、蛋白质印迹、RNA印迹、限制片段长度多态性(RFLP)或等位基因获得或缺失测定。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物对于经工程改造的Igκ轻链基因座为杂合的，如本文所述。在一些实施方案中，本文所述的非人动物的经工程改造的Igκ轻链基因座为半合子，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物含有经工程改造的Igκ轻链基因座或转基因的一个或多个拷贝，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物含有如图中所示的Igκ轻链基因座。
本公开认识到如本文所述的非人动物将在其抗体选择和产生机制(例如，重组和体细胞超突变)中利用其基因组中包含的人重链、λ轻链和κ轻链可变区基因区段。因此，在各种实施方案中，由本文所述的非人动物产生的人免疫球蛋白人重链、λ轻链和κ轻链可变结构域由人重链、λ轻链和κ轻链可变区基因区段编码，所述人重链、λ轻链和κ轻链可变区基因区段分别包含在其基因组中或其体细胞超突变的变体中。
在一些实施方案中，提供了一种非人动物，所述非人动物的基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其中所述非人动物包含B细胞，所述B细胞包含人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的人κ轻链可变区序列。在一些实施方案中，存在于本公开小鼠的B细胞中的人重链可变区序列、人λ轻链和/或人κ轻链可变区序列具有1、2、3、4、5个或更多个体细胞超突变。本领域技术人员已知用于鉴定成熟抗体序列中的来源基因区段的方法。例如，可使用各种工具来辅助这种分析，所述工具例如，DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA以及Ab-origin。
本公开尤其提供如本文所述的非人动物的细胞和组织。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的脾细胞(和/或其他淋巴组织)。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的祖B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的前B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的未成熟B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的成熟初始B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的活化B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的记忆B细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的B谱系淋巴细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的浆体或浆细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的生殖细胞。在一些实施方案中，生殖细胞为卵母细胞。在一些实施方案中，生殖细胞为精细胞。一些实施方案中，如本文所述的非人动物的精细胞表达一种或多种ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。在一些实施方案中，来自如本文所述的非人动物的任何细胞或组织可被分离出。在一些实施方案中，提供来自如本文所述的非人动物的分离的细胞和/或分离的组织。在一些实施方案中，提供一种杂交瘤，其中所述杂交瘤由本文所述的非人动物B细胞制备。在一些实施方案中，杂交瘤由用目标抗原进行免疫的非人动物的B细胞制备。在一些实施方案中，杂交瘤以非人动物的B细胞制备，所述B细胞表达结合(例如，特异性地结合)至目标抗原上的表位的抗体。
如本文所述的任何非人动物可在足以使所述非人动物对一种或多种目标抗原产生免疫应答的条件和时间下，用所述一种或多种目标抗原进行免疫。本领域技术人员已知使非人动物免疫化的方法。作为免疫非人动物的示例性、非限制性方法可见于US 2007/0280945A1中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
本公开尤其提供如本文所述的经免疫的非人动物，以及从所述非人动物分离的细胞和组织。在一些实施方案中，本文所述的非人动物响应于用包含一个或多个表位的抗原进行免疫而产生B细胞群体。在一些实施方案中，非人动物会产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合(例如，特异性结合)至目标抗原的一个或多个表位的抗体。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域的重链，和/或具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域的λ轻链。在一些实施方案中，由响应于抗原而产生的B细胞群体表达的抗体包含(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域，(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述的人λ轻链可变区序列编码的人λ轻链可变结构域，(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域，或(iv)它们的任何组合。
在一些实施方案中，非人动物产生B细胞群体，所述B细胞群体表达结合至目标抗原的一个或多个表位的抗体，其中由响应于抗原产生的B细胞群体所表达的抗体包含：(i)重链，所述重链具有由人重链可变区序列编码的人重链可变结构域，(ii)λ轻链，所述λ轻链具有由如本文所述人λ轻链可变区序列编码的λ轻链可变结构域，(iii)κ轻链，所述κ轻链具有由如本文所述的人κ轻链可变区序列编码的人κ轻链可变结构域编码，或(iv)它们的任何组合。在一些实施方案中，如本文所述的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列为体细胞超突变的。在一些实施方案中，响应于抗原产生的B细胞群体中的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％的B细胞包含为体细胞超突变的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列。
在一些实施方案中，本文提供的非人动物在它们的种系基因组中(1)包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含(a)一个或多个人Vλ基因区段，(b)一个或多个人Jλ基因区段和(c)Cλ基因，其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，(2)在经工程改造的内源性免疫球蛋白κ基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因，并且(3)包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含(a)一个或多个人Vκ基因区段，(b)一个或多个人Jκ基因区段以及(c)Cκ基因，其中所述一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至所述Cκ基因。在一些实施方案中，此类非人动物的脾细胞中的轻链(其为λ轻链)的百分比(例如，如通过流式细胞术检测或观察到的(参见例如实例3))为至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。在一些实施方案中，此类非人动物的脾细胞中的轻链(其为λ轻链)的百分比(例如，如通过流式细胞术检测或观察到的(参见例如实例3))介于35％-80％之间、介于35％-75％之间、介于40％-80％之间、介于40％-75％之间、介于50％-80％之间、介于50％-75％之间、介于55％-80％之间、介于55％-75％之间、介于60％-80％之间或介于60％-75％之间。在一些实施方案中，此类非人动物的脾细胞中的轻链(其为κ轻链)的百分比(例如，如通过流式细胞术检测或观察到的(参见例如实例3))为至多65％、至多60％、至多55％、至多50％、至多45％、至多40％或至多35％。在一些实施方案中，此类非人动物的脾细胞中的轻链(其为κ轻链)的百分比(例如，如通过流式细胞术检测或观察到的(参见例如实例3))介于20％-65％之间、介于25％-65％之间、介于20％-60％之间、介于25％-60％之间、介于20％-55％之间、介于25％-55％之间、介于20％-50％之间、介于25％-50％之间、介于20％-45％之间、介于25％-45％之间、介于20％-40％或介于25％-40％之间。在一些实施方案中，此类非人动物的脾细胞中的κ：λ轻链的比例(例如，如通过流式细胞术检测或观察到的(参见例如实例3))介于0.5:1与3:1之间、介于0.65:1与3:1之间、介于0.8:1与3:1之间、介于1:1与3:1之间、介于1.2:1与3:1之间、介于1:1与2.3:1之间、介于1.1:1与1.8:1之间、介于1.2:1与2.3:1之间或介于1.2:1与1.8:1之间。
制备所提供的非人动物的方法
提供了用于制备非人动物的组合物和方法，所述非人动物的种系基因组包含经工程改造的Igκ轻链基因座，所述经工程改造的Igκ轻链基因座包含位于非人Igκ轻链序列位置中的一个或多个人Igλ轻链序列(例如，人Vλ和Jλ基因区段)，包括人Igλ轻链编码序列，所述人Igλ轻链编码序列包含人Vλ和Jλ区段的特异性多态性形式(例如，特异性V和/或J等位基因或变体)，包括用于制备表达包含Igλ轻链的抗体的非人动物的组合物和方法，所述轻链含有由Igκ轻链基因座组装的人可变区和非人或人恒定区，所述Igκ轻链基因座含有可操作地连接至非人或人Igλ轻链恒定区基因的人Vλ和Jλ基因区段，所述非人或人Igλ轻链恒定区基因位于非人Igκ轻链恒定区基因的位置中，所述非人Igκ轻链恒定区基因通常出现在野生型非人Igκ轻链基因座中。在一些实施方案中，还提供了用于制备非人动物的组合物和方法，所述非人动物在内源性Igκ增强子和/或内源性Igκ调控序列的控制下表达此类抗体。在一些实施方案中，还提供了用于制备非人动物的组合物和方法，所述非人动物在异源性Igκ增强子和/或异源性Igκ调控序列的控制下表达此类抗体。
本文描述的方法包括插入人Vλ和Jλ序列，所述人Vλ和Jλ序列编码非人或人Igλ轻链恒定区基因(例如，小鼠或人的Cλ区域基因)上游的人Vλ结构域，所述非人或人Igλ轻链恒定区基因位于非人Igκ轻链恒定区基因的位置中，所述非人Igκ轻链恒定区基因通常出现在野生型非人Igκ轻链基因座中，以表达抗体，所述抗体的特征在于存在含有人Vλ结构域和非人Cλ结构域(例如，啮齿动物Cλ结构域)的轻链，或存在含有人Vλ和非人Cλ结构域(例如，一个或多个啮齿动物Cλ结构域)的轻链，并表达于B细胞表面和非人动物的血清中。
在一些实施方案中，所述方法包括将含有人Vλ和Jλ基因区段的遗传物质插入Igκ轻链基因座(例如，野生型、经修饰或经工程改造的Igκ轻链基因座)中。在某些实施方案中，方法包括将含有人Jλ基因区段的遗传物质插入经修饰或经工程改造的品系的Igκ轻链基因座中。在一些实施方案中，含有人Igλ轻链序列的遗传物质可被工程改造或基因组化(例如，从细菌人工染色体中克隆)。在一些实施方案中，含有人Igλ轻链序列的遗传物质可由公开来源，和/或细菌人工染色体中设计，以使得所述遗传物质含有呈不同于在人Igλ轻链基因座中出现的取向的取向的人Vλ和Jλ区段，但所述遗传物质仍含有支持所述人Vλ和Jλ片区段的重排的序列以编码Ig轻链的功能性人Vλ结构域。举例而言，可使用本文提供的指南设计对应于多个人Vλ和Jλ基因区段的遗传物质，以构建人Igλ轻链序列，所述人Igλ轻链序列含有具不同于人细胞的人Igλ轻链基因座处出现的顺序和/或排列的人Vλ和Jλ区段(例如，相似于或类似于人或啮齿动物Igκ轻链基因座的排列，例如，一系列V基因区段，通过在3'插入DNA，随后在3'插入一系列J基因区段)。在此实例中，人Vλ和Jλ基因区段的遗传物质将等效于人细胞中的相应区段，然而，顺序和排列可能不同。当构建经工程改造的Igκ轻链基因座以产生如本文所述的非人动物时，可配置必需的重组信号序列，以使得所述人V和J基因区段可正确地重排并形成功能性人Vλ结构域。人Vλ和Jλ基因区段的种系构型和适当重组所必需的序列的指南可在例如Molecular Biology of B Cells,London:Elsevier AcademicPress,2004,Honjo,T.,Alt,F.W.,Neuberger,M.编,第4章(37-59页)以及第5章(61-82页)中找到；所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，方法包括在单一ES细胞克隆中的多次插入。在一些实施方案中，方法包括在连续的ES细胞克隆中进行的依序插入。在一些实施方案中，所述方法包括在经工程改造的ES细胞克隆中进行的单次插入。
在一些实施方案中，方法包括在鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)上游的DNA插入，以使得所述DNA插入可操作地连接至所述鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)，所述DNA插入包含人Vλ基因区段Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，以及人Jλ基因区段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，并且所述鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)位于内源性Igκ轻链基因座的鼠类Cκ基因的位置中。
在一些实施方案中，方法包括人Vλ3-1基因区段下游和经工程改造的Igκ轻链基因座的非人Igκ内含子增强子区(或增强子序列)上游的DNA插入，以使得所述DNA插入可操作地连接至鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)，所述DNA插入包含人Igκ基因组序列，所述人Igκ基因组序列天然地出现在人Igκ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段和人Jκ1基因区段与一个或多个人Jλ基因区段(例如，一、二、三、四、五、六或七)之间，所述鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)位于内源性非人Igκ轻链基因座的鼠类Cκ基因位置的位置中。在某些实施方案中，方法包括介于人Vλ3-1基因区段与非人Igκ内含子增强子之间的DNA插入，所述DNA插入包括人Vκ-Jκ序列，所述人Vκ-Jκ序列天然地出现在人Igκ轻链基因座的人Vκ4-1和Jκ1基因区段与5个人Jλ基因区段(例如，Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7)之间。在各种实施方案中，包括人Jλ基因区段的DNA插入包含具有人Jλ基因区段和人Jλ12RSS的编码序列的人Jκ基因组DNA。
使用本文所述的方法可实现插入额外的人Vλ和Jλ片段，以进一步补充经工程改造的Igλ轻链基因座的多样性。例如，在一些实施方案中，方法可包括在经工程改造的Igκ轻链基因座的鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)上游插入约270kb的DNA，以使得所述DNA可操作地连接至所述鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)，其中所述DNA包含人Vλ基因区段Vλ10-54、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在此类实施方案中，所述DNA插入人Vλ5-52基因区段的上游，所述人Vλ5-52基因区段可操作地连接至经工程改造的Igκ轻链基因座的鼠类Cλ1基因(或人Cλ2基因)，所述DNA包含人Vλ基因区段Vλ10-54、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在某些实施方案中，所述DNA包括人VpreB基因。上述额外的人Vλ基因区段可直接从市售的BAC克隆进行克隆，并使用本文所述或本领域已知的重组技术排列在较小的DNA片段中。此外，可合成上述额外的人Vλ基因区段作为经工程改造的DNA片段，并使用本领域已知的分子生物学技术，将其添加至如上所述的经工程改造的Igκ轻链基因座中。同样地，额外的人Jλ基因区段可获自市售的BAC克隆，或直接从公开的序列合成。示出如本文所述的非人动物的经工程改造的Igκ轻链基因座的示例性说明阐述于图2B或4B中。
在适当的情况下，编码人Vλ结构域的人Igλ轻链序列(即，包含人Vλ和Jλ基因区段的序列)可分别进行修饰，以包括针对在非人动物中表达优化的密码子(例如，参见美国专利号5,670,356和5,874,304)。密码子优化的序列为经工程改造的序列，且优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或与全长多肽具有基本相同的活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码人Vλ结构域的人Igλ轻链序列可分别包括经改变的序列，以优化特定细胞类型(例如啮齿动物细胞)的密码子使用。例如，待插入至非人动物(例如啮齿动物)基因组中的每个核苷酸序列的密码子可针对在非人动物的细胞中表达进行优化。这种序列可描述为密码子优化的序列。
编码人Vλ结构域的核苷酸序列的插入使用如本文所述的非人动物种系基因组的最低修饰，并导致包含具有人Vλ结构域的轻链的抗体的表达，所述人Vλ结构域由内源性经工程改造的Igκ轻链基因座表达。用于产生经工程改造的非人动物的方法(包括敲除和敲入)为本领域所已知(参见例如，Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner编,Oxford University Press,Inc.,2000；其以引用的方式整体并入本文)。例如，经遗传工程改造的啮齿动物的产生可任选地涉及破坏一个或多个内源性啮齿动物基因(或基因区段)的基因座，并引入一个或多个异源基因(或基因区段或核苷酸序列)至所述啮齿动物基因组中，在一些实施方案中，在与内源性啮齿动物基因(或基因区段)相同的位置上。在一些实施方案中，编码人Vλ结构域的核苷酸序列被引入啮齿动物的种系基因组中随机插入的经工程改造的轻链转基因的鼠类或人Igλ轻链恒定区基因上游。在一些实施方案中，编码人Vλ结构域的核苷酸序列被引入啮齿动物的种系基因组中的内源性Igκ轻链基因座处的鼠类或人Igλ轻链恒定区基因的上游；在某些实施方案中，内源性Igκ轻链基因座被改变、修饰或工程改造，以含有可操作地连接至小鼠Cλ1基因或可操作地连接至人Cλ2基因的人Igλ基因区段(例如，人V和J)。
用于构建如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座的示例性方法的示意图(未按比例)提供于图1A、1B、2A、2B、3、4A和4B中。特别地，图1A和1B列出了用于构建经工程改造的Igκ轻链基因座的示例性策略，所述策略的特征在于插入含有多个人Vλ和Jλ基因区段的核苷酸序列。如图1A和1B所示，含有人Vκ-Jκ基因间区域的DNA片段(参见美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092)和含有一组人Jλ基因区段(例如，人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6与Jλ7)的经工程改造的片段可操作地连接至啮齿动物Igκ内含子增强子区域(或增强子序列)，经由使用实施例1中描述的各种分子生物学技术的一系列步骤。此经工程改造的片段还被工程改造为含有可操作地连接至人Jλ基因区段的啮齿动物Igλ轻链恒定区。选择盒(例如，新霉素(Neomycin)和潮霉素(Hygromycin))包含于靶向载体中，以允许在细菌和哺乳动物细胞(例如胚胎干细胞)中选择阳性克隆。如所示，新霉素抗性基因侧接lox2372位点特异性重组位点(lox)，并定位于人Vκ-Jκ区域与人Jλ基因区段组之间，而潮霉素选择盒侧接loxP位点-特异性重组位点，并定位于啮齿动物Igλ轻链恒定区(mCλ1)基因的3'。所述DNA片段然后与含有啮齿动物Igκ轻链3'增强子的DNA片段组合，以产生最终靶向载体(图1B)。将所得靶向载体(构建体G)线性化并电穿孔到啮齿动物胚胎干(ES)细胞中，以产生啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含经工程改造的Igκ轻链基因座。如下面实施例部分所述，用于靶向载体的电穿孔的啮齿动物ES细胞含有经工程改造的Igκ轻链基因座，如先前描述于美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092中；其以引用的方式整体并入本文。如图3中所描绘的，与靶向载体同源重组可产生经工程改造的Igκ轻链基因座，所述经工程改造的Igκ轻链基因座的特征在于可操作地连接至鼠类Cλ1基因的多个人Vλ和Jλ基因区段，所述数量Cλ1基因位于鼠类Cκ基因的位置上，所述鼠类Cκ基因天然地出现于野生型Igκ轻链基因座中。将人Jλ基因区段独特工程改造为尚未天然地出现在基因组人Jκ区域中、但具有人Jλ编码序列和相关的12RSS的序列，位于人Jκ编码序列和相关23RSS处。阳性啮齿动物ES细胞克隆为使用本文所述和/或本领域已知的筛选方法确认。可根据需要通过重组酶介导的缺失删除任何剩余的选择盒(参见实施例2)。
或者，可在靶向载体中使用人Cλ基因，而非小鼠Cλ基因。仅用于举例，图3说明了以与上述类似方式构建的靶向载体，不同之处在于编码人Cλ2基因的序列被工程改造至靶向载体中，并且与五个人Jλ基因区段可操作地连接。使用这种方法在开发人抗体治疗剂方面提供了额外的益处，因为编码轻链可变区和恒定区的DNA可一起分离，从而消除任何后续的克隆步骤，从而连接至人轻链恒定区用于制备完全人抗体。
用于构建如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座的靶向载体可并入非人细胞(例如啮齿动物胚胎干细胞)的种系基因组中。在一些实施方案中，如本文所述的靶向载体并入非人细胞的种系基因组的野生型Igκ轻链基因座中，所述细胞还含有与一个或多个免疫球蛋白重链恒定区基因可操作地连接的人VH、DH和JH基因组DNA(例如，含有多个人VH、DH和JH基因区段)(例如，参见美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，如本文所述的靶向载体并入非人细胞的种系基因组中的经修饰或经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中，所述非人细胞还包含与一个或多个免疫球蛋白重链恒定区基因可操作地连接的人VH、DH和JH基因组DNA(例如，含有多个人VH、DH和JH基因区段)(例如，参见美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940、8,791,323、9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092,所述专利各自以引用的方式整体并入本文)。
靶向载体通过电穿孔引入啮齿动物(例如小鼠)胚胎干细胞中，以使得靶向载体中含有的序列可使非人细胞或非人动物(例如小鼠)有能力表达抗体，所述抗体具有轻链，所述轻链包含人Vλ结构域以及非人或人Cλ结构域，并且所述轻链由内源性经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座表达。如本文所述，产生经遗传工程改造的啮齿动物，其中在啮齿动物的种系基因组中产生经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(例如，含有人Igλ轻链序列的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(即，多个人Vλ和Jλ基因区段)，其可操作地连接至啮齿动物或人Cλ基因，位于内源性啮齿动物Cκ基因处)。抗体表达于啮齿动物B细胞表面和所述啮齿动物的血清中，所述抗体特征在于具有人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域的轻链。当啮齿动物的种系基因组中的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座不被靶向载体靶向时，优选将经工程改造的免疫球蛋白κ轻链转基因插入不同于内源性啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的位置处(例如，随机插入的转基因)。
如上所述，在非人动物中产生经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座提供产生抗体的经工程改造的啮齿动物品系，所述抗体包含从这种经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座(其具有人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域)表达的免疫球蛋白λ轻链。利用包含可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区基因的多个人VH、DH和JH基因区段的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座的存在，产生了经工程改造的啮齿动物品系，所述啮齿动物品系产生用于开发基于人抗体的治疗剂的抗体和抗体成分。因此，实现了单一工程改造的啮齿动物品系，其具有提供用于探索人Vλ结构域以开发用于治疗人疾病的新的基于抗体的药物的另一体内系统的能力。
在一些实施方案中，提供了一种制备非人动物的方法，所述动物的种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述方法包括(a)将DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述DNA片段包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含(i)一个或多个人Vλ基因区段，(ii)一个或多个人Jλ基因区段以及(iii)Cλ基因(例如，非人或人)，其中(i)-(iii)可操作地连接，并且其中所述核苷酸序列还包含介于(i)和(ii)之间的免疫球蛋白κ轻链序列，(b)获得(a)中产生的非人胚胎干细胞；以及(c)使用(b)中的啮齿动物胚胎干细胞产生啮齿动物。
在一些实施方案中，提供了一种制备非人动物的方法，所述动物的种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因，所述方法包括(a)将DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述DNA片段包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一个或多个人Jλ基因区段、一个或多个非人免疫球蛋白κ轻链增强子以及非人或人Cλ基因，所述人Jλ基因区段可操作地连接至所述一个或多个非人免疫球蛋白κ轻链增强子和所述非人或人Cλ基因，(b)获得(a)中产生的非人胚胎干细胞；以及(c)使用(b)中的啮齿动物胚胎干细胞产生啮齿动物。
在一些实施方案中，提供了一种制备非人动物的方法，所述动物的种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段以及非人或人Cλ基因，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述非人或人Cλ基因，并且所述非人Cλ或人Cλ基因插入位于内源性免疫球蛋白κ基因座处的非人Cκ基因处，所述方法包括修饰非人动物的种系基因组，以使得所述种系基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包括插入一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段以及非人Cλ或人Cλ基因，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述非人或人Cλ基因，并且所述非人或人Cλ基因插入位于内源性免疫球蛋白κ基因座处的非人Cκ基因处。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括至少24个、至少34个、至少52个、至少61个，或至少70个人Vλ基因区段。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括39个人Vλ基因区段。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在某些实施方案中，一个或多个人Vλ基因区段包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的相关人Vλ基因区段出现。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个人Jλ基因区段。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括5个人Jλ基因区段。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。在某些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括人非编码DNA(全部或部分)，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的相关人Jλ基因区段出现。在一些实施方案中，一个或多个人Jλ基因区段包括人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人κ轻链基因座的人Jκ1-Jκ5出现。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段包括基因间DNA，所述基因间DNA含有非编码免疫球蛋白DNA(例如，天然地在两个V基因区段的编码序列、V与J基因区段之间或两个J基因区段之间出现的DNA)。在许多实施方案中，所述非编码免疫球蛋白DNA为非编码免疫球蛋白轻链DNA(例如人或鼠类)。在一些实施方案中，非编码免疫球蛋白轻链DNA为免疫球蛋白κ轻链DNA、免疫球蛋白λ轻链DNA或它们的组合。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个选择标记。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含一个或多个位点特异性重组位点。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含用相同的重组酶重组的一组或多组位点特异性重组位。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段还包含用不同的重组酶重组的一组或多组位点特异性重组位点。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段包含经工程改造的序列，所述经工程改造的序列包含一起在连续序列中的免疫球蛋白κ轻链序列和免疫球蛋白λ轻链序列。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段包含经工程改造的序列，所述序列包含一起在单一序列中、但被非免疫球蛋白序列(例如，重组信号序列、抗性基因以及它们的组合)中断的免疫球蛋白κ轻链序列和免疫球蛋白λ轻链序列。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，经工程改造的序列包含Jκ区的部分和Jλ区的部分。在一些实施方案中，经工程改造的序列包含人Jκ区的一部分和人Jλ区的一部分。在某些实施方案中，人Jκ区的部分包括天然出现在人细胞的人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Jκ区非编码序列。在某些实施方案中，人Jλ区的部分包括一个或多个人Jλ基因区段的编码序列和重组信号序列(RSS)。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段包含经工程改造的序列，所述经工程改造的序列在一些实施方案中的特征在于存在一个或多个人Jλ基因区段的编码序列和重组信号序列(RSS)，所述一个或多个人Jλ基因区段定位性地置换或取代(即，定位于)人Jκ基因区段上的相应编码序列和重组信号序列(RSS)，以使得所述一个或多个人Jλ基因区段的编码序列和重组信号序列(RSS)位于所述一个或多个人Jκ基因区段的所述非编码序列内，或与其相邻、连续或并置。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含一个或多个经工程改造免疫球蛋白基因座(例如，免疫球蛋白重链、免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链以及它们的组合)。在某些实施方案中，经工程改造的免疫球蛋白基因座为内源性经工程改造的免疫球蛋白基因座。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含插入一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，其中所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ和一个或多个人Jλ基因区段，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，DNA片段引入非人胚胎干细胞中，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ和一个或多个人Jλ基因区段，以及人免疫球白κ轻链序列定位、置于或位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间，其中所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，修饰非人动物的种系基因组以使其包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座在非人胚胎干细胞中进行，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含插入一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段以及一个或多个人JH基因区段，所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，修饰非人动物的种系基因组以使其包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座在非人胚胎干细胞中进行，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ和一个或多个人Jλ基因区段，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因。在制备非人动物的方法的一些实施方案中，修饰所述非人动物的种系基因组以使其包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座在非人胚胎干细胞中进行，所述非人胚胎干细胞的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ重链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ重链基因座包含插入一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段以及人免疫球蛋白κ轻链序列，定位于、置于或位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因。
在制备非人动物的方法的一些实施方案中，插入一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段包括天然地邻近于人VH基因区段出现的人非编码DNA、天然地邻近于人DH基因区段出现的人非编码DNA以及天然地邻近于内源性人免疫球蛋白基因座中的人JH基因区段出现的人非编码DNA。
在一些实施方案中，提供了由如本文所述的方法制备、产生、制造、获得或可获得的非人动物。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物的基因组还包含一个或多个人免疫球蛋白重链可变区，如美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323中所述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。或者，可将本文所述的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造至不同修饰品系的胚胎干细胞中，例如
Figure BDA0002524439450001151
品系(参见例如美国专利号8,502,018和/或8,642,835；其以引用的方式整体并入本文)。随后可通过育种实现如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座的纯合性。或者，在随机插入经工程改造的免疫球蛋白κ轻链转基因(如上所述)的情况下，啮齿动物品系可基于来自所述转基因的人Vλ结构域的表达等来选择。在一些实施方案中，
Figure BDA0002524439450001153
小鼠可为
Figure BDA0002524439450001152
1(VI-1)小鼠，其包括18个人VH基因区段、所有人DH基因区段和所有JH基因区段。VI-1小鼠还可包括16个人Vκ基因区段和所有人Jκ基因区段。在一些实施方案中，
Figure BDA0002524439450001154
小鼠可为
Figure BDA0002524439450001155
2(VI-2)小鼠，其包括39个人VH基因区段、所有人DH基因区段以及所有JH基因区段。VI-2小鼠还可包括30个人Vκ基因区段和所有人Jκ基因区段。在一些实施方案中，
Figure BDA0002524439450001156
小鼠可为
Figure BDA0002524439450001157
3(VI-3)小鼠，其包括80个人VH基因区段、所有人DH基因区段和所有JH基因区段。VI-3小鼠还可包括40个人Vκ基因区段和所有人Jκ基因区段。
或者和/或另外地，在一些实施方案中，如本文所述的非人动物的种系基因组还包含缺失、失活、功能性沉默的或其他非功能性内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。使用本文所述的方法和/或本领域已知的方法可实现经遗传修饰的，以缺失或产生非功能性基因或基因座。
经遗传工程改造的创始非人动物可基于其种系基因组中经工程改造的Igκ轻链基因座的存在和/或在非人动物组织或细胞中表达具有人Vλ结构域和非人或人Cλ结构域的抗体来鉴定。经遗传工程改造的创始非人动物然后可用于培育携带所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的其他非人动物，从而产生各自携带经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的一个或多个拷贝的一组非人动物。此外，携带如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的遗传工程改造非人动物可进一步与其他携带其他转基因(例如人免疫球蛋白基因)或工程改造免疫球蛋白基因座的遗传工程改造的非人动物一起培育。
还可产生含有选择的系统的遗传工程改造的非人动物，所述系统允许转基因或整合的序列的调控、定向、诱导和/或细胞类型特异性表达。例如，如本文所述的非人动物可被工程改造以包含一个或多个序列，所述一个或多个序列编码条件性表达的抗体的人Vλ结构域(例如，综述于Rajewski,K.等人,1996,J.Clin.Invest.98(3):600-3，其以引用的方式整体并入本文)。示例性系统包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如，Lakso,M.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6232-6，其以引用的方式整体并入本文)，以及酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP/Frt重组酶系统(O’Gorman,S.等人,1991,Science251:1351-5，其以引用的方式整体并入本文)。此类动物可通过构建“双重”遗传工程改造动物来提供，例如通过交配两种遗传工程改造的动物，其中一种含有包含选择的修饰的转基因(例如，经工程改造的Igκ轻链基因座，如本文所述)，而另一种含有编码重组酶的转基因(例如，Cre重组酶)。
如本文所述的非人动物可如上所述制备，或使用本领域已知的方法制备，以包含另外的人、人源化或其他经工程改造的基因，通常取决于非人动物的预期用途。此类人、人源化或其他经工程改造的基因的遗传物质可通过进一步改变具有如上所述的经遗传修饰的或改变的细胞(例如，胚胎干细胞)的基因组，或根据需要通过本领域已知的育种技术以及其他经遗传修饰的或工程改造的品系而引入。在一些实施方案中，制备如本文所述的非人动物，以还包含人IgH和/或Igκ轻链基因或基因区段(参见例如Murphy,A.J.等人,(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-5158；美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323；美国专利号8,791,323；以及美国专利申请公布号2013/0096287A1；其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物可通过将本文所述的靶向载体引入来自经修饰或经工程改造的品系的细胞中而制备。例如，可将如本文所述的靶向载体引入
Figure BDA0002524439450001171
小鼠中。
Figure BDA0002524439450001172
小鼠表达具有完全人可变区和小鼠恒定区的抗体。在另一个实例中，可将如本文所述的靶向载体引入经工程改造的小鼠中，如美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092中所述，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，制备如本文所述的非人动物，以还包含人免疫球蛋白基因(可变区和/或恒定区基因)。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物包含如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座，以及来自异源性物种(例如人)的遗传物质，其中所述遗传物质(全部或部分)编码一个或多个人重链和/或Igκ轻链可变区。
例如，如本文所述，包含如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座的非人动物还可包含(例如，经由交叉-育种或多重基因靶向策略)一种或多种修饰，如描述于Murphy,A.J.等人,(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-8；Macdonald,L.E.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5147-52；U.S.专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323；其全部以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，包含如本文所述的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物与包含人源化免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白κ轻链可变区基因座的啮齿动物进行杂交(参见例如，美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和/或8,791,323；所述专利以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物与包含人源化免疫球蛋白重链基因座(参见例如，美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和/或8,791,323；所述专利以引用的方式整体并入本文)以及失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座(参见例如，美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092，所述专利以引用的方式整体并入本文)的啮齿动物进行杂交。
尽管已描述在小鼠中构建经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的实施方案(即，具有经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的小鼠，其特征为存在与小鼠或人Cλ基因可操作地连接的多个人Vλ和Jλ基因区段，所述小鼠或人Cλ基因定位于小鼠Cκ基因处，以使得表达含有人Vλ结构域和小鼠或人Cλ结构域的抗体)在本文广泛讨论，还提供了包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的其他非人动物。此类非人动物包括可经遗传修饰以表达如本文所述的抗体的任何动物，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猿、恒河猴)等。例如，对于那些不容易获得合适的可经遗传修饰的ES细胞的非人动物，采用其他方法制备包含所述经遗传修饰的非人动物。此类方法包括，例如，修饰非ES细胞基因组(例如，纤维母细胞或诱导的多潜能细胞)，并采用体细胞核转移技术(SCNT)将经遗传修饰的基因组转移至合适的细胞中，例如去核的卵母细胞，并在合适的条件下，在非人动物中孕育所述经修饰细胞(例如，经修饰的卵母细胞)，以形成胚胎。
用于修饰非人动物(例如，猪、牛、啮齿动物、鸡等基因组)的种系基因组的方法包括例如使用锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(即CRISPR/Cas系统)，以包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座。用于修饰非人动物的种系基因组的方法的指南可见于如美国专利申请号14/747，461(于2015年6月23日提交)、14/948,221(于2015年11月20日提交)和14/974,623(于2015年12月18日提交)；所述专利申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为哺乳动物。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为小型哺乳动物，例如跳鼠(Dipodoidea)或鼠类(Muroidea)超级家族。在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的动物为啮齿动物。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自鼠类(Muroidea)超级家族。在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的动物选自仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类似小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠，田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺状小鼠、冠毛大鼠)、非洲攀鼠亚科(Nesomyidae)(攀爬小鼠、岩攀鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹子大鼠和鼢鼠)。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的啮齿动物选自真正的小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠和冠毛大鼠。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的小鼠为来自鼠科(Muridae)的成员。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为啮齿动物。在某些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为小鼠。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为啮齿动物，所述啮齿动物为选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr以及C57BL/Ola。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠为选自由以下组成的组的129-品系：品系129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人,1999,MammalianGenome 10:836；Auerbach,W.等人,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的小鼠为前述129品系和前述C57BL/6品系的混合。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠为前述129品系的混合，或前述BL/6品系的混合。在某些实施方案中，如本文所述混合品系中的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠为BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠为BALB品系和另一种上述品系的混合。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物为大鼠。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6以及DarkAgouti。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠品系为选自由Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6以及Dark Agouti组成组的两种或更多种品系的混合。
大鼠多潜能细胞和/或全能细胞可来自任何大鼠品系，包括例如ACI大鼠品系(最初源自August和Copenhagen品系的近交品系)、Dark Agouti(DA)大鼠品系、Wistar大鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系或Fischer大鼠品系，如Fisher F344或Fisher F6。大鼠多潜能细胞和/或全能细胞还可源自上述两种或更多种品系的混合品系。例如，大鼠多潜能细胞和/或全能细胞可来自DA品系或ACI品系。ACI大鼠品系的特征为具有黑色野鼠色、具有白色腹部和足部以及RT1av1单倍型。这些品系可获自多种来源，包括Harlan Laboratories。来自ACI大鼠的大鼠ES细胞系实例为ACI.G1大鼠ES细胞。DA大鼠品系特征为具有刺豚鼠外皮和RT1av1单倍型。这些大鼠可获自多种来源，包括Charles River和Harlan Laboratories。来自DA大鼠的大鼠ES细胞系实例为DA.2B大鼠ES细胞系以及DA.2C大鼠ES细胞系。在一些实施方案中，大鼠多潜能细胞和/或全能细胞来自近交大鼠品系(参见，例如，于2014年8月21日公开的美国专利申请公布号2014-0235933A1，其以引用的方式整体并入本文)。在大鼠基因组中(例如，在大鼠ES细胞中)，使用如本文所述的方法和/或构建体进行修饰的指南可见于如美国专利申请公布号2014-0310828和2017-0204430；所述申请公布两者均以引用的方式整体并入本文。
具体的示例性实施方案-免疫球蛋白重链基因座
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且还包含经工程改造的IgH基因座(或等位基因)，其特征为存在以种系构型排列并且可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区基因、增强子和调控区的多个人VH、DH与JH基因区段。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座(或等位基因)包含可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。在某些实施方案中，经工程改造的免疫球蛋白重链基因座(或等位基因)包含至少一个人VH基因区段VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合。在某些实施方案中，经工程改造的IgH基因座(或等位基因)包含至少一个人DH基因区段DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合。在某些实施方案中，经工程改造的免疫球蛋白重链基因座(或等位基因)包含至少一个人JH基因区段JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
本公开认识到，如本文所述的非人动物将在其抗体选择和产生机制(例如，重组和体细胞超突变)中利用其基因组中包含的人重链可变区基因区段。因此，在各种实施方案中，由本文所述的非人动物产生的人免疫球蛋白重链可变结构域由其基因组或体细胞超突变的变体中包含的人重链可变区基因区段编码。
在一些实施方案中，提供了一种非人动物，所述非人动物的基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其中所述非人动物包含B细胞，所述B细胞包含人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的人κ轻链可变区序列。在一些实施方案中，存在于本公开小鼠的B细胞中的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列具有1、2、3、4、5或更多个体细胞超突变。本领域技术人员已知用于鉴定出成熟抗体序列中的来源基因区段的方法。例如，可使用各种工具来帮助进行此分析，例如，DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA以及Ab-origin。
在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区包含一个或多个非人免疫球蛋白重链恒定区基因，例如免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白A(IgA)。在某些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区包含啮齿动物IgM、啮齿动物IgD、啮齿动物IgG3、啮齿动物IgG1、啮齿动物IgG2b、啮齿动物IgG2a、啮齿动物IgE和啮齿动物IgA恒定区基因。在一些实施方案中，所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人免疫球蛋白重链增强子(即，增强子序列或增强子区域)。在一些实施方案中，所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人免疫球蛋白重链调控区(或调控序列)。在一些实施方案中，所述人VH、DH和JH基因区段可操作地连接至一个或多个非人免疫球蛋白重链增强子(或增强子序列)与一个或多个非人免疫球蛋白重链调控区(或调控序列)。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座不含有内源性Adam6基因。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座不含有与同一物种的野生型非人动物的种系基因组中发现的相同种系基因组的内源性Adam6基因(或Adam6编码序列)。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座不含人Adam6假基因。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座包含插入至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列编码一个或多个非人(例如啮齿动物)Adam6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。在一些实施方案中，所述插入可位于如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白重链基因座之外(例如但不限于，VH基因区段的5'最上游)，在经工程改造的免疫球蛋白重链基因座内，或非人动物的种系基因组(例如，但不限于，随机引入的非人Adam6编码序列)、细胞或组织中的其他位置。
在各种实施方案中，如本文所提供的非人动物、非人细胞或非人组织不会可检测地表达(全部或部分)抗体分子内的内源性非人VH区域。在各种实施方案中，如本文所提供的非人动物、非人细胞或非人组织不含(或缺乏或含有缺失)一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列(全部或部分)编码抗体分子中的内源性非人VH区域(例如，VH、DH，和/或JH)。在各种实施方案中，如本文所提供的非人动物、非人细胞或非人组织具有种系基因组，所述种系基因组包括内源性非人VH、DH和JH基因区段的缺失(全部或部分)。在各种实施方案中，所提供的非人动物具有生育力。
用于产生携带此类经工程改造的免疫球蛋白重链基因座(或等位基因)的靶向载体、非人细胞和动物的指南可见于美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940和8,791,323中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员已知本领域用于实现此种遗传工程改造和/或操作非人动物(例如哺乳动物)基因组，或者用于制备、提供或制造此类序列以引入非人动物的种系基因组的各种技术。
具体的示例性实施方案-免疫球蛋白κ轻链基因座
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座特征为存在以种系构型排列(即，未重排以及与重组信号序列缔合)并插入且可操作地连接至非人或人Cλ基因的上游的多个人Vλ和Jλ基因区段，所述非人或人Cλ基因插入非人Cκ基因的位置中。如本文所述，此类经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含非人免疫球蛋白κ轻链增强子区(或增强子序列)。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至非人或人Cλ基因的一个或多个人Vλ基因区段和一个或多个人Jλ基因区段。在某些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)包含至少出现在人免疫球蛋白λ轻链基因座的聚簇A中的人Vλ基因区段；在一些实施方案中，人免疫球蛋白λ轻链基因座的聚簇A和聚簇B；在某些实施方案中，人免疫球蛋白λ轻链基因座的聚簇A、聚簇B和聚簇C。在某些实施方案中，经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)包含至少一个人Vλ基因区段Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合。在某些实施方案中，经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)包含至少一个人Jλ基因区段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6Jλ7或它们的任何组合。
本发明认识到，如本文所述的非人动物将在其抗体选择和产生机制(例如，重组和体细胞超突变)中利用其基因组中包含的人λ轻链可变区基因区段。因此，在各种实施方案中，由本文所述的非人动物产生的人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由其基因组或其体细胞高突变体中包含的人λ轻链可变区基因区段编码。
在一些实施方案中，提供了一种非人动物，所述非人动物的基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，其中所述非人动物包含B细胞，所述B细胞包含人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或体细胞超突变的人κ轻链可变区序列。在一些实施方案中，存在于本公开小鼠的B细胞中的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列具有1、2、3、4、5或更多个体细胞超突变。本领域技术人员已知用于鉴定成熟抗体序列中的来源基因区段的方法。例如，可使用各种工具来帮助进行此分析，例如，DNAPLOT、IMGT/V-QUEST、JOINSOLVER、SoDA以及Ab-origin。
在许多实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)含有与野生型免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)中出现的相同非人免疫球蛋白κ轻链增强子区域(或增强子序列)。在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)含有出现在不同物种(例如，不同的啮齿动物物种)的野生型免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)的非人免疫球蛋白κ轻链增强子区域(或增强子序列)。
在一些实施方案中，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至一个或多个非人免疫球蛋白κ轻链增强子(即增强子序列或增强子区)。在某些实施方案中，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至鼠类免疫球蛋白κ轻链内含子增强子区(IgκEi或Eiκ)。在某些实施方案中，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至鼠类免疫球蛋白κ轻链3'增强子区域(Igκ3'E或3'Eκ)。在某些实施方案中，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至鼠类Eiκ，并且可操作地连接至鼠类3'Eκ。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)不含(即缺乏)人VpreB基因(或人VpreB基因编码序列)。
在一些实施方案中，经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因，例如小鼠Cλ基因或大鼠Cλ基因。在某些实施方案中，经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因为或包含来自基因背景的小鼠Cλ基因，其包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合129xC57BL/6品系或它们的组合。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因包含与SEQ ID NO:1(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:3(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:5(小鼠Cλ3)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因包含与SEQ ID NO:1(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:3(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:5(小鼠Cλ3)基本上相同或相同的序列。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因为或包含小鼠Cλ1基因的序列。
在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ结构域包含与SEQ ID NO:2(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:4(小鼠Cλ2)或SEQ ID NO:6(小鼠Cλ3)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ基因包含与SEQ ID NO:2(小鼠Cλ1)、SEQ ID NO:4(小鼠Cλ2)或SEQID NO:6(小鼠Cλ3)基本上相同或相同的序列。在一些实施方案中，由位于如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ基因为或包含小鼠Cλ1结构域多肽。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因包含与SEQ ID NO:7(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:9(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:11(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:13(大鼠Cλ4)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ基因包含与SEQ ID NO:7(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:9(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:11(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:13(大鼠Cλ4)基本上相同或相同的序列。在某些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的非人Cλ基因为或包含大鼠Cλ1基因的序列。
在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ结构域包含与SEQ ID NO:8(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:10(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:12(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14(大鼠Cλ4)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ结构域包含与SEQ ID NO:8(大鼠Cλ1)、SEQ ID NO:10(大鼠Cλ2)、SEQ ID NO:12(大鼠Cλ3)或SEQ ID NO:14(大鼠Cλ4)基本上相同或相同的序列。在某些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的非人Cλ基因为或包含大鼠Cλ1结构域多肽。
在一些实施方案中，经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的人Cλ基因包括人Cλ基因，例如像人Cλ1基因、人Cλ2基因、人Cλ3基因、人Cλ6基因或人Cλ7基因。在某些实施方案中，经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的人Cλ基因为或包含人Cλ2基因。
在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的人Cλ基因包含与SEQ ID NO:15(人Cλ1)、SEQ IDNO:17(人Cλ2)、SEQ ID NO:19(人Cλ3)、SEQID NO:21(人Cλ6)或SEQ ID NO:23(人Cλ7)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的人Cλ基因包含与SEQ ID NO:15(人Cλ1)、SEQ ID NO:17(人Cλ2)、SEQ ID NO:19(人Cλ3)、SEQ ID NO:21(人Cλ6)或SEQ ID NO:23(人Cλ7)基本上相同或相同的序列。在一些实施方案中，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)的人Cλ基因为或包含人Cλ2基因的序列。
在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的人Cλ结构域包含与SEQ ID NO:16(人Cλ1)、SEQ ID NO:18(人Cλ2)、SEQ ID NO:20(人Cλ3)、SEQ ID NO:22(人Cλ6)或SEQ ID NO:24(人Cλ7)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的序列。在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的人Cλ结构域包含与SEQ IDNO:16(人Cλ1)、SEQ ID NO:18(人Cλ2)、SEQ ID NO:20(人Cλ3)、SEQ ID NO:22(人Cλ6)或SEQID NO:24(人Cλ7)基本上相同或相同的序列。在一些实施方案中，由定位在如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座(或等位基因)处的序列编码的人Cλ结构域为或包含人Cλ2结构域多肽。
除其他外，本公开证实在Igκ轻链基因座(或等位基因)处人Vλ和Jλ基因区段的存在可与非人动物的表达抗体库中的轻链多样性相比增加所提供的轻链库多样性，所述非人动物不包含此类经工程改造的Igκ轻链基因座。
具体的示例性实施方案-免疫球蛋白λ轻链基因座
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且还包含野生型或失活的免疫球蛋白λ轻链基因座(或等位基因)。
在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的缺失(全部或部分)。在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织包含在内源性免疫球蛋白λ轻链基因座内的插入，其中所述插入使得所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座无功能。在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织包含内源性免疫球蛋白λ轻链基因座的一个或多个基因区段的缺失，以使得所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座不能重组和/或表达抗体的功能性轻链。
在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织(全部或部分地)不会可检测地表达抗体分子中的内源性非人Vλ区域。在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织不包含(或缺乏或含有缺失)一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列(全部或部分)编码抗体分子中的内源性非人Vλ区域。在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织具有种系基因组，所述种系基因组包括全部或部分内源性非人Vλ和Jλ基因片的缺失。在一些实施方案中，所提供的如本文所述的非人动物、非人细胞和/或非人组织为种系基因组，所述种系基因组包含内源性非人Vλ、Jλ和Cλ基因区段的缺失(全部或部分)。
有关产生携带失活的Igλ轻链基因座(或等位基因)的靶向载体、非人细胞和动物的指南可在例如美国专利号9,006,511、9,012,717、9,029,628、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092中找到，所述专利以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员意识到用于实现特定基因座的基因失活和/或操作非人动物(例如哺乳动物)基因组或用于制备、提供或制造此类基因失活(例如，基因缺失)以用于引入非人动物的种系基因组的本领域已知的多种技术。
具体的示例性实施方案-免疫球蛋白基因座的组合
在一些实施方案中，提供的非人动物包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且还包含一个或多个额外的人或人源化基因(例如，经由杂交育种或多基因靶向策略)。此种非人动物可如上所述制备，或使用本领域已知的方法制备，以根据非人动物的预期用途获得所需的经工程改造的基因型。此类另外的人或人源化基因的遗传物质可通过进一步改变具有如上所述经遗传修饰的细胞(例如，胚胎干细胞)基因组，或通过本领域已知的育种技术和其他经遗传修饰的品系引入。
在一些实施方案中，所提供的非人动物还包含人或人源化免疫球蛋白重链基因座(例如，包括但不限于多个人VH、DH和JH基因区段，其可操作地连接至内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因)。在一些实施方案中，所提供的非人动物对于经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的，如本文所述，并且对于人或人源化免疫球蛋白重链基因座为杂合的。在一些实施方案中，所提供的非人动物对于经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的，如本文所述，并且对于人或人源化免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
在一些实施方案中，制备所提供的非人动物以还包含人或人源化免疫球蛋白重链基因座(例如，包括但不限于多个人VH、DH和JH基因区段，其可操作地连接至内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因)和人源化免疫球蛋白κ轻链基因座(例如，包括但不限于，多个人Vκ和Jκ基因区段，其可操作地连接至内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因)。在一些实施方案中，所提供的非人动物对于人或人源化免疫球蛋白重链基因座为杂合的，并且还包含一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座可含有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白λ轻链恒定区基因(即，如本文所述的经工程改造的Igκ轻链基因座)的多个人Vλ和Jλ基因区段；以及另一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述另一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座具有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因的多个人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，所提供的非人动物对于人或人源化免疫球蛋白重链基因座为纯合的，并且还包含一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座可含有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白λ轻链恒定区基因(即，如本文所述的工程改造Igκ轻链基因座)的多个人Vλ和Jλ基因区段；以及另一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述另一个内源性免疫球蛋白κ轻链基因座具有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因的多个人Vκ与Jκ基因区段。
在一些实施方案中，所提供的非人动物具有基因组，所述基因组包含(a)纯合的或杂合的人或人源化免疫球蛋白重链基因座的基因组，其包含可操作地连接至一个或多个内源性非人免疫球蛋白重链恒定区的人VH、DH与JH基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含与非人CH结构域序列融合的人VH结构域序列；(b)第一免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至非人免疫球蛋白Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与非人Cλ结构域序列融合的人Vλ结构域序列；以及(c)第二免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性非人Cκ基因的人Vκ和Jκ基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与小鼠Cκ结构域序列融合的人Vκ结构域序列。
在一些实施方案中，所提供的非人动物具有基因组，所述基因组包含(a)纯合的或杂合的人或人源化免疫球蛋白重链基因座的基因组，其包含可操作地连接至一个或多个内源性非人免疫球蛋白重链恒定区的人VH、DH和JH基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含与非人CH结构域序列融合的人VH结构域序列；(b)第一免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至非人免疫球蛋白Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与非人Cλ结构域序列融合的人Vλ结构域序列；(c)第二免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性非人Cκ基因的人Vκ和Jκ基因区段，以使得所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与小鼠Cκ结构域序列融合的人Vκ结构域序列；以及(d)(全部或部分地)同源性或异源性功能失活或缺失的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。
例如，如本文所述，包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的非人动物还可包含(例如，经由交叉育种或多基因靶向策略)一种或多种修饰，如描述于美国专利号8,642,835、8,697,940、9,006,511、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092中；所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所提供的非人动物还包含人源化免疫球蛋白重链基因座(例如，免疫球蛋白重链基因座，其包含可操作地连接至一个或多个非人免疫球蛋白重链恒定区基因的人VH、DH和JH基因区段)。在一些实施方案中，所提供的非人动物还包含人源化免疫球蛋白重链基因座，和无功能内源性免疫球蛋白λ轻链基因座(例如，全部或部分缺失，或以其他方式使其无功能)。
在一些实施方案中，所提供的非人动物包含免疫球蛋白κ轻链基因座，所述免疫球蛋白κ轻链基因座具有可操作地连接至定位于非人Cκ基因处的人或非人Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段；以及第二免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性非人Cκ基因的人Vκ和Jκ基因区段。在此类实施方案中，所提供的非人动物被称为对于经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为半合子的。在一些实施方案中，本文提供的所述半合子非人动物还包含人源化免疫球蛋白重链基因座。在一些实施方案中，本文提供的所述半合子非人动物还包含人源化免疫球蛋白重链基因座和无功能的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。
使用所提供的非人动物、细胞或组织的方法
如本文所述的非人动物用作为用于抗体开发的平台。特别地，本文描述的非人动物代表用于产生和鉴定人λ轻链可变结构域和包含此类人λ轻链可变结构域的抗体的特别有利的平台。
因此，本公开提供本文描述的非人动物可用于制备抗体的方法中。根据本公开制备的抗体可包括如人抗体、嵌合抗体、反向嵌合抗体、这些抗体中的任一者的片段或它们的组合。
在一些实施方案中，如本文所述的非人动物可用于制备人抗体(例如，完全人抗体)，所述人抗体包含源自如本文所述的非人动物的细胞基因物质编码的核酸序列可变区。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物在足以使所述非人动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件和时间下，用所述目标抗原进行免疫。抗体和/或抗体序列(即，编码抗体的一部分的序列，例如可变区序列)从非人动物(或一个或多个细胞，例如，一个或多个B细胞)分离和/或鉴定，如此免疫并使用各种测定测量例如亲和力、特异性、表位作图、阻断配体-受体相互作用的能力、抑制受体活化等进行表征。在各种实施方案中，如本文所述的由非人动物产生的抗体包含一个或多个人可变区，所述一个或多个人可变区源自从非人动物分离的一个或多个人可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，可如本文所述，在非人动物中产生抗药物抗体(例如，抗独特型抗体)。在各种实施方案中，如本文所述的由非人动物产生的抗体为反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体包含人轻链可变结构域和非人(例如啮齿动物)轻链恒定结构域，和/或人重链可变结构域，以及非人(例如啮齿动物)重链恒定结构域。
在各种实施方案中，由非人动物产生的抗体包括具有人可变结构域和非人恒定结构域的重链和轻链。在一些实施方案中，如本文所述的由非人动物产生的抗体为反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体包含人轻链可变结构域和非人(例如啮齿动物)轻链恒定结构域。在一些实施方案中，如本文所述的由非人动物产生的抗体为反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体包含人重链可变结构域和非人(例如啮齿动物)重链恒定结构域。
在一些实施方案中，所提供的方法包括用目标抗原对如本文所述的非人动物进行免疫。在一些实施方案中，所提供的方法包括鉴定来自所述非人动物的淋巴细胞(例如，克隆选择的淋巴细胞)，其中所述淋巴细胞表达结合(例如，特异性地结合)目标抗原的抗体。在一些实施方案中，淋巴细胞为B细胞。在一些实施方案中，人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列从淋巴细胞(例如，B细胞)获得和/或鉴定(例如，基因分型，例如，测序)。在一些实施方案中，人重链可变结构域序列、人λ轻链可变结构域序列和/或人κ轻链可变结构域序列从淋巴细胞(例如，B细胞)获得和/或鉴定(例如，测序)。在一些实施方案中，来自非人动物B细胞的人重链可变区序列、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，来自非人动物B细胞的人重链可变区序列变体、人λ轻链可变区序列和/或人κ轻链可变区序列在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，变体包含一个或多个突变。在一些实施方案中，一个或多个突变可改进包含变体的抗体的药物动力学和/或药效学性质。在一些实施方案中，一种或多种突变可改进包含所述变体的抗体的特异性、亲和力和/或免疫原性。
在一些实施方案中，制备人抗体的方法包括鉴定核苷酸序列，所述核苷酸序列编码来自本文所述的非人动物的人免疫球蛋白重链可变结构域，和/或人免疫球蛋白轻链可变结构域；以及(i)将编码人免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列连结或连接至编码人免疫球蛋白重链恒定结构域的核苷酸序列，从而形成编码完全人免疫球蛋白重链的人免疫球蛋白重链序列，(ii)将编码人免疫球蛋白λ轻链可变结构域的核苷酸序列连结或连接至编码人免疫球蛋白λ轻链恒定结构域的核苷酸序列，从而形成编码完全人免疫球蛋白λ轻链的人免疫球蛋白λ轻链序列，和/或(iii)将编码人免疫球蛋白κ轻链可变结构域的核苷酸序列连结或连接至编码人免疫球蛋白κ轻链恒定结构域的核苷酸序列，从而形成编码完全人免疫球蛋白κ轻链的人免疫球蛋白κ轻链序列。在某些实施方案中，人免疫球蛋白重链序列和(i)人免疫球蛋白λ轻链序列，或(ii)人免疫球蛋白κ轻链序列在细胞中(例如，宿主细胞、哺乳动物细胞)表达，以使得表达完全人免疫球蛋白重链和(i)完全人免疫球蛋白λ轻链或(ii)完全人免疫球蛋白κ轻链并形成人抗体。在一些实施方案中，人抗体从细胞或包含所述细胞的培养基中分离。
如本文所述的非人动物可用于鉴定核苷酸或核酸序列，所述核苷酸或核酸序列编码由本文所述的非人动物产生的人可变结构域，例如，作为针对某一表位或抗原的抗体的一部分。
如本文所述的非人动物可用于鉴定由本文所述的非人动物产生的人可变结构域的氨基酸序列，例如，作为针对某一表位或抗原的抗体的一部分。
如本文所述的非人动物提供改进的体内系统和生物材料(例如，细胞、核苷酸、多肽，蛋白质复合物)的来源，用于产生可用于多种测定的人抗体。在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于开发治疗剂，所述治疗剂靶向目标的多肽(例如，跨膜型或分泌型多肽)，和/或调节与所述目标多肽有关的一种或多种活性，和/或调节所述目标多肽与其他结合配偶体(例如配体或受体多肽)的相互作用。例如，在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于开发治疗剂，所述治疗剂靶向一种或多种受体多肽、调节受体多肽活性和/或调节受体多肽与其他结合配偶体的相互作用。在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于鉴定、筛选和/或开发结合一种或多种目标多肽的候选治疗剂(例如，抗体，siRNA等)。在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于筛选和开发可阻断一种或多种目标多肽活性或阻断一种或多种受体多肽活性的候选治疗剂(例如，抗体，siRNA等)。各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于测定一种或多种目标多肽的拮抗剂和/或激动剂的结合概况。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物用于测定结合一种或多种目标多肽的候选治疗性抗体的一个或多个表位。
在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用于测定一种或多种人抗体候选物的药物动力学概况。在各种实施方案中，如本文所述的一种或多种非人动物和一种或多种对照或参考非人动物各自暴露于各种剂量(如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更高)的一种或多种人抗体候选物。候选治疗性抗体可经由任何所需的施用途径施用，包括肠胃外和非肠胃外施用途径。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、经皮、肺、直肠、口腔、阴道、眼部。施用还可经由连续输注、局部给药、由植入物(凝胶、薄膜等)持续释放，和/或静脉内注射。在不同时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或至多30天或更多天)，自非人动物(人源化和对照组)中分离血液。可使用取自如本文所述的非人动物的样品进行各种测定，以确定施用的候选治疗性抗体的药物动力学概况，包括但不限于，总IgG、抗治疗性抗体反应、凝集等。
在各种实施方案中，如本文所述的非人动物，为用于测量阻断或调节目标多肽活性的治疗效果，以及由于细胞变化，或在受体多肽情况下，非人动物细胞表面受体多肽的密度变化，而造成的基因表达影响。在各种实施方案中，将如本文所述的非人动物或由其分离的细胞暴露于候选治疗剂(其与目标多肽结合)，并经过一段时间后分析其对于特定细胞过程的影响，所述过程与所述目标多肽相关，例如，配体-受体相互作用或信息传递。
如本文所述的非人动物表达人抗体可变区，因此可产生细胞、细胞系和细胞培养物，以作为用于结合和功能性测定的人抗体可变区的来源，例如，用于测定拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是当所述拮抗剂或激动剂对于目标人抗原或某一表位具有特异性时，其功能为配体-受体相互作用(结合)。在各种实施方案中，由候选治疗性抗体或siRNA结合的表位可使用从如本文所述的非人动物分离的细胞来确定。
来自所提供的非人动物的细胞可被分离并在特别基底(ad hoc basis)上使用，或者可在培养物中维持许多代。在各种实施方案中，来自所提供的非人动物的细胞为永生化(例如，经由使用病毒)，并可无限期地保持在培养物中(例如，在连续培养中)。
在一些实施方案中，所述非人细胞为非人淋巴细胞。在一些实施方案中，非人细胞选自B细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。在一些实施方案中，非人细胞为未成熟B细胞、成熟初始B细胞、活化B细胞、记忆B细胞和/或浆细胞。
在一些实施方案中，非人细胞为非人胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，非人ES细胞为啮齿动物ES细胞。在某些实施方案中，啮齿动物ES细胞为小鼠ES细胞并且来自129品系、C57BL品系、BALB/c或其混合物。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞，且为129和C57BL品系的混合物。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞，且为129、C57BL与BALB/c品系的混合物。
在一些实施方案中，提供如本文所述的非人ES细胞用于制备非人动物的用途。在某些实施方案中，非人ES细胞为小鼠ES细胞，并用于制备包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的小鼠。在某些实施方案中，非人ES细胞为大鼠ES细胞，并用于制备包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的大鼠。
在一些实施方案中，非人组织选自脂肪、膀胱、脑、乳腺、骨髓、眼、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及它们的组合。
在一些实施方案中，提供从本文所述的分离的非人细胞或组织制备、产生、制造或获得的永生化细胞。
在一些实施方案中，提供从如本文所述的非人ES细胞制备、产生、制造或获得的非人胚胎。在某些实施方案中，非人胚胎为啮齿动物胚胎；在一些实施方案中，为小鼠胚胎；在一些实施方案中，为大鼠胚胎。
如本文所述的非人动物，提供一种用于产生结合目标多肽的人抗体可变区的变体(例如人Vλ结构域变体)的体内系统。此类变体包括人抗体可变区，其具有所需功能性、特异性，与目标多肽的两种或更多种变体共有的共同表位的低交叉反应性。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物用于多组产生人抗体可变区，所述人抗体可变区包含筛选所需或改进的功能性的一系列变体可变区。
如本文所述的非人动物提供一种用于产生人抗体可变区文库(例如，人Vλ结构域文库)的体内系统。此类可变区文库提供重链和/或轻链可变区序列的来源，其可基于期望的效应子功能移植到不同的Fc区上，使用作为可变区序列的亲和力成熟的来源，利用本领域已知技术(例如定点突变、易错PCR等)，和/或使用作为用于产生基于抗体的治疗分子的抗体成分来源，例如嵌合性抗原受体(即，使用抗体成分工程改造的分子，例如scFv)、多特异性结合剂(例如，双特异性结合剂)和融合蛋白(例如，单结构域抗体，scFv等)。
在一些实施方案中，提供在非人动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用目标抗原对如本文所述的非人动物进行免疫；(b)将所述非人动物维持在足以使非人动物对目标抗原产生免疫应答的条件下；和(c)从结合所述目标抗原的非人动物或非人细胞中回收抗体。
在非人动物中产生抗体的方法的一些实施方案中，所述非人细胞为B细胞。在非人动物中产生抗体的方法的一些实施方案中，所述非人细胞为杂交瘤。
在一些实施方案中，提供了非人动物，所述非人动物的种系基因组包含纯合的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含(i)人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的组合，(ii)人JJλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，以及(iii)非人或人Cλ基因，其中(i)-(iii)彼此可操作地连接，所述非人或人Cλ基因插入内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的非人Cκ基因处，所述人Vλ基因区段包含人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的相应人Vλ基因区段出现，并且所述人Jλ基因区段包含人非编码DNA，所述人非编码DNA天然地邻近于内源性人λ轻链基因座中的相应人Vλ基因区段出现。在所提供的非人动物的某些实施方案中，非人Cλ基因为或包含小鼠Cλ1基因。在所提供非人动物的某些实施方案中，人Cλ基因为或包含人Cλ2基因。在所提供非人动物的某些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含非人免疫球蛋白κ轻链增强子Eκi和3'Eκ。在所提供非人动物的某些实施方案中，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包括非人Vκ和Jκ基因区段的缺失。
在一些实施方案中，提供通过一种方法制备的抗体，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文所述的非人动物；(b)用目标抗原对非人动物进行免疫；(c)将所述非人动物维持在足以使所述非人动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件下；和(d)从结合所述目标抗原的非人动物或非人细胞中回收抗体，其中(d)的抗体包含人VH和Vλ结构域。
在通过一种方法制备的抗体的一些实施方案中，由重排的人重链可变区编码的人VH结构域包含人VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2VH6-1，或它们的体细胞超突变变体。
在通过一种方法制备的抗体的一些实施方案中，由重排的人λ轻链可变区编码的人Vλ结构域包含人Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1，或它们的体细胞超突变的变体。
在一些实施方案中，提供如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织，用于制备和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其片段)。
在一些实施方案中，提供如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织，用于制备用于治疗、预防或改善疾病、病症或疾患的药物。
在一些实施方案中，提供如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织，用于药物或疫苗的制造和/或开发，例如用作药物的用途。
在一些实施方案中，提供如本文所述的非人动物、非人细胞或非人组织，用于制造和/或开发抗体或其片段的用途。
如本文所述的非人动物提供一种用于分析和测试药物或疫苗的体内系统。在各种实施方案中，候选药物或疫苗可递送至如本文所述的一种或多种非人动物中，然后监测所述非人动物，以确定对药物或疫苗的免疫应答、药物或疫苗的安全性概况或对疾病或疾患和/或疾病或疾患的一种或多种症状的影响中的一者或多者。用于确定安全性概况的示例性方法包括毒性测量、最佳剂量浓度、抗体(即抗药物)应答、药物或疫苗的功效和可能的风险因素。这些药物或疫苗可在此类非人动物中改进和/或开发。
疫苗药效可使用多种方法测量。简言之，使用本领域已知的方法接种本文所述的非人动物，然后用疫苗激发，或将疫苗施用至已经感染的非人动物。非人动物对疫苗的应答可通过监测和/或对非人动物(或由其分离出的细胞)进行一种或多种测定来测量，以确定所述疫苗的效力。然后使用本领域已知和/或本文所述的一种或多种措施，将非人动物对疫苗的应答与对照动物进行比较。
疫苗功效可进一步通过病毒中和试验来确定。简言之，将如本文所述的非人动物进行免疫，并在免疫后的不同天收集血清。将血清的系列稀释液与病毒预静置，在此期间血清中对于病毒具有特异性的抗体将与其结合。然后将病毒/血清混合物添加至许可细胞中，以通过噬斑测定或微量中和测定确定感染性。如果血清中的抗体可中和病毒，则与对照组相比，斑块或相对荧光酶单位较少。
如本文所述的非人动物产生人抗体可变区，并且因此，提供一种用于产生人抗体的体内系统，所述人抗体用于诊断应用(例如，免疫学、血清学、微生物学、细胞病理学等)。在各种实施方案中，如本文所述的非人动物可用于产生人抗体可变区，所述人抗体可变区结合相关抗原位点，以用于鉴定细胞变化，例如像指示病理变化的特定细胞表面标志物的表达。此类抗体可与各种化学实体(例如，放射性追踪剂)缀合并且可根据需要用于各种体内和/或体外测定。
如本文所述的非人动物提供一种用于开发和筛选用于肿瘤学和/或传染病学的人抗体的改进的体内系统。在各种实施方案中，如本文所述的非人动物和对照非人动物(例如，具有与如本文所述不同的经遗传修饰的，或不具有经遗传修饰的，即野生型)可植入肿瘤(或肿瘤细胞)或感染病毒(例如，流感病毒、HIV、HCV、HPV等)。在植入感染后，可向非人动物施用候选治疗剂。在施用候选治疗剂之前，可允许肿瘤或病毒有足够的时间在非人动物体内一处或多处建立。或者和/或另外地，可在此类非人动物中监测免疫应答，以表征并选择可开发作为治疗剂的潜在人抗体。
药物组合物
在一些实施方案中，由本文公开的非人动物产生的抗体、核酸或其治疗相关部分，或源自由本文公开的非人动物产生的抗体、核酸或其治疗相关部分可施用至受试者(例如，人受试者)。在一些实施方案中，药物组合物包含由本文公开的非人动物产生的抗体。在一些实施方案中，药物组合物可包含缓冲剂、稀释剂、赋形剂或它们的任何组合。在一些实施方案中，如果需要，组合物还可含有一种或多种额外的治疗活性物质。
尽管本文提供的药物组合物描述主要涉及适合于对人进行道德性施用的药物组合物，但本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合施用至各种动物。修饰适于对人施用的药物组合物，以使所述组合物适于施用至各种动物为可理解的，且一般技术的兽医药理学家可仅通过一般实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。
例如，本文提供的药物组合物可以无菌可注射形式(例如，适于皮下注射或静脉内输注的形式)提供。例如，在一些实施方案中，药物组合物以适于注射的液体剂型提供。在一些实施方案中，药物组合物以粉末形式提供(例如，冻干和/或灭菌)，任选地在真空下，所述粉末可在注射前用水性稀释剂(例如水、缓冲液、盐类溶液等)重新配制。在一些实施方案中，将药物组合物稀释和/或重构于水、氯化钠溶液、醋酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中。在一些实施方案中，粉末应与水性稀释剂轻轻混合(例如，不摇动)。
本文所述药物组合物的制剂可经由药理学领域已知或之后开发的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括将活性成分与稀释剂或另一种赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合的步骤，且然后如果需要和/或希望，将产品成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
在一些实施方案中，包含由本文公开非人动物制造的抗体的药物组合物可包含在用于储存或施用的容器中，例如小瓶、注射器(例如，IV注射器)或袋中(例如，IV袋)。根据本公开的药物组合物可以大包装制备、包装和/或销售，作为单一单位剂量和/或多个单一单位剂量。如本文所使用，“单位剂量”为包含预定活性成分的药物组合物的不连续量。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量，和/或这种剂量的方便部分，例如像这种剂量的一半或三分之一。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或疾患而变化，且进一步取决于组合物的施用途径。举例而言，所述组合物可包含介于0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
药物组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，药学上可接受的赋形剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘着剂、润滑剂以及类似物，适合于所需的特定剂型。Remington's The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)公开用于配制药物组合物的各种赋形剂，以及用于其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如经由产生任何不希望的生物效应，或以不利方式与药物组合物的任何其他成分作用，否则其用途视为落于本发明范围内。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂由美国食品药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂为药用等级。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂、分散剂和/或制粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选地包含在药物组合物中。根据配制者的判断，诸如可可脂以及栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂的赋形剂可存在于组合物中。
在一些实施方案中，缩提供的药物组合物包含一种多种药学上可接受的赋形剂(例如，防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等)。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，药物组合物不含防腐剂。
在一些实施方案中，药物组合物以可冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方案中，药物组合物以不能冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方案中，重构的溶液和/或液体剂型可在重构后储存一段时间(例如，2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长时间)。在一些实施方案中，抗体组合物的储存长于指定时间导致抗体降解。
在施用之前，液体剂型和/或重构溶液可包含颗粒物质和/或变色。在一些实施方案中，如果出现变色或混浊，和/或如果在过滤后仍残留颗粒物质，则不应使用所述溶液。
例如，在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005中可找到配制和/或制造药剂的一般考虑因素。
药盒
本发明进一步提供一种包装或药盒，所述包装或药盒包括填充有至少一种如本文所述的非人动物、非人细胞、DNA片段、靶向载体或它们的任何组合的一个或多个容器。药盒可用于任何可应用的方法(例如，研究方法)。任选地与此类容器缔合者可为呈由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的注意事项，所述注意事项反映(a)所述机构批准用于人的制造、使用或销售，(b)使用说明书，和/或(c)管理两种或更多种材料和/或生物制品(如本文所述的非人动物或非人细胞)转移的合约以及它们的组合。
在一些实施方案中，提供一种药盒，所述药盒包括如本文所述的非人动物、非人细胞、非人组织、永生化细胞、非人ES细胞或非人胚胎。在一些实施方案中，提供一种药盒，所述药盒包括来自如本文所述的非人动物、非人细胞、非人组织、永生化细胞、非人ES细胞或非人胚胎的氨基酸(例如，抗体或其片段)。在一些实施方案中，提供一种药盒，所述药盒包括来自如本文所述的非人动物、非人细胞、非人组织、永生化细胞、非人ES细胞或非人胚胎的核酸(如编码抗体或其片段的核酸)。在一些实施方案中，提供一种药盒，所述药盒包括从如本文所述的非人动物、非人细胞、非人组织、永生化细胞、非人ES细胞或非人胚胎中鉴定的序列(氨基酸和/或核酸序列)。
在一些实施方案中，提供如本文所述的药盒，所述药盒用于制备和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其片段)。
在一些实施方案中，提供如本文所述的药盒，所述药盒用于制备和/或开发用于治疗、预防或改善疾病、病症或疾患的药物(例如，抗体或其片段)。
某些实施方案的其他特征将在示例性实施方案的以下描述过程中变得清楚，所述示例性实施方案为了说明而提供，并且不意图限制本发明。
实施例
提供以下实施例以便向本领域技术人员描述如何制备和使用本文所述的方法和组合物，并且不意图限制本公开的发明人视为其发明的范围。除非另有说明，否则温度以摄氏度表示，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1.构建用于产生表达来自κ轻链基因座的至少一个λ轻链的啮齿动物的靶向载体
实施例1.1.工程改造包含啮齿动物λ恒定区的靶向载体
此实施例说明构建靶向载体用于插入非人动物例如啮齿动物(例如小鼠)的基因组中的示例性方法。此外，此实施例证明非人动物的产生，所述非人动物的种系基因组包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座。特别地，此实施例证明靶向载体的构建，用于在啮齿动物中工程改造内源性免疫球蛋白κ轻链基因座以使得所述啮齿动物表达和/或产生抗体，所述抗体包含免疫球蛋白λ轻链，所述免疫球蛋白λ轻链具有来自非人动物的种系基因组中的所述免疫球蛋白κ轻链基因座的人可变区和非人免疫球蛋白λ恒定(Cλ)区域。如下文实施例2中所述，含有多个人Jλ(例如，Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7)的DNA片段编码序列，并且啮齿动物Cλ(例如，小鼠Cλ1)编码序列插入内源性啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。在特定示例性实施方案中，小鼠Cλ1基因插入小鼠Cκ基因的位置中并可操作地连接至啮齿动物Igκ增强子(例如，Eκi和3'Eκ)。用于产生靶向载体的示例性策略在图1中示出(图1A：构建靶向载体的初始步骤；图1B：构建靶向载体的另外后续步骤；人Vλ基因区段与Jλ基因区段之间的人免疫球蛋白κ轻链序列以具有下宽对角线的空白条状表示)，所述靶向载体用于在啮齿动物中产生经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的特征在于存在可操作地连接至啮齿动物(例如小鼠)Cλ基因且可操作地连接至内源性Igκ增强子的多个人Vλ和Jλ基因区段(例如，参见美国专利号9,006,511、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092)，lox：lox2372；NEO：在泛素启动子的转录控制下的新霉素抗性基因(neoR)，HYG：在泛素启动子的转录控制下的潮霉素抗性基因(hygR)，Spec：壮观霉素抗性基因(SpecR)，R6K：R6K复制起点)。
用于插入啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中的含有人Jλ和啮齿动物Cλ编码序列的靶向载体使用
Figure BDA0002524439450001471
技术(参见，例如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等人,2003,Nature Biotech.21(6):652-9；以引用的方式整体并入本文)和本领域已知的分子生物学技术产生。阅读本实施例的一般技术人员将理解，所描述的技术和方法可根据需要用于利用任何人Jλ和任何Cλ编码序列，或编码序列(或序列片段)的组合。
简言之，含有人Jλ基因区段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7以及分别对应于人Vκ-Jκ基因组(非编码)序列和小鼠Cκ基因的5'基因组序列的独特5'和3'重叠区域的2.7kb的DNA片段由从头DNA合成方式制备(pA；图1A，左上角，Blue Heron Biotech，Bothell，WA)。各种限制酶识别位点包含于DNA片段中，以帮助选择标记和其他DNA片段的随后克隆(如下所述)。DNA片段经过独特设计，以含有与人Jλ编码序列和人Jλ重组信号序列(RSS)并置的非编码人Jκ序列。如技术上已知，RSS由七个核苷酸(七聚体)的保守性嵌段组成，接着为长度为12或23个碱基对的间隔区，且之后为第二段9个核苷酸(九聚体)的保守区。因此，RSS具有7-12-9(12RSS)或7-23-9(23RSS)的构型，取决于相关的基因区段(参见，例如，Murphy,Kenneth等人,“第5章”Janeway's Immunobiology,第8版,Garland Science/Taylor&Francis Group,LLC,2012的图5.4，以引用的方式整体并入本文)。特别地，人Jλ基因区段(即人Jλ编码序列)以及其相关的12RSS在人Jκ基因区段(即人Jκ编码序列)及其相关的23RSS处被取代。因此，此片段含有人Jλ和JκDNA序列。在本文所述的靶向载体中包含此类序列可在经工程改造啮齿动物Igκ轻链基因座内提供(或促进)人Vλ和Jλ基因区段的有效连结。
质粒A(pA)为以AgeI和EcoRI裂解，并连接至含有相容的末端的新霉素选择盒(即，在泛素启动子控制下的NeoR基因，其侧接有lox2372位点)以产生质粒B(pB)(图1A)。此外，含有小鼠Igκ内含子增强子(Ei)、小鼠Cλ1基因(来自BAC克隆RP23-60e14)、含有紧邻于小鼠Cκ编码序列下游的316bp序列的DNA片段以及80bp的重叠序列(以促进等温组装和限制酶识别位点(NotI、MluI)来促进随后的克隆步骤)以及R6K-Spec(壮观霉素腺苷酸转移酶基因和R6K复制起点)的独特DNA片段通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，并经由等温组装组合在一起(参见例如Gibson,D.G.等人,2009,Nat.Meth.6(5):343-5；Gibson,D.G.等人,2010,Nat.Meth.7:901-903；所述文献以引用的方式整体并入本文)，以产生质粒C(pC)，随后用NotI和MluI消化并连接至含有相容性末端的潮霉素(Hygromycin)选择盒(即在泛素启动子控制下的HygR基因，其侧接有loxP位点)以产生质粒D(pD；图1A，顶部和中间右侧)。所得的质粒(pD；图1A，中间)然后用PI-SceI和AscI消化，并与含有相容性末端的质粒B(pB)连接(图1A，底部)，以产生质粒E(pE)。
在下一步骤中，含有可操作地连接至小鼠Cκ基因和人免疫球蛋白κ轻链序列(其定位于人Vλ与Jλ基因区段之间)(参见例如，美国专利号9,006,511，所述专利以引用的方式整体并入本文)的人Vλ和Jλ基因区段的靶向载体单独用NotI消化并重新连接，以除去包含人免疫球蛋白κ序列的人Vλ区域(图1B，顶部)，这导致约137kb的缺失。使用CRISPR/Cas9等温组合法将所得到的构建体(构建体F)与质粒E(pE)组合(参见例如，美国专利号9,738,897和美国公布号2016/0145646；以引用的方式整体并入本文)，以使得具有人Jλ-12RSS编码序列(CDS)的人Jκ区域与人Vκ-Jκ基因间(非编码)区域(参见例如美国专利号9,006,511，以引用的方式整体并入本文)和小鼠Igκ3’增强子(图1B)可操作地连接。在含有卡那霉素(Kanamycin)、潮霉素(Hygromycin)和壮观霉素(Spectinomycin)的培养基上选择阳性细菌克隆。所得到的靶向载体(构建体G)含有(从5'至3')loxP识别位点、NotI位点、人Vκ-Jκ基因间序列(参见例如美国专利号9,006,511，其以引用的方式整体并入本文)、侧接有lox2372识别位点的新霉素(Neomycin)选择盒、具有5个人Jλ基因区段的人Jκ区域以及其各自的12RSS、小鼠免疫球蛋白κ内含子增强子(Eiκ)、小鼠Cλ1基因、侧接有loxP识别位点的潮霉素(Hygromycin)选择盒、小鼠免疫球蛋白κ3'增强子(3'Eκ)以及壮观霉素(Spectinomycin)选择盒(图1B)。
实施例1.2.工程改造包含人λ恒定区的靶向载体
此实施例说明构建用于插入非人动物如啮齿动物(例如小鼠)的基因组中的靶向载体的示例性方法。此外，此实施例证明非人动物的产生，所述非人动物的种系基因组包含经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座。特别地，此实施例证明靶向载体的构建，所述靶向载体用于在啮齿动物中工程改造内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，以使得所述啮齿动物表达和/或产生抗体，所述抗体包含具有来自所述非人动物的种系基因组中的所述免疫球蛋白κ轻链基因座的人可变区和人免疫球蛋白λ恒定(Cλ)区的免疫球蛋白λ轻链。如下面实施例2所述，含有多个人Jλ(如Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6和Jλ7)编码序列以及人Cλ(例如人Cλ2)编码序列的DNA片段插入内源性啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座中。特别地，人Cλ2基因插入小鼠Cκ基因的位置中并与啮齿动物免疫球蛋白κ增强子(例如，Eiκ和3'Eκ)可操作地连接。用于产生靶向载体的示例性策略为在图3中阐述。
用于插入啮齿动物Igκ轻链基因座中的含有人Jλ和人Cλ编码序列的靶向载体使用
Figure BDA0002524439450001491
技术(参见例如美国专利号6,586,251，以及Valenzuela等人,2003,Nature Biotech.21(6):652-9；以引用的方式整体并入本文)，以及技术上已知的分子生物技术创造。阅读本实施例的普通技术人员将理解，所描述的方法和技术可用于根据需要使用任何人Jλ和Cλ编码序列，或编码序列(或序列片段)的组合。
简言之，含有人Cλ编码序列和分别对应于小鼠Cκ基因的基因组序列的5'和3'的独特的5'和3'重叠区的871bp的DNA片段通过从头DNA合成法制备(pH；图3，左上角，BlueHeron Biotech,Bothell,WA)。各种限制酶识别位点包括在DNA片段中，以允许随后克隆选择标记和其他DNA片段(如下所述)。将质粒H(pH)用AgeI和XhoI消化，并连接至含有相容性末端的潮霉素(Hygromycin)选择盒(即在泛素启动子控制下的HygR基因，侧接有loxP位点)以产生质粒J(pJ；图3)。使用CRISPR/Cas9等温组装方法将含有可操作地连接至小鼠Cκ基因和小鼠Igκ增强子的具有人Jλ编码序列的经工程改造的人Jκ区域(如上所述)的中间构建体(构建体K，使用Cas9和等温组装，由构建体F和质粒B产生)与质粒J组合(参见例如美国专利号9,738,897和美国公布号2016/0145646；以引用的方式整体并入本文)，以使得具有人Jλ-12RSS编码序列(CDS)的人Jκ区域与质粒J的人Cλ2可操作地连接(图3)。在含有卡那霉素(Kanamycin)、潮霉素(Hygromycin)和壮观霉素(Spectinomycin)的培养基上选择阳性细菌克隆。所得靶向载体(构建体L)含有(从5'至3')、loxP识别位点、NotI位点、人Vκ-Jκ基因间序列(参见例如美国专利号9,006,511，其以引用的方式整体并入本文)、侧接有lox2372识别位点的新霉素(Neomycin)选择盒、具有5个人Jλ基因区段与其各自的12RSS的人Jκ区域、小鼠Igκ内含子增强子(Eiκ)、人Cλ2基因、侧接有loxP识别位点的潮霉素(Hygromycin)选择盒、小鼠免疫球蛋白κ3'增强子(3'Eκ)和壮观霉素(Spectinomycin)选择盒(图3)。
实施例2.产生具有经工程改造的轻链基因座的啮齿动物
此实施例证明非人动物(例如啮齿动物)的产生，所述非人动物的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入多个人Vλ和Jλ基因区段以及啮齿动物或人Cλ基因，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述啮齿动物或人Cλ基因，并且所述啮齿动物或人Cλ基因插入内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因的位置中。在一些实施方案中，此类非人动物的特征为从内源性免疫球蛋白κ轻链基因座表达免疫球蛋白λ轻链(可变结构域和恒定结构域)。
实施例1.1和1.2中描述的靶向载体的靶向插入通过聚合酶链式反应确认。将通过聚合酶链式反应确认的靶向BAC DNA经由电穿孔引入F1杂交(C57BL6NTac/129S6SvEvTac)小鼠胚胎干(ES)细胞，随后在选择培养基中培养。
用于构建体G(小鼠Cλ1)的电穿孔的ES细胞具有种系基因组，所述种系基因组包含杂合免疫球蛋白κ轻链基因座，所述杂合免疫球蛋白κ轻链基因座含有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因(其包括啮齿动物免疫球蛋白κ轻链增强子)和人免疫球蛋白κ轻链序列(其定位于人Vλ和Jλ基因区段之间)以及一个野生型啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座的多个人Vλ和Jλ基因区段。电穿孔之前和之后的ES细胞描绘于图2A中(1741HET：啮齿动物ES细胞克隆，其具有对于经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的基因组，所述经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座含有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因(其包含啮齿动物免疫球蛋白κ轻链增强子)和人免疫球蛋白κ轻链序列(其定位于人Vλ与Jλ基因区段之间，由具有宽向下对角线的空白条表示)以及一个野生型免疫球蛋白重链和λ轻链基因座的人Vλ和Jλ基因区段，例如参见美国专利号9,006,511、9,035,128、9,066,502、9,150,662和9,163,092，所述专利以引用的方式整体并入本文；6557HET：小鼠ES细胞克隆，其在插入构建体G后产生对于经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的基因组，所述经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的特征在于存在多个人Vλ和Jλ基因区段，所述人Vλ基因区段包含在具有代替相应的人Jκ基因区段编码序列和人Jκ23RSS的人Jλ基因区段编码序列和人Jλ12RSS的人Jκ区域序列中，并且所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白λ轻链恒定区基因(例如，mCλ1)；lox:lox2372；NEO：在泛素启动子转录控制下的新霉素(Neomycin)抗性基因(neoR)；HYG：在泛素启动子转录控制下的潮霉素(Hygromycin)抗性基因(hygR)；用于筛选ES细胞克隆的所选引物/探针组的位置在下文描述的测定中检测到的经工程改造的Igκ轻链基因座内的区域的位置附近指示)。
用于构建体L(小鼠Cλ2)的电穿孔的ES细胞具有种系基因组，所述种系基因组包含异源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述异源性免疫球蛋白κ轻链基因座含有可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白κ轻链恒定区基因(其包含啮齿动物免疫球蛋白轻链κ增强子)和人免疫球蛋白κ轻链序列(其定位于人Vλ与Jλ基因区段之间)以及一个野生型啮齿动物Igκ基因座的多个人Vλ与Jλ基因区段。电穿孔之前和之后的ES细胞描绘于图4A中(1741HET：同上；20029HET：小鼠ES细胞克隆，其在插入靶向载体后具有对于经工程改造的Igκ轻链基因座为杂合的基因组，所述经工程改造的Igκ轻链基因座包含啮齿动物免疫球蛋白κ轻链增强子，所述经工程改造的Igκ轻链基因座的特征在于存在多个人Vλ和Jλ基因区段，所述人Jλ基因区段包含在具有代替相应的人Jκ基因区段编码序列和人Jκ23RSS的人Jλ基因区段编码序列和人Jλ12RSS的人Jκ区域序列中，并且所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至人Igλ轻链恒定区基因(例如，hCλ2)；lox：lox2372；NEO：在泛素启动子转录控制下的新霉素(Neomycin)抗性基因(neoR)；HYG：在泛素启动子转录控制下的潮霉素(Hygromycin)抗性基因(hygR)；用于筛选ES细胞克隆的所选引物/探针组的位置在下文描述的测定中检测到的经工程改造的Igκ轻链基因座内的区域的位置附近指示)。
在电穿孔后10天挑选抗药性菌落，并通过TAQMANTM筛选，且进行核型分析以进行正确的靶向，如前所述(Valenzuela等人,同上；Frendewey,D.等人,2010,MethodsEnzymol.476:295-307；以引用的方式整体并入本文)。表1列出了用于筛选阳性ES细胞克隆的示例性引物/探针组(F：正向；R：反向；P：探针；GOA：等位基因增加；LOA：等位基因缺失；WT：野生型)。
其中将靶向ES细胞注射到未浓缩的8-细胞期Swiss Webster胚胎中的
Figure BDA0002524439450001531
方法(DeChiara,T.M.等人,2010,Methods Enzymol.476:285-294；DeChiara,T.M.,2009,Methods Mol.Biol.530:311-324；Poueymirou等人,2007,Nat.Biotechnol.25:91-99；以引用的方式整体并入本文)用于产生健康的完全ES细胞来源的F0代小鼠，所述F0代小鼠对于经工程改造的Igκ轻链基因座为杂合的(图2A和4A)。将F0代杂合的小鼠与C57Bl6/NTac小鼠杂交，以产生F1杂合子，将所述F1杂合子杂交以产生纯合的F2代动物用于表型分析。
或者，可修饰携带如上所述的经工程改造的免疫球蛋白κ基因座的鼠类ES细胞，以根据需要移除经由靶向载体引入的一个或多个选择盒(图2B：6557HET：同上；6558HET：在与靶向载体同源重组后插入的新霉素和潮霉素选择盒的重组酶介导的切除后的小鼠ES细胞克隆；图4B：20029HET：同上；20030HET：在与靶向载体同源重组后插入的新霉素和潮霉素选择盒的重组酶介导的切除后的小鼠ES细胞克隆。Cre：Cre重组酶)。例如，通过靶向载体引入的新霉素和潮霉素盒可通过瞬时重组酶表达或通过育种表达重组酶的经遗传工程改造的品系在经工程改造的ES细胞(或胚胎)中移除(参见例如Lakso,M.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6；Orban,P.C.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6861-5；Gu,H.等人,1993,Cell 73(6):1155-64；Araki,K.等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:160-4；Dymecki,S.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(12):6191-6；所述文献全部以引用的方式整体并入本文)。
总而言之，此实施例说明啮齿动物(例如，小鼠)的产生，所述啮齿动物的种系基因组包含经工程改造的Igκ轻链基因座，所述经工程改造的Igκ轻链基因座的特征在于存在可操作地连接至啮齿动物或人Cλ基因的多个人Vλ与Jλ基因区段，所述啮齿动物或人Cλ基因插入内源性Igκ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因的位置中。如所述的经工程改造的Igκ轻链基因座包含呈非内源性排列的多个人Vλ和Jλ基因区段。本文所述的用于将人Vλ和Jλ基因区段以及啮齿动物或人Cλ基因插入啮齿动物Cκ基因位置中的策略能够构建表达抗体的啮齿动物，所述抗体仅含有人Vλ结构域。目前尚不清楚这种仅包含λ基因区段(在内源性λ基因座之外，呈非内源性取向)的经工程改造的Igκ轻链基因座是否能够产生功能性轻链。如本文所述，此类人Vλ结构域由所提供的啮齿动物的种系基因组中的内源性Igκ轻链基因座表达。
表1.用于筛选阳性ES细胞克隆的代表性引物/探针组
Figure BDA0002524439450001541
Figure BDA0002524439450001551
实施例3.具有经工程改造的免疫球蛋白轻链基因座的啮齿动物的鉴定
实施例3.1.具有经工程改造的免疫球蛋白轻链基因座的啮齿动物的免疫细胞的表型评估
此实施例证明啮齿动物(例如小鼠)中各种免疫细胞群体的鉴定，所述啮齿动物经工程改造以在内源性免疫球蛋白κ轻链基因座内含有可操作地连接至啮齿动物Cλ基因以及啮齿动物免疫球蛋白κ轻链增强子和调节区的多个人Vλ合Jλ基因区段。特别地，此实施例具体地证明，与野生型啮齿动物相比，本文所述的具有经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物展示独特的轻链表达谱。此实施例还证明，所提供的啮齿动物由经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座表达广范围的人Vλ区域库。
简言之，自野生型(WT、75％C57BL/6NTac 25％129SvEvTac)和6558HO((纯合的LiK、75％C57BL/6NTac 25％129SvEvTac)小鼠收获脾和股骨。通过用含有2.5％胎牛血清(FBS)的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)冲洗来从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液(Gibco)裂解来自脾和骨髓制备物的红血球，之后用含有2.5％FBS的1xPBS冲洗。
将分离的细胞(1x106)与选定的抗体混合物一起于+4℃静置30分钟：抗-mIgκ-FITC(187.1，BD Biosciences)、抗-mIgλ-PE(RML-42,BioLegend；1060-09,SouthernBiotech)、抗-mIgλ-FITC(106002,Bio-Rad；ABIN303989,Antibodies-online)、抗小鼠IgM-PeCy7(II/41,eBioscience)、抗小鼠IgD-PerCP/Cy5.5(11-26c.2a,BioLegend)、抗小鼠CD3-Pacific Blue(17A2,BioLegend)、抗小鼠B220-APC(RA3-6B2,eBioscience)、抗小鼠CD19-APC-H7(ID3,BD Biosciences)。在染色后，将细胞洗涤并在2％甲醛中固定。数据采集在BD LSRFORTESSATM流式细胞仪上进行，并用FLOWJOTM软件进行分析。代表性结果如图5-7所示。
如图5和6所示，与脾脏和骨髓区室中的野生型小鼠相比，LiK小鼠展现CD19+和未成熟/成熟B细胞的类似分布。然而，与野生型小鼠相比，LiK小鼠展现独特的轻链表达，在于在这些小鼠中仅观察到Igλ+表达(图7)。特别地，LiK小鼠中>90％的CD19+B细胞表达免疫球蛋白λ轻链，从而证实在经工程改造的免疫球蛋白κ基因座处的适当重组和表达。如所预期的，鉴于这些小鼠缺乏小鼠Cκ基因，LiK小鼠证明出在流式细胞术中无可检测的免疫球蛋白κ表达(即，抗-mIgκ抗体检测到恒定区)。从另外的LiK小鼠同窝小鼠中观察到相似水平的免疫球蛋白λ轻链表达(数据未显示)。在来自LiK基因座的小鼠Cλ区域的背景下人Vλ区域的表达尤其通过使用下一代测序技术(在下文的实施例3.2中描述)的免疫球蛋白库分析而确认。
实施例3.2具有经工程改造的免疫球蛋白轻链基因座的啮齿动物的免疫球蛋白库
上述经工程改造的啮齿动物品系中的人抗体基因(即VDJ基因区段)的用途通过下一代测序抗体库分析而确定。特别地，对从对于LiK基因座纯合的小鼠的脾细胞分离的RNA(6558HO)进行RT-PCR测序，以确认LiK基因座的正确转录和重组。重排的LiK基因座代表性说明如图12所示(LiK基因座：如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座；重排的LiK基因座：经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座(本文称为“LiK基因座”)的代表性重排，导致人Vλ-Jλ重组；重排的LiK mRNA：重排的LiK基因座的代表性转录和mRNA加工)。
简言之，通过使用小鼠抗CD19磁珠和
Figure BDA0002524439450001571
柱(Miltenyi Biotech)的磁性细胞分选，从总脾细胞中富集脾B细胞。根据制造商的说明书，使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(Qiagen)，从纯化的脾B细胞中分离总RNA。使用SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)和免疫球蛋白λ特异性引物(参见下文)进行逆转录，以产生含有免疫球蛋白λ恒定区基因序列的cDNA。在此过程中，将DNA序列(模板转换(TS)引物的3'的反向互补序列)连接至新合成的cDNA的3'端。然后使用TS特异性引物和对小鼠Cλ1序列具有特异性的反向引物通过第1轮PCR反应扩增纯化的Igλ-特异性cDNA。使用Pippin Prep(SAGE Science)分离约450-700bp范围内的PCR产物，且然后通过第2轮PCR反应进一步扩增这些片段。表2列出用于谱库构建的选定引物的序列(for：正向引物；rev：反向引物)。将约400bp-700bp范围内的PCR产物分离、纯化并使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems)通过qPCR定量，然后负载到Miseq测序仪(Illumina)上用于使用Miseq试剂盒v3(2x300个循环)进行测序。
对于生物信息分析，将Raw Illumina序列基于质量、长度和与相应恒定区基因引物的匹配度进行去多重化和过滤。将重叠的配对末端读数使用定制内部管线进行合并和分析。所述管线使用IgBLAST(NCBI,V2.2.25+)的局部安装，以将重排的轻链序列与人种系Vλ和Jλ基因区段数据库进行比对，并表示生产性和非生产性连接以及终止密码子的存在。使用国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中定义的边界，提取CDR3序列和预期的非模板核苷酸。
表2.用于谱库构建的代表性引物
Figure BDA0002524439450001581
包含在本文中例示的经工程改造的小鼠的LiK基因座的大部分功能性人Vλ和Jλ基因区段以LiK小鼠的表达的抗体库表示，所述小鼠包含可操作地连接至内源性κ基因座处的啮齿动物Cλ基因的多个人Vλ和Jλ基因区段(数据未示出)。总之，本发明人观察到LiK小鼠的B细胞如所预期地表达具有从LiK基因座表达的轻链的抗体。在所分析的转录物中，并未观察到改变的剪接产物、插入、缺失或其他未预期的突变。这些结果证实，LiK基因座处的重组产生功能性轻链作为这些小鼠的抗体库的一部分。类似的分析在包含可操作地连接至内源性κ基因座处的人Cλ基因的多个人Vλ和Jλ基因区段的小鼠中进行，其中检测到多个人Vλ和Jλ基因区段的表达(数据未示出)。
实施例3.3.具有经工程改造的轻链基因座的啮齿动物中的抗体表达
此实施例证明从非人动物表达抗体(例如IgG)，所述抗体含有轻链，所述轻链的特征在于存在人Vλ区域和啮齿动物或人Cλ区域，并且所述轻链从经工程改造的内源性啮齿动物免疫球蛋白κ轻链基因座表达。此外，此实施例具体地证明非人动物(例如啮齿动物)血清中IgG抗体(二聚体和单体形式)的表达，所述啮齿动物的种系基因组包含内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含插入一个或多个人Vλ基因区段、一个或多个人Jλ基因区段和啮齿动物Cλ基因，所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至所述啮齿动物Cλ基因，并且所述啮齿动物Cλ基因插入内源性啮齿动物Igκ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因的位置中。
从野生型(WT，75％C57BL/6NTac 25％129SvEvTac)和6558纯合的(“LiK”，75％C57BL/6NTac 25％129SvEvTac)小鼠中抽取血液。使用Eppendorf管，在4℃下以9000rpm离心5分钟，从血液中分离血清。所收集的血清用于免疫印迹术，以鉴定IgG抗体的表达。
将小鼠血清在PBS(不含Ca2+和Mg2+)中1:100或1:500稀释，并在还原和非还原条件下在4％-20％Novex Tris-Glycine凝胶上运行。根据制造商的说明书，将凝胶转移质聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将印迹与5％脱脂牛奶在具有0.05％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBST，Sigma)中封闭过夜。在室温下将PVDF膜暴露于在TBST中的0.1％脱脂牛奶中1:1000稀释的第一抗体(与HRP缀合的山羊抗-mIgG1，Southern Biotech)1小时。将印迹洗涤四次，每次洗涤10分钟，并根据制造商的说明书，使用Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare Life Sciences)显影5分钟。印迹然后使用GE Healthcare ImageQuant LAS-4000Cooled CCD Camera Gel Documentation System进行成像。以15秒的间隔拍摄图像，直至拍摄20张图像或图像完全曝光，以先发生者为准。代表性结果如图13所示(泳道编号显示在每个凝胶图像的顶部，并且两个图像的泳道分配为相同的；左上：还原样品；左下：非还原样品；LiK HO：6558杂合的；WT：野生型；分子量在每一凝胶图像的左侧指示)
如图13所示，在LiK小鼠中表达的IgG抗体大小与针对在野生型小鼠中表达的IgG抗体观察到的大小相似，其证明LiK小鼠产生结合抗原的功能性抗体并且可用作为体内系统，用于产生用于治疗人疾病的人抗体和人抗体组分。
实施例4.包含若干经工程改造的免疫球蛋白基因座的啮齿动物的产生和表征
如本文所述的LiK啮齿动物使用本领域已知的技术分别与多种经工程改造的啮齿动物品系育种，多重育种，以建立含有以下经工程改造的免疫球蛋白基因座的啮齿动物品系：(1)啮齿动物品系，其对于人源化免疫球蛋白重链为纯合的(参见，例如，美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)、对于包含可操作地连接至如本文所述的Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段的免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的且对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的(参见例如，美国专利号9,006,511，所述专利以引用的方式整体并入本文)，在一些实施方案中，在本文中称为HoH/LiK/λ-/-小鼠，(2)啮齿动物品系，其对于人源化免疫球蛋白重链基因座为纯合的(同上)、对于失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的(同上)并且对于免疫球蛋白κ轻链基因座为半合子，所述免疫球蛋白κ轻链基因座具有包含可操作地连接至如本文所述的Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段的第一免疫球蛋白κ轻链基因座以及包含可操作地连接至内源性小鼠Cκ基因的人Vκ和Jκ基因区段的第二免疫球蛋白κ轻链基因座(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)，在一些实施方案中，在本文中称为HoH/KoK/LiK/λ-/-小鼠。或者，这种小鼠可通过将包含经工程改造的基因座的靶向载体引入已包含若干经工程改造的免疫球蛋白基因座的ES细胞中而产生。在一些实施方案中，所述啮齿动物中的免疫球蛋白重链基因座包含功能性和表达的啮齿动物Adam6基因。
具体而言，LiK小鼠在多重育种中与多种经工程改造的小鼠品系一起繁殖，以建立HoH/LiK/λ-/-和HoH/KoK/LiK/λ-/-小鼠。
一旦建立，在这些人源化小鼠中通过流式细胞术鉴定各种免疫细胞群体。简言之，从HoH/LiK/λ-/-(n＝3)、HoH/KoK/LiK/λ-/-(n＝4)和
Figure BDA0002524439450001611
(“HoH/KoK”；n＝3；参见美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)小鼠收获脾脏和股骨，并如上所述制备用于流式细胞术分析。代表性结果在图8-11中列出。在所测试的经工程改造的小鼠品系的脾细胞中观察到的平均轻链表达(κ:λ)大致如下：HoH/LiK/λ-/-：0:100，HoH/KoK/LiK/λ-/-：40:60，HoH/KoK：85:15。
实施例5.在经工程改造的啮齿动物中产生抗体
此实施例说明在啮齿动物中，使用目标抗原(例如，单次跨膜或多次跨膜膜蛋白等)产生抗体，所述啮齿动物包含如上所述的经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座。此实施例中描述的方法或本领域熟知的免疫方法可用于以各种抗原(例如多肽等)免疫含有经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物，如上所述。本文上述的任何经遗传修饰的啮齿动物，例如，LiK小鼠-包含免疫球蛋白κ轻链基因座(其包含可操作地连接至Cλ基因的人Vλ和Jλ基因区段)的小鼠(如对于LiK基因座为纯合的小鼠)；HoH/LiK/λ-/--小鼠-包含LiK基因座的小鼠(如对于LiK基因座为纯合的小鼠)，并且所述小鼠还包含人源化免疫球蛋白重链基因座(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)以及失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座(参见例如，美国专利号9,006,511，其以引用的方式整体并入本文)；以及HoH/KoK/LiK/λ-/-小鼠-对于免疫球蛋白κ轻链基因座为半合子的小鼠，所述免疫球蛋白κ轻链基因座具有包含LiK的第一免疫球蛋白κ轻链基因座和包含可操作地连接至内源性小鼠Cκ基因的人Vκ与Jκ基因区段的第二免疫球蛋白κ轻链基因座(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940)，并且还包含人源化免疫球蛋白重链基因座(参见例如，美国专利号8,642,835和8,697,940，所述专利各自以引用的方式整体并入本文)以及失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座(参见例如美国专利号9,006,511，其以引用的方式并入本文)可用于在用目标抗原进行免疫化之后产生抗体。此类小鼠适于免疫以及产生人抗体和/或人抗体片段。
使用本领域已知的免疫方法用目标抗原激发还包含上述经工程改造的免疫球蛋白基因座的LiK小鼠。通过ELISA免疫测定监测抗体免疫应答(即血清效价)。当实现所需的免疫应答时，收获脾细胞(和/或其他淋巴组织)，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保持其存活力并形成永生杂交瘤细胞系。对所产生的杂交瘤细胞进行筛选(例如，通过ELISA测定)和选择，以鉴定出产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞系。可根据需要进一步表征杂交瘤的相对结合亲和力和同种型。使用这种技术和上述免疫原，获得若干抗原特异性嵌合抗体(即，具有人可变结构域和啮齿动物恒定结构域的抗体)。
可分离或制备编码重链和轻链可变区的DNA，并且可连接至人重链和轻链恒定区(例如，具有所需的同种型)，以制备完全人抗体。此类完全人抗体(和/或其重链或轻链)可在细胞中产生，通常为哺乳动物细胞，如CHO细胞。然后针对目标抗原的相对结合亲和力和/或中和活性来表征完全人抗体。
编码抗原特异性嵌合抗体(其由本文描述和/或例示的经工程改造的小鼠的B细胞产生)和/或其轻链和/或重链的可变结构域的DNA可直接从抗原特异性淋巴细胞中分离出。例如，可分离并表征具有人可变区和啮齿动物恒定区的高亲和力嵌合抗体，以使得定义特定目标抗体(和/或产生它们的B细胞)。仅举几个例子，此类抗体和/或其可变区和/或恒定区的评估特征可为或包括亲和力、选择性、表位的同一性等中的一者或多者。
啮齿动物恒定区用所需的人恒定区置换，以产生完全人抗体。尽管所选择的恒定区可根据特定用途而不同，但在可变区中都具有高亲和力抗原结合以及目标特异性特征。或者，当使用含有人Cλ2基因的LiK小鼠代替本文所述的啮齿动物Cκ基因时，省略了置换抗体(从经免疫的小鼠中分离)的啮齿动物恒定区的步骤。抗原特异性抗体还直接从抗原阳性但不与骨髓瘤细胞融合的B细胞(来自免疫的小鼠)中分离出，例如美国专利号7,582,298中所述，所述专利具体地以引用的方式整体并入本文。使用这种方法，制备若干完全人抗原特异性抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。
实施例6.产生具有经工程改造的轻链基因座并表达人末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)基因的啮齿动物
实施例6.1.产生具有经工程改造的轻链基因座并表达人TDT的啮齿动物
此实施例说明产生小鼠，所述小鼠的种系基因组包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座，并且进一步表达人TdT。表达人TdT的小鼠为如WO 2017/210586的实施例1.1中所述制备，所述专利以引用的方式整体并入本文。经过多次育种，产生具有包含如本文所述的经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座且进一步表达人TdT的基因组的小鼠，以建立含有两种修饰的小鼠品系的群组。
实施例6.2.具有经工程改造的κ基因座并表达人TDT的啮齿动物的表型评估
一旦建立，就通过流式细胞术在这些人源化小鼠中表征免疫细胞群体。简言之，从HoH/LiK/λ-/-/TdT(n＝4)和HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT(n＝6)小鼠中收获脾和股骨，并且如上所述制备用于流式细胞术分析(参见上文实施例3)。代表性结果在图14-17中列出。在所测试的经工程改造的小鼠品系的脾细胞中观察到的平均轻链表达(κ:λ)如下：HoH/LiK/λ-/-/TdT：0:100，HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT：45:55。
实施例6.3.人免疫球蛋白κ连接多样性，以及包含人TdTS的LiK小鼠中的非种系添加
如WO 2017/210586(以引用的方式整体并入本文)所证明，包含外源性引入的TdT的小鼠在它们的轻链中表现出连接多样性和非种系核苷酸添加(还如本文所用的“非模板核苷酸添加”)两者的增加。使用下一代测序技术对包含HoH/LiK/λ-/-/TdT和HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT的小鼠进行评估，以确定它们的免疫球蛋白谱系序列多样性以及在它们的CDR3中非模板核苷酸添加的存在。
简言之，从小鼠收获脾细胞，并且通过抗小鼠CD19磁珠和MACS柱(MiltenyiBiotech)，从总脾细胞中阳性富集B细胞。使用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)，从脾B细胞中分离总RNA。
使用寡-dT引物进行反转录，之后使用SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)进行基因特异性PCR，以产生含有小鼠Cλ1序列的cDNA。在反转录过程中，将特异性DNA序列(PIIA：5’-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3’，SEQ ID NO:71)连接至新合成cDNA的3’端。通过NucleoSpin Gel和PCR Clean-Up试剂盒(Clontech)纯化cDNA，然后使用与小鼠Cλ1特异性引物(5’-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3’，SEQ ID NO:73)配对的PIIA(5’–AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACAT–3’，SEQ ID NO:72)反向互补的引物进一步扩增。
然后使用PIIA特异性引物(5’-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT-3’，SEQ ID NO:74)以及巢式(nested)小鼠Cλ1特异性引物(5’-ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGGTGG AAACAGGGTG ACTGATG-3’，SEQ ID NO:75)通过PCR扩增纯化的扩增子。分离介于450-690bp之间的PCR产物并通过Pippin Prep(SAGE Science)收集。使用以下引物通过PCR进一步扩增这些片段：5’-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATC-3’，SEQ ID NO:76以及5’-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXX GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCT-3’，SEQ ID NO:77(“XXXXXX”代表6bp索引序列，以使多重样品可测序)。通过PippinPre分离并收集介于490bp-710bp之间的PCR产物，然后使用KAPA文库定量试剂盒(KAPABiosystems)进行qPCR定量，之后负载到Miseq测序仪(Illumina)上进行测序(v3，600-循环)。
对于生物信息学分析，将所得Illumina序列去多重化并修正质量。然后使用局部安装的igblast(NCBI、v2.2.25+)组装并注释重叠的配对末端读数。将读数与人种系Vλ和Jλ片段数据库进行比对，并针对最佳命中进行分选。当检测到具有相同分数的多个最佳命中时，将序列标记为模棱两可，并从分析中移除。开发一组内部perl脚本来分析结果。
测试来自HoH/LiK/λ-/-/TdT小鼠脾B细胞的λ轻链以及来HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT小鼠脾B细胞的λ和κ轻链两者在λ和/或κ基因座处的非模板添加和连接多样性方面的增加。来自HoH/LiK/λ-/-/TdT和HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT小鼠的轻链在连接多样性方面增加至少2倍，如通过独特CDR3/10,000读数的数量所测量(数据未示出)。此外，与没有TdT的对照小鼠的轻链相比，约50％的来自HoH/LiK/λ-/-/TdT和HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT小鼠的轻链(λ和/或κ)表现出非模板添加，对照小鼠的轻链仅具有约10％的非模板添加(数据未示出)。
实施例7.经工程改造的啮齿动物的免疫，以及针对免疫原的免疫应答的分析
此实施例说明LiK/VI-3和LiK/VI-3/TdT小鼠的免疫，以及针对免疫原的血清抗体应答的分析。简言之，使用标准方案和佐剂将(1)VI-3/TdT(例如，人κ轻链的阳性对照，其还具有内源性小鼠λ轻链基因座)和具有人λ轻链的VI-3小鼠，(2)LiK/VI-3以及(3)LiK/VI-3/TdT分别用蛋白质免疫原进行免疫。在免疫开始前将小鼠采血，并在免疫原加强后定期采血。针对对应抗原测定抗血清效价。
使用ELISA测定针对免疫原的血清中的抗体效价。将96孔微量滴定板(Pierce)涂覆磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS，Irvine Scientific)中的2μg/ml抗原在4℃下过夜。用含有0.05％Tween-20(PBS-T，Sigma-Aldrich)的PBS溶液洗涤滴定板，并在室温下用PBS中的250μl的0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)封闭1小时。用PBS-T洗涤滴定板。将免疫前和免疫抗血清在1％BSA-PBS中连续稀释3倍，并在室温下加入板中1小时。洗涤滴定板，并将山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体(Jackson Immunoresearch)、山羊抗小鼠κ-HRP(SouthernBiotech)或山羊抗小鼠λ-HRP(SouthernBiotech)以1:5000稀释添加至所述板并在室温下孵育1小时。洗涤滴定板并使用TMB/H2O2作为底物通过孵育15-20分钟显色。用酸终止反应，将板于光谱仪(Victor,Perkin Elmer)上在450nm处读取。使用Graphpad PRISM软件计算抗体效价。效价定义为插入的血清稀释因子，其中结合信号为背景值的2倍。
用蛋白质免疫原免疫之后，研究LiK/VI-3、LiK/VI-3/TdT以及VI-3/TdT小鼠中的体液免疫应答。来自用蛋白质免疫的小鼠的抗血清显示出对于LiK/VI-3和LiK/VI-3/TdT品系中的抗原的高效价，与VI-3/TdT品系可比较(图18)。在LiK/VI-3和LiK/VI-3/TdT小鼠中引发高λ效价。在VI-3/TdT品系小鼠中，在三只小鼠中未观察到λ效价，而在两只小鼠中观察到低效价，这对应于这种品系中的小鼠λ可变区的低使用率。如所预期的，在LiK/VI-3和LiK/VI-3/TdT小鼠中未引发κ效价，因为它们缺乏κ轻链，而VI-3/TdT则显示高κ效价。图19示出在具有抗-Fc和抗-κ检测的所有三种小鼠品系中，在His标签不相关蛋白质抗原上，观察到基线效价(最低血清稀释度)，而在LiK/VI-3和LiK/VI-3/TdT小鼠中，用抗λ检测仅观察到非常低的效价。
某些实施方案
实施方案1.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因；并且
其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案2.如实施方案1所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
实施方案3.如实施方案1所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
实施方案4.如实施方案3所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案5.如实施方案4所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案7.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；以及
(b)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案8.如实施方案7所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案9.如实施方案1-8中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
实施方案10.如实施方案1-9中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
实施方案11.如实施方案1-10中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案12.如实施方案11所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案13.如实施方案11所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案14.如实施方案1-13中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案15.如实施方案14所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案16.如实施方案14所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案17.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地出现在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，并且
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因。
实施方案18.如实施方案17所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案19.如实施方案18所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案20.如实施方案1-19中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案21.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含人重链可变结构域序列和啮齿动物重链恒定结构域序列，其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的；
(b)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因；以及
(c)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性啮齿动物Cκ区域基因的一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个Jκ基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人κ轻链可变结构域序列和啮齿动物κ轻链恒定结构域序列，
其中所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人λ轻链可变结构域序列和啮齿动物λ轻链恒定结构域序列。
实施方案22.如实施方案20或21所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
实施方案23.如实施方案20-22中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案24.如实施方案20-23中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人VH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人DH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人JH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
实施方案25.如实施方案20-24中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案26.如实施方案20-25中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
实施方案27.如实施方案20-26中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
实施方案28.如实施方案20-27中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
实施方案29.如实施方案28所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中表达所述一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
实施方案30.如实施方案28或29所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
实施方案31.如实施方案28-30中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
实施方案32.如实施方案28-31中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
实施方案33.如实施方案28-32中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
实施方案34.如实施方案28-33中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
实施方案35.如实施方案34所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
实施方案36.如实施方案28-31中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
实施方案37.如实施方案20和22-36中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
实施方案38.如实施方案9-37中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因具有与小鼠Cλ1、小鼠Cλ2或小鼠Cλ3基因至少80％相同的序列。
实施方案39.如实施方案9-38中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因包括小鼠Cλ1基因。
实施方案40.如实施方案9-39中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因包括大鼠Cλ基因。
实施方案41.如实施方案40所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述大鼠Cλ基因具有与大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3或大鼠Cλ4基因至少80％相同的序列。
实施方案42.如实施方案1-41中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段代替一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。
实施方案43.如实施方案1-42中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段置换一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。
实施方案44.如实施方案1-43中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的κ轻链非编码序列。
实施方案45.如实施方案44所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述κ轻链非编码序列为人κ轻链非编码序列。
实施方案46.如实施方案45所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列。
实施方案47.如实施方案1-46中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，所述经遗传修饰的啮齿动物还包含失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。
实施方案48.如实施方案47所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为杂合的。
实施方案49.如实施方案47所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的。
实施方案50.如实施方案1-49中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述内源性Vλ基因区段、所述内源性Jλ基因区段和所述内源性Cλ基因全部或部分缺失。
实施方案51.如实施方案1-50中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
实施方案52.如实施方案1-51中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白κ轻链可变结构域。
实施方案53.如实施方案1-52中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物包含表达包括免疫球蛋白λ轻链的抗体的B细胞群体，所述免疫球蛋白λ轻链各自包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
实施方案54.如实施方案53所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列编码，所述重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列包含(i)所述一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
实施方案55.如实施方案1-54中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
实施方案56.如实施方案55所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
实施方案57.如实施方案55或56所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
实施方案58.如实施方案55-57中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述种系基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
实施方案59.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含
(a)编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；
(b)经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，以使得所述啮齿动物表达各自包含人重链可变结构域序列和啮齿动物重链恒定结构域序列的免疫球蛋白重链，其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的；以及
(c)经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6与Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列包含天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因，
其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的，并且
其中所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与啮齿动物λ轻链恒定结构域序列融合的人λ轻链可变结构域序列。
实施方案60.如实施方案1-59中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
实施方案61.一种分离的啮齿动物细胞，所述分离的啮齿动物细胞获自如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物。
实施方案62.一种永生化细胞，所述永生化细胞由如实施方案61所述的分离的啮齿动物细胞产生。
实施方案63.如实施方案61所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
实施方案64.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎由如实施方案63所述的啮齿动物ES细胞产生。
实施方案65.如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备抗体的用途。
实施方案66.如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备轻链可变区序列的用途。
实施方案67.如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备轻链可变结构域序列的用途。
实施方案68.一种获自如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物的分离的B细胞，其中所述B细胞的基因组包含：
(a)可操作地连接至λ轻链可变区序列的重排的人λ轻链可变区序列，其中所述重排的人λ轻链可变区序列包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及
(ii)一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
实施方案69.如实施方案68所述的分离的B细胞，所述B细胞还包含：
(b)可操作地连接至啮齿动物重链可变区序列的重排的人重链可变区序列，其中所述重排的人重链可变区序列包含：
(i)一个或多个人VH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，
(ii)一个或多个人DH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
实施方案70.一种抗体，所述抗体通过包括以下步骤的方法制备：
(a)提供如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物；
(b)用目标抗原对所述啮齿动物进行免疫；
(c)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(d)从所述啮齿动物回收：
(i)结合所述目标抗原的抗体，
(ii)核苷酸，所述核苷酸编码结合所述目标抗原的抗体的人轻链或重链可变结构域、轻链或重链，或
(iii)表达结合所述目标抗原的抗体的细胞，
其中(d)的抗体包含人重链可变结构域和人λ轻链可变结构域。
实施方案71.一种分离的啮齿动物细胞，所述分离的啮齿动物细胞的基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述分离的啮齿动物细胞在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案72.如实施方案71所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
实施方案73.如实施方案71所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
实施方案74.如实施方案73所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案75.如实施方案74所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案76.如实施方案71-75中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞缺乏所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因。
实施方案77.如实施方案71-76中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
实施方案78.如实施方案71-77中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者与一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
实施方案79.如实施方案71-78中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案80.如实施方案79所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案81.如实施方案79所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案82.如实施方案71-81中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(a)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(b)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案83.如实施方案82所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案84.如实施方案82所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案85.如实施方案71-84中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞的所述基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案86.如实施方案85所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
实施方案87.如实施方案85或86所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案88.如实施方案85-87中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
实施方案89.如实施方案85-88中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案90.如实施方案85-89中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
实施方案91.如实施方案85-90中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
实施方案92.如实施方案85-91中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞的所述基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
实施方案93.如实施方案92所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
实施方案94.如实施方案92或93所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
实施方案95.如实施方案92-94中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
实施方案96.如实施方案92-95中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
实施方案97.如实施方案92-96中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
实施方案98.如实施方案97所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
实施方案99.如实施方案92-94中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
实施方案100.如实施方案85-99中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
实施方案101.如实施方案71-100中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
实施方案102.如实施方案101所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
实施方案103.如实施方案101或102所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
实施方案104.如实施方案101-103中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述啮齿动物细胞的所述基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
实施方案105.如实施方案71-104中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为大鼠细胞或小鼠细胞。
实施方案106.一种永生化细胞，所述永生化细胞由如实施方案71-105中任一项所述的分离的啮齿动物细胞产生。
实施方案107.如实施方案71-105中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
实施方案108.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎由如实施方案107所述的啮齿动物ES细胞产生。
实施方案109.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将一个或多个DNA片段引入啮齿动物ES细胞的基因组中的第一经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座中，其中所述一个或多个DNA片段包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述Cλ基因在内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处引入所述啮齿动物ES细胞的所述基因组中，并且其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述Cλ基因可操作地连接；以及
(b)使用(a)中产生的所述啮齿动物ES细胞产生啮齿动物。
实施方案110.如实施方案109所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案111.如实施方案109或110所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案112.如实施方案109-111中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA片段还包含至少一种选择标记。
实施方案113.如实施方案109-112中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA片段还包含至少一个位点特异性重组位点。
实施方案114.如实施方案109-113中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中引入一个或多个人Vλ非编码序列和一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于人Vλ基因区段，并且所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于人Jλ基因区段。
实施方案115.如实施方案109-114中任一项所述的方法，所述方法还包括将κ轻链非编码序列引入所述啮齿动物ES细胞的所述基因组中，以使得所述κ轻链非编码序列位于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间。
实施方案116.如实施方案109-115中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞为大鼠ES细胞或小鼠ES细胞。
实施方案117.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述啮齿动物的种系基因组中的第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因插入在所述第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处。
实施方案118.如实施方案117所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(b)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因插入在所述第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处。
实施方案119.如实施方案117所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(b)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第二工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案120.如实施方案119所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案121.如实施方案117-120中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(c)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案122.如实施方案117-121中任一项所述的方法，其中将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造的所述步骤在啮齿动物ES细胞中进行，所述啮齿动物ES细胞的基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个人Jκ基因区段，其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案123.如实施方案122所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案124.如实施方案117-120、122和123中任一项所述的方法，其中所述工程改造的步骤在啮齿动物ES细胞中进行，所述啮齿动物ES细胞的基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。
实施方案125.如实施方案121-124中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现。
实施方案126.如实施方案121-125中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现。
实施方案127.如实施方案121-126中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现。
实施方案128.如实施方案109-127中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案129.如实施方案110-115和119-128中任一项所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案130.如实施方案109-129中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
实施方案131.如实施方案109-130中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座处的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
实施方案132.如实施方案109-131中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案133.如实施方案132所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案134.如实施方案132所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案135.如实施方案109-134中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案136.如实施方案135所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案137.如实施方案135所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案138.如实施方案111-116和121-137中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案139.如实施方案111-116和121-138中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案140.如实施方案111-116和121-139中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
实施方案141.如实施方案111-116和121-140中任一项所述的方法，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案142.如实施方案111-116和121-141中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合；
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合；以及
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
实施方案143.如实施方案111-116和121-142中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
实施方案144.如实施方案111-116和121-143中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组或所述啮齿动物的所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
实施方案145.如实施方案144所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
实施方案146.如实施方案144或145所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
实施方案147.如实施方案144-146中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
实施方案148.如实施方案144-147中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
实施方案149.如实施方案144-148中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
实施方案150.如实施方案149所述的方法，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
实施方案151.如实施方案144-146中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
实施方案152.如实施方案111-116和121-151中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
实施方案153.如实施方案109-152中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组或所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
实施方案154.如实施方案153所述的方法，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
实施方案155.如实施方案153或154所述的方法，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
实施方案156.如实施方案153-155中任一项所述的方法，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
实施方案157.如实施方案109-156中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
实施方案158.一种在经遗传修饰的啮齿动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤:
(a)用目标抗原对啮齿动物进行免疫，
其中所述啮齿动物具有种系基因组，所述种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因(c)代替所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因；
(b)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(c)从所述啮齿动物中回收：
(i)结合所述目标抗原的抗体，
(ii)核苷酸，所述核苷酸编码结合所述目标抗原的抗体的人轻链或重链可变结构域、轻链或重链，或
(iii)表达结合所述目标抗原的抗体的细胞。
实施方案159.如实施方案158所述的方法，其中所述啮齿动物的所述细胞为B细胞。
实施方案160.如实施方案159所述的方法，所述方法还包括从所述B细胞产生杂交瘤。
实施方案161.一种制备抗体的方法，所述方法包括：
(a)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白重链的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含人重链可变区序列；
(b)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白λ轻链的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列包含人λ轻链可变区序列，所述人λ轻链可变区序列从经遗传修饰的啮齿动物中鉴定出，所述经遗传修饰的啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ片段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；
(c)培养所述宿主细胞，以使得表达免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链并形成抗体；以及
(d)从所述宿主细胞或宿主细胞培养物中获得所述抗体。
实施方案162.如实施方案161所述的方法，其中所述第一核苷酸还包含人重链恒定区基因。
实施方案163.如实施方案161或162所述的方法，其中所述第二核苷酸还包含人λ轻链恒定区基因。
实施方案164.如实施方案158-163中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
实施方案165.如实施方案158-163中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
实施方案166.如实施方案165所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因片和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案167.如实施方案166所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案168.如实施方案158-167中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物在第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案169.如实施方案158-168中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
实施方案170.如实施方案158-169中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
实施方案171.如实施方案158-170中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案172.如实施方案171所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案173.如实施方案171所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案174.如实施方案158-173中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案175.如实施方案174所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案176.如实施方案174所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案177.如实施方案158-176中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案178.如实施方案177所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
实施方案179.如实施方案177或178中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段、所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案180.如实施方案177-179中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
实施方案181.如实施方案177-180中任一项所述的方法，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案182.如实施方案177-181中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
实施方案183.如实施方案177-182中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
实施方案184.如实施方案177-183中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
实施方案185.如实施方案184所述的方法，其中表达所述一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
实施方案186.如实施方案184或185所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
实施方案187.如实施方案184-186中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
实施方案188.如实施方案184-187中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
实施方案189.如实施方案184-188中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
实施方案190.如实施方案184-189中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
实施方案191.如实施方案190所述的方法，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
实施方案192.如实施方案184-187中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
实施方案193.如实施方案177-192中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
实施方案194.如实施方案158-193中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物包含表达包括免疫球蛋白λ轻链的抗体的B细胞群体，所述免疫球蛋白λ轻链各自包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
实施方案195.如实施方案194所述的方法，其中所述人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列编码，所述重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列包含(i)所述一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
实施方案196.如实施方案158-195中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
实施方案197.如实施方案196所述的方法，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
实施方案198.如实施方案196或197所述的方法，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
实施方案199.如实施方案196-198中任一项所述的方法，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述种系基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
实施方案200.如实施方案158-199中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
实施方案201.一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞的基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物ES细胞在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案202.如实施方案201所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
实施方案203.如实施方案201所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
实施方案204.如实施方案203所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
实施方案205.如实施方案204所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
实施方案206.如实施方案201-205中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案207.如实施方案201-206中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
实施方案208.如实施方案201-207中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
实施方案209.如实施方案201-208中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
实施方案210.如实施方案201-209中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案211.如实施方案210所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案212.如实施方案210所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案213.如实施方案201-212中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
实施方案214.如实施方案213所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
实施方案215.如实施方案213所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
实施方案216.如实施方案201-215中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案217.如实施方案216所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
实施方案218.如实施方案216或217所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
实施方案219.如实施方案216-218中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
实施方案220.如实施方案216-219中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
实施方案221.如实施方案216-220中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
实施方案222.如实施方案216-221中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
实施方案223.如实施方案216-222中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物的所述基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
实施方案224.如实施方案223所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
实施方案225.如实施方案223或224所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
实施方案226.如实施方案223-225中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
实施方案227.如实施方案223-226中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
实施方案228.如实施方案223-227中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
实施方案229.如实施方案228所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
实施方案230.如实施方案223-225中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
实施方案231.如实施方案216-230中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物细胞对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
实施方案232.如实施方案201-231中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
实施方案233.如实施方案232所述的啮齿动物ES细胞，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
实施方案234.如实施方案232或233所述的啮齿动物ES细胞，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
实施方案235.如实施方案232-234中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
实施方案236.如实施方案201-235中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞为大鼠ES细胞或小鼠ES细胞。
实施方案237.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用所述抗原对根据实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定编码抗体的人重链可变结构域的核苷酸序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生，和/或确定编码抗体的人λ轻链可变结构域的核苷酸序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)通过采用以下来表达完全人抗体：
(i)(b)的所述编码人重链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至人重链恒定区基因，和/或
(ii)(b)的所述编码人λ轻链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区基因。
实施方案238.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在哺乳动物细胞中表达包含两个人λ轻链和两个人重链的完全人抗体，其中每个人λ轻链包含由人λ轻链可变区编码的人λ轻链可变结构域，并且每个人重链包含由人重链可变区编码的人重链可变结构域，其中至少一个人重链或λ轻链可变区的核苷酸序列是自根据实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物获得；以及
(b)获得所述完全人抗体。
实施方案239.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用所述抗原对根据实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定抗体的人重链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生，和/或确定抗体的人λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)通过采用以下来表达完全人抗体：
(i)可操作地连接至人重链恒定结构域序列的(b)的所述人重链可变结构域序列，和/或
(ii)可操作地连接至人轻链恒定结构域序列的(b)的所述人λ轻链可变结构域序列。
实施方案240.如实施方案239所述的方法，其中采用可操作地连接至人重链恒定结构域序列的(b)的所述人重链可变结构域序列包括表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码(b)的所述人重链可变结构域序列和人重链恒定结构域序列。
实施方案241.如实施方案239或240所述的方法，其中采用可操作地连接至人轻链恒定结构域序列的(b)的所述人λ轻链可变结构域序列包括表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码(b)的所述人λ轻链可变结构域序列和人轻链恒定结构域序列。
实施方案242.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在哺乳动物细胞中表达包含两个人λ轻链和两个人重链的完全人抗体，其中每个人λ轻链包含人轻链可变结构域，并且每个人重链包含人重链可变结构域，其中所述至少一个人重链或λ轻链可变结构域的氨基酸序列是自如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物获得；以及
(b)获得所述完全人抗体。
实施方案243.一种用于产生人重链或λ轻链可变结构域序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；以及
(b)确定抗体的人重链或λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生。
实施方案244.如实施方案243所述的方法，其中确定人重链或λ轻链可变结构域序列包括确定编码所述人重链或λ轻链可变结构域序列的核苷酸序列。
实施方案245.一种制备完全人重链或完全人轻链的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定抗体的人重链或λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)分别将所述人重链或λ轻链可变结构域序列可操作地连接至人重链或轻链恒定结构域序列，以形成完全人重链或完全人轻链。
实施方案246.如实施方案245所述的方法，其中分别将所述人重链或λ轻链可变结构域序列可操作地连接至人重链或轻链恒定结构域序列包括将编码所述人重链或λ轻链可变结构域序列的核苷酸序列可操作地连接至编码所述人重链或轻链恒定结构域序列的核苷酸序列。
实施方案247.一种用于产生人重链或λ轻链可变区序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；以及
(b)确定人重链或λ轻链可变区序列，所述人重链或λ轻链可变区序列分别编码抗体的人重链或λ轻链可变结构域，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生。
实施方案248.一种制备编码完全人重链或完全人轻链的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如实施方案1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定人重链或λ轻链可变区序列，所述人重链或λ轻链可变区序列分别编码抗体的人重链或λ轻链可变结构域，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)分别将所述人重链或λ轻链可变区序列可操作地连接至人重链或轻链恒定区基因，以形成编码完全人重链或完全人轻链的核苷酸序列。
等效物
本领域技术人员应理解，本领域技术人员将可容易地想到本公开的各种改变、修改和改进。此类改变、修改和改进意图成为本公开的一部分，并且意图落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为举例，并且本公开中描述的任何发明将通过以下权利要求进一步详细描述。
本领域技术人员将理解可归因于如本文所述的测定或其他过程中获得的数值的典型的标准偏差或误差。本文引用的用于描述本发明的背景并提供关于其实施的另外细节的出版物、网站和其他参考材料以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司(REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.)
<120> 具有经工程改造的免疫球蛋白λ轻链的非人动物以及所述非人动物的用途
<130> 2010794-1440
<150> 62/609,251
<151> 2017-12-21
<150> 62/609,241
<151> 2017-12-21
<150> 62/594,946
<151> 2017-12-05
<150> 62/594,944
<151> 2017-12-05
<160> 77
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<210> 13
<211> 314
<212> DNA
<213> 家鼠属物种(Rattus sp.)
<400> 13
accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60
ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120
tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180
agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240
atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300
gtgctgagtg ttcc 314
<210> 14
<211> 105
<212> PRT
<213> 家鼠属物种(Rattus sp.)
<400> 14
Asp Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Thr Asp Lys Ala Thr Leu Val Cys Met Val Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Met Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Gln Pro Phe Lys Gln Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Ala Lys Ala Trp Glu Thr
65 70 75 80
His Ser Asn Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Glu Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 15
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
cccaaggcca accccacggt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac 60
aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac ttctacccgg gagctgtgac agtggcttgg 120
aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga gtggagacga ccaaaccctc caaacagagc 180
aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac 240
agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct 300
acagaatgtt catag 315
<210> 16
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 17
<211> 317
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
cttggaaagc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180
aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240
cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300
cccctacaga atgttca 317
<210> 18
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 19
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac 60
aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agttgcctgg 120
aaggcagata gcagccccgt caaggcgggg gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc 180
aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac 240
aaaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agttgcccct 300
acggaatgtt catag 315
<210> 20
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
ggtcagccca aggctgcccc atcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgcctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgaaagtg 120
gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaac acgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccctgcag aatgttcata g 321
<210> 22
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 23
<211> 317
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcgtaa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
cctggaaggc agatggcagc cccgtcaagg tgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac 180
aaagcaacaa caagtatgcg gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt 240
cccacagaag ctacagctgc cgggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300
cccctgcaga atgctct 317
<210> 24
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 25
gtggaagatt gatggcagtg aac 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 26
gtgctgctca tgctgtaggt 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 27
aaatggcgtc ctgaacagtt ggactga 27
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 28
ccatccagtg agcagttaac atc 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 29
tgtcgttcac tgccatcaat c 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 30
aggtgcctca gtcgtgtgct tc 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 31
ggagcccttc cttgttactt ca 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 32
aggtggaaac agggtgactg atg 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 33
tcctctgtgc ttccttcctc aggc 24
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 34
tccttgttac ttcataccat cctct 25
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 35
agggtgactg atggcgaaga ct 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 36
ttccttcctc aggccagccc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 37
gaggcttgct gagctttcag 20
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 38
aggacggtca gcttggtc 18
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 39
tatgagcctg tgtcacagtg ttggg 25
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 40
gctgacccag gactctgttc 20
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 41
tcccagttcc gaagacataa cac 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 42
ccctttggtg agaagggttt tggtc 25
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 43
tacgcggcca gcagctat 18
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 44
tggcagctgt agcttctgt 19
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 45
ctgagcctga cgcctgagca g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 46
tcaacctttc ccagcctgtc t 21
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 47
ccccagagag agaaaacaga tttt 24
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 49
accctctgct gtccct 16
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 50
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 51
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 52
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 53
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 54
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 55
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 56
gggctacttg aggaccttgc t 21
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 57
gacagccctt acagagtttg gaa 23
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 58
cagggcctcc atcccaggca 20
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 59
atctccctac ttcctggcta atg 23
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 60
gcttggaacc tgattggttg tc 22
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 61
agccttgatc cttgggaatc caggaca 27
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 62
gcaaacaaaa accactggcc 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 63
ggccacattc catgggttc 19
<210> 64
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 64
ctgttcctct aaaactggac tccacagtaa atggaaa 37
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 65
caccatcgat gtcgacacgc ctaggg 26
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 66
caccagtgtg gccttgttag tctc 24
<210> 67
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 67
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagggtg actgatggcg aagac 55
<210> 68
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 68
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccat cgatgtcgac acgccta 57
<210> 69
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(35)
<223> a、c、t、g未知或其他
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(35)
<223> n为a、c、g或t
<400> 69
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60
tccgatct 68
<210> 70
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (25)..(30)
<223> a、c、t、g未知或其他
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n为a、c、g或t
<400> 70
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 71
cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 72
aagcagtggt atcaacgcag agtacat 27
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 73
caccagtgtg gccttgttag tctc 24
<210> 74
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 74
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57
<210> 75
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 75
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggtgg aaacagggtg actgatg 57
<210> 76
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (30)..(35)
<223> a、c、t、g未知或其他
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(35)
<223> a、c、t、g未知或其他
<400> 76
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60
tccgatc 67
<210> 77
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(30)
<223> a、c、t、g未知或其他
<400> 77
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64

Claims (248)

1.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因；并且
其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
2.如权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
3.如权利要求1所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
4.如权利要求3所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
5.如权利要求4所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
7.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；以及
(b)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
8.如权利要求7所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
12.如权利要求11所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
13.如权利要求11所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
14.如权利要求1-13中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
15.如权利要求14所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
16.如权利要求14所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
17.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地出现在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，并且
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的啮齿动物Cκ基因。
18.如权利要求17所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
19.如权利要求18所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
20.如权利要求1-19中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
21.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含：
(a)经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含人重链可变结构域序列和啮齿动物重链恒定结构域序列，其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的；
(b)第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因；以及
(c)第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含可操作地连接至内源性啮齿动物Cκ区域基因的一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个Jκ基因区段，以使得所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人κ轻链可变结构域序列和啮齿动物κ轻链恒定结构域序列，
其中所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人λ轻链可变结构域序列和啮齿动物λ轻链恒定结构域序列。
22.如权利要求20或21所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
23.如权利要求20-22中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
24.如权利要求20-23中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人VH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人DH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人JH基因区段中的至少一个相邻，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
25.如权利要求20-24中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
26.如权利要求20-25中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
27.如权利要求20-26中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
28.如权利要求20-27中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
29.如权利要求28所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中表达所述一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
30.如权利要求28或29所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
31.如权利要求28-30中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
32.如权利要求28-31中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
33.如权利要求28-32中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
34.如权利要求28-33中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
35.如权利要求34所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
36.如权利要求28-31中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
37.如权利要求20和22-36中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
38.如权利要求9-37中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因具有与小鼠Cλ1、小鼠Cλ2或小鼠Cλ3基因至少80％相同的序列。
39.如权利要求9-38中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因包括小鼠Cλ1基因。
40.如权利要求9-39中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物Cλ基因包括大鼠Cλ基因。
41.如权利要求40所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述大鼠Cλ基因具有与大鼠Cλ1、大鼠Cλ2、大鼠Cλ3或大鼠Cλ4基因至少80％相同的序列。
42.如权利要求1-41中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段代替一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。
43.如权利要求1-42中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段置换一个或多个啮齿动物Vκ基因区段、一个或多个啮齿动物Jκ基因区段或它们的任何组合。
44.如权利要求1-43中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的κ轻链非编码序列。
45.如权利要求44所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述κ轻链非编码序列为人κ轻链非编码序列。
46.如权利要求45所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人κ轻链非编码序列具有天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座中的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列。
47.如权利要求1-46中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，所述经遗传修饰的啮齿动物还包含失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座。
48.如权利要求47所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为杂合的。
49.如权利要求47所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述失活的内源性免疫球蛋白λ轻链基因座为纯合的。
50.如权利要求1-49中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述内源性Vλ基因区段、所述内源性Jλ基因区段和所述内源性Cλ基因全部或部分缺失。
51.如权利要求1-50中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
52.如权利要求1-51中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物不会可检测地表达内源性免疫球蛋白κ轻链可变结构域。
53.如权利要求1-52中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物包含表达包括免疫球蛋白λ轻链的抗体的B细胞群体，所述免疫球蛋白λ轻链各自包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
54.如权利要求53所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列编码，所述重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列包含(i)所述一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
55.如权利要求1-54中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
56.如权利要求55所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
57.如权利要求55或56所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
58.如权利要求55-57中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述种系基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
59.一种经遗传修饰的啮齿动物，所述啮齿动物的种系基因组包含
(a)编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列；
(b)经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段，以使得所述啮齿动物表达各自包含人重链可变结构域序列和啮齿动物重链恒定结构域序列的免疫球蛋白重链，其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的；以及
(c)经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，其中所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，其中所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合，
(iii)啮齿动物Cλ基因，
(iv)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(v)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6与Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现，以及
(vi)位于所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间的人κ轻链非编码序列，所述人κ轻链非编码序列包含天然地在内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的人Vκ4-1基因区段与人Jκ1基因区段之间出现的序列，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述啮齿动物Cλ基因彼此可操作地连接，
其中所述啮齿动物Cλ基因代替所述内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因，
其中所述种系基因组对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的，并且
其中所述啮齿动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与啮齿动物λ轻链恒定结构域序列融合的人λ轻链可变结构域序列。
60.如权利要求1-59中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
61.一种分离的啮齿动物细胞，所述分离的啮齿动物细胞获自如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物。
62.一种永生化细胞，所述永生化细胞由如权利要求61所述的分离的啮齿动物细胞产生。
63.如权利要求61所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
64.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎由如权利要求63所述的啮齿动物ES细胞产生。
65.如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备抗体的用途。
66.如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备轻链可变区序列的用途。
67.如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物用于制备轻链可变结构域序列的用途。
68.一种获自如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物的分离的B细胞，其中所述B细胞的基因组包含：
(a)可操作地连接至λ轻链可变区序列的重排的人λ轻链可变区序列，其中所述重排的人λ轻链可变区序列包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及
(ii)一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
69.如权利要求68所述的分离的B细胞，所述B细胞还包含：
(b)可操作地连接至啮齿动物重链可变区序列的重排的人重链可变区序列，其中所述重排的人重链可变区序列包含：
(i)一个或多个人VH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，
(ii)一个或多个人DH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
70.一种抗体，所述抗体通过包括以下步骤的方法制备：
(a)提供如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物；
(b)用目标抗原对所述啮齿动物进行免疫；
(c)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(d)从所述啮齿动物回收：
(i)结合所述目标抗原的抗体，
(ii)核苷酸，所述核苷酸编码结合所述目标抗原的抗体的人轻链或重链可变结构域、轻链或重链，或
(iii)表达结合所述目标抗原的抗体的细胞，
其中(d)的抗体包含人重链可变结构域和人λ轻链可变结构域。
71.一种分离的啮齿动物细胞，所述分离的啮齿动物细胞的基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述分离的啮齿动物细胞在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
72.如权利要求71所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
73.如权利要求71所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
74.如权利要求73所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
75.如权利要求74所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
76.如权利要求71-75中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞缺乏所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因。
77.如权利要求71-76中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
78.如权利要求71-77中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者与所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者与一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
79.如权利要求71-78中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
80.如权利要求79所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
81.如权利要求79所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
82.如权利要求71-81中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(a)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(b)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
83.如权利要求82所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
84.如权利要求82所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
85.如权利要求71-84中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞的所述基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
86.如权利要求85所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
87.如权利要求85或86所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
88.如权利要求85-87中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者与所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者相邻，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
89.如权利要求85-88中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
90.如权利要求85-89中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
91.如权利要求85-90中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
92.如权利要求85-91中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞的所述基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
93.如权利要求92所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
94.如权利要求92或93所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
95.如权利要求92-94中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
96.如权利要求92-95中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
97.如权利要求92-96中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
98.如权利要求97所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
99.如权利要求92-94中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
100.如权利要求85-99中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
101.如权利要求71-100中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述分离的啮齿动物细胞的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
102.如权利要求101所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
103.如权利要求101或102所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
104.如权利要求101-103中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述啮齿动物细胞的所述基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
105.如权利要求71-104中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为大鼠细胞或小鼠细胞。
106.一种永生化细胞，所述永生化细胞由如权利要求71-105中任一项所述的分离的啮齿动物细胞产生。
107.如权利要求71-105中任一项所述的分离的啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
108.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎由如权利要求107所述的啮齿动物ES细胞产生。
109.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将一个或多个DNA片段引入啮齿动物ES细胞的基因组中的第一经工程改造的免疫球蛋白κ轻链基因座中，其中所述一个或多个DNA片段包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述Cλ基因在内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处引入所述啮齿动物ES细胞的所述基因组中，并且其中所述一个或多个人Vλ基因区段、所述一个或多个人Jλ基因区段和所述Cλ基因可操作地连接；以及
(b)使用(a)中产生的所述啮齿动物ES细胞产生啮齿动物。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
112.如权利要求109-111中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA片段还包含至少一种选择标记。
113.如权利要求109-112中任一项所述的方法，其中所述一个或多个DNA片段还包含至少一个位点特异性重组位点。
114.如权利要求109-113中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中引入一个或多个人Vλ非编码序列和一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于人Vλ基因区段，并且所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于人Jλ基因区段。
115.如权利要求109-114中任一项所述的方法，所述方法还包括将κ轻链非编码序列引入所述啮齿动物ES细胞的所述基因组中，以使得所述κ轻链非编码序列位于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述一个或多个人Vλ基因区段与所述一个或多个人Jλ基因区段之间。
116.如权利要求109-115中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞为大鼠ES细胞或小鼠ES细胞。
117.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述啮齿动物的种系基因组中的第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因插入在所述第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(b)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因插入在所述第二内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处。
119.如权利要求117所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(b)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第二工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
121.如权利要求117-120中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
(c)将所述啮齿动物的所述种系基因组中的经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座工程改造为包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
122.如权利要求117-121中任一项所述的方法，其中将所述啮齿动物的所述种系基因组中的第一内源性免疫球蛋白κ轻链基因座工程改造的所述步骤在啮齿动物ES细胞中进行，所述啮齿动物ES细胞的基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含一个或多个人Vκ基因区段和一个或多个人Jκ基因区段，其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
124.如权利要求117-120、122和123中任一项所述的方法，其中所述工程改造的步骤在啮齿动物ES细胞中进行，所述啮齿动物ES细胞的基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因的一个或多个人VH基因区段、一个或多个人DH基因区段和一个或多个人JH基因区段。
125.如权利要求121-124中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现。
126.如权利要求121-125中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现。
127.如权利要求121-126中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现。
128.如权利要求109-127中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座缺乏啮齿动物Cκ基因。
129.如权利要求110-115和119-128中任一项所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
130.如权利要求109-129中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
131.如权利要求109-130中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座处的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
132.如权利要求109-131中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
134.如权利要求132所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
135.如权利要求109-134中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
137.如权利要求135所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
138.如权利要求111-116和121-137中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
139.如权利要求111-116和121-138中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
140.如权利要求111-116和121-139中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
141.如权利要求111-116和121-140中任一项所述的方法，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
142.如权利要求111-116和121-141中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合；
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合；以及
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
143.如权利要求111-116和121-142中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
144.如权利要求111-116和121-143中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组或所述啮齿动物的所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
146.如权利要求144或145所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
147.如权利要求144-146中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
148.如权利要求144-147中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
149.如权利要求144-148中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
151.如权利要求144-146中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
152.如权利要求111-116和121-151中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
153.如权利要求109-152中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组或所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
155.如权利要求153或154所述的方法，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
156.如权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
157.如权利要求109-156中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
158.一种在经遗传修饰的啮齿动物中产生抗体的方法，所述方法包括以下步骤:
(a)用目标抗原对啮齿动物进行免疫，
其中所述啮齿动物具有种系基因组，所述种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述Cλ基因(c)代替所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的啮齿动物Cκ基因；
(b)将所述啮齿动物维持在足以使所述啮齿动物对所述目标抗原产生免疫应答的条件下；以及
(c)从所述啮齿动物中回收：
(i)结合所述目标抗原的抗体，
(ii)核苷酸，所述核苷酸编码结合所述目标抗原的抗体的人轻链或重链可变结构域、轻链或重链，或
(iii)表达结合所述目标抗原的抗体的细胞。
159.如权利要求158所述的方法，其中所述啮齿动物的所述细胞为B细胞。
160.如权利要求159所述的方法，所述方法还包括从所述B细胞产生杂交瘤。
161.一种制备抗体的方法，所述方法包括：
(a)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白重链的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含人重链可变区序列；
(b)在宿主细胞中表达编码免疫球蛋白λ轻链的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列包含人λ轻链可变区序列，所述人λ轻链可变区序列从经遗传修饰的啮齿动物中鉴定出，所述经遗传修饰的啮齿动物的种系基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ基因区段，
(ii)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(iii)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ片段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物在所述经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因；
(c)培养所述宿主细胞，以使得表达免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链并形成抗体；以及
(d)从所述宿主细胞或宿主细胞培养物中获得所述抗体。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述第一核苷酸还包含人重链恒定区基因。
163.如权利要求161或162所述的方法，其中所述第二核苷酸还包含人λ轻链恒定区基因。
164.如权利要求158-163中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
165.如权利要求158-163中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(b)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因片和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
168.如权利要求158-167中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
169.如权利要求158-168中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
170.如权利要求158-169中任一项所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
171.如权利要求158-170中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
173.如权利要求171所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
174.如权利要求158-173中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
176.如权利要求174所述的方法，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
177.如权利要求158-176中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
179.如权利要求177或178中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段、所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
180.如权利要求177-179中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
181.如权利要求177-180中任一项所述的方法，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
182.如权利要求177-181中任一项所述的方法，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
183.如权利要求177-182中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
184.如权利要求177-183中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
185.如权利要求184所述的方法，其中表达所述一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段。
186.如权利要求184或185所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
187.如权利要求184-186中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
188.如权利要求184-187中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
189.如权利要求184-188中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
190.如权利要求184-189中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
191.如权利要求190所述的方法，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
192.如权利要求184-187中任一项所述的方法，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
193.如权利要求177-192中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
194.如权利要求158-193中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物包含表达包括免疫球蛋白λ轻链的抗体的B细胞群体，所述免疫球蛋白λ轻链各自包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
195.如权利要求194所述的方法，其中所述人免疫球蛋白λ轻链可变结构域由重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列编码，所述重排的人免疫球蛋白λ轻链可变区序列包含(i)所述一个或多个人Vλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体，以及(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段中的一者或其体细胞超突变的变体。
196.如权利要求158-195中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物的所述种系基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
197.如权利要求196所述的方法，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
198.如权利要求196或197所述的方法，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
199.如权利要求196-198中任一项所述的方法，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于所述种系基因组中的免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
200.如权利要求158-199中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
201.一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，所述啮齿动物胚胎干细胞的基因组包含：
第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(a)一个或多个人Vλ基因区段，
(b)一个或多个人Jλ基因区段，以及
(c)Cλ基因，
其中所述一个或多个人Vλ基因区段和所述一个或多个人Jλ基因区段可操作地连接至所述Cλ基因，并且
其中所述啮齿动物ES细胞在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
202.如权利要求201所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为纯合的。
203.如权利要求201所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞对于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座为杂合的。
204.如权利要求203所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座，所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vκ基因区段，以及
(ii)一个或多个人Jκ基因区段，
其中所述一个或多个人Vκ基因区段和所述一个或多个人Jκ基因区段可操作地连接至Cκ基因。
205.如权利要求204所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第二经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cκ基因为内源性啮齿动物Cκ基因。
206.如权利要求201-205中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组包含经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(i)一个或多个人VH基因区段，
(ii)一个或多个人DH基因区段，以及
(iii)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
207.如权利要求201-206中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处缺乏啮齿动物Cκ基因。
208.如权利要求201-207中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中在所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座处的所述Cλ基因包括啮齿动物Cλ基因。
209.如权利要求201-208中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座还包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Vλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Vλ基因区段出现；
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人Jλ基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座中的人Jλ基因区段出现；或
(iii)它们的任何组合。
210.如权利要求201-209中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
211.如权利要求210所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
212.如权利要求210所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现，
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
213.如权利要求201-212中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人Vλ基因区段包括Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1或它们的任何组合；并且
(ii)所述一个或多个人Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6、Jλ7或它们的任何组合。
214.如权利要求213所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jλ非编码序列，其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7出现。
215.如权利要求213所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座包含：
(i)一个或多个人Vλ非编码序列，其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1，并且其中所述一个或多个人Vλ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白λ轻链基因座的Vλ4-69、Vλ8-61、Vλ4-60、Vλ6-57、Vλ10-54、Vλ5-52、Vλ1-51、Vλ9-49、Vλ1-47、Vλ7-46、Vλ5-45、Vλ1-44、Vλ7-43、Vλ1-40、Vλ5-39、Vλ5-37、Vλ1-36、Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3或Vλ3-1出现；以及
(ii)一个或多个人Jκ非编码序列，其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者邻近于所述第一经工程改造的内源性免疫球蛋白κ轻链基因座中的所述Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6或Jλ7，并且其中所述一个或多个人Jκ非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白κ轻链基因座的Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5出现。
216.如权利要求201-215中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组还包含：
经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含：
(a)一个或多个人VH基因区段，
(b)一个或多个人DH基因区段，以及
(c)一个或多个人JH基因区段，
其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段可操作地连接至所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
217.如权利要求216所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段代替一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的组合。
218.如权利要求216或217所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个人VH基因区段、所述一个或多个人DH基因区段和所述一个或多个人JH基因区段置换一个或多个啮齿动物VH基因区段、一个或多个啮齿动物DH基因区段、一个或多个啮齿动物JH基因区段或它们的任何组合。
219.如权利要求216-218中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座还包含：
(i)一个或多个人VH非编码序列，所述一个或多个人VH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人VH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个VH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人VH基因区段出现；
(ii)一个或多个人DH非编码序列，所述一个或多个人DH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人DH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个DH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人DH基因区段出现；
(iii)一个或多个人JH非编码序列，所述一个或多个人JH非编码序列中的每一者邻近于所述一个或多个人JH基因区段中的至少一者，其中所述一个或多个JH非编码序列中的每一者天然地邻近于内源性人免疫球蛋白重链基因座中的人JH基因区段出现；或
(iv)它们的任何组合。
220.如权利要求216-219中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述一个或多个啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因为一个或多个内源性啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因。
221.如权利要求216-220中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中：
(i)所述一个或多个人VH基因区段包括VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1或它们的任何组合，
(ii)所述一个或多个人DH基因区段包括DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25、DH1-26、DH7-27或它们的任何组合，并且
(iii)所述一个或多个人JH基因区段包括JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6或它们的任何组合。
222.如权利要求216-221中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座缺乏功能性内源性啮齿动物Adam6基因。
223.如权利要求216-222中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物的所述基因组还包含一个或多个编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的核苷酸序列。
224.如权利要求223所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列与所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座包含于同一染色体上。
225.如权利要求223或224所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列包含于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座中。
226.如权利要求223-225中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列代替人Adam6假基因。
227.如权利要求223-226中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列置换人Adam6假基因。
228.如权利要求223-227中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于第一人VH基因区段与第二人VH基因区段之间。
229.如权利要求228所述的啮齿动物ES细胞，其中所述第一人VH基因区段为VH1-2，并且所述第二人VH基因区段为VH6-1。
230.如权利要求223-225中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码一种或多种啮齿动物ADAM6多肽、其功能性直向同源物、功能性同源物或功能性片段的一个或多个核苷酸序列位于人VH基因区段与人DH基因区段之间。
231.如权利要求216-230中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物细胞对于所述经工程改造的内源性免疫球蛋白重链基因座为纯合的。
232.如权利要求201-231中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞的所述基因组还包含编码可操作地连接至转录控制元件的外源性末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)的核酸序列。
233.如权利要求232所述的啮齿动物ES细胞，其中所述TdT为TdT的短同种型(TdTS)。
234.如权利要求232或233所述的啮齿动物ES细胞，其中所述转录控制元件包括RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件、免疫球蛋白λ轻链转录控制元件或它们的任何组合。
235.如权利要求232-234中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座或RAG2基因座处。
236.如权利要求201-235中任一项所述的啮齿动物ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞为大鼠ES细胞或小鼠ES细胞。
237.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用所述抗原对根据权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定编码抗体的人重链可变结构域的核苷酸序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生，和/或确定编码抗体的人λ轻链可变结构域的核苷酸序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由所述经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)通过采用以下来表达完全人抗体：
(i)(b)的所述编码人重链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至人重链恒定区基因，和/或
(ii)(b)的所述编码人λ轻链可变结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区基因。
238.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在哺乳动物细胞中表达包含两个人λ轻链和两个人重链的完全人抗体，其中每个人λ轻链包含由人λ轻链可变区编码的人λ轻链可变结构域，并且每个人重链包含由人重链可变区编码的人重链可变结构域，其中至少一个人重链或λ轻链可变区的核苷酸序列是自根据权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物获得；以及
(b)获得所述完全人抗体。
239.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对根据权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定抗体的人重链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生，和/或确定抗体的人λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由所述经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)通过采用以下来表达完全人抗体：
(i)可操作地连接至人重链恒定结构域序列的(b)的所述人重链可变结构域序列，和/或
(ii)可操作地连接至人轻链恒定结构域序列的(b)的所述人λ轻链可变结构域序列。
240.如权利要求239所述的方法，其中采用可操作地连接至人重链恒定结构域序列的(b)的所述人重链可变结构域序列包括表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码(b)的所述人重链可变结构域序列和所述人重链恒定结构域序列。
241.如权利要求239或240所述的方法，其中采用可操作地连接至人轻链恒定结构域序列的(b)的所述人λ轻链可变结构域序列包括表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码(b)的所述人λ轻链可变结构域序列和所述人轻链恒定结构域序列。
242.一种制备对抗原具有特异性的完全人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在哺乳动物细胞中表达包含两个人λ轻链和两个人重链的完全人抗体，其中每个人λ轻链包含人轻链可变结构域，并且每个人重链包含人重链可变结构域，其中所述至少一个人重链或λ轻链可变结构域的氨基酸序列是自如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物获得；以及
(b)获得所述完全人抗体。
243.一种用于产生人重链或λ轻链可变结构域序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；以及
(b)确定抗体的人重链或λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生。
244.如权利要求243所述的方法，其中确定人重链或λ轻链可变结构域序列包括确定编码所述人重链或λ轻链可变结构域序列的核苷酸序列。
245.一种制备完全人重链或完全人轻链的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定抗体的人重链或λ轻链可变结构域序列，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)分别将所述人重链或λ轻链可变结构域序列可操作地连接至人重链或轻链恒定结构域序列，以形成完全人重链或完全人轻链。
246.如权利要求245所述的方法，其中分别将所述人重链或λ轻链可变结构域序列可操作地连接至人重链或轻链恒定结构域序列包括将编码所述人重链或λ轻链可变结构域序列的核苷酸序列可操作地连接至编码所述人重链或轻链恒定结构域序列的核苷酸序列。
247.一种用于产生人重链或λ轻链可变区序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；以及
(b)确定人重链或λ轻链可变区序列，所述人重链或λ轻链可变区序列分别编码抗体的人重链或λ轻链可变结构域，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生。
248.一种制备编码完全人重链或完全人轻链的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)对如权利要求1-60中任一项所述的啮齿动物进行免疫；
(b)确定人重链或λ轻链可变区序列，所述人重链或λ轻链可变区序列分别编码抗体的人重链或λ轻链可变结构域，所述抗体特异性地结合所述抗原并且由经遗传修饰的小鼠产生；以及
(c)分别将所述人重链或λ轻链可变区序列可操作地连接至人重链或轻链恒定区基因，以形成编码完全人重链或完全人轻链的核苷酸序列。
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