ES2928995T3 - Ratones que tienen una cadena ligera lambda de inmunoglobulina genomanipulada y usos de los mismos - Google Patents

Ratones que tienen una cadena ligera lambda de inmunoglobulina genomanipulada y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Se proporcionan animales no humanos (y/o células no humanas) y métodos para usar los mismos, cuyos animales no humanos (y/o células no humanas) tienen un genoma que comprende secuencias codificantes de anticuerpos humanos (es decir, genes de inmunoglobulina). Los animales no humanos descritos en este documento expresan anticuerpos que contienen cadenas ligeras de inmunoglobulina (Ig) caracterizadas por la presencia de dominios Vλ humanos. Los animales no humanos proporcionados en el presente documento se caracterizan, en algunas realizaciones, por la expresión de anticuerpos que contienen cadenas ligeras Vλ humanas que están codificadas por secuencias codificantes de cadenas ligeras Igλ humanas insertadas en un locus endógeno de cadena ligera Igκ de dichos animales no humanos. También se proporcionan métodos para producir anticuerpos a partir de animales no humanos, cuyos anticuerpos contienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ratones que tienen una cadena ligera lambda de inmunoglobulina genomanipulada y usos de los mismos Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/594.944, presentada el 5 de diciembre de 2017; la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/594.946, presentada el 5 de diciembre de 2017; la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/609.241, presentada el jueves, 21 de diciembre de 2017; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/609.251, presentada el 21 de diciembre de 2017.
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias.
Antecedentes
Los anticuerpos humanos son la clase de agentes terapéuticos de crecimiento más rápido. De las tecnologías que se usan actualmente para su producción, el desarrollo de animales manipulados genéticamente (por ejemplo, ratones) genomanipulados con material genético que codifica anticuerpos humanos, en su totalidad o en parte, ha revolucionado el campo de los anticuerpos monoclonales terapéuticos humanos para el tratamiento de diversas enfermedades. Aún así, es necesario el desarrollo de sistemas in vivo mejorados para generar anticuerpos monoclonales humanos que maximicen los repertorios de anticuerpos humanos en animales huésped manipulados genéticamente.
Sumario
Se proporciona un ratón genéticamente modificado, cuyo genoma de línea germinal comprende:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
ratón
En algunas realizaciones, un gen CA de ratón tiene una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a un gen CA1 de ratón, CA2 de ratón o CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón es o incluye un gen CA1 de ratón.
. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos reemplazan uno o más segmentos génicos Vk de ratón, y uno o más segmentos génicos Jk de ratón. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos reemplazan todos los segmentos génicos Vk de ratón funcionales y/o todos los segmentos génicos Jk de ratón funcionales. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de VA humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos VA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico VA humano en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. Por ejemplo, con referencia a la figura 20, una primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa aparece de forma natural adyacente (y 3') a un segmento génico VA3-12 en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. Un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye la primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa podría incluir esa secuencia no codificante en una posición que está adyacente (y preferentemente 3') a un segmento génico VA3-12 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. Un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye la primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa también podría incluir esa secuencia no codificante en una posición que está adyacente (y preferentemente 5') a un segmento génico VA2-11 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunos casos, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye la primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa también podría incluir esa secuencia no codificante en una posición que está adyacente (y preferentemente 3') a un segmento génico VA3-12 y adyacente (y preferentemente 5') a un segmento génico VA2-11 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano es o incluye un intrón.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de JA humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de JA humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico JA humano en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jk humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico Jk humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno. Por ejemplo, con referencia a la figura 21, una primera secuencia no codificante de Jk humano endógena ilustrativa aparece de forma natural en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno. Un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye la primera secuencia no codificante de Jk humano endógena ilustrativa podría ser una secuencia no codificante en una posición que está adyacente a un segmento génico JA (por ejemplo, JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7) en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano es o incluye un intrón.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de VA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano está adyacente a VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparece de forma natural adyacente a VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de JA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano aparece de forma natural adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o VA7 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jk humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparece de forma natural adyacente a Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una secuencia no codificante de cadena ligera k entre el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones, una secuencia no codificante de cadena ligera k es una secuencia no codificante de cadena ligera k humana. En algunas realizaciones, una secuencia no codificante de cadena ligera k humana tiene una secuencia que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano y un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento es homocigoto para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento es heterocigoto para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, el genoma de línea germinal de un ratón incluye un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye:
(a) uno o más segmentos génicos Vk humanos, y
(b) uno o más segmentos génicos Jk humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vk humanos y el uno o más segmentos génicos Jk humanos están unidos operativamente a un gen Ck.
En algunas realizaciones, el genoma del ratón incluye además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunas realizaciones, el elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera A de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una TdT exógena está ubicada en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, un locus RAG1 o un locus RAG2. En algunas realizaciones, una TdT es una TdT humana. En algunas realizaciones, una TdT es una isoforma corta de TdT (TdTS).
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y exhibe cadenas ligeras (por ejemplo, expresa dominios variables de cadena ligera incluidos) con un aumento de al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,75 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces en la diversidad de unión sobre un ratón comparable (por ejemplo, compañero de camada) que no incluye una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal. En algunas realizaciones, la diversidad de unión se mide por el número de lecturas únicas de CDR3/10.000.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 % de cadenas ligeras (por ejemplo, cadenas ligeras lambda y/o kappa) producidas por el ratón muestran adiciones no plantilla. En algunas realizaciones, el genoma de línea germinal del ratón proporcionado comprende además:
un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos Vh humanos,
(b) uno o más segmentos génicos Dh humanos, y
(c) uno o más segmentos génicos Jh humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vh humanos de (a), el uno o más segmentos génicos Dh humanos de (b), y el uno o más segmentos génicos Jh humanos de (c) están unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos están en el lugar de uno o más segmentos génicos VH de ratón, uno o más segmentos génicos DH de ratón, uno o más segmentos génicos JH de ratón, o una combinación de los mismos. En alguna realización, uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos DH humanos, y uno o más segmentos génicos JH humanos reemplazan uno o más segmentos génicos VH de ratón, uno o más segmentos génicos DH de ratón, uno o más segmentos génicos JH de ratón, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VH humanos incluyen VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Vh humanos incluyen Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 y Vh6-1.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Dh humanos incluyen Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5,
Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22,
Dh6-25, Dh1-26, Dh7-27, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Dh humanos incluyen Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26 y Dh7-27.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Jh humanos incluyen Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Jh humanos incluyen Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 y Jh6.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Vh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos Vh humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Vh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Dh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos Dh humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Dh aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Dh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Dh humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos Jh humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes Jh aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Jh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jh humano es o incluye un intrón.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento es homocigoto para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
En algunas realizaciones, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón es una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena.
En algunas realizaciones, los segmentos génicos VA endógenos, los segmentos génicos JA endógenos y los genes
CA endógenos se eliminen en su totalidad o en parte. En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento no expresa de forma detectable dominios variables de cadena ligera A de inmunoglobulina endógenos.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento no expresa de forma detectable dominios variables de cadena ligera k de inmunoglobulina endógenos.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado carece de un gen Adam6 de ratón endógeno funcional. En algunas realizaciones, un genoma de línea germinal de un ratón incluye una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se expresan (por ejemplo, en una célula del sistema reproductor masculino, por ejemplo, una célula testicular).
En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se incluyen en el mismo cromosoma que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se incluyen en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están entre un primer segmento génico Vh humano y un segundo segmento génico Vh humano. En algunas realizaciones, un primer segmento génico Vh humano es Vh1-2 y segundo un segmento génico Vh humano es Vh6-1. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están en el lugar de un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos reemplazan un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están entre un segmento génico Vh humano y un segmento génico Dh humano.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, incluyendo cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana está codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana reordenada que incluye (i) uno del uno o más segmentos génicos VA humanos o una variante hipermutada somáticamente de los mismos, y (ii) uno del uno o más segmentos génicos JA humanos o una variante hipermutada somáticamente de los mismos.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana está codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenada que incluye (i) uno del uno o más segmentos génicos Vh humanos o una variante hipermutada somáticamente de los mismos, (ii) uno del uno o más segmentos génicos Dh humanos o una variante hipermutada somáticamente de los mismos, y (ii) uno del uno o más segmentos génicos Jh humanos o una variante hipermutada somáticamente de los mismos.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento produce una población de linfocitos B en respuesta a la inmunización con un antígeno que incluye uno o más epítopos. En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a uno o más epítopos del antígeno de interés. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen a uno o más epítopos del antígeno de interés, en donde los anticuerpos expresados por la población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen: (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana como se describe en el presente documento está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % de los linfocitos B en una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k que está hipermutada somáticamente.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen células y/o tejidos proporcionados (por ejemplo, células y/o tejidos aislados) de un ratón. En algunas realizaciones, las células y tejidos proporcionados incluyen, por ejemplo, tejido linfoide, esplenocitos, linfocitos B, células madre y/o células germinales. En algunas realizaciones, una célula proporcionada está aislada. En algunas realizaciones, una célula aislada es o incluye un linfocito pro-B, un linfocito pre-B, un linfocito B inmaduro, un linfocito B virgen maduro, un linfocito B activado, un linfocito B de memoria, un linfocito de linaje B y/o una célula plasmática. En algunas realizaciones, una célula aislada incluye una célula madre (por ejemplo, una célula madre embrionaria) y/o una célula germinal (por ejemplo, esperma, ovocito). En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una célula de ratón aislada, cuyo genoma de línea germinal comprende:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c); y
en donde el genoma de línea germinal de células de ratón aisladas carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
En algunas realizaciones, una célula de ratón aislada descrita en el presente documento es una célula madre embrionaria (ES, por sus siglas en inglés) de ratón.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un embrión de ratón generado a partir de una célula ES de ratón descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una célula inmortalizada generada a partir de una célula de ratón aislada descrita en el presente documento.
También se desvela un método para hacer un ratón cuyo genoma de línea germinal incluye un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, incluyendo el método las etapas de:
(a) introducir uno o más fragmentos de ADN en el genoma de línea germinal de una célula ES de ratón, en donde el uno o más fragmentos de ADN comprenden:
(i) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(ii) uno o más segmentos génicos VA humanos, y
(iii) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos, el uno o más segmentos génicos VA humanos, y el gen CA de ratón se introducen en el genoma de línea germinal de la célula ES de ratón en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno, y en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos, el uno o más segmentos génicos VA humanos, y el gen CA de ratón están unidos operativamente; y
(b) generar un ratón usando la célula ES de ratón generada en (a).
También se desvela un método para hacer un ratón cuyo genoma de línea germinal incluye un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, incluye la etapa de introducir una secuencia no codificante de cadena ligera k en el genoma de línea germinal de la célula ES de ratón de manera que la secuencia no codificante de cadena ligera k esté entre el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos en el genoma de línea germinal de la célula ES de ratón.
También se desvela un método para hacer un ratón cuyo genoma de línea germinal incluye un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, incluyendo el método las etapas de:
genomanipular el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno en el genoma de línea germinal para incluir:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos VA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos están unidos operativamente al gen CA de ratón, y
en donde el gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón en el locus k de inmunoglobulina endógeno.
En algunas realizaciones, un gen CA de ratón reemplaza un gen Ck de ratón en el locus k de inmunoglobulina endógeno.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de VA humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos VA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico VA humano en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de JA humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de JA humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico JA humano en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jk humano, cada una de las cuales está adyacente al menos a uno del uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparecen de forma natural adyacentes a un segmento génico Jk humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano es o incluye un intrón.
En algunas realizaciones, un gen CA de ratón tiene una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a un gen CA1 de ratón, CA2 de ratón o CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón es o incluye un gen CA1 de ratón.
En algunas realizaciones, uno o más fragmentos de ADN al menos un marcador de selección. En algunas realizaciones, uno o más fragmentos de ADN incluyen al menos un sitio de recombinación específico del sitio.
En algunas realizaciones, el genoma de línea germinal de un ratón incluye:
un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, incluyendo:
(a) uno o más segmentos génicos Vh humanos,
(b) uno o más segmentos génicos Dh humanos, y
(c) uno o más segmentos génicos Jh humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vh humanos, el uno o más segmentos génicos Dh humanos, y el uno o más segmentos génicos Jh humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones, la etapa de genomanipular el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno en el genoma de línea germinal se realiza en una célula ES de ratón cuyo genoma de línea germinal incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Vh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos Vh humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh humano aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Vh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de DH humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos DH humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de DH aparece de forma natural adyacente a un segmento génico DH humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de Dh humano es o incluye un intrón. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos JH humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes JH aparece de forma natural adyacente a un segmento génico JH humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, cada una de la una o más secuencias no codificantes de JH humano es o incluye un intrón.
También se desvela un método para producir un anticuerpo en un ratón, incluyendo el método las etapas de:
(i) inmunizar un ratón con un antígeno de interés,
en donde el ratón tiene un genoma de línea germinal que incluye:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos VA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos VA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos VA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado;
(ii) mantener al ratón en condiciones suficientes para que el ratón produzca una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y
(iii) recuperar un anticuerpo que se une al antígeno de interés del ratón, una célula del ratón o una célula derivada de una célula del ratón.
En algunas realizaciones, en respuesta a la etapa de inmunización, un ratón produce un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une al antígeno de interés. En algunas realizaciones, un anticuerpo expresado por un linfocito B incluye una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo expresado por un linfocito B incluye (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, en respuesta a la etapa de inmunización, el ratón produce una población de linfocitos B que expresa anticuerpos que se unen a un antígeno de interés. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, en respuesta a la etapa de inmunización, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen a uno o más epítopos del antígeno de interés, en donde los anticuerpos expresados por la población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen: (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana como se describe en el presente documento está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % de los linfocitos B en una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k que está hipermutada somáticamente.
En algunos casos, un anticuerpo que se une al antígeno de interés se aísla, se recupera o se identifica a partir de un linfocito B del ratón. En algunos casos, un anticuerpo que se une a un antígeno de interés se aísla, se recupera o se identifica a partir de un hibridoma elaborado con un linfocito B del ratón.
En algunas realizaciones, un antígeno incluye uno o más epítopos y un anticuerpo que se une a un antígeno de interés se une a un epítopo de uno o más epítopos.
En algunas realizaciones, un gen CA de ratón tiene una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a un gen CA1 de ratón, CA2 de ratón o CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón es o incluye un gen CA1 de ratón.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos comprenden VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos comprenden VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VA humanos comprenden VA5-52, VA1-51, v A9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos comprenden JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de VA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano está adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparece de forma natural adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de JA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de JA humano aparece de forma natural adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Jk humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o VA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparece de forma natural adyacente a Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno.
En algunas realizaciones, un ratón tiene un genoma de línea germinal que incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye:
(a) uno o más segmentos génicos Vh humanos,
(b) uno o más segmentos génicos Dh humanos, y
(c) uno o más segmentos génicos Jh humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vh humanos, el uno o más segmentos génicos Dh humanos, y el uno o más segmentos génicos Jh humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos VH humanos comprenden VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Vh humanos comprenden Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 y Vh6-1.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Dh humanos comprenden Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26, Dh7-27, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Dh humanos comprenden Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26 y Dh7-27.
En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos Jh humanos comprenden Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JH humanos comprenden Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 y Jh6.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de Vh humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh humano está adyacente a Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 o Vh6-1 en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Vh humano aparece de forma natural adyacente a Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 o Vh6-1 de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de DH humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Dh humano está adyacente a Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26 o Dh7-27 en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de DH humano aparece de forma natural adyacente a Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26 o Dh7-27 de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una o más secuencias no codificantes de JH humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jh humano está adyacente a Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 o Jh6 en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jh humano aparece de forma natural adyacente a Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5 o Jh6 de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, una célula del ratón que se recupera es un linfocito B. En algunas realizaciones, una célula derivada de una célula de ratón es un hibridoma.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana y/o una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana se obtiene de un linfocito B.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado carece de un gen Adam6 de ratón endógeno funcional. En algunas realizaciones, un genoma de línea germinal de un ratón incluye una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se expresan (por ejemplo, en una célula del sistema reproductor masculino, por ejemplo, una célula testicular).
En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se incluyen en el mismo cromosoma que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se incluyen en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están entre un primer segmento génico VH humano y un segundo segmento génico Vh humano. En algunas realizaciones, un primer segmento génico Vh humano es Vh1-2 y segundo un segmento génico Vh humano es Vh6-1. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están en el lugar de un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos reemplazan un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 de ratón, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están entre un segmento génico Vh humano y un segmento génico Dh humano.
En algunas realizaciones, el ratón proporcionado es uno cuyo genoma de línea germinal incluye un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado homocigoto que incluye:
(i) uno o más segmentos génicos VA humanos, en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos comprenden VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos,
(ii) uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde el uno o más segmentos génicos JA humanos comprenden JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, y
(iii) un gen CA de ratón;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos, el uno o más segmentos génicos JA humanos, el gen CA de ratón están unidos operativamente entre sí,
en donde el gen CA de ratón está en el lugar de un gen Ck de ratón del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno, en donde el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye:
(a) una o más secuencias no codificantes de VA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano está adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparece de forma natural adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno, y
(b) una o más secuencias no codificantes de Jk humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparece de forma natural adyacente a Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno, y
en donde el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina incluye una secuencia no codificante de cadena ligera k humana entre el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos que tiene una secuencia que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano y un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón es un gen CA1 de ratón.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye los potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón Ekí y Ek3'.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una eliminación de uno o más segmentos génicos Vk de ratón y/o uno o más segmentos génicos Jk. En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye una eliminación de todos los fragmentos génicos Vk y/o Jk de ratón funcionales.
En algunas realizaciones, el ratón proporcionado es uno cuyo genoma de línea germinal incluye:
(a) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno homocigoto que incluye uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos, y uno o más segmentos génicos Jh humanos unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos de tal forma que el ratón expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina, cada una comprendiendo una secuencia de dominio variable de cadena pesada humana y una secuencia de dominio constante de cadena pesada de ratón,
(b) un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye uno o más segmentos génicos Vk humanos y uno o más segmentos génicos Jk unidos operativamente a un gen de la región Ck de ratón endógeno de tal forma que el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina, cada una incluyendo una secuencia de dominio variable de cadena ligera k humana y una secuencia de dominio constante de cadena ligera k de ratón, y
(c) un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluye:
(i) uno o más segmentos génicos VA humanos, en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos comprenden VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos,
(ii) uno o más segmentos génicos JA humanos, en donde el uno o más segmentos génicos JA humanos comprenden JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, y
(iii) un gen CA de ratón;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos, el uno o más segmentos génicos JA humanos, el gen CA de ratón están unidos operativamente entre sí,
en donde el gen CA de ratón está en el lugar de un gen Ck de ratón del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno,
en donde el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye:
(a) una o más secuencias no codificantes de VA humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano está adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VA humano aparece de forma natural adyacente a VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno, y
(b) una o más secuencias no codificantes de Jk humano, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano está adyacente a JA1, JA2, JA3, JA6 o JA7 en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, y en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de Jk humano aparece de forma natural adyacente a Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno, y
en donde el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina incluye una secuencia no codificante de cadena ligera k humana entre el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos que tiene una secuencia que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano y un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno;
de tal forma que el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina, cada una comprendiendo una secuencia de dominio variable de cadena ligera A humana y una secuencia de dominio constante de cadena ligera A de ratón.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado. En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento es heterocigoto para el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado. En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento es homocigoto para el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado.
En algunas realizaciones, el genoma del ratón incluye además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunas realizaciones, el elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera A de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una TdT exógena está ubicada en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, un locus RAG1 o un locus RAG2. En algunas realizaciones, una TdT es una TdT humana. En algunas realizaciones, una TdT es una isoforma corta de TdT (TdTS).
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y exhibe cadenas ligeras (por ejemplo, expresa dominios variables de cadena ligera incluidos) con un aumento de al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,75 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces en la diversidad de unión sobre un ratón comparable (por ejemplo, compañero de camada) que no incluye una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal. En algunas realizaciones, la diversidad de unión se mide por el número de lecturas únicas de CDR3/10.000. En algunas realizaciones, la diversidad de unión se mide por el número de lecturas únicas de CDR3/10.000.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 % de cadenas ligeras (por ejemplo, cadenas ligeras lambda y/o kappa) producidas por el ratón muestran adiciones no plantilla. También se desvela un anticuerpo preparado mediante un método que incluye las etapas de:
(a) proporcionar un ratón descrito en el presente documento;
(b) inmunizar el ratón con un antígeno de interés;
(c) mantener al ratón en condiciones suficientes para que el ratón produzca una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y
(d) recuperar un anticuerpo que se une al antígeno de interés del ratón, o una célula del ratón, o una célula derivada de una célula del ratón,
en donde el anticuerpo de (d) incluye dominios variables de cadena pesada humana y variables de cadena ligera A humana.
También se desvela un anticuerpo preparado mediante un método que incluye las etapas de:
(a) inmunizar un ratón descrito en el presente documento con un antígeno de interés;
(b) mantener al ratón en condiciones suficientes para que el ratón produzca una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y
(c) recuperar un anticuerpo que se une al antígeno de interés del ratón, o una célula del ratón, o una célula derivada de una célula del ratón,
en donde el anticuerpo de (c) incluye dominios variables de cadena pesada humana y variables de cadena ligera A humana.
En algunas realizaciones, un ratón no expresa de forma detectable dominios variables de cadena ligera k de inmunoglobulina endógenos. En algunas realizaciones, un ratón no expresa de forma detectable dominios variables de cadena ligera A de inmunoglobulina endógenos.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento produce una población de linfocitos B en respuesta a la inmunización con un antígeno que incluye uno o más epítopos. En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a uno o más epítopos del antígeno de interés. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen a uno o más epítopos del antígeno de interés, en donde los anticuerpos expresados por la población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen: (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, y/o (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana como se describe en el presente documento está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % de los linfocitos B en una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k que está hipermutada somáticamente.
También se desvela un método para preparar un anticuerpo, incluyendo:
(i) expresar una primera secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina en una célula huésped, en donde la primera secuencia de nucleótidos incluye una secuencia de región variable de cadena pesada humana;
(ii) expresar una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera A de inmunoglobulina en una célula huésped, en donde la segunda secuencia de nucleótidos incluye una secuencia de región variable de cadena ligera A humana que se identificó (por ejemplo, se expresó y/o se aisló) de un ratón cuyo genoma de línea germinal incluye:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado
(iii) cultivar la célula huésped de manera que las cadenas ligeras de inmunoglobulina y las cadenas pesadas de inmunoglobulina se expresen y formen un anticuerpo; y
(iv) obtener el anticuerpo de la célula huésped y/o cultivo de células huésped.
En algunas realizaciones, una primera secuencia de nucleótidos incluye una región constante de cadena pesada humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.
En algunas realizaciones, un segundo nucleótido incluye una secuencia de región constante de cadena ligera A humana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo quimérico inverso. En algunas realizaciones, una primera secuencia de nucleótidos incluye una región constante de cadena pesada de ratón. En algunas realizaciones, una segunda secuencia de nucleótidos incluye una secuencia de región constante de cadena ligera A de ratón.
En algunas realizaciones, el presente ratón proporcionado es uno cuyo genoma de línea germinal incluye:
(a) un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos,
en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado; y
(b) un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado incluye además:
(i) uno o más segmentos génicos Vk humanos, y
(ii) uno o más segmentos génicos Jk humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vk humanos y el uno o más segmentos génicos Jk humanos están unidos operativamente a un gen Ck.
En algunas realizaciones, un gen Ck es un gen Ck de ratón endógeno.
En algunas realizaciones, el genoma del ratón incluye además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunas realizaciones, el elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera A de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una TdT exógena está ubicada en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, un locus RAG1 o un locus RAG2. En algunas realizaciones, una TdT es una TdT humana. En algunas realizaciones, una TdT es una isoforma corta de TdT (TdTS).
En algunas realizaciones, el genoma del ratón incluye además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional. En algunas realizaciones, el elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera A de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una TdT exógena está ubicada en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, un locus RAG1 o un locus RAG2. En algunas realizaciones, una TdT es una TdT humana. En algunas realizaciones, una TdT es una isoforma corta de TdT (TdTS).
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y exhibe cadenas ligeras (por ejemplo, expresa dominios variables de cadena ligera incluidos) con un aumento de al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,75 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces en la diversidad de unión sobre un ratón comparable (por ejemplo, compañero de camada) que no incluye una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal. En algunas realizaciones, la diversidad de unión se mide por el número de lecturas únicas de CDR3/10.000. En algunas realizaciones, la diversidad de unión se mide por el número de lecturas únicas de CDR3/10.000.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional en su genoma de línea germinal y al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 % de cadenas ligeras (por ejemplo, cadenas ligeras lambda y/o kappa) producidas por el ratón muestran adiciones no plantilla. En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón como se describe en el presente documento comprende una base genética que incluye una cepa 129, una cepa BALB/c, una cepa C57BL/6, una cepa mixta 129xC57BL/6, o combinaciones de las mismas.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos incluidos en el presente documento, que están compuestos por las siguientes figuras, tienen fines ilustrativos y no de limitación.
La figura 1A y 1B muestran ilustraciones de una realización ilustrativa, no a escala, de una estrategia para construir un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.1) usado para generar una realización del ratón de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 2A muestra una ilustración de una realización ilustrativa, no a escala, de la inserción de un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.1) en un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado de un clon de células madre embrionarias (ES) de ratón, cuyo clon de células ES se usó para generar una realización de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 2B muestra una ilustración de una realización ilustrativa, no a escala, de la eliminación de uno o más casetes de selección mediada por recombinasa en un locus de cadena ligera de Igk genomanipulado como resultado de la inserción de un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.1) usado para generar un realización del ratón de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 3 muestra una ilustración de una realización ilustrativa, no a escala, de una estrategia para construir un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.2) usado para generar una realización del ratón de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 4A muestra una ilustración, no a escala, de la inserción de un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.2) en un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado de un clon de células madre embrionarias (ES) de ratón, cuyo clon de células ES se usó para generar una realización del ratón de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 4B muestra una ilustración de una realización ilustrativa, no a escala, de la eliminación de uno o más casetes de selección mediada por recombinasa en un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como resultado de la inserción de un vector de direccionamiento (descrito en el Ejemplo 1.2) usado para generar un realización del ratón de acuerdo con la presente divulgación.
La figura 5 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que muestra esplenocitos activados por células individuales recogidos de ratones de tipo natural (WT) y 6558 HO (LiK, homocigotos), ilustrando la fila superior la expresión de CD19 (eje y) y CD3 (eje x), e ilustrando la fila inferior esplenocitos activados por CD19+ que expresan inmunoglobulina D (IgD, eje y) e inmunoglobulina M (IgM, eje x).
La figura 6 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye médula ósea activada por células individuales representativa recogida de ratones de tipo natural (WT) y 6558HO (LiK, homocigotos), ilustrando la fila superior la expresión de CD19 (eje y) y CD3 (eje x), e ilustrando la fila inferior la expresión de inmunoglobulina M (IgD, eje y) y B220 (eje x).
La figura 7 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye esplenocitos activados por CD19+ representativos recogidos de ratones de tipo natural (WT) y 6558HO (LiK, homocigotos) que ilustran la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina que contienen regiones constantes de IgA de ratón (eje y) o regiones constantes de IgK de ratón (eje x).
La figura 8 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye esplenocitos controlados por células individuales representativos recogidos de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de CD19 (eje y) y CD3 (eje x). Ratones HOH/LiK/A-/- -ratones homocigotos para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940), homocigotos para el locus LiK y homocigotos para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado; ratones HOH/KoK/LiK/A-/- - ratones homocigotos para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940) , hemicigotos para un locus kappa que comprende el locus LiK y un segundo locus kappa que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina inmunizada, y homocigotos para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado; ratones HOH/KoK - ratones de control homocigotos para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada y homocigotos para la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humanizada.
La figura 9 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye esplenocitos activados por CD19+ representativos recogidos de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina containing regiones constantes de IgA de ratón (eje y) o IgK de ratón (eje x).
La figura 10 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye médula ósea activada por células individuales representativa recogida de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de inmunoglobulina M (IgD, eje y) y B220 (eje x).
La figura 11 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye médula ósea activada por células individuales representativa recogida de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina containing regiones constantes de IgA de ratón (eje y) o IgK de ratón (eje x) en linfocitos B inmaduros (fila superior) y maduros (fila inferior).
La figura 12 muestra una ilustración esquemática de una realización ilustrativa, de acuerdo con la presente divulgación, no a escala, de un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y el reordenamiento del locus para formar una molécula de ADNm.
La figura 13 muestra los resultados derivados de una realización representativa de acuerdo con la presente divulgación, que incluye inmunotransferencias de proteína representativas (transferencia de Western) de SDS-PAGE usando suero aislado de ratones de tipo natural (WT) y homocigotos 6558 (LiK HO) como se describe en el Ejemplo 3.3.
La figura 14 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra esplenocitos activados por células individuales representativos recogidos de ratones humanizados que ilustran la expresión de CD19 (eje y) y CD3 (eje x). Ratones HOH/LiK/A-/-/TdT - ratones homocigotos para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940) , homocigotos para el locus LiK y homocigotos para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena; y ratones HOH/KoK/LiK/A^/TdT - ratones homocigotos para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940), hemicigotos para un locus kappa que comprende un locus LiK y un segundo locus kappa que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humanizada, y homocigotos para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena.
La figura 15 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra esplenocitos activados por CD19+ representativos recogidos de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina containing regiones constantes de IgA de ratón (eje y) o IgK de ratón (eje x).
La figura 16 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra médula ósea activada por células individuales representativa recogida de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de inmunoglobulina M (IgM, eje y) y B220 (eje x).
La figura 17 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra médula ósea activada por células individuales representativa recogida de diversos ratones humanizados indicados que ilustran la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina containing regiones constantes de IgA de ratón (eje y) o IgK de ratón (eje x) en linfocitos B inmaduros (fila superior) y maduros (fila inferior).
La figura 18 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra un gráfico que compara las respuestas inmunitarias en las cepas de ratones LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT y VI-3/TdT después de la inmunización con un inmunógeno proteico.
La figura 19 muestra los resultados de ensayar una realización de acuerdo con la presente divulgación, que muestra un gráfico que compara las respuestas inmunitarias contra la etiqueta His en cepas de ratones LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT y VI-3/TdT después de la inmunización con un antígeno proteico irrelevante fusionado con una etiqueta HIS.
La figura 20 muestra una ilustración, no a escala, de una porción de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. La figura 20 incluye una primera flecha que apunta a una representación de una primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa en el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. Como se ilustra, la primera secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa (representada por una línea) en el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno aparece de forma natural adyacente a un segmento génico VA3-12 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) y un segmento génico VA2-11 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) en el locus de cadena ligera IgA de inmunoglobulina humana endógeno. La figura 20 también incluye una segunda flecha que apunta a una representación de una segunda secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa en el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno. Como se ilustra, la segunda secuencia no codificante de VA humano endógena ilustrativa (representada por una línea) en el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno aparece de forma natural adyacente a un segmento génico VA2-11 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) y un segmento génico VA3-10 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) en el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana endógeno.
La figura 21 muestra una ilustración, no a escala, de una porción de un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno. La figura 21 incluye una primera flecha que apunta a una representación de una primera secuencia no codificante de Jk humano endógena ilustrativa en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno. Como se ilustra, la primera secuencia no codificante de JK humano endógena ilustrativa (representada por una línea) en el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno aparece de forma natural adyacente a un segmento génico JK1 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) y un segmento génico Jk2 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) en el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno. La figura 21 también incluye una segunda flecha que apunta a una representación de una segunda secuencia no codificante de JK humano endógena ilustrativa en el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno. Como se ilustra, la segunda secuencia no codificante de JK humano endógena ilustrativa (representada por una línea) en el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Jk2 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) y un segmento génico Jk3 humano (representado por un cuadrado de color gris oscuro) en el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina humana endógeno.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SELECCIONADAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS
Los siguientes son ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos representativas de diversas regiones constantes de inmunoglobulina de los genes lambda de ratón, rata o ser humano. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de los genes y polipéptidos de inmunoglobulina están disponibles en el sitio web del International Immunogenetics Information System, www.imgt.org.
GCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG ACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGT GGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCC AAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCA T GGGA A AGGC AT AGC AGTT AC AGC T GCC AGGT C ACTC AT G AAGGTC AC AC T GT GGAGA AGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCC
Aminoácido de CA1 de ratón (SEQ ID NO:2):
GQPKS SP S VTLFPP S SEELETNKATL VCTITDF YPGVVTVDWKVDGTP VTQGMETTQP SKQ S NNKYMASSYLTLTARAWE RHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS
ADN de CA2 de ratón (SEQ ID NO:3):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACTCTCACCGTGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG GAAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCCAACTTTTCCCCGAGTGGTGTGACAGT GGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACC AAAGAGGGCAACAAGTTCATGGCCAGCAGCTTCCTACATTTGACATCGGACCAGTGGA GATCTCACAACAGTTTTACCTGTCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAG TCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC
Aminoácido de CA2 de ratón (SEQ ID NO:4):
GQPKSTPTLTVFPPSSEELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEG NKFMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL ADN de CA3 de ratón (SEQ ID NO:5):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACCATGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG GAAAACAAAGCCACACTCGTGTGTCTGATTTCCAATTTTTCCCCAAGTGGTGTGACAGT GGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACC AAAGAGGACAACAAGTACATGGCCAGCAGCTTCTTACATTTGACATCGGACCAGTGGA GATCTCACAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAG TCTGTCTC CTGCAGAATG TCTC
Aminoácido de CA3 de ratón (SEQ ID NO:6):
GQPKSTPTLTMFPPSPEELQENKATLVCLISNFSPSGVTYAWKANGTPITQGVDTSNPTKED NKYMASSF LHLTSDQWRSHNSFTCQVTH EGDTVEKSLSPAECL
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAG GGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGT GGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACC AAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGA GATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAGAAGAG TCTGTCTCCTGCAGAATGTGTC
Aminoácido de CA1 de rata (SEQ ID NO:8):
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQ GNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
ADN de CA2 de rata (SEQ ID NO:9):
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG ACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCFACCCTGGTGTTATGACAGT GGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTC AAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGG AGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAG TTTGFCCCGTGCTGAGTGTTCC
Aminoácido de CA2 de rata (SEQ ID NO:10):
DQPKATPS VTLFPP S SEELKTDK ATL V CMVTDF YPGVMT VVW KADGTPITQGVETTQPFK QNNK YM AT S YLLLT AK A W ETHSN Y S C Q VTHEENT VEK SL SR AEC S
ADN de CA3 de rata (SEQ ID NO:11):
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAG GGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGT GGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACC AAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGA GAT C TCGC A AC AGT TTT AC C T GC C A AGTT AC AC AT GA AGGGA AC ACTGT GGA AA AGAG TCTGTCTCCTGCAGAGTGTGTC
Aminoácido de CA3 de rata (SEQ ID NO:12):
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAW KANGAPISQGVDTANPTKQ GNKYIASSFLRLTAEQW RSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG ACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGT GGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTC AAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGG AGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAG TTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC
Aminoácido de CA4 de rata (SEQ ID NO:14):
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKA TLV CM VTDFY PGV M TVV W K AD GTPITQ GV ETTQPFK QNNK YM ATSYLLLTAK AW ETH SNY SCQVTHEEN TVEKSLSRAECS
ADN de CA1 humano (SEQ ID NO:15):
CCCAAGGCCAACCCCACGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAA CAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCTT GGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACGACCAAACCCTCCAAAC AGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGA AGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGA CAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
Aminoácido de CA1 humano (SEQ ID NO:16):
PKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADGSPVKAGVETTKPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
ADN de CA2 humano (SEQ ID NO:17):
GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAA GCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAG TGGCTTGGAAAGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTC CAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCA GTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGA GAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
Aminoácido de CA2 humano (SEQ ID NO:18):
QPKA APSV TLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQS NN K Y A AS S YLSLTPEQW K SHR S YSCQ VTHEGST VEKT YAPTEC S
ADN de CA3 humano (SEQ ID NO:19):
CCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAA CAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTTGCCT GGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGGGTGGAGACCACCACACCCTCCAAAC AAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGA AGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGA CAGTTGCCCCTACGGAATGTTCATAG
Aminoácido de CA3 humano (SEQ ID NO:20):
PKAAP S VTLFPP S SEELQ ANKATLVCLISDF YPGAVTVAW KAD S SP VKAGVETTTP SKQ SN NKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
ADN de CA6 humano (SEQ ID NO:21):
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCATCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCA AGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGCCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGAAA GTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAACACGGGAGTGGAGACCACCACACCCT CCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGC AGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGG AGAAGAC AGT GGCCCCTGC AGAAT GTT C ATAG
Aminoácido de CA6 humano (SEQ ID NO:22):
QPKAAP S VTLFPP S SEELQ ANKATLVCLISDF YPGAVKVAW KADGSPVNTGVETTTP SKQS NNKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS
ADN de CA7 humano (SEQ ID NO:23):
GTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAA
GCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAG
TGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTC
CAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCA
GTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGA
GAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT
Aminoácido de CA7 humano (SEQ ID NO:24):
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQ SNNKY A AS S YLSLTPEQWK SHRS Y SCRVTHEGSTVEKT VAPAEC S
Definiciones
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas al presente documento y no está limitado por determinadas realizaciones descritas en el presente documento. Los expertos en la materia, al leer la presente memoria descriptiva, serán conscientes de diversas modificaciones que pueden ser equivalentes a tales realizaciones descritas, o bien dentro del alcance de las reivindicaciones. En general, los términos usados en el presente documento son según su significado entendido en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario. A continuación, se proporcionan definiciones explícitas de determinados términos; los significados de estos y otros términos en casos particulares a lo largo de esta memoria descriptiva resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir del contexto. A lo largo de la memoria descriptiva se exponen definiciones adicionales para los siguientes y otros términos. Referencias bibliográficas de patentes y no relacionadas con patentes citadas dentro de esta memoria descriptiva, o partes relevantes de las mismas.
El uso de términos ordinales tales como "primero/a", "segundo/a" "tercero/a", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de una reivindicación no denota por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de una reivindicación respecto de otro, o el orden temporal para llevar a cabo los actos de un método, sino que se usan simplemente como marcadores para distinguir un elemento de una reivindicación que tiene un determinado nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (salvo por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación.
Como se usa en la presente solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier número usado en la presente solicitud con o sin "alrededor de" o "aproximadamente" pretende abarcar cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la materia relevante.
Los artículos "un" y "una" en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse que incluyen los referentes en plural. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes para un producto o un proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es de otro modo relevante, para un producto o proceso dado. La invención incluye también realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes, para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introduce en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, o según corresponda, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto en la materia que surja una contradicción o incoherencia. Cuando los elementos se presentan como listados, (por ejemplo, en el grupo Markush o en un formato similar) debe entenderse que también se desvela cada subgrupo de los elementos, y que pueden eliminarse cualquier elemento o elementos del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención o aspectos de la invención, se refiere, o refieren, a comprender elementos particulares, rasgos, etc., determinadas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, rasgos, etc. Por motivos de simplicidad, estas realizaciones no se han expuesto específicamente en todos los casos en el presente documento con tantas palabras. También debe entenderse que cualquier realización o aspecto de la invención puede excluirse explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión específica se menciona en la memoria descriptiva.
Administración: como se usa en el presente documento, incluye la administración de una composición a un sujeto o sistema (por ejemplo, a una célula, órgano, tejido, organismo o componente relevante o conjunto de componentes de los mismos). El experto en la materia apreciará que la vía de administración puede variar dependiendo, por ejemplo, del sujeto o sistema al que se administra la composición, de la naturaleza de la composición, del fin de la administración, etc. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la administración a un sujeto animal (por ejemplo, a un ser humano o un roedor) puede ser bronquial (incluyendo por instilación bronquial), bucal, entérica, interdérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosa, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo por instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y/o vítrea. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación intermitente. En algunas realizaciones, la administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado.
Mejora: como se usa en el presente documento, incluye la prevención, reducción o paliación de un estado o una mejora en el estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad, trastorno o afección.
Aproximadamente: tal como se aplica a uno o más valores de interés, incluye un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro de ±10 % (superior o inferior) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).
Biológicamente activo: como se usa en el presente documento, se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En realizaciones particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina típicamente porción "biológicamente activa".
Comparable: como se usa en el presente documento, se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., que pueden no ser idénticos entre sí, pero que son lo suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos, de modo que se puedan extraer conclusiones razonablemente basándose en las diferencias o similitudes observadas. Los expertos en la materia entenderán, en el contexto, qué grado de identidad se requiere en cualquier circunstancia dada para dos o más de estos agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc. para considerarse comparables.
Conservativa : como se usa en el presente documento, se refiere a casos en los que se describe una sustitución conservativa de aminoácidos, incluyendo una sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor para unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L) e isoleucina (Ile, I); cadenas laterales alifáticas hidroxiladas tales como serina (Ser, S) y treonina (Thr, T); cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q); cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptófano (Trp, W); cadenas laterales básicas tales como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H); cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E); y cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína (Cys, C) y metionina (Met, M). Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina (Val/Leu/Ile, V/L/I), fenilalanina/tirosina (Phe/Tyr, F/Y), lisina/arginina (Lys/Arg, K/R), alanina/valina (Ala/Val, A/V), glutamato/aspartato (Glu/Asp, E/D) y asparagina/glutamina (Asn/Gln, N/Q). En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier residuo natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunas realizaciones, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250 desvelada en Gonnet, G.H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. En algunas realizaciones, una sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250.
Control: como se usa en el presente documento, se refiere al significado entendido en la técnica de un "control" que es un patrón con el que se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables con el fin de llegar a una conclusión sobre dichas variables. En algunas realizaciones, un control es una reacción o ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o ensayo de prueba para proporcionar un elemento de comparación. Un "control" también incluye un "animal de control". Un "animal de control" puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente como se describe en el presente documento, o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo natural). En un experimento, se aplica una "prueba" (es decir, una variable que se está ensayando). En un segundo experimento, el "control", la variable que se ensaya no se aplica. En algunas realizaciones, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o ensayo realizado previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunas realizaciones, un control es o comprende un registro impreso o guardado de otro modo. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.
Interrupción: como se usa en el presente documento, se refiere al resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). En algunas realizaciones, una interrupción puede lograr o representar una inserción, eliminación, sustitución, reemplazo, mutación de aminoácido, o un cambio de marco de una o más secuencias de ADN o cualquier combinación de los mismos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunas realizaciones, una interrupción puede aumentar la expresión y/o la actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de un polipéptido codificado por un gen). En algunas realizaciones, una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunas realizaciones, una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, un polipéptido codificado). En algunas realizaciones, una interrupción puede cortar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, un polipéptido codificado). En algunas realizaciones, una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado. En algunas de estas realizaciones, una interrupción puede lograr el ensamblaje de un polipéptido de fusión. En algunas realizaciones, una interrupción puede afectar al nivel, pero no a la actividad, de un gen o producto génico. En algunas realizaciones, una interrupción puede afectar a la actividad, pero no al nivel, de un gen o producto génico. En algunas realizaciones, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunas realizaciones, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunas realizaciones, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.
Determinar, medir, evaluar, valorar, ensayar y analizar : se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. "Ensayando la presencia de" puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está o no presente o ausente.
Promotor endógeno: como se usa en el presente documento, se refiere a un promotor que está asociado de forma natural, por ejemplo, en un organismo de tipo natural, con un gen endógeno.
Genomanipulado: como se usa en el presente documento se refiere, en general, al aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polinucleótido puede considerarse que está "genomanipulado" cuando dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza se manipulan por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido genomanipulado. En algunas realizaciones, un polinucleótido genomanipulado puede comprender una secuencia reguladora que se encuentra en la naturaleza en asociación operativa con una primera secuencia codificante pero no en asociación operativa con una segunda secuencia codificante, está unida por la mano del hombre de modo que está asociada operativamente con la segunda secuencia codificante. Como alternativa, o adicionalmente, en algunas realizaciones, la primera y segunda secuencias de ácido nucleico que codifican cada una de ellas elementos o dominios polipeptídicos que en la naturaleza no están unidos entre sí pueden unirse entre sí en un único polinucleótido genomanipulado. Comparativamente, en algunas realizaciones, una célula u organismo puede considerarse que está "genomanipulado" si se ha manipulado de manera que se altere su información genética (por ejemplo, se ha introducido nuevo material genético que no estaba previamente presente, o se ha alterado o eliminado material genético previamente presente). Como es una práctica común y lo entienden los expertos en la materia, la descendencia de un polinucleótido o célula genomanipulados se denomina típicamente "genomanipulada" a pesar de que la manipulación real se realizó en una entidad anterior. Además, como apreciarán los expertos en la materia, está disponible una diversidad de metodologías a través de las cuales se puede lograr la "genomanipulación" como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la "genomanipulación" puede implicar la selección o el diseño (por ejemplo, de secuencias de ácido nucleico, secuencias polipeptídicas, células, tejidos y/u organismos) mediante el uso de sistemas informáticos programados para realizar análisis o comparación, o de otro modo para analizar, recomendar y/o seleccionar secuencias, alteraciones, etc.). Como alternativa, o adicionalmente, en algunas realizaciones, la "genomanipulación" puede implicar el uso de metodologías de síntesis química y/o tecnologías de ácidos nucleicos recombinantes in vitro tales como, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa), hibridación, mutación, transformación, transfección, etc., y/o cualquiera de una diversidad de metodologías de emparejamiento controlado. Como apreciarán los expertos en la materia, una diversidad de tales técnicas establecidas (por ejemplo, para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección, etc.) se conocen bien en la técnica y se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y/o analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 and Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5a Ed., ed. por Old, R.W. y S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994.
Funcional: como se usa en el presente documento, se refiere a una forma o fragmento de una entidad (por ejemplo, un gen o segmento de gen) que exhibe una propiedad particular (por ejemplo, forma parte de una secuencia codificante) y/o actividad. Por ejemplo, en el contexto de las inmunoglobulinas, las regiones variables se codifican por segmentos génicos únicos (es decir, V, D y/o J) que se ensamblan (o recombinan) para formar secuencias codificantes funcionales. Cuando están presentes en el genoma, los segmentos génicos están organizados en grupos, aunque se producen variaciones. Un segmento génico "funcional" es un segmento génico representado en una secuencia expresada (es decir, una región variable) para el que se ha aislado (es decir, clonado) el ADN genómico correspondiente y se ha identificado por secuencia. Algunas secuencias de segmentos génicos de inmunoglobulina contienen marcos de lectura abiertos y se consideran funcionales aunque no están representadas en un repertorio expresado, mientras que otras secuencias de segmentos génicos de inmunoglobulina contienen mutaciones (por ejemplo, mutaciones puntuales, inserciones, eliminaciones, etc.), dando como resultado un codón finalizador y/o una secuencia cortada que posteriormente hace que tales secuencias de segmentos génicos sean incapaces de realizar las propiedades y/o actividades asociadas con una secuencia o secuencias no mutadas. Tales secuencias no están representadas en secuencias expresadas y, por lo tanto, se clasifican como pseudogenes.
Gen: como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto polipeptídico). En algunas realizaciones, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto particular). En algunas realizaciones, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunas realizaciones particulares, un gen puede incluir tanto una secuencia codificante (por ejemplo, exónica) como no codificante (por ejemplo, intrónica). En algunas realizaciones, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias de intrones que, por ejemplo, pueden controlar o afectar a uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, expresión específica del tipo de célula, la expresión inducible, etc.). Con fines de claridad, los presentes inventores destacan que, como se usa en la presente divulgación, el término "gen" generalmente se refiere a una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido o fragmento del mismo; el término puede incluir opcionalmente secuencias reguladoras, como resultará evidente a partir del contexto para los expertos en la materia. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término "gen" a las unidades de expresión que no codifican proteínas, sino más bien para aclarar que, en la mayoría de los casos, el término como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido.
Heterólogo: como se usa en el presente documento, se refiere a un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen o producto génico presente en una célula u organismo en particular, el término aclara que el polipéptido, gen o producto génico relevante: 1) se genomanipuló por la mano del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de los mismos) a través de la mano del hombre (por ejemplo, ingeniería genética); y/o 3) no se produjo de forma natural por ni está presente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula u organismo relevante). "Heterólogo" también incluye un polipéptido, gen o producto génico que normalmente está presente en una célula u organismo natural particular, pero se ha alterado o modificado, por ejemplo, por mutación o colocación bajo el control de elementos reguladores no asociados de forma natural y, en algunas realizaciones, no endógenos (por ejemplo, un promotor).
Célula huésped: como se usa en el presente documento, se refiere a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico o proteína. Los expertos tras la lectura de la presente divulgación comprenderán que dichos términos se refieren no solo a la célula en cuestión en particular, sino también se usa para referirse a la descendencia de tal célula. Debido a que determinadas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero todavía están incluidas dentro del alcance de la expresión "célula huésped". En algunas realizaciones, una célula huésped es o comprende una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o proteína heterólogo, independientemente del Reino de vida al que esté designada la célula. Las células ilustrativas incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterias (por ejemplo, cepas de Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, una célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunas realizaciones, una célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PFR.C6®). En algunas realizaciones, una célula huésped es o comprende una célula aislada. En algunas realizaciones, una célula huésped forma parte de un tejido. En algunas realizaciones, una célula huésped forma parte de un organismo.
Identidad: como se usa en el presente documento en relación con una comparación de secuencias, se refiere a la identidad como se determina por una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas realizaciones, las identidades como se describen en el presente documento se determinan usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) empleando una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y usando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
En el lugar de: como se usa en el presente documento, se refiere a una sustitución posicional en la que una primera secuencia de ácido nucleico se ubica en la posición de una segunda secuencia de ácido nucleico en un cromosoma (por ejemplo, en donde estaba ubicada previamente la segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, originalmente) en un cromosoma, por ejemplo, en el locus endógeno de la segunda secuencia de ácido nucleico). La expresión "en el lugar de" no requiere que la segunda secuencia de ácido nucleico se elimine de, por ejemplo, un locus o cromosoma. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de ácido nucleico y la primera secuencia de ácido nucleico son comparables entre sí en que, por ejemplo, la primera y segunda secuencias son homólogas entre sí, contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos codificantes de proteínas, elementos reguladores, etc.) y/o tienen secuencias similares o idénticas. En algunas realizaciones, una primera y/o segunda secuencia de ácido nucleico incluye uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio aceptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); en algunas realizaciones, un primer y/o segundo ácido nucleico secuencia incluye una o más secuencias codificantes. En algunas realizaciones, una primera secuencia de ácido nucleico es un homólogo o una variante (por ejemplo, mutante) de la segunda secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una primera secuencia de ácido nucleico es un ortólogo u homólogo de la segunda secuencia. En algunas realizaciones, una primera secuencia de ácido nucleico es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana. En algunas realizaciones, incluso cuando la primera secuencia de ácido nucleico es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana, la segunda secuencia de ácido nucleico es o comprende una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o rata). En algunas realizaciones, incluso cuando la primera secuencia de ácido nucleico es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana, la segunda secuencia de ácido nucleico es o comprende una secuencia humana. En algunas realizaciones, una primera secuencia de ácido nucleico es una variante o mutante (es decir, una secuencia que contiene una o más diferencias de secuencia, por ejemplo, sustituciones, en comparación con la segunda secuencia) de la segunda secuencia. La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que forman parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones no traducidas 5' o 3', etc.). Por ejemplo, en diversas realizaciones, una primera secuencia de ácido nucleico es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de un ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; una primera secuencia de ácido nucleico es una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un polipéptido de región variable no humana, en su totalidad o en parte, y el fragmento de ADN codifica uno o más polipéptidos de la región variable humana, en su totalidad o en parte). En diversas realizaciones, un segmento génico de inmunoglobulina humana o un fragmento del mismo está en el lugar de un segmento o fragmento génico de inmunoglobulina no humana endógeno.
In vitro: como se usa en el presente documento se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo pluricelular.
In vivo: como se usa en el presente documento se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo pluricelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de sistemas basados en células, la expresión puede usarse para referirse a eventos que se producen en una célula viva (al contrario que, por ejemplo, sistemas in vitro).
Aislado: como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia y/o entidad (1) que se ha separado de al menos algunos de los componentes a los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) que se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o más de aproximadamente el 99 % de los demás componentes a los que estaban asociadas inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados se separan del 10 % al 100 %, 15 %-100 %, 20 %-100 %, 25 %-100 %, 30 %-100 %, 35 %-100 %, 40 %-100 %, 45 %-100 %, 50 %-100 %, 55 %-100 %, 60 %-100 %, 65 %-100 %, 70 %-100 %, 75 %-100 %, 80 %-100 %, 85 %-100 %, 90 %-100 %, 95 %-100 %, 96 %-100 %, 97 %-100 %, 98 %-100 % o el 99 %-100 % de los demás componentes a los que estaban asociados inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados se separan del 10 % al 100 %, 10 %-99 %, 10 %-98 %, 10 %-97 %, 10 %-96 %, 10 %-95 %, 10 %-90 %, 10 %-85 %, 10 %-80 %, 10 %-75 %, 10 %-70 %, 10 %-65 %, 10 %-60 %, 10 %-55 %, 10 %-50 %, 10 %-45 %, 10 %-40 %, 10 %-35 %, 10 %-30 %, 10 %-25 %, 10 %-20 % o el 10 %-15 % de los otros componentes a los que estaban asociados inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados se separan del 11 % al 99 %, 12 %-98 %, 13 %-97 %, 14 %-96 %, 15 %-95 %, 20 %-90 %, 25 %-85 %, 30 %-80 %, 35 %-75 %, 40 %-70 %, 45 %-65 %, 50 %-60 % o el 55 %-60 % de los demás componentes a los que estaban asociados inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 % o más de aproximadamente un 99 % puros. En algunas realizaciones, los agentes aislados son un 80 %-99 %, 85 %-99 %, 90 %-99 %, 95 %-99 %, 96 %-99 %, 97 %-99 % o un 98 %-99 % puros. En algunas realizaciones, los agentes aislados son un 80 %-99 %, 80 %-98 %, 80 %-97 %, 80 %-96 %, 80 %-95 %, 80 %-90 % o un 80 %-85 % puros. En algunas realizaciones, los agentes aislados son un 85 %-98 %, 90 %-97 % o un 95 %-96 % puros. En algunas realizaciones, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas realizaciones, como entenderán los expertos en la materia, una sustancia todavía puede considerarse "aislada" o incluso "pura", después de haberse combinado con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etc.); en dichas realizaciones, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir dichos portadores o excipientes. Por proporcionar un solo ejemplo, en algunas realizaciones, un polímero biológico tal como un polipéptido o polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera "aislado" cuando: a) en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con alguno o con todos los componentes que lo acompañan en su estado natural en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa o está asociado de otro modo con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido que se sintetiza químicamente, o se sintetiza en un sistema celular diferente al que lo produce en la naturaleza, se considera un polipéptido "aislado". Como alternativa, o adicionalmente, en algunas realizaciones, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido "aislado" en la medida en que se haya separado de otros componentes: a) con los que está asociado en la naturaleza; y/o b) con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente.
Locus: como se usa en el presente documento, se refiere a una o más ubicaciones de un gen (o secuencia significativa), secuencia de a Dn , secuencia que codifica un polipéptido, o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un "locus de inmunoglobulina" puede referirse a la ubicación de un segmento génico de inmunoglobulina (por ejemplo, V, D, J o C), secuencia de ADN de segmento génico de inmunoglobulina, secuencia que codifica un segmento génico de inmunoglobulina, o posición de segmento génico de inmunoglobulina en un cromosoma del genoma de un organismo que se ha identificado en cuanto al lugar donde reside dicha secuencia. Un "locus de inmunoglobulina" puede comprender un elemento regulador de un segmento génico de inmunoglobulina, incluyendo, pero sin limitación, un potenciador, un promotor, secuencia o región reguladora 5' y/o 3' o una combinación de los mismos. Un "locus de inmunoglobulina" puede comprender ADN intergénico, por ejemplo, ADN que normalmente reside o aparece entre segmentos génicos en un locus de tipo natural. Los expertos en la materia apreciarán que los cromosomas pueden, en algunas realizaciones, contener cientos o incluso miles de genes y demuestran la colocalización física de locus genéticos similares cuando se comparan entre diferentes especies. Dichos locus genéticos pueden describirse como que tienen sintenia compartida.
Parece de forma natural: como se usa en el presente documento en referencia a un elemento biológico (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico) significa que el elemento biológico se puede encontrar en un contexto y/o ubicación específicos, en ausencia de genomanipulación (por ejemplo, ingeniería genética), en una célula u organismo (por ejemplo, un animal). En otras palabras, una secuencia que aparece de forma natural en un contexto y/o ubicación específicos no está en el contexto y/o ubicación especificados como resultado de la genomanipulación (por ejemplo, ingeniería genética). Por ejemplo, una secuencia que aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana endógeno es una secuencia que puede encontrarse adyacente a un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana endógeno, en ausencia de ingeniería genética, en un ser humano. En algunas realizaciones, se puede obtener, derivar y/o aislar una secuencia de donde aparece naturalmente en una célula u organismo. En algunas realizaciones, una célula u organismo no es una fuente directa de una secuencia que aparece de forma natural en la célula u organismo. Por ejemplo, podría identificarse una secuencia correspondiente en una célula u organismo y a continuación producirse o replicarse mediante mecanismos conocidos en la técnica.
Animal no humano: como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. En algunos casos, un animal no humano es un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero y un ave. En algunas realizaciones, un animal no humano es un mamífero. En algunos casos, un mamífero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca o un ratón. En algunos casos, un animal no humano es un ratón
Ácido nucleico: como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica a través de un enlace fosfodiéster. Como quedará claro por el contexto, en algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es o comprende ARN; en algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más residuos de ácido nucleico naturales. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácido nucleico. En algunas realizaciones, un análogo de ácido nucleico difiere de un "ácido nucleico" en el sentido de que no utiliza una cadena principal fosfodiéster. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más "ácidos nucleicos peptídicos", que son conocidos en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal. Como alternativa, o adicionalmente, en algunas realizaciones, un "ácido nucleico" tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es, comprende o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y combinaciones de las mismas). En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los de los ácidos nucleicos naturales. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o un polipéptido. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" incluye uno o más exones. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" se prepara mediante uno o más aislamientos de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante y síntesis química. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" tiene al menos, por ejemplo, pero sin limitación, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de longitud. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es monocatenario; en algunas realizaciones, un "ácido nucleico" es bicatenario. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas realizaciones, un "ácido nucleico" tiene actividad enzimática.
Unido operativamente: como se usa en el presente documento, se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar un gen de interés (o secuencia de interés). La expresión "secuencia de control de expresión" incluye secuencias polinucleotídicas, que son necesarias para afectar a la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas. Las "secuencias de control de expresión" incluyen: las secuencias de inicio de la traducción, terminación, de promotor y de potenciador apropiadas; señales de procesamiento del ARN eficientes tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de los polipéptidos; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de polipéptidos. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas, típicamente tales secuencias de control incluyen secuencias de promotor y de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.
Condiciones fisiológicas: como se usa en el presente documento, se refiere a su significado entendido en la técnica que hace referencia a las condiciones en las que las células u organismos viven y/o se reproducen. En algunas realizaciones, la expresión incluye condiciones del medio externo o interno que pueden producirse en la naturaleza para un organismo o sistema celular. En algunas realizaciones, las condiciones fisiológicas son aquellas condiciones presentes en el cuerpo de un animal humano o no humano, especialmente las condiciones presentes en y/o dentro de un sitio quirúrgico. Las condiciones fisiológicas típicamente incluyen, por ejemplo, un intervalo de temperatura de 20-40 °C, presión atmosférica de 1, pH de 6-8, concentración de glucosa de 1-20 mM, concentración de oxígeno a niveles atmosféricos y gravedad tal como se encuentra en la tierra. En algunas realizaciones, las condiciones en un laboratorio se manipulan y/o se mantienen en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, las condiciones fisiológicas se encuentran en un organismo.
Polipéptido: como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunas realizaciones, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. En algunas realizaciones, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. En algunas realizaciones, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza por separado unas de otras (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). En algunas realizaciones, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está genomanipulada en el sentido de diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre. En algunas realizaciones, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia que no se produce en la naturaleza (por ejemplo, una secuencia que está genomanipulada en el sentido de diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre para codificar dicho polipéptido).
Recombinante: como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que están diseñados, genomanipulados, preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como polipéptidos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados de una biblioteca recombinante combinatoria de polipéptidos humanos (Hoog-enboom, H. R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, H. y W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J. V. y J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H. y P. Chames, 2000, Immunol. Today 21:371-8), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que se ha manipulado genéticamente para incluir genes de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann, S-A. y L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8) o polipéptidos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique cortar y empalmar elementos de secuencia seleccionados entre sí. En algunas realizaciones, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunas realizaciones, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados están diseñados in silico. En algunas realizaciones, uno o más de dichos elementos de secuencia seleccionados son el resultado de mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, de una fuente natural o sintética (por ejemplo, artificial). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido recombinante comprende secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, ser humano, ratón, etc.). En algunas realizaciones, un polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos que fue el resultado de mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de modo que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, mientras se originan de y se relacionan con secuencias de polipéptidos, pueden no existir de forma natural en el genoma de un animal no humano in vivo.
Referencia: como se usa en el presente documento, se refiere a un agente estándar o de control, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor contra el cual un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés se compara. En algunas realizaciones, un agente de referencia, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor se ensaya y/o se determina de manera sustancialmente simultánea con la prueba o determinación de un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas realizaciones, un agente de referencia, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor es una referencia histórica, opcionalmente incorporada en un medio tangible. En algunas realizaciones, una referencia puede referirse a un control. Una "referencia" también incluye un "animal de referencia". Un "animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a la descrita en el presente documento o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo natural). Típicamente, como entenderían los expertos en la materia, un agente de referencia, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor se determina o se caracteriza en condiciones comparables a las usadas para determinar o caracterizar un agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.
Reemplazo: como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso a través del cual una secuencia de un ácido "reemplazada" (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus del huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y se localiza en su lugar un ácido nucleico de "reemplazo" diferente. En algunas realizaciones, la secuencia del ácido nucleico reemplazada y las secuencias del ácido nucleico de reemplazo son comparables entre sí en que, por ejemplo, son homólogas entre sí, contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos codificantes de proteínas, elementos reguladores, etc.) y/o tienen secuencias similares o idénticas. En algunas realizaciones, una secuencia de un ácido nucleico reemplazada incluye uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio aceptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); en algunas realizaciones, una secuencia de un ácido nucleico de reemplazo incluye una o más secuencias codificantes. En algunas realizaciones, una secuencia de un ácido nucleico de reemplazo es un homólogo o variante (por ejemplo, mutante) de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. En algunas realizaciones, una secuencia de un ácido nucleico de reemplazo es un ortólogo u homólogo de la secuencia reemplazada. En algunas realizaciones, una secuencia de un ácido nucleico de reemplazo es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana. En algunas realizaciones, incluyendo cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada es o comprende una secuencia de ratón. En algunas realizaciones, incluyendo cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es o comprende una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada es o comprende una secuencia humana. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es una variante o mutante (es decir, una secuencia que contiene una o más diferencias de secuencia, por ejemplo, sustituciones, en comparación con la secuencia reemplazada) de la secuencia reemplazada. La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que forman parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones no traducidas 5' o 3', etc.). Por ejemplo, en diversas realizaciones, un reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena por una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de un ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; un reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una función similar a un polipéptido codificado por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un polipéptido de región variable no humana, en su totalidad o en parte, y el fragmento de ADN codifica uno o más polipéptidos de la región variable humana, en su totalidad o en parte). En diversas realizaciones, un segmento génico de inmunoglobulina no humana endógeno o fragmento del mismo se reemplaza por un segmento génico de inmunoglobulina humana o fragmento del mismo.
Sustancialmente: como se usa en el presente documento, se refiere a la condición cualitativa de mostrar la extensión o el grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o transcurren hasta completarse o consiguen o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible carencia de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Similitud sustancial: como se usa en el presente documento, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la materia, dos secuencias generalmente se consideran "sustancialmente similares" si contienen residuos similares (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos) en las posiciones correspondientes. Como se entiende en la técnica, mientras que los residuos similares pueden ser residuos idénticos (véase también Identidad sustancial, a continuación), los residuos similares también pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales comparables de manera apropiada. Por ejemplo, como es bien conocido por los expertos en la materia, determinados aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos", y/o que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo puede considerarse una sustitución "conservativa". Las categorizaciones típicas de aminoácidos se resumen en la siguiente tabla.
Alanina Ala A No polar Neutro 1,8
Arginina Arg R Polar Positivo -4,5
Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5
Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5
Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5
Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5
Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5
Glicina Gly G No polar Neutro -0,4
Histidina His H Polar Positivo -3,2
Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5
Leucina Leu L No polar Neutro 3,8
Lisina Lys K Polar Positivo -3,9
Metionina Met M No polar Neutro 1,9
Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8
Prolina Pro P No polar Neutro -1,6
Serina Ser S Polar Neutro -0,8
Treonina Thr T Polar Neutro -0,7
Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9
Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3
Valina Val V No polar Neutro 4,2
Aminoácidos ambiguos 3 letras 1 letra
Asparagina o ácido aspártico Asx B
Glutamina o ácido glutámico Glx Z
Leucina o isoleucina Xle J
Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X
Como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas ilustrativos de este tipo en Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3), 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266.460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25,3389-402; Baxevanis, A.D. y B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics, A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias similares, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de similitud. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente similares si al menos, por ejemplo, pero sin limitación, el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son similares (por ejemplo, idénticos o incluyen una sustitución conservativa) en un tramo relevante de residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa (por ejemplo, una secuencia de un gen, un segmento génico, una secuencia que codifica un dominio, un polipéptido o un dominio). En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos. En algunas realizaciones, el tramo relevante incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa, por ejemplo, residuos no contiguos reunidos por la conformación plegada de un polipéptido o una porción del mismo.
Identidad sustancial: como se usa en el presente documento, se refiere a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la materia, dos secuencias generalmente se consideran "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos (por ejemplo, aminoácidos o nucleótidos) en las posiciones correspondientes. Como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas ilustrativos de este tipo en Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. y B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas realizaciones, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, el 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un tramo de residuos relevante. En algunas realizaciones, un tramo de residuos relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, un tramo de residuos relevante tiene, por ejemplo, pero sin limitación, al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.
Construcción de direccionamiento o vector de direccionamiento: como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula polinucleotídica que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración de la construcción de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal mediante recombinación homóloga. Las regiones de direccionamiento que se dirigen utilizando sitios de reconocimiento de recombinasas específicos de sitio (por ejemplo, sitios loxP o Frt) también se incluyen y describen en el presente documento. En algunas realizaciones, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además una secuencia de un ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador seleccionable, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de los ácido nucleico que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan en o facilitan la recombinación que implica dichas secuencias. En algunas realizaciones, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. En algunas realizaciones, una construcción de direccionamiento como se describe en el presente documento comprende además un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por una secuencia endógena. En algunas realizaciones, una construcción de direccionamiento (o vector de direccionamiento) puede comprender una secuencia de un ácido nucleico manipulada por la mano del hombre. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede construir una construcción de direccionamiento (o vector de direccionamiento) para que contenga un polinucleótido genomanipulado o recombinante que contenga dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza, pero que sean manipuladas por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido genomanipulado o recombinante.
Transgén o construcción de transgén: como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de un ácido nucleico (que codifica, por ejemplo, un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte) que se ha introducido en una célula por la mano del hombre, tal como por los métodos descritos en el presente documento. Un transgén puede ser parcial o totalmente heterólogo, es decir, exógeno, al animal o célula manipulados genéticamente en donde se introduce. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones o promotores, que puede ser necesario para la expresión de una secuencia de un ácido nucleico seleccionada.
Animal no humano modificado genéticamente o animal no humano manipulado genéticamente: se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier animal no humano de origen no natural en el que una o más de las células del animal no humano contienen un ácido nucleico y/o un gen heterólogos que codifica un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un "animal no humano modificado genéticamente" o "animal no humano manipulado genéticamente" se refiere a un animal no humano que contiene un transgén o una construcción de transgén como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se introduce un ácido nucleico y/o gen heterólogo en la célula, directa o indirectamente mediante introducción en una célula precursora, mediante manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. La expresión manipulación genética no incluye las técnicas clásicas de reproducción, sino que está dirigido a la introducción de moléculas de ADN recombinante. Esta molécula puede estar integrada dentro de un cromosoma, o puede ser un ADN que se replica extracromosómicamente. Las expresiones "animal no humano modificado genéticamente" o "animal no humano manipulado genéticamente" se refieren a animales que son heterocigotos u homocigotos para un ácido nucleico y/o gen heterólogos, y/o animales que tienen copias únicas o múltiples de un ácido nucleico y/o gen heterólogos. El animal no humano modificado genéticamente proporcionado es un ratón.
Vector: como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unida. En alguna realización, los vectores son capaces de realizar la replicación y/o expresión extracromosómica de los ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
Tipo natural: como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (en contraste con mutante, enfermo, alterado, etc.). Los expertos en la materia apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo natural con frecuencia existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Descripción detallada
Se proporciona un ratón modificado genéticamente cuyo genoma de línea germinal comprende:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende.
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
La presente divulgación describe, entre otras cosas, ratones genomanipulados que tienen material genético heterólogo que codifica dominios VA humanos, cuyo material genético heterólogo comprende secuencias génicas VA y JA humanas (es decir, segmentos génicos) y otras secuencias humanas que proporcionan un reordenamiento adecuado (por ejemplo, secuencia señal de recombinación (RSS)) y expresión de anticuerpos que tienen cadenas ligeras de IgA que incluyen una porción humana y una porción no humana, o anticuerpos que tienen cadenas ligeras de IgA que son completamente humanas. Por ejemplo, en diversas realizaciones, cuando un segmento génico humano está presente en un genoma de un ratón genomanipulado, la una o más secuencias señal de recombinación correspondientes también pueden estar presentes (por ejemplo, RSS de VA con segmento génico VA, RSS de JA con segmento génico JA, RSS de Vk con segmento génico Vk, RSS de Jk con segmento génico Jk, etc.). También se describen ratones genomanipulados que contienen material genético heterólogo que se inserta de tal manera que los anticuerpos que contienen cadenas ligeras que tienen un dominio VA humano y un dominio CA de ratón se expresan en el repertorio de anticuerpos del ratón. Además, se describen ratones genomanipulados que contienen material genético heterólogo que se inserta de tal manera que los anticuerpos que contienen cadenas ligeras que tienen un dominio VA humano y un dominio CA de ratón se expresan a partir de locus de cadena ligeras de IgK genomanipulados que incluyen secuencias génicas de IgA humanas y no humanas (por ejemplo, segmentos génicos) y, en algunos casos, secuencias de cadena ligera de Igk humana, en el genoma de línea germinal del ratón.
Sin desear quedar ligado a teoría alguna en particular, se contempla que los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionen un sistema in vivo mejorado que aproveche la expresión de anticuerpos que contienen dominios VA humanos para la producción de anticuerpos terapéuticos. También se contempla que los ratones, como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, proporcionen formas alternativas genomanipuladas de locus de cadena ligera (por ejemplo, locus de cadena ligera de IgK) que contienen material genético heterólogo para el desarrollo de productos terapéuticos basados en anticuerpos humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, agentes de unión multiespecíficos, scFv, polipéptidos de fusión, etc.) para las dianas de la enfermedad que están asociadas con respuestas de anticuerpos sesgadas (por ejemplo, respuestas de anticuerpos caracterizadas por una proporción abrumadora de cadenas ligeras K o A). Por lo tanto, los ratones proporcionados son particularmente útiles para el desarrollo de anticuerpos humanos y moléculas basadas en anticuerpos humanos (por ejemplo, agentes de unión multiespecíficos, scFv, polipéptidos de fusión, etc.) contra dianas asociadas con una mala inmunogenicidad (por ejemplo, virus) debido, en parte, a repertorios y/o respuestas de anticuerpos distorsionados.
La presente divulgación describe, entre otras cosas, un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina que incluye uno o más segmentos génicos VA humanos, uno o más segmentos génicos JA humanos y un gen CA de ratón. Tal locus se denomina locus "lambda en kappa" o "LiK".
En particular, la presente divulgación describe la producción de un ratón que tiene un genoma de línea germinal que contiene un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado que, en algunas realizaciones, está caracterizado por la introducción de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos y la introducción de un gen CA de ratón en el lugar de un gen Ck de ratón, de modo que dicha pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos se unen operativamente a dicho gen CA de ratón. Como se describe en el presente documento, la producción de tal locus de cadena ligera de IgK genomanipulado da como resultado la expresión de anticuerpos que contienen cadenas ligeras que incluyen un dominio VA humano y un dominio CA de ratón de dicho locus de cadena ligera de IgK genomanipulado en el genoma de línea germinal del ratón. El genoma de línea germinal de los ratones proporcionados comprende un locus de cadena ligera de IgK que incluye secuencias de cadena ligera de IgA humana. En algunas realizaciones, el genoma de línea germinal de ratones proporcionados comprende (i) un locus de cadena ligera de IgK que incluye secuencias de cadena ligera de IgA humana, y (ii)(a) un locus de cadena ligera de IgK que incluye secuencias de cadena ligera de IgA humana o (ii)(b) un locus de cadena ligera de IgK que incluye secuencias de cadena ligera de IgK humana. El genoma de línea germinal de los ratones proporcionados, en algunas realizaciones, comprende un locus de cadena ligera de IgK como se describe en el presente documento y además comprende (i) un locus IgH humanizado o (ii) un locus IgH humanizado y un locus de cadena ligera de IgA endógeno funcionalmente silenciado o de otro modo convertida en no funcional. Los ratones proporcionados, como se describe en el presente documento, expresan repertorios de anticuerpos que contienen cadenas ligeras de IgA que incluyen dominios VA humanos.
Los ratones proporcionados contienen secuencias de cadena ligera de IgA humana dentro de un locus de cadena ligera de IgK. Como se describe en el presente documento, los ratones contienen secuencias de cadena ligera de IgA humana y de ratón dentro de un locus de cadena ligera de IgK. En algunas realizaciones, los animales no humanos, como se describe en el presente documento, contienen secuencias de cadena ligera de IgA humana e IgK humana en un locus de cadena ligera de IgK.
En algunas realizaciones, las secuencias de cadena ligera de IgK y/o IgA incluyen ADN intergénico que es de origen humano y/o murino. En algunas realizaciones, las secuencias de cadena ligera de IgK y/o IgA incluyen ADN intergénico que está genomanipulado y basado en una secuencia fuente que es de origen humano o murino. En algunas realizaciones, dicho ADN intergénico es del mismo locus de inmunoglobulina en el ADN intergénico se coloca, se inserta, se posiciona o se genomanipula (por ejemplo, ADN intergénico de IgK en un locus de cadena ligera de IgK). En algunas realizaciones, dicho ADN intergénico es de un locus de inmunoglobulina diferente en el que el ADN intergénico se coloca, se inserta, se posiciona o se genomanipula (por ejemplo, ADN intergénico de IgA en un locus de cadena ligera de IgK). En algunas realizaciones determinadas, los ratones, como se describe en el presente documento, contienen un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado que contiene ADN intergénico que incluye una o más secuencias de cadena ligera de IgK, una o más secuencias de cadena ligera de IgA y/o combinaciones de las mismas.
En diversas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada contiene al menos un segmento génico Vh humano, al menos un segmento génico Dh humano y al menos un segmento génico Jh humano unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena que incluye uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, etc.), por ejemplo, una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados tienen un genoma de línea germinal que incluye uno o más locus de inmunoglobulina representados en los Dibujos. Dichos ratones genomanipulados proporcionan una fuente de anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos humanos, y proporcionan un sistema in vivo mejorado adecuado para aprovechar secuencias VA humanas para la producción de anticuerpos terapéuticos humanos.
Como se describe en la sección de Ejemplos a continuación, se proporcionan ratones que tienen un genoma que contiene al menos uno de cada segmento génico de región variable de cadena pesada humana (es decir, Vh, Dh y Jh) y cadena ligera (por ejemplo, VA y JA en el locus kappa endógeno), por ejemplo, una pluralidad de segmentos génicos de región variable de cadena pesada humana (es decir, Vh, Dh y Jh) y cadena ligera (por ejemplo, VA y JA en el locus kappa endógeno), en el lugar de segmentos génicos de la región variable de ratón en locus de inmunoglobulina endógenos, e incluyen ADN intergénico no codificante humano entre los segmentos génicos de la región variable humana. Dicho ADN intergénico incluye, por ejemplo, promotores, secuencias líder y secuencias señal de recombinación que permiten la recombinación y expresión adecuadas de los segmentos génicos humanos en el contexto de dominios variables de anticuerpos. Los expertos en la materia entienden que los locus de inmunoglobulina de ratón también contienen dicho ADN intergénico no codificante. Tras la lectura de la presente divulgación, los expertos comprenderán que se puede emplear otro ADN intergénico humano o no humano en la construcción de dichos locus que dan como resultado la misma expresión de dominios variables humanos en el contexto de anticuerpos en el ratón. Dichos locus similares solo necesitan contener las secuencias codificantes humanas (es decir, exones) de los segmentos génicos humanos deseados para lograr la expresión de anticuerpos que contienen dominios variables humanos.
Se describen diversos aspectos de determinadas realizaciones con más detalle en las siguientes secciones, cada uno de los cuales puede aplicarse a cualquier aspecto o realización como se describe en el presente documento. El uso de las secciones no es limitativo.
Repertorios de anticuerpos en ratones
Las inmunoglobulinas (también denominadas anticuerpos) son glucoproteínas grandes (~150 kD) en forma de Y que son producidas por linfocitos B de un sistema inmunitario huésped para neutralizar patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, etc.). Cada inmunoglobulina (Ig) se compone de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, cada una de las cuales tiene dos componentes estructurales: un dominio variable y un dominio constante. Las regiones variables de cadena pesada y ligera difieren en los anticuerpos producidos por diferentes linfocitos B, pero son iguales para todos los anticuerpos producidos por un linfocito B o un clon de linfocitos B únicos. Las regiones variables de cadena pesada y ligera de cada anticuerpo juntas comprenden la región de unión a antígeno (o sitio de unión a antígeno). Las inmunoglobulinas pueden existir en diferentes variedades que se denominan isotipos o clases en función de las regiones (o dominios) constantes de cadena pesada que contienen. La región constante de cadena pesada es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en anticuerpos de diferentes isotipos. La siguiente tabla resume los nueve isotipos de anticuerpos en ratones y seres humanos.
Figure imgf000035_0001
Se han identificado isotipos adicionales en otras especies. Los isotipos confieren propiedades biológicas especializadas al anticuerpo debido a las diferentes características estructurales entre los diferentes isotipos y se encuentran en diferentes ubicaciones (células, tejidos, etc.) dentro del cuerpo de un animal. Inicialmente, los linfocitos B producen IgM e IgD con regiones de unión a antígeno idénticas. Tras su activación, los linfocitos B cambian a diferentes isotipos mediante un proceso denominado cambio de clase, que implica un cambio de la región constante del anticuerpo producido por el linfocito B mientras que las regiones variables permanecen iguales, conservando así la especificidad al antígeno del anticuerpo original (linfocito B).
Dos locus separados (IgK e IgA) contienen los segmentos génicos que, tras el reordenamiento, codifican las cadenas ligeras de anticuerpos y presentan exclusión tanto alélica como isotípica. Las relaciones de expresión de los linfocitos B k+ a A+ varían entre especies. Por ejemplo, los seres humanos demuestran una relación de aproximadamente 60:40 (k:A). En ratones y ratas, se observa una relación de 95:5 (k:A). Curiosamente, la relación k:A observada en gatos (5:95) es opuesta a la de ratones y ratas. Se han realizado varios estudios para dilucidar las posibles razones detrás de estas relaciones observadas y se ha propuesto tanto la complejidad del locus (es decir, el número de segmentos génicos, en particular, los segmentos génicos V) como la eficiencia del reordenamiento del segmento génico como justificación. El locus de cadena ligera de IgA humana se extiende sobre 1.000 kb y contiene aproximadamente 70 segmentos génicos VA (29 a 33 funcionales) y siete pares de segmentos génicos JA-CA (cuatro a cinco funcionales) organizados en tres grupos (véase, por ejemplo, la figura 1 de la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511). La mayoría de las regiones VA observadas en el repertorio de anticuerpos expresados están codificadas por segmentos génicos contenidos dentro del grupo más próximo (denominado grupo A). El locus de cadena ligera de IgA de ratón es sorprendentemente diferente del locus humano y, dependiendo de la cepa, contiene solo unos pocos segmentos génicos VA y JA organizados en dos grupos de genes distintos (véase, por ejemplo, la figura 2 de la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511).
El desarrollo de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades humanas se ha centrado en gran medida en la creación de líneas de animales no humanos genomanipuladas, en particular, líneas de roedores genomanipuladas, albergando cantidades variables de material genético en sus genomas correspondientes a genes de inmunoglobulinas humanas (revisado en, por ejemplo, Bruggemann, M. et al., 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp.
63:101-8). Los esfuerzos iniciales para crear tales líneas de roedor manipuladas genéticamente se centraron en la integración de porciones de locus de inmunoglobulina humana que podrían, por sí solas, soportar la recombinación de segmentos génicos y la producción de cadenas pesadas y/o ligeras que fueran completamente humanas inactivando al mismo tiempo los locus de inmunoglobulina endógenos (véanse, por ejemplo, Bruggemann, M. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 86:67-09-13; Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6; Taylor, L.D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. et al., 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. et al., 1994, Nat. Genet. 7:13-21; Lonberg, N. et al., 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. et al., 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Wagner, S.D. et al., 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-56; Green, L.L. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. et al., 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Kellermann, S.A. y L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7). En particular, algunos esfuerzos han incluido la integración de secuencias de cadena ligera de IgA humana (véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 y 2011/0236378 A1; las Patentes de EE.UU. N.° 6.998.514 y 7.435.871; Nicholson, I.C. et al., 1999, J. Immunol. 163:6898-906; Popov, A.V et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10): 1611-19). Dichos esfuerzos se han centrado en la integración aleatoria de cromosomas artificiales de levadura que contienen secuencias VA, JA y CA humanas, creando así cepas de ratón que expresan cadenas ligeras de IgA completamente humanas (es decir, dominios VA y CA humanos). Los esfuerzos más recientes han empleado estrategias similares usando construcciones que también contienen secuencias VA, JA y CA humanas (Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63).
Otros esfuerzos más han incluido la inserción específica de segmentos génicos VA y JA humanos en locus de cadena ligera de Ig de roedor endógenos (k y A) de manera que dichos segmentos génicos VA y JA humanos se unen operativamente a genes de región constante de cadena ligera de Ig endógenos (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092). En dichos animales, todos los segmentos génicos VA humanos de los grupos A y B y uno o cuatro segmentos génicos JA humanos se insertaron en los locus de cadena ligera IgK e IgA endógenos. Como resultado, varios segmentos génicos VA y JA humanos diferentes demostraron un reordenamiento adecuado en ambos locus de cadena ligera de Ig de roedor genomanipulados para formar cadenas ligeras funcionales expresadas en el repertorio de anticuerpos de roedor, cuyas cadenas ligeras incluían dominios VA humanos en el contexto de regiones Ck y CA endógenas (véanse, por ejemplo, la Tabla 7 y las figuras 11-13 de la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511). En particular, los ratones que tenían locus de cadena ligera de Igk genomanipulados que albergaban segmentos génicos VA y JA humanos demostraron una relación lambda humana con respecto a lambda endógena (según lo medido por la relación de IgCK con respecto a IgCA) de aproximadamente 1:1 en el compartimiento esplénico (véase, por ejemplo, la Tabla 4 de la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511). De hecho, ambas cepas de ratón genomanipuladas (es decir, locus de cadena ligera de Igk genomanipulados o de IgA genomanipulados) demostraron que los dominios VA humanos podrían expresarse a partir de locus de cadena ligera de Ig endógenos en roedores, que normalmente muestran un gran sesgo en la expresión de cadenas ligeras (véase anteriormente). La presente divulgación proporciona el reconocimiento de que se pueden producir estructuras de locus de cadena ligera de Ig genomanipulados para maximizar el uso de segmentos génicos VA y JA humanos en repertorios de anticuerpos para dianas terapéuticas en animales no humanos, en particular, en comparación con animales no humanos que contienen un locus de cadena ligera de IgA que carece de la complejidad y calidad fuerte (por ejemplo, ratones y ratas) que normalmente se asocia con un locus de cadena ligera de IgA humana (es decir, un locus que aparece en una célula humana). Dichas estructuras de locus de cadena ligera de Ig genomanipulado proporcionan la capacidad para determinar repertorios de anticuerpos únicos resultantes de su diseño.
La presente divulgación ilustra la producción exitosa de un ratón cuyo genoma de línea germinal contiene un locus de cadena ligera de IgK endógeno genomanipulado que comprende una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos en unión operativa a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón, cuyo gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón se inserta en el lugar de un gen de la región constante de cadena ligera de IgK no humana del locus de cadena ligera de IgK endógeno. En particular, la presente divulgación demuestra específicamente la producción exitosa de (1) un ratón genomanipulado que expresa anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, cuyos anticuerpos incluyen cadenas ligeras que contienen un dominio VA humano y un dominio CA de ratón, y (2) un animal de ratón genomanipulado que expresa anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes humanas, cuyos anticuerpos incluyen cadenas ligeras que contienen dominios VA y CA humanos. Como se ilustra específicamente en el presente documento, la expresión de dichas cadenas ligeras se logra mediante la inserción de dicha pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos en un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK endógeno. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados están genomanipulados para que la expresión de las regiones variables de cadena ligera de IgA endógenas se inactive (por ejemplo, mediante eliminación génica).
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados están genomanipulados para que la expresión de las regiones variables de cadena ligera de IgK endógenas se inactive (por ejemplo, mediante reemplazo o sustitución). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados están genomanipulados para que los ratones expresen regiones variables de cadena ligera de IgA humana de un locus de cadena ligera de IgK endógeno genomanipulado y regiones variables de cadena ligera de IgK humana de un locus de cadena ligera de IgK endógeno genomanipulado. Por lo tanto, la presente divulgación, en al menos algunas realizaciones, abarca el desarrollo de un sistema in vivo mejorado para la producción de anticuerpos humanos al proporcionar un ratón genomanipulado que contiene un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado alternativamente que da como resultado un repertorio de anticuerpos expresados que contiene dominios VA humanos y dominios CA de ratón.
Construcciones de ácido nucleico
Típicamente, una molécula polinucleotídica que contiene secuencias de cadena ligera de IgA humana (por ejemplo, segmentos génicos VA y JA humanos) o una o más porciones de las mismas se unió con (por ejemplo, se inserta en) un vector, preferentemente un vector de ADN, para replicar la molécula polinucleotídica en una célula huésped.
Las secuencias de cadena ligera de IgA humana, pueden clonarse directamente a partir de secuencias o fuentes conocidas (por ejemplo, bibliotecas) o sintetizarse a partir de secuencias de línea germinal diseñadas en silico basándose en secuencias publicadas disponibles en GenBank u otras bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo, IMGT). Como alternativa, las bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden proporcionar secuencias de ADN de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, secuencias VA y JA humanas y combinaciones de las mismas). Las bibliotecas de BAC pueden contener un tamaño de inserción de 100-150 kb y son capaces de albergar inserciones de hasta 300 kb (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218). Por ejemplo, se ha descrito una biblioteca de BAC humanos que alberga tamaños de inserción promedio de 164-196 kb (Osoegawa, K. et al., 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. et al., 1998, Genomics 52:1-8, Artículo N.° GE985423). Se han construido bibliotecas de BAC genómicas humanas y de ratón y están disponibles comercialmente (por ejemplo, ThermoFisher). Las bibliotecas genómicas de BAC también pueden servir como fuente de secuencias de ADN de inmunoglobulina así como de regiones de control transcripcional.
Como alternativa, las secuencias de ADN de inmunoglobulina pueden aislarse, clonarse y/o transferirse a partir de cromosomas artificiales de levadura (YAC). Por ejemplo, se ha determinado la secuencia de nucleótidos del locus de cadena ligera de IgA humana (véase, por ejemplo, Dunham, I. et al., 1999, Nature 402:489-95). Además, los YAC se han empleado previamente para ensamblar un transgén de locus de cadena ligera de IgA humana (véanse, por ejemplo, Popov, A.V. et al., 1996, Gene 177:195-201; Popov, A.V. et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19). Se puede clonar y contener un locus completo de cadena ligera de IgA (humano o de ratón) dentro de varios YAC. Si se emplean múltiples YAC y contienen regiones de similitud solapante, pueden recombinarse dentro de cepas huésped de levadura para producir una única construcción que represente el locus completo o porciones deseadas del locus (por ejemplo, una región a la que se dirija un vector de direccionamiento). Los brazos de YAC pueden modificarse adicionalmente con casetes de selección de mamíferos mediante retroadaptación para ayudar a introducir las construcciones en células madre embrionarias o embriones mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.
Las secuencias de ADN y aminoácidos de los segmentos génicos de cadena ligera de IgA humana para su uso en la construcción de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento pueden obtenerse de bases de datos publicadas (por ejemplo, GenBank, IMGT, etc.) y/o de secuencias de anticuerpos publicadas. En algunas realizaciones, las construcciones de ácido nucleico que contienen segmentos génicos de cadena ligera de IgA humana comprenden una región J (es decir, una secuencia genómica que incluye una pluralidad de segmentos génicos J de cadena ligera), en donde la región J comprende secuencias codificantes de segmentos génicos JA humanos con su correspondiente 12RSS, donde la 12RSS se ha posicionado entre el ADN intergénico no codificante típicamente asociado con secuencias codificantes de segmentos génicos Jk humanos con su correspondiente 23RSS.
En algunas realizaciones, tal secuencia puede denominarse región J de cadena ligera genomanipulada. En algunas realizaciones determinadas, las construcciones de ácido nucleico que contienen segmentos génicos de cadena ligera de IgA humana comprenden secuencias VA y JA humanas unidas operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA (CA) de ratón. En algunas realizaciones determinadas, las construcciones de ácido nucleico que contienen segmentos génicos de cadena ligera de IgA humana comprenden secuencias VA y JA humanas unidas operativamente a una o más regiones potenciadoras de cadena ligera de IgA de ratón (o secuencias potenciadoras). En algunas realizaciones determinadas, las construcciones de ácido nucleico que contienen segmentos génicos de cadena ligera de IgA humana comprenden secuencias VA y JA humanas unidas operativamente a un gen de la región CA de ratón y regiones potenciadoras de cadena ligera de IgK de ratón (o secuencias potenciadoras).
En algunas realizaciones, las construcciones de ácido nucleico que contienen secuencias VA y JA humanas comprenden además ADN intergénico que es de origen humano y/o murino. En algunas realizaciones, el ADN intergénico es o comprende una secuencia de cadena ligera de IgK murina no codificante, una secuencia de cadena ligera de IgK humana no codificante, una secuencia de cadena ligera de IgA murina no codificante, una secuencia de cadena ligera de IgA humana no codificante o combinaciones de las mismas.
Las construcciones de ácido nucleico se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede preparar una construcción de ácido nucleico como parte de un plásmido más grande. Tal preparación permite la clonación y selección de las construcciones correctas de una manera eficaz como se conoce en la técnica. Las construcciones de ácido nucleico que contienen secuencias de cadena ligera de IgA humana, en su totalidad o en parte, como se describe en el presente documento, pueden ubicarse entre sitios de restricción en el plásmido para que puedan aislarse de las secuencias plasmídicas restantes para su incorporación en un animal no humano deseado.
Se conocen en la técnica diversos métodos empleados en la preparación de construcciones de ácido nucleico (por ejemplo, plásmidos) y la transformación de organismos huésped. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véanse Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5a Ed., ed. por Old, R.W. y S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Vectores de direccionamiento
Los vectores de direccionamiento se pueden emplear para introducir una construcción de ácido nucleico en un locus diana genómico y comprenden una construcción de ácido nucleico y brazos de homología que flanquean dicha construcción de ácido nucleico; los expertos en la técnica conocerán una diversidad de opciones y características generalmente aplicables al diseño, la estructura y/o el uso de vectores de direccionamiento. Por ejemplo, los vectores de direccionamiento pueden estar en forma lineal o en forma circular, y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Los vectores de direccionamiento pueden ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Para facilitar la referencia, los brazos de homología se denominan en el presente documento brazos de homología 5' y 3' (es decir, cadena arriba y cadena abajo). Esta terminología se refiere a la posición relativa de los brazos de homología con respecto a una construcción de ácido nucleico dentro de un vector de direccionamiento. Los brazos de homología 5' y 3' corresponden a regiones dentro de un locus diana o a una región dentro de otro vector de direccionamiento, que se denominan en el presente documento "secuencia diana 5'" y "secuencia diana 3'", respectivamente. En algunas realizaciones, los brazos de homología también pueden funcionar como una secuencia diana 5' o 3'.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento emplean dos, tres o más vectores de direccionamiento que son capaces de recombinarse entre sí. En diversas realizaciones, los vectores de direccionamiento son vectores de direccionamiento grandes (LTVEC) como se describe en otra parte del presente documento. En dichas realizaciones, el primer, segundo y tercer vectores de direccionamiento comprenden cada uno un brazo de homología 5' y 3'. El brazo de homología 3' del primer vector de direccionamiento comprende una secuencia que se solapa con el brazo de homología 5' del segundo vector de direccionamiento (es decir, secuencias solapantes), que permite la recombinación homóloga entre el primer y el segundo LTVEC.
En el caso de métodos de doble direccionamiento, un brazo de homología 5' de un primer vector de direccionamiento y un brazo de homología 3' de un segundo vector de direccionamiento pueden ser similares a los segmentos correspondientes dentro de un locus genómico diana (es decir, una secuencia diana), que puede promover la recombinación homóloga del primer y el segundo vectores de direccionamiento con los segmentos genómicos correspondientes y modifica el locus genómico diana.
En el caso de métodos de triple direccionamiento, un brazo de homología 3' de un segundo vector de direccionamiento puede comprender una secuencia que se solapa con un brazo de homología 5' de un tercer vector de direccionamiento (es decir, secuencias solapantes), lo que puede permitir la recombinación homóloga entre el segundo y el tercer LTVEC. El brazo de homología 5' del primer vector de direccionamiento y el brazo de homología 3' del tercer vector de direccionamiento son similares a los segmentos correspondientes dentro del locus genómico diana (es decir, la secuencia diana), que puede promover la recombinación homóloga del primer y tercer vectores de direccionamiento con los segmentos genómicos correspondientes y modifica el locus genómico diana.
Un brazo de homología y una secuencia diana o dos brazos de homología "corresponden" o son "correspondientes" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. La identidad de secuencia entre una secuencia diana dada y el brazo de homología correspondiente que se encuentra en un vector de direccionamiento (es decir, secuencia solapante) o entre dos brazos de homología puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca la recombinación homóloga. Por proporcionar un solo ejemplo, una cantidad de identidad de secuencia compartida por un brazo de homología de un vector de direccionamiento (o un fragmento del mismo) y una secuencia diana de otro vector de direccionamiento o una secuencia diana de un locus genómico diana (o un fragmento del mismo) puede tener, por ejemplo, pero sin limitación, al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % de identidad de secuencia, de modo que las secuencias experimenten una recombinación homóloga.
Además, una región correspondiente de similitud (por ejemplo, identidad) entre un brazo de homología y una secuencia diana correspondiente puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga en el locus genómico diana. Por ejemplo, un brazo de homología dado y/o la secuencia diana correspondiente pueden comprender regiones de similitud correspondientes que tienen, por ejemplo, pero sin limitación, aproximadamente 5-10 kb, 5-15 kb, 5-20 kb, 5-25 kb, 5-30 kb, 5-35 kb, 5-40 kb, 5-45 kb, 5-50 kb, 5-55 kb, 5-60 kb, 5-65 kb, 5-70 kb, 5-75 kb, 5-80 kb, 5-85 kb, 5-90 kb, 5-95 kb, 5-100 kb, 100-200 kb o 200-300 kb de longitud (tal como se describe en otra parte del presente documento) de modo que un brazo de homología tenga suficiente similitud para experimentar una recombinación homóloga con una o más secuencias diana correspondientes dentro de un locus genómico diana de la célula o dentro de otro vector de direccionamiento. En algunas realizaciones, un brazo de homología dado y/o la secuencia diana correspondiente comprenden regiones de similitud correspondientes que tienen, por ejemplo, pero sin limitación, aproximadamente 10-100 kb, 15-100 kb, 20-100 kb, 25-100 kb, 30-100 kb, 35-100 kb, 40-100 kb, 45-100 kb, 50-100 kb, 55-100 kb, 60-100 kb, 65-100 kb, 70-100 kb, 75­ 100 kb, 80-100 kb, 85-100 kb, 90-100 kb o 95-100 kb de longitud (tal como se describe en otra parte del presente documento) de modo que un brazo de homología tenga suficiente similitud para experimentar una recombinación homóloga con una o más secuencias diana correspondientes dentro de un locus genómico diana de la célula o dentro de otro vector de direccionamiento.
Las secuencias solapantes de un brazo de homología 3' de un primer vector de direccionamiento y un brazo de homología 5' de un segundo vector de direccionamiento o de un brazo de homología 3' de un segundo vector de direccionamiento y un brazo de homología 5' de un tercer vector de direccionamiento pueden ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga entre dichos vectores de direccionamiento. Por ejemplo, una secuencia solapante dada de un brazo de homología puede comprender regiones solapantes correspondientes que tienen aproximadamente 1-5 kb, 5-10 kb, 5-15 kb, 5-20 kb, 5-25 kb, 5-30 kb, 5-35 kb, 5-40 kb, 5-45 kb, 5-50 kb, 5-55 kb, 5-60 kb, 5-65 kb, 5-70 kb, 5-75 kb, 5-80 kb, 5-85 kb, 5-90 kb, 5-95 kb, 5-100 kb, 100­ 200 kb o 200-300 kb de longitud, de modo que una secuencia solapante de un brazo de homología tenga suficiente similitud para experimentar recombinación homóloga con una secuencia solapante correspondiente dentro de otro vector de direccionamiento. En algunas realizaciones, una secuencia solapante dada de un brazo de homología comprende una región solapante que tiene aproximadamente 1-100 kb, 5-100 kb, 10-100 kb, 15-100 kb, 20-100 kb, 25-100 kb, 30-100 kb, 35-100 kb, 40-100 kb, 45-100 kb, 50-100 kb, 55-100 kb, 60-100 kb, 65-100 kb, 70-100 kb, 75­ 100 kb, 80-100 kb, 85-100 kb, 90-100 kb o 95-100 kb de longitud, de modo que una secuencia solapante de un brazo de homología tenga suficiente similitud para experimentar recombinación homóloga con una secuencia solapante correspondiente dentro de otro vector de direccionamiento. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene 1-5 kb, ambos inclusive. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 70 kb, ambos inclusive. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 70 kb, ambos inclusive. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 50 kb, ambos inclusive. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene al menos 10 kb. En algunas realizaciones, una secuencia solapante tiene al menos 20 kb. Por ejemplo, una secuencia solapante puede tener de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 5 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 15 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 15 kb a aproximadamente 20 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 25 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 25 kb a aproximadamente 30 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 35 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 35 kb a aproximadamente 40 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 45 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 45 kb a aproximadamente 50 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 60 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 70 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 70 kb a aproximadamente 80 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 90 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 90 kb a aproximadamente 100 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 120 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 120 kb a aproximadamente 140 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 140 kb a aproximadamente 160 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 160 kb a aproximadamente 180 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 180 kb a aproximadamente 200 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 220 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 220 kb a aproximadamente 240 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 240 kb a aproximadamente 260 kb, ambos inclusive, de aproximadamente 260 kb a aproximadamente 280 kb, ambos inclusive, o de aproximadamente 280 kb a aproximadamente 300 kb, ambos inclusive. Por proporcionar un solo ejemplo, una secuencia solapante puede tener de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 60 kb, ambos inclusive. Como alternativa, una secuencia solapante puede tener al menos 1 kb, al menos 5 kb, al menos 10 kb, al menos 15 kb, al menos 20 kb, al menos 25 kb, al menos 30 kb, al menos 35 kb, al menos 40 kb, al menos 45 kb, al menos 50 kb, al menos 60 kb, al menos 70 kb, al menos 80 kb, al menos 90 kb, al menos 100 kb, al menos 120 kb, al menos 140 kb, al menos 160 kb, al menos 180 kb, al menos 200 kb, al menos 220 kb, al menos 240 kb, al menos 260 kb, al menos 280 kb o al menos 300 kb. En algunas realizaciones, una secuencia solapante puede tener como máximo 400 kb, como máximo 350 kb, como máximo 300 kb, como máximo 280 kb, como máximo 260 kb, como máximo 240 kb, como máximo 220 kb, como máximo 200 kb, como máximo 180 kb, como máximo 160 kb, como máximo 140 kb, como máximo 120 kb, como máximo 100 kb, como máximo 90 kb, como máximo 80 kb, como máximo 70 kb, como máximo 60 kb o como máximo 50 kb.
En algunas realizaciones, los brazos de homología pueden corresponder a un locus que es natural de una célula (por ejemplo, un locus diana), o como alternativa pueden corresponder a una región de un segmento de ADN heterólogo o exógeno que se integró en el genoma de la célula, incluyendo, por ejemplo, transgenes, casetes de expresión o regiones heterólogas o exógenas de ADN. En algunas realizaciones, en algunas realizaciones, los brazos de homología pueden corresponder a una región en un vector de direccionamiento en una célula. En algunas realizaciones, los brazos de homología de un vector de direccionamiento pueden corresponder a una región de un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano o cualquier otra región genomanipulada que se encuentre en una célula huésped apropiada. Aún adicionalmente, los brazos de homología de un vector de direccionamiento pueden corresponder a o derivar de una región de una genoteca de BAC, una genoteca de cósmidos o una genoteca de fagos Pi. En algunas realizaciones determinadas, los brazos de homología de un vector de direccionamiento corresponden a un locus que es natural, heterólogo o exógeno a un procariota, una levadura, un ave (por ejemplo, pollo), un mamífero no humano, un ratón, un ser humano, una rata, un ratón, un hámster un conejo, un cerdo, un bovino, un ciervo, una oveja, una cabra, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo, tití común, macaco), un mamífero domesticado, un mamífero para agricultura o cualquier otro organismo de interés. En algunas realizaciones, los brazos de homología corresponden a un locus de la célula que muestra una susceptibilidad limitada al direccionamiento usando un método convencional o que ha mostrado niveles relativamente bajos de integración exitosa en un sitio dirigido y/o niveles significativos de integración inespecífica, en ausencia de una muesca o rotura bicatenaria inducida por un agente nucleasa (por ejemplo, una proteína Cas). En algunas realizaciones, los brazos de homología están diseñados para incluir ADN genomanipulado.
En algunas realizaciones, los brazos de homología 5' y 3' de uno o más vectores de direccionamiento corresponden a un genoma dirigido. Como alternativa, los brazos de homología corresponden a un genoma relacionado. Por ejemplo, un genoma dirigido es un genoma de ratón de una primera cepa, y los brazos dirigidos corresponden a un genoma de ratón de una segunda cepa, en donde la primera cepa y la segunda cepa son diferentes. En determinadas realizaciones, los brazos de homología corresponden al genoma del mismo animal o son del genoma de la misma cepa, por ejemplo, el genoma dirigido es un genoma de ratón de una primera cepa, y los brazos de direccionamiento corresponden a un genoma de ratón del mismo ratón o de la misma cepa.
Un brazo de homología de un vector de direccionamiento puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con una secuencia diana correspondiente, incluyendo, por ejemplo, 1-5 kb, ambos inclusive, 5-10 kb, ambos inclusive, 5-15 kb, ambos inclusive, 5-20 kb, ambos inclusive, 5-25 kb, ambos inclusive, 5-30 kb, ambos inclusive, 5-35 kb, ambos inclusive, 5-40 kb, ambos inclusive, 5-45 kb, ambos inclusive, 5-50 kb, ambos inclusive, 5-55 kb, ambos inclusive, 5-60 kb, ambos inclusive, 5-65 kb, ambos inclusive, 5­ 70 kb, ambos inclusive, 5-75 kb, ambos inclusive, 5-80 kb, ambos inclusive, 5-85 kb, ambos inclusive, 5-90 kb, ambos inclusive, 5-95 kb, ambos inclusive, 5-100 kb, ambos inclusive, 100-200 kb, ambos inclusive, o 200-300 kb, ambos inclusive, de longitud. En algunas realizaciones, un brazo de homología de un vector de direccionamiento tiene una longitud que es suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con una secuencia diana correspondiente que tiene 1-100 kb, ambos inclusive, 5-100 kb, ambos inclusive, 10-100 kb, ambos inclusive, 15­ 100 kb, ambos inclusive, 20-100 kb, ambos inclusive, 25-100 kb, ambos inclusive, 30-100 kb, ambos inclusive, 35­ 100 kb, ambos inclusive, 40-100 kb, ambos inclusive, 45-100 kb, ambos inclusive, 50-100 kb, ambos inclusive, 55­ 100 kb, ambos inclusive, 60-100 kb, ambos inclusive, 65-100 kb, ambos inclusive, 70-100 kb, ambos inclusive, 75­ 100 kb, ambos inclusive, 80-100 kb, ambos inclusive, 85-100 kb, ambos inclusive, 90-100 kb, ambos inclusive, o 95­ 100 kb, ambos inclusive, de longitud. Como se describe en el presente documento, los vectores de direccionamiento grandes pueden emplear brazos de direccionamiento de mayor longitud.
Los agentes nucleasa (por ejemplo, sistemas CRISPR/Cas) se pueden emplear en combinación con vectores de direccionamiento para facilitar la modificación de un locus diana (por ejemplo, modificación de un locus de cadena ligera de IgK, o modificación de un locus de cadena ligera de g modificado o genomanipulado previamente). Dichos agentes nucleasa pueden promover la recombinación homóloga entre un vector de direccionamiento y un locus diana. Cuando se emplean agentes nucleasa en combinación con un vector de direccionamiento, el vector de direccionamiento puede comprender brazos de homología 5' y 3' correspondientes a secuencias diana 5' y 3' ubicadas en suficiente proximidad a un sitio de escisión por nucleasas para promover la aparición de un evento de recombinación homóloga entre secuencias diana y brazos de homología en una muesca o rotura bicatenaria en el sitio de escisión por nucleasas. La expresión "sitio de escisión por nucleasas" incluye una secuencia de ADN en la que un agente nucleasa crea una muesca o una rotura bicatenaria (por ejemplo, un sitio de escisión Cas9). Las secuencias diana dentro de un locus dirigido que corresponden a los brazos de homología 5' y 3' de un vector de direccionamiento están "ubicadas en suficiente proximidad" a un sitio de escisión por nucleasas si la distancia es tal que promueve la aparición de un evento de recombinación homóloga entre las secuencias diana 5' y 3' y los brazos de homología tras una muesca o rotura bicatenaria en el sitio de reconocimiento. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, las secuencias diana correspondientes a los brazos de homología 5' y/o 3' de un vector de direccionamiento están dentro de al menos un nucleótido de un sitio de reconocimiento dado o están dentro de al menos 10 nucleótidos hasta aproximadamente 14 kb de un sitio de reconocimiento dado. En algunas realizaciones, un sitio de escisión por nucleasas está inmediatamente adyacente a al menos una o ambas secuencias diana.
La relación espacial de las secuencias diana que corresponden a los brazos de homología de un vector de direccionamiento y un sitio de escisión por nucleasas puede variar. Por ejemplo, las secuencias diana se pueden ubicar en 5' con respecto a un sitio de escisión por nucleasas, las secuencias diana se pueden ubicar en 3' con respecto a un sitio de reconocimiento, o las secuencias diana pueden flanquear un sitio de escisión por nucleasas.
El uso combinado de un vector de direccionamiento (incluyendo, por ejemplo, un vector de direccionamiento grande) con un agente nucleasa puede dar como resultado una eficacia de direccionamiento aumentada en comparación con el uso de un vector de direccionamiento solo. Por ejemplo, cuando se usa un vector de direccionamiento junto con un agente nucleasa, la eficacia de direccionamiento de un vector de direccionamiento se puede incrementar al menos al doble, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces o dentro de un intervalo formado por estos números enteros, tal como 2-10 veces en comparación con el uso de un vector de direccionamiento solo.
Algunos vectores de direccionamiento son "vectores de direccionamiento grandes" o "LTVEC", que incluyen vectores de direccionamiento que comprenden brazos de homología que corresponden a y derivan de secuencias de un ácido nucleico más grandes que las usadas típicamente por otros enfoques destinados a realizar recombinación homóloga en células. Un LTVEC puede tener, por ejemplo, al menos 10 kb de longitud, o la suma total de un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3' puede ser de, por ejemplo, al menos 10 kb. Los LTVEC también incluyen vectores de direccionamiento que comprenden construcciones de ácido nucleico más grandes que los usados típicamente por otros enfoques destinados a realizar recombinación homóloga en las células. Por ejemplo, los LTVEC hacen posible la modificación de grandes locus que no pueden ser alojados por los vectores de direccionamiento tradicionales basados en plásmidos debido a sus limitaciones de tamaño. Por ejemplo, un locus dirigido puede ser (es decir, los brazos de homología 5' y 3' pueden corresponder a) un locus de una célula que no direccionable usando un método convencional o que puede dirigirse únicamente de forma incorrecta o únicamente con una eficacia significativamente baja en ausencia de una muesca o rotura bicatenaria inducida por un agente nucleasa (por ejemplo, una proteína Cas).
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento emplean dos o tres LTVEC que son capaces de recombinarse entre sí y con un locus genómico diana en un evento de recombinación de tres o cuatro vías. Dichos métodos hacen posible la modificación de grandes locus que no se pueden lograr usando un solo LTVEC.
Los ejemplos de LTVEC incluyen vectores derivados de un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano, o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Los LTVEC pueden tener forma lineal o circular. Se describen ejemplos de LTVEC y métodos para producirlos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N.° 6.586.251, 6.596.541 y N.° 7.105.348; y en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2002/036789.
Ratones, células y tejidos proporcionados
Se proporcionan ratones que expresan (por ejemplo, cuyos linfocitos B expresan) anticuerpos que contienen cadenas ligeras que incluyen un dominio VA humano resultado de la integración de material genético que corresponde al menos a una porción de un locus de cadena ligera de IgA humana (es decir, al menos una porción de los segmentos génicos YA y JA humanos), y que codifica un dominio YA humano (es decir, una secuencia YA-JA humana reorganizada), en el lugar de las correspondientes secuencias de la región variable de cadena ligera de g no humana en el genoma de línea germinal del ratón.
La presente divulgación proporciona sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos anticuerpos, componentes de anticuerpos (por ejemplo, porciones de unión a antígeno y/o composiciones o formatos que los incluyen) y/o agentes terapéuticos basados en anticuerpos que se pueden usar, por ejemplo, en el tratamiento de una diversidad de enfermedades que afectan a los seres humanos. Además, la presente descripción también abarca el reconocimiento de que los ratones que tienen locus de inmunoglobulina genomanipulados, tales como locus de cadena ligera kappa (k) de inmunoglobulina (Ig) genomanipulados y/o que de otro modo expresan, producen o contienen repertorios de anticuerpos caracterizados por cadenas ligeras que tienen regiones V lambda (A) humanas, son útiles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, dichos ratones pueden usarse para aprovechar la diversidad de secuencias VA humanas en la identificación y desarrollo de nuevos productos terapéuticos basados en anticuerpos. En algunas realizaciones, los ratones descritos en el presente documento proporcionan sistemas mejorados in vivo para el desarrollo de anticuerpos y/o productos terapéuticos basados en anticuerpos para su administración a seres humanos. En algunas realizaciones, los ratones descritos en el presente documento proporcionan sistemas in vivo mejorados para el desarrollo de anticuerpos y/o productos terapéuticos basados en anticuerpos que contienen dominios VA humanos caracterizados por un rendimiento mejorado (por ejemplo, expresión y/o representación en un repertorio de anticuerpos específicos de antígeno) en comparación a anticuerpos y/o productos terapéuticos basados en anticuerpos obtenidos de sistemas in vivo existentes que contienen secuencias de la región VA humana.
La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, un ratón que tiene un locus de cadena ligera de IgK que contiene una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina genomanipulada y un gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina genomanipulada. Como se describe en el presente documento, los ratones proporcionados contienen en un genoma de línea germinal un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende una región variable de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulada caracterizada por la presencia de uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos VA humanos, cuyo uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera A de inmunoglobulina (CA) de ratón, cuyo gen de la región constante de cadena ligera A de inmunoglobulina (CA) de ratón se posiciona en el lugar de un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina (Ck) no humana en el locus k de inmunoglobulina endógeno del ratón. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera de IgK que contiene ADN intergénico que sea de origen de cadena ligera A de inmunoglobulina y/o de cadena ligera k de inmunoglobulina, y combinaciones de las mismas.
En muchas realizaciones, una región variable de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulada comprende además una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina posicionada o insertada entre dicho uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones, dicha secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina posicionada o insertada entre dicho uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos es o comprende una secuencia de ratón. En algunas realizaciones, dicha secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina posicionada o insertada entre dicho uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos es o comprende una secuencia humana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana es o comprende una secuencia genómica que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano un segmento génico Jk1 humano de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 segmentos génicos VA humanos funcionales. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 5 a 25, 5 a 24, 5 a 23, 5 a 22, 5 a 21, 5 a 20, 5 a 19, 5 a 18, 5 a 17, 5 a 16, 5 a 15, 5 a 14, 5 a 13, 5 a 12, 5 a 11, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7 o 5 a 6 segmentos génicos VA humanos funcionales. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 6 a 25, 7 a 25, 8 a 25, 9 a 25, 10 a 25, 11 a 25, 12 a 25, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25, 16 a 25, 17 a 25, 18 a 25, 19 a 25, 20 a 25, 21 a 25, 22 a 25, 23 a 25 o 24 a 25 segmentos génicos VA humanos funcionales. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 6 a 24, 7 a 23, 8 a 22, 9 a 21, 10 a 20, 11 a 19, 12 a 18, 13 a 17, 14 a 16 o 15 a 16 segmentos génicos VA humanos funcionales. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 6 a 24, 7 a 23, 8 a 22, 9 a 21, 10 a 20, 11 a 19, 12 a 18, 13 a 17 o 14 a 16 segmentos génicos VA humanos funcionales.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 10 a 70, 10 a 65, 10 a 60, 10 a 55, 10 a 50, 10 a 45, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20 o 10 a 15 segmentos génicos VA humanos en total. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 15 a 70, 20 a 70, 25 a 70, 30 a 70, 35 a 70, 40 a 70, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 70, 60 a 70 o 65 a 70 segmentos génicos VA humanos en total. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden de 15 a 65, 20 a 60, 25 a 55, 20 a 50, 25 a 45, 30 a 40, 30 a 35 o 35 a 40 segmentos génicos VA humanos en total.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados contienen segmentos génicos VA y/o JA humanos en configuración natural o de línea germinal (por ejemplo, una secuencia de ADN que contiene una pluralidad de secuencias codificantes de segmentos génicos VA y/o JA humanos intercalados con una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina humana no codificante). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados contienen segmentos génicos VA y/o JA humanos en una configuración que se aparta o se desvía de una configuración natural o de línea germinal (por ejemplo, una secuencia de ADN que contiene una pluralidad de secuencias codificantes de los segmentos génicos VA y/o JA humanos intercaladas con una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina no codificante (por ejemplo, humana o murina). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados contienen segmentos génicos YA y/o JA humanos en una configuración que no aparece de forma natural en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana del genoma de línea germinal de una célula humana.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados contienen una secuencia de ADN en un locus de cadena ligera de IgK no humana endógeno que incluye una pluralidad de secuencias codificantes de VA y JA humanas intercaladas (o yuxtapuestas, asociadas, etc.) con una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina humana no codificante (por ejemplo, k, A y combinaciones de los mismos). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados contienen una secuencia de ADN en un locus de cadena ligera de IgA no humana endógeno que incluye una pluralidad de secuencias codificantes de VA y JA humanos intercaladas con una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, murina) no codificante.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados están caracterizados por la expresión de anticuerpos de locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógenos en el genoma de línea germinal de dichos ratones, cuyos anticuerpos contienen (1) dominios VA humanos y (2) dominios CA de ratón. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados están caracterizados por un uso mejorado de las regiones VA humanas de locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulados (por ejemplo, pero sin limitación, aproximadamente 2 veces) en comparación con uno o más ratones genomanipulados de referencia.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón, una célula de ratón o tejido de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende: (a) uno o más segmentos génicos VA humanos, (b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y (c) un gen CA de ratón, en donde (a) y (b) están unidos operativamente a (c), y en donde el ratón carece de un gen Ck de ratón en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón, célula de ratón o tejido de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos, uno o más segmentos génicos JA humanos y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a dicho gen CA de ratón, y cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno. En muchas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón, un gen CA de ratón insertado en el lugar de un gen Ck de ratón en una cadena ligera k de inmunoglobulina endógena.
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ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón comprende una secuencia tiene es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a un gen CA de ratón seleccionado del grupo que consiste en CA1 de ratón, CA2 de ratón y CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un gen CA de ratón seleccionado del grupo que consiste en un CA1 de ratón, CA2 de ratón y CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA1 de ratón es o comprende la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA2 de ratón es o comprende la SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA3 de ratón es o comprende la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA de ratón comprende una secuencia que es idéntica a un gen CA1 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón comprende una secuencia que es del 80 % al 100 %, del 85 % al 100 %, del 90 % al 100 %, del 95 % al 100 %, o del 98 % al 100 % idéntica a un gen CA de ratón seleccionado del grupo que consiste en CA1 de ratón, CA2 de ratón y CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón comprende una secuencia que es del 80 % al 98 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 90 %, o del 80 % al 85 % idéntica a un gen CA de ratón seleccionado del grupo que consiste en CA1 de ratón, CA2 de ratón y CA3 de ratón. En algunas realizaciones, un gen CA de ratón comprende una secuencia que es del 85 % al 98 %, del 90 % al 95 %, o del 88 % al 93 % idéntica a un gen CA de ratón seleccionado del grupo que consiste en CA1 de ratón, CA2 de ratón y CA3 de ratón.
En algunas realizaciones, un gen CA de roedor es o comprende un gen CA de rata. En algunas realizaciones, un gen CA de rata comprende una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a un gen CA de rata seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 de rata, CA2 de rata, CA3 de rata y CA4 de rata. En algunas realizaciones, un gen CA de rata comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un gen CA de rata seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 de rata, CA2 de rata, CA3 de rata y CA4 de rata. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA1 de rata es o comprende la SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA2 de rata es o comprende la SEQ ID NO:9. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA3 de rata es o comprende la SEQ ID NO:11. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA4 de rata es o comprende la SEQ ID nO:13.
En algunas realizaciones, un gen CA de rata comprende una secuencia que es del 80 % al 100 %, del 85 % al 100 %, del 90 % al 100 %, del 95 % al 100 % o del 98 % al 100 % idéntica a un gen CA de rata seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 de rata, CA2 de rata, CA3 de rata y CA4 de rata. En algunas realizaciones, un gen CA de rata comprende una secuencia que es del 80 % al 98 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 90 % o del 80 % al 85 % idéntica a un gen CA de rata seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 de rata, CA2 de rata, CA3 de rata y CA4 de rata. En algunas realizaciones, un gen CA de rata comprende una secuencia que es del 85 % al 98 %, del 90 % al 95 % o del 88 % al 93 %, idéntica a un gen CA de rata seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 de rata, CA2 de rata, CA3 de rata y CA4 de rata.
En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano. En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano. En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA1 humano es o comprende la SEQ ID NO:15. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA2 humano es o comprende la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA3 humano es o comprende la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA6 humano es o comprende la SEQ ID NO:21. En algunas realizaciones determinadas, un gen CX7 humano es o comprende la SEQ ID NO:23. En algunas realizaciones determinadas, un gen CA humano es o comprende un gen CA2 humano.
En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es del 80 % al 100 %, del 85 % al 100 %, del 90 % al 100 %, del 95 % al 100 % o del 98 % al 100 % idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano. En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es del 80 % al 98 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 90 % o del 80 % al 85 % idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano. En algunas realizaciones, un gen CA humano comprende una secuencia que es del 85 % al 98 %, del 90 % al 95 % o del 88 % al 93 %, idéntica a un gen CA humano seleccionado del grupo que consiste en un gen CA1 humano, CA2 humano, CA3 humano, CA6 humano y CA7 humano.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos reemplaza los segmentos génicos Vk y Jk no humanos en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones, la inserción incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural entre los segmentos génicos VA y JA humanos, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones de un animal ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos es en el lugar de o remplaza los segmentos génicos Vk y Jk no humanos en el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina comprende la inserción de al menos 24, al menos 34, al menos 52, al menos 61 o al menos 70 segmentos génicos YA humanos y al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones determinadas de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina comprende la inserción de 39 segmentos génicos VA humanos y al menos 5 segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina comprende la inserción de VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1 o cualquier combinación de los mismos, y J JA1 humano, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la inserción incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en un locus de cadena ligera A humana endógeno, y ADN no codificante humano (en su totalidad o en parte) que aparece de forma natural adyacente a JA1 humano, JA2, JA3, JA6 o JA7 en un locus de cadena ligera A humana endógeno. En algunas realizaciones determinadas, la inserción incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en un locus de cadena ligera A humana endógeno, y ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un Jk1 humano, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 en un locus de cadena ligera k humana endógeno. En algunas realizaciones determinadas, la inserción de VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1 o cualquier combinación de los mismos, incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en un locus de cadena ligera A humana endógeno, y la inserción de JA1 humano, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, incluye ADN no codificante humano (en su totalidad o en parte) que aparece de forma natural adyacente a JA1 humano, VA2, JA3, JA6, JA7 en un locus de cadena ligera A humana endógeno. En algunas realizaciones determinadas, la inserción de VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1 o cualquier combinación de los mismos, incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 o VA3-1 en un locus de cadena ligera A humana endógeno, y la inserción de JA1 humano, VA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, incluye ADN no codificante humano (en su totalidad o en parte) que aparece de forma natural adyacente a Jk1 humano, Jk2, Jk3, Jk4 o Jk5 en un locus de cadena ligera k humana endógeno.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, como se describe en el presente documento, comprende además una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana entre el uno o más segmentos génicos VA humanos, el uno o más segmentos génicos JA humanos, el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana, como se describe en el presente documento, es o comprende una secuencia genómica que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano un segmento génico Jk1 humano de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, el genoma de línea germinal de dicho ratón, célula de ratón o tejido de ratón comprende además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos, cuyos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323).
En algunas realizaciones, la inserción de uno o más segmentos génicos VH humanos, uno o más segmentos génicos DH humanos y uno o más segmentos génicos JH humanos son en el lugar de o reemplazan, en su totalidad o en parte, segmentos génicos Vh, Dh y Jh no humanos (por ejemplo, reemplazan o sustituyen posicionalmente secuencias codificantes de segmentos génicos Vh, Dh y Jh no humanos con secuencias codificantes de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos). En algunas realizaciones determinadas, la inserción incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural entre los segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana es o comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena. En muchas realizaciones, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, endógena) incluye uno o más genes o segmentos génicos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana (por ejemplo, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, etc.). En algunas realizaciones determinadas, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, como se describe en el presente documento, comprende la inserción de los segmentos génicos Vh humanos Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, o cualquier combinación de los mismos, los segmentos génicos Dh humanos Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26, Dh7-27, o cualquier combinación de los mismos, y los segmentos génicos Jh humanos Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, la inserción incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a Vh3-74 humano, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, VhI-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 o Vh6-1 en un locus de cadena pesada endógeno, ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un Dh1-1 humano, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26 o Dh7-27, y ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un Jh1 humano, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, o Jh en un locus de cadena pesada endógeno.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6 en su genoma (por ejemplo, su genoma de línea germinal), que codifica un polipéptido ADAM6, un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional del mismo (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940). En algunas realizaciones, un polipéptido ADAM6, un ortólogo funcional, un homólogo funcional o un fragmento funcional del mismo se expresa a partir de un gen Adam6. En algunas realizaciones, un gen Adam6 no se origina del ratón que incluye un gen Adam6 (por ejemplo, un ratón que incluye un gen Adam6 de rata o un gen Adam6 de ratón obtenido de otra cepa de ratón). En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6 ectópico. Un gen Adam6 "ectópico", como se usa en el presente documento, se refiere a un gen Adam6 que está en un contexto diferente al que aparece el gen Adam6 en un ratón de tipo natural. Por ejemplo, el gen Adam6 podría ubicarse en un cromosoma diferente, ubicarse en un locus diferente o posicionarse adyacente a secuencias diferentes. Un gen Adam6 ectópico ilustrativo es un gen Adam6 de ratón ubicado dentro de secuencias de inmunoglobulina humana (por ejemplo, segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana). En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6 insertado o integrado.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una inserción de una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos Adam6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos en su genoma (por ejemplo, su genoma de línea germinal).
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos en su genoma (por ejemplo, su genoma de línea germinal). En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6a de ratón y/o un gen Adam6b de ratón en su genoma (por ejemplo, su genoma de línea germinal). En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye una o más secuencias de nucleótidos de ADAM6a de ratón, un ortólogo funcional, homólogo funcional o fragmento funcional del mismo, y/o ADAM6b de ratón, un ortólogo funcional, homólogo funcional o fragmento funcional del mismo.
En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan y/o se ubican en el mismo cromosoma que el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan y/o se ubican en una posición tal que la una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos son contiguos a segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan y/o se ubican en una posición tal que la una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están adyacentes a segmentos génicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan y/o se ubican en una posición tal que la una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos están ubicados entre los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos y/o se ubican entre un primer y un segundo segmento génico Vh humano. En algunas realizaciones, un primer segmento génico Vh humano es Vh1-2 humano y un segundo segmento génico Vh humano es Vh6-1 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan y/o se ubican en el lugar de un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, una o más secuencias de nucleótidos que codifican uno o más polipéptidos ADAM6 no humanos, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos se insertan entre un segmento génico VH humano y un segmento génico DH humano.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6 que restaura o mejora la actividad de ADAM6. En algunas realizaciones, el gen Adam6 restaura la actividad de ADAM6 al nivel de un ratón comparable que incluye un gen Adam6 endógeno funcional. En algunas realizaciones, el gen Adam6 mejora la actividad de ADAM6 a un nivel que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, o al menos 10 veces la actividad de ADAM6 de un animal no humano comparable que no incluye un gen Adam6 funcional.
En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento incluye un gen Adam6 que restaura o mejora la fertilidad en un ratón macho. En algunas realizaciones, el gen Adam6 restaura la fertilidad en un ratón macho a un nivel de un animal no humano comparable que incluye un gen Adam6 endógeno funcional. En algunas realizaciones, el gen Adam6 restaura la fertilidad en un ratón macho de modo que la cantidad de crías producidas mediante el apareamiento del ratón macho es al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % de la cantidad de crías producidas a partir de un apareamiento comparable de un ratón macho comparable que no incluye un gen Adam6 funcional. En algunas realizaciones, el gen Adam6 mejora la fertilidad en un animal no humano macho de modo que el número de crías producidas por el apareamiento del animal no humano macho incluye al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces el número de crías producidas a partir de un apareamiento comparable de un animal no humano macho comparable que no incluye un gen Adam6 funcional.
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, como se describe en el presente documento, carece de al menos un gen Adam6 endógeno no humano. En algunas realizaciones, la falta de al menos un gen Adam6 de ratón endógeno reduce la actividad de ADAM6 y/o la fertilidad en un ratón macho que carece de un gen Adam6 de ratón endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humana, como se describe en el presente documento, incluye una interrupción de al menos un gen Adam6 de ratón endógeno. En algunas realizaciones, la interrupción de al menos un gen Adam6 de ratón endógeno reduce la actividad de ADAM6 y/o la fertilidad en un ratón macho que carece de un gen Adam6 de ratón endógeno.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón, el ratón, la célula de ratón o el tejido de ratón es homocigoto o heterocigoto para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón, el ratón, la célula de ratón o el tejido de ratón es homocigoto o heterocigoto para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno se elimina en su totalidad o en parte. En algunas realizaciones de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno está funcionalmente silenciado o no es funcional (por ejemplo, mediante direccionamiento génico). En algunas realizaciones determinadas de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados, el ratón, la célula de ratón o el tejido de ratón es homocigoto o heterocigoto para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno funcionalmente silenciado o no funcional como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón, como se describe en el presente documento, no expresa de manera detectable cadenas ligeras A de inmunoglobulina endógenas, cadenas ligeras k de inmunoglobulina endógenas o cadenas ligeras k de inmunoglobulina endógenas y cadenas ligeras k de inmunoglobulina endógenas.
En algunas realizaciones, un animal ratón, célula de ratón o tejido de ratón, como se describe en el presente documento, tiene un genoma que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional.
En algunas realizaciones, un elemento de control transcripcional incluye un elemento de control transcripcional RAG1, un elemento de control transcripcional RAG2, un elemento de control transcripcional de cadena pesada de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera k de inmunoglobulina, un elemento de control transcripcional de cadena ligera A de inmunoglobulina, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una TdT exógena está ubicada en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina, un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, un locus RAG1 o un locus RAG2.
En algunas realizaciones, la TdT es una TdT humana. En algunas realizaciones, la TdT es una isoforma corta de TdT (TdTS).
Una secuencia de cadena ligera IgA humana, en algunas realizaciones, comprende material genético de (por ejemplo, aislado u obtenido de) o idéntico a un locus de cadena ligera de IgA humana, en donde la secuencia de cadena ligera de IgA humana codifica una cadena ligera de Ig que comprende la porción codificada del material genético del locus de cadena ligera de IgA humana. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana, como se describe en el presente documento, comprende al menos un segmento génico VA humano y al menos un segmento génico JA humano, y una o más secuencias necesarias para promover el reordenamiento (por ejemplo, una o más secuencias señal de recombinación) de dicho al menos un segmento génico VA humano con dicho al menos un segmento génico JA humano para formar una secuencia VA-JA humana reordenada funcional que codifica un dominio VA humano. En muchas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos y una o más secuencias necesarias para promover el reordenamiento de dichos segmentos génicos VA humanos con dichos segmentos génicos JA humanos. En muchas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende al menos las secuencias codificantes (por ejemplo, exones) de uno o más segmentos génicos VA humanos y al menos las secuencias codificantes (por ejemplo, exones) de uno o más segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera IgA humana como se describe en el presente documento es una secuencia genómica de un locus de cadena ligera IgA humana (por ejemplo, aislada y/o clonada de un cromosoma artificial bacteriano) y contiene una pluralidad de segmentos génicos VA humanos en configuración de línea germinal. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende secuencias VA y JA humanas (es decir, segmentos génicos) en la configuración de línea germinal (es decir, una pluralidad de segmentos génicos VA humanos separados por ADN intermedio que incluye las secuencias necesarias para y que promueven la recombinación, y una pluralidad de segmentos génicos JA separados por ADN intermedio que incluye las secuencias necesarias para y que promueven la recombinación).
En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana, como se describe en el presente documento, es una secuencia genomanipulada y contiene una pluralidad de segmentos génicos JA humanos en una configuración que es diferente de la que aparece en un locus de cadena ligera de IgA humana en una célula humana. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana, como se describe en el presente documento, es una secuencia genomanipulada y contiene una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos en una configuración que se asemeja o es similar a la que aparece en un locus de cadena ligera de IgK de una célula humana o murina de tipo natural. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende secuencias JA humanas genomanipuladas (es decir, secuencias codificantes de segmentos génicos JA humanos preparadas por síntesis de ADN de novo que incluye las secuencias necesarias para y que promueven la recombinación con uno o más segmentos génicos VA humanos). En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende las secuencias IgK e IgA que aparecen de forma natural por separado en las secuencias genómicas IgK e IgA, respectivamente. En algunas realizaciones determinadas, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende una o más secuencias IgK, en particular, una región Jk (es decir, una secuencia que contiene secuencias codificantes y no codificantes que aparecen en una región que contiene una pluralidad de segmentos génicos Jk), que aparece de forma natural en un locus de cadena ligera de IgK excepto que dicha secuencia IgK contiene secuencias codificantes de segmentos génicos JA y 12RSS de JA en el lugar de secuencias codificantes correspondientes los segmentos génicos Jk y 23RSS de Jk, respectivamente. En algunas realizaciones determinadas, una secuencia de cadena ligera de IgA humana comprende una pluralidad de segmentos génicos JA y 12RSS de JA en el lugar de los segmentos génicos Jk y 23RSS de Jk de una secuencia de región Jk. En diversas realizaciones, el ADN intermedio (o intergénico) que incluye las secuencias necesarias para y que promueven la recombinación incluye una o más secuencias genómicas IgK humanas y/o IgA humanas. Como alternativa, y en algunas realizaciones, el ADN intermedio (o intergénico) que incluye las secuencias necesarias para y que promueven la recombinación incluye una o más secuencias genómicas IgK murinas y/o IgA murinas.
En algunas realizaciones determinadas, una secuencia de cadena ligera de IgA humana es o comprende una secuencia que aparece en el Dibujo. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana codifica, o es capaz de codificar (por ejemplo, después del reordenamiento de segmentos génicos humanos), un polipéptido de dominio VA, cuyo polipéptido de dominio VA aparece en una inmunoglobulina, en particular, una inmunoglobulina que se expresa por un linfocito B humano. También se proporcionan ratones, embriones, células y construcciones de direccionamiento para preparar ratones, embriones de ratón y células que contienen dicha secuencia de cadena ligera de IgA humana en el lugar de una secuencia de cadena ligera de IgK de ratón correspondiente (por ejemplo, un locus de cadena ligera de IgK de ratón endógeno).
En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana se inserta en el lugar de una secuencia de cadena ligera de IgK de ratón correspondiente dentro del genoma de línea germinal de un ratón. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana se inserta cadena arriba de una secuencia de cadena ligera de IgA de ratón, cuya secuencia de cadena ligera de IgA de ratón se posiciona en el lugar de una secuencia de cadena ligera de IgK de ratón. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgK humana se inserta en el centro de dicha secuencia de cadena ligera de IgA humana (es decir, entre los segmentos génicos VA y JA humanos) de manera que dicha secuencia de cadena ligera de IgK humana se yuxtaponga con las secuencias de cadena ligera de IgA humana.
En algunas realizaciones, toda o sustancialmente toda la región variable de un locus de cadena ligera de IgK de ratón se reemplaza o se sustituye por una o más secuencias de cadena ligera de IgA humana (como se describe en el presente documento), y dicha una o más secuencias de cadena ligera de IgA humana están unidas operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón. En algunas realizaciones, un gen de la región constante de cadena ligera IgK de ratón se elimina o se reemplaza en un ratón que incluye una secuencia de cadena ligera de IgA humana como se describe en el presente documento. En un ejemplo no limitativo, en el caso de una inserción de una secuencia de cadena ligera de IgA humana que se inserta en un locus de cadena ligera de IgK de ratón, dicha inserción se hace de manera que se mantenga la integridad de las regiones potenciadoras (o secuencias potenciadoras) de cadena ligera de IgK de ratón cerca del punto de inserción (por ejemplo, un potenciador intrónico de IgK de ratón y/o un potenciador 3' de IgK de ratón). Por lo tanto, dichos ratones tienen regiones potenciadoras (o secuencias potenciadoras) de cadena ligera de IgK de tipo natural unidas operativamente a secuencias de cadena ligera de IgA humana y de ratón (por ejemplo, segmentos génicos VA y JA humanos, y un gen de la región CA de ratón) o unidas operativamente a secuencias de cadena ligera de IgA humana (por ejemplo, segmentos génicos VA y JA humanos, y un gen de la región CA humana). En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera de IgK de ratón que se altera, desplaza, interrumpe, elimina, reemplaza o genomanipula con una o más secuencias de cadena ligera de IgA humana, como se describe en el presente documento, es un locus de cadena ligera de IgK murina. En algunas realizaciones, una o más secuencias de cadena ligera de IgA humana, como se describe en el presente documento, se insertan en una copia (es decir, alelo) de un locus de cadena ligera de IgK de ratón de las dos copias de dicho locus de cadena ligera de IgK de ratón, dando lugar a un ratón que es heterocigoto con respecto a la secuencia de cadena ligera de IgK humana. En algunas realizaciones de un ratón que es heterocigoto con respecto a la secuencia de cadena ligera de IgK humana, el ratón incluye una o más secuencias de cadena ligera de IgK humana insertadas en la otra copia (es decir, alelo) del locus de cadena ligera de IgK de ratón. En algunas realizaciones, se proporciona un ratón que es homocigoto para un locus de cadena ligera de IgK que incluye una o más secuencias de cadena ligera de IgA humana como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera de IgK de ratón genomanipulado, como se describe en el presente documento, comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón, en donde dicho gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón se encuentra en el lugar de un gen de la región constante de cadena ligera IgK de ratón que aparece en un locus de cadena ligera de IgK de tipo natural de un ratón de la misma especie.
En algunas realizaciones, no se eliminan una o más secuencias de cadena ligera de IgA de ratón endógenas (o porciones de las mismas) de un locus de cadena ligera de IgA de ratón endógeno. En algunas realizaciones, se eliminan una o más secuencias de cadena ligera de IgA de ratón endógenas (o porciones de las mismas) de un locus de cadena ligera de IgA de ratón endógeno. En algunas realizaciones, una o más secuencias de cadena ligera de IgA de ratón endógenas (por ejemplo, V, J y/o C o cualquier combinación de las mismas) de un locus de cadena ligera de IgA de ratón endógeno se alteran, desplazan, interrumpen, eliminan o reemplazan de manera que dicho locus de cadena ligera de IgA de ratón se silencie funcionalmente. En algunas realizaciones, una o más secuencias de cadena ligera de IgA de ratón endógenas (por ejemplo, V, J y/o C o cualquier combinación de las mismas) de un locus de cadena ligera de IgA de ratón endógeno se alteran, desplazan, interrumpen, eliminan o reemplazan con un vector de direccionamiento de manera que dicho locus de cadena ligera de IgA de ratón se inactive funcionalmente (es decir, sea incapaz de producir una cadena ligera funcional de un anticuerpo que se exprese y/o sea detectable en el repertorio de anticuerpos del ratón). Se proporciona orientación para la inactivación de un locus de cadena ligera de IgA de ratón endógeno en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511 (véase, por ejemplo, figura 2).
También se hace referencia a un ratón que contiene un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento que se integra aleatoriamente en su genoma (por ejemplo, como parte de una secuencia de cadena ligera de IgA humana integrada aleatoriamente). Por lo tanto, dichos ratones se pueden describir con un transgén de cadena ligera de IgA humana que contiene una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón y humana y regiones potenciadoras (o secuencias potenciadoras) de cadena ligera de IgK de ratón, de manera que dichos segmentos génicos VA y JA humanos sean capaces de reorganizarse y codificar una cadena ligera de Ig de un anticuerpo en el repertorio expresado del animal ratón, cuya cadena ligera de Ig incluye un dominio VA humano y un dominio CA de ratón, o cuya cadena ligera de Ig incluye los dominios VA y CA humanos. Un locus o transgén de cadena ligera de IgK genomanipulado, como se describe en el presente documento, se puede detectar usando una diversidad de métodos incluyendo, por ejemplo, PCR, transferencia de Western, transferencia de Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelo. En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento, es heterocigoto con respecto a un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento, es hemicigoto con respecto a un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento, contiene una o más copias de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento contiene un locus de cadena ligera de IgK como se representa en el Dibujo.
La presente divulgación reconoce que un animal ratón, como se describe en el presente documento, utilizará segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana, una cadena ligera A y una cadena ligera K incluidos en su genoma en sus mecanismos de selección y generación de anticuerpos (por ejemplo, recombinación e hipermutación somática). Como tal, en diversas realizaciones, los dominios variables de cadena pesada humana, cadena ligera A y cadena ligera K de inmunoglobulina humana generados por ratones descritos en el presente documento se codifican por los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana, cadena ligera A y cadena ligera incluidos en su genoma o variantes hipermutadas somáticamente de los mismos, respectivamente.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón cuyo genoma comprende un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado, en donde el ratón incluye un linfocito B que incluye una secuencia de región variable pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana que está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, una secuencia de región variable pesada humana, una cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana presentes en un linfocito B de un ratón de la presente divulgación tienen 1, 2, 3, 4, 5 o más hipermutaciones somáticas. Los expertos en la materia conocen los métodos para identificar los segmentos génicos fuente en una secuencia de anticuerpos maduros. Por ejemplo, hay diversas herramientas disponibles para facilitar este análisis, tales como, por ejemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA y Ab-origin.
La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, células y tejidos de ratones descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporcionan esplenocitos (y/u otro tejido linfoide) de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito B de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito pro-B de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito pre-B de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito B inmaduro de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito B virgen maduro de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito B activado de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito B de memoria de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un linfocito de linaje B de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona plasma o una célula plasmática de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona una célula madre de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula madre es una célula madre embrionaria. En algunas realizaciones, se proporciona una célula germinal de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula germinal es un ovocito. En algunas realizaciones, una célula germinal es un espermatozoide. En algunas realizaciones, un espermatozoide de un ratón, como se describe en el presente documento, expresa uno o más polipéptidos ADAM6, ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos. En algunas realizaciones, se puede aislar cualquier célula o tejido de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona una célula aislada y/o un tejido aislado de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un hibridoma, en donde el hibridoma se hace con un linfocito B de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se hace un hibridoma con un linfocito B de un ratón que se ha inmunizado con un antígeno de interés. En algunas realizaciones, se hace un hibridoma con un linfocito B de un ratón que expresa un anticuerpo que se une (por ejemplo, se une específicamente) a un epítopo en un antígeno de interés.
Cualquiera de los ratones, como se describe en el presente documento, puede inmunizarse con uno o más antígenos de interés en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el ratón desarrolle una respuesta inmunitaria a dicho uno o más antígenos de interés. Los expertos en la materia conocen métodos para inmunizar ratones. En el documento US 2007/0280945A1 se puede encontrar un método no limitante ilustrativos para inmunizar ratones.
La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, ratones inmunizados como se describe en el presente documento, y células y tejidos aislados de los mismos. En algunas realizaciones, un ratón descrito en el presente documento produce una población de linfocitos B en respuesta a la inmunización con un antígeno que incluye uno o más epítopos. En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen (por ejemplo, se unen específicamente) a uno o más epítopos del antígeno de interés. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana y/o una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos expresados por una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, un ratón produce una población de linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen a uno o más epítopos del antígeno de interés, en donde los anticuerpos expresados por la población de linfocitos B producidos en respuesta a un antígeno incluyen: (i) una cadena pesada que tiene un dominio variable de cadena pesada humana codificado por una secuencia de región variable de cadena pesada humana, (ii) una cadena ligera lambda que tiene un dominio variable de cadena ligera lambda humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana como se describe en el presente documento, (iii) una cadena ligera kappa que tiene un dominio variable de cadena ligera kappa humana codificado por una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana como se describe en el presente documento, o (iv) cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana como se describe en el presente documento está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % de los linfocitos B en una población de linfocitos B producida en respuesta a un antígeno incluyen una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana que está hipermutada somáticamente.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados en el presente documento, en su genoma de línea germinal, (1) incluyen un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende (a) uno o más segmentos génicos VA humanos, (b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y (c) un gen CA de ratón, en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos están unidos operativamente al gen CA de ratón, (2) carecen de un gen Ck de ratón en el locus k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, e (3) incluyen un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende (a) uno o más segmentos génicos VK humanos, (b) uno o más segmentos génicos Jk humanos, y (c) un gen Ck, en donde el uno o más segmentos génicos Vk humanos y uno o más segmentos génicos Jk humanos están unidos operativamente al gen Ck. En algunas realizaciones, el porcentaje de cadenas ligeras en esplenocitos (por ejemplo, según se detecta u observa, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3)) de dichos ratones que son cadenas ligeras A es de al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 % o al menos un 75 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de cadenas ligeras en esplenocitos (por ejemplo, según se detecta u observa, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3)) de dichos ratones que son cadenas ligeras A se encuentra entre el 35-80 %, entre el 35-75 %, entre el 40-80 %, entre el 40-75 %, entre el 50­ 80 %, entre el 50-75 %, entre el 55-80 %, entre el 55-75 %, entre el 60-80 % o entre el 60-75 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de cadenas ligeras en esplenocitos (por ejemplo, según se detecta u observa, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3)) de dichos ratones que son cadenas ligeras k es como máximo del 65 %, como máximo el 60 %, como máximo el 55 %, como máximo el 50 %, como máximo el 45 %, como máximo el 40 % o como máximo el 35 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de cadenas ligeras en esplenocitos (por ejemplo, según se detecta u observa, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3)) de dichos ratones que son cadenas ligeras k se encuentra entre el 20-65 %, entre el 25­ 65 %, entre el 20-60 %, entre el 25-60 %, entre el 20-55 %, entre el 25-55 %, entre el 20-50 %, entre el 25-50 %, entre el 20-45 %, entre el 25-45 %, entre el 20-40 % o entre el 25-40 %. En algunas realizaciones, la relación de cadenas ligeras k:A en esplenocitos (por ejemplo, detectadas u observadas, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3)) de dichos ratones se encuentra entre 0,5:1 y 3:1, 0,65:1 y 3:1, entre 0,8:1 y 3:1, entre 1:1 y 3:1, entre 1,2:1 y 3:1, entre 1:1 y 2,3:1, entre 1,1:1 y 1,8:1, entre 1,2:1 y 2,3:1, o entre 1,2:1 y 1,8:1.
Métodos para preparar los ratones proporcionados
Se proporcionan composiciones y métodos para preparar ratones cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado que incluye segmentos génicos VA y VA humanos en el lugar de secuencias de cadena ligera de IgK humana no humana, incluyendo secuencias codificantes de cadena ligera de IgA humana que incluyen formas polimórficas específicas de segmentos VA y VA humanos (por ejemplo, alelos o variantes de V y/o J específicos), incluyendo composiciones y métodos para preparar ratones que expresan anticuerpos que comprenden cadenas ligeras de IgA que contienen regiones variables humanas y regiones constantes no humanas o humanas, ensambladas a partir de un locus de cadena ligera de IgK que contiene los segmentos génicos VA y VA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón, cuyo gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón se encuentra en el lugar de un gen de la región constante de cadena ligera IgK de ratón que normalmente aparece en un locus de cadena ligera de IgK de ratón de tipo natural. En algunas realizaciones, también se proporcionan composiciones y métodos para preparar ratones que expresan dichos anticuerpos bajo el control de uno o más potenciadores de IgK endógenos y/o una o más secuencias reguladoras de IgK endógenas. En algunas realizaciones, también se proporcionan composiciones y métodos para preparar ratones que expresan dichos anticuerpos bajo el control de uno o más potenciadores de IgK heterólogos y/o una o más secuencias reguladoras de IgK heterólogas.
Los métodos descritos en el presente documento incluyen la inserción de secuencias VA y JA humanas que codifican dominios VA humanos cadena arriba de un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón, cuyo gen de la región constante de cadena ligera de ratón se encuentra en el lugar de un gen de la región constante de cadena ligera IgK de ratón que normalmente aparece en un locus de cadena ligera de IgK de ratón de tipo natural, de manera que se expresa un anticuerpo, cuyo anticuerpo está caracterizado por la presencia de una cadena ligera que contiene un dominio VA humano y un dominio CA de ratón o por la presencia de una cadena ligera que contiene un dominio VA humano y uno o más dominios CA de ratón, y se expresa tanto sobre la superficie de los linfocitos B como en el suero sanguíneo de un ratón.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen la inserción de material genético que contiene segmentos génicos VA y JA humanos en un locus de cadena ligera de IgK (por ejemplo, un locus de cadena ligera de IgK de tipo natural, modificado o genomanipulado). En algunas realizaciones determinadas, los métodos incluyen la inserción de material genético que contiene segmentos génicos JA humanos en un locus de cadena ligera de IgK de una cepa modificada o genomanipulada. En algunas realizaciones, el material genético que contiene secuencias de cadena ligera de IgA humana puede ser genomanipulado o genómico (por ejemplo, clonado de un cromosoma artificial bacteriano). En algunas realizaciones, el material genético que contiene secuencias de cadena ligera de IgA humana se puede diseñar a partir de fuentes publicadas y/o cromosomas artificiales bacterianos de modo que dicho material genético contenga segmentos VA y JA humanos en una orientación diferente de la que aparece en un locus de cadena ligera de IgA humana pero dicho material genético todavía contiene secuencias para soportar el reordenamiento de dichos segmentos VA y JA humanos para codificar un dominio VA humano funcional de una cadena ligera de Ig. Por proporcionar un solo ejemplo, el material genético correspondiente a una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos puede diseñarse usando las directrices proporcionadas en el presente documento para construir una secuencia de cadena ligera de IgA humana que contiene segmentos VA y JA humanos en un orden y/o disposición que es diferente a la que aparece en un locus de cadena ligera de IgA humana de una célula humana (por ejemplo, una disposición que se parece o es similar a un locus de cadena ligera de IgK humana o de ratón, tal como, una serie de segmentos génicos V, seguida en 3' de ADN intermedio, seguida en 3' de una serie de segmentos génicos J). En tal ejemplo, el contenido genético de los segmentos génicos VA y JA humanos sería equivalente a los segmentos correspondientes en una célula humana, sin embargo, el orden y la disposición serían diferentes. Cuando se construye un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado para la generación de un ratón como se describe en el presente documento, las secuencias señal de recombinación requeridas se pueden configurar para que los segmentos génicos V y J humanos puedan reorganizarse correctamente y formar un dominio VA humano funcional. Se pueden encontrar directrices para la configuración de la línea germinal de las secuencias y segmentos génicos VA y JA humanos necesarios para una recombinación adecuada, por ejemplo, en por ejemplo, Molecular Biology of B Cells, Londres: Elsevier Academic Press, 2004, Ed. Honjo, T., Alt, F.W., Neuberger, M. Capítulos 4 (págs. 37-59) y 5 (61-82).
En algunas realizaciones, los métodos incluyen múltiples inserciones en un solo clon de células ES. En algunas realizaciones, los métodos incluyen inserciones secuenciales realizadas en clones de células ES sucesivos. En algunas realizaciones, los métodos incluyen una única inserción realizada en un clon de células ES genomanipulado.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen una o más inserciones de ADN cadena arriba de un gen CA1 murino (o un gen CA2 humano) para que dicha una o más inserciones de ADN estén unidas operativamente a dicho gen CA1 murino (o gen CA2 humano), cuya una o más inserciones de ADN comprenden los segmentos génicos VA humanos VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos, y los segmentos génicos JA humanos JA1, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, y cuyo gen CA1 murino (o gen CA2 humano) está situado en el lugar de un gen Ck murino de un locus de cadena ligera de IgK endógeno.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen una o más inserciones de ADN cadena abajo de un segmento génico VA3-1 humano y cadena arriba de una región potenciadora intrónica de IgK no humana (o secuencia potenciadora) de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado, de manera que dicha una o más inserciones de ADN están unidas operativamente a un gen CA1 murino (o gen CA2 humano), cuya una o más inserciones de ADN comprenden una secuencia genómica de IgK humana que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano y un segmento génico Jk1 humano de un locus de cadena ligera de IgK humana, y uno o más segmentos génicos Ja humanos (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete), cuyo gen CA1 murino (o gen CA2 humano) se sitúa en el lugar de un gen Ck murino de un locus de cadena ligera de IgK no humana endógeno. En algunas realizaciones determinadas, los métodos incluyen una o más inserciones de ADN entre un segmento génico VA3-1 humano y un potenciador intrónico de IgK no humana, cuya una o más inserciones de ADN incluyen una secuencia Vk-Jk humana que aparece de forma natural entre los segmentos génicos Vk4-1 y Jk1 humanos de un locus de cadena ligera de IgK humana y cinco segmentos génicos JA humanos (por ejemplo, JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7). En diversas realizaciones, una o más inserciones de ADN que incluyen segmentos génicos JA humanos comprenden ADN genómico de Jk humano con secuencias codificantes de los segmentos génicos JA humanos y 12RSS de JA humano.
La inserción de segmentos VA y JA humanos adicionales puede lograrse usando métodos descritos en el presente documento para complementar aún más la diversidad de un locus de cadena ligera de IgA genomanipulado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos pueden incluir la inserción de aproximadamente 270 kb de ADN cadena arriba de un gen CA1 murino (o gen CA2 humano) de un locus de cadena ligera de Igk genomanipulado de modo que dicho ADN esté unido operativamente a dicho gen CA1 murino (o gen CA2 humano), cuyo ADN incluye los segmentos génicos VA humanos VA10-54, VA6-57, VA4-60, VA8-61 y VA4-69. En dichas realizaciones, dicho a Dn se inserta cadena arriba de un segmento génico VA5-52 humano que está unido operativamente a un gen CA1 murino (o gen CA2 humano) de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado, cuyo ADN incluye los segmentos génicos Va humanos VA10-54 VA6-57, VA4-60, VA8-61 y VA4-69. En algunas realizaciones determinadas, dicho ADN incluye un gen VpreB humano. Los segmentos génicos VA humanos adicionales descritos anteriormente pueden clonarse directamente a partir de clones BAC disponibles en el mercado y disponerse en fragmentos de ADN más pequeños usando técnicas recombinantes descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica. Como alternativa, los segmentos génicos VA humanos adicionales descritos anteriormente pueden sintetizarse como un fragmento de ADN genomanipulado y añadirse a un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se ha descrito anteriormente usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Del mismo modo, pueden obtenerse segmentos génicos JA humanos adicionales a partir de clones BAC disponibles en el mercado o sintetizarse directamente a partir de secuencias publicadas. En la figura 2B o 4B se muestra una ilustración de ejemplo que muestra un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado de ratones como se describe en el presente documento.
Cuando se apropiado, una secuencia de cadena ligera de IgA humana (es decir, una secuencia que contiene segmentos génicos VA y JA humanos) que codifica un dominio VA humano puede modificarse por separado para incluir codones que estén optimizados para su expresión en un ratón (por ejemplo, véanse las Patentes de EE.UU. N.° 5.670.356 y 5.874.304). Las secuencias con codones optimizados son secuencias genomanipuladas y preferentemente codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido precursor sin codones optimizados. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de IgA humana que codifica un dominio VA humano puede incluir por separado una secuencia alterada para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de ratón). Por ejemplo, los codones de cada secuencia de nucleótidos a insertar en el genoma de un ratón pueden optimizarse para la expresión en una célula del ratón. Tal secuencia puede describirse como una secuencia con codones optimizados.
La inserción de secuencias de nucleótidos que codifican dominios VA humanos emplea una modificación mínima del genoma de línea germinal de un ratón, como se describe en el presente documento, y da como resultado la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras que tienen dominios VA humanos, cuyos dominios VA humanos se expresan a partir de locus de cadena ligera de IgK genomanipulados endógenos. Se conocen en la técnica métodos para generar ratones genomanipulados, incluidos inactivados y con inserciones génicas (véase, por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000). Por ejemplo, la generación de ratones manipulados genéticamente puede implicar opcionalmente la interrupción de los locus genéticos de uno o más genes endógenos de ratón (o segmentos génicos) y la introducción de uno o más genes heterólogos (o segmentos génicos o secuencias de nucleótidos) en el genoma de ratón, en algunas realizaciones, en la misma ubicación que un gen de ratón endógeno (o segmentos génicos). En algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios VA humanos se introducen cadena arriba de un gen de la región constante de cadena ligera de IgA murina o humana de un transgén de cadena ligera genomanipulado insertado aleatoriamente en el genoma de línea germinal de un ratón. En algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que codifican dominios VA humanos se introducen cadena arriba de un gen de la región constante de cadena ligera de IgA de ratón de un locus de cadena ligera de IgK endógeno en el genoma de línea germinal de un ratón; en algunas realizaciones determinadas, un locus de cadena ligera de IgK endógeno se altera, modifica o genomanipula para que contenga segmentos génicos de IgA humana (por ejemplo, V y J humanos) unidos operativamente a un gen CA1 de ratón o unidos operativamente a un gen CA2 humano.
Se proporcionan ilustraciones esquemáticas (no a escala) de métodos ilustrativos para construir un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en las figuras 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A y 4B. En particular, las figuras 1A y 1B exponen una estrategia ilustrativa para la construcción de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado caracterizado por la inserción de secuencias de nucleótidos que contienen una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos. Como se ilustra en las figuras 1A y 1B, un fragmento de ADN que contiene una región intergénica Vk-Jk humana (véanse las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092) y un fragmento genomanipulado que contiene un conjunto de segmentos génicos JA humanos (por ejemplo, JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7 humanos) se une operativamente a una región potenciadora intrónica de IgK de ratón (o secuencia potenciadora) a través de una serie de etapas usando diversas técnicas de biología molecular descritas en el Ejemplo 1. Este fragmento genomanipulado también está genomanipulado para contener una región constante de cadena ligera de IgA de ratón que está unida operativamente a los segmentos génicos JA humanos. Los casetes de selección (por ejemplo, neomicina e higromicina) se incluyen en el vector de direccionamiento para permitir la selección de clones positivos en bacterias y células de mamífero (por ejemplo, células madre embrionarias). Como se ilustra, un gen de resistencia a la neomicina está flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio lox2372 (lox) y se posiciona entre la región Vk-Jk humana y el conjunto de segmentos génicos JA humanos, mientras que el casete de selección de higromicina está flanqueado por sitios de recombinación específicos del sitio loxP y posicionado 3' del gen de la región constante de la cadena ligera de IgA de ratón (mCA1). A continuación, el fragmento de ADN se combina con un fragmento de ADN que contiene un potenciador 3' de cadena ligera de IgK de ratón para crear el vector de direccionamiento final (figura 1B). El vector de direccionamiento resultante (construcción G) se linealiza y se somete a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón para crear un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende el locus de cadena ligera de IgK genomanipulado. Como se describe en la sección de ejemplos a continuación, las células ES de ratón empleadas en la electroporación del vector de direccionamiento contenían un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se ha descrito previamente en las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092. La recombinación homóloga con el vector de direccionamiento como se representa en la figura 3 da como resultado un locus de cadena ligera de Igk genomanipulado caracterizado por una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA1 murino, cuyo gen CA1 murino se sitúa en el lugar de un gen Ck murino que aparece de forma natural en un locus de cadena ligera de IgK de tipo natural. Los segmentos génicos JA humanos están genomanipulados de forma única en una secuencia que aparece de forma natural en una región Jk humana genómica pero tiene secuencias codificantes JA humanas y 12RSS asociadas en el lugar de secuencias codificantes Jk humanas y 23RSS asociadas. Los clones de células ES de ratón positivos se confirman usando métodos de cribado descritos en el presente documento y/o conocidos en la técnica. Cualquier casete de selección restante puede eliminarse según se desee mediante eliminación mediada por recombinasa (véase el Ejemplo 2).
También se hace referencia a un vector de direccionamiento en donde se emplea un gen CA humano en el vector de direccionamiento en lugar de un gen CA de ratón. Por proporcionar un solo ejemplo, la figura 3 ilustra un vector de direccionamiento que se construyó de manera similar a la descrita anteriormente, excepto que una secuencia que codifica un gen CA2 humano se genomanipuló en el vector de direccionamiento y en unión operativa con cinco segmentos génicos JA humanos. El uso de tal enfoque proporciona un beneficio adicional en el desarrollo de terapias con anticuerpos humanos, ya que los ADN que codifican las regiones variable y constante de las cadenas ligeras pueden aislarse juntos, eliminando así cualquier etapa de clonación posterior que se vincule a una región constante de cadena ligera humana para la preparación anticuerpos totalmente humanos.
Los vectores de direccionamiento para construir un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento pueden incorporarse en el genoma de línea germinal de una célula no humana (por ejemplo, una célula madre embrionaria de ratón). En algunas realizaciones, los vectores de direccionamiento, como se describen en el presente documento, se incorporan en un locus de cadena ligera de IgK de tipo natural en el genoma de línea germinal de una célula no humana que además contiene ADN genómico de Vh, Dh y Jh humano (por ejemplo, que contiene una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos) unido operativamente con uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, véanse las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323). En algunas realizaciones, los vectores de direccionamiento, como se describen en el presente documento, se incorporan en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina modificado o genomanipulado en el genoma de línea germinal de una célula no humana que contiene además ADN genómico de VH, DH y JH humano (por ejemplo, que contiene una pluralidad de segmentos génicos VH, DH y JH humanos) unido operativamente con uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, véanse las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940, 8.791.323, 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092).
Se introduce un vector de direccionamiento en células madre embrionarias de ratón (por ejemplo, ratón) mediante electroporación de modo que la secuencia contenida en el vector de direccionamiento dé como resultado la capacidad de una célula de ratón o ratón que expresa anticuerpos que tienen cadenas ligeras que incluyen dominios VA humanos y dominios CA de ratón, y cuyas cadenas ligeras se expresan a partir de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado endógeno. Como se describe en el presente documento, se genera un ratón manipulado genéticamente en donde un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado se ha creado en el genoma de línea germinal del ratón (por ejemplo, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que contiene una secuencia de cadena ligera de IgA humana (es decir, una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos) unida operativamente a un gen CA de ratón en el lugar de un gen Ck de ratón endógeno). Los anticuerpos se expresan en la superficie de los linfocitos B de ratón y en el suero de dicho ratón, cuyos anticuerpos se caracterizan por cadenas ligeras que tienen dominios VA humanos y dominios CA de ratón. Cuando un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno en el genoma de línea germinal del ratón no es la diana del vector de direccionamiento, se inserta preferentemente un transgén de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado en una ubicación diferente a la de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón endógeno (por ejemplo, un transgén insertado aleatoriamente).
La creación de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado en un ratón como se ha descrito anteriormente proporciona una cepa de ratón genomanipulada que produce anticuerpos que incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina expresadas a partir de tal locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado que tiene un dominio VA humano y un dominio CA de ratón. Aprovechado con la presencia de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado que incluye una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, se crea una cepa de ratón genomanipulada que produce anticuerpos y componentes de anticuerpos para el desarrollo de productos terapéuticos basados en anticuerpos humanos. Por lo tanto, se realiza una única cepa de ratón genomanipulada que tiene la capacidad de proporcionar un sistema alternativo in vivo para aprovechar dominios VA humanos para el desarrollo de nuevos medicamentos basados en anticuerpos para tratar enfermedades humanas.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para preparar un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, comprendiendo el método (a) introducir un fragmento de ADN en una célula madre embrionaria de ratón, comprendiendo dicho fragmento de ADN una secuencia de nucleótidos que incluye (i) uno o más segmentos génicos VA humanos, (ii) uno o más segmentos génicos JA humanos y (iii) un gen CA de ratón, en donde (i)-(iii) están unidos operativamente, y en donde la secuencia de nucleótidos comprende además una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina entre (i) y (ii), (b) obtener la célula madre embrionaria de ratón generada en (a); y (c) crear un ratón usando la célula madre embrionaria de ratón de (b).
En algunas realizaciones, se proporciona un método para preparar un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, comprendiendo el método (a) introducir un fragmento de ADN en una célula madre embrionaria no humana, comprendiendo dicho fragmento de ADN una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más segmentos génicos JA humanos, uno o más potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana, y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos JA humanos están unidos operativamente a dicho uno o más potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón y dicho gen CA de ratón, (b) obtener la célula madre embrionaria de ratón generada en (a); y (c) crear un ratón usando la célula madre embrionaria de ratón de (b).
En algunas realizaciones, se proporciona un método para preparar un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, cuyo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado comprende la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos, uno o más segmentos génicos JA humanos y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a dicho gen CA de ratón, y cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón en el locus k de inmunoglobulina endógeno, comprendiendo el método modificar el genoma de línea germinal de una ratón para que comprenda un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que incluya la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos, uno o más segmentos génicos JA humanos y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a dicho gen CA de ratón, y cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón en el locus k de inmunoglobulina endógeno.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen al menos 24, al menos 34, al menos 52, al menos 61 o al menos 70 segmentos génicos VA humanos. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen 39 segmentos génicos VA humanos. En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos VA humanos relevantes en un locus de cadena ligera A humana endógeno.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen 5 segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, uno o más segmentos génicos JA humanos comprenden JA1 humano, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen ADN no codificante humano, en su totalidad o en parte, que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos JA humanos relevantes en un locus de cadena ligera A humana endógeno. En algunas realizaciones, uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a un Jk1-Jk5 humano en un locus de cadena ligera k humana endógeno.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN incluye ADN intergénico que contiene ADN de inmunoglobulina no codificante (por ejemplo, ADN que aparece de forma natural entre la secuencia codificante de dos segmentos génicos V, un segmento génico V y J o entre dos segmentos génicos J). En muchas realizaciones, dicho ADN de inmunoglobulina no codificante es ADN de cadena ligera de inmunoglobulina no codificante (por ejemplo, humano o murino). En algunas realizaciones, el ADN de cadena ligera de inmunoglobulina no codificante es a Dn de cadena ligera de k inmunoglobulina, ADN de cadena ligera A de inmunoglobulina o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende además uno o más marcadores de selección. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende además uno o más sitios de recombinación específicos de sitio. En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, un fragmento de a Dn comprende además uno o más conjuntos de sitios de recombinación específicos de sitio que se recombinan con la misma recombinasa. En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende además uno o más conjuntos de sitios de recombinación específicos de sitio que se recombinan con diferentes recombinasas.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende una secuencia genomanipulada que incluye una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina y una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina juntas en una secuencia continua. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende una secuencia genomanipulada que incluye una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina y una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina juntas en una sola secuencia pero interrumpida por una secuencia que no es de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia señal de recombinación, un gen de resistencia y combinaciones de los mismos). En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, una secuencia genomanipulada incluye porciones de una región Jk y porciones de una región JA. En algunas realizaciones, una secuencia genomanipulada incluye porciones de una región Jk humana y porciones de una región JA humana. En algunas realizaciones determinadas, porciones de una región Jk humana incluyen secuencias no codificantes de una región Jk humana que aparecen de forma natural en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana de una célula humana. En algunas realizaciones determinadas, porciones de una región JA humana incluyen secuencias codificantes y secuencias señal de recombinación (RSS) de uno o más segmentos génicos JA humanos. En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN comprende una secuencia genomanipulada que está caracterizada, en algunas realizaciones, por la presencia de secuencias codificantes y secuencias señal de recombinación (RSS) de uno o más segmentos génicos JA humanos que posicionalmente reemplazar o sustituyen (es decir, se posicionan en el lugar de) las correspondientes secuencias codificantes y secuencias señal de recombinación (RSS) de segmentos génicos Jk humanos de modo que dichas secuencias codificantes y secuencias señal de recombinación (RSS) de dicho uno o más segmentos génicos JA humanos estén dentro, adyacentes a, contiguas o yuxtapuestos a dichas secuencias no codificantes de dichos uno o más segmentos génicos Jk humanos.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, se introduce un fragmento de ADN en una célula madre embrionaria no humana cuyo genoma de línea germinal comprende uno o más locus de inmunoglobulina genomanipulados (por ejemplo, cadena pesada de inmunoglobulina, cadena ligera k de inmunoglobulina, cadena ligera A de inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos). En algunas realizaciones determinadas, los locus de inmunoglobulina genomanipulados son locus de inmunoglobulina genomanipulados endógenos.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, se introduce un fragmento de ADN en una célula madre embrionaria de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos, cuyos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN se introduce en una célula madre embrionaria de ratón cuya genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos human VA y uno o más segmentos génicos JA humanos, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En algunas realizaciones determinadas de un método para preparar un ratón, un fragmento de ADN se introduce en una célula madre embrionaria de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos human VA y uno o más segmentos génicos JA humanos, y una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana posicionada, colocada o situada entre dicho uno o más segmentos génicos VA humanos y dicho uno o más segmentos génicos JA humanos, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, la modificación del genoma de línea germinal de un ratón de manera que comprensa un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado se realiza en una célula madre embrionaria de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos, cuyos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, la modificación del genoma de línea germinal de un ratón de manera que comprenda un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado se realiza en una célula madre embrionaria de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos human VA y uno o más segmentos génicos JA humanos, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, la modificación del genoma de línea germinal de un ratón de manera que comprenda un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado se realiza en una célula madre embrionaria de ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos human VA y uno o más segmentos génicos JA humanos, y una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana posicionada, colocada o situada entre dicho uno o más segmentos génicos VA humanos y dicho uno o más segmentos génicos JA humanos, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones de un método para preparar un ratón, la inserción de uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos incluye ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos Vh humanos, ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos Dh humanos y ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos Jh humanos en un locus de inmunoglobulina humana endógeno.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón preparado generado, producido, obtenido u obtenible a partir de un método como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el genoma de un ratón como se describe en el presente documento comprende además una o más regiones variables pesadas de inmunoglobulina humana como se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323. Como alternativa, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento se puede genomanipular en una célula madre embrionaria de una cepa modificada diferente, tal como, por ejemplo, una cepa v ElOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018 y/u 8.642.835). La homocigosidad del locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento se puede lograr posteriormente mediante reproducción. Como alternativa, en el caso de un transgén de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado insertado aleatoriamente (descrito anteriormente), las cepas de ratón pueden seleccionarse basándose, entre otras cosas, en la expresión de dominios VA humanos del transgén. En algunas realizaciones, un ratón VELOCIMMUNE® puede ser un ratón VELOCIMMUNE® 1 (VI-1), que incluye dieciocho segmentos génicos Vh humanos, cada uno de los segmentos génicos Dh humanos, y cada uno de los segmentos génicos Jh. Un ratón VI-1 también puede incluir dieciséis segmentos génicos Vk humanos y cada uno de los segmentos génicos Jk humanos. En algunas realizaciones, un ratón VELOCIMMUNE® puede ser un ratón VELOCIMMUNE® 2 (VI-2), que incluye treinta y nueve segmentos génicos Vh humanos, cada uno de los segmentos génicos Dh humanos, y cada uno de los segmentos génicos Jh. Un ratón VI-2 también puede incluir treinta segmentos génicos Vk humanos y cada uno de los segmentos génicos Jk humanos. En algunas realizaciones, un ratón VELOCIMMUNE® puede ser un ratón VELOCIMMUNE® 3 (VI-3), que incluye ochenta segmentos génicos Vh humanos, cada uno de los segmentos génicos Dh humanos, y cada uno de los segmentos génicos Jh. Un ratón VI-3 también puede incluir cuarenta segmentos génicos Vk humanos y cada uno de los segmentos génicos Jk humanos.
Como alternativa, y/o adicionalmente, en algunas realizaciones, el genoma de línea germinal de un ratón como se describe en el presente documento comprende además un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno eliminado, inactivado, silenciado funcionalmente o no funcional. Pueden lograrse modificaciones genéticas para eliminar o producir un gen o locus genético no funcional usando métodos descritos en el presente documento y/o métodos conocidos en la técnica.
Un ratón fundador manipulado genéticamente basándose en la presencia de un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado en su genoma de línea germinal y/o la expresión de anticuerpos que tienen un dominio VA humano y un dominio CA de ratón en tejidos o células del ratón. A continuación, se puede usar un ratón fundador manipulado genéticamente para criar ratones adicionales que lleven el locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado creando así una cohorte de ratones, cada uno de los cuales porta una o más copias de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado. Además, los ratones manipulados genéticamente que portan un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento pueden cruzarse con otros ratones manipulados genéticamente que portan otros transgenes (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) o locus de inmunoglobulina genomanipulados según se desee.
Los ratones genomanipulados también se pueden producir para que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada, dirigida, inducible y/o específica del tipo de célula del transgén o una o más secuencias integradas. Por ejemplo, los ratones, como se describe en el presente documento, pueden genomanipularse para que contengan una o más secuencias que codifican un dominio VA humano de un anticuerpo que se expresa de forma condicional (por ejemplo, revisado en Rajewski, K. et al., 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3). Los sistemas ilustrativos incluyen el sistema de recombinasa Cre/loxP del bacteriófago PI (véase, por ejemplo, Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6) y el sistema de recombinasa FLp/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al., 1991, Science 251:1351-5). Dichos animales se pueden proporcionar a través de la construcción de animales manipulados genéticamente "dobles", por ejemplo, mediante el apareamiento de dos animales manipulados genéticamente, conteniendo uno un transgén que comprende una modificación seleccionada (por ejemplo, un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento) y conteniendo el otro un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa Cre).
Los ratones, como se describe en el presente documento, se pueden preparar como se ha descrito anteriormente, o usando métodos conocidos en la técnica, para comprender genes humanos, humanizados o genomanipulados de otro modo adicionales, a menudo dependiendo del uso previsto del ratón. El material genético de dichos genes humanos, humanizados o genomanipulados de otro modo puede introducirse mediante la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones o alteraciones genéticas descritas anteriormente o mediante técnicas de reproducción conocidas en la técnica con cepas modificadas o genomanipuladas, según se desee. En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se preparan para comprender además genes o segmentos génicos de cadena ligera de IgH y/o IgK humana (véanse, por ejemplo, Murphy, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158; las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323; la Patentes de EE.UU. N.°: 8.791.323; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU: N.° 2013/0096287 A1).
En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, pueden prepararse introduciendo un vector dirigido descrito en el presente documento en una célula de una cepa modificada o genomanipulada. Por ejemplo, un vector de direccionamiento, como se describe en el presente documento, puede introducirse en un ratón VELOCIMMUNE®. Los ratones VELOCIMMUNE® expresan anticuerpos que tienen regiones variables completamente humanas y regiones constantes de ratón. En otro ejemplo, un vector de direccionamiento, como se describe en el presente documento, puede introducirse en un ratón genomanipulado como se describe en una cualquiera de las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092. En algunas realizaciones, los ratones descritos en el presente documento se preparan para comprender además genes de inmunoglobulina humana (genes de región variable y/o constante). En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, comprenden un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado, como se describe en el presente documento, y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una o más regiones variables de cadena pesada humana y/o ligera de IgK.
Por ejemplo, como se describe en el presente documento, los ratones que comprenden un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento pueden comprender además (por ejemplo, a través de cruzamientos o estrategias de direccionamiento de múltiples genes) una o más modificaciones como se describe en Murphy, A.J. et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323. En algunas realizaciones, un ratón que comprende un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento se cruza con un ratón que comprende un locus de región variable de cadena pesada y/o de cadena ligera K de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y/u 8.791.323). En algunas realizaciones, un ratón que comprende un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento se cruza con un ratón que comprende un locus de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y/u 8.791.323) y un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092).
Otros métodos para preparar un ratón que comprende la modificación genética incluyen, por ejemplo, modificar un genoma de células no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, por sus siglas en inglés) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un ratón en condiciones adecuadas para formar un embrión.
Los métodos para modificar el genoma de línea germinal de un ratón incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de cinc (ZFN, por sus siglas en inglés), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una proteína Cas (es decir, un sistema CRISPR/Cas) para incluir un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento. Se puede encontrar orientación sobre métodos para modificar el genoma de línea germinal de un ratón en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. N.° 14/747.461 (presentada el 23 de junio de 2015), 14/948.221 (presentada el 20 de noviembre de 2015) y 14/974.623 (presentada el 18 de diciembre de 2015).
El animal no humano proporcionado es un ratón.
En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento, es un ratón que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas realizaciones determinadas, un ratón, como se describe en el presente documento, es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). En algunas realizaciones determinadas, un ratón modificado genéticamente como se describe en el presente documento es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas realizaciones determinadas, un ratón como se describe en el presente documento es una mezcla de cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones determinadas, una cepa 129 de la mezcla como se describe en el presente documento es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas realizaciones, un ratón como se describe en el presente documento es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En algunas realizaciones, un ratón como se describe en el presente documento es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
Realizaciones ilustrativas específicas - Locus de cadena pesada de inmunoglobulina
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y comprenden además locus (o alelos) de IgH genomanipulados caracterizados por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos dispuestos en una configuración de línea germinal y unidos operativamente a genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, potenciadores y regiones reguladoras. En algunas realizaciones, un locus (o alelo) de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento comprende uno o más segmentos génicos Vh humanos, uno o más segmentos génicos Dh humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado comprende al menos los segmentos génicos Vh humanos Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de IgH genomanipulado comprende al menos los segmentos génicos Dh humanos Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26, Dh7-27, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado comprende al menos los segmentos génicos Jh humanos Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o cualquier combinación de los mismos.
La presente divulgación reconoce que un ratón, como se describe en el presente documento, utilizará segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana comprendidos en su genoma en sus mecanismos de selección y generación de anticuerpos (por ejemplo, recombinación e hipermutación somática). Como tal, en diversas realizaciones, los dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana generados por los ratones descritos en el presente documento están codificados por los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humana incluidos en su genoma o variantes somáticamente hipermutadas del mismo.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón cuyo genoma comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado, en donde el ratón incluye un linfocito B que incluye una secuencia de región variable pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana que está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, una secuencia de región variable pesada humana, una secuencia de la región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana presentes en un linfocito B de un ratón de la presente divulgación tienen 1, 2, 3, 4, 5 o más hipermutaciones somáticas. Los expertos en la materia conocen los métodos para identificar los segmentos génicos fuente en una secuencia de anticuerpos maduros. Por ejemplo, hay diversas herramientas disponibles para facilitar este análisis, tales como, por ejemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA y Ab-origin.
En algunas realizaciones, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón incluye uno o más genes de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón tales como, por ejemplo, inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina E (IgE) e inmunoglobulina A (IgA). En algunas realizaciones determinadas, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón incluye genes de región constante de IgM de ratón, IgD de ratón, IgG3 de ratón, IgG1 de ratón, IgG2b de ratón, IgG2a de ratón, IgE de ratón e IgA de ratón. En algunas realizaciones, dichos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a uno o más potenciadores de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (es decir, secuencias potenciadoras o regiones potenciadoras). En algunas realizaciones, dichos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a una o más regiones reguladoras de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (o secuencias reguladoras). En algunas realizaciones, dichos segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos están unidos operativamente a uno o más potenciadores de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (o secuencia potenciadora) y una o más regiones reguladoras de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón (o secuencia reguladora).
En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento no contiene un gen Adam6 endógeno. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento no contiene un gen Adam6 endógeno (o secuencia codificante de Adam6) en la misma posición genómica de línea germinal que se encuentra en un genoma de línea germinal de un ratón de tipo natural de la misma especie. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento no contiene un pseudogén Adam6 humano. En algunas realizaciones, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento comprende la inserción de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos Adam6 no humanos (por ejemplo, de ratón), ortólogos funcionales, homólogos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos. En algunas realizaciones, dicha inserción puede estar fuera de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento (por ejemplo, pero sin limitación, cadena arriba de un segmento génico Vh más 5'), dentro de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulado o en cualquier otro lugar del genoma de línea germinal de un ratón (por ejemplo, pero sin limitación, una secuencia codificante de Adam6 no humana introducida al azar), célula o tejido.
En diversas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento no expresa de forma detectable, en su totalidad o en parte, una región Vh endógena de ratón en una molécula de anticuerpo. En diversas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento no contiene (o carece de, o contiene una eliminación de) una o más secuencias de nucleótidos que codifican, en su totalidad o en parte, una región Vh de ratón endógena (por ejemplo, Vh, Dh y/o Jh) en una molécula de anticuerpo. En diversas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento tiene un genoma de línea germinal que incluye una eliminación de segmentos de genes Vh, Dh y Jh de ratón endógenos, en su totalidad o en parte. En diversas realizaciones, un ratón proporcionado es fértil.
Se puede encontrar orientación para la creación de vectores de direccionamiento, células no humanas y animales que albergan tales locus (o alelos) de cadena pesada de inmunoglobulina genomanipulados en las Patentes de Ee .UU. N.° 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 y 8.791.323. Los expertos en la materia conocen una diversidad de tecnologías, conocidas en la técnica, para lograr dicha genomanipulación y/o manipulación de genomas no humanos (por ejemplo, de mamíferos) o de otro modo para preparar, proporcionar o fabricar dichas secuencias para introducir en el genoma de línea germinal de los ratones.
Realizaciones ilustrativas específicas - Locus de cadena ligera k de inmunoglobulina
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado caracterizado por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos dispuestos en una configuración de línea germinal (es decir, no reordenados y asociados con secuencias señal de recombinación) e insertados cadena arriba de, y unidos operativamente a, un gen CA de ratón, cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón. Como se describe en el presente documento, dichos locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado incluye además regiones potenciadoras de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón (o secuencias potenciadoras). En algunas realizaciones, un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado comprende uno o más segmentos génicos VA humanos y uno o más segmentos génicos JA humanos unidos operativamente a un gen CA de ratón. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado comprende segmentos génicos VA humanos que aparecen en al menos un grupo A de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; en algunas realizaciones, el grupo A y el grupo B de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; en algunas realizaciones determinadas, el grupo A, el grupo B y el grupo C de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado comprende al menos los segmentos génicos VA humanos VA4-69, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones determinadas, un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado comprende al menos los segmentos génicos JA humanos JA1, JA2, JA3, JA6 JA7, o cualquier combinación de los mismos.
La presente divulgación reconoce que un ratón, como se describe en el presente documento, utilizará segmentos génicos de la región variable de cadena ligera A humana incluidos en su genoma en sus mecanismos de selección y generación de anticuerpos (por ejemplo, recombinación e hipermutación somática). Como tal, en diversas realizaciones, los dominios variables de cadena ligera A de inmunoglobulina humana generados por los ratones descritos en el presente documento están codificados por los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera A humana incluidos en su genoma o variantes somáticamente hipermutadas del mismo.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón cuyo genoma comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado, en donde el ratón incluye un linfocito B que incluye una secuencia de región variable pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana que está hipermutada somáticamente. En algunas realizaciones, una secuencia de región variable pesada humana, una secuencia de la región variable de cadena ligera A humana, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera k humana presentes en un linfocito B de un ratón de la presente divulgación tienen 1, 2, 3, 4, 5 o más hipermutaciones somáticas. Los expertos en la materia conocen los métodos para identificar los segmentos génicos fuente en una secuencia de anticuerpos maduros. Por ejemplo, hay diversas herramientas disponibles para facilitar este análisis, tales como, por ejemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA y Ab-origin.
En muchas realizaciones, un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado contiene las mismas regiones potenciadoras de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana (o secuencias potenciadoras) que aparecen en un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina de tipo natural. En algunas realizaciones, un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado contiene regiones potenciadoras de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana (o secuencias potenciadoras) que aparecen en un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina de tipo natural de una especie diferente (por ejemplo, una especie de ratón diferente).
En algunas realizaciones, dichos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a uno o más potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana (es decir, secuencias potenciadoras o regiones potenciadoras). En algunas realizaciones determinadas, dichos segmentos génicos VA y Ja humanos están unidos operativamente a una región potenciadora intrónica de cadena ligera k de inmunoglobulina murina (IgK Ei o Eík). En algunas realizaciones determinadas, dichos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a una región potenciadora 3' de cadena ligera k de inmunoglobulina murina (IgK 3'E o 3'Ek). En algunas realizaciones determinadas, dichos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un Eík murino y unidos operativamente a un 3'Ek murino.
En algunas realizaciones, un locus (o alelo) de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento no contiene (es decir, carece de) un gen VpreB humano (o una secuencia que codifica un gen VpreB humano).
En algunas realizaciones determinadas, un gen CA de ratón de un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado es o comprende un gen CA de ratón de una base genética que incluye una cepa 129, una cepa BALB/c, una cepa C57BL/6, una cepa mixta 129xC57BL/6 o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, un gen CA de ratón de un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento comprende una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (CA1 de ratón), SEQ ID NO:3 (CA2 de ratón) o SEQ ID NO:5 (CA3 de ratón). En algunas realizaciones, un gen CA de ratón de un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO: 1 (CA1 de ratón), SEQ ID NO:3 (Ca2 de ratón) o SEQ ID NO:5 (CA3 de ratón). En algunas realizaciones, un gen CA de ratón de un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento es o comprende la secuencia de un gen CA1 de ratón. En algunas realizaciones, un dominio CA de ratón codificado por una secuencia posicionada en un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento comprende una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO:2 (CA1 de ratón), SEQ ID NO:4 (CA2 de ratón) o SEQ ID NO:6 (CA3 de ratón). En algunas realizaciones, un dominio CA de ratón codificado por una secuencia posicionada en un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO:2 (CA1 de ratón), SEQ ID NO:4 (CA2 de ratón) o SEQ ID No :6 (CA3 de ratón). En algunas realizaciones, un gen CA de ratón codificado por una secuencia posicionada en un locus (o alelo) de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento es o comprende un polipéptido de dominio CA1 de ratón.
Entre otras cosas, la presente divulgación demuestra que la presencia de segmentos génicos VA y JA humanos en los locus (o alelos) de cadena ligera de IgK aumenta la diversidad del repertorio de cadenas ligeras de un ratón proporcionado en comparación con la diversidad de las cadenas ligeras en el repertorio de anticuerpos expresados de un ratón que no comprende dichos locus de cadena ligera de Igk genomanipulados.
Realizaciones ilustrativas específicas - Locus de cadena ligera A de inmunoglobulina
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y comprenden además locus (o alelos) de cadena ligera A de inmunoglobulina de tipo natural o inactivados.
En algunas realizaciones, los ratones, células de ratón y/o tejidos de ratón proporcionados como se describe en el presente documento comprenden una eliminación, en su totalidad o en parte, de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones, los ratones, células de ratón y/o tejidos de ratón proporcionados como se describe en el presente documento comprenden una inserción en un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno, en donde dicha inserción hace que el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno no sea funcional. En algunas realizaciones, los ratones, células de ratón y/o tejidos de ratón proporcionados como se describe en el presente documento comprenden una eliminación de uno o más segmentos génicos de un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno de tal forma que el locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno no pueda recombinarse y/o expresar una cadena ligera funcional de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento no expresa de forma detectable, en su totalidad o en parte, una región VA no humana endógena en una molécula de anticuerpo. En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento no contiene (o carece de, o contiene una eliminación de) una o más secuencias de nucleótidos que codifican, en su totalidad o en parte, una región VA no humana endógena en una molécula de anticuerpo. En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento tiene un genoma de línea germinal que incluye una eliminación de segmentos génicos VA y JA de ratón endógenos, en su totalidad o en parte. En algunas realizaciones, un ratón, una célula de ratón o un tejido de ratón proporcionados como se describe en el presente documento tiene un genoma de línea germinal que incluye una eliminación de segmentos génicos VA, JA y CA de ratón endógenos, en su totalidad o en parte.
Se pueden encontrar directrices para la creación de vectores de direccionamiento, células no humanas y animales que albergan locus (o alelos) de cadena ligera de IgA inactivados en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092. Los expertos en la materia conocen una diversidad de tecnologías, conocidas en la técnica, para lograr la inactivación genética de locus específicos y/o la manipulación de genomas no humanos (por ejemplo, de mamífero) o de otro modo para preparar, proporcionar o fabricar dicha inactivación genética (por ejemplo, eliminaciones génicas) para su introducción en el genoma de línea germinal de ratones
Realizaciones ilustrativas específicas - Combinaciones de locus de inmunoglobulina
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y comprenden además uno o más genes humanos o humanizados adicionales (por ejemplo, a través de cruzamientos o estrategias de selección de múltiples genes). Dichos ratones se pueden preparar como se ha descrito anteriormente, o usando métodos conocidos en la técnica, para lograr un genotipo genomanipulado deseado dependiendo del uso previsto del ratón. Se puede introducir material genético de dichos genes humanos o humanizados mediante la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones genéticas como se ha descrito anteriormente o mediante técnicas de reproducción conocidas en la técnica con otras cepas modificadas genéticamente según se desee.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados se preparan para comprender además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitación, una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados son heterocigotos para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y heterocigotos para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados son homocigotos para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y homocigotos para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados se preparan para comprender además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitación, una pluralidad de segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno) y un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitación, una pluralidad de segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados son heterocigotos para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada y comprenden además un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que contiene una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de A de inmunoglobulina de ratón (es decir, un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento), y otro locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que tiene una pluralidad de segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados son homocigotos para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada y comprenden además un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que contiene una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de A de inmunoglobulina de ratón (es decir, un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe en el presente documento), y otro locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que tiene una pluralidad de segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados tienen un genoma que comprende (a) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada homocigoto o heterocigoto que comprende segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a una o más regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógenas de tal forma que el ratón expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio Vh humano fusionada con una secuencia de dominio Ch no humano; (b) un primer locus de cadena ligera K de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de inmunoglobulina de ratón de tal forma que el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio VA humano fusionada con una secuencia de dominio CA de ratón; y (c) un segundo locus de cadena ligera K de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón endógeno de tal forma que el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio Vk humano fusionada con una secuencia de dominio Ck de ratón.
En algunas realizaciones, los ratones proporcionados tienen un genoma que comprende (a) un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana o humanizada homocigoto o heterocigoto que comprende segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a una o más regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógenas de tal forma que el ratón expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio VH humano fusionada con una secuencia de dominio CH de ratón; (b) un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de inmunoglobulina de ratón de tal forma que el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio VA humano fusionada con una secuencia de dominio CA de ratón; (c) un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón endógeno de tal forma que el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio Vk humano fusionada con una secuencia de dominio Ck de ratón; y (d) un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno homocigoto o heterocigoto funcionalmente inactivado o eliminado, en su totalidad o en parte.
Por ejemplo, como se describe en el presente documento, los ratones que comprenden un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento pueden comprender además (por ejemplo, a través de cruzamiento o estrategias de direccionamiento de múltiples genes) una o más modificaciones como se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835, 8.697.940, 9.006.511, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092. En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado (por ejemplo, un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado y un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno no funcional (por ejemplo, eliminados en su totalidad o en parte, o convertidos en no funcional de otro modo). En algunas realizaciones, los ratones proporcionados comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que tiene segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA humano o de ratón posicionado en el lugar de un gen Ck de ratón y un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón endógeno. En dichas realizaciones, los ratones proporcionados se denominan hemicigotos para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado. En alguna realización, dichos ratones hemicigotos proporcionados en el presente documento comprenden además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada. En algunas realizaciones, dichos ratones hemicigotos proporcionados en el presente documento comprenden además un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada y un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno no funcional.
Métodos de uso de ratones, células o tejidos proporcionados
Los ratones, como se describe en el presente documento, pueden usarse como una plataforma para el desarrollo de anticuerpos. En particular, los ratones descritos en el presente documento representan una plataforma particularmente ventajosa para la generación e identificación de dominios variables de cadena ligera lambda humana y anticuerpos que incluyen dichos dominios variables de cadena ligera lambda humana.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona que los ratones descritos en el presente documento se pueden usar en métodos para preparar anticuerpos. Los anticuerpos preparados de acuerdo con la presente divulgación pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos quiméricos inversos, fragmentos de cualquiera de estos anticuerpos o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, pueden emplearse para preparar un anticuerpo humano (por ejemplo, un anticuerpo completamente humano), cuyo anticuerpo humano comprende regiones variables derivadas de secuencias de ácido nucleico codificadas por material genético de una célula de un ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un ratón, como se describe en el presente documento, se inmuniza con un antígeno de interés en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el ratón desarrolle una respuesta inmunitaria a dicho antígeno de interés. Se aíslan y/o identifican anticuerpos y/o secuencias de anticuerpos (es decir, secuencias que codifican parte de un anticuerpo, por ejemplo, una secuencia de región variable) del ratón (o una o más células, por ejemplo, uno o más linfocitos B) así inmunizado y se caracterizan usando diversos ensayos que miden, por ejemplo, la afinidad, especificidad, mapeo de epítopos, capacidad para bloquear la interacción ligando-receptor, activación del receptor de inhibición, etc. En diversas realizaciones, los anticuerpos producidos por ratones, como se describe en el presente documento, comprenden una o más regiones variables humanas que se derivan de una o más secuencias de nucleótidos de región variable humana aisladas del ratón. En algunas realizaciones, los anticuerpos antifármaco (por ejemplo, anticuerpos antiidiotipo) pueden generarse en ratones como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, los anticuerpos producidos por ratones como se describe en el presente documento son anticuerpos quiméricos inversos que incluyen un dominio variable de cadena ligera humana y un dominio constante de cadena ligera de ratón y/o un dominio variable de cadena pesada humana y un dominio constante de cadena pesada de ratón.
En diversas realizaciones, los anticuerpos producidos por ratones incluyen cadenas pesadas y ligeras que tienen un dominio variable humano y un dominio constante de ratón. En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos por ratones como se describe en el presente documento son anticuerpos quiméricos inversos que incluyen un dominio variable de cadena ligera humana y un dominio constante de cadena ligera de ratón. En algunas realizaciones, los anticuerpos producidos por ratones como se describe en el presente documento son anticuerpos quiméricos inversos que incluyen un dominio variable de cadena pesada humana y un dominio constante de cadena pesada de ratón.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen la inmunización de un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados incluyen la identificación de un linfocito (por ejemplo, un linfocito seleccionado clonalmente) de dicho ratón, en donde el linfocito expresa un anticuerpo que se une (por ejemplo, se une específicamente) al antígeno de interés. En algunas realizaciones, un linfocito es un linfocito B. En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana y/o una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana se obtiene del linfocito (por ejemplo, linfocito B) y/o se identifica (por ejemplo, genotipifica, por ejemplo, se secuencia). En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena pesada humana, un dominio variable de cadena ligera lambda humana y/o un dominio variable de cadena ligera kappa humana se obtiene del linfocito (por ejemplo, linfocito B) y/o se identifica (por ejemplo, se secuencia). En algunas realizaciones, una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana y/o una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana de un linfocito B de un ratón se expresa en una célula huésped. En algunas realizaciones, una variante de una secuencia de región variable de cadena pesada humana, una secuencia de región variable de cadena ligera lambda humana y/o una secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana de un linfocito B de un ratón se expresa en una célula huésped. En algunas realizaciones, una variante incluye una o más mutaciones. En algunas realizaciones, una o más mutaciones pueden mejorar una propiedad farmacocinética y/o farmacodinámica de un anticuerpo que incluye una variante. En algunas realizaciones, una o más mutaciones pueden mejorar la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad de un anticuerpo que incluye una variante.
En algunas realizaciones, los métodos para preparar un anticuerpo humano incluyen identificar una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana y/o un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana de un ratón descrito en el presente documento; y (i) unir o ligar la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana, formando así una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina completamente humana, (ii) unir o ligar la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena ligera A de inmunoglobulina humana, formando así una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina humana que codifica una cadena ligera A de inmunoglobulina completamente humana, y/o (iii) unir o ligar la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera k de inmunoglobulina humana a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena ligera k de inmunoglobulina humana, formando así una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana que codifica una cadena ligera k de inmunoglobulina completamente humana. En determinadas realizaciones, una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y (i) una secuencia de cadena ligera A de inmunoglobulina humana, o (ii) un a secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana se expresan en una célula (por ejemplo, una célula huésped, una célula de mamífero) de manera que las cadenas pesadas de inmunoglobulina completamente humana y (i) cadenas ligeras A de inmunoglobulina completamente humana o (ii) cadenas ligeras k de inmunoglobulina completamente humana se expresan y forman anticuerpos humanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se aíslan de la célula o del medio de cultivo que incluye la célula.
Los ratones, como se describe en el presente documento, pueden emplearse para identificar una secuencia de nucleótidos o de ácido nucleico que codifica un dominio variable humano generado por un ratón descrito en el presente documento, por ejemplo, como parte de un anticuerpo contra un epítopo o antígeno.
Los ratones, como se describe en el presente documento, pueden emplearse para identificar una secuencia de aminoácidos de un dominio variable humano generado por un ratón descrito en el presente documento, por ejemplo, como parte de un anticuerpo contra un epítopo o antígeno.
Los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células, nucleótidos, polipéptidos, complejos de proteínas) para producir anticuerpos humanos que son útiles para una diversidad de ensayos. En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para desarrollar productos terapéuticos que se dirigen a un polipéptido de interés (por ejemplo, un polipéptido transmembrana o secretado) y/o modulan una o más actividades asociadas con dicho polipéptido de interés y/o modulan las interacciones de dicho polipéptido de interés con otros compañeros de unión (por ejemplo, un ligando o un polipéptido receptor). Por ejemplo, en diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para desarrollar productos terapéuticos que se dirigen a uno o más polipéptidos receptores, modulan la actividad del polipéptido receptor y/o modulan las interacciones del polipéptido receptor con otros compañeros de unión. En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para identificar, cribar y/o desarrollar productos terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, ARNip, etc.) que se unen a uno o más polipéptidos de interés. En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para cribar y desarrollar candidatos terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos, ARNip, etc.) que bloquean la actividad de uno o más polipéptidos de interés o que bloquean la actividad de uno o más polipéptidos receptores de interés. En diversas realizaciones, los ratones descritos en el presente documento se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de uno o más polipéptidos de interés. En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para determinar el epítopo o los epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a uno o más polipéptidos de interés.
En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se usan para determinar los perfiles farmacocinéticos de uno o más anticuerpos humanos candidatos. En diversas realizaciones, uno o más ratones, como se describe en el presente documento, y uno o más ratones de control o de referencia se exponen cada uno a uno o más anticuerpos humanos candidatos en diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse mediante cualquier vía de administración deseada, incluyendo las vías de administración parenteral y no parenteral. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración también puede ser por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares) y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de ratones (humanizados y de control) en diversos puntos temporales por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Se pueden realizar diversos ensayos para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados usando muestras obtenidas de ratones como se describe en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, IgG total, respuesta de anticuerpos antiterapéuticos, aglutinación, etc.
En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento- se usan para medir el efecto terapéutico de bloquear o modular la actividad de un polipéptido de interés y el efecto sobre la expresión génica como resultado de cambios celulares o, en el contexto de un polipéptido receptor, la densidad de un polipéptido receptor en la superficie de las células de los ratones. En diversas realizaciones, un animal no humano, como se describe en el presente documento, o células aisladas del mismo se exponen a un producto terapéutico candidato que se une a un polipéptido de interés y, después de un período de tiempo posterior, se analizan para determinar los efectos sobre procesos celulares específicos asociados con dicho polipéptido de interés, por ejemplo, interacciones ligando-receptor o transducción de señales.
Los ratones, como se describe en el presente documento, expresan regiones variables de anticuerpos humanos, por lo que se pueden generar células, líneas celulares y cultivos celulares para que sirvan como fuente de regiones variables de anticuerpos humanos para su uso en ensayos de unión y funcionales, por ejemplo, para analizar la unión o función de un antagonista o agonista, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para un antígeno humano de interés o específico para un epítopo que funciona en la interacción (unión) ligando-receptor. En diversas realizaciones, los epítopos unidos por anticuerpos terapéuticos candidatos o ARNip se pueden determinar usando células aisladas de los ratones como se describe en el presente documento.
Las células de los ratones proporcionados se pueden aislar y usar de forma ad hoc, o se pueden mantener en cultivo durante muchas generaciones. En diversas realizaciones, las células de un ratón proporcionado se inmortalizan (por ejemplo, mediante el uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie). En algunas realizaciones, una célula de ratón es un linfocito de ratón. En algunas realizaciones, una célula de ratón se selecciona de un linfocito B, una célula dendrítica, macrófago, monocito y un linfocito T. En algunas realizaciones, una célula de ratón es un linfocito B inmaduro, un linfocito B virgen maduro, un linfocito B activado, un linfocito B de memoria y/o una célula plasmática.
En algunas realizaciones, una célula de ratón es una célula madre embrionaria (ES) no humana. En algunas realizaciones, una célula ES de ratón es una célula ES de ratón. En algunas realizaciones determinadas, una célula ES de ratón es de una cepa 129, cepa C57BL, BALB/c o una mezcla de las mismas. En algunas realizaciones determinadas, una célula madre embrionaria de ratón es una mezcla de las cepas 129 y C57BL. En algunas realizaciones determinadas, una célula madre embrionaria de ratón es una mezcla de las cepas 129, C57BL y BALB/c.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de una célula ES de ratón como se describe en el presente documento para preparar un ratón. En algunas realizaciones determinadas, se usa una célula ES de ratón para preparar un ratón que comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un tejido de ratón se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, óvulo y una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, se proporciona una célula inmortalizada preparada, generada, producida u obtenida a partir de una célula o tejido de ratón aislado como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un embrión de ratón preparado, generado, producido u obtenido a partir de una célula ES de ratón como se describe en el presente documento.
Los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionan un sistema in vivo para la generación de variantes de regiones variables de anticuerpos humanos que se unen a un polipéptido de interés (por ejemplo, variantes de dominio VA humano). Dichas variantes incluyen regiones variables de anticuerpos humanos que tienen una funcionalidad, especificidad, baja reactividad cruzada deseadas con un epítopo común compartido por dos o más variantes de un polipéptido de interés. En algunas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, se emplean para generar paneles de regiones variables de anticuerpos humanos que contienen una serie de regiones variables variantes que se criban para una funcionalidad deseada o mejorada.
Los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionan un sistema in vivo para generar bibliotecas de regiones variables de anticuerpos humanos (por ejemplo, una biblioteca de dominios VA humanos). Dichas bibliotecas proporcionan una fuente para secuencias de regiones variables de cadenas pesadas y/o ligeras que pueden injertarse en diferentes regiones Fc basándose en una función efectora deseada, usada como fuente para la maduración por afinidad de la secuencia de región variable utilizando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, mutagénesis dirigida, PCR propensa a errores, etc.) y/o usada como fuente de componentes de anticuerpos para la generación de moléculas terapéuticas basadas en anticuerpos tales como, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (es decir, una molécula genomanipulada usando componentes de anticuerpos, por ejemplo, un scFv), agentes de unión multiespecíficos (por ejemplo, agentes de unión biespecíficos) y proteínas de fusión (por ejemplo, anticuerpos de un solo dominio, scFv, etc.).
En algunas realizaciones, se proporciona un método para producir un anticuerpo en un ratón, comprendiendo el método las etapas de (a) inmunizar un ratón como se describe en el presente documento con un antígeno de interés; (b) mantener al ratón en condiciones suficientes para que el ratón produzca una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y (c) recuperar un anticuerpo del ratón, o de una célula de ratón, que se une al antígeno de interés.
En algunas realizaciones de un método para producir un anticuerpo en un ratón, una célula de ratón es un linfocito B. En algunas realizaciones de un método para producir un anticuerpo en un ratón, una célula de ratón es un hibridoma.
En algunas realizaciones, se proporciona un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno homocigoto que comprende (i) VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, o cualquier combinación de los mismos, (ii) J JA1 humano, JA2, JA3, JA6, JA7, o cualquier combinación de los mismos, y (iii) un gen CA de ratón, en donde (i)-(iii) están unidos operativamente entre sí, el gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno, el uno o más segmentos génicos VA humanos incluyen ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos VA humanos correspondientes en un locus de cadena ligera A humana endógeno, y el uno o más segmentos génicos JA humanos incluyen ADN no codificante humano que aparece de forma natural adyacente a los segmentos génicos VA humanos correspondientes en un locus de cadena ligera A humana endógeno. En algunas realizaciones determinadas de un ratón proporcionado, un gen CA de ratón es o comprende un gen CA1 de ratón. En algunas realizaciones determinadas de un ratón proporcionado, un gen CA humano es o comprende un gen CA2 humano. En algunas realizaciones determinadas de un ratón proporcionado, el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno comprende además los potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina no humana Ekí y 3' Ek. En algunas realizaciones determinadas de un ratón proporcionado, el locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno incluye una eliminación de segmentos génicos VK y Jk de ratón.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo preparado por un método, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ratón como se describe en el presente documento; (b) inmunizar el ratón con un antígeno de interés; (c) mantener al ratón en condiciones suficientes para que el ratón produzca una respuesta inmunitaria al antígeno de interés; y (d) recuperar un anticuerpo del ratón, o de una célula de ratón, que se une al antígeno de interés, en donde el anticuerpo de (d) incluye los dominios Vh y VA humanos.
En algunas realizaciones de un anticuerpo preparado por un método, un dominio Vh humano codificado por una región variable de cadena pesada humana reordenada que comprende un Vh3-74 humano, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 Vh6-1, o una variante hipermutada somáticamente de los mismos.
En algunas realizaciones de un anticuerpo preparado por un método, un dominio VA humano codificado por una región variable de cadena pesada A humana reordenada que comprende un VA4-69 humano, VA8-61, VA4-60, VA6-57, VA10-54, VA5-52, VA1-51, VA9-49, VA1-47, VA7-46, VA5-45, VA1-44, VA7-43, VA1-40, VA5-39, VA5-37, VA1-36, VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 VA3-1, o una variante hipermutada somáticamente de los mismos.
En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón como se describe en el presente documento se proporciona para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo) para terapia o diagnóstico.
En algunas realizaciones, un ratón, célula de ratón o tejido de ratón como se describe en el presente documento se proporciona para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de un ratón, célula de ratón o tejido de ratón como se describe en el presente documento en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco o vacuna para su uso en medicina, tal como el uso como medicamento.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de un ratón o célula como se describe en el presente documento en la fabricación y/o desarrollo de un anticuerpo o fragmento del mismo.
Los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionan un sistema in vivo para el análisis y ensayo de un fármaco o vacuna. En diversas realizaciones, un fármaco o vacuna candidatos pueden suministrarse a uno o más ratones como se describe en el presente documento, seguido de la monitorización de los ratones para determinar una o más de la respuesta inmunitaria al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección y/o uno o más síntomas de una enfermedad o afección. Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, respuesta a anticuerpos (es decir, antifármacos), eficacia del fármaco o vacuna y posibles factores de riesgo. Dichos fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en dichos ratones.
La eficacia de la vacuna se puede determinar de varias formas. Brevemente, los ratones, como se describe en el presente documento, se vacunan usando métodos conocidos en la técnica y a continuación se exponen a una vacuna o se administra una vacuna a ratones ya infectados. La respuesta de un ratón o ratones a una vacuna puede medirse monitorizando y/o realizando uno o más ensayos en los ratones (o células aisladas de los mismos) para determinar la eficacia de la vacuna. A continuación, se compara la respuesta de un ratón o ratones a la vacuna con animales de control, usando una o más medidas conocidas en la técnica y/o descritas en el presente documento.
La eficacia de la vacuna puede determinarse además mediante ensayos de neutralización vírica. Brevemente, los ratones, como se describe en el presente documento, se inmunizan y el suero se recoge varios días después de la inmunización. Se incuban previamente diluciones en serie de suero con un virus durante el cual los anticuerpos en el suero que son específicos para el virus se unirán a él. A continuación, se añade la mezcla de virus/suero a células permisivas para determinar la infectividad mediante un ensayo de placa o ensayo de microneutralización. Si los anticuerpos en el suero neutralizan el virus, hay menos placas o unidades de luciferasa relativas más bajas en comparación con un grupo de control.
Los ratones, como se describe en el presente documento, producen regiones variables de anticuerpos humanos y, por lo tanto, proporcionan un sistema in vivo para la producción de anticuerpos humanos para su uso en aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, inmunología, serología, microbiología, patología celular, etc.). En diversas realizaciones, los ratones, como se describe en el presente documento, pueden usarse para producir regiones variables de anticuerpos humanos que se unen a sitios antigénicos relevantes para la identificación de cambios celulares tales como, por ejemplo, la expresión de marcadores de superficie celular específicos indicativos de cambios patológicos. Dichos anticuerpos se pueden conjugar con diversas entidades químicas (por ejemplo, un trazador radiactivo) y se pueden emplear en diversos ensayos in vivo y/o in vitro como se desee.
Los ratones, como se describe en el presente documento, proporcionan un sistema in vivo mejorado de desarrollo y selección de anticuerpos humanos para su uso en oncología y/o enfermedades infecciosas. En diversas realizaciones, a los ratones, como se describe en el presente documento, y ratones de control (por ejemplo, que tienen una modificación genética que es diferente a la descrita en el presente documento o sin modificación genética, es decir, de tipo natural) se les puede implantar un tumor (o células tumorales) o se les infecta con un virus (por ejemplo, influenza, VIH, VHC, VPH, etc.). Después de la implantación de la infección, a los ratones se les puede administrar un producto terapéutico candidato. Puede dejarse tiempo suficiente para que el tumor o virus se establezca en una o más ubicaciones dentro de los ratones antes de la administración de un producto terapéutico candidato. Como alternativa, y/o adicionalmente, la respuesta inmunitaria puede monitorizarse en tales ratones para caracterizar y seleccionar anticuerpos humanos potenciales que pueden desarrollarse como productos terapéuticos.
Composiciones farmacéuticas
Un anticuerpo, un ácido nucleico o una porción terapéuticamente relevante del mismo producido por un ratón desvelado en el presente documento o derivado de un anticuerpo, un ácido nucleico o una porción terapéuticamente relevante del mismo producido por un ratón desvelado en el presente documento puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano). Una composición farmacéutica puede incluir un anticuerpo producido por un ratón desvelado en el presente documento. Una composición farmacéutica puede incluir un tampón, un diluyente, un excipiente o cualquier combinación de los mismos. Una composición, si se desea, también puede contener una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento están dirigidas principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética a seres humanos, el experto en la materia entenderá que dichas composiciones son generalmente adecuadas para la administración a animales de todo tipo. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a diversos animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario experto puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación meramente ordinaria, en caso de haberla.
Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede estar en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que es adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, una composición farmacéutica puede estar en una forma farmacéutica líquida que sea adecuada para inyección. En algunos casos, una composición farmacéutica se proporciona en forma de polvos (por ejemplo, liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente al vacío, que se pueden reconstituir con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, tampón, solución salina, etc.) antes de la inyección. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina tamponada con fosfato, etc. En algún caso, un polvo debe mezclarse suavemente con el diluyente acuoso (por ejemplo, no agitado).
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos de preparación incluyen la etapa de asociar el principio activo con un diluyente u otro excipiente y/o uno o más ingredientes auxiliares, y a continuación, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis individual o múltiple.
En algunos casos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo producido por un animal no humano desvelado en el presente documento se puede incluir en un recipiente para almacenamiento o administración, por ejemplo, un vial, una jeringa (por ejemplo, una jeringa IV) o una bolsa (por ejemplo, una bolsa IV). Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede prepararse, envasarse y/o comercializarse a granel, como dosis unitaria individual, y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente equivalente a la dosis del principio activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosis, tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de una dosificación de este tipo.
Las cantidades relativas del principio activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del sujeto tratado y, adicionalmente, dependiendo de la vía por la que ha de administrarse la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 % (p/p) de principio activo.
Una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en el presente documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma farmacéutica particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) desvela diversos excipientes usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como mediante la producción de cualquier efecto biológico no deseable o la interacción de otro modo de forma perjudicial con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, puede usarse. En algunos casos, un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % puro. En algunos casos, un excipiente está aprobado para su uso en seres humanos y para su uso veterinario. En algunos casos, un excipiente está aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos. En algunos casos, un excipiente es de calidad farmacéutica. En algunos casos, un excipiente cumple con los criterios de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, diluyentes inertes, agentes de dispersión y/o granulación, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubricantes y/o aceites. Dichos excipientes pueden incluirse opcionalmente en formulaciones farmacéuticas. Puede haber presentes excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saporíferos y/o perfumantes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.
En algunos casos, una composición farmacéutica proporcionada comprende uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservante, diluyente inerte, agente dispersante, agente tensioactivo y/o emulsionante, agente tamponante, etc.). En algunos casos, una composición farmacéutica comprende uno o más conservantes. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas no contienen conservantes.
En algunos casos, una composición farmacéutica está en una forma que se puede refrigerar y/o congelar. En algunos casos, una composición farmacéutica está en una forma que no se puede refrigerar y/o congelar. En algunos casos, las soluciones reconstituidas y/o las formas farmacéuticas líquidas pueden almacenarse durante un determinado período de tiempo después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más). En algunos casos, el almacenamiento de las composiciones de anticuerpos durante más tiempo del especificado da como resultado la degradación de los anticuerpos.
Las formas farmacéuticas líquidas y/o soluciones reconstituidas pueden comprender partículas y/o decoloración antes de la administración. En algunos casos, no se debe usar una solución si está descolorida o turbia y/o si quedan partículas después de la filtración.
Pueden encontrarse consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Kits
También se describe un paquete o kit que comprende uno o más recipientes llenos con al menos un ratón, una célula de ratón, un fragmento de ADN, un vector de direccionamiento, o cualquier combinación de los mismos, como se describe en el presente documento. Los kits pueden usarse en cualquier método aplicable (por ejemplo, un método de investigación). Opcionalmente asociado a dicho envase o envases puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, cuyo aviso refleja (a) la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para la administración a seres humanos, (b) instrucciones de uso y/o (c) un contrato que rige la transferencia de materiales y/o productos biológicos (por ejemplo, un ratón o una célula de ratón como se describe en el presente) entre dos o más entidades y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, se proporciona un kit que comprende un ratón, una célula de ratón, un tejido de ratón, una célula inmortalizada, una célula ES de ratón o un embrión de ratón como se describe en el presente documento. También se desvela un kit que comprende un aminoácido (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo) de un ratón, célula de ratón, tejido de ratón, célula inmortalizada, célula ES de ratón, embrión de ratón como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un kit que comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo) de un ratón, célula de ratón, tejido de ratón, célula inmortalizada, célula ES de ratón o embrión de ratón como se describe en el presente documento. También se desvela un kit que comprende una secuencia (secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico) identificada a partir de un ratón, célula de ratón, tejido de ratón, célula inmortalizada, célula ES de ratón o embrión de ratón como se describe en el presente documento.
También se desvela un kit como se describe en el presente documento para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo) para terapia o diagnóstico.
También se desvela un kit como se describe en el presente documento para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo) para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
Otras características de determinadas realizaciones resultarán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de realizaciones ilustrativas, que se dan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de las mismas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir al experto en la materia cómo producir y utilizar los métodos y composiciones descritos en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores de la presente divulgación consideran su invención. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejemplo 1. Construcción de vectores de direccionamiento para generar un ratón que exprese al menos una cadena ligera lambda a partir de un locus de cadena ligera kappa
Ejemplo 1.1. Genomanipulación de un vector de direccionamiento que comprende una región constante lambda de ratón
Este ejemplo ilustra métodos de ejemplo para construir un vector de direccionamiento para la inserción en el genoma de un ratón. Además, este ejemplo demuestra la producción de un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado. En particular, este ejemplo demuestra la construcción de un vector de direccionamiento para genomanipular un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno en un ratón para que el ratón exprese y/o produzca anticuerpos que incluyan cadenas ligeras A de inmunoglobulina con regiones variables humanas y regiones constantes A (CA) de inmunoglobulina de ratón de dicho locus de cadena ligera k de inmunoglobulina en el genoma de línea germinal del ratón. Como se describe a continuación en el Ejemplo 2, los fragmentos de ADN que contienen múltiples secuencias codificantes de JA humano (por ejemplo, JA1, jA2, JA3, JA6 y JA7) y una secuencia codificante de CA de ratón (por ejemplo, un CA1 de ratón) se insertan en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón endógeno. En realizaciones ilustradas particulares, se inserta un gen CA1 de ratón en el lugar de un gen Ck de ratón y en unión operativa con potenciadores de IgK de ratón (por ejemplo, Ekí y 3'Ek). Una estrategia ilustrativa para la creación de un vector de direccionamiento para generar un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado en un ratón caracterizado por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de ratón y unidos operativamente a potenciadores de IgK endógenos se expone en la figura 1 (figura 1A: etapas iniciales de construcción del vector de direccionamiento; figura 1B: etapas posteriores adicionales de construcción de un vector de direccionamiento; una secuencia de cadena ligera K de inmunoglobulina humana entre los segmentos génicos VA y JA humanos se indica por una barra de color blanco rellena con líneas diagonales descendentes anchas (por ejemplo, véanse las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092), lox: lox2372; NEO: gen de resistencia a la neomicina (neoR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina, HYG: gen de resistencia a la higromicina (hygR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina, Spec: gen de resistencia a la espectinomicina (SpecR), R6K: origen de replicación de R6K).
Se creó un vector de direccionamiento que contenía secuencias codificantes de JA humano y CA de ratón para la inserción en un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina de ratón usando la tecnología v ElOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9) y técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Los expertos en la materia, que lean el presente ejemplo, apreciarán que las tecnologías y el enfoque descritos pueden emplearse para utilizar cualquier secuencia codificante de JA humano y cualquier secuencia codificante de CA, o una combinación de secuencias codificantes (o fragmentos de secuencia), según se desee.
Brevemente, un fragmento de ADN de 2,7 kb que contenía los segmentos génicos JA humanos JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7 y regiones solapantes 5' y 3' únicas correspondientes a una secuencia genómica (no codificante) de Vk-Jk humano y una secuencia genómica 5' de un gen Ck de ratón, respectivamente, se realizó mediante síntesis de ADN de novo (pA; figura 1A, parte superior izquierda, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Se incluyeron diversos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en el fragmento de ADN para facilitar la posterior clonación de marcadores de selección y otros fragmentos de ADN (descritos a continuación). El fragmento de ADN se diseñó únicamente para contener secuencias Jk humanas no codificantes yuxtapuestas con secuencias codificantes de JA humano y secuencias señal de recombinación (RSS) de JA humano. Como se sabe en la técnica, una RSS consiste en un bloque conservado de siete nucleótidos (heptámero) seguido de un espaciador de 12 o 23 pares de bases de longitud y seguido de un segundo bloque conservado de nueve nucleótidos (nonámero). Por lo tanto, una RSS tiene una configuración de 7-12-9 (12RSS) o 7-23-9 (23RSS) dependiendo del segmento génico asociado (véase, por ejemplo, la figura 5.4 en Murphy, Kenneth, et al. "Capítulo 5". Janeway's Immunobiology, 8a ed., Garland Science/Taylor & Francis Group, LLC, 2012). En particular, los segmentos génicos JA humanos (es decir, las secuencias codificantes de JA humano) y su 12RSS asociada se sustituyeron en el lugar de los segmentos génicos Jk humanos (es decir, las secuencias codificantes de Jk humano) y su 23RSS asociada. Por lo tanto, este fragmento contenía secuencias de ADN JA y Jk humano. La inclusión de dichas secuencias en los vectores de direccionamiento descritos en el presente documento puede proporcionar (o promover) la unión eficiente de los segmentos génicos VA y JA humanos dentro de un locus de cadena ligera de IgK de ratón genomanipulado.
El plásmido A (pA) se digirió con Agel y EcoRI y se ligó a un casete de selección de neomicina (es decir, un gen NeoR bajo el control de un promotor de ubiquitina flanqueado por sitios lox2372) que contenía extremos compatibles para crear el plásmido B (pB) (figura 1A). Por separado, los fragmentos de ADN únicos que contenían un potenciador intrónico (Ei) de IgK de ratón, un gen CA1 de ratón (del clon BAC RP23-60e14), un fragmento de ADN que contenía 316 pb de secuencia inmediatamente cadena abajo de una secuencia codificante de Ck de ratón y 80 pb de secuencia superpuesta para facilitar ensamblaje isotérmico y os sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (Notl, Mlul) para facilitar las etapas de clonación posteriores, y un R6K-Spec (un gen de espectinomicina adeniltransferasa y un origen de replicación R6K) se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se combinaron mediante ensamblaje isotérmico (véanse, por ejemplo, Gibson, D.G. et.al., 2009, Nat. Meth.
6(5):343-5; Gibson, D.G. et al., 2010, Nat. Meth. 7:901-903) para crear el plásmido C (pC), que posteriormente se digirió con Notl y Mlul y se ligó a un casete de selección de higromicina (es decir, un gen HygR bajo el control de un promotor de ubiquitina flanqueado por sitios loxP) que contenía extremos compatibles para crear el plásmido D (pD; figura 1A, parte superior y central derecha). Este plásmido resultante (pD; figura 1A, centro) se digirió a continuación con Pl-Scel y Ascl y se ligó con el plásmido B (pB) que contenía extremos compatibles (figura 1A, parte inferior) para generar el plásmido E (pE).
En una etapa posterior, un vector de direccionamiento que contiene segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón y una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana posicionada entre los segmentos génicos VA y JA humanos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511) se digirió por separado con NotI y se volvió a ligar para eliminar la región VA humana que incluía una secuencia k de inmunoglobulina humana (figura 1B, parte superior), lo que dio como resultado una eliminación de ~137 kb. La construcción resultante (construcción F) se combinó con el plásmido E (pE) mediante un método de ensamblaje isotérmico CRISPR/Cas9 (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.738.897 y la Publicación de EE.u U. N.° 2016/0145646) de modo que la región Jk humana con la secuencia codificante (CDS) JA-12RSS humana se unió operativamente con una región intergénica (no codificante) Vk-Jk humana (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511) y un potenciador 3' de IgK de ratón (figura 1B). Los clones bacterianos positivos se seleccionaron en medios que contenían kanamicina, higromicina y espectinomicina. El vector de direccionamiento resultante (construcción G) contenía, de 5' a 3', un sitio de reconocimiento loxP, un sitio Notl, una secuencia intergénica Vk-Jk humana (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511), un casete de selección de neomicina flanqueado por sitios de reconocimiento lox2372, una región Jk humana con cinco segmentos génicos JA humanos y sus respectivas 12RSS, un potenciador intrónico de inmunoglobulina K de ratón (Eík), un gen CA1 de ratón, un casete de selección de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento loxP, un potenciador 3' de inmunoglobulina k de ratón (3' Ek) y un casete de selección de espectinomicina (figura 1B).
Ejemplo 1.2. Genomanipulación de un vector de direccionamiento que comprende una región constante lambda humana
Este ejemplo ilustra métodos de ejemplo para construir un vector de direccionamiento para la inserción en el genoma de un ratón. Además, este ejemplo demuestra la producción de un ratón cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina genomanipulado. En particular, este ejemplo demuestra la construcción de un vector de direccionamiento para genomanipular un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno en un ratón para que el ratón exprese y/o produzca anticuerpos que incluyan cadenas ligeras A de inmunoglobulina con regiones variables humanas y regiones constantes A (CA) de inmunoglobulina humana de dicho locus de cadena ligera k de inmunoglobulina en el genoma de línea germinal del ratón. Como se describe a continuación en el Ejemplo 2, los fragmentos de ADN que contienen múltiples secuencias codificantes de JA humano (por ejemplo, JA1, jA2, JA3, JA6 y JA7) y una secuencia codificante de CA humano (por ejemplo, un CA2 humano) se insertan en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón endógeno. En particular, se inserta un gen CA2 humano en el lugar de un gen Ck de ratón y en unión operativa con potenciadores k de inmunoglobulina de ratón (por ejemplo, Eík y 3'Ek). En la figura 3 se expone una estrategia ilustrativa para la creación de un vector de direccionamiento.
Se creó un vector de direccionamiento que contenía secuencias codificantes de JA humano y CA humano para la inserción en un locus de cadena ligera de IgK de ratón usando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9) y técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Los expertos en la materia, que lean el presente ejemplo, apreciarán que el enfoque y las tecnologías que se describen pueden emplearse para utilizar cualquier secuencia codificante de JA y CA humano, o una combinación de secuencias codificantes (o fragmentos de secuencia), según se desee.
Brevemente, un fragmento de ADN de 871 pb que contenía una secuencia codificante de CA humano y regiones únicas de superposición 5' y 3' correspondientes a las secuencias genómicas 5' y 3' de un gen Ck de ratón, respectivamente, se realizó mediante síntesis de ADN de novo (pH; figura 3, parte superior izquierda, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Se incluyeron diversos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en el fragmento de ADN para permitir la posterior clonación de marcadores de selección y otros fragmentos de ADN (descritos a continuación). Se digirió el plásmido H (pH) con Agel y Xhol y se ligó a un casete de selección de higromicina (es decir, un gen HygR bajo el control de un promotor de ubiquitina flanqueado por sitios loxP) que contenía extremos compatibles para crear el plásmido J (pJ; figura 3). Una construcción intermedia (construcción K, generada a partir de la construcción F y el plásmido B usando Cas9 y ensamblaje isotérmico) que contenía una región Jk humana genomanipulada con secuencias codificantes de JA humano (descritas anteriormente) unidas operativamente a un gen Ck de ratón y potenciadores de IgK de ratón, se combinó con el plásmido J usando un método de ensamblaje isotérmico CRISPR/Cas9 (véanse, por ejemplo, la Patente de EE.u U. N.° 9.738.897, y la Publicación de EE.u U. N.° 2016/0145646) de manera que la región Jk humana con la secuencia codificante de JA-12RSS humana (CDS) se unión operativamente con la secuencia codificante de CA2 humano del plásmido J (figura 3). Los clones bacterianos positivos se seleccionaron en medios que contenían kanamicina, higromicina y espectinomicina. El vector de direccionamiento resultante (construcción L) contenía, de 5' a 3', un sitio de reconocimiento loxP, un sitio Notl, una secuencia intergénica Vk-Jk humana (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511), un casete de selección de neomicina flanqueado por sitios de reconocimiento lox2372, una región Jk humana con cinco segmentos génicos JA humanos y sus respectivas 12RSS, un potenciador intrónico de IgK de ratón (Eík), un gen CA2 humano, un casete de selección de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento loxP, un potenciador 3' de inmunoglobulina K de ratón (3' Ek) y un casete de selección de espectinomicina (figura 3).
Ejemplo 2. Generación de ratones que tienen un locus de cadena ligera genomanipulado
Este ejemplo demuestra la producción de ratones cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a dicho gen CA de ratón, y cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón de un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina endógeno. Dichos ratones están caracterizados, en algunas realizaciones, por la expresión de cadenas ligeras A de inmunoglobulina (dominios variables y constantes) a partir de un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina endógeno.
La inserción dirigida de vectores de direccionamiento descritos en los Ejemplos 1.1 y 1.2 se confirmó por reacción en cadena de la polimerasa. El ADN de BAC dirigido, confirmado por reacción en cadena de la polimerasa, se introdujo en células madre embrionarias (ES) de ratón híbridas F1 (C57BL6NTac/129S6SvEvTac) mediante electroporación seguida de cultivo en medio de selección.
Las células ES usadas para la electroporación de la construcción G (CA1 de ratón) tenían un genoma de línea germinal que incluía un locus de cadena ligera K de inmunoglobulina heterocigoto que contenía una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera K de inmunoglobulina de ratón que incluye potenciadores de cadena ligera K de inmunoglobulina de ratón, y una secuencia de cadena ligera K de inmunoglobulina humana posicionada entre los segmentos génicos VA y JA humanos y un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón de tipo natural. Las células ES antes y después de la electroporación se representan en la figura 2A (1741HET: un clon de células ES de ratón que tiene un genoma heterocigoto para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado que contiene segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que incluye potenciadores de cadena ligera K de inmunoglobulina de ratón, y una secuencia de cadena ligera K de inmunoglobulina humana posicionada entre los segmentos génicos VA y JA humanos indicados por una barra de color blanco rellena de líneas diagonales descendentes anchas, y locus de cadena pesada y cadena ligera A de inmunoglobulina de tipo natural, por ejemplo, véanse, las Patentes de EE.UU. N.° 9.006.511, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 y 9.163.092; 6557HET: un clon de células ES de ratón después de la inserción de la construcción G que da como resultado un genoma heterocigoto para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado que incluye potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón, cuyo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado está caracterizado por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos, cuyos segmentos génicos JA humanos están contenidos dentro de una secuencia de región Jk humana con secuencias codificantes de segmentos génicos JA humanos y 12RSS de JA humano en el lugar de las correspondientes secuencias codificantes de segmentos génicos Jk humanos y 23RSS de Jk humano, y cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de A de inmunoglobulina de ratón (por ejemplo, mCA1); lox: lox2372; NEO: gen de resistencia a la neomicina (neoR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina; HYG: gen de resistencia a la higromicina (hygR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina; las ubicaciones de los conjuntos de cebador/sonda seleccionados para la detección de clones de células ES se indican cerca de las ubicaciones de las regiones dentro del locus de cadena ligera de IgK genomanipulado detectado en un ensayo descrito a continuación).
Las células ES usadas para la electroporación de la construcción L (CA2 humano) tenían un genoma de línea germinal que incluía un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina heterocigoto que contenía una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón que incluye potenciadores de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón, y una secuencia de cadena ligera k de inmunoglobulina humana posicionada entre los segmentos génicos VA y JA humanos y un locus de IgK de ratón de tipo natural. Las células ES antes y después de la electroporación se representan en la figura 4A (1741HET: anteriormente; 20029HET: un clon de células ES de ratón después de la inserción de un vector de direccionamiento que tiene un genoma heterocigoto para un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado que incluye potenciadores de cadena ligera K de inmunoglobulina de ratón, cuyo locus de cadena ligera de IgK genomanipulado está caracterizado por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos, cuyos segmentos génicos VA humanos están contenidos dentro de una secuencia de región Jk humana con secuencias codificantes de segmentos génicos JA humanos y 12RSS de JA humano en el lugar de las correspondientes secuencias codificantes de segmentos génicos Jk humanos y 23RSS de Jk humano, y cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de IgA humana (por ejemplo, hCA2); lox: lox2372; NEO: gen de resistencia a la neomicina (neoR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina; HYG: gen de resistencia a la higromicina (hygR) bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina; las ubicaciones de los conjuntos de cebador/sonda seleccionados para la detección de clones de células ES se indican cerca de las ubicaciones de las regiones dentro del locus de cadena ligera de IgK genomanipulado detectado en un ensayo descrito a continuación).
Las colonias resistentes a fármacos se recogieron 10 días después de la electroporación y se cribaron mediante TAQMAN™ y cariotipificación para determinar el direccionamiento correcto como se ha descrito previamente (Valenzuela et al., anteriormente; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307). La Tabla 1 expone conjuntos de cebadores/sondas ilustrativos usados para cribar clones de células ES positivos (F: directo; R: inverso; P: sonda; GOA: ganancia de alelo; LOA: pérdida de alelo; WT: tipo natural).
El método VELOCIMOUSE® (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), en el que se inyectaron células ES dirigidas en embriones Swiss Webster en estadio de 8 células sin compactar, se usó para producir ratones sanos de la generación F0 completamente derivados de células ES heterocigotos para el locus de cadena ligera de IgK genomanipulado (figura 2A y 4A). Se cruzaron ratones heterocigotos de generación F0 con ratones C57Bl6/NTac para generar heterocigotos F1 que se entrecruzaron para producir animales homocigotos de generación F2 para análisis fenotípicos.
Como alternativa, las células ES murinas que portan un locus k de inmunoglobulina genomanipulado como se ha descrito anteriormente se pueden modificar para eliminar uno o más casetes de selección introducidos con un vector de direccionamiento según se desee (figura 2B: 6557HET: anteriormente; 6558HET: un clon de células ES de ratón después de la escisión mediada por recombinasa de los casetes de selección de neomicina e higromicina insertados después de la recombinación homóloga con un vector de direccionamiento; figura 4B: 20029HET: anteriormente; 20030HET: un clon de células ES de ratón después de la escisión mediada por recombinasa de los casetes de selección de neomicina e higromicina insertados después de la recombinación homóloga con un vector de direccionamiento. Cre: recombinasa Cre). Por ejemplo, el casete de neomicina e higromicina introducido por los vectores de direccionamiento puede eliminarse en células ES genomanipuladas (o embriones) mediante expresión transitoria de recombinasa o mediante cruzamiento con una cepa manipulada genéticamente que expresa recombinasa (véanse, por ejemplo, Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6; Orban, P.C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6861-5; Gu, H. et al., 1993, Cell 73(6):1155-64; Araki, K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:160-4; Dymecki, S.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(12):6191-6).
En conjunto, este ejemplo ilustra la generación de un ratón), cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado caracterizado por la presencia de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de ratón, cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón de un locus de cadena ligera de IgK endógeno. Un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado como se describe incluye una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos en una disposición no endógena. La estrategia descrita en el presente documento para insertar segmentos génicos VA y JA humanos y un gen CA de ratón en el lugar de un gen Ck de ratón, permite la construcción de un ratón que expresa anticuerpos que contienen exclusivamente dominios VA humanos. No quedó claro si un locus de cadena ligera de IgK genomanipulado que incluía exclusivamente segmentos génicos A (fuera del locus A endógeno, en una orientación no endógena) era capaz de producir cadenas ligeras funcionales. Como se describe en el presente documento, dichos dominios VA humanos se expresan a partir de locus de cadena ligera de IgK endógenos en el genoma de línea germinal de los ratones proporcionados.
Tabla 1. Conjuntos de cebador/sonda representativos para el cribado de clones de células ES positivos Nombre Secuencia (5'-3') Ensayo F GTGGAAGATTGATGGCAGTGAAC (SEQ ID NO:25)
mIgKC-1 R GTGCTGCTCATGCTGTAGGT (SEQ ID NO:26) LOA
P AAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGA (SEQ ID NO:27)
F CCATCCAGTGAGCAGTTAACATC (SEQ ID NO:28)
mIgKC-2 R TGTCGTTCACTGCCATCAATC (SEQ ID NO:29) LOA
P AGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTC (SEQ ID NO:30)
F GGAGCCCTTCCTTGTTACTTCA (SEQ ID NO:31)
mIgKLC1-1 R AGGTGGAAACAGGGTGACTGATG (SEQ ID NO:32) GOA-6557
P TCCTCTGTGCTTCCTTCCTCAGGC (SEQ ID NO:33)
F TCCTTGTTACTTCATACCATCCTCT (SEQ ID NO:34)
mIgKLC1-2 R AGGGTGACTGATGGCGAAGACT (SEQ ID NO:35) GOA-6557
P TTCCTTCCTCAGGCCAGCCC (SEQ ID NO:36)
F GAGGCTTGCTGAGCTTTCAG (SEQ ID NO:37)
hIgKLJ-1 R AGGACGGTCAGCTTGGTC (SEQ ID NO:38) GOA
P TATGAGCCTGTGTCACAGTGTTGGG (SEQ ID NO:39)
F GCTGACCCAGGACTCTGTTC (SEQ ID NO:40)
hIgKLJ-2 R TCCCAGTTCCGAAGACATAACAC (SEQ ID NO:41) GOA
P CCCTTTGGTGAGAAGGGTTTTGGTC (SEQ ID NO:42)
F TACGCGGCCAGCAGCTAT (SEQ ID NO:43)
hIgLC2-1 R TGGCAGCTGTAGCTTCTGT (SEQ ID NO:44) GOA-20029
P CTGAGCCTGACGCCTGAGCAG (SEQ ID NO:45)
F TCAACCTTTCCCAGCCTGTCT (SEQ ID NO:46)
1561hJl R CCCCAGAGAGAGAAAACAGATTTT (SEQ ID NO:47) LOA
P ACCCTCTGCTGTCCCT (SEQ ID NO:49)
F GGTGGAGAGGCTATTCGGC (SEQ ID NO:50)
Neo R GAACACGGCGGCATCAG (SEQ ID NO:51) GOA
P TGGGCACAACAGACAATCGGCTG (SEQ ID NO:52)
F TGCGGCCGATCTTAGCC (SEQ ID NO:53)
Hyg R TTGACCGATTCCTTGCGG (SEQ ID NO:54) GOA
P ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC (SEQ ID NO:55)
F GGGCTACTTGAGGACCTTGCT (SEQ ID NO:56)
1468h2 R GACAGCCCTTACAGAGTTTGGAA (SEQ ID NO:57) Parental P CAGGGCCTCCATCCCAGGCA (SEQ ID NO:58)
________________________________________ (continuación)_______________
Nombre Secuencia (5'-3') Ensayo F ATCTCCCTACTTCCTGGCTAATG (SEQ ID NO:59)
1525hk-VJ1 R GCTTGGAACCTGATTGGTTGTC (SEQ ID NO:60) Parental
P AGCCTTGATCCTTGGGAATCCAGGACA (SEQ ID NO:61)
F GCAAACAAAAACCACTGGCC (SEQ ID NO:62)
mIgKd2 R GGCCACATTCCATGGGTTC (SEQ ID NO:63) WT
P CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA (SEQ ID NO:64)
Ejemplo 3. Caracterización de ratones que tienen un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genomanipulada
Ejemplo 3.1. Evaluación fenotípica de células inmunitarias en ratones que tienen un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genomanipulado
Este ejemplo demuestra la caracterización de diversas poblaciones de células inmunitarias en ratones (por ejemplo, ratones) genomanipulados para contener una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de ratón, y regiones reguladoras y potenciadoras de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón, dentro de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno. En particular, este ejemplo demuestra específicamente que los ratones que tienen locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulados descritos en el presente documento muestran un perfil de expresión de cadena ligera único en comparación con los ratones de tipo natural. Este ejemplo también demuestra que los ratones proporcionados expresan un amplio repertorio de regiones VA humanas a partir del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado.
Brevemente, se recogieron bazos y fémures de ratones de ratones tipo natural (WT, 75 % de C57BL/6NTac 25 % de 129SvEvTac) y 6558HO (LiK homocigotos, 75 % de C57BL/6NTac 25 % de 129SvEvTac). La médula ósea se recogió de los fémures mediante lavado abundante con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, Gibco) con suero bovino fetal al 2,5 % (FBS). Los glóbulos rojos de las preparaciones de bazo y médula ósea se lisaron con tampón de lisis ACK (Gibco) seguido de lavado con 1 x PBS con FBS al 2,5 %.
Las células aisladas (1 x 106) se incubaron con cócteles de anticuerpos seleccionados durante 30 min a 4 °C: anti mIgK-FITC (187.1, b D Biosciences), anti mIgA-PE (RML-42, BioLegend; 1060-09, Southern Biotech), anti mIgA-FITC (106002, BioRad; ABIN303989, Antibodies-online), anti IgM de ratón-PeCy7 (11/41, eBioscience), anti IgD de ratón-PerCP/Cy5.5 (11-26c.2a, BioLegend), anti CD3 de ratón-Pacific Blue (17a 2, BioLegend), anti B220 de ratón-APC (RA3-6B2, eBioscience), anti CD19 de ratón-APC-H7 (ID3, BD Biosciences). Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2 %. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo BD LSRFORTESSA™ y se analizaron con el programa informático FLOWJO™. Los resultados representativos se exponen en las figuras 5-7.
Como se muestra en las figuras 5 y 6, los ratones LiK muestran distribuciones similares de CD19+ y linfocitos B inmaduros/maduros en comparación con ratones de tipo natural en los compartimentos del bazo y la médula ósea, respectivamente. Sin embargo, los ratones LiK demuestran una expresión de cadena ligera única en comparación con los ratones de tipo natural en el sentido de que solo se observó expresión de IgA+ en estos ratones (figura 7). En particular, >90 % de los linfocitos B CD19+ en ratones LiK expresan la cadena ligera A de inmunoglobulina, lo que confirma la recombinación y la expresión adecuadas en el locus k de inmunoglobulina genomanipulado. Como era de esperar, dado que estos ratones carecen de un gen Ck de ratón, los ratones LiK no muestran una expresión detectable de inmunoglobulina k mediante citometría de flujo (es decir, el anticuerpo anti mIgK detecta la región constante). Se observaron niveles similares de expresión de la cadena ligera A de inmunoglobulina en otros compañeros de camada de ratones LiK (datos no mostrados). La expresión de regiones VA humanas en el contexto de una región CA de ratón del locus LiK se confirmó, entre otras cosas, mediante análisis del repertorio de inmunoglobulinas usando técnicas de secuenciación de próxima generación (descritas en el Ejemplo 3.2 a continuación).
Ejemplo 3.2. Repertorio de inmunoglobulinas en ratones que tienen un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genomanipulado
El uso de genes de anticuerpos humanos (es decir, segmentos del gen VDJ) en la cepa de ratón genomanipulada descrita anteriormente se determinó mediante análisis de repertorio de anticuerpos de secuenciación de próxima generación. En particular, la secuenciación por RT-PCR se realizó en ARN aislado de esplenocitos de ratones homocigotos para el locus LiK (6558 HO) para confirmar la transcripción y recombinación correctas del locus LiK. En la figura 12 se muestra una ilustración representativa de un locus LiK reorganizado (locus LiK: locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento; locus LiK reorganizado: reordenamiento representativo del locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado (denominado en el presente documento "locus LiK") que da como resultado la recombinación de VA-JA humano; ARNm de LiK reorganizado: transcripción representativa y procesamiento de ARNm del locus de LiK reorganizado).
Brevemente, los linfocitos B esplénicos se enriquecieron positivamente a partir de esplenocitos totales mediante clasificación celular magnética usando perlas magnéticas anti CD19 de ratón y columnas MACS® (Miltenyi Biotech). El ARN total se aisló de linfocitos B esplénicos purificados usando un kit de aislamiento de ARN RNeasy Plus (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se realizó la transcripción inversa para generar ADNc que contenía la secuencia del gen de la región constante de inmunoglobulina A, usando un kit de amplificación de ADNc SMARTer™ RACE (Clontech) y cebadores específicos de inmunoglobulina A (véanse a continuación). Durante este proceso, una secuencia de ADN, complementaria inversa a 3' de un cebador de cambio de plantilla (TS), se unió al extremo 3' de los ADNc recién sintetizados. A continuación, los ADNc específicos de IgA purificados se amplificaron mediante una reacción de PCR de primera ronda usando el cebador específico de TS y cebadores inversos específicos para secuencias de CA1 de ratón. Los productos de PCR que varían entre ~450-700 pb se aislaron usando Pippin Prep (SAGE Science) y a continuación estos fragmentos se amplificaron aún más mediante una segunda ronda de reacción de PCR. La Tabla 2 expone las secuencias de cebadores seleccionados usados para la construcción de bibliotecas de repertorio (for: cebador directo; rev: cebador inverso). Los productos de PCR que varían entre ~400 pb-700 pb se aislaron, se purificaron y se cuantificaron mediante qPCR usando un kit de cuantificación de bibliotecas KAPA (KAPA Biosystems) antes de cargarlos en un secuenciador Miseq (Illumina) para la secuenciación usando los kits de reactivo Miseq v3 (2 x 300 ciclos).
Para el análisis bioinformático, las secuencias de Illumina sin procesar se demultiplexaron y se filtraron en función de la calidad, la longitud y la coincidencia con el cebador génico de la región constante correspondiente. Las lecturas de extremos emparejados superpuestas se combinaron y analizaron mediante un proceso interno personalizado. El proceso usó la instalación local de IgBLAST (NCBI, v2.2.25+) para alinear las secuencias de cadenas ligeras reorganizadas con la base de datos de segmentos génicos VA y JA de línea germinal humana, y representó uniones productivas y no productivas junto con la presencia de codones finalizadores. Las secuencias de CDR3 y los nucleótidos sin plantilla esperados se extrajeron usando los límites definidos en el Sistema Internacional de Información Inmunogenética (IMGT, por sus siglas en inglés).
_____________Tabla 2. Cebadores representativos para la construcción de bibliotecas de repertorio
Nombre del Secuencia (5'-3')
cebador
Cebador TS CACCATCGAT GTCGACACGC CTAGGG (SEQ ID N 0 65)
IgAC (cebador CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC (SEQ ID NO:66)
RT)
IgAC (1a PCR) ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTCAGGGTG ACTGATGGCG AAGAC (SEQ ID NO:67)
TS específico GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTCACCAT CGATGTCGAC (1a PCR) ACGCCTA (SEQ ID NO:68)
for (2a PCR) AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACAC XXXXXX ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCT (SEQ ID NO:69)
rev (2a PCR) CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGAT XXXXXX GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCT (SEQ ID NO:70)
La mayoría de los segmentos génicos VA y JA humanos funcionales incluidos en el locus LiK en ratones genomanipulados ilustrados en el presente documento se representaron en el repertorio de anticuerpos expresados de ratones LiK que comprendían una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA de ratón en el locus kappa endógeno (datos no mostrados). En general, los inventores observaron que los linfocitos B de los ratones LiK expresaban anticuerpos que tenían cadenas ligeras expresadas del locus LiK como era de esperar. No se observaron productos de corte y empalme alterados, inserciones, eliminaciones ni mutaciones inesperadas en los transcritos analizados. Estos resultados confirman que la recombinación en el locus LiK genera cadenas ligeras funcionales como parte del repertorio de anticuerpos de estos ratones. Se realizó un análisis similar en ratones que comprendían una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA humano en el locus kappa endógeno, en donde se detectó la expresión de una pluralidad de segmentos génicos VA y JA humanos (datos no mostrados).
Ejemplo 3.3. Expresión de anticuerpos en ratones que tienen un locus de cadena ligera genomanipulado
Este ejemplo demuestra la expresión de anticuerpos (por ejemplo, IgG) de ratones, cuyos anticuerpos contienen cadenas ligeras caracterizadas por la presencia de regiones VA humanas y regiones CA de ratón, y cuyas cadenas ligeras se expresan a partir de un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina de ratón endógeno genomanipulado. Entre otras cosas, este ejemplo demuestra específicamente la expresión de anticuerpos IgG (en formas diméricas y monoméricas) en el suero de ratones cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno que comprende la inserción de uno o más segmentos génicos VA humanos, uno o más segmentos génicos JA humanos y un gen CA de ratón, cuyos segmentos génicos VA y JA humanos están unidos operativamente a dicho gen CA de ratón, y cuyo gen CA de ratón se inserta en el lugar de un gen Ck de ratón de un locus de cadena ligera de IgK de ratón endógeno.
Se extrajo sangre de ratones de tipo natural (WT, 75 % de C57BL/6NTac 25 % de 129SvEvTac) y homocigotos 6558 ("LiK", 75 % de C57BL/6NTac 25 % de 129SvEvTac). El suero se separó de la sangre usando tubos Eppendorf centrifugados a 9000 rpm durante cinco minutos a 4 °C. El suero recogido se usó para inmunotransferencia para identificar la expresión de anticuerpos IgG.
Los sueros de los ratones se diluyeron 1:100 o 1:500 en PBS (sin Ca2+ y Mg2+) y se ejecutaron en geles Novex Tris-Glicina al 4-20 % en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las transferencias se bloquearon durante una noche con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,05 % (TBST, Sigma). Las membranas de PVDF se expusieron al anticuerpo primario (anti mlgGl de cabra conjugado con HRP, Southern Biotech) diluidos 1:1000 en leche desnatada al 0,1 % en TBST durante una hora a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron cuatro veces durante diez minutos por lavado y se revelaron durante cinco minutos con el reactivo de detección por transferencia western Amersham ECL (GE Healthcare Life Sciences) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, se obtuvieron imágenes de las transferencias usando el sistema de documentación en gel de cámara CCD refrigerado ImageQuant LAS-4000 de GE Healthcare. Las imágenes se capturaron a intervalos de 15 segundos hasta que se capturaron 20 imágenes o las imágenes estuvieron completamente expuestas, lo que ocurriera primero. Los resultados representativos se exponen en la figura 13 (los números de los carriles se indican en la parte superior de cada imagen de gel y las asignaciones de los carriles son las mismas para ambas imágenes; parte superior izquierda: muestras reducidas; parte inferior izquierda: muestras no reducidas; LiK HO: homocigoto 6558; WT: tipo natural; los pesos moleculares se indican a la izquierda de cada imagen de gel).
Como se muestra en la figura 13, el tamaño de los anticuerpos IgG expresados en ratones LiK es similar al tamaño observado para los anticuerpos IgG expresados en ratones de tipo natural, lo que demuestra que los ratones LiK producen anticuerpos funcionales que se unen al antígeno y pueden usarse como un sistema in vivo para la producción de anticuerpos humanos y componentes de anticuerpos humanos para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades humanas.
Ejemplo 4. Generación y caracterización de ratones que comprenden varios locus de inmunoglobulina genomanipulados
Los ratones LiK, como se describe en el presente documento, se crían por separado con múltiples cepas de ratones genomanipulados durante múltiples reproducciones usando técnicas conocidas en la técnica para establecer cepas de ratones que contienen los siguientes locus de inmunoglobulina genomanipulados: (1) una cepa de ratón homocigota para la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940), homocigota para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA como se describe en el presente documento, y homocigota para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511), en algunas realizaciones, denominados en el presente documento ratones HoH/LiK/A'/_, (2) una cepa de ratón homocigota para un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (anterior), homocigota para un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado (anteriormente), y hemicigota para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que tiene un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA como se describe en el presente documento, y un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón endógeno (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940), en algunas realizaciones, denominados en el presente documento como ratones HoH/KoK/LiK/A^. Como alternativa, dichos ratones pueden generarse mediante la introducción de vectores de direccionamiento que comprenden locus genomanipulados en células ES que ya comprenden varios locus de inmunoglobulina genomanipulados. En algunas realizaciones, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina en dichos ratones comprende un gen Adam6 de ratón funcional y expresado. Específicamente, los ratones LiK se cruzaron con múltiples cepas de ratones genomanipulados durante múltiples cruces para establecer ratones HoH/LiK/A'/' y HoH/KoK/LiK/A^.
Una vez establecidos, se caracterizaron diversas poblaciones de células inmunitarias en estos ratones humanizados mediante citometría de flujo. Brevemente, se recogieron bazos y fémures de ratones HoH/LiK/A'^n = 3), HoH/KoK/LiK/A-'-(n = 4) y VELOCIMMUNE® ("HoH/KoK"; n = 3; véanse las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940) y se prepararon para análisis de citometría de flujo como se ha descrito anteriormente. Los resultados representativos se exponen en las figuras 8-11. La expresión promedio de cadena ligera (k:A) observada en los esplenocitos de las cepas de ratón genomanipuladas ensayadas fue aproximadamente de la siguiente manera: HoH/LÍK/A-/-: 0:100, HoH/KoK/UK/A-/-: 40:60, HoH/KoK: 85:15.
Ejemplo 5. Producción de anticuerpos en ratones genomanipulados
Este ejemplo demuestra la producción de anticuerpos en un ratón que comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado como se ha descrito anteriormente usando un antígeno de interés (por ejemplo, una proteína de membrana de un solo paso o de múltiples pasos, etc.). Los métodos descritos en este ejemplo, o los métodos de inmunización bien conocidos en la técnica, se pueden usar para inmunizar ratones que contienen un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado como se describe con diversos antígenos (por ejemplo, polipéptidos, etc.). Cualquier ratón modificado genéticamente descrito anteriormente en el presente documento, por ejemplo, ratones LiK - ratones que comprenden un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VA y JA humanos unidos operativamente a un gen CA (tales como ratones homocigotos para el locus LiK); ratones HoH/LiK/A-/- - ratones que comprenden un locus LiK (tales como ratones homocigotos para el locus LiK) y también que comprenden locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940) y un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511); y ratones HoH/KoK/LiK/A-/- - ratones hemicigotos para un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que tiene un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende LiK y el segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos Vk y Jk humanos unidos operativamente a un gen Ck de ratón endógeno (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940), y también que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.642.835 y 8.697.940) y un locus de cadena ligera A de inmunoglobulina endógeno inactivado (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.006.511), puede usarse para la producción de anticuerpos después de la inmunización con un antígeno de interés. Dichos ratones son adecuados para la inmunización y producción de anticuerpos humanos y/o fragmentos de anticuerpos humanos.
Los ratones LiK que además incluyen los locus de inmunoglobulina genomanipulados descritos anteriormente se exponen a un antígeno de interés usando métodos de inmunización conocidos en la técnica. La respuesta inmunitaria del anticuerpo se controla mediante un inmunoensayo ELISA (es decir, valor en suero). Cuando se consigue una respuesta inmunitaria deseada, los esplenocitos (y/u otro tejido linfático) se recogen y se fusionan con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas de células de hibridoma inmortales. Las líneas de células de hibridoma se criban (por ejemplo, mediante un ensayo ELISA) y se seleccionan para identificar las líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos específicos de antígeno. Los hibridomas pueden caracterizarse adicionalmente por su afinidad de unión relativa e isotipo, según se desee. Usando esta técnica y el inmunógeno descrito anteriormente, se obtienen varios anticuerpos quiméricos específicos de antígeno (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón).
El ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadenas ligeras puede aislarse o prepararse de otro modo, y puede unirse a las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera humana (por ejemplo, de un isotipo deseado) para la preparación de anticuerpos completamente humanos. Dichos anticuerpos completamente humanos (y/o cadenas pesadas o ligeras de los mismos) se pueden producir en una célula, típicamente una célula de mamífero tal como una célula CHO. A continuación, los anticuerpos completamente humanos pueden caracterizarse por la afinidad de unión relativa y/o la actividad neutralizante del antígeno de interés.
El ADN que codifica anticuerpos quiméricos específicos de antígeno producidos por linfocitos B de los ratones genomanipulados descritos y/o ilustrados en el presente documento, y/o los dominios variables de cadenas ligera y/o pesada de los mismos, puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón pueden aislarse y caracterizarse de modo que se definan los anticuerpos particulares (y/o los linfocitos B que los producen) de interés. Por proporcionar unos pocos ejemplos, las características evaluadas de dichos anticuerpos y/o regiones variables y/o constantes de los mismos, pueden ser o incluir uno o más de afinidad, selectividad, identidad de epítopo, etc.
Las regiones constantes de ratón se reemplazan por una región constante humana deseada para generar anticuerpos completamente humanos. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. Como alternativa, cuando se emplean ratones LiK que contienen un gen CA2 humano en el lugar de un gen Ck de ratón como se describe en el presente, se omite la etapa de reemplazar una región constante de ratón en un anticuerpo aislado de un ratón inmunizado. Los anticuerpos específicos de antígeno también se aíslan directamente de linfocitos B antígeno positivos (de ratones inmunizados) sin fusión con células de mieloma, como se describe en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 7.582.298. Con este método, se produjeron varios anticuerpos específicos de antígeno completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos).
Ejemplo 6. Generación de ratones que tienen un locus de cadena ligera genomanipulado y que expresan el gen de la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) humana
Ejemplo 6. 1. Generación de ratones que tienen un locus de cadena ligera genomanipulado y que expresan TDT humana
Este ejemplo ilustra la generación de ratones cuyo genoma de línea germinal comprende un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y que expresan además TdT humana. Los ratones que expresaban TdT humana se prepararon como se describe en el Ejemplo 1.1. del documento WO 2017/210586. Se generaron ratones que tenían un genoma que comprendía tanto un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina genomanipulado como se describe en el presente documento y que expresaban además TdT humana mediante cruces múltiples para establecer cohortes de cepas de ratones que contenían ambas modificaciones.
Ejemplo 6. 2. Evaluación fenotípica de ratones que tienen un locus kappa genomanipulado y que expresan TDT humana
Una vez establecidos, las poblaciones de células inmunitarias se caracterizaron en estos ratones humanizados mediante citometría de flujo. Brevemente, se recogieron bazos y fémures de ratones HoH/LiK/A-/-/TdT (n = 4) y HoH/KoK/LiK/A-/7TdT (n = 6) y se prepararon por análisis de citometría de flujo como se ha descrito anteriormente (véase el Ejemplo 3 anterior). Los resultados representativos se exponen en las figuras 14-17. La expresión promedio de cadena ligera (k:A) observada en los esplenocitos de las cepas de ratón genomanipuladas ensayadas fue de la siguiente manera: HoH/LiK/A-/-/TdT: 0:100, HoH/KoK/LiK/A-/-/TdT: 45:55.
Ejemplo 6. 3. Diversidad de unión kappa de inmunoglobulina humana y adiciones no germinales en ratones LiK que comprenden TdTS humana
Como se demuestra en el documento WO 2017/210586, los ratones que comprendían TdT introducida exógenamente mostraron aumentos tanto en la diversidad de unión como en las adiciones de nucleótidos no germinales (también "adiciones de nucleótidos sin plantilla" como se usa en el presente documento) en sus cadenas ligeras. Los ratones que comprendían HoH/LiK/A-/-/TdT y HoH/KoK/LiK/A-/-/TdT se evaluaron para determinar la diversidad de secuencias de su repertorio de inmunoglobulinas y la presencia de adiciones de nucleótidos sin plantilla en su CDR3 usando tecnología de secuenciación de próxima generación.
Brevemente, se recogieron esplenocitos de ratones y los linfocitos B se enriquecieron positivamente a partir de esplenocitos totales mediante perlas magnéticas anti CD19 de ratón y columnas MACS (Miltenyi Biotech). Se aisló el a Rn total de los linfocitos B esplénicos usando el kit RNeasy Plus (Qiagen).
Se realizó la transcripción inversa con un cebador oligo-dT seguido de una PCR específica del gen para generar ADNc que contenía la secuencia CA1 de ratón, usando el kit de amplificación de ADNc SMARTer™ RACE (Clontech). Durante la transcripción inversa, una secuencia de a Dn específica (PIIA: 5'-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3', SEQ ID NO: 71) se fijó al extremo 3' de los a Dnc recién sintetizados. Los ADNc se purificaron mediante el kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit (Clontech), luego se amplificaron aún más usando un cebador complementario inverso a PIIA (5' - AAGCAGTGg T ATCAa Cg CAG AG- tAcAT - 3', SEQ ID NO:72) emparejado con un cebador específico de CA1 de ratón (5'-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3', SEQ ID NO:73).
A continuación, los amplicones purificados se amplificaron mediante PCR usando un cebador específico de PIIA (5'-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAG TGGTATCAAC GCAGAGT-3', SEQ ID NO:74 y un cebador específico de CA1 de ratón anidado (5' -ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGgTg G AAACAGg Gt G ACTGATG-3', SEQ ID NO:75. Se aislaron productos de PCR entre 450-690 pb y se recogieron mediante Pippin Prep (SAGE Science). Estos fragmentos se amplificaron adicionalmente mediante PCR usando los siguientes cebadores: 5'-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATC-3', SEQ ID NO:76 y 5'-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXX GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCT-3', SEQ ID NO:77 ("XXXXXX" representa una secuencia de índice de 6 pb para permitir la multiplexación de muestras para secuenciación). Se aislaron productos de PCR entre 490 pb-710 pb y se recogieron por Pippin Prep, después se cuantificaron por qPCR usando un kit de cuantificación de bibliotecas KAPA (KAPA Biosystems) antes de la carga en el secuenciador Miseq (Illumina) para la secuenciación (v3, 600 ciclos).
Para el análisis bioinformático, las secuencias de Illumina resultantes se desmultiplexaron y recortaron para mejorar la calidad. Después, se ensamblaron y se anotaron las lecturas de pares de extremos solapantes mediante la instalación local de igblast (NCBI, v2.2.25+). Las lecturas se alinearon con la base de datos de segmentos VA y JA de línea germinal humana y se clasificaron según el mejor resultado. Una secuencia se marcó como ambigua y se eliminó del análisis cuando se detectaron múltiples mejores resultados con idéntica puntuación. Se desarrolló un conjunto de scripts en perl internos para analizar los resultados.
Las cadenas ligeras lambda de linfocitos B esplénicos de ratones HoH/LiK/A'/'/TdT, y tanto las cadenas ligera lambda

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un ratón modificado genéticamente, cuyo genoma de línea germinal comprende:
un primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos VA humanos,
(b) uno o más segmentos génicos JA humanos, y
(c) un gen CA de ratón,
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están en el lugar de uno o más segmentos génicos Vk de ratón endógenos y uno o más segmentos génicos Jk de ratón endógenos;
en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) están unidos operativamente al gen CA de ratón de (c);
en donde el ratón modificado genéticamente comprende una población de linfocitos B que expresan anticuerpos, en donde los anticuerpos incluyen cadenas ligeras A de inmunoglobulina que incluyen cada una un dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana; y
en donde el ratón modificado genéticamente carece de un gen Ck de ratón en el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
2. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 1, en donde el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
3. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 1, en donde el ratón modificado genéticamente es heterocigoto para el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
4. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 3, en donde el genoma de línea germinal del ratón modificado genéticamente comprende un segundo locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos Vk humanos, y
(b) uno o más segmentos génicos Jk humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vk humanos y el uno o más segmentos génicos Jk humanos están unidos operativamente a un gen Ck.
5. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el genoma de línea germinal del ratón comprende además:
un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado, que comprende:
(a) uno o más segmentos génicos Vh humanos,
(b) uno o más segmentos génicos Dh humanos, y
(c) uno o más segmentos génicos Jh humanos,
en donde el uno o más segmentos génicos Vh humanos de (a), el uno o más segmentos génicos Dh humanos de (b), y el uno o más segmentos génicos Jh humanos de (c) están unidos operativamente a uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
6. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 5, en donde el uno o más segmentos génicos VH humanos de (a), uno o más segmentos génicos DH humanos de (b), y uno o más segmentos génicos JH humanos de (c) están en el lugar de uno o más segmentos génicos VH de ratón, uno o más segmentos génicos DH de ratón, uno o más segmentos génicos JH de ratón, o una combinación de los mismos.
7. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 5 o 6, en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado comprende además:
(i) una o más secuencias no codificantes de VH humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos VH humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de VH aparece de forma natural adyacente a un segmento génico VH humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno;
(ii) una o más secuencias no codificantes de DH humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos DH humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes de DH aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Dh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno;
(iii) una o más secuencias no codificantes de Jh humano, cada una de las cuales está adyacente al menos al uno o más segmentos génicos Jh humanos, en donde cada una de la una o más secuencias no codificantes Jh aparece de forma natural adyacente a un segmento génico Jh humano en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana endógeno; o
(iv) cualquier combinación de las mismas.
8. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón son uno o más genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógenos.
9. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde:
(i) el uno o más segmentos génicos Vh humanos comprenden Vh3-74, Vh3-73, Vh3-72, Vh2-70, Vh1-69, Vh3-66, Vh3-64, Vh4-61, Vh4-59, Vh1-58, Vh3-53, Vh5-51, Vh3-49, Vh3-48, Vh1-46, Vh1-45, Vh3-43, Vh4-39, Vh4-34, Vh3-33, Vh4-31, Vh3-30, Vh4-28, Vh2-26, Vh1-24, Vh3-23, Vh3-21, Vh3-20, Vh1-18, Vh3-15, Vh3-13, Vh3-11, Vh3-9, Vh1-8, Vh3-7, Vh2-5, Vh7-4-1, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2, Vh6-1, o una combinación de los mismos,
(ii) el uno o más segmentos génicos Dh humanos comprenden Dh1-1, Dh2-2, Dh3-3, Dh4-4, Dh5-5, Dh6-6, Dh1-7, Dh2-8, Dh3-9, Dh3-10, Dh5-12, Dh6-13, Dh2-15, Dh3-16, Dh4-17, Dh6-19, Dh1-20, Dh2-21, Dh3-22, Dh6-25, Dh1-26, DH7-27, o una combinación de los mismos, y
(iii) el uno o más segmentos génicos Jh humanos comprenden Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o una combinación de los mismos.
10. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el ratón modificado genéticamente es homocigoto para el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno genomanipulado.
11. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) y el uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) reemplazan uno o más segmentos génicos Vk de ratón, uno o más segmentos génicos Jk de ratón, o una combinación de los mismos.
12. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer locus de cadena ligera k de inmunoglobulina endógeno genomanipulado comprende además una secuencia no codificante de cadena ligera k entre el uno o más segmentos génicos VA humanos y el uno o más segmentos génicos JA humanos.
13. El ratón modificado genéticamente de la reivindicación 12, en donde la secuencia no codificante de cadena ligera k tiene una secuencia que aparece de forma natural entre un segmento génico Vk4-1 humano y un segmento génico Jk1 humano en un locus de cadena ligera k de inmunoglobulina humana endógeno.
14. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los segmentos génicos VA endógenos, los segmentos génicos JA endógenos y los segmentos génicos CA endógenos se eliminan en su totalidad o en parte.
15. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada dominio variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana está codificado por una por una secuencia de región variable de cadena ligera A de inmunoglobulina humana reordenada que comprende (i) uno del uno o más segmentos génicos VA humanos de (a) o una variante hipermutada somáticamente de los mismos, y (ii) uno del uno o más segmentos génicos JA humanos de (b) o una variante hipermutada somáticamente de los mismos.
16. El ratón modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el genoma de línea germinal comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) exógena unida operativamente a un elemento de control transcripcional.
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