BR112020025279B1 - Método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região de diversidade de cadeia pesada manipulada (dh) e método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região dh manipulada - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA NUCLEOTÍDICA, VETOR DE DIRECIONAMENTO, MÉTODOS DE MODIFICAÇÃO DE UMA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA DE IMUNOGLOBULINA, DE PRODUÇÃO DE UM ROEDOR E DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO OU OBTENÇÃO DEUM ÁCIDO NUCLEICO, LOCUS DE CADEIA PESADA DE IMUNOGLOBULINA, GENOMA DE ROEDOR, GENOMA DE ROEDOR DE LINHAGEM GERMINATIVA, ROEDOR OU CÉLULA DE ROEDOR, E, HIBRIDOMA. São fornecidos animais não humanos e métodos e composições para produção e uso dos mesmos, em que os animais não humanos possuem um genoma compreendendo um cluster de diversidade manipulado ou recombinante dentro de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, em que o cluster de diversidade manipulado ou recombinante compreende uma inserção de um ou mais segmentos DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma sequência sinal de recombinação de 23 mer. Também são fornecidos métodos para a produção de anticorpos a partir de animais não humanos, em que os anticorpos contêm, opcionalmente, regiões variáveis humanas e de roedor, por exemplo, regiões constantes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 U.S.C. § 119(3) dos Pedidos de Patente Provisórios US N° 62/685,203 (depositado em 14 de junho de 2018), 62/702,206 (depositado em 23 de julho de 2018) e 62/812,580 (depositado em 1 de março de 2019), cada um dos pedidos está incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] Uma cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um nome de arquivo de “10347_ST25.txt”, que foi criado em 13 de junho de 2019, tem um tamanho de cerca de 50 quilobytes, e está depositada simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e está incorporada neste documento por referência na sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[003] Os produtos de anticorpos monoclonais revolucionaram a indústria biofarmacêutica e alcançaram avanços significativos no tratamento de várias doenças. Muitos desses produtos de anticorpos monoclonais aproveitaram as características naturais das moléculas de anticorpos (isto é, segmentos de gene de imunoglobulina tradicionais) e, em alguns casos, incorporaram outras características, tais como marcação (por exemplo, peguilado, radiomarcado) ou conjugação com outros medicamentos. Na taxa atual de aprovação, espera-se que aproximadamente 70 produtos de anticorpos monoclonais estejam no mercado até 2020. Apesar desses avanços e do conhecimento adquirido pelo uso de anticorpos monoclonais para uso terapêutico, as doenças ligadas a alvos que são difíceis para anticorpos monoclonais se ligarem e/ou o acesso persistirem, o que destaca a necessidade de diferentes abordagens para o desenvolvimento de tratamentos eficazes.

[004] O estado da técnica é aqui representado por Kobuku, F et al.(“Diverse organization of immunoglobulin VH gene loci in a primitive vertebrate”. The EMBO Journal vol.7 no. 1 1 pp.3413 - 3422, 1988); Briney, BS et al. (“Frequency and genetic characterization of V(DD)J recombinants in the human peripheral blood antibody repertoire”. Immunology, 137, 5664, 2012); e BR112014006394A2 (2017).

[005] Em particular, Briney, BS et al. revelam a ocorrência de CDR3 humanos prolongados devido a fusão D-D (ou recombinação V(DD)J) (introdução). Briney, BS et al. não revelam o mecanismo pelo qual ocorre a fusão D-D, ponderando que esta perverteria a regra 12/23. A presente invenção se propõe a favorecer eventos de recombinação V(DD)J mediante a substituição das regiões RSS flanqueadoras de segmentos D. Em humanos, normalmente se verifica que segmentos D são flanqueados por RSS de 12mer em ambas as extremidades 5’ e 3’, a substituição de uma das RSS de 12mer por uma RSS de 23mer em um dado segmento D favoreceria a recombinação desta com os segmentos D não rearranjados.

[006] Nesse aspecto, BR112014006394A2 propõe empregar a regra 12/23 para o desenho de loci sintéticos para obtenção de imunoglobulinas de CDR3 prolongado a partir de animais transgênicos (parágrafos 144 a 155). Mais especificamente, BR112014006394A2 revela configurações de loci sintéticos compreendendo segmentos D flanqueados nas extremidades 5’ ou 3’ por RSS de 23mer, referido como RSS de duas vezes. Entretanto, as configurações reveladas por BR112014006394A2 falham em detalhamento que permitam inferir configurações que compreendam segmentos D com RSS modificados e segmentos D com RSS natural (não rearranjados), condição na qual se observaria de fato os eventos V(DD)J.

[007] Nesse aspecto, ainda é relevante citar o documento Kobuku, F et al., o qual revela espécie de tubarão onde alguns segmentos DH encontram- se flanqueados por RSS de 23mer no lado 3’. Mais especificamente, Kobuku, F et al. revelam a configuração VH[23] [12]D1[23] [12]D2[12] [23]J (figura 1). Entretanto, o estado da técnica não identifica a correlação explícita entre essa configuração particular do loci e CDR3 prolongado.

SUMÁRIO

[008] A presente invenção engloba o reconhecimento de que é desejável manipular animais não humanos (por exemplo, um roedor (por exemplo, um rato, por exemplo, um camundongo) para estabelecer sistemas in vivo adicionais para identificar e desenvolver novas terapêuticas baseadas em anticorpos e, em algumas modalidades, agentes de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou fragmentos destes), que podem ser usados para o tratamento de uma variedade de doenças. Além disso, a presente invenção também engloba o desejo de animais não humanos em ter uma diversidade de cadeia pesada manipulada (DH) cluster (ou região DH manipulada) dentro de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina heteróloga, por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana) compreendendo um ou mais segmentos de DH manipulados para estar operacionalmente ligados a uma sequência de sinal de recombinação que permite rearranjo de DH para DH, o que pode levar ao aumento da expressão de anticorpos contendo região determinante de complementariedade três (CDR3s) que são caracterizadas por um comprimento de aminoácidos mais longo em comparação com CDR3s do tipo selvagem (ou de referência) e por diversidade que, em algumas modalidades, direciona a ligação a antígenos particulares. Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento fornecem sistemas in vivo para o desenvolvimento de anticorpos e/ou terapêuticos baseados em anticorpos para administração a humanos.

[009] São descritas neste documento moléculas de nucleotide compreendendo pelo menos um segmento gênico de diversidade de cadeia pesada de imunoglobulina (DH) operacionalmente ligado a uma sequência sinal de recombinação de 23-mer (RSS), opcionalmente em que o segmento gênico DH pode estar localizado dentro de uma região DH manipulada, por exemplo, de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada). Como tal, em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento compreende uma região Diversidade de cadeia pesada de imunoglobulina manipulada (DH) que compreende pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a um 23-mer (RSS). Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende (i) pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e (ii) um segmento gênico DH flanqueado em um lado por uma RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, em que (i) pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e o (ii) segmento gênico DH de linhagem germinativa flanqueado em um lado por uma RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer são operacionalmente ligados de modo que (i) e (ii) são capazes de se unirem em um evento de recombinação de DH-DH, de acordo com a regra 12/23. São fornecidos também vetores de direcionamento, animais não humanos (por exemplo, roedores (por exemplo, ratos ou camundongos)) e células animais não humanas (por exemplo, células de roedores (por exemplo, células de ratos ou células de camundongos) compreendendo uma molécula nucleotídica descrita neste documento, métodos de uso de uma molécula nucleotídica descrita neste documento, etc.

[0010] Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 19 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 20 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 23 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 28 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 31 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende pelo menos 37 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH2 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH2 compreende pelo menos 30 nucleotídeos e/ou codifica duas cisteínas. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH selecionado do grupo consistindo em um segmento gênico DH3-3 humano, um segmento gênico DH3-9 humano, um segmento gênico DH3-10 humano, um segmento gênico DH3-16 humano, um segmento gênico DH3-22 humano, um segmento gênico DH2-2 humano, um segmento gênico DH2-8 humano, ou um segmento gênico DH2-15 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH humano selecionado do grupo consistindo em um segmento gênico DH3-3 humano, um segmento gênico DH2-2 humano, um segmento gênico DH2-8 humano e um segmento gênico DH2-15 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH humano selecionado do grupo consistindo em um segmento gênico DH3-3 humano, um segmento gênico DH2-2 humano, um segmento gênico DH2-8 humano e um segmento gênico DH2-15 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende um segmento gênico DH3-3 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende o segmento gênico DH2-2 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende um segmento gênico DH2-8 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano compreende um segmento gênico DH2-15.

[0011] Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende: (a) um segmento gênico DH3-3 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 5’ do segmento gênico DH3-3 humano, (b) um segmento gênico DH2-2 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-2 humano, (c) um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-8 humano, (d) um segmento gênico 2-15 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-15 humano, ou (e) qualquer combinação de (a)-(d)

[0012] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma região DH manipulada, como uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência estabelecida como SEQ ID NO: 52.

[0013] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma região DH manipulada, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência estabelecida como SEQ ID NO: 61.

[0014] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma região DH manipulada, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência estabelecida como SEQ ID NO: 70.

[0015] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma região DH manipulada, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência estabelecida como SEQ ID NO: 71.

[0016] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma região DH manipulada, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência estabelecida como SEQ ID NO: 72.

[0017] Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende de 5' a 3' do RSS de 23-mer e o segmento gênico DH, por exemplo compreende de 5' a 3' de uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH (humano), e uma RSS de 12-mer, por exemplo, RSS de 23-mer é contígua à extremidade 5' do segmento gênico DH, por exemplo, o segmento gênico DH é operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5'. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH operacionalmente ligado a RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH3-3 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', por exemplo, a molécula de nucleotídeo compreende de 5' a 3' de uma RSS de 23-mer, o segmento gênico DH3-3 humano e uma RSS de 12-mer.

[0018] As regiões de DH manipuladas compreendendo pelo menos um segmento gênico DH com uma RSS de 23-mer de extremidade 5' pode compreender adicionalmente um segmento gênico DH não rearranjado que é flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer (por exemplo, o segmento gênico DH não rearranjado que é flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer compreende um segmento gênico DH de linhagem germinativa, por exemplo, um segmento gênico DH em sua configuração de linhagem germinativa, etc.), em que o segmento gênico DH não rearranjado está a montante de, e operacionalmente ligado a, pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma extremidade 5’ de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer compreende um segmento gênico DH humano não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer.

[0019] Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende de 5' a 3' do segmento gênico DH e RSS de 23-mer, por exemplo, compreende de 5' a 3' de uma RSS de 12-mer, um segmento gênico DH (humano), e uma RSS de 23-mer, por exemplo, RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH, por exemplo, o segmento gênico DH é operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 3', etc. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma extremidade 3’ de RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH2 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 3', em que o segmento gênico DH2 é selecionado do grupo consistindo em um segmento gênico DH2-2 humano, um segmento gênico DH2-8 humano e um segmento gênico DH2-15 humano. Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende de 5’ a 3’: um segmento gênico DH2-2 humano operacionalmente ligado a uma extremidade 3’ de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 operacionalmente ligado a uma extremidade 3’ de RSS de 23-mer e um segmento gênico DH2- 15 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 3'. Em algumas modalidades, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 3' compreende de 5’ a 3’: uma primeira sequência de nucleotídeos contínua compreendendo uma RSS de 12-mer, um segmento gênico DH2-2 humano, e uma RSS de 23-mer, uma segunda sequência de nucleotídeos contínua compreendendo uma RSS de 12-mer, um segmento gênico DH2-8 humano, e uma RSS de 23-mer, e uma terceira sequência de nucleotídeos contínua compreendendo uma RSS de 12-mer, um segmento gênico DH2-15 humano, e uma RSS de 23-mer.

[0020] As regiões de DH manipuladas compreendendo pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma extremidade 3’ de RSS de 23-mer pode compreender adicionalmente um segmento gênico DH não rearranjado que é flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer (por exemplo, o segmento gênico DH não rearranjado que é flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer pode compreender um segmento gênico DH de linhagem germinativa, por exemplo, um segmento gênico DH em sua configuração de linhagem germinativa, etc.), em que o segmento gênico DH flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro por RSS de 12-mer está a jusante de, e operacionalmente ligado a, pelo menos o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma extremidade de 3’ de RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer compreende um segmento gênico DH humano não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer.

[0021] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, compreende (i) um ou mais segmentos gênicos DH humanos não rearranjados, em que cada um dentre um ou mais segmentos gênicos DH humanos é flanqueado em suas extremidades 5' e 3' por uma RSS de 12-mer e (ii) pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreendendo um segmento gênico DH humano, por exemplo, um segmento gênico DH3-3 humano) operacionalmente ligado em sua extremidade 5’ a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, compreende de 5’ a 3’ de (i) pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, pelo menos um segmento gênico DH2 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3’ a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que pelo menos um segmento gênico DH2 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH2-2 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3’ a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, ou qualquer combinação destes, e (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humano, em que cada um de um ou uma pluralidade de segmentos gênicos DH humanos é flanqueado nas suas extremidades 5' e 3' por uma RSS de 12-mer.

[0022] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende um segmento gênico DH humano.

[0023] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento (por exemplo, regiões DH manipuladas, regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina, etc.) compreende um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e um segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, em que o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e o segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer não passaram por recombinação com (i) outro segmento gênico DH, (ii) um segmento gênico VH, (iii) um segmento gênico JH, ou (iv) qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, as moléculas de nucleotídeos descritas neste documento incluem moléculas compreendendo regiões DH manipuladas compreendendo um ou mais segmentos gênicos DH que recombinaram-se com (i) outro segmento gênico DH, (ii) um segmento gênico VH, (iii) um segmento gênico JH, ou qualquer combinação destes, por exemplo, moléculas de nucleotídeos compreendendo uma sequência codificadora de VDJ ou VDDJ rearranjado que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0024] Da mesma forma, em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, compreende adicionalmente em ligação operacional: (a) pelo menos um segmento gênico variável de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjado (VH) (por exemplo, um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado) que está a montante de, e operacionalmente ligado a, uma região DH manipulada, (b) pelo menos um segmento gênico união de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjado (JH) (por exemplo, um JH6 humano não rearranjado), segmento gênico que está a jusante de, e operacionalmente ligado a, a região DH, ou uma combinação de (a) e (b).

[0025] Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais que se estendendo entre, e incluindo, os segmentos gênicos VH3-74 humanos não rearranjados e VH1-6 humanos não rearranjados. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais que se estendendo entre, e incluindo, os segmentos gênicos VH3-74 humanos não rearranjados e VH1-6 humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado, e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado em configuração de linhagem germinativa.

[0026] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, por exemplo, compreende uma ligação operacional de 5' a 3': (a) pelo menos um segmento gênico variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) não rearranjado, (b) uma região DH manipulada compreendendo pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e (c) pelo menos um segmento gênico de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina (JH) não rearranjado.

[0027] Em algumas modalidades, (a) pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende (i) um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, (ii) um segmento gênico VH2-1 humano não rearranjado e um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado e/ou (iii) todos os segmentos gênicos VH humanos não rearranjados se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico VH3-74 humano não rearranjado ao segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, todos os segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais em configuração de linhagem germinativa, opcionalmente, em que o gene Adam6 de roedor substitui um pseudogene entre os segmentos gênicos VH2-1 e VH6-1 humanos não rearranjados; (b) a região DH manipulada compreende de 5’ a 3’ de: (i) um ou mais, por exemplo, uma pluralidade de, segmentos gênicos DH humanos não rearranjados, em que cada um da pluralidade de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados é flanqueado em suas extremidades 5’ e 3' por uma RSS de 12-mer, e um segmento gênico DH humano operacionalmente ligado em sua extremidade 5’ a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a pluralidade de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados compreendem os segmentos gênicos DH humanos não rearranjados se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico DH1-1 humano não rearranjado e segmento gênico DH1-26 humano não rearranjado em configuração de linhagem germinativa e/ou em que o segmento gênico humano operacionalmente ligado em sua extremidade 5’ a uma RSS de 23-mer é um segmento gênico DH3-3 humano, por exemplo, em que o DH manipulado compreende o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa com a exceção do segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado, que é substituído pelo segmento gênico DH3-3 operacionalmente ligado a uma extremidade 5' de RSS de 23-mer; (ii) pelo menos um segmento gênico DH humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS e 23-mer, e um ou mais de, por exemplo, uma pluralidade de, segmentos gênicos DH humanos, em que cada um do um ou da pluralidade de segmentos gênicos DH humanos é flanqueado em suas extremidades 5’ e 3’ por uma RSS de 12-mer, opcionalmente em que pelo menos um segmento gênico DH humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado em sua extremidade 3’ a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e/ou em que um ou uma pluralidade de segmentos gênicos DH humanos compreendem os segmentos gênicos DH se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico DH1-1 humano não rearranjado e o segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado, opcionalmente em que o DH manipulado compreende o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa com a exceção de que os segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15 humanos não rearranjados são respectivamente substituídos por um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer; (iii) ou uma combinação de (b)(i) e (b)(ii);e (c) pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende (i) um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, (ii) um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, e/ou (iii) o repertório completo de segmentos gênicos JH humanos não rearranjados, por exemplo, um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, opcionalmente em que os segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6 humanos não rearranjados estão na configuração de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a região VH de imunoglobulina (compreendendo pelo menos um segmento gênico VH funcional, a região DH manipulada, e pelo menos um segmento gênico JH funcional) é uma região VH de imunoglobulina humana, por exemplo, cada segmento gênico (por exemplo, cada segmento gênico VH, DH e JH na mesma), incluindo o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, é um segmento gênico (VH, DH ou JH) humano.

[0028] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma região de imunoglobulina VH, conforme descrita neste documento, compreende em ligação operacional de 5' a 3' (a) pelo menos um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, todos ou uma porção de todos os segmentos gênicos funcionais de VH humanos não rearranjados funcionais se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico VH3-74 humano não rearranjado ao segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, opcionalmente incluindo um gene Adam6 de roedor entre dois segmentos gênicos VH humano não rearranjados, por exemplo, (por exemplo, em que o gene Adam6 de roedor está localizado entre um segmento gênico VH1-2 humano e um segmento gênico VH6-1 humano) (b) uma região DH manipulada humana compreendendo de 5’ a 3' os segmentos gênicos DH humanos se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico DH1-1 humano não rearranjado e o segmento gênico DH1-26 humano não rearranjado em configuração de linhagem germinativa e um segmento gênico DH3-3 humano rearranjado operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', por exemplo, o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa, com a exceção do segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado, que é substituído por um segmento gênico DH3-3 humano não rearranjado operacionalmente ligado a uma extremidade 5’ de RSS de 23- mer, e (c) pelo menos um segmento gênico JH6 humano não rearranjado.

[0029] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma região VH de imunoglobulina, conforme descrita neste documento, compreende em ligação operacional de 5' a 3': (a) pelo menos um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, todos ou uma porção de todos os segmentos gênicos funcionais de VH humanos não rearranjados funcionais se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico VH3-74 humano não rearranjado ao segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, opcionalmente incluindo um gene Adam6 de roedor entre dois segmentos gênicos VH humano não rearranjados, por exemplo, (por exemplo, em que o gene Adam6 de roedor está localizado entre um segmento gênico VH1-2 humano e um segmento gênico VH6-1 humano) (b) uma região DH manipulada humana compreendendo de 5’ a 3' os segmentos gênicos DH humanos se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico DH1-1 humano não rearranjado e o segmento gênico DH1-26 humano não rearranjado em configuração de linhagem germinativa e um segmento gênico DH3-3 humano rearranjado operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', por exemplo, o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa, com a exceção do segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado, que é substituído por um segmento gênico DH3-3 humano não rearranjado operacionalmente ligado a uma extremidade 5’ de RSS de 23- mer, e (c) um segmento gênico JH4 humano não reorganizado, um segmento gênico JH5 humano não reorganizado e um segmento gênico JH6 humano não reorganizado.

[0030] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma região VH de imunoglobulina, conforme descrita neste documento, compreende em ligação operacional de 5' a 3' (a) pelo menos um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, todos ou uma porção de todos os segmentos gênicos funcionais de VH humanos não rearranjados funcionais se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico VH3-74 humano não rearranjado ao segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, por exemplo, o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais, opcionalmente incluindo um gene Adam6 de roedor entre dois segmentos gênicos VH humano não rearranjados, por exemplo, (por exemplo, em que o gene Adam6 de roedor está localizado entre um segmento gênico VH1-2 humano e um segmento gênico VH6-1 humano) (b) uma região DH manipulada humana compreendendo de 5’ a 3’ de um segmento gênico DH1-1 humano não rearranjado, um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e os segmentos gênicos DH humanos não rearranjados se estendendo entre, e incluindo, o segmento gênico DH3-16 humano não rearranjado e o segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado, opcionalmente em que o DH manipulado compreende o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa com a exceção de que os segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15 humanos não rearranjados são respectivamente substituídos por um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, e (c) o repertório completo de segmentos gênicos JH humanos não rearranjados, por exemplo, um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, opcionalmente em que os segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6 humanos não rearranjados estão na configuração de linhagem germinativa.

[0031] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo, conforme descrita neste documento, compreende de 5' a 3' (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina (humana) compreendendo pelo menos um segmento gênico VH (humano), uma região DH manipulada (humana), conforme descrita neste documento, e pelo menos um segmento gênico JH (humano) operacionalmente ligado a (b) uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (CH) ou uma porção desta, opcionalmente em que CH é um CH de roedor que compreende uma região potencializadora de íntrons, um gene IgM de roedor, um gene IgD de roedor, um gene IgG de roedor, um gene IgA de roedor, um gene IgE de roedor, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo, conforme descrita neste documento, compreende de 5' a 3' (a) uma região VH de cadeia pesada humana compreendendo pelo menos um segmento gênico VH humano, uma região DH manipulada humana, conforme descrita neste documento, e pelo menos um segmento gênico JH humano operacionalmente ligado a (b) uma região CH de roedor compreendendo pelo menos uma região potencializadora de íntrons e opcionalmente um gene IgM de roedor. Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento compreende de 5' a 3' (a) uma região VH humana compreendendo pelo menos um segmento gênico VH humano, uma região DH manipulada humana, conforme descrita neste documento, e pelo menos um segmento gênico JH humano operacionalmente ligado a (b) uma região CH de roedor compreendendo pelo menos uma região potencializadora de íntrons de roedor e um gene IgM de roedor. Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo descrita neste documento compreende de 5' a 3' (a) uma região VH humana compreendendo pelo menos um segmento gênico VH humano, uma região DH manipulada humana, conforme descrita neste documento, e pelo menos um segmento gênico JH humano operacionalmente ligado a (b) uma região CH de roedor endógeno, por exemplo, em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor endógeno. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um rato. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um camundongo.

[0032] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeo, conforme descrita neste documento, compreende adicionalmente um gene Adam6 de roedor. Em algumas modalidades, o gene de Adam6 de roedor está localizado entre segmentos gênicos VH2-1 e VH6-1 humanos, por exemplo, substitui um gene de Adam6 humano localizado entre um segmento gênico VH2-1 e VH6-1 humano em configuração de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um rato. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um camundongo.

[0033] Em algumas modalidades, uma molécula de nucleotídeos, conforme descrita neste documento, compreende um ou mais cassetes de seleção de droga, por exemplo, um gene de resistência à droga flanqueado por um ou mais sítios de recombinação sítio-específicos, por exemplo, um gene de resistência à droga de neomicina flanqueado por um sítio de reconhecimento de recombinação sítio-específica loxP, em que pelo menos um dentre um ou mais cassetes de resistência à droga está opcionalmente imediatamente a montante de pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a molécula de nucleotídeo compreende uma sequência ilustrada na Figura 2.

[0034] São também descritos neste documento vetores de direcionamento, por exemplo, para modificar o genoma (por exemplo, o genoma de linhagem germinativa) de um animal não humano (por exemplo, um roedor, tal como um rato ou um camundongo) para compreender uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. Em geral, um vetor de direcionamento, conforme descrito neste documento, compreende qualquer uma das moléculas de nucleotídeos descritas neste documento e, opcionalmente, compreende braços de homologia 5'- e 3'- para recombinação homóloga dentro da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, opcionalmente em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada. Em algumas modalidades, um vetor de direcionamento, conforme descrito neste documento, compreende um braço de homologia 5' compreendendo um segmento gênico humano não rearranjado, por exemplo, um segmento gênico VH6-1 e/ou um braço de homologia 3' compreendendo uma região ou porção de CH de roedor (por exemplo, camundongo), por exemplo, uma região potencializadora de íntrons CH de roedor (camundongo) e/ou gene IgM de roedor (camundongo).

[0035] Em algumas modalidades, um vetor de direcionamento compreende uma molécula de nucleotídeo, conforme descrita neste documento, e braços de homologia 5'- e 3'- configurados para permitir a recombinação homóloga com uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina, cuja sequência de cadeia pesada de imunoglobulina pode opcionalmente estar localizada em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor endógeno e/ou compreender uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada. Em algumas modalidades, um vetor de direcionamento, conforme descrito neste documento, compreendendo um braço de homologia 5' compreendendo um segmento gênico humano não rearranjado (por exemplo, um segmento gênico VH6-1), uma região DH manipulada humana, pelo menos um segmento gênico JH humano não rearranjado e um braço de homologia 3' compreendendo uma região potencializadora de íntrons CH de roedor (camundongo) e/ou um roedor (camundongo) pode ser útil na manipulação de uma região DH em um roedor compreendendo um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, por exemplo, um camundongo compreendendo substituição de sequências variáveis de imunoglobulina de camundongo por sequências variáveis de imunoglobulina humana, por exemplo, camundongos VELOCIMMUNE®, que podem compreender opcionalmente um gene ADAM6 funcional que restaura sua fertilidade, uma sequência gênica de região constante de cadeia pesada endógena modificada compreendendo um gene IgM endógeno intacto e outro gene de região constante modificada endógena (por exemplo, IgG) para a produção de anticorpos não IgM quiméricos reversos sem um domínio CH1 funcional, uma sequência codificadora de uma cadeia leve comum humanizada quimérica reversa, uma sequência codificadora de uma cadeia leve kappa humanizada quimérica reversa, uma sequência codificadora de uma cadeia leve lambda humanizada quimérica reversa, uma sequência codificadora de uma cadeia leve kappa/lambda ou kappa/lambda híbrida, segmentos gênicos de cadeia pesada de linhagem germinativa não rearranjados e/ou segmentos gênicos de cadeia leve de linhagem germinativa (não) rearranjados modificados com um códon de histidina pela expressão de domínios variáveis que têm aminoácidos de histidina e podem exibir ligação ao antígeno sensível a pH e/ou desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) para diversidade de receptor de antígeno aumentada. Ver, por exemplo, Patentes US N° 9,035,128; 9,066,502;9,163,092; 9,150,662; 9,334,333; 9,850,462; 9,844,212; 9,029,628; 9,006,511; 9,394,373; 9,206,261; 9,206,262; 9,206,263; 9,226,484; 9,399,683; 9,540,452; 9,012,717; 9,796,788, 8,697,940; 8,754,287;9,334,334; 9,801,362; 9,332,742; 9,969,814; Publicações de Patente US 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0185821, 2013/0302836, 2013/0045492 e 2018/0125043; Publicações PCT N° WO2017210586, e WO2019/113065, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0036] Como tal, são descritos neste documento métodos de manipulação de uma região DH para recombinação de DH-DH, por exemplo, em um roedor. Em algumas modalidades, o método compreende modificar uma região DH compreendendo um ou mais ou uma pluralidade de segmentos gênicos DH não rearranjados para compreender pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, um método de modificação de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina para manipular a recombinação de DH-DH compreende obter uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região DH compreendendo um ou mais segmentos gênicos DH não rearranjados, cada um dentre os quais segmentos gênicos DH não rearranjados são flanqueados em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, e modificando adicionalmente a região DH pelo menos ligada a uma região DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a região DH é uma região DH humana compreendendo um ou uma pluralidade de segmentos gênicos DH humano não rearranjados, por exemplo, em que a pluralidade de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados compreendem opcionalmente todos os segmentos gênicos DH humanos não rearranjados se estendendo entre, e incluindo, os segmentos gênicos DH1-1 e DH7-27, por exemplo, em configuração de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de um ou mais dentre um ou uma pluralidade de segmentos gênicos DH não rearranjados flanqueados em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, por exemplo, um segmento gênico DH humano não rearranjado, com pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH não rearranjado mais próximo de 3' flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer da região DH é substituído pelo segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, em que o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende de 5' a 3', a RSS de 23-mer, o segmento gênico DH e a RSS de 12-mer. Em algumas modalidades, um segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer é substituído por um segmento gênico DH correspondente manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, em que a região DH compreende um segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado (por exemplo, um segmento gênico DH7-27 de linhagem germinativa), o segmento gênico DH7-27 humano não rearranjado é substituído por um segmento gênico DH humano (por exemplo, um segmento gênico DH3-3 humano não rearranjado) operacionalmente ligado a uma extremidade 5’ de RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, em que a região DH compreende um segmento gênico DH2-2 não rearranjado, um segmento gênico DH2-8 não rearranjado e/ou um segmento gênico DH2-15 não rearranjado (por exemplo, em que o DH manipulado compreende o repertório completo dos segmentos gênicos DH humanos não rearranjados em configuração de linhagem germinativa), o segmento gênico DH2-2 não rearranjado, o segmento gênico DH2-8 não rearranjado e/ou o segmento gênico DH2-15 não rearranjado são respectivamente substituídos por um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer e um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a modificação compreende substituir uma de duas RSS de 12-mer flanqueando um segmento gênico DH (por exemplo, um segmento gênico DH de linhagem germinativa humana) por uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina a ser modificada compreende, além de uma região DH, uma região JH (compreendendo opcionalmente um repertório completo de segmentos gênicos JH de linhagem germinativa humanos compreendendo um segmento gênico JH1 de linhagem germinativa humano, um segmento gênico JH2 de linhagem germinativa humano, um segmento gênico JH3 de linhagem germinativa humano, um segmento gênico JH4 de linhagem germinativa humano, um segmento gênico JH5 de linhagem germinativa humano e um segmento gênico JH6 de linhagem germinativa humano, opcionalmente em que os segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6 estão em configuração de linhagem germinativa) operacionalmente ligados à região DH, e substituindo um segmento gênico DH não rearranjado flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer compreende deletar pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreendido na região JH, por exemplo, resulta na deleção de segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4 e/ou JH5 humanos não rearranjados contínuos pela região DH. Em algumas modalidades, deletar pelo menos um segmento gênico JH de linhagem germinativa compreendido na região JH compreende deletar os segmentos gênicos JH1, JH2 e JH3 humanos não rearranjados e, opcionalmente, deletar adicionalmente os segmentos gênicos JH4 e JH5. Em algumas modalidades, substituir um ou mais dentre todos os segmentos gênicos DH funcionais, por exemplo, substituir um segmento gênico DH7-27 por um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', por exemplo, um segmento gênico DH3-3 operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', resulta na deleção de segmentos gênicos JH1, JH2 e JH3 humanos não rearranjados contínuos com a região DH. Em algumas modalidades, substituir um ou mais dentre todos os segmentos gênicos DH funcionais, por exemplo, substituir um segmento gênico DH7-27 por um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', por exemplo, um segmento gênico DH3-3 operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer de extremidade 5', resulta na deleção de segmentos gênicos JH1, JH2 e JH3, JH4 e JH5 humanos não rearranjados contínuos com a região DH. Em algumas modalidades, a região DH é modificada para compreender pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, em que pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende (a) um segmento gênico DH3-3 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 5' do segmento gênico DH3-3, (b) um segmento gênico DH2-2 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-2, (c) um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-8, (d) um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, opcionalmente em que a RSS de 23-mer é contígua à extremidade 3' do segmento gênico DH2-15, ou (e) qualquer combinação de (a)-(d).

[0037] Tais métodos podem resultar em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região DH manipulada, por exemplo, uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (humana), conforme descrita neste documento, em que a região de cadeia pesada de imunoglobulina (humana) (não) rearranjada pode ser opcionalmente ligada a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana ou porção desta, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor compreendendo pelo menos uma região potencializadora de íntrons CH de roedor e/ou gene IgM de roedor, por exemplo, opcionalmente em um locus de cadeia pesada imunoglobulina não humana endógeno. Em algumas modalidades, após a recombinação, tal locus de cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno, compreende uma sequência codificadora de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina tendo um comprimento de aminoácidos da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de mais do que 20 aminoácidos, cujo comprimento pode ser o resultado de uma recombinação de um VH(DHA-DHB)JH, um VHDHJH6, ou um VH(DHA-DHB)JH6. Consequentemente, são fornecidas neste documento roedores, células de roedores, loci e/ou moléculas de nucleotídeos compreendendo uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina VH(DHA-DHB)JH rearranjada, uma sequência de VH(DH)JH6 ou uma VH(DHA-DHB)JH6 codificando um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma CDR3, em que o comprimento da CDR3 tem pelo menos 20 aminoácidos de comprimento.

[0038] São também descritos neste documento animais não humanos, por exemplo, roedores, compreendendo uma região DH manipulada da invenção, por exemplo, os ácidos nucleicos, vetores de direcionamento e/ou loci de cadeia pesada de imunoglobulina, conforme descrito neste documento, por exemplo, em seu genoma, por exemplo, genoma de linhagem germinativa. São também descritos neste documento tais genomas de animais não humanos, por exemplo, genomas de roedores. Em algumas modalidades, é descrito neste documento um roedor cujo genoma de linhagem germinativa compreende, ou um genoma de linhagem germinativa de roedor compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, conforme descrita, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende: (i) pelo menos um segmento gênico (VH) variável de cadeia pesada não rearranjado, (ii) uma região de diversidade (DH) de região variável de cadeia pesada manipulada, em que a região DH manipulada compreende um ou mais segmentos gênicos DH não rearranjados, cada um flanqueado em um lado por um RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer e um ou mais segmentos gênicos DH, cada um operacionalmente ligado a uma sequência de sinal de recombinação de 23- mer (RSS), e (iii) pelo menos um segmento gênico (JH) de união de cadeia pesada não rearranjada, em que (i)-(iii) estão em ligação operacional de modo que, após a recombinação, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada rearranjada que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, opcionalmente em que a sequência de região variável de cadeia pesada rearranjada é formada após um evento de recombinação de VH(DH-DH)JH, opcionalmente em que pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH, cada um operacionalmente ligado a uma sequência de sinal de recombinação de 23-mer (RSS) une um de um ou mais segmentos gênicos DH rearranjados, cada um flanqueado em um lado por um RSS de 12- mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer durante o evento de recombinação de VH(DH-DH). Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5'. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo apenas segmentos gênicos VH, DH e JH humanos. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana é operacionalmente ligada a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena do animal não humano ou genoma de animal não humano, por exemplo, em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende segmentos gênicos VH humanos se estendendo entre VH3-74 a VH6-1 em configuração de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segmento gênico JH6 humano. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma ou mais moléculas de nucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos Adam6 de roedor (por exemplo, um gene Adam6 de roedor), que podem ser opcionalmente ser inseridas entre dois segmentos gênicos VH humanos (por exemplo, inseridas entre um segmento gênico VH1-2 humano e um segmento gênico VH6-1 humano) e/ou inseridas no lugar de um pseudogene de Adam6 humano. Em algumas modalidades, o animal não humano é um roedor. Em algumas modalidades, o genoma de roedor é heterozigoto para região DH manipulada. Em algumas modalidades, o genoma de roedor é homozigoto para a região DH manipulada. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um rato. Em algumas modalidades, o roedor pode ser um camundongo. Em algumas modalidades, o roedor, genoma de roedor ou célula de roedor é um rato, um camundongo, um genoma de rato, um genoma de camundongo, uma célula de rato ou uma célula de camundongo, por exemplo, uma célula-tronco embrionária de roedor (rato ou camundongo).

[0039] Em algumas modalidades, uma célula de roedor, genoma de roedor ou célula de roedor descrita neste documento compreende adicionalmente sequências codificadoras de VDJ e/ou de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjadas que codificam domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, é um animal não humano, por exemplo, um roedor, por exemplo, um rato ou um camundongo, que compreende (1) em seu genoma de linhagem germinativa, por exemplo, em uma célula germinativa, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região DH manipulada compreendendo um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e (2) em seu genoma somático, por exemplo, em uma célula B, uma sequência codificadora da região variável de cadeia pesada rearranjada VH(DHA-DHB)JH, em que o primeiro e o segundo segmentos gênicos DH (DHA ou DHB, respectivamente) são derivados do segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, ou uma porção desta (por exemplo, compreende uma sequência idêntica a de pelo menos uma porção do segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, uma variantes somaticamente hipermutada deste e/ou uma variante de degeneração deste). Em algumas modalidades, em que a célula B é uma célula B não exposta e/ou sequência codificadora de região variável de cadeia pesada rearranjada é operacionalmente ligada a uma sequência de região constante de IgM, pelo menos um segmento gênico DHA e DHB compreende pelo menos 9 nucleotídeos consecutivos que se alinham a uma molécula de nucleotídeo codificada pelo segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e cada um dos segmentos gênicos DHA e DHB compreende pelo menos 5 nucleotídeos consecutivos que se alinham a uma molécula de nucleotídeo de um segmento gênico DH de linhagem germinativa. Em algumas modalidades, em que a célula B é uma célula B de plasma ou memória e/ou a sequência codificadora de região variável de cadeia pesada rearranjada é hipermutada somaticamente e/ou operacionalmente ligada a uma sequência de região constante não IgM (por exemplo, uma IgG, IgA, IgE, etc.), cada uma de DHA e DHB mostra, respectivamente, 40% de identidade com um primeiro e um segundo segmento gênico DH de linhagem germinativa, com um máximo de 1 mutação de nucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos 95% de todas as sequências codificadoras de VDJ e/ou VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjadas no roedor têm um comprimento de CDR3 de pelo menos 10 aminoácidos, opcionalmente em que pelo menos 70% de todas as sequências codificadoras de VDJ e/ou VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjadas no roedor têm um comprimento de CDR3 de pelo menos 11 aminoácidos, opcionalmente pelo menos 15% de todas as sequências codificadoras de VDJ e/ou VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjadas no roedor têm um comprimento de CDR3 de pelo menos 14 aminoácidos. Em algumas modalidades, uma população de sequências codificadoras de VDJ e/ou VH(DHA-DHB)JH no roedor têm um comprimento de CDR3 de pelo menos 15 aminoácidos, opcionalmente pelo menos 16 aminoácidos, opcionalmente pelo menos 17 aminoácidos e opcionalmente pelo menos 18 aminoácidos. Em algumas modalidades, é descrito neste documento um roedor ou uma célula de roedor que expressa, ou um ácido nucleico ou locus de imunoglobulina que compreende, uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada, em que o segundo segmento gênico DH de linhagem germinativa é DH3-3, opcionalmente em que a sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada codifica um comprimento de CDR3 de mais de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, é descrito neste documento um roedor ou uma célula de roedor que expressa, ou um ácido nucleico ou locus de imunoglobulina que compreende uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada, em que o primeiro segmento gênico DH de linhagem germinativa é DH2-2, DH2-8 ou DH2-15, opcionalmente em que a sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada codifica um comprimento de CDR3 de mais de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, é descrito neste documento um roedor ou uma célula roedor que expressa uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH6 de cadeia pesada rearranjada que codifica o comprimento de CDR3 de mais de 20 aminoácidos.

[0040] Em algumas modalidades, é fornecido um genoma de roedor, ácido nucleico ou locus de imunoglobulina compreendendo uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada de imunoglobulina humana rearranjada operacionalmente ligada a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor. Em algumas modalidades, o segmento gênico DHB é derivado de um segmento gênico DH3-3 de linhagem germinativa humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DHA é derivado de um segmento gênico DH2-2, DH2-8 ou DH2-15 de linhagem germinativa humano. Em algumas modalidades, a cadeia pesada rearranjada é determinada como sendo uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH, desde que cada um de DHA e DHB respectivamente mostre 40% de identidade com um primeiro e um segundo segmento gênico DH de linhagem germinativa, com um máximo de 1 mutação de nucleotídeo. Em algumas modalidades, a sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada codifica um comprimento de CDR3 de mais de 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o segmento gênico JH é derivado de um segmento gênico JH6 de linhagem germinativa humano. Em algumas modalidades, um roedor ou célula de roedor compreendendo uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH é fornecida. Em algumas modalidades, o roedor é um rato ou um camundongo ou a célula de roedor é uma célula de rato ou uma célula de camundongo. Em algumas modalidades, a célula de roedor é uma célula B de roedor. Em algumas modalidades, é fornecida um hibridoma compreendendo uma célula B de roedor expressando uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada fundida com uma célula de mieloma. Em algumas modalidades, uma sequência de VH(DHA-DHB)JH é confirmada como o resultado do evento de recombinação de DH-DH quando as sequências identificadas como DHA e DHB, cada uma, respectivamente, mostra 40% de identidade com um primeiro e um segundo segmento gênico DH de linhagem germinativa, com um máximo de 1 mutação de nucleotídeo.

[0041] Em algumas modalidades, um animal ou célula não humana é fornecido, cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, em que a região DH manipulada compreende pelo menos um segmento gênico DH que é operacionalmente ligado a uma primeira e uma segunda sequências de sinal de recombinação (RSS). Em algumas modalidades, a primeira RSS é uma RSS de 23-mer e a segunda RSS é uma RSS de 12-mer. Em algumas modalidades, a primeira RSS é uma RSS de 12-mer e a segunda RSS é uma RSS de 23-mer.

[0042] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano, cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, cuja região DH manipulada compreende um ou mais segmentos de DH que são operacionalmente ligados a uma sequência de sinal de recombinação (RSS) de 23-mer.

[0043] Em algumas modalidades, é fornecida uma célula ou tecido não humano, cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, cuja região DH manipulada compreende um ou mais segmentos de DH que são operacionalmente ligados a uma sequência de sinal de recombinação (RSS) de 23-mer. Em algumas modalidades, uma célula é de uma linhagem linfoide ou mieloide. Em algumas modalidades, uma célula é um linfócito. Em algumas modalidades, uma célula é selecionada a partir de uma célula B, célula dendrítica, macrófago, monócito e uma célula T. Em algumas modalidades, um tecido é selecionado dentre adiposidade, bexiga, cérebro, mama, medula óssea, olhos, coração, intestino, rim, fígado, pulmão, linfonodo, músculo, pâncreas, plasma, soro, pele, baço, estômago, timo, testículo, óvulo ou qualquer combinação dos mesmos.

[0044] Em algumas modalidades, uma célula imortalizada feita de uma célula não humana, conforme descrita neste documento, é fornecida, por exemplo, uma célula de hibridoma feita da fusão de uma célula B isolada de um animal não humano, conforme descrita neste documento, com uma célula de mieloma.

[0045] Em algumas modalidades, uma célula não humana é uma célula-tronco embrionária (ES) não humana. Em algumas modalidades, uma célula-tronco embrionária não humana é uma célula-tronco embrionária de roedor. Em algumas modalidades, uma célula-tronco embrionária de roedor é uma célula-tronco embrionária de camundongo e é de uma linhagem 129, linhagem C57BL, ou uma mistura das mesmas. Em algumas modalidades, uma célula-tronco embrionária de roedor é célula-tronco embrionária de camundongo e é uma mistura de cepas 129 e C57BL.

[0046] Em algumas modalidades, o uso de uma célula-tronco embrionária não humana, como descrita neste documento, é fornecido para produzir um animal não humano. Em algumas modalidades, uma célula tronco embrionária não humana é uma célula tronco embrionária de camundongo e é usada para produzir um camundongo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, uma célula tronco embrionária não humana é uma célula tronco embrionária de rato e é usada para produzir um rato compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um método exemplificativo não limitativo para produzir o rato compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada pode incluir os métodos divulgados em US20140309487, incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

[0047] Em algumas modalidades, é provido um embrião não humano compreendendo, produzido a partir de, obtido a partir de, ou gerado a partir de uma célula-tronco embrionária não humana, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um embrião não humano é um embrião de roedor; em algumas modalidades, um embrião de camundongo; em algumas modalidades, um embrião de rato.

[0048] Em algumas modalidades, o uso de uma célula embrionária não humana como descrita neste documento é provida para produzir um animal não humano. Em algumas modalidades, um embrião não humano é um embrião de camundongo e é usado para produzir um camundongo compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. Em algumas determinadas modalidades, um embrião não humano é um embrião de rato e é usado para produzir um rato compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento.

[0049] São fornecidos neste documento métodos de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região DH manipulada, o método compreendendo (a) modificar o genoma de uma célula-tronco embrionária de roedor para compreender um fragmento de DNA compreendendo um ou mais segmentos de DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer, por exemplo, em que o fragmento de DNA compreende uma molécula de nucleotídeo, vetor de direcionamento e/ou região DH manipulada descrita neste documento, e (b) gerando uma célula embrionária de roedor modificada de (a). Em algumas modalidades, os métodos compreendem modificar uma região DH não rearranjada de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina para compreender pelo menos um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, em que a região DH não rearranjada compreende adicionalmente um ou mais segmentos gênicos DH não rearranjados, cada um dos quais é flanqueado em um lado por uma RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, produzindo assim o referido roedor. Em algumas modalidades, a modificação compreende substituir um ou mais segmentos gênicos DH humanos não rearranjados e, opcionalmente, substituir ou deletar um ou mais segmentos gênicos JH, pelo menos um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana, por exemplo, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende um agrupamento gênico VH de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjada compreendendo pelo menos um segmento gênico VH, uma região DH de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjada compreendendo um ou mais segmentos gênicos DH humanos não rearranjados e um agrupamento gênico JH de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjada compreendendo pelo menos um segmento gênico JH humano não rearranjado, em que a região DH de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjada é modificada para compreender pelo menos um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, a etapa de modificação resulta na região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo (i) o repertório completo de segmentos gênicos VH humanos funcionais, por exemplo, todos os segmentos gênicos VH funcionais se estendendo entre, e incluindo, VH3-74 a VH6-1, (ii) o repertório completo de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados, exceto por DH7-27, que é substituído por pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e (iii) pelo menos um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, e opcionalmente pelo menos segmento gênico JH4 não rearranjado, um segmento gênico JH5 não rearranjado e um segmento gênico JH6 não rearranjado. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende um segmento gênico DH3-3 operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5'. Em algumas modalidades, a etapa modificadora resulta na região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo (i) um repertório completo de segmentos gênicos VH humanos funcionais, por exemplo, todos os segmentos gênicos VH funcionais se estendendo entre, e incluindo, VH3-74 a VH6-1, (ii) o repertório de segmentos gênicos DH humanos não rearranjados, exceto que os segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15 são respectivamente substituídos por um segmento gênico DH2-2 operacionalmente ligado a sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, um segmento gênico DH2-8 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, e um segmento gênico DH2-15 humano operacionalmente ligado em sua extremidade 3' a uma RSS de 23-mer, e (iii) o repertório completo de segmentos gênicos JH humanos não rearranjados, por exemplo, um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado, um segmento gênico JH6 humano não rearranjado. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (a) compreende adicionalmente um ou mais genes Adam6 de roedor, em que, opcionalmente, um ou mais genes Adam6 de roedor estão localizados entre dois segmentos gênicos VH não rearranjados, por exemplo, entre um segmento gênico VH1-2 humano não rearranjado e um segmento gênico VH6-1 humano não rearranjado, e/ou (b) é operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, em que, opcionalmente, a região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de roedor, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor endógena em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno. Em algumas modalidades, o roedor é um rato ou um camundongo.

[0050] Em algumas modalidades, é fornecido um kit, compreendendo um animal não humano, conforme descrito neste documento, uma célula ou tecido não humano, conforme descrito neste documento, uma célula imortalizada, conforme descrita neste documento, uma célula-tronco embrionária não humana, conforme descrita neste documento, ou um embrião não humano, conforme descrito neste documento.

[0051] Em algumas modalidades, é fornecido um kit, como descrito neste documento, para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de uma droga (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para terapia ou diagnóstico. Em algumas modalidades, é fornecido um kit, como descrito neste documento, para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de uma droga (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição.

[0052] Em algumas modalidades, é provido um transgene, construção de ácido nucleico, construção de DNA ou vetor de direcionamento conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento compreende uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento compreende um fragmento de DNA que inclui um ou mais segmentos de DH operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento compreende adicionalmente um ou mais marcadores de seleção. Em algumas modalidades, um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento compreende adicionalmente um ou mais sítios de recombinação sítio- específicos (por exemplo, loxP, Frt ou combinações destes). Em algumas modalidades, um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento é mostrado na Figura 2.

[0053] Em algumas modalidades, o uso de um transgene, construto de ácido nucleico, construto de DNA ou vetor de direcionamento, conforme descrito neste documento, para produzir um animal não humano, célula não humana, célula-tronco embrionária não humana e/ou embrião não humano é fornecido.

[0054] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH estão, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5'.

[0055] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5'. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS 3’. Em algumas modalidades de um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5', um segmento de DH é um segmento de DH sintético; em algumas modalidades, um segmento de DH humano sintético; em algumas modalidades, um segmento de DH humano sintético tendo uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a um segmento de DH3-3 humano. Em algumas modalidades de um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3', um segmento de DH é um segmento de DH sintético; em algumas modalidades, um segmento de DH humano sintético; em algumas modalidades, um segmento de DH humano sintético tendo uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a um segmento de DH3-3 humano.

[0056] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5'. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’, os três segmentos de DH são segmentos de DH sintéticos. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’, os três segmentos de DH são segmentos da família DH2 humanos. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’, os três segmentos de DH são selecionados de DH2-2 humano, DH2-8 humano, DH2-15 humano, DH2-21 humano e combinações destes. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’, os três segmentos de DH são DH2-2 humano, DH2-8 humano e DH2-15 humano.

[0057] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada compreende três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’, os três segmentos de DH são segmentos de DH sintéticos. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’, os três segmentos de DH são segmentos da família DH2 humanos. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’, os três segmentos de DH são selecionados de DH2-2 humano, DH2-8 humano, DH2-15 humano, DH2-21 humano e combinações destes. Em algumas modalidades de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’, os três segmentos de DH são DH2-2 humano, DH2-8 humano e DH2-15 humano.

[0058] Em algumas modalidades, uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, inclui uma pluralidade de segmentos de DH humanos, em que pelo menos um de uma pluralidade de segmentos gênicos DH humanos é operacionalmente ligado a uma RSS 5' ou uma RSS 3'; em algumas modalidades, uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, inclui uma pluralidade de segmentos de DH humanos, em que pelo menos três de uma pluralidade de segmentos gênicos DH humanos são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS 5' ou uma RSS 3'; em algumas modalidades, uma RSS de 23-mer 3’.

[0059] Em algumas modalidades, o genoma de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecidos não possuem um ou mais segmentos de DH do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o genoma de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecidos não possuem todos ou substancialmente todos os segmentos de DH do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o genoma de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecidos contêm apenas segmentos de DH humanos.

[0060] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana é operacionalmente ligada a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, não humana) endógena.

[0061] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana inclui os segmentos gênicos VH humanos de VH3-74 a VH6-1. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana inclui pelo menos o segmento gênico JH humano JH6. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana inclui pelo menos segmentos gênicos JH humanos JH4, JH5 e JH6. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana inclui segmentos gênicos JH humanos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6.

[0062] Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, o genoma carece de um gene Adam6 endógeno. Em algumas modalidades de um animal não humano, células não humanas ou tecido não humano, o genoma compreende adicionalmente a inserção de uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos Adam6 de roedor; em algumas modalidades, uma ou mais sequências de nucleotídeos são inseridas entre um primeiro e um segundo segmento gênico VH humano; em algumas modalidades, uma ou mais sequências de nucleotídeos são inseridas no lugar de um pseudogene Adam6 humano; em algumas modalidades, uma ou mais sequências de nucleotídeos são inseridas entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano. Em algumas modalidades, um primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 humano e um segundo segmento gênico VH humano é VH6-1 humano.

[0063] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano são homozigotos, heterozigotos ou hemizigotos para uma região DH, conforme fornecido neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecidos são transgênicos para uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento.

[0064] Em algumas modalidades, um método para produzir um animal não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada é fornecido, o método compreendendo (a) inserir um fragmento de DNA em uma célula- tronco embrionária não humana, em que o fragmento de DNA compreende um ou mais segmentos de DH que são, cada uma, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer, (b) obter a célula tronco embrionária não humana gerada em (a); e (c) criar um animal não humano usando a célula-tronco embrionária de (b).

[0065] Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH humano sintético operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH3-3 humano sintético operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'.Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende três segmentos de DH humanos, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende três segmentos de DH humanos, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’, cujos segmentos de DH humanos são DH2-2 humano, DH2-8 humano e DH2-15 humano.

[0066] Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um ou mais segmentos de DH, cada um dos quais é operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23- mer 5’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH humano sintético operacionalmente ligado a uma 23-mer 5’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH3-3 humano sintético operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um segmento de DH3-3 humano sintético operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’, em que o segmento de DH3-3 humano sintético está posicionado em uma região DH humano no lugar de um segmento de DH7-27 humano.

[0067] Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um ou mais marcadores de seleção. Em algumas modalidades, um fragmento de DNA compreende um ou mais sítios de recombinação sítio-específicos.

[0068] Em algumas modalidades, um método para produzir um animal não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada é fornecido, o método compreendendo uma etapa de modificar o genoma de um animal não humano ou célula de animal não humano de modo que compreenda uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, cuja região DH manipulada compreende um ou mais segmentos de DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer, produzindo assim o referido animal não humano.

[0069] Em algumas modalidades de produção de um animal não humano, o genoma do animal não humano ou célula animal não humana é modificado para incluir um ou mais segmentos de DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades de produção de um animal não humano, o genoma do animal não humano ou célula animal não humana é modificado para incluir um ou mais segmentos de DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 3’.

[0070] Em algumas modalidades, é fornecido um método de produção de um anticorpo em um animal não humano. Em algumas modalidades, um método de produção de um anticorpo ou obtenção de um ácido nucleico que codifica o mesmo compreende imunizar um animal não humano (por exemplo, um roedor (por exemplo, um rato ou um camundongo) com um antígeno, em que o roedor tem um genoma de linhagem germinativa compreendendo uma região DH manipulada que compreende um ou mais segmentos de DH que são operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer, e permitindo que o roedor produza uma resposta imune ao antígeno incluindo um anticorpo, ou ácido nucleico que codifica o mesmo, que se liga ao antígeno. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente recuperar o anticorpo, ou ácido nucleico que o codifica, do roedor ou de uma célula de roedor, por exemplo, é uma célula B ou um hibridoma. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH estão, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 3'.

[0071] Em algumas modalidades, um método compreendendo as etapas de (a) imunizar um animal não humano com um antígeno, em que o animal não humano possui um genoma compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, em que a região DH manipulada compreende um ou mais segmentos de DH que são, cada um, operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer; (b) mantendo o roedor sob condições suficientes que o animal não humano produz uma resposta imune ao antígeno; e (c) recuperar um anticorpo do animal não humano, ou uma célula de animal não humano, que se liga ao antígeno. Em algumas modalidades, uma célula de animal não humano é uma célula B. Em algumas modalidades, uma célula de animal não humano é um hibridoma.

[0072] Em algumas modalidades, um animal não humano é fornecido cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo um ou mais segmentos gênicos VH humanos, uma região DH manipulada que inclui pelo menos um segmento de DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e pelo menos um segmento gênico JH humano, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana é operacionalmente ligada a um ou mais genes de região constante de imunoglobulina endógena de modo que o roedor é caracterizado por, quando imunizado por um antígeno, gerar anticorpos compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada humanos que incluem regiões de CDR3 geradas por recombinação de DH-DH e/ou recombinação potencializada para um segmento gênico JH6, e em que os anticorpos mostram ligação específica ao antígeno. Em algumas modalidades, pelo menos um segmento de DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer é posicionado no lugar de um segmento de DH7-27 humano. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende menos do que todos os seis segmentos gênicos JH humanos. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende apenas um dos seis segmentos gênicos JH humanos. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende o segmento gênico JH6 humano e não possui um segmento gênico JH1 funcional, não possui um segmento gênico JH2 funcional, não possui um segmento gênico JH3 funcional, não possui um segmento gênico JH4 funcional e não possui um segmento gênico JH5 funcional. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende apenas três dos seis segmentos gênicos JH humanos. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende apenas o segmento gênico JH4 humano, o segmento gênico JH5 humano e o segmento gênico JH6 humano, e não possui o segmento gênico JH1 funcional, não possui um segmento gênico JH2 funcional e não possui um segmento gênico JH3 funcional. Em algumas modalidades, em que um animal não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo menos do que todos os seis segmentos gênicos JH humanos, por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo apenas um dos seis segmentos gênicos JH humanos (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana que compreende o segmento gênico JH6 humano e não possui o segmento gênico JH1 funcional, não possui um segmento gênico JH2, não possui um segmento gênico JH3 funcional, não possui um segmento gênico JH4 funcional e não possui um segmento gênico JH5 funcional), exibe recombinação potencializada para um segmento gênico JH6 em comparação com um animal controle não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo todos os seis segmentos gênicos JH, por exemplo, o animal não humano compreende uma porcentagem maior de sequências de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência do segmento gênico JH6 ou porção deste e/ou codificando um comprimento de CDR3 de pelo menos 20 aminoácidos deste do que o animal controle não humano. Em algumas modalidades, em que um animal não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo menos do que todos os seis segmentos gênicos JH humanos, por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana que compreende apenas três dos seis segmentos gênicos JH (por exemplo, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreende o segmento gênico JH4, o segmento gênico JH5 , e o segmento gênico JH6 humano, e não possui um segmento gênico JH1 funcional, não possui um segmento gênico JH2 funcional e não possui um segmento gênico JH3 funcional), exibe recombinação potencializada para um segmento gênico JH6 em comparação com um animal controle não humano cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana compreendendo todos os seis segmentos gênicos JH humanos, por exemplo, o animal não humano compreende uma porcentagem maior de sequências de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjadas compreendendo a sequência de segmento gênico JH6 ou porção deste e/ou codificando um comprimento de CDR3 de pelo menos 20 aminoácidos em comparação com o animal controle não humano

[0073] Em algumas modalidades, um animal não humano é fornecido cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana que compreende um ou mais segmentos gênicos VH humanos, uma região DH manipulada que inclui pelo menos um segmento de DH humano flanqueado por uma RSS de 23-mer 3’, e pelo menos dois segmentos gênicos JH humanos, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana é operacionalmente ligada a um ou mais genes de região constante de imunoglobulina endógena de modo que o roedor é caracterizado por, quando imunizado por um antígeno, gerar anticorpos compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada humanos que incluem regiões de CDR3 geradas por recombinação de DH-DH humano, e em que os anticorpos mostram ligação específica ao antígeno. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada inclui pelo menos três segmentos de DH humanos que são, cada um, flanqueados em 3' por uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada inclui três segmentos de DH humanos que são, cada um, flanqueados em 3' por uma RSS de 23-mer, em que três segmentos de DH humanos são DH2-2 humano, DH2-8 humano e DH2- 15 humano. Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana inclui os segmentos gênicos VH humanos de VH3- 74 a VH6-1.

[0074] Em algumas modalidades, o antígeno é um patógeno, por exemplo, um patógeno bacteriano, fúngico ou viral. Em algumas modalidades, a imunização de um animal não humano neste documento compreende infectar o animal não humano com um patógeno, por exemplo, um patógeno bacteriano, fúngico ou viral. Em algumas modalidades, a imunização de um animal não humano neste documento compreende administrar ao material genômico ou proteináceo de animal não humano isolado do patógeno, por exemplo, patógeno bacteriano, fúngico ou viral. Em algumas modalidades, o antígeno é um receptor (por exemplo, um receptor de complemento, um receptor de quimiocina, etc.) ou porção deste. Em algumas modalidades, o antígeno é um ácido nucleico que codifica o receptor, ou porção deste. Em algumas modalidades, o antígeno é uma célula que expressa o receptor, ou porção deste. Em algumas modalidades, o antígeno é um canal iônico, ou porção deste. Em algumas modalidades, o antígeno é um ácido nucleico que codifica o canal iônico ou porção deste. Em algumas modalidades, o antígeno é uma célula que expressa o canal iônico ou porção deste.

[0075] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecidos têm um genoma que compreende adicionalmente uma inserção de um ou mais segmentos gênicos VL humanos e um ou mais segmentos gênicos JL humanos em um locus de cadeia leve endógeno. Em algumas modalidades, os segmentos de V L e JL humanos são segmentos gênicos VK e JK e são inseridos em um locus de cadeia leve K endógeno. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos VK e JK são operacionalmente ligados a um gene de Ck de roedor (por exemplo, um gene de Ck de camundongo ou rato). Em algumas modalidades, os segmentos de V L e JL humanos são segmentos gênicos VA e JA e são inseridos em um locus de cadeia leve A endógeno. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos VA e JA humanos são operacionalmente ligados a um gene de CA de roedor (por exemplo, um gene de CA de camundongo ou rato).

[0076] Em algumas modalidades, o uso de um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano, conforme descrito neste documento, na fabricação e/ou desenvolvimento de uma droga ou vacina para uso na medicina, tal como uso como um medicamento, é fornecido. Em algumas modalidades, o uso de um animal não humano, uma célula animal não humana ou um tecido não humano, conforme descrito neste documento, na fabricação e/ou desenvolvimento de um anticorpo para administração a humanos é fornecido. Em algumas modalidades, o uso de um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano, conforme descrito neste documento, na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição é fornecido.

[0077] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, conforme descrito neste documento, é fornecido para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de uma droga para terapia ou diagnóstico. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano, conforme descritos neste documento, são fornecidos para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento, a prevenção ou a melhora de uma doença, um distúrbio ou uma condição.

[0078] Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido neste documento é um roedor; em algumas modalidades, um camundongo; em algumas modalidades, um rato. Em várias modalidades, uma célula de animal não humano fornecida neste documento é uma célula de roedor; em algumas modalidades, uma célula de camundongo; em algumas modalidades, uma célula de rato. Em várias modalidades, um tecido de animal não humano fornecido neste documento é um tecido de roedor; em algumas modalidades, um tecido de camundongo; em algumas modalidades, um tecido de rato.

[0079] Em algumas modalidades, uma RSS de 23-mer compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência estabelecida como SEQ ID NO:151.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0080] Os desenhos incluídos neste documento, que é composto pelas seguintes Figuras, são para fins ilustrativos apenas e não de limitação.

[0081] A Figura 1 mostra uma ilustração geral, fora de escala, de modalidades da presente invenção mostrando a montagem ordenada de segmentos gênicos em um evento de recombinação de DJ para segmentos gênicos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com uma região de DH não modificada (painel superior) e região de DH manipulada (painel inferior). Sequências de sinal de recombinação de 12-mer (RSS) são representadas como triângulos não preenchidos. RSS de 23-mer são representadas como triângulos com faixas verticais. Segmentos gênicos VH ilustrativos não modificados (caixas não preenchidas) e segmentos gênicos DH (caixas preenchidas) são representados respectivamente como caixas não preenchidas e preenchidas e são fornecidas nomenclaturas genéricas usando letras do alfabeto. Os segmentos gênicos D (por exemplo, DH3-3) operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer e segmentos gênicos JH não modificados são representados respectivamente como caixas preenchidas com listras horizontais e caixas não preenchidas e forneceram sua nomenclatura adequada. Também é mostrado o promotor μ0 (μ 0 pro). Uma recombinação de um segmento gênico VH ao segmento gênico DJ recombinado não está representada.

[0082] A Figura 2 mostra ilustrações, fora de escala, de modalidades exemplares de vetores de direcionamento produzidos de acordo com o Exemplo 1. Linhas hash representam segmentos gênicos DH que são incluídos no vetor de direcionamento, mas não são especificamente retratados.

[0083] A Figura 3 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade exemplar não limitante de inserção do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada no genoma de células ES de camundongo através de eletroporação (EP). Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que são incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados.

[0084] A Figura 4 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade exemplar não limitante de deleção mediada por Cre de cassetes de seleção em loci de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada após a eletroporação e integração do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que são incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados.

[0085] A Figura 5 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade exemplar não limitante de inserção do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6 em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada no genoma de células ES de camundongo através de eletroporação (EP). Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que são incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados.

[0086] A Figura 6 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade exemplar não limitante de deleção mediada por Cre de cassetes de seleção em loci de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada após a eletroporação e integração do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que são incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados.

[0087] A Figura 7 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade exemplar não limitante de inserção do vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23/JH1-6 em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada no genoma de células ES de camundongo através de eletroporação (EP). Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que são incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados. Triângulos preenchidos representam pseudogenes.

[0088] A Figura 8 mostra uma ilustração, fora de escala, de uma modalidade não limitante exemplar de deleção Cre-mediada de cassetes de seleção em loci de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada após eletroporação e integração do vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2- 8:23|12:DH2-15:23, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Linhas hash representam segmentos gênicos VH ou segmentos gênicos DH que estão incluídos no locus da região variável de cadeia pesada, mas não são especificamente representados

[0089] A Figura 9A mostra resultados em conexão com uma modalidade da invenção, representando graficamente as porcentagens (eixos y) de todas as leituras de imunoglobulina funcional (Ig) resultantes de um evento de recombinação de DH-DH (painel inferior) que têm uma CDR3 de um comprimento de aminoácido específico (eixos x) isolado de animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2- 8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," e "S3" representam, cada um, um camundongo experimental diferente.

[0090] A Figura 9B mostra resultados em conexão com uma modalidade da invenção, representando graficamente as porcentagens (eixos y) de fusões DD resultantes de um evento de recombinação DH-DH (painel inferior) que têm uma CDR3 de um comprimento de aminoácido específico (eixos x) isolado de animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," e "S3" representam, cada um, um camundongo experimental diferente.

[0091] A Figura 10A mostra resultados em conexão com uma modalidade da invenção, representando graficamente as porcentagens (eixos y) de todas as leituras de imunoglobulina funcional (Ig) resultantes de um evento de recombinação de DH-DH que têm uma CDR3 compreendendo um determinado número de resíduos de cisteína (eixos x) isolados de animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23I12:DH2- 8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," e "S3" representam, cada um, um camundongo experimental diferente.

[0092] A Figura 10B resulta em conexão com uma modalidade da invenção, representando graficamente as porcentagens (eixos y) de todas as leituras de imunoglobulina (Ig) resultantes de um evento de recombinação de DH-DH que têm uma CDR3 compreendendo um determinado número de resíduos de cisteína (eixos x) isolados de animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," e "S3" representam, cada um, um camundongo experimental diferente.

[0093] A Figura 11 mostra resultados em conexão com uma modalidade da presente invenção, representação gráfica de títulos de anticorpos representativos (eixo y) em camundongos individuais com loci de região variável de cadeia Kleve e pesada de imunoglobulina humanizada (VI; veja, por exemplo, Patente US N° 8,697,940 e 8,642,835; cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade) e camundongos modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 conforme descrito neste documento (V(DD)J), ambas as coortes foram imunizadas com um imunógeno de DNA codificando um receptor acoplado à proteína G (GPCR). Os títulos de anticorpos foram determinados por ligação celular MSD em 293 células manipuladas para expressar a GPCR (GPCR; eixo x) e em células que não expressam GPCR (controle; eixo x).

[0094] Figura 12A mostra resultados em conexão com uma modalidade da presente invenção, mostrando a porcentagem (%; eixos y) de sequências gênicas de VHDHJH de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada e sequências gênicas presumidas como sendo o resultado de VHDHA-DHBJH rearranjada de acordo com o critério rigoroso estabelecido na Tabela 7 isolado da medula óssea (MO) ou baço de camundongos modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 e codificação de uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo um comprimento de aminoácido (AA) de 5 a 30 aminoácidos (eixos x). Os números de células da MO e do baço não são normalizados entre si. n=1.

[0095] A Figura 12B mostra resultados em conexão com uma modalidade da presente invenção, fornecendo um aumento do gráfico mostrado no painel da Figura 12A. Os números de células da MO e do baço não são normalizados entre si. n=1.

[0096] A Figura 12C mostra resultados em conexão com uma modalidade da presente invenção, mostrando a porcentagem de leituras tendo uma CDR3 maior que 21 aminoácidos de comprimento na medula óssea ou baço de camundongos modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6. Os números de células da MO e do baço não são normalizados entre si. n=1.

[0097] A Figura 13 mostra resultados em conexão com uma modalidade da presente invenção, mostrando a porcentagem (%; eixos y) de sequências de gênicas de VHDHA-DHBJH de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada presumida (de acordo com o critério rigoroso estabelecido na Tabela 7) isoladas da medula óssea (MO) ou baço de camundongos modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 e codificação de CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo um comprimento de aminoácido (AA) de, todos os quais tinham mais de 20 aminoácidos de comprimento (eixos X). Os números de células da MO e do baço não são normalizados entre si. n=1.

DEFINIÇÕES

[0098] O escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas neste documento e não é limitado por certas modalidades descritas neste documento; aqueles versados na técnica, lendo a presente divulgação, estarão cientes de várias modificações que podem ser equivalentes a tais modalidades descritas, ou de outra forma dentro do escopo das reivindicações. Em geral, a terminologia está de acordo com o seu significado compreendido na técnica, a menos que claramente indicado em contrário. As definições explícitas de certos termos são fornecidas neste documento e abaixo; significados destes e de outros termos em casos específicos ao longo deste relatório descritivo ficarão claras àqueles versados na técnica a partir do contexto. Definições adicionais para os termos a seguir e outros termos são estabelecidas em todo o relatório descritivo. As referências citadas neste relatório descritivo, ou porções relevantes das mesmas, são incorporadas por referência neste documento.

[0099] O uso de termos ordinais, como "primeiro", "segundo", "terceiro", etc., nas reivindicações para modificar um elemento da reivindicação não denota por si só qualquer prioridade, precedência ou ordem de elemento de reivindicação sobre o outro, ou a ordem temporal em que são realizados atos de um método, mas são usados apenas como indicações para distinguir um elemento de reivindicação com um determinado nome de outro elemento com um mesmo nome (mas para o uso do termo ordinal) para distinguir os elementos da reivindicação.

[00100] Os artigos "um" e "uma", conforme usados no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que claramente indicado em contrário, devem ser entendidos como incluindo os respectivos plurais. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais elementos de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais um ou todos os elementos do grupo estiverem presentes em, empregados em, ou então relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado o contrário, ou que fique evidente o contrário a partir do contexto. A invenção inclui modalidades em que exatamente um elemento do grupo está presente em, é empregado em, ou é relevante para um determinado produto ou processo. A invenção também inclui modalidades em que mais de um, ou todo o grupo de elementos estão presentes em, empregados em, ou são relevantes para um determinado produto ou processo. Além disso, deve ser compreendido que a invenção engloba todas as variações, combinações e permutações em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos, etc., de uma ou mais das reivindicações listadas é introduzida em outro reivindicação dependente da mesma reivindicação base (ou, conforme for relevante, qualquer outra reivindicação) salvo indicação em contrário, ou a menos que fique evidente para aquele versado na técnica que surge uma contradição ou inconsistência. Quando elementos são apresentados como listas, (por exemplo, no grupo de Markush ou formato similar) deve ser entendido que cada subgrupo dos elementos também é divulgado e qualquer(quaisquer) elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve ser entendido que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, é/são referido(s) como compreendendo elementos particulares, características, etc., determinadas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em tais elementos, recursos, etc. Para fins de simplicidade, essas modalidades não foram especificamente demonstradas em cada casos em tantas palavras neste documento. Também deve ser entendido que qualquer modalidade ou aspecto da invenção pode ser explicitamente excluído das reivindicações, independentemente se a exclusão específica é recitada no relatório descritivo.

[00101] Conforme usado neste pedido, os termos "cerca de" e "aproximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer numerais usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente destinam-se a abranger quaisquer flutuações normais, por exemplo, +/- 5%, percebidas pelos versados na técnica relevante.

[00102] Administração: refere-se à administração de uma composição a um sujeito ou sistema (por exemplo, a uma célula, órgão, tecido, organismo, ou componente relevante ou conjunto de componentes deste). Aqueles comumente versados na técnica apreciarão que a via de administração pode variar dependendo, por exemplo, do sujeito ou do sistema ao qual está sendo administrada a composição, a natureza da composição, o propósito da administração, etc.

[00103] Por exemplo, em determinadas modalidades, administração a um sujeito animal (por exemplo, a um ser humano ou um roedor) pode ser brônquica (incluindo por instilação brônquica), bucal, entérica, intradérmica, intra-arterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosal, nasal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (incluindo por instilação intratraqueal), transdérmica, vaginal e/ou vítrea. Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem intermitente. Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem contínua (por exemplo, perfusão) durante pelo menos um período de tempo selecionado. Em algumas modalidades, um anticorpo produzido por um animal não humano divulgado neste documento pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, um sujeito humano ou roedor). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica inclui um anticorpo produzido por um animal não humano divulgado neste documento. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode incluir um tampão, um diluente, um excipiente ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo produzido por um animal não humano divulgado neste documento pode ser incluída em um recipiente para armazenamento ou administração, por exemplo, um frasco, uma seringa (por exemplo, uma seringa IV) ou uma bolsa (por exemplo, uma bolsa IV).

[00104] Biologicamente ativo: refere-se a uma característica de qualquer agente que tenha atividade em um sistema biológico, in vitro ou in vivo (por exemplo, em um organismo). Por exemplo, um agente que, quando presente em um organismo, tem um efeito biológico dentro desse organismo é considerado biologicamente ativo.

[00105] Em modalidades particulares, onde uma proteína ou um polipeptídeo é biologicamente ativo, uma porção dessa proteína ou polipeptídeo que confere pelo menos uma atividade biológica da proteína ou polipeptídeo é normalmente referida como uma porção "biologicamente ativa".

[00106] Comparável: refere-se a dois ou mais agentes, entidades,situações, conjuntos de condições, etc. que podem não ser idênticos entre si, mas que são suficientemente semelhantes para permitir a comparação entre eles de modo que podem ser tiradas conclusões razoáveis com base nas diferenças ou semelhanças observadas. Aqueles versados na técnica irão compreender, no contexto, qual o grau de identidade é necessário em qualquer dada circunstância para dois ou mais desses agentes, entidades, situações, conjuntos de condições, etc. serem considerados comparáveis.

[00107] Conservativo: em referência a uma substituição de aminoácido conservativa, ou seja, uma substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido com um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não vai mudar substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de um receptor se ligar a um ligante. Exemplos de grupos de aminoácidos com cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem: cadeias laterais alifáticas, tais como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadeias laterais alifáticas de hidroxila, como serina e treonina; cadeias laterais contendo amida, como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas, como fenilalanina, tirosina e triptofano; cadeias laterais básicas, como lisina, arginina e histidina; cadeias laterais acídicas, como ácido aspártico e ácido glutâmico; e cadeias laterais contendo enxofre tais como cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativa incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, valina/alanina, glutamato/aspartato e asparagina/glutamina.

[00108] Em algumas modalidades, uma substituição do aminoácido conservativa pode ser uma substituição de qualquer resíduo nativo em uma proteína com alanina, como usado em, por exemplo, mutagênese por escaneamento de alanina. Em algumas modalidades, é feita uma substituição conservativa que tem um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 divulgada em Gonnet, G. H. et al., 1992, Science 256:1443-1445, incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma substituição é uma substituição moderadamente conservativa em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.

[00109] Controle: refere-se ao significado compreendido na técnica como um “controle” sendo um padrão contra o qual os resultados são comparados. Normalmente, controles são usados para aumentar a integridade em experimentos, isolando variáveis a fim de tomar uma conclusão sobre essas variáveis. Em algumas modalidades, um controle é uma reação ou ensaio que é realizado simultaneamente com um teste de reação ou ensaio para fornecer um comparador. Como usado neste documento, um "controle" pode se referir a um "animal controle” Um "animal controle" pode ter uma modificação conforme descrita neste documento, uma modificação que é diferente, conforme descrita neste documento, ou nenhuma modificação (isto é, um animal do tipo selvagem). Em um experimento, é aplicado um "teste" (isto é, uma variável sendo testada). Em um segundo experimento, o "controle", a variável sendo testada, não é aplicada. Um controle pode ser um controle positivo ou um controle negativo.

[00110] Em algumas modalidades, um controle é um controle histórico (isto é, de um teste ou ensaio realizado anteriormente, ou uma quantidade ou resultado que é previamente conhecido). Em algumas modalidades, um controle é, ou compreende, um registro salvo ou impresso.

[00111] Ruptura: refere-se ao resultado de um evento de recombinação homóloga com uma molécula de DNA (por exemplo, com uma sequência homóloga endógena, tal como um gene ou locus gênico).

[00112] Em algumas modalidades, uma ruptura pode alcançar ou representar uma inserção, deleção, substituição, reposição, mutação missense, ou um deslocamento do quadro de leitura (“frameshift”) de sequência(s) de DNA, ou qualquer combinação destes. Inserções podem incluir a inserção de genes inteiros ou de fragmentos de genes, por exemplo, éxons, que podem ser de uma origem que não a sequência endógena (por exemplo, uma sequência heteróloga), ou sequências codificantes derivadas ou isoladas de um gene de interesse específico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode aumentar a expressão e/ou atividade de um gene ou produto do gene (por exemplo, de uma proteína codificada por um gene). Em algumas modalidades, uma ruptura pode diminuir a expressão e/ou atividade de um gene ou produto do gene. Em algumas modalidades, uma ruptura pode alterar a sequência de um gene ou produto gênico codificado (por exemplo, uma proteína codificada). Em algumas modalidades, uma ruptura pode alterar a sequência de um cromossomo ou posição cromossômica em um genoma. Em algumas modalidades, uma ruptura pode truncar ou fragmentar um gene ou um produto do gene codificado (por exemplo, uma proteína codificada). Em algumas modalidades, uma ruptura pode estender um gene ou produto gênico codificado. Em algumas dessas modalidades, uma ruptura pode alcançar a montagem de uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, uma ruptura pode afetar o nível, mas não a atividade, de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode afetar a atividade, mas não o nível, de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo no nível de um gene ou produto do gene. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo sobre a atividade de um gene ou produto do gene. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo no nível ou na atividade de um gene ou produto do gene. Em algumas modalidades, um efeito significativo pode ser medido por, por exemplo, mas não limitado a, um teste T de Student.

[00113] Locus endógeno ou gene endógeno: refere-se a um locus genético encontrado em um organismo (ou célula) de origem ou de referência antes da introdução de uma alteração, ruptura, deleção, inserção, modificação, troca ou substituição conforme descrito neste documento.

[00114] Em algumas modalidades, o locus endógeno compreende uma sequência total ou parcialmente encontrada na natureza. Em algumas modalidades, o locus endógeno é um locus do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o organismo de referência é um organismo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o organismo de referência é um organismo manipulado. Em algumas modalidades, o organismo de referência é um organismo criado em laboratório (seja do tipo selvagem ou manipulado).

[00115] Promotor endógeno: refere-se a um promotor que está naturalmente associado, por exemplo, em um organismo do tipo selvagem, a um gene endógeno ou locus genético.

[00116] Manipulado: refere-se, em geral, ao aspecto de ter sido manipulado pelas mãos do homem. Como é prática comum e é entendido por aqueles na técnica, a progênie de um polinucleotídeo ou célula manipulada é tipicamente ainda referida como “manipulada" mesmo que a manipulação real tenha sido desempenhada em uma entidade anterior. Além disso, como será apreciado por aqueles versados na técnica, uma variedade de metodologias está disponível, através da qual a "manipulação" como descrita neste documento pode ser atingida.

[00117] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo pode ser considerado "manipulado" quando duas ou mais sequências que não são ligadas entre si nessa ordem na natureza são manipuladas pelas mãos do homem para serem diretamente ligadas uma à outra no polinucleotídeo manipulado. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo manipulado pode incluir uma sequência reguladora que é encontrada na natureza ligada operacionalmente a uma primeira sequência codificadora, mas não ligada operacionalmente com uma segunda sequência codificadora, é ligada pelas mãos do homem para que seja ligada operacionalmente à segunda sequência codificadora. Nas modalidades do segmento gênico DH manipulado neste documento, um segmento gênico DH é manipulado pela mão do homem para estar operacionalmente ligado (por exemplo, flanqueado pelo menos um lado por, contíguo a, encostando contra, imediatamente adjacente a) uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, um segmento gênico DH manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer é derivado de outro segmento gênico DH, por exemplo, o segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende uma sequência nucleotídica idêntica àquela do outro segmento gênico DH, exceto por diferenças devido à degeneração do código genético e/ou substituição de uma RSS de 12-mer por uma RSS de 23-mer. Um outro segmento gênico DH e um segmento gênico DH manipulado derivado deste (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer) podem ser considerados segmentos gênicos correspondentes. Por exemplo, um segmento gênico DH3- 3 humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer pode ser considerado correspondente a um segmento gênico DH3-3 flanqueado em um lado por uma RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer, em que o segmento gênico DH3-3 operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e o segmento gênico DH3-3 flanqueado em um lado por uma RSS de 12-mer e no outro lado por outra RSS de 12-mer compartilham uma sequência nucleotídica idêntica, exceto por diferenças devido à degeneração do código genético e/ou a substituição de uma das duas RSS de 12-mer pela RSS de 23- mer. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos que, cada uma, codificam elementos ou domínios polipeptídicos que, na natureza, não são ligados um ao outro, podem ser ligados um ao outro em um único polinucleotídeo manipulado. Comparativamente, em algumas modalidades, uma célula ou organismo pode ser considerado “manipulado” se tiver sido modificado de modo que sua informação genética seja alterada (por exemplo, novo material genético não presente previamente tenha sido introduzido ou material genético presente previamente tenha sido alterado ou removido).

[00118] Por exemplo, em algumas modalidades, “manipulação” pode envolver seleção ou design (por exemplo, de sequências de ácidos nucleicos, sequências polipeptídicas, células, tecidos e/ou organismos) através do uso de sistemas computadorizados programados para desempenhar análise ou comparação, ou de outra forma para analisar, recomendar e/ou selecionar sequências, alterações, etc.). Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, "manipulação" pode envolver uso de metodologias de síntese química in vitro e/ou tecnologias de ácidos nucleicos recombinantes, tais como, por exemplo, amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, por meio de reação em cadeia da polimerase), hibridização, mutação, transformação, transfecção, etc., e/ou qualquer uma dentre uma variedade de metodologias de reprodução controladas. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, uma variedade de tais técnicas estabelecidas (por exemplo, para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção, etc.) são bem conhecidas na técnica e descritas em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e/ou discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; incorporado neste documento em sua totalidade por referência).

[00119] Gene: refere-se a uma sequência de DNA em um cromossomo que codifica um produto (por exemplo, um produto de RNA e/ou um produto polipeptídico). Para fins de clareza, o termo "gene" geralmente refere-se a uma porção de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo; o termo opcionalmente pode englobar sequências reguladoras, como será claro a partir do contexto àqueles versados na técnica. Essa definição não se destina a excluir a aplicação do termo “gene" a unidades de expressão não codificadoras de proteínas, mas sim a esclarecer que, na maioria dos casos, o termo conforme usado neste documento refere-se a um ácido nucleico que codifica polipeptídeos.

[00120] Em algumas modalidades, um gene inclui uma sequência codificadora (isto é, sequência que codifica um produto em particular). Em algumas modalidades, um gene inclui uma sequência não codificante. Em algumas modalidades, um gene pode incluir tanto sequência codificante (por exemplo, exônica) quanto não codificante (por exemplo, intrônica). Em algumas modalidades, um gene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, promotores, potenciadores, etc.) e/ou sequências de íntron que, por exemplo, podem controlar ou impactar um ou mais aspectos da expressão gênica (por exemplo, expressão específica ao tipo celular, expressão induzível, etc.).

[00121] Heterólogo: refere-se a um agente ou entidade de uma fonte diferente. Por exemplo, quando usado em referência a um polipeptídeo, gene ou produto gênico presente em uma célula ou organismo específico, o termo esclarece que o polipeptídeo ou fragmento deste, gene ou fragmento deste ou produto gênico ou fragmento deste relevante: (1) foi manipulado pela mão do homem; (2) foi introduzido na célula ou organismo (ou um precursor destes) através da mão do homem (por exemplo, por meio de manipulação genética); e/ou (3) não é naturalmente produzido ou presente na célula ou organismo relevante (por exemplo, o tipo de célula ou tipo de organismo relevante). Outro exemplo inclui um polipeptídeo ou fragmento deste, gene ou fragmento deste, ou produto gênico ou fragmento deste que esteja normalmente presente em uma célula nativa ou organismo particular, mas que foi modificado, por exemplo, por mutação ou colocação sob controle de elementos reguladores não-naturalmente associados e, em algumas modalidades, não-endógenos (por exemplo, um promotor).

[00122] Célula hospedeira: refere-se a uma célula na qual um ácido nucleico ou proteína heteróloga (por exemplo, exógena) foi introduzida. Aquele versado na técnica, ao ler esta divulgação irá entender que estes termos referem-se não só à célula em questão, mas também são usados para se referir à progênie dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucedentes devido a mutação ou influências ambientais, essa progenitura pode, na verdade, não ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira".

[00123] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é, ou compreende, uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é, ou compreende, uma célula de mamífero. Em geral, uma célula hospedeira é qualquer célula que é adequada para receber e/ou produzir um ácido nucleico ou proteína heterólogo, independentemente do Reino da vida ao qual a célula é designada. Células exemplares incluem aquelas de procariotos ou eucariotos (unicelular ou pluricelular), células bacterianas (por exemplo, cepas de Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactéria, células fúngicas, células de levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas por baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animais não humanos, células humanas ou fusões de células como, por exemplo, hibridomas ou quadromas.

[00124] Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato, ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionada a partir das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS- 7), célula da retina, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmico), CV1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula mencionada acima. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula de retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6®). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é, ou compreende, uma célula isolada. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é parte de um tecido. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é parte de um organismo.

[00125] Humanizado: refere-se a uma molécula (por exemplo, um ácido nucleico, proteína, etc.) que era de origem não humana e para a qual uma porção foi substituída por uma porção correspondente de uma molécula humana correspondente de tal forma que a molécula modificada (por exemplo, humanizada) retém sua função biológica e/ou mantém a estrutura que executa a função biológica mantida. Em contraste, "humano" e similares englobam moléculas tendo apenas uma origem humana, por exemplo, nucleotídeos humanos ou proteína compreendendo apenas sequências de nucleotídeos e aminoácidos humanas, respectivamente. O termo "humano(izado)" é usado para refletir que a molécula humana(izada) pode ser (a) uma molécula humana ou (b) uma molécula humanizada.

[00126] Identidade: em conexão com uma comparação de sequências,refere-se à identidade conforme determinada por um número de diferentes algoritmos conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos e/ou de aminoácidos.

[00127] Em algumas modalidades, identidades, conforme descrito neste documento, são determinadas usando um alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) empregando uma penalidade de lacuna aberta de 10,0, uma penalidade de lacuna estendida de 0,1 e usando uma matriz de similaridade de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

[00128] In vitro: refere-se a eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou recipiente de reação, em cultura de células, etc., ao invés de dentro de um organismo pluricelular.

[00129] In vivo: refere-se a eventos que ocorrem dentro de um organismo pluricelular, tal como um humano e um animal não humano. No contexto de sistemas baseados em células, o termo pode ser usado para se referir a eventos que ocorrem dentro de uma célula viva (ao contrário de, por exemplo, sistemas in vitro).

[00130] Isolado: refere-se a uma substância e/ou entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela foi associada quando inicialmente produzida (na natureza e/ou em uma configuração experimental), e/ou (2) designada, produzida, preparada e/ou fabricada pelas mãos do homem. As substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas de cerca de 10 ou mais dos outros componentes com os quais foram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, agentes isolados são pelo menos cerca de 80% ou mais puros. Uma substância é "pura" se é substancialmente livre de outros componentes. Em algumas modalidades, conforme será compreendido por aqueles versados na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "isolada" ou mesmo "pura", depois de ter sido combinada com certos outros componentes, tais como, por exemplo, um ou mais carreadores ou excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.); nessas modalidades, o isolamento ou pureza percentual da substância é calculada sem incluir tais carreadores ou excipientes.

[00131] Para dar apenas um exemplo, em algumas modalidades, um polímero biológico, como um polipeptídeo ou polinucleotídeo que ocorre na natureza, é considerado "isolado" quando: (a) em virtude da sua origem ou fonte de derivação, ele não está associado a alguns ou todos os componentes que o acompanham em seu estado nativo na natureza; (b) ele é substancialmente livre de outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos da mesma espécie da espécie que o produz na natureza; ou (c) ele é expresso por, ou está em associação com os componentes de uma célula ou outro sistema de expressão que não é da espécie que o produz na natureza. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou é sintetizado em um sistema celular diferente do que o produz na natureza é considerado um polipeptídeo "isolado". Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um polipeptídeo que foi submetido a uma ou mais técnicas de purificação pode ser considerado um polipeptídeo "isolado" na medida em que ele foi separado de outros componentes: a) aos quais está associado na natureza; e/ou b) aos quais foi associado quando inicialmente produzido.

[00132] Animal não humano: refere-se a qualquer organismo vertebrado que não seja um ser humano.

[00133] Em algumas modalidades, um animal não humano é um ciclóstomo, um peixe ósseo, um peixe cartilaginoso (por exemplo, um tubarão ou uma arraia), um anfíbio, um réptil, um mamífero e uma ave. Em algumas modalidades, um mamífero não humano é um primata, uma cabra, uma ovelha, um porco, um cão, uma vaca, ou um roedor. Em algumas modalidades, o animal não humano é um roedor, tal como um rato ou um camundongo.

[00134] Ácido nucleico: em seu sentido mais amplo, refere-se a qualquer composto e/ou substância que é ou pode ser incorporada em uma cadeia oligonucleotídica e é geralmente intercambiável com molécula de ácido nucleico, sequência de ácido nucleico, molécula de nucleotídeo, molécula de nucleotídeo, cujos termos também são intercambiáveis entre si.

[00135] Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é um composto e/ou substância que é ou pode ser incorporada em uma cadeia de oligonucleotídeo através de uma ligação fosfodiéster. Como ficará claro a partir do contexto, em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a resíduos de ácido nucleico individuais (por exemplo, nucleotídeos e nucleosídeos); em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a uma cadeia oligonucleotídica que compreende resíduos de ácidos nucleicos individuais. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende RNA; em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende DNA. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende, ou consiste em um ou mais resíduos de ácido nucleico natural. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende, ou consiste em um ou mais análogos de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um análogo de ácido nucleico difere de um "ácido nucleico" pelo fato de não utilizar uma estrutura principal de fosfodiéster. Por exemplo, em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende, ou consiste em um ou mais "ácidos nucleicos de peptídeo", que são conhecidos na técnica e possuem ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster na estrutura principal e são considerados no escopo da presente invenção. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui uma ou mais ligações fosforotioato e/ou 5'-N- fosforamidita, em vez de ligações fosfodiéster. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende, ou consiste em um ou mais nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina). Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende, ou consiste em um ou mais análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2- tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deaza-adenosina, 7-deazaguanosina, 8- oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas e combinações destes). Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" compreende um ou mais açúcares modificados (por exemplo, 2'-fluororibose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose) em comparação com aqueles em ácidos nucleicos naturais. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui uma sequência nucleotídica que codifica um produto gênico funcional, como um RNA ou proteína. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui uma sequência nucleotídica que codifica fragmento de polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo). Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" inclui um ou mais íntrons. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" inclui um ou mais éxons. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" inclui uma ou mais sequências codificantes. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é preparado por um ou mais isolamentos de uma fonte natural, síntese enzimática por polimerização baseada em um modelo complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula ou sistema recombinante e síntese química. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" tem pelo menos 3 ou mais resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é de fita única; em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é de fita dupla. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui uma sequência nucleotídica compreendendo pelo menos um elemento que codifica, ou é o complemento de uma sequência que codifica, um polipeptídeo ou fragmento deste. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui atividade enzimática.

[00136] Ligado operacionalmente: refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem em sua forma destinada.

[00137] Em algumas modalidades, sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas são contíguas entre si, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico compreendendo um segmento gênico de imunoglobulina operacionalmente ligado a uma RSS compreende a sequência nucleotídica do segmento gênico de imunoglobulina contígua à sequência nucleotídica de RSS, por exemplo, o segmento gênico de imunoglobulina é flanqueado pelo menos em um lado por (por exemplo, encosta) a sequência nucleotídica da RSS de uma maneira contígua de modo que o segmento gênico de imunoglobulina fique imediatamente adjacente à sequência nucleotídica da RSS.

[00138] Em outras modalidades, a ligação operacional não requer contiguidade. Por exemplo, segmentos gênicos de região variável não rearranjados "operacionalmente ligados" uns aos outros são capazes de reorganizar para formar um gene de região variável rearranjado, cujos segmentos gênicos de região variável não rearranjados podem não ser necessariamente contíguos entre si. Segmentos gênicos de região variável não rearranjados operacionalmente ligados entre si e a um gene de região constante contígua são capazes de se rearranjarem para formar um gene de região variável rearranjado que é expresso em conjunção com o gene de região constante como uma cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação a antígeno. Uma sequência controle "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora é ligada de modo que a expressão da sequência codificadora seja obtida em condições compatíveis com as sequências controle. Sequências "operacionalmente ligadas" incluem ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse e sequências de controle de expressão que atuam em trans ou à distância para controlar o gene de interesse.

[00139] O termo "sequência de controle de expressão" refere-se a sequências polinucleotídicas, que são necessárias para afetar a expressão e o processamento de sequências codificadoras às quais elas estão ligadas. “Sequências de controle de expressão" incluem: iniciação da transcrição adequada, terminação, sequências de promotor e potenciador; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que melhoram a eficiência da tradução (isto é, sequência consenso de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade da proteína; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção de proteínas. A natureza destas sequências de controle difere, dependendo do organismo hospedeiro. Por exemplo, em procariotas, estas sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal e sequência de terminação de transcrição, enquanto que nos eucariotas, normalmente, estas sequências de controle incluem promotores e a sequência de terminação de transcrição. O termo "sequências de controle" destina-se a incluir componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão.

[00140] Em geral, cada segmento gênico V de imunoglobulina não rearranjado, segmento gênico D ou segmento gênico J está operacionalmente ligado (por exemplo, associado, flanqueado por um ou ambos os lados com, contíguo com, etc.) uma sequência sinal de recombinação (RSS), que pode ser uma RSS de 12-mer ou uma RSS de 23-mer. Qualquer segmento gênico flanqueado em cada lado por uma RSS (incluindo um segmento de gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer) não passou por recombinação e, portanto, pode ser considerado um segmento gênico "não rearranjado". Em algumas modalidades, um segmento gênico não rearranjado neste documento pode compreender um segmento gênico em sua configuração de linhagem germinativa (por exemplo, tipo selvagem), por exemplo, um segmento gênico VH de linhagem germinativa e um segmento gênico JH de linhagem germinativa são, cada um, flanqueados em ambos os lados por RSS de 23- mer. Em contraste, um segmento gênico DH de linhagem germinativa, por exemplo, um segmento gênico DH não rearranjado, é flanqueado em cada lado por uma RSS de 12-mer. Um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, um segmento gênico DH manipulado, também não passou por recombinação e, portanto, compreende (i) uma RSS de 23-mer e (ii) uma RSS de 12-mer. Um segmento gênico DH manipulado (por exemplo, um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer) é capaz de se reorganizar com outro segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 12-mer de acordo com a regra 12/23 de recombinação.

[00141] Condições fisiológicas: inclui seu significado entendido na técnica, referenciando as condições sob as quais as células ou organismos vivem e/ou se reproduzem. Em algumas modalidades, o termo refere-se a condições do meio externo ou interno que podem ocorrer na natureza para um organismo ou sistema celular. Em algumas modalidades, as condições fisiológicas são aquelas condições presentes no corpo de um animal humano ou não humano, especialmente as condições presentes em e/ou dentro de um local cirúrgico. Condições fisiológicas normalmente incluem, por exemplo, uma faixa de temperatura de 20-40° C, pressão atmosférica de 1, pH de 6-8, concentração de glicose de 1-20 mm, concentração de oxigênio em níveis atmosféricos, e a gravidade tal como encontrada na terra. Em algumas modalidades, condições em um laboratório são manipuladas e/ou mantidas em condições fisiológicas. Em algumas modalidades, condições fisiológicas são encontradas em um organismo (por exemplo, animal não humano).

[00142] Polipeptídeo: refere-se a qualquer cadeia polimérica de aminoácidos.

[00143] Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que não ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que contém porções que ocorrem na natureza separadamente uma da outra (isto é, a partir de dois ou mais organismos diferentes, por exemplo, porções humanas e não humanas). Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é projetada em que ela é projetada e/ou produzida pela ação da mão do homem. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender ou consistir em uma pluralidade de fragmentos, cada um dos quais é encontrado no mesmo polipeptídeo parental em uma disposição espacial diferente em relação a outra que é encontrada no polipeptídeo de interesse (por exemplo, fragmentos que são diretamente ligados no parental podem estar espacialmente separados no polipeptídeo de interesse ou vice-versa, e/ou fragmentos podem estar presentes numa ordem diferente no polipeptídeo de interesse em relação ao parental), de modo que o polipeptídeo de interesse é um derivado do seu polipeptídeo parental.

[00144] Recombinante: refere-se a polipeptídeos que são projetados,manipulados, preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como polipeptídeos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, polipeptídeos isolados de uma biblioteca de polipeptídeos humanos combinatória recombinante (Hoogenboom H. R., 1997 TIB Tech. 15:62-70; Hoogenboom H., e Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378; Azzazy H., e Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., e Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145), anticorpos isolados de outro animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364370; Kellermann S. A. e Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Murphy, A.J., et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158; cada um dos quais está incorporado neste documento por referência em sua totalidade) ou polipeptídeos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam o splicing de elementos de sequência selecionados entre si.

[00145] Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência selecionados é encontrado na natureza. Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência selecionados é projetado in silico. Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência selecionados resultam de mutagênese (por exemplo, in vivo ou in vitro) de um elemento de sequência conhecido, por exemplo, de uma fonte natural ou sintética. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante compreende sequências encontradas no genoma (ou polipeptídeo) de um organismo de origem de interesse (por exemplo, ser humano, camundongo, etc.). Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante compreende sequências que ocorrem na natureza separadamente uma da outra (isto é, de dois ou mais organismos diferentes, por exemplo, porções humanas e não humanas) em dois organismos diferentes (por exemplo, um organismo humano e um não humano). Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante tem uma sequência de aminoácidos que resultou da mutagênese (por exemplo, in vitro ou in vivo, por exemplo, em um animal não humano), de modo que as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos recombinantes são sequências que, embora originárias de e relacionadas às sequências de polipeptídeos, podem não existir naturalmente dentro do genoma de um animal não humano in vivo.

[00146] Referência: refere-se a um agente, animal, coorte, indivíduo,população, amostra, sequência ou valor padrão ou controle em relação ao qual um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse é comparado. Uma "referência" pode se referir a um "animal de referência". Um "animal de referência" pode ter uma modificação conforme descrito neste documento, uma modificação que é diferente daquela conforme descrito neste documento, ou nenhuma modificação (isto é, um animal do tipo selvagem). Normalmente, como seria compreendido por aqueles versados na técnica, um agente de referência, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor é determinado ou caracterizado em condições comparáveis às utilizadas para determinar ou caracterizar o agente, animal (por exemplo, um mamífero), coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse.

[00147] Em algumas modalidades, um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é testado e/ou determinado substancialmente simultaneamente com o teste ou determinação do agente, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse. Em algumas modalidades, um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é uma referência histórica, opcionalmente incorporada em um meio tangível. Em algumas modalidades, uma referência pode se referir a um controle.

[00148] Substancialmente: refere-se à condição qualitativa de exibir uma medida ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Aquele versado nas técnicas biológicas irá entender que fenômenos biológicos e químicos raramente, se ocorrerem, chegam até a conclusão e/ou procedem à completude, ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente", portanto, é usado para capturar a potencial falta de completude inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos.

[00149] Homologia substancial: refere-se a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente homólogas" se elas contiverem resíduos homólogos nas posições correspondentes. Resíduos homólogos podem ser resíduos idênticos. Alternativamente, resíduos homólogos podem ser resíduos não-idênticos com características estruturais e/ou funcionais adequadamente similares. Por exemplo, como é sabido por aqueles versados na técnica, certos aminoácidos normalmente são classificados como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofílicos" e/ou como tendo cadeias laterais "polares" ou "apolares". A substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo, muitas vezes, pode ser considerada uma substituição "homóloga". As categorizações típicas de aminoácidos estão resumidas abaixo:

[00150] Como é bem conhecido nesta técnica, sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências nucleotídicas e BLASTP, gapped BLAST e PSI-BLAST para sequências de aminoácidos. Esses programas exemplares são descritos em Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol. 266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D., e B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Além de identificar sequências homólogas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de homologia.

[00151] Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente homólogas se pelo menos 95% ou mais dos seus resíduos correspondentes são homólogos ao longo de um trecho relevante de resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante é de pelo menos 9 ou mais resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante inclui resíduos contíguos ao longo de uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante inclui resíduos descontíguos ao longo de uma sequência completa, por exemplo, resíduos não contíguos unidos por conformação dobrada de um polipeptídeo ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o trecho relevante é de pelo menos 10 ou mais resíduos.

[00152] Identidade substancial: refere-se uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Conforme será apreciado por aqueles versados na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente idênticas" se elas contiverem resíduos idênticos nas posições correspondentes. Como é bem conhecido nesta técnica, sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências nucleotídicas e BLASTP, gapped BLAST e PSI-BLAST para sequências de aminoácidos. Esses programas exemplares são descritos em Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol. 266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., e B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Além de identificar sequências idênticas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de identidade.

[00153] Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente idênticas, se pelo menos 95% ou mais dos seus resíduos correspondentes são idênticos ao longo de um trecho relevante de resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante é de pelo menos 10 ou mais resíduos.

[00154] Vetor de direcionamento ou construto de direcionamento: refere-se a uma molécula polinucleotídica que compreende uma região de direcionamento. Uma região alvo compreende uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência em uma célula alvo, tecido ou animal e proporciona a integração do construto de direcionamento em uma posição dentro do genoma da célula, tecido ou animal através de recombinação homóloga. Regiões de direcionamento que se direcionam usando sítios de reconhecimento de recombinase sítio-específica (por exemplo, sítios loxP ou Frt) também estão incluídas.

[00155] Em algumas modalidades, um construto de direcionamento conforme descrito neste documento compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos ou gene de interesse em particular, um marcador selecionável, sequências de controle ou reguladoras, e outras sequências de ácidos nucleicos que permitem a recombinação mediada através da adição exógena de proteínas que auxiliam ou facilitam a recombinação envolvendo tais sequências. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento, conforme descrito neste documento, compreende adicionalmente um gene de interesse, inteiramente ou em parte, em que o gene de interesse é um gene heterólogo que codifica um polipeptídeo, inteiramente ou em parte, que tem uma função semelhante à de uma proteína codificada por uma sequência endógena. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento, conforme descrito neste documento, compreende adicionalmente um gene humanizado de interesse, inteiramente ou em parte, em que o gene humanizado de interesse codifica um polipeptídeo, inteiramente ou em parte, que tem uma função semelhante à de um polipeptídeo codificado por uma sequência endógena. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento (ou vetor de direcionamento) pode compreender uma sequência de ácido nucleico manipulada pela mão do homem. Por exemplo, em algumas modalidades, um construto de direcionamento (ou vetor de direcionamento) pode ser construído para conter um polinucleotídeo manipulado ou recombinante que contém duas ou mais sequências que não são ligadas entre si nessa ordem na natureza, mas são manipuladas pelas mãos do homem para serem diretamente ligadas uma à outra no polinucleotídeo manipulado ou recombinante.

[00156] Transgene ou construto de transgene: refere-se a uma sequência de ácido nucleico (que codifica, por exemplo, um polipeptídeo de interesse, inteiramente ou em parte) que foi introduzida em uma célula pela mão do homem, como com os métodos descritos neste documento. Um transgene pode ser parcialmente ou inteiramente heterólogo, isto é, estrangeiro, ao animal transgênico ou célula em que é introduzido. Um transgene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras transcricionais e qualquer outro ácido nucleico, tal como íntrons ou promotores, que podem ser necessários para expressão de uma sequência de ácido nucleico selecionada. Um transgene pode incluir um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção subsequente de progênie (por exemplo, células) que absorveram o transgene.

[00157] Animal transgênico, animal não humano transgênico ou Tg+: são usados indistintamente neste documento e se referem a qualquer animal não humano que não ocorra naturalmente no qual uma ou mais das células do animal não humano animal contém ácido nucleico heterólogo e/ou gene que codifica um polipeptídeo de interesse, inteiramente ou em parte.

[00158] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucléico heteróloga e/ou gene heterólogo é introduzido na célula, direta ou indiretamente por introdução em uma célula precursora, por meio de manipulação genética deliberada, tal como microinjeção ou por infecção com um vírus recombinante. O termo manipulação genética não inclui técnicas clássicas de reprodução, mas é dirigido à introdução de molécula(s) de DNA recombinante(s). Tal molécula pode ser integrada dentro de um cromossomo, ou pode ser DNA de replicação extracromossômica. O termo “Tg+” inclui animais que são heterozigotos ou homozigotos em relação um ácido nucleico e/ou gene heterólogo, e/ou animais que possuem uma ou várias cópias de um ácido nucleico e/ou gene heterólogo.

[00159] Vetor: refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual está associado.

[00160] Em algumas modalidades, vetores são capazes de replicação extracromossômica e/ou expressão de ácidos nucleicos a que estão ligados em uma célula hospedeira, como uma célula eucariótica ou procariótica. Vetores capazes de direcionar a expressão de genes operacionalmente ligados são referidos neste documento como "vetores de expressão”.

[00161] Tipo selvagem: inclui seu significado compreendido na técnica em que se refere a uma entidade com uma estrutura e/ou atividade conforme encontrada na natureza em um estado ou contexto "normal" (em contraste com mutante, doente, manipulada, alterada, etc.). Os versados na técnica perceberão que os genes e polipeptídeos de tipo selvagem geralmente existem em várias formas diferentes (por exemplo, alelos).

[00162] Outros recursos, objetivos e vantagens da presente invenção são aparentes na descrição detalhada de determinadas modalidades que seguem. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, embora indicando algumas modalidades da presente invenção, é fornecida a título de ilustração apenas, não de limitação. Várias alterações e modificações no escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica da descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS MODALIDADES

[00163] A presente invenção fornece, entre outras coisas, animais não humanos transgênicos ou manipulados com material genético heterólogo que codifica uma ou mais porções (fragmentos funcionais, porções de ligação, etc.) de imunoglobulinas humanas, cujo material genético heterólogo é inserido em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de modo que o material genético heterólogo esteja operacionalmente ligado a genes constantes de cadeia pesada (CH). Está contemplado que tais animais não humanos demonstram uma capacidade de gerar anticorpos codificados por sequências V(DD)J rearranjadas. Também é contemplado que tais animais não humanos demonstrem uma população de anticorpo caracterizada por regiões variáveis de cadeia pesada com um aumento na diversidade de CDR3 em comparação com uma população de anticorpo tendo diversidade de CDR3 variável de cadeia pesada de imunoglobulina gerada a partir de um locus da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina de tipo selvagem (ou um locus da região d variável da cadeia pesada de imunoglobulina que aparece na natureza). Portanto, os animais não humanos fornecidos são particularmente úteis para o desenvolvimento de terapêuticos baseados em anticorpos que se ligam a antígenos particulares, em particular, antígenos associados a imunogenicidade baixa e/ou fraca ou antígenos que são caracterizados por um ou mais epítopos que são desfavoráveis para ligação por anticorpos tradicionais (ou do tipo selvagem). Em particular, a presente invenção engloba a introdução de uma sequência sinal de recombinação de 23-mer adjacente a (por exemplo, 5' ou 3' de) um ou mais segmentos DH de uma região DH em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina resultando na capacidade de reorganização do segmento DH até DH durante a recombinação de VDJ, e expressão de anticorpos com regiões variáveis de cadeia pesada e, em particular, regiões CDR3, que pode ser caracterizada por um comprimento de aminoácido mais longo em comparação com anticorpos gerados a partir da recombinação de VDJ envolvendo segmentos DH únicos. Tais animais não humanos transgênicos fornecem um sistema de in vivo para a identificação e o desenvolvimento de anticorpos e/ou terapêuticas baseadas em anticorpos que ligam alvos de doenças além das capacidades de direcionamento de tecnologias de descoberta da droga já estabelecidas. Além disso, tais animais não humanos transgênicos fornecem um sistema modelo animal útil para o desenvolvimento de anticorpos e/ou de terapêuticas baseadas em anticorpos centradas em ou concebidas para as interações de ruptura proteína-proteína que são centrais em várias doenças e/ou patologias que afetam seres humanos.

[00164] Conforme mostrado na Figura 1, painel superior, a recombinação entre segmentos gênicos de imunoglobulina segue uma regra comumente referida como a regra 12/23, em que segmentos gênicos flanqueados por sequências de sinal de recombinação (RSS) são unidos por um processo ordenado. Cada RSS consiste em um bloco conservado de sete nucleotídeos (heptâmero; 5’-CACAGTG-3‘; SEQ ID NO:144) que é contíguo com uma sequência codificadora (por exemplo, um segmento VH, DH ou JH) seguida por uma região não conservada, conhecida como espaçador que tem 12bp ou 23bp de comprimento e um segundo bloco conservado de nove nucleotídeos (nonâmero, 5'-ACAAAAACC-3‘; SEQ ID NO:145). O espaçador pode variar em sequência, mas seu comprimento conservado corresponde a uma ou duas voltas da hélice dupla de DNA. Isso leva as sequências de heptâmero e nonâmero para o mesmo lado da hélice de DNA, onde elas podem ser ligadas por um complexo de proteínas que catalisa a recombinação. Uma RSS com espaçador de 23bp é uma RSS de 23-mer e uma RSS com espaçador de 12 bp é uma RSS de 12-mer. A regra 12/23 de recombinação geralmente promove a recombinação entre uma RSS de 12-mer e uma RSS de 23-mer e proíbe a recombinação entre uma RSS de 23-mer e outra RSS de 23-mer, ou entre uma RSS de 12-mer e outra RSS de 12-mer, por exemplo, proíbe a recombinação direta de VH de linhagem germinativa a JH- (ou seja, junção de 23-mer-a-23-mer) ou recombinação de DH de linhagem germinativa a DH de linhagem germinativa (ou seja, junção de 12-mer-a-12- mer), embora exceções tenham sido reportadas.

[00165] Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, compreendem uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina contendo um agrupamento de diversidade manipulado (isto é, uma região DH manipulada) caracterizada pela presença de um ou mais segmentos DH, cada um dos quais está operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e, consequentemente, são capazes de recombinação de DH-DH. Em algumas modalidades, anticorpos contendo CDR3s gerados a partir de tal recombinação podem ser caracterizados como tendo maior diversidade resultante do comprimento de aminoácido mais longo para ligação direta a antígenos particulares (por exemplo, vírus, canais de membrana, etc.). Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento compreendem segmentos gênicos variáveis de cadeia pesada (VH) e de junção (JH) operacionalmente ligados com a região DH manipulada para que a recombinação de VDJ ocorra entre os referidos VH, JH e mais de um segmento de DH para criar uma região variável de cadeia pesada que se liga a um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada, conforme descrita neste documento, contém um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) segmentos DH humanos manipulados para permitir (ou promover) a recombinação de DH a DH em uma frequência aumentada em comparação com um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de referência. Em algumas modalidades, os animais não humanos conforme descritos neste documento compreendem uma pluralidade de segmentos gênicos VH e JH operacionalmente ligados a um ou mais segmentos de DH que são cada um operacionalmente ligados a uma sequência de sinal de recombinação (RSS) de 23-mer em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina no genoma do animal não humano. Em muitas modalidades, os segmentos VH e JH são segmentos gênicos VH humanos e JH humanos.

[00166] Em algumas modalidades, animais não humanos conforme descritos neste documento compreendem ainda um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana ou humanizada (por exemplo, K e/ou À) de modo que os animais não humanos produzam anticorpos que compreendem regiões variáveis humanas (ou seja, pesadas e leves) e regiões constantes não humanas. Em algumas modalidades, o referido locus de cadeia leve de imunoglobulina humana ou humanizada compreende segmentos gênicos VL e JL humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia leve de roedor (por exemplo, um Ck ou ÀC de roedor). Em algumas modalidades, animais não humanos descritos neste documento compreendem ainda um locus de cadeia leve de imunoglobulina conforme descrito nas Patente US N° 9,796,788; 9,969,814; Publicação de Pedido de Patente US N° 2011/0195454 A1, 2012/0021409 A1, 2012/0192300 A1, 2013/0045492 A1, 2013/0185821 A1, 2013/0302836 A1, 2018/0125043; Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 2011/097603, WO 2012/148873, WO 2013/134263, WO 2013/184761, WO 2014/160179, WO 2014/160202; e WO2019/113065 cada um dos quais está incorporado neste documento por referência em sua totalidade).

[00167] Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes nas seções a seguir. O uso de seções não pretende limitar qualquer modalidade descrita neste documento. Cada seção pode aplicar-se a qualquer modalidade ou aspecto descrito neste documento. Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que indicado o contrário.

Recombinação de VDJ

[00168] Os genes responsáveis pela síntese de imunoglobulina são encontrados em todas as células de um animal e são dispostos em segmentos gênicos, sequencialmente situados ao longo do cromossomo. A configuração de segmentos gênicos humanos que são herdados, por exemplo, a configuração de linhagem germinativa de segmentos gênicos humanos, por exemplo, a ordem de segmentos gênicos humanos no genoma da linhagem germinativa (por exemplo, o genoma passado para a próxima geração) de um humano, pode ser encontrada em Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Imunogenet., 18, 100-116 (2001), incorporado neste documento em sua totalidade por referência, que também mostra segmentos gênicos funcionais e pseudogenes encontrados dentro do locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana na configuração de linhagem germinativa. Uma série de eventos de recombinação, envolvendo vários componentes genéticos, serve para montar imunoglobulinas em disposição ordenada de segmentos gênicos (por exemplo, V, D e J). Este conjunto de segmentos gênicos é conhecido por ser impreciso e, portanto, a diversidade de imunoglobulina é conseguida tanto pela combinação de segmentos gênicos diferentes e a formação de junções únicas por meio de junção imprecisa. Ainda mais diversidade é gerada por meio de um processo conhecido como hipermutação somática em que a sequência de região variável de imunoglobulinas é alterada de modo a aumentar a afinidade e especificidade para o antígeno. A molécula de imunoglobulina é um polipeptídeo em forma de Y, composto de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, cada uma das quais possui dois componentes estruturais: um domínio variável e um domínio constante. São os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves que são formados pela montagem de segmentos gênicos, enquanto domínios constantes são fundidos em domínios variáveis por meio de splicing de RNA. Embora o mecanismo de montagem (ou junção) de segmentos gênicos seja semelhante para as cadeias pesadas e leves, apenas um evento de junção é necessário para as cadeias leves (ou seja, V a J) enquanto dois são necessários para as cadeias pesadas (ou seja, D a J e V a DJ).

[00169] A montagem de segmentos gênicos para regiões variáveis de cadeia pesada e leve (referidas como, respectivamente, recombinação de VDJ e recombinação de VJ) é guiada por sequências de DNA não codificadoras conservadas que flanqueiam cada segmento gênicos, denominadas sequências sinal de recombinação (RSSs), que asseguram rearranjos de DNA em locais precisos em relação a sequências codificadoras de V, D e J (ver, por exemplo, Ramsden, D.A. et al., 1994, Nuc. Acids Res. 22(10):1785-96; incorporado neste documento em sua totalidade por referência). Um esquema representativo das sequências envolvidas na recombinação de VDJ de segmentos gênicos de cadeia pesada, conforme compreendido por aquele versado na técnica, é apresentado na Figura 1. Cada RSS consiste em um bloco conservado de sete nucleotídeos (heptâmero) que é contíguo com uma sequência codificadora (por exemplo, um segmento V, D ou J) seguida por um espaçador (12bp ou 23bp) e um segundo bloco conservado de nove nucleotídeos (nonâmero). Embora seja tolerada uma divergência de sequência considerável nos espaçadores de 12bp ou 23bp entre indivíduos, o comprimento dessas sequências normalmente não varia. A recombinação entre segmentos gênicos de imunoglobulina segue uma regra comumente referida como a regra 12/23, na qual segmentos gênicos flanqueados por uma RSS com um espaçador 12bp (12-mer) são tipicamente unidos a um segmento gênico flanqueado por um espaçador 23bp (ou 23-mer; ver, por exemplo, Hiom, K. e M. Gellert, 1998, Mol. Cell. 1(7):1011-9; incorporado neste documento em sua totalidade por referência). Foi relatado que a sequência de uma RSS influencia a eficiência e/ou a frequência da recombinação com um segmento gênico particular (ver, por exemplo, Ramsden, D.A e G.E. Wu, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10721-5; Boubnov, N.V. et al., 1995, Nuc. Acids Res. 23:1060-7; Ezekiel, U.R. et al., 1995, Immunity 2:381-9; Sadofsky, M. et al., 1995, Genes Dev. 9:2193-9; Cuomo, C.A. et al., 1996, Mol. Cell Biol. 16:5683-90; Ramsden, D.A. et al., 1996, EMBO J 15:31973206; cada um dos quais está incorporado neste documento por referência em sua totalidade). De fato, muitos relatórios apontam para um uso altamente tendencioso e variável de segmentos gênicos, em particular, segmentos de DH, entre indivíduos. Salvo indicação em contrário ou a menos que seja evidente para um versado na técnica que uma contradição ou inconsistência surgiria, presume-se que um segmento gênico não rearranjado sem referência a uma RSS compreende as duas RSS com as quais o segmento gênico está naturalmente associado, por exemplo, flanqueado, operacionalmente ligado, etc. Em algumas modalidades, um segmento gênico não rearranjado neste documento pode compreender um segmento gênico em sua configuração de linhagem germinativa (por exemplo, tipo selvagem), por exemplo, um segmento gênico VH de linhagem germinativa e um segmento gênico JH de linhagem germinativa são, cada um, flanqueados em ambos os lados por RSS de 23-mer. Em contraste, um segmento gênico DH de linhagem germinativa, por exemplo, um segmento gênico DH não rearranjado, é flanqueado em cada lado por uma RSS de 12-mer.

[00170] Como tal, um segmento gênico não rearranjado também pode se referir a um segmento gênico em sua configuração de linhagem germinativa, incluindo qualquer RSS associada a tal configuração de linhagem germinativa. Além disso, uma pluralidade de segmentos gênicos em sua configuração de linhagem germinativa geralmente se refere a não apenas cada segmento gênico individual que está em sua configuração de linhagem germinativa (por exemplo, não rearranjada), mas também a ordem e/ou localização dos segmentos gênicos funcionais. Consulte, por exemplo, Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001); incorporado neste documento em sua totalidade por referência, para a configuração da linhagem germinativa de segmentos gênicos V, D e J humanos.

[00171] A montagem de segmentos gênicos para formar regiões variáveis de cadeia pesada e leve resulta na formação de regiões (ou sítios) de ligação a antígeno de imunoglobulinas. Tais regiões de ligação a antígeno são caracterizadas, em parte, pela presença de regiões hipervariáveis, que são comumente referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Existem três CDRs para cadeias pesadas e leves (ou seja, um total de seis CDRs) com ambas as CDR1 e CDR2 sendo totalmente codificadas pelo segmento gênico V. A CDR3, no entanto, é codificada pela sequência resultante da junção dos segmentos V e J para cadeias leves e dos segmentos V, D e J para cadeias pesadas. Assim, o segmento gênico adicional empregado durante a recombinação para formar uma sequência codificante de região variável de cadeia pesada aumenta significativamente a diversidade dos sítios de ligação a antígeno de cadeias pesadas. Assim, os animais não humanos fornecidos contendo uma região DH manipulada conforme descrito neste documento geram diversidade de CDR3 caracterizada pela recombinação de DH a DH e têm um comprimento de aminoácido aumentado em comparação com regiões CDR3 de regiões variáveis de cadeia pesada geradas pela recombinação de VDJ tradicional.

[00172] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a diversidade adicional no repertório de CDR3 de cadeia pesada pode ser possível através do aumento do número de junções que formam a sequência gênica da região variável de cadeia pesada rearranjada e/ou aumentando o comprimento da região CDR3. Um mecanismo para aumentar o número de junções e/ou aumentar o comprimento da região CDR3 pode ser através da união de um primeiro segmento DH (que pode ser genericamente referido como DH“A”) a outro segmento DH (que pode ser genericamente referido como DH”B”) em um evento de recombinação DH-DH antes de eventos subsequentes de recombinação de DH-JH e V-DHJH, levando a sequência gênica VH(DHA- DHB)JH. Em natureza, os eventos de recombinação de DH-DH foram considerados há muito tempo proibidos pela regra 12/23 (Alt, F.W. et al., 1984, EMBO J. 3(6):1209-19; incorporado neste documento por referência em sua totalidade). No entanto, parece que os eventos de recombinação de DH-DH realmente ocorrem em frequência muito baixa em humanos, contradizendo a regra 12/23, (1 em 800 ou ~0,125% células B virgens; vide, por exemplo, Ollier, P.J. et al. 1985, EMBO J. 4(13B):3681-88; Milner, E.C.B. et al. 1986, Immunol. Today 7 :36-40; Liu, Z. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15(11):4688; Liu, Z. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15(15):6296; Meek, K.D. et al., 1989, J. Exp. Med. 169(2):519-33; Meek, K.D. et al., 1989, J. Exp. Med. 170:39-57; Baskin, B. et al. 1998, Clin. Exp. Immunol. 112:447; Briney, B.S. et al., 2012 Immunol. 137: 56-64; cada um dos quais está incorporado integralmente neste documento por referência) e pensa-se que sejam o mecanismo primário para a geração de CDR3s incomumente longas observadas em algumas cadeias pesadas (Janeway’s Immunobiology. 9a Edição. Kenneth Murphy, Casey Weaver. Capítulo 5, 2017; incorporado integralmente por referência). No entanto, alguns alvos terapêuticos potenciais (por exemplo, mas não limitados a, vírus, receptores de superfície celular, proteínas transmembrana tipo IV similar a GPCRs, canais iônicos) têm epítopos mascarados ou recessos que são inacessíveis a anticorpos normais, mas podem ser reconhecidos por anticorpos com sequências de HCDR3 longas. Por exemplo, anticorpos com HCDR3s muito longos são frequentemente encontrados em pacientes com infecções virais crônicas e, em alguns casos, têm atividade amplamente neutralizante (por exemplo, anticorpos amplamente neutralizantes contra HIV-1 ou influenza). Para selecionar anticorpos capazes de alcançar esses epítopos ocultos, seria útil aumentar a frequência de cadeias pesadas com HCDR3s muito longos. Sem desejar estar vinculado pela teoria, uma maneira de alcançar isso é aumentar a frequência de rearranjos de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada, pela manipulação de segmentos de DH para compreender uma RSS de 23-mer e/ou aumentar a frequência de recombinação de um segmento gênico DH para o segmento gênico JH6 mais longo. Em camundongos, acredita-se que a união de DH-JH ocorra em duas etapas ordenadas: (1) rearranjo primário do segmento DQ52 proximal (denominado DH7-27 em humanos) para um dos segmentos JH mais próximos (JH1 ou JH2). O promotor μ0 forte a montante de DQ52 permite então que os segmentos de JH restantes (JH3 e JH4) sejam mais acessíveis aos genes ativadores de recombinação (RAGs); (2) rearranjo secundário de um segmento de DH distal para um dos segmentos de JH restantes (JH3 ou JH4). Ver a Figura 1, painel superior. Isso é consistente com o uso mais frequente de segmentos de JH a jusante observados em camundongos (JH3-JH4) e humanos (JH4-JH6) (Nitschke et al. 2001 J. Immunol. 166:2540-52, incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Sem desejar estar vinculado pela teoria, há a hipótese que a substituição de DH7-27 e JH1-JH3 (ou JH1-JH5) por um gene DH sintético (por exemplo, um segmento DH3-3 sintético) com uma RSS de 23-mer 5’ e RSS de 12-mer 3’ resultaria em uma alta frequência de recombinação de VH(DH- DH)JH e pode ocorrer por um mecanismo de três etapas: (1) rearranjo de 23- DH-12 para JH4, JH5, ou JH6 para produzir um 23(DH)JH, (2) rearranjo de um DH distal (DH1-1 a DH1-26) para o 23(DH)JH para produzir um rearranjo de 12(DH-DH)JH (VH para 23(DH)JH seria proibido pela regra 12/23), (3) rearranjo de VH para 12(DH-DH)JH para produzir uma sequência codificadora VDDJ que codifica um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Figura 1, painel inferior. Foi também formulada a hipótese de que substituir os segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15, que são segmentos gênicos DH longos (compreendendo mais de 31 nucleotídeos que codificam duas cisteínas que formam podem formar uma ligação dissulfeto que se acredita estabilizar regiões HCDR3 longas [ver, por exemplo, Wang et al. 2013 Célula 153:1379-93, incorporada neste documento em sua totalidade por referência], respectivamente, com esses segmentos gênicos operacionalmente ligados a uma RSS de extremidade 5’ 12-mer e RSS de extremidade 3’ 23-mer também resultaria em uma alta frequência de recombinação de VH(DH-DH)JH que pode ocorrer por um mecanismo de três etapas: (1) rearranjo de 12:DH-12 para JH4, JH5, ou JH6 para produzir um 12(DH)JH, (2) rearranjo de um 12:DH2-2:23 distal, 12:DH2-8:23, ou 12:DH2-15-23 para 12(DH)JH para produzir um 12(DH-DH)JH, e (3) rearranjo de VH para 12(DH- DH)JH para produzir uma sequência codificadora VDDJ que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina. Conforme descrito neste documento, uma região DH manipulada foi construída colocando um espaçador de 23-mer em uma posição flanqueadora de 5' ou 3' adjacente a um ou mais segmentos de DH, permitindo assim a recombinação de DH para DH em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada.

[00173] Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento compreendem um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que demonstra recombinação de VDJ que não segue a regra 12/23 em comparação com um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento compreendem uma ou mais RSSs adjacentes ou flanqueando um ou mais segmentos de DH que são modificados em comparação com segmentos de DH do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de um animal não humano, conforme descrito neste documento, estão operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’ de modo que a frequência de recombinação de DH-DH seja aumentada no animal não humano em comparação com um animal não humano de referência. A eficiência e/ou frequência de recombinação pode ser determinada, em algumas modalidades, por frequências de utilização de segmentos gênicos em uma população de sequências de anticorpos (por exemplo, de um indivíduo ou grupo de indivíduos; ver por exemplo, Arnaout, R. et al., 2011, PLoS One 6(8):e22365; Glanville, J. et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 108(50):20066-71; cada um dos quais está incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Assim, os animais não humanos descritos neste documento podem, em algumas modalidades, compreender um ou mais segmentos de DH que estão cada um operacionalmente ligados ou flanqueados por uma RSS de 23-mer de modo que a recombinação de DH-DH ocorra em uma frequência aumentada em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 3 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região de DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 4 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 5 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 10 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 20 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 30 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 40 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, exibe uma frequência pelo menos 50 vezes maior de recombinação de DH-DH em comparação com a recombinação de DH-DH em um animal não humano de referência.

Sistemas in vivo fornecidos

[00174] A presente invenção é baseada no reconhecimento de que os antígenos particulares estão associados a imunogenicidade baixa e/ou fraca e, portanto, são alvos fracos para terapêuticas baseadas em anticorpos. De fato, muitos alvos de doença (por exemplo, vírus, proteínas de canal) foram caracterizados como intratáveis ou não-medicáveis. Assim, a presente invenção é baseada na criação de um sistema in vivo para o desenvolvimento de anticorpos e terapêuticas baseadas em anticorpos que superam deficiências associadas com tecnologias e/ou abordagens de descoberta de drogas estabelecidas. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um sistema in vivo caracterizado pela presença de loci de imunoglobulina, em particular, loci de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, que incluem uma região DH manipulada em que um ou mais RSS de DH são alterados, modificados ou manipulados de um formato 12- mer-DH-12-mer para um formato de 12-mer-DH-23-mer ou formato 23-mer- DH-12-mer, permitindo assim que a recombinação de DH para DH em uma frequência aumentada em comparação com recombinação de DH para DH observada em um sistema in vivo de referência. A presente divulgação demonstra especificamente a construção de um roedor transgênico cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada, em que a região DH manipulada inclui um ou mais segmentos DH que estão cada um operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer posicionada em relação a cada um dentre um ou mais segmentos DH para permitir uma frequência aumentada de recombinação de DH-DH. Os métodos descritos neste documento podem ser adaptados para alcançar qualquer número de segmentos de DH (por exemplo, tradicionais ou sintéticos) em que cada um esteja operacionalmente ligado a uma RSS de 23- mer 5' ou 3' para criar uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento. A região DH manipulada, uma vez integrada em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (ou seja, colocada em ligação operacional com segmentos gênicos VH e JH e/ou uma ou mais regiões constantes), fornece a recombinação de segmentos gênicos VH e JH com a uma ou mais segmentos de DH, por exemplo, para gerar anticorpos caracterizados por cadeias pesadas possuindo diversidade adicional (ou seja, CDR3s longas, por exemplo, em que pelo menos 95% das sequências de CDR3 de cadeia pesada possuem pelo menos 14 aminoácidos de comprimento) para direcionar a ligação a antígenos específicos. Em algumas modalidades, tais regiões variáveis de cadeia pesada têm a capacidade de acessar epítopos difíceis de alcançar em vírus, proteínas de canal, GPCRs, etc.

[00175] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, observamos que os dados fornecidos neste documento demonstram que, em algumas modalidades, roedores cujo genoma compreende um locus variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada caracterizada pela inclusão de um segmento DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer em 5’ efetivamente gera anticorpos produzidos por recombinação de V(DD)J. Nós também observamos que os dados fornecidos neste documento demonstram que, em algumas modalidades, roedores cujo genoma compreende um locus variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada caracterizada pela inclusão de três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3' efetivamente gera anticorpos produzidos por recombinação de V(DD)J. É também observado neste documento que a deleção de alguns ou todos os cinco segmentos gênicos JH a montante do segmento gênico JH6 resulta em recombinação preferencial ao segmento gênico JH6. Notavelmente, o segmento gênico JH6 compreende 63 nucleotídeos, por exemplo, 10 mais nucleotídeos do que os outros segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4 e JH5, que compreendem respectivamente 52, 53, 50, 40 e 51 nucleotídeos. Assim, a presente divulgação, em pelo menos algumas modalidades, abraça o desenvolvimento de um in vivo sistema para gerar anticorpos e/ou terapias baseadas em anticorpos para alvos de doenças intratáveis, por exemplo, fornecendo roedores que geram sequências gênicas de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada, por exemplo, VHDHJH e VH(DHA-DHB)JH, por exemplo, sequências de VH(DHA-DHB)JH6, codificando domínios variáveis da cadeia pesada com comprimentos de CDR3 de pelo menos 20 aminoácidos, por exemplo, comprimentos de CDR3 entre 20-30 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, pelo menos 8-10% das sequências gênicas de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina rearranjadas, por exemplo, sequências gênicas de VHDHJH e VH(DHA-DHB)JH de um animal não humano descrito neste documento codifica regiões CDR3 que possuem pelo menos 21 aminoácidos de comprimento.

[00176] Em algumas modalidades, um animal não humano é descrito neste documento, por exemplo, um roedor, por exemplo, um rato ou um camundongo, que compreende (1) em seu genoma da linhagem germinativa, por exemplo, em uma célula germinativa, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região de DH manipulada compreendendo um segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, e (2) em seu genoma somático, por exemplo, em uma célula B, uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH, em que o primeiro ou segundo segmento gênico DH (ou seja, DHA ou DHB da sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH, respectivamente) compreende o segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, ou uma porção desta, por exemplo, em que o primeiro ou segundo segmento gênico DH tem pelo menos 9 nucleotídeos consecutivos alinhados com um segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, e em que cada um dentre o primeiro e o segundo segmento gênico DH compreendem pelo menos 5 nucleotídeos consecutivos alinhados com um segmento gênico DH de linhagem germinativa correspondente independentemente de qualquer sobreposição.

[00177] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus de cadeia pesada de imunoglobulina caracterizados pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos dispostos na configuração da linhagem germinativa e operacionalmente ligados a genes da regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina não humana, regiões potenciadoras e reguladoras. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana.

[00178] Em algumas modalidades, animais não humanos fornecidos compreendem pelo menos segmentos gênicos VH humanos VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3- 53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3- 20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 e VH6-1.

[00179] Em algumas modalidades, animais não humanos fornecidos compreendem segmentos gênicos DH humanos DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3- 16, DH4-17, DH5-18, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25 e DH1-26. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem ainda DH1-14, DH4-11, DH4-23, DH5-24, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem ainda DH7-27 humano.

[00180] Em algumas modalidades, um animal não humano é descrito neste documento, por exemplo, um roedor, por exemplo, um rato ou um camundongo, que compreende (1) em seu genoma da linhagem germinativa, por exemplo, em uma célula germinativa, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região de DH manipulada compreendendo um segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, e (2) em seu genoma somático, por exemplo, em uma célula B, uma sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH de cadeia pesada rearranjada, em que o primeiro ou segundo segmentos gênicos DH (ou seja, DHA ou DHB da sequência codificadora de VH(DHA-DHB)JH, respectivamente) compreende o segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, ou uma porção desta, por exemplo, em que o primeiro ou segundo segmento gênico DH tem pelo menos 9 nucleotídeos consecutivos alinhados com um segmento gênico DH ligado operacionalmente a uma RSS de 23-mer, e em que cada um dentre o primeiro e o segundo segmentos gênicos DH compreendem pelo menos 5 nucleotídeos consecutivos alinhados com um segmento gênico DH de linhagem germinativa correspondente, independentemente de qualquer sobreposição. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem segmentos gênicos DH humanos operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende dois códons de cisteína. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 37 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 19 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 23 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 28 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 31 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer contém pelo menos 37 nucleotídeos.

[00181] Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH2 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH4 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH5 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH6 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH7 humano.

[00182] Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1-1 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH2-2 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3-3 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH4-4 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH5-5 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH6-6 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1-7 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH2-8 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3-9 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3-10 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH5-12 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH6-13 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH2-15 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3-16 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH4-17 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH5-18 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH6-19 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1-20 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH2-21 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH3-22 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH6-25 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1-26 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH1-14 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH4-11 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH4-23 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH5-24 humano. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer compreende o segmento gênico DH7-27 humano.

[00183] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem o repertório completo ou substancialmente completo dos segmentos gênicos DH humanos geralmente dispostos na ordem encontrada em um locus variável genômico humano não rearranjado, em que um dos segmentos gênicos DH humanos do repertório completo ou substancialmente completo é substituído por um segmento gênico DH manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, um dos segmentos gênicos DH humanos do repertório completo ou substancialmente completo é substituído por um segmento gênico DH correspondente manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, um segmento gênico DH2-2 do tipo selvagem é substituído por um segmento gênico DH2-2 manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, um dos segmentos gênicos DH humanos do repertório completo ou substancialmente completo é substituído por outro segmento gênico DH manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, um segmento gênico DH7-27 do tipo selvagem é substituído por um segmento gênico DH3-3 manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, o segmento gênico DH1-1 de segmentos gênicos DH humanos de repertório completo ou substancialmente completo geralmente dispostos na ordem encontrada em um locus variável genômico humano não rearranjado é substituído por um segmento gênico DH correspondente ou alternativo manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, uma RSS de 23-mer 3'. Em algumas modalidades, o(s) segmento(s) gênico(s) DH1-1, DH2-2, DH2-8, DH2-15, DH2- 21 ou qualquer combinação destes de segmentos gênicos DH humano de repertório completo ou substancialmente completo geralmente disposto na ordem encontrada em um locus variável genômico humano não rearranjado é substituído por um segmento gênico DH correspondente ou alternativo manipulado para estar operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, uma RSS de 23-mer 3’. Em algumas modalidades, cada um dos segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15 de segmentos gênicos DH de repertório completo ou substancialmente completo humanos geralmente dispostos na ordem encontrada em um locus variável genômico humano não rearranjado é substituído por um segmento gênico DH correspondente ou alternativo manipulado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, por exemplo, uma RSS de 23-mer 3’.

[00184] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem pelo menos o segmento gênico JH humano JH6. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem pelo menos segmentos gênicos JH humanos JH4, JH5 e JH6. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem segmentos gênicos JH humanos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6.

[00185] Em algumas modalidades, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana inclui um ou mais genes de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana como, por exemplo, imunoglobulina M (IgM), imunoglobulina D (IgD), imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina E (IgE) e imunoglobulina A (IgA). Em algumas modalidades, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana inclui genes de região constante de IgM de roedor, IgD de roedor, IgG3 de roedor, IgG1 de roedor, IgG2b de roedor, IgG2a de roedor, IgE de roedor e de IgA de roedor. Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos de VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a um ou mais potenciadores de cadeia pesada de imunoglobulina não humanos (isto é, sequências potenciadoras ou regiões potenciadoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a uma ou mais regiões reguladoras de cadeia pesada de imunoglobulina não humanas (ou sequências reguladoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a um ou mais potenciadores de cadeia pesada de imunoglobulina não humana (ou sequência potenciadora) e uma ou mais regiões reguladoras de cadeia pesada de imunoglobulina não humana (ou sequência reguladora).

[00186] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos não contêm (ou carecem de) um gene Adam6 endógeno. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos não contém ou carecem de um gene Adam6 endógeno (ou sequência codificadora de Adam6) na mesma posição genômica da linhagem germinativa encontrada em um genoma de linhagem germinativa de um animal não humano do tipo selvagem da mesma espécie. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos não contêm ou carecem de um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem a inserção de pelo menos uma sequência nucleotídica que codifica um ou mais polipeptídeos de Adam6 não humanos (por exemplo, roedores). A referida inserção pode estar fora de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina manipulado, conforme descrito neste documento, (por exemplo, a montante de um segmento gênico mais a 5' de VH), dentro de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina manipulado ou em outro lugar no genoma da linhagem germinativa de um animal não humano (por exemplo, uma sequência codificadora de Adam6 não humana randomicamente introduzida), célula ou tecido. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos não contêm ou carecem um pseudogene Adam6 endógeno funcional.

[00187] Em várias modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não expressam detectavelmente, no todo ou em parte, uma região de VH não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em várias modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não contêm (ou carecem ou contêm uma deleção de) uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam, no todo ou em parte, uma região de VH não humana endógena (por exemplo, VH, DH e/ou JH) em uma molécula de anticorpo. Em várias modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, têm um genoma da linhagem germinativa que inclui uma deleção dos segmentos gênicos VH, DH e JH não humanos endógenos, no todo ou em parte. Em várias modalidades, um animal não humano fornecido é fértil.

[00188] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulados caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos VK e JK humanos dispostos na configuração da linhagem germinativa e inseridos a montante e operacionalmente ligados a um gene de Ck não humano. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina k manipulado compreende pelo menos segmentos gênicos Vk humano que aparecem no agrupamento variável proximal (ou braço proximal, ou duplicação proximal) de um locus de cadeia leve de imunoglobulina k humano que aparece na natureza. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina k manipulado compreende pelo menos segmentos gênicos Vk humanos Vk2-40, Vk1-39, Vk1-33, Vk2-30, Vk2-8, Vk1-27, Vk2-24, Vk6-21, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-12, Vk3- 11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2 e Vk4-1. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina k manipulado compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou 15 segmentos gênicos Vk selecionados de Vk2-40, Vk1-39, Vk1-33, Vk2-30, Vk2-8, Vk1-27, Vk2-24, Vk6-21, Vk3-20, Vk1- 17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2 e Vk4-1. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina k manipulado compreende segmentos gênicos Jk humanos Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 e Jk5. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina k manipulado compreende pelo menos 1, 2, 3, ou 4 segmentos gênicos Jk humanos selecionados de Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 e Jk5.

[00189] Em várias modalidades, os referidos segmentos gênicos Vk e Jk humanos estão operacionalmente ligados a um ou mais potenciadores de cadeia leve de imunoglobulina k não humana (ou seja, sequências potenciadoras ou regiões potenciadoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos Vk e Jk humanos estão operacionalmente ligados a uma região potenciadora intrônica de cadeia leve de Igk murina (Ig K Ei ou EÍK). Em várias modalidades, os referidos segmentos gênicos VK e JK humanos estão operacionalmente ligados a uma ou mais regiões reguladoras de cadeia leve de imunoglobulina K não humana (ou regiões reguladoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VK e JK humanos estão operacionalmente ligados a uma região potenciadora 3' de cadeia leve de IgK de murino (Ig K 3'E ou 3'EK). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VK e JK humanos estão operacionalmente ligados a um EiK murino e operacionalmente ligados a um 3'EK murino. Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VK e JK estão operacionalmente ligados a ou mais potenciadores de cadeia leve de imunoglobulina K não humana (ou sequências potenciadoras ou regiões potenciadoras) e uma ou mais regiões reguladoras (ou sequências reguladoras) de cadeia leve de imunoglobulina K não humana. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulado não contém as mesmas regiões potenciadoras (ou sequências potenciadoras) de cadeia leve de imunoglobulina K não humana que aparecem em um locus de cadeia leve de imunoglobulina K de tipo selvagem. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulado contém regiões potenciadoras de cadeia leve de imunoglobulina K não humana (ou sequências potenciadoras) que aparecem em um locus de cadeia leve de imunoglobulina K do tipo selvagem de uma espécie diferente (por exemplo, uma espécie de roedor diferente).

[00190] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulado, conforme descrito neste documento, não contém (ou carece de) um gene VpreB humano (ou sequência codificadora do gene VpreB humano).

[00191] Em algumas modalidades, um gene CK não humano de um locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulado inclui um gene CK de roedor, tal como, por exemplo, um gene CK de camundongo ou um gene CK de rato. Em algumas modalidades, um gene CK não humano do locus de cadeia leve de imunoglobulina K manipulado é ou compreende um gene CK de camundongo de um fundo genético que inclui uma linhagem 129, uma linhagem BALB/c, uma linhagem C57BL/6, uma linhagem 129xC57BL/6 mista ou suas combinações.

[00192] Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não expressam detectavelmente, no todo ou em parte, uma região de Vk não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não contêm (ou carecem ou contêm uma deleção de) uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam, no todo ou em parte, uma região de Vk não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, têm um genoma da linhagem germinativa que inclui uma deleção dos segmentos gênios de Vk e Jk não humanos endógenos, no todo ou em parte.

[00193] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem ainda um locus de cadeia leve de imunoglobulina X do tipo selvagem ou inativada (por exemplo, por direcionamento de gene).

[00194] Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não expressam detectavelmente, no todo ou em parte, uma região de VX não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, não contêm (ou carecem ou contêm uma deleção de) uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam, no todo ou em parte, uma região VX não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, têm um genoma da linhagem germinativa que inclui uma deleção dos segmentos gênios de VÀ e JÀ não humanos endógenos, no todo ou em parte. Em algumas modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano fornecidos, conforme descrito neste documento, têm um genoma da linhagem germinativa que inclui uma deleção dos segmentos gênicos VÀ, JÀ e CÀ não humanos endógenos, no todo ou em parte.

[00195] A orientação para a criação de vetores de direcionamento, células não humanas e animais que abrigam tais loci de imunoglobulina manipulados pode ser encontrada nas Patentes US N° 8,642,835, 8,697,940, 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 e 9,163,092, que são incorporadas por sua totalidade de referência neste documento. As pessoas versadas na técnica estão cientes de uma variedade de tecnologias, conhecidas na técnica, para a realização de tal manipulação e/ou manejo genético de genomas não humanos (por exemplo, mamíferos) ou para preparar, fornecer ou fabricar tais sequências para a introdução no genoma da linhagem germinativa de animais não humanos.

Construtos de DNA

[00196] Tipicamente, uma molécula de polinucleotídeo contendo segmentos gênicos de imunoglobulina, conforme descrito neste documento, em particular, um ou mais segmentos de DH que estão operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’ é inserida em um vetor, preferencialmente um vetor de DNA, a fim de replicar a molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira adequada.

[00197] Devido ao tamanho, segmentos de DH podem ser clonados diretamente a partir de fontes genômicas disponíveis em fornecedores comerciais ou projetadas in silico com base em sequências publicadas disponíveis no GenBank. Como alternativa, bibliotecas de cromossomo artificial bacteriano (BAC) podem fornecer sequências de imunoglobulina. As bibliotecas de BAC podem conter um tamanho de inserto médio de 100-150 kb e são capazes de abranger insertos tão grandes quanto 300 kb (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213218; incorporados neste documento por referência nas suas totalidades). Por exemplo, foram construídas bibliotecas genômicas BAC humanas e de camundongo e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Invitrogen, Carlsbad Calif.). Bibliotecas genômicas de BAC também podem servir como uma fonte de sequências de imunoglobulina, bem como regiões de controle transcricional.

[00198] Alternativamente, as sequências de imunoglobulina podem ser isoladas, clonadas e/ou transferidas de cromossomos artificiais de levedura (YACs). Um locus de imunoglobulina inteiro, ou porção substancial deste, pode ser clonado e contido dentro de um ou alguns YACs. Se vários YACs forem empregados e contiverem regiões de homologia sobreposta, eles podem ser recombinados dentro de cepas hospedeiras de levedura para produzir um único construto representando um locus inteiro. Braços YAC podem ser modificados adicionalmente com cassetes de seleções de mamíferos por readaptação para ajudar a introduzir os construtos em células tronco embrionárias ou embriões por métodos conhecidos no estado da técnica e/ou descritos neste documento.

[00199] Os construtos de DNA podem ser preparados utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um construto de DNA pode ser preparado como parte de um plasmídeo maior. Tal preparação permite a clonagem e a seleção dos construtos corretos de forma eficiente como é conhecida no estado da técnica. Fragmentos de DNA contendo uma ou mais segmentos DH que são cada um ligados operacionalmente a uma RSS de 23-mer 5' ou 3', conforme descrito neste documento, podem estar localizados entre sítios de restrição convenientes no plasmídeo, de modo que possam ser facilmente isolados das sequências de plasmídeo restantes para incorporação no animal desejado.

[00200] Em algumas modalidades, métodos empregados na preparação de plasmídeos e transformação de organismos hospedeiros são conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas como eucarióticas, bem como procedimentos recombinantes gerais, ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

Produção de Animais Não Humanos

[00201] São fornecidos animais não humanos que expressam anticorpos com diversidade de CDR3 de cadeia pesada caracterizada por longo comprimento de aminoácidos resultante da integração de RSSs de 23- mer adjacentes a um ou mais segmentos de DH que permitem a recombinação de DH-a-DH dentro de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina no genoma do animal não humano. Exemplos adequados descritos neste documento incluem roedores, em particular, camundongos. Um ou mais segmentos de DH, em muitas modalidades, incluem segmentos de DH heterólogos (por exemplo, segmentos de DH humanos). Também são fornecidos animais não humanos, embriões, células e construtos de direcionamento para produzir animais não humanos, embriões não humanos e células contendo os referidos segmentos de DH que são capazes de recombinação de DH-DH em uma frequência aumentada em comparação com animais não humanos do tipo selvagem ou de referência.

[00202] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH são modificados para serem adjacentes (ou operacionalmente ligados) a uma RSS de 23-mer 5' ou 3' dentro de um cluster de diversidade (ou seja, uma região de DH) de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina no genoma de um animal não humano. Em algumas modalidades, uma região de DH (ou porção da mesma) de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina não é deletada (ou seja, encontra-se intacta). Em algumas modalidades, uma região de DH (ou porção da mesma) de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina é alterada, interrompida, excluída, manipulada ou substituída por um ou mais segmentos de DH que estão cada um operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5' ou 3'. Em algumas modalidades, toda ou substancialmente toda uma região de DH é substituída por uma ou mais segmentos de DH sintéticos que estão operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5' ou 3'; em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH tradicionais não são deletados ou substituídos em uma região de DH de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina. Em algumas modalidades, uma região DH contém segmentos de DH tradicionais (ou seja, um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS 5’ 12-mer e uma RSS de 12-mer 3’) e segmentos gênicos DH manipulados (ou seja, um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’. Em algumas modalidades, uma região de DH conforme descrito neste documento é uma região de DH sintética. Em algumas modalidades, uma região de DH é uma região de DH humana. Em algumas modalidades, uma região de DH é uma região de DH murina. Em algumas modalidades, uma região de DH modificada (ou porção da mesma) conforme descrito neste documento é inserida numa região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de modo a que a dita região de DH manipulada (ou porção da mesma) esteja operacionalmente ligada a um ou mais segmentos gênicos VH e/ou um ou mais segmentos de gene de JH. Em algumas modalidades, a referida região de DH manipulada é inserida em uma das duas cópias de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, dando origem a um animal não humano que é heterozigoto em relação à referida região de DH manipulada. Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido é homozigoto para uma região de DH manipulada. Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido é heterozigoto para uma região de DH manipulada.

[00203] Em algumas modalidades, um animal não humano, conforme descrito neste documento, contém uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana aleatoriamente integrada que inclui uma região de DH que contém um ou mais segmentos de DH que estão cada um operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5' ou 3' dentro do seu genoma. Assim, tais animais não humanos podem ser descritos como tendo um transgene de cadeia pesada de imunoglobulina humana contendo uma região de DH manipulada. Uma região de DH manipulada pode ser detectada usando uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), ou um ensaio de ganho (GOA) ou perda (LOA) de alelos. Em algumas destas modalidades, um animal não humano descrito neste documento é heterozigoto em relação a uma região de DH manipulada conforme descrito neste documento. Em algumas destas modalidades, um animal não humano descrito neste documento é homozigoto em relação a uma região de DH manipulada conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento é hemizigoto em relação a uma região de DH manipulada conforme descrito neste documento. Em algumas destas modalidades, um animal não humano descrito neste documento contém uma ou mais cópias de uma região de DH manipulada conforme descrito neste documento.

[00204] Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui pelo menos um segmento DH que está associado a (ou operacionalmente ligado a) uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui pelo menos um segmento de DH que está associado a (ou operacionalmente ligado a) uma RSS de 23-mer 3’. Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui pelo menos um segmento de DH3-3 humano que está associado a (ou operacionalmente ligado a) uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui pelo menos um segmento de DH2 humano que está associado a (ou operacionalmente ligado a) uma RSS de 23-mer 3’, em que o segmento de DH2 humano é selecionado a partir do grupo consistindo em DH2-2 humano, DH2-8 humano, DH2-15 humano e DH2-21 humano.

[00205] Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui mais de um segmento de DH que estão, cada um, associados a (ou operacionalmente ligados a) uma RSS de 23-mer 5’. Em algumas modalidades, uma região de DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui mais de um segmento DH que estão, cada um, associados a (ou operacionalmente ligados a) uma RSS de 23-mer 3’. Em algumas modalidades, uma região DH manipulada de um animal não humano conforme descrito neste documento inclui segmentos de DH2-2 humanos, DH2-8 humanos e DH2-15 humanos que estão, cada um, associados a (ou operacionalmente ligados a) uma RSS de 23-mer 3’.

[00206] Composições e métodos para produzir animais não humanos cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região de DH manipulada, em que a região DH manipulada inclui um ou mais segmentos de DH que estão associados a (ou operacionalmente ligados a) uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’, são fornecidos, incluindo composições e métodos para produzir animais não humanos que expressam anticorpos compreendendo uma região variável de cadeia pesada que inclui uma região CDR3 com uma sequência de aminoácidos codificada por mais de um segmento de DH de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina que contém segmentos gênicos VH e a JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante de cadeia pesada não humanos. Em algumas modalidades, composições e métodos para produzir animais não humanos que expressam tais anticorpos sob o controle de potenciador(es) endógeno(s) e/ou sequência(s) reguladora(s) endógena(s) também são fornecidos. Em algumas modalidades, são também fornecidos composições e métodos para produzir animais não humanos que expressem esses anticorpos sob o controle de potenciador(es) heterólogo(s) e/ou sequência(s) reguladora(s) heteróloga(s). Os métodos incluem inserir um ou mais segmentos de DH e outras sequências que permitem a recombinação de DH-DH em uma frequência aumentada em comparação com segmentos de DH do tipo selvagem, no genoma de um animal não humano de modo que um anticorpo seja expresso que inclua cadeias pesadas de imunoglobulina resultantes da recombinação de V(DD)J.

[00207] Em algumas modalidades, os métodos incluem inserir DNA que inclui um segmento gênico DH com uma RSS de 23-mer 5' e uma RSS de 12-mer 3' operacionalmente ligadas a um ou mais segmentos gênicos JH. Conforme descrito neste documento, o segmento gênico DH é posicionado a jusante de uma sequência promotora μ 0. Em algumas modalidades, os métodos incluem inserir um segmento de DH com uma RSS de 23-mer 5’ e uma RSS de 12-mer 3’ em uma posição relativa a uma sequência promotora μ 0 de modo que o referido segmento gênico JH fique acessível aos genes RAG (por exemplo, RAG-1 e/ou RAG-2) durante a recombinação. O material genético que inclui o segmento de DH e RSSs flanqueadoras descritos acima pode ser inserido no genoma de um animal não humano, criando assim um animal não humano com uma região de DH manipulada que contém o referido segmento DH e RSSs necessárias para permitir a recombinação com um segmento gênico DH adjacente e segmentos gênicos VH e JH.

[00208] Em algumas modalidades, os métodos incluem a inserção de DNA que inclui três segmentos gênicos DH, cada um associado a uma RSS de 12-mer 5’ e uma RSS 23-mer de 3’ operacionalmente ligada a seis segmentos gênicos JH. Conforme descrito neste documento, os segmentos gênicos DH são posicionados entre uma pluralidade de segmentos gênicos DH que estão, cada um, associados a uma RSS de 12-mer 5’ e 3’. Em algumas modalidades, os métodos incluem inserir segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15, cada um associado a uma RSS de 12-mer 5’ e uma RSS de 23-mer 3’ em um cluster de diversidade com uma pluralidade de outros segmentos gênicos DH, cada um associado a uma RSS tradicional ou do tipo selvagem. O material genético que inclui os segmentos gênicos DH e RSSs flanqueadoras descritos acima podem ser inseridos no genoma de um animal não humano, criando assim um animal não humano com uma região de DH manipulada que contém os referidos segmentos de DH e RSSs necessárias para permitir a recombinação com segmentos gênicos DH adjacentes e segmentos gênicos VH e JH.

[00209] Quando apropriado, as sequências correspondentes a (ou que codificam) aos segmentos de DH podem ser modificadas para incluir códons que são otimizados para expressão no animal não humano (por exemplo, ver Patente US N° 5,670,356 e 5,874,304; cada uma das quais está incorporada por referência em sua totalidade). Sequências de códon otimizado são sequências sintéticas e, preferencialmente, codificam o polipeptídeo idêntico (ou um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo de comprimento total que possui substancialmente a mesma atividade que o polipeptídeo de comprimento total) codificado pelo polinucleotídeo de origem sem códon otimizado. Em algumas modalidades, as sequências correspondentes (ou que codificam) aos segmentos de DH podem incluir uma sequência alterada para otimizar o uso de códons para um tipo de célula específica (por exemplo, uma célula de roedor). Por exemplo, os códons das sequências correspondentes aos segmentos de DH a serem inseridos no genoma de um animal não humano (por exemplo, um roedor) podem ser otimizados para expressão em uma célula do animal não humano. Essa sequência pode ser descrita como uma sequência de códon otimizado.

[00210] A inserção de segmentos de DH operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5' ou 3' em uma região de DH de modo que os referidos segmentos de DH estejam operacionalmente ligados aos segmentos gênicos VH e JH (por exemplo, uma pluralidade de segmentos gênicos VH e JH) emprega uma modificação relativamente mínima do genoma e resulta na expressão de anticorpos compreendendo cadeias pesadas caracterizadas por CDR3s com comprimentos de aminoácidos mais longos.

[00211] Os métodos para gerar animais não humanos transgênicos, incluindo knockouts e knock-ins, são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000); incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Por exemplo, a geração de roedores transgênicos pode envolver, opcionalmente, a ruptura dos loci genéticos de um ou mais genes de roedores endógenos (ou segmentos gênicos) e a introdução de um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, no genoma do roedor, em alguns modalidades, no mesmo local que um gene de roedor endógeno (ou segmentos gênicos). Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23- mer são introduzidos em uma região de DH de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina aleatoriamente inserido no genoma de um roedor. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, são introduzidos em uma região de DH de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno no genoma de um roedor; em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina é alterado, modificado ou manipulado para conter segmentos gênicos humanos (por exemplo, V e/ou J) operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante (por exemplo, humano ou murino).

[00212] Uma ilustração esquemática (fora de escala) de vetores de direcionamento representativos para construir uma região de DH manipulada e integração em células-tronco embrionárias (ES) de roedor para criar um roedor cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui um cluster de diversidade manipulada (ou seja, região de DH), em que o cluster de diversidade inclui um ou mais segmentos DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’, é fornecida na Figura 2. São fornecidas estratégias e métodos exemplares para inserir tais vetores em regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina no genoma de células ES de roedores nas Figuras 3-8. Em cada uma das Figuras 2-8, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição NotI são indicados foram apropriados, nomes e locais aproximados (traço menor) de vários conjuntos de primer/sonda (ver Tabela 4) são indicados para vários alelos mostrados (fora de escala), e salvo indicação em contrário, símbolos e linhas abertos representam a sequência humana, enquanto símbolos fechados e linhas escuras representam a sequência de camundongo. As seguintes abreviações são usadas para cada uma das figuras, spec: gene de resistência à espectinomicina; neo: gene de resistência à neomicina; hyg: gene de resistência à higromicina; lp: sítio de reconhecimento de recombinação específico do sítio loxP; Ei: potencializador intrônico de cadeia pesada murino; IgM: gene de região constante M de imunoglobulina murina; L: sequência do sítio loxP; Frt: Sequência alvo de reconhecimento de Flippase;μ0 pro: sequência promotora μ0.

[00213] Conforme ilustrado na Figura 2, fragmentos de DNA contendo uma pluralidade de segmentos de DH com um segmento de DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’ (Figura 2, em cima e no meio) ou com três segmentos de DH, cada um operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 3’ (Figura 2, embaixo) são produzidos usando tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Patente US N° 6,586,251 e Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; incorporados neste documento por referência em sua totalidade) e técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica. Na Figura 2, salvo indicação em contrário, símbolos e linhas abertos representam a sequência humana, enquanto símbolos fechados e linhas escuras representam a sequência de camundongo. As localizações relativas fora de escala dos segmentos de gene humanos VH6-1, DH2-2, DH2- 8, DH2-15, DH3-3 e JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6 são representadas, quando presentes, e qualquer segmento gênico que permaneça sem nome é um segmento gênico DH. Em geral, a região de DH representada pelos cardinais compreende o repertório completo dos segmentos gênicos DH humanos não rearranjados (ver, por exemplo, www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=l ocus&species=human&group=IGH; incorporado neste documento por referência em sua totalidade) com as seguintes exceções: os dois vetores de direcionamento superior não possui o último gene de DH7-27, que é substituído por uma sequência compreendendo o segmento gênico DH3-3 flanqueado por uma RSS de 23-mer na extremidade 5’ e uma RSS de 12-mer na extremidade 3’ (representada como uma seta aberta); o vetor de direcionamento inferior não possui o segmento gênico DH2-2 humano não rearranjado, o segmento gênico DH2-8 humano não rearranjado, e os segmentos gênicos DH2-15, que são substituídos, respectivamente, pelo segmento gênico DH2-2 flanqueado por uma RSS de 12-mer na extremidade 5’ e uma RSS de 23-mer na extremidade 3’, o segmento gênico DH2-8 flanqueado por uma RSS de 12-mer na extremidade 5’ e uma RSS de 23-mer na extremidade 3’, e o segmento gênico DH2-15 flanqueado por uma RSS de 12-mer na extremidade 5’ e uma RSS de 23-mer na extremidade 3’ (sendo cada um dos segmentos gênicos DH2-2, DH2-8, e DH2-15 manipulados representado por uma seta aberta). Os retângulos verticais não preenchidos representam 40-mers artificiais exclusivos homólogos a primers e sondas de sequência colocados no vetor de direcionamento 12:DH2-2:23I12:DH2-8:23I12:DH2-15:23 para ajudar a garantir a modificação correta do vetor de direcionamento/célula ES. As sequências para os 40-mers artificiais exclusivos denotados como “1,” “2,” “10,” “16,” “8” e “18” são estabelecidas como SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:78, respectivamente.

[00214] Fragmentos de DNA são montados com braços de homologia para inserção direcionada precisa em um locus de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (Figuras 3, 5, 7). Cassetes de seleção (por exemplo, neomicina) flanqueados por sítios de reconhecimento de recombinação sítio-específicos (por exemplo, loxP) são incluídos nos vetores de direcionamento para facilitar a triagem da inserção adequada em clones de células ES e podem ser removidos por expressão transitória de uma recombinase (por exemplo, Cre) em clones de células ES positivos (Figuras 4, 6, 8). Os fragmentos de DNA incluem as sequências necessárias para a montagem adequada (ou seja, recombinação), transcrição e expressão de regiões variáveis de cadeia pesada assim que estiverem integradas em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina. Os vetores de direcionamento são projetados de modo que a região DH manipulada seja flanqueada em 5' por DNA genômico de VH humano e em 3' por DNA genômico de JH humano e DNA de região constante de cadeia pesada genômico não humano (por exemplo, de roedor) (por exemplo, potenciador intrônico e um gene de região constante de IgM). Os vetores de direcionamento final para incorporação no genoma de uma célula não humana (por exemplo, uma célula-tronco embrionária de roedor) contêm DNA genômico de VH (por exemplo, contendo um ou mais segmentos gênicos VH), uma região de DH manipulada, DNA genômico 3' JH, e DNA de região constante de cadeia pesada genômico não humano (por exemplo, de roedor), todos os quais estão operacionalmente ligados de modo a permitir a recombinação entre segmentos gênicos VH, uma região de DH manipulada e um segmento gênico JH assim que forem integrados no genoma de um animal não humano. Uma vez montados, os vetores de direcionamento são linearizados e eletroporados em células ES de roedor.

[00215] Os vetores de direcionamento são introduzidos em células- tronco embrionárias de roedor (por exemplo, de camundongo) para que a sequência contida no vetor de direcionamento (ou seja, uma região DH manipulada) resulte na capacidade de uma célula não humana ou animal não humano (por exemplo, um camundongo) em expressar os anticorpos que contêm CDR3s com aminoácidos codificados por mais de um segmento DH.

[00216] Conforme descrito neste documento, roedores transgênicos são gerados onde uma região DH manipulada tiver sido introduzida em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno do genoma do roedor (por exemplo, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno manipulado para conter segmentos de gene de região variável humana, que pode ser um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno manipulado para tal).

[00217] Loci de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de região variável humana são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, na Pat. US N° 5,633,425; 5,770,429; 5,814,318; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; 6,998,514; 7,795,494; 7,910,798; 8,232,449;8,502,018; 8,697,940; 8,703,485; 8,754,287; 8,791,323; 8,809,051;8,907,157; 9,035,128; 9,145,588; 9,206,263; 9,447,177; 9,551,124; 9,580,491 e 9,475,559, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade, bem como na Pub. de Patente US N° 20100146647, 20110195454, 20130167256, 20130219535, 20130326647,20130096287, e 2015/0113668, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade, e na Pub. PCT N° WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, WO2010039900,WO2011004192, WO2011123708 e WO2014093908, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00218] Em algumas modalidades, animais não humanos conforme divulgados neste documento compreendem transgenes de imunoglobulina totalmente humanos exógenos compreendendo uma região de DH manipulada, que são capazes de se rearranjar em células B precursoras em camundongos (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236; incorporado neste documento em sua totalidade por referência). Nessas modalidades, os transgenes de imunoglobulina totalmente humanos compreendendo uma região de DH podem ser inseridos (aleatoriamente) e genes de imunoglobulina endógenos também podem ser nocauteados (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859, Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143; cada uma das publicações sendo incorporada por referência em sua totalidade), por exemplo, em que loci de cadeias leve K e cadeia pesada de imunoglobulina endógenos são inativados, por exemplo, por deleção direcionada de porções pequenas porém críticas de cada locus endógeno, seguido da introdução de loci de gene de imunoglobulina como transgenes grandes integrados randomicamente, ou minicromossomos (Tomizuka et al., 2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727;incorporado por referência em sua totalidade).

[00219] Em algumas modalidades, loci de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana ou humanizada compreendendo uma região de DH manipulada estão em loci de cadeia pesada e leve de imunoglobulina endógenos, respectivamente. Foi descrito anteriormente um método para uma grande substituição genética in situ dos loci do gene variável de imunoglobulina da linhagem germinativa de camundongo com loci do gene variável de imunoglobulina da linhagem germinativa humana, mantendo a capacidade dos camundongos em gerar descendência. Ver, por exemplo, Patente US N° 6,596,541 e 8,697,940, cada um das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Especificamente, descreve- se a substituição precisa de seis megabases de loci do gene variável de imunoglobulina de cadeia pesada e de cadeia leve K com suas contrapartes humanas enquanto deixa as regiões constantes de camundongo intactas. Como resultado, foram criados camundongos que têm uma substituição precisa de todo o repertório variável de imunoglobulina de linhagem germinativa com sequências variáveis de imunoglobulina de linhagem germinativa humana equivalente, mantendo as regiões constantes de camundongo. As regiões variáveis humanas estão ligadas às regiões constantes de camundongo para formar loci de imunoglobulina de humano-camundongo quiméricos que se rearranjam e expressam em níveis fisiologicamente apropriados. Os anticorpos expressos são "quimeras reversas", isto é, compreendem sequências de região variável humana e sequências de região constante de camundongo. Esses camundongos com regiões variáveis de imunoglobulina humanizada que expressam anticorpos com regiões variáveis humanas ou humanizadas e regiões constantes de camundongo são chamados de camundongos VELOCIMMUNE®.

[00220] Os camundongos humanizados VELOCIMMUNE® exibem um sistema imunológico humoral totalmente funcional que é essencialmente indistinguível daquele dos camundongos do tipo selvagem. Eles exibem populações de células normais em todos os estágios do desenvolvimento de células B. Eles exibem morfologia normal do órgão linfoide. As sequências de anticorpos de camundongos VELOCIMMUNE® apresentam rearranjo de V(D)J normal e frequências normais de hipermutação somática. As populações de anticorpos nestes camundongos refletem distribuições de isotipo que resultam de switching de classe normal (por exemplo, isotipo cis switching normal). Os camundongos VELOCIMMUNE® imunizadores resultam em respostas imunes humorais robustas que geram repertórios de anticorpos grandes e diversificados com domínios variáveis de imunoglobulina humana adequados para uso como candidatos terapêuticos. Esta plataforma fornece uma fonte abundante de sequências de região variável de imunoglobulina humanas naturalmente maturadas por afinidade para produzir anticorpos farmaceuticamente aceitáveis e outras proteínas de ligação a antígeno. Também foi demonstrado que a substituição de um único segmento gênico VH endógeno por um segmento gênico VH humano pode resultar em uma resposta imune compreendendo domínio variável de imunoglobulina humanizado. Ver, por exemplo, Tien et al. (2016) Cell 166:1471-84; incorporado neste documento em sua totalidade por referência. É a substituição precisa de sequências variáveis de imunoglobulina de camundongo por sequências variáveis de imunoglobulina humanas de modo que as sequências variáveis de imunoglobulina humanas estejam operacionalmente ligadas com sequência(s) gênica(s) de região constante não humana(s) endógena(s) em uma maneira quimérica reversa que permite a produção de camundongos VELOCIMMUNE®.

[00221] Os camundongos modificados em uma maneira quimérica reversa incluem camundongos modificados para compreender em um locus de imunoglobulina endógeno uma região variável humana(izada) (por exemplo, compreendendo (D), J, e um ou mais segmentos gênicos V humanos) operacionalmente ligados a uma região constante endógena, por exemplo, (a) em um locus de cadeia pesada endógeno: (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende uma pluralidade de segmentos gênicos VH da região variável de cadeia pesada humanos não rearranjados (por exemplo, todos os segmentos gênicos VH humanos não rearranjados funcionais), um ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados e um ou mais segmentos gênicos JH de cadeias pesadas de imunoglobulina não rearranjados, opcionalmente em que o um ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados e um ou mais segmentos gênicos JH de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados são um ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina humanos não rearranjados (por exemplo, todos os segmentos gênicos DH humanos funcionais) e/ou um ou mais segmentos gênicos JH de cadeia pesada de imunoglobulina humanos não rearranjados (por exemplo, todos os segmentos gênicos JH humanos funcionais); (ii) uma região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada restrita em ligação operável com uma região constante de cadeia pesada endógena, em que a região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada restrita consiste essencialmente de um único segmento gênico VH de região variável de cadeia pesada humana não rearranjada operacionalmente ligado a uma ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados e um ou mais segmentos gênicos JH de cadeias pesadas de imunoglobulina não rearranjados, opcionalmente em que o um ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados e um ou mais segmentos gênicos JH de cadeias pesadas de imunoglobulina não rearranjados são um ou mais segmentos gênicos DH de cadeia pesada de imunoglobulina humana não rearranjados e/ou um ou mais segmentos gênicos JH de cadeia pesada de imunoglobulina humanos não rearranjados, respectivamente; (iii) uma região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena, em que a região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina compreende uma sequência gênica variável de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjada compreendendo, em uma sequência codificadora de região determinante de complementariedade 3 (CDR3), uma substituição de pelo menos um códon para não-histidina por um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina; ou (iv) uma sequência codificadora apenas de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena, em que a região constante de cadeia pesada endógena compreende (1) um gene de IgM endógeno intacto que codifica um isotipo de IgM que se associa com a cadeia leve e (2) um gene de não IgM, por exemplo, um gene de IgG, sem uma sequência que codifica um domínio de CH1 funcional, em que o gene não IgM codifica um domínio de CH1 que não possui um isotipo de não IgM capaz de se associar covalentemente um domínio constante de cadeia leve; e/ou (b) em um locus de cadeia leve endógena: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende uma pluralidade de segmentos gênicos VL de região variável de cadeia leve humanos não rearranjados (por exemplo, todo os segmentos gênicos VL humanos não rearranjados funcionais) e um ou mais segmentos gênicos JL de cadeias leve de imunoglobulina não rearranjados, opcionalmente em que o um ou mais segmentos gênicos JL de cadeia leve de imunoglobulina não rearranjados são um ou mais segmentos gênicos JL de cadeias leve de imunoglobulina humanos não rearranjados (por exemplo, todos os segmentos gênicos JHL humanos funcionais), opcionalmente, em que o locus de cadeia leve de imunoglobulina endógeno é um locus kappa (K) de cadeia leve de imunoglobulina, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende segmentos gênicos variáveis humanos k (Vk) e de junção k (Jk), e em que a região constante de cadeia leve endógena é uma sequência de região constante de cadeia k endógena e/ou em que o locus de cadeia leve de imunoglobulina endógeno é uma cadeia leve lambda (X) de imunoglobulina endógena, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende segmentos gênicos variáveis humanos X (VX) e de junção X (JX), e a região constante de cadeia leve endógena é uma sequência de região constante de cadeia X endógena, opcionalmente em que o locus de cadeia leve X de imunoglobulina endógeno compreende (a) um ou mais segmentos gênicos V x humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jx humanos e (c) um ou mais segmentos gênicos Cx humanos, em que (a) e (b) estão operacionalmente ligados a (c) e uma constante de cadeia leve de imunoglobulina de roedor (segmento gênico Cx) , e em que o locus de cadeia leve x de imunoglobulina endógeno compreende ainda: uma ou mais potencializadores de cadeia leve x de imunoglobulina de roedor (Ex), e um ou mais potencializadores de cadeia leve x de imunoglobulina humana (Ex), opcionalmente compreendendo três Exs humanos; (ii) uma sequência codificadora de cadeia leve comum compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve humana(izada) rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a sequência de região variável de cadeia leve humana(izada) rearranjada compreende um segmento gênico VL de região variável de cadeia leve humano rearranjado com um segmento gênico JL de cadeia leve de imunoglobulina; (iii) uma região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada restrita em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada restrita compreende não mais do que dois segmentos gênicos (VL) variáveis de cadeia leve de imunoglobulina humanos não rearranjados operacionalmente ligados a um ou mais segmentos gênicos (JL) de junção de cadeia leve de imunoglobulina humanos não rearranjados; (iv) uma região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina compreende uma sequência gênica variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreendendo em uma sequência codificadora de região determinante de complementariedade 3 (CDR3) uma substituição de pelo menos um códon para não-histidina por um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina; ou (v) uma região variável de cadeia leve humana(izada) rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a região variável de cadeia leve humana(izada) rearranjada com modificação de histidina compreende uma sequência gênica variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) rearranjada compreendendo em uma sequência codificadora de região determinante de complementariedade 3 (CDR3) uma substituição de pelo menos um códon para não-histidina com um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina, opcionalmente, em que o camundongo compreende ainda (i) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humano(izado) compreendendo um gene ADAM6 funcional de modo que o camundongo exiba fertilidade de tipo selvagem do animal não humano; e/ou (ii) um gene exógeno da desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) para maior diversidade do receptor de antígeno, opcionalmente de modo que pelo menos 10% dos genes de região variável rearranjados compreendem adições não modelo, que já foram descritos anteriormente em camundongos. Ver, por exemplo, Patente US N° 8,697,940; 8,754,287; 9,204,624; 9,334,334; 9,801,362; 9,332,742; e 9,516,868; Publicações de Patente US 20110195454, 20120021409, 20120192300, 20130045492; 20150289489; 20180125043; 20180244804; Publicação PCT N° WO2019/113065, WO2017210586, e WO2011163314; Lee et al. (2014) Nature Biotechnology 32:356, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00222] Em algumas modalidades, a presente invenção inclui um animal não humano geneticamente modificado cujo genoma, por exemplo, genoma da linhagem germinativa, compreende: um locus de imunoglobulina endógeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um segmento gênico VH humano, uma região gênica de DH manipulada humana da invenção e um segmento gênico JH humano, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina está operacionalmente ligada a uma região constante, e/ou um locus de cadeia endógena compreendendo uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um segmento gênico VL humano e segmentos gênicos JL humano, em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina está operacionalmente ligada a uma região constante.

[00223] Em algumas modalidades, um animal não humano, por exemplo, um roedor, por exemplo, um rato ou um camundongo, compreende em seu genoma uma substituição de um ou mais segmentos de VH, DH e JH endógenos em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno com um ou mais segmentos de VH, DH e JH humanos, em que um ou mais segmentos de VH, DH e JH humanos compreende um segmento gênico DH humano operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer e estão operacionalmente ligados a um gene de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno; e, opcionalmente, um segmento de VL humano e JL humano rearranjado ou não rearranjado operacionalmente ligado a um não humano, por exemplo, roedor, por exemplo, camundongo ou rato, ou gene da região constante (CL) de cadeia leve de imunoglobulina humano, por exemplo, em um locus de cadeia leve não humano endógeno.

[00224] Em certas modalidades, os animais não humanos geneticamente modificados compreendem em seu genoma, por exemplo, genoma da linhagem germinativa, um locus de imunoglobulina (exógeno ou endógeno) contendo uma região variável de imunoglobulina compreendendo um ou mais segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados incluindo uma região de DH manipulada e uma região constante de imunoglobulina compreendendo um gene de região constante de imunoglobulina e em que um ou mais segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados estão operacionalmente ligados ao gene da região constante de imunoglobulina.

[00225] Geralmente, um locus de imunoglobulina geneticamente modificado compreende uma região variável de imunoglobulina (compreendendo segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina) operacionalmente ligados a uma região constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina geneticamente modificado compreende um ou mais segmentos gênicos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina não rearranjados humanos, incluindo uma região de DH manipulada, operacionalmente ligados a um gene de região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina geneticamente modificado compreende segmentos de gene K de região variável de imunoglobulina não rearranjados humanos operacionalmente ligados a um gene da região constante de cadeia k. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina geneticamente modificado compreende segmentos gênicos À de região variável de imunoglobulina não rearranjados humanos operacionalmente ligados a um gene da região constante de cadeia k. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina geneticamente modificado compreende segmentos gênicos À de região variável de imunoglobulina não rearranjados humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante de cadeia À.

[00226] Em certas modalidades, o animal não humano compreende em um locus de cadeia pesada endógeno uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreendendo uma região de DH manipulada em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena, em que a região variável de imunoglobulina contém um ou mais segmentos gênicos de região variável de cadeia pesada de Ig humanos não rearranjados. Em algumas modalidades, os um ou mais segmentos gênicos de região variável de Ig humanos não rearranjados compreendem pelo menos um segmento (VH) variável de cadeia pesada de imunoglobulina humano, um ou mais segmentos (DH) de diversidade de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, um ou mais segmentos de DH humanos não rearranjados operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer), e um ou mais segmentos (JH) de junção de cadeia pesada de imunoglobulina (opcionalmente um ou mais segmentos de JH humanos não rearranjados). Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de região variável de Ig humanos não rearranjados compreendem uma pluralidade de segmentos de VH não rearranjados humanos, um ou mais segmentos de DH (humanos) não rearranjados (por exemplo, um ou mais segmentos de DH (humanos) não rearranjados operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer) e um ou mais segmentos de JH (humanos) não rearranjados. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de região variável de Ig humanos não rearranjados compreendem pelo menos 3 segmentos gênicos VH, pelo menos 18 segmentos gênicos VH, pelo menos 20 segmentos gênicos VH, pelo menos 30 segmentos gênicos VH, pelo menos 40 segmentos gênicos VH, pelo menos 50 segmentos gênicos VH, pelo menos 60 segmentos gênicos VH, pelo menos 70 segmentos gênicos VH ou pelo menos 80 segmentos gênicos VH. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de Ig humana não rearranjados incluem todos os segmentos gênicos DH humanos funcionais, em que pelo menos um dos segmentos gênicos DH humanos funcionais é modificado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de Ig humanos não rearranjados incluem todos os segmentos gênicos JH humanos funcionais. Regiões variáveis exemplares compreendendo segmentos gênicos de cadeia pesada de Ig são fornecidas, por exemplo, em Macdonald et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 111:5147-52 e informações complementares, que são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00227] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos neste documento compreendem em um locus de cadeia pesada endógeno, uma região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada restrita em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena compreendendo pelo menos um gene de IgM não humano, em que a região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada restrita é caracterizada por um único segmento gênico VH humano, uma pluralidade de segmentos gênicos DH (por exemplo, segmentos gênicos DH humanos, incluindo um ou mais segmentos de DH (humanos) não rearranjados operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer) e uma pluralidade de segmentos gênicos JH (por exemplo, segmentos gênicos JH humanos), em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito é capaz de rearranjar e formar uma pluralidade de rearranjos distintos, em que cada rearranjo é derivado do segmento gênico único de VH humano, um dos segmentos de DH e um dos segmentos de JH e em que cada rearranjo codifica um domínio variável de cadeia pesada diferente (por exemplo, conforme descrito na Pub. Pat. US N° 20130096287, que está incorporada neste documento por referência na sua totalidade). Em algumas modalidades, o segmento gênico único de VH humano é VH1-2 ou VH1-69.

[00228] Em certas modalidades, um animal não humano compreende em um locus de cadeia leve endógeno uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada contém segmentos gênicos de região variável K de Ig não rearranjados humanos. Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende uma pluralidade de segmentos de Vk humanos não rearranjados e um ou mais segmentos de JK não rearranjados humanos. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem todos os segmentos de Jk humanos. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina compreendem quatro segmentos de Vk funcionais e todos os segmentos de Jk humanos. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina compreendem 16 segmentos de Vk funcionais e todos os segmentos de Jk humanos (por exemplo, todos os segmentos de VK humanos funcionais e segmentos de JK). Em algumas modalidades, os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem todos os segmentos de Vk humanos e todos os segmentos de Jk humanos. Regiões variáveis exemplares compreendendo segmentos gênicos de Ig k são fornecidas, por exemplo, em Macdonald et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 1 11:5147-52 e informações complementares, que são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00229] Em algumas modalidades, uma região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada restrita em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena é caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada não compreende mais do que dois segmentos gênicos VL humanos e uma pluralidade de segmentos gênicos JL (por exemplo, camundongos de cadeia leve dupla, ou DLC, conforme descrito na Patente US N° 9,796,788, que está incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, os segmentos gênicos VL são segmentos gênicos Vk. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos VL são segmentos gênicos VÀ. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos Vk são IGKV3-20 e IGKV1 -39. Em algumas modalidades, um animal não humano compreende exatamente dois segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados e cinco segmentos gênicos Jk humanos não rearranjados operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia leve de camundongo nos loci de cadeia leve k endógenos do camundongo, opcionalmente em que os dois segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados são um segmento gênico Vk1-39 humano e um segmento gênico Vk3-20 humano, em que os cinco segmentos gênicos Jk humanos não rearranjados são um segmento gênico Jk1 humano, um segmento gênico Jk2 humano, um segmento gênico Jk3 humano, um segmento gênico Jk4 humano e um segmento gênico Jk5 humano, em que os segmentos gênicos de cadeia leve kappa humanos não rearranjados são capazes de se rearranjar e codificar domínios variáveis humanos de um anticorpo e, opcionalmente, ainda em que o animal não humano não compreende um segmento gênico VK endógeno que é capaz de se rearranjar para formar uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina.

[00230] Em certas modalidades, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina não rearranjada humana(izada) em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena contém segmentos gênicos de região variável de Igk humanos não rearranjados. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem uma pluralidade de segmentos de Vk humanos e um ou mais segmentos de Jk humanos. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem um ou mais segmentos de Vk humanos, um ou mais segmentos de Jk humanos e uma ou mais sequências de região constante Ck humanas. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem todos os segmentos de Vk humanos. Em algumas modalidades, os segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados compreendem todos os segmentos de Jk humanos. Regiões variáveis exemplares compreendendo segmentos gênicos de Ig k são fornecidas, por exemplo, Patente US N° 9,035,128 e 6,998,514, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena compreende: (a) um ou mais segmentos gênicos Vk humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jk humanos e (c) um ou mais segmentos gênicos Ck humanos, em que (a) e (b) estão operacionalmente ligados a (c) e um segmento gênico Ck (por exemplo, de roedor) endógeno, e em que o locus de cadeia leve À de imunoglobulina endógeno compreende ainda: um ou mais potencializadores de cadeia leve À de imunoglobulina de roedor (EÀ), e um ou mais potencializadores de cadeia leve À de imunoglobulina humanos (EÀ), opcionalmente compreendendo três EÀ humanos.

[00231] Em certas modalidades, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena compreende segmentos gênicos de região variável de IgÀ humanos não rearranjados operacionalmente ligados a um gene CK endógeno (por exemplo, de roedor, por exemplo, rato ou camundongo) de tal modo que o animal não humano expresse uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio variável X humano derivada dos segmentos gênicos VA e JA fundidos com um domínio constante K endógeno, ver, por exemplo, Patente US N° 9,226,484, incorporada neste documento em sua totalidade por referência.

[00232] Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina humanos não rearranjados também inclui sequências intergênicas de região variável de imunoglobulina humanas. Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina inclui sequências intergênicas de região variável de Ig não humanas (por exemplo, de roedor, rato, camundongo). Em algumas modalidades, a sequência intergênica é de origem de espécie endógena.

[00233] Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina é uma região variável leve rearranjada (uma região variável de cadeia leve universal). Em algumas modalidades, o gene da região variável de cadeia leve de Ig rearranjado é um gene de região variável de cadeia leve de Ig rearranjado humano. Regiões variáveis de cadeia leve de Ig rearranjadas exemplares são fornecidas em, por exemplo, Patente US N° 9,969,814; 10,130,181 e 10,143,186 e Pub de Patente US N° 20120021409, 20120192300, 20130045492, 20130185821, 20130302836, e 20150313193, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o organismo não humano (organismo da "cadeia leve universal") que compreende uma região variável de cadeia leve universal é usado para produzir anticorpos biespecíficos. Em algumas modalidades, uma sequência codificadora de cadeia leve comum compreende uma sequência única de VK/JK de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada operacionalmente ligada a uma região constante de cadeia leve endógena, em que a sequência única de Vk/Jk de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada é (i) uma sequência de Vk1-39/Jk5 humana compreendendo um segmento gênico Vk1-39 humano fundido a um segmento gênico Jk5 humano, ou (ii) uma sequência de Vk3-20/Jk1 humana compreendendo um segmento gênico Vk3-20 humano fundido a um segmento gênico Jk1 humano.

[00234] Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina é uma cadeia leve e/ou uma região variável de imunoglobulina de cadeia pesada que inclui inserções e/ou substituições de códons para histidina projetados para introduzir propriedades de ligação dependentes de pH aos anticorpos gerados em tal organismo não humano. Em algumas dessas modalidades, os códons para histidina são inseridos e/ou substituídos nas sequências de ácido nucleico que codificam CDR3. Vários desses loci de imunoglobulina leve e/ou pesada são fornecidos na Patente US N° 9,301,510; 9,334,334; e 9,801,362 e Publicação de Pedido de Patente US N° 20140013456, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve humana(izada) rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia leve endógena compreende uma única sequência gênica de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada compreendendo sequências de segmento VK e JK humanas, opcionalmente em que a sequência de segmento VK é derivada de um segmento gênico VK1-39 ou VK3-20 humano, e em que a única sequência gênica de região variável de cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada compreende uma substituição de pelo menos um códon para não-histidina da sequência de segmento Vk com um códon para histidina que é expresso em uma posição selecionada do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 111 e uma combinação destes (de acordo com numeração de IMGT). Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena compreende uma sequência gênica variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreendendo em uma sequência codificadora de região determinante de complementariedade 3 (CDR3) (por exemplo, em um segmento gênico DH (humano) modificado para ser operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer), uma substituição de pelo menos um códon para não- histidina por um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana(izada) não rearranjada compreende VH humano não rearranjado, DH humano não rearranjado ou DH sintético, incluindo um segmento gênico DH operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer, e segmentos gênicos JH humanos não rearranjados, opcionalmente em que o segmento gênico DH não rearranjado humano ou de DH sintético ou o segmento gênico DH operacionalmente ligado à RSS de 23- mer compreende a substituição de pelo menos um códon para não-histidina por um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina em ligação operável a uma região constante de cadeia pesada endógena compreende segmentos gênicos VL não rearranjados e de JL não rearranjados. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve humana(izada) não rearranjada com modificação de histidina compreende não mais que dois segmentos gênicos VL humanos não rearranjados (por exemplo, não mais que dois segmentos gênicos VK) e um ou mais segmentos gênicos JL humanos não rearranjados (por exemplo, JK), em que cada um dos não mais que dois segmentos gênicos VL humanos compreende, em uma sequência codificadora de CDR3, uma substituição de pelo menos um códon para não-histidina por um códon para histidina ou uma inserção de pelo menos um códon para histidina. Em algumas modalidades, os não mais do que dois segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados são segmentos gênicos Vk1-39 e Vk3- 20 humanos, cada um compreendendo uma ou mais substituições de um códon para não-histidina por um códon para histidina, e em que os segmentos gênicos Vk e Jk humanos são capazes de rearranjar e os segmentos gênicos Vk e Jk humanos codificam um domínio variável de cadeia leve humana que compreende uma ou mais histidinas em uma posição selecionada do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 111 (de acordo com a numeração de IGMT), e uma combinação destes, em que uma ou mais histidinas são derivadas de uma ou mais substituições.

[00235] Em algumas modalidades, a região constante de imunoglobulina compreende um gene da região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia pesada é um gene da região constante de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia pesada é de origem de espécie endógena. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia pesada é um gene de região constante de camundongo ou um gene de região constante de rato. Em algumas modalidades, o gene da região constante é uma mistura de sequência humana e não humana. Por exemplo, em algumas modalidades, o gene da região constante codifica uma região de CH1 humana e uma região de CH2 e/ou CH3 não humana (por exemplo, origem de espécies endógenas, camundongo, rato). Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia pesada é um gene da região constante de Cμ, Cδ, CY (Cyí, CY2, CY3, Cy4), Cα ou Cε. Em algumas modalidades, o gene da região constante é um gene da região constante endógena. Em algumas modalidades, o gene da região constante codifica uma região de CH1 mutada de modo que o animal não humano expressa apenas anticorpos de cadeia pesada (ver, por exemplo, Patente US N° 8,754,287, Publicação de Pedido de Patente US N° 2015/0289489, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, por exemplo, onde a meta é gerar cadeias pesadas para produzir anticorpos biespecíficos (por exemplo, em organismos de cadeia leve universal ou dupla), os domínios Fc das cadeias pesadas compreendem modificações para facilitar a formação de heterodímero de cadeia pesada e/ou inibir a formação de homodímero de cadeia pesada. Tais modificações são fornecidas, por exemplo, na Patente US N° 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 7,642,228 e 8,679,785 e na Pub. de Patente US N° 2013/0195849, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00236] Em algumas modalidades, a região constante de imunoglobulina compreende um gene da região constante de cadeia leve. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia leve é um gene da região constante K. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia leve é um gene de região constante À. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia leve é de origem de espécie endógena. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia leve é um gene de região constante de camundongo ou um gene de região constante de rato. Em algumas modalidades, o gene da região constante de cadeia leve é uma mistura de sequência humana e não humana.

[00237] Em algumas modalidades, a região variável de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de região variável humanos e o gene de região constante de imunoglobulina ao qual os segmentos gênicos de região variável estão operacionalmente ligados estão localizados em um locus de imunoglobulina endógeno. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina endógeno é um locus de cadeia pesada endógeno. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina endógeno é um locus de K endógeno. Em algumas modalidades, o locus de imunoglobulina endógeno é um locus de À endógeno. Em algumas modalidades, o gene da região constante ao qual os segmentos gênicos da região variável humanos estão operacionalmente ligados é um gene da região constante endógeno.

[00238] Em algumas modalidades, um ou mais dos loci de imunoglobulina endógenos ou uma porção dos um ou mais loci endógenos (por exemplo, uma região variável e/ou uma região constante) no genoma do animal não humano fornecido neste documento são inativados. Os loci do gene da região variável de imunoglobulina endógenos e porções destes podem ser inativados usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, a deleção do locus ou uma porção deste do genoma do organismo, a substituição de um locus ou uma porção deste por uma sequência de ácido nucleico diferente, a inversão de uma porção do locus e/ou o deslocamento de uma porção do locus para outra posição no genoma do organismo não humano. Em algumas modalidades, a inativação do locus é apenas uma inativação parcial. Em algumas modalidades, a região variável do locus é inativada, mas a região constante permanece funcional (por exemplo, porque está operacionalmente ligada a segmentos gênicos de região variável não endógenos).

[00239] Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado inclui um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno inativado. Em algumas modalidades, o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno ou uma porção deste é inativado por deleção, substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte da região variável endógena do locus de cadeia pesada endógeno. Em algumas modalidades, pelo menos parte da região variável do locus de cadeia pesada endógeno que é deletada, substituída, deslocada e/ou invertida compreende os segmentos J da região variável. Em algumas modalidades, o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógeno ou porção deste é inativado por deleção, substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte da região constante endógena do locus de cadeia pesada endógeno. Em algumas modalidades, pelo menos parte da região constante do locus de cadeia pesada endógeno que é deletada, substituída, deslocada e/ou invertida compreende o gene de Oμ da região constante endógena.

[00240] Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado inclui um locus de cadeia K de imunoglobulina endógeno inativado. Em algumas modalidades, o locus da cadeia K de imunoglobulina endógena ou uma porção deste é inativado por deleção, substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte da região variável endógena do locus da cadeia k endógeno. Em algumas modalidades, pelo menos parte da região variável do locus da cadeia k endógena que é deletada, substituída, deslocada e/ou invertida compreende os segmentos J da região variável. Em algumas modalidades, o locus da cadeia k de imunoglobulina endógeno ou porção deste é inativado por deleção, substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte da região constante endógena do locus da cadeia k endógena. Em algumas modalidades, pelo menos parte da região constante do locus da cadeia k endógena que é deletada, substituída, deslocada e/ou invertida compreende o gene de Ck da região constante endógena.

[00241] Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado inclui um locus de cadeia À de imunoglobulina endógeno inativado. Em algumas modalidades, o locus da cadeia À de imunoglobulina endógeno ou uma porção deste é inativada por deleção,substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte de uma região variável endógena do locus da cadeia À endógena. Em algumas modalidades, pelo menos parte de pelo menos um cluster gênico V-J-C no locus de cadeia À endógeno é deletado, substituído, deslocado e/ou invertido. Em algumas modalidades, o locus da cadeia À de imunoglobulina endógeno ou porção deste é inativado por deleção, substituição, deslocamento e/ou inversão de pelo menos parte de uma região constante endógena do locus da cadeia À endógeno. Em algumas modalidades, pelo menos parte da região constante do locus da cadeia À endógeno que é deletada, substituída, deslocada e/ou invertida compreende um gene C da região constante endógena.

[00242] Em várias modalidades, as modificações do locus de imunoglobulina não afetam a fertilidade do animal não humano. Em algumas modalidades, o locus de cadeia pesada compreende um gene funcional ADAM6a, gene ADAM6b, ou ambos, por exemplo, endógeno(s) e a modificação genética não afeta a expressão e/ou função do gene ADAM6a endógeno, gene ADAM6b, ou ambos. Em algumas modalidades, o genoma do animal não humano geneticamente modificado compreende ainda uma localização funcional ectópica, por exemplo, gene ADAM6a endógeno, gene ADAM6b, ou ambos. Animais não humanos exemplares expressando ADAM6a e/ou ADAM6b exógeno(s) são descritos na Pat. US N° 8,642,835 e 8,697,940, cada uma das quais está incorporada por meio deste por referência em sua totalidade.

[00243] Em algumas modalidades, o animal não humano geneticamente modificado compreende ainda e expressa uma desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) exógena para maior diversidade do receptor do antígeno. Animais não humanos exemplares expressando TdT exógena são descritos na Publicação PCT WO 2017210586, que está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00244] Em algumas modalidades, o genoma de um animal não humano fornecido compreende adicionalmente um ou mais genes de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Patente US N° 8,502,018; Patente US N° 8,642,835; Patente US N° 8,697,940; Patente US N° 8,791,323; e Publicação de Pedido de Patente US N° 2013/0096287 A1 e 2018/0125043 A1; e Publicação PCT N° WO2019/113065, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Alternativamente, uma região de DH manipulada pode ser introduzida numa célula-tronco embrionária de uma linhagem modificada diferente, tal como, por exemplo, uma linhagem VELOCIMMUNE® (ver, por exemplo, Patente US N° 8,502,018 ou Patente US N° 8,642,835; incorporadas neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento podem ser preparados por meio da introdução de um vetor de direcionamento, conforme descrito neste documento, em uma célula a partir de uma linhagem modificada. Para dar mais um exemplo, um vetor de direcionamento conforme descrito neste documento pode ser introduzido em um animal não humano conforme descrito nas Patentes US N° 8,642,835 e 8,697,940; incorporadas neste documento por referência em sua totalidade, em que o animal não humano expressa anticorpos com regiões variáveis totalmente humanas e regiões constantes de camundongo. Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento são preparados para compreender ainda genes de imunoglobulina humana (genes de região variável e/ou constante). Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento compreendem uma região DH manipulada, conforme descrito neste documento, e o material genético de uma espécie heteróloga (por exemplo, seres humanos), em que o material genético codifica, inteiramente ou em parte, uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve humanas.

[00245] Os animais não humanos como descritos neste documento podem ser preparados conforme descrito acima, ou utilizando os métodos conhecidos na técnica, para compreender genes humanos ou humanizados adicionais, dependendo, muitas vezes, do uso pretendido do animal não humano. O material genético desses genes humanos ou humanizados adicionais pode ser introduzido através da alteração posterior do genoma das células (por exemplo, células-tronco embrionárias) com as modificações genéticas conforme descrito acima ou através da reprodução de técnicas conhecidas na técnica com cepas geneticamente modificadas, conforme desejado.

[00246] Por exemplo, conforme descrito neste documento, animais não humanos compreendendo uma região de DH podem compreender adicionalmente (por exemplo, através de cruzamentos ou estratégias de direcionamento de múltiplos genes) uma ou mais modificações conforme descrito na Publicações de Pedido de Patente US N° 2011-0195454 A1, 20120021409 A1, 2012-0192300 A1, s2013-0045492 A1, 2013-0185821 A1, 2013-0198880 A1, 2013-0302836 A1, 2015-0059009 A1; Publicações de Pedidos de Patente Internacionais N° WO 2011/097603, WO 2012/148873, WO 2013/134263, WO 2013/184761, WO 2014/160179, WO 2014/160202; todas as quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00247] Um animal não humano fundador transgênico pode ser identificado com base na presença de uma região de DH manipulada no seu genoma e/ou expressão de anticorpos que incluam regiões de CDR3 contendo aminoácidos resultantes da recombinação de DH-DH em tecidos ou células do animal não humano. Um animal não humano fundador transgênico pode então ser usado para criar outros animais não humanos portadores da região de DH criando assim uma série de animais não humanos cada um portando uma ou mais cópias de uma região de DH manipulada. Além disso, animais transgênicos não humanos, portando uma região de DH manipulada adicionalmente podem ser criados para outros animais não humanos transgênicos carregando outros transgenes (por exemplo, genes de imunoglobulina humana), como desejado.

[00248] Animais não humanos transgênicos também podem ser produzidos para conter sistemas selecionados que permitem a expressão regulada ou dirigida do transgene. Sistemas exemplares incluem o sistema Cre/loxP recombinase do bacteriófago P1 (ver, por exemplo, Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236, que está incorporado por referência em sua totalidade) e o sistema FLP/Frt recombinase de S. cerevisiae (O’Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355, que está incorporado por referência em sua totalidade). Tais animais podem ser fornecidos por meio da construção de animais transgênicos "duplos", por exemplo, pelo acasalamento de dois animais transgênicos, um contendo um transgene compreendendo uma modificação selecionada (por exemplo, uma região de DH manipulada) e o outro contendo um transgene que codifica uma recombinase (por exemplo, uma Cre-recombinase).

[00249] Embora modalidades empregando uma região DH manipulada em um camundongo (ou seja, um camundongo com uma região DH manipulada ligada operacionalmente com segmentos de gene de VH e JH humanos, os quais estão ligados operacionalmente com um ou mais genes de região constante de cadeia pesada de murino) sejam amplamente discutidas neste documento, outros animais não humanos que compreendem uma região DH manipulada também são fornecidos. Em algumas modalidades, tais animais não humanos compreendem uma região de DH manipulada operacionalmente ligada a segmentos gênicos VH e JH endógenos. Em algumas modalidades, tais animais não humanos compreendem uma região de DH modificada operacionalmente ligada a segmentos gênicos humanizados de VH e JH. Esses animais não humanos incluem qualquer um desses que podem ser modificados geneticamente para expressar anticorpos com CDR3s que incluam aminoácidos resultantes da recombinação de DH-DH a uma frequência elevada em comparação com um locus de cadeia pesada de imunoglobulina do tipo selvagem conforme descrito neste documento, incluindo, por exemplo, mamíferos, por exemplo, camundongo, rato, coelho, porco, bovinos (por exemplo, vaca, touro, búfalo), cervídeo, ovelha, cabra, galinha, gato, cão, furão, primatas (por exemplo, sagui, macaco rhesus), etc. Por exemplo, aqueles animais não humanos em que as células ES geneticamente modificáveis adequadas não estão prontamente disponíveis, outros métodos são empregados para produzir um animal não humano compreendendo modificações genéticas. Esses métodos incluem, por exemplo, modificação de um genoma de célula não ES (por exemplo, um fibroblasto, ou uma célula pluripotente induzida) e emprego de transferência nuclear celular somática (SCNT) para transferir o genoma geneticamente modificado para uma célula adequada, por exemplo, um oócito anucleado, e gestação da célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) em um animal não humano sob condições adequadas para formar um embrião.

[00250] Métodos para modificar um genoma de animal não humano (por exemplo, um porco, vaca, roedores, galinha etc.) incluem, por exemplo, empregar uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TALEN) ou uma proteína Cas (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas) para modificar um genoma a fim de incluir uma região de DH conforme descrito neste documento. Orientação para métodos para modificar o genoma da linhagem germinativa de um animal não humano pode ser encontrada em, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente US N° 2015-0376628 A1, US 2016-0145646 A1 e US 2016-0177339 A1; incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[00251] Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é um mamífero. Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um pequeno mamífero, por exemplo, da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado como descrito neste documento é um roedor. Em algumas modalidades, um roedor como descrito neste documento é selecionado dentre um camundongo, um rato e um hamster. Em algumas modalidades, um roedor como descrito neste documento é selecionado dentre a Superfamília Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado descrito neste documento é de uma família selecionada dentre Calomyscidae (por exemplo, hamsters semelhantes a camundongo), Cricetidae (por exemplo, hamster, ratos e camundongos New World, ratazanas), Muridae (camundongos e ratos verdadeiros, gerbilos, camundongos do gênero Acomys, ratos do gênero Lophiomys), Nesomyidae (camundongos escaladores, camundongos de rocha, ratos-de-cauda-branca, ratos e camundongos Malagasy), Platacanthomyidae (por exemplo, arganazes do gênero Platacanthomys) e Spalacidae (por exemplo, ratos-toupeiras, ratos de bambu e zokores). Em algumas modalidades, um roedor geneticamente modificado descrito neste documento é selecionado dentre um camundongo ou rato verdadeiro (família Muridae), um gerbilo, um camundongo do gênero Acomys e um rato do gênero Lophiomys. Em algumas certas modalidades, um camundongo geneticamente modificado descrito neste documento é de um membro da família Muridae. Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um roedor. Em algumas certas modalidades, um roedor descrito neste documento é selecionado dentre um camundongo e um rato. Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um camundongo.

[00252] Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um roedor que é um camundongo de uma linhagem C57BL selecionada dentre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr e C57BL/Ola. Em algumas determinadas modalidades, um camundongo da presente invenção é uma linhagem 129 selecionada do grupo consistindo em uma linhagem que é 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por exemplo, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032; incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas certas modalidades, um camundongo geneticamente modificado descrito neste documento é uma mistura de uma linhagem 129 acima mencionada e uma linhagem C57BL/6 acima mencionada. Em algumas modalidades, um camundongo descrito neste documento é uma mistura das cepas 129 acima mencionadas, ou uma mistura das cepas BL/6 acima mencionadas. Em algumas determinadas modalidades, uma linhagem 129 da mistura descrita neste documento é uma linhagem 129S6 (129/SvEvTac). Em algumas modalidades, um camundongo como descrito neste documento é uma linhagem BALB, por exemplo, linhagem BALB/c. Em algumas modalidades, um camundongo como descrito neste documento é uma mistura de uma linhagem BALB e outra linhagem acima mencionada.

[00253] Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um rato. Em algumas certas modalidades, um rato descrito neste documento é selecionado dentre um rato Wistar, uma linhagem LEA, uma linhagem Sprague Dawley, uma linhagem de Fischer, F344, F6 e Dark Agouti. Em algumas determinadas modalidades, uma linhagem de rato descrita neste documento é uma mistura de duas ou mais linhagens selecionadas do grupo consistindo em Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 e Dark Agouti.

Métodos

[00254] Diversas tecnologias in vitro e in vivo foram desenvolvidas para a produção de terapêuticas baseadas em anticorpos. Em particular, tecnologias in vivo apresentaram produção de animais transgênicos (ou seja, roedores) contendo genes humanos de imunoglobulina incorporados randomicamente no genoma do animal (por exemplo, ver Patente US N° 5,569,825, incorporada por referência em sua totalidade) ou colocados precisamente em um locus de imunoglobulina endógeno em ligação operacional com regiões constantes de imunoglobulina endógenas do animal (por exemplo, vide Patentes US N° 8,502,018; 8,642,835; 8,697,940; e 8,791,323; cada uma das quais está incorporada por referência em sua totalidade). Ambas as abordagens foram produtivas em produzir candidatos promissores de terapêuticas de anticorpos para uso em seres humanos. Além disso, ambas as abordagens têm a vantagem sobre abordagens in vitro em que candidatos de anticorpos são escolhidos de repertórios de anticorpos gerados in vivo, o que inclui a seleção de afinidade e especificidade para o antígeno dentro do meio interno do sistema imunológico do hospedeiro. Dessa forma, os anticorpos se ligam ao antígeno naturalmente presente (dentro de epítopos e superfícies biológicas relevantes), em vez de ambientes artificiais ou previsões in silico que podem acompanhar as tecnologias in vitro. Apesar dos robustos repertórios de anticorpos produzidos a partir de tecnologias in vivo, os anticorpos para antígenos complexos (por exemplo, vírus, polipeptídeos de canais) ou citoplasmáticos permanecem difíceis. Além disso, gerar anticorpos para polipeptídeos que compartilham um alto grau de identidade de sequência entre espécies (por exemplo, humano e camundongo) continua a ser um desafio devido à tolerância imunológica.

[00255] Assim, a presente invenção é, entre outras coisas, baseada no reconhecimento de que a construção de um sistema in vivo caracterizada pela produção de anticorpos com diversidade adicionada em CDRs, em particular, CDR3s, gerados a partir de rearranjo de segmentos gênicos não tradicional (ou seja, recombinação de DH a DH) pode ser realizada usando um ou mais segmentos de DH que estão operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5' ou 3'. Ao incluir a RSS de 23-mer 5' ou 3', a recombinação entre os segmentos de DH é aumentada em comparação com um locus de cadeia pesada de imunoglobulina que não possui tais segmentos gênicos DH manipulados. Tal diversidade adicionada pode dirigir a ligação a antígenos particulares (por exemplo, vírus, polipeptídeos de canais). Após a recombinação de um segmento gênico VH, pelo menos dois segmentos gênicos DH e um segmento gênico JH, uma sequência codificadora de região variável de cadeia pesada é formada que contém uma região de CDR3 com uma sequência de aminoácidos resultante da recombinação de DH-a-DH. Além disso, esta CDR3 resultante da recombinação de DH a DH contém uma diversidade adicional devido ao aumento do comprimento de aminoácidos. Além disso, essa região de CDR3 tem a capacidade de direcionar a ligação a um antígeno específico (ou epítopo) que é de outro modo incapaz de ser ligado por um anticorpo gerado pela recombinação tradicional de VDJ.

[00256] Os animais não humanos fornecidos podem ser empregados para produzir um anticorpo humano, em que o anticorpo humano compreende domínios variáveis derivados de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de região variável codificadas pelo material genético de uma célula de um animal não humano conforme descrito neste documento. Por exemplo, um animal não humano fornecido é imunizado com um antígeno de interesse (por exemplo, vírus ou polipeptídeo de canal, total ou parcialmente) sob condições e por um tempo suficiente para que o animal não humano desenvolva uma resposta imune ao referido antígeno de interesse. Os anticorpos são isolados de animais não humanos (ou uma ou mais células, por exemplo, uma ou mais células B) e caracterizados usando vários ensaios de medição, por exemplo, afinidade, especificidade, mapeamento de epítopo, capacidade para bloquear a interação ligante-receptor, ativação do receptor de inibição, etc. Em algumas modalidades, anticorpos produzidos pelos animais não humanos fornecidos incluem um ou mais domínios variáveis humanos que são derivados de uma ou mais sequências de nucleotídeos de região variável humanas isoladas do animal não humano. Em algumas modalidades, anticorpos de antidroga (por exemplo, anticorpo de anti-idiotipo) podem ser criados nos animais não humanos fornecidos.

[00257] Animais não humanos descritos neste documento fornecem um sistema in vivo melhorado e fonte de materiais biológicos (por exemplo, células) para produzir anticorpos humanos que são úteis para uma variedade de ensaios. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para desenvolver terapêuticas que se direcionam a um ou mais vírus e/ou modulam a atividade viral e/ou modulam interações virais com outros parceiros de ligação (por exemplo, um receptor de superfície celular). Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para desenvolver terapêuticas que se direcionam a uma ou mais proteínas de canais e/ou modulam a atividade de proteínas de canais e/ou modulam interações de proteínas de canais com outros parceiros de ligação. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para identificar, triar e/ou desenvolver terapias candidatas (por exemplo, anticorpos, siRNA, etc.) que se ligam a um ou mais polipeptídeos virais, de canais ou receptores acoplado à proteína G (GPCR). Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para triar e desenvolver terapias candidatas (por exemplo, anticorpos, siRNA, etc.) que bloqueiam a atividade de um ou mais polipeptídeos virais, um ou mais polipeptídeos de canais humanos ou um ou mais polipeptídeos de GPCR humanos. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são utilizados para determinar o perfil de ligação de antagonistas e/ou agonistas de um ou mais polipeptídeos de GPCR humanos ou de um ou mais polipeptídeos de canais humanos. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para determinar o epítopo ou epítopos de uma ou mais anticorpos de terapêuticas candidatas que se ligam a um ou mais polipeptídeos de GPCR humana ou que se ligam a um ou mais polipeptídeos de canais humanos.

[00258] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para determinar os perfis farmacocinéticos de anticorpos. Em algumas modalidades, um ou mais animais não humanos fornecidos e um ou mais animais não humanos de controle ou de referência são, cada um, expostos a um ou mais anticorpos terapêuticos candidatos em diversas doses (por exemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ou 50 mg/kg ou mais). Anticorpos terapêuticos candidatos podem ser dosados através de qualquer via de administração desejada, incluindo vias parenterais e não parenterais de administração. Rotas parenterais incluem, por exemplo, via intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intraespinhal, intratecal, intracerebroventricular, intracraniana, intrapleural , ou outras vias de injeção. Rotas não parenterais incluem, por exemplo, via oral, nasal, transdérmica, pulmonar, retal, bucal, vaginal, ocular. A administração também pode ser por infusão contínua, administração local, liberação sustentada de implantes (géis, membranas, ou similar) e/ou injeção intravenosa, por exemplo, usando uma bolsa de fluido intravenoso. O sangue é isolado de animais não humanos (humanizado e controle) em vários pontos de tempo (por exemplo, 0 h, 6 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, ou até 30 ou mais dias). Vários ensaios podem ser realizados para determinar os perfis farmacocinéticos de anticorpos terapêuticos candidatos administrados, utilizando amostras provenientes de animais não humanos, conforme descrito neste documento, incluindo, mas não limitado a, total IgG, resposta anti-anticorpo terapêutico, aglutinação, etc.

[00259] Em várias modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para medir o efeito terapêutico de bloquear ou modular a atividade de um antígeno alvo e o efeito na expressão gênica como resultado de alterações celulares ou da densidade da superfície celular do antígeno alvo (no caso de um receptor de superfície celular) das células dos animais não humanos descritos neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido ou células isoladas do mesmo são expostas a uma terapia candidata que se liga a um antígeno de interesse e, após um período de tempo subsequente, analisadas quanto aos efeitos nos processos (ou interações) dependentes do antígeno alvo, por exemplo, interações ligante- receptor ou sinalização relacionada ao antígeno.

[00260] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são usados para medir o efeito terapêutico do bloqueio ou modulação da atividade de canal (ou sinalização de canal, ou interações mediadas por canal, ou potenciais de ação de canal) e o efeito na expressão gênica como resultado de alterações celulares ou da densidade de canal das células dos animais não humanos descritos neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido ou células isoladas do mesmo são expostas a um candidato terapêutico que se liga a um polipeptídeo de canal humano (ou uma porção do mesmo) e, após um período subsequente de tempo, analisadas para efeitos em processos (ou interações) dependentes de canal, por exemplo, interações ligando-receptor ou potenciais de ação de canal.

[00261] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos expressam anticorpos, e assim, células, linhagens celulares e culturas celulares podem ser geradas para servir como uma fonte de anticorpos humanos para uso em ensaios de ligação e funcionais, por exemplo, para ensaio para ligação ou função de um antagonista ou agonista, particularmente onde o antagonista ou agonista é específico para uma sequência polipeptídica ou epítopo humano ou, alternativamente, específico para uma sequência polipeptídica humana ou epítopo que funciona na interação ligante-receptor (ligação). Em algumas modalidades, os epítopos ligados por anticorpos terapêuticos candidatos ou siRNAs podem ser determinados utilizando células isoladas de animais não humanos fornecidos.

[00262] Em algumas modalidades, células de animais não humanos fornecidos podem ser isoladas e usadas em uma base ad hoc, ou podem ser mantidas em cultura por muitas gerações. Em algumas modalidades, células de um animal não humano fornecido são imortalizadas (por exemplo, por meio de uso de um vírus) e mantidas em cultura indefinidamente (por exemplo, em culturas em série).

[00263] Em algumas modalidades, animais não humanos descritos neste documento fornecem um sistema in vivo para a geração de variantes de anticorpos que se ligam a um antígeno alvo humano. Tais variantes incluem anticorpos com uma funcionalidade, especificidade, baixa reatividade cruzada desejadas para um epítopo comum compartilhado por dois ou mais antígenos alvo humanos. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são empregados para gerar painéis de anticorpos para gerar uma série de variantes de anticorpos que são ensaiadas para uma funcionalidade desejada ou melhorada.

[00264] Em algumas modalidades, animais não humanos descritos neste documento fornecem um sistema in vivo para gerar bibliotecas de anticorpos. Essas bibliotecas fornecem uma fonte para sequências de região variável de cadeia leve e pesada que podem ser enxertadas em diferentes regiões Fc com base em uma função efetora desejada e/ou usadas como uma fonte para a maturação de afinidade da sequência de região variável usando técnicas conhecidas na arte (por exemplo, mutagênese sítio-direcionada, PCR propensa a erro, etc.).

[00265] Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento fornecem um sistema in vivo para a análise e teste de uma droga ou vacina. Em algumas modalidades, uma droga ou vacina candidata pode ser administrada a um ou mais animais não humanos fornecidos, seguido de monitoramento dos animais não humanos para determinar um ou mais dentre as respostas imunes à droga ou vacina, o perfil de segurança da droga ou vacina, ou o efeito em uma doença ou condição e/ou um ou mais sintomas de uma doença ou condição. Métodos exemplares usados para determinar o perfil de segurança incluem medições de toxicidade, concentração de dose ideal, resposta de anticorpos (isto é, antidroga), eficácia da droga ou vacina e possíveis fatores de risco. Essas drogas ou vacinas podem ser melhoradas e/ou desenvolvidas em animais não humanos.

[00266] A eficácia da vacina pode ser determinada em uma variedade de maneiras. Resumidamente, os animais não humanos descritos neste documento são vacinados empregando-se métodos conhecidos na técnica e então expostos a uma vacina ou uma vacina é administrada aos animais não humanos já infectados. A resposta de um animal não humano a uma vacina pode ser medida por monitoramento, e/ou execução de um ou mais ensaios, dos animais não humanos (ou células isoladas dos mesmos) para determinar a eficácia da vacina. A resposta de um animal não humano à vacina é comparada então com os animais de controle, usando uma ou mais medidas conhecidas na técnica e/ou descritas neste documento.

[00267] A eficácia da vacina pode ainda ser determinada por ensaios de neutralização viral. Resumidamente, os animais não humanos descritos neste documento são imunizados e o soro é coletado em vários dias pós- imunização. Diluições em série do soro são pré-incubadas com um vírus, tempo durante o qual os anticorpos no soro que são específicos para o vírus irão se ligar a ele. A mistura de vírus/soro é então adicionada a células permissivas para determinar a infecciosidade por meio de um ensaio de placa ou ensaio de microneutralização. Se os anticorpos do soro neutralizam o vírus, há menos placas ou menos unidades relativas de luciferase em comparação com um grupo de controle.

[00268] Animais não humanos descritos neste documento fornecem um sistema in vivo melhorado para o desenvolvimento e a caracterização de terapêuticas candidatas baseadas em anticorpos para uso em câncer e/ou doenças inflamatórias. Inflamação tem sido associada com câncer (analisado em, por exemplo, Grivennikov, S.I. et al., 2010, Cell 140:883-99; Rakoff- Nahoum, S., 2006, Yale J. Biol. Med. 79:123-30, cada um dos quais incorporado por referência neste documento). De fato, um ambiente de tumor em desenvolvimento é caracterizado, em parte, por infiltração de vários mediadores inflamatórios. Além disso, a inflamação persistente pode levar a uma maior probabilidade de desenvolver câncer. Assim, em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento fornece um sistema in vivo para o desenvolvimento e/ou identificação de terapêuticas anticâncer e/ou anti-inflamatórias. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos ou animais não humanos de controle (por exemplo, tendo uma modificação genética diferente da descrita neste documento ou nenhuma modificação genética, ou seja, de tipo selvagem) podem ter um tumor implantado (ou células tumorais), seguido da administração de uma ou mais terapêuticas candidatas. Em algumas modalidades, terapêuticas candidatas podem incluir um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico) ou um coquetel de anticorpos. Em algumas modalidades, as terapêuticas candidatas incluem terapia de combinação como, por exemplo, a administração de dois ou mais anticorpos monoespecíficos dosados sequencialmente ou simultaneamente. Pode-se deixar o tumor estabelecer-se por tempo suficiente em um ou mais locais dentro do animal não humano antes da administração de uma ou mais terapêuticas candidatas. A proliferação, crescimento, sobrevida, etc. de células do tumor pode ser medida antes e após a administração com a(s) terapia(s) candidata(s). A citotoxicidade da terapêuticos candidatos também pode ser medida no animal não humano, conforme desejado.

Kits

[00269] A presente invenção fornece adicionalmente uma embalagem ou kit compreendendo um ou mais recipientes cheios com pelo menos um animal não humano, célula não humana, fragmento de DNA (ou construto) e/ou vetor de direcionamento descrito neste documento. Kits podem ser usados em qualquer método aplicável (por exemplo, um método de pesquisa). Opcionalmente associado a esse (s) recipiente (s) pode ser um aviso na forma prescrita por um órgão governamental regulando a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete (a) a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana, (b) instruções para uso, ou ambas, ou um contrato que regulamente a transferência de materiais e/ou produtos biológicos (por exemplo, um animal não humano ou célula não humana, como descrito neste documento) entre duas ou mais entidades.

[00270] Outras características da invenção tornar-se-ão evidentes no curso das seguintes descrições de modalidades exemplares, que são dadas para ilustração e não se destinam a serem limitantes destas.

EXEMPLOS

[00271] Os exemplos a seguir são fornecidos a fim de descrever para aqueles versados na técnica como fazer e usar métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Salvo indicação em contrário, a temperatura é indicada em graus Celsius e a pressão é, ou está próxima da atmosférica.

Exemplo 1. Projeto e construção de vetores de direcionamento

[00272] Este exemplo ilustra a construção de um vetor de direcionamento para inserção no genoma de um animal não humano, tal como um roedor (por exemplo, um camundongo). Em particular, os métodos descritos neste exemplo demonstram a produção de vetores de direcionamento para inserção no genoma de células-tronco embrionárias (ES) de roedor (por exemplo, um camundongo) para produzir um roedor cujo genoma compreenda uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclua uma região de diversidade de cadeia pesada manipulada (DH), em que a região de DH manipulada inclui um ou mais segmentos de DH que estão operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer 5’ ou 3’. Neste exemplo, três vetores de direcionamento são descritos: um primeiro vetor de direcionamento contendo uma região de DH manipulada que inclui um segmento DH proximal (ou 3') operacionalmente ligado a uma RSS de 23-mer 5’ e operacionalmente ligado a um segmento de JH humano, um segundo vetor de direcionamento contendo uma região de DH manipulada que inclui um segmento de DH proximal (ou 3') operacionalmente ligado a uma RSS de 23- mer 5’ e operacionalmente ligado a três segmentos JH humanos, e um terceiro vetor de direcionamento contendo uma região de DH manipulada que inclui três segmentos de DH, cada um associado a uma RSS de 23-mer 3’ e operacionalmente ligado a seis segmentos de JH humanos (Figura 2). Cada um desses vetores de direcionamento foi gerado e inserido separadamente em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (Figuras 3, 5, 7). Conforme descrito abaixo, a região de DH manipulada foi colocada em ligação operável com segmentos variáveis de cadeia pesada (VH) e de junção de cadeia pesada (JH) de modo que, mediante recombinação de VDJ, anticorpos com CDR3s resultantes da recombinação de DH-DH são expressos.

[00273] Vetores de direcionamento contendo um ou mais segmentos de DH humano, cada um associado com uma 5’ ou 3’ RSS de 23-mer para inserção em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina foram criados usando tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Patente US N° 6,586,251 e Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; incorporados neste documento por referência em sua totalidade) e tecnologias de biologia molecular conhecidas na técnica. Os métodos descritos neste exemplo podem ser empregados para utilizar qualquer segmento de DH, conjunto de segmentos de DH ou combinação de segmentos de DH conforme desejado.

A. 23:Vetor de direcionamento DH3-3:12/JH6 (Figura 2)

[00274] Em resumo, um primeiro vetor de direcionamento foi construído usando um fragmento de DNA genômico contendo uma pluralidade de segmentos de DH humanos e um segmento de DH3-3 humano sintético posicionado no lugar do DH7-27 humano. Um doador para modificação de Cas9/GA in vitro foi produzido por síntese de novo (Blue Heron Bio) e compreendia de 5’ a 3: (a) um braço de homologia de 100 bp a partir de 350 bp a montante da RSS de 12-mer 5’ de DH7-27 (b) Sítios AgeI e XhoI para inserção de um cassete resistente à neomicina, (c) a região 250bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de DH7-27, (d) um segmento de DH3-3 humano sintético manipulado com uma RSS de 23-mer na extremidade 5' (de JH4) e uma RSS de 12-mer na extremidade 3' (de DH3-3), e (3) uma caixa de homologia de 100 bp iniciando 3 bp a jusante de JH5. Um cassete loxp-UbC-Em7-Neo-loxp, por exemplo, um gene de resistência à neomicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinação sítio- específicos para loxP, foi posicionado ~250bp a montante do segmento de DH sintético e a jusante por ligação nos sítios AgeI e XhoI para permitir a seleção em células ES de E. coli e camundongo. Este doador 23:DH3-3:12/JH6 (SEQ ID NO:61) incluindo o cassete de neomicina foi usado para modificar um BAC por Cas9/GA in vitro usando dois complexos Cas9:gRNA. Antes da modificação, o BAC era idêntico em sequência ao locus de IgH quimérico de um camundongo VELOCIMMUNE® (ver, por exemplo, Figuras 3 e 4, mostrando um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena não limitante exemplar de um camundongo VELOCIMMUNE® que é heterozigoto para um alelo 6394 compreendendo uma região variável humanizada que não possui os segmentos gênicos JH e está operacionalmente ligado a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena e um alelo 1460 compreendendo uma região variável humanizada operacionalmente ligada a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena.). Especificamente, o BAC era idêntico ao alelo 1460 a partir do gene de VH humano mais proximal (VH6-1) e incluindo todos os 27 genes de DH humanos, todos os 6 genes de JH humanos, o potenciador intrônico de IgH de camundongo (Eμ), a região de troca de IgM de camundongo (Sμ) e os primeiros 4 éxons do gene de IgM de camundongo. O BAC também incluiu um cassete de resistência à espectinomicina (spec) e ~29kb de sequência intergênica humana a montante do gene de VH6-1. A junção humano- camundongo fica a 222bp 3' do gene de JH6 humano e 490 bp 5' do potenciador Eμ de camundongo. A inserção do doador 23:D3-3:12/JH6 no BAC via GA resultou no vetor de direcionamento final 23:D3-3:12/JH6 compreendendo uma substituição do segmento gênico DH7-7 pelo segmento 23:D3-3:12 manipulado e deleção dos segmentos gênicos JH1, JH2, JH3, JH4 e JH5(Figura 2). A Tabela 1 fornece a sequência do gRNA, primers e sondas usados para determinar a construção precisa do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6.Tabela 1: Sequências de primers e gRNA para construção do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6

[00275] O vetor de direcionamento 23:D3-3:12/JH6 foi linearizado com NotI e eletroporado em células-tronco embrionárias de camundongo com um genoma que era heterozigoto para uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ou seja, um primeiro alelo de cadeia pesada (1460het) contendo uma pluralidade de segmentos de VH, DH, e JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor incluindo potenciadores de cadeia pesada e regiões reguladoras de roedor, e contendo uma sequência nucleotídica inserida que codifica um ou mais genes Adam6 murinos (por exemplo, Patente US N° 8,642,835 e 8,697,940, cada uma das quais está incorporada por referência neste documento em sua totalidade); e um segundo alelo de cadeia pesada (6394het) contendo uma pluralidade de segmentos de VH e DH humanos, uma região de deleção de JH, e uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor incluindo potenciadores de cadeia pesada de roedor e regiões reguladoras, e contendo uma sequência nucleotídica inserida que codifica um ou mais genes Adam6 murinos (por exemplo, Patente US N° 8,642,835 e 8,697,940, cada uma das quais está incorporada por referência neste documento em sua totalidade)) e que era homozigoto (HO) para um locus K endógeno humanizado compreendendo o repertório completo dos segmentos gênicos de cadeia leve de imunoglobulina humana VK e JK operacionalmente ligados a uma região CK de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena (1293) (ver Figura 3). O alelo 6799 é criado mediante eletroporação e recombinação homóloga adequada do alelo 1460 com o vetor de direcionamento 23:D3-3:12/JH6 compreendendo o cassete de neomicina. (Figura 3). Essas células ES de camundongo manipuladas heterozigotas para os alelos 6394 e 679 foram empregadas para facilitar a triagem eficiente de clones ES positivos (veja abaixo) e subsequente remoção mediada por cre dos cassetes de resistência ao medicamento, sendo que, após tal deleção, os alelos 6394 e 6799 são respectivamente referidos como 6643 e 6800 (Figura 4).

B. Vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6 (Figura 2)

[00276] De maneira semelhante, outro vetor de direcionamento (23:DH3-3:12/JH4-6) foi construído usando o mesmo fragmento de DNA genômico contendo uma pluralidade de segmentos de DH humanos e um segmento de DH3-3 humano sintético posicionado no lugar do DH7-27 humano. No entanto, este segundo vetor de direcionamento incluiu três dos seis segmentos de JH humanos (ou seja, JH4, JH5, JH6). Para criar o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6 final, um doador foi usado para modificar o BAC idêntico em sequência ao locus de IgH quimérico de um camundongo VELOCIMMUNE® (ver, por exemplo, Figuras 3 e 4, mostrar um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena não limitante exemplar de um camundongo VELOCIMMUNE® que é heterozigoto para um alelo 6394 compreendendo uma região variável humanizada que não possui segmentos gênicos JH e está operacionalmente ligado a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena e um alelo 1460 compreendendo uma região variável humanizada operacionalmente ligada a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena). O doador compreendeu, de 5’ a 3’: (a) uma caixa de homologia de 100 bp iniciando a 350 bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de D7-27, (b) sítios AgeI e XhoI para inserção de um cassete de resistência à neomicina, (c) a região 250 bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de D7-27, (d) um segmento de DH3-3 sintético humano flanqueado 5' por uma RSS de 23- mer (de JH4) e 3' por uma RSS de 12-mer (de DH3-3), e (e) uma caixa de homologia de 100bp a partir de 3bp a jusante de JH3. Um cassete loxp-UbC- Em7-Neo-loxp, por exemplo, um gene de resistência à neomicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinação sítio-específicos para loxP, foi posicionado ~250bp a montante do segmento de DH sintético por ligação nos sítios AgeI e XhoI para permitir a seleção em células de E. coli e ES de camundongo. Este doador 23:D3-3:12/JH4-6 compreendendo uma sequência nucleotídica estabelecida como SEQ ID NO:52, incluindo o cassete de neomicina, foi usado para modificar o BAC idêntico em sequência ao alelo 1460 (Figuras 3 e 4). Especificamente, o BAC era idêntico ao alelo 1460 a partir do gene de VH humano mais proximal (VH6-1) e incluindo todos os 27 genes de DH humanos, todos os 6 genes de JH humanos, o potenciador intrônico de IgH de camundongo (Eμ), a região de troca de IgM de camundongo (Sμ) e os primeiros 4 éxons do gene de IgM de camundongo. O BAC também incluiu um cassete de resistência à espectinomicina (spec) e ~29kb de sequência intergênica humana a montante do gene de VH6-1. A junção humano-camundongo fica a 222bp 3' do gene de JH6 humano e 490 bp 5' do potenciador Eμ de camundongo. A inserção do doador 23:D3-3:12/JH4-6 no BAC através de Cas9/GA in vitro usando dois complexos Cas9:gRNA resultou no vetor de direcionamento 23:D3-3:12/JH4-6 final (Figura 2) compreendendo uma substituição do segmento gênico DH7-7 pelo segmento gênico 23:D3-3:12 manipulado e deleção de segmentos gênicos JH1, JH2 e JH3. A Tabela 2 fornece a sequência do gRNA, primers e sondas usados para determinar a construção precisa do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6. Tabela 2: Sequências de primers e gRNA para construção do vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6

[00277] O vetor de direcionamento 23:D3-3:12/JH4-6 também foi linearizado com NotI e eletroporado em células-tronco embrionárias de camundongo com um genoma que era heterozigoto para uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ou seja, um primeiro alelo de cadeia pesada (1460het) contendo uma pluralidade de segmentos de VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor incluindo potenciadores de cadeia pesada e regiões reguladoras de roedor, e contendo uma sequência nucleotídica inserida que codifica um ou mais genes Adam6 murinos [por exemplo, Patente US N° 8,642,835 e 8,697,940, cada uma das quais está incorporada por referência neste documento em sua totalidade]; e um segundo alelo de cadeia pesada (6394het) contendo uma pluralidade de segmentos de VH e DH humanos, uma região de deleção de JH e uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor incluindo potenciadores de cadeia pesada de roedor e regiões reguladoras, e contendo uma sequência nucleotídica inserida que codifica um ou mais genes Adam6 murinos [por exemplo, Patente US N° 8,642,835 e 8,697,940, cada uma das quais está incorporada por referência neste documento em sua totalidade]) e que era homozigoto (HO) para um locus K endógeno humanizado compreendendo o repertório completo dos segmentos gênicos de cadeia leve de imunoglobulina humana Vk e Jk operacionalmente ligados a uma região Ck de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena (1293) (ver Figura 5). O alelo 6797 é criado mediante eletroporação e recombinação homóloga adequada do alelo 1460 com o vetor de direcionamento 23:D3-3:12/JH4-6 compreendendo o cassete de neomicina. (Figura 5). Essas células ES de camundongo manipuladas heterozigotas para os alelos 6394 e 6797 foram empregadas para facilitar a triagem eficiente de clones ES positivos (veja abaixo) e subsequente remoção mediada por cre dos cassetes de resistência a drogas, sendo que, após tal deleção, os alelos 6394 e 6797 são respectivamente referidos como 6643 e 6798 (Figura 6).

C. Vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1- 6 (Figura 2)

[00278] Em resumo, um terceiro vetor de direcionamento foi construído usando um fragmento de DNA contendo uma pluralidade de segmentos de DH humanos que incluíam três segmentos gênicos da família DH2 (DH2-2, DH2-8 e DH2-15) cada um tendo uma 5’ RSS de 12-mer e uma 3’ RSS de 23-mer. Primeiro, o BAC idêntico em sequência ao locus de IgH quimérico de um camundongo VELOCIMMUNE® (ver, por exemplo, Figuras 3 e 4, mostrando um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena não limitante exemplar de um camundongo VELOCIMMUNE® que é heterozigoto para um alelo 6394 compreendendo uma região variável humanizada que não possui segmentos gênicos JH e está operacionalmente ligado a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena e um alelo 1460 compreendendo uma região variável humanizada operacionalmente ligada a uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena). Especificamente, o BAC era idêntico ao alelo 1460 a partir do gene de VH humano mais proximal (VH6-1) e incluindo todos os 27 genes de DH humanos, todos os 6 genes de JH humanos, o potenciador intrônico de IgH de camundongo (Eμ), a região de troca IgM de camundongo (Sμ), e os primeiros 4 éxons do gene de IgM de camundongo foram modificados usando recombinação homóloga bacteriana (BHR) para inserir um cassete loxp-UbC- Em7-Neo-loxp, por exemplo, um gene de resistência à neomicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinação sítio-específicos para loxp, 512 bp a montante do primeiro segmento de DH humano (DH1-1) para seleção em E. coli e células ES de camundongo. Esse BAC resultante foi subsequentemente modificado com três doadores usando Cas9/GA in vitro.

[00279] 1. O primeiro doador para modificação de DH2-2 continha,de 5’ a 3’, uma caixa de homologia de 50 bp a partir de 1419 bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de DH2-2, um sítio de clonagem múltipla (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), um gene de D2-2 modificado com a RSS de 12-mer na extremidade 3' substituída por uma RSS de 23-mer na extremidade 3' derivada de um VH1-69 humano (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->;A, G->C; SEQ ID NO:151), e uma caixa de homologia de 50bp até 863bp a jusante da RSS de 23-mer na extremidade 3' de D2-2. A sequência nucleotídica deste primeiro doador para modificação de DH2-2 é estabelecida como SEQ ID NO:70. Uma vez que a região de DH consiste em quatro repetições diretas de ~10kb, é extremamente difícil projetar primers e sondas exclusivos para triagem. Para resolver este problema, duas sequências únicas de 40bp foram inseridas: uma 74bp a jusante da caixa de homologia 5' e uma 40bp a montante da caixa de homologia 3'. Estes 40-mers únicos foram usados como sítios de ligação para PCR/primers de sequenciamento e sondas Taqman, são denotados pelos retângulos verticais não preenchidos “1” e “2” da Figura 2 e compreendem uma sequência nucleotídica estabelecida como SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:74, respectivamente

[00280] 2. O segundo doador para modificação de DH2-8 continha, de 5’ a 3’, uma caixa de homologia de 50 bp a partir de 552 bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de DH2-8, um sítio de clonagem múltipla (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), um gene de D2-8 modificado com a RSS de 12-mer na extremidade 3' substituída por uma RSS de 23-mer na extremidade 3' derivada de VH1-69 humano (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->A, G->C SEQ ID NO:151), e uma caixa de homologia de 50bp até 867bp a jusante da RSS de 23-mer na extremidade 3' de D2-8. A sequência nucleotídica deste segundo doador para modificação de DH2-8 é estabelecida como SEQ ID NO:71. Uma vez que a região de DH consiste em quatro repetições diretas de ~10kb, é extremamente difícil projetar primers e sondas exclusivos para triagem. Para resolver este problema, duas sequências únicas de 40bp foram inseridas: uma 74bp a jusante da caixa de homologia 5' e uma 40bp a montante da caixa de homologia 3'. Estes 40-mers exclusivos foram usados como sítios de ligação para PCR/primers de sequenciamento e sondas Taqman, são denotados pelos retângulos verticais não preenchidos "10" e "16" da Figura 2 e compreendem uma sequência nucleotídica estabelecida como SEQ ID NO:75 e SEQ ID NO:76, respectivamente.

[00281] 3. O terceiro doador para modificação de DH2-15 continha,de 5’ a 3’, uma caixa de homologia de 50 bp a partir de 391bp a montante da RSS de 12-mer na extremidade 5' de DH2-15, um sítio de clonagem múltipla (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), um gene de D2-15 modificado com a RSS de 12-mer na extremidade 3' substituída por uma RSS de 23-mer na extremidade 3' derivada de um VH1-69 humano (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->;A, G->C; SEQ ID NO:151), e uma caixa de homologia de 50bp até 867bp a jusante da RSS de 23-mer na extremidade 3' de D2-15. A sequência nucleotídica deste terceiro doador para modificação de DH2-2 é estabelecida como SEQ ID NO:72. Uma vez que a região de DH consiste em quatro repetições diretas de ~10kb, é extremamente difícil projetar primers e sondas exclusivos para triagem. Para resolver este problema, duas sequências únicas de 40bp foram inseridas: uma 74bp a jusante da caixa de homologia 5' e uma 40bp a montante da caixa de homologia 3'. Estes 40-mers únicos foram usados como sítios de ligação para PCR/primers de sequenciamento e sondas Taqman, são denotados pelos retângulos verticais não preenchidos "8" e "18" da Figura 2 e compreendem uma sequência nucleotídica estabelecida como SEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:78, respectivamente.

[00282] Após a modificação in vitro de Cas9/GA com os três doadores, o vetor de direcionamento final continha, de 5' a 3', um braço de homologia de 49kb 5' contendo DNA da região variável humana, um cassete de seleção de Neomicina, uma região de DH humana manipulada incluindo três segmentos de DH humanos, cada um flanqueado 5' por uma RSS de 12-mer e 3' por uma RSS de 23-mer, seis segmentos de JH humanos, e um braço de homologia 3' de 24kb contendo um potenciador intrônico de cadeia pesada de camundongo (Ei) e uma região gênica constante de IgM de camundongo. (Figura 2). A Tabela 3 fornece a sequência do gRNA, primers e sondas usados para determinar a construção precisa do vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6.Tabela 3: Sequências de primers e gRNA para construção de 12:DH2- 2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6

[00283] O vetor de direcionamento 12:DH2-2:23:|12:DH2-8:23|12:DH2- 15:23x3/JH1-6 também foi linearizado com NotI e eletroporado células-tronco embrionárias de camundongo com um genoma que era homozigoto para uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada que continha o repertório completo de segmentos gênicos VH humano funcional, uma deleção da região de DH com exceção de DH7-27, e um repertório completo de segmentos gênicos JH humano funcional (6011) e que era homozigoto (HO) para um locus K endógeno humanizado compreendendo o repertório completo de segmentos gênicos da cadeia leve de imunoglobulina humana VK e JK operacionalmente ligados a m região de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo Ck (1293) (ver Figura 7). O alelo 20187 é criado após a eletroporação e recombinação homóloga adequada de um alelo 6011 com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6 compreendendo o cassete de neomicina. (Figura 7). Essas células ES de camundongo manipuladas foram empregadas para facilitar a triagem eficiente de clones ES positivos (veja abaixo) e subsequente remoção mediada por cre do cassete de resistência a drogas de neomicina, após o qual a remoção do alelo 20187 é para 20188 (Figura 8).

Exemplo 2. Triagem de células ES

[00284] Este exemplo demonstra a produção de animais não humanos (por exemplo, roedores) cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região de diversidade de cadeia pesada (DH) manipulada, em que a região de DH manipulada inclui um ou mais segmentos de DH que estão cada um operacionalmente ligados a uma RSS de 23-mer.

[00285] A montagem correta dos vetores de direcionamento descritos no Exemplo 1 e a inserção direcionada dos fragmentos de DNA no cluster de diversidade de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada com clones de DNA de BAC foi confirmada por sequenciamento e por reação em cadeia da polimerase por toda a construção de cada vetor de direcionamento. O DNA de BAC alvo, confirmado pela reação em cadeia da polimerase, foi então introduzido em células-tronco embrionárias (ES) de camundongo através de eletroporação seguido por cultivo no meio de seleção. O genoma das células ES usadas para eletroporação de cada vetor de direcionamento é representado nas Figuras 3, 5 e 7, respectivamente. Colônias resistentes a drogas foram escolhidas 10 dias após a eletroporação e triadas por TAQMAN™ e cariotipadas para o direcionamento correto conforme descrito anteriormente (Valenzuela et al., supra; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade) usando conjuntos de primer/sonda que detectaram a integração adequada dos segmentos gênicos DH manipulados (Tabela 4; F: primer forward, P: sonda, R: primer reverse).

[00286] O método VELOCIMOUSE® (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade) foi usado, em que as células ES visadas foram injetadas em embriões de Swiss Webster no estágio de 8 células não compactado, para produzir camundongos de geração F0 derivados de células ES totalmente saudáveis heterozigotos para a região DH manipulada e que expressam anticorpos contendo regiões variáveis de cadeia pesada que incluem regiões CDR3 geradas a partir da recombinação de DH-DH. Machos heterozigotos de geração F0 foram cruzados com fêmeas C57Bl6/NTac para gerar heterozigotos de F1 que foram intercruzados para produzir homozigotos de geração F2 e camundongos do tipo selvagem.

[00287] O cassete de seleção de drogas pode ser opcionalmente removido pela adição subsequente de uma recombinase (por exemplo, por tratamento com Cre) ou por cruzamento com uma linhagem de camundongo deletora para Cre (ver, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 2009/114400, incorporado neste documento por referência em sua totalidade) a fim de remover qualquer cassete selecionado em Lox introduzido pelo construto de direcionado que não é removido, por exemplo, no estágio de células ES ou no embrião. Opcionalmente, o cassete de seleção é mantido nos camundongos. Os cassetes de seleção manipulados em vetores de direcionamento descritos neste documento foram removidos em células ES positivas por expressão transitória de Cre recombinase (ver Figuras 4, 6 e 8, respectivamente).Tabela 4. Conjuntos de primer/sonda para triagem de células ES

Exemplo 3. Caracterização de camundongos modificados com os vetores de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6, 23:DH3-3:12/JH4-6 ou 12:DH2- 2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6

[00288] Imunofenotipagem

[00289] Foi realizada análise imunofenotípica de animais modificados com vetores de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 ou 23:DH3-3:12/JH4-6 para camundongos heterozigotos para os respectivos alelos modificados 6800 ou 6795 (consulte as Figuras 4 e 6). Foi realizada análise imunofenotípica de animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23I12:DH2- 8:2-23| 12:DH2-15:23/JH1-6 para camundongos criados até homozigosidade para o alelo modificado de 20188. O desenvolvimento de células B foi analisado nesses animais por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Em resumo, baços e ossos da perna (fêmur e tíbia) foram colhidos de:Camundongos VELOCIMMUNE® (n=3, 26% C57BL/6 23% 129S6/SvEvTac 51% Balb/cAnNTac; ver, por exemplo, Patente US N° 8,502,018 e 8,642,835), Camundongos 6643het/6800het//1293ho (25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6; ver Figura 4; n=3; Camundongos 6643het/6798het//1293ho (25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6; ver Figura 6; n=3); ou Camundongos 20188ho/1293ho (25% camundongos C57BL/6NTac 25% 129S6/SvFvFvTac 50% Balb/cAnNTac modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2.1523/JH1-6; n= 3). A medula óssea foi coletada de fêmures por centrifugação. Hemácias de preparações de baço e medula óssea foram lisadas com tampão de lise ACK (Gibco), seguido por lavagem com 1xPBS com FBS a 2%. As células isoladas (1x106) foram incubadas com coquetéis de anticorpo selecionados por 30 min a +4°C: Coloração 1: CD43-FITC anti-camundongo de rato (Biolegend 121206, clone 1B11), c-kit-PE anti-camundongo de rato (Biolegend 105808, clone 2B8), IgM-PeCy anti-camundongo de rato (eBiosciences 25-5790-82, clone II/41), IgD-PerCP-Cy5.5 anti-camundongo de rato (Biolegend 405710, clone 11-26c.2a), CD3-PB anti-camundongo de rato (Biolegend 100214, clone 17-A2), B220-APC anti-camundongo de rato (eBiosciences 17-0452-82, clone RA3-6B2), e CD19-APC-H7 anti- camundongo de rato (BD 560143, clone 1D3). Coloração 2: kappa-FITC anti- camundongo de rato (BD 550003, clone 187.1), lambda-PE anti-camundongo de rato (Biolegend 407308, clone RML-42), IgM-PeCy anti-camundongo de rato (eBiosciences 25-5790-82, clone II/41), IgD-PerCP-Cy5.5 anti- camundongo de rato (Biolegend 405710, clone 11-26c.2a), CD3-PB anti- camundongo de rato (Biolegend 100214, clone 17-A2), B220-APC anti- camundongo de rato (eBiosciences 17-0452-82, clone RA3-6B2), e CD19- APC-H7 anti-camundongo de rato (BD 560143, clone 1D3). Após a coloração, as células foram lavadas e, em seguida, fixadas em formaldeído a 2%. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo BD LSRFORTESSA™ (BD Biosciences) e analisada com o software FLOWJO™ (BD Biosciences).

[00290] Em camundongos heterozigotos para os alelos 6800 ou 6798, o número total de células B foi reduzido tanto no baço quanto na medula óssea, e houve um aumento nas células pro-B observadas na medula óssea quando comparados aos camundongos VELOCIMMUNE® de controle (dados não mostrados). Em geral, as células B apresentaram uso semelhante de K e À. (dados não mostrados). Em camundongos homozigotos para o alelo 20188, um nível ligeiramente maior de células B À.+ no baço foi observado (dados não mostrados). Nenhuma das diferenças observadas nas populações de células B em camundongos expressando os alelos 6800, 6798 ou 20188 em comparação com os camundongos VELOLCIMMUNE® de controle foi considerada como afetando o desenvolvimento de células B desses animais (dados não mostrados).

Frequências de rearranjos e características de DH-DH

[00291] Os rearranjos de genes em camundongos não expostos não imunizados modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6, o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6 ou o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 foram analisados por sequenciamento de repertório de IgM. A biblioteca de repertório de IgM das células B do baço foi preparada usando um kit de amplificação de cDNA SMARTerTM RACE (amplificação rápida das extremidades de cDNA) (Clontech) com primers específicos para a constante de IgM de camundongo (Tabela 5, nnnnnn” representa uma sequência de índice de 6bp para permitir a multiplexação de amostras para sequenciamento). A biblioteca de repertório preparada foi então sequenciada em um sequenciador MiSeq (Illumina).

[00292] As sequências de extremidade emparelhada Illumina MiSeq (2x300 ciclos) foram fundidas e filtradas com base na qualidade e correspondência perfeita com o primer de região constante de IgM de cadeia pesada. As sequências de cadeia pesada reorganizadas foram alinhadas aos bancos de dados de referência da linhagem germinativa V, D e J (IMGT). As análises subsequentes incluíram apenas rearranjos produtivos, definidos como sequências sem códons de parada dentro do quadro de leitura aberto e uma junção VDJ no quadro.Tabela 5: Primers usados na preparação da biblioteca para sequenciamento de repertório _ de IgM

[00293] Em animais não imunizados modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 ou o vetor de direcionamento 23:DH3- 3:12/JH4-6, nenhuma expressão de DH7-27 foi detectada e o uso de JH foi respectivamente limitado a JH6 ou JH4, JH5 e JH6, conforme esperado (dados não mostrados). Em animais não imunizados modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23, a recombinação com todos os segmentos de gene JH1-6 foi detectada, embora a recombinação com JH4 tenha sido observada em frequências mais altas (cerca de 50%) em ambos os animais modificados e de controle (dados não mostrados). Em todos os animais modificados, uma variedade de segmentos gênicos VH foi usada (por exemplo, mas não limitada a VH4-39, VH3-23, etc.) e uma variedade de segmentos gênicos DH (por exemplo, mas não limitada a DH1-7, DH3-10 e DH5-12) recombinados com os segmentos gênicos DH manipulados. Curiosamente, o uso de segmentos gênicos DH2-2, DH2-8 e DH2-15 apresentou tendência maior em animais modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 (2,41%; 6,34%; 6,91%; n=3) em comparação aos animais de controle (2,57%, 3,44%; 3,58%; n=3). (Tabela 6).

[00294] Sequências funcionais com um mínimo de dois segmentos de DH consecutivos identificados dentro da região de junção foram confirmadas ainda como resultantes de um evento de recombinação de DH-DH usando os seguintes critérios. Em sequências isoladas de camundongos modificados com o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH6 ou o vetor de direcionamento 23:DH3-3:12/JH4-6, um evento de recombinação de DH-DH foi confirmado quando (1) o segmento de DH identificado como "sucessivo" ou 3’ se alinhou com um mínimo de 9 pares de bases consecutivos a uma sequência de linhagem germinativa do segmento gênico DH de IGHD3-3 e (2) ambos os segmentos gênicos 5' anterior e 3' sucessivo de DH identificados se alinharam com um mínimo de 5 pares de bases consecutivos a um segmento gênico DH de linhagem germinativa, independentemente de qualquer sobreposição. Em sequências isoladas de camundongos modificados com o vetor de direcionamento 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23, um evento de recombinação de DH-DH foi confirmado quando (1) o segmento de DH identificado como "anterior" ou 5’ se alinhou com um mínimo de 9 pares de bases consecutivos a uma sequência de linhagem germinativa do segmento gênico DH de IGHD2-2, do segmento gênico DH de IGHD2-8 ou do segmento gênico DH de IGHD2-15, e (2) ambos os segmentos gênicos 5' anterior e 3' sucessivo de DH identificados se alinharam com um mínimo de 5 pares de bases consecutivos a um segmento gênico DH de linhagem germinativa, independentemente de qualquer sobreposição.

[00295] A Tabela 6 fornece o número de leituras de Ig funcional como uma quantidade absoluta e porcentagem do total de leituras, a porcentagem de todas as leituras funcionais derivadas de um segmento gênico DH2-2, um segmento gênico DH2-8 ou um segmento gênico DH2-15 e a porcentagem de todas as leituras derivadas de um segmento gênico DH2-2, um segmento gênico DH2-8 ou um segmento gênico DH2-15 que satisfazem os critérios a serem confirmados como o resultado de um evento de recombinação de DH- DH.Tabela 6

[00296] Conforme mostrado na Tabela 6, todos os animais modificados não imunizados exibiram um aumento nos eventos de recombinação de DH- DH em comparação com os animais de controle. Em animais modificados com segmentos gênicos 2-2, 2-8 e 2-15 manipulados, por exemplo, homozigotos para o alelo 20188, eventos de recombinação de DH-DH em 1,69% a 4,16% de todos os rearranjos compreendendo um dos três segmentos de gene manipulados de DH 2-2, 2-8, 2-15 manipulados. Em contraste, a recombinação de DH-DH foi confirmada em menos de 0,2% de todos os rearranjos derivados de segmentos gênicos 2-2, 2-8 ou 2-15 em animais de controle. Em um experimento separado, a frequência de eventos de recombinação de DH-DH confirmados envolvendo um segmento gênico DH3-3 manipulado em camundongos heterozigotos para os 6800 camundongos (Figura 4) variou de 0,6 a 1,2% de todas as leituras funcionais derivadas de um segmento gênico DH3-3.

[00297] Em todos os animais modificados, os rearranjos de VH(DHA- DHB)JH rearranjados codificaram comprimentos de CDR3 mais longos (por exemplo, mas não limitados a comprimentos de CDR3 de cerca de 21 aminoácidos) e incorporaram mais resíduos de cisteína (por exemplo, Figuras 9 e 10).

[00298] Em resumo, camundongos modificados com um segmento gênico DH manipulado exibem um fenótipo de células B relativamente normal com uma frequência aumentada de eventos de recombinação de DH-DH devido à utilização do segmento gênico DH manipulado. Além disso, o DH-DH recombinava sequências codificadas para CDR3 que eram mais longas em comprimento e tinham uma taxa mais alta de incorporação de cisteína.

Exemplo 4. Produção de anticorpos

[00299] Este exemplo demonstra a produção de anticorpos em um roedor cujo genoma compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que inclui uma região DH manipulada conforme descrito neste documento. Os métodos descritos neste exemplo e/ou os métodos de imunização bem conhecidos na técnica podem ser usados para imunizar roedores que contêm uma região DH descrita neste documento com polipeptídeos ou seus fragmentos (p.ex. peptídeos derivados de um epítopo desejado) ou uma combinação de polipeptídeos ou seus fragmentos, conforme desejado.

[00300] Resumidamente, as coortes de camundongos que incluem uma região de DH manipulada, conforme descrito neste documento, são imunizadas com um antígeno de interesse usando métodos de imunização conhecidos na técnica. A resposta imune do anticorpo (ou seja, título sérico) é monitorada por um imunoensaio ELISA e/ou em células manipuladas por MSD. Quando uma resposta imune desejada for obtida, os esplenócitos (e/ou outro tecido linfático) serão coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma imortal. As linhagens celulares de hibridoma são triadas (por exemplo, por um ensaio ELISA ou MSD) e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para antígeno. Os hibridomas podem ser caracterizados ainda quanto à afinidade de ligação relativa e isotipo, conforme desejado. Com o uso desta técnica, vários anticorpos quiméricos específicos para antígeno (ou seja, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes de roedores) são obtidos.

[00301] O DNA que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeias leves pode ser isolado e ligado a isotipos desejáveis (regiões constantes) de cadeia pesada e cadeia leve para a preparação de anticorpos totalmente humanos. Tal anticorpo pode ser produzido em uma célula, tal como uma célula CHO. Em seguida, os anticorpos totalmente humanos são caracterizados quanto à afinidade de ligação relativa e/ou neutralização da atividade do antígeno de interesse.

[00302] O DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos para antígeno ou os domínios variáveis de cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos específicos para antígeno. Inicialmente, são isolados anticorpos quiméricos de alta afinidade com uma região variável humana e uma região constante de roedor e são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo, mas não limitadas a, afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de roedores (por exemplo, mas não limitadas a, ratos, camundongos, etc.) são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar anticorpos totalmente humanos. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, as características de afinidade alta de ligação ao antígeno e especificidade alvo residem na região variável. Os anticorpos específicos ao antígeno também são isolados diretamente das células B positivas para antígeno (de camundongos imunizados) sem fusão em células de mieloma, conforme descrito em, por exemplo, Patente US N° 7,582,298, incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Com o uso deste método, vários anticorpos específicos ao antígeno totalmente humanos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis de humanos e domínios constantes de roedores) são feitos.

[00303] Em um experimento, camundongos de controle (por exemplo, camundongos VELOCIMMUNE® com loci de região variável de cadeia pesada e K leve de imunoglobulina humanizada (n= 4-6; ver, por exemplo, Patente US N° 8,697,940 e 8,642,835; cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade)) e camundongos de teste (por exemplo, camundongos modificados para compreender uma região de 23:DH3-3:12/JH4-6 ou 23:DH3-3:12/JH6 manipulada conforme descrito neste documento (n= 4-6)) foram imunizadas com diferentes antígenos e/ou ácidos nucleicos que codificam o mesmo (um receptor acoplado à proteína G (GPCR), um canal iônico, um receptor de quimiocina, ou um patógeno).

[00304] Os camundongos foram capazes de gerar respostas a cada um dos antígenos testados, com respostas variando de títulos baixos a títulos específicos altos (dados não mostrados). Camundongos com uma região de 23:DH3-3:12/JH6 manipulada, conforme descrito neste documento, demonstraram títulos para uma linhagem celular que expressa GPCR comparáveis a camundongos de controle com loci de região variável de cadeia pesada e K leve de imunoglobulina humanizada (Figura 11; círculos preenchidos representam uma linhagem celular manipulada que expressa GPCR; círculos não preenchidos são células de controle que não expressam GPCR).

[00305] Além disso, 100% dos 23 anticorpos testados específicos para um receptor acoplado à proteína G (GPCR) que foram gerados em camundongos compreendendo uma região de DH manipulada tinham um comprimento de CDR3 de cadeia pesada de 10 ou mais aminoácidos; 20% tinham um comprimento de CDR3 de 14 aminoácidos e 1 anticorpo tinha um comprimento de CDR3 de 18 aminoácidos (dados não mostrados). Em contraste, apenas cerca de 60% dos 8 anticorpos testados específicos para a GPCR que foram gerados em camundongos com loci de região variável de cadeia pesada e k leve de imunoglobulina humanizada, mas não uma região de DH manipulada, tinham comprimentos de CDR3 de 10 aminoácidos ou mais, nenhum dos quais tinha comprimentos de CDR3 de 14 ou mais (dados não mostrados).

[00306] Uma pluralidade de anticorpos antivirais foi isolada de um camundongo tendo uma região 23:DH3-3:12/JH4-6 manipulada, com pelo menos uma demonstrando uma atividade de neutralização superior à da molécula comparadora (dados não mostrados).

[00307] Os anticorpos de um camundongo tendo um 23:DH3-3:12/JH6 manipulado e imunizado com um canal iônico compreendiam uma população de anticorpos com comprimentos HCDR3 superiores a 21 aminoácidos decorrente de ambos os rearranjos de VHHDHJH e VHDHA-DHBJH (conforme determinado por critérios rigorosos descritos para este exemplo), com as sequências codificando comprimentos de HCDR3 mais longos sendo encontradas mais na medula óssea em comparação com o baço (Figura 12). A análise dos comprimentos de CDR3 codificados por sequências determinadas como sendo o resultado do rearranjo de VHDHA-DHBJH de acordo com os critérios rigorosos deste exemplo (quando se usa os critérios rigorosos deste exemplo, cada segmento gênico DH detectado deve exibir um mínimo de 40% de identidade com um segmento gênico D de linhagem germinativa, o segmento gênico 3' DH deve ser derivado do segmento gênico DH3-3 detectado, e um máximo de 1 nucleotídeo de mutação em cada segmento gênico DH) é mostrada na Figura 13. A Tabela 7 abaixo fornece uma comparação da frequência de recombinação de VHDHA-DHBJH na medula óssea ou baço usando os critérios rigorosos descritos neste exemplo, ou critérios não-rigorosos neste exemplo (ao usar os critérios não-rigorosos deste exemplo, cada segmento gênico DH detectado deve exibir um mínimo de 5 nucleotídeos de identidade com um segmento gênico linhagem germinativa, o segmento gênico 3' DH deve ser derivado do segmento gênico DH3-3).Tabela 7: Frequência de recombinação de VHDHA-DHBJH

EQUIVALENTES

[00308] Assim, tendo descrito vários aspectos de pelo menos uma modalidade da presente invenção, deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que várias alterações, modificações e melhorias ocorrerão prontamente para aqueles versados na técnica. Essas alterações, modificações e melhorias se destinam a ser parte desta divulgação e se destinam a estar dentro do espírito e do escopo da invenção. Nesse sentido, a descrição acima e o desenho são a título de exemplo apenas e a invenção é descrita em detalhes pelas reivindicações que seguem.

[00309] Os versados na técnica perceberão os padrões de desvio ou erros típicos atribuíveis aos valores obtidos nos ensaios ou nos outros processos descritos neste documento. As publicações, websites e outros materiais de referência mencionados neste documento que descrevem os fundamentos da invenção e fornecem detalhes adicionais sobre a sua prática são incorporados por meio deste por referência em sua totalidade.

Claims (13)

1. Método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região de diversidade de cadeia pesada manipulada (DH), o método caracterizado pelo fato de que compreende (a) modificar o genoma de uma célula-tronco embrionária de roedor para compreender uma região DH manipulada, em que a região DH manipulada compreende na ligação operável: (i) um segmento gênico DH humana manipulada e não arranjado flanqueado, em suas extremidade 5’ ou extremidade 3’, por uma RSS de 23-mer, e (ii) um segmento gênico DH humano e não arranjado; e (b) gerar um roedor usando a célula-tronco embrionária de roedor modificada de (a), em que o roderor é um rato ou um camundongo.

2. Método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região DH manipulada, o método caracterizado pelo fato de que compreende formar a região DH manipulada através pela modificação uma região DH não rearranjada de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de um roedor para compreender pelo menos um segmento gênico DH humano manipulado e não arrajando flanqueado, em sua extremidade 5’ ou extremidade 3’, por uma RSS de 23-mer, em que a região DH não rearranjada compreende ainda um ou mais segmentos gênicos DH de linhagem germinativa, produzindo, desse modo, o referido roedor, em que o roedor é um rato ou um camundongo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o roedor compreende ainda: (a) pelo menos um segmento gênico variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina não rearranjado que está a montante e operativamente ligado à região DH manipulada; (b) pelo menos um segmento gênico de união de cadeia pesada (JH) de imunoglobulina não rearranjado que está a jusante e operativamente ligado à região DH manipulada; ou (c) uma combinação de (a) e (b).

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que: (a) o pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende um segmento gênico VH61 humano não rearranjado, o pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH6 humano não rearranjado, ou uma combinação dos mesmos; (b) o pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado; (c) o pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado e um segmento gênico JH5 humano não rearranjado segmento gênico JH6 humano, (d) o pelo menos um segmento gênico JH não rearranjado compreende, na configuração da linha germinativa, um segmento gênico JH1 humano não rearranjado, um segmento gênico JH2 humano não rearranjado, um segmento gênico JH3 humano não rearranjado, um segmento gênico JH4 humano não rearranjado, um segmento gênico JH5 humano não rearranjado segmento e um segmento gênico JH6 humano não rearranjado; (e) o pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende o repertório completo de segmentos gênico VH humano não rearranjado funcional abrangendo e incluindo um segmento gênico VH3-74 humano não rearranjado e um segmento gênico VH1-6 humano não rearranjado ("repertório completo de gene funcional não rearranjado segmentos do gene VH humano"); e/ou (f) o pelo menos um segmento gênico VH não rearranjado compreende o repertório completo de segmentos funcionais gênico VH humano não rearranjado na configuração da linha germinativa.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o roedor compreende ainda um ou mais genes funcionais de roedor Adam6, opcionalmente em que um ou mais genes funcionais de roedor Adam6 estão localizados entre um segmento de gene humano VH1-2 e um segmento do gene VH6-1 humano e/ou substitui um gene Adam6 humano.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é flanqueado, em sua extremidade 5', com o RSS de 23 meros.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é um segmento do gene DH3-3 humano.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é flanqueado, em sua extremidade 3', com RSS de 23 meros.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 e 8, caracterizado pelo fato de que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é um segmento DH2 humano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é: (i) um segmento do gene DH2-2 humano, (ii) um segmento do gene DH2-8 humano, (iii) um segmento do gene DH2-15 humano, ou (iv) qualquer combinação de (i)-(iii).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o roedor assim feito compreende (a) a sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO:52 ou compreende a sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO:61; (b) a sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO:70; (c) a sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO:71; e/ou (d) a sequência nucleotídica apresentada como SEQ ID NO:72.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 11, caracterizado pelo fato de que o roedor assim feito compreende uma ligação operável de 5' a 3': (a) pelo menos um segmento de gene VH humano não rearranjado, (b) a região DH manipulada, em que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é um segmento do gene DH3-3 humano flanqueado, em sua extremidade 5', com o RSS 23-mer, e (c) pelo menos um segmento do gene JH humano não rearranjado.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o roedor assim feito compreende na ligação operável de 5' a 3': (a) pelo menos um segmento de gene VH humano não rearranjado, (b) a região DH manipulada, em que o segmento do gene DH humano não rearranjado manipulado é (i) um segmento do gene DH2-2 humano; (ii) um segmento do gene DH2-8 humano; (iii) um segmento do gene DH2-15 humano; ou (iv) qualquer combinação de (i)-(iii), e (b) pelo menos um segmento do gene JH humano não rearranjado.