KR20220016880A - 카파 유전자좌에서 발현된 제한적 람다 경쇄 레퍼토리를 갖는 비-인간 동물 및 이의 용도 - Google Patents
카파 유전자좌에서 발현된 제한적 람다 경쇄 레퍼토리를 갖는 비-인간 동물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 무엇보다도, 생식계열 게놈이 비-인간 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 제공하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 동물의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이러한 동물, 이러한 동물의 조직 및 이러한 동물의 세포는 항체, 예를 들어 이중특이적 항체를 생산하기에 효과적인 플랫폼을 나타낸다.
Description
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본 출원은 2019년 6월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/857,712에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2020년 5월 20일에 생성된 ASCII 사본은 이름이 2010794-2050_SL.txt이고 크기는 47,576 바이트이다.
배경
인간 항체는 치료제 중 가장 빠르게 성장하는 부류이다. 현재 이의 생산에 사용되는 기술 중에서, 전적으로 또는 부분적으로 인간 항체를 암호화하는 유전자 물질에 의해 조작된, 유전자 조작된 동물(예를 들어, 설치류)의 개발은 다양한 질병을 치료하기 위한 인간 치료용 단클론 항체 분야에 혁명을 일으켰다. 여전히, 숙주인 유전자 조작된 동물에서 인간 항체 레퍼토리(repertoire)를 최대화하는 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 개선된 생체내 시스템의 개발은 필요하다.
요약
본 개시내용은 유전자 변형된 설치류를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 랫트(rat) 또는 마우스(mouse)이다. 일부 실시양태에서, 모든 내인성 서열은 랫트 또는 마우스 서열이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류는 랫트이고 모든 내인성 서열은 랫트 서열이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류는 마우스이고 모든 내인성 서열은 마우스 서열이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 유전자 변형된 설치류, 제2 유전자 변형된 설치류, 및 제3 유전자 변형된 설치류를 포함하는, 본원에 제공된 유전자 변형된 설치류의 육종 콜로니(breeding colony)를 제공하며, 여기서 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류는 각각 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류이다. 일부 실시양태에서, 제3 유전자 변형된 설치류는 제1 유전자 변형된 설치류 및 제2 유전자 변형된 설치류의 자손이다.
제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리는 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전(somatically hypermutated version)으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 내인성 설치류 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 내인성 설치류 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 내인성 설치류 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌(예를 들어, 조작된 내인성 면역글로불린 λ 또는 κ 경쇄 유전자좌)에 대해 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌(예를 들어, 조작된 내인성 면역글로불린 λ 또는 κ 경쇄 유전자좌)에 대해 이형접합성이다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈은 2개의 대립유전자를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대립유전자는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하고 제2 대립유전자는 제한적 인간 κ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈, 및 이에 따른 설치류 세포 및 설치류 조직은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은, 유전자 변형된 설치류, 및 이에 따른 설치류 세포 또는 설치류 조직은 설치류 Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 비-인간 동물 또는 비-인간 조직은 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터 λ 경쇄 및 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터 κ 경쇄를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20 또는 Vκ1-39를 포함하고 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14를 포함한다. 일 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1이고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 경쇄 불변 영역 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 생식계열 게놈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합 대신에 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절을 각각 대체하는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절은 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절은 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, (i) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절은 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, (ii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절은 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, (iii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자이다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여된 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체(ortholog), 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 발현한다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함된 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 인간 Adam6 유사유전자(pseudogene) 대신에 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 인간 Adam6 유사유전자를 대체하는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제공된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하는 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 및 이 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신한다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 유전자 변형된 마우스는 기능적 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 유전자 변형된 마우스는 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 결실 또는 역전시킴으로써 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 유전자 변형된 마우스는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 가변 도메인을 검출가능하게 발현하지 않는다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 설치류 배아를 제공한다. 일부 실시양태에서, 설치류 배아는 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 게놈을 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 게놈이 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 설치류 배아가 제공된다. 일부 실시양태에서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
본 개시내용은 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류의 B 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류의 B 세포는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포 과돌연변이된 버전을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌 또는 이의 체세포 과돌연변이된 버전의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류의 B 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류의 B 세포는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절의 인간 JH 유전자 분절로부터 유래된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 조작된 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류의 B 세포로부터 생성된 하이브리도마를 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단일 유전자 변형된 설치류로부터의 B 세포 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, B 세포 집단에 의해 발현되는 모든 항체는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포 집단에 의해 발현된 항체는 적어도 2개의 상이한 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포와 같은 줄기 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포(예를 들어, ES 세포)는 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포(예를 들어, ES 세포)의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포(예를 들어, ES 세포)는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다.
항체를 발현하는 포유동물 세포가 본 개시내용에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에 의해 발현된 항체는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 또는 둘 모두는 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류로부터 식별되었거나, 단리되었거나, 또는 동일하다.
일부 실시양태에서, 항체는 (a) 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; (b) 유전자 변형된 설치류가 관심 항원에 대한 면역 반응을 생성하기에 충분한 조건 하에서 유전자 변형된 설치류를 유지하는 단계; 및 (c) 유전자 변형된 설치류로부터 (i) 관심 항원에 결합하는 항체, (ii) 인간 경쇄 가변 도메인, 인간 중쇄 가변 도메인, 관심 항원에 결합하는 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 또는 (iii) 관심 항원에 결합하는 항체를 발현하는 세포를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서 (c)의 항체는 인간 중쇄 가변 및 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 항원에 노출시키는 단계; (b) 유전자 변형된 설치류가 항원에 대해 면역 반응을 발생하도록 하는 단계; 및 (c) 유전자 변형된 설치류로부터 항원에 특이적인 항체, 항원에 특이적인 항체를 발현하는 B 세포, 또는 항원에 특이적인 항체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체를 제조하는 방법은 (a) 포유동물 세포에서 2개의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 및 2개의 인간 면역글로불린 중쇄를 포함하는 상기 항체를 발현시키는 단계로서, 각각의 인간 면역글로불린 λ 경쇄가 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하고 각각의 인간 면역글로불린 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, λ 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, 또는 이의 조합의 아미노산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류로부터 식별되었거나 단리되었던 것인 단계; 및 (b) 항체를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이는 (a) 본원에 기재된 바와 같은 제1 유전자 변형된 설치류를 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계, (b) 본원에 기재된 바와 같은 제2 유전자 변형된 설치류를 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계, (c) 제1 유전자 변형된 설치류로부터 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (d) 제2 유전자 변형된 설치류로부터 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (e) 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계; (f) 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2 인간 중쇄를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계; (g) 포유동물 세포에서 (i) 제1 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (a) 포유동물 세포에서 (i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 본원에 기재된 바와 같은 제1 유전자 변형된 설치류에서 제1 항체로부터 식별되거나, 단리되거나 또는 동일한 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제1 항체는 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 본원에 기재된 바와 같은 제2 유전자 변형된 설치류에서 제2 항체로부터 식별되거나, 단리되거나 또는 동일한 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제2 항체는 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제3 뉴클레오타이드의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전이다.
일부 실시양태에서, 제1 유전자 변형된 설치류 및 제2 유전자 변형된 설치류는 동일한 유전자 변형된 설치류이다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 변형된 설치류 및 제2 유전자 변형된 설치류는 상이한 유전자 변형된 설치류이다.
일부 실시양태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일한 항원이고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 항원이다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및 (c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄가 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체(collection)를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계, 및 (b) 유전자 변형된 설치류로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체는 각각 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인에 결합하며, 여기서 집합체 중 어느 하나의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인과 쌍을 이룬 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 항원에 결합한다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및 (c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 형성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄가 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하는 방법은 (a) 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및 (c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및 (c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
일부 실시양태에서, 표적화 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적화 벡터는 (i) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌의 5' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' 상동성 암(arm); (ii) Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역; (iii) 설치류 Cλ 유전자 분절; 및 (iv) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌의 3' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' 상동성 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법은 (a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법은 (a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 ES 세포의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 ES 세포의 게놈은 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 ES 세포의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 재배열되지 않은 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 ES 세포의 게놈은 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법은 (a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 단계를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하여, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (b) 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 단계를 추가로 포함하여, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하도록 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 설치류 ES 세포에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에는 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 각각 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절을 대체한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절은 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절은 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절은 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자이다.
일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈은 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 이의 기능적 단편은 유전자 변형된 설치류에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함된다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 유사유전자를 대신한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 유사유전자를 대체한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절은 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하고, 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 있다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절은 VH6-1이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신한다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈은 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부를 결실 또는 역전시킴으로써 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자는 전체 또는 부분적으로 결실된다.
이하의 도면으로 구성된 본원에 포함된 도면은 제한하기 위한 것이 아닌, 단지 예시하기 위한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 개시내용에 따른 비-인간 동물의 실시양태를 생성하는데 사용된 표적화 벡터(실시예 1 및 4에 기술됨)를 작제하기 위한 전략의 예시적 실시양태의 실례를 비-축척 비율로 보여준다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양(filled shape)과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "enh"는 인핸서를 나타내고; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SPEC"은 스펙티노마이신 내성 유전자를 나타내며; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "CDS"는 암호 서열을 나타내고; "lox"는 lox2372 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본 개시내용에 따른 비-인간 동물의 실시양태를 생성하는데 사용되는 표적화 벡터(실시예 7 및 10에 기술됨)를 작제하기 위한 전략의 예시적인 실시양태의 실례를, 비-축척 비율로 보여준다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "enh"는 인핸서를 나타내고; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SPEC"은 스펙티노마이신 내성 유전자를 나타내며; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "CDS"는 암호 서열을 나타내고; "lox"는 lox2372 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다.
도 3은 표적화 벡터 A(실시예 1에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 2에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에 대해 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 4는 표적화 벡터 B(실시예 4에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 5에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에 대해 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; loxP"는 lox P 부위를 나타내며; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 5는 표적화 벡터 C(실시예 7에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 8에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에서 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 6은 표적화 벡터 D(실시예 10에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 11에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에서 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 7은 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 25)을 나타낸다. 암호 서열은 볼드체 글자로 표시되며 3' 비해독 영역은 볼드체가 아니다.
도 8은 랫트 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27)을 나타낸다. 암호 서열은 볼드체 글자로 표시되며 3' 비해독 영역은 볼드체가 아니다.
도 9a 내지 도 9c는 조작된 Vλ1-51/Jλ2 벡터(서열번호 31)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 제한 효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부)은 이탤릭체 대문자로 표시된다; Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시된다; Vλ1 51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 및 볼드체로 표시된다; 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 서열은 다음을 포함한다: Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체는 아님)로 표시되고, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되고; Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되고; Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시되며; 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체 문자로 표시된다.
도 10은 Vλ1-51 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 32)을 나타낸다. Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시되고; Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되며; Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되고; 및 Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시된다.
도 11은 Vλ1-51 인트론이 없는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 33)을 나타낸다. Vλ1-51 암호 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Jλ2 서열은 대시선 밑줄이 있는 대문자로 표시된다.
도 12는 신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 34)을 나타낸다. 이탤릭체의 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c는 조작된 Vλ2-14/Jλ2 벡터(서열번호 36)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 제한 효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부)은 대문자 이탤릭체로 표시되고; Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시되며; Vλ1 51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체 및 볼드체로 표시되고; 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 서열은 다음을 포함한다: Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되고; Vλ2-14, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되며; Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄)로 표시되고; 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시된다.
도 14는 Vλ2-14 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 37)을 나타낸다. Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄이 추가로 표시되고; Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체 문자로 표시되고; Vλ1-51, 엑손 2 서열은대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되며; 및 Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시된다.
도 15는 Vλ2-14 인트론이 없는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 38)을 나타낸다. Vλ2-14 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14 시작 코돈은 이탤릭체 및 밑줄로 추가 표시되고; Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시된다.
도 16은 신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 39)을 나타낸다. 이탤릭체, 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
서열 목록의 선택된 서열에 대한 간단한 설명
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 사용될 수 있는 다양한 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System) 웹사이트, www.imgt.org에서, 또는 LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, May, 23, 2001(이하 "LeFranc 2001"이라고 함)에서 입수가능하다.
다음은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는 다양한 마우스, 랫트, 또는 인간 람다 불변 영역 또는 도메인의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다.
다음은 본원에 기술된 바와 같은 비-인간 동물의 몇몇 실시양태에 이용될 수 있는 마우스, 랫트, 또는 인간 카파 불변 영역 또는 도메인의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다.
마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 25)(도 7에 복사됨):
서열번호 25와 관련하여 다음이 적용된다:
- 암호 서열은 볼드체로 표시됨; 및
- 3' 미해독 영역은 볼드체가 아님.
마우스 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 26):
랫트 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27)(도 8에 복사됨):
서열번호 27과 관련하여, 다음이 적용된다:
- 암호 서열은 볼드체로 표시됨; 및
- 3' 미해독 영역은 볼드체가 아님.
랫트 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 28):
인간 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 29):
인간 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 30):
조작된 Vλ1-51/Jλ2 벡터의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 31)(도 1a에 개략적으로 도시되고 도 9a-9c에 복사됨):
서열번호 31과 관련하여 다음이 적용된다:
- 제한효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부) -는 이탤릭체 대문자로 표시됨;
- Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시됨;
- Vλ1-51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 볼드체로 표시됨;
- 하기를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 서열:
· Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
· Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
· Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄 친(대시 밑줄) 문자로 표시됨; 및
- 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시됨.
Vλ1-51 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 32)(도 10에 복사됨):
서열번호 32와 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가 표시됨;
- Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
- Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 및 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨.
Vλ1-51 인트론이 없는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 33)(도 11에 복사됨):
서열번호 33과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ1-51 암호 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시됨.
신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 34)(도 12에 복사됨):
서열번호 34와 관련하여, 이탤릭체의 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
신호 펩타이드 없이 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 35):
조작된 Vλ2-14/Jλ2 벡터의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 36)(도 2a에 개략적으로 도시되고 도 13a-13c에 복사됨):
서열번호 36과 관련하여 다음이 적용된다:
- 제한효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부) -은 이탤릭체 대문자로 표시됨;
- Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시됨;
- Vλ1-51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 및 볼드체로 표시됨;
- 하기를 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 서열:
· Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
· Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
· Vλ2-14, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 및 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시됨.
Vλ2-14 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 37)(도 14에 복사됨):
서열번호 37과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
- Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
- Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨;
- Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨.
Vλ2-14 인트론 없이 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 38)(도 15에 복사됨):
서열번호 38과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ2-14 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시됨.
신호 펩타이드를 포함한 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 39)(도 16에 복사됨):
서열번호 39와 관련하여, 이탤릭체, 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
신호 펩타이드 없이 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 40):
정의
본 발명의 범위는 본원에 첨부된 청구범위에 의해 정의되며 본원에 설명된 특정 실시양태에 의해 제한되지 않는다. 본 명세서를 읽은 본 기술분야의 기술자는 이러한 기술된 실시양태와 동등할 수 있는, 또는 그렇지 않으면 청구범위의 범주 내에서 다양한 수정을 인식할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어는 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 본 기술분야에서 이해하는 의미를 따른다. 특정 용어의 명시적 정의는 이하에 제공되며; 본 명세서 전반에 걸쳐 특정 경우의 이들 용어 및 다른 용어의 의미는 문맥으로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백한 것일 것이다. 이하 용어 및 기타 용어에 대한 추가 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 설명된다. 본 명세서 내에서 인용된 특허 및 비특허 문헌 참조, 또는 이의 관련 부분은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
청구범위에서 청구 요소를 수정하기 위한 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어의 사용은 하나의 청구 요소가 다른 것보다 임의의 우선 순위, 선행 순위 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 그 자체가 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 하나의 청구 요소를 동일한 명칭을 갖는 다른 요소와 구별하여(단, 서수 용어의 사용으로 인해) 청구 요소를 구별하기 위한 라벨로서 사용된 것이다.
본 명세서에 사용된 관사 "a" 및 "an"은 상반되는 것을 명백하게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 그룹 구성원 중 하나, 하나보다 많은, 또는 전부가 문맥에서 달리 명시되거나 상반되는 것을 나타내지 않는 한, 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 또는 달리 관련이 있다면, 충족된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 그룹의 정확히 하나의 구성원은 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련이 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 하나보다 많은 또는 모든 그룹 구성원은 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련이 있는 것이다. 본 발명은 달리 표시되지 않는 한, 또는 모순이나 불일치가 일어날 것이 본 기술분야의 기술자에게 명백하지 않은 한, 나열된 청구항 중 하나 이상에서의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 설명적 용어 등을 동일한 기본 청구항(또는, 적절한 경우 임의의 다른 청구항)에 종속되는 다른 청구항에 도입되는 모든 변경, 조합 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 요소가 목록(예를 들어, Markush 그룹 또는 유사한 형식)으로 제시되는 경우, 요소의 각 하위그룹도 개시되며, 이 그룹에서 임의의 요소(들)가 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 실시양태 또는 양상이 특정 요소, 특징 등을 "포함하는" 것으로 지칭되는 경우, 특정 실시양태 또는 양상은 이러한 요소, 특징 등으로 "이루어지거나", "본질적으로 이루어지는" 것으로 이해되어야 한다. 단순함을 위해, 이러한 실시양태는 모든 경우에 본원의 매우 많은 단어들로 구체적으로 설명되지 않았다. 또한, 특정 배제가 본 명세서에 언급되는지 여부와 상관없이, 임의의 실시양태 또는 양상이 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 시스템(예를 들어, 세포, 기관, 조직, 유기체, 또는 이의 관련 구성요소 또는 구성요소 세트)에 조성물(예를 들어, 항원 또는 항체)을 투여하는 것을 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 투여 경로가, 예를 들어 조성물이 투여되는 대상체 또는 시스템, 조성물의 성질, 투여 목적 등에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 동물 대상체(예를 들어, 인간 또는 설치류)에 대한 투여는 기관지(기관지 점적 포함), 협측, 장, 진피내, 동맥내, 피내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 심실내, 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(기관내 점적 포함), 경피, 질 및/또는 유리체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적 투약을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)를 수반할 수 있다.
항원 결합 단백질 : 본원에 사용된 바와 같이, 적어도 하나의 관심 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 항원 결합 단백질은 항체, 중쇄, 경쇄(예를 들어, λ 또는 κ 경쇄), 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인(예를 들어, λ 또는 κ 경쇄 가변 도메인), 및 단일 사슬 가변 단편(ScFv)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 다중특이적일 수 있고 2개 이상의 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
대략 : 하나 이상의 관심 값에 적용된 경우, 언급된 기준 값과 유사한 값을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 문맥에서 달리 명백하지 않은 한, 언급된 기준 값의 ±10%(초과 또는 미만) 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 100%의 가능한 값을 초과할 경우는 제외됨).
생물학적 활성 : 본원에 사용된 바와 같이, 시험관내 또는 생체내(예를 들어, 유기체에서) 생물학적 시스템에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 존재할 때 그 유기체 내에서 생물학적 효과를 갖는 제제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주한다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성인 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 일부는 전형적으로 "생물학적 활성" 부분으로 지칭된다.
비슷한 : 본원에 사용된 바와 같이, 서로 동일하지 않을 수 있지만 충분히 유사하여, 관찰된 차이 또는 유사성에 기초하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있도록 그들 사이에 비교를 허용하는, 2개 이상의 제제, 실체(entity), 상황, 조건 세트 등을 지칭한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 문맥에서 2 이상의 상기 제제, 실체, 상황, 조건 세트 등이 비슷한 것으로 간주되기 위해 임의의 주어진 상황에서 어느 정도의 동일성이 필요한 지를 이해할 것이다.
보존적 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환을 기술할 때, 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 경우를 지칭한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 있는 기능적 성질, 예를 들어 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L) 및 이소류신(Ile, I)과 같은 지방족 측쇄; 세린(Ser, S) 및 트레오닌(Thr, T)과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q)과 같은 아미드 함유 측쇄; 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 및 트립토판(Trp, W)과 같은 방향족 측쇄; 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 및 히스티딘(His, H)과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인(Cys, C) 및 메티오닌(Met, M)과 같은 황 함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어, 발린/류신/이소류신(Val/Leu/Ile, V/L/I), 페닐알라닌/티로신(Phe/Tyr, F/Y), 라이신/아르기닌(Lys/Arg, K/R), 알라닌/발린(Ala/Val, A/V), 글루타메이트/아스파테이트(Glu/Asp, E/D) 및 아스파라긴/글루타민(Asn/Gln, N/Q)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 사용된 것으로서, 단백질 내의 임의의 천연 잔기를 알라닌으로 치환하는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존적 치환은 본원에 전체가 참고로 포함되는, Gonnet, G.H. 등, 1992, Science 256:1443-1445에 개시된 PAM250 log-가능도 행렬에서 양성 값을 갖는 것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 치환은 중등도의 보존적 치환이며, 여기서 이 치환은 PAM250 로그-가능도 행렬에서 비-음성 값을 갖는다.
대조군 : 본원에 사용된 바와 같이, 결과가 비교되는 표준물질인 "대조군"의 본 기술분야에서 이해되는 의미를 지칭한다. 전형적으로, 대조군은 변수에 대한 결론을 내리기 위해 이러한 변수를 단리하여 실험의 무결성을 높이는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비교인자를 제공하기 위해 테스트 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. "대조군"은 또한 "대조 동물"도 포함한다. "대조 동물"은 본원에 기재된 변형, 본원에 기재된 것과 상이한 변형, 또는 변형이 없는 것(즉, 야생형 동물)일 수 있다. 하나의 실험에서 "테스트" 매개변수(예를 들어, 테스트 중인 변수)가 적용된다. 제2 실험에서, 테스트 중인 변수인 "대조군"이 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대조군은 과거 대조군(즉, 이전에 수행된 테스트 또는 검정의 대조군, 또는 이전에 알려진 양 또는 결과)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 인쇄 기록 또는 달리 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다.
파괴 : 본원에 사용된 바와 같이, DNA 분자(예를 들어, 유전자 또는 유전자 좌와 같은 내인성 상동 서열)와의 상동성 재조합 이벤트의 결과를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 미스센스 돌연변이, 또는 프레임-이동, 또는 이들의 임의의 조합을 달성하거나 나타낼 수 있다. 삽입은 내인성 서열 이외의 다른 기원(예를 들어, 이종 서열)일 수 있는 전체 유전자 또는 유전자 단편, 예를 들어 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물(예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드)의 서열을 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물(예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드)을 절두시키거나 또는 단편화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물을 연장시킬 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 파괴는 융합 폴리펩타이드의 조립을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성이 아닌 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준이 아닌 활성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준 또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다.
결정, 측정, 평가(evaluating), 평가(assessing), 검정 및 분석 : 본원에 임의의 측정 형태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 요소가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 둘 모두를 포함한다. 검정은 상대적이거나 절대적일 수 있다. "존재에 대한 검정"은 존재하는 것의 양을 결정하는 것일 수 있고, 및/또는 이것이 존재하는지 또는 아닌지의 여부를 결정하는 것일 수 있다.
내인성 프로모터 : 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어, 야생형 유기체에서, 내인성 유전자와 자연적으로 연관이 있는 프로모터를 지칭한다.
조작된 : 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 사람의 손에 의해 조작된 양상을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 그 순서로 함께 연결되어 있지 않은 2개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 직접 연결되도록 사람 손에 의해 조작될 때 "조작된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 제1 암호 서열과 작동적으로 연관되어 있지만 제2 암호 서열과 작동적으로 연관되어 있지 않은 것으로 발견된 조절 서열이 제2 암호 서열에 작동적으로 연관되도록 사람 손에 의해 연결된 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 자연에서 서로 연결되지 않은 폴리펩타이드 요소 또는 도메인을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산 서열은 단일 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 연결될 수 있다. 이와 비슷하게, 일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 유전자 정보가 변경되도록 조작되었다면(예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전자 물질이 도입되었거나 이전에 존재한 유전자 물질이 변경 또는 제거됨), "조작된(engineered)" 것으로 간주될 수 있다. 통상적인 관행이고 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 세포의 자손은 비록 실제 조작이 이전 실체에 대해 수행되었을지라도, 여전히 "조작된" 것으로 전형적으로 지칭된다. 더욱이, 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 기재된 "조작한(engineering)"이 달성할 수 있는 다양한 방법론이 이용가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 "조작한"은 분석 또는 비교를 수행하기 위해, 또는 그렇지 않다면 서열, 변경 등을 분석, 권장, 및/또는 선택하기 위해, 프로그래밍된 컴퓨터 시스템의 사용을 통한 선택 또는 설계(예를 들어, 핵산 서열, 폴리펩타이드 서열, 세포, 조직 및/또는 유기체의 선택 또는 설계)를 수반할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, "조작한"은 시험관내 화학적 합성 방법론 및/또는 재조합 핵산 기술, 예를 들어 핵산 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 통해) 혼성화, 돌연변이, 형질전환, 형질감염 등, 및/또는 임의의 다양한 제어된 교배 방법론의 사용을 수반할 수 있다. 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 확립된 이러한 기술(예를 들어, 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션 등)을 위한 것)은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 본 명세서에 전반에 걸쳐 인용 및/또는 논의된 다양한 일반적 및 더 구체적인 참고문헌들에 기술되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 및 Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. 및 S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨.
기능적 : 본원에 사용된 바와 같이, 특정 성질(예를 들어, 암호 서열의 일부를 형성함) 및/또는 활성을 나타내는 실체(예를 들어, 유전자 또는 유전자 분절)의 형태 또는 단편을 지칭한다. 예를 들어, 면역글로불린의 정황에서, 가변 영역은 기능적 암호 서열을 형성하기 위해 조립(또는 재조합)되는 고유 유전자 분절(즉, V, D 및/또는 J)에 의해 암호화된다. 게놈에 존재할 때, 유전자 분절은 변이가 발생할지라도, 클러스터로 조직화된다. "기능적" 유전자 분절은 상응하는 게놈 DNA가 단리(즉, 클로닝)되어 서열에 의해 동정되는, 발현된 서열(즉, 가변 영역)에서 나타나는 유전자 분절이다. 일부 면역글로불린 유전자 분절 서열은 오픈 리딩 프레임을 함유하고, 발현된 레퍼토리에서 나타나지는 않지만 기능적인 것으로 간주되는 반면, 다른 면역글로불린 유전자 분절 서열은 돌연변이(예를 들어, 점 돌연변이, 삽입, 결실 등)를 함유하여 정지 코돈 및/또는 후속적으로 돌연변이되지 않은 서열(들)과 연관된 성질/들 및/또는 활성/들을 수행할 수 없게 하는 유전자 분절 서열을 제공하는 절두 서열을 산출한다. 이러한 서열은 발현된 서열에서 나타나지 않아, 유사유전자(pseudogene)로서 분류된다.
유전자 : 본원에 사용된 바와 같이, 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 암호화하는 염색체 내의 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 암호 서열(즉, 특정 생성물을 암호화하는 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 비-암호 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 유전자는 암호(예를 들어, 엑손) 및 비-암호(예를 들어, 인트론) 서열 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는, 예를 들어, 유전자 발현의 하나 이상의 양상(예를 들어, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현 등)을 제어하거나 영향을 미칠 수 있는, 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 명확성을 기하기 위해, 본 발명자들은 본 개시내용에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 일부를 지칭하며; 이 용어는 문맥상 본 기술분야의 기술자에게 명백하듯이, 조절 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 이 정의는 비-단백질 암호 발현 단위에 "유전자"라는 용어의 적용을 배제하기 위한 것이 아니며, 오히려 대부분의 경우 이 문서에 사용된 바와 같이 이 용어가 폴리펩타이드-암호 핵산을 지칭한다는 것을 명확히 하기 위한 것이다.
유전자 변형된 비-인간 동물 또는 유전자 조작된 비-인간 동물 : 본원에 상호교환적으로 사용되며, 비-인간 동물의 하나 이상의 세포가 관심 있는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 이종 핵산 및/또는 유전자를 함유하는, 임의의 비-자연 발생의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "유전자 변형된 비-인간 동물" 또는 "유전자 조작된 비-인간 동물"은 본원에 기재된 바와 같은 전이유전자 또는 전이유전자 작제물을 함유하는 비-인간 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 및/또는 유전자는 미세주입 또는 재조합 바이러스 감염과 같은 의도적인 유전자 조작을 통해 전구체 세포 내로 도입에 의해 간접적으로 또는 세포 내로 직접 도입된다. 유전자 조작이라는 용어는 고전적인 육종 기술을 포함하는 것이 아니라, 오히려 재조합 DNA 분자(들)의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체 내에 통합될 수 있다. "유전자 변형된 비-인간 동물" 또는 "유전자 조작된 비-인간 동물"이라는 문구는 이종 핵산 및/또는 유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 동물, 및/또는 이종 핵산 및/또는 유전자의 단일 카피 또는 다중 카피를 갖는 동물을 지칭한다.
생식계열 구성 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 야생형 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 서열(예를 들어, 유전자 분절)의 배열을 지칭한다. 면역글로불린 유전자 분절의 생식계열 구성의 예는, 예를 들어, LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, May, 23, 2001(본원에서 "LeFranc 2001"로 지칭됨)에서 찾아볼 수 있다:
인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 47쪽에서 찾아볼 수 있음;
인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 61쪽에서 찾아볼 수 있음;
인간 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 53쪽에서 찾아볼 수 있음;
마우스 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 Lucas, J. 등, Chapter 1: The Structure and Regulation of Immunoglobulin Loci, Molecular Biology of B Cells, 2nd Edition, Academic Press, 2015(Lucas)에서 찾아볼 수 있음;
마우스 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc, M-P 등, Chapter 4: Immunoglobulin Lambda (IGL) Genes of Human and Mouse, Molecular Biology of B Cells, 1st Edition, Academic Press, 2004(LeFranc 2004)에서 찾아볼 수 있음;
마우스 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 κ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 Christele, M-J, 등, Nomenclature and Overview of the Mouse (Mus musculus and Mus sp.) Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes, Exp Clin Immunogenet 2001, 18:255-279(Christele)에서 찾아볼 수 있음.
LeFranc 2001, Lucas, LeFranc 2004 및 Christele의 인용된 섹션은 각각 본원에 참고로 포함된다.
생식계열 게놈 : 본원에 사용된 바와 같이, 동물의 형성에 사용되는 생식 세포(예를 들어, 생식세포, 예를 들어 정자 또는 난자)에서 발견되는 게놈을 지칭한다. 생식계열 게놈은 동물의 세포에 대한 게놈 DNA의 공급원이다. 따라서, 생식계열 게놈에 변형이 있는 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트)은 이들 세포 전부의 게놈 DNA에 변형이 있는 것으로 간주된다.
생식계열 서열 : 본원에 사용된 바와 같이, 야생형 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 DNA 서열, 또는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 DNA 서열에 의해 암호화된 RNA 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린 유전자 분절의 대표적인 생식계열 서열은, 예를 들어, LeFranc 2001에서 찾아볼 수 있다:
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 VH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 VH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 107-234쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 D 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 D 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 98-100쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 JH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 JH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 104쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 Vλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Vλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 350-428쪽에서 찾아볼 수 있음; 및
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 Jλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Jλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 346쪽에서 찾아볼 수 있음.
LeFranc 2001의 인용된 섹션은 각각 본원에 참고로 포함된다.
이종 : 본원에 사용된 바와 같이, 상이한 공급원으로부터의 제제 또는 실체를 지칭한다. 예를 들어, 특정 세포나 유기체에 존재하는 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물과 관련하여 사용될 때, 이 용어는 관련 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물이 1) 사람 손에 의해 조작되었음; 2) 사람 손을 통해(예를 들어, 유전 공학을 통해) 세포 또는 유기체(또는 이의 전구체) 내로 도입되었음; 및/또는 3) 관련 세포 또는 유기체(예를 들어, 관련 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생성되거나 존재하지 않음을 명확히 한다. "이종"은 또한 특정 천연 세포 또는 유기체에 정상적으로 존재하지만, 예를 들어 비-자연적 연관 요소 및 일부 실시양태에서 비-내인성 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 배치 또는 돌연변이에 의해 변경되거나 변형된, 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물을 포함한다.
숙주 세포 : 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 지칭한다. 본 개시내용을 읽을 때 본 기술분야의 기술자는 이러한 용어가 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 데에도 사용된다는 것을 이해할 것이다. 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 "숙주 세포"라는 문구의 범주에 포함된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이거나 이를 포함한다. 일반적으로, 숙주 세포는 세포가 지정된 생물 계에 상관없이 이종 핵산 또는 단백질을 수용 및/또는 생산하기에 적합한 임의의 세포이다. 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)와 같은 세포 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이고, 하기 세포로부터 선택된다: 차이니즈 햄스터 난소(CHO)(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60,(예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 전술한 세포에서 유래된 세포주. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
동일성 : 서열 비교와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 본 기술분야에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정된 동일성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 동일성은 10.0의 개방 갭 패널티, 0.1의 확장 갭 패널티를 이용한 ClustalW v.1.83(slow) 정렬, 및 Gonnet 유사성 행렬(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정한다.
대신에 : 본원에서 사용된 바와 같이, 염색체 내의 제2 핵산 서열의 위치에 위치(예를 들어, 제2 핵산 서열이 염색체에서 이전에(예를 들어 원래) 자리했던 위치, 예를 들어, 제2 핵산 서열의 내인성 유전자좌)에 제1 핵산 서열이 자리하는 위치 치환을 지칭한다. "대신에"라는 어구는 제2 핵산 서열이, 예를 들어, 유전자좌 또는 염색체로부터 제거되어야만 하는 것을 필요로 하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열 및 제1 핵산 서열은, 예를 들어, 제1 및 제2 서열이 서로 상동성이고, 상응하는 요소(예를 들어, 단백질 암호 요소, 조절 요소 등)를 함유하고, 및/또는 유사하거나 동일한 서열을 갖는다는 점에서 서로 비슷할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여체 부위, 스플라이스 수용체 부위, 인트론, 엑손, 비해독 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 하나 이상의 암호 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열의 상동체 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 서열의 이종상동체 또는 상동체이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 제1 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 랫트 서열)이거나 이를 포함한다. 제1 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 인간 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 서열의 변이체 또는 돌연변이체(즉, 제2 서열과 비교하여 하나 이상의 서열 차이, 예를 들어, 치환을 함유하는 서열)이다. 그와 같이 배치된 핵산 서열은 그와 같이 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비해독 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 내인성 서열의 발현 없이, 그와 같이 배치된 핵산 서열(이종 서열 포함)로부터 유전자 생성물의 생산을 초래하는 이종 서열에 의한 내인성 서열의 치환이며; 제1 핵산 서열은 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 의한 내인성 게놈 서열의 치환이다(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화하고, DNA 단편은 전적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화함). 다양한 실시양태에서, 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편은 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 단편을 대신한다.
시험관내 : 본원에 사용된 바와 같이, 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경, 예를 들어 테스트 튜브 또는 반응 용기 내에서, 세포 배양물 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
생체내 : 본원에 사용된 바와 같이, 인간 및/또는 비-인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포-기반 시스템의 정황에서, 이 용어는 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 시험관내 시스템과 반대되는 것임).
단리된 : 본원에 사용된 바와 같이, (1) 처음 생산되었을 때(자연 및/또는 실험 환경 여부에 상관없이) 연관된 구성요소의 적어도 일부로부터 분리되고, 및/또는 (2) 사람 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 처음 연관되었던 다른 구성요소의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 10% 내지 100%, 15%-100%, 20%-100%, 25%-100%, 30%-100%, 35%-100%, 40%-100%, 45%-100%, 50%-100%, 55%-100%, 60%-100%, 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%, 96%-100%, 97%-100%, 98%-100% 또는 99%-100%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 10% 내지 100%, 10%-99%, 10%-98%, 10%-97%, 10%-96%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 10%-20% 또는 10%-15%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 11% 내지 99%, 12%-98%, 13%-97%, 14%-96%, 15%-95%, 20%-90%, 25%-85%, 30%-80%, 35%-75%, 40%-70%, 45%-65%, 50%-60% 또는 55%-60%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 80%-99%, 85%-99%, 90%-99%, 95%-99%, 96%-99%, 97%-99%, 또는 98%-99% 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 80%-99%, 80%-98%, 80%-97%, 80%-96%, 80%-95%, 80%-90%, 또는 80%-85% 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 85%-98%, 90%-97%, 또는 95%-96% 순수하다. 일부 실시양태에서, 물질은 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우, "순수"하다. 일부 실시양태에서, 본 기술분야의 기술자가 이해하는 바와 같이, 물질은, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 구성요소와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 이러한 실시양태에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 그러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산한다. 오직 한 가지 예를 들자면, 일부 실시양태에서, 자연에서 발생하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 생물학적 중합체는 다음과 같은 경우 "단리된" 것으로 간주된다; a) 사실상 자연 상태에서 동반되는 일부 또는 모든 구성요소와 기원 또는 유래하는 공급원 면에서 연관이 없는 경우; b) 자연에서 생산하는 종과 동일한 종의 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; 또는 c) 자연에서 생산하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템의 구성요소에 의해 발현되거나 달리 연관이 있는 경우. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성되거나 자연에서 생산하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩타이드는 "단리된" 폴리펩타이드인 것으로 간주된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 정제 기술로 처리된 폴리펩타이드는 다른 구성요소, 즉 a) 자연에서 연관이 있는 구성요소; 및/또는 b) 처음 생산될 때 연관되었던 구성요소로부터 분리된 정도이면, "단리된" 폴리펩타이드인 것으로 간주될 수 있다.
유전자좌 또는 유전자좌들 : 본원에 사용된 바와 같이, 유전자, DNA 서열, 폴리펩타이드-암호화 서열의 위치(들), 또는 유기체 게놈의 염색체 상의 위치를 지칭한다. 예를 들어, "면역글로불린 유전자좌"는 면역글로불린 유전자 분절(예를 들어, V, D, J 또는 C), 면역글로불린 유전자 분절 DNA 서열, 면역글로불린 유전자 분절-암호화 서열의 위치, 또는 이러한 서열이 존재하는 곳에 관해 식별되었던 유기체 게놈의 염색체 상의 면역글로불린 유전자 분절 위치를 지칭할 수 있다. "면역글로불린 유전자좌"는 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 조절 서열 또는 영역, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 면역글로불린 유전자 분절의 조절 요소를 포함할 수 있다. "면역글로불린 유전자좌"는 유전자간 DNA, 예를 들어 야생형 유전자좌의 유전자 분절 간에 보통 존재하거나 나타나는 DNA를 포함할 수 있다. 본 기술분야의 숙련된 기술자는 염색체가, 일부 실시양태에 따르면, 수백 또는 심지어 수천개의 유전자를 함유할 수 있고 다른 종을 서로 비교하는 경우 유사한 유전자적 유전자좌의 물리적 공동국재화를 입증할 수 있음을 알고 있을 것이다. 그러한 유전자적 유전자좌는 공유 신터니(synteny)를 갖는 것으로서 기술될 수 있다.
자연적으로 나타나는 : 생물학적 요소(예를 들어, 핵산 서열)와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 유기체(예를 들어, 동물)에서 조작(예를 들어, 유전자 조작) 없이 특정 정황 및/또는 위치에서 생물학적 요소가 발견될 수 있음을 의미한다. 즉, 특정 정황 및/또는 위치에서 자연적으로 나타나는 서열은 조작(예를 들어, 유전자 조작)의 결과로서 특정 정황 및/또는 위치에 존재하지 않는다. 예를 들어, 내인성 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌에서 인간 Jκ1 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 서열은 인간에서 유전자 조작 없이 내인성 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌 중 인간 Jκ1 유전자 분절의 인접에서 발견될 수 있는 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열은 세포 또는 유기체에서 자연적으로 나타나는 곳으로부터 수득, 유도 및/또는 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 세포 또는 유기체에서 자연적으로 나타나는 서열의 직접적인 공급원이 아니다. 예를 들어, 세포 또는 유기체에서 상응하는 서열은 식별된 다음, 본 기술분야에 공지된 메커니즘에 의해 생산 또는 복제될 수 있다.
비-인간 동물 : 본원에 사용된 바와 같이, 인간이 아닌 임의의 척추동물 유기체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 원구류, 경골어류, 연골어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물 및 조류이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 또는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
핵산 : 본원에 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 사슬에 혼입되어 있거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오타이드 사슬에 혼입되어 있거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드)를 지칭하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA이거나 RNA를 포함하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 사용하지 않는다는 점에서 "핵산"과 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "핵산"은 본 기술분야에 공지되어 있고 백본에 포스포디에스테르 결합 대신 펩타이드 결합을 갖는 하나 이상의 "펩타이드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, "핵산"은 포스포디에스테르 결합보다 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포아미다이트 연결을 갖는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 천연 핵산에 있는 당과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 또는 폴리펩타이드와 같은 기능적 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 엑손을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형에 기초한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 생식, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 적어도, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 이상의 잔기 길이이지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 단일 가닥이고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보체이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 효소적 활성을 갖는다.
작동가능하게 연결된 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 기술된 구성요소가 의도된 방식(예를 들어, 구성요소가 적절한 조직, 세포 유형, 세포 활성 등에 존재하는 경우)으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 구성요소의 병치를 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 VH 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 JH 유전자 분절은 이 VH, D 및 JH 유전자 분절이 B 세포 발달의 적절한 시기에 중쇄 불변 영역에 스플라이싱될 수 있다면, 중쇄 불변 영역에 "작동가능하게 연결된" 것이며, 이는 이러한 스플라이싱이, 예를 들어, 면역계 외부의 세포(예를 들어, 생식 세포)에서 발생하는지 여부와 상관이 없다. 암호 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 암호 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 근접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자(또는 관심 서열)를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열 둘 모두를 포함한다. "발현 제어 서열"이라는 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열이 결찰된 암호 서열의 발현 및 처리에 영향을 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. "발현 제어 서열"은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작 콘센서스(Kozak consensus) 서열); 폴리펩타이드 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 폴리펩타이드 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 본성은 숙주 유기체에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물에서 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하는 반면, 진핵생물에서 전형적으로 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 존재가 발현 및 처리에 본질적인 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 서로 별도로 발생하는 부분(즉, 2 이상의 상이한 유기체, 예를 들어 인간 및 비-인간 부분 유래)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 사람 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 서열(예를 들어, 상기 폴리펩타이드를 암호화하기 위해 사람 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 서열)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다.
재배열된 : 본원에 사용된 바와 같이, 접합된 유전자 분절이 함께 면역글로불린의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 갖도록 함께 접합된(직접적으로 또는 간접적으로) 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 DNA 서열을 기술한다. 재배열된 DNA 서열의 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절은 기능성 재조합 신호 서열(Recombination Signal Sequence, RSS)와 더 이상 연관되지 않으며, 따라서 추가 재배열을 겪을 수 없다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 DNA 서열의 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절은 더 이상 재배열할 없지만, 이것이 동일한 유전자좌 내의 다른 면역글로불린 유전자 분절이, 예를 들어, 2차 재배열을 겪을 수 없다는 것을 의미하지는 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 유전자 분절(예를 들어, 재배열된 면역글로불린 가변 영역에서)이 천연 VDJ 재조합 과정을 통해 함께 접합될 수 있음을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 또한 재배열된 유전자 분절(예를 들어, 재배열된 면역글로불린 가변 영역에서)이, 예를 들어 표준 재조합 기술을 사용하여 유전자 분절을 접합시킴으로써 함께 접합되도록 조작될 수 있음을 인식할 것이다. 재배열된 면역글로불린 가변 영역은 전형적으로 2개 이상의 접합된 면역글로불린 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 재배열된 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Jλ 유전자 분절과 접합된 Vλ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 접합되는 VH 유전자 분절, D 유전자 분절, JH 유전자 분절을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 또한 모든 또는 실질적으로 모든 유전자간 서열이 일반적으로 재배열된 면역글로불린 가변 영역의 면역글로불린 유전자 분절 사이에서 제거된다는 것을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 서열이 무엇보다도 유전자 분절에 인트론을 포함할 수 있음을 추가로 인식할 것이다.
재조합체 : 본원에 사용된 바와 같이, 다중 공급원(예를 들어, 유기체, 조직, 세포, 게놈 또는 게놈의 일부) 유래의 유전자 물질을 합치기 위해 유전자 재조합의 실험실 방법(예를 들어, 클로닝)에 의해 형성된 분자(예를 들어, DNA, RNA 또는 폴리펩타이드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성 또는 단리되며, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩타이드, 재조합, 조합성 인간 폴리펩타이드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩타이드(Hoogenboom, H.R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, H. 및 W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J.V. 및 J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H., 및 P. Chames, 2000, Immunol.Today 21:371-8, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨), 인간 면역글로불린 유전자를 포함하도록 유전자 조작된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L.D. 등, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann, S-A. 및 L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. 등, 2000, Immunol.Today 21:364-70; Osborn, M.J. 등, 2013; J. Immunol.190:1481-90; Lee, E-C. 등, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. 등, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. 등, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 또는 선택된 서열 요소를 서로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인실리코(in silico)에서 설계된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어 천연 또는 합성(예를 들어, 인공) 공급원으로부터의 공지된 서열 요소의 돌연변이유발(예를 들어, 생체내 또는 시험관내)로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 관심있는 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 게놈에서 발견되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 돌연변이유발(예를 들어, 시험관내 또는 생체내, 예를 들어, 비-인간 동물에서)에서 유래되는 아미노산 서열을 가져, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 폴리펩타이드 서열에서 기원하고 관련이 있지만, 생체내 비-인간 동물의 게놈 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
기준 : 본원에 사용된 바와 같이, 관심 있는 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 비교되는 기준 또는 대조 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 있는 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값의 테스트 또는 결정과 실질적으로 동시에 테스트 및/또는 결정된다. 일부 실시양태에서, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 선택적으로 실재하는 매체에서 구현된, 과거의 기준이다. 일부 실시양태에서, 기준은 대조군을 지칭할 수 있다. "기준"은 "기준 동물"도 포함한다. "기준 동물"은 본원에 기재된 변형, 본원에 기재된 것과 상이한 변형을 갖거나, 또는 변형이 없을 수 있다(즉, 야생형 동물). 전형적으로, 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 제제, 동물(예를 들어, 포유동물), 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 결정하거나 특성화하는데 이용된 것과 비슷한 조건 하에 결정되거나 특성화된다.
대체 : 본원에 사용된 바와 같이, 숙주 유전자좌(예를 들어, 게놈)에서 발견되는 "대체된" 핵산 서열(예를 들어, 유전자)이 그 유전자좌로부터 제거되고, 그 위치에 상이한 "대체" 핵산이 자리하는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열 및 대체 핵산 서열은, 예를 들어, 이들이 서로 상동성이고, 상응하는 요소(예를 들어, 단백질-암호 요소, 조절 요소 등)를 함유하고, 및/또는 유사하거나 동일한 서열을 갖는다는 점에서 서로 비슷하다. 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여체 부위, 스플라이스 수용체 부위, 인트론, 엑손, 비해독 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 하나 이상의 암호 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 상동체 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 이종상동체 또는 상동체이다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 랫트 서열)이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 인간 서열이거나 인간 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 변이체 또는 돌연변이체(즉, 예를 들어, 대체된 서열과 비교하여 하나 이상의 서열 차이, 치환을 함유하는 서열)이다. 그와 같이 배치된 핵산 서열은 그와 같이 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비해독 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 대체는 그와 같이 배치된 핵산 서열(이종 서열 포함)로부터의 유전자 생성물의 생산을 초래하지만 내인성 서열은 발현시키지 않는 이종 서열에 의한 내인성 서열의 치환이고; 치환은 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 의한 내인성 게놈 서열의 치환(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화하고, DNA 단편은 전적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화함)이다. 다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편은 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편으로 대체된다.
실질적으로 : 본원에 사용된 바와 같이, 관심 있는 특성 또는 성질의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 있다하더라도, 거의 완료되지 않고 및/또는 완전하게 진행되지 않거나, 절대적인 결과를 달성하거나 피하지 못한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전함의 잠재적인 부족을 포착하기 위해 본원에 사용된다.
실질적인 유사성 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 상응하는 위치에 유사한 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 함유하는 경우, 일반적으로 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 본 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 유사한 잔기는 동일한 잔기일 수 있지만(또한, 이하의 실질적인 동일성 참조), 유사한 잔기는 또한 구조적 및/또는 기능적 특성이 대략 비슷한 비-동일성 잔기일 수 있다. 예를 들어, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로서 분류된다. 동일한 유형의 다른 아미노산 대신에 한 아미노산의 치환은 종종 "보존적" 치환으로 간주될 수 있다. 전형적인 아미노산 분류는 이하 표에 요약된다.
본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열에 대한 BLASTN, 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는, 전체가 본원에 참고로 포함되는, Altschul, S.F. 등, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. 등, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. 등, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. 및 B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 등 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 유사한 서열을 식별하는 것 외에도, 위에서 언급한 프로그램은 전형적으로 유사성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 서열은 이들의 상응하는 잔기의 적어도, 예를 들어, 비제한적으로, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 적절한 스트레치에 걸쳐 유사(예를 들어, 동일하거나 보존적 치환을 포함)하다면, 실질적으로 유사한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열(예를 들어, 유전자의 서열, 유전자 분절, 도메인을 암호화하는 서열, 폴리펩타이드 또는 도메인)이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 잔기이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열을 따라 근접한 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열을 따른 불연속 잔기, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 폴딩된 입체형태에 의해 합쳐진 비근접 잔기를 포함한다.
실질적인 동일성 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 본 기술분야의 일상적인 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 2개의 서열은 상응하는 위치에 동일한 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 함유하는 경우, 일반적으로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열에 대한 BLASTN, 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는, 전체가 본원에 참고로 포함되는, Altschul, S.F. 등, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. 등, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. 등, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. 및 B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 등 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 외에도, 위에서 언급한 프로그램은 전형적으로 동일성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 서열은 이들의 상응하는 잔기의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 적절한 스트레치에 걸쳐 동일하다면, 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 잔기의 적절한 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시양태에서, 잔기의 적절한 스트레치는, 예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이나, 이에 제한되지는 않는다.
표적화 작제물 또는 표적화 벡터 : 본원에 사용된 바와 같이, 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고 상동성 재조합을 통해 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내의 위치로 표적화 작제물의 통합을 제공한다. 부위-특이적 재조합효소 인식 부위(예를 들어, loxP 또는 Frt 부위)를 사용하여 표적화하는 표적화 영역이 또한 본원에 포함되고 기술된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 특정 관심이 있는 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능한 마커, 제어 서열 및/또는 조절 서열, 및 이러한 서열을 수반하는 재조합에 도움을 주거나 용이하게 하는 단백질의 외인적 첨가를 통해 매개되는 재조합을 허용하는 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 전적으로 또는 부분적으로 관심 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 관심 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 이종 유전자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 관심 있는 인간화 유전자가 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 관심 있는 인간화 유전자를 전적으로 또는 부분적으로 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 작제물(또는 표적화 벡터)은 사람 손에 의해 조작된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적화 작제물(또는 표적화 벡터)은 자연에서는 그 순서로 함께 연결되지 않지만, 조작된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드에서는 사람 손에 의해 서로 직접 연결되도록 조작된 2개 이상의 서열을 함유하는 조작된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하도록 작제될 수 있다.
전이유전자 또는 전이유전자 작제물 : 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 방법과 같은 사람 손에 의해 세포 내로 도입된 핵산 서열(예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화함)을 지칭한다. 전이유전자는 이것이 도입되는 유전자 조작된 동물 또는 세포에 대해 부분적으로 또는 전적으로 이종성, 즉 외래성일 수 있다. 전이유전자는 선택된 핵산 서열의 발현에 필수적일 수 있는, 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 다른 핵산, 예컨대, 인트론 또는 프로모터를 포함할 수 있다.
재배열되지 않은 : 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 이벤트를 겪지 않았거나 달리 접합되어, 사이에 유전자간 서열(들)을 포함하는 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 DNA 서열을 기술한다. 본 기술분야의 기술자는 재배열되지 않은 V 유전자 분절 및 J 유전자 분절이 온전한 재조합 신호 서열(RSS)과 연관될 수 있음을 이해할 것이다. 재배열되지 않은 D 유전자 분절은 2개의 온전한 재조합 신호 서열(RSS)의 측면에 있을 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 재배열되지 않은 유전자 분절이 무엇보다도 인트론을 포함할 수 있음을 또한 인식할 것이다.
벡터 : 본원에 사용된 바와 같이, 연관되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 진핵 및/또는 원핵 세포와 같은 숙주 세포에서 연결되어 있는 핵산의 염색체외 복제 및/또는 발현을 할 수 있다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
야생형 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, "정상"(돌연변이체, 질병에 걸린, 변경된, 조작된 등과 대조됨) 상태 또는 정황의 자연에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 갖는 실체를 지칭한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 야생형 유전자 및 폴리펩타이드가 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다는 것을 인식할 것이다.
상세한 설명
본 개시내용은 면역글로불린 사슬 쌍형성(pairing) 및 친화도 성숙을 비롯한, 비-인간 동물에서의 내인성 항체 발달 메커니즘이 외인성 인간 면역글로불린 서열을 포함하는 항원-특이적, 고친화성 항체를 생성하는데 이용될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 이러한 동물은, 예를 들어, 인간 항체 치료제를 만드는 데 사용될 수 있는 정상적이고 강력한 면역 반응을 생성할 수 있다. 본 개시내용은 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 도메인을 포함하는 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성하기에 효과적이고 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 인식한다. 본 개시내용은 또한 유전자 변형된 비-인간 동물이 친화도-성숙된 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위해 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 성공적으로 이용할 수 있음을 추가로 인식한다.
본 개시내용은 비-인간 동물에서 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한 항체의 생산이, 특정 비-인간 동물에서 λ 경쇄의 발현이 낮기 때문에 이미 문제가 있었음을 인식한다. 예를 들어, 마우스는 κ 경쇄를 λ 경쇄보다 훨씬 더 많이 이용한다(즉, 약 95:5의 κ:λ 비율). 본 개시내용은 또한 비-인간 동물의 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 제한함에 의한 보편적인 경쇄(예를 들어, 복수의 중쇄에 결합할 수 있는 경쇄)를 포함하는 항체의 생산이, 고친화성 항체 생성을 위한 가장 강력한 다양성-생성 메커니즘의 일부, 예를 들어, 조합적 다양성, 이음부 다양성 및 2차 재배열을 제거하기 때문에 문제가 될 수 있음을 인식한다. 또한, "혼합 및 정합" 중쇄 및 경쇄 쌍형성에서 달리 유도될 수 있는 다양성-생성 효과를 상당히 최소화한다. 이러한 인식에 비추어 볼 때, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역으로부터 비-인간 동물에서 인간 λ 경쇄 가변 영역을 생산하기 위한 플랫폼 및 방법은 본 기술분야에서 여전히 요구되고 있다.
본 개시내용은 κ 경쇄 유전자좌에서 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 고친화도, 항원-특이적 항체를 효과적으로 생성할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 이러한 결과는 비-인간 동물에서의 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리가 비-인간 동물로 하여금 λ 경쇄 가변 영역 서열을 이용하도록 하기 때문에 예상치 못한 것이다. λ 경쇄 가변 영역 서열의 사용은 특정 비-인간 동물의 자연적인 선호와 상반되는 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, 비-인간 동물에서 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 사용은 또한 고친화성, 항원 특이적 항체를 생성하는데 사용되는 많은 자연적 메커니즘을 제거한다.
본 개시내용은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제공하며, 여기서 비-인간 동물은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(1개 또는 2 개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함함)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 제공하며, 여기서 비-인간 동물은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 레퍼토리, 및 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 레퍼토리와 연관이 있는, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 발현된, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위한 생물학적 시스템이 또한 제공된다. 인간 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체, 중쇄, 경쇄(예를 들어, λ 경쇄), 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인(예를 들어, λ 경쇄 가변 도메인), 단일 사슬 가변 단편(ScFv))을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 비-인간 동물을 관심 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 항원 결합 단백질(예를 들어, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질)에 이용하는 것을 포함한다. 방법은 다중-특이적 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용하기에 적합한 인간 면역글로불린 중쇄 및/또는 λ 경쇄 가변 도메인을 제조하는 방법을 포함한다.
인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 제한적 레퍼토리로부터 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 제한적 레퍼토리를 발현하는, 유전자 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열(Vλ/Jλ 서열)을 포함하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단지 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단지 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 유전자 조작된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 4개 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 발현된 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 이러한 비-인간 동물에 의해 발현된 다수의 친화도-성숙된 인간 중쇄와 쌍을 이룰 수 있으며, 여기서 다수의 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래된 적합한 친화도-성숙된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 발현 및 선택하고, 여기서 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인은 비-인간 동물의 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 유래된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 연관되고 함께 발현된다. 본 개시내용은 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 인간 중쇄 가변 도메인(암호화 인간 λ 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역과 함께)이 다중-특이적 항체, 특히 이중특이적 항체의 생산에 이용될 수 있다는 통찰력을 제공한다.
비-인간 동물의 항체 레퍼토리
면역글로불린(항체라고도 함)은 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아 등)를 중화하기 위해 숙주 면역계의 B 세포에 의해 생성되는 큰(~150 kD) Y형 당단백질이다. 각 면역글로불린(Ig)은 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 구성되며, 각각은 가변 도메인과 불변 도메인인 2가지 구조적 구성요소를 갖는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생성된 항체에서 상이하지만, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생성된 모든 항체에서는 동일하다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 함께 항원 결합 영역(또는 항원 결합 부위)을 포함한다. 면역글로불린은 이들이 함유하는 중쇄 불변 영역(또는 도메인)을 기반으로 하는 아이소타입(isotype) 또는 클래스로 지칭되는 다양한 변종으로 존재할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 동일한 아이소타입의 모든 항체에서 동일하지만, 상이한 아이소타입의 항체에서는 상이하다. 이하의 표는 마우스 및 인간에 있는 9개의 항체 아이소타입을 요약한 것이다.
다른 종에서 또 다른 아이소타입이 식별되었다. 아이소타입은 상이한 아이소타입 간에 상이한 구조적 특성으로 인해 항체에 특화된 생물학적 성질을 부여하며 동물 신체 내의 상이한 위치(세포, 조직 등)에서 발견된다. 처음, B 세포는 동일한 항원 결합 영역을 갖는 IgM 및 IgD를 생성한다. 활성화 시, B 세포는 클래스 전환이라고 하는 과정에 의해 상이한 아이소타입으로 전환되고, 이 과정은 B 세포에 의해 생산된 항체의 불변 영역의 변화를 수반하는 반면, 가변 영역은 동일하게 유지하여, 초기 항체(B 세포)의 항원 특이성을 보존한다.
2개의 별도의 유전자좌(Igκ 및 Igλ)는 재배열 시 항체의 경쇄를 암호화하고 대립유전자 배제 및 아이소타입 배제 둘 모두를 나타내는 유전자 분절을 함유한다. κ+ 대 λ+ B 세포의 발현 비율은 종마다 다르다. 예를 들어, 인간은 약 60:40(κ:λ)의 비율을 입증한다. 마우스 및 랫트에서는 95:5(κ:λ)의 비율이 관찰된다. 흥미롭게도, 고양이에서 관찰된 κ:λ 비율(5:95)은 마우스 및 랫트와 정반대이다. 이러한 관찰된 비율 배후에 가능한 이유를 해명하기 위해 여러 연구가 수행되었으며, 유전자좌의 복잡성(즉, 유전자 분절, 특히 V 유전자 분절의 수) 및 유전자 분절 재배열의 효율 둘 모두가 합당한 근거로서 제안되었다. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 1,000kb 초과로 확장되며, 3개의 클러스터로 조직된 대략 70개의 Vλ 유전자 분절(29 내지 33개 기능성)과 7개의 Jλ-Cλ 유전자 분절 쌍(4 내지 5개 기능성)을 포함한다(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제9,006,511호의 도 1 참조). 발현된 항체 레퍼토리에서 관찰된 Vλ 영역의 대부분은 가장 근접한 클러스터(클러스터 A로 지칭됨) 내에 함유된 유전자 분절에 의해 암호화된다. 마우스 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 인간 유전자좌와 현저하게 다르며, 계통에 따라 2개의 별개의 유전자 클러스터로 조직된 소수의 Vλ 및 Jλ 유전자 분절만을 함유한다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호의 도 2 참조, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
다양한 인간 질병을 치료하기 위한 치료 항체의 개발은 인간 면역글로불린 유전자에 상응하는 게놈에 다양한 양의 유전자 물질을 수용하는 조작된 비-인간 동물 계통, 특히 조작된 설치류 계통의 생성에 주로 집중되어 있다(예를 들어, Bruggemann, M. 등, 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:101-8에서 검토됨, 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 유전자 조작된 설치류 계통을 생성하는데 있어서 초기 노력은 자체적으로 유전자 분절의 재조합 및 내인성 면역글로불린 유전자좌를 불활성화시키면서 전적으로 인간인 중쇄 및/또는 경쇄의 생산을 지원할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부의 통합에 초점을 맞추었다(예를 들어, Bruggemann, M. 등, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:67-09-13; Bruggemann, M. 등, 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6; Taylor, L.D. 등, 1992, Nucl.Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. 등, 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. 등, 1994, Nat. Genet 7:13-21; Lonberg, N. 등, 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. 등, 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. 등, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. 등, 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Wagner, S.D. 등, 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. 등, 1997, Nat Genet. 15:146-56; Green, L.L. 등, 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. 등, 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. 등, 2000, Immunol. Today 21:364-70; Kellermann, S.A. 및 L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7 참조, 각각 그 전체가 참고로 포함됨). 특히, 일부 노력은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열의 통합을 포함했다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 및 2011/0236378 A1; 미국 특허 제6,998,514호 및 제7,435,871호; Nicholson, I.C. 등, 1999, J. Immunol. 163:6898-906; Popov, A.V. 등, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 노력은 인간 Vλ, Jλ, Cλ 서열을 함유하는 효모 인공 염색체를 무작위 통합하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄(즉, 인간 Vλ 및 Cλ 도메인)를 완전하게 발현하는 마우스 계통을 생성하는데 초점을 맞추었다. 보다 최근의 노력은 인간 Vλ, Jλ, 및 Cλ 서열도 함유하는 작제물을 사용하는 유사한 전략을 이용했다(Osborn, M.J. 등, 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. 등, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
또 다른 노력은 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절이 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되도록, 내인성 설치류 면역글로불린 경쇄 유전자좌(κ 및 λ)에 상기 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 특정 삽입을 포함했다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 이러한 동물의 일부 실시양태에서, 클러스터 A 및 B로부터의 모든 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 또는 4개의 인간 Jλ 유전자 분절이 내인성 면역글로불린 κ 및 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 삽입되었다. 몇몇 상이한 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 설치류 항체 레퍼토리에서 발현되는 기능적 경쇄를 형성하기 위해 조작된 설치류 면역글로불린 경쇄 유전자좌 둘 모두에서의 적절한 재배열을 입증하였고, 여기서 경쇄는 내인성 Cκ 및 Cλ 영역의 정황에서 인간 Vλ 도메인을 포함하였다(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제9,006,511호의 표 7 및 도 11-13 참조). 특히, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 수용하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 마우스는 비장 구획에서 약 1:1의 인간 람다 대 내인성 람다 비율(IgCκ 대 IgCλ 비율로 측정)을 입증했다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호의 표 4 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 실제로, 조작된 마우스 계통(즉, 조작된 면역글로불린 κ 또는 조작된 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌)은 일반적으로 경쇄 발현에 큰 편향(상기 참조)을 나타내는 설치류의 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 인간 Vλ 도메인이 발현될 수 있음을 입증했다. 본 개시내용은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현을 최대화하기 위해, 교호 조작된 면역글로불린 경쇄 유전자좌 구조가 생성될 수 있다는 인식을 제공한다. 이러한 교호 조작된 면역글로불린 경쇄 유전자좌 구조는 이들의 설계에서 유래하는 고유의 항체 레퍼토리의 역량을 제공한다.
본 개시내용은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 생식계열 게놈이 함유하는 비-인간 동물을 제공한다. 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 또는 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 경쇄의 발현은 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 삽입함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역의 발현이 불활성화(예를 들어, 유전자 결실에 의해)되도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역의 발현이 불활성화(예를 들어, 삽입, 대체 또는 치환에 의해)되도록 조작된다.
보편적 경쇄
유용한 다중특이적 항원-결합 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체를 만들기 위한 이전의 노력은 공통 패러다임, 즉 합리적으로 조작하거나, 또는 이종이량체 이중특이적 인간 면역글로불린의 쌍형성을 위한 적합한 형식인 시행착오(trial-and-error)를 통해 조작하는 서열의 시험관내 선택 또는 조작을 흔히 공유하는 다양한 문제들에 의해 방해를 받았다. 불행히도, 시험관내 조작 접근법의 전부는 아니지만 대부분은 적어도 개별 분자에 적합한 즉석 해결책을 주로 제공한다.
인간 치료제로 이어질 수 있는 적절한 쌍형성을 선택하기 위해 복잡한 유기체를 이용하는 생체내 방법이 개발되었다(예를 들어, 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제10,143,186호 참조). 그러나, 이전의 비-인간 동물에서는 충분한 역가 수준으로 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 갖는 고친화도 보편적 λ 경쇄의 생산을 포함하는 강력한 면역 반응을 생성할 수 있는 것이 생산되지 않았다. 일반적으로, 천연 비-인간 서열은 흔히 인간 치료 서열에 좋은 공급원이 아니다. 적어도 이러한 이유로, 보편적 인간 경쇄와 쌍을 이루는 비-인간 중쇄 면역글로불린 가변 도메인을 생성하는 것이 제한적인 실용적 유용성이 있다. 공통 인간 경쇄와 커플링하는 능력 및 에피토프 특이성과 친화도를 유지하기를 희망하면서, 비-인간 중쇄 가변 서열을 인간화하기 위한 시도로 시행착오 과정에서 더 많은 시험관내 조작 노력이 불확실한 결과와 함께 쏟아질 것이다. 이러한 과정 마지막에 최종 생성물은 약간의 특이성과 친화도를 유지하고 보편적 경쇄와 연관될 수 있지만, 궁극적으로 인간에서의 면역원성은 심각한 위험으로 남을 가능성이 있다.
따라서, 인간 치료제를 만들기에 적합한 비-인간 동물은 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 대신에 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 적절하게 큰 레퍼토리를 포함할 것이다. 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 역 키메라 중쇄(즉, 인간 가변 도메인 및 비-인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄)를 형성하기 위해 재배열하여 내인성 비-인간 중쇄 불변 영역에 스플라이싱할 수 있어야 한다. 인간 λ 경쇄 가변 영역의 제한적 레퍼토리에 의해 암호화된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 연관이 있을 수 있는 것을 선택하기 위해, 중쇄 가변 도메인의 적절하게 큰 레퍼토리가 비-인간 동물에서 이용가능하도록, 중쇄 유전자좌는 클래스 전환 및 체세포 과돌연변이를 겪을 수 있어야 한다.
복수의 중쇄에 대해 보편적 경쇄를 선택하는 비-인간 동물은 실용적인 유용성이 있다. 다양한 실시양태에서, 보편적인 경쇄만을 발현할 수 있는 비-인간 동물에서 발현하는 항체는 동일하거나 실질적으로 동일한 경쇄와 연관되어 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 이중특이적 항체를 만드는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 이러한 비-인간 동물은 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하도록 제1 면역원에 의해 면역화될 수 있다. 비-인간 동물(또는 이의 중쇄 및 λ 경쇄 유전자좌에 동일한 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물)은 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하도록 제2 면역원에 의해 면역화될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클로닝되어 동일한 중쇄 불변 영역 및 동일한 경쇄와 함께 발현될 수 있으며, 세포에서 발현되어 이중특이적 항체의 경쇄 구성요소가 이 경쇄 구성요소와 연관되어 함께 발현하도록 비-인간 동물에 의해 선택된 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 보편적 κ 경쇄를 발현하는 비-인간 동물은 개발되어 있다(예를 들어, 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제10,143,186호 참조). 그러나, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 보편적 λ 경쇄를 발현할 수 있는 비-인간 동물의 개발은 여전히 필요하다.
본 개시내용은 가변 영역이 생식계열 서열이 아닌, 예를 들어 친화도 성숙된 또는 체세포 과돌연변이된 가변 영역인 중쇄를 포함하는, 다소 다양한 패밀리의 중쇄와 적절히 쌍을 이룰 면역글로불린 λ 경쇄를 생성하기 위한 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 λ 경쇄 가변 도메인을, 체세포 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 가변 도메인과 함께 발현하고 쌍을 이루도록 조작되어, 인간 치료제로서 사용하기에 적합한 고친화도 결합 단백질(예를 들어, 항체)로 갈 수 있게 한다.
본원에 기재된 바와 같은 유전작 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 유기체 내에서 길고 복잡한 항체 선택 과정을 통해, 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 집합체가 제한된 수의 경쇄 옵션과 쌍을 형성하는데 있어서 생물학적으로 적절한 선택을 할 수 있게 한다. 이를 달성하기 위해, 비-인간 동물은 광범위한 인간 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 인간 λ 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 조작된다. 면역원을 이용한 공격 시에, 본원에 기재된 비-인간 동물은 레퍼토리 중 경쇄 옵션 또는 수에 의해 주로 또는 유일하게 제한되는 면역원에 대한 항체를 개발하기 위해, 그 레퍼토리에서 해결책의 수를 최대화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이것은 비-인간 동물이 특히 체세포 과돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 비교적 큰 다양성의 인간 중쇄 가변 도메인과 양립할 수 있을 뿐만 아니라 경쇄 가변 도메인의 적합하고 양립가능한 체세포 돌연변이를 달성할 수 있도록 하는 것을 포함한다.
인간 λ 경쇄 옵션의 제한적 레퍼토리를 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 천연의 비-인간 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력을 비기능적 또는 실질적으로 비기능적이 되도록 조작할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는, 예를 들어, 비-인간 동물의 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 유전자좌는 내인성 비-인간 경쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된 최상의 적합한 외인성 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열(들)에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 영역 유전자 분절은 재배열되지 않고(예를 들어, 2개의 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 Jλ 유전자 분절), 재배열하여 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱함으로써, 재배열된 역 키메라 경쇄 유전자(인간 가변, 비-인간 불변)를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 유전자 분절은 재배열되고(예를 들어, 하나의 Vλ 유전자 분절 및 하나의 Jλ 유전자 분절) 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱하여 인간 가변 영역 및 비-인간 불변 영역을 포함하는 역 키메라 경쇄 유전자를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 유전자 분절은 재배열되고(예를 들어, 하나의 Vλ 유전자 분절 및 하나의 Jλ 유전자 분절), 외인성 인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱되어 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 인간화된 경쇄 유전자를 형성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 체세포적으로 과돌연변이될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 적절한 인핸서(들)는 비-인간 동물에 보유된다. 인핸서는 체세포 돌연변이를 획득하는 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 내인성 비-인간 동물 κ 가변 영역 유전자 분절을 인간 λ 가변 영역 유전자 분절로 대체하여 비-인간 동물의 κ 유전자좌를 변형시키는데 있어서, 비-인간 κ 인트론성 인핸서 및 비-인간 κ 3' 인핸서는 기능적으로 유지되거나 파괴되지 않는다. 인핸서가 제거되거나 파괴되는 실시양태가 본 개시내용에 의해 고려되지만, 이러한 실시양태는 체세포 과돌연변이를 감소시키거나 또는 제거할 것으로 예상된다. 이러한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 체세포 과돌연변이는, 예를 들어, 하나 이상의 내인성, 비-인간 인핸서를 포함하는 경쇄 가변 영역에 비해 감소된다.
다양한 역 키메라(인간 가변, 비-인간 불변) 중쇄와 연관된 역 키메라(인간 가변, 비-인간 불변) 경쇄의 제한적 레퍼토리를 발현하는 유전자 조작된 비-인간 동물이 제공된다. 다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절은 결실되고 내인성 비-인간 κ 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 단일(또는 2개의) 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절로 대체된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 κ 인트론성 인핸서 및 비-인간 κ 3' 인핸서는 유지된다. 어느 한 이론에 얽매임이 없이, 인핸서는 무엇보다도 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 체세포 과돌연변이를 최대화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 비-인간 동물은 또한 비기능성 λ 경쇄 유전자좌, 또는 이의 결실, 또는 이 유전자좌가 λ 경쇄를 만들 수 없도록 하는 결실을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 경쇄 가변 유전자 분절이 결여되고 인간 가변 유전자 분절을 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하고, 일부 실시양태에서는, 비-인간 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는, 유전자 조작된 비-인간 동물이 제공되며, 여기서 유전자좌는 체세포 과돌연변이를 겪을 수 있고, 유전자좌는 비-인간 Cλ 유전자 분절에 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 발현한다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 유전자좌는 체세포 과돌연변이의 정상 또는 야생형 수준과 상관성이 있는 비-인간 κ 3' 인핸서를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 관심 항원으로 면역화된 경우 유전자 조작된 비-인간 동물은 1개 또는 2개의 재배열된 경쇄와 함께 발현하고 기능하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 다양한 재배열을 나타내는 B 세포를 생성한다. 일부 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 영역은 체세포 과돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 영역은 각각 1 내지 5개의 체세포 과돌연변이를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 발현된 경쇄는 비-인간 동물에서 발현된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 임의의 중쇄와 연관될 수 있고 함께 발현될 수 있다.
제공된 비-인간 동물, 세포 및 조직
비-인간 동물의 생식계열 게놈 중 내인성 비-인간 λ 경쇄 유전자좌에서 (i) 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절로부터 유래되거나, 또는 (ii) 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 서열 대신에 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역으로부터 유래되는, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 함유한 항체를 발현(예를 들어, B 세포가 발현)하는 비-인간 동물이 제공된다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이고, 본원에 기재된 비-인간 요소(인핸서, 불변 영역 등)는 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스의 요소인 것으로 이해될 것이다. 본원에 기재된 비-인간 동물의 적합한 예는 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 특히 마우스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용은, 예를 들어, 인간에 영향을 미치는 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있는, 새로운 항원-결합 단백질, 항체, 항체 구성요소(예를 들어, 항원-결합 부분 및/또는 이를 포함하는 조성물 또는 포맷), 및/또는 항체-기반 치료제를 식별 및 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 제한적 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌와 같은 조작된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 유용하다는 인식을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 인간에게 투여하기 위한 항체 및/또는 항체-기반 치료제의 개발을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 인간 Vλ 영역 서열을 함유하는 기존의 생체내 시스템으로부터 수득된 항체 및/또는 항체 기반의 치료제에 비해, 개선된 및/또는 상이한 성능(예를 들어, 항원-특이적 항체 레퍼토리에서 발현 및/또는 표시)을 특징으로 하는 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 함유하는 항체 및/또는 항체 기반의 치료제를 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다.
본 개시내용은 무엇보다도 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간 Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 2개의 재배열된 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 예컨대, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)이 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류 , 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 예컨대, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역(V/J)을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ3이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 마우스 Cκ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 마우스 Cλ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 생식계열 게놈이 마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공하며, 여기서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하고, 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 무엇보다도 생식계열 게놈이 마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공하며, 여기서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하고, 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 상기 비-인간 동물의 생식계열 게놈에 있는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 항체의 발현을 특징으로 하며, 여기서 항체는 (1) 인간 Vλ 도메인 및 (2) 비-인간 Cλ 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 하나 이상의 기준 조작된 비-인간 동물에 비해, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 인간 Vλ 영역의 개선된 사용법(예를 들어, 약 2배, 그러나 이에 제한되지 않음)을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 생식계열 게놈이 (a) 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역, 및 (b) Cλ 유전자를 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 여기서 (a)는 (b)에 작동가능하게 연결되고, 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 비-인간 동물 Cκ 유전자가 결여되어 있는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 제공된다.
일부 실시양태에서, 게놈이 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 및 Cλ 유전자의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 상기 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결되고, 이 Cλ 유전자는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 비-인간 Cκ 유전자 대신에 삽입되는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 제공된다. 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 많은 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 비-인간 Cκ 유전자 대신에 삽입된 Cλ 유전자는 비-인간 또는 인간 Cλ 유전자이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 Cλ 유전자는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물의 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-인간 Cλ 유전자는 설치류 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2, 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 실질적으로 동일하거나, 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ1 유전자는 서열번호 1이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ2 유전자는 서열번호 2이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ3 유전자는 서열번호 3이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자와 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2, 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 또는 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3, 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ1 유전자는 서열번호 7이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ2 유전자는 서열번호 8이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ3 유전자는 서열번호 9이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ4 유전자는 서열번호 10이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3, 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 또는 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ1 유전자는 서열번호 15이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ2 유전자는 서열번호 16이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ3 유전자는 서열번호 17이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ6 유전자는 서열번호 18이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ7 유전자는 서열번호 18이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6, 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 상기 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 생식계열 게놈은 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하며, 여기서 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다(예를 들어, Macdonald, L.E., 등, "Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14): 5147-5152(April 8, 2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호 참조, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 대신하거나 대체한다(예를 들어, 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 암호 서열을 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 암호 서열로 위치적으로 대체하거나 치환함). 일부 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역이거나 이를 포함한다. 많은 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역(예를 들어, 내인성)은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 또는 유전자 분절(예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA 등)을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 삽입은 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절, 및 이들의 조합 사이에 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 VH 유전자 분절 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합, 인간 DH 유전자 분절 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합, 및 인간 JH 유전자 분절 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합의 삽입을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 삽입은 내인성 중쇄 유전자좌에서 인간 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 또는 VH6-1에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 인간 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, 또는 DH7-27에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 및 내인성 중쇄 유전자좌에서 인간 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 또는 JH6에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 중에 Adam6 유전자를 포함하고, 이는 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 중에 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Adam6 유전자를 포함하고, 이는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편은 Adam6 유전자로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 Adam6 유전자는 상기 특이적 비-인간 동물(예를 들어, 다른 마우스 계통에서 수득되는 마우스 Adam6 유전자 또는 랫트 Adam6 유전자를 포함하는 마우스)에서 기원하는 것이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 이소성 Adam6 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 "이소성" Adam6 유전자는 야생형 비-인간 동물에서 나타나는 Adam6 유전자와 상이한 정황에 있는 Adam6 유전자를 지칭한다. 예를 들어, Adam6 유전자는 상이한 염색체에 위치하거나, 상이한 유전자좌에 위치하거나, 또는 상이한 서열에 인접하여 위치할 수 있다. 예시적인 이소성 Adam6 유전자는 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절) 내에 위치한 마우스 Adam6 유전자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 삽입된 또는 통합된 Adam6 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈)에서 하나 이상의 비-인간 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈)에 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 에 마우스 Adam6a 유전자 및/또는 마우스 Adam6b 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 마우스 ADAM6a, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편, 및/또는 마우스 ADAM6b, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절과 근접하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 인접하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절 사이에 위치하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH6-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 유사유전자의 자리에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 ADAM6 활성을 복원하거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 ADAM6 활성을 기능적 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 비슷한 비-인간 동물의 수준으로 복원시킨다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 비-인간 동물의 ADAM6 활성의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배인 수준으로 ADAM6 활성을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 수컷 비-인간 동물에서 발현되는 경우, 생식력을 복원하거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 기능적 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 비슷한 비-인간 동물의 수준으로 수컷 비-인간 동물의 생식력을 복원한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물을 교미시켜 낳은 새끼의 수가 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 수컷 비-인간 동물의 비슷한 교미로부터 낳은 새끼 수의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이도록 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 복원한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물의 교미에 의해 낳은 새끼의 수가 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 수컷 비-인간 동물의 비슷한 교미로부터 낳은 새끼 수의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배를 포함하도록 수컷 비-인간 동물의 생식력을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 결여는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다.
본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은, 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절(인간 가변 λ 경쇄 유전자 분절)을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 설치류 Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 비-인간 동물 또는 비-인간 조직은 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 λ 경쇄 및 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 κ 경쇄를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20 또는 Vκ1-39를 포함하고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14를 포함한다. 일 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1 또는 Vκ1-39/Jκ5이고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2이다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 전적으로 또는 부분적으로 결실된다. 제공된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 기능적으로 침묵형이거나 또는 달리 비-기능적(예를 들어, 유전자 표적화에 의해)이다. 제공된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 기능적으로 침묵형이거나 또는 달리 비-기능적인 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포, 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 또는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄, 및 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(TdT)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 게놈을 갖는다. (예를 들어, WO 2017/210586 및 미국 공개 번호 2017/0347633 참조, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 전사 제어 요소는 RAG1 전사 제어 요소, RAG2 전사 제어 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 제어 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 제어 요소, 면역글로불린 λ 경쇄 전사 제어 요소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 TdT를 암호화하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, 또는 RAG2 유전자좌에 위치한다.
일부 실시양태에서, TdT는 인간 TdT이다. 일부 실시양태에서, TdT는 TdT의 짧은 아이소폼(TdTS)이다.
일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 삽입 지점(예를 들어, 비-인간 면역글로불린 κ 인트론 인핸서 및/또는 비-인간 면역글로불린 κ 3' 인핸서) 부근에 있는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)의 완전성을 유지하는 방식으로 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입된다. 따라서, 이러한 비-인간 동물은 인간 및 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절, 및 비-인간 Cλ 또는 Cκ)에 작동가능하게 연결되거나 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절, 및 인간 Cλ 또는 Cκ)에 작동가능하게 연결된 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열에 의해 변경, 치환, 파괴, 결실, 대체 또는 조작된 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 2개 카피 중 상기 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 1개 카피(즉, 대립유전자) 내로 삽입되어, 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열과 관련하여 이형접합성인 비-인간 동물을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 비-인간 동물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(또는 이의 부분)은 결실되지 않는다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(또는 이의 부분)은 결실된다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, V, J 및/또는 C 또는 이들의 임의의 조합)은 상기 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌가 기능적으로 침묵하도록 변경, 치환, 파괴, 결실, 또는 대체된다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, V, J 및/또는 C 또는 이의 임의의 조합)은 상기 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌가 기능적으로 비활성화(즉, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 항체 레퍼토리에서 발현 및/또는 검출가능한 항체의 기능적 경쇄를 생산할 수 없음)되도록 표적화 벡터에 의해 변경, 치환, 파괴, 결실 또는 대체된다. 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 비활성화에 대한 지침은, 예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호(예를 들어, 도 2 참조)에 제공되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 또는 전이유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함함) 또는 이의 발현 생성물은, 예를 들어, PCR, 서던 블롯, 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 대립유전자의 획득 또는 손실 검정, 웨스턴 블롯, FACS 분석 등을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 반접합성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 또는 전이유전자의 하나 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 도면에 도시된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 함유한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 이의 게놈에 포함된 λ경쇄 가변 영역 유전자 분절, 및 인간 중쇄를 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것임을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 면역글로불린 인간 중쇄 및 λ 경쇄 가변 도메인은각각 이들의 게놈에 포함된 인간 중쇄 및 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서,게놈에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공되고, 여기서 비-인간 동물은 체세포적으로 과돌연변이된, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙 항체 서열에서 공급원의 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어 DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA, 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용가능하다.
본 개시내용은 무엇보다도 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트, 마우스)로부터의 세포 및 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 비-인간 동물로부터의 비장세포(및/또는 다른 림프구 조직)가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 프로-B(pro-B) 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 프리-B(pre-B) 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 미성숙 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 성숙 나이브(naive) B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 활성화된 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 기억 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 B 계열 림프구가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 혈장 또는 형질 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 줄기 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 생식 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 생식 세포는 난모세포이다. 일부 실시양태에서, 생식 세포는 정자 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 정자 세포는 하나 이상의 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 임의의 세포 또는 조직이 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 단리된 세포 및/또는 단리된 조직이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마가 제공되며, 여기서 하이브리도마는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 관심 항원에 의해 면역화된 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 관심 항원 상의 에피토프에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현하는 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 비-인간 동물이 상기 하나 이상의 관심 항원에 대해 면역 반응을 발달시키기에 충분한 조건 및 시간 동안 하나 이상의 관심 항원에 의해 면역화될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 비-인간 동물을 면역화하는 방법을 알고 있다. 비-인간 동물을 면역화하기 위한 예시적이고 비제한적인 방법은 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,582,298호에서 찾아볼 수 있다.
본 개시내용은 무엇보다도 본원에 기재된 바와 같은 면역화된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스), 및 이들로부터 단리된 세포 및 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원에 의한 면역화에 반응하여 B 세포의 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 관심 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현하는 B 세포의 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에 의해 발현된 항체는 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포의 집단에 의해 발현된 항체는 (i) 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄, 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 관심 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 집단을 생성하며, 여기서 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에 의해 발현된 항체는 (i) 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄, 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 체세포적으로 과돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에서 B 세포의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%는 체세포적으로 과돌연변이된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고 비-인간 동물 또는 인간 Cλ 유전자 분절의 상류에 삽입되고 작동가능하게 연결된, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 비-인간 또는 인간 Cλ 유전자 분절은 비-인간 Cκ 유전자의 자리에 삽입된다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 C에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51, Vλ1-40, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51 또는 Vλ2-14로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Jλl, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Jλl, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 이의 게놈에 포함된 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것이라는 것을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인은 이의 게놈 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체에 포함된 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 게놈에 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공되며, 여기서 비-인간 동물은 체세포적으로 과돌연변이된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열, 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙한 항체 서열에서 공급원의 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용될 수 있다.
많은 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에서 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 상이한 종(예를 들어, 상이한 설치류 종)의 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에서 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에, 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서(즉, 인핸서 서열 또는 인핸서 영역)에 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 인트론성 인핸서 영역(Igκ Ei 또는 Eiκ)에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 3' 인핸서 영역(Igκ 3'E 또는 3'Eκ)에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 Eiκ에 작동가능하게 연결되고 뮤린 3'Eκ에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 설치류 Cλ 유전자, 예컨대, 예를 들어, 마우스 Cλ 유전자 또는 랫트 Cλ 유전자이다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 129 계통, BALB/c 계통, C57BL/6 계통, 혼합 129xC57BL/6 계통 또는 이의 조합을 포함하는 유전자 배경으로부터의 마우스 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 1(마우스 Cλ1), 서열번호 2(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 3(마우스 Cλ3)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 1(마우스 Cλ1), 서열번호 2(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 3(마우스 Cλ3)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자의 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 4(마우스 Cλ1), 서열번호 5(마우스 Cλ2), 또는 서열번호 6(마우스 Cλ3)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 4(마우스 Cλ1), 서열번호 5(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 6(마우스 Cλ3)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 7(랫트 Cλ1), 서열번호 8(랫트 Cλ2), 서열번호 9(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 10(랫트 Cλ4)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 7(랫트 Cλ1), 서열번호 8(랫트 Cλ2), 서열번호 9(랫트 Cλ3), 또는 서열번호 10(랫트 Cλ4)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1 유전자의 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 11(랫트 Cλ1), 서열번호 12(랫트 Cλ2), 서열번호 13(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 14(랫트 Cλ4)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 11(랫트 Cλ1), 서열번호 12(랫트 Cλ2), 서열번호 13(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 14(랫트 Cλ4)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 랫트 Cλ1 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ 유전자, 예컨대, 예를 들어, 인간 Cλ1 유전자, 인간 Cλ2 유전자, 인간 Cλ3 유전자, 인간 Cλ6 유전자 또는 인간 Cλ7 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 서열번호 15(인간 Cλ1), 서열번호 16(인간 Cλ2), 서열번호 17(인간 Cλ3), 서열번호 18(인간 Cλ6) 또는 서열번호 19(인간 Cλ7)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 서열번호 15(인간 Cλ1), 서열번호 16(인간 Cλ2), 서열번호 17(인간 Cλ3), 서열번호 18(인간 Cλ6) 또는 서열번호 19(인간 Cλ7)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자의 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 서열번호 20(인간 Cλ1), 서열번호 21(인간 Cλ2), 서열번호 22(인간 Cλ3), 서열번호 23(인간 Cλ6), 또는 서열번호 24(인간 Cλ7)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 서열번호 20(인간 Cλ1), 서열번호 21(인간 Cλ2), 서열번호 22(인간 Cλ3), 서열번호 23(인간 Cλ6) 또는 서열번호 24(인간 Cλ7)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 인간 Cλ2 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 중쇄 유전자좌
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 생식계열 구성으로 배열되고 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자, 인핸서 및 조절 영역에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 존재를 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 VH 유전자 분절 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 DH 유전자 분절 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6- 25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 JH 유전자 분절 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 이의 게놈에 포함된 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것이라는 것을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 이의 게놈 또는 이의 체세포 과돌연변이된 변이체에 포함된 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 체세포적으로 과돌연변이된 인간 중쇄 가변 영역 서열, 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙한 항체 서열에서 공급원 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자, 예를 들어 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 E(IgE) 및 면역글로불린 A(IgA)와 같은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 IgM, 설치류 IgD, 설치류 IgG3, 설치류 IgG1, 설치류 IgG2b, 설치류 IgG2a, 설치류 IgE 및 설치류 IgA 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 인핸서(즉, 인핸서 서열 또는 인핸서 영역)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 조절 영역(또는 조절 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 인핸서(또는 인핸서 서열) 및 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 조절 영역(또는 조절 서열)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 Adam6 유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 동일한 종의 야생형 비-인간 동물의 생식계열 게놈에서 발견되는 것과 동일한 생식계열 게놈 위치에 내인성 Adam6 유전자(또는 Adam6-암호화 서열)를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Adam6 유사유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류) Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 삽입은 비-인간 동물(예를 들어, 무작위 도입된 비-인간 Adam6-암호화 서열, 이에 제한되지 않음), 세포 또는 조직의 생식계열 게놈 중 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 그 외의 곳에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 외측(예를 들어, 5' 최대 VH 유전자 분절의 상류, 이에 제한되지 않음)일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 항체 분자에 내인성 비-인간 VH 영역을 전적으로 또는 부분적으로 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물은 항체 분자의 내인성 비-인간 VH 영역(예를 들어, VH, DH 및/또는 JH)을 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다(또는 결여되어 있거나, 또는 그의 결실을 함유함). 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물은 내인성 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 결실을 전적으로 또는 부분적으로 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 생식력이 있다.
이러한 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)를 수용하는 표적화 벡터, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 동물의 생성에 대한 지침은 Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 비-인간(예를 들어, 포유동물) 게놈의 유전자 조작 및/또는 조작을 달성하거나 또는 비-인간 동물의 생식계열 게놈에 도입하기 위해 상기 서열을 달리 준비, 제공 또는 제조하기 위한, 본 기술분야에 공지된 다양한 기술을 알고 있다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 유전자좌의 조합
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 다른 인간 또는 인간화된 유전자(예를 들어, TdT를 암호화하는 인간 유전자)를 포함하는(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해) 하나 이상의 또 다른 면역글로불린 유전자좌를 추가로 포함한다. 이러한 비-인간 동물은 이 비-인간 동물의 의도된 용도에 따라 원하는 조작된 유전자형을 달성하기 위해 상기 기재된 바와 같이 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 다른 면역글로불린 유전자좌의 또 다른 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 다른 인간 또는 인간화 유전자(예를 들어, TdT를 암호화하는 인간 유전자)는 전술한 바와 같은 유전자 변형을 갖는 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포) 게놈의 추가 변경을 통해 또는 필요하다면 다른 유전자 변형된 계통과 본 기술분야에 공지된 육종 기술을 통해 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 이의 생식계열 게놈에 하나 이상의 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이고 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 하나 이상의 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하며, 기능적 불활성화된(예를 들어, 전적으로 또는 부분적으로 결실된, 또는 다르게 비-기능성이 되도록 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 기능적으로 불활성화된(예를 들어, 전체 또는 부분적으로 결실되거나 다르게 비-기능성이 되게 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이고, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이며, 기능적으로 불활성화된(예를 들어, 전적으로 또는 부분적으로 결실되거나 다르게 비-기능성이 되게 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)인 유전자 변형된 비-인간 동물의 생식계열 게놈은 2개의 대립유전자를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대립유전자는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하고 제2 대립유전자는 제한적 인간 κ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 세포 또는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직의 생식계열 게놈은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 및 이에 따른 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 세포 또는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직은 제1의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 λ 경쇄 및 제2의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 κ 경쇄를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20 또는 Vκ1-39를 포함하고 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14를 포함한다. 일 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1이고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 (a) 비-인간 동물이 비-인간 CH 도메인 서열과 융합된 인간 VH 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 동형접합성 또는 이형접합성 면역글로불린 중쇄 유전자좌; (b) 비-인간 동물이 비-인간 Cλ 도메인 서열과 융합된 인간 Vλ 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하도록 비-인간(예를 들어, 설치류) 면역글로불린 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 (a) 비-인간 동물이 비-인간 CH 도메인 서열과 융합된 인간 VH 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 동형접합성 또는 이형접합성 면역글로불린 중쇄 유전자좌; (b) 비-인간 동물이 비-인간 Cλ 도메인 서열과 융합된 인간 Vλ 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하도록 비-인간(예를 들어, 설치류) 면역글로불린 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌; 및 (c) 전적으로 또는 부분적으로, 동형접합성 또는 이형접합성 기능적 불활성화 또는 결실된, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 각각 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제8,642,835호, 제8,697,940호, 제9,006,511호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해).
핵산 작제물
전형적으로, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절) 또는 이의 일부(들)를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 복제하기 위해 벡터, 바람직하게는 DNA 벡터와 연결(예를 들어, 삽입)된다.
인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 공지된 서열 또는 공급원(예를 들어, 라이브러리)으로부터 직접 클로닝되거나, GenBank 또는 기타 공개적으로 입수가능한 데이터베이스(예를 들어, IMGT)로부터 입수가능한 공개된 서열에 기초하여 인실리코에서 설계된 생식계열 서열로부터 합성될 수 있다. 대안적으로, 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리는 관심 면역글로불린 DNA 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 서열 및 이들의 조합)을 제공할 수 있다. BAC 라이브러리는 100-150kb의 삽입체 크기를 함유할 수 있고 300kb만큼 큰 삽입체를 수용할 수 있다(Shizuya, 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, 등, 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, 등, 1996, Genomics 34 213-218; 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, 164-196kb의 평균 삽입체 크기를 수용하는 인간 BAC 라이브러리가 기술되어 있다(Osoegawa, K. 등, 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. 등, 1998, Genomics 52:1-8, Article No. GE985423, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함됨). 인간 및 비-인간 동물 게놈 BAC 라이브러리는 작제되어 있고 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, ThermoFisher). 게놈 BAC 라이브러리는 또한 전사 제어 영역뿐만 아니라 면역글로불린 DNA 서열의 공급원으로도 작용할 수 있다.
대안적으로, 면역글로불린 DNA 서열은 효모 인공 염색체(YAC)로부터 단리, 클로닝 및/또는 전달될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 뉴클레오타이드 서열은 결정되어 있다(예를 들어, Dunham, I. 등, 1999, Nature 402:489-95 참조, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, YAC는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌 전이유전자를 조립하기 위해 이미 사용된 바 있다(예를 들어, Popov, A.V. 등, 1996, Gene 177:195-201; Popov, A.V. 등, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19 참조, 이들 각각은 전체가 참고로 본원에 포함됨). 전체 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌(인간 또는 비-인간)는 여러 YAC 내에 클로닝 및 함유될 수 있다. 포함된 서열에 상관없이, 여러 YAC가 사용되고 중첩되는 유사성 영역을 함유하는 경우, 이들은 효모 숙주 균주 내에서 재조합되어 전체 유전자좌 또는 이 유전자좌의 바람직한 부분(예를 들어, 표적화 벡터에 의해 표적화된 영역)을 나타내는 단일 작제물을 생산할 수 있다. YAC 암은 본 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재된 방법에 의해 배아 줄기 세포 또는 배아 내로 작제물을 도입시키는데 도움을 주기 위해 개조함으로써 포유동물 선택 카세트에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하는데 사용하기 위한 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절의 DNA 및 아미노산 서열은 공개된 데이터베이스(예를 들어, GenBank, IMGT 등) 및/또는 공개된 항체 서열로부터 수득할 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자를 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 λ 또는 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역(각각 Cλ또는 Cκ) 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 κ 또는 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 κ 또는 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 Cλ 영역 유전자 및 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 재배열되지 않은 인간 Vλ 및 Jλ 서열을 함유하는 핵산 작제물은 인간 및/또는 뮤린 기원의 유전자간(intergenic) DNA를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자간 DNA는 비암호 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 서열, 비암호 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열, 비암호 뮤린 면역글로불린 λ 경쇄 서열, 비암호 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열, 또는 이들의 조합이거나, 이들을 포함한다.
핵산 작제물은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 더 큰 플라스미드의 일부로서 제조될 수 있다. 이러한 제조는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 효율적인 방식으로 정확한 구성의 클로닝 및 선택을 가능하게 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 전적으로 또는 부분적으로 함유하는 핵산 작제물은 원하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 내로 혼입시키기 위해 나머지 플라스미드 서열로부터 단리될 수 있도록 플라스미드의 제한효소 부위 사이에 위치될 수 있 다.
핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드)의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템, 뿐만 아니라 일반적인 재조합 절차에 대해서는 Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. 및 S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
표적화 벡터
표적화 벡터는 핵산 작제물을 표적 게놈 유전자좌 내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 표적화 벡터는 핵산 작제물 및 상기 핵산 작제물의 측면에 있는 상동성 암을 포함할 수 있고; 본 기술분야의 기술자는 표적화 벡터의 설계, 구조 및/또는 사용에 일반적으로 적용할 수 있는 다양한 옵션 및 특징을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 표적화 벡터는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적화 벡터는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다. 참조의 용이함을 위해 상동성 암은 본원에서 5' 및 3'(즉, 상류 및 하류) 상동성 암으로 지칭된다. 이 용어는 표적화 벡터 내의 핵산 작제물에 대한 상동성 암의 상대적인 위치에 관한 것이다. 5' 및 3' 상동성 암은 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로 본원에서 지칭되는, 표적화된 유전자좌 내의 영역 또는 또 다른 표적화 벡터 내의 영역에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 또한 5' 또는 3' 표적 서열로서 기능할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 서로 재조합할 수 있는 2개, 3개 또는 그 이상의 표적화 벡터를 이용한다. 다양한 실시양태에서, 표적화 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대형 표적화 벡터(large targeting vector, LTVEC)이다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 표적화 벡터는 각각 5' 및 3' 상동성 암을 포함한다. 제1 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 제2 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 중첩되는 서열(즉, 중첩 서열)을 포함하며, 이는 제1 및 제2 LTVEC 간의 상동성 재조합을 허용한다.
이중 표적화 방법의 경우, 제1 표적화 벡터의 5' 상동성 암 및 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 표적 게놈 유전자좌 내의 상응하는 분절(즉, 표적 서열)과 유사할 수 있고, 이는 상응하는 게놈 분절을 갖는 제1 및 제2 표적화 벡터의 상동성 재조합을 촉진할 수 있고 표적 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
삼중 표적화 방법의 경우, 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 제3 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 중첩되는 서열(즉, 중첩 서열)을 포함할 수 있으며, 이는 제2 및 제3 LTVEC 간에 상동성 재조합을 허용할 수 있다. 제1 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 제3 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 표적 게놈 유전자좌 내의 상응하는 분절(즉, 표적 서열)과 유사하며, 이는 상응하는 게놈 분절을 갖는 제1 및 제3 표적화 벡터의 상동성 재조합을 촉진하고 표적 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
상동성 암과 표적 서열 또는 2개의 상동성 암은 상동성 재조합 반응에 대한 기질로서 작용할 수 있도록 2개의 영역이 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유하는 경우, 서로 "상응하거나", 또는 "상응하는 것이다". 주어진 표적 서열과 표적화 벡터 상에서 발견되는 상응하는 상동성 암(즉, 중첩 서열) 사이 또는 2개의 상동성 암 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합이 일어날 수 있게 하는 임의의 서열 동일성 정도일 수 있다. 한 가지 예를 들면, 표적화 벡터(또는 이의 단편)의 상동성 암과 다른 표적화 벡터의 표적 서열 또는 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열(또는 이의 단편)이 공유하는 서열 동일성의 양은 서열이 상동성 재조합을 겪도록 하는, 예를 들어, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
더욱이, 상동성 암과 상응하는 표적 서열 사이의 상응하는 유사성(예를 들어, 동일성) 영역은 표적 게놈 유전자좌에서 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 주어진 상동성 암 및/또는 상응하는 표적 서열은 상동성 암이 세포의 표적 게놈 유전자좌 또는 다른 표적화 벡터 내에 있는 상응하는 표적 서열(들)과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 예를 들어, 약 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5- 95kb, 5-100kb, 100-200kb 또는 200-300kb 길이(예컨대, 본원의 다른 곳에 기재된 것)이되, 이에 제한되지 않는 상응하는 유사성 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 상동성 암 및/또는 상응하는 표적 서열은 상동성 암이 세포의 표적 게놈 유전자좌 또는 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 표적 서열(들)과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, 또는 95-100kb 길이(예컨대, 본원의 다른 곳에 기재된 것)이되, 이에 제한되지는 않는 상응하는 유사성 영역을 포함한다.
제1 표적화 벡터의 3' 상동성 암과 제2 표적화 벡터의 5' 상동성 암의 중첩 서열 또는 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암과 제3 표적화 벡터의 5' 상동성 암의 중첩 서열은 상기 표적화 벡터 사이에 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 상동성 암의 주어진 중첩 서열은 상동성 암의 중첩 서열이 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 중첩 서열과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 1-5kb, 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, 또는 200-300kb 길이인 상응하는 중첩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 암의 주어진 중첩 서열은 상동성 암의 중첩 서열이 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 중첩 서열과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 1-100kb, 5-100kb, 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb 또는 95-100kb 길이인 중첩 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 1kb부터 5kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 1kb부터 약 70kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 10kb부터 약 70kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 10kb부터 약 50kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 적어도 10kb이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 적어도 20kb이다. 예를 들어, 중첩 서열은 약 1kb부터 약 5kb까지, 약 5kb부터 약 10kb까지, 약 10kb부터 약 15kb까지, 약 15kb부터 약 20kb까지, 약 20kb부터 약 25kb까지, 약 25kb부터 약 30kb까지, 약 30kb부터 약 35kb까지, 약 35kb부터 약 40kb까지, 약 40kb부터 약 45kb까지, 약 45kb부터 약 50kb까지, 약 50kb부터 약 60kb까지, 약 60kb부터 약 70kb까지, 약 70kb부터 약 80kb까지, 약 80kb부터 약 90kb까지, 약 90kb부터 약 100kb까지, 약 100kb부터 약 120kb까지, 약 120kb부터 약 140kb까지, 약 140kb부터 약 160kb까지, 약 160kb부터 약 180kb까지, 약 180kb부터 약 200kb까지, 약 200kb부터 약 220kb까지, 약 220kb부터 약 240kb까지, 약 240kb부터 약 260kb까지, 약 260kb부터 약 280kb까지, 또는 약 280kb부터 약 300kb까지일 수 있다. 한 가지 예를 들면, 중첩 서열은 약 20kb 내지 약 60kb일 수 있다. 대안적으로, 중첩 서열은 적어도 1kb, 적어도 5kb, 적어도 10kb, 적어도 15kb, 적어도 20kb, 적어도 25kb, 적어도 30kb, 적어도 35kb, 적어도 40kb, 적어도 45kb, 적어도 50kb, 적어도 60kb, 적어도 70kb, 적어도 80kb, 적어도 90kb, 적어도 100kb, 적어도 120kb, 적어도 140kb, 적어도 160kb, 적어도 180kb, 적어도 200kb, 적어도 220kb, 적어도 240kb, 적어도 260kb, 적어도 280kb 또는 적어도 300kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 최대 400kb, 최대 350kb, 최대 300kb, 최대 280kb, 최대 260kb, 최대 240kb, 최대 220kb, 최대 200kb, 최대 180kb, 최대 160kb, 최대 140kb, 최대 120kb, 최대 100kb, 최대 90kb, 최대 80kb, 최대 70kb, 최대 60kb 또는 최대 50kb일 수 있다.
상동성 암은 일부 실시양태에서 세포에 고유한 유전자좌(예를 들어, 표적화된 유전자좌)에 상응할 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어, 전이유전자, 발현 카세트, 또는 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함하는, 세포의 게놈 내로 통합된 DNA의 이종성 또는 외인성 분절의 영역에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 일부 실시양태에서 세포의 표적화 벡터 상의 영역에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체의 영역, 또는 적절한 숙주 세포에 함유된 임의의 다른 조작된 영역에 상응할 수 있다. 또한, 표적화 벡터의 상동성 암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리, 또는 P1 파지 라이브러리의 영역에 상응하거나, 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 원핵생물, 효모, 조류(예를 들어, 닭), 비-인간 포유동물, 설치류, 인간, 랫트, 마우스, 햄스터 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 고양이, 개, 흰 족제비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이), 가축, 농업용 포유동물 또는 기타 관심 있는 유기체에 고유하거나, 이종성이거나, 외인성인 유전자좌에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉(nick) 또는 이중 가닥 단절의 부재 하에, 표적화 부위에서 비교적 낮은 수준의 성공적인 통합 및/또는 상당한 수준의 표적외 통합을 나타냈거나, 또는 통상적인 방법을 사용하여 표적화에 대해 제한적 감수성을 나타내는 세포의 유전자좌에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 조작된 DNA를 포함하도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 표적화 벡터(들)의 5' 및 3' 상동성 암은 표적화된 게놈에 상응한다. 대안적으로, 상동성 암은 관련 게놈에 상응한다. 예를 들어, 표적화된 게놈은 제1 계통의 마우스 게놈이고, 표적화 암은 제2 계통의 마우스 게놈에 상응하며, 여기서 제1 계통과 제2 계통은 상이하다. 특정 실시양태에서, 상동성 암은 동일한 동물의 게놈에 상응하거나 동일한 계통의 게놈에서 유래하고, 예를 들어, 표적화된 게놈은 제1 계통의 마우스 게놈이고, 표적화 암은 동일한 마우스 또는 동일한 계통의 마우스 게놈에 상응한다.
표적화 벡터의 상동성 암은 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합 이벤트를 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있으며, 예를 들어, 1kb부터 5kb까지, 5kb부터 10kb까지, 5kb부터 15kb까지, 5kb부터 20kb까지, 5kb부터 25kb까지, 5kb부터 30kb까지, 5kb부터 35kb까지, 5kb부터 40kb까지, 5kb부터 45kb까지, 5kb부터 50kb까지, 5kb부터 55kb까지, 5kb부터 60kb까지, 5kb부터 65kb까지, 5kb부터 70kb까지, 5kb부터 75kb까지, 5kb부터 80kb까지, 5kb부터 85kb까지, 5kb부터 90kb까지, 5kb부터 95kb까지, 5kb부터 100kb까지, 100kb부터 200kb까지 또는 200kb부터 300kb까지의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 1kb부터 100kb까지, 5kb부터 100kb까지, 10kb부터 100kb까지, 15kb부터 100kb까지, 20kb부터 100kb까지, 25kb부터 100kb까지, 30kb부터 100kb까지, 35kb부터 100kb까지, 40kb부터 100kb까지, 45kb부터 100kb까지, 50kb부터 100kb까지, 55kb부터 100kb까지, 60kb부터 100kb까지, 65kb부터 100kb까지, 70kb부터 100kb까지, 75kb부터 100kb까지, 80kb부터 100kb까지, 85kb부터 100kb까지, 90kb부터 100kb까지, 또는 95kb부터 100kb까지의 길이인, 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합 이벤트를 촉진하기에 충분한 길이를 갖는다. 본원에 기재된 바와 같이, 대형 표적화 벡터는 더 큰 길이의 표적화 암을 이용할 수 있다.
뉴클레아제 제제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)는 표적 유전자좌의 변형(예를 들어, 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 변형, 또는 이전에 변형되거나 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 변형)을 용이하게 하기 위해 표적화 벡터와 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터와 표적 유전자좌 사이에 상동성 재조합을 촉진할 수 있다. 뉴클레아제 제제가 표적화 벡터와 조합으로 사용되는 경우, 뉴클레아제 절단 부위에서 닉 또는 이중 가닥 단절 시, 표적 서열과 상동성 암 사이에 상동성 재조합 이벤트의 발생을 촉진하기 위해, 표적화 벡터는 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하게 위치한 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암을 포함할 수 있다. 용어 "뉴클레아제 절단 부위"는 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas9 절단 부위)에 의해 닉 또는 이중 가닥 단절이 생성된 DNA 서열을 포함한다. 표적화 벡터의 5' 및 3' 상동성 암에 상응하는 표적화된 유전자좌 내의 표적 서열은 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 단절 시, 5' 및 3' 표적 서열과 상동성 암 간에 상동성 재조합 이벤트의 발생을 촉진할 정도의 거리라면, 뉴클레아제 절단 부위에 대해 "충분히 근접하게 위치"한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적화 벡터의 5' 및/또는 3' 상동성 암에 상응하는 표적 서열이 주어진 인식 부위의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 주어진 인식 부위의 적어도 10개 뉴클레오타이드 내지 약 14kb 내에 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 절단 부위는 표적 서열의 적어도 한쪽 또는 양쪽에 직접 인접한다.
표적화 벡터의 상동성 암에 상응하는 표적 서열과 뉴클레아제 절단 부위의 공간적 관계는 변동될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 뉴클레아제 부위에 대해 5'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 인식 부위에 대해 3'에 위치할 수 있거나, 또는 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있을 수 있다.
표적화 벡터(예를 들어, 대형 표적화 벡터 포함)와 뉴클레아제 제제의 조합 사용은 표적화 벡터 단독 사용 시와 비교했을 때 증가된 표적화 효율을 초래할 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터가 뉴클레아제 제제와 함께 사용되는 경우, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터의 단독 사용과 비교했을 때 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배 또는 이들 정수로부터 형성되는 범위 내, 예컨대 2배 내지 10배로 증가할 수 있다.
일부 표적화 벡터는 "대형 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"이며, 이는 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열에 상응하고 이로부터 유래되는 상동성 암을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. LTVEC는, 예를 들어, 적어도 10kb의 길이일 수 있거나 또는 5' 상동성 암과 3' 상동성 암의 총 합이, 예를 들어, 적어도 10kb일 수 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 작제물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC는 크기 제한으로 인해 전통적인 플라스미드 기반의 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 대형 유전자좌의 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉 또는 이중 가닥 단절의 부재 하에 상당히 낮은 효율로만 또는 부정확하게만 표적화될 수 있거나, 또는 종래 방법을 사용하여 표적화할 수 없는 세포의 유전자좌(즉, 여기에 5' 및 3' 상동성 암이 상응할 수 있음)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 3자간 또는 4자간 재조합 이벤트에서 표적 게놈 유전자좌와 그리고 서로 재조합할 수 있는 2개 또는 3개의 LTVEC를 이용할 수 있다. 이러한 방법은 단일 LTVEC를 사용하여 달성할 수 없는 대형 유전자좌의 변형을 가능하게 한다.
LTVEC의 예로는 박테리아 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체, 또는 효모 인공 염색체(YAC)로부터 유래된 벡터를 포함한다. LTVEC는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있다. LTVEC의 예 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,586,251호, 제6,596,541호 및 제7,105,348호; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2002/036789에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제공된 비-인간 동물의 제조 방법
생식계열 게놈이 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열 대신에, 인간 Vλ 및 Jλ 분절의 특이적 다형성 형태(예를 들어, 특이적 V 및/또는 J 대립유전자 또는 변이체)를 포함하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 암호화 서열을 비롯한, 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절)을 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 조성물 및 방법이 제공되며, 그 예로는 야생형 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 정상적으로 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자 대신에 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자가 위치하는, 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 조립된, 인간 가변 영역 및 비-인간 또는 인간 불변 영역을 함유하는 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 인핸서(들) 및/또는 내인성 면역글로불린 κ 조절 서열(들)의 제어 하에 그러한 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 이종성 면역글로불린 κ 인핸서(들) 및/또는 이종성 면역글로불린 κ 조절 서열(들)의 제어 하에 그러한 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
본원에 기재된 방법은 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 뮤린), 또는 인간 Cλ 영역 유전자의 상류에 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 삽입하여 야생형 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 정상적으로 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자 대신에 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자가 위치하여 항체가 발현되도록 하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 Cλ 도메인(예를 들어, 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 뮤린) Cλ 도메인)을 함유하는 경쇄의 존재, 또는 인간 λ 경쇄 가변 및 인간 Cλ 도메인을 함유하는 경쇄의 존재 하에 특성화되고, B 세포의 표면 및 비-인간 동물의 혈액 혈청 둘 모두에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 방법은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(예를 들어, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 야생형, 변형된 또는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌) 내에 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 유전자 물질의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 또는 조작된 계통의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내에 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 유전자 물질의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단일 ES 세포 클론에 다중 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 연속적인 ES 세포 클론에 제조된 연속 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 조작된 ES 세포 클론에 제조된 단일 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 DNA 삽입(들)이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)에 작동가능하게 연결되도록 상기 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)의 상류에 상기 DNA 삽입(들)을 포함하며, 여기서 DNA 삽입(들)은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 인간 Vλ 유전자 분절, 및 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ 유전자 자리에 위치한다. 일부 실시양태에서, 방법은 DNA 삽입(들)이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)에 작동가능하게 연결되도록 상기 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)의 상류에 DNA 삽입(들)을 포함하며, 여기서 DNA 삽입(들)은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절, 및 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ 유전자 자리에 위치한다.
적절한 경우, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(즉, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 함유하는 서열)은 비-인간 동물에서의 발현에 대해 최적화된 코돈을 포함하도록 별도로 변형될 수 있다(예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,670,356호 및 제5,874,304호 참조). 코돈 최적화된 서열은 조작된 서열이고, 바람직하게는 비-코돈 최적화된 모 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 동일한 폴리펩타이드(또는 전체 길이의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전체 길이의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 특정 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포, 예를 들어, 랫트 또는 마우스 세포)에 대한 코돈 요법을 최적화하기 위해 변경된 서열을 별도로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 게놈에 삽입하기 위한 각 뉴클레오타이드 서열의 코돈은 비-인간 동물의 세포에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 서열은 코돈-최적화된 서열로 기술될 수 있다.
인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 생식계열 게놈의 최소 변형을 사용하고 인간 면역글로불린이 λ 경쇄 가변 도메인이 내인성 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 인간 Vλ 도메인을 갖는 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 초래한다. 녹아웃(knockout) 및 녹인(knockin)을 비롯하여, 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 생성하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000 참조; 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, 유전자 조작된 설치류의 생성은 선택적으로 하나 이상의 내인성 설치류 유전자(또는 유전자 분절)의 유전자적 유전자좌의 파괴 및 설치류 게놈 내로, 일부 실시양태에서는 내인성 설치류 유전자(또는 유전자 분절)와 동일한 위치에 하나 이상의 이종 유전자(또는 유전자 분절 또는 뉴클레오타이드 서열)의 도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 설치류의 생식계열 게놈에 무작위 삽입된 조작된 경쇄 전이유전자의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 상류에 도입된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 상류에 도입되며; 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 마우스 Cλ1 유전자에 작동가능하게 연결되거나 인간 Cλ2 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 유전자 분절(예를 들어, 인간 V 및 J)을 함유하도록 변경, 변형 또는 조작된다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 예시적 방법의 개략도(비축척성)는 도 1 내지 6에 제공된다. 구체적으로, 도 1 내지 6에는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 상응하는 표적화 벡터의 삽입을 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 예시적인 전략이 제시된다. 표적화 벡터는 선형화되고 설치류 배아 줄기(ES) 세포 내로 전기천공되어 생식계열 게놈에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 설치류를 생성할 수 있다. 이하 실시예 섹션에 기재된 바와 같이, 표적화 벡터의 전기천공에 사용된 설치류 ES 세포는 본원에 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제10,143,186호에 이미 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 함유했다. 양성 설치류 ES 세포 클론은 본 기술분야에 공지된 선별 방법을 사용하여 확인한다. 남아 있는 임의의 선택 카세트는 재조합효소-매개 결실을 통해, 필요한 경우 결실될 수 있다.
대안적으로, 인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자 대신에 표적화 벡터에 사용될 수 있다. 표적화 벡터는 인간 Cλ 유전자(예를 들어, Cλ2)를 암호화하는 서열이 표적화 벡터 내로 조작될 수 있다는 점을 제외하고는 상기(또는 이하 실시예에서)와 유사한 방식으로 작제될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하면 경쇄의 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DNA가 함께 단리될 수 있어 완전한 인간 항체의 제조를 위해 인간 경쇄 불변 영역에 연결되는 임의의 후속 클로닝 단계를 제거할 수 있음으로써 인간 항체 치료제의 개발을 허용한다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 표적화 벡터는 비-인간 세포(예를 들어, 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아 줄기 세포)의 생식계열 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 게놈 DNA(예를 들어, 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 함유함)를 추가로 함유하는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포의 생식계열 게놈 중 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 혼입된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호, 및 제8,791,323호 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 게놈 DNA(예를 들어, 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 함유함)를 추가로 함유하는 비-인간 세포의 생식계열 게놈 중 변형된 또는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 혼입된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호, 제8,791,323호, 제9,006,511호 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
표적화 벡터는 전기천공법에 의해 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트) 배아 줄기 세포 내로 도입시켜, 이 표적화 벡터에 함유된 서열이 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 또는 인간 경쇄 불변(Cλ 또는 Cκ) 도메인을 포함하는 경쇄를 갖고, 이 경쇄가 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 항체를 발현하는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 역량을 초래한다. 본원에 기재된 바와 같이, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌가 비-인간 동물의 생식계열 게놈에서 생성된, 유전자 조작된 비-인간 동물이 생성된다(예를 들어, 내인성 설치류 Cκ 유전자의 자리에 설치류 또는 인간 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(즉, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역)을 함유하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌). 항체는 비-인간 동물 B 세포의 표면 및 상기 비-인간 동물의 혈청에서 발현되며, 이 항체는 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 또는 인간 Cλ 도메인을 갖는 경쇄를 특징으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 생식계열 게놈 에서 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌가 표적화 벡터에 의해 표적화되지 않는 경우, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 전이유전자는 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌와 다른 위치에 바람직하게 삽입된다(예를 들어, 무작위 삽입된 전이유전자).
전술한 바와 같은 비-인간 동물에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 생성은 인간 Vλ 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 Cλ 도메인을 갖는 상기 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현된 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 조작된 비-인간 동물 계통을 제공한다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 존재로 영향을 미치면, 인간 항체-기반의 치료제를 개발하기 위한 항체 및 항체 구성요소를 생산하는 조작된 비-인간 동물 계통이 생성된다. 따라서, 인간 질환을 치료하는 새로운 항체-기반의 의약을 개발하기 위해, 인간 Vλ 도메인을 이용하기 위한 대안적인 생체내 시스템을 제공하는 역량을 갖는 단일 조작된 비-인간 동물 계통이 실현된다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하는 방법은 비-인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 상기 기재된 바와 같이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) ES 세포를 사용하여 비-인간 동물을 생성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하는 방법은 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및 (b) 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; (b) 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)에서 생성된 비-인간 ES 세포를 사용하여 비-인간 동물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (d) 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 비-인간 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 것을 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하여, 유전자 변형된 비-인간 동물의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 것을 포함하여, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 의해 발현된 모든 중쇄가 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하도록 한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 단편은 생식계열 게놈이 하나 이상의 조작된 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 κ 경쇄, 면역글로불린 λ 경쇄, 및 이의 조합)를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포 내로 도입된다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 유전자좌는 내인성 조작된 면역글로불린 유전자좌이다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 단편은 면역글로불린 λ 경쇄 서열 및/또는 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 조작된 서열을 포함한다. 비-인간 동물을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 분절은 면역글로불린 λ 경쇄 서열 및/또는 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 조작된 서열을 비-면역글로불린 서열(예를 들어, 재조합 신호 서열, 내성 유전자, 및 이의 조합)과 함께 포함한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 게놈이 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는, 비-인간 배아 줄기 세포 내로 DNA 단편이 도입되며, 여기서 이 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, ES 세포는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 생식계열 게놈이 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포 내로 DNA 단편이 도입되며, 여기서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 있다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은 게놈이 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은, 생식계열 게놈이 하나 이상의 인간 Vλ 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다. 비-인간 동물을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은 생식계열 게놈이 하나 이상의 인간 Vλ 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 및 상기 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 상기 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절 사이에 위치하거나, 자리하거나 또는 배치된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 JH 유전자 분절의 삽입은 인간 VH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 인간 DH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 및 인간 JH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 내인성 인간 면역글로불린 유전자좌에 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법으로부터 제조, 생성, 생산, 수득되거나, 또는 수득가능한 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 게놈은 각각 전체가 본원에 참고로 포함되는 Macdonald (2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는, 예를 들어 VELOCIMMUNE® 계통과 같은 상이한 변형된 계통의 배아 줄기 세포 내로 조작될 수 있다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호 및/또는 제8,642,835호; 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 동형접합성은 육종에 의해 후속적으로 달성될 수 있다. 대안적으로, 무작위 삽입으로 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 전이유전자(상기 기재됨)의 경우에, 비-인간 동물 계통은 무엇보다도 전이유전자로부터 인간 Vλ 도메인의 발현에 기초하여 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 18개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 1(VI-1) 마우스일 수 있다. VI-1 마우스는 또한 16개의 인간 Vκ 유전자 분절과 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 39개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 2(VI-2) 마우스일 수 있다. VI-2 마우스는 또한 30개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 80개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 3(VI-3) 마우스일 수 있다. VI-3 마우스는 또한 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다.
대안적으로 및/또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 생식계열 게놈은 결실, 불활성화, 기능적으로 침묵화되거나, 또는 달리 비-기능적인 내인성 면역 글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 유전자 또는 유전자적 유전자좌를 결실시키거나 비-기능적이게 하는 유전자 변형은 본원에 기재된 방법 및/또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 달성할 수 있다.
유전자 조작된 주조자(founder) 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 존재 및/또는 비-인간 동물의 조직 또는 세포에 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 도메인을 갖는 항체의 발현에 기초하여 식별될 수 있다. 유전자 조작된 주조자 비-인간 동물은 그 다음 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 운반하는 또 다른 비-인간 동물을 육종시키는데 사용될 수 있고, 이로 인해 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 하나 이상이 카피를 각각 운반하는 비-인간 동물의 코호트를 생성할 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 운반하는 유전자 조작된 비-인간 동물은, 필요한 경우, 다른 전이유전자(예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자) 또는 조작된 면역글로불린 유전자좌를 운반하는 다른 유전자 조작된 비-인간 동물로 추가로 육종될 수 있다.
유전자 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 또한 전이유전자 또는 통합된 서열(들)의 조절된, 지시된, 유도성 및/또는 세포 유형 특이적 발현을 허용하는 선택된 시스템을 함유하도록 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 비-인간 동물은 조건부로 발현되는 항체의 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 하나 이상의 서열을 함유하도록 조작될 수 있다(예를 들어, Rajewski, K. 등, 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3에서 검토됨, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 예시적인 시스템은 박테리오파지 P1의 Cre/loxP 재조합효소 시스템(예를 들어, Lakso, M. 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:6232-6 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨) 및 S. 세레비지애의 FLP/Frt 재조합효소 시스템(O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-5, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 동물은 "이중" 유전자 조작된 동물의 작제를 통해, 예를 들어, 2개의 유전자 조작된 동물인, 선택된 변형(예를 들어, 본원에 기재된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌)을 포함하는 전이유전자를 함유한 동물 및 재조합효소(예를 들어, Cre 재조합효소)를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 다른 동물을 교배하여 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 상기에 기재된 바와 같이, 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 종종 비-인간 동물의 의도된 용도에 따라 또 다른 인간, 인간화 또는 달리 조작된 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 인간 유전자, 인간화 유전자 또는 달리 조작된 유전자의 유전자 물질은 상기 기재된 바와 같은 유전자 변형 또는 변경을 갖는 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포)의 게놈의 추가 변경을 통해, 또는 필요한 경우 다른 유전자 변형된 또는 조작된 계통과 본 기술분야에 공지된 육종 기술을 통해 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 중쇄 유전자 분절을 추가로 포함하도록 제조된다(예를 들어, Murphy, A.J. 등,(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158; Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호; 미국 특허 제8,791,323호; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0096287 A1 참고; 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 본원에 기재된 표적화 벡터를 변형 또는 조작된 계통의 세포 내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 벡터는 VELOCIMMUNE® 마우스 내로 도입될 수 있다. VELOCIMMUNE® 마우스는 완전한 인간 가변 도메인과 마우스 불변 도메인을 가진 항체를 발현한다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 본원에 전체가 참고로 포함되는, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 조작된 마우스 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자(가변 및/또는 불변 영역 유전자)를 추가로 포함하도록 제조된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리 및 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전자 물질을 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 여기서 유전자 물질은 전적으로 또는 부분적으로, 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역을 암호화한다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 각각 전체가 본원에 참고로 포함되는, Murphy, A.J. 등, (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald(2014); 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물에 교배된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및/또는 제8,791,323호 참조; 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및/또는 제8,791,323호 참조; 본원에 참고로 포함됨) 및 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조; 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 비-인간 동물에 교배된다.
마우스에서 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 작제를 기술하는 실시양태(즉, 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 마우스 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 도메인을 함유하는 항체가 발현되도록 마우스 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 유전자와 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 존재를 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 마우스)가 본원에 광범위하게 논의되지만, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 다른 비-인간 동물이 또한 제공된다. 이러한 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 발현하도록 유전자 변형될 수 있는 임의의 동물을 포함하며, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소과(예를 들어, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 리서스 원숭이) 등을 포함한다. 예를 들어, 적합한 유전자 변형가능한 ES 세포가 쉽게 입수가능하지 않은 비-인간 동물의 경우에는 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법이 이용된다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능 세포)을 변형시키는 단계 및 체세포 핵 전달(somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 이용하여 적합한 세포, 예를 들어, 탈핵 난모세포로 유전자 변형된 게놈을 전달하는 단계, 및 적합한 조건 하에 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 비-인간 동물에 임신시켜 배아를 형성시키는 단계를 포함한다.
비-인간 동물의 생식계열 게놈(예를 들어, 돼지, 소, 설치류, 닭 등의 게놈)을 변형시키는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하기 위해, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 Cas 단백질(즉, CRISPR/Cas 시스템)을 이용하는 것을 포함한다. 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 방법의 지침은, 예를 들어, 미국 특허 제9,738,897호 및 미국 특허 공개 번호 US 2016/0145646(2016년 5월 26일 공개) 및 US 2016/0177339(2016년 6월 23일 공개)에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 예를 들어 디포도이데아(Dipodoidea) 또는 무로이데아(Muroidea) 상과의 작은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 마우스, 랫트 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 무로이데아 상과로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 동물은 칼로미시대(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스-유사 햄스터), 크리스티대(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, New World 랫트 및 마우스, 들쥐류), 무리대(Muridae)(진정한 마우스 및 랫트, 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 갈기쥐), 네소마이대(Nesomyidae)(나무타기쥐, 바위 쥐, 흰꼬리 쥐, Malagasy 랫트 및 마우스), 플라타칸토마이대(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시 동면쥐), 및 스팔라시대(Spalacidae)(예를 들어, 두더지쥐, 대나무 쥐 및 조코아)로부터 선택되는 과에서 유래된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 진정한 마우스 또는 랫트(무리대 과), 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 및 갈기쥐로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스는 무리대 과의 구성원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 마우스 및 랫트로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다(예를 들어, Festing 등, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. 등, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032 참조; 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통 및 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합물, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 혼합물의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 BALB 계통 및 앞서 언급한 또 다른 계통의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 랫트이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 랫트는 Wistar 랫트, LEA 계통, Sprague Dawley 계통, Fischer 계통, F344, F6, 및 Dark Agouti로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 랫트 계통은 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 및 Dark Agouti로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 계통의 혼합물이다.
랫트 만능 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어 ACI 랫트 계통(August 및 Copenhagen 계통에서 원래 유래하는 근친교배 계통), Dark Agouti(DA) 랫트 계통, Wistar 랫트 계통, LEA 랫트 계통, Sprague Dawley(SD) 랫트 계통, 또는 Fisher F344 또는 Fisher F6과 같은 Fischer 랫트 계통을 포함한, 임의의 랫트 계통에서 유래될 수 있다. 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 또한 위에 언급된 2 이상의 계통의 혼합체로부터 유래된 계통에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 DA 계통 또는 ACI 계통에서 유래될 수 있다. ACI 랫트 계통은 흰 배와 발 및 RTlav1 일배체형을 갖는 검은 아구티(black agouti)인 것을 특징으로 한다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급원에서 입수가능하다. ACI 랫트 유래의 랫트 ES 세포주의 일 예는 ACI.Gl 랫트 ES 세포이다. DA 랫트 계통은 아구티 털 및 RT1av1 일배체형을 갖는 것이 특징이다. 이러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 비롯한 다양한 공급원에서 입수할 수 있다. DA 랫트로부터의 랫트 ES 세포주의 예는 DA.2B 랫트 ES 세포주 및 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 일부 실시양태에서, 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 근친교배된 랫트 계통으로부터 유래된다(예를 들어, 2014년 8월 21일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2014-0235933 A1 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 방법 및/또는 작제물을 사용하여 랫트 게놈(예를 들어, 랫트 ES 세포 중)을 변형시키기 위한 안내서는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2014-0310828 및 2017-0204430에서 찾아볼 수 있으며; 둘 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제공된 비-인간 동물, 세포 또는 조직을 사용하는 방법
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 항체 개발을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 제한적 인간 λ 경쇄 레퍼토리로부터 발현된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루는 인간 중쇄 가변 도메인, 및 이러한 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체의 생성 및 식별에 특히 유리한 플랫폼을 나타낸다. 이러한 인간 중쇄 가변 도메인은, 예를 들어, 이중특이적 항원-결합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 항체를 제조하는 방법에 사용될 수 있음을 제공한다. 본 개시내용에 따라 제조된 항체는, 예를 들어, 인간 항체, 키메라 항체, 역 키메라 항체, 임의의 이들 항체의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 세포의 유전자 물질에 의해 암호화된 핵산 서열로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 인간 항체(예를 들어, 완전 인간 항체)를 제조하는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 유전자 변형된 설치류, 예를 들어, 유전자 변형된 랫트 또는 마우스)은 비-인간 동물이 상기 관심 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기에 충분한 조건 및 시간 동안 관심 항원에 의해 면역화된다. 항체 및/또는 항체 서열(즉, 항체의 부분을 암호화하는 서열, 예를 들어 가변 영역 서열)은 면역화된 비-인간 동물(또는 하나 이상의 세포, 예를 들어, 하나 이상의 B 세포)로부터 단리되고 및/또는 식별되며, 예를 들어, 친화도, 특이성, 에피토프 매핑, 리간드-수용체 상호작용을 차단하기 위한 능력, 수용체 활성화 억제 등을 측정하는 다양한 검정을 사용하여 특성화된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생성된 항체는 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에서 단리된 하나 이상의 인간 가변 영역 뉴클레오타이드 서열로부터 유래되는 하나 이상의 인간 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에서 유발될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 경쇄 불변 도메인 및/또는 인간 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다.
다양한 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직에 의해 생산된 항체는 인간 가변 도메인 및 비-인간 불변 도메인을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류) 경쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다.
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 관심 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 방법은 상기 비-인간 동물로부터 림프구(예를 들어, 클론적으로 선택된 림프구)를 식별하는 것을 포함하며, 여기서 림프구는 관심 항원에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열은 림프구(예를 들어, B 세포)로부터 수득되고, 및/또는 식별된다(예를 들어, 유전형별화, 예를 들어, 시퀀싱됨). 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 림프구(예를 들어, B 세포)로부터 수득되고 및/또는 식별된다(예를 들어, 시퀀싱됨). 일부 실시양태에서, 비-인간 동물의 B 세포 유래의 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열이 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물의 B 세포 유래의 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열의 변이체가 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 변이체는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 변이체를 포함하는 항체의 약동학 및/또는 약력학 성질을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 변이체를 포함하는 항체의 특이성, 친화도, 및/또는 면역원성을 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 항체를 제조하는 방법은 본 명세서에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 식별하고; (i) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 접합시키거나 결찰시켜, 완전한 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 서열을 형성하고, 및/또는 (ii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 접합시키거나 결찰시켜 완전한 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 형성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 서열 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 완전 인간 면역글로불린 중쇄 및 완전 인간 면역글로불린 λ 경쇄가 발현되어 인간 항체를 형성하도록 세포(예를 들어, 숙주 세포, 포유동물 세포)에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 세포 또는 이 세포를 포함하는 배양 배지로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이중특이적 항체를 제조하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 (a) 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물을 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계, (b) 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 제1 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 단일 재배열된 인간 Igλ 경쇄 가변 영역)을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물을 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계, (c) 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물로부터 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (d) 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물로부터 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (e) 제1의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1의 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1의 인간 중쇄를 암호화하는 제1의 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 단계; (f) 제2의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2의 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2의 인간 중쇄를 암호화하는 제2의 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 단계; (g) 포유동물 세포에서 (i) 제1의 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2의 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 이중특이적 항체를 제조하는 방법에 이용될 수 있으며, 이 방법은 (a) 비-인간 세포에서 (i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함하며; 여기서 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물에서 식별된 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물에서 식별된 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하며, 여기서 제1 및 제2 유전자 변형된 비-인간 동물은 각각 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 비-인간 동물이며; 제3 뉴클레오타이드의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전이다. 식별된 아미노산 또는 핵산은 본원에서 식별된 가변 도메인을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을, 예를 들어 에피토프 또는 항원에 대한 항체의 일부로서 식별하는데 이용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 가변 도메인의 아미노산 서열을, 예를 들어 에피토프 또는 항원에 대한 항체의 일부로서 식별하는데 이용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 다양한 검정에 유용한 인간 항체를 생산하기 위한 생물학적 물질(예를 들어, 세포, 뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단백질 복합체)의 개선된 생체내 시스탬 및 공급원을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 막관통 또는 분비된 폴리펩타이드)를 표적으로 하고 및/또는 상기 관심 폴리펩타이드와 연관된 하나 이상의 활성을 조절하며, 및/또는 상기 관심 폴리펩타이드와 다른 결합 파트너(예를 들어, 리간드 또는 수용체 폴리펩타이드)와의 상호작용을 조절하는 치료제를 개발하는데 사용된다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 수용체 폴리펩타이드를 표적으로 하고, 수용체 폴리펩타이드 활성을 조절하고 및/또는 다른 결합 파트너와 수용체 폴리펩타이드의 상호작용을 조절하는 치료제를 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 결합하는 후보 치료제(예를 들어, 항체, scFv 등)를 식별하고, 선별하고 및/또는 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드의 활성을 차단하거나 또는 하나 이상의 관심 수용체 폴리펩타이드의 활성을 차단하는 후보 치료제(예를 들어, 항체, scFv 등)를 선별 및 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드의 길항제(antagonist) 및/또는 작동제(agonist)의 결합 프로파일을 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 결합하는 하나 이상의 후보 치료제 항체의 에피토프 또는 에피토프들을 결정하는데 사용된다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 하나 이상의 인간 항체 후보의 약동학적 프로파일을 결정하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직, 및 하나 이상의 대조군 또는 기준 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 각각 하나 이상의 인간 항체 후보의 다양한 용량(예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg 또는 50 mg/kg 이상)에 노출된다. 후보 치료 항체는 비경구 및 비경구외 투여 경로를 포함하는 임의의 바람직한 투여 경로를 통해 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물에 투여될 수 있다. 비경구 경로는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 문맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수내, 척추강내, 뇌실내, 두개내, 흉막내 또는 기타 주사 경로를 포함한다. 비경구외 경로는, 예를 들어 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 협측, 질, 안구를 포함한다. 투여는 또한 연속 주입, 국소 투여, 임플란트(겔, 막 등)로부터의 지속 방출, 및/또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 혈액은 다양한 시점(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 최대 30일 또는 그 이상)에 비-인간 동물(인간화 및 대조군)로부터 단리된다. 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직으로부터 수득된 샘플을 사용하여 투여된 후보 치료 항체의 약동학적 프로파일을 결정하는 데에는 총 IgG, 항치료 항체 반응, 응집 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 검정이 수행될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 관심 폴리펩타이드의 활성을 차단 또는 조절하는 치료 효과 및 세포 변화의 결과로서 유전자 발현에 대한 효과, 또는 수용체 폴리펩타이드의 정황에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 세포 표면에 있는 수용체 폴리펩타이드의 밀도를 측정하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포), 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 관심 폴리펩타이드에 결합하는 후보 치료제에 노출되고, 이후 시간 기간 후에 상기 관심 폴리펩타이드, 예를 들어, 리간드-수용체 상호작용 또는 신호 전달과 관련된 특정 세포 과정에 대한 효과에 대해 분석된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역을 발현하고, 이에 따라 결합 및 기능 검정에 사용하기 위한 인간 항체 가변 영역의 공급원으로서 제공하기 위해, 예를 들어, 특히 길항제 또는 작동제가 관심 있는 인간 항원에 특이적이거나 리간드-수용체 상호작용(결합)에 기능하는 에피토프에 특이적인 경우, 길항제 또는 작동제의 결합 또는 기능에 대해 검정하기 위해 세포, 세포주 및 세포 배양물을 생성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 후보 치료 항체 또는 단편(예를 들어, Fab 단편, VH, VL, CH1 및 CL 도메인으로 이루어진 일가 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR))에 의해 결합된 에피토프는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 단리된 세포를 사용하여 결정할 수 있다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터의 세포는 단리되어 필요에 따라 사용될 수 있거나, 또는 많은 세대 동안 배양물로 유지될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물로부터의 세포는 불멸화되고(예를 들어, 바이러스의 사용을 통해), 배양물에서 무한하게(예를 들어, 연속 배양물로) 유지된다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 비-인간 림프구이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 및 T 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 미성숙 B 세포, 성숙한 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포, 기억 B 세포 및/또는 형질 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 비-인간 배아 줄기(ES) 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 설치류 ES 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 ES 세포는 마우스 ES 세포이고 129 계통, C57BL 계통, BALB/c 또는 이들의 혼합물로부터 유래된다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 129 및 C57BL 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 129, C57BL 및 BALB/c 계통의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) ES 세포의 사용이 제공된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 마우스 ES 세포이고 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를 제조하는 데 사용된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 랫트 ES 세포이고 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 랫트를 제조하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 지방, 방광, 뇌, 유방, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 비-인간 세포 또는 조직으로부터 제조, 생성, 생산 또는 수득된 불멸화 세포가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 ES 세포로부터 제조, 생성, 생산 또는 수득된 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아가 제공된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 배아는 설치류 배아이고; 일부 실시양태에서, 마우스 배아; 일부 실시양태에서, 랫트 배아이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 관심 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체 가변 영역의 변이체(예를 들어, 인간 Vλ 도메인 변이체)를 생성하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 이러한 변이체는 관심 폴리펩타이드의 2 이상의 변이체에 의해 공유되는 공통 에피토프에 대해 원하는 기능성, 특이성, 낮은 교차 반응성을 갖는 인간 항체 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 원하는 기능성 또는 개선된 기능성에 대해 선별되는 일련의 변이체 가변 영역을 함유하는 인간 항체 가변 영역의 패널을 생성하는데 이용된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역 라이브러리(예를 들어, 인간 Vλ 도메인 라이브러리)를 생성하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 이러한 라이브러리는 원하는 이펙터 기능에 기초하여 상이한 Fc 영역 상에 접목될 수 있고, 본 기술분야에 공지된 기술(예를 들어, 부위 지시성 돌연변이유발, 오류 유발 PCR 등)을 사용하여 가변 영역 서열의 친화도 성숙을 위한 공급원을 제공하고, 및/또는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(즉, 항체 구성요소, 예를 들어 scFv를 사용하여 조작된 분자), 다중특이적 결합 제제(예를 들어, 이중특이적 결합 제제), 및 융합 단백질(예를 들어, 단일 도메인 항체, scFv 등)과 같은 항체 기반의 치료 분자를 생성하기 위한 항체 구성요소의 공급원으로서 사용될 수 있는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 공급원을 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 동물에서 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 관심 항원으로 면역화하는 단계; (b) 비-인간 동물이 관심 항원에 대해 면역 반응을 생산(예를 들어, 항체를 발현)하기에 충분한 조건 하에 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 유지하는 단계; 및 (c) 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 또는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 세포(예를 들어, B 세포)로부터, 관심 항원에 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
비-인간 동물에서 항체를 생산하는 방법의 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 B 세포이다. 비-인간 동물에서 항체를 생산하는 방법의 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 하이브리도마이다.
일부 실시양태에서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 제공하는 단계; (b) 비-인간 동물을 관심 항원으로 면역화하는 단계; (c) 비-인간 동물이 관심 항원에 대한 면역 반응을 생산하기에 충분한 조건 하에 비-인간 동물을 유지시키는 단계; 및 (d) 관심 항원에 결합하는, 비-인간 동물, 또는 비-인간 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 (d)의 항체가 인간 VH 및 Vλ 도메인을 포함하는, 방법에 의해 제조된 항체가 제공된다.
방법에 의해 제조된 항체의 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 도메인은 인간 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 VH6-1 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체를 포함하는 재배열된 인간 중쇄 가변 영역에 의해 암호화된다.
방법에 의해 제조된 항체의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 비-인간 동물로부터 수득되는 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 인간 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 Vλ3-1, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체를 포함하는 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 치료용 또는 진단용 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위해 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 질병, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 호전을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 제공된다.
일부 실시양태에서, 약제로서의 사용과 같은 의약에 사용하기 위한 약물 또는 백신의 제조 및/또는 개발에 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 사용이 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체 및/또는 이의 단편의 제조 및/또는 개발에 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포, 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 사용이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 약물 또는 백신의 분석 및 테스트를 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 후보 약물 또는 백신은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-인간 동물에 전달될 수 있고, 이어서 비-인간 동물을 모니터링하여 약물 또는 백신에 대한 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질병 또는 상태 및/또는 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상에 대한 효과를 결정할 수 있다. 안전성 프로파일을 결정하는 데 사용되는 예시적인 방법으로는 독성 측정, 최적 용량 농도, 항체(즉, 항-약물) 반응, 약물 또는 백신의 효능 및 가능한 위험 인자의 측정을 포함한다. 이러한 약물 또는 백신은 이러한 비-인간 동물에서 개선 및/또는 개발될 수 있다.
백신 효능은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 간단히 말해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 백신접종된 다음, 백신으로 공격되고, 또는 이미 감염된 비-인간 동물에게 백신이 투여된다. 백신에 대한 비-인간 동물(들)의 반응은 비-인간 동물(들)(또는 이로부터 단리된 세포)을 모니터링하고 및/또는 하나 이상의 검정을 수행하여 측정함으로써 백신의 효능을 결정할 수 있다. 백신에 대한 비-인간 동물(들)의 반응은 그 다음 본 기술분야에 공지되고/있거나 본원에 기재된 하나 이상의 척도를 사용하여 대조군 동물과 비교한다.
백신 효능은 바이러스 중화 검정에 의해 추가로 결정될 수 있다. 간단히 말해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 면역화되고, 면역화 후 다양한 날에 혈청이 수집된다. 혈청의 연속 희석액이 바이러스와 함께 사전-항온처리되며, 이 시간 동안 바이러스에 특이적인 혈청 중 항체가 바이러스에 결합할 것이다. 그 다음, 바이러스/혈청 혼합물을 허용 세포에 첨가하여 플라크 검정 또는 미세중화 검정에 의해 감염도를 결정한다. 혈청 내 항체가 바이러스를 중화한다면, 대조군에 비해 플라크가 더 적거나, 상대적 루시페라제 단위가 더 낮다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역을 생산하고, 따라서 진단 적용예(예를 들어, 면역학, 혈청학, 미생물학, 세포 병리학 등)에 사용하기 위한 인간 항체를 생성하기 위해 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은, 예를 들어, 병리학적 변화를 나타내는 특정 세포 표면 마커의 발현과 같이, 세포 변화의 식별에 적절한 관련 항원 부위에 결합하는 인간 항체 가변 영역을 생산하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 다양한 화학적 실체(예를 들어, 방사성 추적자)에 접합될 수 있고, 원한다면 다양한 생체내 및/또는 시험관내 검정에 이용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 종양학 및/또는 감염성 질환에 사용하기 위한 인간 항체의 개발 및 선택을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 및 대조군 비-인간 동물(예를 들어, 본원에 기재된 것과 상이한 유전적 변형을 갖거나 유전적 변형이 없는 것, 즉, 야생형)에 종양(또는 종양 세포)이 이식되거나, 또는 바이러스(예를 들어, 인플루엔자, HIV, HCV, HPV 등)로 감염될 수 있다. 감염 이식 후, 비-인간 동물에게 후보 치료제가 투여될 수 있다. 종양 또는 바이러스는 후보 치료제의 투여 전에 비-인간 동물 내의 하나 이상의 위치에서 확립되기에 충분한 시간이 허용될 수 있다. 대안적으로, 및/또는 추가적으로, 치료제로서 개발될 수 있는 잠재적인 인간 항체를 특성화하고 선택하기 위해 이러한 비-인간 동물에서 면역 반응이 모니터링될 수 있다.
하나보다 많은 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질
본원에 기재된 조성물 및 방법은 하나보다 많은 에피토프에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 장점은 각각 단일 경쇄와 연관이 있을 적절하게 높은 결합성(예를 들어, 친화도 성숙) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다.
이중특이적 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로는 2개의 상이한 중쇄와 연관되고 발현할 수 있는 적절한 경쇄를 식별하는 것과 연관된 문제, 및 부분적으로는 단리 문제로 인해 어려움이 있었다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 체세포적으로 과돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 중쇄를 비롯한 하나보다 많은 중쇄와 연관되어 발현할 수 있는 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 적합한 경쇄를 다른 자연적 과정을 통해 선택할 수 있게 한다. 역 키메라 중쇄(즉, 인간 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 도메인)를 갖는 친화도 성숙된 항체를 발현하는 본원에 기재된 면역화된 마우스의 적합한 B 세포로부터의 인간 Vλ 및 VH 서열은 식별되어, 적합한 인간 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 IgG1)을 갖는 발현 벡터에 프레임에 맞게 클로닝될 수 있다. 이러한 2개의 작제물이 제조될 수 있고, 각 작제물은 상이한 에피토프에 결합하는 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화한다. 생식계열 서열 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 갖는 유전자 분절(예를 들어, B 세포로부터 식별된 것)을 포함하는, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 인간 Vλ2-14/Jλ2)은 적합한 인간 불변 영역 유전자(예를 들어, 인간 λ 불변 유전자)에 프레임에 맞게 융합될 수 있다. 이러한 3개의 완전-인간 중쇄 및 경쇄 작제물은 발현을 위해 적절한 세포에 자리할 수 있다. 이 세포는 2가지 주요 종, 즉 동일한 경쇄를 갖는 동종이량체 중쇄, 및 동일한 경쇄를 갖는 이종이량체 중쇄를 발현한다. 이러한 주요 종이 용이하게 분리되도록 하기 위해, 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정인자가 누락되어, 이종이량체 결합 단백질과 상이한 친화도의 동종이량체 결합 단백질을 초래하도록 변형된다. 이러한 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 각각 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 인간 Vλ 및 VH 서열이 관심 에피토프 또는 관심 항원을 포함하는 항원에 의해 면역화된, 본원에 기재된 마우스로부터 유래되는 것이 제공된다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 제1 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인, 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하며, 여기서 제2 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 도메인(인간 λ 경쇄 가변 도메인과 함께), 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제2 에피토프(제1 에피토프와 동일하거나 상이한 항원 상에 있을 수 있음)에 선택적으로 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 도메인(동일한 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 함께), 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하며, 여기서 제2 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 따르면 H435R)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 Y96F 변형(IMGT; EU에 따르면 Y436F)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R) 및 Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG1 도메인이고, D16E 변형, L18M 변형, N44S 변형, K52N 변형, V57M 변형, V82I 변형, 또는 이의 조합(IMGT; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, V422I, 또는 이의 조합)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG2 도메인이고, N44S 변형, K52N 변형, V82I 변형, 또는 이들의 조합(IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N, V422I 또는 이들의 조합)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의한 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG4 도메인이고, Q15R 변형, N44S 변형, K52N 변형, V57M 변형, R69K 변형, E79Q 변형, 및 V82I 변형(IMGT; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, V422I 또는 이들의 조합)을 추가로 포함한다.
하나보다 많은 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 제조하는 1가지 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 갖는 제1 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제1의 관심 에피토프를 포함하는 제1 항원으로 면역화하는 것이며, 여기서 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 면역화된 경우, 이러한 비-인간 동물은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)로부터 발현된 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체를 만들 것이다. 관심 에피토프에 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 B 세포가 식별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 회수되어(예를 들어, PCR에 의해), 적합한 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 프레임에 맞게 발현 작제물 내에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 과정은 반복되어 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 식별할 수 있으며, 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 회수되어, 발현 벡터 내에 제2의 적합한 면역글로불린 불변 영역에 프레임에 맞게 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 회수되어(예를 들어, PCR에 의해), 적합한 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 발현 작제물 내에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 인간 중쇄 불변 도메인은 동일하거나 상이한 아이소타입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 인간 중쇄 불변 도메인 중 하나(다른 것은 아님)는 본원에 기재된 바와 같이, 또는 본원에 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에서와 같이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단백질은 적합한 세포에서 발현될 수 있고, 예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같이, 동종이량체 항원-결합 단백질에 비해 단백질 A에 대한 상이한 친화도를 기초로 하여 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원은 동일할 수 있고 제1 및 제2 에피토프는 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원은 상이하다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질은 동일한 항원에 결합하는 단일특이적 항원 결합 단백질보다 더 높은 친화도로 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원-결합 단백질은 상이한 친화도로 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 도메인, 및 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 제1 친화도 성숙된(예를 들어, 하나 이상의 체세포 과돌연변이를 포함함) 인간 중쇄 가변 도메인을 식별하는 것을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법은 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 제1 가변 도메인을 생성하는데 사용된 비-인간 동물에서와 동일한 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역), 및 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 제2 친화도 성숙된(예를 들어, 하나 이상의 체세포 과돌연변이를 포함함) 중쇄 가변 도메인을 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 본원에 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같은 단백질 A-결정인자 변형이 결여된 인간 중쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 클로닝되어, 완전 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제2 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같은 단백질 A-결정인자를 포함하는 인간 중쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 클로닝되어 제2 완전 인간 중쇄를 형성한다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 및 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 제1 발현 벡터 상에 포함된다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 제2 발현 벡터 상에 포함된다. 일부 경우에, 제1 및 제2 발현 벡터는 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 이중특이적 항체가 형성되도록 숙주 세포에서 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 및 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드를 발현시키는 것을 포함하고, 여기서 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물에 의해 생산된 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 인간 V/J 재배열로부터 유래된 서열(예를 들어, 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 이중특이적 항체를, 예를 들어 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 수득하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 에세리키아 콜라이, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, 사카라마이세스 세레비지에, 쉬조사카로마이세스 폼베, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마일 수 잇다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵세포이고, 다음 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 전술한 세포에서 유래된 세포주. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다.
약제학적 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 비-인간 동물에 의해 생산되거나, 또는 본원에 개시된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)에 의해 생산된 항체, 핵산, 또는 이의 치료적으로 적절한 부분에서 유래된, 항원 결합 단백질, 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 이의 치료적으로 적절한 부분은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 비-인간 동물에 의해 생산된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 완충액, 희석액, 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 원하는 경우 하나 이상의 또 다른 치료 활성 물질을 추가로 함유할 수 있다.
본원에 제공된 약제학적 조성물에 대한 설명은 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 모든 부류의 동물에 투여하기에 일반적으로 적합하다는 것을 본 기술분야의 기술자라면 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물에게 투여하기에 적합하도록 하기 위한, 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되어 있고, 통상적으로 숙련된 수의학 약리학자는 만일 존재한다면 일상적인 실험을 이용하여 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
예를 들어, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 멸균 주사가능 형태(예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 주사 전에 수성 희석제 (예를 들어, 물, 완충액, 염 용액 등)에 의해 재구성될 수 있는 분말(예를 들어, 동결건조 및/또는 멸균된 것)로서, 선택적으로 진공 하에 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 인산염 완충 식염수 등에 희석 및/또는 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분말은 수성 희석제와 부드럽게 혼합되어야 한다(예를 들어, 진탕되지 않음).
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 기술에 공지되거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비 방법은 활성 성분을 희석제 또는 다른 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연관시키는 단계, 및 그 다음, 필요한 경우 및/또는 바람직한 경우, 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 생성물을 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)에 의해 생산된 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 보관 또는 투여를 위한 용기, 예를 들어, 바이알, 주사기(예를 들어, IV 주사기), 또는 백(예를 들어, IV 백)에 포함될 수 있다. 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 벌크(bulk), 단일 단위 용량, 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 소정량 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물에서 활성 성분, 약제학적 허용성 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적 양은 치료 대상체의 신원, 체격 및/또는 상태에 따라, 또한 조성물이 투여되어야 하는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w) 사이의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 약제학적 허용성 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 본원에 사용된 바와 같이 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 원하는 특정 투여 형태에 적합한 경우, 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)는 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 부형제 매질이 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 달리 상호작용하거나 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생산하는 것과 같이 물질 또는 이의 유도체와 상용할 수 없는 경우가 아닌 한, 그의 사용은 본 개시내용의 범위 내인 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 약제학적 허용성 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간용 및 수의용으로 승인된 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국식품의약국의 승인을 받은 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 약제 등급이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 기준을 맞춘 것이다.
약제학적 조성물의 제조에 사용되는 약제학적 허용성 부형제는 비활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충화제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 약제학적 제형에 선택적으로 포함될 수 있다. 코코아 버터 및 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및/또는 방향제와 같은 부형제는 조제자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제(예를 들어, 보존제, 비활성 희석제, 분산제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 냉장 및/또는 냉동될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 냉장 및/또는 냉동될 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 특정 기간(예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월 또는 그 이상) 동안 보관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 명시된 시간보다 더 긴 시간 동안 항체 조성물의 보관은 항체 분해를 초래한다.
액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색되거나 혼탁해지면 및/또는 여과 후 미립자 물질이 남아 있다면, 용액은 사용하지 않아야 한다.
약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려 사항은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005에서 찾아볼 수 있다.
키트
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 비-인간 세포, 단백질(단일 또는 복합체(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)), DNA 단편, 표적화 벡터, 또는 이의 임의의 조합으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 팩 또는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 임의의 적용가능한 방법(예를 들어, 연구 방법)에 사용될 수 있다. 선택적으로 이러한 용기와 연관되어, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 안내문이 있을 수 있으며, 이 안내문은 (a) 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인, (b) 사용 지침, 및/또는 (c) 2 이상의 실체 간에 물질 및/또는 생물학적 산물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 또는 비-인간 세포)의 이전을 관리하는 계약서 및 이들의 조합을 반영한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아 유래의 아미노산(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아 유래의 핵산(예를 들어, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산)을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아로부터 식별된 서열(아미노산 및/또는 핵산 서열)을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 치료용 또는 진단용 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 질병, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 호전을 위한 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트가 제공된다.
특정 실시양태의 다른 특징은 예시적인 실시양태에 대한 하기 설명 과정에서 명백해질 것이며, 이는 예시를 위해 제공되고 제한하려고 의도된 것이 아니다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 본 기술분야의 기술자에게 설명하기 위해 제공된 것이며; 본 개시내용의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다. 달리 표시되지 않는 한, 온도는 섭씨로 표시되고 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
일반적으로, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 운반하는 표적화 벡터는 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 제조했다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659, 각각 본원에 참고로 포함됨). 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론은 단일 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역을 함유하는 게놈 작제물을 생성하기 위해 변형시켰다. 작제물은 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 결실되도록 사전에 변형된 내인성 κ 경쇄 유전자좌 내로 삽입했다.
실시예 1 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 표적화 벡터의 생성
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2는 본 기술분야에서 인정된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조했다. 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2에 포함된 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절은 각각 인간 Vλ1-51 생식계열 서열 및 인간 Jλ2 생식계열 서열을 갖고 있었다.
DNA 단편은 de novo DNA 합성(Blue Heron Biotech)에 의해 제조했다. 이 단편은 AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vλ1-51 5' 비해독 영역(UTR), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412 bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), 및 PI-SceI 부위를 함유했다(서열번호 31; 도 1a 및 도 9a 내지 9c 참조).
상기 단락에 기재된 단편은 도 1a에서 표적화 벡터 A를 생산하기 위해 이전에 기술된 표적화 벡터에 결찰시켰다. 이전에 기재된 표적화 벡터는 BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역, PI-SceI 부위, 및 BAC CT7-254m04에서 유래된 ~75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다(예를 들어, 미국 특허 제9,334,334호의 도 14b, 및 미국 특허 제10,143,186호의 도 2 참조, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 마우스 상동성 암은 본원에 참고로 포함된 Macdonald 등(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 이미 기술된 것과 동일했다. 5' 암은 내인성 카파 유전자좌의 상류에 약 23kb의 게놈 서열을 함유했고, 3' 암은 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손 및 마우스 κ 유전자좌의 하류에 약 72kb의 게놈 서열을 함유했다. 도 1a 참조.
표적화 벡터 A는 5'에서 3'쪽으로, BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vκλ1-51 5' 미해독 영역(UTR), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), PI-SceI 부위, 및 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손, 및 마우스 κ 유전자좌 하류의 약 72kb의 게놈 서열을 포함하는 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다.
실시예 2 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 ES 세포의 생성
실시예 1에 기재된 바와 같은 표적화 벡터 A가, 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체하고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포에 전기천공된다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 이는 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용될 수 있는 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 3에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 이하 표 A의 것 중에 나열된다.
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 3 참조)는 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화된 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 작제물에 의해 형질감염된다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거된다(예를 들어, US 6,774,279, 전체가 참고로 포함됨). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 3 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 2에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입된다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99, 각각 본원에 참고로 포함됨). 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등, 이는 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 유전자형분석에 의해 식별된다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유할 수 있다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대한 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ1-51/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출된다.
실시예 4 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 표적화 벡터의 생성
표적화 벡터 A에서 마우스 Cκ를 마우스 Cλl로 대체하기 위해, 추가 클로닝 단계를 수행하였다(도 1b 참조). 표적 벡터 A는 2개의 Cas9:gRNA 복합체, 즉 인트론성 카파 인핸서(Ei)의 제1 절단 상류 및 Cκ의 제2 절단 하류로 시험관내에서 절단했다. 그 다음, 깁슨(Gibson) 어셈블리를 수행하여, Cas9-절단된 표적화 벡터의 3' 단부와 45bp 중첩, Ei, 마우스 Cλ1, loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트 및 Cas9-절단된 표적화 벡터의 5' 단부와 80bp 중첩을 함유하는 4.9kb 합성 단편으로 결실된 영역을 교체했다. 합성 단편은 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2018/063841의 도 1a의 플라스미드 pE의 제한 단편으로부터 얻었다. 결과적으로 수득되는 표적화 벡터인 표적화 벡터 B가 도 1b에 도시된다.
표적화 벡터 B는 마우스 Cκ가 마우스 Cλ1로 대체되었고 loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트가 Cκ polyA 신호의 하류에 삽입되었다는 점을 제외하고는 표적화 벡터 A와 동일하다.
실시예 5 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 ES 세포의 생성
실시예 4에 기재된 바와 같은 표적화 벡터 B는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체되고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공했다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능성 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함했다(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출했다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인되었다(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 4에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 상기 표 A의 것 중에 나열되어 있다.
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 4 참조)는 FRT화된 네오마이신 또는 Flox화된 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP 및/또는 CRE를 발현하는 작제물로 형질감염시켰다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거할 수 있고(예를 들어, US 6,774,279, 이는 전체가 참고로 포함됨), 및/또는 하이그로마이신 카세트는 CRE 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거할 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 및/또는 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 6 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1에서 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 5에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 마우스 Cλ1의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별되었다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유한다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 변형된 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ1-51/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출했다.
실시예 7 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 표적화 벡터의 생성
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2는 본 기술분야에서 인정된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조했다. 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2에 포함된 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절은 각각 인간 Vλ2-14 생식계열 서열 및 인간 Jλ2 생식계열 서열을 가졌다.
DNA 단편은 de novo DNA 합성(Blue Heron Biotech)에 의해 제조했다. 이 단편은 AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vλ1-51 5' 비해독 영역(UTR), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412 bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), 및 PI-SceI 부위를 함유했다(서열번호 36; 도 2a 및 도 13a 내지 13c 참조).
상기 단락에 기재된 단편을 도 2a의 표적화 벡터 C를 생산하기 위해 이전에 기술된 표적화 벡터에 결찰시켰다. 이전에 기재된 표적화 벡터는 BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역, PI-SceI 부위, 및 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다(예를 들어, 미국 특허 제9,334,334호의 도 14b, 및 미국 특허 제10,143,186호의 도 2 참조, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 마우스 상동성 암은 본원에 참고로 포함된 Macdonald 등(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 이미 기술된 것과 동일했다. 5' 암은 내인성 카파 유전자좌의 상류에 ~23kb의 게놈 서열을 함유했고, 3' 암은 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손 및 마우스 κ 유전자좌의 하류에 약 72kb의 게놈 서열을 함유했다. 도 2a 참조.
표적화 벡터 C는 5'에서 3'쪽으로, BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vκλ1-51 5' UTR, 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412bp(Jκ5 스플라이스 부위(SD) 포함), PI-SceI 부위, 및 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손, 및 마우스 κ 유전자좌 하류의 약 72kb의 게놈 서열을 포함하는 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유한다.
실시예 8 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 ES 세포의 생성
표적화 벡터 C는, 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체되고 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자를 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공된다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합된 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 이는 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 5에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 이하 표 A의 것 중에 나열된다.
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 5 참조)는 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화된 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 작제물로 형질감염시킨다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거된다(예를 들어, US 6,774,279, 전체가 참고로 포함됨). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 9 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 8에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시킨다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99, 각각 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등, 이는 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별한다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유할 수 있다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 한 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ 및 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ2-14/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출된다.
실시예 10 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 표적화 벡터의 생성
표적화 벡터 C에서 마우스 Cκ를 마우스 Cλl로 대체하기 위해, 추가 클로닝 단계를 수행하였다(도 2b 참조). 표적 벡터 C는 2개의 Cas9:gRNA 복합체, 즉 인트론성 카파 인핸서(Ei)의 제1 절단 상류 및 Cκ의 제2 절단 하류로 시험관내에서 절단되었다. 그 다음, 깁슨(Gibson) 어셈블리를 수행하여, Cas9-절단된 표적화 벡터의 3' 단부와 45bp 중첩, Ei, 마우스 Cλ1, loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트및 Cas9-절단된 표적화 벡터의 5' 단부와 80bp 중첩을 함유하는 4.9kb 합성 단편으로 결실된 영역을 교체했다. 합성 단편은 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2018/063841의 도 1A의 플라스미드 pE의 제한 단편으로부터 얻었다. 결과적으로 수득되는 표적화 벡터인 표적화 벡터 D는 도 2b에 도시된다.
표적화 벡터 D는 마우스 Cκ가 마우스 Cλ1로 대체되었고 loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트가 Cκ polyA 신호의 하류에 삽입되었다는 점을 제외하고는 표적화 벡터 C와 동일하다.
실시예 11 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 ES 세포의 생성
표적화 벡터 D는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체하고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공한다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능성 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론의 선택은 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1로부터 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용되는 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 6에 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 상기 표 A의 것 중에 나열되어 있다.
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1(도 6 참조)을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포는 FRT화된 네오마이신 또는 Flox화된 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP 및/또는 CRE를 발현하는 작제물에 의해 형질감염시킨다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거하며(예를 들어, US 6,774,279, 이는 전체가 참고로 포함됨), 및/또는 하이그로마이신 카세트는 CRE 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거한다. 선택적으로, 네오마이신 및/또는 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 12 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1에서 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 11에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시킨다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 마우스 Cλ1의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별된다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유한다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 변형된 κ 경쇄 유전자좌에 대한 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ12-14/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출한다.
실시예 13 - 마우스 육종
본 실시예는 다수의 유전자 변형된 면역글로불린 유전자좌를 보유하는 다수의 유전자 변형된 마우스 계통을 생성하기 위해 본원에 기술된 유전자 변형된 마우스 중 어느 하나로 육종될 수 있는 몇몇 유전자 변형된 마우스 계통을 설명한다.
마우스가 재배열된 인간 Igλ 가변 도메인을 갖는 경쇄 및 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄를 발현하도록 본원에 기재된 조작된 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성인 마우스를 초래하는 많은 다양한 육종 계획이 구상된다. 하나의 이러한 계획에서, 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자(내인성 카파 유전자좌에서) 상의 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 및 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자(내인성 카파 유전자좌에서)에서 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1에 대해 이형접합성이고, 상기 기재된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 상기 실시예 3, 6, 9, 및 12에 기재된 유전자 변형된 마우스는, 내인성 마우스 Igκ, Igλ 및 Ig 중쇄 유전자좌의 결실에 대해 동형접합성인 마우스로 육종된다. 재배열된 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 결과적으로 생성된 자손은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄에 대해 동형접합성이고 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절(또한 상기 기재된 바와 같은 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함함)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스를 얻기 위해 서로 육종된다. 육종은 본 기술분야에서 인정받은 표준 기술에 의해, 대안적으로 상업적 육종자(예를 들어, The Jackson Laboratory)에 의해 수행된다.
내인성 Igκ 녹아웃(Igκ KO). 예를 들어, 전술한 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Igκ 경쇄 유전자좌가 내인성 Igκ 경쇄를 발현할 수 없게 하는 내인성 Igκ 유전자좌 전체 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이러한 예시적인 마우스는 본원에 참고로 포함되는 Macdonald 등 (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 기술되어 있다.
내인성 Igλ 녹아웃(Igλ KO). 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 사용법을 최적화하기 위해, 상기 기재된 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스를, 내인성 Igλ 경쇄 유전자좌가 내인성 λ 경쇄를 발현할 수 없도록 하는 내인성 Igλ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 함유하는 마우스로 육종된다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,066,502호의 실시예 1 참조). 이러한 방식으로, 수득한 자손은 이들의 유일한 λ 경쇄로서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 발현된 가변 도메인을 갖는 경쇄를 발현할 것이다(예를 들어, 실시예 3, 6, 9 및 12에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 Vλ/Jλ). 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리 및 내인성 λ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 보유하는 마우스 계통은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 선별된다.
내인성 Ig 중쇄 녹아웃(IgH KO). 예를 들어, 전술한 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Ig 중쇄 유전자좌가 내인성 Ig 중쇄를 발현할 수 없게 하는 내인성 Ig 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이러한 예시적인 마우스는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,457,960호의 실시예 7에 기술되어 있다.
따라서, 전술한 바와 같이, 상기 기재된 바와 같은 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Igλ, Igκ, 및/또는 Ig 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이후 자손은 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
실시예 14 - 중쇄 유전자 사용법 및 람다 경쇄의 체세포 과돌연변이 빈도
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역 및 상기 본원에 기재된 인간 중쇄 가변 영역에 의한 내인성 중쇄 가변 영역의 대체를 포함하는 마우스로부터의 중쇄 유전자 사용법은 본 기술분야에 알려진 여러 방법을 통해 결정될 수 있다. 이러한 하나의 방법으로, 차세대 시퀀싱 기술이 사용된다.
보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 마우스 및 상기 본원에 기재된 인간 중쇄 가변 영역에 의한 내인성 중쇄 가변 영역의 대체를 포함하는 마우스로부터 수확된 비장세포 또는 골수는 이들 항체의 중쇄 가변 영역 분절 사용법에 대해 분석된다. 2.5% 소태아혈청(FBS)을 함유하는 1x 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)로 대퇴골을 플러싱하여 대퇴골에서 골수를 수집하고, 필요한 경우 골수 세포를 상이한 B 세포 아형에 대해 FACS 분류한다. 단세포 현탁액은 마우스 비장에서 제조한다. 비장 및 골수 제조물로부터의 적혈구는 ACK 용해 완충액(Gibco)으로 용해한다. 비장 B 세포는 항-CD19(마우스, B 세포용 마커) 자기 비드 및 MACS® 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용한 자기 세포 분류법에 의해 총 비장 세포로부터 양성적으로 농축된다. 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 RNeasy Plus RNA 단리 키트(Qiagen)를 사용하여 골수 및 정제된 비장 B 세포로부터 단리한다.
SMARTer™ RACE cDNA 증폭 키트(Clontech) 및 IgM 또는 IgG 특이적 프라이머를 사용하여 IgM 또는 IgG 불변 영역 서열을 함유하는 인간 중쇄 cDNA를 생성하기 위해 역전사를 수행한다. 역전사 동안, 주형 전환(TS) 프라이머의 역 보체인 DNA 서열을 새로 합성된 cDNA의 3' 단부에 부착한다. 정제된 cDNA는 2회의 세미-네스티드(semi-nested) PCR에 의해 증폭시켜 mRNA가 수득된 세포에 의해 발현되는 전체 IgM 또는 IgG 가변 도메인 보체를 암호화하는 복수의 cDNA를 생성한 다음, 시퀀싱 프라이머 및 인덱스를 부착하기 위한 3차 PCR에 의해 증폭시킨다. 인간 가변 도메인 cDNA는 시퀀싱을 위해 샘플을 MiSeq 시퀀서(Illumina)에 로딩하기 전에, Pippin Prep(SAGE Science)를 사용하여 크기를 선택하고 KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)를 사용하여 qPCR로 정량한다.
생물정보학 분석을 위해, Raw Illumina 서열은 탈-다중화하고, 품질, 길이 및 상응하는 IgM 또는 IgG 불변 영역 유전자 프라이머에 대한 정합(match)에 기초하여 필터링한다. 중첩되는 쌍을 이룬-단부 판독값(paired-end read)은 맞춤형 사내 파이프라인을 사용하여 병합 및 분석한다. 파이프라인은 IgBLAST(NCBI, v2.2.25+)의 로컬 설치를 사용하여 재배열된 중쇄 서열을 인간 생식계열 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절 데이터베이스에 정렬하며, 정지 코돈의 존재와 함께 생산적 및 비생산적 접합을 나타낸다. CDR3 서열 및 예상되는 비-주형 뉴클레오타이드는 IMGT(International Immunogenetics Information System)에서 정의된 바와 같은 경계를 사용하여 추출한다.
상기 방법은 본원에 기술된 보편적인 재배열된 인간 경쇄 마우스에서 특정 인간 VDJ 재배열의 빈도 뿐만 아니라 다양한 인간 V, D, 및 J 분절 사용법을 결정할 수 있게 한다.
유사한 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 보편적으로 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역을 포함하는 마우스의 람다 경쇄에서 체세포 과돌연변이의 존재 및 빈도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 마우스 Cλ(예를 들어, Cλ1) 불변 영역에 연결된 보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역을 포함하는 마우스의 경우, 위에서 설명한 역전사 PCR을 수행하여 면역글로불린 Cλ(예, Cλ1) 특이적 프라이머를 사용하여 면역글로불린 λ 불변영역(예를 들어, Cλ1) 유전자 서열을 함유하는 cDNA를 생성하고, 재배열된 경쇄 서열을 인간 생식계열 Vλ 및 Jλ 유전자 분절 데이터베이스에 정렬하기 위해 생물정보학적 분석을 수행한다. 마우스 Cκ 불변 영역에 연결된 보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역의 경우, 마우스 Cκ 특이적 프라이머가 대신 사용된다. 람다 경쇄에서 체세포 과돌연변이의 존재 및 빈도가 정량된다.
실시예 15 - 마우스로부터 인간 항체의 생성
제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 실시예 3, 6, 9 및 12에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 Vλ/Jλ)를 포함하는 마우스를 다른 내인성 Ig 유전자좌의 변형 및 결실을 함유하는 다양한 바람직한 계통으로 육종한 후(예를 들어, 실시예 13에 기재된 바와 같음), 선택한 마우스는 관심 항원으로 면역화할 수 있다.
일반적으로, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 마우스(이들의 생식계열 게놈에 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 내인성 λ 유전자좌의 제거 여부에 관계없이 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌 대신 조작된 Vλ1- 51/Jλ2 인간 경쇄 영역 또는 조작된 Vλ2-14/Jλ2 인간 경쇄 영역(상기 기술됨)으로의 대체를 포함하는 마우스)는 관심 항원으로 면역화한다. 혈액을 수집하고 항체 면역 반응을 표준 항원 특이적 ELISA 면역검정으로 모니터링한다.
원하는 면역 반응이 달성되면, 1가지 방법으로, 비장세포(및/또는 다른 림프 조직)를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합하여 그의 생존력을 보존하고 불멸성 하이브리도마 세포주를 형성한다. 생성된 하이브리도마 세포주는 항원-특이적 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 식별하기 위해 선별(예를 들어, ELISA 검정에 의해) 및 선택한다. 하이브리도마는 원하는 경우 상대적인 결합 친화도 및 아이소타입에 대해 추가로 특성화될 수 있다. 이 기술 및 상기 기재된 면역원을 사용하여, 여러 항원 특이적 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 보유하는 항체)를 수득한다.
대안적으로, 또 다른 방법으로, 본원에 기술되고/되거나 예시된 조작된 마우스의 B 세포에 의해 생성된 항원-특이적 키메라 항체, 및/또는 이의 λ 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA가 항원-특이적 B 세포로부터 직접 단리될 수 있다. 예를 들어, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고친화성 키메라 항체를 단리하여 특성화할 수 있으며, 관심 있는 특별한 항체(및/또는 이를 생성하는 B 세포)가 지정된다. 몇 가지 예를 들자면, 이러한 항체, 및/또는 이의 가변 및/또는 불변 영역의 평가된 특성은 에피토프의 친화도, 선택성, 동일성 등 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 항원 특이적 항체는, 예를 들어, 본원에 전체가 참고로 특별히 포함되는 미국 특허 제7,582,298호에 기재된 바와 같이, 골수종 세포에 융합함이 없이, 항원-양성 B 세포(면역화된 마우스 유래)로부터 직접 단리된다.
중쇄 및 λ 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 단리되거나 달리 제조될 수 있고, 완전-인간 항체의 제조를 위해, 각각 인간 중쇄 불변 영역(예를 들어, 원하는 아이소타입의 것) 및 인간 λ 경쇄 불변 영역에 연결될 수 있다. 단리된 중쇄 및 λ 경쇄 가변 영역은 체세포적으로 돌연변이될 수 있다. 이것은 항원 특이적 레퍼토리에 또 다른 다양성을 추가한다. 완전-인간 항체(및/또는 이의 중쇄 또는 λ 경쇄)는 세포, 전형적으로 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 그 다음, 완전 인간 항체는 관심 항원의 상대적 결합 친화도 및/또는 중화 활성에 대해 특성화될 수 있다.
실시예 16 - 이중특이적 항체의 결합 친화도
완전 인간 이중특이적 항체는 본 기술분야에 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 상기 기재된 관심 항원에 특이적인 선택된 단일특이적 항체의 클로닝된 인간 중쇄 가변 영역으로부터 작제된다. 간략하게, 조작된 인간 Vλ1-51/Jλ2 경쇄 또는 조작된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 영역을 포함하는 마우스로부터 수득된 2개의 선택된 단일특이적 항체로부터의 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 2개의 인간 중쇄는 그 마우스에 존재하는 것과 동일한 λ 가변 영역, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 인간 경쇄와 함께 적합한 세포주에서 발현되고; 원하는 특성(예를 들어, 2개의 항원에 대한 원하는 친화성)을 포함하는 이중특이적 항체가 수득된다.
항원의 전부 또는 일부에 대한 관심 항원에 특이적인 이중특이적 또는 모 단일특이적 항체의 결합은 BIACORE™ 2000 기기(GE Healthcare)에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 결정한다.
특정 실시양태
실시양태 1. 유전자 변형된 설치류로서, 이의 생식계열 게놈이
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
를 포함하고, 여기서 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 생식계열 게놈이 하기를 추가로 포함하는 유전자 변형된 설치류:
하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌,
여기서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함함.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류가, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 9. 실시양태 4 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 10. 실시양태 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절을 각각 대체하는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 12. 실시양태 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
(i) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절이 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고,
(ii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절이 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며,
(iii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 13. 실시양태 4 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 14. 실시양태 4 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편이 유전자 변형된 설치류에 의해 발현되는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 16. 실시양태 14 또는 15에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함되는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 17. 실시양태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 18. 실시양태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 19. 실시양태 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대체하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 20. 실시양태 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절이 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하고, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 있는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 제1 인간 VH 유전자 분절이 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절이 VH6-1인, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 22. 실시양태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 마우스 Cλ1, (ii) 마우스 Cλ2, 또는 (iii) 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 24. 실시양탱 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ1 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 26. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 랫트 Cλ1, (ii) 랫트 Cλ2, (iii) 랫트 Cλ3 또는 (iv) 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 랫트 Cλ 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자가 전적으로 또는 부분적으로 결실된, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 가변 도메인을 검출가능하게 발현하지 않는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류
실시양태 34. 실시양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 랫트 또는 마우스인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 35. 제1 유전자 변형된 설치류, 제2 유전자 변형된 설치류, 및 제3 유전자 변형된 설치류를 포함하는 유전자 변형된 설치류의 육종 콜로니로서, 제3 유전자 변형된 설치류가 제1 유전자 변형된 설치류 및 제2 유전자 변형된 설치류의 자손이고, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류는 각각 이들의 생식계열 게놈에:
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하된, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
를 포함하며, 여기서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 육종 콜로니.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 육종 콜로니.
실시양태 37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 각각 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는, 육종 콜로니.
실시양태 38. 실시양태 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 유전자 변형된 설치류 각각의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내의 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 육종 콜로니.
실시양태 39. 실시양태 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 유전자 변형된 설치류가 각각 이들의 생식계열 게놈에
하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌
를 포함하고, 여기서 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 육종 콜로니.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 육종 콜로니.
실시양태 41. 게놈이 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 설치류 배아.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자에 대해 동형접합성인, 설치류 배아.
실시양태 43. 실시양태 41 또는 42에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류 배아.
실시양태 44. 실시양태 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류 배아.
실시양태 45. 실시양태 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 설치류 배아.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인, 설치류 배아.
실시양태 47. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류의 B 세포로서,
조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전
을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 B 세포.
실시양태 48. 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류의 B 세포로서,
조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전; 및
조작된 내인성 중쇄 유전자에 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절의 인간 JH 유전자 분절에서 유래하는, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 B 세포.
실시양태 49. 실시양태 47 또는 48의 B 세포로부터 생성된 하이브리도마.
실시양태 50. 생식계열 게놈에 하기를 포함하는 단일 유전자 변형된 설치류의 B 세포 집단:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로서, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Jλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌,
(b) 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌,
여기서 B 세포 집단에 의해 발현되는 모든 항체는 하기를 포함함:
(i) 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) 적어도 2개의 상이한 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인.
실시양태 51. 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 줄기 세포로서, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 줄기 세포.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 줄기 세포의 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 줄기 세포.
실시양태 53. 실시양태 51 또는 52에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기 세포.
실시양태 54. 실시양태 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기 세포.
실시양태 55. 실시양태 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 줄기 세포.
실시양태 56. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 포유동물 세포로서, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 또는 둘 모두가 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류로부터 식별되는, 포유동물 세포.
실시양태 57. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 항체:
(a) 실시양태 1-34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 유전자 변형된 설치류가 관심 항원에 대한 면역 반응을 생성하기에 충분한 조건 하에서 유전자 변형된 설치류를 유지시키는 단계; 및
(c) 유전자 변형된 설치류로부터 하기를 회수하는 단계:
(i) 관심 항원에 결합하는 항체,
(ii) 관심 항원에 결합하는 항체의 인간 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 또는
(iii) 관심 항원에 결합하는 항체를 발현하는 세포,
여기서, (c)의 항체는 인간 중쇄 가변 및 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함함.
실시양태 58. 항체를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 항원에 노출시키는 단계;
(b) 유전자 변형된 설치류가 항원에 대한 면역 반응을 발생하도록 하는 단계; 및
(c) 유전자 변형된 설치류로부터의 항원에 특이적인 항체, 항원에 특이적인 항체를 발현하는 B 세포, 또는 항원에 특이적인 항체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 단리하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 59. 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법:
(a) 2개의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 및 2개의 인간 면역글로불린 중쇄를 포함하는 상기 항체를 포유동물 세포에서 발현시키는 단계로서, 여기서 각각의 인간 면역글로불린 λ 경쇄는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하고 각각의 인간 면역글로불린 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, λ 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, 또는 이들의 조합의 아미노산 서열은 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류에서 식별되었던 것인 단계; 및
(b) 항체를 수득하는 단계.
실시양태 60. 실시양태 58 또는 59에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 방법.
실시양태 61. 이중특이적 항체의 제조 방법:
(a) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 제1 유전자 변형된 설치류를 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계,
(b) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 제2 유전자 변형된 설치류를 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계,
(c) 제1 유전자 변형된 설치류로부터 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(d) 제2 유전자 변형된 설치류로부터 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(e) 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(f) 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2 인간 중쇄를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(g) 포유동물 세포에서 하기를 발현시키는 단계:
(i) 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 62. 이중특이적 항체를 제조하는 방법:
(a) 포유동물 세포에서
(i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열
을 발현시키는 단계를 포함하고;
여기서, 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 제1 유전자 변형된 설치류에서 제1 항체로부터 식별된 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제1 항체는 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하며;
제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 제2 유전자 변형된 설치류에서 제2 항체로부터 식별된 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제2 항체는 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하며;
여기서 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 각각 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나에 따른 유전자 변형된 설치류이고;
여기서 제3 뉴클레오타이드의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전인, 방법.
실시양태 63. 실시양태 59 또는 62에 있어서, 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 동일한 유전자 변형된 설치류인 방법.
실시양태 64. 실시양태 59 또는 62에 있어서, 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 상이한 유전자 변형된 설치류인 방법.
실시양태 65. 실시양태 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 항원은 동일한 항원이고, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 에피토프인 방법.
실시양태 66. 실시양태 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 항원은 상이한 항원인 방법.
실시양태 67. 인간 면역글로불린 중쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 형성하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 68. 실시양태 67의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄.
실시양태 69. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 70. 실시양태 69의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인.
실시양태 71. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 35 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계, 및
(b) 유전자 변형된 설치류로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 단리하는 단계
를 포함하고, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체는 각각 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인에 결합하며,
집합체 내의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이루는 인간 λ 경쇄 가변 도메인이 항원에 결합하는, 방법.
실시양태 72. 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 형성시키는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 73. 실시양태 72의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄.
실시양태 74. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 75. 실시양태 74의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인.
실시양태 76. 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 77. 실시양태 76의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 78. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 79. 실시양태 78의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 80. 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계.
를 포함하는 방법.
실시양태 81. 실시양태 80의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 82. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 83. 실시양태 82의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 84. 하기를 포함하는 표적화 벡터:
(i) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에 5' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' 상동성 암;
(ii) Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역;
(iii) 설치류 Cλ 유전자 분절; 및
(iv) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에 3' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' 상동성 암.
실시양태 85. 실시양태 84에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 벡터.
실시양태 86. 실시양태 84 또는 85에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 벡터.
실시양태 87. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계.
실시양태 88. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계.
실시양태 89. 실시양태 87 또는 88에 있어서, 설치류 ES 세포의 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 방법.
실시양태 90. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계.
실시양태 91. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단계.
실시양태 92. 실시양태 90 또는 91에 있어서, 설치류 ES 세포의 게놈이
조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절
을 포함하는 방법.
실시양태 93. 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈에 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단계를 포함하며,
이로써, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 방법.
실시양태 94. 실시양태 93에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
(b) 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 단계로서,
이로써, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함함.
실시양태 95. 실시양태 93 또는 94에 있어서, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)가 설치류 ES 세포에서 수행되는 방법.
실시양태 96. 실시양태 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에는 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있는 방법.
실시양태 97. 실시양태 93 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
실시양태 98. 실시양태 93 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
실시양태 99. 실시양태 94 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신하는 방법.
실시양태 100. 실시양태 94 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절 각각을 대체하는 방법.
실시양태 101. 실시양태 94 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자인 방법.
실시양태 102. 실시양태 94 내지 101 중 어느 하나에 있어서,
(i) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절이 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고,
(ii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절이 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 조합, 및
(iii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합
을 포함하는 방법.
실시양태 103. 실시양태 94 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있는 방법.
실시양태 104. 실시양태 94 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
실시양태 105. 실시양태 104에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편이 유전자 변형된 설치류에 의해 발현되는, 방법.
실시양태 106. 실시양태 104 또는 105에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함되어 있는, 방법.
실시양태 107. 실시양태 104 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시양태 108. 실시양태 104 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대신하는, 방법.
실시양태 109. 실시양태 104 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대체하는, 방법.
실시양태 110. 실시양태 104 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절이 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하고, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 있는, 방법.
실시양태 111. 실시양태 110에 있어서, 제1 인간 VH 유전자 분절이 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절이 VH6-1인, 방법.
실시양태 112. 실시양태 104 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있는, 방법.
실시양태 113. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 마우스 Cλ1, (ii) 마우스 Cλ2, 또는 (iii) 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 방법.
실시양태 114. 실시양태 93 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 115. 실시양태 93 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ1 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 116. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 랫트 Cλ1, (ii) 랫트 Cλ2, (iii) 랫트 Cλ3 또는 (iv) 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 방법.
실시양태 117. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 랫트 Cλ 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 118. 실시양태 93 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신하는, 방법.
실시양태 119. 실시양태 93 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체하는, 방법.
실시양태 120. 실시양태 93 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 설치류의 생식계열 게놈이 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 121. 실시양태 93 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자가 전적으로 또는 부분적으로 결실되는, 방법.
실시양태 122. 실시양태 93 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 랫트 또는 마우스인 방법.
등가물
본 개시내용에 대한 다양한 변경, 변형 및 개선은 본 기술분야의 기술자에게 쉽게 일어나는 것임을 본 기술분야의 기술자라면 인지하고 있다. 이러한 변경, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고 본 발명의 사상 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예시에 불과하며, 본 개시내용에 기재된 임의의 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
본 기술분야의 기술자는 본원에 기재된 바와 같은 검정 또는 기타 공정에서 수득된 값에 기인할 수 있는 전형적인 표준 편차 또는 오류를 인지하고 있을 것이다. 본 발명의 배경을 설명하고 본 발명의 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본원에 참조된 간행물, 웹사이트 및 기타 참고 자료는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 본 개시내용에 따른 비-인간 동물의 실시양태를 생성하는데 사용된 표적화 벡터(실시예 1 및 4에 기술됨)를 작제하기 위한 전략의 예시적 실시양태의 실례를 비-축척 비율로 보여준다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양(filled shape)과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "enh"는 인핸서를 나타내고; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SPEC"은 스펙티노마이신 내성 유전자를 나타내며; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "CDS"는 암호 서열을 나타내고; "lox"는 lox2372 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본 개시내용에 따른 비-인간 동물의 실시양태를 생성하는데 사용되는 표적화 벡터(실시예 7 및 10에 기술됨)를 작제하기 위한 전략의 예시적인 실시양태의 실례를, 비-축척 비율로 보여준다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "enh"는 인핸서를 나타내고; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SPEC"은 스펙티노마이신 내성 유전자를 나타내며; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "CDS"는 암호 서열을 나타내고; "lox"는 lox2372 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다.
도 3은 표적화 벡터 A(실시예 1에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 2에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에 대해 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 4는 표적화 벡터 B(실시예 4에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 5에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에 대해 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; loxP"는 lox P 부위를 나타내며; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 5는 표적화 벡터 C(실시예 7에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 8에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에서 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 6은 표적화 벡터 D(실시예 10에 기재된 것)를 설치류 배아 줄기(ES) 세포 클론의 조작된 Igκ 경쇄 유전자좌(실시예 11에 기재된 것)에 삽입한 실례를 비-축척 비율로 보여주며, 여기서 ES 세포 클론은 본 개시내용에 따른 설치류의 실시양태를 생성하는데 사용되었다. 이 실례에는, 배아 줄기(ES) 세포 클론이 특정 예시적 서열에서 양성임을 확인하는데 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치(원형 대시 마크에 의해 표시됨)가 포함되어 있다. 다이어그램의 라벨링이 달리 시사하지 않는 한(예를 들어, 선택 카세트의 경우, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내고, 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. "FRT"는 Frt 재조합효소 시스템 부위를 나타내고; "UB-NEO"는 UB 프로모터를 갖는 네오마이신 내성 유전자를 나타내며; "Ei"는 인트론성 인핸서를 나타내고; "3'E"는 3' 인핸서를 나타내고; "SD"는 스플라이스 공여체 부위를 나타내고; "loxP"는 lox P 부위를 나타내고; "UB-HYG"는 UB 프로모터를 갖는 하이그로마이신 내성 유전자를 나타낸다. "Het"는 이형접합성 마우스를 나타내고, "ho"는 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 7은 마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 25)을 나타낸다. 암호 서열은 볼드체 글자로 표시되며 3' 비해독 영역은 볼드체가 아니다.
도 8은 랫트 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27)을 나타낸다. 암호 서열은 볼드체 글자로 표시되며 3' 비해독 영역은 볼드체가 아니다.
도 9a 내지 도 9c는 조작된 Vλ1-51/Jλ2 벡터(서열번호 31)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 제한 효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부)은 이탤릭체 대문자로 표시된다; Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시된다; Vλ1 51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 및 볼드체로 표시된다; 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 서열은 다음을 포함한다: Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체는 아님)로 표시되고, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되고; Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되고; Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시되며; 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체 문자로 표시된다.
도 10은 Vλ1-51 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 32)을 나타낸다. Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시되고; Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되며; Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되고; 및 Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시된다.
도 11은 Vλ1-51 인트론이 없는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 33)을 나타낸다. Vλ1-51 암호 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Jλ2 서열은 대시선 밑줄이 있는 대문자로 표시된다.
도 12는 신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 34)을 나타낸다. 이탤릭체의 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c는 조작된 Vλ2-14/Jλ2 벡터(서열번호 36)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. 제한 효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부)은 대문자 이탤릭체로 표시되고; Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시되며; Vλ1 51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체 및 볼드체로 표시되고; 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 서열은 다음을 포함한다: Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 추가로 이탤릭체 및 밑줄로 표시되고; Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체로 표시되고; Vλ2-14, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되며; Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄)로 표시되고; 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시된다.
도 14는 Vλ2-14 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 37)을 나타낸다. Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄이 추가로 표시되고; Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자, 볼드체 문자로 표시되고; Vλ1-51, 엑손 2 서열은대문자, 볼드체 및 밑줄(실선 밑줄) 문자로 표시되며; 및 Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄(대시선 밑줄) 문자로 표시된다.
도 15는 Vλ2-14 인트론이 없는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 38)을 나타낸다. Vλ2-14 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14 시작 코돈은 이탤릭체 및 밑줄로 추가 표시되고; Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시된다.
도 16은 신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 39)을 나타낸다. 이탤릭체, 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
서열 목록의 선택된 서열에 대한 간단한 설명
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 사용될 수 있는 다양한 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System) 웹사이트, www.imgt.org에서, 또는 LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, May, 23, 2001(이하 "LeFranc 2001"이라고 함)에서 입수가능하다.
다음은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는 다양한 마우스, 랫트, 또는 인간 람다 불변 영역 또는 도메인의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다.
다음은 본원에 기술된 바와 같은 비-인간 동물의 몇몇 실시양태에 이용될 수 있는 마우스, 랫트, 또는 인간 카파 불변 영역 또는 도메인의 대표적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이다.
마우스 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 25)(도 7에 복사됨):
서열번호 25와 관련하여 다음이 적용된다:
- 암호 서열은 볼드체로 표시됨; 및
- 3' 미해독 영역은 볼드체가 아님.
마우스 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 26):
랫트 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 27)(도 8에 복사됨):
서열번호 27과 관련하여, 다음이 적용된다:
- 암호 서열은 볼드체로 표시됨; 및
- 3' 미해독 영역은 볼드체가 아님.
랫트 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 28):
인간 Cκ의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 29):
인간 Cκ의 아미노산 서열(서열번호 30):
조작된 Vλ1-51/Jλ2 벡터의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 31)(도 1a에 개략적으로 도시되고 도 9a-9c에 복사됨):
서열번호 31과 관련하여 다음이 적용된다:
- 제한효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부) -는 이탤릭체 대문자로 표시됨;
- Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시됨;
- Vλ1-51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 볼드체로 표시됨;
- 하기를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 서열:
· Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
· Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
· Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄 친(대시 밑줄) 문자로 표시됨; 및
- 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시됨.
Vλ1-51 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 32)(도 10에 복사됨):
서열번호 32와 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ1-51, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가 표시됨;
- Vλ1-51, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
- Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 및 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨.
Vλ1-51 인트론이 없는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 33)(도 11에 복사됨):
서열번호 33과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ1-51 암호 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ1-51 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시됨.
신호 펩타이드를 포함하는 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 34)(도 12에 복사됨):
서열번호 34와 관련하여, 이탤릭체의 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
신호 펩타이드 없이 재배열된 Vλ1-51/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 35):
조작된 Vλ2-14/Jλ2 벡터의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 36)(도 2a에 개략적으로 도시되고 도 13a-13c에 복사됨):
서열번호 36과 관련하여 다음이 적용된다:
- 제한효소 부위 서열 - AscI(서열의 5' 단부) 및 PI-SceI(서열의 3' 단부) -은 이탤릭체 대문자로 표시됨;
- Vλ1-51 프로모터 서열은 소문자(볼드체 아님)로 표시됨;
- Vλ1-51 5' UTR 서열은 대문자, 이탤릭체, 및 볼드체로 표시됨;
- 하기를 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 서열:
· Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자(볼드체 아님)로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
· Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
· Vλ2-14, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 및 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨; 및
· 인간 Jκ5-Cκ 인트론 서열은 소문자, 이탤릭체로 표시됨.
Vλ2-14 인트론을 포함하는 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 37)(도 14에 복사됨):
서열번호 37과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ2-14, 엑손 1 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14, 엑손 1 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨;
- Vλ2-14, 인트론 1 서열은 소문자 볼드체로 표시됨;
- Vλ1-51, 엑손 2 서열은 대문자, 볼드체, 밑줄친(실선 밑줄) 문자로 표시됨;
- Jλ2 서열은 대문자, 볼드체 및 밑줄친(대시 밑줄) 문자로 표시됨.
Vλ2-14 인트론 없이 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 38)(도 15에 복사됨):
서열번호 38과 관련하여 다음이 적용된다:
- Vλ2-14 서열은 대문자로 표시되며, 여기서 Vλ2-14 시작 코돈은 이탤릭체와 밑줄로 추가로 표시됨; 및
- Jλ2 서열은 대시 밑줄이 있는 대문자로 표시됨.
신호 펩타이드를 포함한 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 39)(도 16에 복사됨):
서열번호 39와 관련하여, 이탤릭체, 볼드체 텍스트는 신호 펩타이드의 서열을 나타낸다.
신호 펩타이드 없이 재배열된 Vλ2-14/Jλ2 가변 도메인의 아미노산 서열(서열번호 40):
정의
본 발명의 범위는 본원에 첨부된 청구범위에 의해 정의되며 본원에 설명된 특정 실시양태에 의해 제한되지 않는다. 본 명세서를 읽은 본 기술분야의 기술자는 이러한 기술된 실시양태와 동등할 수 있는, 또는 그렇지 않으면 청구범위의 범주 내에서 다양한 수정을 인식할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어는 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 본 기술분야에서 이해하는 의미를 따른다. 특정 용어의 명시적 정의는 이하에 제공되며; 본 명세서 전반에 걸쳐 특정 경우의 이들 용어 및 다른 용어의 의미는 문맥으로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백한 것일 것이다. 이하 용어 및 기타 용어에 대한 추가 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 설명된다. 본 명세서 내에서 인용된 특허 및 비특허 문헌 참조, 또는 이의 관련 부분은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
청구범위에서 청구 요소를 수정하기 위한 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어의 사용은 하나의 청구 요소가 다른 것보다 임의의 우선 순위, 선행 순위 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 그 자체가 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 하나의 청구 요소를 동일한 명칭을 갖는 다른 요소와 구별하여(단, 서수 용어의 사용으로 인해) 청구 요소를 구별하기 위한 라벨로서 사용된 것이다.
본 명세서에 사용된 관사 "a" 및 "an"은 상반되는 것을 명백하게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 그룹 구성원 중 하나, 하나보다 많은, 또는 전부가 문맥에서 달리 명시되거나 상반되는 것을 나타내지 않는 한, 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 또는 달리 관련이 있다면, 충족된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 그룹의 정확히 하나의 구성원은 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련이 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 하나보다 많은 또는 모든 그룹 구성원은 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나, 달리 관련이 있는 것이다. 본 발명은 달리 표시되지 않는 한, 또는 모순이나 불일치가 일어날 것이 본 기술분야의 기술자에게 명백하지 않은 한, 나열된 청구항 중 하나 이상에서의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 설명적 용어 등을 동일한 기본 청구항(또는, 적절한 경우 임의의 다른 청구항)에 종속되는 다른 청구항에 도입되는 모든 변경, 조합 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 요소가 목록(예를 들어, Markush 그룹 또는 유사한 형식)으로 제시되는 경우, 요소의 각 하위그룹도 개시되며, 이 그룹에서 임의의 요소(들)가 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 실시양태 또는 양상이 특정 요소, 특징 등을 "포함하는" 것으로 지칭되는 경우, 특정 실시양태 또는 양상은 이러한 요소, 특징 등으로 "이루어지거나", "본질적으로 이루어지는" 것으로 이해되어야 한다. 단순함을 위해, 이러한 실시양태는 모든 경우에 본원의 매우 많은 단어들로 구체적으로 설명되지 않았다. 또한, 특정 배제가 본 명세서에 언급되는지 여부와 상관없이, 임의의 실시양태 또는 양상이 청구범위로부터 명시적으로 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 시스템(예를 들어, 세포, 기관, 조직, 유기체, 또는 이의 관련 구성요소 또는 구성요소 세트)에 조성물(예를 들어, 항원 또는 항체)을 투여하는 것을 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 투여 경로가, 예를 들어 조성물이 투여되는 대상체 또는 시스템, 조성물의 성질, 투여 목적 등에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 동물 대상체(예를 들어, 인간 또는 설치류)에 대한 투여는 기관지(기관지 점적 포함), 협측, 장, 진피내, 동맥내, 피내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 심실내, 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(기관내 점적 포함), 경피, 질 및/또는 유리체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적 투약을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)를 수반할 수 있다.
항원 결합 단백질 : 본원에 사용된 바와 같이, 적어도 하나의 관심 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 항원 결합 단백질은 항체, 중쇄, 경쇄(예를 들어, λ 또는 κ 경쇄), 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인(예를 들어, λ 또는 κ 경쇄 가변 도메인), 및 단일 사슬 가변 단편(ScFv)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단백질은 다중특이적일 수 있고 2개 이상의 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
대략 : 하나 이상의 관심 값에 적용된 경우, 언급된 기준 값과 유사한 값을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 문맥에서 달리 명백하지 않은 한, 언급된 기준 값의 ±10%(초과 또는 미만) 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 100%의 가능한 값을 초과할 경우는 제외됨).
생물학적 활성 : 본원에 사용된 바와 같이, 시험관내 또는 생체내(예를 들어, 유기체에서) 생물학적 시스템에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 존재할 때 그 유기체 내에서 생물학적 효과를 갖는 제제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주한다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성인 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 일부는 전형적으로 "생물학적 활성" 부분으로 지칭된다.
비슷한 : 본원에 사용된 바와 같이, 서로 동일하지 않을 수 있지만 충분히 유사하여, 관찰된 차이 또는 유사성에 기초하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있도록 그들 사이에 비교를 허용하는, 2개 이상의 제제, 실체(entity), 상황, 조건 세트 등을 지칭한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 문맥에서 2 이상의 상기 제제, 실체, 상황, 조건 세트 등이 비슷한 것으로 간주되기 위해 임의의 주어진 상황에서 어느 정도의 동일성이 필요한 지를 이해할 것이다.
보존적 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 보존적 아미노산 치환을 기술할 때, 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 경우를 지칭한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 있는 기능적 성질, 예를 들어 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L) 및 이소류신(Ile, I)과 같은 지방족 측쇄; 세린(Ser, S) 및 트레오닌(Thr, T)과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q)과 같은 아미드 함유 측쇄; 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 및 트립토판(Trp, W)과 같은 방향족 측쇄; 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 및 히스티딘(His, H)과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인(Cys, C) 및 메티오닌(Met, M)과 같은 황 함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어, 발린/류신/이소류신(Val/Leu/Ile, V/L/I), 페닐알라닌/티로신(Phe/Tyr, F/Y), 라이신/아르기닌(Lys/Arg, K/R), 알라닌/발린(Ala/Val, A/V), 글루타메이트/아스파테이트(Glu/Asp, E/D) 및 아스파라긴/글루타민(Asn/Gln, N/Q)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 사용된 것으로서, 단백질 내의 임의의 천연 잔기를 알라닌으로 치환하는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존적 치환은 본원에 전체가 참고로 포함되는, Gonnet, G.H. 등, 1992, Science 256:1443-1445에 개시된 PAM250 log-가능도 행렬에서 양성 값을 갖는 것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 치환은 중등도의 보존적 치환이며, 여기서 이 치환은 PAM250 로그-가능도 행렬에서 비-음성 값을 갖는다.
대조군 : 본원에 사용된 바와 같이, 결과가 비교되는 표준물질인 "대조군"의 본 기술분야에서 이해되는 의미를 지칭한다. 전형적으로, 대조군은 변수에 대한 결론을 내리기 위해 이러한 변수를 단리하여 실험의 무결성을 높이는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 대조군은 비교인자를 제공하기 위해 테스트 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. "대조군"은 또한 "대조 동물"도 포함한다. "대조 동물"은 본원에 기재된 변형, 본원에 기재된 것과 상이한 변형, 또는 변형이 없는 것(즉, 야생형 동물)일 수 있다. 하나의 실험에서 "테스트" 매개변수(예를 들어, 테스트 중인 변수)가 적용된다. 제2 실험에서, 테스트 중인 변수인 "대조군"이 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대조군은 과거 대조군(즉, 이전에 수행된 테스트 또는 검정의 대조군, 또는 이전에 알려진 양 또는 결과)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 인쇄 기록 또는 달리 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다.
파괴 : 본원에 사용된 바와 같이, DNA 분자(예를 들어, 유전자 또는 유전자 좌와 같은 내인성 상동 서열)와의 상동성 재조합 이벤트의 결과를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 미스센스 돌연변이, 또는 프레임-이동, 또는 이들의 임의의 조합을 달성하거나 나타낼 수 있다. 삽입은 내인성 서열 이외의 다른 기원(예를 들어, 이종 서열)일 수 있는 전체 유전자 또는 유전자 단편, 예를 들어 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물(예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드)의 서열을 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물(예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드)을 절두시키거나 또는 단편화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 생성물을 연장시킬 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 파괴는 융합 폴리펩타이드의 조립을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성이 아닌 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준이 아닌 활성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 활성에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 생성물의 수준 또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않을 수 있다.
결정, 측정, 평가(evaluating), 평가(assessing), 검정 및 분석 : 본원에 임의의 측정 형태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 요소가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 용어는 정량적 및/또는 정성적 결정 둘 모두를 포함한다. 검정은 상대적이거나 절대적일 수 있다. "존재에 대한 검정"은 존재하는 것의 양을 결정하는 것일 수 있고, 및/또는 이것이 존재하는지 또는 아닌지의 여부를 결정하는 것일 수 있다.
내인성 프로모터 : 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어, 야생형 유기체에서, 내인성 유전자와 자연적으로 연관이 있는 프로모터를 지칭한다.
조작된 : 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 사람의 손에 의해 조작된 양상을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 그 순서로 함께 연결되어 있지 않은 2개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 직접 연결되도록 사람 손에 의해 조작될 때 "조작된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 제1 암호 서열과 작동적으로 연관되어 있지만 제2 암호 서열과 작동적으로 연관되어 있지 않은 것으로 발견된 조절 서열이 제2 암호 서열에 작동적으로 연관되도록 사람 손에 의해 연결된 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 자연에서 서로 연결되지 않은 폴리펩타이드 요소 또는 도메인을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산 서열은 단일 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 연결될 수 있다. 이와 비슷하게, 일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 유전자 정보가 변경되도록 조작되었다면(예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전자 물질이 도입되었거나 이전에 존재한 유전자 물질이 변경 또는 제거됨), "조작된(engineered)" 것으로 간주될 수 있다. 통상적인 관행이고 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 세포의 자손은 비록 실제 조작이 이전 실체에 대해 수행되었을지라도, 여전히 "조작된" 것으로 전형적으로 지칭된다. 더욱이, 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 기재된 "조작한(engineering)"이 달성할 수 있는 다양한 방법론이 이용가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 "조작한"은 분석 또는 비교를 수행하기 위해, 또는 그렇지 않다면 서열, 변경 등을 분석, 권장, 및/또는 선택하기 위해, 프로그래밍된 컴퓨터 시스템의 사용을 통한 선택 또는 설계(예를 들어, 핵산 서열, 폴리펩타이드 서열, 세포, 조직 및/또는 유기체의 선택 또는 설계)를 수반할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, "조작한"은 시험관내 화학적 합성 방법론 및/또는 재조합 핵산 기술, 예를 들어 핵산 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 통해) 혼성화, 돌연변이, 형질전환, 형질감염 등, 및/또는 임의의 다양한 제어된 교배 방법론의 사용을 수반할 수 있다. 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 확립된 이러한 기술(예를 들어, 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션 등)을 위한 것)은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 본 명세서에 전반에 걸쳐 인용 및/또는 논의된 다양한 일반적 및 더 구체적인 참고문헌들에 기술되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 및 Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. 및 S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨.
기능적 : 본원에 사용된 바와 같이, 특정 성질(예를 들어, 암호 서열의 일부를 형성함) 및/또는 활성을 나타내는 실체(예를 들어, 유전자 또는 유전자 분절)의 형태 또는 단편을 지칭한다. 예를 들어, 면역글로불린의 정황에서, 가변 영역은 기능적 암호 서열을 형성하기 위해 조립(또는 재조합)되는 고유 유전자 분절(즉, V, D 및/또는 J)에 의해 암호화된다. 게놈에 존재할 때, 유전자 분절은 변이가 발생할지라도, 클러스터로 조직화된다. "기능적" 유전자 분절은 상응하는 게놈 DNA가 단리(즉, 클로닝)되어 서열에 의해 동정되는, 발현된 서열(즉, 가변 영역)에서 나타나는 유전자 분절이다. 일부 면역글로불린 유전자 분절 서열은 오픈 리딩 프레임을 함유하고, 발현된 레퍼토리에서 나타나지는 않지만 기능적인 것으로 간주되는 반면, 다른 면역글로불린 유전자 분절 서열은 돌연변이(예를 들어, 점 돌연변이, 삽입, 결실 등)를 함유하여 정지 코돈 및/또는 후속적으로 돌연변이되지 않은 서열(들)과 연관된 성질/들 및/또는 활성/들을 수행할 수 없게 하는 유전자 분절 서열을 제공하는 절두 서열을 산출한다. 이러한 서열은 발현된 서열에서 나타나지 않아, 유사유전자(pseudogene)로서 분류된다.
유전자 : 본원에 사용된 바와 같이, 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 암호화하는 염색체 내의 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 암호 서열(즉, 특정 생성물을 암호화하는 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 비-암호 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 유전자는 암호(예를 들어, 엑손) 및 비-암호(예를 들어, 인트론) 서열 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는, 예를 들어, 유전자 발현의 하나 이상의 양상(예를 들어, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현 등)을 제어하거나 영향을 미칠 수 있는, 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 명확성을 기하기 위해, 본 발명자들은 본 개시내용에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 일부를 지칭하며; 이 용어는 문맥상 본 기술분야의 기술자에게 명백하듯이, 조절 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 이 정의는 비-단백질 암호 발현 단위에 "유전자"라는 용어의 적용을 배제하기 위한 것이 아니며, 오히려 대부분의 경우 이 문서에 사용된 바와 같이 이 용어가 폴리펩타이드-암호 핵산을 지칭한다는 것을 명확히 하기 위한 것이다.
유전자 변형된 비-인간 동물 또는 유전자 조작된 비-인간 동물 : 본원에 상호교환적으로 사용되며, 비-인간 동물의 하나 이상의 세포가 관심 있는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 이종 핵산 및/또는 유전자를 함유하는, 임의의 비-자연 발생의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "유전자 변형된 비-인간 동물" 또는 "유전자 조작된 비-인간 동물"은 본원에 기재된 바와 같은 전이유전자 또는 전이유전자 작제물을 함유하는 비-인간 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 및/또는 유전자는 미세주입 또는 재조합 바이러스 감염과 같은 의도적인 유전자 조작을 통해 전구체 세포 내로 도입에 의해 간접적으로 또는 세포 내로 직접 도입된다. 유전자 조작이라는 용어는 고전적인 육종 기술을 포함하는 것이 아니라, 오히려 재조합 DNA 분자(들)의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체 내에 통합될 수 있다. "유전자 변형된 비-인간 동물" 또는 "유전자 조작된 비-인간 동물"이라는 문구는 이종 핵산 및/또는 유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 동물, 및/또는 이종 핵산 및/또는 유전자의 단일 카피 또는 다중 카피를 갖는 동물을 지칭한다.
생식계열 구성 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 야생형 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 서열(예를 들어, 유전자 분절)의 배열을 지칭한다. 면역글로불린 유전자 분절의 생식계열 구성의 예는, 예를 들어, LeFranc, M-P., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, May, 23, 2001(본원에서 "LeFranc 2001"로 지칭됨)에서 찾아볼 수 있다:
인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 47쪽에서 찾아볼 수 있음;
인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 61쪽에서 찾아볼 수 있음;
인간 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc 2001의 53쪽에서 찾아볼 수 있음;
마우스 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 Lucas, J. 등, Chapter 1: The Structure and Regulation of Immunoglobulin Loci, Molecular Biology of B Cells, 2nd Edition, Academic Press, 2015(Lucas)에서 찾아볼 수 있음;
마우스 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 LeFranc, M-P 등, Chapter 4: Immunoglobulin Lambda (IGL) Genes of Human and Mouse, Molecular Biology of B Cells, 1st Edition, Academic Press, 2004(LeFranc 2004)에서 찾아볼 수 있음;
마우스 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 마우스 κ 경쇄 불변 영역 유전자의 예시적인 구성은 Christele, M-J, 등, Nomenclature and Overview of the Mouse (Mus musculus and Mus sp.) Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes, Exp Clin Immunogenet 2001, 18:255-279(Christele)에서 찾아볼 수 있음.
LeFranc 2001, Lucas, LeFranc 2004 및 Christele의 인용된 섹션은 각각 본원에 참고로 포함된다.
생식계열 게놈 : 본원에 사용된 바와 같이, 동물의 형성에 사용되는 생식 세포(예를 들어, 생식세포, 예를 들어 정자 또는 난자)에서 발견되는 게놈을 지칭한다. 생식계열 게놈은 동물의 세포에 대한 게놈 DNA의 공급원이다. 따라서, 생식계열 게놈에 변형이 있는 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트)은 이들 세포 전부의 게놈 DNA에 변형이 있는 것으로 간주된다.
생식계열 서열 : 본원에 사용된 바와 같이, 야생형 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 DNA 서열, 또는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트 또는 인간)의 내인성 생식계열 게놈에서 발견되는 DNA 서열에 의해 암호화된 RNA 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린 유전자 분절의 대표적인 생식계열 서열은, 예를 들어, LeFranc 2001에서 찾아볼 수 있다:
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 VH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 VH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 107-234쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 D 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 D 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 98-100쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 JH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 JH 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 104쪽에서 찾아볼 수 있음;
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 Vλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Vλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 350-428쪽에서 찾아볼 수 있음; 및
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 일부 실시양태에서 이용될 수 있는, 인간 Jλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Jλ 유전자 분절의 대표적인 생식계열 아미노산 서열은 LeFranc 2001의 346쪽에서 찾아볼 수 있음.
LeFranc 2001의 인용된 섹션은 각각 본원에 참고로 포함된다.
이종 : 본원에 사용된 바와 같이, 상이한 공급원으로부터의 제제 또는 실체를 지칭한다. 예를 들어, 특정 세포나 유기체에 존재하는 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물과 관련하여 사용될 때, 이 용어는 관련 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물이 1) 사람 손에 의해 조작되었음; 2) 사람 손을 통해(예를 들어, 유전 공학을 통해) 세포 또는 유기체(또는 이의 전구체) 내로 도입되었음; 및/또는 3) 관련 세포 또는 유기체(예를 들어, 관련 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생성되거나 존재하지 않음을 명확히 한다. "이종"은 또한 특정 천연 세포 또는 유기체에 정상적으로 존재하지만, 예를 들어 비-자연적 연관 요소 및 일부 실시양태에서 비-내인성 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 배치 또는 돌연변이에 의해 변경되거나 변형된, 폴리펩타이드, 유전자 또는 유전자 생성물을 포함한다.
숙주 세포 : 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 지칭한다. 본 개시내용을 읽을 때 본 기술분야의 기술자는 이러한 용어가 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 데에도 사용된다는 것을 이해할 것이다. 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 "숙주 세포"라는 문구의 범주에 포함된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이거나 이를 포함한다. 일반적으로, 숙주 세포는 세포가 지정된 생물 계에 상관없이 이종 핵산 또는 단백질을 수용 및/또는 생산하기에 적합한 임의의 세포이다. 예시적인 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)와 같은 세포 융합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이고, 하기 세포로부터 선택된다: 차이니즈 햄스터 난소(CHO)(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60,(예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 전술한 세포에서 유래된 세포주. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
동일성 : 서열 비교와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 본 기술분야에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정된 동일성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 동일성은 10.0의 개방 갭 패널티, 0.1의 확장 갭 패널티를 이용한 ClustalW v.1.83(slow) 정렬, 및 Gonnet 유사성 행렬(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정한다.
대신에 : 본원에서 사용된 바와 같이, 염색체 내의 제2 핵산 서열의 위치에 위치(예를 들어, 제2 핵산 서열이 염색체에서 이전에(예를 들어 원래) 자리했던 위치, 예를 들어, 제2 핵산 서열의 내인성 유전자좌)에 제1 핵산 서열이 자리하는 위치 치환을 지칭한다. "대신에"라는 어구는 제2 핵산 서열이, 예를 들어, 유전자좌 또는 염색체로부터 제거되어야만 하는 것을 필요로 하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열 및 제1 핵산 서열은, 예를 들어, 제1 및 제2 서열이 서로 상동성이고, 상응하는 요소(예를 들어, 단백질 암호 요소, 조절 요소 등)를 함유하고, 및/또는 유사하거나 동일한 서열을 갖는다는 점에서 서로 비슷할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여체 부위, 스플라이스 수용체 부위, 인트론, 엑손, 비해독 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 핵산 서열은 하나 이상의 암호 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열의 상동체 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 서열의 이종상동체 또는 상동체이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 제1 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 랫트 서열)이거나 이를 포함한다. 제1 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 인간 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 제2 서열의 변이체 또는 돌연변이체(즉, 제2 서열과 비교하여 하나 이상의 서열 차이, 예를 들어, 치환을 함유하는 서열)이다. 그와 같이 배치된 핵산 서열은 그와 같이 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비해독 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 내인성 서열의 발현 없이, 그와 같이 배치된 핵산 서열(이종 서열 포함)로부터 유전자 생성물의 생산을 초래하는 이종 서열에 의한 내인성 서열의 치환이며; 제1 핵산 서열은 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 의한 내인성 게놈 서열의 치환이다(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화하고, DNA 단편은 전적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화함). 다양한 실시양태에서, 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편은 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 단편을 대신한다.
시험관내 : 본원에 사용된 바와 같이, 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경, 예를 들어 테스트 튜브 또는 반응 용기 내에서, 세포 배양물 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
생체내 : 본원에 사용된 바와 같이, 인간 및/또는 비-인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포-기반 시스템의 정황에서, 이 용어는 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 시험관내 시스템과 반대되는 것임).
단리된 : 본원에 사용된 바와 같이, (1) 처음 생산되었을 때(자연 및/또는 실험 환경 여부에 상관없이) 연관된 구성요소의 적어도 일부로부터 분리되고, 및/또는 (2) 사람 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 처음 연관되었던 다른 구성요소의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 10% 내지 100%, 15%-100%, 20%-100%, 25%-100%, 30%-100%, 35%-100%, 40%-100%, 45%-100%, 50%-100%, 55%-100%, 60%-100%, 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%, 96%-100%, 97%-100%, 98%-100% 또는 99%-100%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 10% 내지 100%, 10%-99%, 10%-98%, 10%-97%, 10%-96%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 10%-20% 또는 10%-15%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 처음에 연관되었던 다른 구성요소의 11% 내지 99%, 12%-98%, 13%-97%, 14%-96%, 15%-95%, 20%-90%, 25%-85%, 30%-80%, 35%-75%, 40%-70%, 45%-65%, 50%-60% 또는 55%-60%로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 80%-99%, 85%-99%, 90%-99%, 95%-99%, 96%-99%, 97%-99%, 또는 98%-99% 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 80%-99%, 80%-98%, 80%-97%, 80%-96%, 80%-95%, 80%-90%, 또는 80%-85% 순수하다. 일부 실시양태에서, 단리된 제제는 85%-98%, 90%-97%, 또는 95%-96% 순수하다. 일부 실시양태에서, 물질은 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우, "순수"하다. 일부 실시양태에서, 본 기술분야의 기술자가 이해하는 바와 같이, 물질은, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 구성요소와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 이러한 실시양태에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 그러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산한다. 오직 한 가지 예를 들자면, 일부 실시양태에서, 자연에서 발생하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 생물학적 중합체는 다음과 같은 경우 "단리된" 것으로 간주된다; a) 사실상 자연 상태에서 동반되는 일부 또는 모든 구성요소와 기원 또는 유래하는 공급원 면에서 연관이 없는 경우; b) 자연에서 생산하는 종과 동일한 종의 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; 또는 c) 자연에서 생산하는 종의 것이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템의 구성요소에 의해 발현되거나 달리 연관이 있는 경우. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성되거나 자연에서 생산하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩타이드는 "단리된" 폴리펩타이드인 것으로 간주된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 정제 기술로 처리된 폴리펩타이드는 다른 구성요소, 즉 a) 자연에서 연관이 있는 구성요소; 및/또는 b) 처음 생산될 때 연관되었던 구성요소로부터 분리된 정도이면, "단리된" 폴리펩타이드인 것으로 간주될 수 있다.
유전자좌 또는 유전자좌들 : 본원에 사용된 바와 같이, 유전자, DNA 서열, 폴리펩타이드-암호화 서열의 위치(들), 또는 유기체 게놈의 염색체 상의 위치를 지칭한다. 예를 들어, "면역글로불린 유전자좌"는 면역글로불린 유전자 분절(예를 들어, V, D, J 또는 C), 면역글로불린 유전자 분절 DNA 서열, 면역글로불린 유전자 분절-암호화 서열의 위치, 또는 이러한 서열이 존재하는 곳에 관해 식별되었던 유기체 게놈의 염색체 상의 면역글로불린 유전자 분절 위치를 지칭할 수 있다. "면역글로불린 유전자좌"는 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 조절 서열 또는 영역, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 면역글로불린 유전자 분절의 조절 요소를 포함할 수 있다. "면역글로불린 유전자좌"는 유전자간 DNA, 예를 들어 야생형 유전자좌의 유전자 분절 간에 보통 존재하거나 나타나는 DNA를 포함할 수 있다. 본 기술분야의 숙련된 기술자는 염색체가, 일부 실시양태에 따르면, 수백 또는 심지어 수천개의 유전자를 함유할 수 있고 다른 종을 서로 비교하는 경우 유사한 유전자적 유전자좌의 물리적 공동국재화를 입증할 수 있음을 알고 있을 것이다. 그러한 유전자적 유전자좌는 공유 신터니(synteny)를 갖는 것으로서 기술될 수 있다.
자연적으로 나타나는 : 생물학적 요소(예를 들어, 핵산 서열)와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 유기체(예를 들어, 동물)에서 조작(예를 들어, 유전자 조작) 없이 특정 정황 및/또는 위치에서 생물학적 요소가 발견될 수 있음을 의미한다. 즉, 특정 정황 및/또는 위치에서 자연적으로 나타나는 서열은 조작(예를 들어, 유전자 조작)의 결과로서 특정 정황 및/또는 위치에 존재하지 않는다. 예를 들어, 내인성 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌에서 인간 Jκ1 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 서열은 인간에서 유전자 조작 없이 내인성 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌 중 인간 Jκ1 유전자 분절의 인접에서 발견될 수 있는 서열이다. 일부 실시양태에서, 서열은 세포 또는 유기체에서 자연적으로 나타나는 곳으로부터 수득, 유도 및/또는 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 유기체는 세포 또는 유기체에서 자연적으로 나타나는 서열의 직접적인 공급원이 아니다. 예를 들어, 세포 또는 유기체에서 상응하는 서열은 식별된 다음, 본 기술분야에 공지된 메커니즘에 의해 생산 또는 복제될 수 있다.
비-인간 동물 : 본원에 사용된 바와 같이, 인간이 아닌 임의의 척추동물 유기체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 원구류, 경골어류, 연골어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물 및 조류이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 또는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
핵산 : 본원에 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 사슬에 혼입되어 있거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오타이드 사슬에 혼입되어 있거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오사이드)를 지칭하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA이거나 RNA를 포함하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 사용하지 않는다는 점에서 "핵산"과 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, "핵산"은 본 기술분야에 공지되어 있고 백본에 포스포디에스테르 결합 대신 펩타이드 결합을 갖는 하나 이상의 "펩타이드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, "핵산"은 포스포디에스테르 결합보다 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포아미다이트 연결을 갖는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 천연 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나 이를 포함하거나, 이것으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 천연 핵산에 있는 당과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 또는 폴리펩타이드와 같은 기능적 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 하나 이상의 엑손을 포함한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형에 기초한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 생식, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 적어도, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 이상의 잔기 길이이지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 단일 가닥이고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보체이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 효소적 활성을 갖는다.
작동가능하게 연결된 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 기술된 구성요소가 의도된 방식(예를 들어, 구성요소가 적절한 조직, 세포 유형, 세포 활성 등에 존재하는 경우)으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 구성요소의 병치를 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 VH 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 JH 유전자 분절은 이 VH, D 및 JH 유전자 분절이 B 세포 발달의 적절한 시기에 중쇄 불변 영역에 스플라이싱될 수 있다면, 중쇄 불변 영역에 "작동가능하게 연결된" 것이며, 이는 이러한 스플라이싱이, 예를 들어, 면역계 외부의 세포(예를 들어, 생식 세포)에서 발생하는지 여부와 상관이 없다. 암호 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 암호 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 근접한 발현 제어 서열 및 관심 유전자(또는 관심 서열)를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 제어 서열 둘 모두를 포함한다. "발현 제어 서열"이라는 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열이 결찰된 암호 서열의 발현 및 처리에 영향을 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. "발현 제어 서열"은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작 콘센서스(Kozak consensus) 서열); 폴리펩타이드 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 폴리펩타이드 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 본성은 숙주 유기체에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물에서 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하는 반면, 진핵생물에서 전형적으로 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 존재가 발현 및 처리에 본질적인 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 서로 별도로 발생하는 부분(즉, 2 이상의 상이한 유기체, 예를 들어 인간 및 비-인간 부분 유래)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 사람 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연에서 발생하지 않는 서열(예를 들어, 상기 폴리펩타이드를 암호화하기 위해 사람 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 서열)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다.
재배열된 : 본원에 사용된 바와 같이, 접합된 유전자 분절이 함께 면역글로불린의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 갖도록 함께 접합된(직접적으로 또는 간접적으로) 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 DNA 서열을 기술한다. 재배열된 DNA 서열의 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절은 기능성 재조합 신호 서열(Recombination Signal Sequence, RSS)와 더 이상 연관되지 않으며, 따라서 추가 재배열을 겪을 수 없다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 DNA 서열의 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절은 더 이상 재배열할 없지만, 이것이 동일한 유전자좌 내의 다른 면역글로불린 유전자 분절이, 예를 들어, 2차 재배열을 겪을 수 없다는 것을 의미하지는 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 유전자 분절(예를 들어, 재배열된 면역글로불린 가변 영역에서)이 천연 VDJ 재조합 과정을 통해 함께 접합될 수 있음을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 또한 재배열된 유전자 분절(예를 들어, 재배열된 면역글로불린 가변 영역에서)이, 예를 들어 표준 재조합 기술을 사용하여 유전자 분절을 접합시킴으로써 함께 접합되도록 조작될 수 있음을 인식할 것이다. 재배열된 면역글로불린 가변 영역은 전형적으로 2개 이상의 접합된 면역글로불린 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 재배열된 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Jλ 유전자 분절과 접합된 Vλ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 접합되는 VH 유전자 분절, D 유전자 분절, JH 유전자 분절을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 또한 모든 또는 실질적으로 모든 유전자간 서열이 일반적으로 재배열된 면역글로불린 가변 영역의 면역글로불린 유전자 분절 사이에서 제거된다는 것을 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 재배열된 서열이 무엇보다도 유전자 분절에 인트론을 포함할 수 있음을 추가로 인식할 것이다.
재조합체 : 본원에 사용된 바와 같이, 다중 공급원(예를 들어, 유기체, 조직, 세포, 게놈 또는 게놈의 일부) 유래의 유전자 물질을 합치기 위해 유전자 재조합의 실험실 방법(예를 들어, 클로닝)에 의해 형성된 분자(예를 들어, DNA, RNA 또는 폴리펩타이드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성 또는 단리되며, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩타이드, 재조합, 조합성 인간 폴리펩타이드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩타이드(Hoogenboom, H.R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, H. 및 W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J.V. 및 J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H., 및 P. Chames, 2000, Immunol.Today 21:371-8, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨), 인간 면역글로불린 유전자를 포함하도록 유전자 조작된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L.D. 등, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann, S-A. 및 L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. 등, 2000, Immunol.Today 21:364-70; Osborn, M.J. 등, 2013; J. Immunol.190:1481-90; Lee, E-C. 등, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. 등, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. 등, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 또는 선택된 서열 요소를 서로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인실리코(in silico)에서 설계된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어 천연 또는 합성(예를 들어, 인공) 공급원으로부터의 공지된 서열 요소의 돌연변이유발(예를 들어, 생체내 또는 시험관내)로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 관심있는 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 게놈에서 발견되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩타이드는 돌연변이유발(예를 들어, 시험관내 또는 생체내, 예를 들어, 비-인간 동물에서)에서 유래되는 아미노산 서열을 가져, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 폴리펩타이드 서열에서 기원하고 관련이 있지만, 생체내 비-인간 동물의 게놈 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
기준 : 본원에 사용된 바와 같이, 관심 있는 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 비교되는 기준 또는 대조 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 있는 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값의 테스트 또는 결정과 실질적으로 동시에 테스트 및/또는 결정된다. 일부 실시양태에서, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 선택적으로 실재하는 매체에서 구현된, 과거의 기준이다. 일부 실시양태에서, 기준은 대조군을 지칭할 수 있다. "기준"은 "기준 동물"도 포함한다. "기준 동물"은 본원에 기재된 변형, 본원에 기재된 것과 상이한 변형을 갖거나, 또는 변형이 없을 수 있다(즉, 야생형 동물). 전형적으로, 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 기준 제제, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 제제, 동물(예를 들어, 포유동물), 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 결정하거나 특성화하는데 이용된 것과 비슷한 조건 하에 결정되거나 특성화된다.
대체 : 본원에 사용된 바와 같이, 숙주 유전자좌(예를 들어, 게놈)에서 발견되는 "대체된" 핵산 서열(예를 들어, 유전자)이 그 유전자좌로부터 제거되고, 그 위치에 상이한 "대체" 핵산이 자리하는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열 및 대체 핵산 서열은, 예를 들어, 이들이 서로 상동성이고, 상응하는 요소(예를 들어, 단백질-암호 요소, 조절 요소 등)를 함유하고, 및/또는 유사하거나 동일한 서열을 갖는다는 점에서 서로 비슷하다. 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이스 공여체 부위, 스플라이스 수용체 부위, 인트론, 엑손, 비해독 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함하고; 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 하나 이상의 암호 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 핵산 서열의 상동체 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이체)이다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 이종상동체 또는 상동체이다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 랫트 서열)이거나 이를 포함한다. 대체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 경우를 포함하는 일부 실시양태에서, 대체된 핵산 서열은 인간 서열이거나 인간 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵산 서열은 대체된 서열의 변이체 또는 돌연변이체(즉, 예를 들어, 대체된 서열과 비교하여 하나 이상의 서열 차이, 치환을 함유하는 서열)이다. 그와 같이 배치된 핵산 서열은 그와 같이 배치된 서열을 얻기 위해 사용된 공급원 핵산 서열의 일부인 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-비해독 영역 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 대체는 그와 같이 배치된 핵산 서열(이종 서열 포함)로부터의 유전자 생성물의 생산을 초래하지만 내인성 서열은 발현시키지 않는 이종 서열에 의한 내인성 서열의 치환이고; 치환은 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 의한 내인성 게놈 서열의 치환(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화하고, DNA 단편은 전적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 인간 가변 영역 폴리펩타이드를 암호화함)이다. 다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편은 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 이의 단편으로 대체된다.
실질적으로 : 본원에 사용된 바와 같이, 관심 있는 특성 또는 성질의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 있다하더라도, 거의 완료되지 않고 및/또는 완전하게 진행되지 않거나, 절대적인 결과를 달성하거나 피하지 못한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전함의 잠재적인 부족을 포착하기 위해 본원에 사용된다.
실질적인 유사성 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열은 상응하는 위치에 유사한 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 함유하는 경우, 일반적으로 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 본 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 유사한 잔기는 동일한 잔기일 수 있지만(또한, 이하의 실질적인 동일성 참조), 유사한 잔기는 또한 구조적 및/또는 기능적 특성이 대략 비슷한 비-동일성 잔기일 수 있다. 예를 들어, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로서 분류된다. 동일한 유형의 다른 아미노산 대신에 한 아미노산의 치환은 종종 "보존적" 치환으로 간주될 수 있다. 전형적인 아미노산 분류는 이하 표에 요약된다.
본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열에 대한 BLASTN, 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는, 전체가 본원에 참고로 포함되는, Altschul, S.F. 등, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. 등, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. 등, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. 및 B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 등 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 유사한 서열을 식별하는 것 외에도, 위에서 언급한 프로그램은 전형적으로 유사성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 서열은 이들의 상응하는 잔기의 적어도, 예를 들어, 비제한적으로, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 적절한 스트레치에 걸쳐 유사(예를 들어, 동일하거나 보존적 치환을 포함)하다면, 실질적으로 유사한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열(예를 들어, 유전자의 서열, 유전자 분절, 도메인을 암호화하는 서열, 폴리펩타이드 또는 도메인)이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 잔기이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열을 따라 근접한 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적절한 스트레치는 완전한 서열을 따른 불연속 잔기, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 폴딩된 입체형태에 의해 합쳐진 비근접 잔기를 포함한다.
실질적인 동일성 : 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 본 기술분야의 일상적인 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 2개의 서열은 상응하는 위치에 동일한 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 함유하는 경우, 일반적으로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열에 대한 BLASTN, 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용가능한 것을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는, 전체가 본원에 참고로 포함되는, Altschul, S.F. 등, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. 등, 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. 등, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. 및 B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 등 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 동일한 서열을 식별하는 것 외에도, 위에서 언급한 프로그램은 전형적으로 동일성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 서열은 이들의 상응하는 잔기의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 적절한 스트레치에 걸쳐 동일하다면, 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 잔기의 적절한 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시양태에서, 잔기의 적절한 스트레치는, 예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이나, 이에 제한되지는 않는다.
표적화 작제물 또는 표적화 벡터 : 본원에 사용된 바와 같이, 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다. 표적화 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고 상동성 재조합을 통해 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내의 위치로 표적화 작제물의 통합을 제공한다. 부위-특이적 재조합효소 인식 부위(예를 들어, loxP 또는 Frt 부위)를 사용하여 표적화하는 표적화 영역이 또한 본원에 포함되고 기술된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 특정 관심이 있는 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능한 마커, 제어 서열 및/또는 조절 서열, 및 이러한 서열을 수반하는 재조합에 도움을 주거나 용이하게 하는 단백질의 외인적 첨가를 통해 매개되는 재조합을 허용하는 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 전적으로 또는 부분적으로 관심 유전자를 추가로 포함하고, 여기서 관심 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 이종 유전자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 작제물은 관심 있는 인간화 유전자가 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 관심 있는 인간화 유전자를 전적으로 또는 부분적으로 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 작제물(또는 표적화 벡터)은 사람 손에 의해 조작된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적화 작제물(또는 표적화 벡터)은 자연에서는 그 순서로 함께 연결되지 않지만, 조작된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드에서는 사람 손에 의해 서로 직접 연결되도록 조작된 2개 이상의 서열을 함유하는 조작된 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하도록 작제될 수 있다.
전이유전자 또는 전이유전자 작제물 : 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 방법과 같은 사람 손에 의해 세포 내로 도입된 핵산 서열(예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 전적으로 또는 부분적으로 암호화함)을 지칭한다. 전이유전자는 이것이 도입되는 유전자 조작된 동물 또는 세포에 대해 부분적으로 또는 전적으로 이종성, 즉 외래성일 수 있다. 전이유전자는 선택된 핵산 서열의 발현에 필수적일 수 있는, 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 다른 핵산, 예컨대, 인트론 또는 프로모터를 포함할 수 있다.
재배열되지 않은 : 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 이벤트를 겪지 않았거나 달리 접합되어, 사이에 유전자간 서열(들)을 포함하는 2개 이상의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 DNA 서열을 기술한다. 본 기술분야의 기술자는 재배열되지 않은 V 유전자 분절 및 J 유전자 분절이 온전한 재조합 신호 서열(RSS)과 연관될 수 있음을 이해할 것이다. 재배열되지 않은 D 유전자 분절은 2개의 온전한 재조합 신호 서열(RSS)의 측면에 있을 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 재배열되지 않은 유전자 분절이 무엇보다도 인트론을 포함할 수 있음을 또한 인식할 것이다.
벡터 : 본원에 사용된 바와 같이, 연관되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 진핵 및/또는 원핵 세포와 같은 숙주 세포에서 연결되어 있는 핵산의 염색체외 복제 및/또는 발현을 할 수 있다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
야생형 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, "정상"(돌연변이체, 질병에 걸린, 변경된, 조작된 등과 대조됨) 상태 또는 정황의 자연에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 갖는 실체를 지칭한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 야생형 유전자 및 폴리펩타이드가 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다는 것을 인식할 것이다.
상세한 설명
본 개시내용은 면역글로불린 사슬 쌍형성(pairing) 및 친화도 성숙을 비롯한, 비-인간 동물에서의 내인성 항체 발달 메커니즘이 외인성 인간 면역글로불린 서열을 포함하는 항원-특이적, 고친화성 항체를 생성하는데 이용될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 이러한 동물은, 예를 들어, 인간 항체 치료제를 만드는 데 사용될 수 있는 정상적이고 강력한 면역 반응을 생성할 수 있다. 본 개시내용은 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 도메인을 포함하는 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성하기에 효과적이고 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 인식한다. 본 개시내용은 또한 유전자 변형된 비-인간 동물이 친화도-성숙된 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위해 인간 중쇄, κ 경쇄 및 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 성공적으로 이용할 수 있음을 추가로 인식한다.
본 개시내용은 비-인간 동물에서 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한 항체의 생산이, 특정 비-인간 동물에서 λ 경쇄의 발현이 낮기 때문에 이미 문제가 있었음을 인식한다. 예를 들어, 마우스는 κ 경쇄를 λ 경쇄보다 훨씬 더 많이 이용한다(즉, 약 95:5의 κ:λ 비율). 본 개시내용은 또한 비-인간 동물의 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 제한함에 의한 보편적인 경쇄(예를 들어, 복수의 중쇄에 결합할 수 있는 경쇄)를 포함하는 항체의 생산이, 고친화성 항체 생성을 위한 가장 강력한 다양성-생성 메커니즘의 일부, 예를 들어, 조합적 다양성, 이음부 다양성 및 2차 재배열을 제거하기 때문에 문제가 될 수 있음을 인식한다. 또한, "혼합 및 정합" 중쇄 및 경쇄 쌍형성에서 달리 유도될 수 있는 다양성-생성 효과를 상당히 최소화한다. 이러한 인식에 비추어 볼 때, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역으로부터 비-인간 동물에서 인간 λ 경쇄 가변 영역을 생산하기 위한 플랫폼 및 방법은 본 기술분야에서 여전히 요구되고 있다.
본 개시내용은 κ 경쇄 유전자좌에서 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 고친화도, 항원-특이적 항체를 효과적으로 생성할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 이러한 결과는 비-인간 동물에서의 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리가 비-인간 동물로 하여금 λ 경쇄 가변 영역 서열을 이용하도록 하기 때문에 예상치 못한 것이다. λ 경쇄 가변 영역 서열의 사용은 특정 비-인간 동물의 자연적인 선호와 상반되는 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, 비-인간 동물에서 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 사용은 또한 고친화성, 항원 특이적 항체를 생성하는데 사용되는 많은 자연적 메커니즘을 제거한다.
본 개시내용은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제공하며, 여기서 비-인간 동물은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(1개 또는 2 개의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함함)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 제공하며, 여기서 비-인간 동물은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 레퍼토리, 및 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 레퍼토리와 연관이 있는, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 발현된, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위한 생물학적 시스템이 또한 제공된다. 인간 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체, 중쇄, 경쇄(예를 들어, λ 경쇄), 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인(예를 들어, λ 경쇄 가변 도메인), 단일 사슬 가변 단편(ScFv))을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 비-인간 동물을 관심 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 항원 결합 단백질(예를 들어, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질)에 이용하는 것을 포함한다. 방법은 다중-특이적 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용하기에 적합한 인간 면역글로불린 중쇄 및/또는 λ 경쇄 가변 도메인을 제조하는 방법을 포함한다.
인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 제한적 레퍼토리로부터 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 제한적 레퍼토리를 발현하는, 유전자 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열(Vλ/Jλ 서열)을 포함하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단지 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 단지 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 유전자 조작된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 4개 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 발현된 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 이러한 비-인간 동물에 의해 발현된 다수의 친화도-성숙된 인간 중쇄와 쌍을 이룰 수 있으며, 여기서 다수의 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래된 적합한 친화도-성숙된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 발현 및 선택하고, 여기서 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인은 비-인간 동물의 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 유래된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 연관되고 함께 발현된다. 본 개시내용은 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 인간 중쇄 가변 도메인(암호화 인간 λ 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역과 함께)이 다중-특이적 항체, 특히 이중특이적 항체의 생산에 이용될 수 있다는 통찰력을 제공한다.
비-인간 동물의 항체 레퍼토리
면역글로불린(항체라고도 함)은 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아 등)를 중화하기 위해 숙주 면역계의 B 세포에 의해 생성되는 큰(~150 kD) Y형 당단백질이다. 각 면역글로불린(Ig)은 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 구성되며, 각각은 가변 도메인과 불변 도메인인 2가지 구조적 구성요소를 갖는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생성된 항체에서 상이하지만, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생성된 모든 항체에서는 동일하다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 함께 항원 결합 영역(또는 항원 결합 부위)을 포함한다. 면역글로불린은 이들이 함유하는 중쇄 불변 영역(또는 도메인)을 기반으로 하는 아이소타입(isotype) 또는 클래스로 지칭되는 다양한 변종으로 존재할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 동일한 아이소타입의 모든 항체에서 동일하지만, 상이한 아이소타입의 항체에서는 상이하다. 이하의 표는 마우스 및 인간에 있는 9개의 항체 아이소타입을 요약한 것이다.
다른 종에서 또 다른 아이소타입이 식별되었다. 아이소타입은 상이한 아이소타입 간에 상이한 구조적 특성으로 인해 항체에 특화된 생물학적 성질을 부여하며 동물 신체 내의 상이한 위치(세포, 조직 등)에서 발견된다. 처음, B 세포는 동일한 항원 결합 영역을 갖는 IgM 및 IgD를 생성한다. 활성화 시, B 세포는 클래스 전환이라고 하는 과정에 의해 상이한 아이소타입으로 전환되고, 이 과정은 B 세포에 의해 생산된 항체의 불변 영역의 변화를 수반하는 반면, 가변 영역은 동일하게 유지하여, 초기 항체(B 세포)의 항원 특이성을 보존한다.
2개의 별도의 유전자좌(Igκ 및 Igλ)는 재배열 시 항체의 경쇄를 암호화하고 대립유전자 배제 및 아이소타입 배제 둘 모두를 나타내는 유전자 분절을 함유한다. κ+ 대 λ+ B 세포의 발현 비율은 종마다 다르다. 예를 들어, 인간은 약 60:40(κ:λ)의 비율을 입증한다. 마우스 및 랫트에서는 95:5(κ:λ)의 비율이 관찰된다. 흥미롭게도, 고양이에서 관찰된 κ:λ 비율(5:95)은 마우스 및 랫트와 정반대이다. 이러한 관찰된 비율 배후에 가능한 이유를 해명하기 위해 여러 연구가 수행되었으며, 유전자좌의 복잡성(즉, 유전자 분절, 특히 V 유전자 분절의 수) 및 유전자 분절 재배열의 효율 둘 모두가 합당한 근거로서 제안되었다. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 1,000kb 초과로 확장되며, 3개의 클러스터로 조직된 대략 70개의 Vλ 유전자 분절(29 내지 33개 기능성)과 7개의 Jλ-Cλ 유전자 분절 쌍(4 내지 5개 기능성)을 포함한다(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제9,006,511호의 도 1 참조). 발현된 항체 레퍼토리에서 관찰된 Vλ 영역의 대부분은 가장 근접한 클러스터(클러스터 A로 지칭됨) 내에 함유된 유전자 분절에 의해 암호화된다. 마우스 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 인간 유전자좌와 현저하게 다르며, 계통에 따라 2개의 별개의 유전자 클러스터로 조직된 소수의 Vλ 및 Jλ 유전자 분절만을 함유한다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호의 도 2 참조, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
다양한 인간 질병을 치료하기 위한 치료 항체의 개발은 인간 면역글로불린 유전자에 상응하는 게놈에 다양한 양의 유전자 물질을 수용하는 조작된 비-인간 동물 계통, 특히 조작된 설치류 계통의 생성에 주로 집중되어 있다(예를 들어, Bruggemann, M. 등, 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:101-8에서 검토됨, 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 유전자 조작된 설치류 계통을 생성하는데 있어서 초기 노력은 자체적으로 유전자 분절의 재조합 및 내인성 면역글로불린 유전자좌를 불활성화시키면서 전적으로 인간인 중쇄 및/또는 경쇄의 생산을 지원할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부의 통합에 초점을 맞추었다(예를 들어, Bruggemann, M. 등, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:67-09-13; Bruggemann, M. 등, 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6; Taylor, L.D. 등, 1992, Nucl.Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. 등, 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. 등, 1994, Nat. Genet 7:13-21; Lonberg, N. 등, 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. 등, 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. 등, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. 등, 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Wagner, S.D. 등, 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. 등, 1997, Nat Genet. 15:146-56; Green, L.L. 등, 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. 등, 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. 등, 2000, Immunol. Today 21:364-70; Kellermann, S.A. 및 L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7 참조, 각각 그 전체가 참고로 포함됨). 특히, 일부 노력은 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열의 통합을 포함했다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 및 2011/0236378 A1; 미국 특허 제6,998,514호 및 제7,435,871호; Nicholson, I.C. 등, 1999, J. Immunol. 163:6898-906; Popov, A.V. 등, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 노력은 인간 Vλ, Jλ, Cλ 서열을 함유하는 효모 인공 염색체를 무작위 통합하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄(즉, 인간 Vλ 및 Cλ 도메인)를 완전하게 발현하는 마우스 계통을 생성하는데 초점을 맞추었다. 보다 최근의 노력은 인간 Vλ, Jλ, 및 Cλ 서열도 함유하는 작제물을 사용하는 유사한 전략을 이용했다(Osborn, M.J. 등, 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. 등, 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
또 다른 노력은 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절이 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되도록, 내인성 설치류 면역글로불린 경쇄 유전자좌(κ 및 λ)에 상기 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 특정 삽입을 포함했다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 이러한 동물의 일부 실시양태에서, 클러스터 A 및 B로부터의 모든 인간 Vλ 유전자 분절 및 1개 또는 4개의 인간 Jλ 유전자 분절이 내인성 면역글로불린 κ 및 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 삽입되었다. 몇몇 상이한 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 설치류 항체 레퍼토리에서 발현되는 기능적 경쇄를 형성하기 위해 조작된 설치류 면역글로불린 경쇄 유전자좌 둘 모두에서의 적절한 재배열을 입증하였고, 여기서 경쇄는 내인성 Cκ 및 Cλ 영역의 정황에서 인간 Vλ 도메인을 포함하였다(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제9,006,511호의 표 7 및 도 11-13 참조). 특히, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 수용하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 마우스는 비장 구획에서 약 1:1의 인간 람다 대 내인성 람다 비율(IgCκ 대 IgCλ 비율로 측정)을 입증했다(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호의 표 4 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 실제로, 조작된 마우스 계통(즉, 조작된 면역글로불린 κ 또는 조작된 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌)은 일반적으로 경쇄 발현에 큰 편향(상기 참조)을 나타내는 설치류의 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 인간 Vλ 도메인이 발현될 수 있음을 입증했다. 본 개시내용은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현을 최대화하기 위해, 교호 조작된 면역글로불린 경쇄 유전자좌 구조가 생성될 수 있다는 인식을 제공한다. 이러한 교호 조작된 면역글로불린 경쇄 유전자좌 구조는 이들의 설계에서 유래하는 고유의 항체 레퍼토리의 역량을 제공한다.
본 개시내용은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 생식계열 게놈이 함유하는 비-인간 동물을 제공한다. 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 또는 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 경쇄의 발현은 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 삽입함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역의 발현이 불활성화(예를 들어, 유전자 결실에 의해)되도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역의 발현이 불활성화(예를 들어, 삽입, 대체 또는 치환에 의해)되도록 조작된다.
보편적 경쇄
유용한 다중특이적 항원-결합 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체를 만들기 위한 이전의 노력은 공통 패러다임, 즉 합리적으로 조작하거나, 또는 이종이량체 이중특이적 인간 면역글로불린의 쌍형성을 위한 적합한 형식인 시행착오(trial-and-error)를 통해 조작하는 서열의 시험관내 선택 또는 조작을 흔히 공유하는 다양한 문제들에 의해 방해를 받았다. 불행히도, 시험관내 조작 접근법의 전부는 아니지만 대부분은 적어도 개별 분자에 적합한 즉석 해결책을 주로 제공한다.
인간 치료제로 이어질 수 있는 적절한 쌍형성을 선택하기 위해 복잡한 유기체를 이용하는 생체내 방법이 개발되었다(예를 들어, 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제10,143,186호 참조). 그러나, 이전의 비-인간 동물에서는 충분한 역가 수준으로 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 갖는 고친화도 보편적 λ 경쇄의 생산을 포함하는 강력한 면역 반응을 생성할 수 있는 것이 생산되지 않았다. 일반적으로, 천연 비-인간 서열은 흔히 인간 치료 서열에 좋은 공급원이 아니다. 적어도 이러한 이유로, 보편적 인간 경쇄와 쌍을 이루는 비-인간 중쇄 면역글로불린 가변 도메인을 생성하는 것이 제한적인 실용적 유용성이 있다. 공통 인간 경쇄와 커플링하는 능력 및 에피토프 특이성과 친화도를 유지하기를 희망하면서, 비-인간 중쇄 가변 서열을 인간화하기 위한 시도로 시행착오 과정에서 더 많은 시험관내 조작 노력이 불확실한 결과와 함께 쏟아질 것이다. 이러한 과정 마지막에 최종 생성물은 약간의 특이성과 친화도를 유지하고 보편적 경쇄와 연관될 수 있지만, 궁극적으로 인간에서의 면역원성은 심각한 위험으로 남을 가능성이 있다.
따라서, 인간 치료제를 만들기에 적합한 비-인간 동물은 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 대신에 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 적절하게 큰 레퍼토리를 포함할 것이다. 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 역 키메라 중쇄(즉, 인간 가변 도메인 및 비-인간 불변 도메인을 포함하는 중쇄)를 형성하기 위해 재배열하여 내인성 비-인간 중쇄 불변 영역에 스플라이싱할 수 있어야 한다. 인간 λ 경쇄 가변 영역의 제한적 레퍼토리에 의해 암호화된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 연관이 있을 수 있는 것을 선택하기 위해, 중쇄 가변 도메인의 적절하게 큰 레퍼토리가 비-인간 동물에서 이용가능하도록, 중쇄 유전자좌는 클래스 전환 및 체세포 과돌연변이를 겪을 수 있어야 한다.
복수의 중쇄에 대해 보편적 경쇄를 선택하는 비-인간 동물은 실용적인 유용성이 있다. 다양한 실시양태에서, 보편적인 경쇄만을 발현할 수 있는 비-인간 동물에서 발현하는 항체는 동일하거나 실질적으로 동일한 경쇄와 연관되어 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 이중특이적 항체를 만드는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 이러한 비-인간 동물은 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하도록 제1 면역원에 의해 면역화될 수 있다. 비-인간 동물(또는 이의 중쇄 및 λ 경쇄 유전자좌에 동일한 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물)은 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하도록 제2 면역원에 의해 면역화될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클로닝되어 동일한 중쇄 불변 영역 및 동일한 경쇄와 함께 발현될 수 있으며, 세포에서 발현되어 이중특이적 항체의 경쇄 구성요소가 이 경쇄 구성요소와 연관되어 함께 발현하도록 비-인간 동물에 의해 선택된 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 보편적 κ 경쇄를 발현하는 비-인간 동물은 개발되어 있다(예를 들어, 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제10,143,186호 참조). 그러나, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 보편적 λ 경쇄를 발현할 수 있는 비-인간 동물의 개발은 여전히 필요하다.
본 개시내용은 가변 영역이 생식계열 서열이 아닌, 예를 들어 친화도 성숙된 또는 체세포 과돌연변이된 가변 영역인 중쇄를 포함하는, 다소 다양한 패밀리의 중쇄와 적절히 쌍을 이룰 면역글로불린 λ 경쇄를 생성하기 위한 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 λ 경쇄 가변 도메인을, 체세포 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 가변 도메인과 함께 발현하고 쌍을 이루도록 조작되어, 인간 치료제로서 사용하기에 적합한 고친화도 결합 단백질(예를 들어, 항체)로 갈 수 있게 한다.
본원에 기재된 바와 같은 유전작 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 유기체 내에서 길고 복잡한 항체 선택 과정을 통해, 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 집합체가 제한된 수의 경쇄 옵션과 쌍을 형성하는데 있어서 생물학적으로 적절한 선택을 할 수 있게 한다. 이를 달성하기 위해, 비-인간 동물은 광범위한 인간 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 인간 λ 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 조작된다. 면역원을 이용한 공격 시에, 본원에 기재된 비-인간 동물은 레퍼토리 중 경쇄 옵션 또는 수에 의해 주로 또는 유일하게 제한되는 면역원에 대한 항체를 개발하기 위해, 그 레퍼토리에서 해결책의 수를 최대화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이것은 비-인간 동물이 특히 체세포 과돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 비교적 큰 다양성의 인간 중쇄 가변 도메인과 양립할 수 있을 뿐만 아니라 경쇄 가변 도메인의 적합하고 양립가능한 체세포 돌연변이를 달성할 수 있도록 하는 것을 포함한다.
인간 λ 경쇄 옵션의 제한적 레퍼토리를 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 천연의 비-인간 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력을 비기능적 또는 실질적으로 비기능적이 되도록 조작할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는, 예를 들어, 비-인간 동물의 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 결실시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 유전자좌는 내인성 비-인간 경쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된 최상의 적합한 외인성 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열(들)에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 영역 유전자 분절은 재배열되지 않고(예를 들어, 2개의 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 Jλ 유전자 분절), 재배열하여 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱함으로써, 재배열된 역 키메라 경쇄 유전자(인간 가변, 비-인간 불변)를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 유전자 분절은 재배열되고(예를 들어, 하나의 Vλ 유전자 분절 및 하나의 Jλ 유전자 분절) 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱하여 인간 가변 영역 및 비-인간 불변 영역을 포함하는 역 키메라 경쇄 유전자를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 인간 가변 유전자 분절은 재배열되고(예를 들어, 하나의 Vλ 유전자 분절 및 하나의 Jλ 유전자 분절), 외인성 인간 경쇄 불변 영역 유전자에 스플라이싱되어 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 인간화된 경쇄 유전자를 형성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 체세포적으로 과돌연변이될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 적절한 인핸서(들)는 비-인간 동물에 보유된다. 인핸서는 체세포 돌연변이를 획득하는 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 내인성 비-인간 동물 κ 가변 영역 유전자 분절을 인간 λ 가변 영역 유전자 분절로 대체하여 비-인간 동물의 κ 유전자좌를 변형시키는데 있어서, 비-인간 κ 인트론성 인핸서 및 비-인간 κ 3' 인핸서는 기능적으로 유지되거나 파괴되지 않는다. 인핸서가 제거되거나 파괴되는 실시양태가 본 개시내용에 의해 고려되지만, 이러한 실시양태는 체세포 과돌연변이를 감소시키거나 또는 제거할 것으로 예상된다. 이러한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 체세포 과돌연변이는, 예를 들어, 하나 이상의 내인성, 비-인간 인핸서를 포함하는 경쇄 가변 영역에 비해 감소된다.
다양한 역 키메라(인간 가변, 비-인간 불변) 중쇄와 연관된 역 키메라(인간 가변, 비-인간 불변) 경쇄의 제한적 레퍼토리를 발현하는 유전자 조작된 비-인간 동물이 제공된다. 다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 κ 경쇄 가변 영역 유전자 분절은 결실되고 내인성 비-인간 κ 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 단일(또는 2개의) 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절로 대체된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 κ 인트론성 인핸서 및 비-인간 κ 3' 인핸서는 유지된다. 어느 한 이론에 얽매임이 없이, 인핸서는 무엇보다도 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 체세포 과돌연변이를 최대화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 비-인간 동물은 또한 비기능성 λ 경쇄 유전자좌, 또는 이의 결실, 또는 이 유전자좌가 λ 경쇄를 만들 수 없도록 하는 결실을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 내인성 비-인간 경쇄 가변 유전자 분절이 결여되고 인간 가변 유전자 분절을 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하고, 일부 실시양태에서는, 비-인간 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는, 유전자 조작된 비-인간 동물이 제공되며, 여기서 유전자좌는 체세포 과돌연변이를 겪을 수 있고, 유전자좌는 비-인간 Cλ 유전자 분절에 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 발현한다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 유전자좌는 체세포 과돌연변이의 정상 또는 야생형 수준과 상관성이 있는 비-인간 κ 3' 인핸서를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 관심 항원으로 면역화된 경우 유전자 조작된 비-인간 동물은 1개 또는 2개의 재배열된 경쇄와 함께 발현하고 기능하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 다양한 재배열을 나타내는 B 세포를 생성한다. 일부 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 영역은 체세포 과돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 영역은 각각 1 내지 5개의 체세포 과돌연변이를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 발현된 경쇄는 비-인간 동물에서 발현된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 임의의 중쇄와 연관될 수 있고 함께 발현될 수 있다.
제공된 비-인간 동물, 세포 및 조직
비-인간 동물의 생식계열 게놈 중 내인성 비-인간 λ 경쇄 유전자좌에서 (i) 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절로부터 유래되거나, 또는 (ii) 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 서열 대신에 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역으로부터 유래되는, 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 함유한 항체를 발현(예를 들어, B 세포가 발현)하는 비-인간 동물이 제공된다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이고, 본원에 기재된 비-인간 요소(인핸서, 불변 영역 등)는 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스의 요소인 것으로 이해될 것이다. 본원에 기재된 비-인간 동물의 적합한 예는 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 특히 마우스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용은, 예를 들어, 인간에 영향을 미치는 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있는, 새로운 항원-결합 단백질, 항체, 항체 구성요소(예를 들어, 항원-결합 부분 및/또는 이를 포함하는 조성물 또는 포맷), 및/또는 항체-기반 치료제를 식별 및 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 제한적 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌와 같은 조작된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 유용하다는 인식을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 인간에게 투여하기 위한 항체 및/또는 항체-기반 치료제의 개발을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 인간 Vλ 영역 서열을 함유하는 기존의 생체내 시스템으로부터 수득된 항체 및/또는 항체 기반의 치료제에 비해, 개선된 및/또는 상이한 성능(예를 들어, 항원-특이적 항체 레퍼토리에서 발현 및/또는 표시)을 특징으로 하는 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 함유하는 항체 및/또는 항체 기반의 치료제를 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다.
본 개시내용은 무엇보다도 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 서열은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간 Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 2개의 재배열된 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 예컨대, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)이 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류 , 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 2개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스, 예컨대, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 4개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절 및 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다. 일부 실시양태에서, 1개의 재배열되지 않은 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7이다.
본 개시내용은 무엇보다도 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역(V/J)을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ3이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ(예를 들어, Cλ1)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 λ 경쇄 불변 영역(예를 들어, 마우스 Cλ, 예를 들어, 마우스 Cλ1)은 내인성 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) Cκ를 대신한다.
본 개시내용은 무엇보다도 마우스 Cκ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 마우스 Cλ에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖고, 여기서 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51이고, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ2-14이고, 인간 Jλ 유전자 분절은 Jλ2이다.
본 개시내용은 무엇보다도 생식계열 게놈이 마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공하며, 여기서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하고, 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 무엇보다도 생식계열 게놈이 마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 조직을 제공하며, 여기서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하고, 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 상기 비-인간 동물의 생식계열 게놈에 있는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 항체의 발현을 특징으로 하며, 여기서 항체는 (1) 인간 Vλ 도메인 및 (2) 비-인간 Cλ 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 하나 이상의 기준 조작된 비-인간 동물에 비해, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 인간 Vλ 영역의 개선된 사용법(예를 들어, 약 2배, 그러나 이에 제한되지 않음)을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 생식계열 게놈이 (a) 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역, 및 (b) Cλ 유전자를 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 여기서 (a)는 (b)에 작동가능하게 연결되고, 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 비-인간 동물 Cκ 유전자가 결여되어 있는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 제공된다.
일부 실시양태에서, 게놈이 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 및 Cλ 유전자의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 상기 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결되고, 이 Cλ 유전자는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 비-인간 Cκ 유전자 대신에 삽입되는, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 제공된다. 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 많은 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 비-인간 Cκ 유전자 대신에 삽입된 Cλ 유전자는 비-인간 또는 인간 Cλ 유전자이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 Cλ 유전자는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물의 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-인간 Cλ 유전자는 설치류 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2, 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 실질적으로 동일하거나, 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ1 유전자는 서열번호 1이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ2 유전자는 서열번호 2이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ3 유전자는 서열번호 3이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자와 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2, 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 또는 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1, 마우스 Cλ2 및 마우스 Cλ3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마우스 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 설치류 Cλ 유전자는 랫트 Cλ 유전자이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3, 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ1 유전자는 서열번호 7이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ2 유전자는 서열번호 8이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ3 유전자는 서열번호 9이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 랫트 Cλ4 유전자는 서열번호 10이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3, 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 또는 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 랫트 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1, 랫트 Cλ2, 랫트 Cλ3 및 랫트 Cλ4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 랫트 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ1 유전자는 서열번호 15이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ2 유전자는 서열번호 16이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ3 유전자는 서열번호 17이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ6 유전자는 서열번호 18이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ7 유전자는 서열번호 18이거나 이를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 98% 내지 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 80% 내지 98%, 80% 내지 95%, 80% 내지 90%, 또는 80% 내지 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ1, 인간 Cλ2, 인간 Cλ3, 인간 Cλ6, 및 인간 Cλ7 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Cλ 유전자와 85% 내지 98%, 90% 내지 95%, 또는 88% 내지 93% 동일한 서열을 포함한다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 상기 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 생식계열 게놈은 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하며, 여기서 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다(예를 들어, Macdonald, L.E., 등, "Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14): 5147-5152(April 8, 2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호 참조, 이들은 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입은 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 대신하거나 대체한다(예를 들어, 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 암호 서열을 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 암호 서열로 위치적으로 대체하거나 치환함). 일부 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역이거나 이를 포함한다. 많은 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역(예를 들어, 내인성)은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 또는 유전자 분절(예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA 등)을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 삽입은 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절, 및 이들의 조합 사이에 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 VH 유전자 분절 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합, 인간 DH 유전자 분절 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합, 및 인간 JH 유전자 분절 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합의 삽입을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 삽입은 내인성 중쇄 유전자좌에서 인간 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 또는 VH6-1에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 인간 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, 또는 DH7-27에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 및 내인성 중쇄 유전자좌에서 인간 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 또는 JH6에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 중에 Adam6 유전자를 포함하고, 이는 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 중에 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Adam6 유전자를 포함하고, 이는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편은 Adam6 유전자로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 Adam6 유전자는 상기 특이적 비-인간 동물(예를 들어, 다른 마우스 계통에서 수득되는 마우스 Adam6 유전자 또는 랫트 Adam6 유전자를 포함하는 마우스)에서 기원하는 것이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 이소성 Adam6 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 "이소성" Adam6 유전자는 야생형 비-인간 동물에서 나타나는 Adam6 유전자와 상이한 정황에 있는 Adam6 유전자를 지칭한다. 예를 들어, Adam6 유전자는 상이한 염색체에 위치하거나, 상이한 유전자좌에 위치하거나, 또는 상이한 서열에 인접하여 위치할 수 있다. 예시적인 이소성 Adam6 유전자는 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절) 내에 위치한 마우스 Adam6 유전자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 삽입된 또는 통합된 Adam6 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈)에서 하나 이상의 비-인간 Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈)에 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 이의 게놈(예를 들어, 이의 생식계열 게놈) 에 마우스 Adam6a 유전자 및/또는 마우스 Adam6b 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 마우스 ADAM6a, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편, 및/또는 마우스 ADAM6b, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절과 근접하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 인접하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절 사이에 위치하도록 하는 위치에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH1-2이고, 제2 인간 VH 유전자 분절은 인간 VH6-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 Adam6 유사유전자의 자리에 삽입 및/또는 위치된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-인간 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 ADAM6 활성을 복원하거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 ADAM6 활성을 기능적 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 비슷한 비-인간 동물의 수준으로 복원시킨다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 비-인간 동물의 ADAM6 활성의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배인 수준으로 ADAM6 활성을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 수컷 비-인간 동물에서 발현되는 경우, 생식력을 복원하거나 향상시키는 Adam6 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 기능적 내인성 Adam6 유전자를 포함하는 비슷한 비-인간 동물의 수준으로 수컷 비-인간 동물의 생식력을 복원한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물을 교미시켜 낳은 새끼의 수가 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 수컷 비-인간 동물의 비슷한 교미로부터 낳은 새끼 수의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이도록 수컷 비-인간 동물에서 생식력을 복원한다. 일부 실시양태에서, Adam6 유전자는 수컷 비-인간 동물의 교미에 의해 낳은 새끼의 수가 기능적 Adam6 유전자를 포함하지 않는 비슷한 수컷 비-인간 동물의 비슷한 교미로부터 낳은 새끼 수의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배를 포함하도록 수컷 비-인간 동물의 생식력을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 결여는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 내인성 비-인간 Adam6 유전자의 파괴는 내인성 비-인간 Adam6 유전자가 결여된 수컷 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)에서 ADAM6 활성 및/또는 생식력을 감소시킨다.
본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은, 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절(인간 가변 λ 경쇄 유전자 분절)을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 설치류 Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 비-인간 동물 또는 비-인간 조직은 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 λ 경쇄 및 제2 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 κ 경쇄를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20 또는 Vκ1-39를 포함하고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14를 포함한다. 일 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1 또는 Vκ1-39/Jκ5이고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2이다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 전적으로 또는 부분적으로 결실된다. 제공된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 기능적으로 침묵형이거나 또는 달리 비-기능적(예를 들어, 유전자 표적화에 의해)이다. 제공된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 기능적으로 침묵형이거나 또는 달리 비-기능적인 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 κ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포, 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 또는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 내인성 면역글로불린 λ 경쇄, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄, 및 내인성 면역글로불린 중쇄를 검출가능하게 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(TdT)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 게놈을 갖는다. (예를 들어, WO 2017/210586 및 미국 공개 번호 2017/0347633 참조, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 전사 제어 요소는 RAG1 전사 제어 요소, RAG2 전사 제어 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 제어 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 제어 요소, 면역글로불린 λ 경쇄 전사 제어 요소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 TdT를 암호화하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, 또는 RAG2 유전자좌에 위치한다.
일부 실시양태에서, TdT는 인간 TdT이다. 일부 실시양태에서, TdT는 TdT의 짧은 아이소폼(TdTS)이다.
일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 삽입 지점(예를 들어, 비-인간 면역글로불린 κ 인트론 인핸서 및/또는 비-인간 면역글로불린 κ 3' 인핸서) 부근에 있는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)의 완전성을 유지하는 방식으로 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입된다. 따라서, 이러한 비-인간 동물은 인간 및 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절, 및 비-인간 Cλ 또는 Cκ)에 작동가능하게 연결되거나 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절, 및 인간 Cλ 또는 Cκ)에 작동가능하게 연결된 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열에 의해 변경, 치환, 파괴, 결실, 대체 또는 조작된 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 2개 카피 중 상기 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 1개 카피(즉, 대립유전자) 내로 삽입되어, 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열과 관련하여 이형접합성인 비-인간 동물을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 비-인간 동물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(또는 이의 부분)은 결실되지 않는다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(또는 이의 부분)은 결실된다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, V, J 및/또는 C 또는 이들의 임의의 조합)은 상기 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌가 기능적으로 침묵하도록 변경, 치환, 파괴, 결실, 또는 대체된다. 일부 실시양태에서, 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, V, J 및/또는 C 또는 이의 임의의 조합)은 상기 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌가 기능적으로 비활성화(즉, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 항체 레퍼토리에서 발현 및/또는 검출가능한 항체의 기능적 경쇄를 생산할 수 없음)되도록 표적화 벡터에 의해 변경, 치환, 파괴, 결실 또는 대체된다. 내인성 비-인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 비활성화에 대한 지침은, 예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호(예를 들어, 도 2 참조)에 제공되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 또는 전이유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함함) 또는 이의 발현 생성물은, 예를 들어, PCR, 서던 블롯, 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 대립유전자의 획득 또는 손실 검정, 웨스턴 블롯, FACS 분석 등을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 반접합성이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 또는 전이유전자의 하나 이상의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 도면에 도시된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 함유한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 이의 게놈에 포함된 λ경쇄 가변 영역 유전자 분절, 및 인간 중쇄를 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것임을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 면역글로불린 인간 중쇄 및 λ 경쇄 가변 도메인은각각 이들의 게놈에 포함된 인간 중쇄 및 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서,게놈에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공되고, 여기서 비-인간 동물은 체세포적으로 과돌연변이된, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙 항체 서열에서 공급원의 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어 DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA, 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용가능하다.
본 개시내용은 무엇보다도 본원에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트, 마우스)로부터의 세포 및 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 비-인간 동물로부터의 비장세포(및/또는 다른 림프구 조직)가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 프로-B(pro-B) 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 프리-B(pre-B) 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 미성숙 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 성숙 나이브(naive) B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 활성화된 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 기억 B 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 B 계열 림프구가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 혈장 또는 형질 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 줄기 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 생식 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 생식 세포는 난모세포이다. 일부 실시양태에서, 생식 세포는 정자 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 정자 세포는 하나 이상의 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 임의의 세포 또는 조직이 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터의 단리된 세포 및/또는 단리된 조직이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마가 제공되며, 여기서 하이브리도마는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 관심 항원에 의해 면역화된 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 관심 항원 상의 에피토프에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현하는 비-인간 동물의 B 세포에 의해 제조된다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 비-인간 동물이 상기 하나 이상의 관심 항원에 대해 면역 반응을 발달시키기에 충분한 조건 및 시간 동안 하나 이상의 관심 항원에 의해 면역화될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 비-인간 동물을 면역화하는 방법을 알고 있다. 비-인간 동물을 면역화하기 위한 예시적이고 비제한적인 방법은 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,582,298호에서 찾아볼 수 있다.
본 개시내용은 무엇보다도 본원에 기재된 바와 같은 면역화된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스), 및 이들로부터 단리된 세포 및 조직을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원에 의한 면역화에 반응하여 B 세포의 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 관심 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현하는 B 세포의 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에 의해 발현된 항체는 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포의 집단에 의해 발현된 항체는 (i) 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄, 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 관심 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 집단을 생성하며, 여기서 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에 의해 발현된 항체는 (i) 인간 중쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄, 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열에 의해 암호화된 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 갖는 람다 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 체세포적으로 과돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 항원에 반응하여 생성된 B 세포 집단에서 B 세포의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%는 체세포적으로 과돌연변이된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고 비-인간 동물 또는 인간 Cλ 유전자 분절의 상류에 삽입되고 작동가능하게 연결된, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 비-인간 또는 인간 Cλ 유전자 분절은 비-인간 Cκ 유전자의 자리에 삽입된다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 A에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 B에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 클러스터 C에서 나타나는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51, Vλ1-40, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Vλ1-51 또는 Vλ2-14로부터 선택된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Jλl, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 Jλl, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 이의 게놈에 포함된 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것이라는 것을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인은 이의 게놈 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체에 포함된 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 게놈에 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공되며, 여기서 비-인간 동물은 체세포적으로 과돌연변이된 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열, 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙한 항체 서열에서 공급원의 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용될 수 있다.
많은 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에서 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 상이한 종(예를 들어, 상이한 설치류 종)의 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에서 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에, 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서(즉, 인핸서 서열 또는 인핸서 영역)에 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 인트론성 인핸서 영역(Igκ Ei 또는 Eiκ)에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 3' 인핸서 영역(Igκ 3'E 또는 3'Eκ)에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)는 뮤린 Eiκ에 작동가능하게 연결되고 뮤린 3'Eκ에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 설치류 Cλ 유전자, 예컨대, 예를 들어, 마우스 Cλ 유전자 또는 랫트 Cλ 유전자이다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 129 계통, BALB/c 계통, C57BL/6 계통, 혼합 129xC57BL/6 계통 또는 이의 조합을 포함하는 유전자 배경으로부터의 마우스 Cλ 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 1(마우스 Cλ1), 서열번호 2(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 3(마우스 Cλ3)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 1(마우스 Cλ1), 서열번호 2(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 3(마우스 Cλ3)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 유전자의 서열이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 4(마우스 Cλ1), 서열번호 5(마우스 Cλ2), 또는 서열번호 6(마우스 Cλ3)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 4(마우스 Cλ1), 서열번호 5(마우스 Cλ2) 또는 서열번호 6(마우스 Cλ3)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ1 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 7(랫트 Cλ1), 서열번호 8(랫트 Cλ2), 서열번호 9(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 10(랫트 Cλ4)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 서열번호 7(랫트 Cλ1), 서열번호 8(랫트 Cλ2), 서열번호 9(랫트 Cλ3), 또는 서열번호 10(랫트 Cλ4)과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 비-인간 Cλ 유전자는 랫트 Cλ1 유전자의 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 11(랫트 Cλ1), 서열번호 12(랫트 Cλ2), 서열번호 13(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 14(랫트 Cλ4)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 서열번호 11(랫트 Cλ1), 서열번호 12(랫트 Cλ2), 서열번호 13(랫트 Cλ3) 또는 서열번호 14(랫트 Cλ4)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 비-인간 Cλ 도메인은 랫트 Cλ1 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ 유전자, 예컨대, 예를 들어, 인간 Cλ1 유전자, 인간 Cλ2 유전자, 인간 Cλ3 유전자, 인간 Cλ6 유전자 또는 인간 Cλ7 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자이거나, 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 서열번호 15(인간 Cλ1), 서열번호 16(인간 Cλ2), 서열번호 17(인간 Cλ3), 서열번호 18(인간 Cλ6) 또는 서열번호 19(인간 Cλ7)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 서열번호 15(인간 Cλ1), 서열번호 16(인간 Cλ2), 서열번호 17(인간 Cλ3), 서열번호 18(인간 Cλ6) 또는 서열번호 19(인간 Cλ7)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)의 인간 Cλ 유전자는 인간 Cλ2 유전자의 서열이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 서열번호 20(인간 Cλ1), 서열번호 21(인간 Cλ2), 서열번호 22(인간 Cλ3), 서열번호 23(인간 Cλ6), 또는 서열번호 24(인간 Cλ7)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 서열번호 20(인간 Cλ1), 서열번호 21(인간 Cλ2), 서열번호 22(인간 Cλ3), 서열번호 23(인간 Cλ6) 또는 서열번호 24(인간 Cλ7)와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(또는 대립유전자)에 위치한 서열에 의해 암호화된 인간 Cλ 도메인은 인간 Cλ2 도메인 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 중쇄 유전자좌
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 생식계열 구성으로 배열되고 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자, 인핸서 및 조절 영역에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 존재를 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 VH 유전자 분절 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 DH 유전자 분절 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6- 25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)는 적어도 인간 JH 유전자 분절 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 이의 게놈에 포함된 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 이의 항체 선택 및 생성 메커니즘(예를 들어, 재조합 및 체세포 과돌연변이)에 이용할 것이라는 것을 인식한다. 이와 같이, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 이의 게놈 또는 이의 체세포 과돌연변이된 변이체에 포함된 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 체세포적으로 과돌연변이된 인간 중쇄 가변 영역 서열, 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 존재하는 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 체세포 과돌연변이를 갖는다. 본 기술분야의 기술자는 성숙한 항체 서열에서 공급원 유전자 분절을 식별하는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 이 분석에 도움을 주기 위해, 예를 들어, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA 및 Ab-기원과 같은 다양한 도구가 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자, 예를 들어 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 E(IgE) 및 면역글로불린 A(IgA)와 같은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 설치류 IgM, 설치류 IgD, 설치류 IgG3, 설치류 IgG1, 설치류 IgG2b, 설치류 IgG2a, 설치류 IgE 및 설치류 IgA 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 인핸서(즉, 인핸서 서열 또는 인핸서 영역)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 조절 영역(또는 조절 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 인핸서(또는 인핸서 서열) 및 하나 이상의 비-인간 면역글로불린 중쇄 조절 영역(또는 조절 서열)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 Adam6 유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 동일한 종의 야생형 비-인간 동물의 생식계열 게놈에서 발견되는 것과 동일한 생식계열 게놈 위치에 내인성 Adam6 유전자(또는 Adam6-암호화 서열)를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 Adam6 유사유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류) Adam6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 삽입은 비-인간 동물(예를 들어, 무작위 도입된 비-인간 Adam6-암호화 서열, 이에 제한되지 않음), 세포 또는 조직의 생식계열 게놈 중 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 그 외의 곳에서, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 외측(예를 들어, 5' 최대 VH 유전자 분절의 상류, 이에 제한되지 않음)일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 항체 분자에 내인성 비-인간 VH 영역을 전적으로 또는 부분적으로 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물은 항체 분자의 내인성 비-인간 VH 영역(예를 들어, VH, DH 및/또는 JH)을 전적으로 또는 부분적으로 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는다(또는 결여되어 있거나, 또는 그의 결실을 함유함). 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 제공된 비-인간 동물은 내인성 비-인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 결실을 전적으로 또는 부분적으로 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물은 생식력이 있다.
이러한 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌(또는 대립유전자)를 수용하는 표적화 벡터, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 동물의 생성에 대한 지침은 Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 비-인간(예를 들어, 포유동물) 게놈의 유전자 조작 및/또는 조작을 달성하거나 또는 비-인간 동물의 생식계열 게놈에 도입하기 위해 상기 서열을 달리 준비, 제공 또는 제조하기 위한, 본 기술분야에 공지된 다양한 기술을 알고 있다.
구체적인 예시적 실시양태 - 면역글로불린 유전자좌의 조합
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 다른 인간 또는 인간화된 유전자(예를 들어, TdT를 암호화하는 인간 유전자)를 포함하는(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해) 하나 이상의 또 다른 면역글로불린 유전자좌를 추가로 포함한다. 이러한 비-인간 동물은 이 비-인간 동물의 의도된 용도에 따라 원하는 조작된 유전자형을 달성하기 위해 상기 기재된 바와 같이 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 다른 면역글로불린 유전자좌의 또 다른 인간 면역글로불린 유전자 분절 또는 다른 인간 또는 인간화 유전자(예를 들어, TdT를 암호화하는 인간 유전자)는 전술한 바와 같은 유전자 변형을 갖는 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포) 게놈의 추가 변경을 통해 또는 필요하다면 다른 유전자 변형된 계통과 본 기술분야에 공지된 육종 기술을 통해 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 이의 생식계열 게놈에 하나 이상의 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이고 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 하나 이상의 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하며, 기능적 불활성화된(예를 들어, 전적으로 또는 부분적으로 결실된, 또는 다르게 비-기능성이 되도록 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 기능적으로 불활성화된(예를 들어, 전체 또는 부분적으로 결실되거나 다르게 비-기능성이 되게 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이고, 본원에 기재된 바와 같이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이며, 기능적으로 불활성화된(예를 들어, 전적으로 또는 부분적으로 결실되거나 다르게 비-기능성이 되게 함) 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)인 유전자 변형된 비-인간 동물의 생식계열 게놈은 2개의 대립유전자를 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대립유전자는 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하고 제2 대립유전자는 제한적 인간 κ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 세포 또는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직의 생식계열 게놈은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 및 이에 따른 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 세포 또는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) Cκ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자를 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 조직은 제1의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 λ 경쇄 및 제2의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 대립유전자로부터의 κ 경쇄를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20 또는 Vκ1-39를 포함하고 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51 또는 Vλ2-14를 포함한다. 일 실시양태에서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1이고, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2이다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 (a) 비-인간 동물이 비-인간 CH 도메인 서열과 융합된 인간 VH 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 동형접합성 또는 이형접합성 면역글로불린 중쇄 유전자좌; (b) 비-인간 동물이 비-인간 Cλ 도메인 서열과 융합된 인간 Vλ 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하도록 비-인간(예를 들어, 설치류) 면역글로불린 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 (a) 비-인간 동물이 비-인간 CH 도메인 서열과 융합된 인간 VH 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 하나 이상의 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 동형접합성 또는 이형접합성 면역글로불린 중쇄 유전자좌; (b) 비-인간 동물이 비-인간 Cλ 도메인 서열과 융합된 인간 Vλ 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하도록 비-인간(예를 들어, 설치류) 면역글로불린 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌; 및 (c) 전적으로 또는 부분적으로, 동형접합성 또는 이형접합성 기능적 불활성화 또는 결실된, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함하는 생식계열 게놈을 갖는다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 각각 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제8,642,835호, 제8,697,940호, 제9,006,511호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해).
핵산 작제물
전형적으로, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절) 또는 이의 일부(들)를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 복제하기 위해 벡터, 바람직하게는 DNA 벡터와 연결(예를 들어, 삽입)된다.
인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 공지된 서열 또는 공급원(예를 들어, 라이브러리)으로부터 직접 클로닝되거나, GenBank 또는 기타 공개적으로 입수가능한 데이터베이스(예를 들어, IMGT)로부터 입수가능한 공개된 서열에 기초하여 인실리코에서 설계된 생식계열 서열로부터 합성될 수 있다. 대안적으로, 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리는 관심 면역글로불린 DNA 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 서열 및 이들의 조합)을 제공할 수 있다. BAC 라이브러리는 100-150kb의 삽입체 크기를 함유할 수 있고 300kb만큼 큰 삽입체를 수용할 수 있다(Shizuya, 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, 등, 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, 등, 1996, Genomics 34 213-218; 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, 164-196kb의 평균 삽입체 크기를 수용하는 인간 BAC 라이브러리가 기술되어 있다(Osoegawa, K. 등, 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. 등, 1998, Genomics 52:1-8, Article No. GE985423, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함됨). 인간 및 비-인간 동물 게놈 BAC 라이브러리는 작제되어 있고 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, ThermoFisher). 게놈 BAC 라이브러리는 또한 전사 제어 영역뿐만 아니라 면역글로불린 DNA 서열의 공급원으로도 작용할 수 있다.
대안적으로, 면역글로불린 DNA 서열은 효모 인공 염색체(YAC)로부터 단리, 클로닝 및/또는 전달될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌의 뉴클레오타이드 서열은 결정되어 있다(예를 들어, Dunham, I. 등, 1999, Nature 402:489-95 참조, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, YAC는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌 전이유전자를 조립하기 위해 이미 사용된 바 있다(예를 들어, Popov, A.V. 등, 1996, Gene 177:195-201; Popov, A.V. 등, 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19 참조, 이들 각각은 전체가 참고로 본원에 포함됨). 전체 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌(인간 또는 비-인간)는 여러 YAC 내에 클로닝 및 함유될 수 있다. 포함된 서열에 상관없이, 여러 YAC가 사용되고 중첩되는 유사성 영역을 함유하는 경우, 이들은 효모 숙주 균주 내에서 재조합되어 전체 유전자좌 또는 이 유전자좌의 바람직한 부분(예를 들어, 표적화 벡터에 의해 표적화된 영역)을 나타내는 단일 작제물을 생산할 수 있다. YAC 암은 본 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재된 방법에 의해 배아 줄기 세포 또는 배아 내로 작제물을 도입시키는데 도움을 주기 위해 개조함으로써 포유동물 선택 카세트에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하는데 사용하기 위한 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절의 DNA 및 아미노산 서열은 공개된 데이터베이스(예를 들어, GenBank, IMGT 등) 및/또는 공개된 항체 서열로부터 수득할 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자를 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 인간 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 λ 또는 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역(각각 Cλ또는 Cκ) 유전자에 작동가능하게 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 κ 또는 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 κ 또는 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 유전자 분절(예를 들어, 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역, 또는 적어도 1개의 재배열되지 않은 Jλ 유전자 분절을 갖는 1개 또는 2개의 재배열되지 않은 Vλ 유전자 분절)을 함유하는 핵산 작제물은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 Cλ 영역 유전자 및 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 인핸서 영역(또는 인핸서 서열)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 재배열되지 않은 인간 Vλ 및 Jλ 서열을 함유하는 핵산 작제물은 인간 및/또는 뮤린 기원의 유전자간(intergenic) DNA를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자간 DNA는 비암호 뮤린 면역글로불린 κ 경쇄 서열, 비암호 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열, 비암호 뮤린 면역글로불린 λ 경쇄 서열, 비암호 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열, 또는 이들의 조합이거나, 이들을 포함한다.
핵산 작제물은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 더 큰 플라스미드의 일부로서 제조될 수 있다. 이러한 제조는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 효율적인 방식으로 정확한 구성의 클로닝 및 선택을 가능하게 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 전적으로 또는 부분적으로 함유하는 핵산 작제물은 원하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 내로 혼입시키기 위해 나머지 플라스미드 서열로부터 단리될 수 있도록 플라스미드의 제한효소 부위 사이에 위치될 수 있 다.
핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드)의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템, 뿐만 아니라 일반적인 재조합 절차에 대해서는 Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5th Ed., ed. By Old, R.W. 및 S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
표적화 벡터
표적화 벡터는 핵산 작제물을 표적 게놈 유전자좌 내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 표적화 벡터는 핵산 작제물 및 상기 핵산 작제물의 측면에 있는 상동성 암을 포함할 수 있고; 본 기술분야의 기술자는 표적화 벡터의 설계, 구조 및/또는 사용에 일반적으로 적용할 수 있는 다양한 옵션 및 특징을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 표적화 벡터는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적화 벡터는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다. 참조의 용이함을 위해 상동성 암은 본원에서 5' 및 3'(즉, 상류 및 하류) 상동성 암으로 지칭된다. 이 용어는 표적화 벡터 내의 핵산 작제물에 대한 상동성 암의 상대적인 위치에 관한 것이다. 5' 및 3' 상동성 암은 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로 본원에서 지칭되는, 표적화된 유전자좌 내의 영역 또는 또 다른 표적화 벡터 내의 영역에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 또한 5' 또는 3' 표적 서열로서 기능할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 서로 재조합할 수 있는 2개, 3개 또는 그 이상의 표적화 벡터를 이용한다. 다양한 실시양태에서, 표적화 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대형 표적화 벡터(large targeting vector, LTVEC)이다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 표적화 벡터는 각각 5' 및 3' 상동성 암을 포함한다. 제1 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 제2 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 중첩되는 서열(즉, 중첩 서열)을 포함하며, 이는 제1 및 제2 LTVEC 간의 상동성 재조합을 허용한다.
이중 표적화 방법의 경우, 제1 표적화 벡터의 5' 상동성 암 및 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 표적 게놈 유전자좌 내의 상응하는 분절(즉, 표적 서열)과 유사할 수 있고, 이는 상응하는 게놈 분절을 갖는 제1 및 제2 표적화 벡터의 상동성 재조합을 촉진할 수 있고 표적 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
삼중 표적화 방법의 경우, 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 제3 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 중첩되는 서열(즉, 중첩 서열)을 포함할 수 있으며, 이는 제2 및 제3 LTVEC 간에 상동성 재조합을 허용할 수 있다. 제1 표적화 벡터의 5' 상동성 암과 제3 표적화 벡터의 3' 상동성 암은 표적 게놈 유전자좌 내의 상응하는 분절(즉, 표적 서열)과 유사하며, 이는 상응하는 게놈 분절을 갖는 제1 및 제3 표적화 벡터의 상동성 재조합을 촉진하고 표적 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
상동성 암과 표적 서열 또는 2개의 상동성 암은 상동성 재조합 반응에 대한 기질로서 작용할 수 있도록 2개의 영역이 서로에 대해 충분한 수준의 서열 동일성을 공유하는 경우, 서로 "상응하거나", 또는 "상응하는 것이다". 주어진 표적 서열과 표적화 벡터 상에서 발견되는 상응하는 상동성 암(즉, 중첩 서열) 사이 또는 2개의 상동성 암 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합이 일어날 수 있게 하는 임의의 서열 동일성 정도일 수 있다. 한 가지 예를 들면, 표적화 벡터(또는 이의 단편)의 상동성 암과 다른 표적화 벡터의 표적 서열 또는 표적 게놈 유전자좌의 표적 서열(또는 이의 단편)이 공유하는 서열 동일성의 양은 서열이 상동성 재조합을 겪도록 하는, 예를 들어, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
더욱이, 상동성 암과 상응하는 표적 서열 사이의 상응하는 유사성(예를 들어, 동일성) 영역은 표적 게놈 유전자좌에서 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 주어진 상동성 암 및/또는 상응하는 표적 서열은 상동성 암이 세포의 표적 게놈 유전자좌 또는 다른 표적화 벡터 내에 있는 상응하는 표적 서열(들)과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 예를 들어, 약 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5- 95kb, 5-100kb, 100-200kb 또는 200-300kb 길이(예컨대, 본원의 다른 곳에 기재된 것)이되, 이에 제한되지 않는 상응하는 유사성 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 상동성 암 및/또는 상응하는 표적 서열은 상동성 암이 세포의 표적 게놈 유전자좌 또는 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 표적 서열(들)과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb, 또는 95-100kb 길이(예컨대, 본원의 다른 곳에 기재된 것)이되, 이에 제한되지는 않는 상응하는 유사성 영역을 포함한다.
제1 표적화 벡터의 3' 상동성 암과 제2 표적화 벡터의 5' 상동성 암의 중첩 서열 또는 제2 표적화 벡터의 3' 상동성 암과 제3 표적화 벡터의 5' 상동성 암의 중첩 서열은 상기 표적화 벡터 사이에 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 상동성 암의 주어진 중첩 서열은 상동성 암의 중첩 서열이 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 중첩 서열과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 1-5kb, 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5-30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5-75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb, 또는 200-300kb 길이인 상응하는 중첩 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 암의 주어진 중첩 서열은 상동성 암의 중첩 서열이 다른 표적화 벡터 내의 상응하는 중첩 서열과 상동성 재조합을 겪기에 충분한 유사성을 갖도록 하는, 약 1-100kb, 5-100kb, 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb 또는 95-100kb 길이인 중첩 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 1kb부터 5kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 1kb부터 약 70kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 10kb부터 약 70kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 약 10kb부터 약 50kb까지이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 적어도 10kb이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 적어도 20kb이다. 예를 들어, 중첩 서열은 약 1kb부터 약 5kb까지, 약 5kb부터 약 10kb까지, 약 10kb부터 약 15kb까지, 약 15kb부터 약 20kb까지, 약 20kb부터 약 25kb까지, 약 25kb부터 약 30kb까지, 약 30kb부터 약 35kb까지, 약 35kb부터 약 40kb까지, 약 40kb부터 약 45kb까지, 약 45kb부터 약 50kb까지, 약 50kb부터 약 60kb까지, 약 60kb부터 약 70kb까지, 약 70kb부터 약 80kb까지, 약 80kb부터 약 90kb까지, 약 90kb부터 약 100kb까지, 약 100kb부터 약 120kb까지, 약 120kb부터 약 140kb까지, 약 140kb부터 약 160kb까지, 약 160kb부터 약 180kb까지, 약 180kb부터 약 200kb까지, 약 200kb부터 약 220kb까지, 약 220kb부터 약 240kb까지, 약 240kb부터 약 260kb까지, 약 260kb부터 약 280kb까지, 또는 약 280kb부터 약 300kb까지일 수 있다. 한 가지 예를 들면, 중첩 서열은 약 20kb 내지 약 60kb일 수 있다. 대안적으로, 중첩 서열은 적어도 1kb, 적어도 5kb, 적어도 10kb, 적어도 15kb, 적어도 20kb, 적어도 25kb, 적어도 30kb, 적어도 35kb, 적어도 40kb, 적어도 45kb, 적어도 50kb, 적어도 60kb, 적어도 70kb, 적어도 80kb, 적어도 90kb, 적어도 100kb, 적어도 120kb, 적어도 140kb, 적어도 160kb, 적어도 180kb, 적어도 200kb, 적어도 220kb, 적어도 240kb, 적어도 260kb, 적어도 280kb 또는 적어도 300kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열은 최대 400kb, 최대 350kb, 최대 300kb, 최대 280kb, 최대 260kb, 최대 240kb, 최대 220kb, 최대 200kb, 최대 180kb, 최대 160kb, 최대 140kb, 최대 120kb, 최대 100kb, 최대 90kb, 최대 80kb, 최대 70kb, 최대 60kb 또는 최대 50kb일 수 있다.
상동성 암은 일부 실시양태에서 세포에 고유한 유전자좌(예를 들어, 표적화된 유전자좌)에 상응할 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어, 전이유전자, 발현 카세트, 또는 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함하는, 세포의 게놈 내로 통합된 DNA의 이종성 또는 외인성 분절의 영역에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 일부 실시양태에서 세포의 표적화 벡터 상의 영역에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체의 영역, 또는 적절한 숙주 세포에 함유된 임의의 다른 조작된 영역에 상응할 수 있다. 또한, 표적화 벡터의 상동성 암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리, 또는 P1 파지 라이브러리의 영역에 상응하거나, 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 원핵생물, 효모, 조류(예를 들어, 닭), 비-인간 포유동물, 설치류, 인간, 랫트, 마우스, 햄스터 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 고양이, 개, 흰 족제비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이), 가축, 농업용 포유동물 또는 기타 관심 있는 유기체에 고유하거나, 이종성이거나, 외인성인 유전자좌에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉(nick) 또는 이중 가닥 단절의 부재 하에, 표적화 부위에서 비교적 낮은 수준의 성공적인 통합 및/또는 상당한 수준의 표적외 통합을 나타냈거나, 또는 통상적인 방법을 사용하여 표적화에 대해 제한적 감수성을 나타내는 세포의 유전자좌에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 암은 조작된 DNA를 포함하도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 표적화 벡터(들)의 5' 및 3' 상동성 암은 표적화된 게놈에 상응한다. 대안적으로, 상동성 암은 관련 게놈에 상응한다. 예를 들어, 표적화된 게놈은 제1 계통의 마우스 게놈이고, 표적화 암은 제2 계통의 마우스 게놈에 상응하며, 여기서 제1 계통과 제2 계통은 상이하다. 특정 실시양태에서, 상동성 암은 동일한 동물의 게놈에 상응하거나 동일한 계통의 게놈에서 유래하고, 예를 들어, 표적화된 게놈은 제1 계통의 마우스 게놈이고, 표적화 암은 동일한 마우스 또는 동일한 계통의 마우스 게놈에 상응한다.
표적화 벡터의 상동성 암은 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합 이벤트를 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있으며, 예를 들어, 1kb부터 5kb까지, 5kb부터 10kb까지, 5kb부터 15kb까지, 5kb부터 20kb까지, 5kb부터 25kb까지, 5kb부터 30kb까지, 5kb부터 35kb까지, 5kb부터 40kb까지, 5kb부터 45kb까지, 5kb부터 50kb까지, 5kb부터 55kb까지, 5kb부터 60kb까지, 5kb부터 65kb까지, 5kb부터 70kb까지, 5kb부터 75kb까지, 5kb부터 80kb까지, 5kb부터 85kb까지, 5kb부터 90kb까지, 5kb부터 95kb까지, 5kb부터 100kb까지, 100kb부터 200kb까지 또는 200kb부터 300kb까지의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 벡터의 상동성 암은 1kb부터 100kb까지, 5kb부터 100kb까지, 10kb부터 100kb까지, 15kb부터 100kb까지, 20kb부터 100kb까지, 25kb부터 100kb까지, 30kb부터 100kb까지, 35kb부터 100kb까지, 40kb부터 100kb까지, 45kb부터 100kb까지, 50kb부터 100kb까지, 55kb부터 100kb까지, 60kb부터 100kb까지, 65kb부터 100kb까지, 70kb부터 100kb까지, 75kb부터 100kb까지, 80kb부터 100kb까지, 85kb부터 100kb까지, 90kb부터 100kb까지, 또는 95kb부터 100kb까지의 길이인, 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합 이벤트를 촉진하기에 충분한 길이를 갖는다. 본원에 기재된 바와 같이, 대형 표적화 벡터는 더 큰 길이의 표적화 암을 이용할 수 있다.
뉴클레아제 제제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)는 표적 유전자좌의 변형(예를 들어, 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 변형, 또는 이전에 변형되거나 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 변형)을 용이하게 하기 위해 표적화 벡터와 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터와 표적 유전자좌 사이에 상동성 재조합을 촉진할 수 있다. 뉴클레아제 제제가 표적화 벡터와 조합으로 사용되는 경우, 뉴클레아제 절단 부위에서 닉 또는 이중 가닥 단절 시, 표적 서열과 상동성 암 사이에 상동성 재조합 이벤트의 발생을 촉진하기 위해, 표적화 벡터는 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하게 위치한 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 암을 포함할 수 있다. 용어 "뉴클레아제 절단 부위"는 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas9 절단 부위)에 의해 닉 또는 이중 가닥 단절이 생성된 DNA 서열을 포함한다. 표적화 벡터의 5' 및 3' 상동성 암에 상응하는 표적화된 유전자좌 내의 표적 서열은 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 단절 시, 5' 및 3' 표적 서열과 상동성 암 간에 상동성 재조합 이벤트의 발생을 촉진할 정도의 거리라면, 뉴클레아제 절단 부위에 대해 "충분히 근접하게 위치"한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적화 벡터의 5' 및/또는 3' 상동성 암에 상응하는 표적 서열이 주어진 인식 부위의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 주어진 인식 부위의 적어도 10개 뉴클레오타이드 내지 약 14kb 내에 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 절단 부위는 표적 서열의 적어도 한쪽 또는 양쪽에 직접 인접한다.
표적화 벡터의 상동성 암에 상응하는 표적 서열과 뉴클레아제 절단 부위의 공간적 관계는 변동될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 뉴클레아제 부위에 대해 5'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 인식 부위에 대해 3'에 위치할 수 있거나, 또는 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있을 수 있다.
표적화 벡터(예를 들어, 대형 표적화 벡터 포함)와 뉴클레아제 제제의 조합 사용은 표적화 벡터 단독 사용 시와 비교했을 때 증가된 표적화 효율을 초래할 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터가 뉴클레아제 제제와 함께 사용되는 경우, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터의 단독 사용과 비교했을 때 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배 또는 이들 정수로부터 형성되는 범위 내, 예컨대 2배 내지 10배로 증가할 수 있다.
일부 표적화 벡터는 "대형 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"이며, 이는 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열에 상응하고 이로부터 유래되는 상동성 암을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. LTVEC는, 예를 들어, 적어도 10kb의 길이일 수 있거나 또는 5' 상동성 암과 3' 상동성 암의 총 합이, 예를 들어, 적어도 10kb일 수 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동성 재조합을 수행하도록 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 작제물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC는 크기 제한으로 인해 전통적인 플라스미드 기반의 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 대형 유전자좌의 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉 또는 이중 가닥 단절의 부재 하에 상당히 낮은 효율로만 또는 부정확하게만 표적화될 수 있거나, 또는 종래 방법을 사용하여 표적화할 수 없는 세포의 유전자좌(즉, 여기에 5' 및 3' 상동성 암이 상응할 수 있음)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 3자간 또는 4자간 재조합 이벤트에서 표적 게놈 유전자좌와 그리고 서로 재조합할 수 있는 2개 또는 3개의 LTVEC를 이용할 수 있다. 이러한 방법은 단일 LTVEC를 사용하여 달성할 수 없는 대형 유전자좌의 변형을 가능하게 한다.
LTVEC의 예로는 박테리아 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체, 또는 효모 인공 염색체(YAC)로부터 유래된 벡터를 포함한다. LTVEC는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있다. LTVEC의 예 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,586,251호, 제6,596,541호 및 제7,105,348호; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2002/036789에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제공된 비-인간 동물의 제조 방법
생식계열 게놈이 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열 대신에, 인간 Vλ 및 Jλ 분절의 특이적 다형성 형태(예를 들어, 특이적 V 및/또는 J 대립유전자 또는 변이체)를 포함하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 암호화 서열을 비롯한, 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(예를 들어, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절)을 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 조성물 및 방법이 제공되며, 그 예로는 야생형 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 정상적으로 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자 대신에 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자가 위치하는, 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 조립된, 인간 가변 영역 및 비-인간 또는 인간 불변 영역을 함유하는 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 인핸서(들) 및/또는 내인성 면역글로불린 κ 조절 서열(들)의 제어 하에 그러한 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 이종성 면역글로불린 κ 인핸서(들) 및/또는 이종성 면역글로불린 κ 조절 서열(들)의 제어 하에 그러한 항체를 발현하는 비-인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
본원에 기재된 방법은 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 뮤린), 또는 인간 Cλ 영역 유전자의 상류에 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 삽입하여 야생형 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 정상적으로 나타나는 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자 대신에 비-인간 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자가 위치하여 항체가 발현되도록 하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 Cλ 도메인(예를 들어, 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 뮤린) Cλ 도메인)을 함유하는 경쇄의 존재, 또는 인간 λ 경쇄 가변 및 인간 Cλ 도메인을 함유하는 경쇄의 존재 하에 특성화되고, B 세포의 표면 및 비-인간 동물의 혈액 혈청 둘 모두에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 방법은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌(예를 들어, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 야생형, 변형된 또는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌) 내에 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 유전자 물질의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 또는 조작된 계통의 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내에 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 유전자 물질의 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단일 ES 세포 클론에 다중 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 연속적인 ES 세포 클론에 제조된 연속 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 조작된 ES 세포 클론에 제조된 단일 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 DNA 삽입(들)이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)에 작동가능하게 연결되도록 상기 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)의 상류에 상기 DNA 삽입(들)을 포함하며, 여기서 DNA 삽입(들)은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 인간 Vλ 유전자 분절, 및 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ 유전자 자리에 위치한다. 일부 실시양태에서, 방법은 DNA 삽입(들)이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)에 작동가능하게 연결되도록 상기 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)의 상류에 DNA 삽입(들)을 포함하며, 여기서 DNA 삽입(들)은 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, 및 Vλ3-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Vλ 유전자 분절, 및 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ1 유전자(또는 인간 Cλ2 유전자)는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cκ 유전자 자리에 위치한다.
적절한 경우, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(즉, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 함유하는 서열)은 비-인간 동물에서의 발현에 대해 최적화된 코돈을 포함하도록 별도로 변형될 수 있다(예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,670,356호 및 제5,874,304호 참조). 코돈 최적화된 서열은 조작된 서열이고, 바람직하게는 비-코돈 최적화된 모 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 동일한 폴리펩타이드(또는 전체 길이의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전체 길이의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 특정 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포, 예를 들어, 랫트 또는 마우스 세포)에 대한 코돈 요법을 최적화하기 위해 변경된 서열을 별도로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 게놈에 삽입하기 위한 각 뉴클레오타이드 서열의 코돈은 비-인간 동물의 세포에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 서열은 코돈-최적화된 서열로 기술될 수 있다.
인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 삽입은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 생식계열 게놈의 최소 변형을 사용하고 인간 면역글로불린이 λ 경쇄 가변 도메인이 내인성 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 인간 Vλ 도메인을 갖는 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 초래한다. 녹아웃(knockout) 및 녹인(knockin)을 비롯하여, 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 생성하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000 참조; 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 예를 들어, 유전자 조작된 설치류의 생성은 선택적으로 하나 이상의 내인성 설치류 유전자(또는 유전자 분절)의 유전자적 유전자좌의 파괴 및 설치류 게놈 내로, 일부 실시양태에서는 내인성 설치류 유전자(또는 유전자 분절)와 동일한 위치에 하나 이상의 이종 유전자(또는 유전자 분절 또는 뉴클레오타이드 서열)의 도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 설치류의 생식계열 게놈에 무작위 삽입된 조작된 경쇄 전이유전자의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 상류에 도입된다. 일부 실시양태에서, 인간 Vλ 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 유전자의 상류에 도입되며; 일부 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는 마우스 Cλ1 유전자에 작동가능하게 연결되거나 인간 Cλ2 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 유전자 분절(예를 들어, 인간 V 및 J)을 함유하도록 변경, 변형 또는 조작된다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 예시적 방법의 개략도(비축척성)는 도 1 내지 6에 제공된다. 구체적으로, 도 1 내지 6에는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 함유하는 뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 상응하는 표적화 벡터의 삽입을 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 예시적인 전략이 제시된다. 표적화 벡터는 선형화되고 설치류 배아 줄기(ES) 세포 내로 전기천공되어 생식계열 게놈에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 설치류를 생성할 수 있다. 이하 실시예 섹션에 기재된 바와 같이, 표적화 벡터의 전기천공에 사용된 설치류 ES 세포는 본원에 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제10,143,186호에 이미 기재된 바와 같은 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 함유했다. 양성 설치류 ES 세포 클론은 본 기술분야에 공지된 선별 방법을 사용하여 확인한다. 남아 있는 임의의 선택 카세트는 재조합효소-매개 결실을 통해, 필요한 경우 결실될 수 있다.
대안적으로, 인간 Cλ 유전자는 마우스 Cλ 유전자 대신에 표적화 벡터에 사용될 수 있다. 표적화 벡터는 인간 Cλ 유전자(예를 들어, Cλ2)를 암호화하는 서열이 표적화 벡터 내로 조작될 수 있다는 점을 제외하고는 상기(또는 이하 실시예에서)와 유사한 방식으로 작제될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하면 경쇄의 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DNA가 함께 단리될 수 있어 완전한 인간 항체의 제조를 위해 인간 경쇄 불변 영역에 연결되는 임의의 후속 클로닝 단계를 제거할 수 있음으로써 인간 항체 치료제의 개발을 허용한다.
본원에 기재된 바와 같이 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 작제하기 위한 표적화 벡터는 비-인간 세포(예를 들어, 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아 줄기 세포)의 생식계열 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 게놈 DNA(예를 들어, 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 함유함)를 추가로 함유하는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포의 생식계열 게놈 중 야생형 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 혼입된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호, 및 제8,791,323호 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 게놈 DNA(예를 들어, 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 함유함)를 추가로 함유하는 비-인간 세포의 생식계열 게놈 중 변형된 또는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 혼입된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호, 제8,791,323호, 제9,006,511호 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
표적화 벡터는 전기천공법에 의해 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트) 배아 줄기 세포 내로 도입시켜, 이 표적화 벡터에 함유된 서열이 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 또는 인간 경쇄 불변(Cλ 또는 Cκ) 도메인을 포함하는 경쇄를 갖고, 이 경쇄가 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현되는 항체를 발현하는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 역량을 초래한다. 본원에 기재된 바와 같이, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌가 비-인간 동물의 생식계열 게놈에서 생성된, 유전자 조작된 비-인간 동물이 생성된다(예를 들어, 내인성 설치류 Cκ 유전자의 자리에 설치류 또는 인간 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열(즉, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역)을 함유하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌). 항체는 비-인간 동물 B 세포의 표면 및 상기 비-인간 동물의 혈청에서 발현되며, 이 항체는 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 또는 인간 Cλ 도메인을 갖는 경쇄를 특징으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물의 생식계열 게놈 에서 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌가 표적화 벡터에 의해 표적화되지 않는 경우, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 전이유전자는 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌와 다른 위치에 바람직하게 삽입된다(예를 들어, 무작위 삽입된 전이유전자).
전술한 바와 같은 비-인간 동물에 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 생성은 인간 Vλ 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 또는 인간 Cλ 도메인을 갖는 상기 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로부터 발현된 면역글로불린 λ 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 조작된 비-인간 동물 계통을 제공한다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 존재로 영향을 미치면, 인간 항체-기반의 치료제를 개발하기 위한 항체 및 항체 구성요소를 생산하는 조작된 비-인간 동물 계통이 생성된다. 따라서, 인간 질환을 치료하는 새로운 항체-기반의 의약을 개발하기 위해, 인간 Vλ 도메인을 이용하기 위한 대안적인 생체내 시스템을 제공하는 역량을 갖는 단일 조작된 비-인간 동물 계통이 실현된다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하는 방법은 비-인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 상기 기재된 바와 같이 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) ES 세포를 사용하여 비-인간 동물을 생성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하는 방법은 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및 (b) 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 비-인간 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; (b) 비-인간 Cλ 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)에서 생성된 비-인간 ES 세포를 사용하여 비-인간 동물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내로 도입시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 (d) 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 비-인간 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 비-인간 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 것을 포함하며, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하여, 유전자 변형된 비-인간 동물의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법은 하나 이상의 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 것을 포함하여, 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 B 세포에 의해 발현된 모든 중쇄가 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하도록 한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 단편은 생식계열 게놈이 하나 이상의 조작된 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 κ 경쇄, 면역글로불린 λ 경쇄, 및 이의 조합)를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포 내로 도입된다. 일부 특정 실시양태에서, 조작된 면역글로불린 유전자좌는 내인성 조작된 면역글로불린 유전자좌이다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 단편은 면역글로불린 λ 경쇄 서열 및/또는 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 조작된 서열을 포함한다. 비-인간 동물을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, DNA 분절은 면역글로불린 λ 경쇄 서열 및/또는 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 조작된 서열을 비-면역글로불린 서열(예를 들어, 재조합 신호 서열, 내성 유전자, 및 이의 조합)과 함께 포함한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 게놈이 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는, 비-인간 배아 줄기 세포 내로 DNA 단편이 도입되며, 여기서 이 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, ES 세포는 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 생식계열 게놈이 단일 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포 내로 DNA 단편이 도입되며, 여기서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 또는 λ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 있다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역)를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은 게놈이 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은, 생식계열 게놈이 하나 이상의 인간 Vλ 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다. 비-인간 동물을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 것은 생식계열 게놈이 하나 이상의 인간 Vλ 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절의 삽입을 포함하는 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 및 상기 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 상기 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절 사이에 위치하거나, 자리하거나 또는 배치된 인간 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함하는 비-인간 배아 줄기 세포에서 수행되며, 여기서, 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 κ 경쇄불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다.
비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제조하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 JH 유전자 분절의 삽입은 인간 VH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 인간 DH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA, 및 인간 JH 유전자 분절에 인접하여 자연적으로 나타나는 인간 비-암호 DNA를 내인성 인간 면역글로불린 유전자좌에 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법으로부터 제조, 생성, 생산, 수득되거나, 또는 수득가능한 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 게놈은 각각 전체가 본원에 참고로 포함되는 Macdonald (2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌는, 예를 들어 VELOCIMMUNE® 계통과 같은 상이한 변형된 계통의 배아 줄기 세포 내로 조작될 수 있다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호 및/또는 제8,642,835호; 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 동형접합성은 육종에 의해 후속적으로 달성될 수 있다. 대안적으로, 무작위 삽입으로 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 전이유전자(상기 기재됨)의 경우에, 비-인간 동물 계통은 무엇보다도 전이유전자로부터 인간 Vλ 도메인의 발현에 기초하여 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 18개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 1(VI-1) 마우스일 수 있다. VI-1 마우스는 또한 16개의 인간 Vκ 유전자 분절과 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 39개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 2(VI-2) 마우스일 수 있다. VI-2 마우스는 또한 30개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 80개의 인간 VH 유전자 분절, 모든 인간 DH 유전자 분절, 및 모든 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 VELOCIMMUNE® 3(VI-3) 마우스일 수 있다. VI-3 마우스는 또한 40개의 인간 Vκ 유전자 분절 및 모든 인간 Jκ 유전자 분절을 포함할 수 있다.
대안적으로 및/또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)의 생식계열 게놈은 결실, 불활성화, 기능적으로 침묵화되거나, 또는 달리 비-기능적인 내인성 면역 글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함한다. 유전자 또는 유전자적 유전자좌를 결실시키거나 비-기능적이게 하는 유전자 변형은 본원에 기재된 방법 및/또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 달성할 수 있다.
유전자 조작된 주조자(founder) 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이의 생식계열 게놈에 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 존재 및/또는 비-인간 동물의 조직 또는 세포에 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 도메인을 갖는 항체의 발현에 기초하여 식별될 수 있다. 유전자 조작된 주조자 비-인간 동물은 그 다음 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 운반하는 또 다른 비-인간 동물을 육종시키는데 사용될 수 있고, 이로 인해 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 하나 이상이 카피를 각각 운반하는 비-인간 동물의 코호트를 생성할 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 운반하는 유전자 조작된 비-인간 동물은, 필요한 경우, 다른 전이유전자(예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자) 또는 조작된 면역글로불린 유전자좌를 운반하는 다른 유전자 조작된 비-인간 동물로 추가로 육종될 수 있다.
유전자 조작된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 또한 전이유전자 또는 통합된 서열(들)의 조절된, 지시된, 유도성 및/또는 세포 유형 특이적 발현을 허용하는 선택된 시스템을 함유하도록 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 비-인간 동물은 조건부로 발현되는 항체의 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 하나 이상의 서열을 함유하도록 조작될 수 있다(예를 들어, Rajewski, K. 등, 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3에서 검토됨, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 예시적인 시스템은 박테리오파지 P1의 Cre/loxP 재조합효소 시스템(예를 들어, Lakso, M. 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89:6232-6 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨) 및 S. 세레비지애의 FLP/Frt 재조합효소 시스템(O'Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-5, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 동물은 "이중" 유전자 조작된 동물의 작제를 통해, 예를 들어, 2개의 유전자 조작된 동물인, 선택된 변형(예를 들어, 본원에 기재된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌)을 포함하는 전이유전자를 함유한 동물 및 재조합효소(예를 들어, Cre 재조합효소)를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 다른 동물을 교배하여 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 상기에 기재된 바와 같이, 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 종종 비-인간 동물의 의도된 용도에 따라 또 다른 인간, 인간화 또는 달리 조작된 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 인간 유전자, 인간화 유전자 또는 달리 조작된 유전자의 유전자 물질은 상기 기재된 바와 같은 유전자 변형 또는 변경을 갖는 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포)의 게놈의 추가 변경을 통해, 또는 필요한 경우 다른 유전자 변형된 또는 조작된 계통과 본 기술분야에 공지된 육종 기술을 통해 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 중쇄 유전자 분절을 추가로 포함하도록 제조된다(예를 들어, Murphy, A.J. 등,(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158; Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호; 미국 특허 제8,791,323호; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0096287 A1 참고; 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 본원에 기재된 표적화 벡터를 변형 또는 조작된 계통의 세포 내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 벡터는 VELOCIMMUNE® 마우스 내로 도입될 수 있다. VELOCIMMUNE® 마우스는 완전한 인간 가변 도메인과 마우스 불변 도메인을 가진 항체를 발현한다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 표적화 벡터는 본원에 전체가 참고로 포함되는, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 조작된 마우스 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자(가변 및/또는 불변 영역 유전자)를 추가로 포함하도록 제조된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리 및 이종성 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전자 물질을 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 여기서 유전자 물질은 전적으로 또는 부분적으로, 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역을 암호화한다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 각각 전체가 본원에 참고로 포함되는, Murphy, A.J. 등, (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald(2014); 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및 제8,791,323호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 교배 또는 다중 유전자 표적화 전략을 통해). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물에 교배된다(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및/또는 제8,791,323호 참조; 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물은 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌(예를 들어, Macdonald(2014), 미국 특허 제6,596,541호, 제8,642,835호, 제8,697,940호 및/또는 제8,791,323호 참조; 본원에 참고로 포함됨) 및 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌(예를 들어, 미국 특허 제9,006,511호, 제9,012,717호, 제9,029,628호, 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,150,662호 및 제9,163,092호 참조; 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 비-인간 동물에 교배된다.
마우스에서 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 작제를 기술하는 실시양태(즉, 인간 λ 경쇄 가변 도메인 및 마우스 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 도메인을 함유하는 항체가 발현되도록 마우스 또는 인간 Cλ 또는 Cκ 유전자와 작동가능하게 연결된 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 존재를 특징으로 하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 갖는 마우스)가 본원에 광범위하게 논의되지만, 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 다른 비-인간 동물이 또한 제공된다. 이러한 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 발현하도록 유전자 변형될 수 있는 임의의 동물을 포함하며, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소과(예를 들어, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 리서스 원숭이) 등을 포함한다. 예를 들어, 적합한 유전자 변형가능한 ES 세포가 쉽게 입수가능하지 않은 비-인간 동물의 경우에는 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법이 이용된다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능 세포)을 변형시키는 단계 및 체세포 핵 전달(somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 이용하여 적합한 세포, 예를 들어, 탈핵 난모세포로 유전자 변형된 게놈을 전달하는 단계, 및 적합한 조건 하에 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 비-인간 동물에 임신시켜 배아를 형성시키는 단계를 포함한다.
비-인간 동물의 생식계열 게놈(예를 들어, 돼지, 소, 설치류, 닭 등의 게놈)을 변형시키는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하기 위해, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 Cas 단백질(즉, CRISPR/Cas 시스템)을 이용하는 것을 포함한다. 비-인간 동물의 생식계열 게놈을 변형시키는 방법의 지침은, 예를 들어, 미국 특허 제9,738,897호 및 미국 특허 공개 번호 US 2016/0145646(2016년 5월 26일 공개) 및 US 2016/0177339(2016년 6월 23일 공개)에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 예를 들어 디포도이데아(Dipodoidea) 또는 무로이데아(Muroidea) 상과의 작은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 마우스, 랫트 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 무로이데아 상과로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 동물은 칼로미시대(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스-유사 햄스터), 크리스티대(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, New World 랫트 및 마우스, 들쥐류), 무리대(Muridae)(진정한 마우스 및 랫트, 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 갈기쥐), 네소마이대(Nesomyidae)(나무타기쥐, 바위 쥐, 흰꼬리 쥐, Malagasy 랫트 및 마우스), 플라타칸토마이대(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시 동면쥐), 및 스팔라시대(Spalacidae)(예를 들어, 두더지쥐, 대나무 쥐 및 조코아)로부터 선택되는 과에서 유래된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 설치류는 진정한 마우스 또는 랫트(무리대 과), 게르빌루스쥐, 가시주머니쥐, 및 갈기쥐로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스는 무리대 과의 구성원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 설치류는 마우스 및 랫트로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다(예를 들어, Festing 등, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. 등, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032 참조; 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통 및 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합물, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 혼합물의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 마우스는 BALB 계통 및 앞서 언급한 또 다른 계통의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 랫트이다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 랫트는 Wistar 랫트, LEA 계통, Sprague Dawley 계통, Fischer 계통, F344, F6, 및 Dark Agouti로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 랫트 계통은 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 및 Dark Agouti로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 계통의 혼합물이다.
랫트 만능 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어 ACI 랫트 계통(August 및 Copenhagen 계통에서 원래 유래하는 근친교배 계통), Dark Agouti(DA) 랫트 계통, Wistar 랫트 계통, LEA 랫트 계통, Sprague Dawley(SD) 랫트 계통, 또는 Fisher F344 또는 Fisher F6과 같은 Fischer 랫트 계통을 포함한, 임의의 랫트 계통에서 유래될 수 있다. 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 또한 위에 언급된 2 이상의 계통의 혼합체로부터 유래된 계통에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 DA 계통 또는 ACI 계통에서 유래될 수 있다. ACI 랫트 계통은 흰 배와 발 및 RTlav1 일배체형을 갖는 검은 아구티(black agouti)인 것을 특징으로 한다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함한 다양한 공급원에서 입수가능하다. ACI 랫트 유래의 랫트 ES 세포주의 일 예는 ACI.Gl 랫트 ES 세포이다. DA 랫트 계통은 아구티 털 및 RT1av1 일배체형을 갖는 것이 특징이다. 이러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 비롯한 다양한 공급원에서 입수할 수 있다. DA 랫트로부터의 랫트 ES 세포주의 예는 DA.2B 랫트 ES 세포주 및 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 일부 실시양태에서, 랫트 만능 및/또는 전능 세포는 근친교배된 랫트 계통으로부터 유래된다(예를 들어, 2014년 8월 21일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2014-0235933 A1 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨). 본원에 기재된 방법 및/또는 작제물을 사용하여 랫트 게놈(예를 들어, 랫트 ES 세포 중)을 변형시키기 위한 안내서는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2014-0310828 및 2017-0204430에서 찾아볼 수 있으며; 둘 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
제공된 비-인간 동물, 세포 또는 조직을 사용하는 방법
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 항체 개발을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 제한적 인간 λ 경쇄 레퍼토리로부터 발현된 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루는 인간 중쇄 가변 도메인, 및 이러한 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체의 생성 및 식별에 특히 유리한 플랫폼을 나타낸다. 이러한 인간 중쇄 가변 도메인은, 예를 들어, 이중특이적 항원-결합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직이 항체를 제조하는 방법에 사용될 수 있음을 제공한다. 본 개시내용에 따라 제조된 항체는, 예를 들어, 인간 항체, 키메라 항체, 역 키메라 항체, 임의의 이들 항체의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 세포의 유전자 물질에 의해 암호화된 핵산 서열로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 인간 항체(예를 들어, 완전 인간 항체)를 제조하는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 유전자 변형된 설치류, 예를 들어, 유전자 변형된 랫트 또는 마우스)은 비-인간 동물이 상기 관심 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기에 충분한 조건 및 시간 동안 관심 항원에 의해 면역화된다. 항체 및/또는 항체 서열(즉, 항체의 부분을 암호화하는 서열, 예를 들어 가변 영역 서열)은 면역화된 비-인간 동물(또는 하나 이상의 세포, 예를 들어, 하나 이상의 B 세포)로부터 단리되고 및/또는 식별되며, 예를 들어, 친화도, 특이성, 에피토프 매핑, 리간드-수용체 상호작용을 차단하기 위한 능력, 수용체 활성화 억제 등을 측정하는 다양한 검정을 사용하여 특성화된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생성된 항체는 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에서 단리된 하나 이상의 인간 가변 영역 뉴클레오타이드 서열로부터 유래되는 하나 이상의 인간 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-약물 항체(예를 들어, 항-이디오타입 항체)는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에서 유발될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 경쇄 불변 도메인 및/또는 인간 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다.
다양한 실시양태에서, 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직에 의해 생산된 항체는 인간 가변 도메인 및 비-인간 불변 도메인을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류) 경쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직에 의해 생산된 항체는 인간 중쇄 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체이다.
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 관심 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 방법은 상기 비-인간 동물로부터 림프구(예를 들어, 클론적으로 선택된 림프구)를 식별하는 것을 포함하며, 여기서 림프구는 관심 항원에 결합하는(예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열은 림프구(예를 들어, B 세포)로부터 수득되고, 및/또는 식별된다(예를 들어, 유전형별화, 예를 들어, 시퀀싱됨). 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 림프구(예를 들어, B 세포)로부터 수득되고 및/또는 식별된다(예를 들어, 시퀀싱됨). 일부 실시양태에서, 비-인간 동물의 B 세포 유래의 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열이 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물의 B 세포 유래의 인간 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간 람다 경쇄 가변 영역 서열의 변이체가 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 변이체는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 변이체를 포함하는 항체의 약동학 및/또는 약력학 성질을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 변이체를 포함하는 항체의 특이성, 친화도, 및/또는 면역원성을 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 항체를 제조하는 방법은 본 명세서에 기재된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 식별하고; (i) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 접합시키거나 결찰시켜, 완전한 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 서열을 형성하고, 및/또는 (ii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 접합시키거나 결찰시켜 완전한 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열을 형성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 서열 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 서열은 완전 인간 면역글로불린 중쇄 및 완전 인간 면역글로불린 λ 경쇄가 발현되어 인간 항체를 형성하도록 세포(예를 들어, 숙주 세포, 포유동물 세포)에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 세포 또는 이 세포를 포함하는 배양 배지로부터 단리된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 이중특이적 항체를 제조하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 (a) 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물을 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계, (b) 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 제1 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 단일 재배열된 인간 Igλ 경쇄 가변 영역)을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물을 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계, (c) 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물로부터 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (d) 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물로부터 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계; (e) 제1의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1의 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1의 인간 중쇄를 암호화하는 제1의 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 단계; (f) 제2의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2의 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2의 인간 중쇄를 암호화하는 제2의 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 단계; (g) 포유동물 세포에서 (i) 제1의 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2의 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 이중특이적 항체를 제조하는 방법에 이용될 수 있으며, 이 방법은 (a) 비-인간 세포에서 (i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열; (ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및 (iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함하며; 여기서 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 제1의 유전자 변형된 비-인간 동물에서 식별된 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 제2의 유전자 변형된 비-인간 동물에서 식별된 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하며, 여기서 제1 및 제2 유전자 변형된 비-인간 동물은 각각 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 Ig λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 비-인간 동물이며; 제3 뉴클레오타이드의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전이다. 식별된 아미노산 또는 핵산은 본원에서 식별된 가변 도메인을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단백질을 제조하는데 사용된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을, 예를 들어 에피토프 또는 항원에 대한 항체의 일부로서 식별하는데 이용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직에 의해 생성된 인간 가변 도메인의 아미노산 서열을, 예를 들어 에피토프 또는 항원에 대한 항체의 일부로서 식별하는데 이용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 다양한 검정에 유용한 인간 항체를 생산하기 위한 생물학적 물질(예를 들어, 세포, 뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단백질 복합체)의 개선된 생체내 시스탬 및 공급원을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 막관통 또는 분비된 폴리펩타이드)를 표적으로 하고 및/또는 상기 관심 폴리펩타이드와 연관된 하나 이상의 활성을 조절하며, 및/또는 상기 관심 폴리펩타이드와 다른 결합 파트너(예를 들어, 리간드 또는 수용체 폴리펩타이드)와의 상호작용을 조절하는 치료제를 개발하는데 사용된다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 수용체 폴리펩타이드를 표적으로 하고, 수용체 폴리펩타이드 활성을 조절하고 및/또는 다른 결합 파트너와 수용체 폴리펩타이드의 상호작용을 조절하는 치료제를 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 결합하는 후보 치료제(예를 들어, 항체, scFv 등)를 식별하고, 선별하고 및/또는 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드의 활성을 차단하거나 또는 하나 이상의 관심 수용체 폴리펩타이드의 활성을 차단하는 후보 치료제(예를 들어, 항체, scFv 등)를 선별 및 개발하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드의 길항제(antagonist) 및/또는 작동제(agonist)의 결합 프로파일을 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 결합하는 하나 이상의 후보 치료제 항체의 에피토프 또는 에피토프들을 결정하는데 사용된다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 하나 이상의 인간 항체 후보의 약동학적 프로파일을 결정하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직, 및 하나 이상의 대조군 또는 기준 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직은 각각 하나 이상의 인간 항체 후보의 다양한 용량(예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg 또는 50 mg/kg 이상)에 노출된다. 후보 치료 항체는 비경구 및 비경구외 투여 경로를 포함하는 임의의 바람직한 투여 경로를 통해 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물에 투여될 수 있다. 비경구 경로는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 문맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수내, 척추강내, 뇌실내, 두개내, 흉막내 또는 기타 주사 경로를 포함한다. 비경구외 경로는, 예를 들어 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 협측, 질, 안구를 포함한다. 투여는 또한 연속 주입, 국소 투여, 임플란트(겔, 막 등)로부터의 지속 방출, 및/또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 혈액은 다양한 시점(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 최대 30일 또는 그 이상)에 비-인간 동물(인간화 및 대조군)로부터 단리된다. 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포 및 비-인간 조직으로부터 수득된 샘플을 사용하여 투여된 후보 치료 항체의 약동학적 프로파일을 결정하는 데에는 총 IgG, 항치료 항체 반응, 응집 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 검정이 수행될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 관심 폴리펩타이드의 활성을 차단 또는 조절하는 치료 효과 및 세포 변화의 결과로서 유전자 발현에 대한 효과, 또는 수용체 폴리펩타이드의 정황에서, 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 비-인간 조직의 세포 표면에 있는 수용체 폴리펩타이드의 밀도를 측정하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포), 비-인간 세포 또는 비-인간 조직은 관심 폴리펩타이드에 결합하는 후보 치료제에 노출되고, 이후 시간 기간 후에 상기 관심 폴리펩타이드, 예를 들어, 리간드-수용체 상호작용 또는 신호 전달과 관련된 특정 세포 과정에 대한 효과에 대해 분석된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역을 발현하고, 이에 따라 결합 및 기능 검정에 사용하기 위한 인간 항체 가변 영역의 공급원으로서 제공하기 위해, 예를 들어, 특히 길항제 또는 작동제가 관심 있는 인간 항원에 특이적이거나 리간드-수용체 상호작용(결합)에 기능하는 에피토프에 특이적인 경우, 길항제 또는 작동제의 결합 또는 기능에 대해 검정하기 위해 세포, 세포주 및 세포 배양물을 생성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 후보 치료 항체 또는 단편(예를 들어, Fab 단편, VH, VL, CH1 및 CL 도메인으로 이루어진 일가 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR))에 의해 결합된 에피토프는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 단리된 세포를 사용하여 결정할 수 있다.
제공된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터의 세포는 단리되어 필요에 따라 사용될 수 있거나, 또는 많은 세대 동안 배양물로 유지될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제공된 비-인간 동물로부터의 세포는 불멸화되고(예를 들어, 바이러스의 사용을 통해), 배양물에서 무한하게(예를 들어, 연속 배양물로) 유지된다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 비-인간 림프구이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 및 T 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 미성숙 B 세포, 성숙한 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포, 기억 B 세포 및/또는 형질 세포이다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포는 비-인간 배아 줄기(ES) 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 설치류 ES 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 ES 세포는 마우스 ES 세포이고 129 계통, C57BL 계통, BALB/c 또는 이들의 혼합물로부터 유래된다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 129 및 C57BL 계통의 혼합물이다. 일부 특정 실시양태에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 129, C57BL 및 BALB/c 계통의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 비-인간 동물을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) ES 세포의 사용이 제공된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 마우스 ES 세포이고 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를 제조하는 데 사용된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 ES 세포는 랫트 ES 세포이고 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 조작된 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 랫트를 제조하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 지방, 방광, 뇌, 유방, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 비-인간 세포 또는 조직으로부터 제조, 생성, 생산 또는 수득된 불멸화 세포가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 ES 세포로부터 제조, 생성, 생산 또는 수득된 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 배아가 제공된다. 일부 특정 실시양태에서, 비-인간 배아는 설치류 배아이고; 일부 실시양태에서, 마우스 배아; 일부 실시양태에서, 랫트 배아이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 관심 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체 가변 영역의 변이체(예를 들어, 인간 Vλ 도메인 변이체)를 생성하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 이러한 변이체는 관심 폴리펩타이드의 2 이상의 변이체에 의해 공유되는 공통 에피토프에 대해 원하는 기능성, 특이성, 낮은 교차 반응성을 갖는 인간 항체 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 원하는 기능성 또는 개선된 기능성에 대해 선별되는 일련의 변이체 가변 영역을 함유하는 인간 항체 가변 영역의 패널을 생성하는데 이용된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역 라이브러리(예를 들어, 인간 Vλ 도메인 라이브러리)를 생성하기 위한 생체내 시스템을 제공한다. 이러한 라이브러리는 원하는 이펙터 기능에 기초하여 상이한 Fc 영역 상에 접목될 수 있고, 본 기술분야에 공지된 기술(예를 들어, 부위 지시성 돌연변이유발, 오류 유발 PCR 등)을 사용하여 가변 영역 서열의 친화도 성숙을 위한 공급원을 제공하고, 및/또는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(즉, 항체 구성요소, 예를 들어 scFv를 사용하여 조작된 분자), 다중특이적 결합 제제(예를 들어, 이중특이적 결합 제제), 및 융합 단백질(예를 들어, 단일 도메인 항체, scFv 등)과 같은 항체 기반의 치료 분자를 생성하기 위한 항체 구성요소의 공급원으로서 사용될 수 있는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열의 공급원을 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 동물에서 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 관심 항원으로 면역화하는 단계; (b) 비-인간 동물이 관심 항원에 대해 면역 반응을 생산(예를 들어, 항체를 발현)하기에 충분한 조건 하에 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)을 유지하는 단계; 및 (c) 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 또는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)의 세포(예를 들어, B 세포)로부터, 관심 항원에 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
비-인간 동물에서 항체를 생산하는 방법의 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 B 세포이다. 비-인간 동물에서 항체를 생산하는 방법의 일부 실시양태에서, 비-인간 세포는 하이브리도마이다.
일부 실시양태에서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 제공하는 단계; (b) 비-인간 동물을 관심 항원으로 면역화하는 단계; (c) 비-인간 동물이 관심 항원에 대한 면역 반응을 생산하기에 충분한 조건 하에 비-인간 동물을 유지시키는 단계; 및 (d) 관심 항원에 결합하는, 비-인간 동물, 또는 비-인간 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 (d)의 항체가 인간 VH 및 Vλ 도메인을 포함하는, 방법에 의해 제조된 항체가 제공된다.
방법에 의해 제조된 항체의 일부 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 도메인은 인간 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 VH6-1 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체를 포함하는 재배열된 인간 중쇄 가변 영역에 의해 암호화된다.
방법에 의해 제조된 항체의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 비-인간 동물로부터 수득되는 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 인간 Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 Vλ3-1, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 변이체를 포함하는 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 암호화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 치료용 또는 진단용 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위해 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직은 질병, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 호전을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 제공된다.
일부 실시양태에서, 약제로서의 사용과 같은 의약에 사용하기 위한 약물 또는 백신의 제조 및/또는 개발에 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 사용이 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체 및/또는 이의 단편의 제조 및/또는 개발에 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스), 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 세포, 또는 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 조직의 사용이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 약물 또는 백신의 분석 및 테스트를 위한 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 후보 약물 또는 백신은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 비-인간 동물에 전달될 수 있고, 이어서 비-인간 동물을 모니터링하여 약물 또는 백신에 대한 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질병 또는 상태 및/또는 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상에 대한 효과를 결정할 수 있다. 안전성 프로파일을 결정하는 데 사용되는 예시적인 방법으로는 독성 측정, 최적 용량 농도, 항체(즉, 항-약물) 반응, 약물 또는 백신의 효능 및 가능한 위험 인자의 측정을 포함한다. 이러한 약물 또는 백신은 이러한 비-인간 동물에서 개선 및/또는 개발될 수 있다.
백신 효능은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 간단히 말해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 백신접종된 다음, 백신으로 공격되고, 또는 이미 감염된 비-인간 동물에게 백신이 투여된다. 백신에 대한 비-인간 동물(들)의 반응은 비-인간 동물(들)(또는 이로부터 단리된 세포)을 모니터링하고 및/또는 하나 이상의 검정을 수행하여 측정함으로써 백신의 효능을 결정할 수 있다. 백신에 대한 비-인간 동물(들)의 반응은 그 다음 본 기술분야에 공지되고/있거나 본원에 기재된 하나 이상의 척도를 사용하여 대조군 동물과 비교한다.
백신 효능은 바이러스 중화 검정에 의해 추가로 결정될 수 있다. 간단히 말해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 면역화되고, 면역화 후 다양한 날에 혈청이 수집된다. 혈청의 연속 희석액이 바이러스와 함께 사전-항온처리되며, 이 시간 동안 바이러스에 특이적인 혈청 중 항체가 바이러스에 결합할 것이다. 그 다음, 바이러스/혈청 혼합물을 허용 세포에 첨가하여 플라크 검정 또는 미세중화 검정에 의해 감염도를 결정한다. 혈청 내 항체가 바이러스를 중화한다면, 대조군에 비해 플라크가 더 적거나, 상대적 루시페라제 단위가 더 낮다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 인간 항체 가변 영역을 생산하고, 따라서 진단 적용예(예를 들어, 면역학, 혈청학, 미생물학, 세포 병리학 등)에 사용하기 위한 인간 항체를 생성하기 위해 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은, 예를 들어, 병리학적 변화를 나타내는 특정 세포 표면 마커의 발현과 같이, 세포 변화의 식별에 적절한 관련 항원 부위에 결합하는 인간 항체 가변 영역을 생산하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 다양한 화학적 실체(예를 들어, 방사성 추적자)에 접합될 수 있고, 원한다면 다양한 생체내 및/또는 시험관내 검정에 이용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 랫트 또는 마우스)은 종양학 및/또는 감염성 질환에 사용하기 위한 인간 항체의 개발 및 선택을 위한 개선된 생체내 시스템을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 및 대조군 비-인간 동물(예를 들어, 본원에 기재된 것과 상이한 유전적 변형을 갖거나 유전적 변형이 없는 것, 즉, 야생형)에 종양(또는 종양 세포)이 이식되거나, 또는 바이러스(예를 들어, 인플루엔자, HIV, HCV, HPV 등)로 감염될 수 있다. 감염 이식 후, 비-인간 동물에게 후보 치료제가 투여될 수 있다. 종양 또는 바이러스는 후보 치료제의 투여 전에 비-인간 동물 내의 하나 이상의 위치에서 확립되기에 충분한 시간이 허용될 수 있다. 대안적으로, 및/또는 추가적으로, 치료제로서 개발될 수 있는 잠재적인 인간 항체를 특성화하고 선택하기 위해 이러한 비-인간 동물에서 면역 반응이 모니터링될 수 있다.
하나보다 많은 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질
본원에 기재된 조성물 및 방법은 하나보다 많은 에피토프에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 이중특이적 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 장점은 각각 단일 경쇄와 연관이 있을 적절하게 높은 결합성(예를 들어, 친화도 성숙) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다.
이중특이적 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로는 2개의 상이한 중쇄와 연관되고 발현할 수 있는 적절한 경쇄를 식별하는 것과 연관된 문제, 및 부분적으로는 단리 문제로 인해 어려움이 있었다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)이 체세포적으로 과돌연변이된(예를 들어, 친화도 성숙된) 중쇄를 비롯한 하나보다 많은 중쇄와 연관되어 발현할 수 있는 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 적합한 경쇄를 다른 자연적 과정을 통해 선택할 수 있게 한다. 역 키메라 중쇄(즉, 인간 가변 도메인 및 비-인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스) 불변 도메인)를 갖는 친화도 성숙된 항체를 발현하는 본원에 기재된 면역화된 마우스의 적합한 B 세포로부터의 인간 Vλ 및 VH 서열은 식별되어, 적합한 인간 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 IgG1)을 갖는 발현 벡터에 프레임에 맞게 클로닝될 수 있다. 이러한 2개의 작제물이 제조될 수 있고, 각 작제물은 상이한 에피토프에 결합하는 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화한다. 생식계열 서열 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 갖는 유전자 분절(예를 들어, B 세포로부터 식별된 것)을 포함하는, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 인간 Vλ2-14/Jλ2)은 적합한 인간 불변 영역 유전자(예를 들어, 인간 λ 불변 유전자)에 프레임에 맞게 융합될 수 있다. 이러한 3개의 완전-인간 중쇄 및 경쇄 작제물은 발현을 위해 적절한 세포에 자리할 수 있다. 이 세포는 2가지 주요 종, 즉 동일한 경쇄를 갖는 동종이량체 중쇄, 및 동일한 경쇄를 갖는 이종이량체 중쇄를 발현한다. 이러한 주요 종이 용이하게 분리되도록 하기 위해, 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정인자가 누락되어, 이종이량체 결합 단백질과 상이한 친화도의 동종이량체 결합 단백질을 초래하도록 변형된다. 이러한 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 각각 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질은 인간 Vλ 및 VH 서열이 관심 에피토프 또는 관심 항원을 포함하는 항원에 의해 면역화된, 본원에 기재된 마우스로부터 유래되는 것이 제공된다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 제1 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인, 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하며, 여기서 제2 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 도메인(인간 λ 경쇄 가변 도메인과 함께), 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단쪽으로, 제2 에피토프(제1 에피토프와 동일하거나 상이한 항원 상에 있을 수 있음)에 선택적으로 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 도메인(동일한 인간 λ 경쇄 가변 도메인과 함께), 그 다음 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하는 불변 도메인을 포함하며, 여기서 제2 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 따르면 H435R)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 Y96F 변형(IMGT; EU에 따르면 Y436F)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R) 및 Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG1 도메인이고, D16E 변형, L18M 변형, N44S 변형, K52N 변형, V57M 변형, V82I 변형, 또는 이의 조합(IMGT; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, V422I, 또는 이의 조합)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의하면 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG2 도메인이고, N44S 변형, K52N 변형, V82I 변형, 또는 이들의 조합(IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N, V422I 또는 이들의 조합)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한 경우; EU 넘버링에 의하면 H435R), Y96F 변형(IMGT; EU에 의한 Y436F), 또는 둘 모두를 포함하는 IgG4 도메인이고, Q15R 변형, N44S 변형, K52N 변형, V57M 변형, R69K 변형, E79Q 변형, 및 V82I 변형(IMGT; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, V422I 또는 이들의 조합)을 추가로 포함한다.
하나보다 많은 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 제조하는 1가지 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 갖는 제1 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)을 제1의 관심 에피토프를 포함하는 제1 항원으로 면역화하는 것이며, 여기서 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 D 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. 면역화된 경우, 이러한 비-인간 동물은 제한적 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)로부터 발현된 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 역 키메라 항체를 만들 것이다. 관심 에피토프에 결합하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 B 세포가 식별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 회수되어(예를 들어, PCR에 의해), 적합한 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 프레임에 맞게 발현 작제물 내에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 과정은 반복되어 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 식별할 수 있으며, 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 회수되어, 발현 벡터 내에 제2의 적합한 면역글로불린 불변 영역에 프레임에 맞게 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 회수되어(예를 들어, PCR에 의해), 적합한 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 발현 작제물 내에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 인간 중쇄 불변 도메인은 동일하거나 상이한 아이소타입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 인간 중쇄 불변 도메인 중 하나(다른 것은 아님)는 본원에 기재된 바와 같이, 또는 본원에 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에서와 같이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단백질은 적합한 세포에서 발현될 수 있고, 예를 들어, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같이, 동종이량체 항원-결합 단백질에 비해 단백질 A에 대한 상이한 친화도를 기초로 하여 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원은 동일할 수 있고 제1 및 제2 에피토프는 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원은 상이하다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질은 동일한 항원에 결합하는 단일특이적 항원 결합 단백질보다 더 높은 친화도로 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원-결합 단백질은 상이한 친화도로 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 도메인, 및 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 제1 친화도 성숙된(예를 들어, 하나 이상의 체세포 과돌연변이를 포함함) 인간 중쇄 가변 도메인을 식별하는 것을 포함하는 이중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단백질을 제조하는 방법은 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역(예를 들어, 제1 가변 도메인을 생성하는데 사용된 비-인간 동물에서와 동일한 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역), 및 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)로부터 제2 친화도 성숙된(예를 들어, 하나 이상의 체세포 과돌연변이를 포함함) 중쇄 가변 도메인을 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 본원에 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같은 단백질 A-결정인자 변형이 결여된 인간 중쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 클로닝되어, 완전 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제2 친화도-성숙된 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,586,713호; 제9,309,326호; 및 제9,982,013호에 기재된 바와 같은 단백질 A-결정인자를 포함하는 인간 중쇄 불변 영역과 프레임에 맞게 클로닝되어 제2 완전 인간 중쇄를 형성한다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 및 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 제1 발현 벡터 상에 포함된다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 제2 발현 벡터 상에 포함된다. 일부 경우에, 제1 및 제2 발현 벡터는 동일하거나 상이하다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 이중특이적 항체가 형성되도록 숙주 세포에서 이 단락에 기재된 바와 같은 제1 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 이 단락에 기재된 바와 같은 제2 완전 인간 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 및 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드를 발현시키는 것을 포함하고, 여기서 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물에 의해 생산된 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 인간 λ 경쇄 가변 도메인은 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 인간 V/J 재배열로부터 유래된 서열(예를 들어, 비-인간 동물에 존재하는 것과 동일한 단일 인간 재배열된 λ 경쇄 가변 영역)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 이중특이적 항체를, 예를 들어 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 수득하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, 에세리키아 콜라이, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, 사카라마이세스 세레비지에, 쉬조사카로마이세스 폼베, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마일 수 잇다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵세포이고, 다음 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 전술한 세포에서 유래된 세포주. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다.
약제학적 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 비-인간 동물에 의해 생산되거나, 또는 본원에 개시된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)에 의해 생산된 항체, 핵산, 또는 이의 치료적으로 적절한 부분에서 유래된, 항원 결합 단백질, 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 이의 치료적으로 적절한 부분은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 비-인간 동물에 의해 생산된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 완충액, 희석액, 부형제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 원하는 경우 하나 이상의 또 다른 치료 활성 물질을 추가로 함유할 수 있다.
본원에 제공된 약제학적 조성물에 대한 설명은 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 모든 부류의 동물에 투여하기에 일반적으로 적합하다는 것을 본 기술분야의 기술자라면 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물에게 투여하기에 적합하도록 하기 위한, 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되어 있고, 통상적으로 숙련된 수의학 약리학자는 만일 존재한다면 일상적인 실험을 이용하여 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
예를 들어, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 멸균 주사가능 형태(예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 주사 전에 수성 희석제 (예를 들어, 물, 완충액, 염 용액 등)에 의해 재구성될 수 있는 분말(예를 들어, 동결건조 및/또는 멸균된 것)로서, 선택적으로 진공 하에 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 인산염 완충 식염수 등에 희석 및/또는 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분말은 수성 희석제와 부드럽게 혼합되어야 한다(예를 들어, 진탕되지 않음).
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 기술에 공지되거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 준비 방법은 활성 성분을 희석제 또는 다른 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연관시키는 단계, 및 그 다음, 필요한 경우 및/또는 바람직한 경우, 원하는 단일 또는 다중 용량 단위로 생성물을 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스)에 의해 생산된 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 보관 또는 투여를 위한 용기, 예를 들어, 바이알, 주사기(예를 들어, IV 주사기), 또는 백(예를 들어, IV 백)에 포함될 수 있다. 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 벌크(bulk), 단일 단위 용량, 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 소정량 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물에서 활성 성분, 약제학적 허용성 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적 양은 치료 대상체의 신원, 체격 및/또는 상태에 따라, 또한 조성물이 투여되어야 하는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w) 사이의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 약제학적 허용성 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 본원에 사용된 바와 같이 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 원하는 특정 투여 형태에 적합한 경우, 포함한다. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)는 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 부형제 매질이 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 달리 상호작용하거나 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생산하는 것과 같이 물질 또는 이의 유도체와 상용할 수 없는 경우가 아닌 한, 그의 사용은 본 개시내용의 범위 내인 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 약제학적 허용성 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간용 및 수의용으로 승인된 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국식품의약국의 승인을 받은 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 약제 등급이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 기준을 맞춘 것이다.
약제학적 조성물의 제조에 사용되는 약제학적 허용성 부형제는 비활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충화제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 약제학적 제형에 선택적으로 포함될 수 있다. 코코아 버터 및 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및/또는 방향제와 같은 부형제는 조제자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 허용성 부형제(예를 들어, 보존제, 비활성 희석제, 분산제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 냉장 및/또는 냉동될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 냉장 및/또는 냉동될 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 특정 기간(예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월 또는 그 이상) 동안 보관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 명시된 시간보다 더 긴 시간 동안 항체 조성물의 보관은 항체 분해를 초래한다.
액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색되거나 혼탁해지면 및/또는 여과 후 미립자 물질이 남아 있다면, 용액은 사용하지 않아야 한다.
약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려 사항은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005에서 찾아볼 수 있다.
키트
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 비-인간 세포, 단백질(단일 또는 복합체(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)), DNA 단편, 표적화 벡터, 또는 이의 임의의 조합으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 팩 또는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 임의의 적용가능한 방법(예를 들어, 연구 방법)에 사용될 수 있다. 선택적으로 이러한 용기와 연관되어, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 안내문이 있을 수 있으며, 이 안내문은 (a) 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인, (b) 사용 지침, 및/또는 (c) 2 이상의 실체 간에 물질 및/또는 생물학적 산물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물 또는 비-인간 세포)의 이전을 관리하는 계약서 및 이들의 조합을 반영한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아 유래의 아미노산(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아 유래의 핵산(예를 들어, 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산)을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물, 비-인간 세포, 비-인간 조직, 불멸화 세포, 비-인간 ES 세포, 또는 비-인간 배아로부터 식별된 서열(아미노산 및/또는 핵산 서열)을 포함하는 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 치료용 또는 진단용 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 질병, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 호전을 위한 약물(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트가 제공된다.
특정 실시양태의 다른 특징은 예시적인 실시양태에 대한 하기 설명 과정에서 명백해질 것이며, 이는 예시를 위해 제공되고 제한하려고 의도된 것이 아니다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 본 기술분야의 기술자에게 설명하기 위해 제공된 것이며; 본 개시내용의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다. 달리 표시되지 않는 한, 온도는 섭씨로 표시되고 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
일반적으로, 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 운반하는 표적화 벡터는 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 제조했다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659, 각각 본원에 참고로 포함됨). 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론은 단일 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역을 함유하는 게놈 작제물을 생성하기 위해 변형시켰다. 작제물은 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 결실되도록 사전에 변형된 내인성 κ 경쇄 유전자좌 내로 삽입했다.
실시예 1 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 표적화 벡터의 생성
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2는 본 기술분야에서 인정된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조했다. 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2에 포함된 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절은 각각 인간 Vλ1-51 생식계열 서열 및 인간 Jλ2 생식계열 서열을 갖고 있었다.
DNA 단편은 de novo DNA 합성(Blue Heron Biotech)에 의해 제조했다. 이 단편은 AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vλ1-51 5' 비해독 영역(UTR), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412 bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), 및 PI-SceI 부위를 함유했다(서열번호 31; 도 1a 및 도 9a 내지 9c 참조).
상기 단락에 기재된 단편은 도 1a에서 표적화 벡터 A를 생산하기 위해 이전에 기술된 표적화 벡터에 결찰시켰다. 이전에 기재된 표적화 벡터는 BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역, PI-SceI 부위, 및 BAC CT7-254m04에서 유래된 ~75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다(예를 들어, 미국 특허 제9,334,334호의 도 14b, 및 미국 특허 제10,143,186호의 도 2 참조, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 마우스 상동성 암은 본원에 참고로 포함된 Macdonald 등(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 이미 기술된 것과 동일했다. 5' 암은 내인성 카파 유전자좌의 상류에 약 23kb의 게놈 서열을 함유했고, 3' 암은 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손 및 마우스 κ 유전자좌의 하류에 약 72kb의 게놈 서열을 함유했다. 도 1a 참조.
표적화 벡터 A는 5'에서 3'쪽으로, BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vκλ1-51 5' 미해독 영역(UTR), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ1-51 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), PI-SceI 부위, 및 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손, 및 마우스 κ 유전자좌 하류의 약 72kb의 게놈 서열을 포함하는 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다.
실시예 2 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 ES 세포의 생성
실시예 1에 기재된 바와 같은 표적화 벡터 A가, 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체하고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포에 전기천공된다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 이는 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용될 수 있는 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 3에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 이하 표 A의 것 중에 나열된다.
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 3 참조)는 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화된 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 작제물에 의해 형질감염된다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거된다(예를 들어, US 6,774,279, 전체가 참고로 포함됨). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 3 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 2에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입된다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99, 각각 본원에 참고로 포함됨). 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등, 이는 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 유전자형분석에 의해 식별된다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유할 수 있다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대한 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ1-51/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출된다.
실시예 4 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 표적화 벡터의 생성
표적화 벡터 A에서 마우스 Cκ를 마우스 Cλl로 대체하기 위해, 추가 클로닝 단계를 수행하였다(도 1b 참조). 표적 벡터 A는 2개의 Cas9:gRNA 복합체, 즉 인트론성 카파 인핸서(Ei)의 제1 절단 상류 및 Cκ의 제2 절단 하류로 시험관내에서 절단했다. 그 다음, 깁슨(Gibson) 어셈블리를 수행하여, Cas9-절단된 표적화 벡터의 3' 단부와 45bp 중첩, Ei, 마우스 Cλ1, loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트 및 Cas9-절단된 표적화 벡터의 5' 단부와 80bp 중첩을 함유하는 4.9kb 합성 단편으로 결실된 영역을 교체했다. 합성 단편은 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2018/063841의 도 1a의 플라스미드 pE의 제한 단편으로부터 얻었다. 결과적으로 수득되는 표적화 벡터인 표적화 벡터 B가 도 1b에 도시된다.
표적화 벡터 B는 마우스 Cκ가 마우스 Cλ1로 대체되었고 loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트가 Cκ polyA 신호의 하류에 삽입되었다는 점을 제외하고는 표적화 벡터 A와 동일하다.
실시예 5 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 ES 세포의 생성
실시예 4에 기재된 바와 같은 표적화 벡터 B는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체되고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공했다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능성 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함했다(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출했다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인되었다(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 4에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 상기 표 A의 것 중에 나열되어 있다.
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 4 참조)는 FRT화된 네오마이신 또는 Flox화된 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP 및/또는 CRE를 발현하는 작제물로 형질감염시켰다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거할 수 있고(예를 들어, US 6,774,279, 이는 전체가 참고로 포함됨), 및/또는 하이그로마이신 카세트는 CRE 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거할 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 및/또는 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 6 - 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1에서 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 5에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 마우스 Cλ1의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별되었다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유한다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 변형된 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ1-51/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출했다.
실시예 7 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 표적화 벡터의 생성
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2는 본 기술분야에서 인정된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조했다. 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2에 포함된 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절은 각각 인간 Vλ2-14 생식계열 서열 및 인간 Jλ2 생식계열 서열을 가졌다.
DNA 단편은 de novo DNA 합성(Blue Heron Biotech)에 의해 제조했다. 이 단편은 AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vλ1-51 5' 비해독 영역(UTR), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412 bp(Jκ5 스플라이스 공여체 부위(SD) 포함), 및 PI-SceI 부위를 함유했다(서열번호 36; 도 2a 및 도 13a 내지 13c 참조).
상기 단락에 기재된 단편을 도 2a의 표적화 벡터 C를 생산하기 위해 이전에 기술된 표적화 벡터에 결찰시켰다. 이전에 기재된 표적화 벡터는 BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역, PI-SceI 부위, 및 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유했다(예를 들어, 미국 특허 제9,334,334호의 도 14b, 및 미국 특허 제10,143,186호의 도 2 참조, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 마우스 상동성 암은 본원에 참고로 포함된 Macdonald 등(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 이미 기술된 것과 동일했다. 5' 암은 내인성 카파 유전자좌의 상류에 ~23kb의 게놈 서열을 함유했고, 3' 암은 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손 및 마우스 κ 유전자좌의 하류에 약 72kb의 게놈 서열을 함유했다. 도 2a 참조.
표적화 벡터 C는 5'에서 3'쪽으로, BAC CT7-302g12 유래의 약 23kb 5' 마우스 상동성 암, Frt-Ub-Neo-Frt 카세트, AscI 부위, 2kb의 인간 Vλ1-51 프로모터 영역, 인간 Vκλ1-51 5' UTR, 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 엑손 1의 암호 서열(리더 펩타이드를 암호화하는 서열 포함), 인간 Vλ2-14 유전자 분절의 인트론 1, 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 Jλ2 유전자 분절의 제2 엑손을 포함하는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 가변 서열, 인간 Jκ5-Cκ 인트론의 처음 412bp(Jκ5 스플라이스 부위(SD) 포함), PI-SceI 부위, 및 약 2.4kb의 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손, 및 마우스 κ 유전자좌 하류의 약 72kb의 게놈 서열을 포함하는 BAC CT7-254m04에서 유래된 약 75kb 3' 마우스 상동성 암을 함유한다.
실시예 8 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 ES 세포의 생성
표적화 벡터 C는, 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절이 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체되고 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자를 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공된다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합된 클론에 대한 선택은 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터의 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 이는 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용된 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 5에서 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 이하 표 A의 것 중에 나열된다.
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포(도 5 참조)는 표적화 작제물에 의해 도입된 FRT화된 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 작제물로 형질감염시킨다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거된다(예를 들어, US 6,774,279, 전체가 참고로 포함됨). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 9 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ로부터 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 8에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시킨다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1): 91-99, 각각 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등, 이는 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별한다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유할 수 있다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 한 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ 및 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cκ를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ2-14/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출된다.
실시예 10 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 표적화 벡터의 생성
표적화 벡터 C에서 마우스 Cκ를 마우스 Cλl로 대체하기 위해, 추가 클로닝 단계를 수행하였다(도 2b 참조). 표적 벡터 C는 2개의 Cas9:gRNA 복합체, 즉 인트론성 카파 인핸서(Ei)의 제1 절단 상류 및 Cκ의 제2 절단 하류로 시험관내에서 절단되었다. 그 다음, 깁슨(Gibson) 어셈블리를 수행하여, Cas9-절단된 표적화 벡터의 3' 단부와 45bp 중첩, Ei, 마우스 Cλ1, loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트및 Cas9-절단된 표적화 벡터의 5' 단부와 80bp 중첩을 함유하는 4.9kb 합성 단편으로 결실된 영역을 교체했다. 합성 단편은 본원에 참고로 포함되는 PCT/US2018/063841의 도 1A의 플라스미드 pE의 제한 단편으로부터 얻었다. 결과적으로 수득되는 표적화 벡터인 표적화 벡터 D는 도 2b에 도시된다.
표적화 벡터 D는 마우스 Cκ가 마우스 Cλ1로 대체되었고 loxP-Ub-Hyg-loxP 카세트가 Cκ polyA 신호의 하류에 삽입되었다는 점을 제외하고는 표적화 벡터 C와 동일하다.
실시예 11 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 ES 세포의 생성
표적화 벡터 D는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절을 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1로 대체하고 면역글로불린 중쇄 유전자좌에, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 마우스 ES 세포 내로 전기천공한다. 마우스 ES 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 또한 기능성 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함한다(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제10,130,081호 참조). 상동성 재조합을 겪은 클론의 선택은 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1로부터 항체를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 산출한다.
양성 ES 세포 클론은 내인성 κ 유전자좌에 삽입된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 TAQMAN™ 선별에 의해 확인된다(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨). 검출에 사용되는 다양한 프로브의 대략적인 위치는 도 6에 원형 대시 마크로 표시된다. 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 상기 표 A의 것 중에 나열되어 있다.
재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1(도 6 참조)을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 ES 세포는 FRT화된 네오마이신 또는 Flox화된 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP 및/또는 CRE를 발현하는 작제물에 의해 형질감염시킨다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거하며(예를 들어, US 6,774,279, 이는 전체가 참고로 포함됨), 및/또는 하이그로마이신 카세트는 CRE 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종하여 제거한다. 선택적으로, 네오마이신 및/또는 하이그로마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
실시예 12 - 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1에서 유래된 경쇄를 발현하는 마우스의 생성
상기 실시예 11에 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시킨다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등(2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조, 각각 전체가 본원에 참고로 포함됨). 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 VELOCIMICE®는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 마우스 Cλ1의 존재를 검출하는 대립유전자 검정의 변형(상기 Valenzuela 등 참조, 본원에 참고로 포함됨)을 사용한 유전자형분석에 의해 식별된다. 하나의 유전자좌 대립유전자에서 마우스 Cλ1에 연결된 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2를 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유하는 마우스는 제2 유전자좌 대립유전자에서 마우스 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌를 보유할 수 있고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유한다.
마우스는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 변형된 κ 경쇄 유전자좌에 대한 동형접합성, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성으로 육종된다. 1가지 방법으로, 이것은 먼저 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자에서 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자에 마우스 Cκ에 연결된 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌, 및 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자(중쇄 대립유전자 둘 모두에)를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를, 이하에 더 설명되는 바와 같은, 내인성 중쇄 및 경쇄 카파 유전자좌의 녹아웃(KO) 및 선택적으로 또한 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하는 마우스로 육종함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 내인성 경쇄 카파 유전자좌의 KO, 선택적으로 내인성 람다 유전자좌의 KO를 포함하고, 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절 및 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스로 육종될 수 있다. 결과적으로 생성된 마우스는 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
새끼는 유전자형분석되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 및 마우스 Cλ1을 포함하는 조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 새끼가 선택되고, 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 또는 이의 체세포적 과돌연변이된 변이체로부터의 인간 λ 경쇄 가변 도메인의 발현이 평가되고 특성화된다. 본원에 기재된 조작된 경쇄를 포함하는 마우스에서 인간 Vλ12-14/Jλ2의 B 세포 표면 발현은 FACS 분석을 사용하여 검출한다.
실시예 13 - 마우스 육종
본 실시예는 다수의 유전자 변형된 면역글로불린 유전자좌를 보유하는 다수의 유전자 변형된 마우스 계통을 생성하기 위해 본원에 기술된 유전자 변형된 마우스 중 어느 하나로 육종될 수 있는 몇몇 유전자 변형된 마우스 계통을 설명한다.
마우스가 재배열된 인간 Igλ 가변 도메인을 갖는 경쇄 및 재배열된 인간 중쇄 가변 도메인을 갖는 중쇄를 발현하도록 본원에 기재된 조작된 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성인 마우스를 초래하는 많은 다양한 육종 계획이 구상된다. 하나의 이러한 계획에서, 하나의 경쇄 유전자좌 대립유전자(내인성 카파 유전자좌에서) 상의 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 및 제2 경쇄 유전자좌 대립유전자(내인성 카파 유전자좌에서)에서 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1에 대해 이형접합성이고, 상기 기재된 재배열되지 않은 인간 VH, D 및 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 상기 실시예 3, 6, 9, 및 12에 기재된 유전자 변형된 마우스는, 내인성 마우스 Igκ, Igλ 및 Ig 중쇄 유전자좌의 결실에 대해 동형접합성인 마우스로 육종된다. 재배열된 λ 경쇄 가변 도메인을 발현하는 결과적으로 생성된 자손은 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄에 대해 동형접합성이고 재배열되지 않은 인간 VH, D, 및 JH 유전자 분절(또한 상기 기재된 바와 같은 기능적 마우스 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함함)을 포함하는 조작된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스를 얻기 위해 서로 육종된다. 육종은 본 기술분야에서 인정받은 표준 기술에 의해, 대안적으로 상업적 육종자(예를 들어, The Jackson Laboratory)에 의해 수행된다.
내인성 Igκ 녹아웃(Igκ KO). 예를 들어, 전술한 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Igκ 경쇄 유전자좌가 내인성 Igκ 경쇄를 발현할 수 없게 하는 내인성 Igκ 유전자좌 전체 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이러한 예시적인 마우스는 본원에 참고로 포함되는 Macdonald 등 (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111:5147-52에 기술되어 있다.
내인성 Igλ 녹아웃(Igλ KO). 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 사용법을 최적화하기 위해, 상기 기재된 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스를, 내인성 Igλ 경쇄 유전자좌가 내인성 λ 경쇄를 발현할 수 없도록 하는 내인성 Igλ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 함유하는 마우스로 육종된다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,066,502호의 실시예 1 참조). 이러한 방식으로, 수득한 자손은 이들의 유일한 λ 경쇄로서, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리로부터 발현된 가변 도메인을 갖는 경쇄를 발현할 것이다(예를 들어, 실시예 3, 6, 9 및 12에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 Vλ/Jλ). 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리 및 내인성 λ 경쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 보유하는 마우스 계통은 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 선별된다.
내인성 Ig 중쇄 녹아웃(IgH KO). 예를 들어, 전술한 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Ig 중쇄 유전자좌가 내인성 Ig 중쇄를 발현할 수 없게 하는 내인성 Ig 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이러한 예시적인 마우스는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제10,457,960호의 실시예 7에 기술되어 있다.
따라서, 전술한 바와 같이, 상기 기재된 바와 같은 재배열된 인간 람다 경쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스는 내인성 Igλ, Igκ, 및/또는 Ig 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 마우스로 육종될 수 있다. 이후 자손은 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 변형된 및/또는 내인성 면역글로불린 유전자좌, 예를 들어, 인간화된 람다 경쇄 및 중쇄 유전자좌에서 동형접합성으로 육종된다.
실시예 14 - 중쇄 유전자 사용법 및 람다 경쇄의 체세포 과돌연변이 빈도
재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역 및 상기 본원에 기재된 인간 중쇄 가변 영역에 의한 내인성 중쇄 가변 영역의 대체를 포함하는 마우스로부터의 중쇄 유전자 사용법은 본 기술분야에 알려진 여러 방법을 통해 결정될 수 있다. 이러한 하나의 방법으로, 차세대 시퀀싱 기술이 사용된다.
보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 재배열된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 마우스 및 상기 본원에 기재된 인간 중쇄 가변 영역에 의한 내인성 중쇄 가변 영역의 대체를 포함하는 마우스로부터 수확된 비장세포 또는 골수는 이들 항체의 중쇄 가변 영역 분절 사용법에 대해 분석된다. 2.5% 소태아혈청(FBS)을 함유하는 1x 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)로 대퇴골을 플러싱하여 대퇴골에서 골수를 수집하고, 필요한 경우 골수 세포를 상이한 B 세포 아형에 대해 FACS 분류한다. 단세포 현탁액은 마우스 비장에서 제조한다. 비장 및 골수 제조물로부터의 적혈구는 ACK 용해 완충액(Gibco)으로 용해한다. 비장 B 세포는 항-CD19(마우스, B 세포용 마커) 자기 비드 및 MACS® 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용한 자기 세포 분류법에 의해 총 비장 세포로부터 양성적으로 농축된다. 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 RNeasy Plus RNA 단리 키트(Qiagen)를 사용하여 골수 및 정제된 비장 B 세포로부터 단리한다.
SMARTer™ RACE cDNA 증폭 키트(Clontech) 및 IgM 또는 IgG 특이적 프라이머를 사용하여 IgM 또는 IgG 불변 영역 서열을 함유하는 인간 중쇄 cDNA를 생성하기 위해 역전사를 수행한다. 역전사 동안, 주형 전환(TS) 프라이머의 역 보체인 DNA 서열을 새로 합성된 cDNA의 3' 단부에 부착한다. 정제된 cDNA는 2회의 세미-네스티드(semi-nested) PCR에 의해 증폭시켜 mRNA가 수득된 세포에 의해 발현되는 전체 IgM 또는 IgG 가변 도메인 보체를 암호화하는 복수의 cDNA를 생성한 다음, 시퀀싱 프라이머 및 인덱스를 부착하기 위한 3차 PCR에 의해 증폭시킨다. 인간 가변 도메인 cDNA는 시퀀싱을 위해 샘플을 MiSeq 시퀀서(Illumina)에 로딩하기 전에, Pippin Prep(SAGE Science)를 사용하여 크기를 선택하고 KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)를 사용하여 qPCR로 정량한다.
생물정보학 분석을 위해, Raw Illumina 서열은 탈-다중화하고, 품질, 길이 및 상응하는 IgM 또는 IgG 불변 영역 유전자 프라이머에 대한 정합(match)에 기초하여 필터링한다. 중첩되는 쌍을 이룬-단부 판독값(paired-end read)은 맞춤형 사내 파이프라인을 사용하여 병합 및 분석한다. 파이프라인은 IgBLAST(NCBI, v2.2.25+)의 로컬 설치를 사용하여 재배열된 중쇄 서열을 인간 생식계열 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절 데이터베이스에 정렬하며, 정지 코돈의 존재와 함께 생산적 및 비생산적 접합을 나타낸다. CDR3 서열 및 예상되는 비-주형 뉴클레오타이드는 IMGT(International Immunogenetics Information System)에서 정의된 바와 같은 경계를 사용하여 추출한다.
상기 방법은 본원에 기술된 보편적인 재배열된 인간 경쇄 마우스에서 특정 인간 VDJ 재배열의 빈도 뿐만 아니라 다양한 인간 V, D, 및 J 분절 사용법을 결정할 수 있게 한다.
유사한 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 보편적으로 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역을 포함하는 마우스의 람다 경쇄에서 체세포 과돌연변이의 존재 및 빈도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 마우스 Cλ(예를 들어, Cλ1) 불변 영역에 연결된 보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역을 포함하는 마우스의 경우, 위에서 설명한 역전사 PCR을 수행하여 면역글로불린 Cλ(예, Cλ1) 특이적 프라이머를 사용하여 면역글로불린 λ 불변영역(예를 들어, Cλ1) 유전자 서열을 함유하는 cDNA를 생성하고, 재배열된 경쇄 서열을 인간 생식계열 Vλ 및 Jλ 유전자 분절 데이터베이스에 정렬하기 위해 생물정보학적 분석을 수행한다. 마우스 Cκ 불변 영역에 연결된 보편적인 재배열된 인간 Vλ1-51/Jλ2 또는 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 가변 영역의 경우, 마우스 Cκ 특이적 프라이머가 대신 사용된다. 람다 경쇄에서 체세포 과돌연변이의 존재 및 빈도가 정량된다.
실시예 15 - 마우스로부터 인간 항체의 생성
제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리(예를 들어, 실시예 3, 6, 9 및 12에 기재된 바와 같은 재배열된 인간 Vλ/Jλ)를 포함하는 마우스를 다른 내인성 Ig 유전자좌의 변형 및 결실을 함유하는 다양한 바람직한 계통으로 육종한 후(예를 들어, 실시예 13에 기재된 바와 같음), 선택한 마우스는 관심 항원으로 면역화할 수 있다.
일반적으로, 제한적 인간 λ 경쇄 가변 영역 레퍼토리를 포함하는 마우스(이들의 생식계열 게놈에 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절 및 내인성 λ 유전자좌의 제거 여부에 관계없이 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자좌 대신 조작된 Vλ1- 51/Jλ2 인간 경쇄 영역 또는 조작된 Vλ2-14/Jλ2 인간 경쇄 영역(상기 기술됨)으로의 대체를 포함하는 마우스)는 관심 항원으로 면역화한다. 혈액을 수집하고 항체 면역 반응을 표준 항원 특이적 ELISA 면역검정으로 모니터링한다.
원하는 면역 반응이 달성되면, 1가지 방법으로, 비장세포(및/또는 다른 림프 조직)를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합하여 그의 생존력을 보존하고 불멸성 하이브리도마 세포주를 형성한다. 생성된 하이브리도마 세포주는 항원-특이적 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 식별하기 위해 선별(예를 들어, ELISA 검정에 의해) 및 선택한다. 하이브리도마는 원하는 경우 상대적인 결합 친화도 및 아이소타입에 대해 추가로 특성화될 수 있다. 이 기술 및 상기 기재된 면역원을 사용하여, 여러 항원 특이적 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 보유하는 항체)를 수득한다.
대안적으로, 또 다른 방법으로, 본원에 기술되고/되거나 예시된 조작된 마우스의 B 세포에 의해 생성된 항원-특이적 키메라 항체, 및/또는 이의 λ 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA가 항원-특이적 B 세포로부터 직접 단리될 수 있다. 예를 들어, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고친화성 키메라 항체를 단리하여 특성화할 수 있으며, 관심 있는 특별한 항체(및/또는 이를 생성하는 B 세포)가 지정된다. 몇 가지 예를 들자면, 이러한 항체, 및/또는 이의 가변 및/또는 불변 영역의 평가된 특성은 에피토프의 친화도, 선택성, 동일성 등 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 항원 특이적 항체는, 예를 들어, 본원에 전체가 참고로 특별히 포함되는 미국 특허 제7,582,298호에 기재된 바와 같이, 골수종 세포에 융합함이 없이, 항원-양성 B 세포(면역화된 마우스 유래)로부터 직접 단리된다.
중쇄 및 λ 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 단리되거나 달리 제조될 수 있고, 완전-인간 항체의 제조를 위해, 각각 인간 중쇄 불변 영역(예를 들어, 원하는 아이소타입의 것) 및 인간 λ 경쇄 불변 영역에 연결될 수 있다. 단리된 중쇄 및 λ 경쇄 가변 영역은 체세포적으로 돌연변이될 수 있다. 이것은 항원 특이적 레퍼토리에 또 다른 다양성을 추가한다. 완전-인간 항체(및/또는 이의 중쇄 또는 λ 경쇄)는 세포, 전형적으로 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 그 다음, 완전 인간 항체는 관심 항원의 상대적 결합 친화도 및/또는 중화 활성에 대해 특성화될 수 있다.
실시예 16 - 이중특이적 항체의 결합 친화도
완전 인간 이중특이적 항체는 본 기술분야에 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 상기 기재된 관심 항원에 특이적인 선택된 단일특이적 항체의 클로닝된 인간 중쇄 가변 영역으로부터 작제된다. 간략하게, 조작된 인간 Vλ1-51/Jλ2 경쇄 또는 조작된 인간 Vλ2-14/Jλ2 경쇄 영역을 포함하는 마우스로부터 수득된 2개의 선택된 단일특이적 항체로부터의 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 2개의 인간 중쇄는 그 마우스에 존재하는 것과 동일한 λ 가변 영역, 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 인간 경쇄와 함께 적합한 세포주에서 발현되고; 원하는 특성(예를 들어, 2개의 항원에 대한 원하는 친화성)을 포함하는 이중특이적 항체가 수득된다.
항원의 전부 또는 일부에 대한 관심 항원에 특이적인 이중특이적 또는 모 단일특이적 항체의 결합은 BIACORE™ 2000 기기(GE Healthcare)에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 결정한다.
특정 실시양태
실시양태 1. 유전자 변형된 설치류로서, 이의 생식계열 게놈이
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
를 포함하고, 여기서 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 생식계열 게놈이 하기를 추가로 포함하는 유전자 변형된 설치류:
하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌,
여기서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함함.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류가, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 9. 실시양태 4 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 10. 실시양태 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절을 각각 대체하는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 12. 실시양태 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
(i) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절이 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고,
(ii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절이 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며,
(iii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 13. 실시양태 4 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 14. 실시양태 4 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편이 유전자 변형된 설치류에 의해 발현되는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 16. 실시양태 14 또는 15에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함되는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 17. 실시양태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 18. 실시양태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 19. 실시양태 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대체하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 20. 실시양태 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절이 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하고, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 있는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 제1 인간 VH 유전자 분절이 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절이 VH6-1인, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 22. 실시양태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 마우스 Cλ1, (ii) 마우스 Cλ2, 또는 (iii) 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 24. 실시양탱 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ1 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 26. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 랫트 Cλ1, (ii) 랫트 Cλ2, (iii) 랫트 Cλ3 또는 (iv) 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 랫트 Cλ 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자가 전적으로 또는 부분적으로 결실된, 유전자 변형된 설치류.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 가변 도메인을 검출가능하게 발현하지 않는 유전자 변형된 설치류.
실시양태 33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류
실시양태 34. 실시양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 랫트 또는 마우스인 유전자 변형된 설치류.
실시양태 35. 제1 유전자 변형된 설치류, 제2 유전자 변형된 설치류, 및 제3 유전자 변형된 설치류를 포함하는 유전자 변형된 설치류의 육종 콜로니로서, 제3 유전자 변형된 설치류가 제1 유전자 변형된 설치류 및 제2 유전자 변형된 설치류의 자손이고, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류는 각각 이들의 생식계열 게놈에:
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하된, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
를 포함하며, 여기서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 면역글로불린 λ 경쇄는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 육종 콜로니.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 육종 콜로니.
실시양태 37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 각각 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내의 인간 Vλ 유전자 분절은 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는, 육종 콜로니.
실시양태 38. 실시양태 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 유전자 변형된 설치류 각각의 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내의 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 육종 콜로니.
실시양태 39. 실시양태 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 유전자 변형된 설치류가 각각 이들의 생식계열 게놈에
하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌
를 포함하고, 여기서 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 육종 콜로니.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 제1, 제2 및 제3 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 육종 콜로니.
실시양태 41. 게놈이 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 설치류 배아.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자에 대해 동형접합성인, 설치류 배아.
실시양태 43. 실시양태 41 또는 42에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류 배아.
실시양태 44. 실시양태 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 설치류 배아.
실시양태 45. 실시양태 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 설치류 배아.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 설치류 배아의 게놈은 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인, 설치류 배아.
실시양태 47. 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류의 B 세포로서,
조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전
을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 B 세포.
실시양태 48. 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류의 B 세포로서,
조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전; 및
조작된 내인성 중쇄 유전자에 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절의 인간 JH 유전자 분절에서 유래하는, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 유전자 변형된 설치류의 B 세포.
실시양태 49. 실시양태 47 또는 48의 B 세포로부터 생성된 하이브리도마.
실시양태 50. 생식계열 게놈에 하기를 포함하는 단일 유전자 변형된 설치류의 B 세포 집단:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로서, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Jλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌,
(b) 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌,
여기서 B 세포 집단에 의해 발현되는 모든 항체는 하기를 포함함:
(i) 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) 적어도 2개의 상이한 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인.
실시양태 51. 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 줄기 세포로서, 여기서 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 줄기 세포.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 줄기 세포의 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 줄기 세포.
실시양태 53. 실시양태 51 또는 52에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기 세포.
실시양태 54. 실시양태 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기 세포.
실시양태 55. 실시양태 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 줄기 세포.
실시양태 56. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 포유동물 세포로서, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 또는 둘 모두가 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류로부터 식별되는, 포유동물 세포.
실시양태 57. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 항체:
(a) 실시양태 1-34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 유전자 변형된 설치류가 관심 항원에 대한 면역 반응을 생성하기에 충분한 조건 하에서 유전자 변형된 설치류를 유지시키는 단계; 및
(c) 유전자 변형된 설치류로부터 하기를 회수하는 단계:
(i) 관심 항원에 결합하는 항체,
(ii) 관심 항원에 결합하는 항체의 인간 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인, 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드, 또는
(iii) 관심 항원에 결합하는 항체를 발현하는 세포,
여기서, (c)의 항체는 인간 중쇄 가변 및 인간 λ 경쇄 가변 도메인을 포함함.
실시양태 58. 항체를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 항원에 노출시키는 단계;
(b) 유전자 변형된 설치류가 항원에 대한 면역 반응을 발생하도록 하는 단계; 및
(c) 유전자 변형된 설치류로부터의 항원에 특이적인 항체, 항원에 특이적인 항체를 발현하는 B 세포, 또는 항원에 특이적인 항체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 단리하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 59. 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법:
(a) 2개의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 및 2개의 인간 면역글로불린 중쇄를 포함하는 상기 항체를 포유동물 세포에서 발현시키는 단계로서, 여기서 각각의 인간 면역글로불린 λ 경쇄는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하고 각각의 인간 면역글로불린 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, λ 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, 또는 이들의 조합의 아미노산 서열은 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류에서 식별되었던 것인 단계; 및
(b) 항체를 수득하는 단계.
실시양태 60. 실시양태 58 또는 59에 있어서, 항체가 이중특이적 항체인 방법.
실시양태 61. 이중특이적 항체의 제조 방법:
(a) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 제1 유전자 변형된 설치류를 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계,
(b) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 제2 유전자 변형된 설치류를 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계,
(c) 제1 유전자 변형된 설치류로부터 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(d) 제2 유전자 변형된 설치류로부터 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(e) 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(f) 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2 인간 중쇄를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(g) 포유동물 세포에서 하기를 발현시키는 단계:
(i) 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 62. 이중특이적 항체를 제조하는 방법:
(a) 포유동물 세포에서
(i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열
을 발현시키는 단계를 포함하고;
여기서, 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 제1 유전자 변형된 설치류에서 제1 항체로부터 식별된 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제1 항체는 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하며;
제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 제2 유전자 변형된 설치류에서 제2 항체로부터 식별된 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 여기서 제2 항체는 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하며;
여기서 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 각각 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나에 따른 유전자 변형된 설치류이고;
여기서 제3 뉴클레오타이드의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전인, 방법.
실시양태 63. 실시양태 59 또는 62에 있어서, 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 동일한 유전자 변형된 설치류인 방법.
실시양태 64. 실시양태 59 또는 62에 있어서, 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 상이한 유전자 변형된 설치류인 방법.
실시양태 65. 실시양태 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 항원은 동일한 항원이고, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 에피토프인 방법.
실시양태 66. 실시양태 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 항원은 상이한 항원인 방법.
실시양태 67. 인간 면역글로불린 중쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 형성하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 68. 실시양태 67의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄.
실시양태 69. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 70. 실시양태 69의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인.
실시양태 71. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 35 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계, 및
(b) 유전자 변형된 설치류로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 단리하는 단계
를 포함하고, 여기서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체는 각각 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인에 결합하며,
집합체 내의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이루는 인간 λ 경쇄 가변 도메인이 항원에 결합하는, 방법.
실시양태 72. 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 형성시키는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 73. 실시양태 72의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄.
실시양태 74. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 75. 실시양태 74의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인.
실시양태 76. 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 77. 실시양태 76의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 78. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 4 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 79. 실시양태 78의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 80. 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계.
를 포함하는 방법.
실시양태 81. 실시양태 80의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 82. 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 항원에 특이적으로 결합하고 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
실시양태 83. 실시양태 82의 방법에 의해 생성된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
실시양태 84. 하기를 포함하는 표적화 벡터:
(i) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에 5' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' 상동성 암;
(ii) Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역;
(iii) 설치류 Cλ 유전자 분절; 및
(iv) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에 3' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' 상동성 암.
실시양태 85. 실시양태 84에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 벡터.
실시양태 86. 실시양태 84 또는 85에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 벡터.
실시양태 87. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계.
실시양태 88. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계.
실시양태 89. 실시양태 87 또는 88에 있어서, 설치류 ES 세포의 게놈이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 방법.
실시양태 90. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계.
실시양태 91. 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단계.
실시양태 92. 실시양태 90 또는 91에 있어서, 설치류 ES 세포의 게놈이
조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절
을 포함하는 방법.
실시양태 93. 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈에 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 단계로서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단계를 포함하며,
이로써, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 방법.
실시양태 94. 실시양태 93에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
(b) 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 조작하는 단계로서,
이로써, 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함함.
실시양태 95. 실시양태 93 또는 94에 있어서, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)가 설치류 ES 세포에서 수행되는 방법.
실시양태 96. 실시양태 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에는 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있는 방법.
실시양태 97. 실시양태 93 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 및 Vλ2-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
실시양태 98. 실시양태 93 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 및 Jλ7로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
실시양태 99. 실시양태 94 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신하는 방법.
실시양태 100. 실시양태 94 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절 각각을 대체하는 방법.
실시양태 101. 실시양태 94 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자인 방법.
실시양태 102. 실시양태 94 내지 101 중 어느 하나에 있어서,
(i) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절이 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고,
(ii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절이 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 조합, 및
(iii) 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합
을 포함하는 방법.
실시양태 103. 실시양태 94 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에는 기능적 내인성 설치류 Adam6 유전자가 결여되어 있는 방법.
실시양태 104. 실시양태 94 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
실시양태 105. 실시양태 104에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편이 유전자 변형된 설치류에 의해 발현되는, 방법.
실시양태 106. 실시양태 104 또는 105에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌와 동일한 염색체 상에 포함되어 있는, 방법.
실시양태 107. 실시양태 104 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시양태 108. 실시양태 104 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대신하는, 방법.
실시양태 109. 실시양태 104 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 Adam6 유사유전자를 대체하는, 방법.
실시양태 110. 실시양태 104 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절이 제1 및 제2 인간 VH 유전자 분절을 포함하고, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 제1 인간 VH 유전자 분절과 제2 인간 VH 유전자 분절 사이에 있는, 방법.
실시양태 111. 실시양태 110에 있어서, 제1 인간 VH 유전자 분절이 VH1-2이고 제2 인간 VH 유전자 분절이 VH6-1인, 방법.
실시양태 112. 실시양태 104 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 인간 VH 유전자 분절과 인간 DH 유전자 분절 사이에 있는, 방법.
실시양태 113. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 마우스 Cλ1, (ii) 마우스 Cλ2, 또는 (iii) 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 방법.
실시양태 114. 실시양태 93 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 115. 실시양태 93 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ1 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 116. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 (i) 랫트 Cλ1, (ii) 랫트 Cλ2, (iii) 랫트 Cλ3 또는 (iv) 랫트 Cλ4 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 방법.
실시양태 117. 실시양태 93 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 설치류 Cλ 유전자가 랫트 Cλ 유전자를 포함하는, 방법.
실시양태 118. 실시양태 93 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신하는, 방법.
실시양태 119. 실시양태 93 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대체하는, 방법.
실시양태 120. 실시양태 93 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 설치류의 생식계열 게놈이 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 121. 실시양태 93 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 내인성 Vλ 유전자 분절, 내인성 Jλ 유전자 분절, 및 내인성 Cλ 유전자가 전적으로 또는 부분적으로 결실되는, 방법.
실시양태 122. 실시양태 93 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 설치류가 랫트 또는 마우스인 방법.
등가물
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SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A LIMITED LAMBDA LIGHT CHAIN REPERTOIRE
EXPRESSED FROM THE KAPPA LOCUS AND USES THEREOF
<130> 2010794-2050
<140>
<141>
<150> 62/857,712
<151> 2019-06-05
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 317
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 1
gccagcccaa gtcttcgcca tcagtcaccc tgtttccacc ttcctctgaa gagctcgaga 60
ctaacaaggc cacactggtg tgtacgatca ctgatttcta cccaggtgtg gtgacagtgg 120
actggaaggt agatggtacc cctgtcactc agggtatgga gacaacccag ccttccaaac 180
agagcaacaa caagtacatg gctagcagct acctgaccct gacagcaaga gcatgggaaa 240
ggcatagcag ttacagctgc caggtcactc atgaaggtca cactgtggag aagagtttgt 300
cccgtgctga ctgttcc 317
<210> 2
<211> 314
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 2
gtcagcccaa gtccactccc actctcaccg tgtttccacc ttcctctgag gagctcaagg 60
aaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ccaacttttc cccgagtggt gtgacagtgg 120
cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180
agggcaacaa gttcatggcc agcagcttcc tacatttgac atcggaccag tggagatctc 240
acaacagttt tacctgtcaa gttacacatg aaggggacac tgtggagaag agtctgtctc 300
ctgcagaatg tctc 314
<210> 3
<211> 314
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 3
gtcagcccaa gtccactccc acactcacca tgtttccacc ttcccctgag gagctccagg 60
aaaacaaagc cacactcgtg tgtctgattt ccaatttttc cccaagtggt gtgacagtgg 120
cctggaaggc aaatggtaca cctatcaccc agggtgtgga cacttcaaat cccaccaaag 180
aggacaacaa gtacatggcc agcagcttct tacatttgac atcggaccag tggagatctc 240
acaacagttt tacctgccaa gttacacatg aaggggacac tgtggagaag agtctgtctc 300
ctgcagaatg tctc 314
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 4
Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu
65 70 75 80
Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser
100 105
<210> 5
<211> 105
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 5
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Mus sp.
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65 70 75 80
His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu
100 105
<210> 7
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 7
gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60
gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120
cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180
agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240
gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgtggagaag agtctgtctc 300
ctgcagaatg tgtc 314
<210> 8
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 8
accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60
ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120
tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180
agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240
atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300
gtgctgagtg ttcc 314
<210> 9
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 9
gtcagcccaa gtccactccc acactcacag tatttccacc ttcaactgag gagctccagg 60
gaaacaaagc cacactggtg tgtctgattt ctgatttcta cccgagtgat gtggaagtgg 120
cctggaaggc aaatggtgca cctatctccc agggtgtgga cactgcaaat cccaccaaac 180
agggcaacaa atacatcgcc agcagcttct tacgtttgac agcagaacag tggagatctc 240
gcaacagttt tacctgccaa gttacacatg aagggaacac tgtggaaaag agtctgtctc 300
ctgcagagtg tgtc 314
<210> 10
<211> 314
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 10
accaacccaa ggctacgccc tcagtcaccc tgttcccacc ttcctctgaa gagctcaaga 60
ctgacaaggc tacactggtg tgtatggtga cagatttcta ccctggtgtt atgacagtgg 120
tctggaaggc agatggtacc cctatcactc agggtgtgga gactacccag cctttcaaac 180
agaacaacaa gtacatggct accagctacc tgcttttgac agcaaaagca tgggagactc 240
atagcaatta cagctgccag gtcactcacg aagagaacac tgtggagaag agtttgtccc 300
gtgctgagtg ttcc 314
<210> 11
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 11
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Asp Val Glu Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Ser Gln Gly Val Asp Thr Ala Asn Pro Thr Lys Gln Gly Asn Lys
50 55 60
Tyr Ile Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Thr Ala Glu Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
Arg Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Val
100 105
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 12
Asp Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Thr Asp Lys Ala Thr Leu Val Cys Met Val Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Met Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Gln Pro Phe Lys Gln Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Ala Lys Ala Trp Glu Thr
65 70 75 80
His Ser Asn Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Glu Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 13
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 13
Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Asp Val Glu Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Ser Gln Gly Val Asp Thr Ala Asn Pro Thr Lys Gln Gly Asn Lys
50 55 60
Tyr Ile Ala Ser Ser Phe Leu Arg Leu Thr Ala Glu Gln Trp Arg Ser
65 70 75 80
Arg Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Val
100 105
<210> 14
<211> 105
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 14
Asp Gln Pro Lys Ala Thr Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Lys Thr Asp Lys Ala Thr Leu Val Cys Met Val Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Met Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Gln Pro Phe Lys Gln Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Met Ala Thr Ser Tyr Leu Leu Leu Thr Ala Lys Ala Trp Glu Thr
65 70 75 80
His Ser Asn Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Glu Asn Thr Val Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Ser Arg Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 15
<211> 315
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
cccaaggcca accccacggt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac 60
aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac ttctacccgg gagctgtgac agtggcttgg 120
aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga gtggagacga ccaaaccctc caaacagagc 180
aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac 240
agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct 300
acagaatgtt catag 315
<210> 16
<211> 317
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
cttggaaagc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180
aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240
cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300
cccctacaga atgttca 317
<210> 17
<211> 315
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac 60
aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agttgcctgg 120
aaggcagata gcagccccgt caaggcgggg gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc 180
aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac 240
aaaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agttgcccct 300
acggaatgtt catag 315
<210> 18
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
ggtcagccca aggctgcccc atcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgcctgatc agtgacttct acccgggagc tgtgaaagtg 120
gcctggaagg cagatggcag ccccgtcaac acgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
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gcccctgcag aatgttcata g 321
<210> 19
<211> 317
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcgtaa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
cctggaaggc agatggcagc cccgtcaagg tgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac 180
aaagcaacaa caagtatgcg gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt 240
cccacagaag ctacagctgc cgggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300
cccctgcaga atgctct 317
<210> 20
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 21
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 22
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
35 40 45
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 23
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
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Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 24
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 25
<211> 532
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 25
gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60
gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120
ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180
gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 240
gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 300
gcttcaacag gaatgagtgt tagagacaaa ggtcctgaga cgccaccacc agctccccag 360
ctccatccta tcttcccttc taaggtcttg gaggcttccc cacaagcgac ctaccactgt 420
tgcggtgctc caaacctcct ccccacctcc ttctcctcct cctccctttc cttggctttt 480
atcatgctaa tatttgcaga aaatattcaa taaagtgagt ctttgcactt ga 532
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 26
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 521
<212> DNA
<213> Rattus sp.
<400> 27
gggctgatgc tgcaccaact gtatctatct tcccaccatc cacggaacag ttagcaactg 60
gaggtgcctc agtcgtgtgc ctcatgaaca acttctatcc cagagacatc agtgtcaagt 120
ggaagattga tggcactgaa cgacgagatg gtgtcctgga cagtgttact gatcaggaca 180
gcaaagacag cacgtacagc atgagcagca ccctctcgtt gaccaaggct gactatgaaa 240
gtcataacct ctatacctgt gaggttgttc ataagacatc atcctcaccc gtcgtcaaga 300
gcttcaacag gaatgagtgt tagacccaaa ggtcctgagg tgccacctgc tccccagctc 360
cttccaatct tccctcctaa ggtcttggag acttccccac aagcgaccta ccactgttgc 420
ggtgctccaa acctcctccc cacctcatcc tccttccttt ccttggcttt gatcatgcta 480
atatttgggg aatattaaat aaagtgaatc tttgcacttg a 521
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 28
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln
1 5 10 15
Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg
35 40 45
Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser
65 70 75 80
His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 29
<211> 320
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60
gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120
ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180
gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240
aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300
gcttcaacag gggagagtgt 320
<210> 30
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 31
<211> 2992
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 31
ggcgcgccac ctgcagtgta cacctgaggt gacatggttc tgaacatcac tttccccatt 60
gaaggcccga gtgacctatc acttgcttct caaaattcag gaactaggtg actctaggag 120
agtgcacagg aagctttctg catattcttt caagagattt cgaggtcact gactcttttt 180
tcaagactta aacacaaaat ccacatccat cattcttgcg taaagagacc attctttttt 240
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca agctggagtg cagtggcatg atctcggctc 300
actgcaagct ctgtcttctg ggttcatgcc cttctcctgc ctcagcctcc caagtagctg 360
ggactacagg cacccgccgc catgcccggc taattttttg tattttttag tggagatggg 420
gtttcaacat gttggccaga atggtcttga tctcttgacc tcgtgatcca cccgccttgg 480
cctcccaaag tgctgggatt acaggtgtga gccactgcac ccggcccaag atggggtttc 540
atcatgttga cctggctggt ctcaaactcc caacctcaag tgatccactc acttcagcct 600
cccaaagtgc tgggatgaca ggcgtgagcc acagtgcccg gcctagtaca ttgtttaaat 660
ggtgcatgta aaacctcatg gtactacaac tgcctggtga cagactcacc agagtaaata 720
actatcctgc tgttctccaa ccacatggga ttccccaaac aaagatttgt tgagtccaag 780
atgcatcatg ccagaactct tgcagtcata cacataattt gtttcatttt aataaatacg 840
gttatctttt ttcttcagtt tattgttttt aatgtatcat cttctaggtt tcattacaca 900
tcaaagatga ataatttctc tcatctttag gacatgctga aaacactcat tagtgatttt 960
gaacagtatt atttcctaaa catcctagtt ggaatggttg atcctaaaag ctaccatgtg 1020
tcaggctcac ctgagtgcag actgtggtct aaacaagcta aagttttaat tcttccatct 1080
tcaaatacgg agcatatttg cttgttttgc tctttagcaa aacactgcaa agtcattcgc 1140
caggatctcc tgcagactgg cattcagtga tggagaacag actcctaggt gagatccctg 1200
gtcacaggat ccagatgact atgactgcaa gtctggaaaa gaagagacag aacaaagatt 1260
taccagcata accctctgag aatgtgcccc agccatcctg gagggaagag ctccctattg 1320
acccagcact gcagaatcca cagaggaagg acagctctgg ccaccaggga gcagccacac 1380
gacaagagag gacccggtgt ccccacaggt gaggaaatga gtccatgggg ctggtcagtg 1440
ctctcgattt cattctgcca taacaggact ttgtgtagtc accacctgag tcctatacag 1500
tgaacagcca aggagacatg gacagattca cccctgagga acccagtaga atgtgaagtc 1560
tgccctgagg tcacgaagaa aagactcggg gggctgcctg gcctggccct gatggagggg 1620
gccatggaca gaacaacggg gaggcagggg tgtctctgag aggctctggt caccttgtca 1680
tacaatggtg gtgtacaatg tcgcaccatg gacactaggg ggcgcctgcg caccattcct 1740
gagaagactg ggtgtgatga gagcaggacc agcgccacct gtcctgcttg gtgccctatg 1800
cttagggctc acagatgtca actctccacc ccctgggacc acacagcccc acccctggca 1860
ctctctgaca tcctcaggca gaggagcttg acccagggcc cagggtggga tcagaaagct 1920
ggagggtctg atttgcatgg atggaccctc cttctctcag agtataaaga ggggcaggga 1980
gagacttggg gaagctctgc ttcagctgtg agcgcagaag gcaggactcg ggacaatctt 2040
catcatgacc tgctcccctc tcctcctcac ccttctcatt cactgcacag gtgcccagac 2100
acagggtcag gggaggggtc caggaagccc atgaggccct gctttctcct tctctctcta 2160
gaccaagaat caccgtgtct gtgtctctcc tgcttccagg gtcctgggcc cagtctgtgt 2220
tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg 2280
gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc ccaggaacag 2340
cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct gaccgattct 2400
ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag actggggacg 2460
aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctgtggta ttcggcggag 2520
ggaccaagct gaccgtccta ggtaagtaat ttttcactat tgtcttctga aatttgggtc 2580
tgatggccag tattgacttt tagaggctta aataggagtt tggtaaagat tggtaaatga 2640
gggcatttaa gatttgccat gggttgcaaa agttaaactc agcttcaaaa atggatttgg 2700
agaaaaaaag attaaattgc tctaaactga atgacacaaa gtaaaaaaaa aaagtgtaac 2760
taaaaaggaa cccttgtatt tctaaggagc aaaagtaaat ttatttttgt tcactcttgc 2820
caaatattgt attggttgtt gctgattatg catgatacag aaaagtggaa aaatacattt 2880
tttagtcttt ctcccttttg tttgataaat tattttgtca gacaacaata aaaatcaata 2940
gcacgcccta agatgccatt tcattacctc tttctccgca cccgacatag at 2992
<210> 32
<211> 497
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 32
atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacaggtgc ccagacacag 60
ggtcagggga ggggtccagg aagcccatga ggccctgctt tctccttctc tctctagacc 120
aagaatcacc gtgtctgtgt ctctcctgct tccagggtcc tgggcccagt ctgtgttgac 180
gcagccgccc tcagtgtctg cggccccagg acagaaggtc accatctcct gctctggaag 240
cagctccaac attgggaata attatgtatc ctggtaccag cagctcccag gaacagcccc 300
caaactcctc atttatgaca ataataagcg accctcaggg attcctgacc gattctctgg 360
ctccaagtct ggcacgtcag ccaccctggg catcaccgga ctccagactg gggacgaggc 420
cgattattac tgcggaacat gggatagcag cctgagtgct gtggtattcg gcggagggac 480
caagctgacc gtcctag 497
<210> 33
<211> 388
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 33
atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120
tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca 180
ggaacagccc ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240
cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300
ggggacgagg ccgattatta ctgcggaaca tgggatagca gcctgagtgc tgtggtattc 360
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctag 388
<210> 34
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 34
Met Thr Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile His Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
35 40 45
Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr
85 90 95
Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp
100 105 110
Ser Ser Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu
<210> 35
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 35
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 36
<211> 3003
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 36
ggcgcgccac ctgcagtgta cacctgaggt gacatggttc tgaacatcac tttccccatt 60
gaaggcccga gtgacctatc acttgcttct caaaattcag gaactaggtg actctaggag 120
agtgcacagg aagctttctg catattcttt caagagattt cgaggtcact gactcttttt 180
tcaagactta aacacaaaat ccacatccat cattcttgcg taaagagacc attctttttt 240
ttttgagatg gagtctcgct ctgttgccca agctggagtg cagtggcatg atctcggctc 300
actgcaagct ctgtcttctg ggttcatgcc cttctcctgc ctcagcctcc caagtagctg 360
ggactacagg cacccgccgc catgcccggc taattttttg tattttttag tggagatggg 420
gtttcaacat gttggccaga atggtcttga tctcttgacc tcgtgatcca cccgccttgg 480
cctcccaaag tgctgggatt acaggtgtga gccactgcac ccggcccaag atggggtttc 540
atcatgttga cctggctggt ctcaaactcc caacctcaag tgatccactc acttcagcct 600
cccaaagtgc tgggatgaca ggcgtgagcc acagtgcccg gcctagtaca ttgtttaaat 660
ggtgcatgta aaacctcatg gtactacaac tgcctggtga cagactcacc agagtaaata 720
actatcctgc tgttctccaa ccacatggga ttccccaaac aaagatttgt tgagtccaag 780
atgcatcatg ccagaactct tgcagtcata cacataattt gtttcatttt aataaatacg 840
gttatctttt ttcttcagtt tattgttttt aatgtatcat cttctaggtt tcattacaca 900
tcaaagatga ataatttctc tcatctttag gacatgctga aaacactcat tagtgatttt 960
gaacagtatt atttcctaaa catcctagtt ggaatggttg atcctaaaag ctaccatgtg 1020
tcaggctcac ctgagtgcag actgtggtct aaacaagcta aagttttaat tcttccatct 1080
tcaaatacgg agcatatttg cttgttttgc tctttagcaa aacactgcaa agtcattcgc 1140
caggatctcc tgcagactgg cattcagtga tggagaacag actcctaggt gagatccctg 1200
gtcacaggat ccagatgact atgactgcaa gtctggaaaa gaagagacag aacaaagatt 1260
taccagcata accctctgag aatgtgcccc agccatcctg gagggaagag ctccctattg 1320
acccagcact gcagaatcca cagaggaagg acagctctgg ccaccaggga gcagccacac 1380
gacaagagag gacccggtgt ccccacaggt gaggaaatga gtccatgggg ctggtcagtg 1440
ctctcgattt cattctgcca taacaggact ttgtgtagtc accacctgag tcctatacag 1500
tgaacagcca aggagacatg gacagattca cccctgagga acccagtaga atgtgaagtc 1560
tgccctgagg tcacgaagaa aagactcggg gggctgcctg gcctggccct gatggagggg 1620
gccatggaca gaacaacggg gaggcagggg tgtctctgag aggctctggt caccttgtca 1680
tacaatggtg gtgtacaatg tcgcaccatg gacactaggg ggcgcctgcg caccattcct 1740
gagaagactg ggtgtgatga gagcaggacc agcgccacct gtcctgcttg gtgccctatg 1800
cttagggctc acagatgtca actctccacc ccctgggacc acacagcccc acccctggca 1860
ctctctgaca tcctcaggca gaggagcttg acccagggcc cagggtggga tcagaaagct 1920
ggagggtctg atttgcatgg atggaccctc cttctctcag agtataaaga ggggcaggga 1980
gagacttggg gaagctctgc ttcagctgtg agcgcagaag gcaggactcg ggacaatctt 2040
catcatggcc tgggctctgc tgctcctcac cctcctcact cagggcacag gtgacgcctc 2100
cagggaaggg gcttcaggga cctctgggct gatccttggt ctcctgctcc tcaggctcac 2160
cggggcccag cactgactca ctggcatgtg tttctccctc tttccagggt cctgggccca 2220
gtctgccctg actcagcctg cctccgtgtc tgggtctcct ggacagtcga tcaccatctc 2280
ctgcactgga accagcagtg acgttggtgg ttataactat gtctcctggt accaacagca 2340
cccaggcaaa gcccccaaac tcatgattta tgaggtcagt aatcggccct caggggtttc 2400
taatcgcttc tctggctcca agtctggcaa cacggcctcc ctgaccatct ctgggctcca 2460
ggctgaggac gaggctgatt attactgcag ctcatataca agcagcagca ctctcgtggt 2520
attcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct aggtaagtaa tttttcacta ttgtcttctg 2580
aaatttgggt ctgatggcca gtattgactt ttagaggctt aaataggagt ttggtaaaga 2640
ttggtaaatg agggcattta agatttgcca tgggttgcaa aagttaaact cagcttcaaa 2700
aatggatttg gagaaaaaaa gattaaattg ctctaaactg aatgacacaa agtaaaaaaa 2760
aaaagtgtaa ctaaaaagga acccttgtat ttctaaggag caaaagtaaa tttatttttg 2820
ttcactcttg ccaaatattg tattggttgt tgctgattat gcatgataca gaaaagtgga 2880
aaaatacatt ttttagtctt tctccctttt gtttgataaa ttattttgtc agacaacaat 2940
aaaaatcaat agcacgccct aagatgccat ttcattacct ctttctccgc acccgacata 3000
gat 3003
<210> 37
<211> 508
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 37
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacaggtga cgcctccagg 60
gaaggggctt cagggacctc tgggctgatc cttggtctcc tgctcctcag gctcaccggg 120
gcccagcact gactcactgg catgtgtttc tccctctttc cagggtcctg ggcccagtct 180
gccctgactc agcctgcctc cgtgtctggg tctcctggac agtcgatcac catctcctgc 240
actggaacca gcagtgacgt tggtggttat aactatgtct cctggtacca acagcaccca 300
ggcaaagccc ccaaactcat gatttatgag gtcagtaatc ggccctcagg ggtttctaat 360
cgcttctctg gctccaagtc tggcaacacg gcctccctga ccatctctgg gctccaggct 420
gaggacgagg ctgattatta ctgcagctca tatacaagca gcagcactct cgtggtattc 480
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctag 508
<210> 38
<211> 391
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 38
atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcccag 60
tctgccctga ctcagcctgc ctccgtgtct gggtctcctg gacagtcgat caccatctcc 120
tgcactggaa ccagcagtga cgttggtggt tataactatg tctcctggta ccaacagcac 180
ccaggcaaag cccccaaact catgatttat gaggtcagta atcggccctc aggggtttct 240
aatcgcttct ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag 300
gctgaggacg aggctgatta ttactgcagc tcatatacaa gcagcagcac tctcgtggta 360
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta g 391
<210> 39
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 39
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val
35 40 45
Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
100 105 110
Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu
130
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 40
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
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gggacgaggc cgattattac tg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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probe"
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cggaacatgg gatagcagcc tga 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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cctccgccga ataccaca 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
<400> 44
gcatcaccgg actccagact 20
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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probe"
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cgaggccgat tattactgcg gaaca 25
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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primer"
<400> 46
aggacggtca gcttggtc 18
<210> 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
<400> 47
caggactcgg gacaatcttc atc 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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probe"
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atggcctggg ctctgctgct c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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tgtgccctga gtgaggag 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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agcgcagaag gcaggactc 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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probe"
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acaatcttca tcatggcctg ggctc 25
<210> 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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primer"
<400> 52
cgtcacctgt gccctgag 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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tgttgcccaa gctggagtg 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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probe"
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tggcatgatc tcggctcact gc 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaggctgagg caggagaa 18
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<213> Artificial Sequence
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primer"
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ggccactcac aagacatcaa c 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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probe"
<400> 57
tcacccattg tcaagagctt caaca 25
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
<400> 58
cgtctcagga cctttgtctc taac 24
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 59
tccttgttac ttcataccat cctct 25
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 60
ttccttcctc aggccagccc 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 61
agggtgactg atggcgaaga ct 22
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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primer"
<400> 62
tccaggcacc ctgtctttg 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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probe"
<400> 63
aaagagccac cctctcctgc aggg 24
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
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aagtagctgc tgctaacact ctgact 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 65
aggtgagggt acagataagt gttatgag 28
<210> 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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probe"
<400> 66
ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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<400> 67
tgacaaatgc cctaattata gtgatca 27
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 68
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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probe"
<400> 69
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 70
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
<400> 71
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe"
<400> 72
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 73
ttgaccgatt ccttgcgg 18
Claims (52)
- 유전자 변형된 설치류로서, 이의 생식계열 게놈이
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌
를 포함하고, 상기 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현되는 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류. - 제1항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류의 상기 생식계열 게놈이 상기 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류의 상기 생식계열 게놈이 상기 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 대해 이형접합성인 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 있어서, 상기 생식계열 게놈이
하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌
를 추가로 포함하고, 상기 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 중쇄가 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류. - 제4항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류의 상기 생식계열 게놈이, 상기 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류에는 상기 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에 설치류 Cκ 유전자가 결여되어 있는 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ1-40, Vλ3-21, 또는 Vλ2-14를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ1-51을 포함하는 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Vλ 유전자 분절이 Vλ2-14를 포함하는 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, 또는 Jλ7을 포함하는 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Jλ 유전자 분절이 Jλ2를 포함하는 유전자 변형된 설치류.
- 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절, 또는 이들의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 분절, 하나 이상의 내인성 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 내인성 JH 유전자 분절을 각각 대체하는 유전자 변형된 설치류.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 하나 이상의 내인성 설치류 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자인 유전자 변형된 설치류.
- 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절이 VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고,
(ii) 상기 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절이 DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며,
(iii) 상기 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절이 JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 유전자 변형된 설치류. - 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류의 생식계열 게놈이 하나 이상의 설치류 ADAM6 폴리펩타이드, 이의 기능적 이종상동체, 기능적 상동체, 또는 기능적 단편을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Cλ 유전자가 (i) 마우스 Cλ1, (ii) 마우스 Cλ2, 또는 (iii) 마우스 Cλ3 유전자와 적어도 80% 동일한 서열을 갖는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Cλ 유전자가 마우스 Cλ1 유전자를 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 하나 이상의 설치류 Vκ 유전자 분절, 하나 이상의 설치류 Jκ 유전자 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 대신하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 추가로 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 경쇄가 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌가 상기 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 중 그의 내인성 위치에 하나 이상의 내인성 인핸서(enhancer)를 추가로 포함하는, 유전자 변형된 설치류.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류가 랫트 또는 마우스인, 유전자 변형된 설치류.
- 유전자 변형된 마우스로서, 이의 생식계열 게놈이
마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ1-51 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하며,
상기 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 마우스. - 유전자 변형된 마우스로서, 이의 생식계열 게놈이
마우스 Cλ1 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ2-14 유전자 분절 및 인간 Jλ2 유전자 분절을 포함하며,
상기 유전자 변형된 마우스의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는, 유전자 변형된 마우스. - 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 게놈에 포함하는 설치류 배아로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 설치류 배아.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스의 B 세포로서,
조작된 내인성 κ 경쇄 유전자좌의 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전
을 포함하는, 유전자 변형된 설치류 또는 마우스의 B 세포. - 제28항의 B 세포로부터 생성된 하이브리도마.
- 생식계열 게놈에 하기를 포함하는 단일 유전자 변형된 설치류의 B 세포 집단:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Jλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하는, 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌,
(b) 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌,
여기서, 상기 B 세포 집단에 의해 발현된 모든 항체는 하기를 포함함:
(i) 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) 적어도 2개의 상이한 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인. - 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하는 배아 줄기 세포로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는, 배아 줄기 세포.
- 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현하는 포유동물 세포로서, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인, 상기 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인, 또는 둘 모두는 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스로부터 식별되었던 것인 포유동물 세포.
- 항체를 제조하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 항원에 노출시키는 단계;
(b) 상기 유전자 변형된 설치류가 상기 항원에 대한 면역 반응을 발생시키도록 하는 단계; 및
(c) 상기 유전자 변형된 설치류로부터 상기 항원에 특이적인 항체, 상기 항원에 특이적인 항체를 발현하는 B 세포, 또는 상기 항원에 특이적인 항체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 단리하는 단계
를 포함하는 방법. - 항체를 제조하는 방법으로서,
(a) 2개의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 및 2개의 인간 면역글로불린 중쇄를 포함하는 상기 항체를 포유동물 세포에서 발현시키는 단계로서, 상기 각각의 인간 면역글로불린 λ 경쇄는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하고 상기 각각의 인간 면역글로불린 중쇄는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, 상기 λ 경쇄 가변 도메인 중 적어도 하나, 또는 이들의 조합의 아미노산 서열은 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스에서 식별되었던 것인 단계; 및
(b) 상기 항체를 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 하기 단계를 포함하는, 이중특이적 항체를 제조하는 방법:
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제1 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 제1 항원의 제1 에피토프와 접촉시키는 단계,
(b) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제2 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 제2 항원의 제2 에피토프와 접촉시키는 단계,
(c) 상기 제1 유전자 변형된 설치류로부터 상기 제1 항원의 상기 제1 에피토프에 특이적인 제1 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 상기 제1 항체의 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(d) 상기 제2 유전자 변형된 설치류로부터 상기 제2 항원의 상기 제2 에피토프에 특이적인 제2 항체를 발현하는 B 세포를 단리하고, 상기 제2 항체의 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 결정하는 단계;
(e) 상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제1 인간 중쇄를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(f) 상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 인간 면역글로불린 불변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결하여 제2 인간 중쇄를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 단계;
(g) 포유동물 세포에서 하기를 발현시키는 단계:
(i) 상기 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 상기 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열. - 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로서,
(a) 포유동물 세포에서
(i) 제1 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열;
(ii) 제2 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(iii) 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열
을 발현시키는 단계를 포함하고;
상기 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제1 항원의 제1 에피토프에 의해 면역화된 제1 유전자 변형된 설치류에서 제1 항체로부터 식별된 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 상기 제1 항체는 상기 제1 항원의 상기 제1 에피토프에 특이적으로 결합하며;
상기 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 제2 항원의 제2 에피토프에 의해 면역화된 제2 유전자 변형된 설치류에서 제2 항체로부터 식별된 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하고, 상기 제2 항체는 상기 제2 항원의 상기 제2 에피토프에 특이적으로 결합하며;
상기 제1 및 제2 유전자 변형된 설치류는 각각 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형된 설치류 또는 마우스이고;
상기 제3 뉴클레오타이드의 상기 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전인, 방법. - 인간 면역글로불린 중쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 형성하는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 제조하는 방법으로서,
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 제조하는 방법으로서,
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류를 관심 항원에 노출시키는 단계, 및
(b) 상기 유전자 변형된 설치류로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체를 단리하는 단계
를 포함하고,
상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 집합체는 각각 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인에 결합하며,
상기 집합체의 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이룬 상기 인간 λ 경쇄 가변 도메인이 상기 항원에 결합하는, 방법. - 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 제조하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 도메인 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 형성시키는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 생성하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계;
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 인간 면역글로불린 λ 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결하여 인간 면역글로불린 λ 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 형성시키는 단계.
를 포함하는 방법. - 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 유전자 변형된 설치류 또는 마우스를 관심 항원에 노출시키는 단계; 및
(b) 상기 항원에 특이적으로 결합하고 상기 유전자 변형된 설치류에 의해 생성된 항체의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 하기를 포함하는 표적화 벡터:
(i) 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에서 5' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5' 상동성 암;
(ii) Vλ 유전자 분절 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역;
(iii) 설치류 Cλ 유전자 분절; 및
(iv) 상기 내인성 설치류 κ 경쇄 유전자좌에서 3' 표적 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3' 상동성 암. - 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계. - 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법:
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 생성된 상기 설치류 ES 세포를 사용하여 설치류를 생성시키는 단계. - 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계. - 하기 단계를 포함하는 유전자 변형된 설치류 ES 세포를 제조하는 방법:
설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 설치류 ES 세포의 게놈 중 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌 내로 도입시키는 단계로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역이 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계. - 유전자 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
(a) 설치류 Cλ 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하도록 설치류의 생식계열 게놈 중 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 조작하는 단계로서, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하는 것인 단계를 포함하며,
이로써, 상기 유전자 변형된 설치류의 B 세포에 의해 발현된 모든 면역글로불린 λ 경쇄가 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역 또는 이의 체세포적으로 과돌연변이된 버전으로부터 발현된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 도메인을 포함하는 방법. - 재조합 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 재조합 설치류 세포의 게놈을 하기를 포함하도록 변형시키는 것을 포함하는 방법:
설치류 Cλ 유전자분절에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 여기서 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 λ 경쇄 가변 영역은 인간 Vλ 유전자 분절 및 인간 Jλ 유전자 분절을 포함함.
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