KR20230156162A - 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물 - Google Patents

외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물 Download PDF

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나타샤 레벤코바
린 맥도날드
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앤드류 제이. 머피
베라 보로니나
낙신 투
페이쓰 해리스
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Abstract

외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 발현하는 비인간 동물과 관련된 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.

Description

외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS EXPRESSING EXOGENOUS TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE}
관련 출원
본 출원은 그 전문이 본원에 참조로서 포함되고 2016년 6월 3일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/345,524호의 우선권의 이익을 주장한다.
비인간 동물, 특히 마우스 및 래트는 치료용 항체의 유용한 공급원으로 밝혀졌으며 잠재적으로 다른 항원 결합 분자의 공급원으로서 작용할 수 있다. 이러한 비인간 동물에서 높은 수준의 항원 수용체 다양성은 면역화 후에 바람직한 치료 특성을 갖는 항원 결합 분자가 생성될 가능성을 증가시킨다. 따라서, 치료용 항원 결합 분자의 생산량을 향상시키기 위해 증가된 항원 수용체 다양성을 갖는 유전자 조작 비인간 동물에 대한 필요성이 존재한다.
특정 양태에서, 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 외인성 핵산을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물뿐 아니라 상기 비인간 동물을 제조 및 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 외인성 TdT는 인간 TdT이다. 일부 구현예에서, 외인성 TdT는 내인성 종 기원이다(예컨대, 마우스에서 외인성 TdT는 마우스 서열을 가진다). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 B 세포 발달 중에, 예를 들어 프로-B 세포(pro-B cell) 및/또는 프리-B 세포(pre-B cell)에서 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 TdT를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 T 세포 발달 중에, 예를 들어, 이중 음성(double-negative, DN) 흉선 세포 및/또는 이중 양성(double-positive, DP) 흉선 세포에서 외인성 핵산에 의해 인코딩된 TdT를 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 TdT를 인코딩하는 외인성 핵산의 다수의 카피(copy)(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 카피)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트)와 같은 포유류이다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 게놈에 면역글로불린 불변 영역 유전자(예컨대, 중쇄 불변 영역 유전자, κ쇄 불변 영역 유전자, λ쇄 불변 영역 유전자)에 작동 가능하게 연결된 비재배열(unrearranged) 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각(예컨대, 중쇄 유전자 조각, κ쇄 유전자 조각, λ쇄 유전자 조각)을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자, 마우스 불변 영역 유전자 또는 래트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 가변 영역 및 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 유전자좌(예컨대, 중쇄 유전자좌, κ 유전자좌, λ 유전자좌)에 위치한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 생물체는 면역글로불린 가변 영역에서 유래된 인간 면역글로불린 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 항체, B 세포, 하이브리도마 또는 핵산을 생성하기 위해 이러한 유전자 변형 비인간 동물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은, T 세포 수용체(TCR) 불변 영역 유전자(예컨대, TCRα 불변 영역 유전자, TCRβ 불변 영역 유전자, TCRγ 불변 영역 유전자, TCRδ 불변 영역 유전자)에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각(예컨대, TCRα 유전자 조각, TCRβ 유전자 조각, TCRγ 유전자 조각, TCRδ 유전자 조각)을 포함하는 TCR 가변 영역을 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자, 마우스 불변 영역 유전자 또는 래트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 가변 영역 및 불변 영역 유전자는 내인성 TCR 유전자좌(예컨대, TCRα 유전자좌, TCRβ 유전자좌, TCRγ 유전자좌, TCRδ 유전자좌)에 위치한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 생물체는 TCR 가변 영역에서 유래된 인간 TCR 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 TCR 불변 도메인을 포함하는 TCR을 발현한다. 일부 구현예에서, TCR, T 세포, T 세포 하이브리도마 또는 인간 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 생성하기 위해 이러한 유전자 변형 비인간 동물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은, TCR 불변 영역 유전자(예컨대, TCRα 불변 영역 유전자, TCRβ 불변 영역 유전자, TCRγ 불변 영역 유전자, TCRδ 불변 영역 유전자)에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각(예컨대, 중쇄 유전자 조각, κ쇄 유전자 조각, λ쇄 유전자 조각)을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자, 마우스 불변 영역 유전자 또는 래트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 가변 영역 및 불변 영역 유전자는 내인성 TCR 유전자좌(예컨대, TCRα 유전자좌, TCRβ 유전자좌, TCRγ 유전자좌, TCRδ 유전자좌)에 위치한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 생물체는 면역글로불린 가변 영역에서 유래된 인간 면역글로불린 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 TCR 불변 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현한다. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 CAR, T 세포, T 세포 하이브리도마 또는 핵산을 생성하기 위해 이러한 유전자 변형 비인간 동물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전자 변형을 그의 생식 세포(germline)에 포함하도록 상기 비인간 동물을 유전자 조작하는 단계를 포함하여, 본원에 개시된 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전자 변형을 포함하는 비인간 ES 세포가 본원에 제공된다.
도 1은 마우스 Rag2 유전자의 일부가 짧은 동종형(isoform) 인간 TdT(hTdTs)를 인코딩하는 DNA 서열로 치환되는 반면, 예시적인 표적 벡터(축척대로 도시되지 않음)의 도면을 도시한다. 예시적인 구현예에서, 벡터는 게놈내로 무작위로 통합된다. 도면에 레이블이 달리 제시되지 않는 한(예컨대, 선택 카세트, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내며 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. E1, E2 등은 특정한 설명이 있는 유전자의 엑손을 나타내고, GFP는 녹색 형광 단백질이며, CM은 클로람페니콜 내성 유전자이고, neo는 네오마이신 내성 유전자이다. 접합부 1-4는 표 1에 표시된 접합부에 해당한다.
도 2는 마우스 Rag2 유전자의 일부가 짧은 동종형 인간 TdT(hTdTs)를 인코딩하는 DNA 서열로 치환되는 예시적인 표적 벡터(비례 아님)의 도면을 도시한다. 도시된 구현예에서, 벡터는 마우스 RAG2 프로모터에 의해 구동된 hTdT를 Ig 카파 유전자좌에 삽입하는 데 사용된다. 도면에 레이블이 달리 제시되지 않는 한(예컨대, 선택 카세트, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내며 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. E1, E2 등은 특정한 설명이 있는 유전자의 엑손을 나타내고, GFP는 녹색 형광 단백질이며, CM은 클로람페니콜 내성 유전자이고, hyg는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 접합부 1-7은 표 2의 접합부에 해당한다.
도 3은 VH1-72 프로모터 및 Eμ 인핸서에 의해 구동된, 인간 TdT(hTdTs)를 인코딩하는 DNA 서열을 면역글로불린 κ 유전자좌에 삽입하는 데 사용된 예시적인 표적 벡터(축척대로 도시되지 않음)의 도면이다. 도면에 레이블이 달리 제시되지 않는 한(예컨대, 선택 카세트, loxP 부위 등), 채워진 모양과 단일 선은 마우스 서열을 나타내며 빈 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. E1, E2 등은 특정한 설명이 있는 유전자의 엑손을 나타내고, GFP는 녹색 형광 단백질이며, CM은 클로람페니콜 내성 유전자이고, hyg는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 접합부 1-4는 표 3의 접합부에 해당한다.
도 4는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, VELOCIMMUNE® TdT 마우스의 림프구에서의 hTdT mRNA의 발현을 나타낸다. 본원에서 VELOCIMMUNE® 마우스는 비재배열 인간 중쇄 및 카파 경쇄 가변(V(D)J) 유전자 조각의 다양한 레퍼토리를 포함하는 마우스이다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 5는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 hIgκ 서열 다양성(10,000 hIgκ 서열 판독 당 고유한 경쇄 CDR3 서열의 수)을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 6은 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 hIgκ 비주형 첨가의 분포를 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다. "NT"는 뉴클레오타이드를 의미한다.
도 7에는 두 개의 패널이 있다. 패널(A)는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 hIgκ CDR3 길이의 분포를 나타내는 그래프를 도시한다. "AA"는 아미노산을 의미한다. 패널(B)는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 JK 조각의 5' 영역에서의 엑소뉴클레아제 결실 길이를 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 8에는 두 개의 패널이 있다. 패널(A)는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 Vκ 사용량(usage)을 나타내는 그래프를 도시한다. 패널(B)는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 Jκ 사용량을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 9는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 mIgλ 서열 다양성(10,000 Igλ 서열 판독 당 고유한 경쇄 CDR3 서열의 수)을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 10은 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 mIgλ 비주형 첨가의 분포를 나타내는 그래프이다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다. "NT"는 뉴클레오타이드를 의미한다.
도 11은 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 mIgλ CDR3 길이의 분포를 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다. "AA"는 아미노산을 의미한다.
도 12는 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 Vλ 사용량을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 나타내고, HO는 동형접합성 마우스(homozygous mouse)를 나타낸다.
도 13은 hTdT를 발현하는 VELOCIMMUNE® 마우스(왼쪽 패널: 표시된 바와 같이 hTdT 유전자가 존재함) 및 hTdT를 발현하지 않는 DLC 및 VELOCIMMUNE® 대조 마우스와 비교하여, hTdT(오른쪽 패널: 표시된 바와 같이 hTdT 유전자가 존재함)를 발현하는 이중 경쇄 마우스(DLC: 2개의 비재배열 인간 Vk 유전자 조각 및 5개의 비재배열 인간 Jk 유전자 조각뿐만 아니라 비재배열 인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 조각의 다양한 레퍼토리를 포함하는 마우스)에서 hIgκ 서열 다양성(10,000 Igκ 서열 판독 당 고유한 경쇄 CDR3 서열의 수)을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 hTdT에 대한 이형접합성 마우스를 나타내고, HO는 hTdT에 대한 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 14는 hTdT(DLC)를 발현하지 않는 DLC 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 마우스에서의 hIgκ 비주형 첨가의 분포를 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 hTdT에 대한 이형접합성 마우스를 나타내고, HO는 hTdT에 대한 동형접합성 마우스를 나타낸다. "NT"는 뉴클레오타이드를 의미한다.
도 15는 hTdT를 발현하지 않는 DLC 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 DLC 마우스에서의 hIgκ CDR3 길이의 분포를 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 hTdT에 대한 이형접합성 마우스를 나타내고, HO는 hTdT에 대한 동형접합성 마우스를 나타낸다.
도 16은 hTdT를 발현하지 않는 DLC 대조 마우스와 비교하여, hTdT를 발현하는 DLC 마우스에서의 Vκ 사용량 및 Jκ 사용량을 나타내는 그래프를 도시한다. Het는 hTdT에 대한 이형접합성 마우스를 나타내고, HO는 hTdT에 대한 동형접합성 마우스를 나타낸다. 별도로 도시된 두 개의 상이한 Rag TdT tg(HO) DLC 마우스만 사용된다.
총론
TdT(예컨대, 인간, 마우스 또는 래트 TdT)를 인코딩하는 외인성 핵산을 게놈에 포함하는 비인간 동물과 관련된 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트)와 같은 포유류이다. 특정 구현예에서, 비인간 동물의 게놈은 인간 가변 도메인을 갖는 항원 결합 분자(예컨대, 항체, TCR 및/또는 CAR)를 발현하도록 추가 변형을 포함한다.
TdT는 B 림프구 및 T 림프구의 항원-수용체 다양성을 증가시키는 V(D)J 재조합에서 접합부 형성 중에 뉴클레오타이드의 주형-독립적인 첨가(N-첨가)를 촉매하는 DNA 중합 효소이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은, TdT를 인코딩하는 외인성 핵산을 게놈에 포함하지 않는 상응하는 비인간 동물(즉, 동일한 종 및 품종(strain)의 비인간 동물)에 비해 B 세포 발달 및/또는 T 세포 발달 중에 증가된 수준으로 TdT를 발현한다. 일부 구현예에서, TdT를 인코딩하는 외인성 핵산을 게놈에 포함하지 않는 상응하는 비인간 동물이 TdT를 발현하지 않는 동안(예컨대, 프리-B 세포 단계 동안)인 B 세포 발달 및/또는 T 세포 발달 단계 동안, 본원에 제공된 비인간 동물은 TdT를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물은, TdT를 인코딩하는 외인성 핵산을 게놈에 포함하지 않는 상응하는 비인간 동물과 비교하여, 증가된 항원 수용체 다양성(예컨대, 항체 다양성, TCR 다양성 및/또는 CAR 다양성)을 갖는다.
정의
단수 표현 "하나의(a 및 an)"는 본원에서 이 표현의 문법적인 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 모두를 포함하고, 천연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는 천연 또는 합성물의 모든 분자를 포괄하는 것으로 의도된다. 예시적인 아미노산은 천연 발생 아미노산; 그의 유사체, 유도체 및 동족체; 변이(variant) 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 상기한 모든 입체 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 손상되지 않은 항체(intact antibody) 및 그의 항원 결합 단편 모두를 지칭할 수 있다. 손상되지 않은 항체는 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)가 다이설파이드 결합에 의해 상호 연결되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존성이 높고 프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 불리는 영역에 산재된, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 불리는, 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단에 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 용어 "항체"는 또한 단일 도메인 항체, 중쇄만 있는 항체, 중쇄상에 경쇄 가변 유전자 조각을 갖는 항체 등을 포함한다.
본원에 사용된 항원 결합 분자(예컨대, 항체, T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR))의 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합 부분"이란 용어는 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항원 결합 분자의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편은 손상되지 않은 항원 결합 분자의 가변 영역의 적어도 일부분을 보유하고 항원에 결합할 수있는 임의의 항체, TCR, 또는 CAR 단편을 포함할 수 있다. 용어 "항원 결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 이에 제한되지 않지만 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 다이설파이드 결합된 Fv, Fd, 단일-쇄 항체, 가용성 TCR, 단일-쇄 TCR, 가용성 CAR, 단일-쇄 CAR, 단리된 CDRH3(항체 또는 TCR), 및 손상되지 않은 항원 결합 분자의 가변 영역의 적어도 일부분을 보유하는 기타 항원 결합 단편을 포함한다. 이들 항원 결합 단편은 통상적인 재조합 및/또는 효소 기술을 사용하여 수득될 수 있으며, 손상되지 않은 항체와 동일한 방식으로 항원 결합에 대해 스크리닝될 수 있다.
비인간 동물과 관련하여 "상응하는"이란 용어는 대상 비인간 동물은 외인성 TdT를 발현하지만 상응하는 비인간 동물은 발현하지 않는 점을 제외하고 대상 비인간 동물과 동일한 유전자 변형을 포함하는, 동일한 종의 대조 비인간 동물의 특징을 기술하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역글로불린 항원 결합 도메인(예컨대, 면역글로불린 가변 도메인) 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는, TCR 폴리펩타이드의 "불변 도메인"은 막-근위 TCR 불변 도메인을 포함하고, 또한 TCR 막관통 도메인 및/또는 TCR 세포질 꼬리를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 TCRβ 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 TCRα 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(예컨대, κ 또는 λ 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이량체이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCRα 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 TCRβ 불변 도메인에 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(예컨대, κ 또는 λ 가변 도메인)을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이량체이다.
비재배열 가변 영역 및/또는 비재배열 가변 영역 유전자 조각에서 "유래된" 재배열 가변 영역 유전자 또는 가변 도메인과 관련하여 사용될 때 "유래된"이라는 문구는 재배열 가변 영역 유전자 또는 가변 도메인의 서열을, 가변 도메인을 발현하는 재배열 가변 영역 유전자를 형성하기 위해 재배열된 비재배열 가변 영역 유전자 조각 세트까지 거슬러 추적하는 능력(적용 가능한 경우, 스플라이싱 차이 및 체세포 돌연변이를 설명함)을 지칭한다. 예를 들어, 체세포 돌연변이를 겪은 재배열 가변 영역 유전자의 경우 비재배열 가변 영역 유전자 조각에서 유래된다는 사실은 변하지 않는다.
본원에서 사용된 "유전자좌"라는 용어는 관련된 유전 요소 세트(예컨대, 유전자, 유전자 조각, 조절 요소)를 포함하는 염색체상의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 비재배열 면역글로불린 유전자좌는 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각, 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 및 V(D)J 재조합 및 면역글로불린 발현을 구동하는 관련 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 스위치 요소 등)를 포함할 수 있는 한편, 비재배열 TCR 유전자좌는 TCR 가변 영역 유전자 조각, TCR 불변 영역 유전자 및 V(D)J 재조합 및 TCR 발현을 구동하는 관련 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 등)를 포함할 수 있다. 유사하게, 비재배열 CAR 유전자좌는 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각, TCR 불변 영역 유전자 및 V(D)J 재조합 및 CAR 발현을 구동하는 관련 조절 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 등)를 포함할 수 있다. 유전자좌는 내인성 또는 비-내인성일 수 있다. 용어 "내인성 유전자좌 "는 특정 유전 요소가 자연적으로 발견되는 염색체상의 위치를 지칭한다.
비재배열 가변 영역 유전자 조각이 재배열하여 항원 결합 단백질의 폴리펩타이드 사슬로서 불변 영역 유전자와 함께 발현되는 재배열 가변 영역 유전자를 형성할 수 있는 경우, 비재배열 가변 영역 유전자 조각은 인접한 불변 영역 유전자에 "작동 가능하게 연결 "된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드인, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 하나, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 결합 분석에서 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 추가로 변형될 수 있으며, 예를 들면 표지 성분과의 접합에 의해 변형될 수 있다. 본원에 제공되는 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오타이드는 T 뉴클레오타이드와 상호 교환 가능하다.
본원에서 사용된 "특이적 결합" 및 "항원 특이성"은 항원 결합 분자(예컨대, 항체, TCR, CAR)가 소정의 항원과 같은 소정의 표적에 결합할 수있는 능력을 말한다. 전형적으로, 항원 결합 분자는 약 10-7 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 소정의 표적에 특이적으로 결합하고, 비특이적 및 관계없는 표적(예컨대, BSA, 카세인)에 대한 KD보다 적어도 10배 적은, 적어도 100배 적은, 또는 적어도 1000배 적은 KD에 상응하는 친화도로 소정의 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 약 10-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 소정의 표적에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 TCR 항원 결합 도메인(예컨대, TCR 가변 도메인) 및 TCR 불변 도메인의 적어도 일부분을 모두 포함하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는, TCR 폴리펩타이드의 "불변 도메인"은 막-근위 TCR 불변 도메인을 포함하고, 또한 TCR 막관통 도메인 및/또는 TCR 세포질 꼬리를 포함한다. 특정 구현예에서, TCR은 가용성 TCR이고 TCR 막관통 도메인 또는 TCR 세포질 꼬리를 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, TCR은 TCRβ 불변 도메인(또는 그의 단편)에 연결된 TCRβ 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 TCRα 불변 도메인(또는 그의 단편)에 연결된 TCRα를 포함하는 제2 폴리펩타이드을 포함하는 이량체이다.
용어 "비재배열"은 면역글로불린, TCR 또는 CAR 가변 영역 유전자좌 또는 가변 영역 유전자 조각을 포함하되, V 유전자 조각 및 J 유전자 조각이(무거운 또는 TCRβ 가변 영역, D 유전자 조각에 대해서도) 별도로 유지되지만 V(D)J 레퍼토리의 단일 V, (D), J를 포함하는 재배열 V(D)J 유전자("가변 영역 유전자")를 형성하도록 결합될 수 있다.
유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포
특정 양태에서, 게놈에 TdT(예컨대, 인간, 마우스, 또는 래트 TdT)를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 비인간 동물 및 ES 세포가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 비인간 동물 및 ES 세포의 게놈은, 예를 들어 인간 가변 도메인(예컨대, 항체, TCR 및/또는 CAR)을 갖는 항원 결합 분자의 발현을 일으키는 변형을 포함하여, 추가 변형을 포함한다.
본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 변형을 함유한 비인간 동물 ES 세포는 미국 특허 번호 제6,586,251호, 제6,596,541호, 제7,105,348호 및 문헌 [Valenzuela et al. (2003) "High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis" Nat. Biotech. 21(6): 652-659], 및 미국 특허 공개 번호 제US 2014/0310828호에 기술된 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 생성될 수 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,228,208호 및 미국 특허 공개 번호 제US 2015-0159174 A1호, 제US 2016-0060657 A1호, 제US 2015-0376650 A1호, 제US 2015-0376651 A1호, 제US 2016-0046960 A1호, 제US 2015-0376628 A1호 및 제US 2016-0115486 A1호(이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 표적 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,703,485호, 제8,530,214호, 및 제8,624,000호(이들 각각은 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이 메가뉴클레아제를 사용하여 표적 변형이 또한 이루어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,150,584호, 제6,114,598호, 제5,633,425호, 제7,501,552호, 제6,235,883호, 제6,998,514호 및 제5,776,773호(이들 각각은 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 바를 포함하여, 당업계의 표준 방법을 사용하여 비표적 유전자 변형이 이루어질 수 있다.
본원에 기술된 ES 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 비인간 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 마우스 비인간 동물 ES 세포는 미국 특허 번호 제7,294,754호, 및 문헌 [Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007)](이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이, VELOCIMOUSE® 방법을 사용하여 유전자 조작 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있다. 래트 ES 세포는 기술된 방법, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 제US 2014/0310828호(본원에 참조로서 포함됨)를 사용하여 변형된 래트를 생성하는 데 사용될 수 있다. 생성 마우스 또는 래트는 동형접합성으로 번식될 수 있다. 별도로 변형된 동물을 사육하거나 또는 (예컨대, 본원에 기술된 방법을 사용하여) 이미 변형된 ES 세포에 추가 변형을 도입함으로써 다중 고유 변형은 단일 유전자 변형 생물체 내에 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 임의의 비인간 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 척추 동물이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유류이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예컨대, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 라마, 닭, 고양이, 개, 페럿(ferret), 영장류(예컨대, 마모셋(marmoset), 히말라야 원숭이)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 적절하게 유전적으로 변형 가능한 ES 세포가 용이하게 이용 가능하지 않은 비인간 동물에 대해, 본원에 기술된 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조하기 위해 다른 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 비-ES 세포 게놈(예컨대, 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키는 단계, 변형 게놈을 핵이식을 이용하여 난모 세포와 같은 적합한 세포로 이식하는 단계, 및 변형 세포(예컨대, 변형 난모 세포)를 적합한 조건 하에 비인간 동물에 임신시켜 배아를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유류이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은, 예컨대 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 소형 포유류이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 특정 구현예에서, 설치류는 마우스, 래트, 또는 햄스터이다. 일부 구현예에서, 설치류는 쥐상과에서 선택된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae; 예컨대, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae; 예컨대, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae; 예컨대, 참(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 갈기쥐(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae; 예컨대, 클라이밍(climbing) 마우스, 락(rock) 마우스, 흰꼬리쥐(white-tailed rat), 마다가스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae; 예컨대, 가시겨울잠쥐(spiny dormice)) 및 소경쥐과(Spalacidae; 예컨대, 뒤쥐(mole rat), 대나무쥐, 및 두더지쥐(zokor)) 중에서 선택되는 과에서 유래된다. 일부 구현예에서, 설치류는 참 마우스 또는 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시쥐 및 갈기쥐 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 마우스는 쥐과의 구성원에서 유래된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 및 래트에서 선택된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 C57BL 품종의 마우스이다. 일부 구현예에서, C57BL 품종은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola에서 선택된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 129 품종의 마우스이다. 일부 구현예에서, 129 품종은 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예컨대, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 품종으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 마우스는 129 품종 및 C57BL 품종의 잡종이다. 일부 구현예에서, 마우스는 129 품종 및/또는 C57BL/6 품종의 잡종이다. 일부 구현예에서, 잡종의 129 품종은 129S6(129/SvEvTac) 품종이다. 일부 구현예에서, 마우스는 BALB 품종(예컨대, BALB/c)이다. 일부 구현예에서, 마우스는 BALB 품종과 또 다른 품종(예컨대, C57BL 품종 및/또는 129 품종)의 잡종이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 상기 품종의 임의의 조합에서 유래된 마우스일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 래트이다. 일부 구현예에서, 래트는 위스타 래트(Wistar rat), LEA 품종, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 품종, 피셔(Fischer) 품종, F344, F6 및 다크 아구티(Dark Agouti)에서 선택된다. 일부 구현예에서, 래트 품종은 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 품종의 잡종이다.
외인성 TdT를 발현하는 비인간 동물
특정 양태에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 핵산 서열을 생식 세포 및/또는 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포가 본원에 제공된다. 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)는 B 림프구 및 T 림프구의 항원-수용체 다양성을 증가시키는 V(D)J 재조합에서 접합부 형성 중에 뉴클레오타이드(NP-첨가)의 주형 독립적 첨가를 촉매하는 DNA 중합 효소이다. 주형-독립적 첨가, 비주형 첨가 및 비-생식 세포 첨가는 모두 TdT에 의해 촉매된 뉴클레오타이드 첨가를 지칭하며, 이들 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
특정 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물의 게놈에서 외인성 TdT의 서열은 TdT 또는 TdT 오솔로그(orthologue)를 인코딩하는 임의의 동물에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, TdT는 척추 동물의 TdT이다. 일부 구현예에서, TdT는 포유류 TdT이다. 일부 구현예에서, TdT는 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예컨대, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 라마, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예컨대, 마모셋, 히말라야 원숭이) 또는 인간으로 이루어진 군에서 선택되는 포유류에서 유래된다. 일부 구현예에서, TdT는 내인성 종 기원이다(즉, TdT 서열은 유전자 변형 비인간 동물과 동일한 종의 것이다). 일부 구현예에서, TdT는 인간 TdT, 마우스 TdT 또는 래트 TdT이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 게놈 TdT 서열(즉, 엑손 및 인트론을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 TdT mRNA/cDNA(즉, 하나 이상의 TdT 동종형의 엑손)를 인코딩한다.
인간 TdT(hTdT)는 인간 염색체 10에 위치한 DNTT 유전자에 의해 인코딩된다. hTdT의 예시적인 게놈 DNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000010.11의 96304328 내지 96338564 위치에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. hTdT의 동종형의 예시적인 mRNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001017520.1 및 NM_004088.3에 의해 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 이들 동종형에 의해 인코딩되는 단백질 서열은 각각 NCBI 수탁 번호 NP_001017520.1 및 NP_004079.3에 의해 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. TdT 동종형 중에는 짧은 동종형(hTdTS)과 두 개의 긴 동종형(hTdTL1과 hTdTL2)이 있다. 3개의 동종형의 서열은 예를 들어, 문헌 [Thai 및 Kearney, Adv. Immunol. 86:113-36(2005)]에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 hTdTS를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 hTdTL1을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 hTdTL2를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 비인간 생물체는 다수의 동종형(예컨대, hTdTS 및 hTdTL2 모두)을 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 비인간 생물체는 3가지 모든 인간 동종형(예컨대, hTdTS 및 hTdTL2 모두)을 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다.
마우스 TdT(mTdT)는 마우스 염색체 19번에 위치한 Dntt 유전자에 의해 인코딩된다. mTdT의 예시적인 게놈 DNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000085.6의 41029275 내지 41059525 위치에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. mTdT의 동종형의 예시적인 mRNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001043228.1 및 NM_009345.2에 의해 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 이들 동종형에 의해 인코딩되는 단백질 서열은 각각 NCBI 수탁 번호 NP_001036693.1 및 NP_033371.2에 의해 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
래트 TdT(rTdT)는 래트 염색체 1에 위치한 Dntt 유전자에 의해 인코딩된다. rTdT의 예시적인 게놈 DNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_005100.4의 260289626 내지 260321174 위치에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. rTdT의 예시적인 mRNA 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001012461.1에 의해 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 이 mRNA에 의해 인코딩되는 단백질 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001012479.1에 의해 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물의 게놈은 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 다수의 카피를 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 외인성 TdT를 인코딩하는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 카피의 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 외인성 TdT를 인코딩하는, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 카피의 핵산 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 전사 조절 요소(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 항시성(constitutive)(즉, 유비쿼터스) 프로모터이다. 항시성 프로모터의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, SV40, CMV 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, EF1 프로모터, β-액틴 프로모터, EGR1 프로모터, eIF4A1 프로모터, FerH 프로모터, FerL 프로모터, GAPDH 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, HSP70 프로모터, β-Kin 프로모터, PGK-1 프로모터, ROSA 프로모터 및 유비퀴틴 B 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않는다.
일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 B 세포 발달 중에 인코딩된 TdT의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 TdT의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 B 세포 발달 중에, 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 발현되는 유전자의 전사 조절 요소(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 조절 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 조절 요소 및/또는 면역글로불린 λ 경쇄 전사 조절 요소이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 마우스 전사 조절 요소, 래트 전사 조절 요소 또는 인간 전사 조절 요소이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 내인성 전사 조절 요소이다(예컨대, 외인성 TdT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 도입되어, 외인성 TdT의 발현이 내인성 전사 조절 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절되게 하는 위치에서 비인간 동물의 게놈에 삽입된다). 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 RAG1, RAG2, λ5, VpreB, CD34, CD45, AA4.1, CD45R, IL-7R, MHC 클래스 II, CD10, CD19, CD38, CD20, CD40, 다양한 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 V 유전자 조각 프로모터 및 인핸서(참조: 예컨대, 국제 면역유전학 정보 시스템® 웹사이트(IMGT, imgt.org)에 기재된 다양한 V 유전자 조각 목록, 예컨대 마우스 VH1-72 프로모터 및 기타 등)의 전사를 조절하는 요소를 포함할 수 있다. 전사 조절 요소는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 종 기원의 것들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 T 세포 발달 중에 인코딩된 TdT의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 TdT의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 T 세포 발달 중에, DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 발현되는 유전자의 전사 조절 요소(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 마우스 전사 조절 요소, 래트 전사 조절 요소 또는 인간 전사 조절 요소이다. 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 내인성 전사 조절 요소이다(예컨대, 외인성 TdT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 도입되어, 외인성 TdT의 발현이 내인성 전사 조절 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절되게 하는 위치에서 비인간 동물의 게놈에 삽입된다). 일부 구현예에서, 전사 조절 요소는 RAG1, RAG2, Lck, ZAP-70, CD34, CD2, HSA, CD44, CD25, PTα, CD4, CD8, CD69, 다양한 TCRα, TCRβ, TCRδ, 및 TCRγ V 유전자 조각 프로모터 및 인핸서(참조: 예를 들어, 국제 면역유전학 정보 시스템® 웹사이트(IMGT, imgt.org 등)에 기재된 다양한 V 유전자 조각 목록)의 전사를 조절하는 요소를 포함할 수 있다. 전사 조절 요소는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 종 기원의 것들을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, TdT를 인코딩하는 핵산은 비인간 동물의 게놈에서 B 세포 발달 중에, 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 발현되는 유전자의 게놈 유전자좌에 또는 그 근방에(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 kb 내에) 위치한다. 일부 구현예에서, TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌 또는 RAG2 유전자좌에 또는 그 근방에 위치한다.
일부 구현예에서, TdT를 인코딩하는 핵산은 비인간 동물의 게놈에서 T 세포 발달 중에 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 발현되는 유전자의 게놈 유전자좌 또는 그 근방에(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100kb 내에) 위치한다. 일부 구현예에서, TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌, TCRδ쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌 또는 RAG2 유전자좌에 또는 그 근방에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물과 비교하여 T 세포 및/또는 B 세포 발달에서의(예컨대, 프로-B 세포, 프리-B 세포, DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서) 하나 이상의 단계 동안 TdT 발현의 증가된 수준을 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물은, T 세포 및/또는 B 세포 발달의 하나 이상의 단계에서 상응하는 비인간 동물보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% 또는 500% 더 많은 TdT를 발현한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열 당 적어도 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 또는 1700개의 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 포함하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열 당 적어도 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개의 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 중쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 포함하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J TCRα쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRα CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCR쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRβ쇄 접합부의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D TCRβ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRβ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서의 비주형 첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRβ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 D-J TCRβ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서의 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J TCRγ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRγ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D TCRδ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRδ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서의 비주형 첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 D-J TCRδ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 D-J TCRδ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 생물체에서 내인성 TdT 유전자좌는 손상되지 않은 상태이다. 일부 구현예에서, 내인성 TdT 유전자좌는 비활성화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 내인성 TdT 유전자좌는 전체 또는 일부가 결실되어 비인간 생물체가 내인성 TdT를 발현하지 않게 된다.
인간 가변 도메인 항체 및 외인성 TdT를 발현하는 비인간 동물
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 외인성 TdT를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는 또한 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자를 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 함유하는 면역글로불린 유전자좌(외인성 또는 내인성)를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함하되, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 및 비인간 ES 세포는 생식 세포 및/또는 게놈에 이러한 면역글로불린 유전자좌를 다수 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는, 비재배열 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각 및 비재배열 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각(예컨대, κ쇄 유전자 조각 및/또는 λ쇄 유전자 조각)을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는 비재배열 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 유전자좌, 비재배열 인간 κ쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 유전자좌, 및 비재배열 인간 λ쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물, 예를 들어, 유전자 변형 마우스 또는 래트는 유전자 변형 면역글로불린 유전자좌(유전자 변형 재배열 또는 비재배열 면역글로불린 유전자좌)를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함하여 마우스가 인간 항체, 인간화 항체, 부분적 인간 항체, 리버스 키메라(인간 가변 및 비인간 불변 영역) 항체를 만들게 된다.
인간 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 유전자좌는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,633,425호, 제5,770,429호, 제5,814,318호, 제6,075,181호, 제6,114,598호, 제6,150,584호, 제6,998,514호, 제7,795,494호, 제7,910,798호, 제8,232,449호, 제8,502,018호, 제8,697,940호, 제8,703,485호, 제8,754,287호, 제8,791,323호, 제8,907,157호, 제9,035,128호, 제9,145,588호, 및 제9,206,263호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)뿐만 아니라 미국 특허 공개 번호 제2008/0098490호, 제2010/0146647호, 제2011/0195454호, 제2012/0167237호, 제2013/0145484호, 제2013/0167256호, 제2013/0219535호, 제2013/0326647호, 제2013/0096287호, 제2014/013275호, 제2014/093908호 및 제2015/0113668호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨), 및 PCT 공개 번호 제WO2007117410호, 제WO2008151081호, 제WO2009157771호, 제WO2010039900호, 제WO2011004192호, 제WO2011123708호 및 제WO2014093908호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 중쇄 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 경쇄, 예컨대 κ쇄, 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 중쇄 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 κ쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 κ쇄 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 κ쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 λ쇄 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 κ쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 λ쇄 유전자 조각이고 면역글로불린 불변 영역 유전자는 λ쇄 불변 영역 유전자이다.
특정 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 비재배열 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 VH 조각, 하나 이상의 인간 DH 조각 및 하나 이상의 인간 JH 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각은 적어도 3개의 VH 유전자 조각, 적어도 18개의 VH 유전자 조각, 적어도 20개의 VH 유전자 조각, 적어도 30개의 VH 유전자 조각, 적어도 40개의 VH 유전자 조각, 적어도 50개의 VH 유전자 조각, 적어도 60개의 VH 유전자 조각, 적어도 70개의 VH 유전자 조각 또는 적어도 80개의 VH 유전자 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 유전자 조각은 인간 DH 유전자 조각을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 유전자 조각은 인간 JH 유전자 조각을 모두 포함한다. Ig 중쇄 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 문헌 [Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되고, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 단일 다형성 인간 VH 유전자 조각, 복수의 DH 유전자 조각 및 복수의 JH 유전자 조각을 특징으로 하는 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 갖는다(예컨대, 이는 미국 특허 공개 번호 제2013/0096287호에 기재된 바와 같고, 본원에 참조로서 포함된다). 일부 구현예에서, VH 유전자 조각은 VH1-2 또는 VH1-69이다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 면역글로불린 유전자좌 변형은 비인간 동물의 번식력에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 중쇄 유전자좌는 내인성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 이들 모두를 포함하고, 유전자 변형은 내인성 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 이들 모두의 발현 및/또는 기능에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물의 게놈은 이소성으로(ectopically) 위치한 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다를 포함한다. 외인성 Adam6a 및/또는 Adam6b를 발현하는 예시적인 비인간 동물은 미국 특허 번호 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 조각은 B 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 B 세포에서 재배열 인간 중쇄 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 면역글로불린 중쇄의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 중쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
특정 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 비재배열 인간 Ig κ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 Vκ 조각 및 하나 이상의 인간 Jκ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Jκ 조각 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 4개의 기능성 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 16개의 기능성 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각(예컨대, 모든 기능적 인간 Vκ 조각 및 Jκ 조각)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 모든 인간 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각을 포함한다. Ig κ 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 문헌 [Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되고, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 두개 이하의 인간 VL 유전자 조각 및 복수의 JL 유전자 조각을 특징으로 하는 제한된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 갖는다(예컨대, 미국 특허 공개 번호 제2013/0198880호(본원에 참조로서 포함됨)에 개시된 이중 경쇄 마우스, 즉 DLC). 일부 구현예에서, VL 유전자 조각은 Vκ 유전자 조각이다. 일부 구현예에서, VL 유전자 조각은 Vλ 유전자 조각이다. 일부 구현예에서, Vκ 유전자 조각은 IGKV3-20 및 IGKV1-39이다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 κ 가변 영역 유전자 조각은 B 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 B 세포에서 재배열 인간 κ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열 당 적어도 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 또는 1700개의 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 비재배열 인간 Ig λ 가변 영역 유전자 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 Vλ 조각 및 하나 이상의 인간 Jλ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Vλ 조각 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Jλ 조각 모두를 포함한다. Ig λ 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역이 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2012/0073004호 및 제2002/0088016호에 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 λ 가변 영역 유전자 조각은 B 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 B 세포에서 재배열 인간 λ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 포함하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열 당 적어도 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개의 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역은 또한 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 비인간(예컨대, 설치류, 래트, 마우스) Ig 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자간 서열은 내인성 종 기원이다.
일부 구현예에서, 비인간 생물체는 재배열 중쇄 가변 영역(보편 중쇄 가변 영역)을 포함하는 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열 Ig 중쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열 Ig 중쇄 가변 영역 유전자이다. 예시적인 재배열 Ig 중쇄 가변 영역은 미국 특허 공개 번호 제2014/0245468호에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 보편 중쇄 가변 영역을 포함하는 비인간 생물체는 이중특이적 항체를 생산하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 비인간 생물체는 재배열 가벼운 가변 영역(보편 경쇄 가변 영역)을 포함하는 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열 Ig 경쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열 Ig 경쇄 가변 영역 유전자이다. 예시적인 재배열 Ig 경쇄 가변 영역은 예컨대, 미국 특허 공개 번호 제2011/0195454호, 제2012/0021409호, 제2012/0192300호, 제2013/0045492호, 제2013/0185821호, 제2013/0302836호, 제2015/0313193호, 제2015/0059009호 및 제2013/0198879호에 제공되며, 이들은 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 보편 경쇄 가변 영역을 포함하는 비인간 생물체("보편 경쇄" 생물체)는 이중특이적 항체를 생산하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 비인간 생물체는 경쇄 가변 유전자 조각(예컨대, 2개의 경쇄 가변 유전자 조각을 포함하는 이중 경쇄 가변 영역)의 제한된 레퍼토리를 포함하는 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 유전자 조각의 제한된 레퍼토리 내의 경쇄 가변 유전자 조각은 인간 경쇄 유전자 조각이다. 예시적인 이중 경쇄 가변 영역은 미국 특허 공개 번호 제2013/0198880호에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 이중 경쇄 가변 영역을 포함하는 비인간 생물체는 이중특이적 항체를 생산하는 데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 비인간 생물체는 pH 의존성 결합 특성을 이러한 비인간 생물체에서 생성된 항체에 도입시키도록 고안된 히스티딘 코돈의 삽입(insertion) 및/또는 치환(replacement)을 포함하는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 히스티딘 코돈은 CDR3을 인코딩하는 핵산 서열에 삽입 및/또는 치환된다. 다양한 그런 가벼운 및/또는 무거운 면역글로불린 유전자좌는 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제9,301,510 호, 제9,334,334호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0247236호, 제20140013456호에 제공된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 중쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자 또는 래트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 및 비인간 서열의 혼합물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 CH1 영역 및 비인간(예컨대, 내인성 종 기원, 마우스, 래트) CH2 및/또는 CH3 영역을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 Cμ, Cδ, Cγ(Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4), Cα 또는 Cε 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 돌연변이 CH1 영역을 인코딩하여, 비인간 동물이 중쇄만의 항체를 발현한다(예컨대, 미국 특허 번호 제8,754,287호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2015/0289489호(본원에 참조로서 포함됨) 참조). 일부 구현예에서, (예컨대, 보편 또는 이중 경쇄 생물체에서) 예를 들어 이중특이적 항체를 제조하기 위해 중쇄를 생성하는 것이 목적인 경우, 중쇄의 Fc 도메인은 중쇄 이형이량체(heterodimer) 형성을 촉진하고/하거나 중쇄 동형이량체(homodimer) 형성을 억제하기 위한 변형을 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,731,168호, 제5,807,706호, 제5,821,333호, 제7,642,228호 및 제8,679,785호 및 미국 특허 공개 번호 제2013/0195849호 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역은 경쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자 또는 래트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 인간 및 비인간 서열의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 인간 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 및 가변 영역 유전자 조각이 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 κ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 λ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 영역 유전자 조각이 작동 가능하게 연결된 불변 영역 유전자는 내인성 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물의 게놈 내의 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자좌 또는 하나 이상의 내인성 유전자좌의 일부분(예컨대, 가변 영역 및/또는 불변 영역)은 비활성화된다. 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자좌 및 그 일부분은, 이에 제한되지 않지만 생물체의 게놈에서 유전자좌 또는 그 일부분이 결실되는 방법, 유전자좌 또는 그 일부분이 다른 핵산 서열과 치환되는 방법, 유전자좌의 일부분이 역위되고/되거나 유전자좌의 일부분이 비인간 생물체의 게놈 내의 다른 위치로 변위되는 방법을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 비활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 비활성화는 단지 부분 비활성화이다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 가변 영역은 비활성화되지만 불변 영역은 (예컨대, 비내인성 가변 영역 유전자 조각에 작동 가능하게 연결되기 때문에) 계속 기능성이 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 비활성화 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 중쇄 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부는 가변 영역의 J 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 중쇄 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 Cμ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 비활성화 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 κ쇄 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된 내인성 κ쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부는 가변 영역의 J 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 κ쇄 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된 내인성 κ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 Cκ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 비활성화 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 λ쇄 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 내인성 λ쇄 유전자좌 내의 적어도 하나의 V-J-C 유전자 클러스터의 적어도 일부는 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌 또는 그 일부분은 내인성 λ쇄 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, 결실, 치환, 변위 및/또는 역위된 내인성 λ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 Cλ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물은 인간 가변 도메인(예컨대, 본원에 기술된 비재배열 인간 가변 영역 유전자 조각에서 유래된 인간 가변 도메인)을 갖는 항체를 발현한다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄 단독 항체이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에 의해 생성된 항체는 인간 중쇄 가변 도메인 및 인간 경쇄 가변 도메인 둘 다를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 경쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인은 비인간 기원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 중쇄 불변 도메인은 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 도메인은 마우스 또는 래트 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 래트 또는 마우스 기원이다.
인간 가변 도메인 T 세포 수용체 및 외인성 TdT를 발현하는 비인간 동물
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 외인성 TdT를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는 또한 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역 및 TCR 불변 영역 유전자를 포함하는 TCR 불변 영역을 함유하는 TCR 유전자좌(외인성 또는 내인성)를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함하고, 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 TCR 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 다양한 유전자 변형 비인간 동물, 예컨대 유전자 변형 마우스는 유전자 변형 T 세포 수용체 유전자좌(유전자 변형 TCRα, β, γ 및/또는 δ 유전자좌)를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함하여 마우스가 인간 T 세포 수용체, 인간화 T 세포 수용체, 부분적 인간 T 세포 수용체, 리버스 키메라(인간 가변 및 비인간 불변 영역) T 세포 수용체를 발현한다. 하나의 구현예에서, 예시적인 비인간 동물은 미국 특허 번호 제9,113,616호 및 국제 공개 번호 제WO 2016/164492호에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 비인간 TCR 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자 또는 마우스 불변 영역 유전자와 같은 설치류 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 비인간 동물 및 비인간 ES 세포는 이러한 다수의 TCR 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는 비재배열 TCRα 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 TCR 유전자좌 및 비재배열 TCRβ 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 TCR 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포는 비재배열 인간 TCRγ 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 TCR 유전자좌 및 비재배열 인간 TCRδ 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 적어도 하나의 TCR 유전자좌를 생식 세포 및/또는 게놈에 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 비재배열 TCR 가변 영역 유전자 조각은 TCRα 유전자 조각이고, TCR 불변 영역 유전자는 TCRα 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 TCR 가변 영역 유전자 조각은 TCRβ쇄 유전자 조각이고, TCR 불변 영역 유전자는 TCRβ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 TCR 가변 영역 유전자 조각은 TCRγ쇄 유전자 조각이고, TCR 불변 영역 유전자는 TCRγ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 인간 비재배열 TCR 가변 영역 유전자 조각은 TCRδ쇄 유전자 조각이고, TCR 불변 영역 유전자는 TCRδ 불변 영역 유전자이다. 인간 TCR 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어 미국 특허 번호 제9,113,616호 및 문헌 [Li et al., Nature Medicine 16:1029-1035(2010)]에 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, TCR 가변 영역은 비재배열 인간 TCRβ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 인간 TCRβ 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 TCRβ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRβ 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 보유하지 않은 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D 및/또는 D-J TCRβ 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRβ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, TCR 가변 영역은 비재배열 인간 TCRα 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 인간 TCRα 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 TCRα 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRα 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2% 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRα 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRα 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J TCRα 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRα CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, TCR 가변 영역은 비재배열 인간 TCRδ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 인간 TCRδ 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 TCRδ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRδ 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D 및/또는 D-J TCRδ 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRδ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, TCR 가변 영역은 비재배열 인간 TCRγ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 인간 TCRγ 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 TCRγ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D TCRγ 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2% 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개 이상의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J TCRγ 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J TCRγ 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J TCRγ 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 TCRγ CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역은 또한 인간 TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 가변 영역은 비인간(예컨대, 설치류, 래트, 마우스) TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자간 서열은 내인성 종 기원이다.
일부 구현예에서, 인간 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역 및 가변 영역 유전자 조각이 작동 가능하게 연결된 TCR 불변 영역 유전자는 내인성 TCR 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRα 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRβ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRγ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRδ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 영역 유전자 조각이 작동 가능하게 연결된 불변 영역 유전자는 내인성 불변 영역 유전자, 예컨대 상응하는 내인성 불변 영역이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물의 게놈 내의 하나 이상의 내인성 TCR 유전자좌 또는 하나 이상의 내인성 유전자좌의 일부분(예컨대, 가변 영역 및/또는 불변 영역)은 비활성화된다. 내인성 TCR 가변 영역 유전자좌 및 그 일부분은, 이에 제한되지 않지만, 생물체의 게놈에서 유전자좌 또는 그 일부분이 결실되는 방법, 유전자좌 또는 그 일부분이 다른 핵산 서열과 치환되는 방법, 유전자좌의 일부분이 역위되고/되거나 유전자좌의 일부분이 비인간 생물체의 게놈 내의 다른 위치로 변위되는 방법을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 비활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 비활성화는 단지 부분 비활성화이다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 가변 영역은 비활성화되지만 불변 영역은 (예컨대, 비내인성 가변 영역 유전자 조각에 작동 가능하게 연결되기 때문에) 계속 기능성이 있다. 비활성화 TCR 유전자좌의 예는 예를 들어 문헌 [Mombaerts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3084-3087(1991) 및 Mombaerts et al., Nature 390:225-231(1992)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물은 인간 가변 도메인(예컨대, 본원에 기술된 비재배열 인간 가변 영역 유전자 조각에서 유래된 인간 가변 도메인)을 갖는 TCR을 발현한다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 TCRα 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 TCRβ 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 TCRγ 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 도메인은 인간 TCRδ 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에 의해 생성된 TCR은 인간 TCRα 가변 도메인 및 인간 TCRβ 가변 도메인 둘 다를 갖는다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에 의해 생성된 TCR은 인간 TCRγ 가변 도메인 및 인간 TCRδ 가변 도메인 둘 다를 갖는다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에 의해 생성된 TCR은 인간 TCRα 가변 도메인 및 인간 TCRβ 가변 도메인 둘 다, 및 인간 TCRγ 가변 도메인 및 인간 TCRδ 가변 도메인 둘 다를 갖는다. 일부 구현예에서, TCR은 인간 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 비인간 기원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 불변 도메인은 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 마우스 또는 래트 기원이다.
키메라 항원 수용체(CAR) 및 외인성 TdT를 발현하는 비인간 동물
특정 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자좌를 또한 포함하는 본원에 기술된 외인성 TdT를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 및 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다. 이러한 CAR 유전자좌는 일반적으로 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 가변 영역은 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 반면, 불변 영역 유전자좌는 TCR 불변 영역 유전자를 포함하며, Ig 가변 영역 유전자 조각은 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 비인간 TCR 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자 또는 마우스 불변 영역 유전자와 같은 설치류 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 유전자좌는 내인성 TCR 유전자좌에 위치한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, TCRα 불변 영역 유전자를 포함하는 CAR 유전자좌는 내인성 TCRα 불변 영역 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, TCRα 비재배열 가변 영역의 일부 또는 전부를 비재배열 Ig 가변 영역으로 치환함으로써 이러한 유전자좌가 생성된다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 영역 유전자를 포함하는 CAR 유전자좌는 내인성 TCRβ 불변 영역 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, TCRβ 비재배열 가변 영역의 일부 또는 전부를 비재배열 Ig 가변 영역으로 치환함으로써 이러한 유전자좌가 생성된다.
특정 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각을 함유할 것이다. 인간 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역 유전자좌는 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 그러한 유전자좌는 미국 특허 번호 제5,633,425호, 제5,770,429호, 제5,814,318호, 제6,075,181호, 제6,114,598호, 제6,150,584호, 제6,998,514호, 제7,795,494호, 제7,910,798호, 제8,232,449호, 제8,502,018호, 제8,697,940호, 제8,703,485호, 제8,754,287호, 제8,791,323호, 제8,907,157호, 제9,035,128호, 제9,145,588호 및 제9,206,263호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)뿐만 아니라, 미국 특허 공개 번호 제2008/0098490호, 제2010/0146647호, 제2011/0195454호, 제2012/0167237호, 제2013/0145484호, 제2013/0167256호, 제2013/0219535호, 제2013/0326647호, 제2014/013275호, 제2014/093908호, 제2015/0113668호 및 제2016/0081314호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨) 및 PCT 공개 번호 제WO2007117410호, 제WO2008151081호, 제WO2009157771호, 제WO2010039900호, 제WO2011004192호, 제WO2011123708호, 제WO2014093908호 및 제WO2016/044745호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 비재배열 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 VH 조각, 하나 이상의 인간 DH 조각 및 하나 이상의 인간 JH 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 가변 영역 유전자 조각은 적어도 3개의 VH 유전자 조각, 적어도 18개의 VH 유전자 조각, 적어도 20개의 VH 유전자 조각, 적어도 30개의 VH 유전자 조각, 적어도 40개의 VH 유전자 조각, 적어도 50개의 VH 유전자 조각, 적어도 60개의 VH 유전자 조각, 적어도 70개의 VH 유전자 조각 또는 적어도 80개의 VH 유전자 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 유전자 조각은 인간 DH 유전자 조각을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 영역은 TCRβ 가변 영역 유전자 조각(예컨대, V, D 및/또는 J 유전자 조각)을 더 포함한다. 하나의 구현예에서, CAR 가변 영역은 원위 TCR Vβ 유전자 조각, 예컨대 TCR Vβ31 유전자 조각을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 원위 TCR Vβ 유전자 조각, 예컨대 TCR Vβ31 유전자 조각은 기능적으로 비활성화되거나 결실되었다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 유전자 조각은 인간 JH 유전자 조각을 모두 포함한다. Ig 중쇄 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 문헌 [Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되고, 이는 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 중쇄 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-D 및/또는 D-J 면역글로불린 중쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 중쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 더 크다.
일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 CAR 가변 유전자좌는 또한 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 유전자좌는 비인간(예컨대, 설치류, 래트, 마우스) Ig 중쇄 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 유전자좌는 인간 또는 비인간 동물(예컨대, 설치류, 래트, 마우스) TCRβ 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR 유전자좌의 비재배열 가변 영역은 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의) 트립신(TRY) 유전자(예컨대, TCRβ 가변 영역 유전자좌에 정상적으로 존재하는 TRY 유전자 및/또는 위유전자(pseudogene))를 포함한다. 일부 구현예에서, TRY 유전자는 비인간, 예컨대 마우스 TRY 유전자이다. 일부 구현예에서, 마우스 TRY 유전자는 Try1, Try2, Try3, Try4, Try5, Try6, Try7, Try8, Try9, Try10, Try11, Try12, Try13, Try14, Try15, Try16, Try17, Try18, Try19 및 Try20으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 TRY 유전자는 비재배열 가변 영역의 VH 조각의 상류에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 TRY 유전자는 VH 조각의 하류 및 비재배열 가변 영역의 DH 조각의 상류에 위치한다. 일부 구현예에서, Try1-7은 비재배열 가변 영역의 VH 조각의 상류에 위치하고, Try 8-20은 VH 조각의 하류 및 비재배열 가변 영역의 DH 조각의 상류에 위치한다. 인간 및/또는 마우스 TCRβ 유전자좌에 위치한 TRY 유전자에 관한 부가적인 정보는 문헌 [Glusman et al., Immunity 15:337-349(2001) 및 Skok et al., Nature Immunology 8 : 378-387(2007)]에 제공되며, 이들 각각은 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, CAR 유전자좌는 비인간 조절 요소(예컨대, 비인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예컨대, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다. 일부 구현예에서, CAR 유전자좌는 IgM 인핸서(Eμ)를 포함한다. 일부 구현예에서, IgM 인핸서는 비인간 Eμ(예컨대, 마우스 또는 래트 Eμ와 같은 설치류 Eμ)이다.
특정 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 비재배열 인간 Ig κ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 Vκ 조각 및 하나 이상의 인간 Jκ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 4개의 기능성 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 16개의 기능성 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Vκ 조각 및 모든 인간 Jκ 조각(예컨대, 모든 기능성 인간 Vκ 조각 및 Jκ 조각)을 모두 포함한다. Ig κ 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 문헌 [Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52] 및 보충 정보에 제공되고, 이는 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Jκ 조각 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 영역은 TCRα 가변 영역 유전자 조각(예컨대, V 및/또는 J 유전자 조각)을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 κ 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 κ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 κ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열 당 적어도 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 또는 1700개의 고유의 면역글로불린 κ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 비재배열 인간 Ig λ 가변 영역 유전자 조각을 함유한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 복수의 인간 Vλ 조각 및 하나 이상의 인간 Jλ 조각을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 모든 인간 Vλ 조각(예컨대, 모든 기능성 인간 Vλ 조각)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 Jλ 조각 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 영역은 TCRα 가변 영역 유전자 조각(예컨대, V 및/또는 J 유전자 조각)을 더 포함한다. Ig λ 유전자 조각을 포함하는 예시적인 가변 영역이 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2012/0073004호 및 제2002/0088016호에 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 λ 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 생물체의 T 세포에서 재배열 인간 λ 가변 영역 유전자를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 포함하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1% 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 비주형 첨가를 함유하지 않는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 작다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 1개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 2개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 3개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 게놈에 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산을 갖지 않는 상응하는 비인간 동물보다 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율이 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 변형 비인간 동물에서 적어도 4개의 N-첨가를 함유하는 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율은 상응하는 비인간 동물에서의 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 백분율보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 λ쇄 접합부의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 비주형 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 상응하는 비인간 동물보다 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열의 빈도가 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 더 크다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 10,000개의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열 당 적어도 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개의 고유의 면역글로불린 λ쇄 CDR3 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 비재배열 인간 Ig 경쇄 가변 영역 유전자 조각을 함유하는 CAR 가변 유전자 유전자좌는 또한 인간 Ig 경쇄 가변 영역 유전자간 서열(예컨대, κ 가변 영역 유전자간 서열 및/또는 λ 가변 영역 유전자간 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 유전자좌는 비인간(예컨대, 설치류, 래트, 마우스) Ig 경쇄 가변 영역 유전자간 서열(예컨대, κ 가변 영역 유전자간 서열 및/또는 λ 가변 영역 유전자간 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 가변 유전자좌는 인간 또는 비인간(예컨대, 설치류, 쥐, 마우스) TCRα 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 유전자좌는 비인간 조절 요소(예컨대, 비인간 프로모터 및/또는 인핸서)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 조절 요소는 설치류 조절 요소(예컨대, 래트 또는 마우스 프로모터 또는 인핸서)이다.
일부 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 Ig 중쇄 가변 영역 유전자(보편 중쇄 가변 영역)를 포함하는 재배열 가변 영역 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 재배열 Ig 중쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열 Ig 중쇄 가변 영역 유전자이다. 보편 중쇄 가변 영역의 사용은 하나 이상의 항원-결합 도메인이 펩타이드/MHC 복합체에 대한 특이성을 갖는 이중특이적 항체의 생성을 용이하게 한다. 예시적인 재배열 Ig 중쇄 가변 영역은 미국 특허 공개 번호 제2014/0245468호에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, CAR 가변 영역 유전자좌는 Ig 경쇄 가변 영역 유전자(보편 경쇄 가변 영역)를 포함하는 재배열 가변 영역 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 재배열 Ig 경쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열 Ig 경쇄 가변 영역 유전자이다. 보편 경쇄 가변 영역의 사용은 하나 이상의 항원-결합 도메인이 펩타이드/MHC 복합체에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체의 생성을 용이하게 한다. 예시적인 재배열 Ig 중쇄 가변 영역은 미국 특허 공개 번호 제2013/0185821호에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 포함된다.
기타 유전자 변형
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드(예컨대, 인간화 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-g, HLA-K 및/또는 HLA-L)를 인코딩하는 유전자좌를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인(예컨대, 인간 α1, α2 및 α3 도메인) 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드, 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 MHC 클래스 I α쇄 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 미국 특허 공개 번호 제2013/0111617호, 제2013/0185819호 및 제2014/0245467호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌를 발현하고/하거나 포함한다. 인간화 β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드, 인간화 β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자좌 및 인간화 β-2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 미국 특허 공개 번호 제2013/0111617호 및 제2013/0185819호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드(예컨대, 인간화 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 및/또는 HLA-DRA)를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드, 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 MHC 클래스 II α쇄 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 미국 특허 번호 제8,847,005호 및 제9,043,996호 및 미국 특허 공개 번호 제2014/0245467호에 기술되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드(예컨대, 인간화 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 및/또는 HLA-DRB)를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드는 인간 세포외 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드, 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 MHC 클래스 II β쇄 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 미국 특허 번호 제8,847,005호 및 제9,043,996호, 미국 특허 공개 번호 제2014/0245467호에 기술되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
외인성 TdT, 인간화 TCR 유전자좌 및 인간화 MHC I 및/또는 MHC II(MHC IIα/IIβ) 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물은 통상적인 방법을 사용하여 교배함으로써 생성될 수 있고, 대안으로, 이들은 하나 이상의 유전자 조작 유전자좌(예컨대, 인간화 TCR 유전자좌)를 이미 포함하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성될 수 있으며, 상기 ES 세포로부터 비인간 동물을 생성할 수 있다.
외인성 TdT, 인간화 CAR 유전자좌 및 인간화 MHC I 및/또는 MHC II(MHC IIα/IIβ) 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물은 통상적인 방법을 사용하여 교배함으로써 생성될 수 있고, 대안으로, 이들은 하나 이상의 유전자 조작 유전자좌(예컨대, 인간화 CAR 유전자좌)를 이미 포함하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성될 수 있으며, 상기 ES 세포로부터 비인간 동물을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드는 인간 세포외 면역글로불린 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드, 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 CD8 α쇄 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 공개 번호 제2014/0245466호에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드는 인간 세포외 면역글로불린 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드, 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 CD8 β쇄 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 공개 번호 제2014/0245466호에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 외인성 TdT, 인간화 TCR 또는 CAR을 발현하는 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물 및 ES 세포는 또한 게놈에 인간화 CD4 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌를 발현하고/하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 CD4 폴리펩타이드는 완전히 인간의 것과 같다. 일부 구현예에서, 인간화 CD4 폴리펩타이드는 적어도 하나의 인간 세포외 면역글로불린 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 CD4 폴리펩타이드는 적어도 인간 D1 면역글로불린 도메인, 인간 D2 면역글로불린 도메인 및 인간 D3 면역글로불린 도메인, 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 CD4 폴리펩타이드는 인간 D1 면역글로불린 도메인, 인간 D2 면역글로불린 도메인, 인간 D3 면역글로불린 도메인, 내인성 종 기원의 D4 면역글로불린 도메인 및 내인성 종 기원의 세포질 도메인을 포함한다. 인간화 CD4 폴리펩타이드, 인간화 CD4 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자좌 및 인간화 CD4 폴리펩타이드를 발현하는 비인간 동물은 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 공개 번호 제2014/0245466호에 기술되어 있다.
외인성 TdT, 인간화 TCR 유전자좌 및 인간화 CD4 및/또는 CD8(CD8α/CD8β) 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물은 통상적인 방법을 사용하여 교배함으로써 생성될 수 있고, 대안으로 이들은 하나 이상의 유전자 조작 유전자좌(예컨대, 인간화 TCR 유전자좌)를 이미 포함하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성될 수 있으며, 상기 ES 세포로부터 비인간 동물을 생성할 수 있다.
외인성 TdT, 인간화 CAR 유전자좌 및 인간화 CD4 및/또는 CD8(CD8α/CD8β) 유 전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물은 통상적인 방법을 사용하여 교배함으로써 생성될 수 있고, 대안으로, 이들은 하나 이상의 유전자 조작 유전자좌(예컨대, 인간화 CAR 유전자좌)를 이미 포함하는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 생성될 수 있으며, 상기 ES 세포로부터 비인간 동물을 생성할 수 있다.
유전자 변형 비인간 동물의 사용 방법
특정 양태에서, 항원 결합 단백질(예컨대, 항체, CAR, TCR), 이러한 항원 결합 단백질을 발현하는 세포(예컨대, B 세포, T 세포, B 세포 하이브리도마, T 세포 하이브리도마) 및 이러한 항원 결합 단백질 또는 그 부분들(예컨대, 가변 도메인)을 인코딩하는 핵산을 생성하기 위해 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 보다 다양한 항원 결합 단백질(예컨대, 항체, CAR, TCR)을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 증가된 수의 뉴클레오타이드 첨가를 갖는 항원 결합 단백질(예컨대, 항체, CAR, TCR)의 재배열 가변 영역을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 방법은 유전자 변형 비인간 동물이 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하도록 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 B 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 비인간 동물로부터의 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; 및 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; B 세포로부터 하이브리도마를 선택적으로 제조하는 단계; 및 B 세포 또는 하이브리도마로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; B 세포로부터 하이브리도마를 선택적으로 제조하는 단계; B 세포 또는 하이브리도마로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계; 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에서 인간 면역글로불린 불변 도메인을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결시키는 단계; 및 숙주 세포가 면역글로불린 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 인간 항체를 발현하도록 하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 TCR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 및 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 TCR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 T 세포로부터 T 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 TCR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 TCR의 인간 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 TCR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; TCR의 인간 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계; 및 세포가 TCR 가변 도메인 및 TCR 불변 도메인을 포함하는 TCR을 발현하도록 세포에서 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 TCR 불변 도메인과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 CAR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 및 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 CAR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 T 세포로부터 T 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 CAR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 CAR의 인간 CAR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외인성 TdT 및 인간 가변 도메인을 갖는 CAR을 발현하도록 변형된 본원에 기술된 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 핵산에 노출시키는 단계; 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 CAR의 인간 CAR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계; 및 세포가 인간 면역글로불린 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체를 발현하도록 세포에서 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 인간 면역글로불린 불변 도메인과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 면역 반응(예컨대, B 세포 면역 반응 및/또는 T 세포 면역 반응)을 유도하기 위해 본원에 기술된 비인간 동물을 항원에 노출(면역화)시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 전체 단백질 항원 또는 그의 단편으로 면역화된다. 설치류는 당업계에 공지된 임의의 방법(예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik and Lillehoj(1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA] 참조)에 의해 면역화될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 렌티바이러스)를 비인간 동물에게 투여함으로써 유전자 변형 비인간 동물이 항원에 노출된다. 바이러스 예방 접종을 위한 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,001,349호, 제8,663,622호, 제8,691,502호, 제8,377,688호뿐만 아니라 문헌 [Precopio et al., JEM 204:1405-1416(2007)]에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에게 바이러스가 직접 투여된다. 일부 구현예에서, 세포(예컨대, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포)가 바이러스에 시험관내 또는 생체외 감염된 후 비인간 동물에게 투여된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 펩타이드/MHC 복합체(예컨대, 단일-쇄 펩타이드/MHC 복합체)를 인코딩한다. 단일-쇄 펩타이드/MHC 기반 백신의 예는 문헌 [Truscott et al., J. Immunol. 178:6280-6289(2007), EP1773383, Kim et al., Vaccine 30:2178-2186(2012), Kim et al., J. Immunol. 184:4423-4430(2010)]에 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물은 항원을 인코딩하는 핵산을 동물에게 투여함으로써 항원에 노출된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에게 단일 쇄 펩타이드/MHC 복합체를 인코딩하는 핵산이 투여된다. 단일-쇄 펩타이드/MHC 기반 백신의 예는 문헌 [Truscott et al., J. Immunol. 178:6280-6289(2007), EP1773383, Kim et al., Vaccine 30:2178-2186(2012), Kim et al., J. Immunol. 184:4423-4430(2010)]에 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 특정 구현예에서, 핵산은 DNA 벡터이다. 핵산 전달은 바이러스 매개 유전자 전달 및 리포좀 매개 유전자 전달을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 목적 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,770,291호, 제7,001,614호, 제6,749,863호, 제5,512,295호 및 제7,112,338호(이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨)에 기술된 바와 같이, 리포좀과 결합되어 유전자 전달체(delivery vehicle)를 형성한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA 벡터이다. mRNA 벡터를 생성하고 투여하는 예시적인 방법의 예는 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,278,036호 및 미국 특허 공개 번호 제2013/151736호 및 제2012/135805호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 항원은 암 관련 항원이다. 암 관련 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 아디포피린(adipophilin), AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-페토프로틴("AFP"), ALK, ANKRD30A, ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, BIRC7, CA-125, CA9, CALCA, 암종 배아 항원(carcinoembryonic antigen, "CEA"), CALR, CASP-5, CASP-8, CCR5, CD19, CD20, CD22, CD27, CD274, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD45, CD52, CD56, CD79, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLEC12A, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, EGFR, EGFR 변이 III, 신장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA2, EphA3, 상피 종양 항원(epithelial tumor antigen, "ETA"), ERBB3, ERBB4, ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, FCRL3, FGF5, FLT3-ITD, FN1, FOLR1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸(glypican)-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, HAUS3, 헵신(Hepsin), HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13R알파2, 장 카복실에스터레이즈, K-ras, 칼리크레인(Kallikrein) 4, KIF20A, KIT, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, CCDC110으로도 공지되어 있는 KMHN1, KRAS, LAGE-1, 융합 단백질로서의 LDLR-푸코실트랜스퍼레이즈, 렝신(Lengsin), LGR5, LMP2, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말릭 효소, 마마글로빈(mammaglobin)-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로(Meloe), 미드카인(Midkine), MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC5AC, MUC16, 뮤신(mucin), MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신(Myosin), 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, OX40, P 폴리펩타이드, p53, PAP, PAX3, PAX5, PBF, PLAC1, PMEL, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신(polymorphic epithelial mucin, "PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PRLR, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RET, RGS5, RhoC, RNF43, ROR1, RU2AS, SAGE, SART1, SART3, 세세르닌 1(secernin 1), SIRT2, SLAMF7, SLC39A6, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, STEAP2, 서바이빈(survivin), SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머레이스, TERT, TGF-베타RII, 톰슨-누벨 항원(Thompson-nouvelle antigen), TMPRSS2, TNFRSF17, TPBG, TRAG-3, 삼탄당 인산 이성질체화효소(Triosephosphate isomerase), TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 타이로시네이스, 타이로시네이스("TYR"), UPK3A, VEGF, VTCN1, WT1, XAGE-1b/GAGED2a를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신항원(neo-antigen)이다.
일부 구현예에서, 항원은 감염성 병원체에 의해 발현되는 항원이다. 일부 구현예에서, 병원체는 바이러스, 세균, 진균류, 기생충 또는 원생 동물이다. 바이러스의 비제한적인 예는 HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스(예컨대, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비(flavi)바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키(coxsackie) 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스(parvovirus), 백시나 바이러스, HTLV, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스(papillomavirus), 연체 동물 바이러스, 폴리오 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 에볼라 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 기생충은 말라리아이다. 일부 구현예에서, 병원체는, 아스퍼질러스(Aspergillus), 브루지아(Brugia), 칸디다(Candida), 클라미디아(Chlamydia), 콕시디아(Coccidia), 크립토코커스(Cryptococcus), 디로필라리아(Dirofilaria), 임균(Gonococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 클렙시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 리슈만 편모충(Leishmania), 수막구균(Meningococci), 결핵균(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 짚신벌레(Paramecium), 백일해(Pertussis), 열원충(Plasmodium), 폐렴 구균(Pneumococcus), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 포도상 구균(Staphylococcus), 연쇄상 구균(Streptococcus), 톡소플라스마(Toxoplasma) 및 콜레라균(Vibriocholerae)이다. 예시적인 종은 나이세리아 임질균(Neisseria gonorrhea), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 질편모충(Trichomonas vaginalis), 헤모필루스 바지날리스(Haemophilus vaginalis), 그룹 B 연쇄상구균속(Streptococcus sp.), 마이크로플라즈마 호미니스(Microplasma hominis), 연성하감균(Hemophilus ducreyi), 서혜부 육아종(Granuloma inguinale), 임파 육아종(Lymphopathia venereum), 매독균(Treponema pallidum), 소유산균(Brucella abortus), 말타열균(Brucella melitensis), 돼지 유산균(Brucella suis), 개 유산균(Brucella canis), 태아고균(Campylobacter fetus), 장 태아고균(Campylobacter fetus intestinalis), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 양 유산균(Brucella ovis), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 쇠세모편모충(Trichomonas foetus), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 대장균(Escherichia coli), 악티노바실러스 에퀼리(Actinobacillus equuli), 살모넬라 아보르투스 오비스(Salmonella abortus ovis), 살모넬라 아보르투스 에퀴(Salmonella abortus equi), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi), 화농성 코리네박테리움(Corynebacterium pyogenes), 악티노바실러스 세미니스(Actinobaccilus seminis), 마이코플라스마 보비게니탈리움(Mycoplasma bovigenitalium), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 앱시디아 라모사(Absidia ramosa), 트리파노소마 에퀴페르둠(Trypanosoma equiperdum), 바베시아 카발리(Babesia caballi), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum); 또는 예컨대 브라질 파라콕시디오이디즈(Paracoccidioides brasiliensis)와 같은 균류; 또는 기타 병원체, 예컨대 열대 열원충(Plasmodium falciparum)을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 방법은 유전자 변형 비인간 동물로부터 T 세포 및/또는 B 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 이러한 세포를 수득할 수 있다. 예를 들어, 이러한 T 세포 및/또는 B 세포는 동물의 비장, 림프절 및/또는 말초 혈액으로부터 수득될 수 있다. 이러한 T 세포 및/또는 B 세포는 당업계에서 이용 가능한 방법을 사용하여 결합 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 B 세포로부터 B 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함한다. B 세포 하이브리도마를 제조하는 데 유용한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik and Lillehoj(1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA]에 기술되어 있으며, 이들은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 T 세포로부터 T 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함한다. T 세포 하이브리도마를 제조하는 데 유용한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hedrick et al., Cell 30:141-152(1982) 및 Kruisbeek Curr. Protoc. Immunol. Chapter 3(2001) 및 White et al., Methods in Molecular Biology 134:185-193(2000)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 Ig 또는 TCR 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 임의의 방법을 사용하여 Ig 또는 TCR 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산을 단리하는 단계는 B 세포 또는 T 세포로부터 B 세포 또는 T 세포 하이브리도마를 각각 제조하고 하이브리도마로부터 핵산을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 핵산 증폭 공정을 사용하여 단리된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산 증폭 공정은 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 자가-유지 서열 복제(3SR), Qβ 레플리카아제 기반 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 복구 연쇄 반응(RCR), 부메랑 DNA 증폭(BDA) 또는 롤링 서클 증폭(RCA)이다.
일부 구현예에서, 핵산은 재배열 Ig 또는 TCR 가변 영역 유전자를 B 세포, T 세포, B 세포 하이브리도마 또는 T 세포 하이브리도마에서 시퀀싱(sequencing)하고 재배열 Ig 또는 TCR 가변 영역 유전자를 포함하는 핵산 서열을 합성함으로써 단리된다. 예시적인 핵산 시퀀싱 공정은 이에 제한되지 않지만 사슬 종결 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 이온 반도체 시퀀싱, 단일 분자 실시간 시퀀싱, 454 시퀀싱 및/또는 희석-'N'-이동 시퀀싱(Dilute-'N'-Go sequencing)을 포함한다.
중쇄 및/또는 경쇄 Ig 가변 영역을 인코딩하는 DNA 단편이 수득되는 경우, 이들 DNA 단편은 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키는 표준 재조합 DNA 기술로 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, 가변 영역-인코딩 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 2개의 DNA 단편이 결합되어 2개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 머무르도록 하는 것을 의미한다.
중쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 가변 영역-인코딩 DNA를 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있고(예컨대, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 복지부, NIH 간행물 번호 91-3242, 또는 Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 도메인은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 도메인일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, VH-인코딩 DNA는 CH1 중쇄 불변 영역만 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 숙주 세포가 Ig 중쇄 가변 도메인 및 Ig 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Ig 중쇄 폴리펩타이드를 발현하도록 중쇄 Ig 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포에서 중쇄 Ig 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 숙주 세포가 Ig 경쇄 가변 도메인 및 Ig 경쇄 불변 도메인을 포함하는 Ig 경쇄 폴리펩타이드를 발현하도록 경쇄 Ig 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포에서 경쇄 Ig 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 숙주 세포가 중쇄 Ig 가변 도메인 및 중쇄 Ig 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄 Ig 가변 도메인 및 경쇄 Ig 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 갖는 항체를 발현하도록, 중쇄 Ig 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포에서 중쇄 Ig 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결시키는 단계 및 Ig 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포에서 경쇄 Ig 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함한다. Ig 가변 영역은 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 Ig 불변 영역과 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 폴리펩타이드를 발현할 수있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예컨대, PERC.6™ 세포), 또는 CHO 세포, HEK-293 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포 또는 베로(Vero) 세포이다.
일부 구현예에서, 중쇄 불변 도메인을 인코딩하는 핵산은 변형 Fc 도메인(예컨대, Fc 및 Fc 수용체 사이의 상호 작용을 변화시키는 돌연변이)을 포함하는 불변 도메인을 인코딩한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 불변 도메인은 위치 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 및/또는 407(EU 넘버링 시스템 사용)에서 그의 Fc 도메인에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A 및/또는 Y407V(EU 넘버링 시스템 사용)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 불변 도메인은 그의 Fc 도메인에 다수의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 변형은 D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H로 이루어진 군에서 선택된다. 추가적인 Fc 변형 및 Fc 변형의 조합은 미국 특허 번호 제5,624,821호, 제5,648,260호, 제6,528,624호, 제6,737,056호, 제7,122,637호, 제7,183,387호, 제7,297,775호, 제7,317,091호, 제7,332,581호, 제7,632,497호, 제7,662,925호, 제7,695,936호, 제8,093,359호, 제8,216,805호, 제8,218,805호, 제8,388,955호 및 제8,937,158호, 및 미국 특허 공개 번호 제2005/0054832호, 제2006/0222653호, 제2006/0275282호, 제2006/0275283호, 제2007/0190063호, 제2008/0154025호, 제2009/0042291호, 제2013/0108623호 및 제2013/0089541호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
항원 결합 단백질
특정 양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라(예컨대, 본원에 기술된 비인간 동물을 사용하여) 수득 가능하고/하거나 수득된 항원 결합 단백질(예컨대, 항체, TCR, CAR 및 이의 항원 결합 단편)이 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항원 결합 분자는 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이하의 해리 상수로 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, (KD로 표현된) 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 관련 없는 항원에 대한 항원 결합 단백질의 친화도보다 적어도 10배 미만, 적어도 100배 미만 또는 적어도 1,000배 미만이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이하의 해리 상수로 펩타이드/MHC 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, (KD로 표현된) 펩타이드/MHC 복합체에 대한 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 관련 없는 펩타이드를 제시하는 동일한 MHC 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 친화도보다 적어도 10배 미만, 적어도 100배 미만 또는 적어도 1000배 미만이다. 항원 결합 단백질의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블랏 및 RIA를 포함하여 당업계에 공지되어 있다. 항원 결합 단백질의 결합 속도(binding kinetic)(예컨대, 결합 친화도)는 또한 Biacore 분석과 같은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 암 관련 항원이고/이거나 암 관련 항원의 항원 결정기를 포함한다. 암 관련 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 아디포피린, AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-페토프로틴("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, CA-125, CALCA, 암종 배아 항원("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, 신장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, 상피 종양 항원("ETA"), ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, 헵신, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13R알파2, 장 카복실에스터레이즈, K-ras, 칼리크레인 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, CCDC110으로도 공지되어 있는 KMHN1, LAGE-1, 융합 단백질로서의 LDLR-푸코실트랜스퍼레이즈, 렝신, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말릭 효소, 마마글로빈-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로, 미드카인, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, 뮤신, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P 폴리펩타이드, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, 세세르닌 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, 서바이빈, SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머레이스, TGF-베타RII, TPBG, TRAG-3, 삼탄당 인산 이성질체화효소, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 타이로시네이스, 타이로시네이스("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신항원이다.
일부 구현예에서, 항원은 감염성 병원체에 의해 발현되는 항원이고/이거나 항원의 항원 결정기를 포함한다. 일부 구현예에서, 병원체는 바이러스, 세균, 진균류, 기생충 또는 원생 동물이다. 바이러스의 일부 비제한적인 예는 HPV, HBV, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)와 같은 레트로 바이러스, 엡스타인 바 바이러스(EPV)와 같은 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV), HSV-1 및 HSV-2, 및 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 기생충은 말라리아이다. 일부 구현예에서, 병원체는 아스퍼질러스, 브루지아, 칸디다, 클라미디아, 콕시디아, 크립토코커스, 디로필라리아, 임균, 히스토플라스마, 리슈만 편모충, 결핵균, 마이코플라스마, 짚신벌레, 백일해, 열원충, 폐렴 구균, 뉴모시스티스, 리케차, 살모넬라, 시겔라, 포도상 구균, 연쇄상 구균, 톡소플라스마 및 콜레라균이다. 예시적인 종은 나이세리아 임질균, 결핵균, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 질편모충, 헤모필루스 바지날리스, 그룹 B 연쇄상구균속, 마이크로플라즈마 호미니스, 연성하감균, 서혜부 육아종, 임파 육아종, 매독균, 소유산균, 말타열균, 돼지 유산균, 개 유산균, 태아고균, 장 태아고균, 렙토스피라 포모나, 리스테리아 모노사이토제니스, 양 유산균, 클라미디아 시타시, 쇠세모편모충, 톡소포자충, 대장균, 악티노바실러스 에퀼리, 살모넬라 아보르투스 오비스, 살모넬라 아보르투스 에퀴, 녹농균, 코리네박테리움 에퀴, 화농성 코리네박테리움, 악티노바실러스 세미니스, 마이코플라스마 보비게니탈리움, 아스퍼질러스 푸미가투스, 앱시디아 라모사, 트리파노소마 에퀴페르둠, 바베시아 카발리, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 보툴리눔; 또는 예컨대 브라질 파라콕시디오이디즈와 같은 균류; 또는 기타 병원체, 예컨대 열대 열원충을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 염증성 질환, 피부 또는 장기 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환(GVHD) 또는 자가 면역 질환에서 자가 반응성 T 세포의 표적인 단백질이고/이거나 단백질의 항원 결정기를 포함한다. 자가 면역 질환의 예는 예를 들어, 사구체 신장염, 관절염, 확장성 심근병증-유사 질환, 궤양성 대장염(ulceous colitis), 건조 증후군, 크론병, 전신성 홍반(systemic erythematodes), 만성 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 접촉성 피부염, 다발성 근육염, 피부비후증, 결절동맥 주위염(periarteritis nodosa), 류마티스열, 보통 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트병, 하시모토병, 애디슨병, 피부근염, 중증 근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스병, 악성 빈혈증, 굿파스처 증후군, 불임증, 만성 활동성 간염, 천포창, 자가면역 혈소판 감소 자색반, 및 자가 면역 용혈 빈혈, 활동성 만성 간염, 애디슨 병, 항-인지질 증후군, 아토피성 알러지, 자가 면역 위축성 위염, 자가 면역성 무염소증, 셀리악병, 쿠싱 증후군, 피부 근육염, 원반 모양 낭창, 홍반, 굿파스처 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 부신 위축증, 특발성 혈소판 감소증, 인슐린 의존성 당뇨병, 람베르트-이튼 증후군, 루포이드 간염, 림프구 감소증의 일부 경우, 혼합성 결합 조직 질환, 유사천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 수정체성 포도막염, 결절성 다발 동맥염, 다발성자가 증후군, 원발성 쓸개관 간경화증, 원발성 경화 담관염, 레이노 증후군, 재발성 다발 연골염, 슈미트 증후군, 제한된 공피증(또는 크레스트 증후군), 교감 눈염증, 전신성 홍반 루푸스, 다카야스의 동맥염, 일시적 동맥염, 갑상선 중독증, b형 인슐린내성, 궤양성 대장염 및 베게너 육아종증을 포함한다. 자기 반응성 T 세포에 의해 표적화된 예시적인 단백질에는 예를 들어, p205, 인슐린, 갑상선 자극 호르몬, 타이로시네이스, TRP1 및 미엘린이 포함된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 도메인을 포함한다. 인간 중쇄 불변 도메인의 서열은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 복지부, NIH 간행물 번호 91-3242, 또는 Lefranc, Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001] 참조). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 중쇄 불변 도메인 또는 그의 일부를 결여한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 변형 Fc 도메인(예컨대, Fc와 Fc 수용체 사이의 상호 작용을 변화시키는 돌연변이)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 위치 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 및/또는 407(EU 넘버링 시스템 사용)에서 그의 Fc 도메인에 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A 및/또는 Y407V(EU 넘버링 시스템 사용)로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항체는 그의 Fc 도메인에 다수의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 변형은 D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H로 이루어진 군에서 선택된다. 추가적인 Fc 변형 및 Fc 변형의 조합은 미국 특허 번호 제5,624,821호, 제5,648,260호, 제6,528,624호, 제6,737,056호, 제7,122,637호, 제7,183,387호, 제7,297,775호, 제7,317,091호, 제7,332,581호, 제7,632,497호, 제7,662,925호, 제7,695,936호, 제8,093,359호, 제8,216,805호, 제8,218,805호, 제8,388,955호 및 제8,937,158호, 및 미국 특허 공개 번호 제2005/0054832호, 제2006/0222653호, 제2006/0275282호, 제2006/0275283호, 제2007/0190063호, 제2008/0154025호, 제2009/0042291호, 제2013/0108623호 및 제2013/0089541호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 항체는 이중-특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 이중-특이적 항체의 2개의 항원 결합 도메인은 별개의 중쇄 가변 도메인을 갖지만 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 중쇄의 Fc 도메인은 중쇄 이형이량체 형성을 촉진하고/하거나 중쇄 동형이량체 형성을 억제하기 위한 변형을 포함한다. 이러한 변형은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,731,168호, 제5,807,706호, 제5,821,333호, 제7,642,228호 및 제8,679,785호 및 미국 특허 공개 번호 제2013/0195849호 제공되며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 λ 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 κ 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 경쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 λ 경쇄 불변 도메인이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 κ 경쇄 불변 도메인이다. 인간 경쇄 불변 도메인의 서열은 당업계에 공지되어있다(예컨대, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 복지부, NIH 간행물 번호 91-3242, 또는 Lefranc, Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001] 참조).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 손상되지 않은 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 항원 결합을 보유하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 다이설파이드 결합된 Fv, Fd, 단일-쇄 항체, 단리된 CDRH3 또는 손상되지 않은 항체의 가변 도메인의 적어도 일부분을 보유하는 또 다른 항체 단편이다.
특정 구현예에서, 항원 결합 단백질은 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 막-결합된다. 일부 구현예에서, CAR은 가용성 CAR(예컨대, 막관통 또는 세포질 도메인 결여)이다. 일부 구현예에서, 이러한 CAR은 Ig 중쇄 가변 도메인 및 TCRβ 불변 도메인을 포함하는 제1 CAR 폴리펩타이드 및 Ig 경쇄 가변 도메인(예컨대, Ig κ 가변 도메인 또는 Ig λ 가변 도메인) 및 TCRα 불변 도메인을 포함하는 제2 CAR 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, Ig 중쇄 가변 도메인 및/또는 Ig 경쇄 가변 도메인은 인간 Ig 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인 및/또는 TCRα 불변 도메인은 비인간 불변 도메인(예컨대, 래트 또는 마우스 불변 도메인)이다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인 및/또는 TCRα 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다.
특정 구현예에서, 항원 결합 단백질은 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 막-결합된다. 일부 구현예에서, TCR은 가용성 TCR(예컨대, 관통막 또는 세포질 도메인 결여)이다. 일부 구현예에서, 이러한 TCR은 TCRβ 가변 도메인 및 TCRβ 불변 도메인을 포함하는 제1 TCR 폴리펩타이드 및 TCRα 가변 도메인 및 TCRα 불변 도메인을 포함하는 제2 TCR 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, TCRα 가변 도메인 및/또는 TCRβ 가변 도메인은 인간 TCR 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인 및/또는 TCRα 불변 도메인은 비인간 불변 도메인(예컨대, 래트 또는 마우스 불변 도메인)이다. 일부 구현예에서, TCRβ 불변 도메인 및/또는 TCRα 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다.
약학 조성물
특정 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 본원에 기술된 적어도 하나의 약제(예컨대, 항체로서 본원에 기술된 항원 결합 분자, 본원에 기술된 비인간 동물로부터 얻어지는 본원에 기술된 CAR 또는 TCR)를 함유하는 조성물, 예컨대 약학 조성물이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 약학 조성물은 특히 다음의 용도로 개조된 것들을 포함하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 물약(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예컨대 구강, 설하 및 전신 흡수용으로 표적화된 정제들, 큰 알약, 분말, 과립, 혀에 바르기 위한 연고; 또는 (2) 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 서방형 제형과 같은 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여.
비경구 투여에 적합한 본원에 제공된 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액 또는 사용하기 전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합하여 본원에 기술된 하나 이상의 약제를 포함하며, 이는 당, 알코올, 산화 방지제, 완충액, 세균 발육 저지제, 의도된 수용자의 혈액 또는 현탁제 또는 농후화제로 제형을 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있다.
본원에 제공된 약학 조성물에 사용될 수있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 올레산에틸과 같은 주사 가능한 유기 에스터를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 원하는 투여량에 적절한 w/v가 되는 농도로 본원에 기술된 항체, TCR 및/또는 CAR을 포함한다. 항체, TCR 및/또는 CAR은 적어도 1 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 20 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 30 mg/mL, 적어도 35 mg/mL, 적어도 40 mg/mL, 적어도 45 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 55 mg/mL, 적어도 60 mg/mL, 적어도 65 mg/mL, 적어도 70 mg/mL, 적어도 75 mg/mL, 적어도 80 mg/mL, 적어도 85 mg/mL, 적어도 90 mg/mL, 적어도 95 mg/mL, 적어도 100 mg/mL, 적어도 105 mg/mL, 적어도 110 mg/mL, 적어도 115 mg/mL, 적어도 120 mg/mL, 적어도 125 mg/mL, 적어도 130 mg/mL, 적어도 135 mg/mL, 적어도 140 mg/mL, 적어도 150 mg/mL, 적어도 200 mg/mL, 적어도 250 mg/mL 또는 적어도 300 mg/mL의 농도로 조성물에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 전형적으로 서로 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 활성 화합물인, 치료 받는 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 포함한다. 이러한 추가 활성 화합물은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 항체, TCR 및/또는 CAR을 이에 제한되지 않지만 완충제, 당류, 염, 계면 활성제, 가용화제, 폴리올, 희석제, 결합제, 안정화제, 염, 친유성 용매, 아미노산, 킬레이터, 방부제 등을 포함하여 생리학적으로 허용가능한 선택적 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써(문헌 [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed.(1999)]) 원하는 최종 농도에서 동결 건조된 조성물 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 히스티딘, 포스페이트, 시트르산, 글라이신, 아세테이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화 방지제; (옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올; 및 m-크레졸과 같은) 방부제; (약 10 잔기 미만의) 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리바이닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 트레할로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 소듐과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN, 폴리소베이트 80, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.
일부 구현예에서, 완충제는 히스티딘, 시트트산, 포스페이트, 글라이신 또는 아세테이트이다. 당류 부형제는 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 말토스 또는 라피노스일 수 있다. 계면 활성제는 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 40, 폴리소베이트 80 또는 플루로닉 F68일 수 있다. 염은 NaCl, KCl, MgCl2 또는 CaCl2일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 개선된 pH 조절을 제공하기 위해 완충제 또는 pH 조절제를 포함한다. 이러한 조성물은 pH가 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 5.5 내지 약 6.5이다. 추가 구현예에서, 이러한 조성물은 pH가 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0이다. 특정 구현예에서, 조성물은 pH가 약 6.0이다. 당업자는 조성물의 pH가 일반적으로 조성물에 사용되는 특정 항체, TCR 또는 CAR의 등전점과 같아서는 안된다는 것을 이해한다. 전형적으로, 완충제는 유기 또는 무기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 이에 제한되지 않지만, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 주석산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 인산 완충액을 포함한다. 또한, 아미노산 성분은 또한 완충 능력에서 작용할 수 있다. 조성물에 완충제로서 사용될 수 있는 대표적인 아미노산 성분으로는 이에 제한되지 않지만 글라이신 및 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 완충제는 히스티딘, 시트트산, 포스페이트, 글라이신 및 아세테이트에서 선택된다. 특정 구현예에서, 완충제는 히스티딘이다. 또 다른 특정 구현예에서, 완충제는 시트르산이다. 또 다른 특정 구현예에서, 완충제는 글라이신이다. 완충제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 히스티딘 및 글라이신과 관련하여 "순도"라는 용어는 예컨대 문헌 [The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001)]에 기술된 바와 같이 당업계에서 이해되는 히스트딘 또는 글라이신의 화학적 순도를 지칭한다.
특정 구현예에서, 조성물은 완충제로서 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 히스티딘은 적어도 약 1 mM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 20 mM, 적어도 약 30 mM, 적어도 약 40 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 75 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 150 mM, 또는 적어도 약 200 mM의 히스티딘의 농도로 조성물에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 75 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 30 mM의 히스티딘을 포함한다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1mM, 약 5mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 60mM 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 150 mM 또는 약 200 mM의 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 10 mM, 약 25 mM의 히스티딘을 포함하거나 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 탄수화물 부형제는 예컨대, 점도 증진제, 안정화제, 벌크제, 가용화제 및/또는 기타 등등으로서 작용할 수 있다. 탄수화물 부형제는 중량% 또는 부피%로 약 1% 내지 약 99%로 예컨대, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 0.1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 15% 내지 약 20%로 일반적으로 존재한다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 1% 또는 1.5%, 또는 2%, 또는 2.5%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10% 또는 15%, 또는 20%로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 조성물에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는 이에 제한되지 않지만, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토오스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜리지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨) 등과 같은 알디톨을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 조성물에서 사용하기 위한 탄수화물 부형제는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 만니톨 및 라피노스에서 선택된다. 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 트레할로스이다. 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 만니톨이다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 수크로스이다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 라피노스이다. 탄수화물 부형제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이어야 한다.
일부 구현예에서, 조성물은 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 4%, 적어도 약 8%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30% 약 2% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 30%, 또는 약 4% 내지 약 20%의 트레할로스를 함유할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 4%, 약 6%, 약 8%, 약 15%, 약 20%, 약 30% 또는 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 4%, 약 6% 또는 약 15%의 트레할로스를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 당, 염, 계면 활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 방부제 중에서 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 염, 예컨대 NaCl, KCl, CaCl2 및 MgCl2에서 선택된 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 NaCl을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 아미노산, 예컨대 라이신, 아르기닌, 글라이신, 히스티딘 또는 아미노산 염을 포함한다. 조성물은 적어도 약 1 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 25 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 150 mM, 적어도 약 200 mM, 적어도 약 250 mM, 적어도 약 300mM, 적어도 약 350mM, 또는 적어도 약 400mM의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 25 mM 내지 약 250 mM, 약 25 mM 내지 약 300 mM, 약 25 mM 내지 약 350mM, 약 25mM 내지 약 400mM, 약 50mM 내지 약 250mM, 약 50mM 내지 약 300mM, 약 50mM 내지 약 350mM, 약 50mM 내지 약 400mM, 약 100 mM 내지 약 250mM, 약 100mM 내지 약 300mM, 약 100mM 내지 약 400mM, 약 150mM 내지 약 250mM, 약 150mM 내지 약 300mM, 또는 약 150mM 내지 약 400 mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1mM, 1.6mM, 25mM, 약 50mM, 약 100mM, 약 150mM, 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 350mM 또는 약 400mM 의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 계면 활성제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "계면 활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 의미하며; 즉, 이들은 일반적으로 지용성 탄화수소 사슬과 수용성 이온기인 서로 다른 용해성 경향의 군으로 구성된다. 계면 활성제는 계면 활성 모이어티의 전하에 따라 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면 활성제로 분류될 수 있다. 계면 활성제는 종종 다양한 약학적 조성물 및 생물학적 제제를 위한 습윤제, 유화제, 가용화제 및 분산제로서 사용된다. 폴리소베이트(예컨대, 폴리소베이트 20 또는 80)와 같은 약학적으로 허용되는 계면 활성제; 폴리옥사머(예컨대, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-설포베타인(sulfobetaine); 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신(sarcosine); 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필(lauroamidopropyl)-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 파이미도프로필(paImidopropyl)- 또는 아이소스테아르아미도프로필-베타인(예컨대, 라우로아미도프로필); 또는 미리스타미도프로필-, 파이미도프로필- 또는 아이소스테아르아미도프로필-다이메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 다이소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUA® 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, NJ), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예컨대, PLURONICS® PF68, 등)를 응집을 감소시키기 위해 선택적으로 조성물에 첨가할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 40, 폴리소베이트 60 또는 폴리소베이트 80을 포함한다. 계면 활성제는 펌프 또는 플라스틱 용기를 사용하여 조성물을 투여하는 경우에 특히 유용하다. 약학적으로 허용되는 계면 활성제의 존재는 단백질이 응집하는 성향을 완화시킨다. 조성물은 약 0.001% 내지 약 1%, 또는 약 0.001% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.1% 범위의 농도의 폴리소베이트를 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 조성물은 0.001%, 또는 0.002%, 또는 0.003%, 또는 0.004%, 또는 0.005%, 또는 0.006%, 또는 0.007%, 또는 0.008%, 또는 0.009%, 또는 0.01%, 또는 0.015% 또는 0.02%의 농도의 폴리소베이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 다른 부형제 및/또는 이에 제한되지 않지만 희석제, 결합제, 안정화제, 친유성 용매, 방부제, 보조제 등을 포함하는 첨가제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 첨가제가 본원에 제공된 조성물에 사용될 수 있다. 통상적으로 사용되는 부형제/첨가제, 예컨대 약학적으로 허용되는 킬레이트제(예를 들어, 이에 제한되지 않지만 EDTA, DTPA 또는 EGTA)를 응집을 감소시키기 위해 선택적으로 조성물에 첨가할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물을 투여하는 데 펌프 또는 플라스틱 용기가 사용되는 경우에 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 조성물은 방부제를 포함한다. 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 아질산 페닐수은(phenylmercuric nitrate), 페녹시에탄올, 폼알데하이드, 클로로뷰탄올, 염화 마그네슘(예를 들어, 이에 제한되지 않지만 헥사하이드레이트), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 뷰틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살 또는 이들의 혼합물과 같은 방부제는 선택적으로 약 0.001% 내지 약 5% 또는 이 안의 임의의 범위 또는 값과 같은 임의의 적합한 농도로 조성물에 첨가될 수 있다. 조성물에 사용되는 방부제의 농도는 미생물 효과를 발생시키기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 방부제에 따라 좌우되며 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
일부 구현예에서, 조성물은 인간 혈액과 등장성이며, 조성물은 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는다. 이러한 등장성 조성물은 일반적으로 약 250 mOSm 내지 약 350 mOSm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 얼음-동결형 삼투압 측정기(ice-freezing type osmometer)를 사용하여 측정할 수 있다. 조성물의 장성(tonicity)은 장성 개질제(tonicity modifier)를 사용하여 조정된다. "장성 개질제"는 조성물의 등장성을 제공하기 위해 조성물에 첨가될 수 있는 약학적으로 허용되는 비활성 물질이다. 본원에 제공된 조성물에 적합한 장성 개질제는 이에 제한되지 않으나 당류, 염 및 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 발열 물질이 없는 조성물이다. 내독소는 미생물 내부에 국한되는 독소를 포함하며 미생물이 분해되거나 죽을 때에만 방출된다. 발열성 물질은 열을 유발하는, 세균과 다른 미생물의 외막으로부터의 열 안정성 물질도 포함한다. 이들 물질 모두는 인간에게 투여하면 발열, 저혈압 및 쇼크를 일으킬 수 있다. 잠재적인 해로운 영향으로 인해 정맥내 투여되는 약제 용액에서 적은 양의 내독소조차 제거해야 한다. 미국 식품 의약국("FDA")은 정맥내 약물 적용을 위해 단 1 시간 내에 체중 1 킬로그램 당 투여량 당 5개의 내독소 단위(endotoxin unit, EU)의 상한선을 설정했다(문헌 [The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223(2000)]). 치료용 단백질을 체중 1 킬로그램 당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여하는 경우, 목적 단백질(예컨대, 항체)의 경우와 같이, 유해하고 위험한 내독소는 미량조차 제거해야 한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 또는 0.001 EU/mg 미만이다.
생체내 투여에 사용되는 경우, 본원에 기술된 조성물은 멸균 상태여야 한다. 조성물은 멸균 여과, 방사선 등을 포함하는 다양한 멸균 방법에 의해 멸균될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 미리 살균된 0.22 미크론 필터로 여과-멸균된다. 주사용 멸균 조성물은 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)]에 기술된 바와 같이 통상적인 약학적 관례에 따라 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 목적 단백질(예컨대, 항체 또는 TCR 또는 CAR)을 포함하는 조성물은 일반적으로 동결 건조된 형태 또는 용액으로 저장될 것이다. 목적 단백질(예컨대, 항체, TCR 또는 CAR)을 포함하는 멸균 조성물을 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 조성물의 회수를 허용하는 어댑터, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 봉지 또는 바이알 내에 위치시킨다. 특정 구현예에서, 조성물은 미리 충진된 주사기로서 제공된다.
특정 구현예에서, 조성물은 동결 건조 제형이다. 용어 "동결 건조된(lyophilized 또는 freeze-dried)"은 적어도 50%의 수분이 제거된 동결 건조와 같은 건조 과정을 거친 물질의 상태를 포함한다.
선택된 투여 경로와 관계 없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본원에 제공된 제제 및/또는 본원에 제공된 약학 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다.
치료 방법
특정 양태에서, 대상에게 항원 결합 단백질(예컨대, 완전 인간 항체, TCR 또는 CAR과 같은 본원에 기술된 항체, TCR 및/또는 CAR)을 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체, TCR 및/또는 CAR은 본원에 기술된 방법(예컨대, 본원에 기술된 비인간 동물을 사용하여)을 사용하여 수득되거나 수득 가능한 항체, TCR 및/또는 CAR이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 약학 조성물(예컨대, 본원에 기술된 비인간 동물로부터 수득된 본원에 기술된 완전 인간 항체, TCR 또는 CAR과 같은 본원에 기술된 항체를 포함하는 약학 조성물)을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 임의의 암성 또는 전암성(pre-cancerous) 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 이에 제한되지 않지만 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 정소, 혀 또는 자궁을 포함한다. 다양한 조직학적 유형의 암의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 악성 신생물(neoplasm); 암종; 미분화 암종; 거대 세포 암종 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프 상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종(pilomatrix carcinoma); 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 신경내분비 종양(gastrinoma); 담관암; 간세포성 암종; 간세포성 암종 및 담관암을 합한 것; 소주형 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 용종의 선암종; 선암종, 가족성 용종증 결장(familial polyposis coli); 고형 암종; 악성 유암종; 세기관지폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종(acidophil carcinoma); 호산세포성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신 피질 암종; 자궁 내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린(apocrine) 선암종; 피지샘 선암종; 이구선 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 관암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파제트병(paget's disease); 포상 세포(acinar cell) 암종; 선 편평 상피암; 편평 상피 화생을 동반한 선암종(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 악성 흉선종; 악성 난소 간질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립 막 세포 종양; 및 악성 모세포종; 세르톨리(sertoli) 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색 세포종(pheochromocytoma); 사구맥관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종(amelanotic melanoma); 표재 확장성 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구증; 점액 육종(myxosarcoma); 지방 육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종, 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 골막 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종; 골 거대 세포 종양; 유잉 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원 종양; 사기질모세포 치아육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경아교종; 뇌실막세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 원섬유성 성상세포종(fibrillary astrocytoma); 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽 종양(primitive neuroectodermal); 소뇌 육종(cerebellar sarcoma); 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후신경 원성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 부육아종(paragranuloma); 악성 소림프구 림프종; 악성 대세포 미만성 림프종; 악성 여포상 림프종; 균상식육종; 기타 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거대핵모세포성 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종; 및 모발상 세포 백혈병.
특정 구현예에서, 대상에 투여되는 약학 조성물 중의 항체, TCR 또는 CAR은 암 관련 항원의 항원 결정기(예컨대, 치료 받는 암에 의해 발현되는 항원 결정기)에 대한 결합 특이성을 갖는다. 암 관련 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 아디포피린, AIM-2, ALDH1A1, 알파-액티닌-4, 알파-페토프로틴("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL 융합 단백질 b3a2, 베타-카테닌, BING-4, CA-125, CALCA, 암종 배아 항원("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, 사이클린 D1, 사이클린-A1, dek-can 융합 단백질, DKK1, EFTUD2, 신장 인자 2, ENAH(hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, 상피 종양 항원("ETA"), ETV6-AML1 융합 단백질, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, 글리피칸-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, 헵신, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13R알파2, 장 카복실에스터레이즈, K-ras, 칼리크레인 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, CCDC110으로도 공지되어 있는 KMHN1, LAGE-1, 융합 단백질로서의 LDLR-푸코실트랜스퍼레이즈, 렝신, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, 말릭 효소, 마마글로빈-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, 멜로, 미드카인, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, 뮤신, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, 미오신 클래스 I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P 폴리펩타이드, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RAR알파 융합 단백질, 다형성 상피 뮤신("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, 세세르닌 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, 서바이빈, SYT-SSX1 또는 -SSX2 융합 단백질, TAG-1, TAG-2, 텔로머레이스, TGF-베타RII, TPBG, TRAG-3, 삼탄당 인산 이성질체화효소, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, 타이로시네이스, 타이로시네이스("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 신항원이다.
특정 구현예에서, 바이러스 감염, 진균 감염, 세균 감염, 기생충 감염 또는 원충 감염을 포함하는 감염증을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 본원에 기술된 약학 조성물(예컨대, 본원에 기술된 비인간 동물로부터 수득된 본원에 기술된 항체, TCR 또는 CAR을 포함하는 약학 조성물)을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 바이러스성 감염 질환의 비제한적인 예는 HPV, HBV, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)와 같은 레트로 바이러스, 엡스타인 바 바이러스(EPV)와 같은 헤르페스 바이러스, 거대세포바이러스(CMV), HSV-1 및 HSV-2, 및 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 기생충 감염의 비제한적인 예는 말라리아이다. 세균, 진균 및 다른 병원성 질환의 비제한적인 예는 아스퍼질러스, 브루지아, 칸디다, 클라미디아, 콕시디아, 크립토코커스, 디로필라리아, 임균, 히스토플라스마, 리슈만 편모충, 결핵균, 마이코플라스마, 짚신벌레, 백일해, 열원충, 폐렴 구균, 뉴모시스티스, 리케차, 살모넬라, 시겔라, 포도상 구균, 연쇄상 구균, 톡소플라스마 및 콜레라균을 포함한다. 예시적인 종은 나이세리아 임질균, 결핵균, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 질편모충, 헤모필루스 바지날리스, 그룹 B 연쇄상구균속, 마이크로플라즈마 호미니스, 연성하감균, 서혜부 육아종, 임파 육아종, 매독균, 소유산균, 말타열균, 돼지 유산균, 개 유산균, 태아고균, 장 태아고균, 렙토스피라 포모나, 리스테리아 모노사이토제니스, 양 유산균, 클라미디아 시타시, 쇠세모편모충, 톡소포자충, 대장균, 악티노바실러스 에퀼리, 살모넬라 아보르투스 오비스, 살모넬라 아보르투스 에퀴, 녹농균, 코리네박테리움 에퀴, 화농성 코리네박테리움, 악티노바실러스 세미니스, 마이코플라스마 보비게니탈리움, 아스퍼질러스 푸미가투스, 앱시디아 라모사, 트리파노소마 에퀴페르둠, 바베시아 카발리, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 보툴리눔; 또는 예컨대 브라질 파라콕시디오이디즈와 같은 균류; 또는 기타 병원체, 예컨대 열대 열원충을 포함한다.
특정 양태에서, 대상에게 투여되는 약학 조성물 중의 항체, TCR 또는 CAR은 감염성 병원체에 의해 발현되는 항원의 항원 결정기(예컨대, 치료중인 감염성 병원체에 의해 발현되는 항원 결정기)에 대한 결합 특이성을 갖는다.
일부 구현예에서, 염증성 질환, 피부 또는 장기 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환(GVHD) 또는 자가 면역 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 본원에 기술된 약학 조성물(예컨대, 본원에 기술된 비인간 동물로부터 수득된 본원에 기술된 항체, TCR 또는 CAR을 포함하는 약학 조성물)을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 자가 면역 질환의 예는 예를 들어, 사구체 신장염, 관절염, 확장성 심근병증-유사 질환, 궤양성 대장염, 건조 증후군, 크론병, 전신성 홍반, 만성 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 접촉성 피부염, 다발성 근육염, 피부비후증, 결절동맥 주위염, 류마티스열, 보통 백반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트병, 하시모토병, 애디슨병, 피부근염, 중증 근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스병, 악성 빈혈증, 굿파스처 증후군, 불임증, 만성 활동성 간염, 천포창, 자가면역 혈소판 감소 자색반, 및 자가 면역 용혈 빈혈, 활동성 만성 간염, 애디슨 병, 항-인지질 증후군, 아토피성 알러지, 자가 면역 위축성 위염, 자가 면역성 무염소증, 셀리악병, 쿠싱 증후군, 피부 근육염, 원반 모양 낭창, 홍반, 굿파스처 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 부신 위축증, 특발성 혈소판 감소증, 인슐린 의존성 당뇨병, 람베르트-이튼 증후군, 루포이드 간염, 림프구 감소증의 일부 경우, 혼합성 결합 조직 질환, 유사천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 수정체성 포도막염, 결절성 다발 동맥염, 다발성자가 증후군, 원발성 쓸개관 간경화증, 원발성 경화 담관염, 레이노 증후군, 재발성 다발 연골염, 슈미트 증후군, 제한된 공피증(또는 크레스트 증후군), 교감 눈염증, 전신성 홍반 루푸스, 다카야스의 동맥염, 일시적 동맥염, 갑상선 중독증, b형 인슐린내성, 궤양성 대장염 및 베게너 육아종증을 포함한다.
특정 구현예에서, 환자에게 투여된 약학 조성물 중의 항체, TCR 또는 CAR은 치료 받는 질환에서 자가 반응성 T 세포의 표적(예컨대, 자가 면역 질환에서 자가 반응 T 세포에 의해 표적화되는 항원 결정기)에 대한 결합 특이성을 갖는다. 자기 반응성 T 세포에 의해 표적화된 예시적인 단백질에는 예를 들어, p205, 인슐린, 갑상선 자극 호르몬, 타이로시네이스, TRP1 및 미엘린이 포함된다.
본원에 기술된 약학 조성물은 구강내, 예를 들어 스프레이에 의해 비강내, 직장내, 질내, 비경구, 수조내(intracisternally) 및 구강 및 설하를 포함해서 분말, 연고 또는 점적에 의해 국소적으로 투여하는 것을 포함하여 임의의 적합한 투여 경로에 의해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 일반적으로(예컨대, 경구 또는 비경구 투여를 통해) 전달된다.
본원에 기술된 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 달라질 수 있다.
선택된 투여량 수준은 이용되는 특정 작용제의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 또는 대사 속도, 치료 기간, 이용되는 특정 화합물과 조합하여 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료받는 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 인자를 포함하여 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 및/또는 TCR은 T 세포 기반 치료에 사용된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 및/또는 TCR을 발현하는 T 세포를 환자에게 투여하여 대상에서 T 세포 기반 면역 반응을 유도한다. T 세포 기반 치료에 유용한 방법은 예를 들어, 문헌 [Schumacher Nat. Rev. Immunol. 2:512-519(2002) 및 Bitton et al., Frontiers in Bioscience 4:d386-393(1999)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 양태에서, 대상에서 면역 반응(예컨대, T 세포 기반 면역 반응)을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포(예컨대, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포와 같은 인간 T 세포)를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상은 이를 필요로 하는 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 암에 걸린 대상 또는 병원체에 감염된 대상이다. 이러한 구현예에서, CAR 또는 TCR에 의해 인식되는 펩타이드/MHC 복합체 내의 펩타이드는 감염성 병원체에 의해 발현되는 항원에서의 펩타이드 또는 암 항원의 펩타이드이다.
일부 양태에서, 대상에서 면역 반응을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 기술된 CAR 또는 TCR을 발현하는 조절 T 세포(예컨대, CD4+, CD-25+ 및 Foxp3+ 조절 T 세포 또는 Treg17 T 세포)를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상은 이를 필요로 하는 대상, 예컨대 자가 면역 질환이 있는 대상이다. 이러한 구현예에서, T 세포는 조절 T 세포(즉, 억제 T 세포)이고, TCR 또는 CAR에 의해 인식되는 펩타이드/MHC 복합체 내의 펩타이드는 대상이 자가 면역 반응을 겪고 있는 자기 항원이다.
핵산 분자
본원에 기술된 항체, TCR 또는 CAR 및/또는 본원에 기술된 항체, TCR 및 CAR의 일부분을 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원에 기술된 항체, TCR 또는 CAR의 가변 도메인을 인코딩한다. 핵산 분자는 예를 들어, 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 항체, TCR 및/또는 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 핵산은 예를 들어, 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기술된 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 핵산 분자는 표준 PCR 기술을 사용하여 복제되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현되는 CAR, TCR 또는 항체를 인코딩하는 핵산의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체, TCR 또는 CAR의 각 사슬을 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 분자를 함유하는 벡터가 본원에 제공된다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 추가 DNA 조각은 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예컨대, 세균성 복제 기원 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 세균 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로 지칭된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 핵산(예컨대, 본원에 기술된 항체, TCR 또는 CAR 또는 그 일부분을 인코딩하는 핵산)을 함유하는 세포가 제공된다. 세포는 예를 들어, 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 조류, 쥐 및/또는 인간일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 핵산은 프로모터와 같은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 기술된 핵산을 전사함으로써 본원에 기술된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 폴리펩타이드를 발현한다. 핵산 분자는 세포 게놈에 통합되거나 외염색체일 수 있다.
본원에 제공된 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 핵산 분자는 표준 PCR 기술을 사용하여 복제되거나 화학적으로 합성될 수 있다.
본원에 기술된 항체 및 CAR 핵산에 대해, VH 및 VL 조각을 인코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키는 기술을 이용하여 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서 VL-인코딩 또는 VH-인코딩 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 2개의 DNA 단편이 결합되어 2개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 머무르도록 하는 것을 의미한다.
중쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 중쇄 가변 영역 DNA를 중쇄 불변 영역(예컨대, CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있고(예컨대, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 복지부, NIH 간행물 번호 91-3242, 또는 Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, VH-인코딩 DNA는 CH1 중쇄 불변 영역만 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
경쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 가변 영역 인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 당업계에 공지되어 있고(예컨대, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 미국 보건 복지부, NIH 간행물 번호 91-3242, 또는 Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어진다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
추가적인 예시적 구현예
예시적인 구현예 1에서, 게놈에 인간 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(hTdT)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 2에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 구현예 1의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 3에서, 전사 조절 요소는 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 hTdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 2의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 4에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 조절 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 조절 요소 및/또는 면역글로불린 λ 경쇄 전사 조절 요소로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 2의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 5에서, 비인간 동물은 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 hTdT를 발현하는, 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 6에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 hTdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 2의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 7에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 2의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 8에서, 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 hTdT를 발현하는, 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 9에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 1 내지 8중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 10에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시성(constitutive) 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 11에서, hTdT는 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 12에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 13에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 12의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 14에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 12의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 15에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 핵산 서열; 및 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함하는, 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 16에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 15의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 17에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는, 구현예 15 또는 16의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 18에서, 전사 조절 요소는 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 17의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 19에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 조절 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 조절 요소 및/또는 면역글로불린 λ 경쇄 전사 조절 요소로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 17의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 20에서, 비인간 동물은 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 15 내지 19 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 21에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 17의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 22에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소 또는 RAG2 전사 조절 요소인, 구현예 17의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 23에서, 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 15 내지 22 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 24에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열이 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 또는 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 15 내지 23 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 25에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열이 항시성 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 15 내지 24 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 26에서, 외인성 TdT는 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 15 내지 25 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 27에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 15 내지 26 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 28에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 27의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 29에서, 동물의 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 27의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 30에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 15 내지 26 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 31에서, 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 30의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 32에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 Cμ 유전자, Cδ 유전자, Cγ 유전자, Cε 유전자 또는 Cα 유전자인, 구현예 31의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 33에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 31 또는 32의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 34에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 31 또는 32의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 35에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 31 또는 32의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 36에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 31 또는 32의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 37에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 비인간 CH2 및 CH3 도메인을 갖는, 구현예 31 또는 32의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 38에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 내인성 종 기원인, 구현예 37의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 39에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 마우스 CH2 및 CH3 도메인인, 구현예 37의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 40에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 래트 CH2 및 CH3 도메인인, 구현예 37의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 10에서, 동물은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 이들의 조합에서 선택되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 기능성 CH1 도메인을 결여한, 구현예 15-40의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 20에서, 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 31 내지 41 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 43에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 구현예 30 내지 42 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 44에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 κ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 43의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 45에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 λ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 43의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 46에서, 제2 불변 영역 유전자는 경쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 43 내지 45 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 47에서, 제2 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자인, 구현예 46의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 48에서, 제2 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자인, 구현예 46의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 49에서, 제2 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 43 내지 48 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 50에서, 제2 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 43 내지 48 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 51에서, 제2 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 43 내지 48 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 52에서, 제2 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 43 내지 48 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 53에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 가변 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 43 내지 52 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 54에서, 제2 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 κ 유전자좌인, 구현예 53의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 55에서, 제2 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 λ 유전자좌인, 구현예 53의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 56에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열 인간 경쇄 가변 영역(V/J) 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 예시적인 구현예 30 내지 42 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 57에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열 인간 경쇄 가변 영역(V/J) 유전자 조각은 Jκ 유전자 조각으로 재배열되는 Vκ1-39 및 Vκ3-20에서 선택되는 Vκ 유전자 조각을 포함하는, 구현예 56의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 58에서, 동물은 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 게놈에 포함하는, 구현예 57의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 59에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 경쇄 가변 영역(V 및 J) 유전자 조각의 제한된 레퍼토리를 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 구현예 30 내지 42 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 60에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 경쇄 가변 영역(V 및 J) 유전자 조각의 제한된 레퍼토리는 2개의 V 유전자 조각 및 적어도 2개, 바람직하게는 5개의 J 유전자 조각을 포함하는, 구현예 59의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 61에서, 2개의 V 유전자 조각은 Vk1-39 및 Vk3-20 유전자 조각인, 구현예 60의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 62에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 15 내지 29 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 63에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 κ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 62의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 64에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 λ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 63의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 65에서, 불변 영역 유전자는 경쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 62 내지 64 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 66에서, 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자인, 구현예 65의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 67에서, 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자인, 구현예 65의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 68에서, 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 62 내지 64 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 69에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 62 내지 68 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 70에서, 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 62 내지 68 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 71에서, 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 62 내지 68 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 72에서, 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 62 내지 68 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 73에서, 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 62 내지 72 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 74에서, 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 κ 유전자좌인, 구현예 73의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 75에서, 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 λ 유전자좌인, 구현예 73의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 76에서, 면역글로불린 가변 영역은 인간 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 15 내지 75 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 77에서, 면역글로불린 가변 영역은 내인성 종 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 15 내지 75 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 78에서, 면역글로불린 가변 영역은 마우스 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 15 내지 75 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 79에서, 면역글로불린 가변 영역은 래트 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 15 내지 75 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 80에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌를 게놈에 더 포함하는, 구현예 15 내지 79 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 81에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌인, 구현예 80의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 82에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 81에 기재된 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다.
예시적인 구현예 83에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 82의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 84에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 81의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 85에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cμ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 84의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 86에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌인, 구현예 80의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 87에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 86의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 88에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 87의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 89에서, 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 86의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 90에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cκ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 89의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 91에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌인, 구현예 80의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 92에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 λ쇄 유전자좌의 V-J-C 클러스터의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 91의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 93에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 B 세포 발달 중에 재배열되어 비인간동물의 B 세포에서 재배열 가변 영역 유전자를 생성하는, 구현예 15 내지 92 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 94에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 93의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 95에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 93의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 96에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 93의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 97에서, 동물은 재배열 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 가변 도메인 및 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 불변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는, 구현예 93 내지 96 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 98에서, 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 더 포함하는, 구현예 15 내지 97 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 99에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 핵산 서열; 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 100에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 99의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 101에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는, 구현예 99 또는 100의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 102에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 101의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 103에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 101의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 104에서, 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 99 내지 103 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 105에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 99 내지 104 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 106에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시성 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 99 내지 105 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 107에서, 외인성 TdT는 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 99 내지 106 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 108에서, 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 인간 TCRα 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 99 내지 107 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 109에서, 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 인간 TCRβ 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 99 내지 107 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 110에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRα 불변 영역 유전자인, 구현예 99 내지 108 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 111에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRβ 불변 영역 유전자인, 구현예 99 내지 107 및 109 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 112에서, TCR 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 99 내지 111 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 113에서, TCR 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 99 내지 111 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 114에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 99 내지 111 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 115에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 99 내지 111 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 116에서, TCR 가변 영역 및 TCR 불변 영역 유전자는 내인성 TCR 유전자좌에 위치하는, 구현예 99 내지 115 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 117에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRα 유전자좌인, 구현예 99 내지 108, 110, 112-115 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 118에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRβ 유전자좌인, 구현예 99-107, 109, 111-115 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 119에서, TCR 가변 영역은 인간 기원의 TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 99 내지 118 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 120에서, TCR 가변 영역은 내인성 종 기원의 TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 99 내지 118 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 121에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌를 게놈에 더 포함하는, 구현예 99 내지 120 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 122에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌는 TCRα 유전자좌인, 구현예 121의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 123에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌는 TCRβ 유전자좌인, 구현예 121의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 124에서, 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 동물의 T 세포에서 재배열 TCR 가변 영역 유전자를 생성하는, 구현예 99 내지 123 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 125에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 124의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 126에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 124의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 127에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 124의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 128에서, 동물은 재배열 TCR 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 불변 도메인을 포함하는 TCR을 발현하는, 구현예 124 내지 127 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 129에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 핵산 서열; 및 TCR 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 130에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 129의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 131에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는, 구현예 129 또는 130의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 132에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 131의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 133에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 131의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 134에서, 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 131 내지 132 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 135에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 129 내지 134 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 136에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시성 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 129 내지 135 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 137에서, 외인성 TdT는 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 129 내지 136 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 138에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 129 내지 137 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 139에서, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각은 κ 유전자 조각인, 구현예 138의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 140에서, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각은 λ 유전자 조각인, 구현예 138의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 141에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 138 내지 140 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 142에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 141의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 143에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 141의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 144에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 129 내지 137 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 145에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRα 불변 영역 유전자인, 구현예 129 내지 143 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 146에서, 면역글로불린 가변 영역 및 TCRα 불변 영역 유전자는 내인성 TCRα 유전자좌에 위치하는, 구현예 145의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 147에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRβ 불변 영역 유전자인, 구현예 144의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 148에서, 면역글로불린 가변 영역 및 TCRβ 불변 영역 유전자는 내인성 TCRβ 유전자좌에 위치하는, 구현예 147의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 149에서, TCR 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 129 내지 148 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 150에서, TCR 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 129 내지 148 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 151에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 129 내지 148 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 152에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 129 내지 148 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 153에서, 면역글로불린 가변 영역은 인간 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 129 내지 152 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 154에서, 면역글로불린 가변 영역은 내인성 종 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 141 내지 152 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 155에서, 면역글로불린 가변 영역은 마우스 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 141 내지 152 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 156에서, 면역글로불린 가변 영역은 래트 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 141 내지 152 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 157에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌를 게놈에 더 포함하는, 구현예 141 내지 155 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 158에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌인, 구현예 157의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 159에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 158의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 160에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 159의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 161에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 158의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 162에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cμ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 161의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 163에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌인, 구현예 157의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 164에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 163의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 165에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 164의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 166에서, 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 163의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 167에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cκ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 164의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 168에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌인, 구현예 157의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 169에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 λ쇄 유전자좌의 V-J-C 클러스터의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 168의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 170에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 비인간 동물의 T 세포에서 재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자를 생성하는, 구현예 129 내지 169 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
예시적인 구현예 171에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 170의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 172에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 170의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 173에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 170의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 174에서, 동물은 재배열 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 불변 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는, 구현예 170 내지 173 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 175에서, 비인간 동물은 포유류인, 구현예 1 내지 174 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 176에서, 포유류는 설치류인, 구현예 175의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 177에서, 설치류는 래트 또는 마우스인, 구현예 176의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 178에서, 설치류는 마우스인, 구현예 176의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 179에서, 설치류는 래트인, 구현예 176의 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 180에서, 인간 가변 도메인을 포함하는 항체의 발현을 유도하는 방법으로서, 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시켜 유전자 변형 비인간 동물이 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 생산하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 181에서, 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 182에서, 인간 가변 영역을 포함하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; 및 (c) 단계(b)의 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 183에서, 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) 비인간 동물로부터 항원에 대해 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 184에서, 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; (c) 단계(b)의 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계; 및 (d) 하이브리도마로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 185에서, 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 항체를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 유전자 변형 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계; (c) 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에서 인간 면역글로불린 불변 도메인을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결시키는 단계; 및 (d) 숙주 세포가 면역글로불린 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 인간 항체를 발현하도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 186에서, 항원에 특이적인 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 포함하는 항체를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 97의 비인간 동물을 항원에 노출시키는 단계; (b) 비인간 동물로부터 항원에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 수득하는 단계; (c) 단계 (b)의 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계; (d) 하이브리도마로부터 항원에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계; (e) 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에서 인간 면역글로불린 불변 도메인을 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결시키는 단계; 및 (f) 숙주 세포가 면역글로불린 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 인간 항체를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 187에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 128의 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; 및(b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 188에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 하이브리도마를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 128의 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 T 세포로부터 T 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 189에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 T 세포 수용체(TCR) 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 128의 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 (c) TCR의 인간 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 190에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 128의 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; (c) TCR의 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 T 세포로부터 단리하는 단계; 및 (d) 세포가 TCR 가변 도메인 및 TCR 불변 도메인을 포함하는 TCR을 발현하도록 세포에서 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 세포에서 TCR 불변 도메인과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 191에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 면역글로불린 불변 및 인간 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 174의 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; 및 (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 192에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 TCR 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포 하이브리도마를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 174의 유전자 변형 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 (c) 단계(b)의 T 세포로부터 T 세포 하이브리도마를 제조하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 193에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 174의 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물에서 MHC상에 제시되도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; 및 (c) T 세포로부터 CAR의 인간 TCR 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 194에서, MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 항체를 제조하는 방법으로서, (a) 구현예 174의 비인간 동물을, 펩타이드가 비인간 동물의 MHC상에 존재하도록, 펩타이드를 포함하는 항원을 인코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 항원에 노출시키는 단계; (b) (a)의 유전자 변형 비인간 동물로부터 MHC상에 제시된 펩타이드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 수득하는 단계; (c) T 세포로부터 CAR의 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계; 및 (d) 세포가 인간 면역글로불린 가변 도메인 및 인간 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체를 발현하도록 세포에서 인간 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 인간 면역글로불린 불변 도메인과 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 195에서, 비인간 동물은 포유류인, 구현예 180 내지 194 중 어느 하나의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 196에서, 포유류는 설치류인, 구현예 195의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 197에서, 설치류는 래트 또는 마우스인, 구현예 196의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 198에서, 구현예 180, 185, 186 또는 194의 방법에 따라 생성된 항체가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 199에서, 구현예 181, 187 또는 191의 방법에 따라 생성된 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 200에서, 구현예 182, 188 또는 192의 방법에 따라 생성된 하이브리도마가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 201에서, 구현예 183, 184, 189 또는 193의 방법에 따라 생성된 핵산이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 202에서, 인간 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(hTdT)를 인코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 203에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는, 구현예 202의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 204에서, 전사 조절 요소는 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 hTdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 203의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 205에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 조절 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 조절 요소 및/또는 면역글로불린 λ 경쇄 전사 조절 요소로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 203의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 206에서, 비인간 동물은 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 hTdT를 발현하는, 구현예 202 내지 204 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 207에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 hTdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 203의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 208에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 203의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 209에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 hTdT를 발현하는, 구현예 202 내지 207 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 210에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 202 내지 209 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 211에서, hTdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 202 내지 210 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 212에서, hTdT는 비인간 동물 ES 세포 유래 비인간 동물에서 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 202 내지 211 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 213에서, ES 세포 유래 비인간 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 202 내지 212 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 214에서, ES 세포 유래 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 213의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 215에서, ES 세포 유래 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 213의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 216에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 인코딩하는 핵산 서열; 및 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함하는, 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 217에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 216의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 218에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는, 구현예 216 또는 217의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 219에서, 전사 조절 요소는 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 218의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 220에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, 면역글로불린 중쇄 전사 조절 요소, 면역글로불린 κ 경쇄 전사 조절 요소 및/또는 면역글로불린 λ 경쇄 전사 조절 요소로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 218의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 221에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 프로-B 세포 및/또는 프리-B 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 216 내지 220 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 222에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 218의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 223에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소 또는 RAG2 전사 조절 요소인, 구현예 218의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 224에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 216 내지 223 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 225에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌, 면역글로불린 중쇄 유전자좌, RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 216 내지 224 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 226에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 216 내지 225 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 227에서, 외인성 TdT는 ES 세포 유래 비인간 동물에서 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 216 내지 226 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 228에서, ES 세포 유래 비인간 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 216 내지 227 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 229에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 228의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 230에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 228의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 231에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 216 내지 227 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 232에서, 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 231의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 233에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 Cμ 유전자, Cδ 유전자, Cγ 유전자, Cε 유전자 또는 Cα 유전자인, 구현예 232의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 234에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 232 또는 233의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 235에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 232 또는 233의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 236에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 232 또는 233의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 237에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 232 또는 233의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 238에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 비인간 CH2 및 CH3 도메인을 갖는, 구현예 232 또는 233의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 239에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 내인성 종 기원인, 구현예 238의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 240에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 마우스 CH2 및 CH3 도메인인, 구현예 238의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 241에서, 비인간 CH2 및 CH3 도메인은 래트 CH2 및 CH3 도메인인, 구현예 238의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 242에서, 동물은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 이들의 조합에서 선택되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 기능성 CH1 도메인을 결여한, 구현예 216-241의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 243에서, 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 232 내지 242 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 244에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 구현예 231 내지 243 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 245에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 κ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 244의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 246에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 λ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 244의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 247에서, 제2 불변 영역 유전자는 경쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 244 내지 246 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 248에서, 제2 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자인, 구현예 247의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 249에서, 제2 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자인, 구현예 247의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 250에서, 제2 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 244 내지 249 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 251에서, 제2 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 244 내지 249 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 252에서, 제2 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 244 내지 249 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 253에서, 제2 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 244 내지 249 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 254에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자 및 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 가변 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 244 내지 253 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 255에서, 제2 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 κ 유전자좌인, 구현예 254의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 256에서, 제2 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 λ 유전자좌인, 구현예 254의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 257에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열 인간 경쇄 가변 영역(V/J) 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 구현예 231 내지 243 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 258에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열 인간 경쇄 가변 영역(V/J) 유전자 조각은 Jκ 유전자 조각으로 재배열되는 Vκ1-39 및 Vκ3-20에서 선택되는 Vκ 유전자 조각을 포함하는, 구현예 257의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 259에서, 동물은 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 게놈에 포함하는, 구현예 258의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 260에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 경쇄 가변 영역(V 및 J) 유전자 조각의 제한된 레파토리를 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 더 포함하는, 구현예 231 내지 243 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 261에서, 제2 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 경쇄 가변 영역(V 및 J) 유전자 조각의 제한된 레퍼토리는 2개의 V 유전자 조각 및 적어도 2개, 바람직하게는 5개의 J 유전자 조각을 포함하는, 구현예 260의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 262에서, 2개의 V 유전자 조각은 Vk1-39 및 Vk3-20 유전자 조각인, 구현예 261의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 263에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 216 내지 230 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 264에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 κ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 263의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 265에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 λ쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 263의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 266에서, 불변 영역 유전자는 경쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 263 내지 265 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 267에서, 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자인, 구현예 266의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 268에서, 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자인, 구현예 266의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 269에서, 불변 영역 유전자는 중쇄 불변 영역 유전자인, 구현예 263 내지 265 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 270에서, 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 263 내지 269 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 271에서, 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 263 내지 269 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 272에서, 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 263 내지 269 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 273에서, 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 263 내지 269 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 274에서, 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 263 내지 273 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 275에서, 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 κ 유전자좌인, 구현예 274의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 276에서, 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 면역글로불린 λ 유전자좌인, 구현예 274의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 277에서, 면역글로불린 가변 영역은 인간 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 216 내지 276 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 278에서, 면역글로불린 가변 영역은 내인성 종 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 216 내지 276 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 279에서, 면역글로불린 가변 영역은 마우스 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 216 내지 276 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 280에서, 면역글로불린 가변 영역은 래트 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 216 내지 276 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 281에서, 게놈에 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌를 더 포함하는, 예시적인 구현예 216 내지 280 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 282에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌인, 구현예 281의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 283에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 282의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 284에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 283의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 285에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 282의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 286에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실이 불변 영역의 Cμ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 285의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 287에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌인, 구현예 281의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 288에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 287의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 289에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 288의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 290에서, 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 287의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 291에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실이 불변 영역의 Cκ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 290의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 292에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌인, 구현예 281의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 293에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 λ쇄 유전자좌의 V-J-C 클러스터의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 292의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 294에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 B 세포 발달 중에 재배열되어 ES 세포 유래 비인간 동물의 B 세포에서 재배열 가변 영역 유전자를 생성하는, 구현예 216 내지 293 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 295에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 비인간 동물에서 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 294의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 296에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 비인간 동물에서 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 294의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 297에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 비인간 동물에서 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 294의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 298에서, ES 세포 유래 동물은 재배열 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 가변 도메인 및 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 불변 도메인을 포함하는 항체를 발현하는, 구현예 294 내지 297 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 299에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 코딩하는 핵산 서열; 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역을 게놈에 포함하는, 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 300에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 299의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 301에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 구현예 299 또는 300의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 302에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 301의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 303에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 301의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 304에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 299 내지 303 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 305에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 299 내지 304 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 306에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 299 내지 305 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 307에서, 외인성 TdT는 ES 세포 유래 비인간 동물에 의해 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 299 내지 306 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 308에서, 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 인간 TCRα 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 299 내지 307 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 309에서, 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 인간 TCRβ 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 299 내지 307 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 310에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRα 불변 영역 유전자인, 구현예 299 내지 308 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 311에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRβ 불변 영역 유전자인, 구현예 299 내지 307 및 309 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 312에서, TCR 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 299 내지 311 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 313에서, TCR 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 299 내지 311 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 314에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 299 내지 311 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 315에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 299 내지 311 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 316에서, TCR 가변 영역 및 TCR 불변 영역 유전자는 내인성 TCR 유전자좌에 위치하는, 구현예 299 내지 315 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 317에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRα 유전자좌인, 구현예 299 내지 308, 310, 313-315 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 318에서, 내인성 TCR 유전자좌는 내인성 TCRβ 유전자좌인, 구현예 299-307, 309, 311-315 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 319에서, TCR 가변 영역은 인간 기원의 TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 299 내지 318 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 320에서, TCR 가변 영역은 내인성 종 기원의 TCR 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 299 내지 318 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 321에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌를 게놈에 더 포함하는, 예시적인 구현예 299 내지 320 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 322에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌는 TCRα 유전자좌인, 구현예 321의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 323에서, 비활성화 내인성 TCR 유전자좌는 TCRβ 유전자좌인, 구현예 321의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 324에서, 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 ES 세포 유래 비인간 동물의 T 세포에서 재배열 TCR 가변 영역 유전자를 생성하는, 예시적인 구현예 299 내지 323 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 325에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 ES 세포 유래 비인간 동물에 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 324의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 326에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 ES 세포 유래 비인간 동물에 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 324의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 327에서, 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 ES 세포 유래 비인간 동물에 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 324의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 328에서, ES 세포 유래 동물은 재배열 TCR 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 도메인을 포함하는 TCR을 발현하는, 구현예 324 내지 327 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 제공된다.
예시적인 구현예 329에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 코딩하는 핵산 서열; 및 TCR 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함하는, 유전자 변형 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 330에서, 외인성 TdT는 인간 TdT인, 구현예 329의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 331에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 구현예 329 또는 330의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 332에서, 전사 조절 요소는 CD4/CD8 이중 음성(DN) 흉선 세포 및/또는 CD4/CD8 이중 양성(DP) 흉선 세포에서 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동하는, 구현예 331의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 333에서, 전사 조절 요소는 RAG1 전사 조절 요소, RAG2 전사 조절 요소, TCRα 전사 조절 요소, TCRβ 전사 조절 요소, TCRγ 전사 조절 요소 및/또는 TCRδ 전사 조절 요소인, 구현예 331의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 334에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 DN 흉선 세포 및/또는 DP 흉선 세포에서 외인성 TdT를 발현하는, 구현예 331 내지 333 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 335에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 RAG1 유전자좌, RAG2 유전자좌, TCRα쇄 유전자좌, TCRβ쇄 유전자좌, TCRγ쇄 유전자좌 및/또는 TCRδ쇄 유전자좌에 위치하는, 구현예 331 내지 334 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 336에서, 외인성 TdT를 인코딩하는 핵산 서열은 항시적 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않는, 구현예 331 내지 335 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 337에서, 외인성 TdT는 ES 세포 유래 비인간 동물에서 항시적으로 발현되는 것은 아닌, 구현예 331 내지 336 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 338에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 331 내지 337 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 339에서, ES 세포 유래 비인간 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 338의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 340에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 339의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 341에서, 동물에서 V-J 면역글로불린 경쇄 접합부의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 339의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 342에서, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각은 κ 유전자 조각인, 구현예 338 내지 341 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 343에서, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 조각은 λ 유전자 조각인, 구현예 338 내지 341 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 344에서, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 조각인, 구현예 331 내지 337 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 345에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRα 불변 영역 유전자인, 구현예 331 내지 343 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 346에서, 면역글로불린 가변 영역 및 TCRα 불변 영역 유전자는 내인성 TCRα 유전자좌에 위치하는, 구현예 345의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 347에서, TCR 불변 영역 유전자는 TCRβ 불변 영역 유전자인, 구현예 344의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 348에서, 면역글로불린 가변 영역 및 TCRβ 불변 영역 유전자는 내인성 TCRβ 유전자좌에 위치하는, 구현예 347의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 349에서, TCR 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원인, 구현예 331 내지 344 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 350에서, TCR 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자인, 구현예 331 내지 348 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 351에서, TCR 불변 영역 유전자는 래트 불변 영역 유전자인, 구현예 331 내지 348 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 352에서, TCR 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자인, 구현예 331 내지 348 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 353에서, 면역글로불린 가변 영역은 인간 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 331 내지 352 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 354에서, 면역글로불린 가변 영역은 내인성 종 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 340 내지 352 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 355에서, 면역글로불린 가변 영역은 마우스 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 341 내지 352 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 356에서, 면역글로불린 가변 영역은 래트 기원의 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열을 포함하는, 구현예 341 내지 352 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 357에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌를 게놈에 더 포함하는, 구현예 341 내지 356 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 358에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌인, 구현예 357의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 359에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 358의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 360에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 359의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 361에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 358의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 362에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cμ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 361의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 363에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌인, 구현예 357의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 364에서, 내인성 면역글로불린 κ쇄 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 363의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 365에서, 가변 영역의 적어도 일부의 결실은 가변 영역의 J 유전자 조각의 결실을 포함하는, 구현예 364의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 366에서, 내인성 면역글로불린 κ 유전자좌는 내인성 κ쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 365의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 367에서, 불변 영역의 적어도 일부의 결실은 불변 영역의 Cκ 유전자의 결실을 포함하는, 구현예 366의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 368에서, 비활성화 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌인, 구현예 357의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 369에서, 내인성 면역글로불린 λ쇄 유전자좌는 내인성 λ쇄 유전자좌의 V-J-C 클러스터의 적어도 일부의 결실에 의해 비활성화되는, 구현예 368의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 370에서, 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각은 T 세포 발달 중에 재배열되어 ES 세포 유래 비인간 동물의 T 세포에서 재배열 면역글로불린 가변 영역 유전자를 생성하는, 구현예 331 내지 369 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 371에서, ES 세포 유래 비인간 동물에서의 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 10%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 370의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 372에서, ES 세포 유래 비인간 동물의 재배열 가변 영역 유전자의 적어도 20%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 370의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 373에서, ES 세포 유래 비인간 동물의 재조합 가변 영역 유전자의 적어도 40%는 비주형 첨가를 포함하는, 구현예 370의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 374에서, ES 세포 유래 비인간 동물은 재배열 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된 가변 도메인 및 TCR 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는, 구현예 370 내지 372 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 375에서, 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 더 포함하는, 구현예 202 내지 374 중 어느 하나의 유전자 변형 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 376에서, 비인간 동물은 포유류인, 구현예 202 내지 375 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 377에서, 포유류는 설치류인, 구현예 376의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 378에서, 설치류는 래트 또는 마우스인, 구현예 377의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 379에서, 설치류는 마우스인, 구현예 377의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 380에서, 설치류는 래트인, 구현예 377의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포가 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 381에서, 구현예 202 내지 380 중 어느 하나의 유전자 변형 비인간 동물 ES 세포를 사용하는 단계를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 382에서, 인간 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(hTdT)를 인코딩하는 핵산 서열을 생식 세포에 포함하도록 비인간 동물을 조작하는 단계를 포함하는 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법이 제공된다.
예시적인 구현예 383에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 코딩하는 핵산 서열; 및 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 생식 세포에 포함하도록 비인간 동물을 조작하는 단계를 포함하는 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물 제조 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 385에서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 코딩하는 핵산 서열; 및 T 세포 수용체(TCR) 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 TCR 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 TCR 가변 영역을 생식 세포에 포함하도록 비인간 동물을 조작하는 단계를 포함하는 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물 제조 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 386에있어서, 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT)를 코딩하는 핵산 서열; 및 TCR 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 생식 세포에 포함하도록 비인간 동물을 조작하는 단계를 포함하는 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물 제조 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 387에서, 비인간 동물은 포유류인, 구현예 382 내지 385 중 어느 하나의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 388에서, 포유류는 설치류인, 구현예 386의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 389에서, 설치류는 래트 또는 마우스인, 구현예 387의 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예 390에서, 설치류는 마우스인, 구현예 387의 방법이 본원에 제공된다.
실시예
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로서, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 그렇게 해석되어서도 안 된다. 실시예는 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법(분자 복제 기술 등)의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량부, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨로 표시되고 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예 1: 인간 TdT를 발현하는 마우스의 생성
무작위 도입유전자 또는 면역글로불린 카파 유전자좌로 표적화된 인간 TdT 유전자를 포함하는 마우스는 VELOCIGENE® 유전자 조작 기술(예컨대, 미국 특허 번호 제6,586,251호 및 Valenzuela, DM, et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659 참조)을 사용하여 제조되며, 세균 상동성 재조합을 이용한 BAC 라이브러리 유래의 인간 서열을 사용하여 인간 TdT 유전자좌의 게놈 단편을 포함하는 대형 표적화 벡터(large targeting vector, LTVEC)를 제조하고, IgK 유전자좌를 표적으로 하는 TdT의 경우, 마우스 ES 세포에서 IgK 유전자좌로 LTVEC를 표적으로 하는 표적 팔에 의해 측면에 위치한다. LTVEC는 Valenzuela 등에 따르면 마우스 ES 세포주로 선형화되고 일렉트로포레이션된다. ES 세포는 TAQMAN®에 의해 스크리닝되어 (무작위로 통합된 도입유전자의 경우) 유전자 카피 수 또는 IgK 유전자좌로의 올바른 표적화를 결정한다.
대안으로, 짧은 동종형 인간 TdT(TdTS) cDNA는 처음부터(de novo) (Blue Heron Bio) 합성되어 상기에 기술한 대로 ES 세포에 도입하기 위한 표적화에 통합된다.
표적 ES 세포 클론이 VELOCIMOUSE® 방법(Poueymirou, WT 등(2007), F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat. Biotech. 25: 91-99)에 의해 8-세포 단계(또는 그 이전) 마우스 배아에 도입된다. 인간 TdT 유전자좌를 가진 VELOCIMICE®(기증자 ES 세포에서 완전히 유래된 F0 마우스)는 TAQMAN®에 의한 인간 대립 유전자 검사(Valenzuela 등)의 스크리닝에 의해 동정된다. F0 새끼들은 유전자형이 분석되고 동형접합성으로 번식된다. 인간 TdT 유전자좌에 대한 마우스 동형접합체를 제조하고 표현형을 분석한다. 하기 실시예 1에 구체적으로 기술된 바와 같이, 인간 TdTS 및 비재배열 인간 가변 경쇄 및 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 인간 TdTS 무작위 도입유전자를 도입하거나 인간 TdTS를 IgK 유전자좌로 표적화함으로써 생성된다. 그러나, 적어도 무작위로 도입된 인간 TdTS 도입유전자에 대하여, 이러한 동물은 하기 기술된 바와 같이 인간 TdTS를 포함하는 ES 세포를 먼저 생성시키고, 그로부터 마우스를 생성하며, 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스와 무작위로 통합된 인간 TdTS 유전자좌를 포함하는 마우스를 번식시킴으로써, 생성될 수 있다.
실시예 1.1. 마우스 Rag 조절 요소(Rag-TdT tg)의 제어하에 인간 TdT(TdTS)의 짧은 동종형을 발현하는 도입유전자의 생성
요약하면, 도 1에 상세히 도시된 대형 표적화 벡터(LTVEC)는 (엑손 3의 ATG개시 코돈에서 엑손 3의 TGA 종결 코돈까지의)마우스 Rag2 유전자는 (엑손 1의 ATG 개시 코돈부터 엑손 13의 폴리A 신호의 약 0.5kb 3'까지의) 오직 짧은 동종형, TdTS를 인코딩하는 인간 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(TdT 또는 DNTT) 유전자로 치환되는 마우스 및 인간 BAC 클론으로 구성하였다. TdT 엑손 7 및 12의 RNA 스플라이스 부위는 긴 동종형(TdTL1 및 L2)의 발현을 방지하기 위해 돌연변이 되었다. 동일한 LTVEC에서, 엑손 2의 ATG개시 코돈으로부터 엑손 2의 TAA 정지 코돈까지의 마우스 Rag1 유전자는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 LacZ 3'UTR-폴리A 신호의 코딩 서열로 치환하였다. LTVEC는 5.6kb Rag2-Rag1 유전자간 영역뿐 아니라 마우스 Rag2 유전자의 5'의 상류 조절 서열의 130kb와 마우스 Rag1 유전자의 3'의 상류 조절 서열의 8.8kb를 함유한다.
PCR, 제한 효소 절단/라이게이션, Gibson 등온 어셈블리, CRISPR/Cas9, 박테리아 상동성 재조합 등과 같은 표준 분자 생물학 및 재조합 기술을 사용하여 Rag2 및 Rag1 유전자를 함유하는 마우스 BAC 클론 RP23-374f10(Invitrogen/Life Technologies), 및 TdT 유전자를 함유하는 인간 BAC 클론 RP11-1070o2(Invitrogen/Life Technologies)으로 LTVEC를 구성하였다. 최종 LTVEC는5'에서 3'까지 다음을 포함한다: (1) ES 세포 또는 세균에서의 선택을 위한 Loxp-pgkp-em7-neo-loxp 카세트, (2) Rag2 엑손 1의 상류 129,440bp에서 시작하여 Rag2 엑손 3의 시작으로부터 25bp에서 종결하는, 134,069bp의 마우스 게놈 서열(GRCm38 어셈블리에 기초한 마우스 게놈 좌표 2: 101,495,278-101,629,347), (3) 엑손 1의 ATG개시 코돈에서 시작하여 폴리A 신호의 3' 514bp에서 종결하는, 34,573bp의 인간 TdT 게놈 서열(GRCh38 어셈블리에 기초한 인간 게놈 좌표 10: 96,304,498-96,339,063); 인간 TdT 유전자 내에서 엑손 7의 스플 라이스 공여 부위를 결실시키고 NotI 부위로 치환하여 TdTL2 동종형의 발현을 방지하고 엑손 12의 스플라이스 수용 부위를 결실시켜 TdTL1 동종형의 발현을 방지함(하기에 상세히 설명됨), (4) AsiSI 부위; (5) Rag2 엑손 3의 3'UTR(1599bp), 5753bp Rag2/Rag1 유전자간 영역, 및 Rag1 엑손 2의 3' UTR(3390bp)을 함유하는 10,742bp의 마우스 게놈 서열(GRCm38 게놈 좌표 2: 101,630,931-101,641,672) (6) FseI 부위, (7) 249bp의 LacZ의 폴리A 신호 및 793bp EGFP의 CDS를 함유하는 마이너스 가닥상의 1,068bp, (8) Rag1 엑손 2의 ATG개시 코돈에서 시작하여 Rag1의 전사 시작 부위의 3' 8,750bp에서 종결하는, 마이너스 가닥 상의 Rag1을 갖는 13,459bp 의 마우스 게놈 서열(GRCm38 좌표 2: 101,644,793-101,658,251), 및 (9) 세균에서의 선별을위한 Em7-CM 카세트(도 1 참조).
상세하게 보면, 짧은 동종형 TdTS를 인코딩하는 전사물의 스플라이싱을 여전히 허용하면서 (각각 긴 동종형 TdTL2 및 TdTL1을 제조하는 데 사용되는) TdT 엑손 7 및 12를 사용하여 대안적 스플라이싱을 방지하기 위해 TdT 유전자의 두 가지 변형을 생성하는 클로닝 단계는 BHR 및 라이게이션을 사용하여 BAC 클론 RP11-1070o2로부터 제작되었다:
(1) 엑손 7(GTCGGGTCGTG GT(서열 번호 1), 스플라이스 공여체 밑줄로 표시)의 스플라이스 공여 부위를 포함하는 13bp를 결실시키고 NotI 부위(GCGGCCGC(서열 번호 2))로 치환하였다. 이것은 중첩 SacII 부위(CCGCGG(서열 번호 3))를 생성하였고,
(2) 엑손 12의 2bp 스플라이스 수용체 부위는 결실되었다.
최종 LTVEC는 도 1에 도시되어 있고, 다양한 서열 접합부의 대략적인 위치는 도면에 표시되어 있다. 접합부는 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1: Rag-TdT Tg LTVEC의 서열 접합부
최종 LTVEC는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포로 선형화시키고 일렉트로포레이션하였다(예컨대, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제8,642,835호 참조). Neo로 선별한 후 TAQMAN®으로 ES 세포를 스크리닝하여 도입유전자의 카피 수를 결정하였다. 인간 Rag-TdT 도입유전자의 단일 카피, 2개의 카피 또는 다수의 카피를 포함하는 ES 세포를 수득하였다.
Rag-TdT 도입유전자의 통합 부위는 당업계에 공지된 방법을 통해 결정된다. 하나의 구현예에서, 통합 부위는 전체 마우스 게놈의 낮은 커버리지 페어드-엔드(paired-end) 시퀀싱(시퀀싱 라이브러리-넥스 테라(Nextera) DNA 라이브러리 제조, Illumina; Sequence-Miseq, Illumina)을 사용하여 결정된다. 예를 들어, 하나의 예에서, Rag-TdT 도입유전자는 염색체 1(GRCm38/mm10 조립체에서의 좌표)상의 41130492 및 41130502 좌표 사이에 머리부터 꼬리까지의 2개의 직렬 카피로 어떠한 코딩 영역도 분열시키지 않고 통합한 것을 확인하였다.
실시예 1.2. 마우스 Rag 조절 요소 (Rag-TdT IgK)의 제어하에 인간 TdT (TdTS)의 짧은 동종형의 표적화된 면역 글로불린 카파 유전자좌 삽입의 생성
마우스 면역글로불린 카파 유전자좌상의 Rag 조절 요소의 제어하에 인간 TdT를 포함하는 마우스를 생성하기 위해, ES 세포에서 재조합을 위한 마우스 IgK 상동성 팔을 실시예 1.1 및 도 1에 기술된 바와 같이 생성된 작제물의 5' 및 3' 말단에 첨가 하였다. 일반적으로, 마우스 IgK 팔은 (1) I-CeuI 및 PI-SceI 제한 효소 부위가 측면에 위치하는 선택 카세트(예컨대, Hyg, Neo 등)를 삽입하기 위해 세균 상동성 재조합에 의해 마우스 IgK BAC를 변형시키는 단계; (2) I-CeuI 및 PI-SceI 라이게이션에 의해 마우스 IgK BAC에 TdT 작제물을 삽입하는 단계로 첨가된다. 최종 LTVEC는 도 2에 도시된다.
이 최종 LTVEC는 5'에서 3'까지 다음을 포함한다: (1) 세균에서 선택하기 위한 Spec 카세트, (2) IgKc 유전자, IgK 3' 인핸서 및 3' IgK 재조합 서열(RS)을 함유하는 28591bp 5' 마우스 상동성 팔(GRCm38 게놈 좌표 6: 70,725,823-70,754,415); 마우스 팔은 RS의 3'의 약 2.6kb에서 종결, (3) PI-SceI 부위, (4) ES 세포 또는 박테리아에서 선택하기 위한 loxp-UbCp-em7-hyg-loxp 카세트, (5) Rag2 프로모터-인간 TdTS 및 Rag1-EGFP 유전자를 함유하는 상기 실시예 1.1 및 도 1에서 기술된 작제물, (6) I-CeuI 부위, (7) 44,900 bp의 3' 마우스 IgK 상동성 팔(GRCm38 게놈 좌표 6: 70,754,508-70,799,678) 및 (8) 세균에서의 선택을 위한 CM 카세트.
최종 LTVEC는 도 2에 도시되어 있고 다양한 서열 접합부의 대략적인 위치가 도면에 표시되어 있다. 접합부는 하기 표 2에 요약되어 있다.
표 2: Rag-TdT IgK LTVEC의 서열 접합부
생성된 LTVEC는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포로 선형화시키고 일렉트로포레이션하였다(예컨대, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제8,642,835호 참조). Hyg-내성에 대한 선별 후, 정확히 표적화된 클론을 동정하기 위해 TAQMAN® 변형 대립 유전자 분석법(앞서 언급한 바와 같이, Valenzuela 등)에 의해 ES 세포를 스크리닝하였다.
실시예 1.3. 마우스 면역글로불린 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 마우스 IgV H 1-72 프로모터(mIgH-Eμ-V H 1-72-TdT tg 및 mIgH-Eμ-V H 1-72-TdT IgK, 각각) 둘 다의 제어하에, 인간 TdT(TdTS)의 짧은 동종형의 무작위 도입유전자 및 표적화 면역글로불린 카파 유전자좌 삽입의 생성
실시예 1.1 및 1.2에서 Rag-TdT를 제조하는 데 사용되는 동일한 (즉, ATG 개시 코돈 내지 폴리A 신호의 3' 약 514 bp까지의) 인간 TdTS 유전자를 689bp 마우스 Eμ 인핸서 및 303bp 마우스 IgVH1-72 프로모터의 제어하에 두었다. 이 작제물을 마우스 게놈에 무작위로 통합하거나 면역글로불린 K(IgK) 유전자좌에 표적화하였다. 표적 통합을 위해, 실시예 1.2에서 LTVEC를 제조하는 데 사용된 것과 동일한 5' 및 3' 마우스 IgK 상동성 팔 사이에 유전자를 삽입하였다.
구체적으로, 최종 LTVEC는 5'에서 3'까지 다음을 함유한다(도 3): (1) 세균에서 선택하기 위한 Spec 카세트, (2) IgK 불변(IgKC) 유전자, IgK 3' 인핸서 및 3' IgK 재조합 서열(RS)을 함유하는 28591bp 5' 마우스 상동성 팔(GRCm38 게놈 좌표 6: 70,725,823-70,754,415); 마우스 팔은 RS의 3'의 약 2.6kb에서 종결, (3) I-CeuI 부위, (4) ES 세포 또는 세균에서 선택하기 위한 역방향으로 loxp-UbCp-em7-hyg-loxp 카세트, (5) 역방향으로 상기 실시예에서 사용된 동일한 34,573bp 인간 TdTS 유전자, (6) 303bp 마우스 IgHV1-72 프로모터(GRCm38 게놈 좌표 12: 115,758,417-115,758,719), (7) 역방향으로 689bp 마우스 Eμ 인핸서(EcoRI-XbaI 단편, GRCm38 게놈 좌표 12: 113,427,284-113,427,972), (8) PI-SceI 부위, (9) 44,900 bp 3' 마우스 IgK 상동성 팔(GRCm38 게놈 좌표 6: 70,754,508-70,799,678), 및 (10) 세균에서 선택을 위한 CM 카세트.
최종 벡터에서의 특이적 서열 접합부의 대략의 위치가 도 3에 도시되어 있고, 그의 서열이 하기 표 3에 표시되어 있다.
표 3: mIgH-Eμ-V H 1-72-TdT IgK LTVEC의 서열 접합부
생성된 LTVEC는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포로 선형화시키고 일렉트로포레이션하였다(예컨대, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제8,642,835호 참조). Hyg-내성에 대한 선별 후, ES 세포 클론을 마우스 IgK 유전자로의 정확한 표적화(mIgH-Eμ-VH1-72-TdT IgK)를 위해 또는 도입유전자 카피 수(mIgH-Eμ-VH1-72-TdT tg)를 위해 TAQMAN®로 스크리닝하였다.
실시예 1.4. 표적 면역글로불린 카파 유전자좌 삽입 및 TdTS cDNA로부터의 형질 전환 인간 TdTS 생성
대안으로, TdTS cDNA는 처음부터 (Blue Heron Bio) 3682bp DNA 단편으로 합성하고 ES 세포에 도입하기 위해 표적 벡터에 통합된다. 표적 벡터는 5'에서 3'까지, PI-SceI 부위, 689bp 마우스 IgH 인트론 인핸서(EcoRI-XbaI 단편), 303bp 마우스 VH1-72 프로모터, 인트론 매개 발현 증강을 위해 엑손 2와 3 사이에 보유된 735bp 인트론 2와 함께 인간 TdTS의 1530bp CDS(NCBI RefSeq NM_004088), 340bp 인간 TdT 3' UTR/폴리A 신호, loxp-neo-loxp 카세트에서 라이게이션을 위한 NotI 및 SalI 제한 효소 부위 및 I-CeuI 부위를 함유한다. 벡터는 실시예 1.2에서 LTVEC를 제조하는 데 사용된 것과 동일한 5' 및 3' 마우스 IgK 상동성 팔 사이에 삽입되었고, IgK 유전자좌를 표적으로 하거나 마우스 게놈에 무작위로 통합되었다.
생성된 LTVEC는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포로 선형화시키고 일렉트로포레이션하였다(예컨대, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제8,642,835호 참조). Hyg-내성에 대한 선별 후, ES 세포 클론을 마우스 IgK 유전자좌로의 정확한 표적화(IgK 표적 버전)를 위해 또는 도입유전자 카피 수(형질 전환 버전)를 위해 TAQMAN®로 스크리닝하였다.
실시예 1.5. 인간 TdTS 발현 마우스
상기한 바와 같이, 일단 정확하게 표적화된 ES 세포가 생성되면, VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계(또는 그 이전) 마우스 배아에 도입되고, 대립 유전자 검정으로 스크리닝하여 동형접합성으로 번식되었다. 이형접합성 또는 동형접합성 동물은 인간 TdTS뿐만 아니라 인간 가변 경쇄 및 중쇄 도메인 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 발현한다(이들 마우스는 각각 내인성 IgK 및 IgH 유전자좌에 인간 면역글로불린 가변 경쇄 및 중쇄 유전자 조각을 포함한다: VELOCIMMUNE® 마우스).
인간 TdTS 마우스의 여러 버전을 생성하고 테스트하였고, Rag 프로모터 및 Eμ-VH1-72 조절 요소의 제어하에 무작위 형질 전환 및 IgK 표적 TdTS를 둘 다 포함하였다. 또한 TdTS 도입유전자의 하나, 둘 또는 여러 카피를 포함하는 버전뿐만 아니라 게놈 TdT 및 cDNA TdT 서열로부터 생성된 버전을 포함한다. 나머지 실시예들은 Rag-게놈 TdTS(상기 실시예 1.1에 기술된 바와 같이, 1번 염색체의 두 카피의 직렬 삽입) 및 IgK 유전자좌에 표적화된 Eμ-VH1-72-게놈 TdTS(실시예 1.3)의 도입유전자를 포함하는 마우스로 얻은 데이터를 보여준다.
우선, TdT의 발현을 위해 마우스를 테스트한다. VELOCIMMUNE® 대조, VELOCIMMUNE® + Rag-게놈 TdTS 도입유전자, 또는 VELOCIMMUNE® + IgK 유전자좌 마우스에 표적화된 Eμ-VH1-72-게놈 TdTS 중 골수에서 TdT 전사물 증폭에 PT-PCR을 사용하였다. Oligo-dT 프라이머를 사용하여 SUPESCRIPT® III Reverse Transcriptase(Life Technologies)에 의한 역전사에 전체 RNA를 사용하였다. 베타 액틴(대조군), 엑손 1-2를 증폭하도록 설계된 프라이머, 엑손 4-6을 증폭하도록 설계된 프라이머, 엑손 7-9를 증폭하도록 설계된 프라이머 및 엑손 9-11 증폭하도록 설계된 프라이머와 함께 SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix를 사용하여 PCR을 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 인간 TdT 엑손의 존재는 두 버전의 마우스에서 모두 검출된 반면, VELOCIMMUNE® 대조 마우스에는 부재하였다.
실시예 2. 인간 TdTS를 포함하는 마우스의 인간 면역글로불린 카파 접합 다양성
상기 실시예 1에서 기술된 다양한 VELOCIMMUNE® 인간 TdTS 마우스 모델에서 면역 글로불린 레퍼토리 서열 다양성을 평가하기 위해, IgK 서열을 mIgK 불변 프라이머를 갖는 다양한 마우스의 비장으로부터 5' RACE로 증폭시키고 Illumina MiSeq를 사용하여 시퀀싱하였다.
구체적으로 말하면, 비장 B 세포는 항-CD19(마우스) 자성 비드 및 MACS® 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용하여 자성 세포 분류에 의해 전체 비장 세포에서 분명히 풍부해졌다. 제조사의 지침에 따라 RNeasy Plus RNA 단리 키트(Qiagen)를 사용하여 정제된 비장 B 세포에서 전체 RNA를 단리했다. Igκ 불변 영역 서열을 함유하는 cDNA를 생성하기 위해, SMARTer™ RACE cDNA 증폭 키트(Clontech) 및 Igκ 특이적 프라이머(표 4)를 사용하여 역전사를 수행하였다. 이 과정에서, 프라이머 PE2-PIIA의 3'에 역상보적인 DNA 서열이 새로 합성된 cDNA의 3'말단에 부착되었다. 정제된 Igκ 특이적 cDNA를 PE2-PIIA 프라이머 및 표 4에 열거된 Igκ 불변 특이적 프라이머를 사용하여 1차 PCR에 의해 증폭시켰다. Pippin Prep(SAGE Science)을 사용하여 450-700bp 사이의 PCR 산물을 단리하였다. 표 4에 열거된 프라이머("XXXXXX"는 시퀀싱을 위해 샘플을 다중화 가능하게 하는 6bp 인덱스 서열을 나타냄)를 사용하여 2차 PCR에 의해 이들 산물을 추가로 증폭시켰다. Miseq Reagent Kits v3(600 cycles)을 사용하여 시퀀싱하기 위해 Miseq sequencer (Illumina)에 로딩하기 전에 KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)를 사용하여 qPCR에 의해 400bp-700bp 사이의 PCR 산물을 단리, 정제 및 정량하였다.
표 4: Igk 레퍼토리 시퀀싱을 위한 라이브러리 제조에 사용된 프라이머
생물 정보학 분석을 위해, 원 Illumina 서열은 카파 불변 영역 프라이머에 대한 품질, 길이 및 완벽한 일치를 기준으로 하여 역다중화되고 필터링되었다. 겹쳐진 페어드-엔드 리드(paired-end read)는 맞춤형 인하우스 파이프라인(in-house pipeline)을 사용하여 병합되고 분석되었다. 이 파이프 라인은 재배열 경쇄 서열을 인간 생식 세포 V 및 J 유전자 데이터베이스에 정렬시키기 위해 IgBLAST(NCBI, v2.2.25+)의 국부 설치를 사용했다. 재배열은 정지 코돈이 검출되지 않고 VJ 접합부가 J 조각과 프레임 내에 있는 경우 생산적인 것으로 간주되었다. 그렇지 않은 경우 재배열은 비생산적인 것으로 간주되어 분석에서 제외되었다.
IMGT(International Immunogenetics Information System) 경계를 사용하여 CDR3 서열을 추출하였다. 주석이 달린(annotated) V와 J 조각 사이의 접합부 영역은 P 및 N 뉴클레오타이드로 분류되었다. N/P 첨가가 있는 영역을 각각의 서열에서 추출하고 길이를 계산하였다. 항체 레퍼토리의 다양성은 고유의 클론형을 분석하여 계산하였다. 무작위로 선택된 10,000 개의 리드에서 고유의 CDR3 서열의 수로 서열 다양성은 정의되었다.
도 5는 인간 TdTS를 포함하지 않는 VELOCIMMUNE® 마우스와 비교하여, 고유의 CDR3 아미노산 서열의 수에서 최대 2 배의 증가가 인간 TdTS 마우스 모델에서 검출되었음을 보여준다. 증가된 CDR3 다양성 또한 뉴클레오타이드 수준에서 관찰되었다(데이터 미도시). 도 5는 IgK 유전자좌(mIgH- Eμ-VH1-72 TdT IgK)에 표적화된 Rag-게놈 TdTS(Rag TdT Tg) 및 Eμ-VH1-72-게놈 TdTS의 도입유전자(동형접합체 및 이형접합체 두 버전 모두)의 2 카피를 포함하는 마우스로 얻은 데이터만 나타내지만, 유사한 데이터를 다른 버전의 마우스에서 수득하였다(미도시).
실시예 3. 인간 TdTS를 포함하는 마우스에서 비생식 세포 첨가의 증가
(Vκ 및 Jκ 유전자 조각의 부분으로 구성된) CDR3에서의 비생식 세포 뉴클레오타이드 첨가의 백분율 또한 상기 실시예 2에 기술된 차세대 시퀀싱으로 결정하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, B 세포에서 인간화 κ 경쇄의 약 45 %는 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 약 10 %와 비교하여 인간화 TdTS 마우스의 두 가지 버전 모두에서 비생식 세포 첨가를 갖는 것으로 나타났다. 비장으로부터의 면역글로불린 경쇄의 서열 분석은 인간 TdTS 마우스의 경쇄에서 0 내지 8개의 비주형 첨가를 나타냈다(도면에서 8은 8개 이상의 비주형 첨가를 가진 서열을 포함함).
실시예 4. 인간 TdTS 마우스로부터 수득한 면역글로불린에서의 인간 경쇄 CDR3 길이
IMGT(International Immunogenetics Information System) 경계를 사용하여 CDR3 서열을 추출하였다. 비주형 뉴클레오타이드는 공지된 경쇄 V 및 J 서열에 기초하여 결정하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 2 및 3에 기술된 인간 TdTS 마우스의 두 가지 버전에서 관찰된 증가된 비주형 첨가는 대조군(기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스)과 비교하여 카파 경쇄 CDR3 길이를 증가시켰다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 서열 분석은 대조군(기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스)과 비교하여 Rag-TdTS 마우스(이형접합 마우스에 대한 데이터만이 여기 도시됨)에서의 5' J 트리밍 속도에 영향을 주는 광범위한 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않았다.
실시예 5. 인간 TdTS 마우스에서 인간 경쇄 Vκ 및 Jκ 유전자 조각 사용량(Usage)
도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 2 및 3에서 기술된 마우스의 두 가지 버전에서 인간 TdTS의 도입은 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스와 비교하여 Vκ 유전자 조각 또는 Jκ 유전자 조각의 사용량을 유의미하게 변경하지 않았다.
실시예 6. 인간 TdTS를 포함하는 마우스에서의 경쇄 람다 면역글로불린 유전자좌 및 기타 재배열 유전자좌에서의 접합 다양성
인간 면역글로불린 카파 유전자좌 외에도, B 림프구(λ 경쇄, 중쇄) 및 T 림프구(α/β)의 다른 유전자좌에서의 항원-수용체 다양성이 조사될 수 있다.
예를 들어, 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서의 C λ1-함유 람다 경쇄 접합 다양성을, 실시예 2에 기술된 동일한 시퀀싱 방법 및 표 5에 열거된 프라이머를 사용하여, 상기 실시예 1에 기술된 인간 TdT 도입유전자를 또한 포함하는 동일한 VELOCIMMUNE® 마우스와 비교하였고, 증가된 서열 다양성(약 2 배)이 형질 전환 마우스의 마우스 람다 유전자좌에서 관찰되었다(도 9). 또한, 마우스 면역글로불린 람다 비주형 첨가의 증가된 비율을 관찰하였다(도 10). TdT 형질 전환 마우스의 람다 쇄의 CDR3 길이는 도 11에 도시된다. 마지막으로, 마우스 V 람다 사용량의 차이는 테스트된 여러 동물 사이에서 관찰되지 않았다(도 12).
표 5: IgL-C1 레퍼토리 시퀀싱을 위한 라이브러리 제조에 사용된 프라이머
또한, 전술한 바와 같은 기능성 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는, 비재배열 인간 중쇄 및 경쇄 가변 유전자 단편을 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에(예컨대, 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 제8,878,001호, 제9,078,418호, 제9,125,386호), 또는 비재배열 인간 중쇄 가변 유전자 조각 또는 비재배열 인간 경쇄 가변 유전자 조각만을 포함하는 마우스에 인간 TdTS를 함유하는 기타 동물이 생성될 수 있다. 이러한 동물 중 일부는 내인성 마우스 람다 또는 카파 유전자좌상의 인간 람다 가변 영역 (미국 특허 번호 제9,035,128호, 제9,066,502호, 제9,163,092호, 제9,120,662호, 제9,029,628호, 제9,006,511호, 제9,012,717호), 내인성 중쇄 유전자좌의 인간 카파 가변 영역(예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0096572호), 인간화 TCR 알파 및 베타 유전자좌(예컨대, 미국 특허 번호 제9,113,616호) 및 이의 다양한 치환체, 이중 경쇄 마우스 및 이의 치환체(미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0198880호), 보편 경쇄 마우스 및 이의 치환체(예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 제2011/0195454호, 제2013/018582호), 보편 중쇄 마우스 및 이의 치환체(예컨대, 미국 특허 번호 제9,204,624호), 생식 세포 게놈에 히스티딘 치환을 포함하는 마우스(예컨대, 미국 특허 번호 제9,334,334호 및 제9,301,510호, 미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0247236호, 제2014/0013456호), 키메라 항원 수용체 마우스(예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 제2016/0081314호), CH1 도메인을 결여한 마우스(예컨대, 미국 특허 제8,754,287호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2015/0289489호)를 포함하며, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다. 경쇄 및/또는 중쇄(예컨대, 인간 경쇄 및/또는 중쇄)에서 접합 다양성을 증가시키고자 하는 이러한 모든 동물은 본원에 기술된 인간 TdTS의 도입유전자 또는 표적화된 삽입 중 하나를 이러한 변형을 포함하는 ES 세포에 도입함으로써 생성될 수있다. 무작위로 통합된 TdTS 도입유전자를 포함하는 ES 세포로부터 생성된 마우스(및 IgK 유전자좌가 변형되지 않은 경우, 예컨대, 인간화 TCR 유전자좌 마우스)의 경우, 상기 언급된 다양한 변형을 포함하는 마우스로 번식함으로써 생성될 수 있다. 이러한 동물에 TdTS 대립 유전자의 성공적인 통합은 본원에서 상기 기술된 바와 같이 결정되고, 다양한 유전자좌에서 접합 다양성의 생성에 대한 인간 TdTS 발현의 효과는 상기 기술된 바와 같이 결정된다. 내인성 마우스 면역글로불린 및 T 세포 유전자좌와 같은 변형되지 않은 재배열 유전자좌에 대한 효과도 연구된다.
이중 경쇄 마우스의 접합 다양성에 대한 TdT 도입의 효과가 연구된 일 예가 하기 실시예 7-10에 제시되어 있다.
실시예 7. 인간 TdTS를 포함하는 이중 경쇄(DLC) 마우스에서의 인간 면역글로불린 카파 접합 다양성
기능성 마우스 Adam6 유전자(미국 특허 번호 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조) 및 외인성 인간 TdTS를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스와 함께 이중 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스(참조로서 본원에 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0198880호 참조)를 번식시킴으로써 이중 경쇄 유전자좌 및 인간 TdTS를 포함하는 마우스를 생성하였다.
IGVK3-20 및 IGVK1-39 두 개의 비재배열 Vκ 유전자 조각만을 함유하는 제한된 Igκ 유전자좌 및 5개의 비재배열 IGJK 유전자 조각을 갖는 DLC 인간 TdTS 마우스 모델에서 면역글로불린 레퍼토리 서열 다양성을 평가하기 위해(미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0198880호, 본원에 참조로서 포함됨), Igκ 서열을 mIgK 불변 프라이머를 갖는 다양한 마우스의 비장으로부터 5' RACE에 의해 증폭시키고, Illumina MiSeq을 사용하여 시퀀싱하였다. 대부분의 실험에서, Rag TdT Tg에 대한 이형접합체 및 DLC 유전자좌(Rag TdT tg (HET) DLC)에 대한 동형접합체인 몇 마리의 마우스, 및 Rag TdT Tg에 대한 동형접합체 및 DLC 유전자좌(Rag TdT tg (HO) DLC)에 대한 동형접합체인 두 마리의 마우스를 사용하였고, Rag TdT tg (HET) DLC에 대한 데이터는 테스트한 모든 마우스의 평균으로 나타내지만, 두 마리의 Rag TdT tg (HO) DLC 마우스는 개별적으로 나타낸다.
구체적으로 말하면, 비장 B 세포는 항-CD19(마우스) 자성 비드 및 MACS® 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용하여 자성 세포 분류에 의해 전체 비장 세포에서 분명히 풍부해졌다. 제조사의 지침에 따라 RNeasy Plus RNA 단리 키트(Qiagen)를 사용하여 정제된 비장 B 세포에서 전체 RNA를 단리했다. Igκ 불변 영역 서열을 함유하는 cDNA를 생성하기 위해, SMARTer™ RACE cDNA 증폭 키트(Clontech) 및 Igκ 특이적 프라이머(표 4)를 사용하여 역전사를 수행하였다. 이 과정에서, 프라이머 PE2-PIIA의 3'에 역상보적인 DNA 서열이 새로 합성된 cDNA의 3'말단에 부착되었다. 정제된 Igκ 특이적 cDNA를 PE2-PIIA 프라이머 및 표 4에 열거된 Igκ 불변 특이적 프라이머를 사용하여 1차 PCR에 의해 증폭시켰다. Pippin Prep(SAGE Science)을 사용하여 450-700bp 사이의 PCR 산물을 단리하였다. 표 4에 열거된 프라이머("XXXXXX"는 시퀀싱을 위해 샘플을 다중화 가능하게 하는 6bp 인덱스 서열을 나타냄)를 사용하여 2차 PCR에 의해 이들 산물을 추가로 증폭시켰다. Miseq Reagent Kits v3(600 cycles)을 사용하여 시퀀싱하기 위해 Miseq sequencer (Illumina)에 로딩하기 전에 KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)를 사용하여 qPCR에 의해 400bp-700bp 사이의 PCR 산물을 단리, 정제 및 정량하였다.
생물 정보학 분석을 위해, 원 Illumina 서열은 카파 불변 영역 프라이머에 대한 품질, 길이 및 완벽한 일치를 기준으로 하여 역다중화되고 필터링되었다. 겹쳐진 페어드-엔드 리드(paired-end read)는 맞춤형 인하우스 파이프라인(in-house pipeline)을 사용하여 병합되고 분석되었다. 이 파이프 라인은 재배열 경쇄 서열을 인간 생식 세포 V 및 J 유전자 데이터베이스에 정렬시키기 위해 IgBLAST(NCBI, v2.2.25+)의 국부 설치를 사용했다. 재배열은 정지 코돈이 검출되지 않고 VJ 접합부가 J 조각과 프레임 내에 있는 경우 생산적인 것으로 간주되었다. 그렇지 않은 경우 재배열은 비생산적인 것으로 간주되어 분석에서 제외되었다.
IMGT(International Immunogenetics Information System) 경계를 사용하여 CDR3 서열을 추출하였다. 주석이 달린 V와 J 조각 사이의 접합부 영역은 P 및 N 뉴클레오타이드로 분류되었다. N/P 첨가가 있는 영역을 각각의 서열에서 추출하고 길이를 계산하였다. 항체 레퍼토리의 다양성은 고유의 클론형을 분석하여 계산하였다. 무작위로 선택된 10,000 개의 리드에서 고유의 CDR3 서열의 수로 서열 다양성은 정의되었다.
도 13은 도입된 인간 TdTS를 포함하지 않는 DLC 마우스와 비교하여 고유의 CDR3 아미노산 서열의 수에서 2 배 이상의 증가가 DLC 인간 TdTS 마우스 모델에서 검출되었음을 보여준다.
실시예 8. 인간 TdTS를 포함하는 DLC 마우스의 비생식 세포 첨가의 증가
DLC TdT 마우스의 면역글로불린 서열 중 (Vκ 및 Jκ 유전자 조각의 일부로 이루어진) CDR3에서의 비생식 세포 뉴클레오타이드의 백분율을 또한 상기 실시예 7에 기술된 차세대 시퀀싱으로 결정하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, B 세포에서 인간화 카파 경쇄의 약 절반은 DLC 대조 마우스에서 약 10%와 비교하여 DLC 인간화 TdTS 마우스(TdT의 경우 HET 및 HO 모두)에서의 비생식 세포 첨가를 갖는 것으로 나타났다.
실시예 9. 인간 TdTS를 포함하는 DLC 마우스로부터 수득된 면역글로불린에서의 인간 경쇄 CDR3 길이
IMGT(International Immunogenetics Information System) 경계를 사용하여 CDR3 서열을 추출하였다. 비주형 뉴클레오타이드는 공지된 경쇄 V 및 J 서열에 기초하여 결정하였다.
도 15에 도시된 바와 같이, 기술된 DLC 인간화 TdTS 마우스에서 관찰된 증가된 비주형 첨가는 대조군(도입된 인간 TdT가 없는 DLC 마우스)과 비교하여 카파 경쇄 CDR3 길이를 증가시켰다.
실시예 10. 인간 TdTS를 포함하는 DLC 마우스에서의 인간 경쇄 Vκ 및 Jκ 유전자 조각 사용량
도 16에 도시된 바와 같이, DLC 마우스에서의 인간 TdTS의 도입은 DLC 대조군 마우스(도입된 인간 TdT가 없는 DLC 마우스)와 비교하여 Vκ 유전자 조각 또는 Jκ 유전자 조각의 사용량을 유의미하게 변경하지 않았다.
참조로서 포함
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것처럼 그 전체가 참조로서 포함된다. 충돌이 있는 경우, 본원에 정의된 내용을 포함하여 본 출원이 우선한다.
균등물
당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인식할 수 있거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> NON-HUMAN ANIMALS EXPRESSING EXOGENOUS TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE <130> RPB-01325 <140> PCT/US2017/035731 <141> 2017-06-02 <150> 62/345,524 <151> 2016-06-03 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 gtcgggtcgt ggt 13 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 gcggccgc 8 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 ccgcgg 6 <210> 4 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 tattgcgttt ttttaatcct ttcagataaa agacctattc acaatcaaaa atggatccac 60 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Claims (1)

  1. 유전자 변형 비인간 동물에 있어서,
    전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소(Terminal Deoxynucleotidyltransferase, TdT)를 인코딩하는 핵산 서열; 및
    면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 비재배열(unrearranged) 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 조각을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 게놈에 포함하는, 유전자 변형 비인간 동물.
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