ES2612459T3

ES2612459T3 - Ratones que producen proteínas de unión que comprenden dominios VL

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Publication number: ES2612459T3
Application number: ES11741730.3T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Sean Stevens; Cagan Gurer; Karolina A. Hosiawa; Andrew J. Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2031-08-02
Also published as: BR112013002695B1; PL2601298T3; US20260071006A1; RU2750219C2; JP2018046872A; RU2612903C2; CN113150121B; SG187673A1; JP2013535213A; HK1181810A1; KR102306967B1; CA2807282A1; NZ740900A; IL271804B1; US20170223939A1; IL315833A; JP7078400B2; IL224523B; MX363084B; CY1118562T1

Abstract

Un ratón que comprende en su línea germinal un primer segmento génico variable de cadena ligera kappa (VK) humano no reordenado y un segmento génico de unión de cadena ligera kappa (JK) humano no reordenado unidos operativamente a la región constante de cadena pesada (CH) de ratón endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico JK humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos variables de cadena pesada (VH) de ratón endógenos funcionales, todos los segmentos génicos de diversidad (DH) de ratón endógenos funcionales y todos los segmentos génicos de unión de cadena pesada (JH) de ratón endógenos funcionales, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado participan en el reordenamiento para formar una secuencia VK/JK reordenada unida operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón endógena en el ratón, y donde el ratón comprende adicionalmente en su línea germinal un segundo segmento génico variable de cadena ligera (VL) humano y un segmento génico J de cadena ligera (JL) humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera (CL) de ratón.

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones que producen proteínas de unión que comprenden dominios VL.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

En el presente documento se describen proteínas de unión de tipo inmunoglobulina que comprenden una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina, así como proteínas de unión que tienen un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina fusionado con un dominio constante de cadena ligera y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina 10 fusionado con un dominio constante de cadena pesada. También se describen células que expresan tales proteínas de unión, ratones que las producen, y métodos y composiciones relacionados.

ANTECEDENTES

15

Los anticuerpos típicamente comprenden una estructura tetramérica que tiene dos cadenas pesadas idénticas, cada una de ellas comprendiendo una región constante de cadena pesada (CH) fusionada con un dominio variable de cadena pesada (VH) asociado con una región constante de cadena ligera (CL) fusionada con un dominio variable de cadena ligera (VL). Una IgG humana típica, que es una molécula de anticuerpo, tiene aproximadamente de 150 kDa a aproximadamente 170 kDa de tamaño (por ejemplo, para lgG3, que comprende una región de bisagra más 20 grande), dependiendo de la subclase de IgG (por ejemplo lgG1, lgG3, lgG4) y de la longitud (variable) de la región variable.

En un anticuerpo típico, los dominios VH y VL se asocian para formar un sitio de unión que se une a un antígeno diana. Las características del anticuerpo con respecto a la afinidad y especificidad, por lo tanto, pueden depender en 25 gran medida de las características de los dominios VH y VL. En los anticuerpos típicos en seres humanos y en ratones, los dominios VH se acoplan con dominios VL λ o κ. Sin embargo, también se sabe que se pueden producir dominios VL que se unan específicamente a un antígeno diana en ausencia de un dominio VH equivalente (por ejemplo, un dominio VH que se exprese naturalmente en el contexto de un anticuerpo y esté asociado al dominio VL particular), y que se pueden aislar dominios VH que se unan específicamente a un antígeno diana en ausencia de un 30 dominio VL equivalente. Por lo tanto, la útil diversidad en las proteínas de unión a base de inmunoglobulina, generalmente es conferida por una recombinación que conduce a una VH o VL particular (e hipermutación somática, en la medida en que ocurra), así como por la combinación de un par VH/VL equivalente. Será útil desarrollar composiciones y métodos para explotar otras fuentes de diversidad.

35

Existe una necesidad en la técnica de proteínas de unión basadas en estructuras de inmunoglobulina, incluyendo regiones variables de inmunoglobulina tales como las regiones variables de cadena ligera, e incluyendo proteínas de unión que exhiban una mayor diversidad sobre los anticuerpos tradicionales. También existe una necesidad de otros métodos y animales para preparar proteínas de unión útiles, incluyendo proteínas de unión que comprendan las diversas secuencias de región variable de inmunoglobulina de cadena ligera. También existe una necesidad de 40 formatos útiles de proteínas de unión basadas en inmunoglobulina, que proporcionen una mayor diversidad de proteínas de unión a partir de las cuales elegir, y una mayor diversidad de dominios variables de inmunoglobulina, incluyendo composiciones y métodos para generar dominios variables de inmunoglobulina somáticamente mutados y seleccionados por clonación, para su uso, por ejemplo, en la preparación de agentes terapéuticos para seres humanos. 45

La solicitud WO2009/143472 describe una estrategia con el fin de generar un ratón con inserción génica para generar anticuerpos quiméricos de cadena sencilla que tienen un dominio VL somáticamente hipermutado humano, y una región CH de ratón. Tal ratón no se ha obtenido realmente.

50

La solicitud WO2011/158009 describe la inserción de la región VDJ de IgH humana, y/o las regiones VJde cadena ligera, en unión operativa en el genoma con una región constante mu de una especie no humana. Esta solicitud no describe la generación real de ningún animal no humano que tiene un genoma que codifica una cadena de anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera humana en 5’ de una región constante de cadena pesada no humana y a fortiori, la expresión real de una proteína de unión a antígeno que comprende un polipéptido que 55 comprende una secuencia de región variable de cadena ligera humana fusionada con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.

La invención proporciona un ratón que comprende en su línea germinal un primer segmento génico (VK) variable de cadena ligera kappa humano no reordenado y un segmento génico (JK) de unión de cadena ligera kappa humano no reordenado unidos operativamente a la región constante (CH) de cadena pesada de ratón endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento 5 génico Jκ humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos (VH) variables de cadena pesada de ratón endógenos funcionales, todos los segmentos génicos de diversidad (DH) de ratón endógenos funcionales y todos los segmentos génicos (JH) de unión de cadena pesada de ratón endógenos funcionales, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico JK humano no reordenado participan en el reordenamiento para formar una secuencia VK/JK reordenada unida operativamente a la región constante de cadena 10 pesada de ratón endógena en el ratón, y donde el ratón comprende adicionalmente en su línea germinal un segundo segmento génico (VL) variable de cadena ligera humano y un segmento génico (JL) J de cadena ligera humano unidos operativamente a un gen (CL) constante de cadena ligera de ratón.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un ratón de la invención para producir una proteína de unión a 15 antígeno que comprende un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena ligera kappa humano fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y un segundo polipéptido que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera humano fusionado con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón. La proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo.

20

La invención proporciona adicionalmente el uso de un ratón de la invención para producir un hibridoma o un cuadroma para producir un anticuerpo como se ha definido anteriormente.

La invención también proporciona una célula de ratón que comprende en su genoma un primer segmento génico VK humano no reordenado y un segmento génico Jκ humano no reordenado unidos operativamente a la región 25 constante de cadena pesada endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos VH, DH y JH endógenos funcionales, y donde la célula de ratón comprende adicionalmente un segundo segmento VL humano y un segmento génico JL humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera de ratón. 30

La invención proporciona adicionalmente un tejido obtenido a partir de un ratón de la invención, que comprende células como se ha definido anteriormente.

La invención proporciona adicionalmente un embrión de ratón que comprende una célula que comprende en su 35 genoma un primer segmento génico VK humano no reordenado y un segmento génico Jκ humano no reordenado unidos operativamente a la región constante de cadena pesada endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos VH, DH y JH endógenos funcionales, y donde la célula comprende adicionalmente un segundo segmento génico VL humano y un segmento génico JL humano unidos 40 operativamente a un gen constante de cadena ligera de ratón.

La invención proporciona un método para preparar un ratón modificado genéticamente de la invención, que comprende reemplazar en un locus de cadena pesada endógeno del ratón todos los segmentos génicos VH, DH y JH funcionales del ratón con un primer segmento génico VK humano no reordenado y un segmento génico Jκ humano 45 no reordenado, para unir operativamente de esta manera el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado a la región constante de cadena pesada endógena, y también insertando en la línea germinal del ratón un segundo segmento génico VL humano y un segmento génico JL humano unidos operativamente a un gen de región constante de cadena ligera de ratón.

50

La invención también proporciona una proteína de unión a antígeno obtenible a partir de un ratón de la invención, donde la proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana fusionado a un dominio constante de cadena ligera de ratón y un dominio variable de cadena ligera inmunoglobulina kappa humana fusionado a un dominio constante de cadena pesada de ratón.

55

La invención proporciona adicionalmente un método para hacer una proteína de unión a antígeno, donde dicho método comprende obtener una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VK de un gen que codifica un dominio VK fusionado a una región CH de una célula de un ratón de la invención, clonar la secuencia nucleotídica que codifica el dominio VK en marco con un gen que codifica una región CH humana para formar una secuencia de proteína de unión a antígeno humana, y expresar la secuencia de proteína de unión a antígeno humana en una célula adecuada.

La invención también proporciona un método para hacer una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio VK humano, donde dicho método comprende exponer un ratón de la invención a un antígeno de interés, 5 permitir que el ratón desarrolle una respuesta inmune al antígeno de interés, y aislar dicha proteína de unión a antígeno, o aislar el dominio VK humano de dicha proteína de unión a antígeno.

La invención proporciona adicionalmente un método para obtener una secuencia génica VK humana, donde dicho método comprende exponer un ratón de la invención a un antígeno de interés, y aislar de dicho ratón una secuencia 10 génica VK humana reordenada, donde la secuencia génica VK humana reordenada se fusiona con una secuencia nucleotídica que codifica una región CH en dicho ratón.

En un aspecto, se describen proteínas de unión que comprenden dominios variables de inmunoglobulina que se derivan de la cadena ligera (es decir, dominios variables de inmunoglobulina kappa (κ) y/o lambda (λ), pero no de 15 dominios variables de inmunoglobulina de cadena pesada de longitud completa. También se describen métodos y composiciones para preparar proteínas de unión, incluyendo ratones genéticamente modificados.

En un aspecto, se describen construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones y métodos, para preparar proteínas que comprenden uno o más dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina κ y/o λ y 20 una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo proteínas que comprendan un dominio variable de cadena ligera λ o κ y una secuencia de región constante de cadena pesada humana o murina.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un reemplazo de uno o más segmentos génicos variables de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina, segmentos 25 génicos de diversidad de cadena pesada (DH) y segmentos génicos de unión de cadena pesada (JH), en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógeno, con uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera (VL) y uno o más segmentos génicos de región de unión de cadena ligera (JL).

En un aspecto, se describe un ratón que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende 30 un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH con uno o más segmentos génicos VL y uno o más segmentos génicos JL, para formar una secuencia de segmento génico VL en un locus de cadena pesada endógena (locus VLH), donde el locus VLH es capaz de recombinarse con un gen CH murino endógeno, para formar un gen reordenado que se obtiene de un segmento génico VL, un segmento génico JL, y un gen CH de ratón endógeno. 35

En un aspecto, los segmentos génicos VL son segmentos génicos VL humanos. En un aspecto, los segmentos JL son segmentos génicos JL humanos. En un aspecto específico, los segmentos génicos VL y JL son segmentos génicos VL humanos y segmentos JL humanos.

40

En un aspecto, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH se reemplazan con al menos seis segmentos génicos Vκ humanos y al menos un segmento génico Jκ. En un aspecto, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH se reemplazan con al menos 16 segmentos génicos Vκ humanos (Vκ humanos) y al menos un segmento génico Jκ. En un aspecto, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH se reemplazan con al menos 30 segmentos génicos Vκ humanos y al 45 menos un segmento génico Jκ. En un aspecto, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH se reemplazan con al menos 40 segmentos génicos Vκ humanos y al menos un segmento génico Jκ. En un aspecto, el al menos un segmento génico Jκ comprende dos, tres, cuatro o cinco segmentos génicos Jκ humanos.

En un aspecto, los segmentos génicos Vκ humanos comprenden 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 y 1-6. En una realización, el 50 segmento κ VL comprende 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16. En un aspecto, los segmentos génicos Vκ humanos comprenden 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 y 2-30. En un aspecto, los segmentos génicos Vκ humanos comprenden 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 y 2-40.

55

En un aspecto, los segmentos génicos Vκ humanos comprenden 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 y 1-16. En un aspecto, los segmentos génicos Vκ además comprenden 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 y 2-30. En una realización, los segmentos génicos Vκ comprenden además 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 y 2-40.

En un aspecto, los segmentos génicos VL son segmentos génicos Vλ humanos y comprenden un fragmento de un grupo A del locus de cadena ligera λ humana. En un aspecto específico, el fragmento del grupo A del locus de cadena ligera λ humana se extiende desde el hVλ3-27 hasta el hVλ3-1. 5

En un aspecto, los segmentos génicos VL comprenden un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera λ humana. En un aspecto específico, el fragmento del grupo B del locus de cadena ligera λ humana se extiende desde el hVλ5-52 hasta hVλ1-40.

10

En un aspecto, los segmentos génicos VL comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera λ humana que comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena ligera λ humana comprende al menos un segmento génico del grupo A y al menos un segmento génico del grupo B.

15

En un aspecto, los segmentos génicos VL comprenden al menos un segmento génico del grupo B y al menos un segmento génico del grupo C.

En un aspecto, los segmentos génicos VL comprenden hVλ, 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 y 3-12. En un aspecto específico, los segmentos génicos VL comprenden una secuencia contigua del locus de cadena ligera λ humana que 20 se extiende desde Vλ3-12 hasta Vλ3-1. En un aspecto, la secuencia contigua comprende al menos los segmentos génicos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 hVλ. En un aspecto específico, las hVλs incluyen 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 y 3-12. En un aspecto específico, las hVλ comprenden una secuencia contigua del locus λ humano que se extiende desde Vλ3-12 hasta Vλ3-1.

25

En un aspecto, las hVλ comprenden 13 a 28 o más hVλ. En un aspecto específico, las hVλ incluyen 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 y 3-27. En un aspecto específico, las hVλ comprenden una secuencia contigua del locus λ humano, que se extiende desde Vλ3-27 hasta Vλ3-1.

En un aspecto, los segmentos génicos VL comprenden 29 a 40 hVλ. En un aspecto específico, los segmentos 30 génicos VL comprenden una secuencia contigua del locus λ humano que se extiende desde Vλ3-29 hasta Vλ3-1, y una secuencia contigua del locus λ humano que se extiende desde Vλ5-52 hasta Vλ1-40. En un aspecto específico, la totalidad o sustancialmente la totalidad de las secuencias entre hVλ1-40 y hVλ3-29 en el ratón genéticamente modificado, consiste básicamente en una secuencia λ humana de aproximadamente 959 pb encontrada en la naturaleza (por ejemplo, en la población humana), en 3’ del segmento génico hVλ1-40 (en 3’ de la porción 3' no 35 traducida), que es un sitio de enzima de restricción (por ejemplo Pl-Scel), seguido de una secuencia λ humana de aproximadamente 3.431 pb en 5’ del segmento génico hVλ3-29 encontrado en la naturaleza.

En un aspecto, el segmento génico Jκ humano se selecciona del grupo que consiste de Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, y una combinación de los mismos. En una realización específica, los segmentos génicos Jκ comprenden Jκ1 a Jκ5. 40

En un aspecto, los segmentos génicos VL son segmentos génicos Vλ humanos, y el segmento génico Jκ comprende una RSS que tiene un separador 12-mer, donde la RSS está yuxtapuesta en el extremo 5’ del segmento génico Jκ. En un aspecto, los segmentos génicos VL son segmentos génicos Vλ humanos y el locus VLH comprende dos o más segmentos génicos Jκ, comprendiendo cada uno una RSS que tiene un separador 12-mer, donde la RSS está 45 yuxtapuesta en el extremo 5’ de cada segmento génico Jκ.

En una realización específica, los segmentos génicos Vκ comprenden segmentos génicos κ humanos contiguos que abarcan el locus κ humano desde Vκ4-1 hasta Vκ2-40, y los segmentos génicos Jκ comprenden segmentos génicos contiguos que abarcan el locus κ humano desde los segmentos génicos Jκ1 hasta Jκ5. 50

En un aspecto, cuando los segmentos génicos VL son segmentos génicos Vλ, y no hay presente ningún segmento génico DH entre los segmentos génicos VL y segmentos génicos J, los segmentos génicos VL están flanqueados en 3’ (es decir, yuxtapuestos en el lado 3’) con RSS 23-mer, y los segmentos génicos Jκ, si los hay, o los segmentos génicos Jλ, si los hay, están flanqueados en 5’ (es decir, yuxtapuestos en el lado 5’) con RSS 12-mer. 55

En un aspecto, cuando hay segmentos génicos Vκ humanos y no hay presente ningún segmento génico DH entre los segmentos génicos VH y los segmentos génicos JH, cada segmento génico Vκ está yuxtapuesto en el lado 3’ con una RSS 12-mer, y los segmentos génicos Jκ, si los hay, o los segmentos génicos Jλ, si los hay, cada uno está yuxtapuesto en el lado 5’ con una RSS 23-mer.

5

En un aspecto, el ratón comprende un gen reordenado que se obtiene de un segmento génico VL, un segmento génico JL y un gen CH murino endógeno. En un aspecto, el gen reordenado está somáticamente mutado. En un aspecto, el gen reordenado comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más N adiciones. En un aspecto, las N adiciones y/o las mutaciones somáticas observadas en el gen reordenado derivado del segmento génico VL y el segmento génico JL superan en un factor de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, o al menos 5, el número de N adiciones y/o mutaciones 10 somáticas que se observan en un dominio variable de cadena ligera reordenado (derivado del mismo segmento génico VL y el mismo segmento génico JL), que se redispone en un locus de cadena ligera endógeno. En un aspecto, el gen reordenado está en una célula B que se une específicamente a un antígeno de interés, donde la célula B se une al antígeno de interés con una KD en el rango nanomolar bajo o menor (es decir, una KD de 10 nanomolar o menor). En un aspecto, el gen CH de ratón se selecciona de IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. En un aspecto 15 específico, la IgG de ratón se selecciona de lgG1, lgG2A, lgG2B, lgG2C e lgG3. En otro aspecto específico, la IgG de ratón es lgG1.

En un aspecto, el ratón comprende una célula B, donde la célula B produce a partir de un locus en un cromosoma de la célula B una proteína de unión que consiste esencialmente en cuatro cadenas polipeptídicas, donde las cuatro 20 cadenas polipeptídicas consisten esencialmente en (a) dos polipéptidos idénticos que comprenden una región CH de ratón endógena fusionada con un dominio VL, y (b) dos polipéptidos idénticos que comprenden una región CL de ratón endógena fusionada con un dominio VL que es equivalente con respecto al dominio VL que está fusionado con la región CH de ratón, y, en un aspecto, es un dominio VL humano (por ejemplo, κ humana). En un aspecto, el dominio VL fusionado con la región CH de ratón endógena, es un dominio VL humano. En un aspecto específico, el 25 dominio VL humano fusionado con la región CH de ratón es un dominio Vκ. En un aspecto específico, el dominio VL humano fusionado con la región CH de ratón es idéntico a un dominio V codificado por una secuencia nucleotídica de cadena ligera de línea germinal humana reordenada. En un aspecto específico, el dominio VL humano fusionado con la región CH de ratón comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o más hipermutaciones somáticas. En un aspecto, el dominio VL humano fusionado con la región CH de ratón está codificado por un gen reordenado que comprende 1, 2, 30 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 o más N adiciones.

En un aspecto, al menos el 50% de todas las moléculas de IgG producidas por el ratón comprenden un polipéptido que comprende una región CH de isotipo IgG y un dominio VL, donde la longitud de dicho polipéptido no es mayor de 535, 530, 525, 520 ó 515 aminoácidos. En un aspecto, al menos el 75% de todas las moléculas de IgG comprenden 35 el polipéptido mencionado en este párrafo. En un aspecto, al menos el 80%, 85%, 90% ó 95% de todas las moléculas IgG comprenden el polipéptido mencionado en este párrafo. En un aspecto específico, todas las moléculas IgG producidas por el ratón comprenden un polipéptido que no es más largo que la longitud del polipéptido mencionado en este párrafo.

40

En un aspecto, el ratón produce una proteína de unión que comprende un primer polipéptido que comprende una región CH de ratón endógena fusionada con un dominio variable codificado por un segmento génico V humano reordenado y un segmento génico J, pero no un segmento génico DH, y un segundo polipéptido que comprende una región CL de ratón endógena fusionada con un dominio V codificado por un segmento génico V humano reordenado y un segmento génico J, pero no un segmento génico DH, y la proteína de unión se une específicamente a un 45 antígeno con una afinidad en el rango micromolar, nanomolar o picomolar. En un aspecto, el segmento génico J es un segmento génico J humano (por ejemplo, un segmento génico κ humano). En un aspecto, el segmento génico V humano es un segmento génico Vκ humano. En un aspecto, el dominio variable que está fusionado con la región CH de ratón endógena comprende un mayor número de hipermutaciones somáticas que el dominio variable que está fusionado con la región CL de ratón endógena; en un aspecto específico, el dominio variable fusionado con la región 50 CH de ratón endógena comprende aproximadamente 1,5, 2, 3, 4 ó 5 veces o más hipermutaciones somáticas que el dominio V fusionado con la región CL de ratón endógena; en un aspecto específico, el dominio V fusionado con la región CH de ratón comprende al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, o más, hipermutaciones somáticas, que el dominio V fusionado con la región CL de ratón. En un aspecto, el dominio V fusionado con la región CH de ratón está codificado por un gen reordenado que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones. 55

En un aspecto, el ratón expresa una proteína de unión que comprende un primer dominio variable de cadena ligera (VL1) fusionado con una secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, y un segundo dominio variable de cadena ligera (VL2) fusionado con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, donde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde Vdonde V

En un aspecto, se describe un ratón genéticamente modificado que expresa una inmunoglobulina que consiste esencialmente en los siguientes polipéptidos: un primer par de polipéptidos idénticos, donde cada uno consiste esencialmente en una región CH fusionada con un dominio variable que se obtiene de segmentos génicos que 10 consisten esencialmente en un segmento génico VL y un segmento génico JL, y un segundo para de polipéptidos idénticos donde cada uno consiste esencialmente en una región CL fusionada con un dominio variable que se obtiene de segmentos génicos que consisten esencialmente en un segmento génico VL y un segmento génico JL.

En un aspecto específico, los dos polipéptidos idénticos que tienen la región CH, tienen una región CH de ratón. 15

En un aspecto específico, los dos polipéptidos idénticos que tienen la región CL tienen una región CL de ratón.

En un aspecto, el dominio variable fusionado con la región CL es un dominio variable que es equivalente al dominio variable fusionado con la región CH. 20

En un aspecto, el dominio variable que está fusionado con la región CH de ratón endógena comprende un mayor número de hipermutaciones somáticas que el dominio variable que está fusionado con la región CL de ratón endógena; en un aspecto específico, el dominio variable fusionado con la región CH de ratón endógena comprende aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 o 5 veces o más hipermutaciones somáticas, que el dominio variable 25 fusionado con la región CL de ratón endógena. En un aspecto, el dominio variable fusionado con la región CL de ratón endógena está codificado por un gen que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más N adiciones.

En un aspecto, uno o más de los segmentos génicos V y los segmentos génicos J son segmentos génicos humanos. En un aspecto específico, tanto los segmentos génicos V como los segmentos génicos J son segmentos génicos κ 30 humanos. En otro aspecto específico, tanto los segmentos génicos V como los segmentos génicos J son segmentos génicos λ humanos. En un aspecto, los segmentos génicos V y los segmentos génicos J se seleccionan independientemente de segmentos génicos κ humanos y λ humanos. En un aspecto específico, los segmentos génicos V son segmentos génicos Vκ y los segmentos génicos J son segmentos génicos Jλ. En otro aspecto específico, los segmentos génicos V son segmentos génicos Vλ, y los segmentos génicos J son segmentos génicos 35 Jκ.

En un aspecto, uno o más de los dominios variables fusionados con la región CL y los dominios variables fusionados con la región CH, son dominios variables humanos. En un aspecto específico, los dominios variables humanos son dominios Vκ humanos. En otro aspecto específico, los dominios variables humanos son dominios Vλ. En un aspecto, 40 los dominios humanos se seleccionan independientemente de dominios Vκ humanos y dominios Vλ humanos. En un aspecto específico, el dominio variable humano fusionado con la región CL es un dominio Vλ humano, y el dominio variable humano fusionado con la región CH es un dominio Vκ humano. En otro aspecto, el dominio variable humano fusionado con la región CL es un dominio Vκ humano y el dominio variable humano fusionado con CH es un dominio Vλ humano. 45

En un aspecto, el dominio VL del primer par de polipéptidos idénticos se selecciona de un dominio Vλ humano y un dominio Vκ humano. En un aspecto, el dominio VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona de un dominio Vλ humano y un dominio Vκ humano. En un aspecto específico, el dominio VL del primer par de polipéptidos idénticos es un dominio Vκ humano y el dominio VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona de un 50 dominio Vκ humano y un dominio Vλ humano. En un aspecto específico, el dominio VL del primer par de polipéptidos idénticos es un dominio Vλ humano y el dominio VL del segundo par de polipéptidos idénticos se selecciona de un dominio Vλ humano y un dominio Vκ humano. En un aspecto específico, el dominio VL humano del primer par de polipéptidos idénticos es un dominio Vκ humano, y el dominio VL humano del segundo par de polipéptidos idénticos es un dominio Vκ humano. 55

En un aspecto, la IgG del ratón comprende una proteína de unión producida en respuesta a un antígeno, donde la proteína de unión comprende un polipéptido que consiste esencialmente en un dominio variable y una región CH, donde el dominio variable está codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente en un segmento génico Vdonde el dominio variable está codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente en un segmento génico Vdonde el dominio variable está codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente en un segmento génico Vdonde el dominio variable está codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente en un segmento génico Vdonde el dominio variable está codificado por una secuencia nucleotídica que consiste esencialmente en un segmento génico V

En un aspecto, se describe un ratón, donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de la IgG producida por el 5 ratón en respuesta a un antígeno, comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable, donde el dominio variable está codificado por un gen reordenado derivado de los segmentos génicos que consisten esencialmente en un segmento génico V y un segmento génico J. En un aspecto, el gen reordenado comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones.

10

En un aspecto, el segmento génico V es un segmento génico V de una cadena ligera. En un aspecto, la cadena ligera se selecciona de una cadena ligera κ y una cadena ligera λ. En un aspecto específico, la cadena ligera es una cadena ligera κ. En un aspecto específico, el segmento génico V es un segmento génico V humano. En un aspecto específico, el segmento génico V es un segmento génico Vκ humano y el segmento génico J es un segmento génico Jκ humano. 15

En un aspecto, el segmento génico J es un segmento génico J de una cadena ligera. En un aspecto, la cadena ligera se selecciona de una cadena ligera κ y una cadena ligera λ. En un aspecto específico, la cadena ligera es una cadena ligera κ. En un aspecto específico, el segmento génico J es un segmento génico J humano. En otro aspecto, el segmento génico J es un segmento génico J de una cadena pesada (es decir, JH). En un aspecto específico, la 20 cadena pesada es de origen murino. En otro aspecto específico, la cadena pesada es de origen humano.

En un aspecto, el dominio variable de la cadena pesada se produce a partir de no más de un segmento génico V y un segmento génico J es un dominio variable somáticamente mutado.

25

En un aspecto, el dominio variable de la cadena pesada que se produce a partir de no más de un segmento génico V y un segmento génico J está fusionado a una región CH de ratón.

En un aspecto específico, la totalidad o sustancialmente la totalidad de la IgG producida por el ratón en respuesta a un antígeno comprende un dominio variable que se obtiene de no más de un segmento génico V humano y no más 30 de un segmento génico J humano, y el dominio variable está fusionado con una región constante de IgG murina, y la IgG además comprende una cadena ligera que comprende un dominio VL humano fusionado con una región CL de ratón. En un aspecto específico, el dominio VL fusionado con la región CL de ratón, se deriva de un segmento génico Vκ humano y un segmento génico Jκ humano. En un aspecto específico, el dominio VL fusionado con la región CL de ratón, se deriva de un segmento génico Vλ humano y un segmento génico Jλ humano. 35

En un aspecto, se describe un ratón que produce una IgG que comprende una primera CDR3 en un polipéptido que comprende una región CH, y una segunda CDR3 en un polipéptido que comprende una región CL, donde tanto la primera CDR3 como la segunda CDR3, se derivan cada una independientemente de no más de dos segmentos génicos, donde los dos segmentos génicos consisten esencialmente en un segmento génico VL y un segmento 40 génico JL. En un aspecto, la CDR3 en el polipéptido que comprende la región CH comprende una secuencia que se obtiene de una secuencia nucleotídica de CDR3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones.

En un aspecto, el segmento génico VL y el segmento génico JL son segmentos génicos humanos. En un aspecto, el segmento génico VL y el segmento génico JL son segmentos génicos κ. En un aspecto, el segmento génico VL y el 45 segmento génico JL son segmentos génicos λ.

En un aspecto, se describe un ratón que produce una IgG que comprende una primera CDR3 en un primer polipéptido que comprende una región CH, y una segunda CDR3 en un segundo polipéptido que comprende una región CL, donde tanto la primera CDR3 como la segunda CDR3 comprenden cada una una secuencia de 50 aminoácidos donde más del 75% de los aminoácidos se derivan de un segmento génico V. En un aspecto, la CDR3 en el polipéptido que comprende la región CH comprende una secuencia que se obtiene de una secuencia nucleotídica de CDR3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones.

En un aspecto, más del 80%, más del 90%, o más del 95% de los aminoácidos de las primera CDR3; y más del 55 80%, más del 90%, o más del 95% de los aminoácidos de la segunda CDR3, se derivan de un segmento génico V de cadena ligera.

En un aspecto, no más de dos aminoácidos de la primera CDR3 se derivan de un segmento génico diferente del segmento génico V de cadena ligera. En un aspecto, no más de dos aminoácidos de la segunda CDR3 se derivan de un segmento génico diferente a un segmento génico V de cadena ligera. En un aspecto específico, no más de dos aminoácidos de la primera CDR3 y no más de dos aminoácidos de la segunda CDR3, se derivan de un segmento génico diferente a un segmento génico V de cadena ligera. En un aspecto, ninguna de las CDR3 de la IgG 5 comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un segmento génico D. En un aspecto, la CDR3 del primer polipéptido no comprende una secuencia derivada de un segmento génico D.

En un aspecto, el segmento génico V es un segmento génico V humano. En un aspecto específico, el segmento génico V es un segmento génico Vκ humano. 10

En un aspecto, la primera y/o la segunda CDR3 tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis hipermutaciones somáticas. En un aspecto, la primera CDR3 está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones.

15

En un aspecto, la primera CDR3 consiste esencialmente en aminoácidos derivados de un segmento génico V de cadena ligera humana y un segmento génico J de cadena ligera humana, y la segunda CDR3 consiste esencialmente en aminoácidos derivados de un segmento génico V de cadena ligera humana y un segmento génico J de cadena ligera humana. En un aspecto, la primera CDR3 se deriva de una secuencia de ácido nucleico que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más N adiciones. En un aspecto, la primera CDR3 se deriva de no más de 20 dos segmentos génicos, donde los no más de dos segmentos génicos son un segmento génico Vκ humano y un segmento génico Jκ humano; y la segunda CDR3 se deriva de no más de dos segmentos génicos, donde los no más de dos segmentos génicos son un segmento génico Vκ humano y un segmento génico J que se selecciona de un segmento génico Jκ humano, un segmento génico Jλ humano, y un segmento génico JH humano. En un aspecto, la primera CDR3 se deriva de no más de dos segmentos génicos, donde los no más de dos segmentos génicos son un 25 segmento génico Vλ humano y un segmento génico J que se selecciona de un segmento génico Jκ humano, un segmento génico Jλ humano, y un segmento génico JH humano.

En un aspecto, se describe un ratón que produce una IgG que no contiene una secuencia de aminoácidos derivada de un segmento génico DH, donde la IgG comprende un primer polipéptido que tiene un primer dominio VL fusionado 30 con una región CL de ratón, y un segundo polipéptido que tiene un segundo dominio VL fusionado con una región CH de ratón, donde el primer dominio VL y el segundo dominio VL no son idénticos. En un aspecto, el primer y segundo dominios VL se derivan de diferentes segmentos génicos V. En otro aspecto, el primer y segundo dominios VL se derivan de diferentes segmentos génicos J. En un aspecto, el primer y segundo dominios VL se derivan de segmentos génicos V y J idénticos, donde el segundo dominio VL comprende un número más alto de 35 hipermutaciones somáticas, en comparación con el primer dominio VL.

En un aspecto, el primer y segundo dominios VL se seleccionan independientemente de dominios VL humanos y murinos. En un aspecto, el primer y segundo dominios VL se seleccionan independientemente de dominios Vκ y Vλ. En un aspecto específico, el primer dominio VL se selecciona de un dominio Vκ y un dominio Vλ, y el segundo 40 dominio VL es un dominio Vκ. En otro aspecto específico, el dominio Vκ es un dominio Vκ humano.

En un aspecto, se describe un ratón donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de todas las IgG producidas por el ratón, consiste esencialmente en una cadena ligera que tiene un primer dominio VL humano fusionado con un dominio CL murino, y una cadena pesada que tiene un segundo dominio VL humano fusionado con un dominio CH 45 murino.

En un aspecto, el dominio VL humano fusionado con el dominio CH murino es un dominio Vκ humano.

En un aspecto, el primero y el segundo dominios VL humanos no son idénticos. 50

En un aspecto, se describe un ratón donde al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o aproximadamente el 100 % de la inmunoglobulina G producida por el ratón, consiste esencialmente en un dímero de (a) un primer polipéptido que consiste esencialmente en un dominio VL de inmunoglobulina y una región CL de inmunoglobulina; y (b) un segundo polipéptido de no más de 535 aminoácidos de longitud, donde el segundo 55 polipéptido consiste esencialmente en una región CH y un dominio V que carece de una secuencia derivada de un segmento génico DH.

En un aspecto, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-535 aminoácidos de longitud. En un aspecto específico, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-530 aminoácidos de longitud. En un aspecto específico, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-525 aminoácidos de longitud. En un aspecto específico, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-520 aminoácidos de longitud. En un aspecto específico, el segundo polipéptido tiene aproximadamente 435-515 aminoácidos de longitud. 5

En un aspecto, en aproximadamente el 90% o más de las IgG producidas por el ratón, el segundo polipéptido no tiene más de aproximadamente 535 aminoácidos de longitud.

En un aspecto, en aproximadamente el 50% o más de las IgG producidas por el ratón, el segundo polipéptido no 10 tiene más de aproximadamente 535 aminoácidos de longitud. En un aspecto, en aproximadamente el 50% o más de la inmunoglobulina G producida por el ratón, el segundo polipéptido no tiene más de aproximadamente 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455 ó 450 aminoácidos de longitud. En un aspecto, aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90% ó 95%, o más de la IgG producida por el ratón, tiene la longitud mencionada. En un aspecto específico, la totalidad o sustancialmente la totalidad de la IgG producida por el 15 ratón,tiene la longitud mencionada.

En un aspecto, el dominio V del segundo polipéptido es un dominio VL. En un aspecto específico, el dominio V del segundo polipéptido se selecciona de un dominio Vκ y un dominio Vλ. En un aspecto específico, el dominio V del segundo polipéptido es un dominio Vκ o Vλ humano. 20

En un aspecto, se describe un ratón que expresa, a partir de una secuencia nucleotídica en su línea germinal, un polipéptido que comprende una secuencia variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V y/o J), una secuencia DH, y una región constante de cadena pesada.

25

En un aspecto, el ratón expresa el polipéptido a partir de un locus de cadena pesada de ratón endógeno, que comprende un reemplazo de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos del locus variable de cadena pesada de ratón endógeno funcionales, por una pluralidad de segmentos génicos humanos en el locus de cadena pesada de ratón endógeno.

30

En un aspecto, el polipéptido comprende un dominio VL derivado de un segmento génico Vλ o Vκ, el polipéptido comprende una CDR3 derivada de un segmento génico DH, y el polipéptido comprende una secuencia derivada de un segmento génico JH o Jλ o Jκ.

En un aspecto, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada murino endógeno que 35 comprende un reemplazo de la totalidad de segmentos génicos VH funcionales, por uno o más segmentos génicos Vλ de cadena ligera humana, donde el uno o más segmentos génicos Vλ humanos tiene cada uno yuxtapuesta en el lado 3’ una secuencia de señal de recombinación (RSS) separada 23-mer, donde los segmentos génicos Vλ están unidos operativamente a un segmento génico DH humano o murino que tiene yuxtapuesta en 5’ y 3’ una RSS separada 12-mer; el segmento génico DH está unido operativamente con un segmento génico J yuxtapuesto en 5’ 40 con una RSS separada 23-mer que es adecuada para recombinarse con la RSS separada 12-mer yuxtapuesta con el segmento génico DH, donde los segmentos génicos V, DH y J están unidos operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada.

En un aspecto, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno que 45 comprende un reemplazo de la totalidad de segmentos génicos VH funcionales, por uno o más segmentos génicos Vκ humanos, cada uno yuxtapuesto en el lado3’ con una secuencia de señal de recombinación (RSS) separada 12-mer, donde los segmentos génicos V están unidos operativamente a un segmento génico DH humano o murino que está yuxtapuesto tanto en 5’ como en 3’ con una RSS separada 23-mer, el segmento génico DH está unido operativamente con un segmento génico J yuxtapuesto en el lado 5’ con una RSS separada 12-mer, que es 50 adecuada para recombinarse con la RSS separada 23-mer yuxtapuesta con el segmento génico DH, donde los segmentos génicos V, DH y J están unidos operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada.

En un aspecto, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de ratón 55 endógena. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico codifica un dominio que se selecciona de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3, y una combinación de los mismos. En un aspecto, uno o más de los CH1, bisagra, CH2 y CH3, son humanos.

En un aspecto, el ratón comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno que comprende un reemplazo de la totalidad de los segmentos génicos VH funcionales, por una pluralidad de segmentos génicos Vλ o Vκ humanos, cada uno yuxtapuesto en 3’ con una RSS separada 23-mer, una pluralidad de segmentos génicos DH humanos yuxtapuestos tanto en 5’ como en 3’ con una RSS separada 12-mer, una pluralidad de segmentos génicos J humanos (JH o Jλ o Jκ) yuxtapuestos tanto en 5’ comoen 3’ con una RSS separada 23-mer, 5 donde el locus comprende una secuencia de región constante murina endógena que se selecciona de CH1, bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, el ratón comprende la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos Vλ o Vκ humanos funcionales, la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos DH humanos, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos JH o Jλ o Jκ. 10

En un aspecto, el ratón expresa una proteína de unión al antígeno que comprende: (a) un polipéptido que comprende un dominio de cadena ligera humana unido a una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia murina; y (b) un polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera humana unido a una región constante de cadena ligera humana o murina. En un aspecto específico, la secuencia de cadena ligera es 15 una secuencia de cadena ligera humana, y al exponerse a una proteasa que sea capaz de escindir un anticuerpo en un Fc y un Fab, se forma un Fab completamente humano que comprende al menos cuatro CDR de cadena ligera, donde las al menos cuatro CDR de cadena ligera se seleccionan de secuencias λ, secuencias κ, y una combinación de las mismas. En un aspecto, el Fab comprende al menos cinco CDR de cadena ligera. En un aspecto, el Fab comprende seis CDR de cadena ligera. En un aspecto, al menos una CDR del Fab comprende una secuencia 20 derivada de un segmento génico Vλ o un segmento génico Vκ, y la al menos una CDR además comprende una secuencia derivada de un segmento génico D. En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 y la CDR se deriva de un segmento génico Vκ humano, un segmento génico D humano, y un segmento génico Jκ humano.

En un aspecto, el polipéptido comprende un dominio variable derivado de un segmento génico Vλ o Vκ humano, un 25 segmento génico DH humano, y un segmento génico JH o Jλ o Jκ humano. En un aspecto específico, la región constante de cadena pesada se deriva de una secuencia CH1 humana y una secuencia CH2 murina y una secuencia CH3 murina.

En un aspecto, se describe un ratón que comprende en su línea germinal un segmento génico Vκ o Vλ, humano no 30 reordenado, unido operativamente a un segmento génico J humano y una región constante de cadena pesada, donde el ratón expresa una proteína de unión VL que comprende un dominio Vκ humano fusionado con una región constante de cadena pesada, y donde el ratón exhibe una población de células B esplénicas que expresa proteínas de unión VL en células B CD19+, incluyendo células B de transición CD19+IgMhiIgDint), y células B maduras (CD19+IgMintIgDhi). 35

En un aspecto, se describe un ratón que comprende en su línea germinal, un segmento génico Vκ o Vλ, humano no reordenado, unido operativamente a un segmento génico J humano y una región constante de cadena pesada, donde el ratón expresa en una célula B, una inmunoglobulina que comprende un dominio variable de cadena ligera fusionado con una región constante de cadena pesada, donde la población linfocítica de la médula ósea del ratón, 40 exhibe una población de células pro/pre B que es aproximadamente la misma en número que una población de células pro/pre B de un ratón de tipo silvestre (linfocitos en la médula ósea).

En un aspecto, el ratón comprende al menos 6 segmentos génicos hVκ no reordenados y uno o más segmentos génicos hJκ no reordenados, y los ratones comprenden una población de células esplénicas activadas por linfocitos 45 e lgM+ que expresan una proteína de unión VL, donde la población es al menos 75% tan grande como una población de células esplénicas activadas por linfocitos e IgM+ de un ratón de tipo silvestre.

En un aspecto, los ratones exhiben una población de esplenocitos activados por células B maduras (CD19+) de células lgD+ e lgM+, que en total constituyen aproximadamente el 90%; en una realización, la población de 50 esplenocitos activados por células B maduras (CD19+) de células lgD+ e lgM+ del ratón modificado, es aproximadamente igual (por ejemplo, dentro del 10% o dentro del 5%) que el total de células IgD+ y células lgM+ de un ratón de tipo silvestre que son esplenocitos activados por células B maduras (CD19+).

En un aspecto, se describe un ratón que expresa una proteína inmunoglobulina a partir de un locus de cadena 55 pesada endógeno modificado en su línea germinal, donde el locus de cadena pesada endógeno modificado carece de un segmento génico V de cadena pesada de ratón funcional y el locus comprende segmentos génicos V de cadena ligera no reordenados y segmentos génicos J no reordenados, donde los segmentos génicos V de cadena ligera no reordenados y los segmentos génicos J no reordenados, están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada; donde la proteína inmunoglobulina consiste esencialmente en un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende un dominio de cadena ligera de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, y el segundo polipéptido comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región constante de cadena ligera. 5

En un aspecto, se describe un ratón que expresa una proteína inmunoglobulina, donde la proteína inmunoglobulina carece de un dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada, y la proteína inmunoglobulina comprende un primer dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena ligera, y un segundo dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena ligera, donde el primer dominio variable y el segundo dominio variable son 10 equivalentes uno con respecto al otro, donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera no son idénticos, y donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera se asocian, y cuando están asociados, se unen específicamente al antígeno de interés.

En un aspecto, se describe un ratón que produce a partir de segmentos génicos no reordenados en su línea 15 germinal, una proteína inmunoglobulina que comprende dominios variables que se derivan por completo de segmentos génicos que consisten esencialmente en segmentos génicos humanos no reordenados, donde la proteína inmunoglobulina comprende una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que se selecciona del grupo que consiste en CH1, una bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas. 20

En un aspecto, se describe un ratón que produce, a partir de segmentos génicos no reordenados en su línea germinal, una proteína inmunoglobulina que comprende dominios variables, donde todas las CDR3 de todas las regiones variables son generadas por completo a partir de segmentos génicos V y J de cadena ligera, y opcionalmente una o más hipermutaciones somáticas, por ejemplo una o más N adiciones. 25

En un aspecto, se describe un ratón que produce una proteína inmunoglobulina somáticamente mutada derivada de segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reordenados, en la línea germinal del ratón, donde la proteína inmunoglobulina carece de una CDR que comprenda una secuencia derivada de un segmento génico D, donde la proteína inmunoglobulina comprende una primera CDR3 en un dominio variable 30 de cadena ligera fusionado con una región constante de cadena ligera, comprende una segunda CDR3 en un dominio variable de cadena ligera fusionado con una región constante de cadena pesada, y donde la segunda CDR3 se deriva de la secuencia de región variable de cadena ligera reordenada que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 ó 10, o más N adiciones.

35

En un aspecto, se proporciona un ratón como se describe en el presente documento, donde el ratón comprende un locus de cadena ligera funcionalmente silenciado que se selecciona de un locus λ, un locus κ, y una combinación de los mismos. En un aspecto, el ratón comprende una deleción de un locus λ y/o κ, en su totalidad o en parte, de tal modo que el locus λ y/o κ no es funcional.

40

En un aspecto, se describe un embrión de ratón que comprende una célula que comprende un locus de inmunoglobulina modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, el ratón es una quimera y al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de las células del embrión comprenden un locus de inmunoglobulina modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, al menos el 96%, 97%, 98%, 99% ó 99,8% de las células del embrión, comprenden un locus de inmunoglobulina modificado como se 45 describe en el presente documento. En un aspecto, el embrión comprende una célula huésped y una célula derivada de una célula ME donante, donde la célula derivada de la célula ME donante comprende un locus de inmunoglobulina modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, el embrión es un embrión huésped en el estadío de 2, 4, 8, 16, 32 ó 64 células, o un blastocisto, y además comprende una célula ME donante que comprende un locus de inmunoglobulina modificado como se describe en el presente documento. 50

En un aspecto, se proporciona un ratón o una célula obtenida utilizando una construcción de ácido nucleico como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se proporciona un ratón obtenido utilizando una célula como se describe en el presente documento. 55 En un aspecto, la célula es una célula ME murina.

En un aspecto, uso de un ratón como se describe en el presente documento, para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica una primera secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (VL1), que es equivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (Vequivalente a una segunda secuencia variable de inmunoglobulina de cadena ligera humana (V

5

En un aspecto, uso de un ratón como se describe en el presente documento para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que está fusionada con una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina humana, donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido VL-CH humano, donde el polipéptido VL-CH humano se expresa en forma de un dímero, y donde el dímero se expresa en ausencia de una cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, en ausencia de una cadena 10 ligera λ humana o κ humana). En un aspecto, el dímero VL-CH se une específicamente a un antígeno de interés, en ausencia de una cadena ligera λ y en ausencia de una cadena ligera κ.

En un aspecto, uso de un ratón como se describe en el presente documento, para preparar una secuencia de ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción de un dominio variable de inmunoglobulina. En un aspecto, el 15 dominio variable de inmunoglobulina es un dominio Vλ, humano o Vκ humano.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento para preparar un Fab completamente humano (que comprende una primera VL humana fusionada con una región constante de cadena pesada humana, y una segunda VL humana fusionada con una región constante de cadena pesada humana), o un 20 F(ab)2 completamente humano.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento, para preparar una línea celular inmortalizada. En un aspecto, la línea celular inmortalizada comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio Vλ o Vκ humano, unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que comprende una 25 secuencia de ácido nucleico de región constante murina.

En un aspecto, se describe el uso de un ratón como se describe en el presente documento, para preparar un hibridoma o un cuadroma.

30

En un aspecto, se describe una célula que comprende un locus de inmunoglobulina modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula se selecciona de una célula totipotente, una célula pluripotente, una célula madre pluripotente inducida (CMPi), y una célula ME. En un aspecto específico, la célula es una célula de ratón, por ejemplo una célula ME murina. En un aspecto, la célula es homocigota para el locus de inmunoglobulina modificado. 35

En un aspecto, se describe una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer dominio Vκ o Vλ humano somáticamente mutado, fusionado con un gen de región constante de cadena pesada humana.

40

En un aspecto, la célula además comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio Vκ o Vλ somáticamente mutado, fusionado con una región constante de cadena ligera humana.

En un aspecto, el dominio Vκ o Vλ humano del primer polipéptido es equivalente al dominio Vκ o Vλ humano del segundo polipéptido. 45

En un aspecto, Vκ o Vλ del primer polipéptido y Vκ o Vλ humano del segundo polipéptido, cuando se asocian, se unen específicamente a un antígeno de interés. En un aspecto específico, el primer polipéptido comprende un dominio variable que consiste esencialmente en un dominio Vκ humano, y el segundo polipéptido comprende un dominio variable que consiste en un dominio Vκ humano que es equivalente al dominio Vκ humano del primer 50 polipéptido, y la región constante humana, es una secuencia de IgG.

En un aspecto, la célula se selecciona de una célula CHO, una célula COS, una célula 293, una célula HeLa y una célula retiniana humana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

55

En un aspecto, se describe una célula somática de ratón que comprende un cromosoma que comprende una modificación genética como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe una célula germinal de ratón, que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una modificación genética como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente, derivada de un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto específico, la célula es una célula madre embrionaria (ME) 5 murina.

En un aspecto, se describe el uso de una célula como se describe en el presente documento, para la fabricación de un ratón, una célula, o una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo u otra proteína de unión al antígeno).

10

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico DH humano yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 23-mer. En un aspecto específico, la construcción de ácido nucleico comprende un brazo de homología que es homólogo a una secuencia genómica humana que comprende segmentos génicos Vκ humanos. En un aspecto, la construcción de direccionamiento comprende la totalidad o sustancialmente la totalidad de los segmentos génicos DH humanos, cada uno yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 23-mer. 15

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico Jκ humano yuxtapuesto en 5’ con una RSS separada 12-mer. En un aspecto específico, la construcción de ácido nucleico comprende un primer brazo de homología que contiene homología con una secuencia génica DH genómica humana que está yuxtapuesta en 5’y 3’ con una RSS separada 23-mer. En un aspecto, la construcción de ácido nucleico 20 comprende un segundo brazo de homología que contiene homología con una secuencia génica J genómica humana, o que contiene homología con una secuencia de región constante de cadena pesada de ratón, o que contiene homología con una secuencia intergénica J-C que se encuentra en 5’ de una secuencia de cadena pesada de región constante murina.

25

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico Vλ yuxtapuesto en 3’ con una RSS separada 23-mer, un segmento génico DH humano yuxtapuesto en 3’ y 5’ con una RSS separada 12-mer, y un segmento génico J humano que se selecciona de un segmento génico Jκ yuxtapuesto en 5’ con una RSS separada 23-mer, un segmento génico Jλ humano yuxtapuesto en 5’ con una RSS separada 23-mer, y un segmento génico JH humano yuxtapuesto en 5’ con una RSS separada 23-mer. En un aspecto, la construcción 30 comprende un brazo de homología que contiene homología con una secuencia de región constante murina, una secuencia intergénica J-C murina, y/o una secuencia Vλ humana.

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende una región variable de cadena ligera λ humana que comprende un fragmento del grupo A del locus de la cadena ligera λ humana. En un aspecto específico, el 35 fragmento del grupo A del locus de cadena ligera λ humana, se extiende desde hVλ3-27 a hVλ3-1.

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende una región variable de cadena ligera λ humana que comprende un fragmento del grupo B del locus de cadena ligera λ humana. En un aspecto específico, el fragmento del grupo B del locus de cadena ligera λ humana se extiende desde hVλ5-52 a hVλ1-40. 40

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende una región variable de cadena ligera λ humana que comprende un fragmento genómico del grupo A y un fragmento genómico del grupo B. En un aspecto, la región variable de cadena ligera λ humana comprende al menos un segmento génico del grupo A y al menos un segmento génico del grupo B. 45

En un aspecto, la región variable de cadena ligera λ humana comprende al menos un segmento génico del grupo B y al menos un segmento génico del grupo C.

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico DH humano 50 yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 23-mer, normalmente encontrada en la naturaleza flanqueando un segmento génico Jκ, JH, Vλ o VH. En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende un primer brazo de homología que es homólogo a una región intergénica V-J humana, o es homólogo a una secuencia genómica humana que comprende un segmento génico V humano. En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende un segundo brazo de homología que es homólogo a una secuencia de región constante de cadena 55 pesada humana o murina. En un aspecto específico, la región constante de cadena pesada humana o murina se selecciona de CH1, bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas. En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende un segmento génico J humano flanqueado en 5’ por una RSS separada 12-mer. En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende un segundo brazo de homología que contiene homología con un segmento génico J flanqueado en 5' por una RSS separada 12-mer. En un aspecto, el segmento génico J se selecciona de un Jκ humano, Jλ humano, y J

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico DH humano 5 yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 23-mer, y una secuencia de reconocimiento de recombinasa específica de sitio, por ejemplo una secuencia reconocida por una recombinasa específica de sitio, tal como una proteína Cre, Flp o Dre.

En un aspecto, se describe una construcción de ácido nucleico que comprende un segmento génico Vλ humano o 10 Vκ humano, un segmento génico DH yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 12-mer ó 23-mer, y un segmento génico J humano con una RSS separada 12-mer ó 23-mer, donde la RSS separada 12-mer ó 23-mer está situada inmediatamente en 5' respecto al segmento génico J humano (es decir, con respecto a la dirección de la transcripción). En un aspecto, la construcción comprende un segmento génico Vλ humano yuxtapuesto con una RSS separada 23-mer en 3', un segmento génico DH humano yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 12-mer, y un 15 segmento génico Jκ humano yuxtapuesto en 5’ con una RSS separada 23-mer. En un aspecto, la construcción comprende un segmento génico Vκ humano yuxtapuesto en 3’ con una RSS separada 12-mer, un segmento génico DH humano yuxtapuesto en 5’ y 3’ con una RSS separada 23-mer y un segmento génico Jλ humano yuxtapuesto con una RSS separada 12-mer en 5’.

20

En un aspecto, se describe un vector de direccionamiento, que comprende: (a) un primer brazo de direccionamiento y un segundo brazo de direccionamiento, donde el primer y segundo brazos de direccionamiento se seleccionan independientemente de brazos de direccionamiento humanos y murinos, donde los brazos de direccionamiento dirigen al vector hacia un locus génico de la región V de inmunoglobulina endógeno o modificado; y (b) una secuencia contigua de segmentos génicos VL humanos o una secuencia contigua de segmentos génicos VL 25 humanos y al menos un segmento génico Jκ humano, donde la secuencia contigua se selecciona del grupo que consiste en (i) hVκ4-1 a hVκ1-6 y Jκ1, (ii) hVκ4-1 a hVκ1-6 y Jκ1 a Jκ2, (iii) hVκ4-1 a hVκ1-6 y Jκ1 a Jκ3, (iv) hVκ4-1 a hVκ1-6 y Jκ1 a Jκ4, (v) hVκ4-1 a hVκ1-6 y Jκ1 a Jκ5, (vi) hVκ3-7 a hVκ1-16, (vii) hVκ1-17 a hVκ2-30, (viii) hVκ3-31 a hVκ2-40, y (ix) una combinación de los mismos.

30

En un aspecto, los brazos de direccionamiento que dirigen el vector hacia un locus de inmunoglobulina endógeno o modificado, son idénticos o sustancialmente idénticos a una secuencia en el locus de inmunoglobulina endógeno o modificado.

En un aspecto, se describe el uso de una construcción de ácido nucleico como se describe en el presente 35 documento, para la fabricación de un ratón, una célula o una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo u otra proteína de unión a un antígeno).

En un aspecto, se describe el uso de una secuencia de ácido nucleico de un ratón, como se describe en el presente documento, para preparar una línea celular para la fabricación de un agente terapéutico humano. En un aspecto, el 40 agente terapéutico humano es una proteína de unión que comprende un dominio variable de cadena ligera humana (por ejemplo, derivado de un segmento génico Vλ humano o Vκ humano), fusionado con una región constante de cadena pesada humana. En un aspecto, el agente terapéutico humano comprende un primer polipéptido que es una cadena ligera de inmunoglobulina λ o κ humana, y un segundo polipéptido que comprende un dominio variable Vλ humano o Vκ humano fusionado con una región constante de cadena pesada humana. 45

En un aspecto, se describe un sistema de expresión que comprende una célula de mamífero transfectada con una construcción de ADN que codifica un polipéptido que comprende un dominio VL humano somáticamente mutado, fusionado con un dominio CH humano.

50

En un aspecto, el sistema de expresión comprende además una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VL de inmunoglobulina fusionado con un dominio CL humano, donde el dominio VL fusionado con el dominio CL humano es una cadena ligera equivalente al dominio VL fusionado con el dominio CH humano.

En un aspecto, la célula de mamífero se selecciona de una célula CHO, una célula COS, una célula Vero, una célula 55 293, y una célula retiniana que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™).

En un aspecto, se describe un método para preparar una proteína de unión, que comprende obtener una secuencia nucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio Vnucleotídica que codifica un dominio V

5

En un aspecto, el ratón se ha inmunizado con un antígeno de interés, y el dominio VL fusionado con la región CH se une específicamente (por ejemplo, con una KD en el rango micromolar, nanomolar o picomolar) a un epítopo del antígeno de interés. En un aspecto, la secuencia nucleotídica que codifica el dominio VL fusionado con la región CH, está somáticamente mutada en el ratón.

10

En un aspecto, la célula adecuada se selecciona de una célula B, un hibridoma, un cuadroma, una célula CHO, una célula COS, una célula 293, una célula HeLa y una célula retiniana humana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

En un aspecto, la región CH comprende un isotipo IgG humano. En un aspecto específico, la IgG humana se 15 selecciona de lgG1, lgG2 e lgG4. En otro aspecto específico, la IgG humana es la IgG 1. En otro aspecto específico, la IgG humana es la lgG4. En otro aspecto específico, la lgG4 humana es una lgG4 modificada. En un aspecto, la lgG4 modificada comprende una sustitución en la región de bisagra. En un aspecto específico, la lgG4 modificada comprende una sustitución en el residuo de aminoácido 228 en relación con una lgG4 humana de tipo silvestre, numerada de acuerdo con el índice de numeración de la UE de Kabat. En un aspecto específico, la sustitución en el 20 residuo de aminoácido 228 es una sustitución S228P, numerada de acuerdo con el índice de numeración de la UE de Kabat.

En un aspecto, la célula además comprende una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VL a partir de una cadena ligera que es equivalente al dominio VL fusionado con la región CH, y el método además comprende 25 expresar la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio VL equivalente fusionado con un dominio Cκ o Cλ humano.

En un aspecto, se describe un método para preparar un ratón genéticamente modificado, que comprende reemplazar, en un locus de cadena pesada de ratón endógeno, uno o más segmentos génicos de cadena pesada de 30 inmunoglobulina de un ratón, con uno o más segmentos génicos de cadena ligera de inmunoglobulina humanos. En un aspecto, el reemplazo es de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina murina funcionales (es decir, los segmentos génicos VH, DH y JH), por uno o más segmentos génicos de cadena ligera humana funcionales (es decir, segmentos VL y JL). En un aspecto, el reemplazo es de la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos VH, DH y JH de cadena pesada de ratón funcionales 35 por la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos Vλ o Vκ humanos y al menos un segmento génico Jλ o Jκ. En un aspecto específico, el reemplazo incluye la totalidad o sustancialmente la totalidad de segmentos génicos Jλ o Jκ humanos funcionales.

En un aspecto, se describe un método para producir un ratón que expresa un polipéptido que comprende una 40 secuencia derivada de un segmento génico Vλ o Vκ y/o Jλ o Jκ de inmunoglobulina humana fusionado con una región constante de cadena pesada de ratón, que comprende reemplazar los segmentos génicos variables de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógenos (VH, DH y JH) con al menos un segmento génico Vλ o Vκ humano, y al menos un segmento génico Jλ o Jκ humano, donde el reemplazo es en una célula de ratón pluripotente, pluripotente inducida, o totipotente, para formar una célula progenitora murina genéticamente 45 modificada; la célula progenitora murina genéticamente modificada se introduce en un ratón huésped; y el ratón huésped que comprende la célula progenitora genéticamente modificada, se somete a gestación para formar un ratón que comprende un genoma derivado de la célula progenitora de ratón genéticamente modificada. En un aspecto, el huésped es un embrión. En un aspecto específico, el huésped se selecciona de una premórula murina (por ejemplo, estadío de 8 ó 4 células), un embrión tetraploide, un agregado de células embrionarias, o un 50 blastocisto.

En un aspecto, se describe un método para preparar un ratón genéticamente modificado como se describe en el presente documento, que comprende introducir, por transferencia nuclear, un ácido nucleico que contiene una modificación como se describe en el presente documento, en una célula, y mantener la célula bajo condiciones 55 adecuadas (por ejemplo, incluyendo el cultivo de la célula y la gestación de un embrión que comprende la célula, en una madre sucedánea), para que se desarrolle y forme un ratón como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para producir un ratón modificado, que comprende modificar como se describe en el presente documento una célula ME murina o una célula pluripotencial o totipotencial o pluripotencial inducida murina, para incluir uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenados, unidos operativamente a una secuencia constante de cadena pesada de inmunoglobulina, cultivar la célula ME, introducir la célula ME cultivada en un embrión huésped para formar un embrión quimérico, e introducir el embrión quimérico en un ratón huésped adecuado, para que se desarrolle y se forme un ratón modificado. En un 5 aspecto, el uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenados son segmentos génicos λ humanos o κ humanos. En un aspecto, el uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenados comprenden segmentos génicos Vλ humanos o Vκ humanos, y uno o más segmentos génicos Jλ, Jκ o J

15

En un aspecto, se describe una región variable de inmunoglobulina (VR) (por ejemplo, que comprende un segmento génico de VL humana fusionado con una JL o JH, o DH y JH, o DH y JL humana) producida en un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto específico, la VR de inmunoglobulina se deriva de un segmento génico humano de línea germinal que se selecciona de un segmento génico Vκ y un segmento génico Vλ, donde la VR está codificada por una secuencia reordenada del ratón donde la secuencia reordenada está somáticamente 20 hipermutada. En un aspecto, la secuencia reordenada comprende 1 a 5 hipermutaciones somáticas. En un aspecto, la secuencia reordenada comprende al menos 6, 7, 8, 9 ó 10 hipermutaciones somáticas. En un aspecto, la secuencia reordenada comprende más de 10 hipermutaciones somáticas. En un aspecto, la secuencia reordenada está fusionada con una o más secuencias de región constante de cadena pesada humana o murina (por ejemplo, que se seleccionan de CH1, bisagra, CH2, CH3 humanas o murinas, y una combinación de las mismas). 25

En un aspecto, se describe una secuencia de aminoácidos de dominio variable de inmunoglobulina de una proteína de unión, producida en un ratón como se describe en el presente documento. En un aspecto, la VR está fusionada con una o más secuencias de región constante de cadena pesada humana o murina (por ejemplo, que se seleccionan de CH1, bisagra, CH2, CH3, humana o murina, y una combinación de las mismas). 30

En un aspecto, se describe un dominio variable de cadena ligera codificado por una secuencia de ácido nucleico derivada de un ratón como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo Fab, F(ab)2, 35 scFv) producido en un ratón como se describe en el presente documento, o derivado de una secuencia producida en un ratón como se describe en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

40

La fig. 1A ilustra un esquema (no a escala) del locus de cadena pesada de ratón. El locus de cadena pesada de ratón tiene aproximadamente 3 Mb de longitud y contiene aproximadamente 200 segmentos génicos de región variable de cadena pesada (VH), 13 segmentos génicos de región de diversidad de cadena pesada (DH) y 4 segmentos génicos de región de unión de cadena pesada (JH), así como potenciadores (Pot) y regiones constantes de cadena pesada (CH). 45

La fig. 1B ilustra un esquema (no a escala) del locus de cadena ligera κ humana. El locus de cadena ligera κ humana está duplicado en fragmentos contiguos distal y proximal de polaridad opuesta que abarcan aproximadamente 440 kb y 600 kb, respectivamente. Entre los dos segmentos contiguos hay aproximadamente 800 kb de ADN que se cree que carece de segmentos génicos Vκ. El locus de cadena ligera κ humana contiene 50 aproximadamente 76 segmentos génicos Vκ, 5 segmentos génicos Jκ, un potenciador intrónico (Pot) y una única región constante (CK).

La fig. 2 muestra una estrategia de direccionamiento para la inserción progresiva de 40 segmentos génicos Vκ humanos y 5 Jκ humanos en el locus de cadena pesada de ratón. Se muestran los casetes de selección de 55 higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, etc.).

La fig. 3 muestra un locus de cadena pesada de ratón modificado que comprende segmentos génicos Vκ y Jκ humanos unidos operativamente a las regiones Chumanos unidos operativamente a las regiones Chumanos unidos operativamente a las regiones C

La fig. 4A muestra un ejemplo de estrategia de direccionamiento para la inserción progresiva de un segmento génico Vλ humano y un único segmento génico Jλ humano en el locus de cadena pesada de ratón. Se muestran los casetes de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, 5 R2, etc.).

La fig. 4B muestra un ejemplo de una estrategia de direccionamiento para la inserción progresiva de segmentos génicos Vλ humanos y cuatro segmentos génicos Jλ humanos en el locus de cadena pesada de ratón. Se muestran los casetes de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa 10 (R1, R2, etc.).

La fig. 5A muestra un ejemplo de una estrategia de direccionamiento para la inserción progresiva de segmentos génicos Vλ, humanos, DH humanos y JH humanos, en el locus de cadena pesada de ratón. Se muestran los casetes de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, 15 etc.).

La fig. 5B muestra un ejemplo de una estrategia de direccionamiento para la inserción progresiva de segmentos génicos Vλ, humanos, DH humanos y Jκ humanos, en el locus de cadena pesada de ratón. Se muestran los casetes de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con los sitios de reconocimiento de recombinasa (R1, R2, 20 etc.).

La fig. 6A muestra gráficas de contorno de esplenocitos teñidos para la expresión de superficie de B220 e IgM de un ratón de tipo silvestre (TS) representativo y un ratón representativo homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos situados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ 25 HO).

La fig. 6B muestra gráficas de contorno de esplenocitos activados en células B CD19+ y teñidos para inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina M (IgM), procedentes de un ratón representativo de tipo silvestre (TS) y un ratón representativo homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ 30 humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO).

La fig. 6C muestra el número total de células B CD19+, células B de transición (CD19+IgMhiIgDint) y células B maduras (CD19+IgMintIgDhi) en bazos extraídos de de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena 35 pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO).

La fig. 7A muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en singletes teñidos por inmunoglobulina M (IgM) y B220, procedentes de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-40 5hJκ HO). Se observan células B inmaduras, maduras y pro/pre B en cada uno de los gráficos de puntos.

La fig. 7B muestra el número total de células B pre/Pro (B220+IgM-), inmaduras (B220intIgM+) y maduras (B220hiIgM+) en médula ósea aislada de los fémures de ratones de tipo silvestre (TS) y de ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la 45 cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO).

La fig. 7C muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en CD19+ y teñida para ckit+ y CD43+, procedente de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO). Se 50 observan células pro y pre B en cada uno de los gráficos de puntos.

La fig. 7D muestra el número de células pro B (CD19+CD43+ckit+) y pre B (CD19+CD43–ckit–) en médula ósea extraída de los fémures de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-55 5hJκ HO).

La fig. 7E muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en singletes teñida para CD19 y CD43 procedente de un ratón de tipo silvestre (TS) y de un ratón homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO). Se observan células B inmaduras, pre y pro B en cada uno de los gráficos.

La fig. 7F muestra histogramas de médula ósea activada en células pre B (CD19+CD43int) y que expresa 5 inmunoglobulina M (IgM) procedente de un ratón de tipo silvestre (TS) y un ratón homocigoto para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO).

La fig. 7G muestra el número de células pre B lgM+ (CD19+IgM+CD43int) y células B inmaduras (CD19+IgM+CD43−), 10 en médula ósea extraída de los fémures de ratones de tipo silvestre (TS) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, posicionados en el locus de la cadena pesada endógena (6hVκ-5hJκ HO).

La fig. 8A muestra gráficas de contorno de esplenocitos activados en CD19+ y teñidos para la expresión de lgλ+ e 15 lgκ+, procedentes de un ratón que contiene un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos (TS), y un ratón homocigoto para treinta segmentos génicos hVκ y cinco Jκ, en el locus de la cadena pesada endógena y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos (30hVκ-5hJκ HO).

20

La fig. 8B muestra gráficas de contorno de médula ósea activada en células B inmaduras (B220intIgM+) y maduras (B220hiIgM+), teñidas para la expresión de lgλ e lgκ, aislada de los fémures de un ratón que contenía un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos (TS) y un ratón homocigoto para treinta segmentos génicos hVK y cinco Jκ, en el locus de cadena pesada endógena y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ 25 y Jκ humanos (30hVκ-5hJκ HO).

La fig. 9 muestra una alineación de secuencia nucleotídica de la unión Vκ-Jκ-mIgG de doce clones de RT-PCR independientes amplificados a partir de ARN de esplenocitos de ratones no tratados homocigotos para treinta segmentos génicos hVκ y cinco segmentos génicos Jκ en el locus de cadena pesada de ratón y un reemplazo de los 30 segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos. Las bases en letra minúscula indican bases que no son de línea germinal resultantes de la mutación y/o la N adición durante la recombinación. Se incluyen espacios artificiales (periodos) para alinear apropiadamente la región marco 4 y mostrar alineación de la secuencia nucleotídica IgG de cadena pesada de ratón para clones cebados con lgG1, lgG2a/c e lgG3.

35

Descripción detallada

La frase "proteína de unión biespecífica" incluye una proteína de unión capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Las proteínas de unión biespecíficas comprenden dos diferentes polipéptidos que comprenden un primer dominio variable de cadena ligera (VL1), fusionado con una primera región CH y un segundo dominio variable de 40 cadena ligera (VL2) fusionado con una segunda región CH. En general, la primera y segunda regiones CH son idénticas, o difieren en una o más sustituciones de aminoácido (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Las regiones VL1 y VL2 se unen específicamente a diferentes epítopos-ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, antígenos) o en la misma molécula (por ejemplo, en el mismo antígeno). Si una proteína de unión biespecífica se une selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la 45 afinidad de la VL1 por el primer epítopo generalmente será al menos de uno a dos o de tres a cuatro órdenes de magnitud más baja que la afinidad de VL1 por el segundo epítopo, y viceversa, con respecto a VL2. Los epítopos reconocidos por la proteína de unión biespecífica pueden estar en la misma diana o en una diferente (por ejemplo, en el mismo antígeno o en uno diferente). Las proteínas de unión biespecíficas pueden prepararse, por ejemplo, al combinar una VL1 y una VL2 que reconozcan diferentes epítopos del mismo antígeno. Por ejemplo, se pueden 50 fusionar secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias VL que reconozcan diferentes epítopos del mismo antígeno, con secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes regiones CH, y tales secuencias pueden ser expresadas en una célula que exprese una cadena ligera de inmunoglobulina, o se pueden expresar en una célula que no exprese una cadena ligera de inmunoglobulina. Una proteína de unión biespecífica típica tiene dos cadenas pesadas, teniendo cada una tres CDR de cadena ligera, seguidas de (del extremo N-terminal al extremo C-terminal) 55 un dominio CH1, una gbisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión al antígeno, pero puede asociarse con cada una de las cadenas pesadas, o que puede asociarse con cada una de las cadenas pesadas y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por VVVVV

Por lo tanto, dos tipos generales de proteínas de unión biespecíficas son (1) VL1-CH(dímero), y (2) VL1-CH:cadena ligera + VL2-CH:cadena ligera, donde la cadena ligera es igual o diferente. En cualquiera de los casos, la CH (es 5 decir, la región constante de cadena pesada) puede ser diferencialmente modificada (por ejemplo, para unirse diferencialmente a la proteína A, para aumentar la semivida en suero, etc.) como se describe en el presente documento, o puede ser la misma.

El término "célula" cuando se utiliza con referencia a la expresión de una secuencia, incluye cualquier célula que sea 10 adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (de una única célula o de múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células de hongos, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células 15 humanas, células B, o fusiones celulares, tales como por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariótica y se selecciona de entre las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, 20 BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmicas), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula anteriormente mencionada. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

25

El término "equivalente" cuando se utiliza en el sentido de "equivalente a", por ejemplo, un primero dominio VL que es "equivalente a" un segundo dominio VL, pretende incluir una referencia a la relación entre dos dominios VL procedentes de una misma proteína de unión producida por un ratón de acuerdo con la invención. Por ejemplo, un ratón que se modifica genéticamente de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, por ejemplo un ratón que tiene un locus de cadena pesada en el que los segmentos génicos VH, DH y JH se reemplazan por segmentos 30 génicos VL y JL, produce proteínas de unión similares a anticuerpo que tienen dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región CH de ratón (por ejemplo un isotipo IgG) fusionada con un primer dominio VL humano, y dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región CL murina fusionadas con un segundo dominio VL humano. Durante la selección clonal en el ratón, el primer y segundo dominios VL humanos se seleccionaron por el proceso de selección clonal para aparecer juntos en el contexto de una única proteína de unión similar a anticuerpo. 35 Por lo tanto, el primer y segundo dominios VL que aparecen juntos, como resultado del proceso de selección clonal, en una única molécula similar a anticuerpo, se refieren como "equivalentes". Por el contrario, un dominio VL que aparece en una primera molécula similar a anticuerpo y un dominio VL que aparece en una segunda molécula similar a anticuerpo, no son equivalentes, a menos que la primera y la segunda moléculas similares a anticuerpo tengan cadenas pesadas idénticas (es decir, a menos que el dominio VL fusionado con la primera región de cadena pesada 40 humana y el dominio VL fusionado con la segunda región de cadena pesada humana, sean idénticos).

La frase "región determinante de complementariedad" o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo, que normalmente aparece (es decir, en un animal de tipo silvestre) entre dos regiones marco en una región variable de una cadena 45 ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de células T). Una CDR puede codificarse, por ejemplo, por una secuencia de línea germinal, o por una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por una célula B sin tratar o madura, o por una célula T. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden codificarse por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada), pero que son 50 contiguas en una secuencia de ácido nucleico de células B, por ejemplo, como resultado de corte y empalme o por la conexión de las secuencias (por ejemplo, una recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

La frase "segmento génico", o "segmento", incluye la referencia a un segmento génico de inmunoglobulina V (de cadena ligera o pesada) o D o J (de cadena ligera o pesada), que incluye secuencias no reordenadas en loci de 55 inmunoglobulina (por ejemplo, en seres humanos y ratones) que pueden participar en un reordenamiento (mediado, por ejemplo, por recombinasas endógenas), para formar una secuencia V/J o V/D/J reordenada. A menos que se indique otra cosa, los segmentos génicos V, D y J comprenden las secuencias de señal de recombinación (RSS) que permiten la recombinación V/J o la recombinación V/D/J, de acuerdo con la regla 12/23. A menos que se indique otra cosa, los segmentos génicos comprenden además secuencias con las que están asociadas en la naturaleza o equivalentes funcionales de las mismas (por ejemplo, para promotores y líderes de segmentos génicos V).

La frase "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina procedente de cualquier organismo, y a menos que se especifique de otro modo, incluye un 5 dominio variable de cadena pesada (VH). Los dominios VH incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica consiste esencialmente en, después del dominio variable (del extremo N-terminal al extremo C-terminal): un dominio CH1, una región de bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y opcionalmente un dominio CH4 (por ejemplo, en el caso de la IgM o IgE), y un dominio transmembrana (M) 10 (por ejemplo, en el caso de inmunoglobulina unida a la membrana en los linfocitos). Una región constante de cadena pesada es una región de una cadena pesada que se extiende (desde el extremo N-terminal hacía el extremo C-terminal) desde fuera de FR4 hasta el extremo C-terminal de la cadena pesada. Las regiones constantes de cadena pesada con desviaciones menores, por ejemplo truncamientos de uno, dos, tres o varios aminoácidos del extremo C-terminal, se incluirán por la frase "región constante de cadena pesada", así como las regiones constantes de cadena 15 pesada con modificaciones de secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácido. Las sustituciones de aminoácido pueden hacerse en una o más posiciones que se seleccionan de, por ejemplo (con referencia a la numeración UE de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo una región constante de IgG humana), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 20 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, y 439.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, una región constante de cadena pesada puede modificarse para mostrar una 25 semivida en suero aumentada (en comparación con la misma región constante de cadena pesada, sin la modificación o modificaciones mencionadas) y puede tener una modificación en la posición 250 (por ejemplo E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en 428 y/o 433 (por ejemplo, L/R/SI/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en 250 y/o 428; o una modificación en 307 ó 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En otro 30 ejemplo, la modificación puede comprender una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y una modificación 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). 35

La frase "cadena ligera" incluye una región constante de cadena ligera (CL) de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique otra cosa, incluye cadenas ligeras κ humana y λ humana. Los dominios variables de cadena ligera (VL) típicamente incluyen tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique de otro modo. En general, una cadena ligera de longitud completa (VL + CL) incluye, del 40 extremo amino al extremo carboxilo, un dominio VL que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región CL. Las cadenas ligeras (VL + CL) que pueden usarse en esta invención, incluyen aquellas que, por ejemplo, no se unen selectivamente a un primer o segundo epítopo (en el caso de proteínas de unión biespecíficas) selectivamente unido por la proteína de unión (por ejemplo, el o los epítopos selectivamente unidos por el dominio VL fusionado con la región CH). Los dominios VL que no se unen selectivamente al o los epítopos unidos por el 45 dominio VL que está fusionado con la región CH, incluyen aquellos que pueden ser identificados mediante el cribado de las cadenas ligeras más comúnmente empleadas en las bibliotecas de anticuerpos existentes (bibliotecas húmedas o in silico), donde las cadenas ligeras no interfieren sustancialmente con la afinidad y/o selectividad de los dominios de unión al epítopo de las proteínas de unión. Las cadenas ligeras adecuadas incluyen aquellas que pueden unirse (por sí solas o en combinación con su VL equivalente fusionada con la región CH) a un epítopo que es 50 unido específicamente por el dominio VL fusionado con la región CH.

La frase "rango micromolar" pretende referirse a 1-999 micromolar; la frase "rango nanomolar" pretende referirse a 1-999 nanomolar; la frase "rango picomolar" pretende referirse a 1-999 picomolar.

55

La frase "animales no humanos" pretende incluir cualquier vertebrado, tal como ciclostomas, peces con esqueleto, peces cartilaginosos tales como tiburones y rayas, anfibios, reptiles, mamíferos y aves. Los animales no humanos adecuados incluyen los mamíferos. Los mamíferos adecuados incluyen primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, vacas y roedores. Los animales no humanos adecuados se seleccionan de la familia de roedores, incluyendo ratas y ratones. De acuerdo con la invención, los animales no humanos son ratones.

Ratones, secuencias nucleotídicas y proteínas de unión

Se describen proteínas de unión que están codificadas por elementos de loci de inmunoglobulina, donde las 5 proteínas de unión comprenden regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina fusionadas con dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, se describen múltiples estrategias para modificar genéticamente un locus de cadena pesada de inmunoglobulina en un ratón, para codificar proteínas de unión que contengan elementos codificados por loci de cadena ligera de inmunoglobulina. Tales ratones genéticamente modificados representan una fuente para generar poblaciones únicas de proteínas de unión que tienen una 10 estructura de inmunoglobulina, pero que todavía exhiben una mayor diversidad sobre los anticuerpos tradicionales.

Los aspectos de las proteínas de unión que se describen en el presente documento, incluyen proteínas de unión que están codificadas por loci de inmunoglobulina modificados, que se modifican de tal forma que segmentos génicos que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) codifican dominios variables de cadena ligera de 15 inmunoglobulina (o porciones de los mismos), están unidos operativamente a secuencias de nucleótidos que codifican regiones constantes de cadena pesada. Tras el reordenamiento de los segmentos génicos de cadena ligera, se obtiene una secuencia nucleotídica reordenada que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena ligera, fusionado con una secuencia que codifica una región constante de cadena pesada. Esta secuencia codifica un polipéptido que tiene un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina fusionado con 20 una región constante de cadena pesada. Por lo tanto, en un aspecto, el polipéptido consiste esencialmente, del extremo N-terminal al extremo C-terminal, en un dominio VL, un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y opcionalmente un dominio CH4.

En los ratones modificados descritos en el presente documento, se producen dichas proteínas de unión que también 25 comprenden una cadena ligera equivalente, donde, en un aspecto, la cadena ligera equivalente se empareja con el polipéptido que se ha descrito anteriormente, para producir una proteína de unión que es similar a un anticuerpo, pero la proteína de unión comprende un dominio VL-no un dominio VH- fusionado con una región CH.

En diversos aspectos, los ratones modificados producen proteínas de unión que comprenden un dominio VL 30 fusionado con una región CH (una cadena pesada híbrida), donde el dominio VL de la cadena pesada híbrida exhibe un mayor grado de hipermutación somática. En estos aspectos, la mejora es sobre un dominio VL que está fusionado con una región CL (una cadena ligera). En algunos aspectos, un dominio VL de una cadena pesada híbrida exhibe aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ó 5 veces o más hipermutaciones somáticas, que un dominio VL fusionado con una región CL. En algunos aspectos, los ratones modificados en respuesta a un antígeno, 35 exhiben una población de proteínas de unión que comprenden un dominio VL de cadena pesada híbrida, donde la población de proteínas de unión muestra un promedio de aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5 veces o más hipermutaciones somáticas, , en el dominio VL de la cadena pesada híbrida, de lo que se observa en un ratón de tipo silvestre en respuesta al mismo antígeno. En un aspecto, las hipermutaciones somáticas en el dominio VL de la cadena pesada híbrida, comprenden una o más, o dos o más, N adiciones en una CDR3. 40

En diversos aspectos, las proteínas de unión comprenden dominios variables codificados por secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenden un número mayor de N adiciones que las observadas en la naturaleza para las cadenas ligeras reordenadas a partir de un locus de cadena ligera endógena, por ejemplo una proteína de unión que comprende una región constante de cadena pesada de ratón fusionada con un dominio variable derivado 45 de segmentos génicos V de cadena ligera humana y segmentos génicos J humanos (de cadena ligera o pesada), donde los segmentos génicos V humanos y J humanos se reordenan para formar un gen reordenado que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 76, 8, 9 ó 10, o más, N adiciones.

En diversos aspectos, los ratones descritos producen proteínas de unión que en promedio son más pequeñas que 50 los anticuerpos de tipo silvestre (es decir, anticuerpos que tienen un dominio VH), y poseen ventajas asociadas a un tamaño menor. El menor tamaño se debe, al menos en parte, a la ausencia de una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento génico DH, normalmente presente en un dominio VH. El menor tamaño también se puede deber a la formación de una CDR3 derivada, por ejemplo, de un segmento génico Vκ y un segmento génico Jκ. 55

En otro aspecto, se describe un ratón y un método para proporcionar una población de proteínas de unión que tienen dominios VL somáticamente hipermutados, por ejemplo dominios Vκ humanos somáticamente mutados y, por ejemplo, dominios Vκ humanos codificados por genes variables κ reordenados, que comprenden 1-10 o más N adiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio Vadiciones. En un aspecto, en ausencia de un dominio V

En otros aspectos, se puede producir un ratón donde los loci de inmunoglobulina de cadena pesada y/o de cadena ligera murina están deshabilitados, se vuelven no funcionales, o se inactivan, y se pueden colocar transgenes completamente humanos o quiméricos humano-murinos, en el ratón, donde al menos uno de los transgenes 15 contiene un locus de cadena pesada modificado (por ejemplo, que tiene segmentos génicos de cadena ligera unidos operativamente a una o más secuencias génicas de cadena pesada). Tales ratones también pueden producir una proteína de unión como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para aumentar la diversidad, incluyendo por hipermutación somática o por N 20 adiciones en un dominio VL, que comprende colocar un segmento génico V de cadena ligera no reordenado y un segmento génico J no reordenado, unidos operativamente a una secuencia génica CH murina; exponer al animal a un antígeno de interés; y aislar del animal una secuencia génica V(ligera)/J reordenada y somáticamente hipermutada, donde dicha secuencia génica V(ligera)/J reordenada está fusionada con una secuencia nucleotídica que codifica una región CH de inmunoglobulina. 25

En un aspecto, la cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la VL hipermutada, es una IgM; en otro aspecto, una IgG; en otro aspecto, una IgE; en otro aspecto, una IgA.

En un aspecto, el dominio VL de clase conmutada y somáticamente hipermutado contiene aproximadamente de 2 a 30 5 veces o más de las hipermutaciones somáticas observadas para un anticuerpo de clase conmutada y reordenado que tenga un dominio VL, que esté unido operativamente a una región CL. En un aspecto, las hipermutaciones somáticas observadas en el dominio VL somáticamente hipermutado, son aproximadamente las mismas en número que las observadas en un dominio VH expresado a partir de un segmento génico VH fusionado con una región CH.

35

En un aspecto, se describe un método para preparar un dominio VL humano de alta afinidad, que comprende exponer un ratón descrito en el presente documento a un antígeno de interés, permitir que el ratón desarrolle una respuesta inmunitaria hacia el antígeno de interés, y aislar un dominio VL humano de clase conmutada y somáticamente mutado del ratón, que se une específicamente al antígeno de interés con una alta afinidad.

40

En un aspecto, la KD de una proteína de unión que comprende el dominio VL humano de clase conmutada y somáticamente mutado, está en el rango nanomolar o picomolar.

En un aspecto, la proteína de unión consiste esencialmente en un polipéptido dimérico, donde el polipéptido consiste esencialmente en la proteína de unión de clase conmutada y somáticamente mutada, que comprende un dominio VL 45 humano fusionado con una región CH humana.

En un aspecto, la proteína de unión consiste esencialmente en un polipéptido dimérico y dos cadenas ligeras, donde el polipéptido consiste esencialmente en la proteína de unión de clase conmutada y somáticamente mutada que tiene un dominio VL humano fusionado con una región CH humana; y donde cada polipéptido del dímero está 50 asociado con una cadena ligera equivalente que comprende un dominio VL de cadena ligera equivalente y una región CL humana.

En un aspecto, se describe un método para hipermutar somáticamente una secuencia génica VL humana, que comprende colocar un segmento génico VL humano y un segmento génico JL humano unidos operativamente a una 55 región CH de ratón endógena en un locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón endógeno, exponer el ratón a un antígeno de interés; y obtener del ratón un dominio VL humano somáticamente hipermutado, que se una al antígeno de interés.

En un aspecto, el método comprende además obtener a partir del ratón una secuencia génica VL de una cadena ligera, que sea equivalente al dominio VL humano somáticamente hipermutado que se une al antígeno de interés.

Proteínas de Unión VL con secuencias DH

5

En varios aspectos, los ratones que comprenden un segmento génico V de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenado y un segmento génico J (por ejemplo, de cadena ligera o pesada) no reordenado, también comprenden un segmento génico DH no reordenado que es capaz de recombinarse con el segmento génico J para formar una secuencia D/J reordenada, que, a su vez, es capaz de reordenarse con el segmento génico V de cadena ligera para formar una secuencia variable reordenada derivada de (a) el segmento génico V de cadena ligera, (b) el segmento 10 génico DH, y (c) el segmento génico J (por ejemplo, de cadena ligera o pesada); donde la secuencia variable reordenada está unida operativamente a una región constante de cadena pesada (por ejemplo, que se selecciona de CH1, bisagra, CH2, CH3, y una combinación de las mismas; por ejemplo, unida operativamente a una CH1, una bisagra, una CH2 y una CH3 murina o humana).

15

En diversos aspectos, los ratones que comprenden segmentos génicos V de cadena ligera humana no reordenados y segmentos génicos J que también comprenden un segmento génico D humano, son útiles, por ejemplo, como fuente de una mayor diversidad de secuencias CDR3. Normalmente, las secuencias CDR3 surgen en las cadenas ligeras por recombinación V/J, y en las cadenas pesadas por recombinación V/D/J. Se proporciona diversidad adicional mediante adiciones de nucleótidos que ocurren durante la recombinación (por ejemplo, N adiciones) y 20 también como resultado de hipermutación somática. Las características de unión conferidas por las secuencias CDR3, generalmente están limitadas a aquellas conferidas por la secuencia CDR3 de cadena ligera, la secuencia CDR3 de cadena pesada, y una combinación de las secuencias CDR3 de cadena ligera y pesada, según pueda ser el caso. En los ratones como se describe en el presente documento, sin embargo, está disponible una fuente de diversidad adicional debido a las características de unión conferidas como resultado de una combinación de una 25 primera CDR3 de cadena ligera (en el polipéptido de cadena pesada) y una segunda CDR3 de cadena ligera (en el polipéptido de cadena ligera). Es posible una diversidad adicional cuando la primera CDR3 de cadena ligera puede contener una secuencia derivada de un segmento génico D, como en un ratón como se describe en el presente documento, que comprende un segmento génico V no reordenado procedente de un dominio V de cadena ligera, unido operativamente a un segmento génico D y unido operativamente a un segmento génico J (de cadena ligera o 30 pesada), empleando el diseño de RSS como se indica aquí.

Otra fuente de diversidad son las N adiciones y/o P adiciones que pueden ocurrir en las recombinaciones V(ligera)J o V(ligera)/D/J, que son posibles en los ratones como se describe. Por lo tanto, los ratones descritos en el presente documento, no sólo proporcionan una diferente fuente de diversidad (cadena ligera-cadena ligera), sino también una 35 fuente de diversidad adicional debido a la adición de, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o más, N adiciones en un gen V(ligera)/J reordenado o un gen V(ligera)/D/J reordenado, en un ratón como se describe en el presente documento.

En diversos aspectos, el uso de un segmento génico D unido operativamente a un segmento génico J y un 40 segmento génico V de cadena ligera, proporciona una mayor diversidad. La unión operativa de un segmento génico DH en este caso, requerirá que el segmento génico D sea capaz de recombinarse con el segmento J en cuestión. Por lo tanto, se requerirá que el segmento génico D tenga yuxtapuesta una RSS en 3’ que coincida con la RSS yuxtapuesta en 5’ del segmento génico J, de tal modo que el segmento génico D y el segmento génico J puedan reordenarse. Además, el segmento génico D requerirá una RSS apropiada yuxtapuesta en 5’ que coincida con la 45 RSS yuxtapuesta en 3’ del segmento génico V, de tal modo que el segmento génico D/J reordenado y el segmento génico V puedan reordenarse, para formar un gen que codifique para un dominio variable.

Una RSS, o secuencia de señal de recombinación, comprende una secuencia heptamérica de ácido nucleico conservada separada por 12 pares de bases (pb) ó 23 pares de bases (pb) de secuencia no conservada, de una 50 secuencia nonamérica de ácido nucleico conservada. Las RSS se usan por las recombinasas para unir segmentos de genes de inmunoglobulina durante el proceso de reordenamiento, siguiendo la regla 12/23. De acuerdo con la regla 12/23, un segmento génico yuxtapuesto con una RSS que tiene un separador de 12 pb (no conservado), se reordena con un segmento génico yuxtapuesto con una RSS que tiene un separador de 23 pb (no conservado); es decir, generalmente no se observan reordenamientos entre segmentos génicos en los que cada uno tiene una RSS 55 con un separador de 12 pb, o donde cada una tiene una RSS con un separador de 23 pb.

En el caso del locus de cadena ligera λ, los segmentos génicos variables (segmentos génicos Vλ) están flanqueados en 3’ (con respecto a la dirección de la transición de la secuencia V) con una RSS que tiene un separador 23-mer, y segmentos génicos de unión (segmentos génicos Jλ) están flanqueados en 5’ (con respecto a la dirección de la transición de la secuencia J) con una RSS que tiene un separador 12-mer. Por lo tanto, los segmentos génicos Vλ y Jλ están flanqueados por RSS que son compatibles con la regla 12/23, y por lo tanto son capaces de recombinarse durante el reordenamiento.

5

Sin embargo, en el locus κ de un organismo silvestre, cada segmento génico Vκ funcional está flanqueado en 3’ por una RSS que tiene un separador 12-mer. Los segmentos génicos Jκ, por lo tanto, tienen separadores 23-mer yuxtapuestos en el lado 5’ del segmento génico Jκ. En el locus de cadena pesada, los segmentos génicos VH están yuxtapuestos en 3’ por una RSS que tiene un separador 23-mer, seguido de un segmento génico DH yuxtapuesto en 5’ y 3’ por un separador 12-mer, y segmentos génicos JH cada uno con un segmento 23-mer yuxtapuesto en el lado 10 5’ del segmento génico JH. En el locus de la cadena pesada, primero ocurre la recombinación D/J, mediada por la RSS de DH en 3’ con el separador 12-mer y la RSS de JH en 3’ con el separador 23-mer, para producir una secuencia D-J reordenada intermedia que tiene una RSS yuxtapuesta en el lado 5’ que tiene una RSS con un separador 12-mer. El segmento génico D-J reordenado que tiene la RSS con el separador 12-mer yuxtapuesta en el lado 5’, entonces, se reordena con el segmento génico VH que tiene la RSS con el separador 23-mer yuxtapuesto en 15 su lado 3’, para formar una secuencia V/D/J reordenada.

En un aspecto, se emplea un segmento génico Vλ, en el locus de cadena pesada con un segmento génico J que es un segmento génico Jλ, donde el segmento génico Vλ comprende una RSS yuxtapuesta en el lado 3’ de la secuencia Vλ, y la RSS comprende un separador 23-mer, y el segmento génico J es un segmento génico Jλ con una 20 RSS yuxtapuesta en su lado 5’ que tiene un separador 12-mer (por ejemplo, tal como se encuentra en la naturaleza).

En un aspecto, se emplea un segmento génico Vλ en el locus de cadena pesada con un segmento génico J que es un segmento génico Jκ o JH, donde la secuencia Vλ tiene yuxtapuesta en su lado 3’ una RSS que comprende un separador 23-mer, y el segmento génico Jκ o JH tiene yuxtapuesta una RSS en su lado 5’, que comprende un 25 separador 12-mer.

En un aspecto, se emplea un segmento génico Vλ en el locus de cadena pesada con un segmento génico DH y un segmento génico J. En un aspecto, el segmento génico Vλ, comprende una RSS yuxtapuesta en el lado 3’ del segmento génico Vλ, con una RSS que tiene un separador 23-mer; el segmento génico DH comprende una RSS 30 yuxtapuesta en el lado 5’ y en el lado 3’ del segmento génico DH, que tiene una RSS que tiene un separador 12-mer, y un segmento génico J que tiene una RSS yuxtapuesta en su lado 5’ que tiene un separador 23-mer, donde el segmento génico J se selecciona de Jλ, Jκ, y JH.

En un aspecto, el segmento génico Vκ se emplea en el locus de cadena pesada con un segmento génico J (sin 35 ningún segmento génico D interviniente), donde el segmento génico Vκ tiene una RSS yuxtapuesta en el lado 3’ del segmento génico Vκ, que comprende una RSS con un separador 12-mer, y el segmento génico J tiene yuxtapuesta en su lado 5’, una RSS con un separador 23-mer, y el segmento génico Jκ se selecciona de un segmento génico Jκ, un segmento génico Jλ y un génico segmento JH. En un aspecto, el segmento génico V y/o el segmento génico J son humanos. 40

En un aspecto, el segmento génico Vκ se emplea en el locus de cadena pesada con un segmento génico D y un segmento génico J, donde el segmento génico Vκ tiene una RSS yuxtapuesta en el lado 3’ del segmento génico Vκ, que comprende una RSS con un separador 12-mer, el segmento génico D tiene yuxtapuesta en su lado 5’ y en su lado 3’, una RSS separada 23-mer, y el segmento génico J tiene yuxtapuesta en su lado 5’, una RSS separada 12-45 mer. En un aspecto, el segmento génico J se selecciona de un segmento génico Jκ, un segmento génico Jλ y un segmento génico JH. En un aspecto, el segmento génico V y/o el segmento génico J son humanos.

Un segmento génico Jλ con una RSS que tiene un separador 23-mer yuxtapuesta en su extremo 5’, o un segmento génico Jκ o JH con una RSS que tiene un separador 12-mer yuxtapuesta en su extremo 5’, se prepara usando 50 cualquiera de los métodos adecuados para preparar secuencias de ácido nucleico que se conocen en la técnica. Un método adecuado para preparar un segmento génico J que tenga una RSS yuxtapuesta en 5’, donde la RSS tiene un separador seleccionado (por ejemplo, 12-mer ó 23-mer), es sintetizar químicamente un ácido nucleico que comprende el heptámero, el nonámero, y el separador seleccionado, y fusionarlo con una secuencia de segmento génico J que se sintetiza químicamente o se clona de una fuente adecuada (por ejemplo, una fuente de secuencia 55 humana), y emplear la secuencia del segmento génico J fusionado y una RSS en un vector de direccionamiento para dirigir la RSS-J a un sitio adecuado.

Un segmento génico D con una RSS separada 23 yuxtapuesta en 5’ y 3’ puede hacerse mediante cualquier método conocido en la técnica. Un método comprende sintetizar químicamente la RSS 23-mer en 5’ y la secuencia del segmento génico y la RSS 23-mer en 3’, y colocar el segmento génico D flanqueado por RSS en un vector adecuado. El vector puede dirigirse para reemplazar uno o más segmentos génicos D de ratón con un segmento génico D 5 humano con secuencias de RSS 12-mer yuxtapuestas en los lados 5’ y 3’, o dirigirse para insertarse en, por ejemplo, un locus humanizado en una posición entre un segmento génico V humano y un segmento génico J humano o de ratón.

Se conocen en la técnica nonámeros y heptámeros adecuados para la construcción de RSS (por ejemplo, véanse 10 Janeway’s Immunobiology, 7ª ed., Murphy et al., (2008, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC) en la página 148, fig. 4.5). Las secuencias de separador no conservadas adecuadas incluyen, por ejemplo, secuencias de separador observadas en secuencias RSS en loci de inmunoglobulina humana o de ratón.

Proteínas de unión biespecíficas 15

Las proteínas de unión descritas en el presente documento, y las secuencias de nucleótidos que las codifican, se pueden emplear para preparar proteínas de unión multiespecíficas, por ejemplo proteínas de unión biespecíficas. En este aspecto, un primer polipéptido que consiste esencialmente en un primer dominio VL fusionado con una región CH, se puede asociar a un segundo polipéptido que consiste esencialmente en un segundo dominio VL fusionado 20 con una región CH. Cuando el primer dominio VL y el segundo dominio VL se unen específicamente a un epítopo diferente, se puede preparar una molécula de unión biespecífica empleando los dos dominios VL. La región CH puede ser igual o diferente. En un aspecto, por ejemplo una de las regiones CH puede ser modificada para eliminar un determinante de unión a proteína A, mientras que la otra región constante de cadena pesada no es modificada. Esta disposición particular simplifica el aislamiento de la proteína de unión biespecífica de, por ejemplo, una mezcla 25 de homodímeros (por ejemplo, homodímeros del primer o el segundo polipéptidos).

En un aspecto, los métodos y composiciones que se describen en el presente documento se usan para preparar proteínas de unión biespecíficas. En este aspecto, un primer dominio VL que está fusionado a una región CH y un segundo dominio VL que está fusionado a una región CH, se clonan cada uno independientemente en marco con 30 una secuencia de IgG humana del mismo isotipo (por ejemplo, una lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana). El primer dominio VL se une específicamente a un primer epítopo, y el segundo dominio VL se une específicamente a un segundo epítopo. El primer y segundo epítopos pueden estar en antígenos diferentes, o en el mismo antígeno.

En un aspecto, el isotipo IgG de la región CH fusionada al primer dominio VL y el isotipo IgG de la región CH 35 fusionada al segundo dominio VL, son el mismo isotipo, pero difieren en que un isotipo IgG comprende al menos una sustitución de aminoácido. En un aspecto, la al menos una sustitución de aminoácido hace que la cadena pesada portadora de la sustitución sea incapaz o sustancialmente incapaz de unirse a la proteína A, en comparación con la cadena pesada que carece de la sustitución.

40

En un aspecto, la primera región CH comprende un primer dominio CH3 de una IgG humana, que se selecciona de IgG1, lgG2, e lgG4; y la segunda región CH comprende un segundo dominio CH3 de una IgG humana que se selecciona de IgG1, lgG2 e IgG4, donde el segundo dominio CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 con la proteína A.

45

En un aspecto, el segundo dominio CH3 comprende una modificación 435R, numerada de acuerdo con el índice UE de Kabat. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende además una modificación 436F, numerada de acuerdo con el índice UE de Kabat.

En un aspecto, el segundo dominio CH3 es el de una IgG1 humana que comprende una modificación que se 50 selecciona del grupo que consiste en D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I, numeradas de acuerdo con el índice UE de Kabat.

En un aspecto, el segundo dominio CH3 es el de una lgG2 humana que comprende una modificación que se selecciona del grupo que consiste en N384S, K392N, y V422I, numeradas de acuerdo con el índice UE de Kabat. 55

En un aspecto, el segundo dominio CH3 es el de una lgG4 humana que comprende una modificación que se selecciona del grupo que consiste en Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I, numeradas de acuerdo con el índice UE de Kabat.

En un aspecto, la proteína de unión comprende regiones CH que tienen una o más modificaciones como se menciona en el presente documento, donde la región constante de la proteína de unión es no inmunógena o sustancialmente no inmunógena en un ser humano. En un aspecto específico, las regiones CH comprenden secuencias de aminoácidos que no presentan un epítopo inmunógeno en un ser humano. En otro aspecto 5 específico, la proteína de unión comprende una región CH que no se encuentra en una cadena pesada humana de tipo silvestre, y la región CH no comprende una secuencia que genere un epítopo de células T.

Ejemplos

10

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir cómo preparar y utilizar los métodos y composiciones que se describen en el presente documento, y no pretenden limitar el alcance de la invención según se define en las reivindicaciones. A menos que se indique otra cosa, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es atmosférica o casi atmosférica.

15

Ejemplo I

Introducción de segmentos génicos de cadena ligera en un locus de cadena pesada

Se prepararon varias construcciones de direccionamiento usando tecnología de ingeniería genética de 20 VELOCIGENE® (véanse, por ejemplo, la Pat. de Estados Unidos n.º 6.586.251 y Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. 25 Nat Biotechnol 21, 652-659), para modificar bibliotecas de Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) genómicos murinos. El ADN BAC murino se modificó por recombinación homologa para inactivar el locus de cadena pesada murino endógeno, mediante la eliminación dirigida a diana de los segmentos génicos VH, DH y JH, para asegurar la inserción de secuencias de genes de cadena ligera κ de línea germinal humana no reordenados (parte superior de la fig. 2). 30

Brevemente, el locus de cadena pesada de ratón fue eliminado en dos eventos de direccionamiento sucesivos usando una recombinación mediada por recombinasa. El primer evento de direccionamiento incluyó un direccionamiento en el extremo 5' del locus de cadena pesada de ratón, utilizando un vector de direccionamiento que comprende, de 5' a 3', un brazo de homología murino 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa, un casete de 35 neomicina, y un brazo de homología 3'. Los brazos de homología 5' y 3' contenían la secuencia 5' del locus de cadena pesada de ratón. El segundo evento de direccionamiento incluyó un direccionamiento en el extremo 3' del locus de cadena pesada de ratón en la región de los segmentos génicos JH, utilizando un segundo vector de direccionamiento que contenía, de 5' a 3', un brazo de homología de ratón 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa, un casete de higromicina, un tercer sitio de 40 reconocimiento de recombinasa, y un brazo de homología de ratón 3'. Los brazos de homología 5' y 3' contenían una secuencia que flanqueaba los segmentos génicos JH de ratón y en dirección 5' del potenciador intrónico, y las regiones constantes. Las células ME positivas que contenían un locus de cadena pesada modificado hacia el cual estaban dirigidos ambos vectores de direccionamiento (como se ha descrito anteriormente), se confirmaron por cariotipado. Después, se aisló el ADN de las células ME de doble diana y se sometió a tratamiento con una 45 recombinasa, mediando de esta manera la deleción de ADN genómico del locus de cadena pesada de ratón, entre el sitio de reconocimiento de la recombinasa 5' en el primer vector de direccionamiento, y el sitio de reconocimiento de recombinasa 5' en el segundo vector de direccionamiento, dejando un solo sitio de reconocimiento de recombinasa y el casete de higromicina flanqueados por dos sitios de reconocimiento de recombinasa (véase la parte superior de la fig. 2). Por lo tanto, se creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía genes CH intactos, para 50 insertar progresivamente segmentos génicos de línea germinal κ humana, de una manera precisa mediante el uso de vectores de direccionamiento que se describen a continuación.

Se diseñaron cuatro vectores de direccionamiento por separado, para insertar progresivamente 40 segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, en el locus de cadena pesada de ratón inactivado 55 (descrito anteriormente), empleando las técnicas moleculares estándar reconocidas en la técnica (fig. 2). Los segmentos génicos κ humanos utilizados para el diseño por ingeniería de las cuatro construcciones de direccionamiento, se encuentran en la naturaleza de manera contigua proximal al locus de cadena ligera κ humana de línea germinal (fig. 1B y Tabla 1).

Se diseñó por ingeniería un fragmento genómico humano de ~110.499 pb que contenía los primeros seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, para que incluyera un sitio PI-SceI de 431 pb aguas abajo (3') del segmento génico Jκ5 humano. Otro sitio Pl-Scel se diseñó por ingeniería en el extremo 5' de un fragmento genómico de ~7.852 pb, que contenía el potenciador intrónico de cadena pesada de ratón, la región de 5 conmutación IgM (Sµ) y el gen IgM del locus de cadena pesada de ratón. Este fragmento de ratón se usó como un brazo de homología 3', al ligarlo al fragmento humano de ~110,5 kb, lo que creó una unión 3' que contenía de 5' a 3', la secuencia genómica de ~110,5 kb del locus de cadena ligera κ humana que contenía los primeros seis segmentos génicos Vκ consecutivos y cinco segmentos génicos Jκ, un sitio Pl-Scel, una secuencia de cadena pesada de ratón de ~7.852 pb que contenía el potenciador intrónico de ratón, Sµ y el gen constante IgM de ratón. Aguas arriba (5') 10 del segmento génico Vκ1-6 humano, se encontraba una secuencia κ humana adicional de 3.710 pb, antes del inicio del brazo de homología de ratón 5', que contenía 19.752 pb de ADN genómico de ratón correspondiente a la secuencia 5' del locus de cadena pesada de ratón. Entre el brazo de homología 5' y el inicio de la secuencia humana κ, había un casete de neomicina flanqueado por tres sitios de reconocimiento de recombinasa (véase el Vector de direccionamiento 1, fig. 2). El vector de direccionamiento final para la primera inserción de la secuencia κ humana, 15 de 5' a 3', incluía un brazo de homología 5' que contenía ~20 kb de secuencia genómica de ratón en 5' del locus de la cadena pesada, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un casete de neomicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa (R3), una secuencia κ genómica humana de ~110,5 kb que contenía los primeros seis segmentos génicos Vκ humanos consecutivos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, un sitio Pl-Scel, y un brazo de homología 3' que contenía ~8 kb de secuencia 20 genómica de ratón, incluyendo el potenciador intrónico, Sµ y el gen constante IgM de ratón (véase la fig. 2, Vector de direccionamiento 1). La recombinación homologa con este vector de direccionamiento, creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a los genes constantes de cadena pesada de ratón endógenos, que, después de la recombinación, dio lugar a una cadena pesada híbrida (es decir, un dominio Vκ humano y una región CH de 25 ratón).

Tabla 1

Vector de direccionamiento: Tamaño de la secuencia κ humana Segmentos génicos κ humanos añadidos

Vκ: Jκ

1: ~110,5 kb 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6 1 - 5

2: ~140 kb 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16 -

3: ~161 kb 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, 2-30 -

4: ~90 kb 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, 2-40 -

Introducción de diez segmentos génicos Vκ humanos adicionales en un locus de cadena pesada híbrido. Se diseñó por ingeniería un segundo vector de direccionamiento para la introducción de 10 segmentos génicos Vκ humanos adicionales en el locus de cadena pesada de ratón modificado que se ha descrito anteriormente (véase la 5 fig. 2, Vector de direccionamiento 2). Se diseñó por ingeniería un fragmento genómico humano de 140.058 pb que contenía 12 segmentos génicos Vκ humanos consecutivos procedentes del locus de cadena ligera κ humano, con un brazo de homología 5' que contenía la secuencia genómica de ratón en 5' del locus de cadena pesada de ratón y un brazo de homología 3' que contenía una secuencia κ genómica humana. Aguas arriba (5') del segmento génico Vκ1-16 humano, había una secuencia κ humana adicional de 10.170 pb, antes del inicio del brazo de homología de 10 ratón 5', el cual era el mismo brazo de homología 5' utilizado para la construcción del Vector de direccionamiento 1 (véase la fig. 2). Entre el brazo de homología 5' y el inicio de la secuencia κ humana, había un casete de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El brazo de homología 3' incluía un solapamiento de 31.165 pb de la secuencia κ genómica humana correspondiente al extremo 5' equivalente del fragmento de ~110,5 kb de la secuencia κ genómica humana del Vector de direccionamiento 1 (fig. 2). El vector de direccionamiento final 15 para la inserción de 10 segmentos génicos Vκ humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un brazo de homología 5' que contenía ~20 kb de secuencia genómica de ratón en 5' del locus de la cadena pesada, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un casete de higromicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), y una secuencia κ genómica humana de ~140 kb, que contenía 12 segmentos génicos Vλ humanos consecutivos, ~31 kb de los cuales se solapan con el extremo 5' de la secuencia κ humana del Vector de 20 direccionamiento 1 y sirven como brazo de homología 3' para esta construcción de direccionamiento. La recombinación homologa con este vector de direccionamiento creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía 16 segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a los genes constantes de cadena pesada de ratón que, después de la recombinación, dio lugar a la formación de una cadena pesada híbrida. 25

Introducción de catorce segmentos génicos Vκ humanos adicionales en un locus de cadena pesada híbrida. Se diseñó por ingeniería un tercer vector de direccionamiento para la introducción de 14 segmentos génicos Vκ humanos adicionales en el locus de cadena pesada de ratón modificado que se ha descrito anteriormente (véase la fig. 2, Vector de direccionamiento 3). Se diseñó por ingeniería un fragmento genómico humano de 160.579 pb que 30 contenía 15 segmentos génicos Vκ humanos consecutivos con un brazo de homología 5' que contenía la secuencia genómica de ratón en 5' del locus de cadena pesada de ratón y un brazo de homología 3' que contenía la secuencia κ genómica humana. Aguas arriba (5') del segmento génico Vκ2-30 humano, había una secuencia κ humana adicional de 14.687 pb antes del inicio del brazo de homología murino 5', el cual era el mismo brazo de homología 5' utilizado para los dos vectores de direccionamiento anteriores (descritos anteriormente, véase también la fig. 2). 35 Entre el brazo de homología 5' y el inicio de la secuencia κ humana, había un casete de neomicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El brazo de homología 3' incluía un solapamiento de 21.275 pb de la secuencia κ genómica humana, correspondiente al extremo 5' equivalente del fragmento de ~140 kb de la secuencia κ genómica humana del Vector de direccionamiento 2 (fig. 2). El vector de direccionamiento final para la inserción de 14 segmentos génicos Vκ humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un brazo de homología 5' que contenía ~20 kb de 40 una secuencia genómica de ratón en 5' del locus de la cadena pesada de ratón, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un casete de neomicina, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa (R2), y ~161 kb de una secuencia κ genómica humana que contenía 15 segmentos génicos Vκ humanos, ~21 kb de los cuales se solapan con el extremo 5' de la secuencia κ humana del Vector de direccionamiento 2 y sirven como brazo de homología 3' para esta construcción de direccionamiento. La recombinación homologa con este vector de 45 direccionamiento creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía 30 segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a los genes constantes de cadena pesada de ratón que, después de la recombinación, da lugar a laformación de una cadena pesada κ quimérica.

Introducción de diez segmentos génicos Vκ humanos adicionales en un locus de cadena pesada híbrida. Se 5 diseñó por ingeniería un cuarto vector de direccionamiento para la introducción de 10 segmentos génicos Vκ humanos adicionales en el locus de cadena pesada de ratón modificado que se ha descrito anteriormente (véase la fig. 2, Vector de direccionamiento 4). Se diseñó por ingeniería un fragmento genómico humano de 90.398 pb, que contenía 16 segmentos génicos Vκ humanos consecutivos, con un brazo de homología 5' que contenía una secuencia genómica de ratón en 5' del locus de cadena pesada de ratón, y un brazo de homología 3' que contenía 10 una secuencia κ genómica humana. Aguas arriba (5') del segmento génico Vκ2-40 humano, había una secuencia κ humana adicional de 8.484 pb antes del inicio del brazo de homología de ratón 5', el cual era el mismo brazo de homología 5' que el de los vectores de direccionamiento anteriores (anteriormente descritos, véase también la fig. 2). Entre el brazo de homología 5' y el inicio de la secuencia κ humana, había un casete de higromicina flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. El brazo de homología 3' incluía un solapamiento de 61.615 pb de la 15 secuencia κ genómica humana, que correspondía al extremo 5' equivalente del fragmento de ~160 kb de la secuencia κ genómica humana del Vector de direccionamiento 3 (fig. 2). El vector de direccionamiento final para la inserción de 10 segmentos génicos Vκ humanos adicionales, de 5' a 3', incluía un brazo de homología 5' que contenía ~20 kb de una secuencia genómica de ratón en 5' del locus de la cadena pesada de ratón, un primer sitio de reconocimiento de recombinasa (R1), un casete de higromicina, un segundo sitio de reconocimiento de 20 recombinasa (R2), y ~90 kb de una secuencia κ genómica humana que contenía 16 segmentos génicos Vκ humanos, ~62 kb de los cuales se solapan con el extremo 5' de la secuencia κ humana del Vector de direccionamiento 3, y sirven como el brazo de homología 3 para esta construcción de direccionamiento. La recombinación homologa con este vector de direccionamiento creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía 40 segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a 25 los genes constantes de cadena pesada de ratón que, después de la recombinación, da lugar a la formación de una cadena pesada κ quimérica (fig. 3).

Usando un enfoque similar al que se ha descrito anteriormente, se construyeron otras combinaciones de dominios variables de cadena ligera humanos en el contexto de regiones constantes de cadena pesada de ratón. Se pueden 30 obtener dominios variables de cadena ligera adicionales a partir de segmentos génicos Vλ y Jλ humanos (fig. 4A y 4B).

El locus de la cadena ligera λ humana se extiende en más de 1.000 kb y contiene más de 80 genes que codifican segmentos variables (V) o de unión (J). Entre los 70 segmentos génicos Vλ del locus de cadena ligera λ humana, 35 cualquier fracción entre 30 y 38 parecen ser segmentos génicos funcionales de acuerdo con los informes publicados. Las 70 secuencias Vλ se disponen en tres grupos, todos los cuales contienen diferentes números de distintos grupos de familias génicas V (grupos A, B y C). En el locus de la cadena ligera λ humana, más de la mitad de todos los dominios Vλ observados están codificados por los segmentos génicos 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, y 3-21. Existen siete segmentos génicos Jλ, sólo cuatro de los cuales se consideran como segmentos génicos Jλ generalmente 40 funcionales ↓ Jλ1, Jλ2, Jλ3, y Jλ7. En algunos alelos, se ha indicado un quinto par de segmentos génicos Jλ-Cλ, como un pseudogen (Cλ6). La incorporación de múltiples segmentos génicos Jλ humanos en un locus de cadena pesada híbrida, como se describe en el presente documento, se construye mediante síntesis de novo. De esta manera, un fragmento genómico que contiene múltiples segmentos génicos Jλ humanos en configuración de línea germinal, se diseña por ingeniería con múltiples segmentos génicos Vλ humanos y permite la recombinación V-J 45 normal en el contexto de una región constante de cadena pesada.

El acoplamiento de dominios variables de cadena ligera con regiones constantes de cadena pesada, representa una fuente potencialmente rica de diversidad para generar proteínas de unión VL únicas con regiones VL humanas en animales no humanos. La explotación de esta diversidad del locus de cadena ligera λ humana (o del locus κ 50 humano, como se ha descrito anteriormente) en ratones, da como resultado el diseño por ingeniería de cadenas pesadas híbridas únicas, y da lugar a otra dimensión de proteínas de unión al repertorio inmunitario de animales genéticamente modificados y su posterior uso como una plataforma de próxima generación para la generación de productos terapéuticos.

55

Adicionalmente, los segmentos génicos DH y JH (o Jκ) humanos pueden incorporarse con cualquiera de los segmentos génicos Vκ o Vλ humanos para construir loci híbridos novedosos que darán lugar, después de la recombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos Drecombinación, a nuevos dominios variables diseñados por ingeniería (fig. 5A y 5B). En este último caso, las combinaciones diseñadas por ingeniería de los segmentos génicos que normalmente no están contenidos en un único locus, requerirá una atención específica a las secuencias de señal de recombinación (RSS) que están asociadas a los respectivos segmentos génicos, de tal modo que se pueda lograr una recombinación normal cuando éstos se recombinen en un solo locus. Por ejemplo, se sabe que la recombinación V(D)J está guiada por secuencias 5 de ADN no codificantes conservadas, conocidas como secuencias heptaméricas y nonaméricas que se encuentran adyacentes a cada segmento génico en la localización precisa en la que se produce la recombinación. Entre estas secuencias de ADN no codificantes, hay regiones separadoras no conservadas de 12 ó 23 pares de bases (pb) de longitud. Generalmente, la recombinación sólo ocurre en segmentos génicos localizados en el mismo cromosoma y los segmentos génicos flanqueados, por un separador de 12 pb pueden ser unidos a un segmento génico 10 flanqueado por un separador de 23 pb, es decir, la regla 12/23, aunque se ha observado la unión de dos segmentos génicos D

Por lo tanto, el uso de la estrategia que se ha señalado anteriormente para la incorporación de segmentos génicos de cadena ligera κ humanos en un locus de cadena pesada endógeno permite el uso de otras combinaciones de segmentos génicos de cadena ligera λ humana, así como segmentos génicos de cadena pesada humana 20 específicos (por ejemplo, DH y JH) y combinaciones de los mismos.

Ejemplo II

Identificación de células ME dirigidas portadoras de segmentos génicos de cadena ligera humana en un 25 locus de cadena pesada endógeno

El ADN BAC dirigido que se preparó en los Ejemplos anteriores, se utilizó para electroporar células ME murinas para crear células ME modificadas para la generación de ratones quiméricos que expresen proteínas de unión VL (es decir, segmentos génicos de cadena ligera κ humanos unidos operativamente a regiones constantes de cadena 30 pesada de ratón). Las células ME que contenían una inserción de segmentos génicos de cadena ligera κ humana no reordenados se identificaron mediante el ensayo de PCR cuantitativa, TAQMAN® (Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9: 43-48). Se diseñaron conjuntos de cebadores específicos y sondas para la inserción de secuencias κ humanas y los casetes de selección asociados, la pérdida de secuencias de cadena pesada de ratón y la retención de secuencias de ratón que flanqueaban el locus de cadena pesada endógeno. 35

Las células ME portadoras de los segmentos génicos de cadena ligera κ humanos pueden transfectarse con una construcción que exprese una recombinasa con el fin de eliminar cualquier casete de selección no deseado que se haya introducido por la inserción de la construcción de direccionamiento que contiene los segmentos génicos κ humanos. Opcionalmente, el casete de selección puede eliminarse al aparear los animales con ratones que 40 expresen la recombinasa (por ejemplo, documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de selección se retiene en el ratón.

Ejemplo III

45

Generación y análisis de ratones que expresan proteínas de unión VL

Las células ME dirigidas que se han descrito anteriormente se usaron como células ME donantes y se introdujeron en embriones de ratón en estadío de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véanse por ejemplo, Pat. de Estados Unidos n.º 7.294.754 y Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., 50 Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99). Se identificaron segmentos génicos κ humanos que portaban independientemente VELOCIMICE® (ratones F0 totalmente derivados de la célula ME donante) en el locus de cadena pesada de ratón mediante una genotipificación utilizando una modificación del ensayo de alelos 55 (Valenzuela et al., supra), que detectó la presencia de los segmentos génicos κ humanos únicos en el locus de cadena pesada endógena (supra). Las crías se genotipifican, y se selecciona una cría heterocigota para el locus del gen de cadena pesada híbrido para caracterizar la expresión de proteínas de unión VL.

Citometría de Flujo. La introducción de segmentos génicos de cadena ligera κ humana en locus de cadena pesada de ratón se realizó en una línea ME F1 (F1H4; Valenzuela et al. 2007, supra) derivada de embriones heterocigotos 129S6/SvEvTac y C57BL/6NTac que contenían además un reemplazo in situ de los segmentos génicos de cadena ligera κ de ratón por segmentos génicos de cadena ligera κ humana (documento US 6.596.541). Los segmentos 5 génicos variables de línea germinal de cadena ligera κ humana se dirigen al alelo 129S6, que es portador del haplotipo lgMa, mientras que el alelo C576BL/6N de ratón no modificado es portador del haplotipo lgMb. Estas formas alélicas de IgM pueden distinguirse por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos para los polimorfismos encontrados en los alelos lgMa o IgM b. Los ratones heterocigotos portadores de segmentos génicos de cadena ligera κ humana en el locus de cadena pesada endógeno, como se describió en el Ejemplo I, se evaluaron con 10 respecto a la expresión de proteínas de unión VL humanas usando citometría de flujo.

Brevemente, se extrajo sangre de grupos de ratones (n = 6 por grupo) y se mezcló usando portaobjetos de vidrio. Se usaron ratones C57BL/6 y Balb/c como grupos de control. Tras la lisis de glóbulos rojos (RBC) con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville), las células se resuspendieron en tampón de tinción BD Pharmingen FACS y se 15 bloquearon con anti-CD16/32 de ratón (BD Pharmingen). Los linfocitos se tiñeron con anti-IgMb de ratón-FITC (BD Pharmingen), anti-IgMa de ratón-PE (BD Pharmingen), anti-CD19 de ratón (Clon 1D3; BD Biosciences), y anti-CD3 de ratón (17A2; BIOLEGEND®) seguido de fijación con BD CYTOFIX™, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sedimentos celulares finales se resuspendieron en tampón de tinción y se analizaron usando un software BD FACSCALIBUR™ y BD CELLQUEST PRO™. La Tabla 2 expone los valores porcentuales medios para 20 la expresión de células B (CD19+), células T (CD3+), cadena pesada híbrida (CD19+IgMa+) y cadena pesada de tipo silvestre (CD19+IgMb+) observada en grupos de animales portadores de cada modificación genética.

En un experimento similar, el contenido de células B de los compartimentos del bazo, sangre y médula ósea de ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos 25 operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón (que se describen en el Ejemplo I, fig. 2), se analizó con respecto al progresión a través del desarrollo de células B, usando citometría de flujo de diversos marcadores de superficie celular.

Brevemente, dos grupos (n = 3 cada uno, hembras de 8 semanas de edad) de ratones de tipo silvestre y 30 homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón, se sacrificaron y se les extrajo sangre, el bazo y la médula ósea. La sangre se recogió en tubos microtainer con EDTA (BD Biosciences). La médula ósea se recogió de los fémures, mediante un lavado con medio RPMI completo (medio RPMI complementado con suero fetal de ternera, piruvato sódico, HEPES, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y gentamicina). Los RBC de preparaciones 35 del bazo y de médula ósea se lisaron con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville), seguido de un lavado con medio RPMI completo.

Se incubaron células (1 x 106) con anti-CD16/CD32 de ratón (2.4G2, BD) sobre hielo durante diez minutos, seguido de marcado con el siguiente cóctel de anticuerpos durante treinta minutos sobre hielo: anti-CD43 de ratón-FITC 40 (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Médula ósea: células B inmaduras (B220intIgM+), células B maduras (B220hiIgM+), células pro-B (CD19+ckit+CD43+), células pre-B (CD19+ckit–CD43–), células pre-B (CD19+CD43intIgM+/–), células B inmaduras (CD19+CD43–IgM+/-). Sangre y bazo: células B (CD19+), células B maduras (CD19+IgMintIgDhi), células B de 45 transición/inmaduras (CD19+IgMhiIgDint).

Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Las fig- 6A, 6B y 6C muestran los resultados para el compartimento esplénico. Las fig. 7A-7G muestran los resultados para el 50 compartimiento de médula ósea. Los resultados obtenidos para el compartimiento de sangre de cada grupo de ratones demostraron resultados similares en comparación con el compartimiento esplénico de cada grupo (datos no mostrados).

En un experimento similar, se analizó el contenido de células B de los compartimentos del bazo, sangre y médula 55 ósea de ratones homocigotos para treinta segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón (descritos en el Ejemplo I, fig. 2), con respecto a la progresión a través del desarrollo de células B usando citometría de flujo de diversos marcadores de superficie celular.

Brevemente, dos grupos de ratones (N = 3 cada uno, hembras de 6 semanas de edad) que contenían un locus de cadena pesada de tipo silvestre y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos (TS), y ratones homocigotos para treinta segmentos génicos hVκ y cinco segmentos génicos Jκ, y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos 5 (30hVκ-5hJκ HO) se sacrificaron y se obtuvieron los bazos y médula ósea. Se prepararon la médula ósea y los esplenocitos para una tinción con diversos marcadores de superficie celular (como se ha descrito anteriormente).

Se incubaron las células (1 x 106) con anti-CD16/CD32 de ratón (2.4G2, BD Biosciences) sobre hielo durante diez minutos, seguido de marcado con paneles de médula ósea o esplenocitos durante treinta minutos sobre hielo. Panel 10 de médula ósea: anti-CD43 de ratón-FITC (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Panel de médula ósea y bazo: FITC-Igκ anti-ratón (187.1 BD Biosciences), PE-Igλ (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD). Médula ósea: células B inmaduras (B220intIgM+), células B maduras (B220hiIgM+), células pro-B 15 (CD19+ckit+CD43+), células pre-B (CD19+ckit-CD43-), células B Igκ+ inmaduras (B220intIgM+Igκ+Igλ–), células B Igλ+ inmaduras (B220intIgM+Igκ–Igλ+), células B Igκ+ maduras (B220hiIgM+Igκ+Igλ–), células B Igλ+ maduras (B220hiIgM+Igκ–Igλ+). Bazo: células B (CD19+), células B maduras (CD19+IgDhiIgMint), células B de transición/inmaduras (CD19+IgDintIgMhi). Médula ósea y bazo: células B Igκ+ (CD19+Igκ+Igλ–), células B Igλ+ (CD19+ Igκ–Igλ+). 20

Después de la tinción, las células se lavaron y se fijaron con formaldehído al 2%. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizó con el software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Los resultados demostraron patrones de tinción y poblaciones de células similares para los tres compartimentos en comparación con los ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos (descritos 25 anteriormente). Sin embargo, estos ratones demostraron una pérdida de expresión de cadena ligera λ endógena, tanto en el compartimiento esplénico como en el de médula ósea (fig. 8A y 8B, respectivamente), a pesar de que el locus de cadena ligera λ endógeno está intacto en estos ratones. Esto podría reflejar una incapacidad de los dominios de cadena ligera κ humanos reordenados, en el contexto de regiones constantes de cadena pesada, para emparejarse o asociarse con dominios de cadena ligera λ murinos, lo que conduce a la deleción de células Igλ+. 30

Expresión de isotipo. Se determinó la inmunoglobulina M (IgM) y la inmunoglobulina G1 (lgG1) total y de superficie (es decir, unida a la membrana), en ratones homocigotos para loci humanos de genes variables de cadena pesada y de cadena ligera κ (VELCOIMMUNE® Humanized Mice, véase el documento US 7.105.348) y ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y 5 segmentos génicos Jκ humanos, diseñados por ingeniería en el locus 35 de cadena pesada endógeno ((6hVκ-5hJκ HO), mediante un ensayo de PCR cuantitativa utilizando sondas TAQMAN® (como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo II).

Brevemente, las células B CD19+ se purificaron a partir de los bazos de grupos de ratones (n = 3 a 4 ratones por grupo), utilizando microperlas CD19 de ratón (Miltenyi Biotec), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El 40 ARN total se purificó utilizando el Mini kit RNEASY™ (Qiagen). El ARN genómico se eliminó usando un tratamiento en columna de ADNasa sin ARNasa (Qiagen). Se sometieron a transcripción inversa aproximadamente 200 ng de ARNm para obtener ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Invitrogen) y después se amplificó con la mezcla máster de PCR universal TAQMAN® (Applied Biosystems), usando el sistema de detección de secuencia ABI 7900 (Applied Biosystems). Se emplearon combinaciones únicas de cebador/sonda para determinar 45 específicamente la expresión de las formas total, de superficie (es decir, transmembrana) y secretadas de los isotipos IgM e lgG1 (Tabla 3). La expresión relativa se normalizó con respecto a la región constante κ de ratón (mCκ).

Tabla 2

Genotipo de ratón: % de CD3 % de CD19 % de IgMa % de IgMb

C57BL/6: 22 63 0 100

Balb/c: 11 60 100 0

6hVκ-5hJκ HET: 43 30 7 85

16hVκ-5hJκ HET: 33 41 7 81

50

Tabla 3

Isotipo: Secuencia (5’-3’) SEQ ID NOs:

IgM de superficie: sentido: GAGAGGACCG TGGACAAGTC antisentido: TGACGGTGGT GCTGTAGAAG sonda: ATGCTGAGGA GGAAGGCTTT GAGAACCT 1 2 3

IgM total: sentido: GCTCGTGAGC AACTGAACCT antisentido: GCCACTGCAC ACTGATGTC sonda: AGTCAGCCAC AGTCACCTGC CTG 4 5 6

IgG1 de superficie: sentido: GCCTGCACAA CCACCATAC antisentido: GAGCAGGAAG AGGCTGATGA AG sonda: AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGG 7 8 9

IgG1 total: sentido: CAGCCAGCGG AGAACTACAA G antisentido: GCCTCCCAGT TGCTCTTCTG sonda: AACACTCAGC CCATCATGGA CACA 10 11 12

Cκ: sentido: TGAGCAGCAC CCTCACGTT antisentido: GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTT sonda: ACCAAGGACG AGTATGAA 13 14 15

Los resultados del ensayo de PCR TAQMAN® cuantitativo demostraron una disminución de la IgM total y de la IgG1 total. Sin embargo, la relación de las formas secretada frente a superficial de IgM e IgG 1 pareció normal en comparación con los ratones humanizados VELCOIMMUNE® (datos no mostrados). 5

Análisis del uso del segmento génico κ humano y la unión Vκ-Jκ. Ratones sin tratar homocigotos para treinta segmentos génicos hVκ y cinco segmentos génicos Jκ y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos (30hVκ-5hJκ HO) se analizaron con respecto a reordenamientos Vκ- Jκ humanas únicas en la cadena pesada de ratón (IgG), mediante una reacción en cadena de 10 polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR) usando ARN aislado de esplenocitos.

Brevemente, se recogieron los bazos y se perfundieron con 10 ml de RPMI-1640 (Sigma) con HI-FBS al 5% en bolsas desechables estériles. Cada bolsa que contenía un único bazo se colocó en un STOMACHER™ (Seward) y se homogeneizó a una configuración media durante 30 segundos. Los bazos homogeneizados se filtraron utilizando 15 un filtro celular de 0,7 µm y después se sedimentaron con una centrífuga (1.000 rpm durante 10 minutos) y los RBC se lisaron en BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) durante tres minutos. Los esplenocitos se diluyeron con RPMI-1640 y se centrifugaron de nuevo, seguido de resuspensión en 1 ml de PBS (Irvine Scientific). El ARN se aisló de los esplenocitos sedimentados usando técnicas convencionales conocidas en la técnica.

20

La RT-PCR se realizó en ARN de esplenocitos usando cebadores específicos para segmentos génicos hVκ humanos y la IgG de ratón. El cebador de IgG de ratón se diseñó de tal forma que fuera capaz de amplificar ARN obtenido de todos los isotipos de IgG de ratón. Los productos de las PCR se purificaron en gel y se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) y se secuenciaron con cebadores M13 directos (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO: 16) y M13 inversos (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO: 17) localizados en el vector en 25 localizaciones que flanqueaban el sitio de clonación. El uso de los segmentos génicos Vκ y Jκ humanos entre doce clones seleccionados se muestra en la Tabla 4. La fig. 9 muestra la secuencia nucleotídica de la unión hVκ-hJκ-mIgG para los doce clones RT-PCR seleccionados.

Como se muestra en este Ejemplo, los ratones homocigotos para seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco 30 segmentos génicos Jκ humanos, u homocigotos para treinta segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos, unidos operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón, demostraron la expresión de dominios variables de cadena ligera humanos a partir de un locus de cadena pesada modificado que contenía segmentos génicos variables de cadena ligera en su configuración de línea germinal. Se observó en estos ratones la progresión a través de los diversos estadíos del desarrollo de células B, indicando múltiples eventos de 35 recombinación productiva que involucraron a los segmentos génicos variables de cadena ligera de un locus de cadena pesada endógeno y la expresión de tales cadenas pesadas híbridas (es decir, la región variable de cadena ligera humana unida a una región constante de cadena pesada), como parte del repertorio de anticuerpos.

Tabla 4

Clon: Cadena pesada híbrida SEQ ID NO:

Vκ: Jκ CH

1E: 1-5 4 IgG2A/C 18

1G: 1-9 4 IgG2A/C 19

1A: 1-16 5 IgG3 20

2E: 1-12 2 IgG1 21

1C: 1-27 4 IgG2A/C 22

2H: 2-28 1 IgG1 23

3D: 3-11 4 IgG1 24

3A: 3-20 4 IgG2A/C 25

4B: 4-1 5 IgG2A/C 26

4C: 4-1 2 IgG3 27

5A: 5-2 2 IgG2A/C 28

5D: 5-2 1 IgG1 29

Ejemplo IV

Propagación de ratones que expresan proteínas de unión VL

5

Para crear una nueva generación de proteínas de unión VL, los ratones portadores de los segmentos génicos k humanos no reordenados se pueden aparear con otro ratón que contiene una deleción del otro alelo de cadena pesada endógeno. De esta manera, la progenie obtenida expresará solamente cadenas pesadas híbridas como las descritas en el Ejemplo I. La cría se realizó mediante técnicas estándar reconocidas en la técnica y, como alternativa, por empresas comerciales, por ejemplo, The Jackson Laboratory. Las cepas de ratones portadores de un 10 locus de cadena pesada híbrida se cribaron con respecto a la presencia de las cadenas pesadas híbridas únicas y la ausencia de cadenas pesadas murinas tradicionales.

Como alternativa, los ratones portadores de segmentos génicos κ humanos no reordenados en el locus de la cadena pesada de ratón pueden optimizarse al aparearlos con otros ratones que contienen una o más deleciones de los loci 15 de cadena ligera murina (κ y λ). De esta manera, la progenie obtenida expresará únicamente anticuerpos únicamente con cadena pesada κ humana únicos, como los descritos en el Ejemplo I. De manera similar, la cría se realizó mediante técnicas estándar reconocidas en la técnica y, como alternativa, por empresas comerciales, por ejemplo, The Jackson Laboratory. Las cepas de ratón portadoras de un locus de cadena pesada híbrida y una o más deleciones de los loci de cadena ligera de ratón se cribaron con respecto a la presencia de las cadenas pesadas 20 híbridas únicas que contenían dominios de cadena ligera κ humanos y dominios constantes de cadena pesada de ratón, y la ausencia de cadenas ligeras de ratón endógenas.

Los ratones portadores de un locus de cadena pesada híbrido no reordenado también se aparean con ratones que contienen un reemplazo del locus génico variable de cadena ligera κ de ratón endógeno por el locus génico variable 25 de cadena ligera κ humano (véase el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology). El paquete VELOCIMMUNE® Humanized Mouse incluye, en parte, tener un genoma que comprende regiones variables de cadena ligera κ humanas unidas operativamente a loci de región constante variable de cadena ligera κ de ratón endógeno, de tal modo que el ratón produzca anticuerpos que comprendan un dominio variable de cadena ligera κ humano y un dominio constante de cadena pesada de 30 ratón, en respuesta a una estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas ligeras de los anticuerpos puede aislarse y unirse operativamente a ADN que codifica las regiones constantes de cadena ligera humana. Después, el ADN puede expresarse en una célula capaz de expresar la cadena ligera completamente humana del anticuerpo. Después de un programa de cría y apareamiento adecuado, se obtuvieron ratones portadores de un reemplazo de la cadena ligera κ de ratón endógena por el locus de cadena ligera κ humana, y un locus de cadena pesada híbrida no reordenado. Las proteínas de unión V

5

Ejemplo V

Generación de proteínas de unión VL

Después del apareamiento de ratones que contienen el locus de cadena pesada híbrida no reordenado con diversas 10 cepas deseadas que contienen modificaciones y deleciones de otros loci de Ig endógenos (como se describe en el Ejemplo IV), los ratones seleccionados pueden inmunizarse con un antígeno de interés.

Generalmente, un ratón humanizado VELOCIMMUNE® que contiene al menos un locus de cadena pesada híbrida se expone a un antígeno, y las células (tales como las células B) se recuperan del animal (por ejemplo, del bazo o 15 de los ganglios linfáticos). Las células pueden fusionarse con una línea celular de mieloma, para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y tales líneas celulares de hibridoma se criban y se seleccionan para identificar líneas de células de hibridoma que produzcan anticuerpos que contengan cadenas pesadas híbridas específicas para el antígeno utilizado para la inmunización. El ADN que codifica las regiones Vκ humanas de las cadenas pesadas híbridas puede aislarse y unirse a las regiones constantes deseables, por ejemplo, de cadena pesada y/o 20 de cadena ligera. Debido a la presencia de segmentos génicos Vκ humanos fusionados a regiones constantes de cadena pesada de ratón, se produce un repertorio único de moléculas similares a anticuerpos y la diversidad del repertorio de inmunoglobulinas se aumenta drásticamente como resultado del formato de anticuerpo único creado. Esto contiene un nivel añadido de diversidad al repertorio específico contra el antígeno después de la inmunización. Las secuencias de anticuerpo clonadas resultantes, posteriormente pueden producirse en una célula, tal como una 25 célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica las proteínas de unión VL específicas de antígeno o los dominios variables, se puede aislar directamente de los linfocitos específicos de antígeno (por ejemplo, células B).

Inicialmente, se aíslan proteínas de unión VL de alta afinidad que tienen una región Vκ humana y una región constante murina. Como se ha descrito anteriormente, las proteínas de unión VL se caracterizan y seleccionan para 30 características deseables, incluyendo la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes murinas se reemplazan por una región constante humana deseada, para generar proteínas de unión VL completamente humanas únicas, que contienen dominios Vκ humanos somáticamente mutados procedentes de un locus de cadena pesada híbrida no reordenado de la invención. Las regiones constantes humanas adecuadas incluyen, por ejemplo, lgG1 o lgG4 de tipo silvestre o modificadas o, como alternativa, Cκ o Cλ. 35

Cohortes separadas de ratones que contenían un reemplazo del locus de cadena pesada de ratón endógeno por seis segmentos génicos Vκ humanos y cinco segmentos génicos Jκ humanos (como se describe en el Ejemplo I) y un reemplazo de los segmentos génicos Vκ y Jκ endógenos por segmentos génicos Vκ y Jκ humanos, se inmunizaron con una proteína receptora de superficie celular humana (antígeno X). El antígeno X se administra 40 directamente en la almohadilla plantar de las patas traseras de los ratones con seis inyecciones consecutivas, cada 3-4 días. De dos a tres microgramos del antígeno X se mezclan con 10 µg de oligonucleótido CpG (Cat. n.º tlrl-modn - oligonucleótido ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) y 25 µg de Adju-Phos (adyuvante de gel de fosfato de aluminio Cat. n.º H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de la inyección. Se administran un total de seis inyecciones antes del refuerzo final del antígeno, que se proporciona 3-5 días antes del sacrificio. Se 45 recogen las extracciones de sangre después de la 4ª y 6ª inyección, y la respuesta inmunitaria de anticuerpos se monitoriza hmediante un inmunoensayo específico de antígeno estándar.

Cuando se logra una respuesta inmunitaria deseada, los esplenocitos se recogen y se fusionan con células de mieloma murino para conservar su viabilidad y para formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de 50 hibridoma se criban y se seleccionan para identificar líneas celulares que produzcan proteínas de unión VL específicas de antígeno X. Con el uso de esta técnica, se obtienen varias proteínas de unión VL anti-antígeno X específicas (es decir, proteínas de unión que poseían dominios Vκ humanos en el contexto de dominios constantes de cadena pesada y ligera murinos).

55

Como alternativa, se aíslan proteínas de unión VL anti-antígeno X directamente de las células B positivas para el antígeno, sin fusión con células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Con el uso de este método, se obtuvieron varias proteínas de unión VL anti-antígeno X completamente humanas (es decir, anticuerpos que poseían dominios Vκ humanos y dominios constantes humanos).

Uso del segmento génico κ humano. Para analizar la estructura de las proteínas de unión VL anti-antígeno X producidas, los ácidos nucleicos que codifican los dominios Vκ humanos (tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras de la proteína de unión VL), se clonaron y se secuenciaron usando métodos adaptados a partir de los 5 descritos en el documento US 2007/0280945A1 (supra). A partir de las secuencias de ácido nucleico y de las secuencias de aminoácidos predichas de los anticuerpos, se identificó el uso de los genes para la región variable de cadena pesada híbrida de las proteínas de unión VL seleccionadas obtenidas de ratones inmunizados (descrito anteriormente). La Tabla 5 presenta el uso de los genes de los segmentos génicos Vκ y Jκ humanos procedentes de proteínas de unión VL anti-antígeno X seleccionadas, lo que demuestra que los ratones de acuerdo con la invención, 10 generan proteínas de unión VL específicas de antígeno, a partir de una diversidad de segmentos génicos Vκ y Jκ humanos, debido a una diversidad de reordenamientos en los loci de cadena pesada y los loci de cadena ligera κ endógenos, tanto aquellos que contenían segmentos génicos Vκ como aquellos contenían segmentos génicos Jκ humanos no reordenados. Los segmentos génicos Vκ humanos se reordenaron con una diversidad de segmentos Jκ humanos, para producir proteínas de unión VL específicas de antígeno únicas. 15

Tabla 5

Anticuerpo: Cadena pesada híbrida Cadena ligera

Vκ: Jκ Vκ Jκ

A: 4-1 3 3-20 1

B: 4-1 3 3-20 1

C: 4-1 3 3-20 1

D: 4-1 3 3-20 1

E: 4-1 3 3-20 1

F: 4-1 3 3-20 1

G: 4-1 3 3-20 1

H: 4-1 3 3-20 1

I: 4-1 3 3-20 1

J: 1-5 3 1-33 3

K: 4-1 3 3-20 1

L: 4-1 3 1-9 3

M: 4-1 1 1-33 4

N: 4-1 1 1-33 3

O: 1-5 1 1-9 2

P: 1-5 3 1-16 4

Q: 4-1 3 3-20 1

R: 4-1 3 3-20 1

S: 1-5 1 1-9 2

T: 1-5 1 1-9 2

U: 5-2 2 1-9 3

V: 1-5 2 1-9 2

W: 4-1 1 1-33 4

Ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas (ELISA). Las proteínas de unión VL humanas producidas contra el antígeno X se ensayaron para determinar su capacidad de bloquear la unión del ligando natural del antígeno X (ligando Y), en un ensayo de ELISA.

Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con el ligando Y a una concentración de 2 µg/ml, diluido en PBS y se incubó durante una noche seguido de cuatro lavados con PBS con Tween-20 al 0,05%. Después, la placa se 5 bloqueó con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía BSA al 0,5% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa separada, los sobrenadantes que contenían proteínas de unión VL anti-antígeno X se diluyeron 1:10 en tampón. Se usó un sobrenadante simulado con los mismos componentes de las proteínas de unión VL como control negativo. El dominio extracelular (ECD) del antígeno X se conjugó con la porción Fc de la lgG2a murina (antígeno X-mFc). Se añadió antígeno X-mFc a una concentración 10 final de 0,150 nM y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después, la mezcla proteína de unión VL/antígeno X-mFc se añadió a la placa que contenía el Ligando Y, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La detección del antígeno X-mFc unido al ligando Y se determinó con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) y se reveló mediante una respuesta colorimétrica estándar, usando el sustrato tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizado 15 con ácido sulfúrico. La absorbancia se leyó a una DO450 durante 0,1 s. La absorbancia de fondo de una muestra sin el antígeno X, se restó de todas las muestras. El porcentaje de bloqueo se calculó para >250 (tres placas de 96 pocillos) proteínas de unión VL específicas de antígeno X, dividiendo el MFI restado del fondo de cada muestra por el valor del control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el valor resultante de 100.

20

Los resultados mostraron que varias proteínas de unión VL aisladas de ratones inmunizados con el antígeno X, se unieron específicamente al dominio extracelular del antígeno X fusionado a la porción Fc de la lgG2a murina (datos no mostrados).

Determinación de afinidad. Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (KD) para los 25 sobrenadantes de proteína de unión VL específicas contra el antígeno X seleccionados mediante SPR (Resonancia de plasmón superficial), usando un instrumento BIACORE™ T100 (GE Healthcare). Todos los datos se obtuvieron utilizando HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,3 mM, tensioactivo P20 al 0,05%, pH 7,4) tanto como los tampones de realización y de muestra, a 25ºC.

30

Brevemente, se capturaron las proteínas de unión VL a partir de muestras de sobrenadante en bruto en una superficie de chip sensor CM5 previamente derivatizada con una alta densidad de anticuerpos anti-Fc humano usando la química de acoplamiento amina estándar. Durante la etapa de captura, los sobrendantes se inyectaron por la superficie del anti-Fc humano a un caudal de 3 µl/min, durante un total de 3 minutos. La etapa de captura se siguió de una inyección del tampón de realización o analito a una concentración de 100 nM durante 2 minutos, a un 35 caudal de 35 µl/min. La disociación del antígeno de la proteína de unión VL capturada se monitorizó durante 6 minutos. La proteína de unión VL capturada se retiró mediante una breve inyección de glicina 10 mM, pH 1,5. Todos los sensogramas fueron referenciados por duplicado, restando los sensogramas de las inyecciones de tampón de los sensogramas de analitos, eliminando así los artefactos causados por la disociación de la proteína de unión VL de la superficie de captura. Los datos de unión para cada proteína de unión VL, se ajustaron a un modelo 40 de unión 1:1 con un transporte de masa usando el software de evaluación BIAcore T100 v2.1.

Las afinidades de unión de treinta y cuatro proteínas de unión VL seleccionadas variaron, presentando todas una KD en el rango nanomolar (1,5 a 130 nM). Además, aproximadamente el 70% de las proteínas de unión VL seleccionadas (23 de 34), demostró una afinidad nanomolar de un único dígito. Las mediciones de T1/2 para estas 45 proteínas de unión VL seleccionadas, demostraron un rango de aproximadamente 0,2 a 66 minutos. De las treinta y cuatro proteínas de unión VL, seis mostraron una afinidad mayor de 3 nM para el antígeno X (1,53, 2,23, 2,58, 2,59, 2,79 y 2,84). Los datos de afinidad son consistentes con las proteínas de unión VL resultantes de la asociación combinatoria de dominios variables de cadena ligera humana reordenados unidos a regiones constantes de cadena pesada y ligera (descritos en la Tabla 4), que son de alta afinidad, seleccionadas por clonación, y somáticamente 50 mutadas. Las proteínas de unión VL generadas por los ratones descritos en el presente documento comprenden una colección de diversas proteínas de unión únicas y de alta afinidad, que muestran especificidad para uno o más epítopos del antígeno X.

En otro experimento, las proteínas de unión VL humanas seleccionadas producidas contra el antígeno X, se 55 ensayaron para determinar su capacidad de bloquear la unión del ligando natural del antígeno X (ligando Y) a antígeno X en un ensayo basado en perlas LUMINEX® (datos no mostrados). Los resultados demostraron que, además de unirse específicamente al dominio extracelular del antígeno X con afinidades en el rango nanomolar (descrito anteriormente), las proteínas de unión VL seleccionadas también fueron capaces de unirse al antígeno X de mono cinomolgus (Macaca fascicularis).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ratón que comprende en su línea germinal un primer segmento génico variable de cadena ligera kappa (VK) humano no reordenado y un segmento génico de unión de cadena ligera kappa (JK) humano no reordenado unidos operativamente a la región constante de cadena pesada (CH) de ratón endógena en el locus de cadena pesada de 5 ratón endógeno, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico JK humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos variables de cadena pesada (VH) de ratón endógenos funcionales, todos los segmentos génicos de diversidad (DH) de ratón endógenos funcionales y todos los segmentos génicos de unión de cadena pesada (JH) de ratón endógenos funcionales, donde el primer segmento génico VK humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado participan en el reordenamiento para formar 10 una secuencia VK/JK reordenada unida operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón endógena en el ratón, y donde el ratón comprende adicionalmente en su línea germinal un segundo segmento génico variable de cadena ligera (VL) humano y un segmento génico J de cadena ligera (JL) humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera (CL) de ratón.

15
2. El ratón de la reivindicación 1, que comprende una célula B que comprende en su genoma una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana reordenada unida operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón endógena en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno.

20
3. El ratón de la reivindicación 1, donde el segundo segmento génico VL humano es un segmento génico Vκ humano.
4. El ratón de la reivindicación 3, donde el gen constante de cadena ligera es un gen constante de cadena ligera κ.

25
5. El ratón de la reivindicación 1, donde el segundo segmento génico VL humano es un segmento génico Vλ humano.
6. El ratón de la reivindicación 5, donde el gen constante de cadena ligera es un gen constante de cadena ligera λ.

30
7. El ratón de la reivindicación 1 que expresa una proteína de unión a antígeno, donde la proteína de unión a antígeno comprende un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena ligera kappa humano fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y un segundo polipéptido que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera humano fusionado con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón. 35
8. El ratón de la reivindicación 7, donde el segundo dominio variable de cadena ligera humano se selecciona de un dominio variable Vκ humano y un dominio variable Vλ humano.
9. El ratón de la reivindicación 1, que es homocigoto o heterocigoto para dicho locus de cadena pesada endógeno, 40 que comprende un primer segmento génico Vκ humano no reordenado y un segmento génico JK humano no reordenado unidos operativamente con la región constante de cadena pesada de ratón endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico Vκ humano no reordenado y el segmento génico JK humano no reordenado remplazan todos los segmentos génicos VH, DH y JH de ratón endógenos funcionales. 45
10. Uso de un ratón de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para producir una proteína de unión a antígeno que comprende un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena ligera kappa humano fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y un segundo polipéptido que comprende un segundo dominio variable de cadena ligera humano fusionado con una región 50 constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón.
11. Uso de un ratón de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para producir un anticuerpo que comprende un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena ligera kappa humano fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, y un segundo polipéptido que 55 comprende un segundo dominio variable de cadena ligera humano fusionado con una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón.
12. Uso de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para producir un hibridoma o un cuadroma para la producción de un anticuerpo como se define en la reivindicación 11.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

5
14. Una célula de ratón que comprende en su genoma un primer segmento génico Vκ humano no reordenado y un segmento génico Jκ humano no reordenado unidos operativamente con la región constante de cadena pesada endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico Vκ humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado reemplazan todos los segmentos génicos VH, DH y JH endógenos funcionales, y donde la célula de ratón comprende adicionalmente un segundo segmento génico VL 10 humano y un segmento génico JL humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera de ratón.
15. Una célula de acuerdo con la reivindicación 14 que se obtiene a partir de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15
16. Una célula de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, donde la célula es una célula ME.
17. Un tejido obtenido de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende células como se define en la reivindicación 14.

20
18. El tejido de la reivindicación 17, que comprende una célula B que comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana reordenada unida operativamente a la región constante de cadena pesada de ratón en el locus de cadena pesada de ratón endógeno y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera de ratón. 25
19. Un embrión de ratón que comprende una célula que comprende en su genoma un primer segmento génico Vκ humano no reordenado y un segmento génico Jκ humano no reordenado unidos operativamente con la región constante de cadena pesada endógena en el locus de cadena pesada de ratón endógeno, donde el primer segmento génico Vκ humano no reordenado y el segmento génico Jκ humano no reordenado reemplazan todos los 30 segmentos génicos VH, DH y JH endógenos funcionales, y donde la célula comprende adicionalmente un segundo segmento génico VL humano y un segmento génico JL humano unidos operativamente a un gen constante de cadena ligera de ratón.
20. Un método para preparar un ratón genéticamente modificado de acuerdo con una cualquiera de las 35 reivindicaciones 1 a 9, que comprende reemplazar en un locus de cadena pesada endógeno del ratón todos los segmentos génicos VH, DH y JH funcionales del ratón con un primer segmento génico Vκ humano no reordenado y un segmento génico JK humano no reordenado, para unir operativamente así el primer segmento génico Vκ humano no reordenado y el segmento génico JK humano no reordenado a la región constante de cadena pesada endógena, y también insertar en la línea germinal del ratón un segundo segmento génico VL humano y un segmento génico JL 40 humano unidos operativamente a un gen de región constante de cadena ligera de ratón.
21. Una proteína de unión a antígeno obtenible a partir de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humano fusionado a un dominio constante de cadena ligera de ratón y un dominio variable de 45 cadena ligera kappa de inmunoglobulina humano fusionado a un dominio constante de cadena pesada de ratón.
22. Un método para preparar una proteína de unión a antígeno, donde dicho método comprende obtener una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VK de un gen que codifica un dominio VK fusionado a una región CH de una célula de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, clonar la secuencia 50 nucleotídica que codifica el dominio VK en marco con un gen que codifica una región CH humana para formar una secuencia de proteína de unión a antígeno humana, y expresar la secuencia de proteína de unión a antígeno humana en una célula adecuada.
23. Un método para preparar una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio VK humano, donde dicho 55 método comprende exponer un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 a un antígeno de interés, permitir que el ratón desarrolle una respuesta inmune al antígeno de interés, y aislar dicha proteína de unión a antígeno, o aislar el dominio VK humano de dicha proteína de unión a antígeno.
24. Un método para obtener una secuencia génica VK humana, donde dicho método comprende exponer un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 a un antígeno de interés, y aislar de dicho ratón una secuencia génica VK humana reordenada, donde la secuencia génica VK humana reordenada se fusiona con una secuencia nucleotídica que codifica una región CH en dicho ratón. 5