RS55495B1 - Miševi koji stvaraju vezujuće proteine koji sadrže vl domene - Google Patents

Miševi koji stvaraju vezujuće proteine koji sadrže vl domene

Info

Publication number
RS55495B1
RS55495B1 RS20161086A RSP20161086A RS55495B1 RS 55495 B1 RS55495 B1 RS 55495B1 RS 20161086 A RS20161086 A RS 20161086A RS P20161086 A RSP20161086 A RS P20161086A RS 55495 B1 RS55495 B1 RS 55495B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
gene segment
heavy chain
light chain
Prior art date
Application number
RS20161086A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Cagan Gurer
Karolina A Meagher
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44543797&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55495(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55495B1 publication Critical patent/RS55495B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae (F), e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

OBLASTPRONALASKA
Ovde su opisani vezujući proteini slični imunoglobulinu koji sadrže konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa varijabilnim domenom lakog lanca imunoglobulina, kao i vezujući proteini koji imaju varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim domenom lakog lanca i varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim domenom teškog lanca. Takođe su opisane ćelije koje eksprimiraju takve vezujuće proteine, miševi koji ih stvaraju i povezani postupci i kompozicije.
OSNOVA PRONALASKA
Antitela tipično sadrže tetramernu strukturu koja ima dva identična teška lanca od kojih svaki sadrži konstantni region teškog lanca (Ch) fuzionisan sa varijabilnim domenom teškog lanca (VH) spojen sa konstantnim regionom lakog lanca (Cl) fuzionisanim sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL). Za tipičan humani IgG, molekul antitela je približno oko 150 kDa do oko 170 kDa u veličini( npr.,za IgG3, koji sadrži duži zglobni region), u zavisnosti od podklase IgG( npr.,IgGl, IgG3, IgG4) i (varirajuće) dužine varijabilnog regiona.
U tipičnom antitelu, Vn i Vldomeni se spajaju tako da formiraju vezujuće mesto koje vezuje ciljni antigen. Karakteristike antitela u vezi sa afinitetom i specifičnošću prema tome mogu da zavise u velikom delu od karakteristika VHi VLdomena. U tipičnim antitelima ljudi i miševa, Vhdomeni se spajaju sa X ilikVldomenima. Takođe je poznato, međutim, da mogu biti stvoreni VLdomeni koji specifično vezuju ciljni antigen u odsustvu srodnog VHdomena( npr.,Vh domena koji se prirodno eksprimira u kontekstu antitela i povezan je određenim Vldomenom), i da mogu biti izolovani VHkoji specifično vezuju ciljni antigen u odsustvu srodnog VLdomena. Na taj način, korisna raznovrsnost u vezujućim proteinima na bazi imunoglobulina je generalno obezbeđena preko rekombinacije koja dovodi do određenog VHili VL(i somatske hipermutacije, do stepena u kome se javlja), kao i kombinacijom srodnog Vh/Vlpara. Bilo bi korisno razviti kompozicije i postupke za iskorišćavanje drugih izvora raznovrsnosti.
U tehnici postoji potreba za vezujućim proteinima na bazi imunoglobulinskih struktura, uključujući varijabilne regione imunoglobulina kao što su varijabilni regioni lakog lanca i uključujući vezujuće proteine koji ispoljavaju povećani diverzitet u odnosu na tradicionalna antitela. Takođe postoji potreba za dodatnim postupcima i životinjama za stvaranje korisnih vezujućih proteina, uključujući vezujuće proteine koji sadrže različite sekvence varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Takođe postoji potreba za korisnim formatima za vezujuće proteine na bazi imunoglobulina koji obezbeđuju povećanu raznovrsnost vezujućih proteina od kojih se vrši izbor i povećanu raznovrsnost varijabilnih domena imunoglobulina, uključujući kompozicije i postupke za dobijanje somatski imitiranih i klonalno izabranih varijabilnih domena imunoglobulina za upotrebu,npr.,u dobijanju humanih lekova.
Prijava WO2009/143472 opisuje strategiju za dobijanje „knock in" miševa za dobijanje jednolančanih himernih antitela koja imaju humani somatski hipermutirani Vldomen i mišji Ci i region. Takav miš nije stvarno dobijen.
Prijava WO2011/158009 opisuje inserciju humanog IgH VDJ regiona i/ili VJ regiona lakog lanca, u funkcionalnu vezu u genomu sa mu konstantnim regionom iz nehumanih vrsta. Ova prijava ne opisuje stvarno stvaranje bilo koje nehumane životinje koja ima genom koji kodira lanac antitela koji ima humani varijabilni region lakog lanca ushodno od nehumanog konstantnog regiona teškog lanca, ia fortioristvarnu ekspresiju antigen-vezujućeg proteina koji sadrži polipeptid koji sadrži humanu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca fuzionisanu sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina.
REZIME PRONALASKA
Pronalazak daje miša koji sadrži u svojoj klicinoj liniji prvi nerearanžirani humani varijabilni genski segment kapa lakog lanca (Vk) i nerearanžirani humani spajajući genski segment kapa lakog lanca (Jk) funkcionalno vezan sa endogenim mišjim konstantnim regionom teškog lanca (Ch) na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nearanžirani humani genski segment Vki nearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene mišje varijabilne genske segmente teškog lanca (VH), sve funkcionalne endogene mišje raznovrsne (DH) genske segmente i sve funkcionalne endogene mišje spajajuće genske segmente teškog lanca (Jh), pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkučestvuju u rearanžmanu da bi se formirala rearanžirana sekvenca Vk/Jkfunkcionalno vezana za endogeni mišji konstantni region teškog lanca u mišu, i pri čemu miš dalje sadrži u svojoj klicinoj liniji drugi humani genski segment varijabilnog lakog lanca (VL) i humani genski segment lakog lanca J (Jl) funkcionalno vezan za mišji gen konstantnog lakog lanca (CL)
Pronalazak dalje daje upotrebu miša prema pronalasku za proizvodnju antigen-vezujućeg proteina koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi humani varijabilni domen kapa lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina, i drugi polipeptid koji sadrži drugi humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom lakog lanca imunoglubulina. Antigen-vezujući protein može biti antitelo.
Pronalazak dodatno daje upotrebu miša prema pronalasku za proizvodnju hibridoma ili kvadroma za proizvodnju antitela kao što je definisano u prethodnom tekstu.
Pronalazak takođe daje mišju ćeliju koja sadrži u svom genomu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkfunkcionalno vezan sa endogenim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vkgena i nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene Vh, Dhi Jhgenske segmente i pri čemu mišja ćelija dalje sadrži drugi humani genski segment Vli humani genski segment Jlfunkcionalno vezan za konstantni gen lakog lanca miša.
Pronalazak dodatno daje tkivo poreklom od miša prema pronalasku, koje sadrži ćelije kao što su definisane u prethodnom tekstu.
Pronalazak dalje daje mišji embrion koji sadrži ćeliju koja sadrži u svom genomu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžiran humani genski segment Jkfunkcionalno vezan sa endogenim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene genske segmente VH, DHi Jh, i pri čemu ćelija dalje sadrži drugi humani genski segment VLi humani genski segment JLfunkcionalno vezane za mišji gen konstantnog regiona lakog lanca.
Pronalazak daje postupak za dobijanje genetički modifikovanog miša prema pronalasku, koji sadrži zamenu na endogenom lokusu teškog lanca miša svih funkcionalnih genskih segmenata Vh, Dhi Jhmiša sa prvim nerearanžiranim humanim genskim segmentom Vki nerearanžiranim humanim genskim segmentom Jk, da bi na taj način funkcionalno vezali prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkza endogeni konstantni region teškog lanca i takođe inseriranje u klicinu liniju miša drugog humanog genskog segmenta Vli humanog genskog segmenta Jlfunkcionalno vezanog sa mišjim genom za konstantni region lakog lanca.
Pronalazak takođe daje antigen-vezujući protein koji se može dobiti od miša prema pronalasku, pri čemu antigen vezujući protein sadrži humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom lakog lanca i humani varijabilni domen kapa lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom teškog lanca.
Pronalazak dodatno daje postupak za dobijanje antigen-vezujućeg proteina, pri čemu navedeni postupak sadrži dobijanje nukleotidne sekvence koja kodira domen Vkpomoću gena koji kodira domen Vkfuzionisan sa CHregionom iz ćelije miša prema pronalasku, kloniranje nukleotidne sekvence koja kodira domen Vku okviru sa genom koji kodira humani region Chtako da se formira humana sekvenca antigen-vezujućeg proteina, i ekspresiju humane sekvence antigen-vezujućeg proteina u pogodnoj ćeliji.
Pronalazak takođe daje postupak za dobijanje antigen-vezujućeg proteina koji sadrži humani domen Vk, pri čemu navedeni postupak sadrži izlaganje miša prema pronalasku antigenu od interesa, omogućavajući mišu da razvije imuni odgovor na antigen od interesa, i izolaciju navedenog antigen-vezujućeg proteina ili izolaciju humanog domena Vknavedenog antigen-vezujućeg proteina.
Pronalazak dalje daje postupak za dobijanje humane genske sekvence Vk, pri čemu navedeni postupak sadrži izlaganje miša prema pronalasku antigenu od interesa i izolaciju iz navedenog miša rearanžirane humane genske sekvence Vk, pri čemu rearanžirana humana genska sekvenca Vk je fuzionisana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira CHregion u navedenom mišu.
U jednom aspektu, opisani su vezujući proteini koji sadrže varijabilne regione imunoglobulina koji su poreklom od varijabilnih domena lakog lanca( tj.,kapa (k) i/ili lambda( k))imunoglobulina, ali ne od varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina pune dužine. Takođe su dati postupci i kompozicije za dobijanje vezujućih proteina, uključujući genetički modifikovane miševe.
U jednom aspektu, konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, miševi i postupci su obezbeđeni za stvaranje proteina koji sadrže jednu ili više sekvenci varijabilnog regionaki/iliXlakog lanca imunoglobulina i sekvence konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući proteine koji sadrže varijabilni domen humanogXiliKlakog lanca i humanu ili mišju sekvencu konstantnog regiona teškog lanca.
U jednom aspektu, opisan je miš, koji sadrži lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži zamenu jednog ili više genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (VH), raznovrsnih genskih segmenata teškog lanca (DH) i spajajućih genskih sekvenci teškog lanca (Jh) na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i jednim ili više spajajućih genskih segmenata lakog lanca (JL).
U jednom aspektu, opisan je miš, koji sadrži lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži zamenu svih ili značajno svih genskih segmenata VH, DHi Jhsa jednim ili više genskih segmenata VLi jednim ili više genskih segmenata JLda bi se formirala sekvenca genskog segmenta VLna endogenom lokusu teškog lanca (VLHlokus), pri čemu je VLHlokus sposoban da se rekombinuje sa endogenim mišjim Chgenom da bi se formirao rearanžirani gen koji je poreklom od genskog segmenta VL, genskog segmenta Jl i endogenog mišjeg gena Ch.
U jednom aspektu, genski segmenti VLsu humani genski segmenti VL. U jednom aspektu, segmenti Jlsu humani genski segmenti Jl. U specifičnom aspektu, genski segmenti VLi Jl su humani genski segmenti VLi humani genski segmenti Jl.
U jednom aspektu, svi ili značajno svi genski segmenti VH, DHi Jhsu zamenjeni sa najmanje šest humanih genskih segmenata Vki najmanje jednim genskim segmentom Jk. U jednom aspektu, svi ili značajno svi genski segmenti VH, DHi Jhsu zamenjeni sa najmanje 16 humanih genskih segmenata Vk(humanih Vk) i najmanje jednim genskim segmentom Jk. U jednom aspektu, svi ili značajno svi od genskih segmenata Vh, Dhi Jhsu zamenjeni sa najmanje 30 humanih genskih segmenata Vki najmanje jednim genskim segmentom Jk. U jednom aspektu, svi ili značajno svi od genskih segmenata Vh, Dhi Jhsu zamenjeni sa najmanje 40 humanih genskih segmenata Vki najmanje jednim genskim segmentom Jk. U jednom aspektu, najmanje jedan genski segment Jksadrži dva, tri, četiri ili pet humanih genskih segmenata Jk.
U jednom aspektu, humani genski segmenti VKsadrže 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5 i 1-6. U jednom aspektu,kVlsadrže 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16. U jednom aspektu, humani genski segmenti Vksadrže 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 i 2-30. U jednom aspektu, humani genski segmenti Vksadrže 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 i 2-40.
U jednom aspektu, humani genski segmenti VKsadrže 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15 i 1-16. U jednom aspektu, genski segmenti Vkdalje sadrže 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29 i 2-30. U jednom primeru izvođenja, genski segmenti Vkdalje sadrže 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39 i 2-40.
U jednom aspektu, genski segmenti VLsu humani genski segmentiVXi sadrže fragment klastera A humanog lokusaXlakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera A humanog lokusaXlakog lanca se pruža od hVX3- 27 do hWX3- l.
U jednom aspektu, genski segmenti VLsadrže fragment klastera B humanog lokusaXlakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera B humanog lokusaXlakog lanca se pruža od hVX5-52 dohVXl-40.
U jednom aspektu, genski segmenti Vl sadrže humanu sekvencu varijabilnog regionaXlakog lanca koja sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom aspektu, humana sekvenca varijabilnog regionaXlakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan genski segment klastera B.
U jednom aspektu, genski segmenti VLsadrže najmanje jedan genski segment klastera B i najmanje jedan genski segment klastera C.
U jednom aspektu, genski segmenti Vl sadržehWX3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 i 3-12. U specifičnom aspektu, genski segmenti Vlsadrže kontinuiranu sekvencu humanog lokusaXlakog lanca koja se pruža od VX3- 12 do VX3- l. U jednom aspektu, kontinuirana sekvenca sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 h\ Xs. U specifičnom aspektu, hVXs obuhvataju 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 i 3-12. U specifičnom aspektu, hVXs sadrži kontinuiranu sekvencu humanog lokusaXkoja se pruža od VX3-\ 2 do VX3-\.
U jednom aspektu, hVXs sadrži 13 do 28 ili više hVXs. U specifičnom aspektu, hVXs obuhvataju 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25 i 3-27. U specifičnom aspektu, hVXs sadrže kontinuiranu sekvencu humanog lokusaXkoji se pruža od VX3- 27 do VX3- l. U jednom aspektu, genski segmenti VL sadrže 29 do 40 hVXs. U specifičnom aspektu, genski segmenti Vlsadrže kontinuiranu sekvencu humanog lokusaXkoji se pruža od VX3- 29 do VX3- l, i kontinuiranu sekvencu humanog lokusaXkoji se pruža od VX5- 52 do VXl- 40. U specifičnom aspektu, sva ili značajno sva sekvenca između hVXl- 40 i hVX3-29 u genetički modifikovanom mišu se uglavnom sastoji od humane sekvenceXod približno 959 bp koja se nalazi u prirodi( npr.,u humanoj populaciji) nishodno od hVX\- 40 genskog segmenta
(nishodno od 3' netranslatiranog dela), mesta za restrikcioni enzim( npr.,Pl-SceI), nakon koga sledi humana sekvencaXod približno 3,431 bp ushodno od hVA3-29 genskog segmenta koji se nalazi u prirodi.
U jednom aspektu, humani genski segment Jk je izabran iz grupe koja se sastoji od JkI, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5 i njihovih kombinacija. U specifičnom primeru izvođenja, Jksadrži JkI do Jk5. U jednom aspektu, genski segmenti Vlsu humani genski segmentiVX,i genski segment Jksadrži RSS koji ima 12-merni spejser, pri čemu je RSS postavljen pored ushodnog kraja genskog segmenta Jk. U jednom aspektu, genski segmenti VLsu humani genski segmentiVXi VLHlokus sadrži dva ili više genskih segmenata Jk, pri čemu svaki sadrži RSS koji ima 12-merni spejser, gde je RSS postavljen na ushodnom kraju svakog genskog segmenta Jk.
U specifičnom primeru izvođenja, genski segmenti Vk sadrže kontinuirane humane genske segmentekkoji se pružaju u humanomklokusu od Vk4-1 do Vk2-40, i genski segmenti Jksadrže kontinuirane genske segmente koji se pružaju u humanomklokusu od JkI do Jk5.
U jednom aspektu, gde, genski segmenti VLsu genski segmentiYXi nijedan genski segment DHnije prisutan između genskih segmenata VLi genskih segmenata J, genski segmenti Vlsu flankirani nishodno( tj.,postavljeni na nishodnoj strani) sa 23-mernim RSS, i genski segmenti Jkako su prisutni ili genski segmenti JX ako su prisutni su flankirani ushodno( tj.,postavljeni na ushodnoj strani) sa 12-mernim RSS.
U jednom aspektu, tamo gde su prisutni humani genski segmenti Vki nijedan genski segment DHnije prisutan između genskih segmenata VHi genskih segmenata JH, svaki od genskih segmenata Vk je postavljen na nishodnoj strani sa 12-mernim RSS, i genski segmenti Jkako su prisutni ili genski segmenti JA, ako su prisutni su postavljeni na ushodnu stranu sa 23-mernim RSS.
U jednom aspektu, miš sadrži rearanžirani gen koji je poreklom od genskog segmenta Vl, genskog segmenta Jli endogenog mišjeg Chgena. U jednom aspektu, rearanžirani gen je somatski mutiran. U jednom aspektu, rearanžirani gen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više adicija N. U jednom aspektu, adicije N i/ili somatske mutacije zabeležene u rearanžiranom genu poreklom od genskog segmenta VLi genskog segmenta JLsu 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta ili najmanje 5-puta veće od broja adicija N i/ili somatskih mutacija zabeleženih u rearanžiranom varijabilnom domenu lakog lanca (poreklom od istog genskog segmenta VLi istog genskog segmenta JL) koji je rearanžiran na endogenom lokusu lakog lanca. U jednom aspektu, rearanžirani gen je u B ćeliji koja specifično vezuje antigen od interesa, pri čemu B ćelija vezuje antigen od interesa sa KDu niskom nanomolarnom opsegu ili niže( npr.,KDod 10 nanomola ili niže). U jednom aspektu, mišji CHgen je izabran od IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. U specifičnom aspektu, mišji IgG je izabran od IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C i IgG3. U sledećem specifičnom aspektu, mišji IgG je IgGl.
U jednom aspektu, miš sadrži B ćeliju, pri čemu B ćelija stvara od lokusa na hromozomu B ćelije, vezujući protein koji se uglavnom sastoji od četiri polipeptidna lanca, pri čemu se četiri polipeptidna lanca uglavnom sastoje od (a) dva identična polipeptida koji sadrže endogeni mišji Chregion fuzionisan sa VL; i, (b) dva identična polipeptida koji sadrže endogeni mišji Clregion fuzionisan sa VLregionom koji je srodan sa VLregionom koji je fuzionisan sa mišjim Chregionom, i, u jednom aspektu, je humani( npr.,humanik) Vldomen. U jednom aspektu, Vldomen fuzionisan sa endogenim mišjim Chregionom je humani Vldomen. U specifičnom aspektu, humani Vl domen fuzionisan sa mišjim Ch regionom je Vkdomen. U specifičnom aspektu, humani VL domen fuzionisan sa mišjim CHregionom je identičan sa V domenom koji je kodiran od strane rearanžirane nukleotidne sekvence lakog lanca humane klicine linije. U specifičnom aspektu, humani Vldomen fuzionisan sa mišjim Chregionom sadrži dve, tri, četiri, pet, šest ili više somatskih hipermutacija. U jednom primeru izvođenja, humani Vldomen fuzionisan sa mišjim Chregionom je kodiran od strane rearanžiranog gena koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, najmanje 50% svih molekula IgG stvorenih od strane miša sadrže polipeptid koji sadrži Chregion i VLdomen IgG izotipa, pri čemu dužina navedenog polipeptida nije veća od 535, 530, 525, 520 ili 515 aminokiselina. U jednom aspektu, najmanje 75% svih molekula IgG sadrže polipeptid naveden u ovom pasusu. U jednom aspektu, najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% svih molekula IgG sadrže polipeptid naveden u ovom pasusu. U specifičnom aspektu, svi molekuli IgG stvoreni od strane miša sadrže polipeptid koji nije duži od dužine polipeptida navedenog u ovom pasusu.
U jednom aspektu, miš stvara vezujući protein koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži endogeni mišji CHregion fuzionisan sa varijabilnim domenom kodiranim od strane rearanžiranog humanog genskog segmenta V i genskog segmenta J, ali ne genskog segmenta DH, i drugi polipeptid koji sadrži endogeni mišji Clfuzionisan sa V domenom kodiranim od strane rearanžiranog humanog genskog segmenta V i genskog segmenta J, ali ne genskog segmenta DH, i vezujući protrein specifično vezuje antigen sa afinitetom u mikromolarnom, nanomolamom ili pikomolarnom opsegu. U jednom aspektu, genski segment J je humani genski segment J{ npr.,humani genski segmentk). U jednom aspektu, humani genski segement V je humani genski segment Vksegment. U jednom aspektu, varijabilni domen koji je fuzionisan sa endogenim mišjim CHregionom sadrži veći broj somatskih hipermutacija od varijabilnog domena koji je fuzionisan sa endogenim mišjim Clregionom; u specifičnom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa endogenim mišjim Chregionom sadrži oko 1.5, 2-, 3-, 4- ili 5-puta ili više somatskih hipermutacija od V domena fuzionisanog sa endogenim mišjim CLregionom; u specifičnom aspektu, V domen fuzionisan sa mišjim CHregionom sadrži najmanje 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 ili više somatskih hipermutacija od V domena fuzionisanog sa mišjim Clregionom. U jednom aspektu, V domen fuzionisan sa mišjim Cn regionom je kodiran od strane rearanžiranog gena koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, miš eksprimira vezujući protein koji sadrži prvi varijabilni domen lakog lanca (VlI) fuzionisan sa sekvencom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i drugi varijabilni domen lakog lanca (Vl2) fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina, pri čemu VL1 sadrži određeni broj somatskih hipermutacija što je oko 1.5- do oko 5-puta više ili više od broja somatskih hipermutacija prisutnih u VL2. U jednom aspektu, broj somatskih hipermutacija u VlI je oko 2- do oko 4-puta veći onego kod Vl2. U jednom aspektu, broj somatskih hipermutacija u VL1 je oko 2- do oko 3-puta veći nego u Vl2. U jednom aspektu, VlI je kodiran od strane sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovani miš koji eksprimira imunoglobulin koji se uglavnom sastoji od sledećih polipeptida: prva dva identična polipeptida od kojih se svaki uglavnom sastoji od Chregiona fuzionisanog sa varijabilnim domenom koji je poreklom od genskih segmenata koji se uglavnom sastoje od genskog segmenta VLi genskog segmenta JL, i druga dva identična polipeptida od kojih se svaki uglavnom sastoji od CLregiona fuzionisanog sa varijabilnim domenom koji je poreklom od genskih segmenata koji se uglavnom sastoje od genskog segmenta Vli genskog segmenta Jl.
U specifičnom aspektu, dva identična polipeptida koji imaju CHregion imaju mišji CHregion. U specifičnom aspektu, dva identična polipeptida koji imaju CLregion imaju mišji CLregion. U jednom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa Clregionom je varijabilni domen koji je srodan sa varijabilnim domenom fuzionisanim sa Chregionom.
U jednom aspektu, varijabilni domen koji je fuzionisan sa endogenim mišjim CHregionom sadrži veći broj somatskih hipermutacija od varijabilnog domena koji je fuzionisan sa endogenim mišjim Clregionom; u specifičnom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa endogenim mišjim Chregionom sadrži oko 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta ili 5-puta ili više somatskih hipermutacija od varijabilnog domena fuzionisanog sa endogenim mišjim CLregionom. U jednom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa endogenim mišjim Clregionom je kodiran od strane gena koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, jedan ili više genskih segmenata V i genskih segmenata J su humani genski segmenti. U specifičnom aspektu, genski segmenti V i genski segmenti J su humani genski segmentik. U sledećem specifičnom aspektu, genski segmenti V i genski segmenti J su humani A genski segmenti. U jednom aspektu, genski segmenti V i genski segmenti J su nezavisno izabrani od humanih genskih segmenataki humanih genskih segmenata X. U specifičnom aspektu, genski segmenti V su genski segmenti Vki genski segmenti J su genski segmenti JA,. U sledećem specifičnom aspektu, genski segmenti V su genski segmenti VA i genski segmenti J su genski segmenti Jk.
U jednom aspektu, jedan ili više varijabilnih domena fuzionisanih sa CLregionom i varijabilnih domena fuzionisanih sa Chregionom su humani varijabilni domeni. U sledećem specifičnom aspektu, humani varijabilni domeni su humani Vkdomeni. U sledećem specifičnom aspektu, humani varijabilni domeni su VA domeni. U jednom aspektu, humani domeni su nezavisno izabrani od humanih Vki VA domena. U specifičnom aspektu, humani varijabilni domen fuzionisan sa Clregionom je humani VA domen i humani varijabilni domen fuzionisan sa Chregionom je humani Vkdomen. U sledećem aspektu, humani varijabilni domenfuzionisan sa Clregionom je humani Vkdomen i humani varijabilni domen fuzionisan sa CHje humani VA domen.
U jednom aspektu, Vldomen prva dva identična polipeptida je izabran od humanog VA domena i humanog Vkdomena. U jednom aspektu, Vldomen druga dva identična polipeptida je izabran od humanog VA domena i humanog Vkdomena. U specifičnom aspektu, VLdomen prva dva identična polipeptida je humani Vkdomen i VLdomen druga dva identična polipeptida je izabran od humanog Vkdomena i humanog VA domena. U specifičnom aspektu, Vldomen prva dva identična polipeptida je humani VA domen i VLdomen druga dva identična polipeptida je izabran od humanog VA domena i humanog Vkdomena. U specifičnom aspektu, humani VLdomen prva dva identična polipeptida je humani Vkdomen i humani Vldomen druga dva identična polipeptida je humani Vkdomen. U jednom aspektu, IgG miša sadrži vezujući protein stvoren kao odgovor na antigen, pri čemu vezujući protein sadrži polipeptid koji se uglavnom sastoji od varijabilnog domena i CHregiona, pri čemu je varijabilni domen kodiran od strane nukleotidne sekvence koja se uglavnom sastoji od rearanžiranog genskog segmenta VLi rearanžiranog genskog segmenta J, i pri čemu vezujući protein specifično vezuje epitop antigena sa KDu mikromolamom, nanomolamom ili pikomolarnom opsegu.
U jednom aspektu, opisan je miš, pri čemu sav ili značajno sav IgG stvoren od strane miša kao odgovor na antigen sadrži težak lanac koji sadrži varijabilni domen, pri čemu je varijabilni domen kodiran preko rearanžiranog gena poreklom od genskih segmenata koji se uglavnom sastoje od genskog segmenta V i genskog segmenta J. U jednom aspektu, rearanžirani gen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicije N.
U jednom aspektu, genski segment V je genski segment V lakog lanca. U jednom aspektu, laki lanac je izabran odklakog lanca i X lakog lanca. U specifičnom aspektu, laki lanac jeklaki lanac. U specifičnom aspektu, genski segment V je humani genski segment V. U specifičnom aspektu, genski segment V je humani genski segment Vki genski segment J je humani genski segment Jk.
U jednom aspektu, genski segment J je genski segment J lakog lanca. U jednom aspektu, laki lanac je izabran odklakog lanca iXlakog lanca. U specifičnom aspektu, laki lanac jeklaki lanac. U specifičnom aspektu, genski segment J je humani genski segment J. U sledećem aspektu, genski segment J je genski segment J teškog lanca( tj.,JH). U specifičnom aspektu, težak lanac je mišjeg porekla. U sledećem specifičnom aspektu, težak lanac je humanog porekla.
U jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca koji je stvoren od ne više od genskog segmenta V i genskog segmenta J je somatski mutiran varijabilni domen.
U jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca koji je stvoren od ne više od genskog segmenta V i genskog segmenta J je fuzionisan sa mišjim Chregionom.
U specifičnom aspektu, sav ili značajno sav IgG stvoren od strane miša kao odgovor na antigen sadrži varijabilni domen koji je poreklom od ne više od jednog humanog genskog segmenta V i ne više od jednog humanog genskog segmenta J, i varijabilni domen je fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom IgG, i IgG dalje sadrži lak lanac koji sadrži humani VLdomen fuzionisan sa mišjim Clregionom. U specifičnom aspektu, Vldomen fuzionisan sa mišjim Clregionom je poreklom od humanog genskog segmenta Vki humanog genskog degmenta Jk. U specifičnom aspektu, Vldomen fuzionisan sa mišjim Clregionom je poreklom od humanog genskog segmenta VA i humanog genskog segmenta JA,.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji sadrži prvi CDR3 na polipeptidu koji sadrži CHregion i drugi CDR3 na polipeptidu koji sadrži CLregion, pri čemu su oba, prvi CDR3 i drugi CDR3 svaki nezavisno poreklom od ne više od dva genska segmenta, pri čemu se dva genska segmenta uglavnom sastoje od genskog segmenta VLi genskog segmenta JL. U jednom aspektu, CDR3 na polipeptidu koji sadrži Chregion sadrži sekvencu koja je poreklom od CDR3 nukleotidne sekvence koja sadrži 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, genski segment VLi genski segment Jlsu humani genski segmenti. U jednom aspektu, genski segment VLi genski segment Jlsu genski segmentiK. U jednom aspektu, genski segment VLi genski segment JLsu genski segmentiX.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji sadrži prvi CDR3 na prvom polipeptidu koji sadrži Chregion i drugi CDR3 na drugom polipeptidu koji sadrži Clregion, pri čemu oba, prvi CDR3 i drugi CDR3 svaki sadrže sekvencu aminokiselina gde je više od 75% aminokiselina poreklom od genskog segmenta V. U jednom aspektu, CDR3 na polipeptidu koji sadrži Chregion sadrži sekvencu koja je poreklom od CDR3 nukleotidne sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektui, više od 80%, više od 90% ili više od 95% aminokiselina prvog CDR3, i više od 80%, više od 90% ili više od 95% aminokiselina drugog CDR3, su poreklom od genskog segmenta V lakog lanca.
U jednom aspektu, ne više od dva aminokiseline prvog CDR3 su poreklom od genskog segmenta koji se razlikuje od genskog segmenta V lakog lanca. U jednom aspektu, ne više od dve aminokiseline drugog CDR3 su poreklom od genskog segmenta koji se razlikuje od genskog segmenta V lakog lanca. U jednom specifičnom aspektu, ne više od dve aminokiseline prvog CDR3 i ne više od dve aminokiseline drugog CDR3 su poreklom od genskog segmenta koji se razlikuje od genskog segmenta V lakog lanca. U jednom aspektu, nijedan CDR3 IgG ne sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od genskog segmenta D. U jednom aspektu, CDR3 prvog polipeptida ne sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta
D.
U jednom aspektu, genski segment V je humani genski segment V. U jednom specifičnom aspektu, genski segment V je humani genski segment Vk.
U jednom aspektu, prvi i/ili drugi CDR3 imaju najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, prvi CDR3 je kodiran od strane nukleinsko kiselinske sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, prvi CDR3 se uglavnom sastoji od aminokiselina poreklom od humanog genskog segmenta V lakog lanca i humanog genskog segmenta J lakog lanca, i drugi CDR3 se uglavnom sastoji od aminokiselina poreklom od humanog genskog segmenta V lakog lanca i humanog genskog segmenta J lakog lanca. U jednom aspektu, prvi CDR3 je poreklom od nukleoinsko kiselinske sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N. U jednom aspektu, prvi CDR3 je poreklom od ne više od dva genska segmenta, pri čemu ne više od dva genska segmenta su humani genski segment Vki humani genski segment Jk; i drugi CDR3 je poreklom od ne više od dva genska segmenta, pri čemu ne više od dva genska segmenta su humani genski segment Vki humani genski segment J izabran od humanog genskog segmenta Jk, humanog genskog segmenta JA, i humanog genskog segmenta JH. U jednom aspektu, prvi CDR3 je poreklom od ne više od dva genska segmenta, pri čemu ne više od dva genska segmenta su humani genski segment VA i humani genski segment J izabran od humanog genskog segmenta Jk, humanog genskog segmenta JA i humanog genskog segmenta Jh.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji ne sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od genskog segmenta DH, pri čemu IgG sadrži prvi polipeptid koji ima prvi VLdomen fuzionisan sa mišjim CLregionom i drugi polipeptid koji ima drugi VLdomen fuzionisan sa mišjim Chregionom, pri čemu prvi VLdomen i drugi VLdomen nisu identični. U jednom aspektu, prvi i drugi Vldomen su poreklom od različitih genskih segmenata V. U sledećem aspektu, prvi i drugi Vldomen su poreklom od različitih genskih segmenata J. U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomen su poreklom od identičnih genskih segmenata V i J, pri čemu drugi VLdomen sadrži veći broj somatskih hipermutacija u poređenju sa prvim VLdomenom.
U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomen su nezavisno izabrani od humanog i mišjeg VLdomena. U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomen su nezavisno izabrani od Vki VA- domena. U jednom specifičnom aspektu, prvi VLdomen je izabran od Vkdomena i VA domena, i drugi VLdomen je Vkdomen. U sledećem specifičnom aspektu, Vkdomen je humani Vkdomen.
U jednom aspektu, opisan je miš, pri čemu se sav ili značajno sav IgG stvoren od strane miša uglavnom sastoji od lakog lanca koji ima prvi humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CLdomenom, i težak lanac koji ima drugi humani VLdomen fuzionisan sa mišjim Chdomenom. U jednom aspektu, humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CHdomenom je humani Vkdomen.
U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni nisu identični.
U jednom aspektu, opisan je miš, pri čemu se najmanje 10%, 20%>, 30%, 40%>, 50%, 60%, 70%o, 80%o, 90%o, 95%o ili oko 100% imunoglobulina G stvorenog od strane miša uglavnom sastoji od dimera (a) prvog polipeptida koji se uglavnom sastoji od VLdomena imunoglobulina i CLregiona imunoglobulina; i, (b) drugog polipeptida od ne više od 535 aminokiselina u dužinu, pri čemu su drugi polipeptid uglavnom sastoji od Chregiona i V domena kome nedostaje sekvenca poreklom od genskog segmenta DH.
U jednom aspektu, drugi polipeptid je oko 435-535 aminokiselina u dužinu. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je oko 435-530 aminokiselina u dužinu. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je oko 435-525 aminokiselina u dužinu. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je oko 435-520 aminokiselina u dužinu. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je oko 435-515 aminokiselina u dužinu.
U jednom aspektu, kod oko 90% ili više IgG stvorenog od strane miša drugi polipeptid nije veći od oko 535 aminokiselina u dužinu.
U jednom aspektu, kod oko 50%> ili više IgG stvorenog od strane miša drugi polipeptid nije veći od oko 535 aminokiselina u dužinu. U jednom aspektu, kod oko 50%> ili više imunoglobulina G stvorenog od strane miša drugi polipeptid nije veći od oko 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455 ili 450 aminokiselina u dužinu. U jednom aspektu, oko 60%, 70%, 80%, 90% ili 95 % ili više IgG stvorenog od strane miša je navedene dužine. U specifičnom aspektu, sav ili značajno sav IgG stvoren od strane miša je navedene dužine.
U jednom aspektu, V domen drugog polipeptida je VLdomen. U specifičnom aspektu, V domen drugog polipeptida je izabran od VkiVkdomena. U specifičnom aspektu, V domen drugog polipeptida je humani VkiliVkdomen.
U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira iz nukleotidne sekvence u svojoj klicinoj liniji polipeptid koji sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca( npr.,sekvencu V i/ili J), sekvencu DHi konstantni region teškog lanca.
U jednom aspektu, miš eksprimira polipeptid iz endogenog mišjeg lokusa teškog lanca koji sadrži zamenu svih ili značajno svih funkcionalnih endogenih mišjih genskih segmenata varijabilnog lokusa teškog lanca sa množinom humanih genskih segmenata na endogenom mišjem lokusu teškog lanca.
U jednom aspektu, polipeptid sadrži VLdomen poreklom od genskog segmentaVkili Vk, polipeptid sadrži CDR3 poreklom od genskog segmenta DHi polipeptid sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta Jhili JA ili Jk.
U jednom aspektu, miš sadrži endogeni mišji lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži zamenu svih funkcionalnih genskih segmenata VHsa jednim ili više humanih genskih segmenataYklakog lanca, pri čemu je svaki od jednog ili više humanih genskih segmenata VA- postavljen na nishodnoj strani 23-merno udaljene rekombinacione signalne sekvence (RSS), pri čemu su genski segmenti VA- funkcionalno vezani za humani ili mišji genski segment DHkoji je postavljen ushodno ili nishodno od 12-merno udaljene RSS; genski segment DHje funkcionalno vezan sa genskim segmentom J postavljenim ushodno sa 23-merno udaljenom RSS koji je pogodan za rekombinaciju sa 12-merno udaljenom RSS koji je postavljen pored genskog segmenta DH; pri čemu genski segmenti V, DHi J su funkcionalno vezani za nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca.
U jednom aspektu, miš sadrži endogeni mišji lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži zamenu svih funkcionalnih genskih segmenata VHsa jednim ili više humanih genskih segmenata Vkod kojih je svaki postavljen na nishodnoj strani sa 12-merno udaljenom rekombinacionom signalnom sekvencom (RSS), pri čemu su genski segmenti V funkcionalno vezani za humani ili mišji genski segment DHkoji je postavljen i ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS; genski segment DHje funkcionalno vezan sa genskim segmentom J postavljenim na ushodnoj strani sa 12-merno udaljenom RSS koja je pogodna za rekombinovanje sa 23-merno udaljenom RSS postavljenom pored genskog segmenta DH; pri čemu genski segmenti V, DHi J su funkcionalno vezani za nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca.
U jednom aspektu, konstantni region teškog lanca je endogeni mišji konstantni region teškog lanca. U jednom aspektu, nukleinsko kiselinska sekvenca kodira sekvencu izabranu od CH1, zglobnog regiona, Ch2, Ch3 i njihovih kombinacija. U jednom aspektu, jedan ili više od ChI, zglobnog regiona, Ch2 i Ch3 su humani.
U jednom aspektu, miš sadrži endogeni mišji lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži zamenu svih funkcionalnih genskih segmenata VHsa množinom humanih genskih segmenata VA- ili Vkod kojih je svaki postavljen nishodno sa 23-merno udaljenom RSS, množinom humanih genskih segmenata DHpostavljenih i ushodno i nishodno sa 12-merno udaljenom RSS, množinom humanih genskih segmenata J (JHili JA, ili Jk) postavljenih i ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS, pri čemu lokus sadrži endogenu mišju sekvencu konstantnog regiona izabranu od Cnl, zglobnog regiona, Cn2, Cn3 i njihove kombinacije. U specifičnom aspektu, miš sadrži sve ili značajno sve funkcionalne humane genske segmente VA- ili Vk, sve ili značajno sve funkcionalne humane genske segmente DHi sve ili značajno sve genske segmente Jhili JA, ili Jk.
U jednom aspektu, miš eksprimira antigen-vezujući protein koji sadrži (a) polipeptid koji sadrži humani domen lakog lanca vezan za konstantni region teškog lanca koja sadrži mišju sekvencu; i (b) polipeptid koji sadrži humani varijabilni domen lakog lanca vezan za humani ili mišji konstantni region lakog lanca. U specifičnom aspektu, sekvenca lakog lanca je humana sekvenca lakog lanca, i posle izlaganja proteazi koja je sposobna da čepa antitelo u Fc i Fab, formiran je poptuno humani Fab koji sadrži najmanje četiri CDR lakog lanca, pri čemu najmanje četiri CDR lakog lanca su izabrani od A, sekvenci,ksekvenci i njihove kombinacije. U jednom aspektu, Fab sadrži najmanje pet CDR lakog lanca. U jednom aspektu, Fab sadrži šest CDR lakog lanca. U jednom aspektu, najmanje jedan CDR Fab sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta VA ili genskog segmenta Vk, i najmanje jedan CDR dalje sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta D. U jednom aspektu, najmanje jedan CDR je CDR3 i CDR je poreklom od humanog genskog segmenta Vk, humanog genskog segmenta D i humanog genskog segmenta Jk.
U jednom aspektu, polipeptid sadrži varijabilni region poreklom od humanog genskog segmenta VA ili Vk, humanog genskog segmenta Dn i humanog genskog segmenta Jn ili JA ili Jk. U jednom specifičnom aspektu, konstantni region teškog lanca je porekom od humane CH1 i mišje CH2 i mišje CH3 sekvence.
U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži u svojoj klicinoj liniji nerearanžirani humani genski segment Vkili VA, funkcionalno vezan za humani genski segment J i konstantni region teškog lanca, pri čemu miš eksprimira VLvezujući protein koji sadrži humani Vkdomen fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca, i pri čemu miševi ispoljavaju populaciju B ćelija slezine koje eksprimiraju Vlvezujuće proteine u CD19<+>B ćelijama, uključujući prelazne B ćelije (CD19<+>IgM<hi>IgD<int>) i zrele B ćelije (CD19<+>IgM<int>IgD<hi>).
U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži u svojoj klicinoj liniji nerearanžirani humani genski segment Vkili VA, funkcionalno vezan za humani genski segment J i konstantni region teškog lanca, pri čemu miš eksprimira na B ćeliji imunoglobulin koji sadrži varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca, pri čemu populacija limfocita u koštanoj srži miševa ispoljava pro/pre B ćelijsku populaciju koja je približno ista u broju kao u pro/pre B ćelijskoj populaciji miša divljeg tipa (limfociti u koštanoj srži).
U jednom aspektu, miševi sadrže najmanje 6 nerearanžiranih genskih segmenata hVKijedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata hJK, i miševi sadrže limfocitima-detektovanu i ćelijsku populaciju IgM<+>slezine koja eksprimira VLvezujući protein, pri čemu je populacija najmanje 75% veličine limfocitima-detektovane i ćelijske populacije IgM<+>slezine miša divljeg tipa.
U jednom aspektu, miševi ispoljavaju zrelu B ćelijski-detektovanu (CD19<+>) populaciju splenocita IgD<+>ćelija i IgM<+>ćelija kojih je ukupno oko 90%; u jednom aspektu, zrela B ćelijski-detektovana (CD19<+>) populacija splenocita IgD<+>ćelija i IgM<+>ćelija modifikovanog miša je približno ista( npr.,unutar 10%>, ili unutar 5%) kao ukupne IgD<+>ćelije i IgM<+>ćelije miša divljeg tipa koje su zrele B ćelijski-detektovane (CD19<+>) splenocite.
U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira imunoglobulinski protein iz modifikovanog endogenog lokusa teškog lanca u svojoj klicinoj liniji, pri čemu modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca nedostaje funkcionalni mišji genski segment V teškog lanca i lokus sadrži nerearanžirane genske segmente V lakog lanca i nerearanžirane genske segmente J, pri čemu su nerearanžirani genski segmenti V lakog lanca i nerearanžirani genski segmenti J funkcionalno vezani sa konstantnim regionom teškog lanca; pri čemu se imunoglobulinski protein uglavnom sastoji od prvog polipeptida i drugog polipeptida, pri čemu prvi polipeptid sadrži domen lakog lanca imunoglobulina i konstantni region teškog lanca imunoglobulina, i drugi polipeptid sadrži varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina i konstantni region lakog lanca.
U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira imunoglobulinski protein, pri čemu imunoglobulinskom proteinu nedostaje varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, i imunoglobulinski protein sadrži prvi varijabilni domen poreklom od genskih segmenata lakog lanca, i drugi varijabilni domen poreklom od genskih segmenata lakog lanca, pri čemu prvi varijabilni domen i drugi varijabilni domen su srodni međusobno, pri čemu prvi i drugi varijabilni domeni lakog lanca nisu identični, i pri čemu se prvi i drugi varijabilni domeni lakog lanca spajaju i kada su spojeni specifično vezuju antigen od interesa.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara od nerearanžiranih genskih segmenata u svojoj klicinoj liniji imunoglobulinski protein koji sadrži varijabilne domene koji su potpuno poreklom od genskih segmenata koji se uglavnom sastoje od nerearanžiranih humanih genskih segmenata, pri čemu imunoglobulinski protein sadrži konstantni region lakog lanca imnunoglobulina i konstantni region teškog lanca imunoglobulina izabran iz grupe koja se sastoji od ChI, zglobnog regiona, Ch2, Ch3 i njihove kombinacije.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara od nerearanžiranih genskih segmenata u svojoj klicinoj liniji imunoglobulinski protein koji sadrži varijabilne domene, pri čemu su svi CDR3 svih varijabilnih regiona stvoreni potpuno od genskih segmenata V i J lakog lanca, i izborno jedne ili više somatskih hipermutacija,npr.,jedne ili više adicija N.
U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara somatski mutirani imunoglobulinski protein poreklom od nerearanžiranog humanog genskog segmenta varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina u klicinoj liniji miša, pri čemu imunoglobulinskom proteinu nedostaje CDR koji sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta D, pri čemu imunoglobulinski protein sadrži prvi CDR3 na varijabilnom domenu lakog lanca fuzionisan sa konstatnim regionom lakog lanca, sadrži drugi CDR3 na varijabilnom domenu lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca i pri čemu drugi CDR3 je poreklom od rearanžirane sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U jednom aspektu, obezbeđen je miš kao što je ovde opisan, pri čemu miš sadrži funkcionalno ugašen lokus lakog lanca izabran od X lokusa,klokusa i njihove kombinacije. U jednom aspektu, miš sadrži delecijuXi/iliklokusa, u celini ili delimično, tako da jeXi/iliklokus nefunkcionalan.
U jednom aspektu, obezbeđen je mišji embrion, koji sadrži ćeliju koja sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, miš je himera i najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% ćelija embriona sadrže modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, najmanje 96%. 97%, 98%, 99% ili 99.8%> ćelija embriona sadrže modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, embrion sadrži ćeliju domaćina i ćeliju poreklom od donorske ES ćelije, pri čemu ćelija poreklom od donorske ES ćelije sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, embrion je embrion domaćina na stadijumu 2-, 4-, 8, 16-, 32 ili 64-ćelije, ili blastocista, i dalje sadrži donorsku ES ćeliju koja sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan.
U jednom aspektu, obezbeđen je miš ili ćelija stvoreni upotrebom konstrukta nukleinske kiseline kao što je ovde opisan.
U jednom aspektu, obezbeđen je miš stvoren upotrebom ćelije koja je opisana ovde. U jednom aspektu, ćelija je mišja ES ćelija.
U jednom aspektu, upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira prvu humanu varijabilnu sekvencu lakog lanca imunoglobulina (VL1) koja je srodna sa drugom humanom varijabilnom sekvencom lakog lanca imunoglobulina (VL2), pri čemu VL1 fuzionisan sa humanim konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina (polipeptid 1) eksprimira se sa VL2 fuzionisanim sa humanim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina (polipeptid 2), kao dimer polipeptida 1/polipeptida 2, da bi se formiralo Vl1-Vl2 antitelo.
U jednom aspektu, upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira humanu varijabilnu sekvencu lakog lanca imunoglobulina koja je fuzionisana sa humanom sekvencom teškog lanca imunoglobulina, pri čemu nukleinsko kiselinska sekvenca kodira humani Vl-Chpolipeptid, pri čemu se humani Vl-Chpolipeptid eksprimira kao dimer, i pri čemu se dimer eksprimira u odsustvu lakog lanca imunoglobulina{ npr.,u odsustvu humanog A, ili humanogKlakog lanca). U jednom aspektu, VL-CHdimer specifično vezuje antigen od interesa u odsustvuXlakog lanca i u odsustvuklakog lanca.
U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira sav ili deo varijabilnog domena imunoglobulina. U jednom aspektu, varijabilni domen imunoglobulina je humaniVXili humani Vk.
U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje potpuno humanog Fab (koji sadrži prvi humani Vlfuzionisan sa humanim konstantnim regionom lakog lanca i drugim humanim VLfuzionisanim sa humanom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca) ili potpuno humani F(ab)2.
U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje besmrtne ćelijske linije. U jednom aspektu, besmrtna ćelijska linija sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira humaniYXili Vkdomen funkcionalno vezan za nukleinsko kiselinsku sekvencu koja sadrži mišju nukleinsko kiselinsku sekvencu konstantnog regiona.
U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisan za stvaranje hibridoma ili kvadroma.
U jednom aspektu, opisana je ćelija, koja sadrži modifikovani lokus imunoglobulina kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, ćelija je izabrana od totipotentne ćelije, pluripotentne ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije (iPS) i ES ćelije. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja ćelija,npr.,mišja ES ćelija. U jednom aspektu, ćelija je homozigotna za modifikovani lokus imunoglobulina.
U jednom aspektu, opisana je ćelija, koja sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira prvi polipeptid koji sadrži prvi somatski mutirani humani Vkili VA, domen fuzionisan sa humanim genom za konstantni region teškog lanca.
U jednom aspektu, ćelija dalje sadrži drugi polipeptidni lanac koji sadrži drugi somatski mutirani humani Vkili VA, domen fuzionisan sa humanim konstantnim regionom lakog lanca. U jednom aspektu, humani Vkili VA- domen prvog polipeptida je srodan sa humanim Vkili VA, domenom drugog polipeptida.
U jednom aspektu, Vkili VA, prvog polipeptida i humani Vkili VA, drugog polipeptida kada su spojeni specifično vezuju antigen od inetersa. U specifičnom aspektu, prvi polipeptid sadrži varijabilni domen koji se uglavnom sastoji od humanog Vkdomena i drugi polipeptid sadrži varijabilni domen koji se sastoji od humanog Vkdomena koji je srodan sa humanim Vkdomenom prvog polipeptida, i humani konstantni region je IgG sekvenca.
U jednom aspektu, ćelija je izabrana od CHO ćelije, COS ćelije, 293 ćelije, HeLa ćelije i humane retinalne ćelije koje eksprimiraju virusnu nukleinsko kiselinsku sekvencu{ npr.,PERC.6™ ćeliju).
U jednom aspektu, opisana je somatska mišja ćelija, koja sadrži hromozom koji sadrži genetičku modifikaciju kao što je ovde opisana.
U jednom aspektu, opisana je mišja klicina ćelija, koja sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu koja sadrži genetičku modifikaciju kao stoje ovde opisana.
U jednom aspektu, opisana je pluripotentna, indukovana pluripotentna ili totipotentna ćelija poreklom od miša kao što je ovde opisan. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja embrionalna matična (ES) ćelija.
U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije kao što je ovde opisana za proizvodnju miša, ćelije ili terapeutskog proteina{ npr.,antitelo ili drugi antigen-vezujući protein).
U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS. U specifičnom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži homologni krak koji je homologan sa humanom genomskom sekvencom koja sadrži humane genske segmente Vk. U jednom aspektu, ciljni kontrukt sadrži sve ili značajno sve humane genske segmente DHod kojih je svaki postavljen ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS.
U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani genski segment Jkpostavljen ushodno sa 12-merno udaljenom RSS. U specifičnom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadži prvi homologi krak koji sadrži homologiju sa humanom genomskom genskom sekvencom DHkoja je postavljena ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugi homologi krak koji sadrži homologiju sa humanom genomskom genskom sekvencom J ili koji sadrži homologiju sa mišjom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca ili koji sadrži homologiju sa J-C intergenom sekvencom ushodno od mišje sekvence konstantnog regiona teškog lanca. U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani genski segment VA. postavljen nishodno sa 23-merno udaljenom RSS, humani genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 12-merno udaljenom RSS i humani genski segment J izabran od genskog segmenta Jkpostavljenog ushodno sa 23-merno udaljenom RSS, humani genski segment JA, postavljen ushodno sa 23-merno udaljenom RSS, i humani genski segment JHpostavljen ushodno sa 23-merno udaljenom RSS. U jednom aspektu, konstrukt sadrži homologi krak koji sadrži homologiju sa mišjom sekvencom konstantnog regiona, J-C intergenom mišjom sekvencom i/ili humanom VA. sekvencom.
U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži humani varijabilni regionklakog lanca koji sadrži fragment klastera A humanog lokusaklakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera A humanog lokusaklakog lanca se pruža od hVA.3-27 do hVA.3-1.
U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži humani varijabilni regionklakog lanca koji sadrži fragment klastera B humanog lokusaklakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera B humanog lokusaklakog lanca se pruža od hVA5-52 do hVAJ-40.
U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži humani varijabilni regionklakog lanca koji sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom aspektu, humani varijabilni regionklakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan genski segment klastera B.
U jednom aspektu, humani varijabilni regionklakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera B i najmanje jedan genski segment klastera C.
U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži humani genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS koja se normalno nalazi u prirodi i koja fiankira genski segment Jk, JH, VA. ili VH. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži prvi homologi krak koji je homolog sa humanim V-J intergenim regionom ili homolog sa humanom genomskom sekvencom koja sadrži humani genski segment V. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugi homologi krak koji je homolog sa humanom ili mišjom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca. U jednom specifičnom aspektu, humani ili mišji konstantni region teškog lanca je izabran od ChI, zglobnog regiona, Ch2, Ch3 i njihove kombinacije. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži humani genski segment J flankiran ushodno sa 12-mernom RSS. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugi homologi krak koji sadrži homologiju sa genskim segmentom J flankiranim sa 12-mernom RSS. U jednom aspektu, genski segment J je izabran od humanog genskog segmenta Jk, humanog genskog segmenta JA i humanog genskog segmenta Jh.
U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 23-merno udaljenom RSS, i sekvencu koju prepoznaje rekombinaza koja je specifična za mesto,npr.,sekvenca koju prepoznaje rekombinaza specifičnu za mesto kao što je Cre, Flp ili Dre protein.
U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani genski segment VA. ili humani genski segment Vk, genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 12-merno ili 23-merno udaljenom RSS, i humani genski segment J sa 12-merno ili 23-merno udaljenom RSS, pri čemu je 12-merno ili 23-merno udaljena RSS postavljena neposredno 5' prema humanom genskom segmentu J( tj.,u odnosu na smer transkripcije). U jednom aspektu, konstrukt sadrži humani genski segment VA, postavljen pored 3' 23-merno udaljene RSS, humani genski segment Dn postavljen ushodno i nishodno sa 12-merno udaljenom RSS i humani genski segment Jkpostavljen pored 5' 23-merno udaljene RSS. U jednom aspektu, konstrukt sadrži humani genski segment Vkpostavljen pored 3' 12-merno udaljene RSS, humani genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno pored 23-merno udaljene RSS i humani genski segment JA, postavljen pored 5' 12-merno udaljene RSS.
U jednom aspektu, obezbeđen je ciljni vektor, koji sadrži (a) prvi ciljni krak i drugi ciljni krak, pri čemu su prvi i drugi ciljni kraci nezavisno izabrani od humanih i mišjih ciljnih kraka, pri čemu ciljni kraci usmeravaju vektor ka endogenom ili modifikovanom genskom lokusu V regiona imunoglobulina; i, (b) kontinuiranu sekvencu humanih genskih segmenata Vlili kontinuiranu sekvencu humanih genskih segmenata Vli najmanje jedan humani genski segment Jk, pri čemu je kontinuirana sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od (i) 1iVk4-1 do hVKl-6 i JkI, (ii) 1iVk4-1 do hVKl-6 i JkI do Jk2, (iii) 1iVk4-1 do hVKl-6 i JkI do Jk3, (iv) hVK4-l do hVKl-6 i JkI do Jk4, (v) 1iVk4-1 do hVKl-6 i JkI do Jk5, (vi) 1iVk3-7 do hVKl-16, (vii) hVKl-17 do 1iVk2-30, (viii) 1iVk3-31 do 1iVk2-40, i (ix) njihovu kombinaciju. U jednom aspektu, ciljni kraci koji usmeravaju vektor ka endogenom ili modifikovanom lokusu imunoglobulina su identični ili značajno identični sekvenci na endogenom ili modifikovanom lokusu imunoglobulina.
U jednom aspektu, opisana je upotreba konstrukta nukleinske kiseline kao što je ovde opisan za proizvodnju miša, ćelije ili terapeutskog proteina( npr.,antitelo ili drugi antigen-vezujući protein).
U jednom aspektu, opisana je upotreba nukleinsko kiselinske sekvence iz miša kao što je ovde opisana za stvaranje ćelijske linije za proizvodnju humanog leka. U jednom aspektu, humani lek je vezujući protein koji sadrži humanu varijabilnu sekvencu lakog lanca( npr.,poreklom od humanog genskog segmenta VA, ili humanog genskog segmenta Vk) fuzionisanu sa humanim konstantnim regionom teškog lanca. U jednom aspektu, humani lek sadrži prvi polipeptid koji je humani A iliklaki lanac imunoglobulina i drugi polipeptid koji sadrži humani varijabilni domen VA ili humani varijabilni domen Vkfuzionisan sa humanim konstantnim regionom teškog lanca.
U jednom aspektu, opisan je ekspresioni sistem, koji sadrži sisarsku ćeliju transficiranu sa DNK konstruktom koji kodira polipeptid koji sadrži somatski mutirani humani VLdomen fuzionisan sa humanim Chdomenom.
U jednom aspektu, ekspresioni sistem dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VLdomen imunoglobulina fuzionisan sa humanim CLdomenom, pri čemu VLdomen fuzionisan sa humanim CLdomenom je srodni laki lanac sa VLdomenom fuzionisanim sa humanim CHdomenom.
U jednom aspektu, sisarska ćelija je izabrana od CHO ćelije, COS ćelije, Vero ćelije, 293 ćelije i retinalne ćelije koja eksprimira virusni gen{ npr.,PER.C6™ ćelija).
U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje vezujućeg proteina, koji sadrži dobijanje nukleotidne sekvence koja kodira VLdomen iz gena koji kodira Vldomen fuzionisan sa Chregionom iz ćelije miša kao što je ovde opisan, i kloniranje nukleotidne sekvence koja kodira VLdomen u okviru sa genom koji kodira humani Cn region da bi se formirala humana sekvenca vezujućeg proteina, koja eksprimira humani vezujući protein u pogodnoj ćeliji. U jednom aspektu, mišje imunizovan sa antigenom od interesa, i Vldomen fuzionisan sa Chregionom specifično vezuje( npr.,sa Kdu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu) epitop antigena od interesa. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira VLdomen fuzionisan sa CHregionom je somatski mutirana u mišu.
U jednom aspektu, pogodna ćelija je izabrana od B ćelija, hibridoma, kvadroma, CHO ćelije, COS ćelije, 293 ćelije, HeLa ćelije i humane retinalne ćelije koja eksprimira virusnu nukleinsko kiselinsku sekvencu( npr.,PERC.6™ ćelija).
U jednom aspektu, Chregion sadrži humani IgG izotip. U specifičnom aspektu, humani IgG je izabran od IgGl, IgG2 i IgG4. Sledećem specifičnom aspektu, humani IgG je IgGl. U sledećem specifičnom aspektu, humani IgG je IgG4. U sledećem specifičnom aspektu, humani IgG4 je modifikovani IgG4. U jednom aspektu, modifikovani IgG4 sadrži supstituciju u zglobnom regionu. U specifičnom aspektu, modifikovani IgG4 sadrži supstituciju na aminokiselinskom ostatku 228 u odnosu na divlji tip humanog IgG4, numerisan prema EU indeksu numeracije Kabat-a. U specifičnom aspektu, supstitucija na aminokielinskom ostatku 228 je S228P supstitucija, numerisana prema EU indeksu numeracije Kabat-a.
U jednom aspektu, ćelija dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VLdomen iz lakog lanca koji je srodan sa Vldomenom fuzionisanim sa Chregionom, i postupak dalje sadrži ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira srodni Vldomen fuzionisan sa humanim Ckili CA, domenom.
U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša, koji sadrži zamenu na endogenom mišjem lokusu teškog lanca jednog ili više genskih segmenata miša teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više humanih genskih segmenata lakog lanca imunoglobulina. U jednom aspektu, izvodi se zamena svih ili značajno svih funkcionalnih mišjih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina( tj.,genskih segmenata Vn, Dn i Ju) sa jednim ili više funkcionalnih humanih genskih segmenata lakog lanca( tj.,Vli Jlsegmenti). U jednom aspektu, izvodi se zamena svih ili značajno svih funkcionalnih mišjih genskih segmenata VH, DHi Jhteškog lanca sa svim ili značajno svim humanim genskim segmentima VA ili Vki najmanje jednim genskim segmentom JA ili Jk. U specifičnom aspektu, zamena obuhvata sve ili značajno sve funkcionalne humane genske segmente JA, ili Jk.
U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje miša koji eksprimira polipeptid koji sadrži sekvencu poreklom od humanog genskog segmenta VA, ili Vki/ili JA ili Jkimunoglobulina fuzionisanu sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca, koja sadrži zamenu endogenih mišjih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca imunoglobulina (Vh, Dhi Jh) sa najmanje jednim humanim genskim segmentom VA, ili Vki najmanje jednim humanim genskim segmentom JA. ili Jk, pri čemu je zamena u pluripotentoj, indukovanoj pluripotentnoj ili totipotentnoj mišjoj ćeliji da bi se formirala genetički modifikovana mišja progenitorska ćelija; genetički modifikovana mišja progenitorska ćelija je uvedena u mišjeg domaćina; i, mišji domaćin koji sadrži genetički modifikovanu progenitorsku ćeliju je podvrgnut gestaciji da bi se fomirao miš koji sadrži genom poreklom od genetički modifikovane mišje progenitorske ćelije. U jednom aspektu, domaćin je embrion. U specifičnom aspektu, domaćin je izabran od mišje pre-morule( npr.,stadijum od 8- ili 4-ćelija), tetraploidnog embriona, agregata embrionalnih ćelija ili blastocista.
U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša kao što je ovde opisan, koji sadrži uvođenje putem jedarnog transfera nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju kao što je opisana ovde u ćeliju, i održavanje ćelije pod pogodnim uslovima
( npr.,uključujući kultivisanje ćelije i gestaciju embriona koji sadrži ćeliju u majci surogatu)
da bi se razvio u miša kao što je ovde opisan.
U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje modifikovanog miša, koji sadrži modifikaciju kao što je ovde opisana mišje ES ćelije ili pluripotentne ili totipotentne ili indukovane pluripotentne mišje ćelije da bi se obuhvatio jedan ili više nerearanžiranih varijabilnih genskih segmenata lakog lanca imunoglobulina funkcionalno vezanih za konstantnu sekvencu teškog lanca imunoglobulina, kultivisanje ES ćelije, uvođenje kultivisane ES ćelije u embrion domaćina da bi se formirao himerni embrion i uvođenje himernog embriona u pogodnog miša domaćina da bi se razvio u modifikovanog miša. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina su humani A, ili humaniKgenski segmenti. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina sadrže humane genske segmente VA ili humane genske segmente Vki jedan ili više genskih segmenata JA,, Jkili JH. U jednom aspektu, konstantna genska sekvenca teškog lanca je humana sekvenca izabrana od CH1, zglobnog regiona, CH2, CH3 i njihove kombinacije. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih varijabilnih genskih segmenata lakog lanca imunoglobulina menjaju sve ili značajno sve funkcionalne endogene mišje genske segmente varijabilnog regiona teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, i konstantna sekvenca teškog lanca je mišja sekvenca koja sadrži CH1, zglobni region, CH2 i CH3. U jednom aspektu, opisan je varijabilni region imunoglobulina (VR)( npr.,koji sadrži humani genski segment VLfuzionisan sa humanim JLili Jhili Dhi Jhili DHi Jl) stvoren u mišu kao što je ovde opisan. U specifičnom aspektu, VR imunoglobulina je poreklom iz humanog genskog segmenta klicine linije izabranog od genskog segmenta Vki genskog segmenta VA, pri čemu je VR kodiran od strane rearanžirane sekvence iz miša, pri čemu je rearanžirana sekvenca somatski hipermutirana. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži 1 do 5 somatskih hupermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži najmanje 6, 7, 8, 9 ili 10 somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži više od 10 somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca je fuzionisana sa jednom ili više humanih ili mišjih sekvenci konstantnog regiona teškog lanca( npr.,izabrana od humanih ili mišjih ChI, zglobnog regiona, Ch2, Ch3 i njihove kombinacije).
U jednom aspektu, opisana je aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina vezujućeg proteina stvorena u mišu kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, VR je fuzionisan sa jednom ili više humanih ili mišjih sekvenci konstantnog regiona teškog lanca( npr.,izabrane od humanih ili mišjih ChI, zglobnog regiona, Ch2, Ch3 i njihove kombinacije).
U jednom aspektu, opisan je varijabilni domen lakog lanca kodiran nukleinsko kiselinskom sekvencom poreklom od miša kao što je ovde opisan.
U jednom aspektu, opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment( npr.,Fab, F(ab)2, scFv) stvoren u mišu kao što je ovde opisan, ili poreklom od sekvence stvorene u mišu kao što je ovde opisan.
KRATAK OPIS SLIKA
SI. 1A ilustruje šemu (nije u razmeri) mišjeg lokusa teškog lanca. Mišji lokus teškog lanca je oko 3 Mb u dužinu i sadrži približno 200 varijabilnih (Vh) genskih segmenata teškog lanca, 13 raznovrsnih (Dn) genskih segmenata teškog lanca i 4 spajajućih (Jn) genskih segmenata teškog lanca kao i pojačivače (Enh) i konstantne regione teškog lanca (CH).
SI.1B ilustruje šemu (nije u razmeri) humanog lokusaklakog lanca. Humani lokusklakog lanca je dupliciran u distalne i proksimalne dodirne sekvence suprotnog polariteta koji obuhvataju 440 kb i 600 kb, respektivno. Između dve dodirne sekvence je oko 800 kb DNK za koju se veruje daje bez genskih segmenata Vk. Humani lokusklakog lanca sadrži oko 76 genskih segmenata Vk, 5 genskih segmenata Jk, intronski pojačivač (Enh) i jedan konstantni region (Ck).
SI. 2 Prikazuje strategiju ciljnog delovanja za progresivnu inserciju 40 humanih Vki 5 humanih Jkgenskih segmenata u mišji lokus teškog lanca. Selekcione kasete higromicina (HYG) i neomicina (NEO) su prikazane sa mestima za prepoznavanje rekombinaze (Rl, R2, itd.).
SI. 3 prikazuje modifikovani mišji lokus teškog lanca koji sadrži humane Vki Jkgenske segmente funkcionalno vezane za mišje CHregione.
SI. 4A prikazuje primer strategije ciljnog delovanja za progresivnu inserciju humanog VA, i pojedinačnog humanog JA. genskog segmenta u mišji lokus teškog lanca. Selekcione kasete higromicina (HYG) i neomicina (NEO) su prikazane sa mestima za prepoznavanje rekombinaze (Rl, R2, itd.).
SI. 4B prikazuje primer strategije ciljnog delovanja za progresivnu inserciju humanih VA, i četiri humana JA genska segmenta u mišji lokus teškog lanca. Selekcione kasete higromicina (HYG) i neomicina (NEO) su prikazane sa mestima za prepoznavanje rekombinaze (Rl, R2, itd.).
SI. 5A prikazuje primer strategije ciljnog delovanja za progresivnu inserciju humanih VA, humanih DHi humanih JHgenskih segmenata u mišji lokus teškog lanca. Selekcione kasete higromicina (HYG) i neomicina (NEO) su prikazane sa mestima za prepoznavanje rekombinaze (Rl, R2, itd.).
SI. 5B prikazuje primer strategije ciljnog delovanja za progresivnu inserciju humanih VA., humanih DHi humanih Jkgenskih segmenata u mišji lokus teškog lanca. Selekcione kasete higromicina (HYG) i neomicina (NEO) su prikazane sa mestima za prepoznavanje rekombinaze (Rl, R2, itd.).
SI. 6A prikazuje grafikon sa konturama splenocita obojenih za površinsku ekspresiju B220 i IgM iz reprezentativnog divljeg tipa (WT) i reprezentativnog mišjeg homozigota za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom mišjem lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 6B prikazuje grafikon sa konturama splenocita detektovanih na CD19<+>B ćelijama i obojenih za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz reprezentativnog divljeg tipa (WT) i reprezentativnog mišjeg homozigota za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 6C prikazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, prelaznih B ćelija (CD19<+>IgM<hi>IgD<int>) i zrelih B ćelija (CD19<+>IgM<int>IgD<hl>) u sakupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu tekog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 7A prikazuje grafikon sa konturama koštane srži detektovane na singletima obojenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO). Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su zabeležene na svakom od grafikona sa tačkama.
SI. 7B prikazuje ukupan broj pre/pro (B220<+>IgM~), nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<hl>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 7C prikazuje grafikon sa konturama koštane srži detektovane na CD19<+>i obojenim za ckit<+>i CD43<+>iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO). Pro i pre B ćelije su zabeležene na svakom od grafikona sa tačkama.
SI. 7D prikazuje broj pro B (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre B (CD19<+>CD43"ckif) ćelija u koštanoj srži sakupljenih iz femura miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 7E prikazuje grafikone sa konturama koštane srži detektovane na singletima obojenim za CD 19 i CD43 iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO). Nezrele, pre i pro B ćelije su zabeležene na svakom od grafikona sa tačkama.
SI. 7F prikazuje histograme koštane srži detektovane na pre B ćelijama (CD19<+>CD43<int>) i koj<a>eksprimira imunoglobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
SI. 7G prikazuje broj IgM<+>pre B ćelija (CD19<+>IgM<+>CD43<int>) i nezrelih B ćelija (CD19+IgM+CD43~) u koštanoj srži sakupljenoj iz femura miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za šest humanih Vki pet humanih Jkgenskih segmenata koji se nalaze na endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO).
S1.8A prikazuje grafikone sa konturama splenocita detektovane na CD19<+>i obojenih zaIgk<+>i IgK<+>ekspresiju iz miša koji sadrži divlji tip lokusa teškog lanca i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentima (WT) i miša homozigotnog za trideset hVKi pet Jkgenskih segmenata na endogenom lokusu teškog lanca i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentima (30hVK-5hJKHO).
SI. 8B prikazuje grafikone sa konturama koštane srži detektovane na nezrelim (B220<i>ntIgM<+>) i zrelim (B220<hl>IgM<+>) B ćelijama obojenim za IgA. i IgKekspresiju izolovane iz femura miša koji sadrži divlji tip lokusa teškog lanca i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentima (WT) i miša homozigotnog za trideset hVKi pet Jkgenskih segmenata na endogenom lokusu teškog lanca i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentima (30hVK-5hJKHO).
SI. 9 prikazuje poravnanje nukleotidne sekvence VK-jK-mlgG spoja dvadest nezavisnih RT-PCR klonova amplifikovanih iz RNK splenocite iz imunološki naivnih miševa homozigotnih za trideset hVKi pet Jkgenskih segmenata na mišjem lokusu teškog lanca i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentom. Baze prikazane malim slovima prikazuju baze koje nisu iz klicine linije koje su rezultat mutacije i/ili adicije N u toku rekombinacije. Veštački razmaci (periodi) su uključeni da bi se propisno poravnao okvirni region 4 i prikazalo poravnanje mišje nukleotidne sekvence teškog lanca IgG za IgGl, IgG2a/c i IgG3 prajmovane klonove.
DETALJAN OPIS
Izraz "bispecifičan vezujući protein" obuhvata vezujući protein sposoban da selektivno vezuje dva ili više epitopa. Bispecifični vezujući proteini sadrže dva različita polipeptida koji sadrže prvi varijabilni domen lakog lanca (VlI) fuzionisan sa prvim Chregionom i drugi varijabilni domen lakog lanca (VL2) fuzionisan sa drugim CHregionom. Uopšteno, prvi i drugi CHregioni su identični, ili se razlikuju prema jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija( npr.,kao što su ovde opisane). VL1 i Vl2 specifično vezuju različite epitope—bilo na dva različita molekula( npr.,antigena) ili na istom molekulu( npr.,na istom antigenu). Ako bispecifičan vezujući protein selektivno vezuje dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet VL1 za prvi epitop će generalno biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri reda veličine niži od afiniteta VL1 za drugi epitop, i obrnuto u odnosu na Vl2. Epitopi koje prepoznaje bispecifičan vezujući protein mogu biti na istom ili na različitom ciljnom mestu( npr.,na istom ili različitom antigenu). Bispecifični vezujući proteini mogu biti stvoreni, na primer, kombinovanjem VL1 i VL2 koji prepoznaju različite epitope istog antigena. Na primer, nukleinsko kiselinske sekvence koje kodiraju Vlsekvence koje prepoznaju različite epitope istog antigena mogu biti fuzionisane sa nukleinsko kiselinskim sekvencama koje kodiraju različite Chregione, i takve sekvence mogu biti eksprimirane u ćeliji koja eksprimira laki lanac imunoglobulina ili mogu biti eksprimirane u ćeliji koja ne eksprimira laki lanac imunoglobulina. Tipičan bispecifičan vezujući protein ima dva teška lanca od kojih svaki ima tri CDR lakog lanca, nakon čega sledi (od N-terminusa do C-terminusa) ChI domen, zglobni region, Ch2 domen i Ch3 domen, i laki lanac imunoglobulina koji ne pruža antigen-vezujuću specifičnost, ali koji može da se spoji sa svakim teškim lancem, ili koji može da se spoji sa svakim teškim lancem i koji može da veže jedan ili više epitopa vezanih sa VL1 i/ili VL2, ili koji može da se spoji sa svakim teškim lancem i omogući vezivanje ili pomogne u vezivanju jednog ili oba teška lanca za jedan ili oba epitopa.
Prema tome, dva opšta tipa bispecifičnih vezujućih proteina su (1) VLl-CH(dimer) i (2) VL1-CH:laki lanac + VL2-CH:laki lanac, pri čemu je laki lanac isti ili različit. U svakom slučaju, CH( tj.,konstantni region teškog lanca) može biti različito modifikovan( npr.,da bi diferencijalno vezao protein A, da bi povećao polu-život u serumu,itd.)kao što je ovde opisano, ili može biti isti.
Termin "ćelija," kada je korišćen u vezi sa ekspresijom sekvence, obuhvata bilo koju ćeliju koja je pogodna za ekspresiju rekombinantne nukleinsko kiselinske sekvence. Ćelije obuhvataju one prokariota i eukariota (pojedinačna ćelija ili višestruke ćelije), bakterijske ćelije( npr.,sojeviE. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.),ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca( npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.),biljne ćelije, ćelije insekata( npr., SF- 9, SF- 21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.),ne-humane životinjske ćelije, humane ćelije, B ćelije ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim primerima izvođenja, ćelija je humana ćelija, ćelija majmuna, bezrepog majmuna, hrčka, pacova ili miša. U nekim primerima izvođenja, ćelija je eukariotska i izabrana je od sledećih ćelija: CHO( npr.,CHO Kl, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS( npr.,COS-7), retinalna ćelija, Vero, CV1, bubrega( npr.,HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60,( npr.,BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeva ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, tumorska ćelija i ćelijska linija poreklom od gore navedene ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena,npr.retinalna ćelija koja eksprimira virusni gen( npr.,PER.C6™ ćelija).
Termin "srodan," kada je korišćen u smislu "srodan sa,"npr.,prvi VLdomen koji je "srodan sa" drugim Vldomenom, je određen tako da obuhvata pozivanje na vezu između dva Vldomena iz istog vezujućeg proteina stvorenog od strane miša u skladu sa pronalaskom. Na primer, miš koji je genetički modifikovan u skladu sa aspektom predmetnog opisa,npr.,miš koji ima lokus teškog lanca u kome su genski segmenti VH, DHi Jhzamenjeni sa genskim segmentima VLi Jl, stvara vezujuće proteine slične antitelu koji imaju dva identična polipeptidna lanca stvorena od istog mišjeg Chregiona( npr.,IgG izotip) fuzionisanog sa prvim humanim VLdomenom, i dva identična polipeptidna lanca stvorena od istog mišjeg Clregiona fuzionisanog sa drugim humanim VLdomenom. U toku klonalne selekcije u mišu, prvi i drugi humani VLdomeni su izabrani pomoću procesa klonalne selekcije tako da se jave zajedno u kontekstu jednog vezujućeg proteina sličnog antitelu. Na taj način, prvi i drugi Vldomeni koji se javljaju zajedno, kao rezultat procesa klonalne selekcije, u jednom molekulu sličnom antitelu su označeni kao "srodni." Nasuprot tome, VLdomen koji se javlja u prvom molekulu slinom antitelu i VLdomen koji se javlja u drugom molekulu sličnom antitelunisu srodni, osim ukolikoprvi i drugi molekul sličan antitelu imaju identične teške lance( tj.,osim ukoliko su VLdomen fuzionisan sa prvim humanim regionom teškog lanca i Vldomen fuzionisan sa drugim humanim regionom teškog lanca identični).
Izraz "region koji određuje komplementarnost," ili termin "CDR," obuhvata aminokiselinsku sekvencu kodiranu od strane nukleinsko kiselinske sekvence gena za imunoglobulin organizma koja se normalno( tj.,u životinji divljeg tipa) javlja između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina( npr.,antitela ili receptora za T ćeliju). CDR može biti kodiran sa, na primer, sekvencom klicine linije ili rearanžiranom ili nerearanžiranom sekvencom, i, na primer, pomoću imunološki naivnih ili zrelih B ćelija ili T ćelija. U nekim slučajevima( npr.,za CDR3), CDR regioni mogu biti kodirani od strane dve ili više sekvenci( npr.,sekvenci klicine linije) koje nisu kontinuirane( npr.,u nerearanžiranoj nukleinsko kiselinskoj sekvenci), ali su kontinuirane u nukleinsko kiselinskoj sekvenci B ćelije,npr.,kao rezultat splajsinga ili spajanja sekvenci( npr.,V-D-J rekombinacija da bi se formirao CDR3 teškog lanca).
Izraz "genski segment," ili "segment" obuhvata pozivanje na V (lak ili težak) ili D ili J (lak ili težak) genski segment imunoglobulina, koji obuhvata nerearanžirane sekvence na lokusima imunoglobulina (u npr., ljudima i miševima) koje mogu da učestvuju u rearanžmanu (poredovanom preko,npr.,endogenih rekombinaza) da bi se formirala rearanžirana V/J ili V/D/J sekvenca. Osim ukoliko nije naznačeno drugačije, genski segmenti V, D i J sadrže rekombinacione signalne sekvence (RSS) koje omogućavaju] V/J rekombinaciju ili V/D/J rekombinaciju prema 12/23 pravilu. Osim ukoliko nije naznačeno drugačije, genski segmenti dalje sadrže sekvence sa kojima su spojeni u prirodi ili njihove funkcionalne ekvivalente( npr.,za promotor(e) i lider(e) genskih segmenata V).
Izraz "težak lanac," ili "težak lanac imunoglobulina" obuhvata konstantni region teškog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ukoliko nije drugačije naznačeno obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH). VHdomeni obuhvataju tri CDR regiona teškog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca obuhvataju CDR regione, CDR regione i FRs, i njihove kombinacije. Tipičan težak lanac se uglavnom sastoji od, posle varijabilnog domena (od N-terminusa do C-terminusa), CH1 domena, zglobnog regiona, CH2 domena, CH3 domena i izborno CH4 domena( npr.,u slučaju IgM ili IgE) i transmembranskog (M) domena( npr.,u slučaju za membranu-vezanog imunoglobulina na limfocitima). Konstantni region teškog lanca je region teškog lanca koji se pruža (od N-terminalne strane do C-terminalne strane) od izvan FR4 do C-terminusa teškog lanca. Konstantni regioni teškog lanca sa manjim devijacijama,npr.,skraćenjima od jedne, dve, tri ili nekoliko aminokiselina sa C-terminusa, bili bi obuhvaćeni izrazom "konstantni region teškog lanca," kao što su konstantni regioni teškog lanca sa modifikacijama sekvence,npr.,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih supstitucija. Aminokiselinske supstitucije mogu biti stvorene najednom ili više položaja izabranih od,npr.(u vezi sa EU numerisanjem konstantnog regiona imunoglobulina,npr.,humanog konstantnog regiona IgG), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 i 439. Na primer, i ne kao ograničenje, konstantni region teškog lanca može biti modifikovan tako da ispolji povećani polu-život u serumu (u poređenju sa istim konstantnim regionom teškog lanca bez navedene modifikacije(a)) i da ima modifikaciju na položaju 250( npr.,E ili Q); 250 i 428( npr.,L ili F); 252( npr.,LA7FAV ili T), 254( npr.,S ili T), i 256( npr.,S/R/O/E/D ili T); ili modifikaciju na 428 i/ili 433( npr.,L/R/SI/P/Q ili K) i/ili 434( npr.,H/F ili Y); ili modifikaciju na 250 i/ili 428; ili modifikaciju na 307 ili 308( npr.,308F, V308F) i 434. U sledećem primeru, modifikacija može da sadrži 428L( npr.,M428L) i 434S( npr.,N434S) modifikaciju; 428L, 2591( npr.,V259I), i 308F( npr.,V308F) modifikaciju; 433K( npr.,H433K) i 434( npr.,434Y) modifikaciju; 252, 254 i 256( npr.,252Y, 254T i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju( npr.,T250Q i M428L); 307 i/ili 308 modifikaciju( npr.,308F ili 308P).
Izraz "laki lanac" obuhvata konstantni region (Cl) lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ukoliko nije drugačije naznačeno obuhvata humanekiXlake lance. Varijabilni domeni (VL) lakog lanca tipično obuhvataju tri CDR regiona lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine (VL+ CL) obuhvata, od amino terminusa do karboksil terminusa, VLdomen koji obuhvata FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i CL region. Laki lanci (VL+ CL) koji se mogu koristiti sa ovim pronalaskom obuhvataju one,npr.,koji ne vezuju selektivno prvi ili drugi (u slučaju bispecifičnih vezujućih proteina) epitop selektivno vezan od strane vezujućeg proteina( npr.,epitop(i) selektivno vezan od strane VL domena fuzionisanog sa CHregionom). Vldomeni koji ne vezuju selektivno epitop(e) vezan(e) od strane VLkoji je fuzionisan sa Chregionom obuhvataju one koji mogu biti odentifikovani skriningom za najčešće korišćene lake lance u postojećim bibliotekama antitela (vlažne biblioteke iliin silico),pri čemu laki lanci značajno ne utiču na afinitet i/ili selektivnost domena vezujućih proteina koji vezuju epitop. Pogodni laki laci obuhvataju one koji mogu da vežu (pojedinačno ili u kombinaciji sa njegovim srodnim VLfuzionisanim sa Chregionom) epitop koji je specifično vezan od strane Vlfuzionisanog sa Chregionom.
Izraz "mikromolarni opseg" je određen tako da označava 1-999 mikromolarni; izraz "nanomolarni opseg" je određen tako da označava 1-999 nanomolarni; izraz "pikomolarni opseg" je određen tako da označava 1-999 pikomolaran.
Termin "ne-humane životinje" je određen tako da obuhvata bilo kog kičmenjaka kao što su ciklostome, košljoribe, hrskavičave ribe kao što su ajkule i raže, vodozemci, gmizavce, sisare i ptice. Pogodne nehumane životinje obuhvataju sisare. Pogodni sisari obuhvataju nehumane primate, koze, ovce, svinje, pse, krave i glodare. Pogodne nehumane životinje su izabrane iz porodice glodara uključujući pacova i miša. U jednom aspektu, nehumane životinje su miševi.
Miševi,nukleotidnesekvence i vezujućiproteini
Opisani su vezujući proteini koji su kodirani od strane elemenata lokusa imunoglobulina, pri čemu vezujući proteini sadrže konstantne regione teškog lanca imunoglobulina fuzionisane sa varijabilnim domenima lakog lanca imunoglobulina. Pored toga, opisane su višestruke strategije za genetičku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina u mišu radi kodiranja vezujućih proteina koji sadrže elemente kodirane lokusima lakog lanca imunoglobulina. Takvi genetički modifikovani miševi predstavljaju izvor za stvaranje jedinstvenih populacija vezujućih proteina koji imaju strukturu imunoglobulina, i koji još uvek ispoljavaju povećanu raznovrsnost u odnosu na tradicionalna antitela.
Aspekti vezujućeg proteina koji su ovde opisani obuhvataju vezujuće proteine koji su kodirani modifikovanim lokusima imunoglobulina, koji su modifikovani tako da su genski segmenti koji normalno( tj.,kod životinje divljeg tipa) kodiraju varijabilne domene lakog lanca imunoglobulina (ili njegove delove) funkcionalno vezani za nukleotidne sekvence koje kodiraju konstantne regione teškog lanca. Posle rearanžmana genskih segmenata lakog lanca, dobijena je rearanžirana nukleotidna sekvenca koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen lakog lanca fuzionisanu sa sekvencom koja kodira konstantni region teškog lanca. Ova sekvenca kodira polipeptid koji ima varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca. Na taj način, u jednom aspektu, polipeptid se sastoji uglavnom od, od N-terminusa do C-terminusa, Vldomena, ChI domena, zglobnog regiona, CH2 domena, CH3 domena i izborno CH4 domena.
Kod modifikovanih miševa koji su ovde opisani, stvoreni su takvi vezujući proteini koji takođe sadrže srodni laki lanac, pri čemu u jednom aspektu srodni laki lanac se sparuje sa polipeptidom opisanim u prethodnom tekstu tako da stvara vezujući protein koji je sličan antitelu, ali vezujući protein sadrži VLdomen —ne VHdomen —fuzionisan sa CHdomenom. U različitim aspektima, modifikovani miševi stvaraju vezujuće proteine koji sadrže VLdomen fuzionisan sa Chregionom (hibridni teški lanac), pri čemu Vldomen hibridnog teškog lanca ispoljava povećani stepen somatske hipermutacije. U ovim aspektima, pojačanje je u odnosu na VLdomen koji je fuzionisan sa CLregionom (laki lanac). U nekim aspektima, VLdomen hibridnog teškog lanca ispoljava oko 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta ili 5-puta ili više somatskih hipermutacija od VLdomena fuzionisanog sa Clregionom. U nekim aspektima, modifikovani miševi kao odgovor na antigen ispoljavaju populaciju vezujućih proteina koji sadrže Vldomen hibridnog teškog lanca, pri čemu populacija vezujućih proteina ispoljava u prošeku oko 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta, 5-puta ili više somatskih hipermutacija u VLdomenu hibridnog teškog lanca što je zabeleženo u mišu divljeg tipa kao odgovor na isti antigen. U jednom aspektu, somatske hipermutacije u VLdomenu hibridnog teškog lanca sadrže jednu ili više ili dve ili više adicija NuCDR3.
U različitim aspektima, vezujući proteini sadrže varijabilne domene kodirane od strane sekvenci lakog lanca imunoglobulina koje sadrže veći broj adicija N nego što je to zabeleženo u prirodi za lake lance rearanžirane iz endogenog lokusa lakog lanca,npr.,vezujući protein koji sadrži mišji konstantni region teškog lanca fuzionisan sa varijabilnim domenom poreklom od humanih genskih segmenata V lakog lanca i humanih genskih segmenata J (lakog ili teškog), pri čemu humani V i humani J genski segmenti se rearanžiraju tako da formiraju rearanžirani gen koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N.
U različitim aspektima, miševi prema pronalasku stvaraju vezujuće proteine koji su u prošeku manji od antitela divljeg tipa( tj.,antitela koja imaju VHdomen) i poseduju prednosti povezane sa manjom veličinom. Manja veličina je realizovana najmanje u delu preko odsustva aminokiselinske sekvence kodirane od strane DHregiona, koja je normalno prisutna u Vhdomenu. Manja veličina može takođe biti realizovana u formiranju CDR3 koji je poreklom,npr.,od Vkgenskog segmenta i Jkgenskog segmenta.
U sledećem aspektu, opisan je postupak i miš za obezbeđivanje populacije vezujućih proteina koji imaju somatski hipermutirane Vldomene,npr.,somatski mutirane humane VKdomene, i,npr.,humane Vkdomene kodirane od strane rearanžiranihkvarijabilnih gena koji sadrže 1-10 ili više adicija N. U jednom aspektu, u odsustvu VHdomena za stvaranje raznovrsnosti antitela, miš prema pronalasku će stvarati vezujuće proteine,npr.,kao odgovor na imunizaciju antigenom, čiji V domeni su samo ili značajno VLdomeni. Proces klonalne selekcije miša prema tome je ograničen na selekciju samo ili značajno od vezujućih proteina koji imaju Vldomene, pre nego VHdomene. Somatska hipermutacija VLdomena biće iste učestalosti, ili značajno učestalija( npr., 2-do 5-puta viša ili više), nego kod miševa divljeg tipa (koji takođe mutiraju VLdomene sa određenom učestalošću). Proces klonalne selekcije u mišu prema pronalasku stvaraće visoko afinitetne vezujuće proteine iz modifikovanog lokusa imunoglobulina, uključujući vezujuće proteine koji specifično vezuju epitop sa afinitetom u nanomolamom ili pikomolarnom opsegu. Sekvence koje kodiraju takve vezujuće proteine mogu biti korišćene za stvaranje terapeutskih vezujućih proteina koji sadrže humani varijabilni domen i humane konstantne regione upotrebom odgovarajućeg ekspresionog sistema.
U drugim aspektima, može biti stvoren miš, pri čemu su mišji lokusi teškog lanca i/ili lakog lanca imunoglobulina onesposobljeni, napravljeni nefunkcionalnim ili „knocked out", i potpuno humani ili himerni humani-mišji transgeni mogu biti postavljeni u miša, pri čemu najmanje jedan od transgena sadrži modifikovani lokus teškog lanca( npr.,koji ima genske segmente lakog lanca funkcionalno vezane za jednu ili više genskih sekvenci teškog lanca). Takav miš takođe može da stvara vezujući protein kao što je ovde opisan.
U jednom aspektu, opisan je postupak za povećanje raznovrsnosti, uključujući pomoću somatske hipermutacije ili pomoću adicija N u VLdomenu, koji sadrži postavljanje nerearanžiranog genskog segmenta V lakog lanca i nerearanžiranog genskog segmenta J u funkcionalnu vezu sa mišjom genskom sekvencom Ch, izlaganje životinje antigenu od interesa, i izolaciju iz životinje rearanžirane i somatski hipermutirane V(laki)/J genske sekvence životinje, pri čemu je rearanžuirana V(laki)/J genska sekvenca fuzionisana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira CHregion imunoglobulina.
U jednom aspektu, težak lanac imunoglobulina fuzionisan sa hipermutiranim VLje IgM; u sledećem aspektu, IgG; u sledećem aspektu, IgE; u sledećem aspektu, IgA.
U jednom aspektu, VLdomen koji je somatski hipermutiran i kome je promenjena klasa sadrži oko 2- do 5-puta ili više somatskih hipermutacija zabeleženih za rearanžirano antitelo kome je promenejna klasa i koje ima VLdomen koji je funkcionalno vezan sa CLregionom. U jednom aspektu, zabeležene somatske hipermutacije u VLdomenu su oko iste po broju kao što je zabeleženo u Vhdomenu eksprimiranom iz Vhgenske sekvence fuzionisane sa Chregionom. U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje visoko afinitetnog humanog VLdomena, koji sadrži izlaganje miša prema pronalasku antigenu od interesa, omogućavajući mišu da razvije imuni odgovor na antigen od interesa, i izolaciju somatski imitiranog, sa promenjenom klasom humanog VLdomena iz miša koji specifično vezuje antigen od interesa sa visokim afinitetom.
U jednom aspektu, KDvezujućeg proteina koji sadrži humani VLdomen koji je somatski mutiran i kome je promenjena klasa je u nanomolamom ili pikomolarnom opsegu.
U jednom aspektu, vezujući protein se uglavnom sastoji od polipeptidnog dimera, pri čemu se polipeptid sastoji uglavnom od vezujućeg proteina koji je somatski imitiran i kome je promenjena klasa, koji sadrži humani Vldomen fuzionisan sa humanim Chregionom.
U jednom aspektu, vezujući protein se sastoji uglavnom od polipeptidnog dimera i dva laka lanca, pri čemu se polipeptid uglavnom sastoji od vezujućeg proteina koji je somatski mutiran i kome je promenjena klasa, koji ima humani VLdomen fuzionisan sa humanim CHregionom; i pri čemu je svaki polipeptid dimera spojen sa srodnim lakim lancem koji sadrži srodni VLdomen lakog lanca i humani CLregion.
U jednom aspektu, opisan je postupak za somatsku hipermutaciju humane genske sekvence VL, koji sadrži postavljanje humanog genskog segmenta VLi humanog genskog segmenta JLu funkcionalnu vezu sa endogenim mišjim Chregionom na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina, izlaganje miša antigenu od interesa, i dobijanje iz miša somatski hipermutiranog humanog VLdomena koji vezuje antigen od interesa.
U jednom aspektu, postupak dalje sadrži dobijanje iz miša genske sekvence VLiz lakog lanca koji je srodan sa humanim somatski hipermutiranim humanim Vldomenom koji vezuje antigen od interesa.
VLvezujući proteini saDHsekvencama
U različitim aspektima, miševi koji sadrže nerearanžirani genski segment V lakog lanca imunoglobulina i nerearanžirani{ npr.,laki ili težak) J genski segment takođe sadrže nerearanžirani genski segment DHkoji je sposoban da se rekombinuje sa genskim segmentom J da bi se formirala rearanžirana D/J sekvenca, koja je zatim sposobna da se rearanžira sa genskim segmentom V lakog lanca da bi se formirana rearanžirana varijabilna sekvenca poreklom od (a) genskog segmenta V lakog lanca, (b) genskog segmenta DHi (c){ npr.,lakog ili teškog) J genskog segmenta; pri čemu je rearanžirani varijabilni region funkcionalno vezan za konstantni region teškog lanca{ npr.,izabran od CHI, zglobnog regiona, CH2, CH3 i njihove kombinacije;npr.,funkcionalno vezan za mišji ili humani CHI, zglobni region, CH2 i CH3).
U različitim aspektima, miševi koji sadrže nerearanžirane humane genske segmente V lakog lanca i genske segmente J koji takođe sadrže humani genski segment D su korisni,npr.,kao izvor povećane raznovrsnosti CDR3 sekvenci. Normalno, CDR3 sekvence se javljaju u lakim lancima iz V/J rekombinacije, i u teškim lancima iz V/D/J rekombinacije. Dodatna raznovrsnost je obezbeđena preko nukleotidnih adicija koje se javljaju u toku rekombinacije{ npr.,adicija N), i takođe kao rezultat somatske hipermutacije. Vezujuće karakteristike koje su obezbeđene preko CDR3 sekvence su generalno ograničene na one koje su obezbeđene preko CDR3 sekvence lakog lanca, CDR3 sekvence teškog lanca i kombinacije CDR3 sekvence lakog i teškog lanca, kao što to može biti slučaj. Kod miševa kao što su ovde opisani, međutim, dodatni izvor raznovrsnosti je dostupan zahvaljujući vezujućim karakteristikama koje su obezbeđene kao rezultat kombinacije CDR3 prvog lakog lanca (na polipeptidu teškog lanca) i CDR3 drugog lakog lanca (na polipeptidu lakog lanca). Dodatna raznovrsnost je moguća gde CDR3 prvog lakog lanca može da sadrži sekvencu poreklom od genskog segmenta D, kao od miša kao što je ovde opisan koji sadrži nerearanžirani genski segment V iz V domena lakog lanca funkcionalno vezan za genski segment D i funkcionalno vezan za genski segment J (laki ili težak), koji koristi RSS inženjering kao što je ovde navedeno.
Sledeći izvor raznovrsnosti je predstavljen adicijama N i/ili P koje mogu da se jave u V(laki)/J ili V(težak)/D/J reklombinacijama koje su moguće kod miševa kao što su opisani. Na taj način, miševi koji su ovde opisani ne samo da obezbeđuju različiti izvor raznovrsnosti (laki lanac-laki lanac), već takođe i dodatni izvor raznovrsnosti zahvaljujući adiciji,npr.,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više adicija N u rearanžiranom V(laki)/J ili rearanžiranom V(laki)/D/J genu u mišu kao što je ovde opisan.
U različitim aspektima upotreba genskog segmenta D funkcionalno vezanog za genski segment J i genski segment V lakog lanca obezbeđuje povećanu raznovrsnost. Funkcionalna veza genskog segmenta DHu ovom slučaju zahtevaće da je genski segment D sposoban za rekombinaciju sa segmentom J sa kojim je naveden. Na taj način, genski segment D će zahtevati da ima postavljen nishodno RSS koji se poklapa sa RSS postavljenom ushodno od genskog segmenta J tako da genski segment D i genski segment J mogu da se rearanžiraju. Pored toga, genski segment D će zahtevati odgovarajuću RSS postavljenu ushodno koja se poklapa sa RSS postavljenom nishodno od genskog segmenta V tako da se rearanžirani D/J genski segment i genski segment V mogu rearanžirati tako da formiraju gen koji kodira varijabilni domen.
RSS, ili rekombinaciona signalna sekvenca, sadrži konzervativnu nukleinsko kiselinsku heptamernu sekvencu odvojenu, pomoću 12 baznih parova (bp) ili 23 bazna para (bp) nekonzervativne sekvence, od konzervativne nukleinsko kiselinske nonamer sekvence. RSS su korišćene od strane rekombinaza da bi se postiglo spajanje genskih segmenata imunoglobulina u toku procesa rearanžmana prema 12/23 pravilu. Prema 12/23 pravilu, genski segment postavljen pored RSS koji ima 12 bp (nekonzervativan) spejser se rearanžira sa genskim segmentom postavljenim pored RSS koji ima 23 bp (nekonzervativan) spejser;tj.,rearanžmani između genskih segmenata od kojih svaki ima RSS sa 12 bp spejserom, ili od kojih svaki ima RSS sa 23 bp spejserom, generalno nisu zabeleženi.
U slučaju lokusa A lakog lanca, varijabilni genski segmenti (genski segmenti VA,) su flankirani nishodno (u odnosu na smer transkripcije V sekvence) sa RSS koji ima 23-merni spejser, i spajajući genski segmenti (genski segmenti JA.) su flankirani ushodno (u odnosu na smer transkripcije J sekvence) sa RSS koji ima 12-merni spejser. Na taj način, genski segmenti VA i JA, su flankirani sa RSS sekvencama koje su kompatibilne prema 12/23 pravilu, i prema tome su sposobne da se rekombinuju u toku rearanžmana.
Naklokusu u organizmu divljeg tipa, međutim, svaki funkcionalni genski segment Vkje flankiran nishodno sa RSS koji ima 12-merni spejser. Genski segmenti Jk, prema tome, imaju 23-merne razmake postavljene na ushodnoj strani genskog segmenta Jk. Na lokusu teškog lanca, genski segmenti VHsu postavljeni nishodno pored RSS koji ima 23-merni spejser, nakon čega sledi genski segment DHpostavljen ushodno i nishodno sa 12-mernim spejserom, i genski segmenti Jhsu svaki sa 23-mernim segmentom postavljeni na ushodnu stranu genskog segmenta JH. Na lokusu teškog lanca, D/J rekombinacija se javlja prva, posredovana preko nishodnog DHRSS sa 12-mernim spejserom i ushodnim JHRSS sa 23-mernim spejserom, da bi se proizvela intermedijerna rearanžirana D-J sekvenca koja ima RSS postavljen na ushodnu stranu koja ima RSS sa 12-mernim spejserom. Rearanžirani genski segment D-J koji ima RSS sa 12-merom postavljenim na ushodnu stranu zatim se rearanžira sa genskim segmentom VHkoji ima RSS sa 23-merom postavljenim na njegovu nishodnu stranu da bi se formirala rearanžirana V/D/J sekvenca.
U jednom aspektu, genski segment VA, je korišćen na lokusu teškog lanca sa genskim segmentom J koji je genski segment JA, pri čemu genski segment VA, sadrži RSS postavljenu na nishodnu stranu genske sekvence VA, i RSS sadrži 23-merni spejser, i genski segment J je genski segment JA, sa RSS postavljenim na njegovu ushodnu stranu koji ima 12-merni spejser( npr.,koji se nalazi u prirodi).
U jednom aspektu, genski segment VA, je korišćen na lokusu teškog lanca sa genskim segmentom J koji je genski segment Jkili JH, pri čemu VA, sekvenca je postavljena na njenu nishodnu stranu pored RSS koji sadrži 23-merni spejser, i genski segment Jkili JHje postavljen na njenu ushodnu stranu pored RSS koji sadrži 12-merni spejser.
U jednom aspektu, genski segment VA. je korišćen na lokusu teškog lanca sa genskim segmentom Dhi genskim segmentom J. U jednom aspektu, genski segment Va. sadrži RSS postavljenu na nishodnu stranuY%sekvence sa RSS koji ima 23-merni spejser; genski segment DHsadrži RSS postavljenu na ushodnu stranu i na nishodnu stranu DHsekvence sa RSS koji ima 12-merni spejser; i genski segment J koji ima RSS postavljenu na njenu ushodnu stranu koji ima 23-merni spejser, pri čemu je genski segment J izabran od JA,, Jki JH. U jednom aspektu, genski segment Vkje korišćen na lokusu teškog lanca sa genskim segmentom J (bez genskog segmenta D koji se nalazi između), pri čemu genski segment Vkima RSS postavljen na nishodnu stranu genskog segmenta Vkkoja sadrži 12-merno udaljenu RSS, i genski segment J je postavljen na njenu ushodnu stranu pored 23-merno udaljene RSS, i genski segment Jkje izabran od genskog segmenta Jk, genskog segmenta JA i genskog segmenta JH. U jednom aspektu, genski segment V i/ili genski segment J su humani.
U jednom aspektu, genski segment Vkje korišćen na lokusu teškog lanca sa genskim segmentom D i genskim segmentom J, pri čemu genski segment Vkima RSS postavljenu na nishodnu stranu genskog segmenta Vkkoji sadrži 12-merno udaljenu RSS, genski segment D je postavljen na njegovu ushodnu ili nishodnu stranu pored 23-merno udaljene RSS, i genski segment J je postavljen na njegovu ushodnu stranu pored 12-merno udaljene RSS. U jednom aspektu, genski segment J je izabran od genskog segmenta Jk, genskog segmenta JA, i genskog segmenta Jh. U jednom aspektu, genski segment V i/ili genski segment J su humani.
Genski segment JA, sa RSS koja ima 23-merni spejser postavljen na njegovom ushodnom kraju, ili genski segment Jkili JHsa RSS koja ima 12-merni spejser postavljen na njegovom ushodnom kraju, je stvoren upotrebom bilo kog pogodnog postupka za stvaranje nukleinsko kiselinskih sekvenci koji je poznat u tehnici. Pogodan postupak za stvaranje genskog segmenta J koji ima RSS postavljen ushodno pri čemu RSS ima izabrani spejser( npr., 12-merni ili 23-merni) je hemijsko sintetisanje nukleinske kiseline koja sadrži heptamer, nonamer, i izabrani spejser i njeno fuzionisanje sa sekvencom genskog segmenta J koja je hemijski sintetisana ili klonirana iz pogodnog izvora( npr.,humani izvor sekvence), i korišćenje fuzionisanog sekvence genskog segmenta J i RSS u ciljnom vektoru da bi RSS-J ciljno delovao na pogodno mesto.
Genski segment D sa 23-merno udaljenom RSS postavljen ushodno i nishodno može biti stvoren pomoću bilo kog postupka poznatog u tehnici. Jedan postupak sadrži hemijsko sintetisanje ushodne 23-merne RSS i sekvence genskog segmenta D i nishodne 23-merne RSS, i postavljanje RSS-flankiranog genskog segmenta D u pogodni vektor. Vektor može biti usmeren tako da zameni jedan ili više mišjih genskih segmenata D sa humanim genskim segmentom D sa 12-mernim RSS sekvencama postavljenim na ushodne i nishodne strane, ili usmeren tako da bude inseriran u,npr.,humanizovani lokus na položaju između humanog genskog segmenta V i humanog ili mišjeg genskog segmenta J.
Pogodni nonameri i heptameri za konstrukciju RSS su poznati u tehnici (npr., videti Janeway's Immunobiologv, 7th ed., Murphv et al., (2008, Garland Science, Tavlor & Francis Group, LLC) at page 148, Fig. 4.5). Pogodne nekonzervativne spejser sekvence obuhvataju,npr.,spejser sekvence zabeležene u RSS sekvencama na humanim ili mišjim lokusima imunoglobulina.
Bispecifični-vezujući proteini
Vezujući proteini opisani ovde, i nukleotidne sekvence koje ih kodiraju, mogu se koristiti za stvaranje multispecifičnih vezujućih proteina,npr.,bispecifičnih vezujućih proteina. U ovom aspektu, prvi polipeptid koji se uglavnom sastoji od prvog Vldomena fuzionisanog sa Chregionom može da se spaja sa drugim polipeptidom koji se uglavnom sastoji od drugog VLdomena fuzionisanog sa CHregionom. Tamo gde prvi VLdomen i drugi VLdomen specifično vezuju različiti epitop, bispecifičan-vezujući molekul može biti stvoren upotrebom dva Vldomena. Chregion može biti isti ili različit. U jednom aspektu,npr.,jedan od Chregiona može biti modifikovan tako da eliminiše vezujuću determinantu proteina A, pri čemu drugi konstantni region teškog lanca nije tako modifikovan. Ovo posebno uređenje pojednostavljuje izolaciju bispecifičnog vezujućeg proteina iz,npr.,smeše homodimera( npr.,homodimera prvog i drugog polipeptida).
U jednom aspektu, postupci i kompozicije koji su ovde opisani su korišćeni za stvaranje bispecifičnih-vezujućih proteina. U ovom aspektu, prvi VLdomen koji je fuzionisan sa CHregionom i drugi VLdomen koji je fuzionisan sa CH regionom su svaki nezavisno klonirani u okviru sa humanom IgG sekvencom istog izotipa( npr.,humani IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4). Prvi Vldomen specifično vezuje prvi epitop, i drugi Vldomen specifično vezuje drugi epitop. Prvi i drugi epitop mogu biti na različitim antigenima ili na istom antigenu.
U jednom aspektu, IgG izotip CHregiona fuzionisan sa prvim VLdomenom i IgG izotip CHregiona fuzionisan sa drugim VLdomenom su isti izotip, ali se razlikuju po tome što jedan IgG izotip sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju. U jednom aspektu, najmanje jedna aminokiselinska supstitucija omogućava da je teški lanac koji nosi supstituciju nesposoban ili značajno nesposoban da veže protein A u poređenju sa teškim lancem kome nedostaje supstitucija.
U jednom aspektu, prvi Chregion sadrži prvi Ch3 domen humanog IgG izabran od IgGl, IgG2 i IgG4; i drugi CHregion sadrži drugi CH3 domen humanog IgG izabran od IgGl, IgG2 i
IgG4, pri čemu drugi CH3 domen sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog Ch3 domena sa proteinom A.
U jednom aspektu, drugi Ch3 domen sadrži 435R modifikaciju, numerisanu prema EU indeksu Kabat-a. U sledećem aspektu, drugi Ch3 domen dalje sadrži 436F modifikaciju, numerisanu prema EU indeksu Kabat-a.
U jednom aspektu, drugi CH3 domen je onaj od humanog IgGl koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I, numerisane prema EU indeksu Kabat-a.
U jednom aspektu, drugi CH3 domen je onaj od humanog IgG2 koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od N384S, K392N i V422I, numerisane prema EU indeksu Kabat-a.
U jednom aspektu, drugi Ch3 domen je onaj od humanog IgG4 koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I, numerisane prema EU indeksu Kabat-a.
U jednom aspektu, vezujući protein sadrži Chregione koji imaju jednu ili više modifikacija kao što su ovde navedene, pri čemu je konstantni region vezujućeg proteina neimunogen ili značajno neimunogen kod čoveka. U jednom specifičnom aspektu, Chregioni sadrže aminokiselinske sekvence koje ne predstavljaju imunogeni epitop kod čoveka. U sledećem specifičnom aspektu, vezujući protein sadrži CHregion koji se ne nalazi kod divljeg tipa humanog teškog lanca i Chregion ne sadrži sekvencu koja stvara T-ćelijski epitop.
PRIMIRI
Sledeći primeri su obezbeđeni da bi se opisalo kako stvoriti i koristiti postupke i kompozicije koji su ovde opisani, i nije bila namera da ograniče obim pronalaska kao što je definisan u patentnim zahtevima. Osim ukoliko nije naznačeno drugačije, temperatura je prikazana u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer I
Uvođenje genskih segmenata lakog lanca u lokus teškog lanca
Različiti ciljni konstrukti su stvoreni upotrebom VELOCIGENE® tehnologije genetičkog inženjeringa (videti,npr.,SAD Pat. br. 6,586,251 i Valenzuela, D.M., Murphv, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Pouevmirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorskv, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, L, Torres, R., Macdonald, L.E., Stevvart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659) da bi se modifikovale mišje genomske biblioteke bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC). Mišja BAC DNK je modifikovana pomoću homologe rekombinacije da bi se inaktivirao endogeni mišji lokus teškog lanca koji ciljno deluje na deleciju genskih segmenata VH, DHi Jhza osiguravanje insercije nerearanžiranih genskih segvenciklakog lanca humane klicine linije (vrh SI. 2).
Ukratko, mišji lokus teškog lanca je deletiran u dva uzastopna ciljana događaja upotrebom rekombinacije posredovane preko rekombinaze. Prvi ciljani događaj obuhvatao je ciljno delovanje na 5' kraju mišjeg lokusa teškog lanca upotrebom ciljnog vektora koji sadrži od 5' do 3' - 5' mišji homologi krak, mesto za prepoznavanje rekombinaze, kasetu za neomicin i 3' homologi krak. 5' i 3' homologi kraci su sadržali sekvencu 5' mišjeg lokusa teškog lanca. Drugi ciljani događaj je uključivao ciljno delovanje na 3' kraju mišjeg lokusa teškog lanca u regionu genskih segmenata JHupotrebom drugog ciljnog vektora koji je sadržao od 5' do 3' - 5' mišji homologi krak, 5' mesto za prepoznavanje rekombinaze, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze, kasetu za higromicin, treće mesto za prepoznavanje rekombinaze, i 3' mišji homologi krak. 5' i 3' homologi kraci su sadržali sekvencu koja flankira mišje genske segmente Jhi 5' instronski pojačivač i konstantne regione. Pozitivne ES ćelije koje sadrže modifikovani lokus teškog lanca ciljan preko oba ciljna vektora (kao što je opisan u prethodnom tekstu) su potvrđene preko kariotipinga. DNK je zatim izolovana iz dvostruko-ciljanih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa rekombinazom na taj način posredovajući u deleciji genomske DNK mišjeg lokusa teškog lanca između 5' mesta za prepoznavanje rekombinaze u prvom ciljnom vektoru i 5' mesta za prepoznavanje rekombinaze u drugom ciljnom vektoru, ostavljajući jedno mesto za prepoznavanje rekombinaze i kasetu za higromicin flankirane sa dva mesta za prepoznavanje rekombinaze (videti vrh SI. 2). Na taj način modifikovani mišji lokus teškog lanca koji sadrži intaktne CHgene je stvoren za progresivnu inserciju genskih segmenata humanekklicine linije na precizan način upotrebom ciljnih vektora opisanih u daljem tekstu.
Četiri posebna ciljna vektora su stvorena inženjeringom da bi se progresivno inseriralo 40 humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jku inaktivirani mišji lokus teškog lanca (opisan u prethodnom tekstu) upotrebom standardnih molekularnih tehnika koje su poznate u tehnici (SI. 2). Humanikgenski segmenti korišćeni za inženjering četiri ciljna konstrukta se prirodno nalaze u proksimalnim dodirnim sekvencama lokusa humanogklakog lanca klicine linije (SI. 1B i Tabela 1).
Humani genomski fragment od -110,499 bp koji sadrži prvih šest humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkje stvoren inženjeringom tako da sadrži Pl-SceI mesto 431 bp nishodno (3') od humanog genskog segmenta Jk5. Sledeće Pl-SceI mesto je stvoreno inženjeringom na 5' kraju -7,852 bp genomskog fragmenta koji sadrži mišji intronski pojačivač teškog lanca, IgM prekidački region (S|o,) i IgM gen mišjeg lokusa teškog lanca. Ovaj mišji fragment je korišćen kao 3' homologi krak ligacijom za -110.5 kb humani fragment, koji je stvorio 3' spoj koji sadrži, od 5' do 3', -110.5 kb genomske sekvence humanog lokusaklakog lanca koi sadrži prvih šest uzastopnih genskih segmenata Vki pet genskih segmenata Jk, Pl-SceI mesto, -7,852 bp mišje sekvence teškog lanca sadrži mišji intronski pojačivač, Sii i mišji gen za konstantni IgM. Ushodno (5') od humanog genskog segmenta Vk1-6 bilo je dodatnih 3,710 bp humaneksekvence pre početka 5' mišjeg homologog kraka, koji je sadržao 19,752 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5' mišjeg lokusa teškog lanca. Između 5' homologog kraka i početka humaneksekvence bila je kaseta za neomicin flankirana sa tri mesta za prepoznavanje rekombinaze (videti ciljni vektor 1, SI. 2). Krajnji ciljni vektor za prvu inserciju humaneksekvence od 5' do 3' obuhvatao je 5' homologi krak koji sadrži -20 kb mišje genomske sekvence 5' lokusa teškog lanca, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze (Rl), kasetu za neomicin, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze (R2), treće mesto za prepoznavanje rekombinaze (R3), -110.5 kb humane genomskeksekvence koja sadrži prvih šest uzastopnih humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jk, Pl-SceI mesto i 3' homologi krak koji sadrži -8 kb mišje genomske sekvence uključujući intronski pojačivač, Sli i mišji gen konstantnog IgM (videti SI. 2, ciljni vektor 1). Homologa rekombinacija sa ovim ciljnim vektorom stvorila je modifikovani mišji lokus teškog lanca koji sadrži šest humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkfunkcionalno vezanih za endogene mišje gene konstantnog teškog lanca, posle rekombinacije, dovodi do formiranja hibridnog teškog lanca( tj.,humanog Vkdomena i mišjeg Chregiona).
Uvođenjedeset dodatnih humanih genskih segmenata Vku hibridni lokus teškog lanca. Drugi ciljni vektor je stvoren inženjeringom za uvođenje 10 dodatnih humanih genskih segmenata Vku modifikovani mišji lokus teškog lanca opisan u prethodnom tekstu (videti SI. 2, ciljni vektor 2). Humani genomski fragment od 140,058 bp koji sadrži 12 uzastopnih humanih genskih segmenata Vkiz humanog lokusaklakog lanca je stvoren inženjeringom sa 5' homologim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5' od mišjeg lokusa teškog lanca i 3' homologi krak koji sadrži humanu genomskuksekvencu. Ushodno (5') od humanog Vk1-16 genskog segmenta bilo je dodatnih 10,170 bp humaneksekvence pre početka 5' mišjeg homologog kraka, koji je bio isti 5' homologi krak korišćen za konstrukciju ciljnog vektora 1 (videti SI. 2). Između 5' homologog kraka i početka humaneksekvence bila je kaseta za higromicin flankirana mestima za prepoznavanje rekombinaze. 3' homologi krak je uključivao 31,165 bp preklapanje humane genomskeksekvence što odgovara ekvivalentnom 5' kraju -110.5 kb fragmenta humane genomskeksekvence ciljnog vektora 1 (SI. 2). Krajnji ciljni vektor za inserciju 10 dodatnih humanih genskih segmenata Vksa 5' u 3' uključivao je 5' homologi krak koji sadrži -20 kb mišje genomske sekvence 5' od lokusa teške sekvence, prvo mesto za prepoznavanje rekombinaze (Rl), kasetu za higromicin, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze (R2) i -140 kb humane genomskeksekvence koja sadrži 12 uzastopnih humanih genskih segmenata Vk, od kojih se -31 kb preklapa sa 5' krajem humaneksekvence ciljnog vektora 1 i služi kao 3' homologi krak za ovaj ciljni konstrukt. Homologna rekobminacija sa ovim ciljnim vektorom stvorila je modifikovani mišji lokus teškog lanca koji sadrži 16 humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkfunkcionalno vezanih za mišje gene konstantnog teškog lanca koji, posle rekombinacije, dovodi do formiranja hibridnog teškog lanca.
Uvođenje četrnaest dodatnih humanih genskih segmenata Vku hibridni lokus teškog lanca. Treći ciljni vektor je stvoren inženjeringom za uvođenje 14 dodatnih humanih genskih segmenata Vku modifikovani mišji lokus teškog lanca opisan u prethodnom tekstu (videti SI.
2, ciljni vektor 3). Humani genomski fragment od 160,579 bp koji sadrži 15 uzastopnih humanih genskih segmenata Vkje stvoren inženjeringom sa 5' homologim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5' od mišjeg lokusa teškog lanca i 3' homologi krak koji sadrži humanu genomskuksekvencu. Ushodno (5') od humanog Vk2-30 genskog segmenta bilo je dodatnih 14,687 bp humaneksekvence pre početka 5' mišjeg homologog kraka, koji je bio iste 5' homologije korišćene za prethodna dva ciljna vektora (opisana u prethodnom tekstu, videti takođe SI. 2). Između 5' homologog kraka i početka humaneksekvence bila je kaseta za neomicin flankirana sa mestima za prepoznavanje rekombinaze. 3' homologi krak je uključivao preklapanje od 21,275 bp humane genomskeksekvence koje odgovara ekvivalentnom 5' kraju od - 140 kb fragmenta humane genomskeksekvence ciljnog vektora 2 (SI. 2). Krajni ciljni vektor za inserciju 14 dodatnih humanih genskih segmenata Vkod 5' do 3' uključivao je 5' homologi krak koji sadrži -20 kb mišje genomske sekvence 5' od mišjeg lokusa teškog lanca, prvo mesto za prepoznavanje rekombinaze (Rl), kasetu za neomicin, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze (R2) i -161 kb humane genomskeksekvence koja sadrži 15 humanih genskih segmenata Vk, od kojih se -21 kb preklapa sa 5' krajem humaneksekvence ciljnog vektora 2 i služi kao 3' homologi krak za ovaj ciljni konstrukt. Homologa rekombinacija sa ovim ciljnim vektorom stvorila je modifikovanu mišji lokus teškog lanca koji sadrži 30 humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jk funkcionalno vezanih sa mišjim genima za konstantni teški lanac koja, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himernogkteškog lanca.
Uvođenje deset dodatnih humanih genskih segmenata Vk u hibridni lokus teškog lanca. Četvrti ciljni vektor je stvoren inženjeringom za uvođenje 10 dodatnih humanih genskih segmenata Vku modifikovani mišji lokus teškog lanca opisan u prethodnom tekstu (videti SI. 2, ciljni vektor 4). Humani genomski fragment od 90,398 bp koji sadrži 16 uzastopnih humanih genskih segmenata Vkje stvoren inženjeringom sa 5' homologim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5' od mišjeg lokusa teškog lanca i 3' homologi krak koji sadrži humanu genomskuksekvencu. Ushodno (5') od humanog Vk2-40 genskog segmenta bilo je dodatnih 8,484 bp humaneksekvence pre početka 5' mišjeg homologog kraka, koji je bio iste 5' homologije kao prethodni ciljni vektori (opisani u prethodnom tekstu, videti takođe SI. 2). Između 5' homologog kraka i početka humaneksekvence bila je kaseta za higromicin flankirana mestima za prepoznavanje rekombinaze. 3' homologi krak je uključivao preklapanje od 61,615 bp humane genomskeksekvence što odgovara ekvivalentu 5' kraja
-160 kb fragmenta humane genomskeksekvence ciljnog vektora 3 (SI. 2). Krajni ciljni vektor za inserciju 10 dodatnih humanih genskih segmenata Vkod 5' do 3' uključivao je 5'
homologi krak koji sadrži -20 kb mišje genomske sekvence 5' od mišjeg lokusa teškog lanca, prvo mesto za prepoznavanje rekombinaze (Rl), kasetu za higromicin, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze (R2) i -90 kb humane genomskeksekvence koja sadrži 16 humanih genskih segmenata Vk, od kojih se -62 kb preklapa sa 5' krajem humaneksekvence ciljnog vektora 3 i služi kao 3' homologi krak za ovaj ciljni konstrukt. Homologa rekombinacija sa ovim ciljnim vektorom stvorila je modifikovani mišji lokus teškog lanca koji sadrži 40 humanih genskih segmenata Vki pet humanih Jkgenskih segmenata funkcionalno vezanih za mišje gene konstantnog teškog lanca koji, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himernogkteškog lanca (SI. 3).
Upotrebom sličnog pristupa kao što je opisan u prethodnom tekstu, konstruisane su druge kombinacije humanih varijabilnih domena lakog lanca u kontekstu mišjih konstantnih regiona teškog lanca. Dodatni varijabilni domeni lakog lanca mogu biti poreklom od humanih genskih segmenataVkiJk(SI. 4A i 4B).
Humani lokusklakog lanca se proteže preko 1,000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju varijabilne (V) ili spajajuće (J) segmente. Među 70 genskih segmenataVkhumanog lokusaklakog lanca, bilo gde od 30-38 izgleda da su funkcionalni genski segmenti prema objavljenim izveštajima. 70Vksekvenci su uređene u tri klastera, od kojih svi sadrže različite članove posebnih grupa porodica gena V (klasteri A, B i C). Unutar humanog lokusaklakog lanca, preko polovine svih zabeleženihVkdomena su kodirani od strane genskih segmenata 1-40, 1-44, 2-8, 2-14 i 3-21. Postoje sedam genskih segmenataJk,od kojih se samo četiri smatraju kao generalno funkcionalnimJkgenskim segmentima IJkl,Jk2, Jk3i JA.7. U nekim alelima, peti par genskih segmenataJk- Ckje navodno pseudo gen ( Ck6). Ugradnja višestrukih humanih genskih segmenata Jk u hibridni lokus teškog lanca, kao što je ovde opisan, je konstruisana preko de novo sinteze. Na ovaj način, genomski fragment koji sadrži višestruke humane genske segmenteJku konfiguraciji klicine linije je konstruisan inženjeringom sa višestrukim humanim genskim segmentimaVki omogućava normalnu V-J rekombinaciju u kontekstu konstantnog regiona teškog lanca.
Spajanje varijabilnih domena lakog lanca sa konstantnim regionima teškog lanca predstavlja potencijalno bogat izvor raznovrsnosti za stvaranje jedinstvenih VLvezujući proteina sa humanim Vlregionima u nehumanim životinjama. Eksploatacija ove raznovrsnosti humanog lokusaklakog lanca (ili humanog lokusakkao što je ovde opisan) kod miševa ima za rezultat inženjering jedinstvenih hibridnih teških lanaca i daje drugu dimenziju vezujućih proteina imunom repertoaru genetički modifikovanih životinja i njihove kasnije upotrebe kao platforme sledeće generacije za stvaranje lekova.
Pored toga, humani genski segmenti DHi Jh(ili Jk) mogu biti ugrađeni sa humanim genskim segmentima Vkili VA da bi se konstruisali novi hibridni lokusi koji će dati, posle rekombinacije, nove inženjeringom stvorene varijabilne domene (SI. 5A i 5B). U ovom poslednjem slučaju, kombinacije stvorene inženjeringom genskih segmenata koji normalno nisu sadržani u jednom lokusu zahtevali bi specifičnu pažnju prema rekombinacionim signalnim sekvencama (RSS) koje su spojene sa odgovarajućim genskim segmentima tako da se normalna rekombinacija može postići kada su oni kombinovani u jedan lokus. Na primer, poznato je da je V(D)J rekombinacija vođena preko konzervativnih nekodirajućih DNK sekvenci, poznatih kao heptamer i nonamer sekvence koje se nalaze pored svakog genskog segmenta na tačnoj lokaciji na kojoj se odigrava rekombinacija. Između ovih nekodirajućih DNK sekvenci su nekonzervativni spejser regioni koji su 12 ili 23 baznih parova (bp) u dužini. Generalno, rekombinacija se javlja samo na genskim segmentima lociranim na istom hromozomu i oni genski segmenti flankirani sa 12-bp spejserom mogu biti spojeni sa genskim segmentom flankiranim sa 23-bp spejserom,tj.12/23 pravilo, iako je spajanje dva genska segmenta DH(svaki flankiran sa 12-bp spejserima) zabeleženo u maloj proporciji antitela. Da bi se omogućila rekombinacija između genskih segmenata koji normalno nemaju kompatibilne spejsere( npr.,Vki DHili DHi JA,), jedistveni, kompatibilni spejseri su sintetisani u susednim lokacijama sa željenim genskim segmentima za konstrukciju jedinstvenih hibridnih teških lanaca koji omogućavaju uspešnu rekombinaciju da bi se formirali jedinstveni teški lanci koji sadrže varijabilne regione lakog lanca.
Na taj način, upotreba strategije navedene u prethodnom tekstu za ugradnju humanih genskih segmenataklakog lanca u endogeni lokus teškog lanca omogućava upotrebu drugih kombinacija humanih genskih segmenata A, lakog lanca kao i specifičnih humanih genskih segmenata teškog lanca( npr.,DHi Jh) i njihovih kombinacija.
Primer II
Identifikacija ciljnih ES ćelija koje nose humane genske segmente lakog lanca na
endogenom lokusu teškog lanca
Ciljna BAC DNK stvorena u gore navedenim Primerima je korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija do modifikovanih ES ćelija za stvaranje himernih miševa koji eksprimiraju VLvezujuće proteine( tj.,humanekgenske segmente funkcionalno vezane za mišje konstantne regione teškog lanca). ES ćelije koje sadrže inserciju nerearanžiranih humanih genskih segmenataklakog lanca identifikovane su pomoću kvantitativne PCR analize, TAQMAN<®>
(Lie and Petropoulos, 1998.Curr. Opin. Biotechnologv 9:43-48). Specifični setovi prajmera i probe dizajnirani su za inserciju humanihksekvenci i spojenih selekcionih kaseta, gubitak mišjih sekvenci teškog lanca i zadržavanje mišjih sekvenci koje flankiraju endogeni lokus teškog lanca.
ES ćelije koje nose humane genske segmenteklakog lanca mogu biti transficirane sa konstruktom koji eksprimira rekombinazu u cilju uklanjanja bilo koje neželjene selekcione kasete uvedene insercijom ciljnog konstrukta koji sadrži humanekgenske segmente. Izborno, selekciona kaseta može biti uklonjena gajenjem do miševa koji eksprimiraju rekombinazu{ npr.,US 6,774,279). Izborno, selekciona kaseta je zadržana u miševima.
PrimerIII
Stvaranje i analiza miševa koji eksprimiraju VLvezujuće proteine
Ciljne ES ćelije opisane u prethodnom tekstu korišćene su kao donorske ES ćelije i uvedene su u mišji embrion na stadijumu od 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® postupka (videti,npr.,SAD Pat. br. 7,294,754 i Pouevmirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickev, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotvpic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi u potpunosti poreklom od donorske ES ćelije) koji nezavisno nose humanekgenske segmente na mišjem lokusu teškog lanca identifikovani su genotipizacijom upotrebom modifikacije analize alela (Valenzuelaet ah, supra)koja je detektovala prisustvo jedinstvenih humanihkgenskih segmenata na endogenom lokusu teškog lanca{ supra).Mladunci su genotipizirani i mladunče heterozigot za hibridni genski lokus teškog lanca je izabran za karakterizaciju ekspresije VLvezujućih proteina.
Protočna citometrija. Uvođenje humanih genskih segmenataklakog lanca u mišji lokus teškog lanca je izvedeno u Fl ES liniji (F1H4; Valenzuelaet al.2007,supra)poreklom od 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona koji su dalje sadržaliin situzamenu mišjih genskih segmenataklakog lanca sa humanim genskim segmentimaklakog lanca (SAD 6,596,541). Humani varijabilni genski segmenti klicine linijeKlakog lanca su ciljani do 129S6 alela, koji nosi IgM<a>haplotip, dok nemodifikovani mišji C576BL/6N alel nosi IgM<b>haplotip. Ovi alelski oblici IgM mogu biti razlikovani pomoću protočne citometrije upotrebom antitela specifičnih za polimorfizme zabeležene u IgM<a>ili IgM<b>alelima. Heterozigotni miševi koji nose humane genske segmenteklakog lanca na endogenom lokusu teškog lanca kao što je opisano u Primeru I procenjivani su za ekspresiju humanih VLvezujućih proteina upotrebom protočne citometrije.
Ukratko, krv je vađena iz grupa miševa (n=6 po grupi) i sastrugana upotrebom staklenih pločica. C57BL/6 i Balb/c miševi su korišćeni kao kontrone grupe. Posle lize crvenih krvnih zrnaca (RBCs) sa ACK puferom za lizu (Lonza Walkersville), ćelije su resuspendovane u BD Pharmingen FACS puferu za bojenje i blokirane sa anti-mišjim CD16/32 (BD Pharmingen). Limfociti su bojeni sa anti-mišjim IgM<b->FITC (BD Pharmingen), anti-mišjim IgM<a->PE (BD Pharmingen), anti-mišjim CD19 (klon 1D3; BD Biosciences) i anti-mišjim CD3 (17A2; BIOLEGEND®) nakon čega je sledila fiksacija sa BD CYTOFIX™ sve prema uputstvima proizvođača. Krajnji ćelijski taloži su resuspendovani u pufer za bojenje i analizirani upotrebom BD FACSCALIBUR™ i BD CELLOUEST PRO™ softvera. Tabela 2 navodi srednje procentne vrednosti za ekspresiju B ćelije (CD19<+>), T ćelije (CD3<+>), hibridni težak lanac (CD19<+>IgM<a+>) i težak lanac divljeg tipa (CD19<+>IgM<b+>) zabeležene u grupama životinja od kojih svaka nosi genetičku modifikaciju.
U sličnom eksperimentu, sadržaj B ćelija slezine, krvi odeljaka koštane srži iz miševa homozigotnih za šest humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jk funkcionalno vezanih za mišji konstantni region teškog lanca (opisan u Primeru I, SI. 2) su analizirani za napredovanje preko razvoja B ćelija upotrebom protočne citometrije različitih markera ćelijske površine.
Ukratko, dve grupe (svaka po n=3, ženke starosti 8 nedelja) miševa divljeg tipa i miševa homozigotnih za šest humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkfunkcionalno vezanih za mišji konstantni region teškog lanca su žrtvovane i sakupljena je krv, slezine i koštana srž. Krv je sakupljana u microtainer epruvete sa EDTA (BD Biosciences). Koštana srž je sakupljena iz femura ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom (RPMI medijum dopunjen sa fetusnim telećim serumom, natrijum piruvat, Hepes, 2-merkaptoetanol, ne-esencijalne aminokiseline i gentamicin). Preparati RBC ćelija iz slezine i koštane srži su lizirani sa ACK puferom za lizu (Lonza Walkersville), nakon čega je sledilo ispiranje sa kompletnim RPMI medijumom.
Ćelije (1x10<6>) su inkubirane sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD) na ledu deset minuta, nakon čega je sledilo obeležavanje sa sledećim koktelom antitela u toku trideset minuta na
ledu: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Koštana srž: nezrele B ćelije (B220<int>IgM<+>), zrele B ćelije (B220<hi>IgM<+>), pro B ćelije (CD19<+>ckit<+>CD43<+>), pre B ćelije (CD19<+>ckit"CD43"), pre-B ćelije (CD19<+>CD43<int>IgM<+/>_), nezrele B ćelije (CD19<+>CD43~IgM<+/>~). Krv i slezina: B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (CD19<+>IgMintIgD<hi>), prelazne/nezrele B ćelije (CD19<+>IgM<hl>IgD<int>).
Posle bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i analizirani su sa FLOWJO™ softverom (Tree Star, Inc.). SI. 6A, 6B i 6C prikazuju rezultate za odeljak slezine. SI. 7A - 7G prikazuju rezultate za odeljak koštane srži. Ovi podaci dobijeni za odeljak krvi za svaku grupu miševa pokazali su slične rezultate u poređenju sa rezultatima iz odeljka slezine iz svake grupe (podaci nisu prikazani). U sličnom eksperimentu, sadržaj B ćelija odeljaka slezine, krvi i koštane srži iz miševa homozigotnih za trideset humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jk funkcionalno vezanih sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca (opisan u Primeru I, SI. 2) analizirani su za napredovanje preko razvoja B ćelija upotrebom protočne citometrije različitih markera ćelijske površine.
Ukratko, dve grupe (svaka po N=3, ženke starosti 6 nedelja) miševa koji sadrže lokus divljeg tip teškog lanca i zamenu endogenih genskih segmenata Vki Jksa humanim genskim segmentima Vki Jk(WT) i miševa homozigotnih za trideset hVKi pet Jkgenskih segmenata i zamenom endogenih genskih segmenata Vki Jksa humanim genskim segmentima Vki Jk (30hVK-5hJKHO) žrtvovane su i sakupljene su slezine i koštana srž. Koštana srž i splenocite su pripremljeni za bojenje sa različitim markerima ćelijske površine (kao što je opisano u prethodnom tekstu).
Ćelije (1 x IO<6>) su inkubirane sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu deset minuta, nakon čega je usledilo obeležavanje sa panelima koštane srži ili splenocita u trajanju od trideset minuta na ledu. Panel koštane srži: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-IgK(187.1 BD Biosciences), PE-IgX (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (11/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (ll-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD). Koštana srž: nezrele B ćelije (B220<int>IgM<+>), zrele B ćelije (B220<hl>IgM<+>), pro B ćelije
(CD19<+>ckit<+>CD43<+>), pre B ćelije (CD19+ckit-CD43-), nezrele IgK<+>B ćelije (B220intIgM+IgK+IgA ), nezrelelgk<+>B ćelije(B220intIgM+IgK lgk+),zrele IgK<+>B ćelije (B220<hl>IgM<+>IgK<+>Igr), zrelelgk<+>B ćelije (B220<hl>IgM<+>IgK"IgX<+>). Slezina: B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (CD19<+>IgDhiIgM<int>), prelazne/nezrele B ćelije (CD19<+>IgD<int>IgM<hl>). Koštana srž i slezina: IgK<+>B ćelije (CD19+IgK+IgAr), lgl<+>B ćelije (CD19<+>IgK"IgX<+>).
Posle bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i podaci su analizirani sa FLOWJO™ softverom (Tree Star, Inc.). Rezultati su pokazali slične obrasce bojenja i ćelijske populacije za sva tri odeljka u poređenju sa miševima homozigotnim za šest humanih genskih sekvenci Vki pet humanih genskih sekvenci Jk(opisani u prethodnom tekstu). Međutim, ovi miševi su pokazali gubitak u ekspresiji endogenog A lakog lanca i u odeljku slezine i u odeljku koštane srži (SI. 8A i 8B, respektivno), uprkos tome što je endogeni lokusXlakog lanca intaktan kod ovih miševa. Ovo može da reflektuje nesposobnost rearanžiranih humanih domenaklakih lanaca, u kontekstu konstantnih regiona teškog lanca, da bi se sparili ili spojili sa mišjim domenimaXlakog lanca, što dovodi do delecije lgk<+>ćelija.
Ekspresija izotipa.Ukupni i površinski( tj.,vezan za membranu) imunoglobulin M (IgM) i imunoglobulin Gl (IgGl) je određen za miševe homozigotne za humane varijabilne genske lokuse teškog iklakog lanca (VELCOIMMUNE® humanizovani miševi, videti SAD 7,105,348) i miševe homozigotne za šest humanih genskih segmenata Vki 5 humanih genskih segmenata Jk stvorenih inženjeringom u endogenom lokusu teškog lanca (6hVK-5hJKHO) pomoću kvantitativne PCR analize upotrebom TAQMAN<®>proba (kao što su opisane u prethodnom tekstu u Primeru II).
Ukratko, CD19<+>B ćelije su prečišćene iz slezina grupa miševa (n=3 do 4 miševa po grupi) upotrebom mišjeg CD 19 Microbeads (Miltenvi Biotec) prema uputstvima proizvođača. Ukupna RNK je prečišćena upotrebom RNEASY™ Mini kompleta (Qiagen). Genomska RNK je uklonjena upotrebom tretmana DNazom bez RNaze na koloni (Qiagen). Oko 200 ng iRNK je reverzno-transkribovano u cDNK upotrebom First Štand cDNA Svnthesis kompleta (Invitrogen) i zatim amplifikovano sa TAQMAN<®>Universal PCR Master Mix (Applied Biosvstems) upotrebom ABI 7900 Sequence Detection Svstem (Applied Biosvstems). Jedinstvene kombinacije prajmera/probe su korišćene za specifično određivanje ekspresije ukupnih, površinskih( tj.,transmembranskih)i izlučenih oblika IgM i IgGl izotipova (Tabela 3). Relativna ekspresija je normalizovana prema mišjemkkonstantnom regionu (mCK). Rezultati iz kvantitativne TAQMAN<®>PCR analize pokazali su smanjenje u ukupnom IgM i ukupnom IgGl. Međutim, odnos izlučenih prema površinskim oblicima IgM i IgGl izgledao je normalan u poređenju sa VELCOIMMUNE® humanizovanim miševima (podaci nisu prikazani).
Upotreba humanogkgenskog segmenta i analiza Vk-Jkspoja.Imunološki naivni miševi homozigotni za trideset genskih segmenata hVKi pet genskih segmenata Jki zamenu endogenih genskih segmenata Vki Jksa humanim genskim segmentima Vki Jk(30hVK-5hJKHO) analizirani su za jedinstvene humane Vk-Jkrearanžmane na mišjem teškom lancu (IgG) pomoću reverzne transkripcije/lančane reakcije polimeraze (RT-PCR) upotrebom RNK izolovane iz splenocita.
Ukratko, slezine su sakupljene i perfuzovane sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim kesama za jednokratnu upotrebu. Svaka kesa koja sadrži jednu slezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana na srednjim uslovima u trajanju od 30 sekundi. Homogenizovane slezine su filtrirane upotrebom 0.7um ćelijskog sita i zatim istaložene sa centrifugom (1000 rpm za 10 minuta) i RBC ćelije su lizirane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tri minuta. Splenocite su razblažene sa RPMI-1640 i ponovo centrifugirane, nakon čega je sledilo resuspendovanje u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je izolovana iz istaloženih spenocita upotrebom standardnih tehnika poznatih u tehnici. RT-PCR je izveden na RNK splenocita upotrebom prajmera specifičnih za humane genske segmente hVKi mišji IgG. Mišji IgG prajmer je dizajniran tako da je bio sposoban da amplifikuje RNK poreklom od svih mišjih IgG izotipova. Proizvodi PCR-a su gelom-prečišćeni i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencirani sa prajmerima M13 Fonvard (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO: 16) i M13 Reverse (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO: 17) lociranim unutar vektora na lokacijama koje flankiraju mesto kloniranja. Upotreba humanih genskih segmenata Vki Jkmeđu dvanaest izabranih klonova prikazan je u Tabeli 4. SI. 9 prikazuje nukleotidnu sekvencu hVK-hJK-mlgG spoja za dvadeset izabranih RT-PCR klonova.
Kao što je prikazano u ovom Primeru, miševi homozigotni za šest humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkili homozigotni za trideset humanih genskih segmenata Vki pet humanih genskih segmenata Jkfunkcionalno povezanih sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca pokazali su ekspresiju humanih varijabilnih regiona lakog lanca iz modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži varijabilne genske segmente lakog lanca u njihovoj konfiguraciji klicine linije. Napredovanje preko različitih stadijuma razvoja B ćelije je zabeleženo kod ovih miševa, što ukazuje na višestruke produktivne rekombinacione događaje koji uključuju varijabilne genske segmente lakog lanca iz endogenog lokusa teškog lanca i ekspresiju takvih hibridnih teških lanaca( tj.,humanog varijabilnog regiona lakog lanca vezanog za konstantni region teškog lanca) kao deo repertoara antitela.
PrimerIV
Umnožavanje miševa koji eksprimiraju VLvezujuće proteine
Da bi se stvorila nova generacija Vlvezujućih proteina, miševi koji nose nerearanžirane humanekgenske segmente mogu biti uzgajani do drugog miša koji sadrži deleciju drugog endogenog alela teškog lanca. Na ovaj način, dobij eno potomstvo bi eksprimiralo samo hibridne teške lance kao što su opisani u Primeru I. Uzgajanje je izvedeno pomoću standardnih tehnika koje su priznate u tehnici i, alternativno, od strane komercijalnih kompanija,npr.,The Jackson Laboratorv. Mišji sojevi koji nose hibridni lokus teškog lanca su ispitivani za prisustvo jedinstvenih hibridnih teških lanaca i odsustvo tradicionalnih mišjih teških lanaca.
Alternativno, miševi koji nose nerearanžirane humanekgenske segmente na mišjem lokusu teškog lanca mogu biti optimizovani uzgajanjem do drugih miševa koji sadrže jednu ili više delecija u mišjim lokusima teškog lanca (kiX).Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi eksprimiralo jedistvena antitela samo sa humanimkteškim lancem kao što je opisano u Primeru I. Uzgajanje je slično izvedeno pomoću standardnih tehnika priznatih u tehnici i, alternativno, od strane komercijalnih kompanija,npr.,The Jackson Laboratorv. Mišji sojevi koji nose hibridni lokus teškog lanca i jednu ili više delecija mišjih lokusa teškog lanca su ispitivane za prisustvo jedinstvenih hibridnih lakih lanaca koji sadrže humane domeneklakog lanca i mišje konstantne domene teškog lanca i odsustvo endogenih mišjih lakih lanaca. Miševi koji nose nerearanžirani hibridni lokus teškog lanca su takođe uzgajani sa miševima koji sadrže zamenu endogenog mišjeg varijabilnog genskog lokusaklakog lanca sa humanim varijabilnim genskim lokusomklakog lanca (videti SAD 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technologv). VELOCIMMUNE® humanizovani miš obuhvata, delimično, genom koji sadrži humane varijabilne regioneklakog lanca funkcionalno vezane sa endogenim mišjim lokusima varijabilnog/konstantnog regionaklakog lanca tako da miš proizvodi antitela koja sadrže humani varijabilni domenklakog lanca i mišji konstantni domen teškog lanca kao odgovor na stimulaciju antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione lakih lanaca antitela može biti izolovana i funkcionalno vezana sa DNK koja kodira huumane konstantne regione lakog lanca. DNK može zatim biti eksprimirana u ćeliji koja je sposobna da eksprimira potpuno humani laki lanac antitela. Posle pogodnog rasporeda uzgajanja, dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog mišjegklakog lanca sa humanim lokusomklakog lanca i nerearanžirani hibridni lokus teškog lanca. Jedinstveni VLvezujući proteini koji sadrže somatski imitirane humane Vkdomene mogu biti izolovani posle imunizacije sa antigenom od interesa.
Primer V
Stvaranje VLvezujućih proteina
Posle uzgajanja miševa koji sadrže nerearanžirani hibridni lokus teškog lanca do različitih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih lokusa Ig (kao što je opisano u Primeru IV), selekcionisani miševi mogu biti imunizovani sa antigenom od interesa. Generalno, VELOCIMMUNE® humanizovani miš koji sadrži najmanje jedan hibridni lokus teškog lanca je imunizovan sa antigenom, i ćelije (kao što su B-ćelije) su izolovane iz životinje( npr.,iz slezine ili limfnih čvorova). Ćelije mogu biti fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne ćelijske linije hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma su ispitivane i izabrane da identifikuju ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže hibridne teške lance specifične za antigen korišćen za imunizaciju. DNK koja kodira humane Vkregione hibridnih teških lanaca može biti izolovana i povezana sa poželjnim konstantnim regionima,npr.,teškog lanca i/ili lakog lanca. Zahvaljujući prisustvu humanih genskih segmenata Vkfuzionisanih sa mišjim konstantnim regionima teškog lanca, proizveden je jedinstven repertoar sličan antitelu i raznovrsnost repertoara imunoglobulina je dramatično povećana kao rezultat jedinstvenog stvorenog formata antitela. Ovo pruža dodatni nivo raznovrsnosti antigen specifičnom repertoaru posle imunizacije. Rezultirajuće klonirane sekvence antitela mogu biti zatim proizvedene u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifične Vlvezujuće proteine ili varijabilne domene može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita( npr.,B ćelija).
Početno, izolovani su visoko afinitetni VLvezujući proteini koji imaju humani Vkregion i mišji konstantni region. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, Vlvezujući proteini su okarakterisani i izabrani za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop,itd.Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se stvorili jedinstveni humani VLvezujući proteini koji sadrže somatski mutirane humane Vkdomene iz nerearanžiranog hibridnog lokusa teškog lanca prema pronalasku. Pogodni humani konstantni regioni obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovani IgGl ili IgG4 ili, alternativno CkiliCk.
Posebne kohorte miševa koji sadrže zamenu endogenog mišjeg lokusa teškog lanca sa šest humanih Vki pet humanih Jk genskih segmenata (kao što su opisani u Primeru I) i zamenu endogenih Vki Jkgenskih segmenata sa humanim Vki Jkgenskim segmentima imunizovane su sa humanim proteinom receptora na ćelijskoj površini (Antigen X). Antigen X je primenjivan direktno na taban zadnje šape miševa sa šest uzastopnih injekcija svaka 3-4 dana. Dva do tri mikrograma Antigena X su mešana sa 10 iig CpG oligonukleotida (Cat # tlrl-modn - ODN1826 oligonukleotid; InVivogen, San Diego, CA) i 25 u.g Adju-Phos (aluminijum fosfat gel adjuvant, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark) pre injekcije. Ukupno šest injekcija je dato pre krajnjeg povlačenja antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Krv je sakupljana posle 4-te i 6-te injekcije i imuni odgovor antitela je praćen pomoću standardne antigen-specifične imunološke analize.
Kada je željeni odgovor postignut splenocite su sakupljene i fuzionisane sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se očuvala njihova vijabilnost i fomirale ćelijske linije hibridoma. Ćelijske linije hibridoma su skriningovane i izabrane za identifikaciju ćelijskih linija koje proizvode Antigen X-specifične VLvezujuće proteine. Upotrebom ove tehnike dobijeno je nekoliko anti-Antigen X-specifičnih VLvezujućih proteina( tj.,vezujućih proteina koji poseduju humane Vkdomene u kontekstu mišjih konstantnih domena teškog i lakog lanca). Alternativno, anti-Antigen X VLvezujući proteini su izolovani direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u SAD 2007/0280945A1. Upotrebom ovog postupka, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-Antigen X Vlvezujućih proteina( tj.,antitela koja poseduju humane Vkdomene i humane konstantne domene).
Upotreba humanogkgenskog segmenta. Da bi se analizirala struktura proizvedenih anti-Antigen X Vlvezujućih proteina, nukleinske kiseline koje kodiraju humane Vkdomene (iz teških i lakih lanaca VLvezujućeg proteina) su klonirane i sekvencirane upotrebom postupaka prilagođenih iz onih opisanih u SAD 2007/0280945A1( supra).Tz nukleinsko kiselinskih sekvenci i predviđenih aminokiselinskih sekvenci antitela, upotreba gena je identifikovana za hibridni varijabilni region teškog lanca izabranih Vlvezujućih proteina dobijenih iz imunizovanh miševa (opisani u prethodnom tekstu). Tabela 5 navodi za gen upotrebu humanih Vki Jk genskih segmenata iz izabranih anti-Antigen X Vlvezujućih proteina, koja pokazuje da miševi prema pronalasku stvaraju antigen-specifične VLvezujuće proteine iz različitih humanih Vki Jkgenskih segmenata, zahvaljujući raznovrsnosti rearanžmana na endogenim lokusima teškog lanca iklakog lanca, gde oba sadrže nerearanžirane humane Vki Jkgenske segmente. Humani Vkgenski segmenti rearanžirani sa različitim humanim Jksegmentima da bi se proizveli jedinstveni antigen-specifični Vlvezujući proteini. Enzimski-vezana imunosorbent analiza (ELISA).Humani Vlvezujući proteini uzgajani protiv Antigena X su testirani za njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje prirodnog Uganda Antigena X (Liganda Y) u ELISA analizi.
Ukratko, Ligand Y je obložen na 96-komorne ploče u koncentraciji od 2 iig/mL razblažen u PBS i inkubiran preko noći, nakon čega je sledilo ispiranje četiri puta u PBS sa 0.05% Tween-20. Ploča je zatim blokirana sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 0.5%o (tež./zapr.) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) jedan čas na sobnoj temperaturi. U posebnoj ploči, supernatanti koji sadrže anti-Antigen X Vlvezujući protein su razblaženi 1:10 u puferu. Kontrolni supernatant sa istim komponentama Vlvezujućih proteina je korišćen kao negativna kontrola. Ekstracelularni domen (ECD) Antigena X je konjugovan sa Fc delom mišjeg IgG2a (Antigen X-mFc). Antigen X-mFc je dodat u krajnju koncentraciju od 0.150 nM i inkubiran jedan čas na sobnoj temperaturi. Smeša VLvezujućeg proteina/Antigena X-mFc je zatim dodata u ploču koja sadrži Ligand Y i inkubirana jedan čas na sobnoj temperaturi. Detekcija Antigena X-mFc vezanog za Ligand Y je određena sa renovom peroksidazom (HRP) konjugovanom za anti-Penta-His antitelom (Qiagen, Valencia, CA) i razvijena pomoću standardnog kolorimetrijskog odgovora upotrebom tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizovanog pomoću sumporne kiseline. Apsorbanca je očitavana na OD450 u trajanju od 0.1 sek. Apsorbanca pozadine uzorka bez Antigena X je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokade je izračunat za >250 (tri 96-komorne ploče) Antigen X-specifičnih VLvezujućih proteina deljenjem MFI kome je oduzeta vrednost za pozadinu svakog uzorka sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanje dobijene vrednosti od 100.
Rezultati su pokazali daje nekoliko Vlvezujućih proteina izolovanih iz miševa imunizovanih sa Antigenom X specifično vezalo ekstracelularni domen Antigena X fuzionisan sa Fc delom mišjeg IgG2a (podaci nisu prikazani).
Određivanje afiniteta.Ravnotežne konstante disocijacije (KD) za izabrane supernatante Antigen X-specifičnih VLvezujućih proteina su određene pomoću SPR (površinske plazmon rezonance) upotrebom BIACORE™ TI00 instrumenta (GE Healthcare). Svi podaci su dobijeni upotrebom HBS-EP (lOmM HEPES, 150mM NaCl, 0.3mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) kao radni pufer i pufer za uzorke, na 25°C.
Ukratko, Vlvezujući proteini su uhvaćeni iz sirovih uzoraka supernatanta na površini CM5 senzornog čipa prethodno derivatizovanog sa visokom gustinom anti-humanih Fc antitela upotrebom standardne hernije kuplovanja amina. U toku koraka hvatanja, supernatanti su injektirani preko površine anti-humanog Fc pri stopi protoka od 3 uL/min, ukupno 3 minuta. Nakon koraka hvatanja sledila je injekcija radnog pufera ili analita u koncentraciji od 100 nM u trajanju od 2 minuta pri stopi protoka od 35 uE/min. Disocijacija antigena sa uhvaćenog VLvezujućeg proteina je praćena 6 minuta. Uhvaćeni VLvezujući protein je uklonjen kratkom injekcijom od 10 mM glicina, pH 1.5. Svi senzorgrami su dvostruko referencirani oduzimanjem senzorgrama iz puferskih injekcija od senzorgrama analita, na taj način uklanjajući artefakte izazvane disocijacijom Vlvezujućeg proteina sa uhvaćene površine. Podaci vezivanja svakog VLvezujućeg proteina su podešeni prema 1:1 vezujućem modelu sa transportom mase upotrebom BIAcore TI00 Evaluation softvera v2.1.
Afiniteti vezivanja trideset i četiri izabrana VLvezujuća proteina variraju, pri čemu svi ispoljavaju KDu nanomolamom opsegu (1.5 do 130 nM). Pored toga, oko 70% izabranih VLvezujućih proteina (23 od 34) pokazalo je jednocifreni nanomolarni afinitet. Tl/2 merenja za ove izabrane VLvezujuće proteine pokazala su opseg od oko 0.2 do 66 minuta. Od trideset i četiri VLvezujuća proteina, šest je pokazalo afinitet veći od 3 nM za Antigen X (1.53, 2.23, 2.58, 2.59, 2.79 i 2.84). Rezultati afiniteta su u skladu sa VLvezujućim proteinima koji su rezultat kombinatornog spajanja rearanžiranih humanih varijabilnih domena lakog lanca vezanih za konstantne regione teškog i lakog lanca (opisani u Tabeli 4) koji su visoko afinitetno, klonalno selekcionisani i somatski mutirani. VLvezujući proteini stvoreni od strane miševa koji su ovde opisani sadrže kolekciju raznovrsnih, visoko afinitetnih jedinstvenih vezujućih proteina koji ispoljavaju specifičnost za jedan ili više epitopa na Antigenu X. U sledećem eksperimentu, izabrani humani VLvezujući proteini uzgajani protiv Antigena X su testirani za njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje prirodnog Uganda Antigena X (Liganda Y) za Antigen X u analizi na bazi LUMINEX® kuglica (podaci nisu prikazani). Rezultati su pokazali da pored specifičnog vezivanja ekstracelularnog domena Antigena X sa afinitetima u nanomolamom opsegu (opisan u prethodnom tekstu), izabrani VLvezujući proteini su takođe bili sposobni da vezuju Antigen X iz makaki majmuna( Macaca fascicularis).

Claims (24)

1. Miš koji sadrži u svojoj klicinoj liniji prvi nerearanžirani humani varijabilni genski segment kapa lakog lanca (Vk) i nerearanžirani humani spajajući genski segment kapa lakog lanca (Jk) funkcionalno vezan sa endogenim mišjim konstantnim regionom teškog lanca (Ch) na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene mišje varijabilne genske segmente teškog lanca (VH), sve funkcionalne endogene mišje raznovrsne genske segmente (DH) i sve funkcionalne endogene mišje spajajuće genske segmente teškog lanca (Jh), pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkučestvuju u rearanžmanu da bi se formirala rearanžirana Vk/Jksekvenca funkcionalno vezana za endogeni mišji konstantni region teškog lanca u mišu, i pri čemu miš dalje sadrži u svojoj klicinoj liniji drugi humani varijabilni genski segment lakog lanca (Vl) i humani genski segment lakog lanca J (Jl) funkcinalno vezan za mišji konstantni gen lakog lanca (CL).
2. Miš prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži B ćeliju koja sadrži u svom genomu rearanžiranu humanu nukleinsko kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona kapa lakog lanca imunoglobulina funkcionalno vezanu sa endogenim mišjim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca imunoglobulina.
3. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu drugi humani genski segment Vlje humani genski segment Vk.
4. Miš prema patentnom zahtevu 3, pri čemu konstantni gen lakog lanca je konstantni genklakog lanca.
5. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu drugi humani genski segment VLje humani genski segment VA,.
6. Miš prema patentnom zahtevu 5, pri čemu konstantni gen lakog lanca je konstantni gen A lakog lanca.
7. Miš prema patentnom zahtevu 1 koji eksprimira antigen-vezujući protein, pri čemu antigen-vezujući protein sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi humani varijabilni domen kapa lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina i drugi polipeptid koji sadrži drugi humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina.
8. Miš prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je drugi humani varijabilni domen lakog lanca izabran od humanog varijabilnog domena Vki humanog varijabilnog domena VA,.
9. Miš prema patentnom zahtevu 1, koji je homozigotan ili heterozigotan za navedeni endogeni lokus teškog lanca koji sadrži prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkfunkcionalno vezan sa endogenim mišjim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene mišje genske segmente VH, DHi Jh-
10. Upotreba miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za proizvodnju antigen-vezujućeg proteina koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi humani varijabilni domen kapa lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imnunoglobulina i drugi polipeptid koji sadrži drugi humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina.
11. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za proizvodnju antitela koje sadrži prvi polipeptid koji sadrži prvi humani varijabilni domen kapa lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca imnunoglobulina i drugi polipeptid koji sadrži drugi humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantim regionom teškog lanca inunoglobulina.
12. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za proizvodnju hibridoma ili kvadroma za proizvodnju antitela kao što je definisano u patentnom zahtevu 11.
13. Upotreba prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je antitelo bispecifično antitelo.
14. Mišja ćelija koja sadrži u svom genomu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkfunkcionalno vezan sa endogenim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene genske segmente VH, DHi Jh, i pri čemu mišja ćelija dalje sadrži drugi humani genski segment Vli humani genski segment Jlfunkcionalno vezane za mišji konstantni gen lakog lanca.
15. Ćelija prema patentnom zahetvu 14 koja je poreklom od miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.
16. Ćelija prema patentnom zahtevu 14 ili 15, pri čemu, ćelija je ES ćelija.
17. Tkivo poreklom od miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, koje sadrži ćelije kao što su definisane u patentnom zahtevu 14.
18. Tkivo prema patentnom zahtevu 17, koje sadrži B ćeliju koja sadrži nerearanžiranu humanu nukleinsko kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona kapa lakog lanca imunoglobulina funkcionalno vezanu sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca i rearanžiranu humanu nukleinsko kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina funkcionalno vezanu sa mišjim genom za konstantni region lakog lanca.
19. Mišji embrion koji sadrži ćeliju koja sadrži u svom genomu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkfunkcionalno vezan sa endogenim konstantnim regionom teškog lanca na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, pri čemu prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jkmenjaju sve funkcionalne endogene genske segmente Vn, Dn i Jn , i pri čemu ćelija dalje sadrži drugi humani genski segment Vli humani genski segment Jlfunkcionalno vezan sa mišjim konstantnim genom lakog lanca.
20. Postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koji sadrži zamenu na endogenom lokusu teškog lanca miša svih funkcionalnih genskig segmenata VH, DHi Jhmiša sa prvim nerearanžiranim humanim genskim segmentom Vki nerearanžiranim humanim genskim segmentom Jk, da bi se na taj način funkcionalno vezao prvi nerearanžirani humani genski segment Vki nerearanžirani humani genski segment Jksa endogenim konstantnim regionom teškog lanca i takođe inseriranje u klicinu liniju miša drugog humanog genskog segmenta VLi humanog genskog segmenta Jlfunkcionalno vezanog sa mišjim genom za konstantni region lakog lanca.
21. Antigen-vezujući protein koji se može dobiti iz miša prema bilo kom mod patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu antigen vezujući protein sadrži humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom lakog lanca i humani varijabilni domen kapa lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom teškog lanca.
22. Postupak za stvaranje antigen-vezujućeg proteina, pri čemu navedeni postupak sadrži dobijanje nukleotidne sekvence koja kodira Vkdomen iz gena koji kodira Vkdomen fuzionisan sa CHregionom iz ćelije miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, kloniranje nukleotidne sekvence koja kodira Vkdomenu okviru sa genom koji kodira humani Chregion da bi se formirala humana sekvenca antigen-vezujućeg proteina i ekspresiju humane sekvence antigen-vezujućeg proteina u pogodnoj ćeliji.
23. Postupak za stvaranje antigen-vezujućeg proteina koji sadrži humani Vkdomen, pri čemu navedeni postupak sadrži izlaganje miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 antigenu od interesa, omogućavajući mišu da razvije imuni odgovor na antigen od interesa i izolaciju navedenog antigen-vezujućeg proteina ili izolaciju humanog Vkdomena navedenog antigen-vezujućeg proteina.
24. Postupak za dobijanje humane genske sekvence Vk, pri čemu navedeni postupak sadrži izlaganje miša prema bilo kom od patentih zahteva 1 do 9 antigenu od interesa i izolaciju iz navedenog miša rearanžirane humane genske sekvence Vk, pri čemu rearanžirana humana genska sekvenca Vkje fuzionisana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira Chregion u navedenom mišu.
RS20161086A 2010-08-02 2011-08-02 Miševi koji stvaraju vezujuće proteine koji sadrže vl domene RS55495B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36990910P 2010-08-02 2010-08-02
PCT/US2011/046196 WO2012018764A1 (en) 2010-08-02 2011-08-02 Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP11741730.3A EP2601298B1 (en) 2010-08-02 2011-08-02 Mice that make binding proteins comprising vl domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55495B1 true RS55495B1 (sr) 2017-04-28

Family

ID=44543797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20161086A RS55495B1 (sr) 2010-08-02 2011-08-02 Miševi koji stvaraju vezujuće proteine koji sadrže vl domene

Country Status (27)

Country Link
US (8) US9516868B2 (sr)
EP (3) EP3960865A1 (sr)
JP (6) JP6146913B2 (sr)
KR (4) KR102008655B1 (sr)
CN (4) CN103154255B (sr)
AU (1) AU2011285919C1 (sr)
BR (1) BR112013002695B1 (sr)
CA (2) CA2807282A1 (sr)
CY (1) CY1118562T1 (sr)
DK (1) DK2601298T3 (sr)
ES (1) ES2612459T3 (sr)
HK (1) HK1217511A1 (sr)
HR (1) HRP20170322T1 (sr)
HU (1) HUE031903T2 (sr)
IL (4) IL315833A (sr)
LT (1) LT2601298T (sr)
MX (5) MX363084B (sr)
MY (1) MY172618A (sr)
NZ (2) NZ707327A (sr)
PL (1) PL2601298T3 (sr)
PT (1) PT2601298T (sr)
RS (1) RS55495B1 (sr)
RU (2) RU2750219C2 (sr)
SG (3) SG10201912639SA (sr)
SI (1) SI2601298T1 (sr)
SM (2) SMT201700023T1 (sr)
WO (1) WO2012018764A1 (sr)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2669298A3 (en) * 2008-05-23 2014-02-26 Ablexis, LLC Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
DK2597945T3 (da) 2010-07-26 2020-09-21 Trianni Inc Transgene dyr og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
JP2014531452A (ja) 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
BR112014006390A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
HRP20220253T1 (hr) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi s ograničenim teškim lancem imunoglobulina
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
SG10201913428QA (en) * 2012-02-01 2020-03-30 Regeneron Pharma Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
EP2825653A4 (en) 2012-03-14 2016-01-20 Innovative Targeting Solutions Inc PRODUCTION OF TARGETED SEQUENCE DIVERSITY IN FUSION PROTEINS
CA2867231C (en) * 2012-03-14 2021-10-19 Innovative Targeting Solutions Inc. Generating targeted sequence diversity in proteins
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
KR102484480B1 (ko) 2012-06-12 2023-01-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
LT2840892T (lt) * 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis
LT3501272T (lt) * 2013-03-13 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, vykdančios imunoglobulino lengvosios grandinės riboto rinkinio raišką
AU2014233385C1 (en) 2013-03-15 2019-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
KR102252925B1 (ko) 2013-08-26 2021-05-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도
ES2993142T3 (en) 2013-10-01 2024-12-23 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
FR3011249A1 (sr) * 2013-10-01 2015-04-03 Kymab Ltd
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
BR112016021679A2 (pt) * 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
HK1250038A1 (zh) * 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
KR20240142591A (ko) 2015-03-27 2024-09-30 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 이의 컨주게이트, 및 사용 방법
UA126272C2 (uk) 2015-06-05 2022-09-14 Дженентек, Інк. Антитіло проти тау-білка та спосіб його застосування
EP3384030A4 (en) 2015-12-03 2019-07-03 Trianni, Inc. IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY
KR102885186B1 (ko) 2016-01-25 2025-11-17 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 그의 접합체, 및 사용 방법
WO2017136734A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
CN109475109B (zh) 2016-05-20 2021-10-29 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
SI3462853T1 (sl) 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
KR20190074310A (ko) 2016-11-08 2019-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 스테로이드 및 이의 단백질-접합체
MX2019006334A (es) 2016-12-07 2019-08-01 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso.
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
SG10202109874VA (en) 2017-01-19 2021-10-28 Open Monoclonal Tech Inc Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci
CA3063871A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cyclodextrin protein drug conjugates
US11021540B2 (en) 2017-09-07 2021-06-01 Augusta University Research Institute, Inc. Antibodies to programmed cell death protein 1
JP7426931B2 (ja) 2017-11-07 2024-02-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 抗体薬物コンジュゲートのための親水性リンカー
BR112020013492A2 (pt) 2018-01-08 2020-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Esteroides e conjugados de anticorpo dos mesmos
HUE070158T2 (hu) 2018-03-24 2025-05-28 Regeneron Pharma Genetikailag módosított egerek vagy patkányok peptid-mhc komplexek elleni terápiás antitestek létrehozásra, ezek elõállítására szolgáló módszerek, valamint alkalmazásuk
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
KR20210008008A (ko) 2018-05-09 2021-01-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-msr1 항체 및 이의 사용 방법
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146312A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146309A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146305A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146316A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
US11701427B2 (en) 2020-04-16 2023-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Diels-alder conjugation methods
KR20240038138A (ko) 2020-07-13 2024-03-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단백질에서 글루타민 잔기에 접합된 캄토테신 유사체 및 그의 용도
EP4211155A1 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
WO2022056494A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
CA3199879A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
MX2024008640A (es) 2022-01-12 2024-07-24 Regeneron Pharma Analogos de camptotecina conjugados a un residuo de glutamina en una proteina y su uso.
WO2023147470A2 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Georgiamune Inc. Antibodies to programmed cell death protein 1 that are pd-1 agonists
WO2024138000A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of topoisomerase i inhibitor for adc conjugations and methods of use thereof
US20250171516A1 (en) 2023-11-03 2025-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide acids as a glp1r agonist and antibody-drug conjugates thereof
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5075181A (en) 1989-05-05 1991-12-24 Kennametal Inc. High hardness/high compressive stress multilayer coated tool
WO1991000906A1 (en) 1989-07-12 1991-01-24 Genetics Institute, Inc. Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE175234T1 (de) 1990-07-10 1999-01-15 Nippon Kokan Kk Geflügelspezifischen immunglobulin g produzierende hybridomas
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP2835787B2 (ja) 1991-03-22 1998-12-14 キヤノン株式会社 強誘電性液晶素子
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5150584A (en) 1991-09-26 1992-09-29 General Motors Corporation Method and apparatus for detecting low refrigerant charge
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
EP0583980A1 (en) 1992-08-20 1994-02-23 Eli Lilly And Company Method for generating monoclonal antibodies from rabbits
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
KR100371784B1 (ko) 1992-12-01 2003-07-22 프로테인 디자인랩스, 인코포레이티드 L-셀렉틴과반응성인인체화된항체
DE4309308C1 (de) 1993-03-23 1994-04-14 Siemens Nixdorf Inf Syst Belüftungssystem für Schränke mit stark wärmeerzeugenden elektronischen Funktionseinheiten
IL109168A0 (en) * 1993-04-01 1994-06-24 Univ Columbia A retroviral vector capable of transducing the aldehyde dehydrogenase-1 gene and making cells resistant to the chemotherapeutic agent cyclophosphamide and its derivatives and analogs
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
WO1997016537A1 (en) 1995-10-30 1997-05-09 Spectral Diagnostics, Inc. Stable chicken b-cell line and method of use thereof
WO1997049804A1 (en) 1996-06-26 1997-12-31 Baylor College Of Medicine Chromosomal rearrangement by insertion of two recombination substrates
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
CN1203922A (zh) 1997-03-21 1999-01-06 三共株式会社 人源化抗人fas抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
CA2373638A1 (en) 1999-05-27 2000-12-07 Human Genome Sciences, Inc. Adam polynucleotides and polypeptides
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
WO2002012437A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Schooten Wim Van Production of humanized antibodies in transgenic animals
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US7034134B2 (en) 2001-04-26 2006-04-25 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel metalloprotease highly expressed in the testis, MMP-29
CN1789416B (zh) 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
CA2447851C (en) 2001-06-28 2012-08-28 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
FR2827302B1 (fr) * 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
EP3269235B1 (en) 2001-11-30 2022-01-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic mice bearing human ig lambda light chain genes
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20030182675A1 (en) 2002-03-22 2003-09-25 Origen Therapeutics Functional disruption of avian immunoglobulin genes
US20050246782A1 (en) 2002-03-22 2005-11-03 Origen Therapeutics Transgenic aves producing human polyclonal antibodies
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
FI117110B (fi) 2002-07-05 2006-06-15 Outokumpu Oy Anodin syöttö sulatusreaktoriin
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
GB0228210D0 (en) * 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
GB0230203D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
US20100069614A1 (en) * 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
EP2395016A3 (en) * 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
WO2005001087A2 (en) 2003-06-11 2005-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying genes in eukaryotic cells
CN1852925A (zh) 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
WO2005019463A1 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis with humanized immunoglobulin loci
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
WO2005038001A2 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer
FR2861255B1 (fr) 2003-10-24 2006-02-17 Centre Nat Rech Scient Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe a et ses applications.
US8911234B2 (en) 2004-02-20 2014-12-16 Woodwelding Ag Implant that can be implanted in osseous tissue, method for producing said implant and corresponding implant
EP4353819A3 (en) * 2004-07-22 2024-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
CA2584814A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Suppression of endogenous immunoglobulin expression in non-human transgenic animals
GB0618345D0 (en) * 2006-09-18 2006-10-25 Univ Erasmus Binding molecules
TWI404727B (zh) 2006-01-25 2013-08-11 荷蘭鹿特丹Ｅｒａｓｍｕｓ大學醫學中心 對偶基因排除
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
SG174053A1 (en) 2006-09-01 2011-09-29 Therapeutic Human Polyclonals Inc Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
WO2008054606A2 (en) 2006-10-02 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human il-4 receptor
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
KR102096731B1 (ko) 2007-06-01 2020-04-02 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
ITMI20071522A1 (it) 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
BRPI0815848A2 (pt) 2007-08-30 2017-06-06 The Burnet Inst composto, linhagem de célula que produz anticorpo estável, composição, métodos para modular uma resposta imune em um indivíduo e para tratar e/ou prevenir uma doença, usos de um composto e/ou uma composição e de células dendríticas ou precursores das mesmas, métodos para enriquecer e detectar células dendríticas ou um subconjunto ou precursores das mesmas, polipeptídeo, polinucleotídeo vetor, célula hospedeira, planta transgênica, animal não humano transgênico, extrato, processo para preparar um composto ou um polipeptídeo, população enriquecida de células dendríticas e/ou precursores das mesmas, população de célula dendrítica expandida e/ou precursores das mesmas, métodos para identificar uma molécula que se liga a um polipeptídeo e para triar quanto a um composto que se liga a um polipeptídeo, uso de um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um vetor, uma célula hospedeira, uma planta transgênica, um extrato, uma população de célula e/ou uma composição, método para produzir um composto, e, kit.
DK3059246T3 (en) 2007-09-26 2018-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified constant region of an antibody
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2271758B1 (en) 2008-04-14 2018-09-12 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
EP2669298A3 (en) 2008-05-23 2014-02-26 Ablexis, LLC Single variable immunoglobulin domain comprising VL-DH-JL
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
PT3456190T (pt) * 2008-06-27 2022-02-15 Merus Nv Animal murino transgénico produtor de anticorpo
KR101987351B1 (ko) 2008-09-30 2019-06-10 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
RU2011129459A (ru) 2008-12-18 2013-01-27 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение
US9085795B2 (en) 2009-02-04 2015-07-21 Molecular Innovations, Inc. Methods for screening candidate agents for modulating prorenin and renin, assays for detecting prorenin and antibodies
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
KR20110126748A (ko) 2009-04-07 2011-11-23 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-ｅｒｂｂ-1/항-ｃ-ｍｅｔ 항체
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
RU2425880C2 (ru) 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
CN101620635A (zh) * 2009-08-07 2010-01-06 中兴通讯股份有限公司 页面数据获取方法及服务器、页面更新方法及服务器
WO2011072204A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
AU2011266843C9 (en) 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG10201504568YA (en) 2010-06-22 2015-07-30 Regeneron Pharma Hybrid light chain mice
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
WO2012063048A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Kymab Limited Cells & vertebrates for enhanced somatic hypermutation and class switch recombination
ME03732B (me) 2011-02-25 2021-01-20 Regeneron Pharma Miševi s ADAM6
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
US20120310284A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Royal Oak Industries Polyaxial pedicle screw
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
BR112014006390A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd anticorpos, domínios variáveis e cadeias feitos especialmente para uso humano
JP2014531452A (ja) 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
HRP20220253T1 (hr) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi s ograničenim teškim lancem imunoglobulina
GB2496375A (en) 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
ME03477B (me) 2011-12-20 2020-01-20 Regeneron Pharma Miševi sa humanizovanim lakim lancem
SG10201913428QA (en) 2012-02-01 2020-03-30 Regeneron Pharma Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA2908697C (en) 2013-04-16 2023-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013002695B1 (pt) 2023-01-24
PL2601298T3 (pl) 2017-03-31
US20260071006A1 (en) 2026-03-12
RU2750219C2 (ru) 2021-06-24
JP2018046872A (ja) 2018-03-29
RU2612903C2 (ru) 2017-03-13
CN113150121B (zh) 2024-08-16
SG187673A1 (en) 2013-03-28
JP2013535213A (ja) 2013-09-12
HK1181810A1 (en) 2013-11-15
KR102306967B1 (ko) 2021-10-01
CA2807282A1 (en) 2012-02-09
NZ740900A (en) 2023-11-24
IL271804B1 (en) 2024-11-01
US20170223939A1 (en) 2017-08-10
IL315833A (en) 2024-11-01
JP7078400B2 (ja) 2022-05-31
IL224523B (en) 2018-04-30
MX363084B (es) 2019-03-07
CY1118562T1 (el) 2017-07-12
RU2017106292A3 (sr) 2020-12-10
KR102008655B1 (ko) 2019-08-08
KR20130100277A (ko) 2013-09-10
EP2947151A1 (en) 2015-11-25
NZ707327A (en) 2017-01-27
US20220177606A1 (en) 2022-06-09
KR20190095511A (ko) 2019-08-14
US20140130194A1 (en) 2014-05-08
CA3250882A1 (en) 2025-11-29
JP2020078328A (ja) 2020-05-28
MX345251B (es) 2017-01-23
US20170226231A1 (en) 2017-08-10
IL258338B (en) 2020-01-30
IL271804B2 (en) 2025-03-01
US20120096572A1 (en) 2012-04-19
CN105753979B (zh) 2021-05-07
PT2601298T (pt) 2017-01-09
BR112013002695A2 (pt) 2017-03-01
NZ724003A (en) 2021-03-26
US9686970B2 (en) 2017-06-27
RU2013109068A (ru) 2014-09-10
EP2601298A1 (en) 2013-06-12
US20210163628A1 (en) 2021-06-03
SI2601298T1 (sl) 2017-03-31
MX2013001360A (es) 2013-06-28
EP3960865A1 (en) 2022-03-02
KR102434557B1 (ko) 2022-08-23
MX2023001793A (es) 2023-03-10
HK1217511A1 (en) 2017-01-13
IL271804A (en) 2020-02-27
KR102163138B1 (ko) 2020-10-08
HRP20170322T1 (hr) 2017-04-21
KR20200116547A (ko) 2020-10-12
MX350591B (es) 2017-09-11
ES2612459T3 (es) 2017-05-17
CN118791596A (zh) 2024-10-18
RU2017106292A (ru) 2019-01-21
MX2018014787A (es) 2023-02-14
LT2601298T (lt) 2017-03-10
CN113150121A (zh) 2021-07-23
JP6146913B2 (ja) 2017-06-14
US10954310B2 (en) 2021-03-23
SG10201912639SA (en) 2020-02-27
SMT201700023T1 (it) 2017-03-08
DK2601298T3 (en) 2017-02-27
IL258338A (en) 2018-05-31
CN105753979A (zh) 2016-07-13
WO2012018764A1 (en) 2012-02-09
CN103154255B (zh) 2016-04-06
JP2019047805A (ja) 2019-03-28
JP2021119792A (ja) 2021-08-19
JP2016054746A (ja) 2016-04-21
SG10201504971QA (en) 2015-07-30
AU2011285919A1 (en) 2013-02-28
SMT201700023B (it) 2017-03-08
JP6759303B2 (ja) 2020-09-23
KR20210118972A (ko) 2021-10-01
AU2011285919B2 (en) 2015-04-30
JP7110257B2 (ja) 2022-08-01
US20140130193A1 (en) 2014-05-08
EP2601298B1 (en) 2016-11-30
MY172618A (en) 2019-12-06
CN113150121B9 (zh) 2024-11-26
CN103154255A (zh) 2013-06-12
US9516868B2 (en) 2016-12-13
HUE031903T2 (en) 2017-08-28
AU2011285919C1 (en) 2015-09-17
US12486335B2 (en) 2025-12-02
NZ606824A (en) 2015-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12486335B2 (en) Mice that make VL binding proteins
AU2017219079B9 (en) Mice that make binding proteins comprising vl domains
HK40069751A (en) Mice that make binding proteins comprising vl domains
HK1181810B (en) Mice that make binding proteins comprising vl domains
NZ724003B2 (en) Mice that make binding proteins comprising vl domains