BR112013002695B1 - Métodos para preparação de um camundongo geneticamente modificado, proteína de ligação ao antígeno, uso de um camundongo preparado pelo método e vetor de direcionamento - Google Patents

Métodos para preparação de um camundongo geneticamente modificado, proteína de ligação ao antígeno, uso de um camundongo preparado pelo método e vetor de direcionamento Download PDF

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Abstract

MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DE CAMUNDONGOS GENETICAMENTE MODIFICADOS, PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, USO, VETOR, CONSTRUCTO E DOMÍNIOS VL. São proporcionados camundongos geneticamente modificados e métodos para produzir uma usando os mesmos, em que os camundongos compreendem uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos V de cadeia pesada de imunoglobulina, segmentos genéticos D, e segmentos genéticos J com no mínimo um segmento genético V de cadeia leve e no mínimo um segmento genético J de cadeia leve. São proporcionados camundongos que produzem proteínas de ligação que compreendem um domínio variável de cadeia leve ligado operavelmente a uma região constante de cadeia pesada. São proporcionadas proteínas de ligação que contêm um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, incluindo um domínio variável de cadeia leve hipermutado somaticamente, fundido com uma região constante de cadeia pesada. São proporcionadas células, embriões e camundongos modificados que codificam sequências para produzir as proteínas de ligação.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] São proporcionadas proteínas de ligação semelhantes a imunoglobulina compreendendo uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina, bem como proteínas de ligação tendo um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina fundido a um domínio constante de cadeia leve e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina fundido a um domínio constante de cadeia pesada. Também são proporcionadas células expressando as proteínas de ligação referidas, camundongos que produzem as mesmas, e métodos e composições relacionados.
ANTECEDENTES
[0002] Os anticorpos tipicamente compreendem uma estrutura tetramérica tendo duas cadeias pesadas idênticas que cada uma compreendem uma região constante de cadeia pesada (CH) fundida com um domínio variável de cadeia pesada (VH) associado com uma região constante de cadeia leve (CL) fundida com um domínio variável de cadeia leve (VL). Para uma IgG humana típica, uma molécula de anticorpo tem aproximadamente cerca de 150 kDa a cerca de 170 kDa de tamanho (por exemplo, para IgG3, a qual compreende uma região de articulação mais longa), dependendo da subclasse de IgG (por exemplo, IgG1, IgG3, IgG4) e extensão (variável) de uma região variável.
[0003] Em um anticorpo típico, os domínios VH e VL se associam para formar um sítio de ligação que liga um antígeno alvo. As características do anticorpo com respeito a afinidade e especificidade portanto podem depender em grande parte das características dos domínios VH e VL. Em anticorpos típicos em humanos e em camundongos, os domínios VH se acoplam ou com domínios VL À ou K. No entanto, também é sabido que os domínios VL podem ser produzidos de modo a que liguem especificamente um antígeno alvo na ausência de um domínio VH cognato (por exemplo, um domínio VH que seja expressado naturalmente no contexto de um anticorpo e esteja associado com o domínio VL em particular), e que podem ser isolados domínios VH que ligam especificamente um antígeno alvo na ausência de um domínio VL cognato. Deste modo, a útil diversidade em proteínas de ligação à base de imunoglobulina geralmente é conferida por recombinação levado a um VH ou VL particular (e hipermutação somática, na medida em que ocorre), bem como por combinação de um par VH/VL cognato. Seria útil desenvolver composições e métodos para explorar outras fontes de diversidade.
[0004] Existe a necessidade na arte de proteínas de ligação à base de estruturas de imunoglobulina, incluindo regiões variáveis de imunoglobulinas tais como regiões variáveis de cadeia leve, e incluindo proteínas de ligação que apresentem aumentada diversidade em relação aos anticorpos tradicionais. Além disso existe a necessidade na arte de métodos e animais adicionais para produzir proteínas de ligação úteis, incluindo proteínas de ligação que compreendem diversas sequências de regiões variáveis de cadeia leve de imunoglobulina. Também são necessários formatos úteis para proteínas de ligação à base de imunoglobulina que proporcionem uma aumentada diversidade de proteínas de ligação das quais escolher, e aumentada diversidade de domínios variáveis de imunoglobulina, incluindo composições e métodos para produzir domínios variáveis de imunoglobulina mutados somaticamente e selecionados clonalmente para Uso, por exemplo, na produção de terapêuticos humanos.
SUMÁRIO
[0005] Em um aspecto, são descrtas proteínas de ligação que compreendem domínios variáveis de imunoglobulina que são derivados de cadeia leve (isto é, kappa (K) e/ou lambda (X)) domínios variáveis de imunoglobulina, mas não de domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina de extensão completa. Também são proporcionados métodos e composições para produzir proteínas de ligação, incluindo camundongos geneticamente modificados.
[0006] Em um aspecto, são proporcionados constructos de ácidos nucleicos, células, embriões, camundongos, e métodos para produzir proteínas que compreendem uma ou mais sequências de imunoglobulina de região variável de cadeia leve k e/ou X e uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo proteínas que compreendem um domínio variável de cadeia leve X ou k humana e uma sequência de região constante de cadeia pesada humana ou de camundongo.
[0007] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo, compreendendo um locus de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma substituição de um ou mais segmentos genéticos de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), segmentos genéticos de diversidade de cadeia pesada (DH), e segmentos genéticos de ligação de cadeia pesada (JH) em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno com um ou mais segmentos genéticos de região variável de cadeia leve (VL) e um ou mais segmentos genéticos de região de ligação de cadeia leve (JL).
[0008] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo, compreendendo um locus de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos VH, DH, e JH com um ou mais segmentos genéticos VL e um ou mais segmentos genéticos JL para formar uma sequência de segmento genético VL em um locus de cadeia pesada endógena (locus VLH), em que o locus VLH é capaz de recombinação com um gene de camundongo endógeno CH para formar um gene rearranjado que é derivado de um segmento genético VL, de um segmento genético JL, e um gene de camundongo endógeno CH.
[0009] Em uma modalidade, os segmentos VL são segmentos VL humanos. Em uma modalidade, os segmentos JL são segmentos JL humanos. Em uma modalidade específica, os segmentos VL e JL são segmentos VL humanos e JL humanos.
[00010] Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos VH, DH, e JH são substituídos com no mínimo seis segmentos genéticos VK humanos e no mínimo um segmento genético JK. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos VH, DH, e JH são substituídos com no mínimo 16 segmentos genéticos Vk humanos (Vk humanos) e no mínimo um segmento genético Jk. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos VH, DH, e JH são substituídos com no mínimo 30 segmentos genéticos Vk humanos e no mínimo um segmento genético Jk. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos VH, DH, e JH são substituídos com no mínimo 40 segmentos genéticos Vk humanos e no mínimo um segmento genético Jk. Em uma modalidade, o no mínimo um segmento genético Jk compreende dois, três, quatro, ou cinco segmentos genéticos Jk humanos.
[00011] Em uma modalidade, os segmentos VL são segmentos Vk humanos. Em uma modalidade, os segmentos Vk humanos compreendem 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, e 1-6. Em uma modalidade, os k VL compreendem 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16. Em uma modalidade, os segmentos Vk humanos compreendem 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, e 2-30. Em uma modalidade, os segmentos VK humanos compreendem 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, e 2-40.
[00012] Em uma modalidade, os segmentos VL são segmentos Vk humanos e compreendem 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 210, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, e 1-16. Em uma modalidade, os segmentos Vk compreendem 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, e 2-30. Em uma modalidade, os segmentos Vk compreendem adicionalmente 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 135, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, e 2-40.
[00013] Em uma modalidade, os segmentos VL são segmentos VÀ humanos e compreendem um fragmento de cluster A do locus de cadeia leve à humana. Em uma modalidade específica, o fragmento de cluster A do locus de cadeia leve à humana se estende de hVà3-27 a hVà3-1.
[00014] Em uma modalidade, os segmentos VL compreendem um fragmento de cluster B do locus de cadeia leve à humana. Em uma modalidade específica, o fragmento de cluster B do locus de cadeia leve à humana se estende de hVà5-52 a hVà1-40.
[00015] Em uma modalidade, os segmentos VL compreendem uma sequência de região variável de cadeia leve à humana que compreende um fragmento genômico de cluster A e um fragmento genômico de cluster B. Em uma modalidade, a sequência de região variável de cadeia leve à humana compreende no mínimo um segmento genético de cluster A e no mínimo um segmento genético de cluster B.
[00016] Em uma modalidade, os segmentos VL compreendem no mínimo um segmento genético de cluster B e no mínimo um segmento genético de cluster C.
[00017] Em uma modalidade, os segmentos VL compreendem hVà 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, e 3-12. Em uma modalidade específica, os segmentos VL compreendem uma sequência contígua do locus de cadeia leve À humana que se estende de VÀ3-12 a VÀ3-1. Em uma modalidade, a sequência contígua compreende no mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 hVÀs. Em uma modalidade específica, os hVÀs incluem 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, e 3-12. Em uma modalidade específica, os hVÀs compreende uma sequência contígua do locus À humano que se estende de VÀ3-12 to VÀ3-1.
[00018] Em uma modalidade, os hVÀs compreende 13 a 28 ou mais hVÀs. Em uma modalidade específica, os hVÀs incluem 2-14, 3-16, 218, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, e 3-27. Em uma modalidade específica, os hVÀs compreendem uma sequência contígua do locus À humano que se estende de VÀ3-27 a VÀ3-1.
[00019] Em uma modalidade, os segmentos VL compreendem 29 a 40 hVÀs. Em uma modalidade específica, os segmentos VL compreendem uma sequência contígua do locus À humano que se estende de VÀ3-29 a VÀ3-1, e uma sequência contígua do locus À humano que se estende de VÀ5-52 a VÀ1-40. Em uma modalidade específica, todas ou substancialmente todas as sequências entre hVÀ1- 40 e hVÀ3-29 no camundongo geneticamente modificado consiste essencialmente de uma sequência À humana de aproximadamente 959 bp encontrada na natureza (por exemplo, na população humana) a jusante do segmento genético hVÀ1-40 (a jusante da porção não traduzida 3’), um sítio enzimático de restrição (por exemplo, PI-SceI), seguido por uma sequência À humana de aproximadamente 3,431 bp a montante do segmento genético hVÀ3-29 encontrado na natureza.
[00020] Em uma modalidade, o JK é humano e é selecionado entre o gurpo consistindo em JK1, JK2, JK3, JK4, JK5, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o Jk compreende Jk1 a Jk5.
[00021] Em uma modalidade, os segmentos VL são segmentos VÀ humanos, e o segmento genético Jk compreende uma RSS tendo um espaçador de 12-meros, em que a RSS está justaposta na extremidade a montante do segmento genético JK. Em uma modalidade, os segmentos genéticos VL são VÀ humanos e o locus VLH compreende dois ou mais segmentos genéticos Jk, cada um compreendendo uma RSS tendo um espaçador de 12-meros em que a RSS está justaposta na extremidade a montante de cada segmento genético Jk.
[00022] Em uma modalidade específica, os segmentos VL compreendem segmentos genéticos k humanos contíguos abrangendo o locus k humano de Vk4-1 a Vk2-40, e os segmentos JL compreendem segmentos genéticos contíguos abrangendo o locus k humano de Jk1 a Jk5.
[00023] Em uma modalidade, onde os segmentos VL são segmentos Và e não há segmento DH presente entre os segmentos VL e os segmentos J, os segmentos VL são flanqueados a jusante (isto é, justapostos sobre o lado a jusante) com RSS de 23-meros, e os segmentos Jk caso presentes ou os segmentos Jà caso presentes são flanqueados a montante (isto é, justapostos sobre o lado a montante) com RSS de 12-meros.
[00024] Em uma modalidade, onde os segmentos genéticos V são segmentos genéticos Vk e não há segmento genético DH presente entre os segmentos genéticos V e os segmentos genéticos J, os segmentos genéticos Vk são cada um justapostos sobre o lcado a jusante com uma RSS de 12-meros, e os segmentos Jk caso presentes ou os segmentos Jà caso presentes são cada um justapostos sobre o lado a montante com uma RSS de 23-meros.
[00025] Em uma modalidade, o camundongo compreende um gene rearranjado que é derivado de um segmento genético VL, um segmento genético JL, e um gene de CH de camundongo endógeno. Em uma modalidade, o gene rearranjado é mutado somaticamente. Em uma modalidade, o gene rearranjado compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais adições de N. Em uma modalidade, as adições de N e/ou as mutações somáticas observadas no gene rearranjado derivado do segmento VL e do segmento JL são 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, ou no mínimo 5 vezes mais do que o número de adições de N e/ou mutações somáticas observadas em um domínio variável de cadeia leve reorganizado (derivado do mesmo segmento genético VL e do mesmo segmento genético JL) que é reorganizado em um locus de cadeia leve endógena. Em uma modalidade, o gene rearranjado está em uma célula B que liga especificamente um antígeno de interesse, em que a célula B liga o antígeno de interesse com uma KD na faixa nanomolar baixa ou inferior (por exemplo, uma KD de 10 nanomolar ou inferior). Em uma modalidade específica, o segmento VL, o segmento JL, ou ambos, são segmentos genéticos humanos. Em uma modalidade específica, os segmentos VL e JL são segmentos genéticos K humanos. Em uma modalidade, o gene de CH de camundongo é selecionado entre IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Em uma modalidade específica, a IgG de camundongo é selecionada entre IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C e IgG3. Em outra modalidade específica, a IgG de camundongo é IgG1.
[00026] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula B, em que a célula B produz a partir de um locus sobre um cromossoma da célula B uma proteína de ligação consistindo essencialmente de quatro cadeias de polipeptídeos, em que as quatro cadeias de polipeptídeo consistem essencialmente de (a) dois polipeptídeos idênticos que compreendem uma região CH de camundongo endógena fundida com um VL; e, (b) dois polipeptídeos idênticos que compreendem uma região CL de camundongo endógena fundida com uma região VL que é cognata com respeito à região VL que é fundida com a região CH de camundongo, e, em uma modalidade, é uma região VL humana (por exemplo, uma k humana). Em uma modalidade, a região VL fundida com a região CH de camundongo endógena é uma região VL humana. Em uma modalidade específica, a região VL humana fundida com a uma CH de camundongo é uma região VK. Em uma modalidade específica, a região VL humana fundida com a região CH de camundongo é idêntica a uma região V codificada por uma sequência de nucleotídeos de cadeia leve de linhagem germinativa humana reorganizada. Em uma modalidade específica, a região VL humana fundida com a região CH de camundongo compreende duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a região VL humana fundida com a região CH de camundongo é codificada por um gene rearranjado que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00027] Em uma modalidade, no mínimo 50% de todas as moléculas de IgG produzidas pelo camundongo compreendem um polipeptídeo que compreende uma região CH de isótipo de IgG e uma região VL, em que a extensão do referido polipeptídeo é não maior do que 535, 530, 525, 520, ou 515 aminoácidos. Em uma modalidade, no mínimo 75% de todas as moléculas de IgG compreendem o polipeptídeo mencionado neste parágrafo. Em uma modalidade, no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de todas as moléculas de IgG compreendem o polipeptídeo mencionado neste parágrafo. Em uma modalidade específica, todas as moléculas de IgG produzidas pelo camundongo compreendem um polipeptídeo que é não maior do que a extensão do polipeptídeo mencionado neste parágrafo.
[00028] Em uma modalidade, o camundongo produz uma proteína de ligação que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende uma região CH de camundongo endógena fundida com um domínio variável codificado por um segmento genético V humano reorganizado e um segmento genético J mas não um segmento genético DH, e um segundo polipeptídeo que compreende uma região CL de camundongo endógena fundida com um domínio V codificado por um segmento genético V humano reorganizado e um segmento genético J mas não um segmento genético DH, e a proteína de ligação liga especificamente um antígeno com uma afinidade na faixa micromolar, nanomolar, ou picomolar. Em uma modalidade, o segmento J é um segmento J humano (por exemplo, um segmento genético K humano). Em uma modalidade, o segmento V humano é um segmento VK humano. Em uma modalidade, o domínio variável que é fundido com a região CH de camundongo endógena compreende um maior número de hipermutações somáticas do que a região variável que é fundida com a região CL de camundongo endógena; em uma modalidade específica, a região variável fundida com a região CH de camundongo endógena compreende cerca de 1,5, 2-, 3-, 4-, ou 5- vezes ou mais hipermutações somáticas do que a região V fundida com a região CL de camundongo endógena; em uma modalidade específica, a região V fundida com o região CH de camundongo compreende no mínimo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 ou mais hipermutações somáticas do que a região V fundida com a região CL de camundongo. Em uma modalidade, a região V fundida com a região CH de camundongo é codificada por um gene rearranjado que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00029] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma proteína de ligação que compreende um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1) fundido com uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) fundido com uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina, em que VL1 compreende uma série de hipermutações somáticas que é cerca de 1,5 vez a cerca de 5 vezes maior ou mais do que o número de hipermutações somáticas presentes em VL2. Em uma modalidade, o número de hipermutações somáticas em VL1 é cerca de 2 vezes a cerca de 4 vezes maior do que em VL2. Em uma modalidade, o número de hipermutações somáticas em VL1 cerca de 2 vezes a cerca de 3 vezes maior do que em VL2. Em uma modalidade, VL1 é codificado por uma sequência que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00030] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo geneticamente modificado que expressa uma imunoglobulina que consiste essencialmente dos seguintes polipeptídeos: um primeiro conjunto de dois polipeptídeos idênticos que consistem cada um essencialmente de uma região CH fundida com um domínio variável que é derivado de segmentos genéticos que consistem essencialmente de um segmento genético VL e um segmento genético JL, e um segundo conjunto de dois polipeptídeos idênticos que consistem cada um essencialmente de uma região CL fundida com um domínio variável que é derivado de segmentos genéticos que consistem essencialmente de um segmento VL e um segmento JL.
[00031] Em uma modalidade específica, os dois polipeptídeos idênticos que têm a região CH têm um região CH de camundongo. Em uma modalidade específica, os dois polipeptídeos idênticos que têm a CL têm uma região CL de camundongo.
[00032] Em uma modalidade, o domínio variável fundido com a região CL é um domínio variável que é cognato com o domínio variável fundido com a região CH.
[00033] Em uma modalidade, o domínio variável que é fundido com a região CH de camundongo endógena compreende um número maior de hipermutações somáticas do que o domínio variável que é fundido com a endógeno camundongo CL região; em uma modalidade específica, o domínio variável fundido com a região CH de camundongo endógena compreende cerca de 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, ou 5 vezes ou mais hipermutações somáticas do que odomínio variável fundido com a região CL de camundongo endógena. Em uma modalidade, o domínio variável fundido com a região CL de camundongo endógena é codificado por um gene que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais adições de N.
[00034] Em uma modalidade, um ou mais dos segmentos V e dos segmentos J são segmentos genéticos humanos. Em uma modalidade específica, tanto os segmentos V e quanto os segmentos J são segmentos genéticos K humanos. Em outra modalidade específica, tanto os segmentos V quanto os segmentos J são segmentos genéticos Àhumanos. Em uma modalidade, os segmentos V e os segmentos J são selecionados de modo independente entre segmentos genéticos k humanos e À humanos. Em uma modalidade específica, os segmentos V são segmentos VK e os segmentos J são segmentos JÀ. Em outra modalidade específica, os segmentos V são segmentos VÀ e os segmentos J são segmentos Jk.
[00035] Em uma modalidade, um ou mais dos domínios variáveis fundidos com a região CL e dos domínios variáveis fundidos com a região CH são domínios variáveis humanos. Em uma modalidade específica, os domínios variáveis humanos são domínios V K humanos. Em outra modalidade específica, os domínios variáveis humanos são domínios VÀ. Em uma modalidade, os domínios humanos são selecionados de modo independente entre domínios Vk humanos e VÀ humanos. Em uma modalidade específica, o domínio variável humano fundido com a região CL é um domínio VÀ humano e o domínio variável humano fundido com a região CH é um domínio Vk humano. Em outra modalidade, o domínio variável humano fundido com a região CL é um domínio VK humano e o domínio variável humano fundido com a CH é um domínio VÀ humano.
[00036] Em uma modalidade, o segmento genético VL dos primeiros dois polipeptídeos idênticos é selecionado entre um segmento VÀ humano e um segmento VK humano. Em uma modalidade, o segmento VL dos segundos dois polipeptídeos idênticos é selecionado entre um segmento Và humano e um segmento Vk humano. Em uma modalidade específica, o segmento VL dos primeiros dois polipeptídeos idênticos é um segmento Vk humano e o segmento VL dos segundos dois polipeptídeos idênticos é selecionado entre um segmento Vk humano e um humano Và segmento. Em uma modalidade específica, o segmento VL dos primeiros dois polipeptídeos idênticos é um segmento Và humano e o segmento VL dos segundos dois polipeptídeos idênticos é selecionado entre um segmento Và humano e um segmento Vk humano. Em uma modalidade específica, o segmento VL humano dos pirmeiros dois polipeptídeos idênticos é um segmento Vk humano, e o segmento VL humano dos segundos dois polipeptídeos idênticos é um segmento Vk humano.
[00037] Em uma modalidade, a IgG do camundongo compreende uma proteína de ligação produzida em resposta a um antígeno, em que a proteína de ligação compreende um polipeptídeo que consiste essencialmente de um domínio variável e uma região CH, em que o domínio variável é codificado por uma sequência de nucleotídeos que consiste essencialmente de um segmento VL reorganizado e um segmento J reorganizado, e em que a proteína de ligação liga especificamente um epítope do antígeno com uma KD na faixa micromolar, nanomolar, ou picomolar.
[00038] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo, em que todas ou substancialmente todas as IgG produzidas pelo camundongo em resposta a um antígeno compreendem uma cadeia pesada que compreende um domínio variável, em que o domínio variável é codificado por um gene rearranjado derivado de segmentos genéticos que consistem essencialmente de um segmento genético V e um segmento genético J. Em uma modalidade, o gene rearranjado compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00039] Em uma modalidade, o segmento V é um segmento V de uma cadeia leve. Em uma modalidade, a cadeia leve é selecionada entre uma cadeia leve K e uma cadeia leve X. Em uma modalidade específica, a cadeia leve é uma cadeia leve K. Em uma modalidade específica, o segmento V é um segmento V humano. Em uma modalidade específica, o segmento V é um segmento Vk humano e o segmento J é um segmento Jk humano.
[00040] Em uma modalidade, o segmento J é um segmento J de uma cadeia leve. Em uma modalidade, a cadeia leve é selecionada entre uma cadeia leve k e uma cadeia leve X. Em uma modalidade específica, a cadeia leve é uma cadeia leve k. Em uma modalidade específica, o segmento J é um segmento J humano. Em outra modalidade, o segmento J é um segmento J de uma cadeia pesada (isto é, um JH). Em uma modalidade específica, a cadeia pesada é de origem de camundongo. Em outra modalidade específica, a cadeia pesada é de origem humana.
[00041] Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada que é produzido a partir de não mais de um segmento V e um segmento J é um domínio variável mutado somaticamente.
[00042] Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia pesada que é produzido a partir de não mais de um segmento V e um segmento J é fundido com uma região CH de camundongo.
[00043] Em uma modalidade específica, todas ou substancialmente todas as IgG produzidas pelo camundongo em resposta a um antígeno compreende um domínio variável que é derivado de não mais de um segmento V humano e não mais de um segmento J humano, e o domínio variável é fundido com uma região constante de IgG de camundongo, e a IgG compreende adicionalmente uma cadeia leve que compreende um domínio humano VL fundido com uma região CL de camundongo. Em uma modalidade específica, o domínio VL fundido com a região CL de camundongo é derivado de um segmento VK humano e um segmento JK humano. Em uma modalidade específica, o domínio VL fundido com a região CL de camundongo é derivado de um segmento VÀ humano e um segmento JÀ humano.
[00044] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz uma IgG compreendendo uma primeira CDR3 sobre um polipeptídeo compreendendo uma região CH e uma segunda CDR3 sobre um polipeptídeo compreendendo uma região CL, em que tanto a primeira CDR3 quanto a segunda CDR3 são cada uma de modo independente derivadas de não mais de dois segmentos genéticos, em que os dois segmentos genéticos consistem essencialmente de um segmento genético VL e um segmento genético JL. Em uma modalidade, a CDR3 sobre o polipeptídeo compreendendo a região CH compreende uma sequência que é derivada de uma sequência de nucleotídeos de CDR3 que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00045] Em uma modalidade, o segmento VL e o segmento JL são segmentos genéticos humanos. Em uma modalidade, o segmento VL e o segmento JL são segmentos genéticos k. Em uma modalidade, o segmento VL e o segmento JL são segmentos genéticos à.
[00046] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz uma IgG compreendendo uma primeira CDR3 sobre um primeiro polipeptídeo compreendendo uma região CH e uma segunda CDR3 sobre um segundo polipeptídeo compreendendo uma região CL, em que tanto a primeira CDR3 quanto a segunda CDR3 cada uma compreendem uma sequência de aminoácidos em que mais de 75% dos aminoácidos são derivados de um segmento genético V. Em uma modalidade, a CDR3 sobre o polipeptídeo compreendendo a região CH compreende uma sequência que é derivada de uma sequência de nucleotídeos de CDR3 que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00047] Em uma modalidade, mais de 80%, mais de 90%, ou mais de 95% dos aminoácidos da primeira CDR3, e mais de 80%, mais de 90%, ou mais de 95% dos aminoácidos da segunda CDR3, são derivados de um segmento V de cadeia leve.
[00048] Em uma modalidade, não mais de dois aminoácidos da primeira CDR3 são derivados de um segmento genético diferente de um segmento V de cadeia leve. Em uma modalidade, não mais de dois aminoácidos da segunda CDR3 são derivados de um segmento genético diferente de um segmento V de cadeia leve. Em uma modalidade específica, não mais de dois aminoácidos da primeira CDR3 e não mais de dois aminoácidos da segunda CDR3 são derivados de um segmento genético diferente de um segmento V de cadeia leve. Em uma modalidade, nenhuma CDR3 da IgG compreende uma sequência de aminoácidos derivada a partir de um segmento genético D. Em uma modalidade, a CDR3 do primeiro polipeptídeo não compreende uma sequência derivada a partir de um segmento D.
[00049] Em uma modalidade, o segmento V é um segmento genético V humano. Em uma modalidade específica, o segmento V é um segmento genético VK humano.
[00050] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda CDR3 têm no mínimo uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a primeira CDR3 é codificada por uma sequência de ácido nucleico que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00051] Em uma modalidade, a primeira CDR3 consiste essencialmente de aminoácidos derivados de um segmento genético de cadeia leve V humano e um segmento genético de cadeia leve J humano, e a segunda CDR3 consiste essencialmente de aminoácidos derivados de um segmento genético de cadeia leve V humano e um segmento genético de cadeia leve J humano. Em uma modalidade, a primeira CDR3 é derivada de uma sequência de ácido nucleico que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N. Em uma modalidade, a primeira CDR3 é derivada de não mais de dois segmentos genéticos, em que os não mais de dois segmentos genéticos são um segmento genético VK humano e um segmento genético JK humano; e a segunda CDR3 é derivada de não mais de dois segmentos genéticos, em que os não mais de dois segmentos genéticos são um segmento genético Vk humano e um segmento genético J selecionado entre um segmento JK humano, um segmento JÀ humano, e um segmento JH humano. Em uma modalidade, a primeira CDR3 é derivada de não mais de dois segmentos genéticos, em que os não mais de dois segmentos genéticos são um segmento Và humano e um segmento J selecionado entre um segmento Jk humano, um segmento Jà humano, e um segmento JH humano.
[00052] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz uma IgG que não contém uma sequência de aminoácidos derivada de um segmento genético DH, em que a IgG compreende um primeiro polipeptídeo tendo um primeiro domínio VL fundido com uma região CL de camundongo e um segundo polipeptídeo tendo um segundo domínio VL fundido com uma região CH de camundongo, em que o primeiro domínio VL e o segundo domínio VL não são idênticos. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL são derivados de diferentes segmentos V. Em outra modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL são derivados de diferentes segmentos J. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL são derivados de segmentos V e J idênticos, em que o segundo domínio VL compreende um maior número de hipermutações somáticas em comparação com o primeiro domínio VL.
[00053] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL são selecionados de modo independente entre domínios VL humanos e de camundongo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL são selecionados de modo independente entre domínios VK e VÀ. Em uma modalidade específica, o primeiro domínio VL é selecionado entre um domínio Vk e um domínio Và, e o segundo VL domínio é um domínio Vk. Em outra modalidade específica, o domínio Vk é um domínio Vk humano.
[00054] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo, em que todas ou substancialmente todas as IgG produzidas pelo camundongo consistem essencialmente de uma cadeia leve tendo um primeiro domínio VL humano fundido com um domínio CL de camundongo, e uma cadeia pesada tendo um segundo domínio VL humano fundido com um domínio CH de camundongo.
[00055] Em uma modalidade, o domínio VL humano fundido com o domínio CH de camundongo é um domínio Vk humano.
[00056] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios VL humano não são idênticos.
[00057] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo, em que no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou cerca de 100% da imunoglobulina G produzida pelo camundongo consiste essencialmente de um dímero de (a) um primeiro polipeptídeo que consiste essencialmente de um domínio VL de imunoglobulina e uma região CL de imunoglobulina; e, (b) um segundo polipeptídeo de não mais de 535 aminoácidos de extensão, em que o segundo polipeptídeo consiste essencialmente de uma região CH e um domínio V que carece de uma sequência derivada a partir de um segmento genético DH.
[00058] Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo tem cerca de 435 a 535 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade específica, o segundo polipeptídeo tem cerca de 435 a 530 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade específica, o segundo polipeptídeo tem cerca de 435 a 525 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade específica, o segundo polipeptídeo tem cerca de 435 a 520 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade específica, o segundo polipeptídeo tem cerca de 435 a 515 aminoácidos de extensão.
[00059] Em uma modalidade, em cerca de 90% ou mais da IgG produzida pelo camundongo o segundo polipeptídeo tem não mais de cerca de 535 aminoácidos de extensão.
[00060] Em uma modalidade, em cerca de 50% ou mais da IgG produzida pelo camundongo o segundo polipeptídeo tem não mais de cerca de 535 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade, em cerca de 50% ou mais da imunoglobulina G produzida pelo camundongo o segundo polipeptídeo tem não mais de cerca de 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455, ou 450 aminoácidos de extensão. Em uma modalidade, cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95 % ou mais da IgG produzida pelo camundongo é da extensão mencionada. Em uma modalidade específica, todas ou substancialmente todas as IgG produzidas pelo camundongo é da extensão mencionada.
[00061] Em uma modalidade, o domínio V do segundo polipeptídeo é um domínio VL. Em uma modalidade específica, o domínio V do segundo polipeptídeo é selecionado entre um domínio VK e um domínio VÀ. Em uma modalidade específica, o domínio V do segundo polipeptídeo é um domínio VK ou VÀ humano.
[00062] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que expressa a partir de uma sequência de nucleotídeos em sua linhagem germinativa um polipeptídeo que compreende uma cadeia leve sequência variável (por exemplo, uma sequência V e/ou J), uma sequência DH, e uma região constante de cadeia pesada.
[00063] Em uma modalidade, o camundongo expressa o polipeptídeo a partir de um locus de cadeia pesada de camundongo endógena que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos de loci variáveis de cadeia pesada de camundongo endógena funcionais com uma pluralidade de segmentos genéticos humanos no locus de cadeia pesada de camundongo endógena.
[00064] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende uma sequência VLderivada de um segmento genético VÀ ou de um segmento genético VK, o polipeptídeo compreende uma CDR3 derivada de um segmento genético DH, e o polipeptídeo compreende uma sequência derivada de um segmento genético JH ou Jà ou Jk.
[00065] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno compreendendo uma substituição de todos os segmentos genéticos VH funcional com um ou mais segmentos genéticos Và de cadeia leve humanos em que o um ou mais segmentos Và humanos cada um têm justaposta sobre o lado a jusante uma sequência de sinal de recombinação (RSS) espaçada por 23-meros, em que os segmentos Và são ligados operavelmente a um segmento DH humano ou de camundongoo que tem justaposta a montante e a jusante uma RSS espaçada por 12-meros; o segmento genético DH é ligado operavelmente com um segmento J justaposto a montante com uma RSS espaçada por 23-meros que é adequado para recombinação com a RSS espaçada por 12-meros em justaposição ao segmento genético DH; em que os segmentos V, DH, e J são ligados operavelmente a uma sequência de ácido nucleico codificando uma região constante de cadeia pesada.
[00066] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno compreendendo uma substituição de todos os segmentos genéticos VH funcionais com um ou mais segmentos genéticos VK humanos cada um justapost sobre o lado a jusante com uma sequência de sinal de recombinação (RSS) espaçada por 12-meros, em que os segmentos V são ligados operavelmente a um segmento DH humano ou de camundongo que é justaposto tanto a montante quanto a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros; o segmento DH é ligado operavelmente com um segmento J justaposto sobre o lado a montante com uma RSS espaçada por 12-meros que é adequado para recombinação com uma RSS espaçada por 23-meros em justaposição com o segmento DH; em que os segmentos genéticos V, DH, e J são ligados operavelmente a uma sequência de ácido nucleico codificando uma região constante de cadeia pesada.
[00067] Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de camundongo endógena. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico codifica uma sequência selecionada entre uma CH1, uma articulação, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, uma ou mais da CH1, articulação, CH2, e CH3 são humanas.
[00068] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno compreendendo uma substituição de todos os segmentos genéticos VH funcionais com uma pluralidade de segmentos genéticos VÀ ou VK humanos cada um justaposto a jusante com RSS espaçada por 23- meros, uma pluralidade de segmentos DH humanos justapostos tanto a montante quanto a jusante por uma RSS espaçada por 12-meros, uma pluralidade de segmentos J (JH ou Jà ou Jk) humanos justapostos tanto a montante quanto a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros, em que o locus compreende uma sequência de região constante de camundongo endógena selecionada entre CH1, articulação, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ ou VK humanos funcionais, todos ou substancialmente todos os segmentos DH humanos funcionais, e todos ou substancialmente todos os segmentos JH ou JÀ ou Jk.
[00069] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma proteína de ligação de antígeno compreendendo (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de cadeia leve humana encadeada a uma sequência constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de camundongo; e (b) um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia leve humana encadeada a uma sequência constante de cadeia leve humana ou de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve é uma sequência de cadeia leve humana, e depois de exposição a uma protease que é capaz de clivar um anticorpo em um Fc e um Fab, forma-se um Fab plenamente humano que compreende no mínimo quatro CDRs de cadeia leve, em que as no mínimo quatro CDRs de cadeia leve são selecionadas entre sequências À, sequências k, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, o Fab compreende no mínimo cinco CDRs de cadeia leve. Em uma modalidade, o Fab compreende seis CDRs de cadeia leve. Em uma modalidade, no mínimo uma CDR do Fab compreende uma sequência derivada de um segmento VÀ ou de um segmento Vk, e a no mínimo uma CDR compreende adicionalmente uma sequência derivada de um segmento D. Em uma modalidade, a no mínimo uma CDR é uma CDR3 e a CDR é derivada de um segmento Vk humano, um segmento D humano, e um segmento Jk humano.
[00070] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende uma região variável derivada de um segmento genético VÀ ou Vk humano, um segmento genético DH humano, e um segmento genético JH ou JÀ ou Jk humano. Em uma modalidade específica, a sequência constante de cadeia pesada é derivado de uma sequência de CH1 humana e uma CH2 de camundongo e uma CH3 de camundongo.
[00071] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que compreende em sua linhagem germinativa um segmento genético VK ou VÀ humano não reorganizado ligado operavelmente a um segmento genético humano J e uma sequência de região constante de cadeia pesada, em que o camundongo expressa uma proteína de ligação VL que compreende um domínio Vk humano fundido com uma região constante de cadeia pesada, e em que os camundongos apresentam uma população de células B esplênicas que expressam proteínas de ligação VL em células B CD19+, incluindo células B transicionais (CD19+IgMhiIgDint), e células B maduras (CD19+IgMintIgDhi).
[00072] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que compreende em sua linhagem germinativa um segmento genético Vk ou VÀ humano não reorganizado ligado operavelmente a um segmento genético J humano e uma sequência de região constante de cadeia pesada, em que o camundongo expressa sobre uma célula B uma imunoglobulina que compreende um domínio variável de cadeia leve fundido com uma região constante de cadeia pesada, em que a população de linfócitos na medula óssea dos camundongos apresentam uma população de células B pro/pre que tem aproximadamente o mesmo número que em uma pro/pre população de células B pro/pre de um camundongo selvagem (linfócitos na medula óssea).
[00073] Em uma modalidade, os camundongos compreendem no mínimo 6 segmentos genéticos hVk não reorganizados e um ou mais segmentos genéticos hJk não reorganizados, e os camundongos compreendem uma população de células esplênicas de IgM+ e gated por linfócitos expressando uma proteína de ligação VL, em que a população é no mínimo 75% tão grande quanto uma população de células esplênicas de IgM+ e gated por linfócitos de um camundongo selvagem.
[00074] Em uma modalidade, os camundongos apresentam uma população de esplenócitos gated por células B maduras (CD19+) de células de IgD+ e células de IgM+ que totaliza cerca de 90%; em uma modalidade, a população de esplenócitos gated por células B maduras (CD19+) de células de IgD+ e células de IgM+ do camundongo modificado é aproximadamente a mesma (por exemplo, dentro de 10%, ou dentro de 5%) que o total de células de IgD+ e células de IgM+ de um camundongo selvagem que são esplenócitos gated por células B maduras (CD19+).
[00075] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que expressa uma proteína imunoglobulina a partir de um locus de cadeia pesada endógena modificado em sua linhagem germinativa, em que o locus de cadeia pesada endógena modificado carece de um segmento genético V de cadeia pesada de camundongo funcional e o locus compreende segmentos genéticos V de cadeia leve não rearranjados e segmentos genéticos J não rearranjados, em que os segmentos genéticos V de cadeia leve não rearranjados e os segmentos genéticos J não rearranjados são ligados operavelmente com uma sequência de região constante de cadeia pesada; em que a proteína imunoglobulina consiste essencialmente de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina e uma sequência constante de cadeia pesada de imunoglobulina, e o segundo polipeptídeo compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região constante de cadeia leve.
[00076] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que expressa uma proteína imunoglobulina, em que a proteína imunoglobulina carece de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, e a proteína imunoglobulina compreende um primeiro domínio variável derivado de um gene de cadeia leve, e um segundo domínio variável derivado de um gene de cadeia leve, em que o primeiro domínio variável e o segundo domínio variável são cognatos em relação um ao outro, em que o primeiro e o segundo domínios variáveis de cadeia leve não são idênticos, e em que o primeiro e o segundo domínios variáveis de cadeia leve se associam e quando associados ligam especificamente um antígeno de interesse.
[00077] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz a partir de segmentos genéticos não rearranjados em sua linhagem germinativa uma proteína imunoglobulina compreendendo regiões variáveis que são totalmente derivadas de segmentos genéticos que consistem essencialmente de segmentos genéticos não reorganizados humanos, em que a proteína imunoglobulina compreende uma sequência constante de cadeia leve de imunoglobulina e uma sequência constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionada entre o gurpo consistindo em uma CH1, uma articulação, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas.
[00078] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz a partir de segmentos genéticos não rearranjados em sua linhagem germinativa uma proteína imunoglobulina compreendendo regiões variáveis, em que todas as CDR3s de todas as regiões variáveis são produzidas inteiramente a partir de segmentos genéticos V e J de cadeia leve, e opcionalmente um ou mais hipermutações somáticas, por exemplo, uma ou mais adições de N.
[00079] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo que produz uma proteína imunoglobulina mutada somaticamente derivada a partir de segmentos genéticos humanos não reorganizados de imunoglobulina de região variável de cadeia leve na linhagem germinativa do camundongo, em que a proteína imunoglobulina carece de uma CDR que compreende uma sequência derivada a partir de um segmento genético D, em que a proteína imunoglobulina compreende uma primeira CDR3 sobre um domínio variável de cadeia leve fundido com uma região constante de cadeia leve, compreende uma segundo CDR3 sobre um domínio variável de cadeia leve fundido com uma região constante de cadeia pesada, e em que a segunda CDR3 é derivada de uma sequência de região variável de cadeia leve reorganizada que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[00080] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em que o camundongo compreende um locus de cadeia leve funcionalmente silenciado selecionado entre um locus À, um locus K, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma deleção de um locus À e/ou um locus k, no todo ou em parte, de tal modo que o locus À e/ou o locus k é não funcional.
[00081] Em um aspecto, é proporcionado um embrião de camundongo, compreendendo uma célula que compreende um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente,. Em uma modalidade, o camundongo é uma quimera e no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% das células do embrião compreendem um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, no mínimo 96%. 97%, 98%, 99%, ou 99.8% das células do embrião compreendem um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, o embrião compreende uma célula hospedeira e uma célula derivada de uma célula ES doadora, em que a célula derivada da célula ES doadora compreende um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, o embrião é um embrião hospedeiro no estágio de 2, de 4, de 8, de 16, de 32, ou de 64 células, ou um blastocisto, e compreende adicionalmente uma célula ES doadora compreendendo um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[00082] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo ou uma célula produzida usando um constructo de ácido nucleico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[00083] Em um aspecto, é proporcionado um camundongo produzido usando uma célula conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, a célula é uma célula ES de camundongo.
[00084] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir uma sequência de ácido nucleico codificando uma primeira sequência variável de cadeia leve de imunoglobulina humana (VL1) que é cognata com uma segunda sequência variável de cadeia leve de imunoglobulina humana (VL2), em que a VL1 fundida com uma região constante de cadeia leve humana de imunoglobulina (polipeptídeo 1) expressa com VL2 fundida com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina humana (polipeptídeo 2), como um dímero de polipeptídeo1/polipeptídeo 2, para formar um VL1-VL2 anticorpo.
[00085] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência variável de cadeia leve de imunoglobulina humana que é fundida com uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina humana, em que a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo VL-CH humano, em que o polipeptídeo VL-CH humano expressa como um dímero, e em que o dímero expressa na ausência de uma cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, na ausência de uma cadeia leve À humana ou K humana). Em uma modalidade, o dímero VL-CH liga especificamente um antígeno de interesse na ausência de uma cadeia leve À e na ausência de uma cadeia leve K.
[00086] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir uma sequência de ácido nucleico codificando todo ou uma porção de um domínio variável de imunoglobulina. Em uma modalidade, o domínio variável de imunoglobulina é um domínio VÀ humano ou um domínio Vk humano.
[00087] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir um Fab plenamente humano (compreendendo um primeiro VL humano fundido com uma região constante de cadeia leve humana, e um segundo VL humano fundido com uma sequência de região constante de cadeia pesada humana) ou um F(ab)2 plenamente humano.
[00088] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir uma linhagem celular imortalizada. Em uma modalidade, a linhagem celular imortalizada compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio VÀ ou Vk humano ligado operavelmente a uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico de região constante de camundongo.
[00089] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir um hibridoma ou um quadroma.
[00090] Em um aspecto, é proporcionada uma célula, compreendendo um locus de imunoglobulina modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, a célula é selecionada entre uma célula totipotente, uma célula pluripotente, uma célula-tronco pluripotente induzida (iPS), e uma célula-tronco embrionária (ES). Em uma modalidade específica, a célula é uma célula de camundongo, por exemplo, uma célula ES de camundongo. Em uma modalidade, a célula é homozigótica para o locus de imunoglobulina modificado.
[00091] Em um aspecto, é proporcionada uma célula, compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira sequência VK ou VÀ humana mutada somaticamente fundida a uma sequência de região constante de cadeia pesada humana.
[00092] Em uma modalidade, a célula compreende adicionalmente uma segunda cadeia de polipeptídeo que compreende uma segunda sequência Vk ou Và humana mutada somaticamente fundida a uma sequência de região constante de cadeia leve humana.
[00093] Em uma modalidade, a sequência Vk ou Và humana do primeiro polipeptídeo é cognata com a sequência Vk ou Và humana do segundo polipeptídeo.
[00094] Em uma modalidade, a Vk ou Và do primeiro polipeptídeo e a Vk ou Và humana do segundo polipeptídeo quando associadas ligam especificamente um antígeno de interesse. Em uma modalidade específica, o primeiro polipeptídeo compreende um domínio variável consistindo essencialmente de uma Vk humana, e o segundo polipeptídeo compreende um domínio variável consistindo em uma Vk humana que é cognata com a Vk humana do primeiro polipeptídeo, e a sequência de região constante humana é uma sequência de IgG.
[00095] Em uma modalidade, a célula é selecionada entre uma célula CHO, uma célula COS, uma célula 293, uma célula HeLa, e uma célula retinal humana expressando uma sequência de ácido nucleico viral (por exemplo, uma célula PERC.6™.
[00096] Em um aspecto, é proporcionada uma célula de camundongo somática, compreendendo um cromossoma que compreende uma modificação genética conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[00097] Em um aspecto, é proporcionada uma célula germinativa de camundongo, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que compreende uma modificação genética conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[00098] Em um aspecto, é proporcionada uma célula pluripotente, pluripotente induzida, ou totipotente derivada de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula-tronco (ES) embrionária de camundongo.
[00099] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de uma célula conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para a fabricação de um camundongo, uma célula, ou uma proteína terapêutica (por exemplo, um anticorpo ou outra proteína de ligação de antígeno).
[000100] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico que compreende um segmento genético DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros. Em uma modalidade específica, o constructo de ácido nucleico compreende um braço de homologia que é homólogo a uma sequência genômica humana compreendendo segmentos genéticos VK humanos. Em uma modalidade, o constructo de direcionamento compreende todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos DH humanos cada um justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23- meros.
[000101] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico que compreende um segmento genético Jk humano justaposto a montante com uma RSS espaçada por 12-meros. Em uma modalidade específica, o constructo de ácido nucleico compreende um primeiro braço de homologia que contém homologia com uma sequência genética DH genômica humana que é justaposta a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende um segundo braço de homologia que contém homologia com uma sequência genética J genômica humana ou que contém homologia com uma sequência de região constante de cadeia pesada de camundongo ou que contém homologia com uma sequência intergênica J-C a montante de uma sequência de cadeia pesada de região constante de camundongo.
[000102] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico que compreende um segmento VÀ humano justaposto a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros, um segmento DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 12-meros, e um segmento J humano selecionado entr um segmento JK justaposto a montante com uma RSS espaçada por 23-meros, um segmento JÀ humano justaposto a montante com uma RSS espaçada por 23-meros, e um segmento JH humano justaposto a montante com uma RSS espaçada por 23-meros. Em uma modalidade, o constructo compreende um braço de homologia que contém homologia com uma sequência de região constante de camundongo, uma sequência de camundongo intergênica J-C, e/ou uma sequência VÀ humana.
[000103] Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia leve À humana que compreende um fragmento de cluster A do locus de cadeia leve À humana. Em uma modalidade específica, o fragmento de cluster A do locus de cadeia leve À humano se estende de hVÀ3-27 a hVÀ3-1.
[000104] Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia leve À humana que compreende um fragmento de cluster B do locus de cadeia leve À humana. Em uma modalidade específica, o fragmento de cluster B do locus de cadeia leve À humana se estende de hVÀ5-52 a hVÀ1-40.
[000105] Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende uma sequência de região variável de cadeia leve À humano que compreende um fragmento genômico de cluster A e um fragmento genômico de cluster B. Em uma modalidade, a sequência de região variável de cadeia leve À humana compreende no mínimo um segmento genético de cluster A e no mínimo um segmento genético de cluster B.
[000106] Em uma modalidade, a sequência de região variável de cadeia leve À humana compreende no mínimo um segmento genético de cluster B e no mínimo um segmento genético de cluster C.
[000107] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico, compreendendo um segmento DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros encontrada normalmente na natureza flanqueando quer um segmento JK, um segmento JH, um segmento VÀ, ou um segmento VH. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende um primeiro braço de homologia homólogo a uma região intergênica V-J humana ou homólogo a uma sequência genômica humana compreendendo um segmento genético V humano. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende uma segundo braço de homologia homólogo a uma sequência de região constante de cadeia pesada humana ou de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência de região constante de cadeia pesada humana ou de camundongo é selecionada entre uma CH1, articulação, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende um segmento genético humano J flanqueado a montante com uma RSS de 12-meros. Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende um segundo braço de homologia que contém homologia com um segmento genético J flanqueado a montante com uma RSS de 12-meros. Em uma modalidade, o segmento genético Jo é selecionado entre um segmento JK humano, um segmento JÀ humano, e um segmento JH humano.
[000108] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico que compreende um segmento DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros, e uma sequência de reconhecimento de recombinase sítio-específica, por exemplo, uma sequência reconhecida por uma recombinase sítio- específica tal como uma proteína Cre, uma proteína Flp, ou uma proteína Dre.
[000109] Em um aspecto, é proporcionado um constructo de ácido nucleico que compreende um segmento Và humano ou um segmento Vk humano, um segmento DH justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 12-meros ou uma RSS espaçada por 23-meros, e um segmento J humano com uma RSS espaçada por 12-meros ou uma RSS espaçada por 23-meros, em que a RSS espaçada por 12- meros ou a RSS espaçada por 23-meros está posicionada imediatamente 5’ ao segmento J humano (isto é, com respeito à direção de transcrição). Em uma modalidade, o constructo compreende um segmento Và humano justaposto com uma 3’ RSS espaçada por 23- meros, um segmento DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 12-meros, e um segmento Jk humano justaposto com uma 5’ RSS espaçada por 23-meros. Em uma modalidade, o constructo compreende um segmento Vk humano justaposto com uma 3’ RSS espaçada por 12-meros, um segmento DH humano justaposto a montante e a jusante com uma RSS espaçada por 23-meros, e um segmento Jà humano justaposto com uma 5’ RSS espaçada por 12-meros.
[000110] Em um aspecto, é proporcionado um vetor de direcionamento, compreendendo (a) um primeiro braço de direcionamento e um segundo braço de direcionamento, em que o primeiro e o segundo braços de direcionamento são selecionados de modo independente entre braços de direcionamento humanos e de camundongo, em que os braços de direcionamento direcionam o vetor para um locus genético de região V de imunoglobulina endógena ou modificada; e, (b) uma sequência contígua de segmentos genéticos VL humanos ou uma sequência contígua de segmentos genéticos VL humanos e no mínimo um segmento genético JK humano, em que a sequência contígua é selecionada entre o gurpo consistindo em (i) hVk4-1 a hVk1-6 e Jk1, (ii) hVk4-1 a hVk1-6 e Jk1 a Jk2, (iii) hVk4-1 a hVk1-6 e Jk1 a Jk3, (iv) hVk4-1 a hVk1-6 e Jk1 a Jk4, (v) hVk4-1 a hVk1-6 e Jk1 a Jk5, (vi) hVk3-7 a hVk1-16, (vii) hVk1-17 a hVk2-30, (viii) hVk3-31 a hVk2-40, e (ix) uma combinação das mesmas.
[000111] Em uma modalidade, os braços de direcionamento que direcionam o vetor para um locus de imunoglobulina endógeno ou modificado são idênticos ou substancialmente idênticos a uma sequência no locus de imunoglobulina endógeno ou modificado.
[000112] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de um constructo de ácido nucleico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para a fabricação de um camundongo, uma célula, ou uma proteína terapêutica (por exemplo, um anticorpo ou outra proteína de ligação de antígeno).
[000113] Em um aspecto, é proporcionada a Uso de uma sequência de ácido nucleico de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, para produzir uma linhagem celular para a fabricação de um humano terapêutico. Em uma modalidade, o terapêutico humano é uma proteína de ligação que compreende uma sequência variável de cadeia leve humana (por exemplo, derivada de um segmento VÀ humano ou de segmento VK humano) fundida com uma sequência constante de cadeia pesada humana. Em uma modalidade, o terapêutico humano compreende um primeiro polipeptídeo que é uma cadeia leve À ou K de imunoglobulina humana, e um segundo polipeptídeo que compreende uma sequência variável VÀ humana ou Vk humana fundida com uma sequência constante de cadeia pesada humana.
[000114] Em um aspecto, é proporcionado um sistema de expressão, compreendendo uma célula de mamífero transfectado com um constructo de DNA que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio VL humano mutado somaticamente fundido com um domínio CH humano.
[000115] Em uma modalidade, o sistema de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VL de imunoglobulina fundido com um domínio CL humano, em que o domínio VL fundido com o domínio CL humano é uma cadeia leve cognata com o domínio VL fundido com o domínio CH humano.
[000116] Em uma modalidade, a célula de mamífero é selecionada entre uma célula CHO, uma célula COS, uma célula Vero, uma célula 293, e uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™).
[000117] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir uma proteína de ligação, compreendendo obter uma sequência de nucleotídeos codificando um domínio VL de um gene codificando uma região VL fundida a uma região CH de uma célula de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e clonar a sequência de nucleotídeos codificando a sequência de região VL in frame com um gene codificando uma região CH humana para formar uma sequência de proteína de ligação humana, expressando a sequência de proteína de ligação humana em uma célula adequada.
[000118] Em uma modalidade, o camundongo foi imunizado com um antígeno de interesse, e a região VL fundida com a região CH liga especificamente (por exemplo, com uma KD na faixa micromolar, nanomolar, ou picomolar) um epítope do antígeno de interesse. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos codificando a região VL fundida com a região CH é mutada somaticamente no camundongo.
[000119] Em uma modalidade, a célula adequada é selecionada entre uma célula B, um hibridoma, um quadroma, uma célula CHO, uma célula COS, uma célula 293, uma célula HeLa, e uma célula retinal humana expressando uma sequência de ácido nucleico viral (por exemplo, uma célula PERC.6™).
[000120] Em uma modalidade, a região CH compreende um isótipo de IgG humana. Em uma modalidade específica, a IgG humana é selecionada entre uma IgG1, uma IgG2, e uma IgG4. Em outra modalidade específica, a IgG humana é IgG1. Em outra modalidade específica, a IgG humana é IgG4. Em outra modalidade específica, a IgG4 humana é uma IgG4 modificada. Em uma modalidade, a IgG4 modificada compreende uma substituição na região de articulação. Em uma modalidade específica, a IgG4 modificada compreende uma substituição no resíduo aminoácido 228 relativo a uma IgG4 humana selvagem, numerada de acordo com o índice de numeração de Kabat da União Européia. Em uma modalidade específica, a substituição no resíduo aminoácido 228 é uma substituição S228P, numerada de acordo com o índice de numeração de Kabat da União Européia.
[000121] Em uma modalidade, a célula compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos codificando um domínio VL de uma cadeia leve que é cognato ao domínio VL fundido com a região CH, e o método compreende adicionalmente expressar a sequência de nucleotídeos codificando o domínio VL cognato fundido com um domínio CK ou CÀ humano.
[000122] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir um camundongo geneticamente modificado, compreendendo substituir em um locus de cadeia pesada de camundongo endógena um ou mais segmentos genéticos de cadeia pesada de imunoglobulina de um camundongo com um ou mais segmentos genéticos de cadeias leves de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, a substituição é de todos ou substancialmente todos os segmentos de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo funcionais (isto é, VH, DH, e JH segmentos) com um ou mais funcional humano cadeia leve segmentos (isto é, VL e JL segmentos). Em uma modalidade, a substituição é de todos ou substancialmente todos os segmentos VH, DH, e JH de cadeia pesada de camundongo funcionais com todos ou substancialmente todos os segmentos VÀ ou VK humanos e no mínimo um segmento JÀ ou JK. Em uma modalidade específica, a substituição inclui todos ou substancialmente todos os segmentos JÀ ou Jk humanos funcionais.
[000123] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir um camundongo que expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência derivada a partir de um segmento VÀ ou Vk e/ou JÀ ou Jk de imunoglobulina humana fundido com uma região constante de cadeia pesada de camundongo, compreendendo a substituição de segmentos variáveis de imunoglobulina (VH, DH, e JH) de cadeia pesada endógena de camundongo com no mínimo um segmento VÀ ou Vk humano e no mínimo um segmento JÀ ou Jk humano, em que a substituição é em uma célula de camundongo pluripotente, pluripotente induzida, ou totipotente para formar uma célula progenitora de camundongo geneticamente modificada; a célula progenitora de camundongo geneticamente modificada é introduzida em um camundongo hospedeiro; e, o camundongo hospedeiro compreendendo a célula progenitora geneticamente modificada é gestado para formar um camundongo compreendendo um genoma derivado da célula progenitora de camundongo geneticamente modificada. Em uma modalidade, o hospedeiro é um embrião. Em uma modalidade específica, o hospedeiro é selecionado entre uma pré-mórula de camundongo (por exemplo, no estágio de 8 células ou de 4 células), um embrião tetraplóide, um agregado de células embrionárias, ou um blastocisto.
[000124] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir um camundongo geneticamente modificado conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, compreendendo a introdução por transferência nuclear de um ácido nucleico contendo uma modificação conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em uma célula, e a manutenção da célula sob condições adequadas (por exemplo, incluindo a cultra da célula e a gestação de um embrião compreendendo a célula em uma mãe substituta) para se desenvolver em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[000125] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir um camundongo modificado, compreendendo a modificação conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de uma célula ES de camundongo ou de uma célula de camundongo pluripotente ou totipotente ou pluripotente induzida para incluir um ou mais segmentos genéticos variáveis de cadeia leve de imunoglobulina não reorganizados ligados operavelmente a uma sequência constante de cadeia pesada de imunoglobulina, a cultura da célula ES, a introdução da célula ES cultivada em um embrião hospedeiro para formar um embrião quimérico, e a introdução do embrião quimérico em um camundongo hospedeiro adequado para se desenvolver em um camundongo modificado. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos genéticos de imunoglobulina de região variável de cadeia leve não reorganizados são segmentos genéticos À humanos ou K humanos. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos genéticos de imunoglobulina de região variável de cadeia leve não reorganizados compreendem segmentos VÀ humanos ou Vk humanos e um ou mais segmentos JÀ, Jk, ou JH. Em uma modalidade, a sequência genética constante de cadeia pesada é uma sequência humana selecionada entre CH1, articulação, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos genéticos variáveis de cadeia leve de imunoglobulina não reorganizados substituem todos ou substancialmente todos os segmentos genéticos de região variável de cadeia pesada de camundongo endógena funcional no locus de cadeia pesada de camundongo endógena, e a sequência constante de cadeia pesada é uma sequência de camundongo compreendendo uma CH1, uma articulação, uma CH2, e uma CH3.
[000126] Em um aspecto, é proporcionada uma região variável (VR) de imunoglobulina (por exemplo, compreendendo uma sequência VL humana fundida com um JL, ou JH, ou DH e JH, ou DH e JL humano) produzida em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade específica, a VR de imunoglobulina é derivada de uma linhagem germinativa de segmento genético humano selecionado entre um segmento V K e um segmento VÀ, em que a VR é codificada por uma sequência reorganizada do camundongo em que a sequência reorganizada é hipermutada somaticamente. Em uma modalidade, a sequência reorganizada compreende 1 a 5 hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a sequência reorganizada compreende no mínimo 6, 7, 8, 9, ou 10 hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a sequência reorganizada compreende mais de 10 hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a sequência reorganizada é fundida com um ou mais sequências de região constante de cadeia pesada humana ou de camundongo (por exemplo, selecionada entre uma humano ou camundongo CH1, articulação, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas).
[000127] Em um aspecto, é proporcionado uma domínio variável de imunoglobulina sequência de aminoácidos de uma proteína de ligação produzida em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade, a VR é fundida com um ou mais sequências de região constante de cadeia pesada humana ou de camundongo (por exemplo, selecionada entre uma CH1, articulação, CH2, CH3 humanas ou de camundongo, e uma combinação das mesmas).
[000128] Em um aspecto, é proporcionado um domínio variável de cadeia leve codificado por uma sequência de ácido nucleico derivada de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[000129] Em um aspecto, é proporcionado um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica do mesmo (por exemplo, Fab, F(ab)2, scFv) produzido em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, ou derivado de uma sequência produzida em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[000130] A FIG. 1A ilustra um diagrama esquemático (não está em escala) do locus de cadeia pesada de camundongo. O locus de cadeia pesada de camundongo tem cerca de 3 Mb de extensão e contém aproximadamente 200 segmentos genéticos de cadeia pesada variáveis (VH), 13 segmentos genéticos de diversidade de cadeia pesada (DH) e 4 segmentos genéticos de união de cadeia pesada (JH) bem como reforçadores (Enh) e regiões constantes de cadeia pesada (CH).
[000131] A FIG. 1B ilustra um diagrama esquemático (não está em escala) do locus de cadeia leve K humana. O locus de cadeia leve K humana é duplicado em contigs (elementos contíguos) distal e proximal de polaridade oposta abrangendo cerca de 440 kb e 600 kb, respectivamente. Entre os dois contigs há cerca de 800 kb de DNA que se acredita que sejam livres de segmentos genéticos Vk. O locus de cadeia leve K humana contém cerca de 76 segmentos genéticos VK, 5 segmentos genéticos JK, um reforçador intrônico (Enh) e uma única região constante (Ck).
[000132] A FIG. 2 mostra uma estratégia de direcionamento para a inserção progressiva de 40 segmentos genéticos Vk humanos e 5 segmentos genéticos Jk humanos no locus de cadeia pesada de camundongo. São mostrados cassetes de seleção de Higromicina (HYG) e de Neomicina (NEO) com sítios de reconhecimento de recombinase (R1, R2, etc.).
[000133] A FIG. 3 mostra um locus de cadeia pesada de camundongo modificado compreendendo segmentos genéticos Vk e Jk humanos ligados operavelmente a regiões CH de camundongo.
[000134] A FIG. 4A mostra um exemplo de estratégia de direcionamento para a inserção progressiva de segmento genético VÀ humano e um único segmento genético JÀ humano no locus de cadeia pesada de camundongo. São mostrados cassetes de seleção de Higromicina (HYG) e Neomicina (NEO) com sítios de reconhecimento de recombinase (R1, R2, etc.).
[000135] A FIG. 4B mostra um exemplo de estratégia de direcionamento para a inserção progressiva de segmento genético Và humano e quatro segmentos genéticos Jà humanos no locus de cadeia pesada de camundongo. São mostrados cassetes de seleção de Higromicina (HYG) e Neomicina (NEO) com sítios de reconhecimento de recombinase (R1, R2, etc.).
[000136] A FIG. 5A mostra um exemplo de estratégia de direcionamento para a inserção progressiva de segmentos genéticos VÀ humanos, DH humanos e JH humanos no locus de cadeia pesada de camundongo. São mostrados cassetes de seleção de Higromicina (HYG) e Neomicina (NEO) com sítios de reconhecimento de recombinase (R1, R2, etc.). A FIG. 5B mostra um exemplo de estratégia de direcionamento para a inserção progressiva de segmentos genéticos VÀ humanos, DH humanos e JK humanos no locus de cadeia pesada de camundongo. São mostrados cassetes de seleção de Higromicina (HYG) e Neomicina (NEO) com sítios de reconhecimento de recombinase (R1, R2, etc.).
[000137] A FIG. 6A mostra gráficos de contorno de esplenócitos corados para a expressão superficial de B220 e IgM de um camundongo selvagem típico (WT) e um camundongo homozigoto típico para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk- 5hJk HO).
[000138] A FIG. 6B mostra gráficos de contorno de esplenócitos gated on CD19+ células B e corados para imunoglobulina D (IgD) e imunoglobulina M (IgM) de um camundongo selvagem típico (WT) e um camundongo homozigoto típico para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO).
[000139] A FIG. 6C mostra o número total de células B CD19+, células B transicionais (CD19+IgMhiIgDint) e células B maduras (CD19+IgMintIgDhi) em baços colhidos a partir de camundongos selvagens (WT) e homozgotos para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO).
[000140] A FIG. 7A mostra gráficos de contorno de medula óssea gated sobre singletos corados para imunoglobulina M (IgM) e B220 de um camundongo selvagem (WT) e de um camundongo homozigoto para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk- 5hJk HO). Células B imatura, maduras e pro/pre estão anotadas sobre cada um dos gráficos de pontos.
[000141] A FIG. 7B mostra o número total de células B pre/pro (B220+IgM-), imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220hiIgM+) em medula óssea isolada a partir dos fêmures de camundongos selvagens (WT) e camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO).
[000142] A FIG. 7C mostra gráficos de contorno de medula óssea gated sobre CD19+ e corada para ckit+ e CD43+ de um camundongo selvagem (WT) e de um camundongo homozigoto para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO). Células B pro e pre estão anotadas sobre cada um dos gráficos de pontos.
[000143] A FIG. 7D mostra o número de células B pro (CD19+CD43+ckit+) e células B pre (CD19+CD43-ckit-) em medula óssea isolada a partir dos fêmures de camundongos selvagens (WT) e camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO).
[000144] A FIG. 7E mostra gráficos de contorno de de medula óssea gated sobre singletos corados para CD19 e CD43 de um selvagem camundongo (WT) e um camundongo homozigoto para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO). Células B imaturas, pre e pro estão anotadas sobre cada um dos gráficos de pontos.
[000145] A FIG. 7F mostra histogramas de medula óssea gated sobre células B pre (CD19+CD43int) e expressando imunoglobulina M (IgM) de um camundongo selvagem (WT) e de um camundongo homozigoto para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk- 5hJk HO).
[000146] A FIG. 7G mostra o número de células B pre IgM+ (CD19+IgM+CD43int) e células B imaturas (CD19+IgM+CD43-) em medula óssea isolada a partir dos fêmures de camundongos selvagens (WT) e de camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos posicionados no locus de cadeia pesada endógena (6hVK-5hJK HO).
[000147] A FIG.8A mostra gráficos de contorno de esplenócitos gated sobre CD19+ e corados para a expressão de IgV e IgK+ de um camundongo contendo um locus de cadeia pesada selvagem e uma substituição dos segmentos genéticos VK e JK endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (WT) e um camundongo homozigoto para trinta segmentos genéticos hVK e cinco segmentos genéticos JK no locus de cadeia pesada endógena e uma substituição dos segmentos genéticos VK e JK endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (30hVK-5hJK HO).
[000148] A FIG. 8B mostra gráficos de contorno de medula óssea gated sobre células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220hiIgM+) corada para a expressão de IgÀ e IgK em medula óssea isolada a partir dos fêmures de um camundongo contendo um locus de cadeia pesada selvagem e uma substituição dos segmentos genéticos VK e JK endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (WT) e um camundongo homozigoto para trinta segmentos genéticos hVK e cinco JK segmentos genéticos no locus de cadeia pesada endógena e uma substituição dos segmentos genéticos VK e JK endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (30hVK-5hJK HO).
[000149] A FIG. 9 mostra um alinhamento de sequências de nucleotídeos da junção VK-JK-mIgG de doze clones de RT-PCR independentes amplificados a partir de RNA de esplenócito de camundongos naive homozigotos para trinta segmentos genéticos hV K e cinco segmentos genéticos JK no locus de cadeia pesada de camundongo e uma substituição dos segmentos genéticos Vk e Jk endógenos com segmento genético Vk e Jk humano. Bases em letra minúscula indicam bases não da linhagem germinativa resultantes ou de mutação e/ou adição de N durante a recombinação. Espaços artificiais (períodos) são incluídos de modo a alinhar adequadamente a região de Framework 4 e mostram o alinhamento da sequência de nucleotídeos de IgG de cadeia pesada de camundongo para os clones primed IgG1, IgG2a/c, e IgG3.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[000150] A expressão “proteína de ligação bi-específica” inclui uma proteína de ligação capaz de ligar seletivamente dois ou mais epítopes. As proteínas de ligação bi-específicas compreendem dois polipeptídeos diferentes que compreendem um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1) fundido com uma primeira região CH e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) fundido com uma segunda região CH. Em geral, a primeira e a segunda regiões CH são idênticas, ou diferem por uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente). VL1 e VL2 ligando especificamente epítopes diferentes — quer sobre duas moléculas diferentes (por exemplo, antígenos) ou sobre a mesma molécula (por exemplo, sobre o mesmo antígeno). Se uma proteína de ligação bi- específica ligar seletivamente dois epítopes diferentes (um primeiro epítope e um segundo epítope), a afinidade de VL1 para o primeiro epítope de modo geral vai ser de no mínimo uma a duas ou três ou quatro ordens de magnitude menor do que a afinidade de VL1 para o segundo epítope, e vice versa com respeito a VL2. Os epítopes reconhecidos pela proteína de ligação bi-específica podem estar sobre o mesmo ou sobre um alvo diferente (por exemplo, sobre o mesmo ou sobre um antígeno diferente). As proteínas de ligação bi-específicas podem ser produzidas, por exemplo, combinando um VL1 e um VL2 que reconhecem epítopes diferentes do mesmo antígeno. Por exemplo, sequências de ácido nucleico codificando sequências de VL que reconhecem epítopes diferentes do mesmo same antígeno podem ser fundidas com as sequências de ácido nucleico codificando regiões CH diferentes, e as sequências referidas podem ser expressadas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina, ou podem ser expressadas em uma célula que não expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Uma proteína de ligação bi-específica típica tem duas cadeias pesadas, cada uma tendo três CDRs de cadeia leve, seguidas por um domínio CH1 (N-terminal a C-terminal), uma articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3, e uma cadeia leve de imunoglobulina que ou não confere especificidade de ligação antigênica mas que pode associar com cada cadeia pesada, ou que pode associar com cada cadeia pesada e que pode ligar um ou mais dos epítopes ligados por VL1 e/ou VL2, ou que pode associar com cada cadeia pesada e possibilitar a ligação ou auxiliar na ligação de uma ou de ambas as cadeias pesadas a um ou a ambos os epítopes.
[000151] Portanto, dois tipos gerais de proteínas de ligação bi- específicas são (1) VL1-CH(dímero), e (2) cadeia leve VL1-CH: + cadeia leve VL2-CH:, em que a cadeia leve é a mesma ou diferente. Em cada caso, a CH (isto é, a região constante de cadeia pesada) pode ser modificada diferencialmente (por exemplo, para ligar diferencialmente proteína A, para aumentar a meia-vida sérica, etc.) conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, ou pode ser a mesma.
[000152] O termo “célula,” quando usado em conexão com a expressão de uma sequência, inclui qualquer célula que é adequada para a expressão de uma sequência de ácido nucleico recombinante. Células incluem as células de procariotas e eucariotas (única célula ou múltiplas células), células bacterianas (por exemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de mycobactérias, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células de plantas, células de insetos (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não-humano, células humanas, células B, ou fusões celulares tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, de símio, de hamster, de rato, ou de camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionada entre as células que se seguem: célula CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), célula COS (por exemplo, COS- 7), célula retinal, célula Vero, célula CV1, célula renal (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, e uma linhagem celular derivada de uma célula supracitada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™).
[000153] O termo “cognato,” quando usado no sentido de “cognato com,” por exemplo, um primeiro domínio VL que é “cognato com” um segundo domínio VL, pretende incluir referência à relação entre dois domínios VL de uma mesma proteína de ligação produzida por um camundongo de acordo com a invenção. Por exemplo, um camundongo que é modificado geneticamente de acordo com uma modalidade da invenção, por exemplo, um camundongo tendo um locus de cadeia pesada no qual as regiões VH, DH, e JH são substituídas com regiões VL e JL, produz proteínas de ligação semelhantes a anticorpo que têm duas cadeias de polipeptídeos idênticos produzidas pela mesma região CH do camundongo (por exemplo, um isótipo de IgG) fundida com um primeiro domínio VL humano, e duas cadeias de polipeptídeos idênticos produzidas pela mesma região CL do camundongo fundida com um segundo domínio VL humano. Durante a seleção clonal no camundongo, o primeiro e o segundo domínios VL humanos foram selecionados por meio do processo de seleção clonal de modo a aparecerem juntos no contexto de uma única proteína de ligação semelhante a anticorpo. Deste modo, o primeiro e o segundo domínios VL que aparecem juntos, em consequência do processo de seleção clonal, em uma única molécula semelhante a anticorpo são referidos como sendo “cognatos.” Em contraste, um domínio VL que aparece em uma primeira molécula semelhante a anticorpo e um domínio VL que aparece em uma segunda molécula semelhante a anticorpo são não cognatos, a menos que a primeira e a segunda moléculas semelhantes a anticorpo tenham cadeias pesadas idênticas (isto é, a menos que o domínio VL fundido com a primeira região de cadeia pesada humana e o domínio VL fundido com a segunda região de cadeia pesada humana sejam idênticos).
[000154] A expressão “região determinante de complementaridade,” ou o termo “CDR,” inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico de genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal selvagem) aparece entre duas regiões de framework em uma região variável de uma cadeia leve ou de uma cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de células T). Uma CDR podem ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou por uma sequência reorganizada ou não reorganizada, e, por exemplo, por uma célula B ou uma célula T naive ou madura. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por djuas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linhagens germinativas) que são não contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico não reorganizada) mas são contíguas em uma sequência de ácido nucleico de células B, por exemplo, em consequência da união ou da conexão das sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma CDR3 de cadeia pesada).
[000155] A expressão “segmento genético,” ou “segmento” inclui referência a um segmento genético de imunoglobulina V (leve ou pesada) ou D ou J (leve ou pesada), o qual inclui sequências não reorganizadas em loci de imunoglobulina (em, por exemplo, humanos e camundongos) que podem participar em uma reorganização (mediada, por exemplo, por recombinases endógenas) para formar uma sequência V/J ou V/D/J reorganizada. A menos que indicado de modo diverso, os segmentos V, D, e J compreendem sequências de sinal de recombinação (RSS) que possibilitam a recombinação V/J ou a recombinação V/D/J de acordo com a regra 12/23. A menos que indicado de modo diverso, os segmentos compreendem adicionalmente sequências com as quais estão associados na natureza ou equivalentes funcionais das mesmas (por exemplo, para promotor(es) e líder(es) de segmentos V).
[000156] A expressão “cadeia pesada,” ou “cadeia pesada de imunoglobulina” inclui uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que especificado de modo diverso inclui um domínio variável de cadeia pesada (VH). Os domínios VH incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões de framework (FR), a menos que especificado de modo diverso. Fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações dos mesmos. Uma cadeia pesada típica consiste essencialmente de, seguindo o domínio variável (de N-terminal a C- terminal), um domínio CH1, uma articulação, um domínio CH2, um domínio CH3, e opcionalmente um domínio CH4 (por exemplo, no caso de IgM ou IgE) e um domínio transmembrana (M) (por exemplo, no caso de imunoglobulina ligada a membrana sobre linfócitos). Uma região constante de cadeia pesada é uma região de uma cadeia pesada quie se estende (a partir do lado N- terminal ao lado C-terminal) a partir de FR4 externo até o C-terminal da cadeia pesada. Regiões constantes de cadeia pesada com desvios menores, por exemplo, truncações de um, dois, três ou vários aminoácidos do C-terminal, seriam englobadas pela expressão “região constante de cadeia pesada,” bem como regiões constantes de cadeia pesada com modificações de sequência, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma ou mais posições selecionadas entre, por exemplo, (com referência à numeração da União Européia de uma imunoglobulina região constante, por exemplo, uma região constante de IgG humana), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, e 439.
[000157] Por exemplo, e não a título de limitação, uma região constante de cadeia pesada pode ser modificada para apresentar meia- vida sérica aumentada (em comparação com a mesma região constante de cadeia pesada sem a uma ou mais modificações mencionadas) e ter uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação em 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/SI/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação em 250 e/ou 428; ou uma modificação em 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em outro exemplo, a modificação pode compreender uma modificação de 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação de 428L, 259I (por exemplo, V259I), e uma modificação de 308F (por exemplo, V308F); uma modificação de 433K (por exemplo, H433K) e uma modificação de 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação de 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E); uma modificação de 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); uma modificação de 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[000158] A expressão “cadeia leve” inclui uma sequência de região constante (CL) de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que especificado de modo diverso inclui cadeias leves K e À humanas. Domínios variáveis de cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de framework (FR), a menos que especificado de modo diverso. De modo geral, uma cadeia leve de extensão completa (VL + CL) inclui, a partir do término amino até o término carboxila, um domínio VL que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4, e uma região CL. Cadeias leves (VL + CL) que podem ser usadas com esta invenção incluem cadeias leves que, por exemplo, não ligam seletivamente ou um primeiro ou um segundo epítope (no caso de proteínas de ligação bi-específicas ) ligado seletivamente pela proteína de ligação (por exemplo, o um ou mais epítopes ligados seletivamente pelo domínio VL fundido com o domínio CH). Domínios VL que não ligam seletivamente o um ou mais epítopes ligados pelo VL que é fundido com o domínio CH incluem os domínios VL que podem ser identificados por meio de triagem para as cadeias leves mais comumente empregadas nas bibliotecas de anticorpos existentes (bibliotecas do tipo wet libraries ou in silico), em que as cadeias leves não interferem substancialmente com a afinidade e/ou com a seletividade dos domínios de ligação de epítope das proteínas de ligação. Cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem ligar (sozinhas ou em combinação com seu VL cognato fundido com a região CH) um epítope que é ligado especificamente pelo VL fundido com a região CH.
[000159] A expressão “faixa micromolar” pretende significar 1 a 999 micromolar; a expressão “faixa nanomolar” pretende significar 1 a 999 nanomolar; a expressão “faixa picomolar” pretende significar 1 a 999 picomolar.
[000160] O termo "animais não-humanos" pretende incluir qualquer vertebrado tal como ciclóstomos, peixes ósseos, peixes cartilaginosos tais como tubarões e arraias, anfíbios, répteis, mamíferos, e aves. Animais não-humanos adequados incluem mamíferos. Mamíferos adequados incluem primatas não-humanos, cabras, carneiro, porcos, cães, vacas, e roedores. Animais não-humanos adequados são selecionados entre a família dos roedores incluindo rato e camundongo. Em uma modalidade, os animais não-humanos são camundongos.
Camundongos, Sequências de Nucleotídeos, e Proteínas de ligação
[000161] São proporcionados proteínas de ligação que são codificadas por elementos de loci de imunoglobulinas, em que as proteínas de ligação compreendem regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina fundidas com domínios variáveis de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, são proporcionadas múltiplas estratégias para modificar geneticamente um locus de cadeia pesada de imunoglobulina em um camundongo para codificar proteínas de ligação que contêm elementos codificados por loci de cadeia leve de imunoglobulina. Os camundongos geneticamente modificados referidos representam uma fonte para a produção de populações únicas de proteínas de ligação que têm uma estrutura de imunoglobulina, porém apresentam uma diversidade aumentada em relação aos anticorpos tradicionais.
[000162] Aspectos das proteínas de ligação descritas aqui, neste requerimento de patente, incluem proteínas de ligação que são codificadas por loci de imunoglobulinas modificadas, as quais são modificadas de tal modo a que segmentos genéticos que normalmente (isto é, em um animal selvagem) codificam domínios variáveis de cadeia leve de imunoglobulina (ou porções dos mesmos) são ligados operavelmente a sequências de nucleotídeos que codificam regiões constantes de cadeia pesada. Depois da reorganização dos segmentos genéticos de cadeia leve, é obtida uma sequência de nucleotídeos reorganizada a qual compreende uma sequência codificando um domínio variável de cadeia leve fundido com uma sequência codificando uma região constante de cadeia pesada. Esta sequência codifica um polipeptídeo que tem um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina fundido com uma região constante de cadeia pesada. Deste modo, em uma modalidade, o polipeptídeo consiste essencialmente de, a partir do N-terminal até o C-terminal, um domínio VL, uma região CH1, uma articulação, uma região CH2, uma região CH3, e opcionalmente uma região CH4.
[000163] Nos camundongos modificados descritos aqui, neste requerimento de patente, são produzidas as proteínas de ligação referidas que também compreendem uma cadeia leve cognata, em que em uma modalidade a cadeia leve cognata pareia com o polipeptídeo descrito acima para produzir uma proteína de ligação que é semelhante a anticorpo, mas a proteína de ligação compreende uma região VL — não uma região VH —fundida com uma região CH.
[000164] Em várias modalidades, os camundongos modificados produzem proteínas de ligação que compreendem uma região VL fundida com uma região CH (uma cadeia pesada híbrida), em que a região VL da cadeia pesada híbrida apresenta um grau aumentado de hipermutação somática. Nestas modalidades, o aprimoramento é ao longo de uma região VL que é fundida com uma região CL (uma cadeia leve). Em algumas modalidades, uma região VL de uma cadeia pesada híbrida apresenta cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, ou 5 vezes ou mais hipermutações somáticas do que uma região VL fundida com uma região CL. Em algumas modalidades, os camundongos modificados em resposta a um antígeno apresentam uma população de proteínas de ligação que compreendem uma região VL de uma cadeia pesada híbrida, em que a população de proteínas de ligação apresenta uma média de cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou mais hipermutações somáticas na região VL da cadeia pesada híbrida do que é observado em um camundongo selvagem em resposta ao mesmo antígeno. Em uma modalidade, as hipermutações somáticas na região VL da cadeia pesada híbrida compreendem uma ou mais ou duas ou mais adições de N em uma CDR3.
[000165] Em várias modalidades, as proteínas de ligação compreendem domínios variáveis codificado por sequências de cadeia leve de imunoglobulina que compreendem um número maior de adições de N do que observado na natureza para cadeias leves reorganizadas a partir de um locus de cadeia leve endógena, por exemplo, uma proteína de ligação que compreende uma região constante de cadeia pesada de camundongo fundida com um domínio variável derivado de segmentos genéticos humanos V de cadeia leve e segmentos genéticos J (de cadeia leve ou pesada) humanos, em que os segmentos V humanos e os segmentos J humanos se reorganizam para formar um gene rearranjado que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N.
[000166] Em várias modalidades, os camundongos da invenção produzem proteínas de ligação que são em média menores do que anticorpos selvagem (isto é, anticorpos que têm um domínio VH), e possuem vantagens associadas com o tamanho menor. O tamanho menor é realizado no mínimo em parte através da ausência de uma sequência de aminoácidos codificada por uma região DH, presente normalmente em um domínio VH. O tamanho menor também pode ser realizado na formação de uma CDR3 que é derivada, por exemplo, a partir de uma região VK e uma região JK.
[000167] Em outro aspecto, são proporcionados um camundongo e um método para prover uma população de proteínas de ligação tendo domínios VL hipermutados somaticamente, por exemplo, domínios Vk humanos mutados somaticamente, e, por exemplo, domínios Vk humanos codificados por genes variáveis k reorganizados que compreendem 1 a 10 ou mais adições de N. Em uma modalidade, na ausência de uma região VH para gerar diversidade de anticorpo, um camundongo da invenção vai produzir proteínas de ligação, por exemplo, em resposta a estímulo com um antígeno, cujos domínios V são somente ou substancialmente domínios VL. O processo de seleção clonal do camundongo portanto está limitado à seleção de somente ou substancialmente proteínas de ligação que tenham domínios VL, ao invés de domínios VH. Hipermutação somática dos domínios VL será tão frequente, ou substancialmente mais frequente (por exemplo, 2 a 5 vezes maior, ou mais), do que em camundongos selvagens (os quais também mutam domínios VL com a mesma frequência). O processo de seleção clonal em um camundongo da invenção vai produzir proteínas de ligação de alta afinidade a partir do locus de imunoglobulina modificado, incluindo proteínas de ligação que ligam especificamente um epítope com uma afinidade na faixa nanomolar ou picomolar. Sequências que codificam as proteínas de ligação referidas podem ser usadas para produzir proteínas de ligação terapêuticas contendo regiões variáveis humanas e regiões constantes humanas usando um sistema de expressão apropriado.
[000168] Em outras modalidades, pode ser produzido um camundongo de acordo com a invenção em que os loci de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de camundongo são desabilitados, tornados não-funcionais, ou knocked out, e transgenes plenamente humanos ou quiméricos humanos-camundongo podem ser colocados no camundongo, em que no mínimo um dos transgenes contém um locus de cadeia pesada modificado (por exemplo, tendo segmentos genéticos de cadeia leve ligados operavelmente a uma ou mais sequências genéticas de cadeia pesada). Um camundongo semelhante também pode produzir uma proteína de ligação conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[000169] Em um aspecto, é proporcionado um método para aumentar a diversidade, inclusive por hipermutação somática ou por adições de N em um domínio VL, compreendendo a colocação de um segmento genético V de cadeia leve não reorganizado e um segmento genético J não reorganizado em ligação operável com uma sequência genética de CH de camundongo, a exposição do animal a um antígeno de interesse, e o isolamento a partir do animal de uma sequência genética V(leve)/J reorganizada e hipermutada somaticamente do animal, em que a sequência genética V(leve)/J reorganizada é fundida com uma sequência de nucleotídeos codificando uma região CH de imunoglobulina.
[000170] Em uma modalidade, a cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a VL hipermutada é uma IgM; em outra modalidade, é uma IgG; em outra modalidade, é uma IgE; em outra modalidade, é uma IgA.
[000171] Em uma modalidade, o domínio VL hipermutado somaticamente e com permuta de classe (class-switched) contém cerca de 2 a 5 vezes ou mais das hipermutações somáticas observadas para um anticorpo reorganizado e com permuta de classe tendo uma sequência VL que é encadeada operavelmente a uma sequência CL. Em uma modalidade, as hipermutações somáticas observadas no domínio VL hipermutado somaticamente são cerca do mesmo número conforme observado em um domínio VH expressado a partir de um gene VH fundido com uma região CH.
[000172] Em um aspecto, é proporcionado um método para produzir um domínio VL humano de alta afinidade, compreendendo a exposição de um camundongo da invenção a um antígeno de interesse, permitindo que o camundongo desenvolva uma reação imune contra o antígeno de interesse, e o isolamento de um domínio VL humano mutado somaticamente e com permuta de classe a partir do camundongo que liga especificamente o antígeno de interesse com alta afinidade.
[000173] Em uma modalidade, a KD de uma proteína de ligação que compreende o domínio VL humano mutado somaticamente e com permuta de classe é na faixa nanomolar ou picomolar.
[000174] Em uma modalidade, a proteína de ligação consiste essencialmente de um dímero de polipeptídeo, em que o polipeptídeo consiste essencialmente da proteína de ligação mutada somaticamente e com permuta de classe que compreende um domínio VL humano fundido com uma região CH humana.
[000175] Em uma modalidade, a proteína de ligação consiste essencialmente de um dímero de polipeptídeo e duas cadeias leves, em que o polipeptídeo consiste essencialmente da proteína de ligação mutada somaticamente e com permuta de classe tendo um domínio VL humano fundido com uma região CH humana; e em que cada polipeptídeo do dímero está associado com uma cadeia leve cognata compreendendo um domínio VL de cadeia leve cognata e uma região CL humana.
[000176] Em um aspecto, é proporcionado um método para a hipermutação somática de uma sequência genética VL humana, compreendendo a colocação de um segmento genético VL humano e de um segmento genético JL humano em ligação operável com um gene CH de camundongo endógeno em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno, a exposição do camundongo a um antígeno de interesse, e a obtenção a partir do camundongo de uma sequência genética VL humana hipermutada somaticamente que liga o antígeno de interesse.
[000177] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente a obtenção a partir do camundongo de uma sequência genética VL de uma cadeia leve que é cognata com a sequência genética VL humana hipermutada somaticamente humana que liga o antígeno de interesse. Proteínas de Ligação VL com Sequências DH
[000178] Em vários aspectos, camundongos compreendendo um segmento genético V de cadeia leve de imunoglobulina não reorganizado e um segmento genético J não reorganizado (por exemplo, de cadeia leve ou pesada) também compreendem um segmento genético DH não reorganizado que é capaz de recombinação com o segmento J para formar uma sequência D/J reorganizada, a qual por sua vez é capaz de reorganização com o segmento V de cadeia leve para formar uma sequência variável reorganizada derivada (a) do segmento V de cadeia leve, (b) do segmento DH, e (c) do segmento J (por exemplo, de cadeia leve ou pesada); em que a sequência variável reorganizada é encadeada operavelmente a uma sequência constante de cadeia pesada (por exemplo, selecionada entre CH1, articulação, CH2, CH3, e uma combinação das mesmas; por exemplo, encadeada operavelmente a uma CH1 de camundongo ou humana, uma articulação, uma CH2, e uma CH3).
[000179] Em vários aspectos, camundongos compreendendo segmentos V de cadeia leve humana não reorganizados e segmentos J que também compreendem um segmento D humano são úteis, por exemplo, como uma fonte de aumentada diversidade de sequências de CDR3. Normalmente, as sequências de CDR3 surgem em cadeias leves a partir da recombinação V/J, e em cadeias pesadas a partir da recombinação V/D/J. Diversidade adicional é proporcionada por adições de nucleotídeos que ocorrem durante a recombinação (por exemplo, adições de N), e também como o resultado de hipermutação somática. As características de ligação conferidas por sequências de CDR3 estão limitadas de modo geral às características conferidas pela sequência de CDR3 de cadeia leve, a sequência de CDR3 de cadeia pesada, e uma combinação da sequência de CDR3 de cadeia leve e da sequência de CDR3 de cadeia pesada, conforme pode ser o caso. No entanto, em camundongos conforme são descritos aqui, neste requerimento de patente, está disponível uma fonte adicional de diversidade devido às características de ligação conferidas como o resultado de uma combinação de uma primeira CDR3 de cadeia leve (sobre o polipeptídeo de cadeia pesada) e uma segunda CDR3 de cadeia leve (sobre o polipeptídeo de cadeia leve). É possível diversidade adicional onde a primeira CDR3 de cadeia leve pode conter uma sequência derivada a partir de um segmento genético D, como a partir de um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, que compreende um segmento V não reorganizado a partir de uma região V de cadeia leve encadeada operavelmente a um segmento D e encadeada operavelmente a um segmento J (de cadeia leve ou pesada), empregando a manipulação de RSS conforme aqui ensinado.
[000180] Outra fonte de diversidade são as adições de N e/ou P que podem ocorrer nas recombinações V(de cadeia leve)/J ou V(de cadeia leve)/D/J que são possíveis em camundongos conforme descrito. Deste modo, os camundongos descritos aqui, neste requerimento de patente, não somente proporcionam uma fonte de diversidade diferente (cadeia leve-cadeia leve) mas também uma fonte de diversidade adicional devido à adição de, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais adições de N em um gene V(de cadeia leve)/J ou um reorganizado V(de cadeia leve)/D/J reorganizado em um camundongo conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[000181] Em vários aspectos a Uso de um segmento genético D ligado operavelmente a um segmento genético J e um segmento genético V de cadeia leve proporciona uma aumentada diversidade. A ligação operável de um segmento DH neste caso vai necessitar de que este segmento D seja capaz de recombinação com o segmento J com o qual é enumerado. Deste modo, o segmento D vai necessitar de ter justaposta uma RSS a jusante que é combinada com a RSS justaposta a montante do segmento J de tal modo que o segmento D e o segmento J podem se reorganizar. Além disso, o segmento D vai necessitar de uma RSS apropriada justaposta a montante que é combinada com a RSS justaposta a jusante do V segmento de tal modo a que o segmento D/J reorganizado e o segmento V podem se reorganizar para formar um gene codificando um domínio variável.
[000182] Uma RSS, ou uma sequência de sinal de recombinação, compreende uma sequência de heptâmero de ácido nucleico conservada separada por 12 pares de bases (bp) ou 23 pares de bases (bp) de sequência não conservada, de uma sequência de nonâmero de ácido nucleico conservada. As RSS’s são usadas por recombinases para realizar a união de segmentos genéticos de imunoglobulina durante o processo de reorganização seguindo a regra 12/23. De acordo com a regra 12/23, um segmento genético justaposto com uma RSS tendo um espaçador de 12 bp (não conservado) se reorganiza com um segmento genético justaposto com uma RSS tendo um espaçador de 23 bp (não conservado); isto é, geralmente não são observadas reorganizações entre segmentos genéticos cada um tendo uma RSS com um espaçador de 12 bp, ou cada um tendo uma RSS com um espaçador de 23 bp.
[000183] No caso do locus de cadeia leve À, segmentos genéticos variáveis (segmentos genéticos VÀ) são flanqueados a jusante (com respeito à direção de transcrição da sequência V) com uma RSS tendo um espaçador de 23-meros, e segmentos genéticos de união (segmentos genéticos JÀ) são flanqueados a montante (com respeito à direção de transcrição da sequência J) com uma RSS tendo um espaçador de 12-meros. Deste modo, segmentos VÀ e JÀ são flanqueados com RSS’s que são compatíveis segundo a regra 12/23, e portanto são capazes de recombinar durante a reorganização.
[000184] No entanto, no locus K em um organismo selvagem, cada segmento VK funcional é flanqueado a jusante com uma RSS tendo um espaçador de 12-meros. Portanto, segmentos Jk têm espaços de 23- meros justapostos sobre o lado a montante do segmento Jk. No locus de cadeia pesada, segmentos genéticos VH são justapostos a jusante com uma RSS tendo um espaçador de 23-meros, seguida por segmento DH justaposto a montante e a jusante com um espaçador de 12-meros, e segmentos JH cada um com um segmento de 23-meros justaposto sobre o lado a montante do segmento JH. No locus de cadeia pesada, a recombinação D/J ocorre primeiro, mediada pela DH RSS a jusante com o espaçador de 12-meros e a JH RSS a montante com o espaçador de 23-meros, para produzir uma sequência D-J reorganizada intermediária tendo uma RSS justaposta sobre o lado a montante que tem uma RSS com um espaçador de 12-meros. O segmento D-J reorganizado tendo a RSS com o espaçador de 12-meros justaposta sobre o lado a montante em seguida se reorganiza com o segmento VH tendo a RSS com o espaçador de 23-meros justaposta sobre seu lado a jusante para formar uma sequência V/D/J reorganizada.
[000185] Em uma modalidade, um segmento VÀ é empregado no locus de cadeia pesada com um segmento genético J que é um segmento Jà, em que o segmento Và compreende uma RSS justaposta sobre o lado a jusante da sequência Và, e a RSS compreende um espaçador de 23-meros, e o segmento J é um segmento Jà com uma RSS justaposta sobre seu lado a montante tendo um espaçador de 12- meros (por exemplo, conforme encontrado na natureza).
[000186] Em uma modalidade, um segmento Và é empregado no locus de cadeia pesada com um segmento genético J que é um segmento genético JK ou um JH, em que a sequência VÀ tem justaposta sobre seu lado a jusante uma RSS compreendendo um espaçador de 23-meros, e o segmento Jk ou JH tem justaposto sobre seu lado a montante uma RSS compreendendo um espaçador de 12-meros.
[000187] Em uma modalidade, um segmento Và é empregado no locus de cadeia pesada com um segmento genético DH e um segmento genético J. Em uma modalidade, o segmento Và compreende uma RSS justaposta sobre o lado a jusante da sequência Và com uma RSS tendo um espaçador de 23-meros; o segmento DH compreende uma RSS justaposta sobre o lado a montante e sobre o lado a jusante da sequência DH com uma RSS tendo um espaçador de 12-meros; e um segmento J tendo uma RSS justaposta sobre seu lado a montante tendo um espaçador de 23-meros, em que o segmento J é selecionado entre um Jà, um Jk, e um JH.
[000188] Em uma modalidade, um segmento Vk é empregado no locus de cadeia pesada com um segmento genético J (sem nenhum segmento D interveniente), em que o segmento Vk tem uma RSS justaposta sobre o lado a jusante do segmento Vk que compreende uma RSS espaçada por 12-meros, e o segmento J tem justaposta sobre seu lado a montante uma RSS espaçada 23-meros, e o segmento Jk é selecionado entre um segmento JK, um segmento JÀ, e um segmento JH. Em uma modalidade, o segmento V e/ou o segmento J são humanos.
[000189] Em uma modalidade, o segmento Vk é empregado no locus de cadeia pesada com um segmento D e um segmento J, em que o segmento Vk tem uma RSS justaposta sobre o lado a jusante do segmento Vk que compreende uma RSS espaçada por 12-meros, o segmento D tem justaposta sobre seu lado a montante e a jusante uma RSS espaçada 23-meros, e o segmento J tem justaposta sobre seu lado a montante uma RSS espaçada por 12-meros. Em uma modalidade, o segmento J é selecionado entre um segmento Jk, um segmento Jà, e um segmento JH. Em uma modalidade, o segmento V e/ou o segmento J são humanos.
[000190] Um segmento Jà com uma RSS tendo um espaçador de 23- meros justaposta em sua extremidade a montante, ou um segmento Jk ou JH com uma RSS tendo um espaçador de 12-meros justaposta em sua extremidade a montante, é produzido usando qualquer método adequado para produzir sequências de ácido nucleico que seja conhecida na arte. Um método adequado para produzir um segmento J tendo uma RSS justaposta a montante em que a RSS tem um espaçador selecionado (por exemplo, ou de 12-meros ou de 23-meros) é sintetizar quimicamente um ácido nucleico compreendendo o heptâmero, o nonâmero, e o espaçador selecionado e fundir este a uma sequência de segmento J que ou é sintetizada quimicamente ou é clonada a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma fonte de sequência humana), e empregar a sequência de segmento J fundido e RSS em um vetor de direcionamento para direcionar a RSS-J para um sítio adequado.
[000191] Um segmento D com uma RSS espaçada por 23-meros justaposta a montante e a jusante pode ser produzido por qualquer método conhecido na arte. Um método compreende sintetizar quimicamente a sequência de RSS de 23-meros e segmento D a montante e a RSS de 23-meros a jusante, e colocar o segmento D flanqueado por RSS em um vetor adequado. O vetor pode ser direcionado para substituir um ou mais segmentos D de camundongo com um segmento D humano com sequências RSS de 12-meros justapostas sobvre os lados a montante e a jusante, ou direcionado para ser inserido, por exemplo, em um locus humanizado em uma posição entre um segmento V humano e um segmento J humano ou de camundongo.
[000192] Nonâmeros e heptâmeros adequados para construção de RSS são conhecidos na arte (por exemplo, vide Janeway’s Immunobiology, 7th ed., Murphy et al., (2008, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC) à página 148, Fig. 4.5, incorporada por meio de referência). Sequências de espaçadores não conservadas adequadas incluem, por exemplo, espaçador sequências de espaçadores observadas em sequências de RSS em loci de imunoglobulinas humanas ou de camundongo.
Proteínas de Ligação Bi-específicas
[000193] As proteínas de ligação descritas aqui, neste requerimento de patente, e sequências de nucleotídeos codificando as mesmas, podem ser usadas para produzir proteínas de ligação multi-específicas, por exemplo, proteínas de ligação bi-específicas. Neste aspecto, um primeiro polipeptídeo consistindo essencialmente de um primeiro domínio VL fundido com uma região CH pode se associar com um segundo polipeptídeo consistindo essencialmente de um segundo domínio VL fundido com uma região CH. Onde o primeiro domínio VL e o segundo domínio VL ligam especificamente um epítope diferente, pode ser produzida uma molécula de ligação bi-específica usando os dois domínios VL. A região CH pode ser a mesma ou diferente. Em uma modalidade, por exemplo, uma das regiões CH pode ser modificada de modo a eliminar um determinante de ligação de proteína A, ao passo que a outra região constante de cadeia pesada não é modificada deste modo. Esta organização em particular simplifica o isolamento da proteína de ligação bi-específica a partir de, por exemplo, uma mistura de homodímeros (por exemplo, homodímeros do primeiro ou do segundo polipeptídeos).
[000194] Em um aspecto, os métodos e as composições descritos aqui, neste requerimento de patente, são usados para produzir proteínas de ligação bi-específicas. Neste aspecto, um primeiro VL que é fundido a uma região CH e um segundo VL que é fundido a uma região CH são cada um clonados de modo independente in frame com uma sequência de IgG humana do mesmo isótipo (por exemplo, uma IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 humana). O primeiro VL liga especificamente um primeiro epítope, e o segundo VL liga especificamente um segundo epítope. O primeiro e o segundo epítopes podem estar em diferentes antígenos, ou sobre o mesmo antígeno.
[000195] Em uma modalidade, o isótipo de IgG da região CH fundido ao primeiro VL e o isótipo de IgG da região CH fundido ao segundo VL são o mesmo isótipo, porém diferem em que um isótipo de IgG compreende no mínimo uma substituição de aminoácido. Em uma modalidade, a no mínimo uma substituição de aminoácido torna a cadeia pesada que porta a substituição incapaz ou substancialmente incapaz de ligar proteína A em comparação com a cadeia pesada que carece da substituição.
[000196] Em uma modalidade, a primeira região CH compreende um primeiro domínio CH3 de uma IgG humana selecionada entre IgG1, IgG2, e IgG4; e a segunda região CH compreende um segundo domínio CH3 de uma IgG humana selecionada entre IgG1, IgG2, e IgG4, em que o segundo domínio CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segundo domínio CH3 a proteína A.
[000197] Em uma modalidade, o segundo domínio CH3 compreende uma modificação 435R, numerada de acordo com o índice de Kabat da União Européia. Em outra modalidade, o segundo domínio CH3 compreende adicionalmente uma modificação 436F, numerada de acordo com o índice de Kabat da União Européia.
[000198] Em uma modalidade, o segundo domínio CH3 é o domínio de uma IgG1 humana que compreende uma modificação selecionada entre o gurpo consistindo em D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I, numerada de acordo com o índice de Kabat da União Européia.
[000199] Em uma modalidade, o segundo domínio CH3 é o domínio de uma IgG2 humana que compreende uma modificação selecionada entre o gurpo consistindo em N384S, K392N, e V422I, numerada de acordo com o índice de Kabat da União Européia.
[000200] Em uma modalidade, o segundo domínio CH3 é o domínio de uma IgG4 humana compreendendo uma modificação selecionada entre o gurpo consistindo em Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I, numerada de acordo com o índice de Kabat da União Européia.
[000201] Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende regiões CH tendo uma ou mais modificações conforme mencionado aqui, neste requerimento de patente, em que a região constante da proteína de ligação é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma modalidade específica, as regiões CH compreendem sequências de aminoácidos que não apresentam um epítope imunogênico em um humano. Em outra modalidade específica, a proteína de ligação compreende uma região CH que não é encontrada em uma cadeia pesada humana selvagem, e a região CH não compreende uma sequência que produz um epítope de células T.
EXEMPLOS
[000202] Os exemplos que se seguem são proporcionados de modo a descreve como produzir e utilizar os métodos e as composições da invenção, e não se pretende que limitem o âmbito daquilo que os inventores consideram como sua invenção. A menos que indicado de modo diverso, a temperatura é indicada em graus Celsius, e a pressão é pressão atmosférica ou em torno da pressão atmosférica.
Exemplo I Introdução de Segmentos Genéticos de Cadeia Leve em Um Locus de Cadeia Pesada
[000203] Foram produzidos vários constructos de direcionamento usando a tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 6.586.251 e Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659) a fim de modificar bibliotecas de Cromossoma Artificial Bacteriano Genômico de Camundongo (BAC). DNA BAC de camundongo foi modificado por recombinação homóloga para inativar o locus de cadeia pesada de camundongo endógena através de deleção direcionada de segmentos genéticos VH, DH e JH para a inserção subsequente de sequências genéticas de cadeia leve K da linhagem germinativa não reorganizadas humanas (parte superior da FIG 2).
[000204] Em resumo, o locus de cadeia pesada de camundongo foi deletado em dois eventos de direcionamento sucessivos usando recombinação mediada por recombinase. O primeiro evento de direcionamento incluiu um direcionamento na extremidade 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo usando um vetor de direcionamento compreendendo de 5’ a 3’ um braço de homologia de camundongo 5’, um sítio de reconhecimento de recombinase, um cassete de neomicina e um braço de homologia 3’. Os braços de homologia 5’ e 3’ continham a sequência 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo. O segundo evento de direcionamento incluiu um direcionamento na extremidade 3’ do locus de cadeia pesada de camundongo na região dos segmentos genéticos JH usando um segundo vetor de direcionamento que continha de 5’ a 3’ um braço de homologia de camundongo 5’, um sítio de reconhecimento de recombinase 5’, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase, um cassete de higromicina, um terceiro sítio de reconhecimento de recombinase, e um braço de homologia de camundongo 3’. Os braços de homologia 5’ e 3’ continham sequência flanqueando os segmentos genéticos JH de camundongo e 5’ do reforçador intrônico e regiões constantes. Células ES positivas contendo um locus de cadeia pesada modificado direcionado tanto com ambos os vetores de direcionamento (conforme descrito acima) foram confirmados por cariotipagem. Em seguida DNA foi isolado a partir das células ES duplamente direcionadas e submetido a tratamento com uma recombinase deste modo mediando a deleção de DNA genômico do locus de cadeia pesada de camundongo entre o sítio de reconhecimento de recombinase 5’ no primeiro vetor de direcionamento e o sítio de reconhecimento de recombinase 5’ no segundo vetor de direcionamento, deixando um único sítio de reconhecimento de recombinase e o cassete de higromicina flanqueado por dois sítios de reconhecimento de recombinase (vide a parte superior da FIG. 2). Deste modo um locus de cadeia pesada de camundongo modificado contendo genes CH intactos foi criado para a inserção de modo progressivo de segmentos genéticos da linhagem germinativa K humana em uma maneira precisa usando os vetores de direcionamento descritos abaixo.
[000205] Quatro vetores de direcionamento separados foram manipulados de modo a inserir progressivamente 40 segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos no locus de cadeia pesada de camundongo inativado (descrito acima) usando técnicas moleculares de rotina reconhecidas na arte (FIG. 2). Os segmentos genéticos k humanos usados para a manipulação dos quatro constructos de direcionamento são enxontrados naturalmente em elemento contíguo (contig) proximal do locus de cadeia leve k humana da linhagem germinativa (FIG. 1B e Tabela 1).
[000206] Um fragmento genômico humano de ~110.499 bp contendo os primeiros seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos foi manipulado de modo a conter um sítio PI-SceI de 431 bp a jusante (3’) do segmento genético Jk5 humano. Outro sítio PI-SceI foi manipulado na extremidade 5’ de um fragmento genômico de ~7.852 bp contendo o cadeia pesada de camundongo reforçador intrônico, a região de troca (switch region) de IgM (Sμ) e o gene de IgM do locus de cadeia pesada de camundongo. Este fragmento de camundongo foi usado como um braço de homologia 3’ por ligação ao fragmento humano de ~110,5 kb, o qual criou uma junção 3’ contendo, de 5’ a 3’, ~110,5 kb de sequência genômica do locus de cadeia leve k humana contendo os primeiros seis segmentos genéticos Vk consecutivos e cinco segmentos genéticos Jk, sítio um PI-SceI, ~7.852 bp de sequência de cadeia pesada de camundongo contendo o reforçador intrônico de camundongo, Sμ e o gene constante de IgM de camundongo. A montante (5’) do segmento genético Vk1-6 humano estava um adicional de 3.710 bp de sequência k humana antes do início do braço de homologia de camundongo 5’, o qual continha 19.752 bp de DNA genômico de camundongo correspondenta à sequência 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo. Entre o braço de homologia 5’ e o início da sequência K humana estava um cassete de neomicina flanqueado por três sítios de reconhecimento de recombinase (vide o Vetor de direcionamento 1, FIG. 2). O vetor de direcionamento final para a primeira inserção de sequência k humana de 5’ a 3’ incluiu um braço de homologia 5’ contendo ~20 kb de sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada, um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (R1), um cassete de neomicina, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (R2), um terceiro sítio de reconhecimento de recombinase (R3), ~110,5 kb de sequência k genômica humana contendo os primeiros seis segmentos genéticos Vk humanos consecutivos e cinco segmentos genéticos Jk humanos, um sítio PI-SceI, e um braço de homologia 3’ contendo ~8 kb de sequência genômica de camundongo incluindo o reforçador intrônico, Sμ e o gene constante de IgM de camundongo (vide a FIG. 2, Vetor de direcionamento 1). Recombinação homóloga com este vetor de direcionamento criou um locus de cadeia pesada de camundongo modificado contendo seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos ligados operavelmente aos genes constantes de cadeia pesada de camundongo endógena a qual, depois de recombinação, leva à formação de uma cadeia pesada híbrida (isto é, um domínio Vk humano e uma região CH de camundongo).
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[000207] Introdução de dez segmentos genéticos VK humanos adicionais em um locus de cadeia pesada híbrida. Um segundo vetor de direcionamento foi manipulado para a introdução de 10 segmentos genéticos Vk humanos adicionais no locus de cadeia pesada de camundongo modificado descrito acima (vide a FIG. 2, Vetor de direcionamento 2). Um fragmento genômico humano de 140.058 bp contendo 12 segmentos genéticos Vk humanos consecutivos do locus de cadeia leve k humana foi manipulado com um braço de homologia 5’ contendo a sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo e um braço de homologia 3’ contendo sequência genômica K humana. A montante (5’) do segmento genético Vk1-16 humano estava um adicional de 10.170 bp de sequência k humana antes do início do braço de homologia de camundongo 5’, o qual foi o mesmo braço de homologia 5’ usado para a construção do Vetor de direcionamento 1 (vide a FIG. 2). Entre o braço de homologia 5’ e o início da sequência k humana estava um cassete de higromicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase. O braço de homologia 3’ incluiu uma sobreposição de 31.165 bp de sequência k genômica humana correspondente à extremidade 5’ equivalente do fragmento de ~110,5 kb de sequência K genômica humana do Vetor de direcionamento 1 (FIG. 2). O vetor de direcionamento final para a inserção de 10 segmentos genéticos Vk humanos adicionais de 5’ a 3’ incluíram um braço de homologia 5’ contendo ~20 kb de sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada, um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (R1), um cassete de higromicina, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (R2) e ~140 kb de sequência k genômica humana contendo 12 segmentos genéticos VÀ humanos consecutivos, da qual ~31 kb se sobrepõem com a extremidade 5’ da sequência k humana do Vetor de direcionamento 1 e serve como o braço de homologia 3’ para este constructo de direcionamento. Recombinação homóloga com este vetor de direcionamento criou um locus de cadeia pesada de camundongo modificado contendo 16 segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos ligados operavelmente aos genes constantes de cadeia pesada de camundongo o qual, depois de recombinação, leva à formação de uma cadeia pesada híbrida.
[000208] Introdução de quatorze segmentos genéticos Vk humanos adicionais em um locus de cadeia pesada híbrida. Um terceiro vetor de direcionamento foi manipulado para a introdução de 14 segmentos genéticos Vk humanos adicionais no locus de cadeia pesada de camundongo modificado descrito acima (vide a FIG. 2, Vetor de direcionamento 3). Um fragmento genômico humano de 160.579 bp contendo 15 segmentos genéticos Vk humanos consecutivos foi manipulado com um braço de homologia 5’ contendo a sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo e um braço de homologia 3’ contendo sequência K genômica humana. A montante (5’) do segmento genético Vk2-30 humano estava um adicional de 14.687 bp de sequência k humana antes do início do braço de homologia de camundongo 5’, o qual foi o mesmo braço de homologia 5’ usado para os dois vetores de direcionamento anteriores (descritos acima, vide também a FIG. 2). Entre o braço de homologia 5’ e o início da sequência K humana estava um cassete de neomicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase. O braço de homologia 3’ incluiu uma sobreposição de 21.275 bp de sequência k genômica humana correspondente à extremidade 5’ equivalente do fragmento de ~140 kb de sequência k genômica humana do Vetor de direcionamento 2 (FIG. 2). O vetor de direcionamento final para a inserção de 14 segmentos genéticos Vk humanos adicionais de 5’ a 3’ incluiu um braço de homologia 5’ contendo ~20 kb de sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo, um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (R1), um cassete de neomicina, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (R2) e ~161 kb de sequência k genômica humana contendo 15 segmentos genéticos Vk humanos, da qual ~21 kb se sobrepõem com a extremidade 5’ da sequência k humana do Vetor de direcionamento 2 e serve como o braço de homologia 3’ para este constructo de direcionamento. Recombinação homóloga com este vetor de direcionamento criou um locus de cadeia pesada de camundongo modificado contendo 30 segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos ligados operavelmente aos genes constantes de cadeia pesada de camundongo o qual, depois de recombinação, leva à formação de uma cadeia pesada k. quimérica
[000209] Introdução de dez segmentos genéticos VK humanos adicionais em um locus de cadeia pesada híbrida. Um quarto vetor de direcionamento foi manipulado para a introdução de 10 segmentos genéticos Vk humanos adicionais no locus de cadeia pesada de camundongo modificado descrito acima (vide a FIG. 2, Vetor de direcionamento 4). Um 90,398 bp humano fragmento genômico contendo 16 consecutive segmentos genéticos VK humanos foi manipulado com um braço de homologia 5’ contendo camundongo genômica sequência 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo e um braço de homologia 3’ contendo humano genômica K sequência. A montante (5’) do segmento genético Vk2-40 humano estava um adicional de 8.484 bp de sequência k humana antes do início do braço de homologia de camundongo 5’, o qual foi o mesmo braço de homologia que os vetores de direcionamento anteriores (descritos acima, vide também a FIG. 2). Entre o braço de homologia 5’ e o início da sequência k humana estava um cassete de higromicina flanqueado por sítios de reconhecimento de recombinase. O braço de homologia 3’ incluiu uma sobreposição de 61.615 bp de sequência k genômica humana correspondente à extremidade 5’ equivalente do fragmento de ~160 kb de sequência k genômica humana do Vetor de direcionamento 3 (FIG. 2). O vetor de direcionamento final para a inserção de 10 segmentos genéticos VK humanos adicionais deD5’ a 3’ incluiu um braço de homologia 5’ contendo ~20 kb de sequência genômica de camundongo 5’ do locus de cadeia pesada de camundongo, um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (R1), um cassete de higromicina, um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (R2) e ~90 kb de sequência k genômica humana contendo 16 segmentos genéticos Vk humanos, ~62 kb da qual se sobrepõe com a extremidade 5’ da sequência k humana do Vetor de direcionamento 3 e serve como o braço de homologia 3’ para este constructo de direcionamento. Recombinação homóloga com este vetor de direcionamento criou um locus de cadeia pesada de camundongo modificado contendo 40 segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos J K humanos ligados operavelmente aos genes constantes de cadeia pesada de camundongo o qual, depois de recombinação, leva à formação de uma cadeia pesada k quimérica (FIG. 3).
[000210] Usando uma abordagem similar conforme descrito acima, são construídas outras combinações de domínios variáveis de cadeia leve humana no contexto de regiões constantes de camundongo de cadeia pesada. Domínios variáveis de cadeia leve adicionais podem ser derivados de segmentos genéticos VÀ e JÀ humanos (FIG. 4A e 4B).
[000211] O locus de cadeia leve À humana se estende acima de 1.000 kb e contém mais de 80 genes que codificam segmentos variáveis (V) ou de união (J). Entre os 70 segmentos genéticos VÀ do locus de cadeia leve À humana, em qualquer ponto a partir de 30 a 38 parecem ser segmentos genéticos funcionais de acordo com relatórios publicados. As 70 sequências VÀ são arranjadas em três clusters, todos os quais contèm diferentes membros de grupos de famílias genéticas V distintas (clusters A, B e C). Dentro do locus de cadeia leve À humana, mais da metade de todos os domínios VÀ observados são codificados pelos segmentos genéticos 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, e 3-21. Há sete segmentos genéticos JÀ, dos quais somente quatro são considerados como segmentos genéticos JÀ funcionais de modo geral -JÀ1, JÀ2, JÀ3, e JÀ7. Em alguns alelos, um quiinto par de segmentos genéticos JÀ-CÀ é sabidamente um pseudo gene (CÀ6). A incorporação de múltiplos segmentos genéticos JÀ humanos em um locus de cadeia pesada híbrida, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é construída por síntese novamente. Deste modo, um fragmento genômico contendo múltiplos segmentos genéticos JÀ humanos na configuração da linhagem germinativa é manipulado com múltiplos segmentos genéticos VÀ humanos e possibilita a recombinação V-J normal no contexto de uma região constante de cadeia pesada.
[000212] A ligação de domínios variáveis de cadeia leve com regiões constantes de cadeia pesada representa uma fonte potencialmente rica de diversidade para gerar proteínas de ligação VL únicas com regiões VL humanas em animais não-humanos. A exploração desta diversidade do locus de cadeia leve À humana (ou locus K humano conforme descrito acima) em camundongos resulta na manipulação de cadeias pesadas híbridas únicas e dá origem a outra dimensão de proteínas de ligação para o repertório imune de animais geneticamente modificados e para sua Uso subsequente como uma próxima plataforma de produção para a produção de terapêuticos.
[000213] Adicionalmente, segmentos genéticos DH e JH (ou Jk) humanos podem ser incorporados ou com segmentos genéticos Vk ou VÀ humanos para construir novos loci híbridos que vão dar origem, depois de recombinação, a novos domínios variáveis manipulados (FIG. 5A e 5B). Neste último caso, a manipulação de combinações de segmentos genéticos que não estão contidos normalmente em um único locus vai requerer atenção específica às sequências de sinal de recombinação (RSS) que estão associadas com segmentos genéticos respectivos de tal modo a que possa ser obtida recombinação normal quiando eles são combinados em um único locus. Por exemplo, sabe- se que a recombinação V(D)J é guiada por sequências de DNA não codificante conservadas, conhecidas como sequências de heptâmeros e nonâmeros que são encontradas adjacentes a cada segmento genético na precisa localização na qual ocorre a recombinação. Entre estas sequências de DNA não codificante estão regiões espaçadoras não conservadas que tem ou 12 ou 23 pares de bases (bp) de extensão. De modo geral, somente ocorre recombinação em segmentos genéticos localizados sobre o mesmo cromossoma e os segmentos genéticos flanqueados por um espaçador de 12-bp podem ser uindos a um segmento genético flanqueado por um espaçador de 23-bp, isto é, a regra 12/23, embora a união de dois dos segmentos genéticos DH (cada um flanqueado por espaçadores de 12-bp) tenha sido observada em uma pequena proporção de anticorpos. Para possibilitar a recombinação entre segmentos genéticos que normalmente não têm espaçadores compatíveis (por exemplo, VK e um DH ou DH e JÀ), espaçadores únicos, compatíveis são sintetizados em localizações adjacentes com os segmentos genéticos desejados para a construção de cadeias pesadas híbridas únicas que possibilitam o sucesso da recombinação para formar cadeias pesadas únicas contendo regiões variáveis de cadeia leve.
[000214] Deste modo, a Uso da estratégia resumida acima para a incorporação de segmentos genéticos de cadeia leve k humana em um locus de cadeia pesada endógena possibilita a Uso de outras combinações de segmentos genéticos de cadeia leve à humana bem como segmentos genéticos de cadeia pesada humana específicos (por exemplo, DH e JH) e combinações dos mesmos.
Exemplo II Identificação de Direcionamento de Células ES Portando Segmentos Genéticos de Cadeia Leve Humana em um Locus de Cadeia Pesada Endógena
[000215] O DNA BAC direcionado produzido nos Exemplos precedentes foi usado para eletroporação de células ES de camundongo para células ES modificadas criadas para a produção de camundongos quiméricos que expressam proteínas de ligação VL (isto é, segmentos genéticos de cadeia leve k humana ligados operavelmente a regiões constantes de camundongo de cadeia pesada). As células ES contendo uma inserção de segmentos genéticos de cadeia leve k humana não reorganizados foram identificadas pelo teste de PCR quantitativo, TAQMAN® (Lie e Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Conjuntos de primers e sondas específicos foram projetados para a inserção de sequências k humanas e cassetes de seleção associados, perda de sequências de cadeia pesada de camundongo e retenção de sequências de camundongo flanqueando o locus de cadeia pesada endógena.
[000216] Células ES portando segmentos genéticos de cadeia leve K humana podem ser transfectadas com um constructo que expressa uma recombinase de modo a remover qualquer cassete de seleção indesejado introduzido pela inserção do constructo de direcionamento contendo segmentos genéticos K humanos. Opcionalmente, o cassete de seleção pode ser removido por cruzamento com camundongos que expressam a recombinase (por exemplo, vide a patente dos Estados Unidos No. US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de seleção é conservado nos camundongos.
Exemplo III Produção e Análise de Camundongos Expressando Proteínas de Ligação VL
[000217] Células ES direcionadas descritas acima foram usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo no estágio de 8 células por meio do método VELOCIMOUSE® (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. US 7.294.754 e Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99). VELOCIMICE® (Camundongos F0 plenamente derivados a partir da célula ES doadora) portando de modo independente segmentos genéticos k humanos no locus de cadeia pesada de camundongo foram identificados por genotipagem usando uma modificação do teste de alelo (Valenzuela et al., supra) que detectou a presença dos segmentos genéticos k humanos únicos no locus de cadeia pesada endógena (supra). As pupas são genotipadas e uma pupa heterozigótica para o locus genético de cadeia pesada híbrida é selecionada para caracterizar a expressão de proteínas de ligação VL.
[000218] Citometria de Fluxo. A introdução de segmentos genéticos de cadeia leve K humana no locus de cadeia pesada de camundongo foi realizada em uma linhagem de ES F1 (F1H4; Valenzuela et al. 2007, supra) derivada a partir de embriões heterozigóticos 129S6/SvEvTac e C57BL/6NTac que continham adicionalmente uma substituição in situ dos segmentos genéticos de cadeia leve k de camundongo com segmentos genéticos de cadeia leve k humana (Patente dos Estados Unidos No. US 6.596.541). Os segmentos genéticos variáveis da linhagem germinativa de cadeia leve k humana são direcionados para o alelo 129S6, o qual carrega o haplótipo IgMa, ao passo que o alelo C576BL/6N de camundongo não modificado carrega o haplótipo IgMb. Estas formas alélicas de IgM podem ser distinguidas por citometria de fluxo usando anticorpos específicos para os polimorfismos encontrados nos alelos IgMa ou IgMb. Camundongos heterozigotos portando segmentos genéticos de cadeia leve k humana no locus de cadeia pesada endógena conforme descrito no Exemplo I foram avaliados para a expressão de proteínas de ligação VL humanas usando citometria de fluxo.
[000219] Em resumo, foi colhido sangue de grupos de camundongos (n = 6 por grupo) e triturado usando lâminas de vidro. Camundongos C57BL/6 e Balb/c foram usados como grupos de controle. Depois da lise das hemácias (RBCs) com tampão de lise ACK (Lonza Walkersville), as células foram ressuspendidas em tampão de coloração BD Pharmingen FACS e bloquedas com anti-camundongo CD16/32 (BD Pharmingen). Os linfócitos foram corados com anti-camundongo IgMb- FITC (BD Pharmingen), anti-camundongo IgMa-PE (BD Pharmingen), anti-camundongo CD19 (Clone 1D3; BD Biosciences), e anti- camundongo CD3 (17A2; BIOLEGEND®) seguida por fixação com BD CYTOFIX™ todos de acordo com as instruções do fabricante. Os péletes celulares finais foram ressuspendidos em tampão de coloração e analisados usando um software BD FACSCALIBUR™ e BD CELLQUEST PRO™. A Tabela 2 determina os valores de percentagem média para a expressão de células B (CD19+), células T (CD3+), cadeia pesada híbrida (CD19+IgMa+), e cadeia pesada selvagem (CD19+IgMb+) observada em grupos de animais carregando cada modificação genética.
[000220] Em um experimento similar, os conteúdos de células B de compartimentos do baço, do sangue e da medula óssea de camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos ligados operavelmente à região constante de cadeia pesada de camundongo (descrita no Exemplo I, FIG. 2) foram analisados para progressão através do desenvolvimento de células B usando citometria de fluxo de vários marcadores da superfície celular.
[000221] Em resumo, dois grupos (n = 3 cada, fêmeas de 8 semanas de idade) de camundongos selvagens e homozigotos para seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos ligados operavelmente à região constante de cadeia pesada de camundongo foram sacrificados e foi colhido o sangue, os baços e a medula óssea. O sangue foi coletado dentro de tubos microtainer com EDTA (BD Biosciences). A medula óssea foi coletada dos fêmures lavando com meio RPMI completo (meio RPMI suplementado com soro de feto de vitelo, piruvato de sódio, Hepes, 2-mercaptoetanol, aminoácidos não-essenciais, e gentamicina). As hamácias de preparações de baço e medula óssea foram lisadas com tampão de lise ACK (Lonza Walkersville), seguido por lavagem com meio RPMI completo.
[000222] As células (1x106) foram incubadas com CD16/CD32 anti- camundongo (2.4G2, BD) sobre gelo por dez minutos, seguido por marcação com o seguinte coquetel de anticorpo por trinta minutos sobre gelo: FITC-CD43 anti-camundongo (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Medula óssea: células B imaturas (B220intIgM+), células B maduras (B220hiIgM+), células pró B (CD19+ckit+CD43+), células pré B (CD19+ckit-CD43-), células pré B (CD19+CD43intIgM+/—), células B imaturas (CD19+CD43-IgM+/-). Sangue e baço: células B (CD19+), células B maduras (CD19+IgMintIgDhi), células B transicionais/imaturas (CD19+IgMhiIgDint).
[000223] Depois da coloração, as células foram lavadas e fixadas em 2% de formaldeído. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo LSRII e os dados foram analisados com o software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). As FIGs. 6A, 6B e 6C mostram os resultados para o compartimento esplênico. As FIGs. 7A a 7G mostram os resultados para o compartimento da medula óssea. Os resultados obtidos para o compartimento do sangue de cada grupo de camundongos demonstraram resultados similares em comparação com os resultados do compartimento esplênico de cada grupo (dados não mostrados).
[000224] Em um experimento similar, os conteúdos de células B dos compartimento do baço, do sangue e da medula óssea de camundongos homozigotos para trinta segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos ligados operavelmente à região constante de cadeia pesada de camundongo (descritos no Exemplo I, FIG. 2) foram analisados para progressão através de desenvolvimento de células B usando citometria de fluxo de vários vários marcadores da superfície celular.
[000225] Em resumo, dois grupos (n = 3 cada, fêmeas de 6 semanas de idade) de camundongos contendo um locus de cadeia pesada selvagem e uma substituição dos segmentos genéticos Vk e Jk endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (WT) e camundongos homozigotos para trinta segmentos genéticos hVK e cinco segmentos genéticos Jk e uma substituição dos segmentos genéticos VK e JK endógenos com segmentos genéticos VK e JK humanos (30hVK-5hJK HO) foram sacrificados e foram colhidos os baços e a medula óssea. A medula óssea e os esplenócitos foram preparados para coloração com vários marcadores da superfície celular (conforme descrito acima).
[000226] As células (1 x 106) foram incubadas com CD16/CD32 anti- camundongo (2.4G2, BD Biosciences) sobre gelo por dez minutos, seguido por marcação com painéis de medula óssea ou esplenócitos por trinta minutos sobre gelo. Painel de medula óssea: FITC-CD43 anti- camundongo (1B11, BIOLEGEND®), PE-ckit (2B8, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®). Painel de medula óssea e baço: FITC-IgK anti- camundongo (187.1 BD Biosciences), PE-IgÀ (RML-42, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), Pacific Blue-CD3 (17A2, BIOLEGEND®), APC-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-H7-CD19 (ID3, BD). Medula óssea: células B imaturas (B220intIgM+), células B maduras (B220hiIgM+), células pró B (CD19+ckit+CD43+), células pré B (CD19+ckit-CD43-), células B IgK+ imaturas (B220intIgM+IgK+IgV), células B IgV imaturas (B220intIgM+IgK-IgV), mature IgK+ células B (B220hiIgM,IgK,IgZ.), células B IgV maduras (B220hiIgM+IgK-IgÀ+). Baço: células B (CD19+), mature células B (CD19+IgDhiIgMint), células B transicionais/imaturas (CD19+IgDintIgMhi). Medula óssea e baço: células B IgK+ (CDW’Igx’IgZ ), células B IgV (CD19+ Igx Ig/J).
[000227] Depois da coloração, as células foram lavadas e fixadas em 2% de formaldeído. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo LSRII e os dados foram analisados com o software FLOWJO™ (Tree Star, Inc.). Os resultados demonstraram padrões de coloração e populações celulares similares para todos os três compartimentos em compaação com camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos (descritos acima). No entanto, estes camundongos demonstraram uma perda na expressão de cadeia leve À endógena tanto nos compartimentos esplênico quanto da medula óssea (FIG. 8A e 8B, respectivamente), apesar do locus de cadeia leve À endógena estar intacto nestes camundongos. Isto pode refletir uma incapacidade dos domínios de cadeia leve k humana reorganizados, no contexto de regiões constantes de cadeia pesada, para parear ou associar com domínios de cadeia leve À murina, levando à deleção de células IgÀ+.
[000228] Expressão de Isótipos. A imunoglobulina M (IgM) e a imunoglobulina G1 (IgG1) total e superficial (isto é, ligada à membrana) foi determinada para camundongos homozigotos para loci genéticos variáveis de cadeias pesada e leve k humana (Camundongos Humanizados VELCOIMMUNE®, vide a patente dos Estados Unidos No. US 7.105.348) e camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos Vk humanos e 5 segmentos genéticos Jk humanos manipulados no locus de cadeia pesada endógena (6hVk-5hJk HO) por um teste de PCR quantitativo usando sondas TAQMAN® (conforme descrito acima no Exemplo II).
[000229] Em resumo, células B CD19+ foram purificadas a partir dos baços de grupos de camundongos (n = 3 a 4 camundongos por grupo) usando Microcontas CD19 de camundongo (CD19 Microbeads da Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi purificado usando o Mini kit RNeasy™ (Qiagen). O RNA genômico foi removido usando um tratamento sobre a coluna de DNase isenta de RNase (Qiagen). Cerca de 200 ng de mRNA foi reverso-transcrito em cDNA usando o kit First Stand cDNA Synthesis (Invitrogen) e em seguida amplificado com a mistura TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) usando o sistema de detecção de sequência ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Combinações de único primer/sonda foram empregadas de modo a determinar especificamente a expressão de formas totais, superficiais (isto é, transmembrana) e secretadas de isótipos de IgM e de IgG1 (Tabela 3). A expressão relativa foi normalizada para a região constante K de camundongo (mCK).
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[000230] Os resultados do teste de PCR TAQMAN® quantitativo demonstraram uma redução na IgM total e na IgG1 total. No entanto, a proporção de formas secretadas versus formas superficiais de IgM e IgG1 pareceu normal em comparação com camundongos humanizados VELCOIMMUNE® (dados não mostrados).
[000231] Uso de segmento genético K humano e análise da junção VK-JK. Camundongos naive homozigotos para trinta segmentos genéticos hVk e cinco segmentos genéticos Jk e uma substituição dos segmentos genéticos Vk e Jk endógenos com segmentos genéticos Vk e Jk humanos (30hVk-5hJk HO) foram analisados para reorganizações Vk-Jk humanas únicas sobre cadeia pesada de camundongo (IgG) por transcrição reversa - reação de cadeia polimerase (RT-PCR) usando RNA isolado a partir de esplenócitos.
[000232] Em resumo, os baços foram isolados e perfundidos com 10 mL de RPMI-1640 (Sigma) com 5% de HI-FBS detro de bolsas descartáveis estéreis. Cada bolsa contendo um único baço foi em seguida colocada dentro de um STOMACHER™ (Seward) e homogenizado em uma fixação de meio por 30 segundos. Os baços homogenizados foram filtrados usando uma peneira celular de 0,7 μm e em seguida peletizados com uma centrífuga (1000 rpm por 10 minutos) e as hemácias foram lisadas em BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) por três minutos. Os esplenócitos foram diluídos com RPMI-1640 e centrifugados de novo, seguida por ressuspensão em 1 mL de PBS (Irvine Scientific). O RNA foi isolado a partir dos esplenócitos peletizados usando técnicas de rotina conhecidas na arte.
[000233] Foi realizada reação de RT-PCR sobre o RNA dos esplenócitos usando primers específicos para segmentos genéticos hVK humanos e para a IgG de camundongo. O primer para IgG de camundongo foi designado de tal modo a que fosse capaz de amplificar RNA derivado de todos os isótipos de IgG de camundongo. Os produtos de foram purificados por gel e clonados em vetor pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) e sequenciados com primers M13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO:16) e M13 Reverso (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO:17) localizados dentro do vetor em localizações flanqueando o sítio de clonagem. É mostrada na Tabela 4 a Uso de segmentos genéticos VK e JK humanos entre doze clones selecionados. A FIG. 9 apresenta a sequência de nucleotídeos da junção hVK-hJK-mIgG para os doze clones de RT- PCR selecionados.
[000234] Conforme mostrado neste Exemplo, camundongos homozigotos para seis segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos ou homozigotos para trinta segmentos genéticos VK humanos e cinco segmentos genéticos JK humanos ligados operavelmente à região constante de cadeia pesada de camundongo demonstraram expressão de regiões variáveis de cadeia leve humana a partir de um locus de cadeia pesada modificada contendo segmentos genéticos variáveis de cadeia leve na configuração de sua linhagem germinativa. Foi observada progressão através dos vários estágios do desenvolvimento de células B nestes camundongos, indicando múltiplos eventos de recombinação produtiva envolvendo segmentos genéticos variáveis de cadeia leve de um locus de cadeia pesada endógena e expressão de semelhantes cadeias pesadas híbridas (isto é, região variável de cadeia leve humana encadeada a uma região constante de cadeia pesada) como parte do repertório de anticorpo.
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Exemplo IV Propagação de Camundongos Expressando Proteínas de Ligação VL
[000235] A fim de criar uma nova generação de proteínas de ligação VL, camundongos portando os segmentos genéticos K humanos não reorganizados podem ser cruzados com outro camundongo contendo uma deleção do outro alelo de cadeia pesada endógena. Desta maneira, a progênie obtida vai expressar somente cadeias pesadas híbridas conforme descrito no Exemplo I. O cruzamento é realizado por meio de técnicas de rotina reconhecidas na arte e, alternativamente, por empresas comerciais, por exemplo, The Jackson Laboratory. As cepas de camundongo portando um locus de cadeia pesada híbrida são triadas para a presença das cadeias pesadas híbridas únicas e para a ausência de cadeias pesadas de camundongos tradicionais.
[000236] Alternativamente, camundongos portando os segmentos genéticos K humanos não reorganizados no locus de cadeia pesada de camundongo podem ser otimizados por cruzamento com outros camundongos contendo uma ou mais deleções nos loci (K e À) de cadeias leves de camundongo. Desta maneira, a progênie obtida vai expressar somente anticorpos de cadeia pesada k humana única conforme descrito no Exemplo I. O cruzamento é realizado de modo similar por meio de técnicas de rotina reconhecidas na arte e, alternativamente, por empresas comerciais, por exemplo, The Jackson Laboratory. Cepas de camundongo portando um locus de cadeia pesada híbrida e uma ou mais deleções do loci de cadeia leve de camundongo são triados para a presença das cadeias pesadas híbridas únicas contendo domínios de cadeia leve k humana e domínios constantes de cadeia pesada de camundongo e para a ausência de cadeias leves de camundongo endógenas.
[000237] Camundongos portando um locus de cadeia pesada híbrida não reorganizado também são cruzados com camundongos que contêm uma substituição do locus genético variável de cadeia leve k de camundongo endógena com o locus genético variável de cadeia leve k humana (vide a publicação de patente dos Estados Unidos No. US 6.596.541, da Regeneron Pharmaceuticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology). O camundongo humanizado da VELOCIMMUNE® (VELOCIMMUNE® Humanized Mouse) inclui, em parte, ter um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeia leve k humana encadeadas operavelmente a loci de regiões constantes variáveis de cadeia leve k de camundongo endógena de tal modo que o camundongo produz anticorpos compreendendo um domínio variável de cadeia leve k humana e um domínio constante de cadeia pesada de camundongo em resposta a estimulação antigênica. O DNA codificando as regiões variáveis das cadeias leves dos anticorpos pode ser isolado e ligado operavelmente a um DNA codificando as regiões constantes de cadeia leve humana. Em seguida o DNA pode ser expressado em uma célula capaz de expressar a cadeia leve plenamente humana do anticorpo. Depois de um esquema de cruzamento adequado, são obtidos os camundongos portando uma substituição da cadeia leve K de camundongo endógena com o locus de cadeia leve K humana e um locus de cadeia pesada híbrida não reorganizado. Proteínas de ligação VL únicas contendo domínios VK humanos mutados somaticamente podem ser isoladas depois de imunização com um antígeno de interesse.
Exemplo V Produção de Proteínas de ligação VL
[000238] Depois do cruzamento de camundongos que contêm o locus de cadeia pesada híbrida não reorganizada com várias cepas desejadas contendo modificações e deleções de outros loci de Ig endógena (conforme descrito no Exemplo IV), camundongos selecionados podem ser imunizados com um antígeno de interesse.
[000239] De modo geral, um camundongo humanizado da VELOCIMMUNE® contendo no mínimo um locus de cadeia pesada híbrida é estimulado com um antígeno, e células (tais como células B) são recuperadas do animal (por exemplo, a partir do baço ou dos linfonodos). As células podem ser fundidas com uma linhagem celular de mieloma de modo a preparar linhagens celulares de hibridomas imortais, e as linhagens celulares de hibridomas referidas são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridomas que produzem anticorpos contendo cadeias pesadas híbridas específicas para o antígeno usado para imunização. DNA codificando as regiões Vk humanas das cadeias pesadas híbridas pode ser isolado e ligado a regiões constantes desejáveis, por exemplo, de cadeia pesada e/ou de cadeia leve. Devido à presença de segmentos genéticos Vk humanos fundidos às regiões constantes de cadeia pesada de camundongo, é produzido um repertório semelhante a anticorpo único e a diversidade do repertório de imunoglobulinas é dramaticamente aumentada em consequência do formato de anticorpo único criado. Isto confere um nível adicional de diversidade ao repertório antígeno específico depois da imunização. As sequências de anticorpos clonadas resultantes podem ser em seguida produzidas em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, DNA codificando as proteínas de ligação VL antígeno-específicas ou os domínios variáveis pode ser isolado diretamente a partir de linfócitos antígeno-específicos (por exemplo, células B).
[000240] Inicialmente, são isoladas proteínas de ligação VL de alta afinidade tendo uma região VK humana e uma região constante de camundongo. Conforme descrito acima, as proteínas de ligação VL são caracterizadas e selecionadas para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítope, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar proteínas de ligação VL plenamente humanas únicas contendo domínios Vk humanos mutados somaticamente de um locus de cadeia pesada híbrida não reorganizado da invenção. Regiões constantes humanas adequadas incluem, por exemplo, IgG1 ou IgG4 selvagens ou modificadas ou, alternativamente CK ou CÀ.
[000241] Coortes separadas de camundongos contendo uma substituição do locus de cadeia pesada de camundongo endógena com seis segmentos genéticos Vk humanos e cinco segmentos genéticos Jk humanos (conforme descrito no Exemplo I) e uma substituição dos segmentos genéticos Vk e Jk endógenos com segmentos genéticos Vk e Jk humanos foram imunizados com uma proteína receptora de superfície celular humana (Antígeno X). O Antígeno X é administrado diretamente sobre o coxim plantar da pata traseira de camundongos com seis injeções consecutivas a cada 3 a 4 dias. Dois a três microgramas de Antígeno X são misturados com 10 μg de oligonucleotídeo CpG (Cat no. tlrl-modn - ODN1826 oligonucleotide ; InVivogen, San Diego, CA) e 25 μg de Adju-Phos (gel adjuvante de gel de fosfato de alumínio, Cat no. H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de aplicar a injeção. Um total de seis injeções são administradas antes da retirada definitiva do antígeno, o qual é administrado 3 a 5 dias antes do sacrifício. As sangrias depois da quarta e da sexta injeção são coletadas e a reação imune de anticorpos é monitorada por um imunoensaio antígeno-específico de rotina.
[000242] Quando é obtida uma reação imune desejada, os esplenócitos são colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem proteínas de ligação de VL específicas contra o Antígeno X. Usando esta técnica, são obtidas várias proteínas de ligação de VL específicas anti- Antígeno X (isto é, proteínas de ligação possuindo domínios VK humanos no contexto de domínios constantes de cadeias pesada e leve de camundongo).
[000243] Alternativamente, proteínas de ligação de VL anti-Antígeno X são isoladas diretamente a partir de células B antígeno-positivas sem fusão às células de mieloma, conforme descrito no Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. U.S. 2007/0280945A1, especificamente incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Usando este método, foram obtidas várias proteínas de ligação de VL anti-Antígeno X plenamente humanas (isto é, anticorpos possuindo domínios Vk humanos e domínios constantes humanos).
[000244] Uso de Segmento Genético k Humano. A fim de analisar a estrutura das proteínas de ligação VL anti-Antígeno X produzidas, ácidos nucleicos codificando os domínios VK humanos (tanto das cadeias pesadas quanto leves das proteína de ligação VL) foram clonados e sequenciados usando métodos adaptados a partir dos métodos descritos no requerimento de patente dos Estados Unidos No. US 2007/0280945A1 (acima). A partir das sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácidos previstas dos anticorpos, o uso de gene foi identificado para a região variável de cadeia pesada híbrida de proteínas de ligação VL selecionadas obtidas a partir de camundongos imunizados (descrito acima). A Tabela 5 estabelece o uso de gene de segmentos genéticos Vk e Jk humanos de proteínas de ligação VL anti- Antígeno X selecionadas, o que demonstra que os camundongos de acordo com a invenção produzem proteínas de ligação VL antígeno- específicas a partir de uma variedade de segmentos genéticos Vk e Jk humanos, devido a uma variedade de redisposições nos loci de cadeia pesada e cadeia leve k endógenos ambos contendo segmentos genéticos Vk e Jk humanos não reorganizados. Segmentos genéticos Vk humanos reorganizados com uma variedade de segmentos Jk humanos para produzir proteínas de ligação VL antígeno-específicas únicas.
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[000245] Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Proteínas de ligação VL humanas cultivadas contra o Antígeno X foram testadas para sua capacidade para bloquear a ligação de ligante natural de Antígeno X (Ligante Y) em um ensaio ELISA.
[000246] Em resumo, Ligante Y foi revestido sobre lâminas de 96 cavidades em uma concentração de 2 μg/mL diluído em PBS e incubado de um dia para o outro seguido por lavagem quatro vezes em PBS com 0,05% de Tween 20. A lâmina foi em seguida bloqueada com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 0,5% (em peso/volume) de BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) por uma hora em temperatura ambiente. Em uma lâmina separada, sobrenadantes contendo proteínas de ligação VL anti-Antígeno X foram diluídas a 1:10 em tampão. Um falso sobrenadante com os mesmos componentes das proteínas de ligação VL foi usado como um controle negativo. O domínio extracelular (ECD) de Antígeno X foi conjugado à porção Fc de IgG2a de camundongo (Antígeno X-mFc). Antígeno X-mFc foi adicionado a uma concentração final de 0,150 nM e incubado por uma hora em temperatura ambiente. A mistura de proteína de ligação VL com Antígeno X-mFc foi em seguida adicionada à lâmina contendo Ligante Y e incubado por uma hora em temperatura ambiente. A detecção de Antígeno X-mFc ligado a Ligante Y foi determinada com Peroxidase de Raiz Forte (HRP) conjugada a anticorpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) e desenvolvida por reação colorimétrica de rotina usando substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizada por ácido sulfúrico. A absorvência foi lida a OD450 por 0,1 seg. A absorvência de fundo de uma amostra sem Antígeno X foi subtraída de todas as amostras. A percentagem de bloqueio foi calculada para >250 (três lâminas de 96 cavidades) proteínas de ligação VL específicas contra Antígeno X por divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.
[000247] Os resultados mostraram que várias proteínas de ligação VL isoladas a partir de camundongos imunizados com Antígeno X ligaram especificamente o domínio extracelular de Antígeno X fundido com a porção Fc de IgG2a de camundongo (dados não mostrados).
[000248] Determinação de Afinidade. As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para sobrenadantes de proteínas de ligação VL específicas contra Antígeno X selecionadas foram determinadas por SPR (Ressonância de Plasmon Superficial) usando um instrumento BIACORE™ T100 (GE Healthcare). Todos os dados foram obtidos usando HBS-EP (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,3 mM de EDTA, 0,05% de Surfatante P20, pH 7,4) como os tampões tanto de operação quanto de amostra, a 25°C.
[000249] Em resumo, proteínas de ligação VL foram capturadas a partir de amostras de sobrenadante bruto sobre uma superfície de chip sensor CM5 previamente derivatizada uma alta densidade de anticorpos anti- Fc humano usando química de ligação de amina de rotina. Durante a etapa de captura, os sobrenadantes foram injetados através da superfície anti- Fc humano em uma taxa de fluxo de 3 μL/min, por um total de 3 minutos. A etapa de captura foi seguida por uma injeção quer de tampão de operação ou de analisado em uma concentração de 100 nM por 2 minutos em uma taxa de fluxo de 35 μL/min. A dissociação de antígeno da proteína de ligação VL capturada foi monitorada por 6 minutos. A proteína de ligação VL capturada foi removida por uma breveinjeção de 10 mM de glicina, pH 1,5. Todos os sensorgramas foram referenciados em dupla subtraindo os sensorgramas de injeções de tampão dos sensorgramas do analisado, deste modo removendo artefatos causados por dissociação da proteína de ligação VL da superfície de captura. Dados de ligação para cada proteína de ligação VL foi ajustada para um modelo de ligação a 1:1 com transporte de massa usando software BIAcore T100 Evaluation v2.1.
[000250] As afinidades de ligação de trinta e quatro proteínas de ligação VL selecionadas variaram, com todas apresentando uma KD na faixa nanomolar (1,5 a 130 nM). Adicionalmente, cerca de 70% das proteínas de ligação VL selecionadas (23 de 34) demonstraram afinidade nanomolar de único dígito. As medições de T1/2 para as proteínas de ligação VL selecionadas demonstraram uma faixa de cerca de 0,2 a 66 minutos. Das trinta e quatro proteínas de ligação VL, seis mostraram mais de 3 nM de afinidade por Antígeno X (1.53, 2.23, 2.58, 2.59, 2.79, e 2.84). Os dados de afinidade são consistentes com as proteínas de ligação VL resultantes da associação combinatorial de domínios variáveis de cadeia leve humanos reorganizados ligados a regiões constantes de cadeia pesada e leve (descritos na Tabela 4) sendo de alta afinidade, selecionados clonalmente, e mutados somaticamente. As proteínas de ligação VL geradas pelos camundongos descritos aqui, neste requerimento de patente, compreendem uma coleção de diversas proteínas de ligação únicas e de alta afinidade que apresentam especificidade para um ou mais epítopes sobre o Antígeno X.
[000251] Em outro experimento, proteínas de ligação de VL humanas selecionadas cultivadas contra o Antígeno X foram testadas para sua capacidade para bloquear a ligação do ligante natural do Antígeno X (Ligante Y) ao Antígeno X em um teste à base de contas LUMINEX® (dados não mostrados). Os resultados demonstraram que além de ligar especificamente o domínio extracelular do Antígeno X com afinidades na faixa nanomolar (descrito acima), as proteínas de ligação de VL selecionadas também foram capazes de ligar o Antígeno X de macaco cynomolgus (Macaca fascicularis).

Claims (17)

1. Método para preparar um camundongo geneticamente modificado para compreender em sua linhagem germinativa um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina (Ig) de camundongo modificado para compreender uma sequência kappa (K) de cadeia leve de Ig de linhagem genômica germinativa humana operacionalmente com uma sequência de ácido nucleico endógena de região constante de cadeia pesada de Ig de camundongo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) modificar uma célula totipotente de camundongo substituindo, no locus endógeno de cadeia pesada de Ig de camundongo, uma sequência genômica endógena compreendendo: (i) segmentos gênicos endógenos de cadeia pesada V (VH) de Ig de camundongo, (ii) todos os segmentos gênicos endógenos D (DH) da cadeia pesada de Ig de camundongo, e (iii) segmentos gênicos endógenos de cadeia pesada J (JH) de Ig de camundongo, com a sequência k da linhagem germinativa genômica humana de modo que a sequência k da linha germinativa genômica humana está operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico endógeno da região constante da cadeia pesada de Ig de camundongo no locus endógeno da cadeia pesada de Ig de camundongo, em que a sequência k da linhagem germinativa genômica humana compreende: (iv) um ou mais segmentos de gene humanos k variável de cadeia leve de Ig (hVk) não rearranjados e (v) ) pelo menos um segmento de gene k (hJkL) de junção humano de cadeia leve de Ig não rearranjado, em que cada um dos um ou mais segmentos gênicos hVK não rearranjados e o pelo menos um segmento gênico hJK não rearranjado compreende sequências de sinal de recombinação que permitem que um ou mais segmentos genéticos hVK não rearranjados e pelo menos um hJK não rearranjados se recombinem em uma célula B para formar uma sequência de nucleotídeos da região variável K da cadeia leve (VK/JK) de Ig humana rearranjada ligada à sequência de ácido nucleico da região constante da cadeia pesada de Ig endógena de camundongo, e em que a célula de camundongo totipotente modificada compreende ainda, em um locus endógeno do gene K de cadeia leve de Ig de camundongo, uma segunda pluralidade de segmentos gênicos de hVK e hJK não rearranjados operacionalmente ligados a uma sequência de ácido nucleico endógena de região constante de cadeia leve de Ig de camundongo; e (ii) manter a célula totipotente modificada de camundongo sob condições adequadas para se transformar em um camundongo geneticamente modificado compreendendo (i) em sua linhagem germinativa: no locus endógeno de cadeia pesada de Ig de camundongo, o um ou mais segmento(s) de gene hVK humano não rearranjado(s) e pelo menos um segmento do gene de hJK não rearranjado ligado operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico da região constante da cadeia pesada endógena de Ig de camundongo, e no locus endógeno da cadeia leve de Ig de camundongo, a segunda pluralidade de segmentos gênicos de hVK e hJK não rearranjados operacionalmente ligados à sequência de ácido nucleico endógena da região constante K de cadeia leve de Ig de camundongo, e (ii) uma célula B que expressa uma proteína de ligação ao antígeno, em que a proteína de ligação ao antígeno compreende: (iii) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio variável K de cadeia leve de Ig humana fundido com um domínio constante de cadeia pesada de Ig endógeno de camundongo, (iv) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo domínio variável k de cadeia leve de Ig humana fundido com um domínio constante k de cadeia leve de Ig endógeno de camundongo, (v) i) um terceiro polipeptídeo idêntico ao primeiro polipeptídeo, e (vi) um quarto polipeptídeo idêntico ao segundo polipeptídeo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência k da linhagem germinativa genômica substitui todos ou substancialmente todos os segmentos do gene endógeno VH de camundongo funcionais no locus endógeno de cadeia pesada de Ig de camundongo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência k da linhagem germinativa genômica substitui todos ou substancialmente todos os segmentos endógenos do gene de JH de camundongo no locus endógeno de cadeia pesada de Ig de camundongo.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende substituir na célula totipotente de camundongo, (1) no locus endógeno de Ig de camundongo: (i) todos ou substancialmente todos os segmentos de gene VHendógenos funcionais de camundongo, (ii) todos os segmentos endógenos do gene DH de camundongo, e (iii) todos os segmentos endógenos do gene JH de camundongo, com a sequência K da linhagem germinativa genômica humana de modo que a sequência K da linha germinativa genômica humana está operacionalmente alinhada a uma sequência de ácido nucleico endógena da região constante da cadeia pesada de Ig de camundongo, em que a sequência k da linhagem germinativa genômica humana compreende: (i) pelo menos seis ou mais segmentos do gene de hVk não rearranjados e (ii) o pelo menosum segmento do gene de hJk ; (II) no locus endógeno k de cadeia leve de Ig de camundongo, (i) todos os segmentos endógenos do gene Vk de camundongo, e (ii) todos os segmentos endógenos do gene Jk de camundongo, com a segunda pluralidade de segmentos gênicos de hVk e hJk não rearranjados de modo que a segunda pluralidade de segmentos gênicos de hVk e hJk não rearranjados esteja operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico endógeno da região constante k da cadeia leve de Ig de camundongo.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a célula totipotente de camundongo é uma célula pluripotente de camundongo, uma célula-tronco embrionária de camundongo (ES) ou uma célula pluripotente induzida de camundongo.
6. Proteína de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro dímero compreendendo (i) um primeiro polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio variável de cadeia leve de Ig humana (VK1) fusionado com um primeiro domínio constante de cadeia pesada de Ig de camundongo (CH); e (ii) um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo domínio variável da cadeia leve de Ig (VK2) fundido com um domínio constante K da cadeia leve de camundongo (CK); em que VKL1 de (i) é codificado por uma sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve k de Ig humana rearranjada (VkL/Jk) que é isenta de qualquer sequência de uma sequência do gene DH; em que Vk1 de (i) e Vk2 de (ii) são cognatos um em relação ao outro e não são idênticos, em que o CH de (i) e Ck de (ii) se associam de tal modo que o primeiro dímero compreende um primeiro Fab que inclui o Vk1 e o Vk2, e em que a referida proteína de ligação ao antígeno pode ser obtida de um camundongo feito pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Proteína de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo dímero compreendendo (iii) um terceiro polipeptídeo compreendendo um terceiro domínio variável de cadeia leve k humana de Ig (Vk3) fusionado a um segundo CH de camundongo ;e (iv) um quarto polipeptídeo compreendendo um quarto domínio variável k da cadeia leve de Ig (Vk 4) humano fusionado a um Ck de camundongo em que o segundo CH de (iii) e o segundo Ck de (iv) se associam de tal modo que o segundo dímero compreende um segundo Fab que inclui o VK3 e o VK4, e em que o primeiro e o segundo dímeros formam uma molécula de ligação ao antígeno tetramérica compreendendo um (Fab)2 e um Fc, e em que o (Fab)2 compreende o primeiro Fab e o segundo Fab.
8. Uso de um camundongo preparado pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para produzir uma proteína de ligação VK que compreende um domínio variável K de cadeia leve humano.
9. Uso de um camundongo preparado pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para produzir um anticorpo.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o anticorpo é um anticorpo humano.
11. Uso de um camundongo preparado pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para produzir um anticorpo biespecífico.
12. Vetor de direcionamento, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um primeiro braço e um segundo braços de direcionamento, em que o primeiro braço de direcionamento e o segundo braço de direcionamento são braços de direcionamento de camundongo, que direcionam o vetor de direcionamento para um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo; e, (b) entre o primeiro braço de direcionamento e o segundo braço de direcionamento, uma sequência contígua k germinativa genômica humana compreendendo: (i) segmentos do gene Vk humano não rearranjado, ou (ii) segmentos do gene Vk humano não rearranjado e um segmento do gene JK humano não rearranjado, em que recombinação homóloga no locus da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena com o vetor de direcionamento cria um locus de gene de imunoglobulina híbrida compreendendo (i) os segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados operacinalmente ligados a uma sequência de ácido nucleico endógena da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina no locus endógeno do gene da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, ou (ii) os segmentos do gene Vk humano não rearranjado e o segmento do gene Jk humano não rearranjado operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico endógena da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina no locus do gene da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógeno, e em que a sequência k da linhagem germinativa genômica humana substitui os segmentos gênicos VH de Ig de camundongo endógenos, todos os segmentos de genes DH de Ig de camundongo endógenos e segmentos de genes endógenos JH de Ig de camundongo no locus endógeno da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.
13. Vetor de direcionamento, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que, após recombinação homóloga, (i) os segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados ou (ii) os segmentos do gene Vk humano não rearranjado e o segmento do gene Jk humano não rearranjado substituem todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos de Ig VH, DH e JH de Ig endógena de camundongo no locus endógeno da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.
14. Vetor de direcionamento, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a sequência K germinativa genômica humana contígua é selecionada do grupo que consiste em (i) hVi<4-1 a hVid-6 e JK1, (ii) hW4-1 a hW1-6 e JK1 a JK2, (iii) hVi<4-1 a hVid-6 e JK1 a JK3, (iv) hW4-1 a hW1-6 e JK1 a JK4, (v) hW4-1 a hVK1-6 e JK1 a JK5, (vi) hVK3-7 a hVK1-16, (vii) hVK1-17 a hVK2-30, (viii) hVK3-31 a hVK2-40, e (ix) uma combinação das mesmas.
15. Vetor de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que cada um dos segmentos gênicos Vk humanos não rearranjados e o segmento gênico Jk humano não rearranjado compreende sequências de sinal de recombinação que permitem os segmentos gênicos Vk humano não rearranjados e o segmento gênico Jk humano não rearranjado recombinar para formar uma sequência de nucleotídeos da região variável k da cadeia leve de imunoglobulina humana rearranjada (Vk/Jk) ligada à sequência de ácido nucleico da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena no locus endógeno do gene da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.
16. Vetor de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro braço direcionamento é idêntico a um segmento do gene VH endógeno no locus da imunoglobulina endógena e/ou o segundo braço de direcionamento é idêntico a uma sequência a jusante de um segmento do gene JH endógeno no locus de imunoglobulina endógena ou modificada.
17. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: permitir que o camundongo preparado pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, desenvolva uma resposta imune a um antígeno de interesse.
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