RS57893B1 - Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija - Google Patents

Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija

Info

Publication number
RS57893B1
RS57893B1 RS20181207A RSP20181207A RS57893B1 RS 57893 B1 RS57893 B1 RS 57893B1 RS 20181207 A RS20181207 A RS 20181207A RS P20181207 A RSP20181207 A RS P20181207A RS 57893 B1 RS57893 B1 RS 57893B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
segments
rodent
locus
tcrα
Prior art date
Application number
RS20181207A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
John Mcwhirter
Naxin Tu
Vera Voronina
Cagan Gurer
Karolina Meagher
Sean Stevens
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS57893B1 publication Critical patent/RS57893B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na genetski modifikovanog glodara (npr. miš ili pacov) koji sadrži u svom genomu varijabilne genske lokuse ljudskog ili humanizovanog TC receptora (npr. TCRα i TCRβ varijabilne genske lokuse i/ili TCRδ i TCRγ varijabilne genske lokuse) i eksprimira ljudske ili humanizovane TCR polipeptide (npr. TCRα i TCRβ polipeptide i/ili TCRδ i TCRγ polipeptide) iz ljudskih ili humanizovanih TCR varijabilnih genskih lokusa. Glodar sa ljudskim ili humanizovanim TCR varijabilnim genskim lokusom prema pronalasku obuhvata nepreuređene ljudske TCR varijabilne regione (npr. V, D i/ili J segmente) kod endogenih ne-ljudskih TCR genskih lokusa. Takođe su pruženi i postupci korišćenja glodara koji sadrže ljudske ili humanizovane TCR varijabilne genske lokuse i eksprimiranje ljudskih ili humanizovanih TCR polipeptida iz tih lokusa.
STANJE TEHNIKE
[0002] U adaptivnom imunom odgovoru, strani antigeni se prepoznaju od strane receptor molekula na B limfocitima (npr., imunoglobulini) i T limfocitima (npr. receptori T ćelija ili TCR). Dok su patogeni u krvi i ekstracelularnom prostoru prepoznati od strane antitela u toku humoralnog imunog odgovora, uništenje patogena unutar ćelija je posredovano u toku ćelijskog imunog odgovora od strane T ćelija.
[0003] T ćelije prepoznaju i napadaju antigene predstavljene njima u kontekstu kompleksa velike histokompatibilnosti (MHC) na ćelijskoj površini. Prepoznavanje antigena je posredovano sa TCR eksprimiranim na površini T ćelija. Dve glavne klase T ćelija služe ovoj funkciji: citotoksične T ćelije, koje eksprimiraju CD8 protein ćelijske površine i pomoćne T ćelije, koje eksprimiraju CD4 protein ćelijske površine. Citotoksične T ćelije aktiviraju signalne kaskade koje rezultuju u direktnom uništenju ćelije koja predstavlja antigen (u kontekstu MHC I), dok se pomoćne T ćelije razlikuju u nekoliko klasa, i njihova aktivacija (prajmovana prepoznavanjem antigena predstavljenog u kontekstu MHC II) rezultuje uništavanjem patogena posredstvom makrofaga i stimulacijom proizvodnje antitela od strane B ćelija.
[0004] Zbog svoje specifičnosti antigena, antitela se trenutno široko proučavaju zbog svog terapeutskog potencijala protiv brojnih poremećaja kod ljudi. Kako bi proizveli antitela sposobna za neutralizaciju ljudskih meta, istovremeno izbegavajući aktivaciju imunih odgovora protiv takvih antitela, naučnici su koncentrisali svoje napore na proizvodnju ljudskih ili humanizovanih imunoglobulina. Jedan od načina proizvodnje humanizovanih antitela in vivo je koristeći VELOCIMMUNE® miša, humanizovanog miša sadrži (1) repertoar nepreuređenih ljudskih V, D i J segmenata imunoglobulina, koji su operativno povezani jedni sa drugima, i mišji konstantni region na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina miša i (2) nepreuređeni ljudski Vκ i repertoar segmenta Jκ koji su operativno povezani jedni sa drugima i konstanta miša κ regiona na endogenom lokusu lakog lanca imunoglobulina. Kao takvi, VELOCIMMUNE® miševi pružaju bogat izvor različitih varijabilnih domena za preuređena antitela za upotrebu kod ljudskih antitela.
[0005] Slično antitelu, receptor T ćelija da sadrži varijabilni region, kodiran nepreuređenim lokusima (α i β lokusi, ili δ i γ lokusi) koji sadrže segmente varijabilnog regiona V(D)J, i ova varijabilna oblast daje T ćeliji svoju specifičnost vezivanja antigena. Takođe, slično antitelu, TCR specifičnost za njegov antigen može se koristiti za razvoj nove terapije. Stoga u struci postoji potreba za životinjama koje nisu čoveka (npr. glodari, npr. pacovi ili miševi) koji sadrže nepreuređene ljudske varijabilne regione T ćelija genskih segmenata sposobnih za preuređivanje kako bi se formirali geni koji kodiraju receptor varijabilne domene ljudskih T-ćelija, uključujući domene koji su srodni jedni sa drugima, uključujući i domene koje specifično vezuju antigen od interesa. Takođe postoji potreba za životinjama koje nisu čovek, koje obuhvataju varijabilne regione T ćelija koje sadrže konzervativne humanizacije, uključujući i životinje koje nisu čovek koje sadrže nepreuređene ljudske segmente gena koji mogu da se preuređuju kako bi se formirali geni varijabilnih regiona receptora T ćelija koji su povezani sa ne-ljudske (endogene) konstantne genske sekvence receptora T ćelija. Ostaje potreba za životinjama koje nisu čovek koje su sposobne da generišu raznovrstan repertoar ljudskih varijabilnih sekvenci receptora T ćelija. Postoji potreba za životinjama koje nisu čovek koje su sposobne da preuređuju većinu ili sve funkcionalne segmente varijabilnog regiona receptora T ćelija, kao odgovor na antigen od interesa, kako bi se formirali polipeptidi receptora T ćelija koji sadrže potpuno ljudske varijabilne domene.
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] U jednom aspektu, ovde je dat genetski modifikovan glodar, na primer, miš ili pacov prema patentnom zahtevu 1.
[0007] U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni glodarski TCRα varijabilni genski lokus na endogenom TCRα varijabilnom genskom lokusu. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni glodarski TCRβ varijabli genski lokus na endogenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu. U jednom otelotvorenju, endogeni Vα i Jα segmenti glodara nisu sposobni da se preuređuju kako bi se formirala preuređena sekvenca Vα/Jα. U jednom otelotvorenju, endogeni glodarski Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu sposobni da se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži brisanje tako da genom životinje ne sadrži funkcionalni Vα i funkcionalni Jα segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži brisanje tako da genom glodara ne sadrži funkcionalni endogeni Vβ, funkcionalni endogeni Dβ, i funkcionalni endogeni Jβ segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži brisanje svih funkcionalnih endogenih Vα i Jα segmenata. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži brisanje svih funkcionalnih endogenih Vβ, Dβ i Jβ segmenata. U nekim otelotvorenjima, ljudski Vα i Jα segmenti se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vα/Jα sekvenca. U nekim otelotvorenjima, ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti su preuređeni kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. Tako, u različitim otelotvorenjima, glodar eksprimira receptor T ćelija koji sadrži ljudski varijabilni region i konstantni region glodara na površini T ćelije.
[0008] U nekim aspektima, T ćelije glodara podležu razvoju T ćelija u timusu za proizvodnju CD4 i CD8 jednostruko pozitivnih T ćelija. U nekim aspektima, glodar sadrži normalan odnos CD3+ T ćelija slezine i ukupnih splenocita. U različitim otelotvorenjima, glodar generiše populaciju centralnih i efektorskih memorijskih T ćelija na periferiji.
[0009] U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus u ovde opisanom glodaru sadrži 61 ljudski Jα segment i 8 ljudskih Vα segmenata. U još jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus u glodaru sadrži potpun repertoar ljudskih Jα segmenata i potpun repertoar ljudskih Vα segmenata.
[0010] U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus u ovde opisanom glodaru obuhvata 14 ljudskih Jβ segmenta, 2 ljudska Dβ segmenta i 14 ljudskih Vβ segmenata. U još jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus u glodaru sadrži potpun repertoar ljudskih Jβ segmenta, potpun repertoar ljudskih Dβ segmenata i potpun repertoar ljudskih Vβ segmenata.
[0011] U dodatnom otelotvorenju, ovde opisan glodar dalje sadrži nukleotidne sekvence ljudskih TCRδ varijabilnih segmenata na humanizovanom TCRα lokusu. U jednom otelotvorenju, glodar dalje sadrži najmanje jedan ljudski Vδ, Dδ i Jδ segment, na primer, potpun repertoar ljudskih Vδ, Dδ i Jδ segmenata na humanizovanom TCRα lokusu.
[0012] U jednom otelotvorenju, glodar zadržava endogeni ne-ljudski TCRα i/ili TCRβ lokus, gde je lokus nefunkcionalni lokus.
[0013] U jednom otelotvorenju, glodar je odabran od miša i pacova. U jednom otelotvorenju, glodar je miš.
[0014] U jednom aspektu, pronalazak pruža genetski modifikovanog miša prema patentnom zahtevu 13. U jednom otelotvorenju, miš sadrži potpun repertoar ljudskih Vα segmenata. U jednom otelotvorenju, miš sadrži potpun repertoar ljudskih Vβ segmenata. U jednom otelotvorenju, miš sadrži potpun repertoar ljudskih Vα segmenata i ljudskih Jα segmenata. U jednom otelotvorenju, miš sadrži potpun repertoar ljudskih Vα segmenata i ljudskih Vβ segmenata. U jednom otelotvorenju, miš sadrži potpun repertoar ljudskog Vα, ljudskog Jα, ljudskog Vβ, ljudskog Dβ i ljudskog Jβ segmenta.
[0015] U jednom otelotvorenju, miš sadrži najmanje jedan endogeni mišji Vα i najmanje jedan endogeni mišji Jα segment, gde se endogeni segmenti ne mogu preurediti kako bi se formirala preuređena Vα/Jα sekvenca, i takođe sadrži najmanje jedan endogeni mišji Vβ, najmanje jedan endogeni mišji Dβ i najmanje jedan endogeni mišji Jβ segment, gde se endogeni segmenti ne mogu preurediti kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca.
[0016] U jednom aspektu, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus koji sadrži segmente ljudskog TCRα varijabilnog regiona zamenjuje mišje TCRα varijabilne gene kod endogenog TCRα varijabilnog lokusa i nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji obuhvata segmente ljudskih TCRβ varijabilnih regiona zamenjuje miša TCRβ varijabilne gene na endogeni TCRβ varijabilni lokus miša.
[0017] U jednom aspektu, ljudski Vα i Jα segmenti se preuređuju kako bi se formirala preuređena ljudska Vα/Jα sekvenca, i ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti se preuređuju kako bi se formirala preuređena ljudska Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. U jednom otelotvorenju, preuređena ljudska Vα/Jα sekvenca je operativno vezana za sekvencu mišjeg TCRα konstantnog regiona U jednom otelotvorenju, preuređena ljudska Vβ/Dβ/Jβ sekvenca je operativno vezana za sekvencu mišjeg TCRβ konstantnog regiona. Tako, u različitim otelotvorenjima, miš eksprimira receptor T ćelija na površini T ćelije, gde receptor T ćelija sadrži ljudski varijabilni region i mišji konstantni region.
[0018] U jednom otelotvorenju, miš dalje sadrži repertoar segmenata ljudskih TCRδ varijabilnih regiona (npr., ljudskih Vδ, Jδ, i Dδ segmenti) na humanizovanom TCRα lokusu. U jednom otelotvorenju, repertoar ljudskih TCRδ segmenata varijabilnog regiona je potpuni ljudski repertoar TCRδ- varijabilnog regiona. U jednom otelotvorenju, segmenti varijabilnog regiona ljudskog TCRδ su na endogenom TCRα lokusu. U jednom otelotvorenju, segmenti varijabilnog regiona ljudskog TCRδ zamenjuju endogene segmente mišjeg TCRδ varijabilnog regiona.
[0019] U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš eksprimira receptor T ćelija koji sadrži ljudski varijabilni region i mišji konstantni region na površini T ćelije. U jednom otelotvorenju, T ćelije miša prolaze timuski razvoj T ćelija za proizvodnju CD4 i CD8 jednostruko pozitivnih T ćelija. U jednom otelotvorenju, miš sadrži normalni odnos CD3+ T ćelija slezine i ukupnih splenocita; u jednom aspektu, miš generiše populaciju centralnih i efektorskih memorijskih T ćelija antigenu od interesa.
[0020] Takođe su obelodanjeni postupci za izradu genetski modifikovanih životinja koje nisu čovek (npr. glodari, npr., miševi ili pacovi) koje su ovde opisane.
[0021] Ovde je obelodanjen postupak za izradu humanizovanog glodara (npr. miš ili pacov), koji obuhvata zamenu glodarskih segmenata TCRα i TCRβ varijabilnih regiona, ali ne konstantnih gena glodara, sa ljudskim nepreuređenim segmentima TCRα i TCRβ varijabilnog regiona kod endogenog glodarskog TCR lokusa. Kao što je ovde obelodanjeno, postupak može obuhvatiti zamenu glodarskog segmenta TCRα varijabilnog regiona (Vα i/ili Jα) sa ljudskim segmentima TCRα varijabilnog regiona (Vα i/ili Jα), gde su segmenti TCRα varijabilnog regiona operativno povezani sa ne-ljudskim TCR konstantni region genom za formiranje humanizovanog TCRα lokusa; i zamenu glodarskog segmenata TCRβ varijabilnog regiona (Vβ i/ili Dβ i/ili Jβ) sa ljudskim segmentima TCRβ varijabilnog regiona (Vβ i/ili Dβ i/ili Jβ), gde su segmenti TCRβ varijabilnog regiona operativno povezani sa genom ne-ljudskog TCR konstantnog regiona za formiranje humanizovanog TCRβ lokusa. Humanizovani glodar može biti miš, i germlinija miša može sadržati ljudske segmente TCRα varijabilnog regiona koji se operativno vezuju za endogenu konstantnu sekvencu TCRα miša kod endogenog TCRα lokusa; a germlinija miša može sadržati segmente varijabilnog regiona ljudskog TCRβ operativno vezane za endogenu mišju konstantnu sekvencu TCRβ kod endogenog TCRβ lokusa.
[0022] Ovde je obelodanjen postupak za izradu genetski modifikovane životinje koja nije čovek (npr. glodar, npr. miš ili pacov) koji eksprimira receptor T ćelije koji sadrži ljudski ili humanizovani varijabilni region i ne-ljudski (npr. glodarski) konstantni region na površini T ćelije, koji sadrži: zamenu u prvoj životinji koja nije čovek endogenog ne-ljudskog TCRα varijabilnog genskog lokusa sa nepreuređenim humanizovanim TCRα varijabilnim genskim lokusom koji sadrži najmanje jedan ljudski Vα segment i najmanje jedan ljudski Jα segment, gde je humanizovani TCRα varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim ne-ljudskim TCRα konstantnim regionom; zamenu u drugoj životinji koja nije čovek endogenog ne-ljudskog TCRβ varijabilnog genskog lokusa sa nepreuređenim humanizovanim TCRβ varijabilnim genskim lokusom koji sadrži najmanje jedan ljudski Vβ segment, najmanje jedan ljudski Dβ segment i najmanje jedan ljudski Jβ segment, gde je humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim TCRβ konstantnim regionom; i uzgajanje prve i druge životinje koja nije čovek, kako bi se dobila životinja koja nije čovek koji eksprimira receptor T ćelije koji sadrži ljudski ili humanizovani varijabilni region i ne-ljudski konstantni region.
[0023] Endogeni ne-ljudski (npr. glodarski) Vα i Jα segmenti mogu biti nesposobni za preuređivanje kako bi se formirala preuređena sekvenca Vα/Jα, i endogeni ne-ljudski (npr. glodarski) Vβ, Dβ i Jβ segmenti mogu biti nesposobni za preuređivanje da formiraju preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. Ljudski Vα i Jα segmenti mogu da se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vα/Jα sekvenca, i ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti mogu da se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. nepreuređeni humanizovani TCRα varijabilni genski lokus može sadržati 61 ljudski Jα segment i 8 ljudskih Vα segmenata, i nepreuređeni humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus može obuhvatati 14 ljudskih Vβ segmenata, 2 ljudska Dβ segmenta i 14 ljudskih Jβ segmenta. nepreuređeni humanizovani TCRα varijabilni genski lokus može obuhvatiti potpun repertoar ljudskih Jα segmenata i potpun repertoar ljudskih Vα segmenata, i nepreuređeni humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus može obuhvatiti potpun repertoar ljudskih Vβ segmenata, potpun repertoar ljudskih Dβ segmenta, i potpun repertoar ljudskih Jβ segmenata.
[0024] U jednom aspektu postupka, T ćelije glodara podležu razvoju timuske T ćelije kako bi proizvele CD4 i CD8 jednostruko pozitivne T ćelije. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži normalni odnos CD3+ T ćelija slezine i ukupnih splenocita. U jednom otelotvorenju, glodar generiše populaciju centralnih i efektorskih memorijskih T ćelija antigenu od interesa.
[0025] U nekim otelotvorenjima, ovde opisana zamena endogenog ne-ljudskog TCRα varijabilnog genskog lokusa je napravljena u pojedinačnoj ES ćeliji, i pojedinačna ES ćelija se unosi u glodara, npr. embrion miša ili pacova, kako bi se genetski modifikovao prvi glodar; i zamena endogenog ne-ljudskog TCRβ varijabilnog genskog lokusa opisanog ovde je napravljena u pojedinačnoj ES ćeliji, i pojedinačnoj ES ćelija se unosi u glodara, npr., embrion miša ili pacova, kako bi se napravio genetski modifikovani drugi glodar. Kao što je ovde obelodanjeno, prvi glodar i drugi glodar se uzgajaju da formiraju potomstvo, gde potomstvo u svojoj rodnoj liniji sadrži humanizovani varijabilni TCRα lokus i humanizovani TCRβ varijabilni lokus.
[0026] Stoga je ovde pokazan postupak za izradu genetski modifikovanog miša.
[0027] Takođe su ovde pokazane ćelije, npr. izolovane T ćelije (npr. citotoksične T ćelije, pomoćne T ćelije, memorijske T ćelije, itd.), izvedene iz životinja koje nisu čovek (npr. glodari, npr. miševi ili pacovi). Takođe su obelodanjena tkiva i embrioni koji su izvedeni iz ovde opisanih životinja koje nisu čovek.
[0028] Ovde se obelodanjuje postupak za izradu ljudskog TCR varijabilnog domena, koji obuhvata genetsko modifikovanje glodara kao što je ovde opisano da obuhvati humanizovani TCRα lokus i/ili humanizovani TCRβ lokus, održavajući glodara pod uslovima koji su dovoljni kako bi se formirala T ćelija, gde T ćelija eksprimira ljudski TCRα i/ili ljudski TCRβ varijabilni domen.
[0029] Ovde je obelodanjen postupak za pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen koji se vezuje za epitop od interesa, koji obuhvata izlaganje životinje koja nije čovek, kao što je ovde opisano, epitopu od interesa, održavanje životinje koja nije čovek pod uslovima dovoljnim da životinja prezentuje epitop koji je od interesa humanizovanom TCR od životinje, i identifikovanje nukleinske kiseline životinje koja kodira polipeptida ljudskog TCR varijabilnog domena koji vezuje epitop interesa.
[0030] U jednom aspektu, upotreba glodara kao što je ovde opisano data je za izradu humanizovanog TCR receptora prema patentnom zahtevu 18.
[0031] Ovde je obelodanjena upotreba sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen ili njegov fragment kako bi se napravio antigen-vezujući protein. Antigen-vezujući protein može sadržati TCR varijabilni domen koji sadrži ljudski TCRα i/ili ljudski TCRβ varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa.
[0032] Ovde je obelodanjeno korišćenje životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano za stvaranje ćelije koja nije ljudska, koja na svojoj površini eksprimira humanizovan receptor T ćelija.
[0033] Ovde je obelodanjen humanizovani receptor T ćelija iz životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano.
[0034] Ovde je obelodanjena sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen ili njen fragment, napravljen u životinji koja nije čovek kao što je ovde opisano.
[0035] Bilo koje od ovde opisanih otelotvorenja i aspekata mogu se koristiti zajedno jedni sa drugima, osim ako nije drugačije naznačeno ili očigledno iz konteksta. Ostala otelotvorenja će biti očigledna stručnjacima iz pregleda detaljnog opisa koji sledi. Detaljni opis koji sledi uključuje primerne prikaze različitih otelotvorenja pronalaska, koja nisu restriktivna prema pronalasku koji se zahteva. Priložene slike predstavljaju deo ove specifikacije i zajedno sa opisom služe samo za ilustraciju otelotvorenja i ne ograničavaju pronalazak.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0036]
SLIKA 1 pokazuje interakciju u mišu između TCR molekula i molekula MHC: levi panel pokazuje mišju T ćeliju (vrh) iz humanizovanog TCR miša koji sadrži receptor T ćelija sa ljudskim varijabilnim TCR domenima i mišjim konstantnim TCR domenima, koji prepoznaje antigen (siva kuglica) predstavljen preko MHC klase I pomoću antigena koji predstavlja ćeliju (dno); desni panel pokazuje isto za MHC klasu II. Kompleti MHC I i MHC II pokazani su zajedno sa odgovarajućim ko-receptorima, CD8 i CD4. Regioni miša su u crnom, a regioni čoveka su beli.
SLIKA 2 pokazuje (ne u razmeri) opštu organizaciju mišjeg (gornji panel, prvi lokus) i ljudskog (gornji panel, drugi lokus) TCRα lokusa. Donji panel ilustruje strategiju zamene segmenata TCRα varijabilnih regiona u mišu (zatvoreni simboli) sa ljudskim segmentima TCRα varijabilnog regiona (otvoreni simboli) na endogenom lokusu miša na hromozomu 14; humanizovani TCRα lokus koji ima ljudske Vα i Jα segmente pokazan je sa mišjim konstantnim regionom i mišjim pojačivačima; u pokazanom otelotvorenju, TCRδ lokus je obrisan tokom humanizacije.
SLIKA 3 pokazuje (ne u razmeri) progresivnu strategiju za humanizaciju mišjeg TCRα lokusa, gde se segmenti ljudskih TCRα varijabilnih regiona sekvencijalno dodaju uzvodno od inicijalne humanizacije mišjeg lokusa (MAID1540). Mišja sekvenca označena je zatvorenim simbolima; ljudska sekvenca označena je otvorenim simbolima. MAID se odnosi na ID broj modifikovanog alela. TRAV=TCR Vα segment, TRAJ=TCR Jα segment (hTRAJ=ljudski TRAJ), TRAC=TCR Cα domena, TCRD=TCRδ.
SLIKA 4 je detaljno pokazuje (ne u razmeri) progresivne strategije humanizacije na TCRα lokusu. SLIKA 4A pokazuje brisanje mišjih TCRα V i J segmenata; SLIKA 4B pokazuje strategiju ubacivanja ljudskih segmenata 2V i 61J u obrisan mišji TCRα lokus; SLIKA 4C pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih V segmenata, što rezultuje sa ukupno 8V i 61J ljudskih segmenata; SLIKA 4D pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih V segmenata, što rezultuje sa ukupno 23V i 61J ljudskih segmenata; SLIKA 4E pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih V segmenata koji rezultuju ljudskim segmentima od 35V i 61J; SLIKA 4F pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih segmenata koji rezultuju ljudskim segmentima od 48V i 61J; i SLIKA 4G pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih segmenata koji rezultuju ljudskim segmentima od 54V i 61J. MAID se odnosi na ID broj modifikovanog alela.
SLIKA 5 pokazuje (ne u razmeri) jedno otelotvorenje strategije humanizacije mišjeg TCRα lokusa, u kojoj su ljudske TCR δ sekvence (TCRδ Vs, TCRδ Ds, TCRδ Js, TCRδ enh (poboljšivač) i TCRδ konstanta (C)) takođe smeštene u humanizovan TCRα lokus. Mišja sekvenca označena je zatvorenim simbolima; ljudska sekvenca označena je otvorenim simbolima. LTVEC se odnosi na veliki vektor ciljanja; hTRD=ljudski TCRδ.
SLIKA 6 pokazuje (ne u razmeri) opštu organizaciju mišjeg (gornji panel, prvi lokus, na hromozomu 6 miša) i ljudskog (gornji panel, drugi lokus, na ljudskom hromozomu 7) TCRβ lokusa. Donji panel ilustruje strategiju zamene segmenata TCRβ varijabilnog regiona u mišu (zatvoreni simboli) sa ljudskim TCRβ varijabilnim regionima (otvoreni simboli) na endogenom lokusu miša na mišjem hromozomu 6. Humanizovani TCRβ lokus koji ima ljudske Vβ, Dβ i Jβ segmente pokazan je sa konstantnim regionima miša i mišjim pojačivačima; u pokazanom otelotvorenju, humanizovani lokus zadržava mišje tripsinogen gene (puni pravougaonici); i u pokazanom konkretnom otelotvorenju, jedan pojedinačni mišji V segment se zadržava uzvodno od 5' mišjih tripsinogen gena.
SLIKA 7 pokazuje (ne u razmeri) progresivnu strategiju za humanizaciju TCRβ lokusa mišeg lokusa, gde se genski segmenti TCRβ varijabilnih regiona sekvencijalno dodaju u TCRβ varijabilni lokus. Mišja sekvenca označena je zatvorenim simbolima; ljudska sekvenca označena je otvorenim simbolima. MAID se odnosi na ID broj modifikovanog alela. TRBV ili TCRBV=TCRβ V segment.
SLIKA 8 je detaljni prikaz progresivne strategije humanizacije na TCRβ lokusu. SLIKA 8A pokazuje strategiju za brisanje mišjeg TCRβ V segmenta; SLIKA 8B pokazuje strategiju ubacivanja 14V segmenata u obrisani TCRβ lokus; SLIKA 8C pokazuje strategiju ubacivanja 2D i 14J segmenata u TCRβ lokus (i), nakon čega sledi brisanje loxP mesta (ii), što dovodi do ljudskih 14V, 2D i 14J segmenata; SLIKA 8D pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih V segmenata koji rezultuju ljudskim 40V, 2D i 14J segmentima; i SLIKA 8E pokazuje strategiju ubacivanja dodatnih ljudskih V segmenata koji rezultuju ljudskim 66V, 2D i 14J segmentima;
SLIKA 8F pokazuje zamenu mišjeg V segmenta nizvodno od poboljšivača miša, što rezultuje ljudskim 67V, 2D i 14J segmentima. U ovom konkretnom otelotvorenju jedan mišji V segment zadržava 5' mišjih tripsinogen gena.
SLIKA 9 pokazuje reprezentativne histograme FACS analize za procenat ćelija slezine (gde je Y osa broj ćelija, X osa je srednja vrednost intenziteta fluorescencije, i vrata pokazuju frekvenciju CD3+ T ćelija unutar populacije pojedinačnih limfocita) obojenih anti-CD3 antitelom u divljim tipovima (WT) miš; miš je homozigotan za obrisani TCRα lokus (prvi gornji panel; MAID 1540 na SLICI 3); miš je homozigotan za obrisani TCRα lokus i sadrži 8 ljudskih Vα i 61 ljudska Jα segmenata (drugi gornji panel, MAID 1767 od SLIKE 3 ili humanizovani TCRα miš); miš koji je homozigotan za obrisani TCRβ lokus, sa izuzetkom jednog uzvodnog i jednog mišjeg Vβ (prva donja tabla; MAID 1545 na SLICI 7); miš koji je homozigotan za obrisani TCRβ lokus sa jednim uzvodnim i jednim nizvodnim mišjim Vβ segmentom i koji sadrži 14 ljudskih Vβ, 2 ljudska Dβ i 14 ljudskih Jβ segmenata (drugi donji panel, MAID 1716 na SLICI 7 ili humanizovani TCRβ miš); i miš homozigotna i za TCRα i za TCRβ brisanja lokusa (sa izuzetkom pomenuta dva mišja Vβ segmenta) i koja obuhvata 8 ljudskih Vα i 61 ljudski Jα segment na endogenom TCRα lokusu kao i 14 ljudskih Vβ, 2 ljudska Dβ i 14 ljudskih Jβ segmenata na endogenim TCRβ lokusima (MAID 1767/1716 ili humanizovan TCRα/β miš).
SLIKA10 je reprezentativan FACS konturni grafik mišjih timuskih ćelija od WT, homozigotne humanizovane TCRα (1767 HO; hTCRα); homozigotna humanizovana TCRβ (1716 HO; hTCRβ); i homozigotni humanizovani TCRα/β miš (1716 HO 1767 HO; hTCRα/β) obojeni anti-CD4 (Y osa) i anti-CD8 (X osa) antitela (gornja ploča) i anti-CD44 (Y osa) i anti-CD25 (X osa) antitela (donja ploča). FACS grafik na vrhu panela omogućava razliku između dvostruko negativnih (DN), dvostruko pozitivnih (DP), CD4 jednostruko pozitivnih (CD4 SP) i CD8 jednostruko pozitivnih (SP CD8) T ćelija. FACS grafik u donjem panelu omogućava izdvajanje različitih faza dvostruko negativnih T ćelija tokom razvoja T ćelija (DN1, DN2, DN3 i DN4).
1716 i 1767 se odnose na MAID brojeve kao što je identifikovano na SLIKAMA 3 i 7.
SLIKA 11 pokazuje bilo frekvenciju (gornji panel) ili apsolutni broj (donji panel) DN, DP, CD4 SP i CD SP T ćelija u timusu bilo WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševa (n=4).
SLIKA 12 je reprezentativna FACS analiza ćelija slezine WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miša: levi panel predstavlja analizu a anti-CD19 antitela zasnovanog na singlet ćelijama (Y osa, mrlja za B limfocite) ili anti-CD3 antitela (X osa, mrlja za T limfocite); srednji panel predstavlja analizu CD3+ ćelija na osnovu anti-CD4 (Y osa) ili anti-CD8 (X osa) bojenja antitela; i desni pane predstavlja analizu CD4+ ili CD8+ ćelija na osnovu anti-CD44 (Y osa) ili anti-CD62L (X osa) bojenja antitela, mrlje omogućavaju da se razlikuju različite vrste T ćelija na periferiji (naivne T ćelije nasuprot centralnim memorijskim T ćelijama (Tcm) u odnosu na efektorske ili efektorske memorijske T ćelije (Teff/Tem)).
SLIKA 13 pokazuje broj CD4+ (levi panel) ili CD8+ (desni panel) T ćelija po slezini (Y os) WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševi (n=4).
SLIKA 14 pokazuje broj T naivnih, Tcm i Teff/em ćelija po slezini (Y ose) CD4+ (gornji panel) ili CD8+ (donji panel) T ćelije WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševi (n=4).
SLIKA 15 su tabele koje sumiraju eksprimiranje (utvrđeno FACS analizom pomoću varijabilnih segment-specifičnih antitela) različitih ljudskih TCRβ V segmenata u CD8+ T ćelijama slezine (SLIKA 15A) ili CD4+ T ćelijama (SLIKA 15B) WT, hTCRβ (1716 HO) ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševi. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SD (n=4 miša po grupi) SLIKA 16 pokazuje mRNK eksprimiranje (Y ose) različitih ljudskih TCRβ V segmenata prisutnih kod WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševa u timuskoj ili T ćeliji slezine; SLIKA 16A predstavlja analizu mRNK eksprimiranja ljudskog TCRβ varijabilnog segmenta (hTRBV) 18, 19, 20 i 24; i SLIKA 16B predstavlja analizu mRNK eksprimiranje hTRBV 25, 27, 28 i 29.
SLIKA 17 pokazuje reprezentativne FACS histograme ćelija slezine (gde je Y osa broj ćelija, X osa je srednja vrednost intenziteta fluorescencije, i vrata pokazuju frekvenciju CD3+ T ćelija unutar populacije pojedinačnih limfocite) obojene anti-CD3 antitelima kod WT miša, i homozigotnog miša za obrisani TCRα lokus (TCRα ΔV), homozigotnog miša za obrisani TCRα lokus sa 2 ljudska V segmenta i 61 ljudska J segmenata (TCRα 2 hV; MAID 1626 na SLICI 3), miš koji je homozigotan za obrisani TCRα lokus sa 8 ljudskih V segmenata i 61 ljudska J segmenata (TCRα 8 hV; MAID 1767 na SLICI 3), i homozigotnog miša za obrisani TCRα lokus sa 23 ljudska V segmenta i 61 ljudska J segmenta (TCRα 23 hV; MAID 1979 na Fig.3).
SLIKA 18, na gornjem levom panelu je reprezentativna FACS analiza CD3+ T ćelija timusa dobijenih od WT ili homozigotnog hTCRα miša sa 23 ljudska V segmenta i 61 ljudska J segmenta (1979 HO) obojena bilo sa anti-CD4 (Y osa) ili sa anti-CD8 (X osa) antitelima; na donjem levom panelu je FACS analiza DN T ćelija bilo od WT ili 1979 miša obojenog sa anti-CD44 (Y osa) ili anti-CD25 (X osa); Na desnom panelu su grafici procenta timocita (Y osa) koji su DN, DP, CD4 SP ili CD8 SP kod bilo WT ili 1979 HO miševa (n=4).
SLIKA 19, na levom panelu data je reprezentativna FACS analizu limfocita slezine bilo od WT ili 1979 HO miša obojenog bilo sa anti-CD19 ili anti-CD3 antitelima; na desnom panelu su grafici procenta splenocita (Y osa) dobijeni od WT i 1979 HO miševa (n=4) koji su CD3+.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Definicije
[0037] Ovaj pronalazak pruža genetski modifikovane glodare, npr. miševe ili pacove, koji eksprimiraju humanizovane receptore T ćelija. Predmetni pronalazak se odnosi i na genetski modifikovane glodare koji sadrže u svojoj germliniji nepreuređene varijabilne genske lokuse receptora T ćelija. Ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze koje se ovde koriste uključuju značenje koje ti izrazi i fraze imaju u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se izraz ili fraza koriste.
[0038] Izraz „konzervativno“, kada se koristi za opisivanje konzervativne aminokiselinske supstancije, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostacima koji ima grupu R bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Konzervativne aminokiselinske supstitucije se mogu postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede promena nukleotida koja će kodirati konzervativnu supstituciju. Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina od interesa, na primer, sposobnost T ćelije da prepozna peptid predstavljen pomoću molekula MHC. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatične bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izolevcin; alifatično-hidroksilne bočne lance kao serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance, kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance, kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance, kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kojih prirodnih ostataka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi u, na primer, mutagenezi skeniranja alaninom. U nekim otelotvorenjima se pravi konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici logaritamske verovatnoće obelodanjenoj u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima supstitucija je umereno konzervativna supstitucija u kojoj supstitucija ima negativnu vrednost u PAM250 matrici logaritamske verovatnoće.
[0039] Prema tome, pronalaskom je obuhvaćen genetski modifikovani glodar koji eksprimira humanizovane TCR α i β polipeptide (i/ili humanizovane TCR i TCRγ polipeptide) koji sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije u ovde opisanoj aminokiselinskoj sekvenci.
[0040] Stručnjak u oblasti bi shvatio da pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju humanizovane TCR α i β polipeptide koji su ovde opisani, zbog degeneracije genetskog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati polipeptide pronalaska. Zbog toga, pored genetski modifikovanog glodara koji sadrži u svom genomu nukleotidne sekvence koje kodiraju humanizovane TCR polipeptide koji su ovde opisani, dati su i glodari koji u svom genomu sadrže nukleotidne sekvence koje se razlikuju od onih koje su ovde opisane zbog degeneracije genetičkog koda.
[0041] Izraz „identičnost“ kada se koristi u vezi sa sekvencom obuhvata identičnost kao što je određeno većim brojem različitih algoritama poznatih u struci, koje se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotida i/ili aminokiseline. U nekim otelotvorenjima opisanim ovde, identičnosti se određuju koristeći ClustalW v. 1.83 (sporo) poravnanje open gap penalty od 10.0, extend gap penalty od 0.1, i koristeći Gonnet matricu sličnosti (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identičnosti sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identičnost se određuje upoređivanjem sekvence zrelog proteina od njegovog N-terminala do njegov C-terminala. U različitim otelotvorenjima, kada poredimo himernu ljudsku/ne-ljudsku sekvencu sa ljudskom sekvencom, ljudski deo himerne ljudske/ne-ljudske sekvence (ali ne i ne-ljudski deo) se koristi u upoređivanju u svrhu utvrđivanje nivoa identičnosti između ljudske sekvence i ljudskog dela himerne ljudske/ne-ljudske sekvence (npr. upoređivanje ljudskog ektodomena himernog ljudskog/mišjeg proteina sa ljudskim ektodomenom ljudskog proteina).
[0042] Izrazi „homologija“ ili „homologni“ u odnosu na sekvence, npr. sekvence nukleotida ili aminokiselina, označavaju dve sekvence koje su, nakon optimalnog poravnanja i poređenja, identične za najmanje oko 75% nukleotida ili aminokiselina, najmanje oko 80% nukleotida ili aminokiselina, najmanje oko 90-95% nukleotida ili aminokiselina, npr. više od 97% nukleotida ili aminokiselina. Stručnjak u oblasti bi shvatio kako bi, za optimalno ciljanje gena, ciljani konstrukt trebalo da sadrži krake homologne endogenim sekvencama DNK (tj., homologne krake); tako se može desiti homologna rekombinacija između konstrukta ciljanja i ciljane endogene sekvence.
[0043] Izraz „operativno povezani“ odnosi se na jednakost u kojoj su tako opisane komponente u odnosima koji dozvoljavaju da funkcionišu na svoj predviđen način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može se operativno povezati sa regulatornim sekvencama (npr., promoter, pojačivač, utišavač sekvencom itd.) kako bi zadržala odgovarajuću regulaciju transkripcije. Osim toga, različiti delovi humanizovanog proteina prema pronalasku mogu biti operativno povezani da zadrže odgovarajuće preklapanje, obradu, ciljanje, eksprimiranje i druge funkcionalne osobine proteina u ćeliji. Osim ako nije drugačije naznačeno, različiti domeni humanizovanog proteina pronalaska operativno su povezani jedni sa drugima.
[0044] Izraz „zamena“ u odnosu na zamenu gena odnosi se na postavljanje egzogenog genetskog materijala na endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje ceo ili deo endogenog gena sa ortolognom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. U jednom slučaju, endogeni ne-ljudski gen ili njegov fragment zamenjuje se odgovarajućim ljudskim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući ljudski gen ili njegov fragment je ljudski gen ili fragment koji je ortologan, homologan ili je u suštini identičan ili isti u strukturi i/ili funkciji, kao endogeni ne-ljudski gen ili njegov fragment koji se zamenjuje. Kao što je pokazano u dole navedenim primerima, nukleotidne sekvence endogenih ne-ljudskih TCR α i β varijabilnih genskih lokusa zamenjene su nukleotidnim sekvencama koje odgovaraju ljudskim TCR α i β varijabilnim genskim lokusima.
[0045] „Funkcionalno“, kad se ovde koristi, npr., u odnosu na funkcionalni protein, odnosi se na protein koji zadržava barem jednu biološku aktivnost koja je obično povezana sa prirodnim proteinom. Na primer, u nekim otelotvorenjima pronalaska, zamena kod endogenog lokusa (npr. zamena kod endogenih ne-ljudskih TCRα, TCRβ, TCRδ i/ili TCRγ varijabilnih genskih lokusa) dovodi do lokusa koji ne eksprimira funkcionalni endogeni protein.
[0046] TCR lokus ili TCR genski lokus (npr. TCRα lokus ili TCRβ lokus), kad se ovde koriste, odnose se na genomsku DNK koja obuhvata TCR region za kodiranje, uključujući i celi TCR region kodiranja, uključujući nepreuređenu V(D)J sekvencu, pojačivač, sekvencu, konstantnu sekvencu, i bilo koje uzvodne ili nizvodne (UTR, regulatorni regioni itd.), ili interferirajuće DNK sekvence (introni itd.). TCR varijabilni lokus ili TCR varijabilni genski lokus (npr. TCRα varijabilni genski lokus ili TCRβ varijabilni genski lokus) odnosi se na genomsku DNK koja obuhvata region koji uključuje segmente TCR varijabilnog regiona (V(D)J), ali isključuje konstantne sekvence TCR i, u različitim otelotvorenjima, sekvence pojačivača. Ostale sekvence mogu biti uključene u TCR varijabilni genski lokus u svrhu genetske manipulacije (npr., selektivne kasete, mesta za ograničavanje itd.), i one su obuhvaćene ovde.
Genetski modifikovane TCR životinje
[0047] U različitim otelotvorenjima, pronalazak generalno pruža genetski modifikovane glodare, gde životinje koje nisu ljudi sadrže u genomu nepreuređene humanizovane TCR varijabilne genske lokuse.
[0048] T ćelije vezuju epitope na malim antigenim determinantima na površini antigen-prezentujućih ćelija koje su povezane sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC, kod miševa) ili kompleksom ljudskog leukocitnog antigena (HLA, kod ljudi). T ćelije vezuju ove epitope preko kompleksa receptora T ćelija (TCR) na površini T ćelije. Receptori T ćelija su heterodimerne strukture sastavljene od dve vrste lanaca: lanac α (alfa) i β (beta), ili γ (gamma) i δ (delta) lanac. Lanac α je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar α lokusa (na hromozomu 14 čoveka ili miša), koja takođe obuhvata ceo δ lokus, i β lanac je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar β lokusa (na mišjem hromozomu 6 ili ljudskom hromozomu 7). Većina T ćelija ima αβ TCR; dok manjina T ćelija nosi γδ TCR. Interakcije TCRδ sa molekulima MHC klase I (prezentovanje CD8+ T ćelijama) i molekulima MHC klase II (prezentovanje CD4+ T ćelijama) prikazane su na SLICI 1 (zatvoreni simboli predstavljaju ne-ljudske sekvence, otvoreni simboli predstavljaju ljudske sekvence, pokazujući jednu posebno otelotvorenje TCR proteina iz ovog pronalaska).
[0049] α i β polipeptidi receptora T ćelija (i slično γ i δ polipeptidi) su međusobno povezani preko disulfidne veze. Svaki od dva polipeptida koji čine TCR sadrži ekstracelularni domen koji sadrži konstantne i varijabilne regione, transmembranski domen i citoplazmatski rep (transmembranski domen i citoplazmatski rep su takođe deo konstantnog regiona). Varijabilni region TCR određuje njegovu antigensku specifičnost, i slično imunoglobulinu, sastoji se od 3 regiona određivanja komplementarnosti (CDR). Takođe, slično genima imunoglobulina, varijabilni genski lokusi T receptora (npr. TCRα i TCRβ lokusi) sadrže niz nepreuređenih V(D)J segmenata (varijabla (V), spajanje (J) i TCRβ i δ, raznolikost D) segmenti). Tokom razvoja T ćelija u timusu, TCRα varijabilni genski lokus prolazi kroz preuređivanje, tako da je rezultujući TCR α lanac kodiran specifičnom kombinacijom VJ segmenata (Va/Ja sekvenca); i TCRβ varijabilni genski lokus podleže preuređenju, tako da je rezultujući TCR β lanac kodiran posebnom kombinacijom VDJ segmenta (Vβ/Dβ/Jβ sekvenca).
[0050] Interakcije sa timuskom stromom izazivaju timocite da prođu kroz nekoliko razvojnih faza, koje karakteriše eksprimiranje različitih markera ćelijske površine. Pregled karakterističnih markera ćelijske površine u različitim razvojnim stadijumima u timusu je pokazan u Tabeli 1. Preuređivanje na TCRβ varijabilnom genskom lokusu počinje na DN2 fazi i završava se tokom DN4 faze, dok se preuređivanje TCRα varijabilnog genskog lokusa javlja na DP fazi. Posle završetka preuređivanja TCRβ lokusa, ćelije eksprimiraju TCRβ lanac na ćelijskoj površini zajedno sa surogatnim α lancem, pTα. Pogledati, Janeway's Immunobiology, Chapter 7, supra.
Tabela 1: Razvojne faze T ćelija u timusu
[0051] Naivne CD4+ i CD8+ T ćelije izlaze iz timusa i ulaze u periferne limfoidne organe (npr. Slezinu) gde su izložene antigenima i aktiviraju se za klonsko širenje i diferenciraju u broj efektorskih T ćelija (Teff), npr. citotoksične T ćelije, TREGćelije, TH17 ćelije, TH1 ćelije, TH2 ćelije, itd. Nakon infekcije, broj T ćelija se istrajava kao memorijske T ćelije i klasifikovane su bilo kao centralne memorijske T ćelije (Tcm) ili T ćelije efektorske memorije (Tem). Sallusto i dr. (1999) Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions, Nature 401:708-12 i Commentary by Mackay (1999) Dual personality of memory T cells, Nature 401:659-60. Sallusto i kolege su predložili da, nakon inicijalne infekcije, Tem ćelije predstavljaju spremno raspoloživu bazu T ćelija sa pripojenim antigenom u perifernim tkivima sa efektorskim funkcijama, dok Tcm ćelije predstavljaju antigen-prajmovane memorijske T ćelije u perifernim limfoidnim organima koje nakon sekundarnog izazova mogu postati nove efektorske T ćelije. Dok sve memorijske T ćelije eksprimiraju CD45RO izoformu CD45 (naivne T ćelije eksprimiraju CD45RA izoformu), Tcm se karakterišu eksprimiranjem L-selektina (takođe poznatog kao CD62L) i CCR7+, koji su važni za vezivanje i signalizaciju u perifernim limfoidnim organima i limfnim čvorovima. Id. Prema tome, sve T ćelije pronađene u perifernim limfoidnim organima (npr. naivne T ćelije, Tcm ćelije, itd.) eksprimiraju CD62L. Pored CD45RO, poznate su sve memorijske T ćelije koje eksprimiraju niz različitih markera ćelijske površine, npr., CD44. Za sažetak različitih markera ćelijske površine na T ćelijama, pogledati Janeway's Immunobiology, Chapter 10, supra.
[0052] Dok TCR varijabilni domen funkcioniše prvenstveno u prepoznavanju antigena, ekstracelularni deo konstantnog domena, kao i transmembranski i citoplazmatski domeni TCRδ takođe služe važnim funkcijama. Kompletan kompleks TCR receptora zahteva više od α i β ili γ i δ polipeptida; potrebni dodatni molekuli uključuju CD3γ, CD3δ i CD3ε, kao i homodimer ζ lanca (ζζ). Po završetku TCRβ preuređenja, kada ćelije eksprimiraju TCRβ/pTα, ovaj pre-TCR kompleks postoji zajedno sa CD3 na ćelijskoj površini. TCRα (ili pTα) na ćelijskoj površini ima dva osnovna ostatka u svom transmembranskom domenu, od kojih jedan regrutuje CD3γε heterodimer, a drugi regrutuje zζ preko njihovih odgovarajućih kiselih ostataka. TCRβ ima dodatni osnovni ostatak u svom transmembranskom domenu za koji se veruje da regrutuje CD3DE heterodimer. Pogledati, na primer, Kuhns i dr. (2006) Deconstructing the Form and Function of the TCR/CD3 Complex, Immunity 24:133-39; Wucherpfennig i dr. (2009) Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140. Sklopljeni kompleks, koji sadrži TCRαβ heterodimer, CD3γε, CD3δε i ζζ, se eksprimira na površini T ćelija. Polarni ostaci u transmembranskom domenu su predloženi da služe kao kontrola kvaliteta za izlazni endoplazmatski retikulum; dokazano je da u odsustvu CD3 podjedinica, TCR lanci se zadržavaju u ER i ciljani su za degradaciju. Pogledati, na primer, Call and Wucherpfennig (2005) The T Cell Receptor: Critical Role of the Membrane Environment in Receptor Assembly and Function, Annu. Rev. Immunol.23:101-25.
[0053] CD3 i ζ lanci sklopljenog kompleksa pružaju komponente za TCR signalizaciju jer TCRαβ heterodimer (ili TCRγδ heterodimer) sam po sebi nema aktivnost prenosa signala. CD3 lanci imaju po jedan imuno-receptorski-tirozin-aktivacioni-Motif (ITAM), dok ζ lanac sadrži tri tandem ITAM-a. ITAM-i sadrže ostatke tirozina koji mogu biti fosforilovani pomoću povezanih kinaza. Dakle, sklopljeni TCR-CD3 kompleks sadrži 10 ITAM motiva. Pogledati, na primer, Love and Hayes (2010) ITAM-Mediated Signaling by the T-Cell Antigen Receptor, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:e002485.
Posle TCR angažovanja, ITAM motivi su fosforilisani iz Src porodice tirozin kinaza, Lck i Fyn, koji iniciraju signalnu kaskadu, što rezultuje aktivacijom Ras, mobilizacijom kalcijuma, aktinskim citoskeletnim preuređenjima i aktivacijom transkripcionih faktora, što na kraju dovodi do diferencijacije T ćelija, proliferacije i efektivne akcije. Id., Pogledati takođe, Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy i dr. eds., Garland Science, 2008.
[0054] Pored toga, TCRβ transmembranski i citoplazmatski domeni imaju ulogu u mitohondrijalnom ciljanju i indukciji apoptoze; zapravo, prirodno prisutni N-terminalno skraćeni TCRβ molekuli postoje u timocitima. Shani i dr. (2009) Incomplete T-cell receptor--β peptides target the mitochondrion and induce apoptosis, Blood 113:3530-41. Stoga, TCR konstantni region (koji u različitim otelotvorenjima sadrži deo ekstracelularnih, kao i transmembranskih i citoplazmatskih domena) služi nekoliko važnih funkcija; i različite aspekte struktura ovog regiona treba uzeti u obzir prilikom dizajniranja humanizovanih TCR ili genetski modifikovanih životinja koje nisu čovek koje ga eksprimiraju.
[0055] Transgeni miševi za preuređene sekvence receptora T ćelija su poznati u struci. Ovaj pronalazak se odnosi na genetski modifikovane glodare, npr. na pacove, miševe koji sadrže nepreuređene ljudske ili humanizovane T-ćelijske varijabilne genske lokuse, koji su sposobni za preuređivanje kako bi se formirale sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne domene ljudskog receptora T-ćelija, uključujući životinje koje sadrže T ćelije koje obuhvataju preuređene ljudske i ne-ljudske (npr. konstantne regione miša ili pacova) varijabilne regione. Ovaj pronalazak takođe pruža životinje koja nije čovek (npr., glodare, npr., pacove, miševe) koji su sposobni da generišu raznovrstan repertoar sekvenci varijabilnog regiona ljudskih receptora T ćelija; Prema tome, predmetni pronalazak pruža životinje koja nije čovek koje eksprimiraju TCR sa potpuno ljudskim varijabilnim domenima kao odgovor na antigen od interesa, i koji se vezuju za epitop antigena od interesa. U nekim otelotvorenjima pružene su životinje koje nisu čovek koje stvaraju različiti repertoar receptora T ćelija koji mogu reagovati sa različitim antigenom, uključujući, ali ne ograničavajući se na antigene koji predstavljaju APC.
[0056] U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža genetski modifikovane glodare, npr. pacove, miševe koji u svojim genomima sadrže nepreuređene segmente ljudskog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmenti), gde se nepreuređeni ljudski TCR varijabilni regioni zamenjuju kod endogenog glodarskog TCR varijabilnog genskog lokusa (npr. TCRα, β, δ i/ili γ varijabilni genski lokus), endogeni segmenti ne-ljudskog varijabilnog regiona. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni ljudski TCR varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni glodarski TCR varijabilni genski lokus.
[0057] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža genetski modifikovane glodare, npr. pacove, miševe koji u svojim genomima sadrže nepreuređene segmente ljudskog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmenti), gde su nepreuređeni segmenti ljudskog TCR varijabilnog regiona operativno povezani sa glodarskom sekvencom TCR gena konstantnog regiona, što rezultuje humanizovanim TCR lokusom, gde je humanizovani TCR lokus na mestu u genomu koji nije endogeni glodarski TCR lokus. Prema tome, u jednom otelotvorenju, takođe je pružen glodar, npr. miš, pacov koji sadrži transgen koji sadrži nepreuređeni segment ljudskog TCR varijabilnog regiona koji je operativno povezan sa sekvencom neljudskog TCR konstantnog regiona.
[0058] U jednom aspektu, genetski modifikovani glodari iz pronalaska sadrže u svom genomu segmente ljudskih TCR varijabilnih regiona, dok zadržavaju segmente glodarskih, npr. mišjih, pacovskih TCR konstantnih gena. U različitim otelotvorenjima, konstantni regioni obuhvataju transmembranski domen i citoplazmatski rep od TCR. Prema tome, u različitim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, genetski modifikovani glodari zadržavaju endogeni transmembranski domen TCG i citoplazmatski rep. U drugim otelotvorenjima, glodari obuhvataju ne-endogene glodarske konstantne genske sekvence, npr., glodarski ne-endogeni TCR transmembranski domen i citoplazmatski rep. Kao što je gore navedeno, konstantni region TCR učestvuje u signalnoj kaskadi koja se započinje tokom aktivacije T ćelija sa antigenom; stoga, endogeni TCR konstantni region stupa u interakciju sa različitim glodarskim sidrom i signalnim proteinima u T ćeliji. Tako, u jednom aspektu, genetski modifikovani glodari pronalaska eksprimiraju humanizovane receptore T ćelija koji zadržavaju sposobnost regrutovanja različitih endogenih ne-ljudskih sidra ili molekula za signalizaciju, npr. CD3 molekula (npr. CD3γ, CD3δ, CD3ε), ζ lanac, Lck, Fyn, ZAP-70 itd. Neograničavajuća lista molekula koja se regrutuju u TCR kompleks opisana je kod Janeway's Immunobiology, supra. Pored toga, slično VELOCIMMUNE® miševima koji pokazuju normalan razvoj B ćelija i normalne procese klonske selekcije za koje se veruje da su posledica barem delimično u rasporedu varijabilnih regiona kod endogenih mišjih lokusa i održavanja mišjih konstantnih domena, u jednom aspektu, glodari iz ovog pronalaska pokazuju normalan razvoj T ćelija i procese diferencijacije T ćelija.
[0059] U nekim otelotvorenjima je pružen glodar koji u svom genomu sadrži nepreuređene segmente ljudskih TCRα varijabilnih regiona, gde su nepreuređeni segmenti ljudskog TCRα varijabilnog regiona operativno povezani sa genskom sekvencom TCRα konstantnog regiona koja dovodi do humanizovanog TCRα lokusa. U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus je na mestu u genomu koji nije endogeni glodarski TCRα lokus. U drugom otelotvorenju, segmenti nepreuređenih ljudskih TCRα varijabilnih regiona zamenjuju segmente endogenih pacovskih TCRα varijabilnih regiona zadržavajući endogeni glodarski TCRα konstantni region. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni ljudski TCRα varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni glodarski TCRα varijabilni genski lokus. U nekim otelotvorenjima životinje zadržavaju endogeni TCRβ varijabilni region i genske sekvence konstantnog regiona. Prema tome, životinja eksprimira TCR koji sadrži ljudski/glodarski (tj., humanizovani) TCRα lanac i TCRβ lanac glodara.
[0060] U drugim otelotvorenjima pružen je glodar koji sadrži u svom genomu segmente nepreuređenog ljudskog TCRβ varijabilnog regiona, gde su segmenti nepreuređenog ljudskog TCRβ varijabilnog regiona operativno povezani sa genskom sekvencom glodarskog TCRβ konstantnog regiona, što rezultuje humanizovanim TCRβ lokusom. U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus je na mestu u genomu koji nije endogeni glodarski TCRβ lokus. U još jednom otelotvorenju, nepreuređeni segmenti ljudskog TCRβ varijabilnog regiona zamenjuju segmente endogenog glodarskog TCRβ varijabilnog regiona, i zadržavaju endogeni glodarski konstantni region TCRβ. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni ljudski TCRβ varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni TCRβ varijabilni genski lokus. U nekim otelotvorenjima životinje zadržavaju endogeni glodarski TCRα varijabilni region i genske sekvence konstantnog regiona. Prema tome, glodar eksprimira TCR koji sadrži himerni ljudski/glodarski (tj., humanizovani) TCRβ lanac i glodarski TCRα lanac.
[0061] U nekim konkretnim otelotvorenjima, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara, npr. miša ili pacova koji sadrži u svom genomu (a) nepreuređeni receptor T ćelija (TCR) α varijabilni genski lokus koji sadrži najmanje jedan ljudski Vα segment i najmanje jedan ljudski Jα segment, funkcionalno povezan sa endogenim glodarskim, npr. mišjim ili pacovskim TCRα konstantnim genskim sekvencama i/ili (b) nepreuređenim TCRβ varijabilnim genskim lokusom koji sadrži najmanje jedan ljudski Vβ segment, najmanje jedan ljudski Dβ segment, i najmanje jedan ljudski Jβ segment, funkcionalno povezan sa endogenim glodarskim, npr. mišjim ili pacovskim TCRβ konstantnim genskim sekvencama.
[0062] U različitim otelotvorenjima pronalaska, nepreuređeni ljudski ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus (npr., TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus genski lokus) se nalazi u germliniji glodara, npr. miša ili pacova. U različitim otelotvorenjima, zamene TCR V(D)J segmenata nepreuređenim ljudskim TCR V(D)J segmentima (npr. Vα i Jα, i/ili Vβ i Dβ i Jβ segmenti) su na endogenom TCR varijabilnom lokusu (ili lokusima), gde su nepreuređeni ljudski V i J i/ili V, D i J segmenti operativno povezani sa glodarskim TCR genom konstantnog regiona.
[0063] U nekim aspektima pronalaska, glodar sadrži dve kopije nepreuređenog ljudskog ili humanizovanog TCRα varijabilnog genskog lokusa i/ili dve kopije nepreuređenog ljudskog ili humanizovanog TCRβ varijabilnog genskog lokusa. Stoga, životinja glodar je homozigotna za jedan ili oba nepreuređena ljudska ili humanizovana TCRα i TCRβ varijabilna genska lokusa. U nekim aspektima pronalaska, glodar sadrži jednu kopiju nepreuređenog ljudskog ili humanizovanog TCRα varijabilnog genskog lokusa i/ili jednu kopiju nepreuređenog ljudskog ili humanizovanog TCRβ varijabilnog genskog lokusa. Prema tome, životinja glodar je heterozigotna za jedan ili oba nepreuređena ljudska ili humanizovana TCRα i TCRβ varijabilna genska lokusa.
[0064] U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus koji sadrži segmente ljudskog varijabilnog regiona (npr., ljudski Vα i Jα segmenti) postavlja se u genom glodara tako da segmenti ljudskog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće segmente varijabilnih regiona glodara. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus koji sadrži ljudske varijabilne regione zamenjuje endogeni TCRα varijabilni genski lokus. U jednom otelotvorenju, endogeni glodarski Vα i Jα segmenti nesposobni su da se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vα/Jα sekvenca. Tako, u jednom aspektu, ljudski Vα i Jα segmenti u nepreuređenom TCRα varijabilnom genskom lokusu mogu da se preurede da formiraju preuređenu ljudsku Vα/Jα sekvencu.
[0065] Slično tome, u jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži segmente ljudskog varijabilnog regiona (npr., ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti) postavlja se u genom glodara tako da segmenti ljudskog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće segmente varijabilnog regiona glodara. U jednom otelotvorenju, nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži ljudske varijabilne regione zamenjuje endogeni TCRβ varijabilni genski lokus. U jednom otelotvorenju, endogeni glodarski Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu sposobni da se preuređuju kako bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. Tako, u jednom aspektu, ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti u nepreuređenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu mogu da se preurede da formiraju preuređenu ljudsku Vαβ/Dβ/Jβ sekvencu.
[0066] U još jednom otelotvorenju, i nepreuređeni TCRα i β varijabilni geni lokusi koji sadrže ljudske varijabilne regione zamenjuju odgovarajuće endogene TCRα i β varijabilne genske lokuse. U jednom otelotvorenju, endogeni ne-ljudski Vα i Jα segmenti nisu sposobni da se preuređuju kako bi se formirala preuređena Vα/Jα sekvenca, i endogeni ne-ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu sposobni da se preurede kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. Prema tome, u jednom aspektu, ljudski Vα i Jα segmenti u nepreuređenom TCRα varijabilnom genusu mogu da se preurede da formiraju preuređenu ljudsku Vα/Jα sekvencu, i segmenti ljudskih Vβ, Dβ i Jβ u nepreuređenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu su sposobni da se preurede da formira preuređenu ljudsku Vαβ/Dβ/Jβ sekvencu.
[0067] U nekim aspektima pronalaska, glodar koji sadrži humanizovani TCRα i/ili TCRβ genski lokus (koji sadrži nepreuređeni TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus) zadržava endogeni TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus. U jednom otelotvorenju, endogeni glodarski TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus je nefunkcionalni lokus. U jednom otelotvorenju, nefunkcionalni lokus je inaktivirani lokus, npr. obrnuti lokus (npr. sekvenca nukleinske kiseline kodiranja varijabilnog genskog lokusa je u inverznoj orijentaciji u odnosu na sekvencu konstantnog regiona, tako da nikakvi uspešna preuređenja nisu moguća koristeći segmente varijabilnih regiona od obrnutog lokusa). U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus se postavlja između endogenog glodarskog TCRα i/ili TCRβ varijabilnog genskog lokusa i endogenog glodarskog TCRα i/ili TCRβ konstantnog genskog lokusa.
[0068] Broj, nomenklatura, položaj, kao i drugi aspekti V i J i/ili V, D i J segmenta TCR lokusa za ljude i miševe mogu se utvrditi korišćenjem IMGT baze podataka, dostupne na www.imgt.org. Mišji TCRα varijabilni lokus je približno 1,5 megabaza i sadrži ukupno 110Vα i 60 Jα segmenata (SLIKA 2). Ljudski TCRα varijabilni lokus je otprilike 1 megabaza i sadrži ukupno 54Vα i 61 Jα segmenata, sa 45Vα i 50Jα za koje se veruje da su funkcionalni. Osim ako nije drugačije naznačeno, brojevi ljudskih V(D)J segmenata navedeni u ovoj specifikaciji odnose se na ukupan broj V(D)J segmenata. U jednom otelotvorenju pronalaska, genetski modifikovani glodar, npr. miš ili pacov, sadrži najmanje jedan ljudski Vα i bar jedan ljudski Jα segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50, ili do 54 ljudskih Vα segmenata. U nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRα lokus sadrži 2, 8, 23, 35, 48 ili 54 ljudskih Vα segmenata. Tako, u nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRα lokus u glodaru može da sadrži 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% ljudskog Vα; u nekim otelotvorenjima može da sadrži oko 2%, oko 3%, oko 15%, oko 65%, oko 90%, ili 100% ljudskog Vα.
[0069] U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Vα40 do Vα41 (Vα segment se takođe naziva „TRAV“ ili „TCRαV“) i DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od 61 ljudskog Jα segmenta (Jα segment se takođe naziva „TRAJ“ ili „TCRαJ“). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od ljudskog TRAV35 do TRAV41 i DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od 61 ljudskog TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od ljudskog TRAV22 do TRAV41 i DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od 61 ljudskog TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od ljudskog TRAV13-2 do TRAV41 i DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od 61 ljudskih TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od ljudskog TRAV6 do TRAV41 i 61 ljudski TRAJ. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu od ljudskog TRAV1-1 do TRAV 41 i 61 ljudski TRAJ. U različitim otelotvorenjima DNK fragmenti koji sadrže susedne ljudske sekvence ljudskih TCRα varijabilnih regiona obuhvataju i restrikciona mesta enzima, selektivne kasete, mesta endonukleaza ili druge lokacije ubačene kako bi se olakšalo kloniranje i selekcija tokom procesa humanizacije. U različitim otelotvorenjima, ove dodatne lokacije ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr. preuređivanje, spajanje, itd.) različitih gena na TCRα lokusu.
[0070] U jednom aspektu, humanizovani TCRα lokus sadrži 61 ljudski Jα segment ili 100% od ljudskih Jα segmenata. U konkretnom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži 8 ljudskih Vα segmenata i 61 ljudski Jα segment; u drugom konkretnom aspektu, humanizovani TCRα lokus sadrži 23 ljudska Vα segmenta i 61 ljudski Jα segment. U drugom posebnom otelotvorenju, humanizovani TCRα lokus sadrži potpun repertoar ljudskih Vα i Jα segmenata, tj. sve ljudske varijabilne α region genske segmente kodirane od strane α lokusa ili 54 ljudskih Vα i 61 ljudski Jα segment. U različitim otelotvorenjima, životinja koja nije čovek ne sadrži bilo koji endogeni glodarski Vα ili Jα segment na TCRα lokusu.
[0071] Mišji TCRβ varijabilni lokus je približno 0,6 megabaza i sadrži ukupno 33 Vβ, 2 Dβ i 14 Jβ segmenata (SLIKA 6). Ljudski TCRβ varijabilni lokus je otprilike 0,6 megabaza i sadrži ukupno 67 Vβ, 2 Dβ i 14 Jβ segmenata. U jednom otelotvorenju pronalaska, genetski modifikovani glodar, npr. miš ili pacov, sadrži najmanje jedan ljudski Vβ, najmanje jedan ljudski Dβ i najmanje jedan ljudski Jα segment. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, 60 ili do ljudskih 67 Vβ segmenata. U nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRβ lokus obuhvata 8, 14, 40, 66 ili ljudskih 67 Vβ segmenata. Tako, u nekim otelotvorenjima, humanizovani TCRβ lokus u glodaru može da sadrži 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% od ljudskog Vβ; u nekim otelotvorenjima može sadržati oko 20%, oko 60%, oko 15%, oko 98% ili 100% od ljudskog Vβ.
[0072] U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Vβ18 do Vβ29-1 (Vβ segment se takođe naziva „TRBV“ ili „TCRBV“). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog TRBV18 do TRBV29-1, zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ1-Jβ1 (tj. ljudski Dβ1-Jβ1-1-Jβ1-6 segmenti) i zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ2-Jβ2 (tj. ljudske Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmente). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog TRBV6-5 do TRBV29-1, zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ1-Jβ1 (tj. ljudskog Dβ1 -Jβ1-1-Jβ1-6 segmenata) i zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ2-Jβ2 (tj. ljudski Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmenti). U jednom otelotvorenju, glodar sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog TRBV1 do TRBV29-1, zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ1-Jβ1 i zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ2-Jβ2. U jednom otelotvorenju, životinja koja nije čovek sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog TRBV1 do TRBV29-1, zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ1-Jβ1, zaseban DNK fragment koji sadrži susednu ljudsku sekvencu ljudskog Dβ2-Jβ2, i zaseban DNK fragment koji sadrži sekvencu ljudskog TRBV30. U različitim otelotvorenjima DNK fragmenti koji sadrže susedne ljudske sekvence segmenata ljudskog TCRβ varijabilnog regiona takođe obuhvataju restrikciona mesta enzima, selektivne kasete, lokacije endonukleaza ili druge lokacije ubačene kako bi se olakšalo kloniranje i selekcija tokom procesa humanizacije lokusa. U različitim otelotvorenjima, ove dodatne lokacije ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr. preuređivanje, spajanje, itd.) različitih gena na TCRβ lokusu.
[0073] U jednom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 ljudskih Jβ segmenta, ili 100% od ljudskih Jβ segmenta i 2 ljudska Dβ segmenta ili 100% ljudskih Jβ segmenta. U još jednom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus sadrži najmanje jedan ljudski Vβ segment, npr. 14 ljudskih Vβ segmenata, i sve mišje Dβ i Jβ segmente. U određenom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 ljudskih Vβ segmenata, 2 ljudska Dβ segmenta i 14 ljudskih Jβ segmenta. U još jednom konkretnom otelotvorenju, humanizovani TCRβ lokus sadrži potpun repertoar ljudskih Vβ, Dβ, i Jβ segmenata, tj. sve genske segmenata ljudskog varijabilnog β regiona kodiranog sa β lokusom ili 67 ljudskih Vβ, 2 ljudska Dβ i 14 ljudskih Jβ segmenata. U jednom otelotvorenju, glodar sadrži jedan (npr., 5') ne-ljudski Vβ segment na humanizovanom TCRβ lokusu. U različitim otelotvorenjima, glodar ne sadrži bilo koji endogeni ne-ljudski Vβ, Dβ ili Jβ segment na TCRβ lokusu.
[0074] U različitim otelotvorenjima, gde glodar sadrži repertoar ljudskih TCRα i TCRβ (i opciono ljudskih TCRδ i TCRγ) segmenata varijabilnog regiona (npr. potpun repertoar segmenata varijabilnog regiona), repertoar različitih segmenata (npr. potpun repertoar različitih segmenata) se koristi od strane životinje da generiše različiti repertoar TCR molekula za različite antigene.
[0075] U različitim aspektima, glodari sadrže susedne delove ljudskih genomskih TCR varijabilnih lokusa koji sadrže V, D i J ili D i J, ili V i J ili V segmente raspoređene kao u nepreuređenom ljudskom varijabilnom genskom lokusu, npr. koji sadrži promoterske sekvence, liderske sekvence, intergenske sekvence, regulatorne sekvence itd., raspoređene kao u ljudskom TCR varijabilnom genskom lokusu. U drugim aspektima, različiti segmenti su uređeni kao u nepreuređenom ne-ljudskom TCR varijabilnom genskom lokusu. U različitim otelotvorenjima humanizovanog TCRα i/ili β lokusa, humanizovani lokus može da sadrži dva ili više ljudskih genomskih segmenata koji se ne javljaju u ljudskom genomu koji mu je susedan, na primer, fragmentom V segmenta ljudskog V lokusa koji se nalazi u ljudskom genomu koji je u blizini konstantnog regiona, susedan sa fragmentom V segmenata ljudskog V lokusa koji se nalazi u ljudskom genomu na uzvodnom kraju ljudskog V lokusa.
[0076] I kod miša i kod čoveka, TCRδ genski segmenti se nalaze sa TCRα lokusom (pogledati Slike 2 i 5). TCRδ J i D segmenti se nalaze između Vα i Jα segmenata, dok su TCRδ V segmenti razbacani kroz TCRα lokus, gde se većina nalazi među različitim Vα segmentima. Broj i lokacije različitih TCRδ segmenata mogu se odrediti iz IMGT baze podataka. Zbog genomskog rasporeda TCRδ genskih segmenata unutar TCRα lokusa, uspešno preuređivanje u TCRα lokusu generalno briše TCRδ genske segmente.
[0077] U nekim aspektima pronalaska, glodar koji sadrži nepreuređeni ljudski TCRα varijabilni genski lokus takođe sadrži najmanje jedan ljudski Vδ segment, npr., do potpunog repertoara ljudskih Vδ segmenata. Prema tome, u nekim otelotvorenjima zamena endogenog TCRα varijabilnog genskog lokusa rezultuje zamenom bar jednog glodarskog Vδ segmenta sa ljudskim Vδ segmentom. U drugim otelotvorenjima, glodar pronalaska sadrži potpun repertoar ljudskih Vδ, Dδ i Jδ segmenata na nepreuređenom humanizovanom TCRα lokusu; u još nekim otelotvorenjima, glodar sadrži kompletan nepreuređeni ljudski TCRδ lokus na nepreuređenom humanizovanom TCRα lokusu (to jest, TCRδ lokus koji obuhvata segmente ljudskih varijabilnih regiona, kao i ljudski pojačivač i konstantni region). Primer otelotvorenja za konstrukt nepreuređenog humanizovanog TCRα lokusa koji sadrži kompletan nepreuređeni TCRδ lokus je pokazan na SLICI 5.
[0078] U još jednom otelotvorenju, glodar iz ovog pronalaska dalje sadrži nepreuređeni humanizovani TCRγ lokus, npr. TCRγ lokus koji sadrži najmanje jedan ljudski Vγ i bar jedan ljudski Jg segment (npr. potpun repertoar segmenata ljudskog Vy i ljudskog Jγ varijabilnog regiona). Ljudski TCRγ lokus je na ljudskom hromozomu 7, dok je mišji TCRγ lokus na mišjem hromozomu 13. Pogledati bazu podataka IMGT za više detalja o TCRγ lokusu.
[0079] U jednom aspektu, glodar, npr. miš ili pacov koji sadrži humanizovane TCRα i β varijabilne genske lokuse (i opciono humanizovane TCRδ/γ varijabilne genske lokuse) koji su ovde opisani, eksprimira humanizovani receptor T ćelija koji sadrži ljudski varijabilni region i ne-ljudski (npr. glodarski, npr. miš ili pacov) konstantni region na površini T ćelije. U nekim aspektima, životinja koja nije čovek je sposobna ili eksprimira raznovrsni repertoar humanizovanih receptora T ćelija koji prepoznaju različite predstavljene antigene.
[0080] Polipeptidi humanizovanog receptora T ćelija koji su ovde opisani obuhvataju ljudske liderske sekvence. U alternativnim otelotvorenjima, humanizovane sekvence nukleinske kiseline TCR receptora su dizajnirane tako da humanizovani TCR polipeptidi sadrže sekvence ne-ljudske liderske sekvence.
[0081] Humanizovani TCR polipeptidi koji se ovde opisuju mogu se eksprimirati pod kontrolom endogenih ne-ljudskih regulatornih elemenata (npr. regulatornih elemenata glodara), npr. promotera, prigušivača, poboljšivača itd. Humanizovani TCR polipeptidi koji se ovde opisuju mogu alternativno biti eksprimirani pod kontrolom ljudskog regulatornog elementa. U različitim otelotvorenjima, ovde opisani glodari obuhvataju sve regulatorne i druge sekvence koje se normalno nalaze in situ u ljudskom genomu.
[0082] U različitim otelotvorenjima, ljudski varijabilni region humanizovanog TCR proteina je sposoban da interakuje sa različitim proteinima na površini iste ćelije ili druge ćelije. U jednom otelotvorenju, ljudski varijabilni region humanizovanog TCR interakuje sa MHC proteinom (npr. proteini MHC klase I ili II) koji predstavljaju antigene na površini druge ćelije, npr., ćelije koja predstavlja antigen (APC). U nekim otelotvorenjima, MHC I ili II protein je ne-ljudski (npr., glodarski, npr., miš ili pacov) protein. U drugim otelotvorenjima, MHC I ili II protein je ljudski protein. U jednom otelotvorenju, druga ćelija, npr. APC, je endogena ne-ljudska ćelija koja eksprimira ljudski ili humanizovani MHC molekul. U drugom otelotvorenju, druga ćelija je ljudska ćelija koja eksprimira ljudski MHC molekul.
[0083] U jednom aspektu, glodar eksprimira humanizovan receptor T ćelija sa ne-ljudskim konstantnim regionom na površini T ćelije, gde je receptor sposoban da interakuje sa ne-ljudskim molekulima, npr. sidro ili signalnim molekulima eksprimiranim u T ćelijama (npr. CD3 molekuli, ζ lanac ili drugih proteina usidreni na TCR kroz CD3 molekule ili ζ lanac).
[0084] Prema tome, ćelijski kompleks je ovde obelodanjen, i sadrži glodarsku T-ćeliju koja eksprimira TCR koji sadrži humanizovani TCRα lanac kao što je ovde opisano i humanizovani TCRβ lanac kao što je ovde opisano, i glodarsku ćeliju koja predstavlja antigen koji sadrži antigen vezan za MHC I ili MHC II. U jednom otelotvorenju, konstantni TCRα i TCRβ lanci kompleksirani su sa glodarskim zeta (ζ) lančanim homodimerom i CD3 heterodimerima. U jednom otelotvorenju, ćelijski kompleks je in vivo ćelijski kompleks. U jednom otelotvorenju, ćelijski kompleks je in vitro ćelijski kompleks.
[0085] Genetski modifikovani glodar može biti izabran iz grupe koja se sastoji od miša, pacova.
[0086] Genetski modifikovana životinja je glodar. U jednom otelotvorenju, glodar se bira od miša, pacova i hrčka. U jednom otelotvorenju, glodar je odabran iz superfamilije Muroidea. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovana životinja je iz porodice izabrane od Calomyscidae (npr. hrčci slični miševima), Cricetidae (npr. hrčak, pacovi i miševi novog sveta, voluharice), Muridae (pravi miševi i pacovi, pustinjski pacovi, grivasti pacovi), Nesomyidae (penjući miševi, stenoviti miša, belorepi pacovi, Malagasy pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr. bdljikavi miševi) i Spalacidae (npr. slepo kuče, bambusovi pacovi i zokori). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani glodar je izabran od istinskog miša ili pacova (familija Muridae), gerbila, bodljikavog miša i grivastog pacova. U jednom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je član familije Muridae. U jednom otelotvorenju, životinja je glodar. U specifičnom otelotvorenju, glodar se bira od miša i pacova. U jednom otelotvorenju, životinja koja nije čovek je miš.
[0087] U specifičnom otelotvorenju, životinja koja nije čovek je glodar koji je miš C57BL linije odabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U još jednom otelotvorenju, miš je 129 linija odabrana iz grupe koja se sastoji od linije koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr.
129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (pogledati, npr. Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, pogledati takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je mešavina pomenute 129 linije i pomenute C57BL/6 linije. U još jednom specifičnom otelotvorenju, miš je mešavina pomenute 129 linije ili mešavina pomenute BL/6 linije. U specifičnom otelotvorenju, 129 linija je mešavina 129S6 (129/SvEvTac) linije. U još jednom otelotvorenju, miš je BALB linija, npr., BALB/c linija. U još jednom otelotvorenju, miš je mešavina BALB linije i još jedne pomenute linije.
[0088] U jednom otelotvorenju, životinja koja nije čovek je pacov. U jednom otelotvorenju, pacov je izabran od Wistar pacova, LEA linija, Sprague Dawley linija, Fischer linija, F344, F6 i Dark Agouti. U jednom otelotvorenju, linija pacova je mešavina dve ili više linije odabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
[0089] Prema tome, u jednom otelotvorenju pronalazak pruža genetski modifikovanog miša koji u svom genomu sadrži nepreuređeni ljudski ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus, npr. TCRα, TCRβ, TCRδ i/ili TCRγ varijabilni genski lokus. U nekim otelotvorenjima, nepreuređeni ljudski ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni TCR varijabilni genski lokus. U drugim otelotvorenjima, nepreuređeni ljudski ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus nalazi se na mestu u genomu, različitom od odgovarajućeg endogenog mišjeg TCR lokusa. U nekim otelotvorenjima, ljudski ili humanizovani nepreuređeni TCR varijabilni genski lokus je operativno povezan sa mišjim TCR konstantnim regionom.
[0090] U jednom otelotvorenju, pružen je genetski modifikovani miš, gde miš u svom genomu sadrži nepreuređeni varijabilni genski lokus receptora T ćelija (TCR) α koji sadrži najmanje jedan ljudski Jα segment i najmanje jedan ljudski Vα segment, operativno povezan sa mišjom TCRα konstantnom genskom sekvencom i nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži barem jedan ljudski Jβ segment, najmanje jedan ljudski Dβ segment i najmanje jedan ljudski Vβ segment operativno povezan sa mišjom TCRβ konstantnom genskom sekvencom. U jednom specifičnom otelotvorenju, miš sadrži u svom genomu nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus koji sadrži potpun repertoar ljudskih Jα segmenata i potpun repertoar ljudskih Vα segmenata, operativno povezan sa mišjom TCRα konstantnom genskom sekvencom i nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži potpun repertoar ljudskih Jβ segmenata, potpun repertoar ljudskih Dβ segmenata i potpun repertoar ljudskih Vβ segmenata, operativno povezanih sa mišjim TCRβ konstantnim genskim sekvencama.
[0091] U nekim otelotvorenjima, nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus koji sadrži segmente ljudskih TCRα varijabilnih regiona zamenjuje endogeni TCRα varijabilni genski lokus i nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji obuhvata segmente ljudskih TCRβ varijabilnih regiona zamenjuje endogeni mišji TCRβ varijabilni genski lokus. U nekim otelotvorenjima, endogeni Vα i Jα segmenti nisu sposobni da se preurede kako bi se formirala preuređena Va/Ja sekvenca, i endogeni Vβ, Dβ i Jβ segmenti miša nisu sposobni da se preurede kako bi se formirala preuređena Vβ/Dβ/Jβ sekvenca. U nekim otelotvorenjima, ljudski Vα i Jα segmenti su preuređeni kako bi se formirala preuređena ljudska Va/Ja sekvenca, i ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti su preuređeni kako bi se formirala preuređena ljudska Vβ/Dβ/Jβ sekvenca.
[0092] U različitim otelotvorenjima, glodari, npr. miševi ili pacovi koji su ovde opisani, proizvode T-ćelije koji su u stanju da se podvrgnu timusnom razvoju, napredujući od DN1 do DN2 do DN3 do DN4 do DP i do CD4 ili CD8 SP T ćelija. Takve T ćelije glodara pronalaska eksprimiraju molekule ćelijskih površina koji se obično proizvode od strane T ćelije tokom određene faze razvoja timusa (npr. CD25, CD44, Kit, CD3, pTα itd.). Prema tome, glodari koji su ovde opisani eksprimiraju pTα kompleksirane sa TCRβ na DN3 stadijumu timusnog razvoja. Glodari koji su ovde opisani eksprimiraju T ćelije sposobne za podvrgavanje timuskom razvoju kako bi proizvele CD4+ i CD8+ T ćelije. Normalno, u timusu je fiziološki odnos CD4+ i CD8+ T ćelija između oko 2:1 i 3:1. Pogledati, na primer, Ge and Stanley (2008) The O-fucose glycan in the ligand-binding domain of Notch 1 regulates embryogenesis and T cell development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1539-44. Prema tome, u jednom otelotvorenju, ovde opisani glodari proizvode CD4+ i CD8+ T ćelije u timusu u odnosu od oko 2:1 do 3:1 (CD4+: CD8+).
[0093] U različitim otelotvorenjima, ovde opisani glodari proizvode T-ćelije koje su sposobne da prolaze kroz normalnu diferencijaciju T ćelija na periferiji. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani glodari mogu da proizvedu normalan repertoar efektorskih T ćelija, npr. CTL (citotoksični T limfociti), TH1, TH2, TREG, TH17, itd. U ovim otelotvorenjima, ovde opisani glodari generišu efektorske T ćelije koje ispunjavaju različite funkcije tipične za određeni tip T ćelije, npr. prepoznaje, vezuje i reaguje na strane antigene. U različitim otelotvorenjima, ovde opisani glodari proizvode efektorske T ćelije koje ubijaju ćelije koje pokazuju peptidne fragmente citosolnih patogena eksprimiranih u kontekstu MHC I molekula; prepoznaje peptide izvedene iz antigena degradiranih u intracelularnim vezikulama i predstavljene od strane MHC II molekula na površini makrofaga i indukuju makrofage kako bi ubili mikroorganizme; proizvode citokine koji predvode B ćelijsku diferencijaciju; aktiviraju B ćelije za proizvodnju opsonizujućih antitela; indukuju epitelne ćelije kako bi proizvele hemokine koje regrutuju neutrofile na mesta infekcije; itd.
[0094] U dodatnim otelotvorenjima, ovde opisani glodari sadrže normalan broj CD3+ T ćelija na periferiji, npr., u slezini. U nekim otelotvorenjima, procenat perifernih CD3+ T ćelija u glodarima koji su ovde opisani, može se uporediti sa životinjama divljeg tipa (tj. životinje koje sadrže sve endogene segmente TCR varijabilnog regiona). U jednom otelotvorenju, ovde opisani glodari obuhvataju normalni odnos CD3+ T ćelija slezine i ukupnih splenocita.
[0095] U drugim aspektima, ovde opisani glodari mogu da generišu populaciju memorijskih T ćelija u odgovoru antigen od interesa. Na primer, glodari generišu i centralne memorijske T ćelije (Tcm) i efektorske memorijske T ćelije (Tem) za antigen, npr. antigen od interesa (npr. antigen koji se testira za razvoj vakcine itd.).
[0096] DN1 i DN2 ćelije koje ne primaju dovoljno signala (npr. Notch signali) mogu se razviti u B ćelije, mijelodne ćelije (npr., dendritičke ćelije), mastocite i NK ćelije. Pogledati, na primer, Yashiro-Ohtani i dr. (2010) Notch regulation of early thymocyte development, Seminars in Immunology 22:261-69. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani glodari razvijaju normalni broj B ćelija, mijeloidne ćelije (npr., dendritičke ćelije), mastocite i NK ćelije. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani glodari razvijaju normalnu populaciju dendritičnih ćelija u timusu.
[0097] Preovlađujući tip receptora T ćelija, eksprimiran na površini T ćelija, je TCRα/β, gde manjina ćelija eksprimira TCRδ/γ. U nekim otelotvorenjima pronalaska, T ćelije glodara koje sadrže humanizovane TCRα i/ili β lokuse pokazuju normalno korišćenje TCRα/β i TCRδ/γ lokusa, npr. korišćenje TCRα/β i TCRδ/γ lokusa koji je sličan životinji divljeg tipa (npr. T ćelije glodara opisane ovde eksprimiraju TCRα/β i TCRδ/γ proteine u uporedivim proporcijama sa onima eksprimiranim od strane životinja divljeg tipa). Tako, u nekim otelotvorenjima, glodari koji sadrže humanizovane TCRα/β i endogeni ne-ljudske TCRδ/γ lokuse pokazuju normalno korišćenje svih lokusa.
[0098] Pored genetski konstruisanih životinja koje nisu čovek opisanih ovde, takođe je opisan ne-ljudski embrion (npr. embrion glodara, npr. mišji ili pacovski embrion), gde embrion sadrži donorsku ES-ćeliju koja je izvedena iz životinje koja nije čovek (npr. glodar, npr. miš ili pacov) kako je ovde opisano. Embrion može da sadrži ES donorsku ćeliju koja sadrži nepreuređeni humanizovani TCR lokus i ćelije embrionskih domaćina.
[0099] Takođe je obelodanjeno tkivo, gde je tkivo izvedeno od životinje koja nije čovek (npr. miš ili pacov) kako je ovde opisano i eksprimira humanizovani TCR polipeptid (npr. TCRα i/ili TCRβ ili TCRδ i/ili TCRγ polipeptid).
[0100] Pored toga, obelodanjena je ne-ljudska ćelija izolovana od životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ćelija je ES ćelija. U jednom otelotvorenju, ćelija je T ćelija. U jednom otelotvorenju, T ćelija je CD4+ T ćelija. U drugom otelotvorenju, T ćelija je CD8+ T ćelija.
[0101] Takođe je obelodanjena ne-ljudska ćelija koja sadrži hromozom ili njegov fragment životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ne-ljudska ćelija sadrži jedro životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ne-ljudska ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog transfera.
[0102] Takođe je obelodanjena ne-ljudska ćelija koja eksprimira TCR protein koji sadrži ljudski varijabilni region i ne-ljudski konstantni region. TCR protein može sadržati TCRα, TCRβ ili njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, ćelija je T ćelija, npr., CD4+ ili CD8+ T ćelija.
[0103] Obelodanjena je pluripotentna ćelija ne-ljudski indukovana, koja sadrži nepreuređeni humanizovani TCR lokus koji kodira humanizovani TCR polipeptid kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, indukovana pluripotentna ćelija izvedena je iz životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano.
[0104] Hibridom ili kvadrom je obelodanjen, izveden iz ćelije životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, životinja koja nije čovek je glodar, na primer, miš ili pacov.
[0105] Ovde je obelodanjen postupak za izradu genetski modifikovane životinje koja nije čovek (npr. glodar, npr. miš ili pacov) koji je ovde opisan. Postupak za stvaranje genetski modifikovane životinje koja nije čovek rezultuje u životinji čiji genom obuhvata humanizovani nepreuređeni TCR lokus (npr., humanizovani nepreuređeni TCRα, TCRβ, TCRδ i/ili TCRγ lokus). U jednom otelotvorenju, dat je postupak za stvaranje genetski modifikovane ne-ljudske životinje (npr. glodara, npr. miša ili pacova) koji eksprimira receptor T ćelija koji sadrži ljudski varijabilni region i ne-ljudski (npr. glodarski, npr. miš ili pacova) konstantni region na površini T ćelije, gde postupak obuhvata zamenu u prvoj životinji koja nije čovek endogenog ne-ljudskog TCRα varijabilnog genskog lokusa sa nepreuređenatim humanizovanim TCRα varijabilnim genskim lokusom koji sadrži najmanje jedan ljudski Vα segment i najmanje jedan ljudski Jα segment, gde je humanizovani TCRα varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim TCRα konstantnim regionom; zamenu u drugoj životinji koja nije čovek endogenog ne-ljudskog TCRβ varijabilnog genskog lokusa sa nepreuređenim humanizovanim TCRβ varijabilnim genskim lokusom koji sadrži najmanje jedan ljudski Vβ segment, jedan ljudski Dβ segment i jedan ljudski Jβ segment, gde je humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim TCRβ konstantnim regionom; i uzgajanje prve i druge životinje koja nije čovek, kako bi se dobila životinja koja nije čovek koji eksprimira receptor T ćelije koji sadrži ljudski varijabilni region i ne-ljudski konstantni region. U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža postupak za proizvodnju genetski modifikovane životinje koja nije čovek čiji genom sadrži humanizovani nepreuređeni TCRα lokus, ili životinje koja nije čovek čiji genom sadrži humanizovani nepreuređeni TCRβ lokus, generisan prema postupcima opisanim ovde. U različitim otelotvorenjima zamene se prave na endogenim lokusima. U nekim otelotvorenjima, postupak koristi jedan ili više konstrukata ciljanja napravljenih pomoću VELOCIGENE® tehnologije, uvođenje konstrukata u ES ćelije i uvođenje ciljanih klonova ES ćelija u embrion miša koristeći VELOCIMOUSE® tehnologiju, kako je opisano u Primerima. U nekim otelotvorenjima ES ćelije potiču iz miša koji je mešavina 129 i C57BL/6 linija. U različitim otelotvorenjima, postupak obuhvata progresivnu strategiju humanizacije, gde se konstrukt koji sadrži dodatne varijabilne regione uvodi u ES ćelije na svakom sledećem koraku humanizacije, što na kraju rezultuje mišem koji sadrži potpun repertoar segmenata ljudskog varijabilnog regiona (pogledati, na primer, SLIKA 3 i 7).
[0106] Prema tome, obelodanjeni su i nukleotidni konstrukti koji se koriste za generisanje genetski dizajniranih životinja koje nisu čovek koje su opisane ovde. Nukleotidni konstrukt može sadržati: 5' i 3' homologne krake, ljudski DNK fragment koji obuhvata ljudski segment TCR varijabilnog regiona i selekcionu kasetu na kojoj se nalaze mesta rekombinacije. Ljudski DNK fragment može biti TCRα genski fragment i može sadržati bar jedan segment ljudskog TCRα varijabilnog regiona. Ljudski DNK fragment može biti TCRβ fragment i može sadržati bar jedan genski segment ljudskog TCRβ varijabilnog regiona. Najmanje jedan krak homologije može biti ne-ljudski krak homologije, i može biti homologan ne-ljudskom TCR lokusu (npr., ne-ljudski TCRα ili TCRβ lokus).
[0107] Selekciona kaseta je nukleotidna sekvence umetnuta u konstrukt ciljanja radi olakšavanja selekcije ćelija (npr., ES ćelija) koje su integrisale konstrukt od interesa. U struci je poznato nekoliko odgovarajućih selekcionih kaseta. Uobičajeno, selekciona kaseta omogućava pozitivni izbor u prisustvu određenog antibiotika (npr., Neo, Hyg, Pur, CM, Spec, itd.). Pored toga, selekciona kaseta može biti okrenuta mestima rekombinacije, koja omogućavaju brisanje kasete za selekciju nakon tretmana sa enzimima rekombinaze. Najčešće korišćene lokacije za rekombinaciju su IoxP i Frt, koje prepoznaju Cre i Flp enzimi, respektivno, ali druge su poznate u struci.
[0108] U jednom otelotvorenju, selekciona kaseta se nalazi na 5' kraju ljudskog DNK fragmenta. U još jednom otelotvorenju, selekciona kaseta se nalazi na 3' kraju ljudskog DNK fragmenta. U još jednom otelotvorenju, selekciona kaseta se nalazi unutar ljudskog DNK fragmenta, npr. unutar ljudskog introna. U još jednom otelotvorenju, selekciona kaseta nalazi se na spoju DNK ljudskog i mišjeg fragmenta.
[0109] Različiti primeri otelotvorenja strategije ciljanja za stvaranje genetski konstruisanih životinja koje nisu čovek, konstrukti i vektori ciljanja koji se koriste za njih, prikazani su na SLICI 3, 4, 5, 7 i 8.
[0110] Po završetku ciljanja gena, ES ćelije, ili genetski modifikovane životinje koje nisu čovek, su skriningovane kako bi se potvrdilo uspešno inkorporiranje egzogene nukleotidne sekvence od interesa ili eksprimiranje egzogenog polipeptida (npr., segmenti varijabilnog regiona ljudskog TCRδ). Brojne tehnike su poznate stručnjacima i uključuju (ali se ne ograničavaju na) Southern blotting, dugotrajni PCR, kvantitativni PCT (npr., PCR u realnom vremenu koristeći TAQMAN®), fluorescenciju in situ hibridizaciju, Northern blotting, protočnu citometriju, Western analiza, imunocitohemiju, imunohistohemiju itd. U jednom primeru, životinje koje nisu čovek (npr. miševi) sa genetskom modifikacijom od interesa mogu se identifikovati skriningom za gubitak mišjeg alela i/ili dobitka ljudskog alela koristeći testa modifikacije alela opisan u Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.
21(6):652-659. Ostali testovi koji identifikuju specifičnu sekvencu nukleotida ili aminokiselina u genetski modifikovanim životinjama su poznati stručnjacima.
[0111] Obelodanjenje takođe pruža postupak modifikacije TCRα varijabilnog genskog lokusa (npr., TCRα, TCRα, TCRδ i/ili TCRγ genskog lokusa) životinje koji nije čovek da eksprimira humanizovani TCR protein koji je ovde opisan. U jednom otelotvorenju pronalazak pruža postupak modifikacije TCR varijabilnog gena za eksprimiranje humanizovanog TCR proteina na površini T ćelije, gde postupak sadrži zamenu u životinji koja nije čovek endogenog ne-ljudskog TCR varijabilnog genskog lokusa sa nepreuređenim humanizovanim TCR varijabilnim genskim lokusom. U jednom otelotvorenju gde je TCR varijabilni genom lokus TCRα varijabilni genski lokus, nepreuređeni humanizovani TCR varijabilni genski lokus sadrži najmanje jedan ljudski Vα segment i najmanje jedan ljudski Jα segment. U jednom otelotvorenju gde je TCR varijabilni genski lokus TCRβ varijabilni genski lokus, nepreuređeni humanizovani TCR varijabilni genski lokus sadrži najmanje jedan ljudski Vβ segment, najmanje jedan ljudski Dβ segment i najmanje jedan ljudski Jβ segment. U različitim otelotvorenjima, nepreuređeni humanizovani TCR varijabilni genski lokus je operativno povezan sa odgovarajućim endogenim konstantnim regionom koji nije ljudski.
[0112] Takođe je pružen humanizovani TCR protein koji je napravljen od strane životinje koja nije čovek (npr., glodar, npr., miš ili pacov) kako je ovde opisano, gde humanizovani TCR protein sadrži ljudski varijabilni region i ne-ljudski konstantni region. Prema tome, humanizovani TCR protein sadrži ljudske regione za određivanje komplementarnosti (tj. ljudski CDR1, 2 i 3) u svojom varijabilnom domenu i ne-ljudskom konstantnom regionu.
[0113] Iako navedeni primeri opisuju genetski konstruisanu ne-ljudsku životinju čiji genom obuhvata humanizovani TCRα i/ili humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus, stručnjak u oblasti će shvatiti da se slična strategija može koristiti za proizvodnju genetski modifikovanih životinja čiji genom obuhvata humanizovani TCRδ i/ili TCRγ varijabilni genski lokus. Takođe je obelodanjena genetski konstruisana ne-ljudska životinja sa humanizacijom sva četiri TCR varijabilnih genskih lokusa.
Upotreba genetski modifikovanih TCR životinja
[0114] U različitim otelotvorenjima, genetski modifikovani glodari pronalaska proizvode T ćelije sa humanizovanim TCR molekulima na svojoj površini, i kao rezultat toga bi prepoznali peptide koji su im predstavljeni od strane MHC kompleksa na ljudski način. Genetski modifikovani glodari koji su ovde opisani mogu se koristiti za proučavanje razvoja i funkcije ljudskih T ćelija i procesa imunološke tolerancije; da testiraju kandidate za ljudsku vakcinu; da generišu TCR sa određenim specifičnostima za TCR genu terapiju; da generišu TCR biblioteke za antigene povezane sa bolestima (npr. antigeni povezani sa tumorom (TAA) itd.
[0115] Postoji rastuće interesovanje za terapiju T ćelijama u struci, jer T ćelije (npr. citotoksične T ćelije) mogu biti usmerene da napadaju i dovedu do uništavanja antigena od interesa, npr. virusnog antigena, bakterijskog antigena, tumorskog antigena i sl., ili ćelija koje ga predstavljaju. Inicijalne studije u terapiji kancera T ćelijama usmerene su na izolaciju limfocita infiltriranih tumora (TIL, populacije limfocita u masi tumora koja verovatno sadrži T ćelije reaktivne protiv tumorskih antigena) iz mase ćelija tumora, njihovo proširivanje in vitro koristeći faktore rasta T ćelija, i prenošenje na pacijenta u procesu koji se naziva adoptivni transfer T ćelija. Pogledati, npr, Restifo i dr. (2012) Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews 12:269-81; Linnermann i dr. (2011) T-Cell Receptor Gene Therapy: Critical Parameters for Clinical Success, J. Invest. Dermatol. 131:1806-16. Međutim, uspeh ovih terapija do sada je bio ograničen na melanom i karcinom bubrežnih ćelija; i TIL adoptivni transfer nije posebno usmeren na definisane antigene povezane sa tumorom (TAA). Linnermann i dr., supra.
[0116] Učinjeni su pokušaji da se inicira TCR genska terapiju gde su T ćelije ili odabrane ili programirane kako bi ciljale antigen od interesa, npr. TAA. Trenutna TCR genska terapija se oslanja na identifikaciju TCRδ sekvenci koje su usmereni na specifične antigene, npr. antigene povezane sa tumorom. Na primer, Rosenberg i saradnici su objavili su nekoliko studija u kojima su transdukovali limfocite periferne krvi, izvedene iz pacijenta sa melanomom, genom koji kodira TCRα i β lance specifične za epitope MART-1, povezane sa melanomom, i koristili proširene limfocite za adoptivnu terapiju T ćelijama. Johnson i dr. (2009) Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen, Blood 114:535-46; Morgan i dr. (2006) Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science 314:126-29. MART-1 specifični TCR izolovani su od pacijenata koji su imali regresiju tumora nakon TIL terapije. Međutim, identifikaciju takvih TCR, posebno TCR sa visokim aviditetom (koji je najverovatnije terapijski koristan), komplikuje činjenica da većina tumorskih antigena predstavljaju sopstvene antigene, i TCR koji ciljaju na ove antigene često su ili obrisani ili imaju suboptimalni afinitet, prvenstveno zbog imunološke tolerancije.
[0117] U različitim otelotvorenjima, ovaj pronalazak rešava ovaj problem pružanjem genetski dizajniranih glodara koji u svom genomu sadrže nepreuređeni ljudski TCR varijabilni genski lokus. Ovde opisan glodar sposoban je da generiše T ćelije sa različitim repertoarima humanizovanih receptora T ćelija. Prema tome, ovde opisani glodari mogu biti izvor raznovrsnog repertoara humanizovanih receptora T ćelija, npr. humanizovanih receptora T ćelija za primenu u adoptivnom prenosu T ćelija.
[0118] Prema tome, u jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak pruža postupak generisanja receptora T ćelija za ljudski antigenu, i obuhvata imunizaciju glodara, npr. miša ili pacova koji je ovde opisan, sa antigenom od interesa, što omogućava glodaru da razvije imuni odgovor, izolovanje od životinje aktiviranu T ćeliju sa specifičnošću za antigen od interesa, i određivanje sekvence nukleinske kiseline receptora T ćelija eksprimiranog antigen-specifičnom T ćelijom.
[0119] U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža postupak za proizvodnju ljudskog receptora T ćelija specifičnog za antigen od interesa (npr., antigen povezan sa bolestima) koji obuhvata imunizaciju glodara koji je ovde opisan sa antigenom od interesa; dozvoljavajući životinjama da uspostave imuni odgovor; izolovanje od životinje T ćeliju reaktivnu na antigen od interesa; određivanje sekvence nukleinske kiseline ljudskog TCR varijabilnog regiona eksprimiranog od strane T ćelije; kloniranje ljudskog TCR varijabilnog regiona u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline ljudskog TCR konstantnog regiona tako da je ljudski TCR varijabilni region operativno povezan sa ljudskim TCR konstantnim regionom; i eksprimiranje iz konstrukta ljudskog receptora T ćelija specifičnog za antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, koraci izolovanja T ćelije, određivanja sekvence nukleinske kiseline ljudskog TCR varijabilnog regiona eksprimiranog od strane T ćelije, kloniranje ljudskog TCR varijabilnog regiona u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline ljudskog TCR konstantnog regiona, i eksprimiranje ljudskog receptora T ćelija se izvode koristeći standardne tehnike poznate stručnjacima.
[0120] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira receptor T ćelija specifičan za antigen od interesa, eksprimira se u ćeliji. U jednom otelotvorenju, ćelija koja eksprimira TCR je izabrana od CHO, COS, 293, HeLa, PERC.6™ ćelija, itd.
[0121] Antigen od interesa može biti svaki antigen za koji je poznato da uzrokuje ili je povezan sa bolesti ili stanjem, npr. antigen povezan sa tumorom; antigen virusnog, bakterijskog ili drugog patogenog porekla; itd. Mnogi antigeni povezani sa tumorom su poznati u struci. Izbor antigena povezanih sa tumorom je predstavljen u bazi podataka o peptidima Cancer Immunity (A Journal of the Cancer Research Institute) Peptide Database (archive.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm). U nekim otelotvorenjima pronalaska, antigen od interesa je ljudski antigen, na primer, ljudski antigen povezan sa tumorom. U nekim otelotvorenjima, antigen je intracelularni antigen specifičan za ćelijski tip, i receptor T ćelija se koristi za ubijanje ćelije koja eksprimira antigen.
[0122] Ovde je obelodanjen postupak identifikacije T ćelija sa specifičnostima protiv antigena koji je od interesa, npr. antigen povezan sa tumorom, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek opisane ovde sa antigenom od interesa, omogućavanje životinji da razvije imuni odgovor, i izolovanja od životinje koja nije čovek T ćelije sa specifičnostima za antigen.
[0123] Ovde su obelodanjeni novi postupci za usvajanje terapije T ćelijama. Tako je ovde opisan postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja (npr. raka) kod pacijenta (npr. sisarskog pacijenta, npr. ljudskog pacijenta) koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek opisane ovde sa bolestima ili stanjima povezanim sa antigenom, omogućujući životinji da uspostavi imuni odgovor, izolovanje od životinje populacije antigen-specifičnih T ćelija i ubacivanje izolovanih antigen-specifičnih T ćelija u pacijenta. Ovde je obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja kod čoveka, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek opisane ovde sa antigenom od interesa (npr. antigen koji je povezan sa bolestima ili stanjima, npr. antigen povezan sa tumorom), omogućavanje životinji da razvije imuni odgovor, izolovanje od životinje populacije antigen-specifičnih T ćelija, određivanje sekvence nukleinske kiseline receptora T ćelija, eksprimiranu antigen-specifičnim T ćelijama, kloniranje sekvence nukleinske kiseline receptora T ćelija u vektor eksprimiranja (npr. retrovirusni vektor), uvođenje vektora u T ćelije izvedene iz pacijenta tako da T ćelije eksprimiraju antigenspecifični receptor T ćelija i ubacivanje T ćelija u pacijenta. U jednom otelotvorenju, sekvenca nukleinske kiseline receptora T ćelija je dodatno humanizovana pre unošenja u T ćelije izvedene iz pacijenta, npr. Sekvenca koja kodira ne-ljudski konstantni region modifikovana je da više podseća na konstantni region ljudskog TCR (npr. ne-ljudski konstantni region zamenjen je ljudskim konstantnim regionom). U nekim otelotvorenjima bolest ili stanje je kancer. U nekim otelotvorenjima, populacija T ćelija specifičnih za antigen eksprimira se pre ubacivanja u pacijenta. U nekim otelotvorenjima, populacija imunih ćelija pacijenta je imunopotrošena pre ubacivanja antigen-specifičnih T ćelija. U nekim otelotvorenjima, TCR specifičan za antigen je TCR sa visokim aviditetom, npr. TCR sa visokim aviditetom za antigen povezan sa tumorom. U nekim otelotvorenjima, T ćelija je citotoksična T ćelija. U drugim otelotvorenjima, bolest ili stanje izaziva virus ili bakterija.
[0124] U drugom otelotvorenju, bolest ili stanje je autoimuna bolest. TREGćelije su subpopulacija T ćelija koje održavaju toleranciju na sopstvene antigene i sprečavaju patološku samoreaktivnost. Stoga su, takođe, obelodanjeni ovde, postupci lečenja autoimunih bolesti koje se oslanjaju na stvaranje antigen-specifičnih TREGćelija u životinji koja nije čovek iz ovog pronalaska koja je ovde opisana.
[0125] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja (npr. raka) kod pacijenta, koji obuhvata unošenje ćelija pogođenih bolestima ili stanjima (npr. ćelija karcinoma) pacijenta u životinju koja nije čovek, što omogućava životinji da razvije imuni odgovor na ćelije, izolovanje od životinje populacije T ćelija reaktivnih na ćelije, određivanje sekvence nukleinske kiseline receptora T ćelija eksprimiranog od strane T ćelija, kloniranje sekvence receptora T ćelija u vektor, uvođenje vektora u T ćelije dobijene od pacijenta, i ubacivanje u pacijenta T ćelija pacijenta koje čuvaju receptor T ćelija.
[0126] Takođe je ovde obelodanjena upotreba životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano kako bi se sekvence nukleinske kiseline kodirale ljudskim TCR varijabilnim domenima (npr., TCR α i/ili varijabilni domeni). U jednom otelotvorenju, pružen je postupak za pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, omogućavajući životinji koja nije čovek da razvije imuni odgovor na antigen od interesa i dobijanje od nje sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, postupak dalje obuhvata stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski TCR varijabilni domen koji je operativno povezan sa TC-konstantnim regionom koji nije ljudski, koji obuhvata izolovanje T ćelije iz životinje koja nije čovek opisane ovde i dobijanje od nje sekvence nukleinske kiseline koja kodira TCR varijabilni domen povezan sa TCR konstantnim regionom.
[0127] Takođe je ovde obelodanjena upotreba životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano kako bi se napravio ljudski terapeutik, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek sa antigenom od interesa (npr. antigen povezan sa tumorom), omogućavanje životinjama koje nisu čoveka da razviju imuni odgovor, dobijanja od životinja T ćelija reaktivnih prema antigenu od interesa, dobijanje iz T ćelija sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanizovani TCR protein koji se vezuje za antigen od interesa i primena sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanizovani TCR proteina u ljudskom terapeutiku.
[0128] Tako je, takođe, obelodanjen postupak za pravljenje ljudskog terapeutika, koji obuhvata imunizaciju životinje koja nije čovek kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, dozvoljavajući ne-ljudskoj životinji da razvije imuni odgovor, dobijanje od životinje T ćelija reaktivnih na antigen od interesa, dobijanje iz T ćelija sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanizovani receptor T ćelija koji se vezuje za antigen od interesa i koji primenjuje humanizovani receptor T ćelije u ljudskom terapeutiku.
[0129] U jednom aspektu, ljudski terapeutik je T ćelija (npr., ljudska T ćelija, npr. T ćelija izvedena iz ljudskog pacijenta) koja ima sekvencu nukleinske kiseline od interesa (npr. transfektovan ili transdukovana ili na drugi način uvedena sa nukleinskom kiselinom od interesa), tako da T ćelija eksprimira humanizovani TCR protein sa afinitetom za antigen od interesa. U jednom otelotvorenju, pacijent na kome se terapeutik koristi ima potrebu za terapijom određene bolesti ili stanja, i antigen je povezan sa bolest ili stanjem. U jednom otelotvorenju, T ćelija je citotoksična T ćelija, antigen je antigen povezan sa tumorom, i bolest ili stanje je kancer. U jednom otelotvorenju, T ćelija je izvedena iz pacijenta.
[0130] U drugom otelotvorenju, terapijski ljudski receptor je receptor T ćelija. U jednom otelotvorenju, terapeutski receptor je rastvorljiv receptor T ćelija. Veliki napor je uložen kako bi se proizveli rastvorljivi receptori T ćelija ili TCR varijabilni regioni za upotrebu terapeutskih agenasa. Generisanje rastvorljivih receptora T ćelija zavisi od dobijanja preuređenih TCR varijabilnih regiona. Jedan od pristupa je dizajnirati jednolančani TCR koji sadrži TCRα i TCRβ, i, slično formatu scFv imunoglobulina, zajedno ih povezati preko veznika (pogledati, npr. WO 2011/044186). Dobijeni scTv, ako je analogan sa scFv, bi obezbedio termički stabilan i rastvorljiv oblik TCRα/β vezujućeg proteina. Alternativni pristupi uključivali su izradu rastvorljivog TCR koji ima TCRβ konstantne domene (pogledati, npr. Chung i dr., (1994) Functional three-domain single-chain T-cell receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91:12654-58); kao i dizajniranje ne-prirodne disulfidne veze u interfejsu između TCR konstantnih domena (pregledano kod Boulter and Jakobsen (2005) Stable, soluble, high-affinity, engineered T cell receptors: novel antibody-like proteins for specific targeting of peptide antigens, Clinical and Experimental Immunology 142:454-60; takođe pogledati, U.S. Patent No. 7,569,664). Opisani su i drugi formati rastvorljivih receptora T ćelija. Ovde opisane životinje koje nisu čovek mogu se koristiti za određivanje sekvence receptora T ćelija koji se sa visokim afinitetom vezuje za antigen od interesa, i zatim oblikuje rastvorljiv receptor T ćelija baziran na sekvenci.
[0131] Rastvorljivi receptor T ćelija koji je izveden iz TCR receptorske sekvence, eksprimiran od strane životinje koja nije čovek, može se koristiti za blokiranje funkcije proteina od interesa, npr. viralnog, bakterijskog ili proteina povezanog sa tumorom. Alternativno, rastvorljivi receptor T ćelija može biti spojen na deo koji može ubiti inficiranu ili ćeliju raka, na primer, citotoksični molekuli (npr. hemoterapeutik), toksin, radionuklid, prolek, antitelo itd. Rastvorljivi receptor T ćelija može takođe se fuzioniše na imunomodulatorni molekul, npr. citokin, hemokin itd. Rastvorljivi receptor T ćelija takođe može biti fuzionisan ma imuno-inhibitorni molekul, na primer, molekul koji inhibira T ćeliju od ubijanja drugih ćelija koje imaju antigen prepoznat od strane T ćelija. Takvi rastvorljivi receptori T ćelija koji su spojeni sa imuno-inhibitornim molekulima mogu se koristiti, na primer, u blokiranju autoimunosti. Različiti primerni imuno inhibitni molekuli koji se mogu spojiti sa rastvorljivim receptorima T ćelija su pregledani kod Ravetch and Lanier (2000) Immune Inhibitory Receptors, Science 290:84-89.
[0132] Takođe su ovde obelodanjeni postupci za proučavanje imunog odgovora u kontekstu ljudskih TCR, uključujući preuređivanje ljudskog TCR, razvoj T ćelija, aktivacija T ćelija, imunološka toleranciju itd.
[0133] Takođe su obelodanjeni postupci ispitivanja kandidata za vakcinu. U jednom otelotvorenju, ovde opisan postupak je određivanje da li će vakcina aktivirati imuni odgovor (npr. proliferaciju T ćelija, oslobađanje citokina itd.) i dovesti do stvaranja efektora, kao i memorijskih T ćelija (npr. centralne i efektorske memorijske T ćelije).
PRIMERI
[0134] Pronalazak će biti dodatno ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Ovi primeri su predstavljeni kako bi pomogli u razumevanju pronalaska, ali nisu namenjeni, i ne treba ih tumačiti, da ograničavaju njegov opseg na bilo koji način. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih postupaka, koje su dobro poznati stručnjacima u oblasti (tehnike molekularnog kloniranja itd.). Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je označena u Celzijusu, i pritisak je atmosferski ili blizu njega.
Primer 1. Stvaranje miševa sa humanizovanim TCR varijabilnim genskim lokusom
[0135] Miševi koji sadrže brisanje endogenih varijabilnih lokusa TCR (α ili β) i zamene endogenih V i J ili V, D i J segmenata se izrađuju pomoću VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (pogledati, npr., US Pat. No. 6,586,251 i Valenzuela, D.M., i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech.21(6): 652-659), gde su ljudske sekvence, dobijene iz BAC biblioteka koje koriste bakterijsku homolognu rekombinaciju, koriste za stvaranje velikih vektora ciljanja (LTVEC) koje sadrže genomske fragmente ljudskog TCR varijabilnog lokusa okruženog kracima za ciljanje kako bi ciljao LTVEC na endogene mišje TCR varijabilne lokuse u mišjim ES ćelijama. LTVEC su ponovo linearizovani i elektroporirani u mišju ES ćelijsku liniju premaValenzuela i dr. ES ćelije su odabrane za otpornost na higromicin ili neomicin i ispitane su za gubitak mišjeg alela ili dobitak ljudskog alela.
[0136] Ciljani ES ćelijski klonovi uvedeni su u 8 ćelijski stadijum (ili ranije) embriona miševa pomoću VELOCIMOUSE® postupka (Poueymirou, W.T. i dr. (2007). F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat. Biotech.25: 91-99.). VELOCIMICE® (F0 miševi koji su potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) sa humanizovanim TCR lokusima identifikovani su skriningom za gubitak endogenog TCR varijabilnog alela i dobitka ljudskog alela koristeći testa modifikacije alela (Valenzuela i dr.). F0 mladunci su genotipovani i uzgojeni do homozigotnosti. Miševi homozigotni za humanizovani TCRα i/ili TCRβ varijabilne lokuse (npr., koji sadrže podskup ljudskih TCRα i/ili TCRβ varijabilnih segmenata) su napravljeni i fenotipovani kao što je ovde opisano.
[0137] Svi miševi su smešteni i odgajani u posebnom postrojenju bez patogena kod Regeneron Pharmaceuticals. Svi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane IACUC i Regeneron Pharmaceuticals.
Primer 2: Progresivna humanizacija TCRα varijabilnog lokusa
[0138] 1,5 megabaza DNK na mišem TCRα lokusu koji odgovara mišjim segmentima od 110 V i 60 J zamenjen je sa 1 megabazom DNK koja odgovara 54V i 61J ljudskim segmentima TCRα koristeći progresivnu strategiju humanizacije sumiranu na SLIKAMA 2 i 3. Čvorne sekvence nukleinskih kiselina različitih vektora ciljanja korišćenih za progresivnu strategiju humanizacije TCRα lokusa su rezimirane u Tabeli 2, i obuhvaćene u Spisku sekvenci.
Tabela 2: Čvorne sekvence nukleinskih kiselina za različite vektore koji ciljaju TCRα lokuse
[0139] Konkretno, kao što je prikazano na SLICI 4A, DNK od mišjeg BAC klona RP23-6A14 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1539) kako bi se zamenio TCRαJ1-TCRαJ28 region endogenog mišjeg TCRα lokusa sa Ub-higromicin kasetom, nakon čega sledi IoxP mesto. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-117i19 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1535) kako bi se zamenio ~ 15kb region koji okružuje (uključujući i) TCRαV1 endogenog mišjeg TCRα i δ lokusa sa PGK-neomicin kasetom, nakon čega sledi IoxP mesto. ES-ćelije sa dvostruko ciljanim hromozomom (tj., pojedinačan endogeni mišji TCRα lokus ciljan sa oba vektora ciljanja) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES T ćelije tretirane su sa CRE rekombinazom, čime se posreduje uklanjanje regiona između dva IoxP mesta (tj. region koji se sastoji od endogenog mišjeg TCRα lokusa od TCRαV1 do TCRαJ1) i ostavljajući za sobom samo jedno IoxP mesto, neomicin kasetu i mišji konstantni region i region poboljšanja. Ova strategija rezultovala je stvaranjem obrisanog mišjeg TCR α/δ lokusa (MAID 1540).
[0140] Prvi ljudski ciljani vektor za TCRα imao je 191,660 bp ljudske DNK iz CTD2216p1 i CTD2285m07 BAC klonova (Invitrogen) koji su sadržali prve dve sekvence ljudskih TCRαV genskih segmenata (TRAV40 i 41) i 61 TCRαJ (50 funkcionalnih) genskih segmenata. Ovaj BAC je modifikovan homolognom rekombinacijom kako bi se obuhvatio Not1 mesto 403 bp nizvodno (3') od genskog segmenta TCRαJ1 za ligiranje mišjeg 3' kraka homologije i 5' AsiSI mesto za ligiranje mišjeg 5' kraka homologije. Dve različita kraka homologije su korišćena za ligiranje ovog ljudskog fragmenta: 3' krak homologije sadržao je endogene mišje TCRα sekvence iz RP23-6A14 BAC klona, i 5' krak homologije sadržao je endogenu TCRα sekvencu ,5' mišjeg TCRαV iz mišjeg BAC klona RP23 -117i19. Ovaj ljudski himerni BAC je korišćen kao vektor ciljanja (MAID 1626) za izradu početnog umetanja ljudskih TCRα genskih segmenata plus uzvodna Ioxp-ub-higromicin-Ioxp kaseta na mišjem TCRα lokusu (SLIKA 4B). Sekundarne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 1-3) za MAID 1626 vektor ciljanja su opisane u Tabeli 2.
[0141] Zatim je napravljen niz ljudskih vektora ciljanja koji koriste isti mišju 5' krak koji sadrži endogenu TCRα sekvencu 5' mišjeg TCRαV od mišjeg BAC klona RP23-117i19 sa varijabilnim IoxP-neomicin-IoxP i IoxP-higromicin-IoxP (ili frt-higromicin-frt za MAID 1979) selekcionim kasetama.
[0142] Za generisanje ljudskog TCRα mini-lokusa koji sadrži ukupno 8 ljudskih TCRαV (7 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ (50 funkcionalnih) genskih segmenata, DNK iz ljudskog BAC klona RP11-349p11 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1767) (SLIKA 4C). Ovo je dodalo 104.846 bp ljudske DNK koji sadrže sledećih 6 (5 funkcionalnih) sekvencijalnih ljudskih TCRαV genskih segmenata (TRAV35 do TRAV39) i 5' IoxP-ub-neomicin-IoxP kaseta. Rezultujući TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ub-neomicin-IoxP kaseta plus ukupno 8 ljudskih TCRαV (7 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ genskih segmenata operativno povezanih sa mišjim TCRα konstantnim genima pojačivačima. Sekundarne sekvence nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 4 i 5) za vektor ciljanja MAID 1767 su opisane u Tabeli 2.
[0143] Kako bi se generisao ljudski TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 23 ljudska TCRαV (17 funkcionalnih) i 61 ljudski TCRαJ genski segmenta, DNK iz mišjeg BAC klona koji sadrži od 5' do 3': jedinstveno I-Ceul mesto, 20 kb mišji TCRα krak 5' mišjeg TCRα lokusa koji se koristi za homolognu rekombinaciju u ES ćelije, i IoxP-Ub-Hig-IoxP kaseta u obrnutoj orijentaciji, modifikovani su bakterijskom homolognom rekombinacijom kako bi sadržali od 5' do 3': jedinstveno I-Ceul mesto, 20 kb mišji TCRα krak 5' mišjeg TCRα lokusa, frt-pgk-Hig-frt kaseta i jedinstveno AsiSI mestoa. DNK iz ljudskog BAC klona RP11-622o20 (Invitrogen), koji se bavi ljudskim TCRαV22-V34, modifikovan je homolognom rekombinacijom da sadrži Spec kasetu koja je oružena jedinstvenim I-Ceul i AsiSI mestima. Kasnije, Spec kaseta u modifikovanom ljudskom BAC klonu zamenjena je sa sekvencom koja se nalazi između I-Ceul i AsiSI mesta u modifikovanom mipjem BAC klonu standardnim postupcima za digestiju/ligaciju. Dobijeni vektor ciljanja (MAID 1979; SLIKA 4D) je dodao 136.557 bp ljudske DNK koja sadrži sledećih 15 (10 funkcionalnih) sekvencijalnih ljudskih TCRαJ genskih segmenata (TRAV22 do TRAV34) i 5' frt-pgk-Hig-frt kasetu. Rezultujući TCRα lokus sadržao je 5' frt-pgk-Higfrt kaseta plus ukupno 23 ljudskih TCRαV (17 funkcionalnih) i 61 ljudski TCRαV segment operativno povezan sa mišjim TCRα konstantnim genom i pojačivačem. Sekundarne sekvence nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 6 i 7) za MAID 1979 vektore za ciljanje su opisane u Tabeli 2.
[0144] Za generisanje ljudskog TCRα mini-lokusa koji sadrži ukupno 35 ljudskih TCRαV (28 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ genskih segmenata, DNK iz ljudskog BAC klona CTD2501-k5 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao vektor ciljanja (MAID 1769) (SLIKA 4E). Ovo je dodalo 124.118 bp ljudske DNK koje su sadržale narednih 12 (11 funkcionalnih) uzastopnih ljudskih TCRαV genskih segmenata (TRAV13-2 do TRAV21) i 5' Ioxp-ubneomicin-IoxP kasetu. Rezultujući TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 35 ljudskih TCRαV (28 funkcionalnih) i 61 ljudski TCRαJ genski segment koji su operativno povezani sa mišjim TCRα konstantnim genom i pojačivačem. Sekundarne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 8 i 9) za vektor ciljanja MAID 1769 su opisane u Tabeli 2.
[0145] Za generisanje ljudskog TCRα mini-lokusa koji sadrži ukupno 48 ljudskih TCRαV (39 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ genskih segmenata, DNK iz ljudskog BAC klona RP11-92F11 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao vektor ciljanja (MAID 1770) (SLIKA 4F). Ovo je dodalo 145.505 bp ljudske DNK koje su sadržale narednih 13 (11 funkcionalnih) uzastopnih ljudskih TCRαJ genskih segmenata (TRAV6 do TRAV8.5) i 5' Ioxp-ubneomicin-IoxP kasetu. Rezultujući TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 48 ljudskih TCRαV (39 funkcionalnih) i 61 ljudski TCRαJ genski segmenta koji su operativno povezani sa mišjim TCRα konstantnim genom i pojačivačem. Sekundarne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 10 i 11) za vektor ciljanja MAID 1770 su opisane u Tabeli 2.
[0146] Za generisanje ljudskog TCRα mini-lokusa koji sadrži ukupno 54 ljudskih TCRαV (45 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ genskih segmenata, DNK iz ljudskog BAC klona RP11-780M2 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao vektor ciljanja (MAID 1771) (SLIKA 4G). Ovo je dodalo 148.496 bp ljudske DNK koje su sadržale narednih 6 (6 funkcionalnih) uzastopnih ljudskih TCRαV genskih segmenata (TRAV1-1 do TRAV5) i 5' Ioxp-ubneomicin-IoxP kasetu. Rezultujući TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 54 ljudskih TCRαV (45 funkcionalnih) i 61 ljudskih TCRαJ genskih segmenata koji su operativno povezani sa mišjim TCRα konstantnim genom i pojačivačem. Sekundarne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 12 i 13) za vektor ciljanja MAID 1771 su opisane u Tabeli 2.
[0147] U bilo kom od gore navedenih koraka, selektivne kasete uklanjaju se brisanjem Cre ili Flp rekombinaze. Pored toga, može se uvesti ljudski TCRδ lokus kao što je prikazano na SLICI 5.
Primer 3: Progresivna humanizacija TCRβ varijabilnog lokusa
[0148] 0,6 megabaza DNK na mišjem TCRβ lokusu koji odgovara 33 V, 2 D i 14 J mišjim segmentima zamenjene su sa 0,6 megabaza DNK koja odgovara 67 V, 2 D i 14 J ljudskim segmentima TCRα korišćenjem progresivne strategije humanizacije koja je rezimirana na SLIKAMA 6 i 7. Čvorne sekvence nukleinskih kiselina različitih ciljanih vektora koje se koriste za progresivnu strategiju humanizacije TCRβ lokusa su rezimirane u Tabeli 3 i uključene u Spisak sekvenci.
Tabela 3: Sekundarne sekvence nukleinskih kiselina za različite TCRβ centre za ciljanje lokusa
[0149] Konkretno, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-153p19 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1544) kako bi zamenio 17kb region (uključujući TCRBV30) odmah uzvodno od 3' tripsinogen klastera gena u endogenom mišjem TCRβ lokusu sa PGK-neo kasetom, a zatim IoxP mestom (SLIKA 8A). DNK iz mišjeg BAC klona RP23-461h15 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1542) kako bi se zamenio 8355 bp region (uključujući TCRBV2 i TCRBV3) nizvodno od 5' tripsinogen klastera gena u endogenom mišjem TCRβ lokusu sa Ub-higromicin kasetom i a IoxP mestom. ES ćelije koje imaju dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljan sa oba vektora ciljanja) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES T ćelije tretirane su sa CRE rekombinazom, posredujući brisanje regiona između 5' i 3' IoxP mesta (sastoji se od endogenog TCRβ lokusa miša od mišje TCRBV2 do TCRBV30) i ostavljajući za sobom samo jedno IoxP mesto, higromicin kasetu i TCRBD, TCRBJ, konstantne i pojačane sekvence. Jedan mišji TCRVβ je ostavljena uzvodno od 5' klastera tripsinogen gena, i jedan mišji TCRBβ je ostavljen nizvodno od mišjeg Eβ, kao što je navedeno na Slici 8A.
[0150] Prvi ljudski vektor ciljanja za TCRβ imao je 125.781 bp ljudske DNK od CTON2559j2 BAC klona (Invitrogen) koji sadrži prvih 14 sekvenci ljudskih TCRβV genskih segmenata (TRBV18-TRBV29-1). Ovaj BAC je modifikovan homolognom rekombinacijom da sadrži 5' AsiSI mesto i 3' AscI mesto za ligiranje od 5' i 3' mišjih kraka homologije. Dva različita kraka homologije su korišćena za ligiranje ovog ljudskog fragmenta: jedan skup kraka homologije sadržao je endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje nizvodne mišje tripsinogen gene od RP23-153p19 BAC klona, i drugi skup sadrži endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje uzvodne mišje tripsinogen gene od mišjeg BAC klona RP23-461h15. Ovaj ljudsko-mišji himerni BAC korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1625) za početno ubacivanje ljudskih TCRβ genskih segmenata plus uzvodne frt-ub-neomicin-frt kasete u mišji TCRβ lokus, i rezultovao je ljudskim TCRβ mini-lokusom koji sadrži 14 ljudskih (8 funkcionalnih) TCRβV (SLIKA 8B). Čvorne sekvence nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 14-16) za vektor ciljanja MAID 1625 su opisane u Tabeli 3.
[0151] Kako bi se zamenili mišji TCRβ D i J segmenti sa ljudskim TCRβ D i J segmentima, DNK iz BAC klona RP23-302p18 (Invitrogen) i iz ljudskog BAC klona RP11-701D14 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1715) u ES ćelijama koje su sadržali TCRβV mini-lokus opisan iznad (tj. MAID 1625). Ova modifikacija je zamenila region ~18.540 bp (od 100 bp nizvodno od polyA od 3' tripsinogen gena do 100 bp nizvodno od J segmenata u klasteru D2 koji uključuje mišji TCRBD1-J1, mišju konstantu 1 i mišji TCRBD2-J2) u endogeni mišji TCRβ lokus sa ~25425 bp sekvence koja sadrži ljudski TCRBD1-J1, IoxP Ubhigromicin-IoxP kaseta, konstantu miša 1, ljudski TCRBD2-J2 (SLIKA 8C(i)). ES ćelije koje imaju dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljan sa oba vektora ciljanja) potvrđeni su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAQMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES T ćelije tretirane su CRE rekombinazom, čime se posredstvom brisanja kaseta higromicina ostavlja samo jedno IoxP mesto nizvodno od ljudskih J segmenata u D1J klasteru (SLIKA 8C(ii)). Sekundarne sekvence nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 17-21) za MAID 1715 vektore za ciljanje su opisane u Tabeli 3.
[0152] Zatim je napravljen niz vektora ciljanja ljudi koji koriste isti mišji 5' krak koji sadrži endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje mišje tripsinogen gene od mišjeg BAC klona RP23-461h15 sa alternativnom kasetom za selekciju.
[0153] Za generisanje ljudskog TCRβ mini-lokusa koji sadrži ukupno 40 ljudskih TCRβV (30 funkcionalnih) i ljudskih TCRβ D i J segmenata, DNK iz ljudskih BAC klonova RP11-134h14 i RP11-785k24 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i kombinovan u vektor ciljanja (MAID 1791) korišćenjem standardne bakterijske homologne rekombinacije, restrikcione digestije/ligacije i drugih tehnika kloniranja. Uvođenje MAID 1791 vektora ciljanja rezultovalo je dodavanjem 198,172 bp ljudske DNK koja sadrži sledeće 26 (22 funkcionalne) sekvence ljudskih TCRβV gena (TRBV6-5 do TRBV17) i 5' frt-ub-higromicin-frt kasetu. Rezultujući TCRβ lokus sadrži 5' frt-ub-higromicin-frt kasetu plus ukupno 40 ljudskih TCRβV (30 funkcionalnih) i ljudskih TCRβ D i J genskih segmenata operativno povezanih sa mišjim TCRβ konstantnim genima i pojačivačem (SLIKA 8D). Čvorne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 22 i 23) za vektor ciljanja MAID 1791 su opisani u Tabeli 3.
[0154] Za generisanje ljudskog TCRβ mini-lokusa koji sadrži ukupno 66 ljudskih TCRβV (47 funkcionalnih) i ljudskih TCRβ D i J segmenata, DNK iz ljudskog BAC klona RP11-902B7 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom i korišćen je kao vektor ciljanja (MAID 1792). Ovo je rezultovalo dodatkom 159.742 bp ljudske DNK koja sadrži sledeće 26 (17 funkcionalnih) sekvencijalnih ljudskih TCRβV genskih segmenata (TRBV1 do TRBV12-2) i 5' frt-ub-neomicin-frt kaseta. Rezultujući TCRβ lokusa sadrži 5' frt-ub-neomicin-frt kaseta plus ukupno 66 ljudskih TCRβV (47 funkcionalnih) i ljudskih TCRβ D i J genskih segmenata operativno povezanih sa mišjim TCRβ konstantnim genima i pojačivačem. (SLIKA 8E). Čvorne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 24 i 25) za vektor ciljanja MAID 1792 su opisani u Tabeli 3.
[0155] U bilo kom od gore navedenih koraka, selekcione kasete uklanjaju se brisanjem Cre ili Flp rekombinaze. Na primer, kao što je prikazano na SLICI 7, MAID 1716 odgovara MAID 1715 sa uklanjanjem kasete sa hidromicinom.
[0156] Na kraju, generisan je ljudski TCRβ mini-lokus koji sadrži ukupno 67 ljudskih TCRβV (48 funkcionalnih) i ljudskih TCRβ D i J segmenata. Mišji TCRBV31 nalazi se ~9,4 kb 3' odTCRBC2 (druga TCRB sekvenca konstantnog regiona) i nalazi se u suprotnoj orijentaciji prema ostalim segmentima TCRBV. Ekvivalentni ljudski V segment je TCRBV30, koji se nalazi na sličnom položaju u ljudskom TCRB lokusu.
[0157] Kako bi se humanizovao TCRBV31, mišji klon BAC koji sadrži mišji TCRBV31, modifikovan je bakterijskom homolognom rekombinacijom kako bi se napravio LTVEC MAID 6192 (SLIKA 8F). Celokupni region kodiranja, počevši od početnog kodona u eksonu 1, intron, 3' UTR i sekvence rekombinacionog signala (RSS) TCRBV31 zamenjene su homolognim ljudskim TCRBV30 sekvencama. 5' UTR se čuva kao mišja sekvenca. Za selekciju, ubačena kaseta (Iox2372-Ubikuitin promoter-Hig-PGKpolyA-protaminski promoter-Cre-SV40polyA-Iox2372) ubačena je u intron (72 bp 3' od eksona, 1,289 bp 5' od eksona 2). Zarad jednostavnosti, SLIKE 7 i 8 pokazuju selekcionu kasetu 3' hTCRBV30, dok je dizajnirana da se nalazi u intronu između eksona 1 i eksona 2 od hTCRBV30 gena. Protaminski promoter koji se kreira Cre eksprimiranjem se transkribuje isključivo u postmejotičkim spermatidima, tako da je kaseta „samo-obrisana“ u F1 generaciji miševa.
[0158] Čvorne sekvence nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 26 i 27) za MAID 6192 vektore za ciljanje su opisane u Tabeli 3. MAID 6192 DNK se elektroporira u MAID1792 ES ćelije. ES ćelijski klonovi su izabrani za otpornost na higromicin i ispitani su za gubitak mišjeg alela TCRB31 i dobitak ljudskog alela TCRB30.
[0159] Slična strategija se koristi da opciono izbriše preostali 5' mišji TCRβ V segment.
Primer 4: Generisanje TCRα/TCRβ miševa
[0160] Na svakom koraku progresivne humanizacije TCRα i TCRβ lokusa, miševi homozigotni za humanizovani varijabilni lokus TCRα mogu se ukrštati sa miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ varijabilni lokus kako bi se formiralo potomstvo koje obuhvata humanizovani varijabilni TCRα i TCRβ varijabilni lokus. Potomstvo se uzgaja do homozigotnosti u odnosu na humanizovani TCRα i humanizovani TCRβ lokus.
[0161] U jednom aspektu, miševi homozigotni za humanizovani TCRα varijabilni lokus koji sadrže 8 ljudskih Vα i 61 ljudskih Jα (MAID 1767; „1767 HO“) ukrštaju se sa miševima homozigotnim za humanizovani varijabilni lokus TCRβ koji sadrži 14 ljudskih Vβ, 2 ljudska Dβ i 14 ljudskih Jβ (MAID 1716; 1716 HO). Potomstvo se uzgaja do homozigotnosti u odnosu na oba humanizovana lokusa. Primer 5: Proizvodnja slezinske T ćelije kod miševa homozigotnih za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0162] Slezine iz miševa tipa vrste (WT); miševi sa obrisanim TCRα lokusom miša („MAID1540“, pogledati SLIKU 3); miševi homozigotni za ljudski TCRα lokus („MAID 1767“, pogledati SLIKU 3); miševi sa obrisanim segmentima TCRβ V sa izuzetkom dva preostala mišja segmenta V („MAID1545“, pogledati SLIKU 7); miševi homozigotni za ljudski TCRβ lokus, koji takođe sadrže dva preostala mišja segmenta V („MAID 1716“, pogledati SLIKU 7); i miševi homozigotni za oba ljudska TCRα i TCRβ lokusa, sa TCRβ lokusom koji takođe sadrži dva preostala mišja segmenta V („MAID 17671716“) perfuzirani su sa Collagenase D (Roche Bioscience) i eritrociti su lizovani sa ACK lizinskim puferom, nakon čega sledi pranje u RPMI medijumu.
[0163] Splenociti iz jedne WT, MAID 1540, 1767, 1545, 1716 i 17161767 reprezentativne životinje su procenjivani protočnom citometrijom. Ukratko, suspenzije ćelija su izrađene korišćenjem standardnih postupaka. 1x10<6>ćelije su inkubirane sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD) na ledu 10 minuta, obojene odgovarajućim koktelom antitela u trajanju od 30 minuta na ledu. Nakon bojenja, ćelije su isprane i zatim fiksirane u 2% formaldehida. Prikupljanje podataka vršeno je na protočnom citometru LSRII/Cantoll/LSRFortessa i analizirano sa FlowJo.
[0164] Za bojenje splenocita korišćen je anti-mišji FITC-CD3 (17A2, BD). Kao što je prikazano na SLICI 9, miševi sa ljudskim TCR segmentima bili su u mogućnosti da proizvedu značajan broj CD3+ T ćelija, dok miševi sa brisanjem mišjeg TCRα lokusa nisu. Miševi sa brisanjem TCRβ lokusa takođe su proizveli CD3+ T ćelije, verovatno zbog korišćenja preostalog 3' mišjeg V segmenta (pogledati u nastavku).
Primer 6: Razvoj timuskih T ćelija kod miševa homozigotnih za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0165] Kako bi se utvrdilo da li su miševi homozigotni za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus pokazali normalan razvoj T ćelija u timusu, splenociti od četiri od svake od WT, 1767 HO, 1716 HO i 1716 HO 1767 HO staromodno uparene životinje (starosti 7-10 nedelja) korišćeni su u protočnoj citometriji za procenu proizvodnje T ćelija u različitim razvojnim stadijumima, kao i za procenu frekvencije i apsolutnog broja svake od DN, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelija.
[0166] Određivanje ćelija ćelija vršeno je na osnovu prisustva CD4, CD8, CD44 i CD25 ćelijskih površinskih markera kao što je sumirano u Tabeli 1. Korelacija između oznake tipa ćelije i eksprimiranje markera ćelijske površine u timusu je sledeća: dvostruko negativne (DN) ćelije (CD4-CD8-), dvostruko pozitivne (DP) ćelije (CD4+ CD8+), CD4 jednostruko pozitivne ćelije (CD4+ CD8-), CD8 jednostruko pozitivne ćelije (CD4- CD8+), dvostruko negativne 1/DN1 ćelije (CD4- CD8-, CD25- CD44+), dvostruko negativne 2/DN2 ćelije (CD4- CD8-, CD25 CD44+), dvostruko negativne 3/DN3 ćelije (CD4- CD8-, CD25 CD44-), dvostruko negativne 4/DN4 ćelije (CD4- CD8-, CD25-CD44-).
[0167] Timociti su procenjeni protočnom citometrijom. Ukratko, suspenzije ćelija su izrađene korišćenjem standardnih postupaka. Protočna citometrija je sprovedena kao što je opisano u Primeru 5. Korišćena antitela: anti-mišje PE-CD44 (IM7, BioLegend), PeCy7-CD25 (PC61, BioLegend), APC-H7-CD8a (53-6.7, BD) i APC -CD4 (GK1.5, eBioscience).
[0168] Kao što je prikazano na SLIKAMA 10 i 11, miševi homozigotni za humanizovani TCRα, TCRβ i oba od TCRα i TCRβ su mogli da proizvedu DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelije, što ukazuje da T ćelije proizvedeni iz humanizovanih lokusa mogu da prđu kroz razvoj T ćelija u timusu.
Primer 7: Diferencijacija T ćelije slezine kod miševa homozigotnih za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0169] Kako bi se utvrdilo da li su miševi homozigotni za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus pokazali normalnu T-ćelijsku diferencijaciju na periferiji (npr., slezina), četiri od svake od WT, 1767 HO, 1716 HO i 1716 HO 1767 HO starosno uparene životinje (7-10 starih nedelja) korišćene su u protočnoj citometriji kako bi se procenila proizvodnja različitih T ćelija u slezini (CD3+, CD4+, CD8+, T naivne, Tcm i Teff/em), kao i da se proceno apsolutni broj svakog tipa T ćelija u slezini.
[0170] Određivanje tipa ćelija vršeno je na osnovu prisustva CD19 (markera B ćelija), CD3 (marker T ćelijaa), CD4, CD8, CD44 i CD62L (L-selektin) markera ćelijske površine. Korelacija između oznake tipa ćelije i eksprimiranje markera ćelijske površine je sledeća: T ćelije (CD3+), CD4 T ćelije (CD3+ CD4+ CD8-), CD8 T ćelije (CD3+ CD4- CD8+), CD4 efektorske/efektorska memorijske T ćelije (CD3+ CD4+ CD8- CD62L- CD44+), CD4 centralne memorijske T ćelije (CD3+ CD4+ CD8- CD62L+ CD44+), CD4 naivne T ćelije (CD3+ CD4+ CD8- CD62L+ CD44-), CD8 efektorske/ efektorke memorijske T ćelije (CD3+ CD4- CD8+ CD62L- CD44+), CD8 centralne memorijske T ćelije (CD3+ CD4- CD8+ CD62L+ CD44+), CD8 naivne T ćelije (CD3+ CD4- CD8+ CD62L+ CD44-).
[0171] Splenociti su procenjeni protočnom citometrijom. Ukratko, suspenzije ćelija su izrađene korišćenjem standardnih postupaka. Protočna citometrija je sprovedena kao što je opisano u Primeru 5. Korišćena antitela: anti-mišje FITC-CD3 (17A2, BD), PE-CD44 (IM7, BioLegend), PerCP-Cy5.5-CD62L (Mel-14, BioLegend) APC-H7-CD8a (53-6.7, BD), APC-CD4 (GK1.5, eBioscience) i V450-CD19 (1D3, BD).
[0172] Kao što je prikazano na SLIKAMA 12-14, T ćelije u slezini miševa homozigotne za humanizovane TCRα, TCRβ i oba TCRα i TCRβ su mogle da se podvrgnu diferencijaciji T ćelija, i prisutne su i CD4+ i CD8+ T ćelije. Pored toga, memorijske T ćelije su detektovane u slezinama testiranih miševa.
Primer 8: Korišćenje ljudskih V segmenata kod humanizovanih TCR miševa
[0173] Eksprimiranje ljudskih TCRβ V segmenata je procenjeno na nivou proteina i RNK korišćenjem protočne citometrije i TAQMAN™ PCR u realnom vremenu, respektivno, u miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ lokus (1716 HO) i miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ i TCRα lokus (1716 HO 1767 HO).
[0174] Za protočnu citometriju, pripremljene su slezinske T ćelije i izvršena je analiza kako je opisano u Primeru 5. Za protočnu citometriju korišćen je TCRβ repertoar komplet (IOTEST® Beta Mark, Beckman Coulter). Komplet sadrži anti-ljudska antitela specifična za određeni broj ljudskih TCRBV, npr., HTRBV-18, -19, -20, -25, -27, -28 i -29.
[0175] Rezultati su rezimirani na SLICI 15. Tabele predstavljene na SLICI 15A (preko CD8 T ćelija) i SLICI 15B (preko CD4 T ćelija) pokazuju da su T ćelije slezine kod 1716 HO i 1716 HO 1767 HO miševa koristile niz ljudskih TCRβ V segmenata. Miševi divljeg tipa korišćeni su kao negativna kontrola.
[0176] Za PCR u realnom vremenu, ukupna RNK se prečišćava od slezine i timusa koristeći MAGMAX™-96 za Microarrays Total RNA Isolation Kit (Ambion od Life Technologies) prema specifikacijama proizvođača. Genomska DNK je uklonjena koristeći MAGMAX™ TURBO™ DNase Buffer i TURBO DNase iz gore navedenog MAGMAX kompleta (Ambion od Life Technologies). mRNK (do 2,5ug) je prepisana u cDNK koristeći SUPERSCRIPT® VILO™ Master Mix (Invitrogen od Life Technologies). cDNK je razblažen na 2-5ng/μL, i cDNK od 10-25ng je amplificirana sa TAQMAN® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems od Life Technologies) pomoću ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), koristeći prajmere i Taqman MGB sonde (Applied Biosystems) ili BHK1/BHQ-Plus sonde(Biosearch Technologies) date u Tabeli 4 prema uputstvima proizvođača. Relativno eksprimiranje svakog gena je normalizovano do mišje TCR beta konstanta 1 (TRBC1) kontrole.
Tabela 4: Primeri i sonde koji se koriste za detektovanje RNK eksprimiranja TCRβ V segmenata i konstantnog regiona kod humanizovanih TCR miševa sa PCR u realnom vremenu
(TAQMAN™)
[0177] Kao što je prikazano na SLICI 16A-B, miševi homozigotni za humanizovani TCRβ lokus (1716 HO) i miševi homozigotni za oba humanizovana TCRβ i TCRα lokusa (1716 HO 1767 HO) pokazali su eksprimiranje RNK različitih ljudskih TCRβ segmenata i kod timusa i slezine. Miševi su takođe pokazali RNK eksprimiranje mišjih TRBV-1 i TRBV-31 segmenta (podaci nisu prikazani), ali nijedan mišji TRBV-1 protein nije detektovan protočnom citometrijom (podaci nisu prikazani).
[0178] Mišji TRBV-31 segment zamenjen je ljudskim TRBV-30 segmentom, kao što je prikazano na SLICI 8F i miševi su generisani iz MAID 6192 ES ćelija kako je ovde opisano. Slezina i timus nastalih homozigotnih životinja se testiraju na korišćenje ljudskih Vβ segmenata, uključujući TRBV-30, protočnom citometrijom i/ili PCR u realnom vremenu, kao što je ovde opisano. MTRBV-1 se takođe može izbrisati.
Primer 9: Razvoj T ćelija kod miševa homozigotnih za 23 ljudska TCR Vα segmenta
[0179] Homozigotni humanizovani TCRα miševi okarakterisani u prethodnim primerima sadrže 8 ljudskih Vα segmenata i 61 ljudski Jα segment (1767 HO, pogledati SLIKU 3). Homozigotni humanizovani TCRα miševi koji se sastoji od 23 ljudska Vα segmenta i 61 ljudski Jα segment (1979 HO, pogledati SLIKU 3) su testirani za svoju sposobnost generisanja CD3+ T ćelija slezine i pokazuju razvoj T ćelija u timusu.
[0180] Eksperimentalni podaci su dobijeni korišćenjem protočne citometrije koristeći odgovarajuća antitela kako je opisano u prethodnim primerima. Kao što je prikazano na SLICI 17, miš koji je bio homozigotan za 23 ljudska Vα segmenta i 61 ljudski Jα segment, proizveo je značajan broj CD3+ T ćelija slezine, i procenat perifernih CD3+ T ćelija bio je uporediv sa onim kod životinja divljeg tipa (SLIKA 19).
[0181] Štaviše, timociti kod 1979 HO miševa su mogli da prolaze kroz razvoj T ćelija i sadrže T ćelije u DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP stadijumima (SLIKA 18).
Primer 10: Razvoj i diferencijacija T ćelija kod miševa homozigotnih za potpun repertoar ljudskog TCRα i TCR β varijabilnog regiona
[0182] Miševi su homozigotni za potpun repertoar segmenata ljudskog TCRα varijabilnog regiona (tj.
54 ljudskih Vα i 61 ljudskih Jα) i homozigotne za potpun repertoar segmenata ljudskog TCRβ varijabilnog regiona (67 ljudskih Vβ, 2 ljudska Dβ i 14 ljudskih Jβ), „1771 HO 6192 HO“ (pogledati SLIKE 3 i 7), testirani su za svoju sposobnost da proizvode timocite koji prolaze kroz normalan razvoj T ćelija, proizvode T ćelije koje prolaze kroz normalnu diferencijaciju T ćelija na periferiji i koriste potpun repertoar svojih ljudskih Vα i Vβ segmenata.
[0183] Protočna citometrija se sprovodi kako bi se utvrdilo prisustvo DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelija u timusu pomoću anti-mišjih CD4, CD8, CD25 i CD44 antitela kao što je gore opisano u Primerima 5 i 6. Protočna citometrija se takođe sprovodi kako bi se odredio broj CD3+ T ćelija na periferiji, kao i da se proceni diferencijacija T ćelija na periferiji (npr. prisustvo efektora i memorijskih T ćelija na periferiji). Eksperiment se sprovodi pomoću anti-mišjih CD3, CD19, CD4, CD8, CD44 i CD62L antitela kako je gore opisano u Primerima 5 i 7.
[0184] Konačno, protočna citometrija i/ili PCR u realnom vremenu se sprovode kako bi se utvrdilo da li T ćelije u 1771 HO 6192 HO koriste potpun repertoar TCRB i TCRα V segmenata. Za eksprimiranje proteina koristeći protočnu citometriju, koristi se TCRβ repertoar komplet (IOTEST® Beta Mark, Beckman Coulter), koji sadrži anti-ljudska hTCRBV specifična antitela (pogledati Primer 8). Za eksprimiranje RNK koristeći PCR u realnom vremenu, cDNK iz slezine ili timusa se amplifikuju pomoću ljudskih TCR-V prajmera i sondi TAQMAN, prema uputstvima proizvođača i kao što je opisano u Primeru 8.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Genetski modifikovani glodar, koji u svom genomu sadrži:
nepreuređeni varijabilni genski lokus receptora T ćelija (TCR) α koji sadrži najmanje jedan ljudski Vα segment i najmanje jedan ljudski Jα segment, gde je TCRα varijabilni gen operativno povezan sa glodarskom TCRα konstantnom genskom sekvencom i/ili nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji sadrži barem jedan ljudski Vβ segment, najmanje jedan ljudski Dβ segment i najmanje jedan ljudski Jβ segment, gde je nepreuređeni TCRβ varijabilni gen operativno povezan sa glodarskom TCRβ konstantnom genom sekvencom, i
gde se genski segmenti nepreuređenog ljudskog varijabilnog regiona T ćelija mogu preurediti kako bi formirali gene koji kodiraju ljudske varijabilne domene receptora T ćelija, uključujući domene koje specifično vezuju antigen od interesa.
2. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde endogeni glodarski Vα i Jα segmenti nisu sposobni za preuređivanje kako bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu i/ili endogeni glodarski Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu sposobni za preuređivanje kako bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu.
3. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde glodaru nedostaje funkcionalni endogeni glodarski TCRα, tako da nedostatak funkcionalnog endogenog glodarskog TCRα varijabilnog lokusa sadrži brisanje izabrano iz grupe koja se sastoji od (a) uklanjanja svih endogenih Vα genskih segmenata (b) uklanjanje svih endogenih Jα genskih segmenata, i (c) njihova kombinacija i/ili u gde glodaru nedostaje funkcionalni endogeni glodarski TCRβ varijabilni lokus, tako da nedostatak funkcionalnog endogenog glodarskog TCRβ varijabilnog lokusa sadrži brisanje izabrano iz grupe koja se sastoji od: (a) uklanjanja svih endogenih Vβ genskih segmenata, (b) uklanjanja svih endogenih Dβ genskih segmenata, (c) uklanjanja svih endogenih Jβ genskih segmenata, i (d) njihove kombinacije.
4. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde se ljudski Vα i Jα segmenti preuređuju kako bi se formirala preuređena ljudska Vα/Jα sekvenca i/ili se ljudski Vβ, Dβ i Jβ segmenti preuređuju kako bi se formirala preuređena ljudska Vβ/Dβ/Jβ sekvenca.
5. Glodar prema patentnom zahtevu 4, gde glodar eksprimira receptor T ćelija koji sadrži ljudski TCRα i/ili TCRβ varijabilni domen na površini T ćelije.
6. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde T ćelije glodara podležu razvoju timuske T ćelije kako bi proizvele CD4 i CD8 jednostruko pozitivne T ćelije.
7. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde glodar sadrži normalni odnos CD3+ T ćelija slezine i ukupnih splenocita.
8. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde glodar generiše populaciju centralnih i efektorskih memorijskih T ćelija za antigen od interesa.
9. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus sadrži potpun repertoar ljudskih Jα segmenata i potpun repertoar ljudskih Vα segmenata i/ili nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus obuhvata potpun repertoar ljudskih Jβ segmenata, potpun repertoar ljudskih Dβ segmenta i potpun repertoar ljudskih Vβ segmenata.
10. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde glodar zadržava endogeni TCRα varijabilni genski lokus i/ili endogeni glodarski TCRβ varijabilni genski lokus, i gde je endogeni glodarski TCRα varijabilni genski lokusa nefunkcionalni lokus, i gde je endogeni glodarski TCRβ varijabilni genski lokus nefunkcionalni lokus.
11. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus zamenjuje ceo ili deo endogenog glodarskog TCRα genskog lokusa i/ili gde nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus zamenjuje ceo ili deo endogenog glodarskog TCRβ genskog lokusa.
12. Glodar prema patentnom zahtevu 1, gde je glodar miš.
13. Glodar prema patentnom zahtevu 12, gde nepreuređeni TCRα varijabilni genski lokus sadrži 61 ljudski Jα segment i 8 ljudskih Vα segmenata, i gde nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus sadrži 14 ljudskih Jβ segmenta, 2 ljudska Dβ segmenta i 14 ljudskih Vβ segmenata.
14. Glodar prema patentnom zahtevu 12, gde glodar dalje sadrži repertoar nepreuređenih segmenta ljudskog TCRδ varijabilnog regiona na humanizovanom TCR α lokusu.
15. Glodar prema patentnom zahtevu 13, gde glodar dalje sadrži potpun repertoar ljudskih Vδ segmenata, potpun repertoar ljudskih Dδ segmenta, i potpun repertoar ljudskih Jδ segmenta na humanizovanom TCRα varijabilnom lokusu.
16. Genetski modifikovan glodar prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je glodar miš koji u svom genomu sadrži:
nepreuređeni varijabilni genski lokus receptora T ćelija (TCR) α koji sadrži potpun repertoar ljudskih Jα segmenata, i potpun repertoar ljudskih Vα segmenata, operativno povezan sa mišjom TCRα konstantnom genskom sekvencom i
nepreuređeni TCRβ varijabilni genski lokus koji obuhvata potpun repertoar ljudskih Jβ segmenata, potpun repertoar ljudskih Dβ segmenta i potpun repertoar ljudskih Vβ segmenta, funkcionalno vezan za mišju TCRβ konstantnu gensku sekvencu.
17. Postupak proizvodnje ljudskog receptora T ćelija za antigen od interesa, koji obuhvata:
imunizaciju glodara bilo kog od prethodnih patentnih zahteva sa antigenom od interesa; dopuštanje glodaru da razvije imuni odgovor;
izolovanje iz glodara T ćelije koja reaguje na antigen od interesa;
određivanje sekvence nukleinske kiseline ljudskog TCR varijabilnog regiona eksprimiranog T ćelijom;
kloniranje ljudskog TCR varijabilnog regiona u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline ljudskog TCR konstantnog regiona, gde je ljudski TCR varijabilni region operativno povezan sa ljudskim TCR konstantnim regionom; i eksprimiranje u ćeliji ljudskog receptora T ćelija.
RS20181207A 2011-10-28 2012-10-26 Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija RS57893B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161552582P 2011-10-28 2011-10-28
US201261621198P 2012-04-06 2012-04-06
US201261700908P 2012-09-14 2012-09-14
PCT/US2012/062065 WO2013063361A1 (en) 2011-10-28 2012-10-26 Genetically modified t cell receptor mice
EP12784833.1A EP2771357B1 (en) 2011-10-28 2012-10-26 Genetically modified t cell receptor mice

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57893B1 true RS57893B1 (sr) 2019-01-31

Family

ID=47178340

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181207A RS57893B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija
RS20210210A RS61455B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210210A RS61455B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora

Country Status (25)

Country Link
US (3) US9113616B2 (sr)
EP (3) EP3795587A1 (sr)
JP (7) JP6254528B2 (sr)
KR (5) KR101964776B1 (sr)
CN (5) CN114891797A (sr)
AU (5) AU2012327204B2 (sr)
BR (1) BR112014009203B1 (sr)
CA (1) CA2853707A1 (sr)
CY (2) CY1120945T1 (sr)
DK (2) DK3424947T3 (sr)
ES (2) ES2691475T3 (sr)
HR (2) HRP20181626T1 (sr)
HU (1) HUE053444T2 (sr)
IL (4) IL274914B2 (sr)
IN (1) IN2014CN03890A (sr)
LT (2) LT3424947T (sr)
MX (2) MX379517B (sr)
PL (2) PL2771357T3 (sr)
PT (2) PT2771357T (sr)
RS (2) RS57893B1 (sr)
RU (1) RU2661106C2 (sr)
SG (2) SG11201401030WA (sr)
SI (2) SI3424947T1 (sr)
SM (2) SMT202100243T1 (sr)
WO (1) WO2013063361A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891797A (zh) * 2011-10-28 2022-08-12 瑞泽恩制药公司 T细胞受体基因修饰小鼠
CN103212064B (zh) * 2012-01-19 2016-02-17 中国科学院上海巴斯德研究所 磷酸化途径相关因子在调控调节性t细胞功能中的应用
CN104364380B (zh) 2012-04-25 2018-10-09 瑞泽恩制药公司 核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向
GB2508414A (en) * 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
CA2908697C (en) 2013-04-16 2023-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
SG10201700961TA (en) 2013-12-11 2017-04-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for the targeted modification of a genome
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
HUE049776T2 (hu) * 2014-06-06 2020-10-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására
HUE048677T2 (hu) * 2014-06-19 2020-07-28 Regeneron Pharma Humanizált programozott sejthalál 1 génnel rendelkezõ nem-humán állatok
EP3161128B1 (en) 2014-06-26 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
WO2016044745A1 (en) * 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
EP3221457B1 (en) 2014-11-21 2019-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
KR20240055876A (ko) * 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물
JP6840077B2 (ja) 2014-12-19 2021-03-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物
KR20240132525A (ko) * 2015-04-06 2024-09-03 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 비인간 동물에서의 인간화 t 세포 매개 면역반응
PL3291679T3 (pl) 2015-05-06 2022-04-25 Snipr Technologies Limited Zmiana populacji drobnoustrojowych i modyfikowanie mikrobioty
AU2016358101B2 (en) 2015-11-20 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized Lymphocyte-activation gene 3
CA3020330A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
ES2914648T3 (es) 2016-04-08 2022-06-15 Immunocore Ltd Receptores de células T
SI3462853T1 (sl) * 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
EP3638262A4 (en) * 2017-06-16 2021-03-24 Mayo Foundation for Medical Education and Research MATERIALS AND METHODS FOR INCREASING IMMUNE REACTION
CN111954679A (zh) 2017-10-03 2020-11-17 朱诺治疗学股份有限公司 Hpv特异性结合分子
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
KR20210029707A (ko) * 2018-04-05 2021-03-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 세포의 생산 방법 및 관련 조성물
EP3845638A4 (en) * 2018-07-26 2022-05-11 Kyoto University METHOD OF PRODUCTION OF A CELL DELIVERED BY A RECEPTOR GENE OF A FOREIGN ANTIGEN
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
CA3154287A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
AU2020395122A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-MHC II protein constructs and uses thereof
CN115485294A (zh) * 2020-03-27 2022-12-16 2赛文缇生物公司 T细胞受体
CN113684258B (zh) 2020-05-18 2024-08-20 上海赛比曼生物科技有限公司 用于检测鼠源tcr转基因拷贝数的试剂盒及方法
AU2022249328A1 (en) 2021-03-31 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice comprising humanized cellular immune system components with improved diversity of tcrβ repertoire
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
TW202417476A (zh) 2022-08-18 2024-05-01 英商英美偌科有限公司 Ｔ細胞受體及其融合蛋白
KR20250077529A (ko) * 2022-09-22 2025-05-30 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 인간 세포 면역계의 성분을 발현하는, 유전자적으로 변형된 마우스
TW202520975A (zh) 2023-08-09 2025-06-01 英商劍橋企業有限公司 基因改造之囓齒動物及囓齒動物細胞以及其等用途
GB2640828A (en) 2024-04-22 2025-11-12 T Therapeutics Ltd Methods and products for the generation and identification of T cells and TCRs
GB2642411A (en) 2024-04-22 2026-01-14 T Therapeutics Ltd T Cell Receptor identification and provision

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1994006908A1 (en) 1992-09-11 1994-03-31 The Regents Of The University Of California Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
WO1997032603A1 (en) 1996-03-05 1997-09-12 The Scripps Research Institute Recombinant constructs encoding t cell receptors specific for human hla-restricted tumor antigens
US6320306B1 (en) * 1996-08-05 2001-11-20 Samsung Display Devices Co., Ltd. Shadow mask with porous insulating layer and heavy metal layer
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
WO2001027291A1 (en) 1999-10-12 2001-04-19 Institut Pasteur Design of a polyepitopic construct for the induction of hla-a2.1 restricted hiv 1 specific ctl responses using hhd mice
US7462486B2 (en) 2000-05-12 2008-12-09 Oregon Health & Science University Methods of selecting T cell receptor V peptides for therapeutic use
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002222610A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof
AU2002246733B2 (en) * 2000-12-19 2007-09-20 Altor Bioscience Corporation Transgenic animals comprising a humanized immune system
FR2827302B1 (fr) 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
EP1421115B1 (en) 2001-08-31 2005-03-02 Avidex Limited Soluble t cell receptor
JP4087338B2 (ja) 2001-11-15 2008-05-21 キリンファーマ株式会社 キメラ非ヒト動物
DE60106469T2 (de) * 2001-12-22 2005-10-13 4-Antbody AG Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Lymphozyten Vorläuferzellen von Wirbeltieren und deren Gebrauch zur Produktion von heterologen Bindeproteinen
JP4238138B2 (ja) 2001-12-22 2009-03-11 ４−アンチボディ アーゲー 遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成方法及び異種結合タンパク質の産生を目的としたその使用。
DE10244457A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur rationalen Mutagenese von alpha/beta T-Zell Rezeptoren und entsprechend mutierte MDM2-Protein spezifische alpha/beta T-Zell Rezeptoren
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
AU2003279820A1 (en) * 2002-10-30 2004-06-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Mouse model for autoimmune disorders
US7663017B2 (en) * 2003-07-30 2010-02-16 Institut Pasteur Transgenic mice having a human major histocompatability complex (MHC) phenotype, experimental uses and applications
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
CA2651174A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services Chimeric t cell receptors and related materials and methods of use
EP1878342A1 (en) * 2006-07-13 2008-01-16 Institut Pasteur Immunodeficient mice transgenic for HLA class I and HLA class II molecules and their uses
WO2008051854A2 (en) 2006-10-20 2008-05-02 Trustees Of Boston University A tunable genetic switch for regulating gene expression
JP2008159109A (ja) 2006-12-21 2008-07-10 Matsushita Electric Ind Co Ltd データ転送装置
WO2009114400A1 (en) 2008-03-07 2009-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Es cell-derived mice from diploid host embryo injection
US20090328240A1 (en) 2008-06-24 2009-12-31 Sing George L Genetically modified mice as predictors of immune response
WO2010107400A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Agency For Science, Technology And Research Genetically modified animal and method of obtaining the same
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
GB0917090D0 (en) 2009-09-29 2009-11-11 Ucl Biomedica Plc T-cell receptor
US10464987B2 (en) 2009-10-06 2019-11-05 Abbvie Inc. Human single-chain T cell receptors
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US9557323B2 (en) 2010-09-24 2017-01-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Humanized transgenic mouse model
US10765093B2 (en) 2010-11-27 2020-09-08 James Zhu Humanized transgenic animal
CN114891797A (zh) * 2011-10-28 2022-08-12 瑞泽恩制药公司 T细胞受体基因修饰小鼠
KR20240132525A (ko) 2015-04-06 2024-09-03 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 비인간 동물에서의 인간화 t 세포 매개 면역반응

Also Published As

Publication number Publication date
KR102542272B1 (ko) 2023-06-13
JP2023024744A (ja) 2023-02-16
SMT201800553T1 (it) 2018-11-09
AU2018204700A1 (en) 2018-07-19
SI3424947T1 (sl) 2021-04-30
JP2014532413A (ja) 2014-12-08
JP7305840B2 (ja) 2023-07-10
PT2771357T (pt) 2018-11-09
KR102397961B1 (ko) 2022-05-13
JP2019033770A (ja) 2019-03-07
EP3424947A1 (en) 2019-01-09
HRP20181626T1 (hr) 2018-12-14
WO2013063361A1 (en) 2013-05-02
US20130109053A1 (en) 2013-05-02
US9113616B2 (en) 2015-08-25
CN104011071B (zh) 2017-11-07
KR102148387B1 (ko) 2020-08-26
IL305550B2 (en) 2025-02-01
BR112014009203B1 (pt) 2023-02-28
AU2012327204B2 (en) 2016-01-21
KR20210133325A (ko) 2021-11-05
IL274914B1 (en) 2023-10-01
NZ623147A (en) 2016-03-31
IL232098A0 (en) 2014-05-28
CY1123831T1 (el) 2022-05-27
IL232098B (en) 2020-06-30
JP2024019646A (ja) 2024-02-09
ES2858978T3 (es) 2021-09-30
CN104011071A (zh) 2014-08-27
RU2014121160A (ru) 2015-12-10
CA2853707A1 (en) 2013-05-02
US20220386575A1 (en) 2022-12-08
CN114891797A (zh) 2022-08-12
MX353134B (es) 2017-12-20
SG10201914043XA (en) 2020-03-30
DK3424947T3 (da) 2021-02-22
AU2021203192A1 (en) 2021-06-10
CN107858332A (zh) 2018-03-30
KR20220066197A (ko) 2022-05-23
CY1120945T1 (el) 2019-12-11
US11528895B2 (en) 2022-12-20
MX2014004894A (es) 2014-09-12
AU2018204700B2 (en) 2021-04-01
DK2771357T3 (en) 2018-10-29
ES2691475T3 (es) 2018-11-27
JP7656580B2 (ja) 2025-04-03
SI2771357T1 (sl) 2018-11-30
PL2771357T3 (pl) 2018-12-31
IL315445A (en) 2024-11-01
AU2016202512A1 (en) 2016-05-12
CN107858333A (zh) 2018-03-30
AU2021203192B2 (en) 2024-04-11
SMT202100243T1 (it) 2021-05-07
KR101964776B1 (ko) 2019-04-04
KR20190037354A (ko) 2019-04-05
JP6706311B2 (ja) 2020-06-03
HUE053444T2 (hu) 2021-06-28
IL274914B2 (en) 2024-02-01
CN114891798A (zh) 2022-08-12
US20160021856A1 (en) 2016-01-28
US20210051930A1 (en) 2021-02-25
AU2016202512C1 (en) 2018-10-11
JP6532924B2 (ja) 2019-06-19
EP3795587A1 (en) 2021-03-24
AU2018204700C1 (en) 2021-10-14
JP2020146045A (ja) 2020-09-17
JP6254528B2 (ja) 2017-12-27
PT3424947T (pt) 2021-03-01
IN2014CN03890A (sr) 2015-10-16
CN107858333B (zh) 2022-05-27
BR112014009203A2 (pt) 2020-10-27
EP2771357B1 (en) 2018-07-18
CN114891798B (zh) 2025-12-02
HK1198171A1 (en) 2015-03-13
PL3424947T3 (pl) 2021-06-14
AU2016202512B2 (en) 2018-03-29
AU2024204645A1 (en) 2024-08-01
JP2022093637A (ja) 2022-06-23
HRP20210256T1 (hr) 2021-04-02
EP2771357A1 (en) 2014-09-03
MX379517B (es) 2025-03-10
JP2018007696A (ja) 2018-01-18
EP3424947B1 (en) 2020-11-25
AU2012327204A1 (en) 2013-05-23
RS61455B1 (sr) 2021-03-31
SG11201401030WA (en) 2014-04-28
IL274914A (en) 2020-07-30
KR20140077219A (ko) 2014-06-23
LT3424947T (lt) 2021-03-10
KR102321909B1 (ko) 2021-11-05
LT2771357T (lt) 2018-10-25
KR20200102001A (ko) 2020-08-28
IL305550A (en) 2023-10-01
IL305550B1 (en) 2024-10-01
RU2661106C2 (ru) 2018-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220386575A1 (en) Genetically modified t cell receptor mice
US12582105B2 (en) Genetically modified T cell receptor mice
HK40049273A (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK40002846B (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK40002846A (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK1198171B (en) Genetically modified t cell receptor mice