JP6840077B2 - 単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物 - Google Patents

単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１２月１９日に出願された米国出願第６２／０９４，１０４号、２０１５年５月２８日に出願された米国出願第６２／１６７，４０８号、及び２０１５年８月１４日に出願された米国出願第６２／２０５，５２４号に関し、これらのそれぞれは、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ＥＦＳウェブを介してテキストファイルとして提出された）
（配列表の参照）
ファイル４７２２２４ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載される配列表は、１６．７ｋｂであり、２０１５年１２月１６日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
ゲノム遺伝子座で特定の核酸配列を付加、欠失、又は置換するように設計された標的化ベクターを使用した相同組み換えは、非ヒト動物において所望のゲノム修飾を実現する一般的な方法である。
相同組み換えを通じたゲノム修飾の技術は、過去２０年にわたって大幅に進歩しているが、多くの状況において、例えば、げっ歯類ゲノムの大部分が、大型ヒトゲノムフラグメントと置き換えられるか、又はある特定の細胞型、例えば、線維芽細胞若しくは他の体細胞を標的化しているとき、非常に大型の大型標的化ベクター、ＬＴＶＥＣを使用した許容できる標的化頻度を実現する困難さはまだ残る。
単一の隣接する核酸セグメントを形成するために互いと組み換えることが可能である２つ以上の標的化ベクターを利用する標的化系を介して、細胞内の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物が提供される。任意に、標的化ベクターは、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、ＬＴＶＥＣはそれぞれ、サイズが少なくとも１０ｋｂである。
本発明は、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法を提供し、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、細胞に導入することであって、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の５’アームは互いに、又は個々に１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの更なる５’及び３’ホモロジーアームに相同であり、それぞれは、更なる５’ホモロジーアーム及び更なる３’ホモロジーアームが隣接した更なる核酸挿入物を含み、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１の核酸挿入物、存在する場合には１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの１つ以上の更なる核酸挿入物、及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物、存在する場合には１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの１つ以上の更なる核酸挿入物、及び第２の核酸挿入物を含む、標的化された細胞を選択することと、を含む。任意に、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、及び１つ以上の更なるＬＴＶＥＣはそれぞれ、サイズが少なくとも１０ｋｂである。いくつかのそのような方法において、更なるＬＴＶＥＣは、存在する場合、第１のＬＴＶＥＣと第２のＬＴＶＥＣとの間に挿入される、１つ以上の他のＬＴＶＥＣである。
本発明はまた、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための二重標的化方法を提供し、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、細胞に導入することであって、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を含む、標的化された細胞を選択することと、を含む。
任意に、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
いくつかのそのような方法において、細胞は、ヒト細胞である。他のそのような方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼを含む。上記の方法のうちのいくつかにおいて、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、ヒト核酸である。
いくつかの方法において、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、又は約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂである。任意に、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである。任意に、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約３００ｋｂである。
いくつかの方法において、標的化された細胞は、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらは、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する。
いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの第１の重複配列は、第２のＬＴＶＥＣの第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。いくつかの方法において、第１の重複配列のサイズは、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。いくつかの方法において、第１の重複配列のサイズは、少なくとも１０ｋｂ又は少なくとも２０ｋｂである。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。任意に、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ及び第２のＬＴＶＥＣの組み合わせた使用は、単一のＬＴＶＥＣの使用と比較して標的化効率性の増大をもたらす。任意に、標的化効率性の増大は、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ又は第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ又は第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法のうちのいずれかによって生産された、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
本発明はまた、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための三重標的化方法を提供し、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、細胞に導入することであって、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、第３のＬＴＶＥＣの第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第３のＬＴＶＥＣの第３の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物を含む、標的化された細胞を選択することと、を含む。
任意に、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、第２の核挿入及び第２の３’ホモロジーアーム、並びに第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
いくつかのそのような方法において、細胞は、ヒト細胞である。他のそのような方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼを含む。いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
いくつかのそのような方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかのそのような方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物は、ヒト核酸である。
いくつかのそのような方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂである。任意に、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである。任意に、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約４００ｋｂである。
いくつかのそのような方法において、標的化された細胞は、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらは、約５ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する。
いくつかのそのような方法において、第１のＬＴＶＥＣの第１の重複配列は、第２のＬＴＶＥＣの第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一であり、かつ／又は第２のＬＴＶＥＣの第２の重複配列は、第３のＬＴＶＥＣの第２の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一である。いくつかのそのような方法において、第１の重複配列のサイズは、約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、かつ／又は第２の重複配列のサイズは、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。いくつかのそのような方法において、第１の重複配列のサイズは、少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂであり、かつ／又は第２の重複配列のサイズは、少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂである。
いくつかのそのような方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。任意に、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、又は第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかのそのような方法において、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、又は第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法のうちのいずれかによって生産された、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
本発明はまた、細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法を提供し、第１の核酸及び第２の核酸を細胞に導入することを含み、第１及び第２の核酸は、重複ヌクレオチド配列を含む。いくつかのそのような方法において、相同組み換えは、単一の核酸のみが細胞に導入される方法と比較して強化される。
いくつかのそのような方法において、相同組み換えは、ヌクレアーゼ剤の使用なしで標的ゲノム遺伝子座において強化される。いくつかのそのような方法は、標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することを更に含む。いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼを含む。いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
いくつかのそのような方法において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸、第２の核酸、又は両方の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第１の核酸が第２の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第２の核酸が第１の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。任意に、相同組み換えの強化は、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
いくつかのそのような方法において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。いくつかのそのような方法において、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。任意に、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂ、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂ、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂ、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約５５ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約６５ｋｂ、又は約６５ｋｂ〜約７０ｋｂである。いくつかのそのような方法において、重複配列は、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、又は少なくとも７０ｋｂである。任意に、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。
いくつかのそのような方法において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、第２の核酸は、重複配列を除いて、標的ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。任意に、第１の標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、又は約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。任意に、第１の標的化ベクターは、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、長さが少なくとも１０ｋｂである。任意に、第１の標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
いくつかのそのような方法において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の標的化ベクターであり、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである。任意に、第１の標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、若しくは約５ｋｂ〜約１０ｋｂであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、若しくは約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。任意に、第１の標的化ベクターは、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、第２の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、長さが少なくとも１０ｋｂであり、かつ／又は第２のＬＴＶＥＣは、長さが少なくとも１０ｋｂである。任意に、第１の標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、若しくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、かつ／又は第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、若しくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第１のＬＴＶＥＣ又は第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
いくつかの方法において、重複配列は、第１の核酸の３’末端及び第２の核酸配列の５’末端に位置する。いくつかの方法において、重複ヌクレオチド配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する。
いくつかのそのような方法において、細胞は、ヒト細胞である。他のそのような方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかのそのような方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法のうちのいずれかによって生産された、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
単一の隣接する核酸セグメントを形成するために互いと組み換えることが可能である２つ以上の標的化ベクターを利用する標的化系を介して、細胞内の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物が提供される。様々な実施形態において、標的化ベクターは、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。任意に、ＬＴＶＥＣはそれぞれ、サイズが少なくとも１０ｋｂである。
一実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供される。そのような方法は、標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを導入することであって、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的遺伝子座内の対応するセグメントに相同であり、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の５’アームは、互いに、又は個々に１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの更なる５’及び３’ホモロジーアームに相同であり、それぞれは、更なる５’ホモロジーアーム及び更なる３’ホモロジーアームが隣接した更なる挿入を含み、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１の挿入物、存在する場合には１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの１つ以上の更なる挿入物、及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される。任意に、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、及び１つ以上の更なるＬＴＶＥＣはそれぞれ、サイズが少なくとも１０ｋｂである。本方法は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物、存在する場合には１つ以上の更なる核酸挿入物、及び第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することを更に含む。そのような方法において、更なるＬＴＶＥＣは、存在する場合、第１のＬＴＶＥＣと第２のＬＴＶＥＣとの間に挿入される、１つ以上の他のＬＴＶＥＣである。
別の実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための二重標的化方法が提供される。そのような方法は、標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを導入することと、を含む。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣは、サイズが少なくとも１０ｋｂである。そのような方法において、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座が、対応するゲノムセグメント間の第１及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾されるように、標的遺伝子座内の対応するセグメントに相同である。本方法は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することを更に含む。
いくつかのそのような方法において、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
別の実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための三重標的化方法が提供される。そのような方法は、標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを導入することと、を含む。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣは、サイズが少なくとも１０ｋｂであり、第３のＬＴＶＥＣは、サイズが少なくとも１０ｋｂである。そのような方法において、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、第３のＬＴＶＥＣの第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第３のＬＴＶＥＣの第３の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座が、対応するゲノムセグメント間の第１、第２、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾されるように、標的遺伝子座内の対応するセグメントに相同である。本方法は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することを更に含む。
いくつかのそのような方法において、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、第２の核挿入及び第２の３’ホモロジーアーム、並びに第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
一実施形態において、細胞は、多能性細胞である。別の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、造血幹細胞又は神経幹細胞である。別の実施形態において、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞内の染色体外ＤＮＡ上に存在している。
一実施形態において、細胞は、線維芽細胞である。
いくつかの方法において、細胞は、非ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、ヒト由来である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。いくつかの場合において、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトから発現され、その核酸は、細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結されている。他の方法において、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡから発現される。いくつかのそのような方法において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。他のそのような方法において、ヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。更に他の方法において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。いくつかのそのような実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、細胞の種とは異なる種由来である。一実施形態において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び／又は第３の核酸挿入物は、異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、ヒト核酸である。別の実施形態において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び／又は第３の核酸挿入物は、ヒト核酸である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上は、ヒト核酸である。
一実施形態において、第１及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、又は約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂである。別の実施形態において、第１及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである。更に別の実施形態において、第１及び第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約３００ｋｂである。
いくつかの実施形態において、標的化された細胞は、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含む。
一実施形態において、第１、第２、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂである。
いくつかの実施形態において、標的化された細胞は、約５ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ第１、第２、及び第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含む。任意に、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである。いくつかの実施形態において、第１、第２、及び第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズは、約４００ｋｂである。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、第１のＬＴＶＥＣの第１の重複配列は、第２のＬＴＶＥＣの第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。上記の方法のうちのいくつかにおいて、第２のＬＴＶＥＣの第２の重複配列は、第３のＬＴＶＥＣの第２の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。上記の方法のうちのいずれかにおいて、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。具体的な実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。別の具体的な実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。上記の方法のうちのいくつかにおいて、第１の重複配列及び／又は第２の重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。いくつかの方法において、第１の重複配列及び／又は第２の重複配列は、少なくとも１０ｋｂ又は少なくとも２０ｋｂである。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加をもたらす。一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び／又は第３の核酸挿入物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加をもたらす。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失をもたらす。別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び／又は第３の核酸挿入物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失をもたらす。いくつかのそのような方法において、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の挿入の組み込みは、ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせをもたらす。更に別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び／又は第３の核酸挿入物の組み込みは、ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせをもたらす。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、第１のＬＴＶＥＣ及び第２のＬＴＶＥＣの組み合わせた使用は、単一のＬＴＶＥＣの使用と比較して標的化効率性の増大をもたらす。任意に、標的化効率性の増大は、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ又は第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの実施形態において、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、又は第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂであり、第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。他の実施形態において、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、又は第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、第３のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法が更に提供される。そのような方法は、非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法のうちのいずれかによって生産された、導入することと、代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
本発明はまた、細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法を提供し、第１の核酸及び第２の核酸を細胞に導入することを含み、第１及び第２の核酸は、重複ヌクレオチド配列を含む。いくつかのそのような方法において、相同組み換えは、単一の核酸のみが細胞に導入される方法と比較して強化される。いくつかのそのような方法において、相同組み換えは、ヌクレアーゼ剤の使用なしで標的ゲノム遺伝子座において強化される。他のそのような方法は、標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することを更に含む。
一態様において、ヌクレアーゼ剤の使用なしで細胞中のゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法が提供され、第１の核酸及び第２の核酸を細胞に導入することを含み、第１及び第２の核酸は、重複ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第１の核酸が第２の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第２の核酸が第１の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の核酸の相同組み換えを増大させる。
一実施形態において、相同組み換えの強化は、少なくとも０．５倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列に相同である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸のその重複配列と１００％同一である。
一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。いくつかの方法において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５０ｋｂ〜約５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５５ｋｂ〜約６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６０ｋｂ〜約６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６５ｋｂ〜約７０ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、少なくとも５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも７０ｋｂである。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、第２の核酸は、重複配列を除いて、ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターであり、第１の核酸は、重複配列を除いて、ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の標的化ベクターであり、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである。一実施形態において、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物は、隣接する核酸の重複フラグメントである。
一実施形態において、標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約２ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。
一実施形態において、標的化ベクターは、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。いくつかの方法において、標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶＬＴＶＥＣである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１のＬＴＶＥＣであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２のＬＴＶＥＣである。一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、第１のＬＴＶＥＣであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、第２のＬＴＶＥＣである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、第１の核酸の３’末端及び第２の核酸配列の５’末端に位置する。一実施形態において、重複配列は、第１の核酸配列の５’末端及び第２の核酸配列の３’末端に位置する。
一実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、異なる種由来である。別の実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、ヒト核酸である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、ヒト核酸である。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の挿入の組み込みは、ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加をもたらす。
いくつかの実施形態において、標的化された細胞は、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの方法において、標的化された細胞は、第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらは、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する。
別の実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の核酸挿入物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失をもたらす。一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、細胞は、ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
一実施形態において、細胞は、多能性細胞である。別の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、造血幹細胞又は神経幹細胞である。別の実施形態において、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞内の染色体外ＤＮＡ上に存在している。
一実施形態において、細胞は、線維芽細胞である。
いくつかの方法において、細胞は、非ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、ヒト由来である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。いくつかの場合において、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、重複ヌクレオチド配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法によって生産されたものである、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
別の態様において、ヌクレアーゼ剤を用いて細胞中のゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法が提供され、（ｉ）第１の核酸及び第２の核酸（第１及び第２の核酸は重複ヌクレオチド配列を含む）と、（ｉｉ）ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤とを、細胞に導入することを含む。
一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第１の核酸が第２の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第２の核酸が第１の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の核酸の相同組み換えを増大させる。一実施形態において、相同組み換えの強化は、少なくとも０．５倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列に相同である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と１００％同一である。
一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５０ｋｂ〜約５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５５ｋｂ〜約６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６０ｋｂ〜約６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６５ｋｂ〜約７０ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、少なくとも５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも７０ｋｂである。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、第２の核酸は、重複配列を除いて、ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターであり、第１の核酸は、重複配列を除いて、標的ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の標的化ベクターであり、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである。一実施形態において、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物は、隣接する核酸の重複フラグメントである。
一実施形態において、標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約２ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。
一実施形態において、標的化ベクターは、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。いくつかの方法において、標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ大型標的化ベクターである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、第１のＬＴＶＥＣであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、第２のＬＴＶＥＣである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクターであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２の大型標的化ベクターである。一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣ５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、第１の核酸の３’末端及び第２の核酸配列の５’末端に位置する。一実施形態において、重複配列は、第１の核酸配列の５’末端及び第２の核酸配列の３’末端に位置する。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトから発現され、その核酸は、細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡから発現される。一実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態において、ヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
一実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、異なる種由来である。別の実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、ヒト核酸である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、ヒト核酸である。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の挿入の組み込みは、ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加をもたらす。
いくつかの実施形態において、標的化された細胞は、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの方法において、標的化された細胞は、第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらは、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する。
別の実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の核酸挿入物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失をもたらす。一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、細胞は、ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
一実施形態において、細胞は、多能性細胞である。別の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、造血幹細胞又は神経幹細胞である。別の実施形態において、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞内の染色体外ＤＮＡ上に存在している。
一実施形態において、細胞は、線維芽細胞である。
いくつかの方法において、細胞は、非ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、ヒト由来である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。いくつかの場合において、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。
上記の方法のうちのいくつかにおいて、重複ヌクレオチド配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法によって生産されたものである、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
別の態様において、標的化ベクター上に組み換え機構を搭載することによって、細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法が提供され、第１の核酸及び第２の核酸を細胞に導入することを含み、第１及び第２の核酸は、重複ヌクレオチド配列を含み、重複ヌクレオチド配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する。
一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第１の核酸が第２の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、第２の核酸が第１の核酸なしで導入される方法と比較して、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化する。いくつかのそのような方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の核酸の相同組み換えを強化する。一実施形態において、相同組み換えの強化は、少なくとも０．５倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である。
一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列に相同である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である。一実施形態において、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸のその重複配列と１００％同一である。
一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５０ｋｂ〜約５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約５５ｋｂ〜約６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６０ｋｂ〜約６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約６５ｋｂ〜約７０ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、少なくとも５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも２５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも３５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも４５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも５５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも６５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも７０ｋｂである。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、第２の核酸は、重複配列を除いて、ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターであり、第１の核酸は、重複配列を除いて、ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の標的化ベクターであり、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである。一実施形態において、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物は、隣接する核酸の重複フラグメントである。
一実施形態において、標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約２ｋｂ〜約５ｋｂである。一実施形態において、標的化ベクターは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂである。
一実施形態において、標的化ベクターは、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。いくつかの方法において、標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶＬＴＶＥＣである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、第１のＬＴＶＥＣであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、第２のＬＴＶＥＣである。いくつかの方法において、第１の標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１のＬＴＶＥＣであり、かつ／又は第２の標的化ベクターは、約１０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２のＬＴＶＥＣである。一実施形態において、ＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。任意に、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。いくつかの方法において、第１のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂであり、第２のＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、１０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
一実施形態において、重複配列は、第１の核酸の３’末端及び第２の核酸配列の５’末端に位置する。一実施形態において、重複配列は、第１の核酸配列の５’末端及び第２の核酸配列の３’末端に位置する。
一実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、異なる種由来である。別の実施形態において、第１の核酸挿入物及び／又は第２の核酸挿入物は、ヒト核酸である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、細胞の種とは異なる種由来である。いくつかの方法において、第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方は、ヒト核酸である。
いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は両方の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。いくつかの方法において、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、及び第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みは、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす。
一実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の挿入の組み込みは、ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加をもたらす。
いくつかの実施形態において、標的化された細胞は、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ第１及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの方法において、標的化された細胞は、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらは、約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する。
別の実施形態において、ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の核酸挿入物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失をもたらす。一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである。
いくつかの方法において、細胞は、ヒト細胞である。他の方法において、細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの方法において、細胞は、多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である。任意に、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの方法において、細胞は、哺乳類細胞である。任意に、哺乳類細胞は、げっ歯類細胞である。任意に、げっ歯類細胞は、マウス細胞又はラット細胞である。
一実施形態において、細胞は、多能性細胞である。別の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、造血幹細胞又は神経幹細胞である。別の実施形態において、細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
一実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。別の実施形態において、標的ゲノム遺伝子座は、細胞内の染色体外ＤＮＡ上に存在している。
一実施形態において、細胞は、線維芽細胞である。
一実施形態において、細胞は、非ヒト細胞である。他の実施形態において、細胞は、ヒト由来である。他の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。別の実施形態において、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。
本発明はまた、Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法を提供し、（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、非ヒトＥＳ細胞は、上記の方法によって生産されたものである、導入することと、（ｂ）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることであって、代理母が、修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産する、懐胎させることと、を含む。任意に、非ヒト動物は、マウス又はラットである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目２）
前記第１の核酸挿入物及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それが、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方がヒト核酸である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、又は約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約３００ｋｂである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ又は少なくとも２０ｋｂである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方の前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、及び
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１のＬＴＶＥＣ及び前記第２のＬＴＶＥＣの組み合わせた使用が、単一ＬＴＶＥＣの使用と比較して標的化効率性の増大をもたらす、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記標的化効率性の増大が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１のＬＴＶＥＣ又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目１７）
前記第１の核挿入及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、前記第２の核挿入及び前記第２の３’ホモロジーアーム、並びに前記第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームが、前記隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１６又は１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上がヒト核酸である、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約４００ｋｂである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一であり、かつ／又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列が前記第３のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一である、項目１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂである、項目１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは、
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のＬＴＶＥＣ、前記第２のＬＴＶＥＣ、又は前記第３のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列の前記欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである、項目１２又は２７に記載の方法。
（項目３０）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法であって、第１の標的化ベクターと第２の標的化ベクターとを細胞に導入することを含み、前記第１の標的化ベクターが、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含み、前記第２の標的化ベクターが、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含み、
前記第１の３’ホモロジーアーム及び前記第２の５’ホモロジーアームが、重複ヌクレオチド配列を含み、
前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメントに相同である、方法。
（項目３１）
相同組み換えが、ヌクレアーゼ剤の使用なしで前記標的ゲノム遺伝子座において強化される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することを更に含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼである、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、前記標的ゲノム遺伝子座における前記第１の標的化ベクター、前記第２の標的化ベクター、又は両方の前記相同組み換えを強化する、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記相同組み換えの前記強化が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の標的化ベクターの前記重複配列が、前記第２の標的化ベクターの前記重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記重複配列が約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記重複配列が少なくとも２０ｋｂである、項目３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記第２の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４１又は４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４２又は４３に記載の方法。
（項目４５）
前記重複ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する、項目３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞がヒト細胞である、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞が非ヒト細胞である、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である、項目１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記哺乳類細胞がげっ歯類細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法であって、
（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、前記非ヒトＥＳ細胞が、項目１〜４５及び４７〜５２のいずれか一項に記載の方法によって生産されたものである、導入することと、
（Ｂ）代理母において前記非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、修飾を含む前記Ｆ０世代非ヒト動物を生産する、方法。
（項目５４）
前記非ヒト動物がマウス又はラットである、項目５３に記載の方法。
ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体１４上のＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞が標的化される、ゲノム二重標的化事象に関する模式図を提供する。ハイグロマイシン選択カセットは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）によって、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって開裂され、ネオマイシン選択カセット及び２８０ｋｂを超えるヒト免疫グロブリンカッパ鎖可変遺伝子セグメントを含む、２つの大型標的化ベクターで標的化される。大型標的化ベクターはそれぞれ約２０ｋｂの重複配列を含み、それは、大型標的化ベクター間の相同組み換えを可能にする。標的化事象は、単一の標的化ステップで、両方の標的化ベクターからのヒト免疫グロブリンカッパ鎖可変遺伝子セグメントを正確に挿入した。標的化事象を確認するために使用される様々なプローブの位置は、丸で囲んだ矩形として示される。マウス配列は、上向きの斜線の網掛けによって表され、ヒト配列は、網掛けなしで表され、組み換え部位及び選択カセットは、下向きの斜線の網掛けによって表される。模式図は、正確な縮尺ではなく、例えば、可変遺伝子セグメントの実際の数を反映していない。
ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体１４上のＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞が、ネオマイシン選択カセット及び１２０ｋｂのヒト免疫グロブリンカッパ鎖可変遺伝子セグメントを含む、１つの大型標的化ベクターで標的化される、単一の標的化事象に関する模式図を提供する。標的化事象を確認するために使用される様々なプローブの位置は、丸で囲んだ矩形として示される。マウス配列は、上向きの斜線の網掛けによって表され、ヒト配列は、網掛けなしで表され、組み換え部位及び選択カセットは、下向きの斜線の網掛けによって表される。模式図は、正確な縮尺ではなく、例えば、可変遺伝子セグメントの実際の数を反映していない。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用したハイグロマイシン選択カセットの標的化及び破壊に関する模式図を提供し、ハイグロマイシン遺伝子中の異なる配列を標的化する様々なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に対する、ＣＲＩＳＰＲ認識部位のハイグロマイシン遺伝子内の位置を示す。模式図は、正確な縮尺ではない。
ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体１４上のＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞が標的化される、ゲノム三重標的化事象に関する模式図を提供する。ハイグロマイシン選択カセットは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）によって、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって開裂され、ネオマイシン選択カセット及び約３７０ｋｂのヒト免疫グロブリンカッパ鎖可変遺伝子セグメントを含む、３つの大型標的化ベクターで標的化される。大型標的化ベクターはそれぞれ約２０ｋｂ〜約６０ｋｂの重複配列を含み、それは、大型標的化ベクター間の相同組み換えを可能にする。標的化事象は、単一の標的化ステップで、３つ全ての標的化ベクターからのヒト免疫グロブリンカッパ鎖可変遺伝子セグメントを正確に挿入した。標的化事象を確認するために使用される様々なプローブの位置は、丸で囲んだ矩形として示される。マウス配列は、上向きの斜線の網掛けによって表され、ヒト配列は、網掛けなしで表され、組み換え部位及び選択カセットは、下向きの斜線の網掛けによって表される。模式図は、正確な縮尺ではなく、例えば、可変遺伝子セグメントの実際の数を反映していない。
定義
本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、コード及び非コードアミノ酸、並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。それらの用語はまた、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されたポリマーを含む。
本明細書で互換的に使用される用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの類似体若しくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。それらは、プリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにポリマーを含む。
標的ゲノム遺伝子座は、標的化ベクターを用いた標的化修飾によって修飾されるゲノムの領域を意味する。その領域は、標的化ベクター内のホモロジーアームに対応するゲノムＤＮＡのセグメントの外縁内の領域として定義され得る。標的ゲノム遺伝子座は、遺伝子、１つ以上のイントロン、１つ以上のエクソン、１つ以上の調節配列などの遺伝子又は遺伝子の群のうちのいずれか又は全部を含むことができる。
「コドン最適化」は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子中でより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンと置換することによって、特定の宿主細胞中の発現の強化のために核酸配列を修飾する工程を概ね含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、自然発生的核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は任意の他の宿主細胞を含む所与の原核又は真核細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、いくつかの方法で適用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現に対する特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムもまた、入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
「操作可能な連結」又は「操作可能に連結」されていることは、両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性を可能にするような、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並置を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在又は非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結され得る。
用語「多能性細胞」又は「多能性幹細胞」は、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性細胞は、例えば、哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞又は哺乳類誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。
「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」という用語には、インビトロで未分化増殖できる、胚由来の全能性又は多能性細胞が含まれ、胚への導入により、発生中の胚のいかなる組織にも寄与することができる。
用語「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、分化した成人細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞を含む。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、並びに／又は、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及び／若しくはＧｌｉｓ１などの関連転写因子を含んでもよい、非多能性細胞内にリプログラミング因子の特定の一群を導入することによって発生させることができる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する小分子、又は系譜特異化剤の使用によって発生させてもよい。ヒトｉＰＳ細胞は、３種類の脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、又は内胚葉のうちいずれかの細胞に分化する能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１２６（４），ｐｐ．６６３〜６７６）を参照されたい。
免疫グロブリン核酸配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。
核酸の「相補性」は、そのヌクレオ塩基の基の配向によって、核酸の１つの鎖中のヌクレオチド配列が、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ中の相補的塩基は、通常は、ＴとＡ及びＧとＣである。ＲＮＡ中では、それらは、通常は、ＧとＣ及びＡとＵである。相補性は、完全又は実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、この２つの核酸が、二重鎖中の全ての塩基がワトソン−クリック対合によって相補的塩基に結合される二重鎖を形成することができることを意味する。「実質的な」又は「十分な」相補性は、１つの鎖中の配列が対向する鎖中の配列に全面的及び／又は完璧に相補的ではないが、２つの鎖上の塩基間で十分な結合が生じて、一組のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）下で、安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。そのような条件は、配列及びハイブリダイズ鎖のＴｍ（融解温度）を予測するための標準的な数学的計算を使用することによって、又は常法を用いたＴｍの経験的決定によって予測され得る。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性される（即ち、二本鎖核酸分子の集団が半分一本鎖に解離される）温度を含む。Ｔｍ未満の温度においては、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利に働く一方で、Ｔｍを超える温度においては、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解又は分離に有利に働く。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に対して推定されてもよいが、他の既知のＴｍ計算は、核酸構造特徴を考慮に入れる。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が、ハイブリダイゼーション複合体を生み出すために、相補鎖相互作用及び水素結合によって第２の核酸鎖に結合する、累積的な環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性又は有機溶液の化学構成成分及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法などの他の要因が環境に寄与し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１１．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい。
ハイブリダイゼーションは、塩基間のミスマッチの可能性はあるものの、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。短区間の相補性（例えば、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２２個以下、２０個以下、又は１８個以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関して、ミスマッチの位置は重要になる（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１１．７〜１１．８を参照されたい）。通常は、ハイブリダイズ可能な核酸に対する長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸に対する例示的な最小長は、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。更に、温度及び洗浄溶液塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調整されてもよい。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含んでもよい。例えば、２０個中１８個のヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、ｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドには、相補的ヌクレオチドが群がって又は点在していてもよく、互いに又は相補的ヌクレオチドに接触している必要はない。
核酸内の核酸配列の特定の区間の間の相補性パーセントは、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６）を使用して、又は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）を使用するデフォルト設定を用いる、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して、規定通りに決定することができる。
本明細書に提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成成分を採用する。いくつかの構成成分が活性な変異体及びフラグメントを有することができることが、本明細書全体を通して認識される。そのような構成成分としては、例えば、ヌクレアーゼ剤、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれに関する生物活性は、本明細書の別の箇所に記載される。
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連での「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大限に一致するようにアラインメントされたときに同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基部分は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なることが認識され、この保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換の点で異なるとき、配列同一性の百分率は、置換の保存的性質を考慮して補正するように上方調節されてもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると称される。この調節を行うための手段は、周知である。通常は、これは、保存的置換を完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、配列同一性の百分率を増加させることを伴う。したがって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換は、ゼロ〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実装されるように計算される。
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定された値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、基準配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
特に指示がない限り、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータ、即ち、５０のＧＡＰ重み及び３の長さ重み並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用するヌクレオチド配列に対する％同一性及び％類似性、８のＧＡＰ重み及び２の長さ重み並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用するアミノ酸配列に対する％同一性及び％類似性、又はそれらの任意の同等のプログラムを用いる、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、当該の任意の２つの配列に関して、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって生成された対応するアラインメントと比較したとき、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチ及び同一の配列同一性の百分率を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを含む。
「相同の」配列は、それが既知の基準配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるように、既知の基準配列と同一、又は実質的に同様のいずれかである核酸配列が含まれる。「オルソロガス」配列は、別の種において既知の基準配列と機能的に同等の、ある種からの核酸配列を含む。
用語「インビトロ」は、人工環境、及び人工環境（例えば、試験管）内で生じる過程又は反応を含む。用語「インビボ」は、自然環境（例えば、細胞又は生物又は身体）、及び自然環境内で生じる過程又は反応を含む。用語「エクスビボ」は、個体の体から取り出された細胞、及びそのような細胞内で生じる過程又は反応を含む。
１つ以上の列挙された要素を「備える（comprising）」又は「含む（including）」組成物又は方法は、特に列挙されていない他の要素を含んでもよい。例えば、あるタンパク質を「備える（comprises）」又は「含む（includes）」組成物は、そのタンパク質を単独で、又は他の成分と組み合わせて含有してもよい。
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を画定する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
文脈から明らかではない限り、用語「約」は、規定された値の測定の標準的な標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「Ｃａｓタンパク質」又は「少なくとも１つのＣａｓタンパク質」は、これらの混合物を含む複数のＣａｓタンパク質を含むことができる。
Ｉ．複数の標的化ベクターを使用したゲノムの修飾
細胞内の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物が提供される。そのような方法は、単一の隣接する核酸セグメントを形成するために互いと組み換えることが可能である、複数の標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を採用する。そのような方法は、単一の標的化ステップで１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣを利用することができる。細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法及び組成物もまた提供される。そのような方法は、１つ以上の重複配列を含む２つ以上の核酸を採用する。本明細書に開示される方法のうちのいずれも、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで生じることができる。
Ａ．二重標的化
二重標的化方法を介して、細胞内の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物が提供される。本方法及び組成物は、単一の隣接する核酸セグメントを形成するために互いと組み換えることが可能である、２つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（即ち、第１のＬＴＶＥＣ及び第２のＬＴＶＥＣ）を採用する。第１のＬＴＶＥＣは、第１の核酸挿入物を含み、第２のＬＴＶＥＣは、第２の核酸挿入物を含む。核酸挿入物には、５’及び３’ホモロジーアームが隣接している。第１の核酸挿入物及びその３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及びその５’ホモロジーアームは、同じ隣接する核酸の重複フラグメントであり得る。第１のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣ重複の５’ホモロジーアーム（即ち、互いに相補的である）、並びに第１及び第２の挿入物は、重複ホモロジーアームと隣接する。そのような方法は、任意の順序で生じることができる３つの組み換え事象、（１）第１のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームと第２のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームとの間の組み換え、（２）第１のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームと標的遺伝子座中の対応するセグメントとの間の組み換え、及び（３）第２のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームと標的遺伝子座中の対応するセグメントとの間の組み換えを伴う。この三元の組み換えは、ホモロジーアームの重複配列が第１の核酸挿入物と第２の核酸挿入物との間に位置付けられた、標的遺伝子座中の隣接する核酸を再構成する。
ＬＴＶＥＣのそれぞれはまた、単一の隣接する核酸セグメンの組み換え及び組み込みを可能にする、標的ゲノム遺伝子座内、又はその付近のＤＮＡの領域に相同である５’又は３’ホモロジーアームのいずれかを含む。したがって、三元の組み換え事象によって、大きい核酸修飾（即ち、欠失、挿入、及び／又は置き換え）が単一の標的化ステップで、標的遺伝子座において行われ得る。
３つの組み換え事象は、任意の順序で生じることができる。一実施形態において、２つのＬＴＶＥＣの重複配列間の組み換え事象は、標的遺伝子座との相同組み換えの前に生じる。別の実施形態において、標的遺伝子座との組み換えは、２つのＬＴＶＥＣ間の組み換え前に生じる。更に別の実施形態において、３つの組み換え事象は、同時に生じることができる。
一実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供される。そのような方法は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを導入することを含み、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される。本方法は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することを更に含む。
Ｂ．三重標的化
三重標的化方法を介して、細胞内の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物もまた提供される。本方法及び組成物は、単一の隣接する核酸セグメントを形成するために互いと組み換えることが可能である、３つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（即ち、第１のＬＴＶＥＣ、第２のＬＴＶＥＣ、及び第３のＬＴＶＥＣ）を採用する。第１のＬＴＶＥＣは、第１の核酸挿入物を含み、第２のＬＴＶＥＣは、第２の核酸挿入物を含み、第３のＬＴＶＥＣは、第３の核酸挿入物を含む。核酸挿入物には、５’及び３’ホモロジーアームが隣接している。第１の核酸挿入物及びその３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及びその５’ホモロジーアームは、同じ隣接する核酸の重複フラグメントであり得る。第２の核酸挿入物及びその３’ホモロジーアーム、並びに第３の核酸挿入物及びその５’ホモロジーアームは、同じ隣接する核酸の重複フラグメントであり得る。第１のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣ重複の５’ホモロジーアーム（即ち、互いに相補的である）、並びに第１及び第２の挿入物は、重複ホモロジーアームと隣接する。第２のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアーム及び第３のＬＴＶＥＣ重複の５’ホモロジーアーム（即ち、互いに相補的である）、並びに第１及び第２の挿入物は、重複ホモロジーアームと隣接する。
そのような方法は、任意の順序で生じることができる４つの組み換え事象、（１）第１のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームと第２のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームとの間の組み換え、（２）第２のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームと第３のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームとの間の組み換え、（３）第１のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームと標的遺伝子座中の対応するセグメントとの間の組み換え、及び（４）第３のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアームと標的遺伝子座中の対応するセグメントとの間の組み換えを伴う。この四元の組み換えは、ホモロジーアームの重複配列が第１の核酸挿入物と第２の核酸挿入物との間に、かつ第２の核酸挿入物と第３の核酸挿入物との間に位置付けられた、標的遺伝子座中の隣接する核酸を再構成する。
第１及び第３のＬＴＶＥＣはまた、単一の隣接する核酸セグメンの組み換え及び組み込みを可能にする、標的ゲノム遺伝子座内、又はその付近のＤＮＡの領域に相同である５’又は３’ホモロジーアームのいずれかを含む。したがって、四元の組み換え事象によって、大きい核酸修飾（即ち、欠失、挿入、及び／又は置き換え）が単一の標的化ステップで、標的遺伝子座において行われ得る。
４つの組み換え事象は、任意の順序で生じることができる。一実施形態において、３つのＬＴＶＥＣの重複配列間の組み換え事象は、標的遺伝子座との相同組み換えの前に生じる。別の実施形態において、標的遺伝子座との組み換えは、３つのＬＴＶＥＣ間の組み換え前に生じる。更に別の実施形態において、４つの組み換え事象は、同時に生じることができる。
一実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供される。そのような方法は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを導入することを含み、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、第３のＬＴＶＥＣの第３の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第３のＬＴＶＥＣの第３の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１、第２、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される。本方法は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することを更に含む。
Ｃ．複数のＬＴＶＥＣを用いた標的化
単一の標的化ステップで遺伝子修飾を引き起こすための本明細書に提供される標的化方法は、単一のＬＴＶＥＣ標的化方法で達成されるものと比べて、標的化遺伝子修飾のための新しい可能性及び強化された効率性を提供する。互いと組み換えることが可能である２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣを用いた標的化は、ＤＮＡのより大きいセグメントの修飾を可能にする。組み換え事象は、任意の順序で生じることができる。例えば、ＬＴＶＥＣの重複配列間の組み換え事象は、標的遺伝子座との相同組み換え前に生じることができる。あるいは、標的遺伝子座との組み換えは、ＬＴＶＥＣ間の組み換え前に生じることができるか、又は組み換え事象は同時に生じることができる。
本明細書に記載される標的化方法は、既存の単一のＬＴＶＥＣ標的化方法と比べて、標的化効率性の増大、遺伝子修飾の達成可能なサイズの増大、及び大きいゲノム修飾を得るために必要な標的化ステップの数の低減を含む、いくつかの利点を提供し、それは、時間を節約し、修飾した胚性幹細胞の多能性を維持する。これは、本方法が単一のステップで２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの核酸挿入物の組み合わせを用いたゲノム遺伝子座の修飾を可能にするため、大きいゲノム修飾にとって特に重要である。したがって、そのような修飾は、標的化ゲノム遺伝子座内の非常に大きい（例えば、５０ｋｂ超の）欠失、置き換え、及び挿入を可能にすることができる。
例えば、標的ゲノム遺伝子座を修飾し、標的化修飾をスクリーニング及び確認するために順次に３つのＬＴＶＥＣを使用するために必要とされる時間が、約９ヶ月である一方で、同じ修飾が、３つのＬＴＶＥＣを同時に用いて、わずか約４ヶ月で行われ、かつ確認され得る。
順次の修飾はまた、胚性幹細胞などの多能性細胞が修飾されるとき、多能性及び生殖細胞系伝達能力の損失のより高いリスクを引き起こす。培養における継代数が増加し、エレクトロポレーションの数が増加するにつれて、染色体及び核型異常が蓄積し、生殖細胞系能力の損失を引き起こす可能性がある。例えば、Ｂｕｅｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３５：１２８７〜１２９８、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３５（７）：１２９９〜１３１０、及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０９：８５〜９１を参照されたく、それらのそれぞれは、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。順次の代わりに同時に複数のＬＴＶＥＣを使用した標的化は、継代数及びエレクトロポレーションの数を低減し、それにより、胚性幹細胞などの多能性細胞中の遺伝子操作を実施すると同時に、それらの生殖細胞系能力を保持する能力を高める。
特定の実施形態において、遺伝子修飾は、１つ以上の内因性核酸の修飾、１つ以上の内因性核酸の置換、異種核酸による内因性核酸の置き換え、ノックアウト、又はノックインを含む。具体的な実施例において、遺伝子修飾は、少なくとも２つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を細胞に導入することによって導入される。別の実施例において、遺伝子修飾は、少なくとも３つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を細胞に導入することによって導入される。そのような実施例において、ＬＴＶＥＣは、細胞の標的ゲノム遺伝子座に挿入されるＤＮＡを含むことができる。
いくつかの実施形態において、標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法は、遺伝子修飾を哺乳類細胞に導入することを含む。同様に、本発明は、遺伝子修飾を含む哺乳類細胞を提供する。
細胞中で標的化遺伝子修飾を行うための様々な方法が使用され得る。例えば、上記のように、標的化遺伝子修飾は、相同組み換え事象を介して標的化遺伝子修飾を発生させる系を採用する。他の場合には、細胞は、標的化されたゲノム遺伝子座において一本鎖又は二本鎖切断を発生させるヌクレアーゼ剤を使用して修飾され得る。一本鎖又は二本鎖切断は、次いで、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）によって修復される。例えば、大型標的化ベクターの使用を含む、そのような標的化遺伝子修飾を発生させるための例示的な方法は、本明細書の別の箇所で詳細に考察される。また、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０〜９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１〜９、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０〜５３２を参照されたく、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
標的化ベクターと標的遺伝子座との間の相同組み換えによる標的化遺伝子改変は、特にげっ歯類胚性幹細胞以外の細胞型で、非常に非効率的であり得る。標的遺伝子座におけるヌクレアーゼ特異的二本鎖ＤＮＡ切断と組み合わせた標的化ベクターの使用は、欠失又は挿入などの修飾のための標的化効率性を大幅に強化することができる。同様に、標的遺伝子座におけるヌクレアーゼ特異的一本鎖ＤＮＡ切断と組み合わせた標的化ベクターの使用は、修飾のための標的化効率性を大幅に強化することができる。
いくつかの実施形態において、ＬＴＶＥＣは、標的化されたゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤と組み合わせて採用され得る。そのような方法は、ヌクレアーゼ剤を細胞に導入することを更に含む。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。別の実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系である。
一実施形態において、複数のＬＴＶＥＣを利用することによって、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供される。そのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを導入することであって、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメントに相同であり、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の５’アームは、互いに、又は個々に１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの更なる５’及び３’ホモロジーアームに相同であり、それぞれは、更なる５’ホモロジーアーム及び更なる３’ホモロジーアームが隣接した更なる挿入を含み、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１の核酸挿入物、１つ以上の更なるＬＴＶＥＣの１つ以上の更なる核酸挿入物（存在する場合）、及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた第１の核酸挿入物、１つ以上の更なる核酸挿入物（存在する場合）、及び第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む。そのような方法において、更なるＬＴＶＥＣは、存在する場合、第１のＬＴＶＥＣと第２のＬＴＶＥＣとの間に挿入される、１つ以上の他のＬＴＶＥＣである。
一実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための二重標的化方法が提供され、本方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを導入することを含み、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１及び第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む。そのような方法において、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
一実施形態において、細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための三重標的化方法が提供され、本方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、細胞に導入することと、（ｂ）第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを導入することを含み、第１のＬＴＶＥＣの第１の３’ホモロジーアームは、第２のＬＴＶＥＣの第２の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第２のＬＴＶＥＣの第２の３’ホモロジーアームは、第３のＬＴＶＥＣの第３の５’ホモロジーアームに相同の重複配列を有し、第１のＬＴＶＥＣの第１の５’ホモロジーアーム及び第３のＬＴＶＥＣの第３の３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、標的ゲノム遺伝子座は、対応するゲノムセグメント間の第１、第２、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座中に組み込まれた第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む。そのような三重標的化方法において、第１の核挿入及び第１の３’ホモロジーアーム、並びに第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、第２の核挿入及び第２の３’ホモロジーアーム、並びに第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームは、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、標的ゲノム遺伝子座への第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、及び第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される。
いくつかの場合において、２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣが同時に導入され得る。あるいは、２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣが、順次に導入され得るか、又は異なる時間に導入され得る。
標的化系の様々な構成要素としては、例えば、標的化ベクター、ヌクレアーゼ剤、標的ゲノム遺伝子座、核酸挿入物、対象となるポリヌクレオチド、及び／又は他の構成要素が挙げられ得、それらのそれぞれは、本明細書の別の箇所で詳細に記載される。
Ｄ．複数の重複核酸を用いた標的化
単一の標的化ステップで遺伝子修飾を引き起こすための本明細書に提供される標的化方法は、単一の核酸で達成されるものと比べて、標的化遺伝子修飾のための新しい可能性及び強化された効率性を提供する。互いと組み換えることが可能である２つ、３つ、又はそれよりも多くの核酸を用いた標的化は、ＤＮＡのより大きいセグメントの修飾を可能にし、ヌクレアーゼ剤の非存在下でさえ、単一の核酸単独よりも強化された標的化効率性を提供することができる。ヌクレアーゼ剤なしのそのような方法は、ヌクレアーゼを使用した方法に必要とされるスクリーニングが、開裂を確認し、オフターゲット効果を調べる追加のスクリーニングステップを伴い、より複雑であり、時間がかかるため、ヌクレアーゼ剤を採用する方法よりも有利であり得る。十分な長さの重複領域を伴う核酸（例えば、ＬＴＶＥＣ）は、標的化ヌクレアーゼの非存在下でさえ、標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化することができる。一例として、十分な長さの重複領域を伴う２つの核酸の使用は、単一の核酸の使用と比較して、標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化することができる。機構の理解は実践のために必要とされないが、相同組み換えは、核酸（例えば、ＬＴＶＥＣ）上への組み換え機構（例えば、ＥｘｏＩ、Ｒａｄ５１、ＢＲＣＡ２など）の搭載によって、そのような状況下で強化され、それにより、標的遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進すると考えられる。
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するか、又は標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法が本明細書に記載され、第１及び第２の核酸を細胞に導入することを含み、第１及び第２の核酸は、重複ヌクレオチド配列を含む。第１及び第２の核酸は、例えば、直鎖核酸であってもよい。そのような方法は、互いと組み換えることが可能である３つ以上の核酸を細胞に導入することを含むことができる。例えば、第１及び第２の核酸は、第１の重複配列を有することができ、第２及び第３の核酸は、第２の重複配列を有することができる。いくつかの方法において、ヌクレアーゼの補助なしで、標的ゲノム遺伝子座が修飾されるか、又は標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えが強化される。他の方法において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、又はＣａｓ９及びガイドＲＮＡなど、標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼを用いて、標的ゲノム遺伝子座が修飾されるか、又は標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えが強化される。
本方法は、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えを強化することができる、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えを強化することができる、又は標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の核酸の両方の相同組み換えを強化することができる。一例として、標的ゲノム遺伝子座における第１の核酸の相同組み換えは、第１の核酸が第２の核酸なしで導入される方法と比較して強化され得る。同様に、標的ゲノム遺伝子座における第２の核酸の相同組み換えは、第２の核酸が第１の核酸なしで導入される方法と比較して強化され得る。相同組み換えの強化は、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍であってもよい。いくつかの方法において、ヌクレアーゼなしの強化は、ヌクレアーゼを用いた強化と比較可能であってもよい。例えば、ヌクレアーゼを用いた強化の倍率変化は、ヌクレアーゼなしの強化と比較して、
０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１．０倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍であってもよい。いくつかの場合において、ヌクレアーゼなしの強化は、ヌクレアーゼを用いた強化と同じであるか、又はそれより大きくなってもよい。
第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列に相同であってもよい。例えば、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一であってもよい。あるいは、第１の核酸の重複配列は、第２の核酸の重複配列と１００％同一であってもよい。
重複配列は、例えば、約１ｋｂ〜約７０ｋｂ又はそれよりも長くてもよい。例えば、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂ、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂ、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂ、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５５ｋｂ、約５５ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約６５ｋｂ、約６５ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２０ｋｂ、約２２０ｋｂ〜約２４０ｋｂ、約２４０ｋｂ〜約２６０ｋｂ、約２６０ｋｂ〜約２８０ｋｂ、又は約２８０ｋｂ〜約３００ｋｂであってもよい。一例として、重複配列は、約２０ｋｂ〜約６０ｋｂであってもよい。あるいは、重複配列は、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２０ｋｂ、少なくとも２４０ｋｂ、少なくとも２６０ｋｂ、少なくとも２８０ｋｂ、又は少なくとも３００ｋｂであってもよい。
重複配列は、第１及び第２の核酸内のどこでも位置することができる。例えば、重複配列は、第１の核酸の３’末端及び第２の核酸の５’末端に位置することができる。あるいは、重複配列は、第１の核酸の５’末端及び第２の核酸の３’末端に位置することができる。
いくつかの方法において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターである。第２の核酸は、プラスミド、標的化ベクター、又は大型標的化ベクターなど、重複配列を含む任意の核酸であってもよい。いくつかの方法において、第２の核酸は、重複配列を除いて、標的ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。例えば、第２の核酸は、重複配列から本質的になることができるか、又は重複配列からなることができる。
いくつかの方法において、第１の核酸は、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、第２の核酸は、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである。
第１の標的化ベクターは、任意のサイズを有することができる。同様に、第２の標的化ベクターは、任意のサイズを有することができる。例えば、第１及び／又は第２の標的化ベクターは、約１ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約５ｋｂ、又は約５ｋｂ〜約１０ｋｂであってもよい。第１の標的化ベクターはまた、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であってもよい。同様に、第２の標的化ベクターは、ＬＴＶＥＣであってもよい。ＬＴＶＥＣの例示的なサイズは、本明細書の別の箇所に開示される。例えば、第１及び／又は第２のＬＴＶＥＣは、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、又は約７５０ｋｂ〜約８００ｋｂであってもよい。
いくつかの方法において、第１の核酸は、ＬＴＶＥＣであり、第２の核酸は、プラスミド又は標的化ベクターなど、重複配列を含むより小さい核酸である。いくつかの方法において、第２の核酸は、重複配列を除いて、標的ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない。例えば、第２の核酸は、重複配列から本質的になることができるか、又は重複配列からなることができる。
いくつかの方法において、第１の核酸挿入物及び第２の核酸挿入物は、隣接する核酸の重複フラグメントである。いくつかの方法において、第１及び／又は第２の核酸挿入物は、細胞の種とは異なる種由来であってもよい。例えば、第１及び／又は第２の核酸挿入物は、ヒト核酸であってもよい。
本方法は、標的ゲノム遺伝子座への第１及び／又は第２の核酸挿入物の組み込みをもたらすことができる。組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における配列の付加、標的ゲノム遺伝子座における配列の欠失、又は標的ゲノム遺伝子座における配列の置き換えをもたらすことができる。例えば、組み込みは、標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、又は標的ゲノム遺伝子座における外因性配列での内因性配列の置き換えをもたらすことができる。標的ゲノム遺伝子座に挿入される第１の核酸挿入物、第２の核酸挿入物、又は第１及び第２の核酸挿入物の組み合わせは、例えば、約５ｋｂ〜約５００ｋｂであってもよい。他の例示的な核酸挿入物及び挿入サイズは、本明細書の別の箇所に開示される。標的ゲノム遺伝子座における欠失は、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂであってもよい。他の例示的な欠失サイズは、本明細書の別の箇所に開示される。
標的化された細胞は、本明細書に提供される細胞型のうちのいずれであってもよく、標的ゲノム遺伝子座は、細胞内の任意のＤＮＡであってもよい。例えば、標的ゲノム遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在し得るか、又はそれは、細胞内の染色体外ＤＮＡ上に存在し得る。
ＩＩ．核酸挿入物及び標的化ベクター
Ａ．核酸挿入物
１つ以上の核酸挿入物は、本明細書に開示される方法で採用され得、それらは、別々の標的化ベクターを介して、又は同じ標的化ベクター上で細胞に導入され得る。核酸挿入物は、ゲノム標的遺伝子座において組み込まれることとなるＤＮＡのセグメントを含む。標的遺伝子座における核酸挿入物の組み込みは、標的遺伝子座への対象となる核酸配列の追加、標的遺伝子座における対象となる核酸配列の欠失、及び／又は標的遺伝子座における対象となる核酸配列の置換をもたらすことができる。
本方法は、従来の単一の標的化技術（即ち、単一のＬＴＶＥＣ）を使用して達成され得るサイズよりも大きい核酸挿入物を用いたゲノム遺伝子座の修飾を提供する。そのような方法において、核酸挿入物は、２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣ上に含まれる。ＬＴＶＥＣは、それらが、２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの組み合わせた核酸挿入物を含むＤＮＡの単一の大きいセグメントを形成するために、互いと組み換えることが可能であるように設計される。
そのような方法において、核酸挿入物には、５’及び３’ホモロジーアームが隣接している。第１の核酸挿入物に隣接する３’ホモロジーアーム及び第２の核酸挿入物に隣接する５’ホモロジーアームは、同じ隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは次いで、ホモロジーアームの重複フラグメント間の組み換えによって改質される。そのような方法において、２つのＬＴＶＥＣ間の組み換えは、ホモロジーアームの重複配列が第１の核酸挿入物と第２の核酸挿入物との間に位置付けられた、隣接する核酸挿入物をもたらす。三重標的化方法は、第２のＬＴＶＥＣと第３のＬＴＶＥＣとの間の更なる組み換えを伴い、第２の核酸挿入物に隣接する３’ホモロジーアーム及び第３の核酸挿入物に隣接する５’ホモロジーアームは、同じ隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは次いで、ホモロジーアームの重複フラグメント間の組み換えによって改質される。そのような三重標的化方法において、３つのＬＴＶＥＣ間の組み換えは、ホモロジーアームの重複配列が第１、第２、及び第３の核酸挿入物の間に位置付けられた、隣接する核酸挿入物をもたらす。一実施形態において、ホモロジーアームの重複配列は、核酸挿入物の一部分を含む。
したがって、これらの方法は、単一の標的化ステップで２つ、３つ、又はそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの核酸挿入物を用いたゲノム遺伝子座の修飾を可能にし、したがって、核酸挿入物の全体のサイズを効果的に増大させると同時に、標的化ステップの数を低減する。
核酸挿入物又は置換される標的遺伝子座における対応する核酸は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。更に、核酸挿入物（即ち、２つ、３つ、若しくはそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの組み合わせた核酸挿入物）又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸のサイズは、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド〜１ｋｂ長、１ｋｂ〜１．５ｋｂ長、１．５ｋｂ〜２ｋｂ長、２ｋｂ〜２．５ｋｂ長、２．５ｋｂ〜３ｋｂ長、３ｋｂ〜５ｋｂ長、５ｋｂ〜８ｋｂ長、８ｋｂ〜１０ｋｂ長、又はそれよりも長い長さを含む、任意の所望の長さであってもよい。他の場合において、長さは、約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、又は約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂであってもよい。あるいは、２つ、３つ、若しくはそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの組み合わせた核酸挿入物又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸は、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約６Ｍｂ、約６Ｍｂ〜約７Ｍｂ、約７Ｍｂ〜約８Ｍｂ、約８Ｍｂ〜約９Ｍｂ、又は約９Ｍｂ〜約１０Ｍｂであってもよい。更に他の場合には、長さは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ以上であってもよい。例えば、２つ、３つ、若しくはそれよりも多くのＬＴＶＥＣからの組み合わせた核酸挿入物又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、少なくとも２Ｍｂ、少なくとも２．５Ｍｂ、少なくとも３Ｍｂ、少なくとも４Ｍｂ、少なくとも５Ｍｂ、少なくとも６Ｍｂ、少なくとも７Ｍｂ、少なくとも８Ｍｂ、少なくとも９Ｍｂ、少なくとも１０Ｍｂであってもよい。一実施形態において、核酸挿入物のサイズは、約５ｋｂ〜約７００ｋｂである。一実施形態において、核酸挿入物のサイズは、約５ｋｂ〜約５００ｋｂである。別の実施形態において、核酸挿入物のサイズは、約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである。別の実施形態において、核酸挿入物のサイズは、約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである。具体的な実施形態において、核酸挿入物は、約１４０ｋｂである。別の具体的な実施形態において、核酸挿入物は、約３７０ｋｂである。別の具体的な実施形態において、核酸挿入物は、約３００ｋｂである。別の具体的な実施形態において、核酸挿入物は、約４００ｋｂである。
いくつかの個々の標的化ベクターにおいて、（即ち、別の標的化ベクターとの組み換えの前）、核酸挿入物は、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド〜１ｋｂ長、１ｋｂ〜１．５ｋｂ長、１．５ｋｂ〜２ｋｂ長、２ｋｂ〜２．５ｋｂ長、２．５ｋｂ〜３ｋｂ長、又は３ｋｂ〜５ｋｂ長であってもよい。他の場合において、長さは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。あるいは、核酸挿入物は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂであってもよい。あるいは、核酸挿入物は、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、又は約７５０ｋｂ〜約８００ｋｂであってもよい。
いくつかの場合において、標的遺伝子座における核酸の置き換えは、約１ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２ｋｂ〜約２０ｋｂ、又は約０．５ｋｂ〜約３Ｍｂに及ぶ核酸配列の欠失をもたらす。いくつかの場合において、欠失の範囲は、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの合計の長さよりも広い。
いくつかの場合において、核酸配列の欠失の範囲は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ。あるいは、欠失は、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂであってもよい。
他の場合において、核酸挿入物又は置き換えられる標的遺伝子における対応する核酸は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、又はそれを超えてもよい。
核酸挿入物は、ゲノムＤＮＡ又は任意の他の種類のＤＮＡを含んでもよい。例えば、核酸挿入物は、原核生物、真核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜用哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、又は他の任意の対象となる生物由来であってもよい。
核酸挿入物及び／又は標的遺伝子座における核酸は、調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、若しくは転写リプレッサー結合要素）などのコード配列又は非コード配列を含んでもよい。例えば、核酸挿入物は、内因性遺伝子の少なくとも１つのエクソンのノックイン対立遺伝子、又は外因性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子（即ち、「遺伝子スワップノックイン」）を含んでもよい。例えば、核酸挿入物は、ゲノム標的遺伝子座における欠失のために標的化される配列に相同であるか、又はオルソロガスであってもよい。相同又はオルソロガス核酸挿入物は、対象となるゲノム遺伝子座における欠失のために標的化される配列を置き換えることができる。これは、核酸挿入物の挿入が、相同又はオルソロガスヒト核酸配列での非ヒト核酸配列の置き換えをもたらす場合、遺伝子座のヒト化をもたらすことができる（即ち、核酸挿入物は、その内因性ゲノム遺伝子座における対応する非ヒトＤＮＡ配列の代わりに挿入される）。
核酸挿入物はまた、条件付き対立遺伝子を含んでもよい。条件付き対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号に記載されるように、多機能性対立遺伝子であってもよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、（ｂ）センス配向又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス方向において、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、及び（ｄ）反転モジュールによる条件（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及びジーントラップ様モジュールを利用する）、を含んでもよい。例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの暴露時に組み換わり、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向においてＮＳＩを含み、アンチセンス配向においてＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する、組み換え可能単位を更に含んでもよい。米国第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。
いくつかの核酸挿入物は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセット内に含まれてもよい。そのような選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、若しくは単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的化された細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。プロモーターの例は、本明細書の別の箇所に記載される。
いくつかの標的化ベクターでは、核酸挿入物は、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、及びそれらの組み合わせである。そのようなレポーター遺伝子は、標的化された細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。プロモーターの例は、本明細書の別の箇所に記載される。
いくつかの標的化ベクターでは、核酸挿入物は、１つ以上の発現カセット又は欠失カセットを含む。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節成分と共に、対象となるヌクレオチド配列、選択マーカーをコードする核酸配列、及び／又はレポーター遺伝子を含んでもよい。含まれてもよい選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の箇所で詳細に考察される。
いくつかの標的化ベクターにおいて、核酸挿入物は、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含む。核酸挿入物全体に、そのような部位特異的組み換え標的配列が隣接してもよい一方で、核酸挿入物内の任意の領域又は個々の対象となるポリヌクレオチドにもまた、そのような部位が隣接してもよい。核酸挿入物又は核酸挿入物中の任意の対象となるポリヌクレオチドが隣接してもよい部位特異的組み換え標的配列としては、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げられ得る。一実施例では、部位特異的組み換え部位は、核酸挿入物内に含まれる選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。標的化された遺伝子座における核酸挿入物の組み込みに続いて、部位特異的組み換え部位間の配列は、除去され得る。
Ｂ．対象となるポリヌクレオチド
任意の対象となるポリヌクレオチドは、様々な核酸挿入物中に含まれてもよく、それにより標的ゲノム遺伝子座において組み込まれてもよい。本明細書に開示される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれよりも多くの対象となるポリヌクレオチドが標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれることを可能にする。
核酸挿入物内の対象となるポリヌクレオチドは、標的ゲノム遺伝子座において組み込まれたとき、１つ以上の遺伝子修飾を細胞に導入することができる。遺伝子修飾は、内因性核酸配列の欠失、及び／又は標的ゲノム遺伝子座への外因性若しくは異種若しくはオルソロガスポリヌクレオチドの付加を含むことができる。一実施形態において、遺伝子修飾は、標的ゲノム遺伝子座における、内因性核酸配列の、対象となる外因性ポリヌクレオチドとの置き換えを含む。したがって、本明細書で提供される方法は、標的ゲノム遺伝子座中のノックアウト、欠失、挿入、置き換え（「ノックイン」）、点突然変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせを含む、遺伝子修飾の発生を可能にする。そのような修飾は、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、又は任意の後続の核酸挿入物の組み込み後に生じてもよい。
核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞を起源とする若しくは細胞に相同な配列を含んでもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して異種であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して外因性であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対してオルソロガスであってもよいか、又は、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞と異なる種由来であってもよい。配列に関した「相同な」は、細胞起源の配列を含む。配列に関連した「異種」は、外来種に由来するか、又は同じ種由来である場合、意図的な人間の介入によって組成物及び／又はゲノム遺伝子座内でその天然の形態から実質的に修飾される配列である。配列に関した「外因性の」は、外来種に起源を有する配列を含む。「オルソロガス」は、別の種（即ち種変異体）において既知の参照配列と機能的に同等の、ある種からのポリヌクレオチドを含む。対象となるポリヌクレオチドには、非ヒト、げっ歯動物、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、鳥類、農業用哺乳動物、又は非農業用哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない、対象となる任意の生物由来であってもよい。対象となるポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、制御領域、又はゲノムＤＮＡを更に含むことができる。したがって、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び／又は後続の任意の核酸挿入物は、そのような配列を含むことができる。
一実施形態において、核酸挿入物内のかつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ヒト核酸に相同である。なお更なる実施形態において、標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ゲノム核酸のフラグメントである。一実施形態において、ゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸、非ヒト核酸、げっ歯動物核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、若しくは非農業用哺乳動物核酸、又はこれらの組み合わせである。
一実施形態において、対象となるポリヌクレオチドは、上記のように、約５００ヌクレオチド〜約２００ｋｂの範囲に及んでもよい。対象となるポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、又は約６００ｋｂ〜約７００ｋｂであってもよい。
核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ｍｉＲＮＡをコードすることができ、長い非コードＲＮＡをコードすることができるか、又は対象となるポリヌクレオチドは、例えば、調節配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列を含む、対象となる任意の調節領域若しくは非コード領域、又は非タンパク質コード配列の欠失を含むことができるが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。加えて、核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、又はこれらの組み合わせにおいて発現するタンパク質をコードすることができる。
核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、コード配列中の遺伝子修飾を含むことができる。そのような遺伝子修飾には、コード配列の欠失突然変異又は２つのコード配列の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態において、突然変異タンパク質は、変異した結合特徴、変異した局所化、変異した発現、及び／又は変異した発現パターンを特徴とする。一実施形態において、核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの疾病対立遺伝子を含む。そのような場合、疾病対立遺伝子は、優性対立遺伝子であってもよく、又は疾病対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。更に、疾病対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含んでもよい。突然変異タンパク質をコードする対象となるポリヌクレオチドには、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
核酸挿入物内の、かつ／又標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドはまた、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列、又は転写ターミネーター配列を含む、調節配列を含むことができる。具体的な実施形態において、核酸挿入物内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、非タンパク質コード配列の欠失を有するポリヌクレオチドを含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態において、非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。別の実施形態において、調節要素の欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態において、調節要素の欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。そのような対象となるポリヌクレオチドには、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
標的化された遺伝子修飾は、対象となるポリヌクレオチドに対する標的化された変異を含んでもよい。そのような標的化された修飾には、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックアウト、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックイン、異種核酸配列による内因性核酸配列の置換、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１００、５００個、若しくはそれよりも多くのヌクレオチド、又は少なくとも１０ｋｂ〜５００ｋｂ若しくはそれよりも多くが、標的化されたゲノム修飾を形成するように変化されている。
Ｃ．標的化ベクター
標的化ベクターは、標的ゲノム遺伝子座に核酸挿入物を導入するために採用され得、核酸挿入物及び核酸挿入物に隣接するホモロジーアームを含む。標的化ベクターは、直線形状又は円形形状であってもよく、かつそれらは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。標的化ベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であってもよい。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書において５’及び３’（即ち、上流及び下流）ホモロジーアームと称される。この用語は、標的化ベクター内の核酸挿入物に対するホモロジーアームの相対位置に関する。５’及び３’ホモロジーアームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される、標的化された遺伝子座内の領域又は別の標的化ベクター内の領域に対応する。いくつかの場合において、ホモロジーアームはまた、５’又は３’標的配列として機能することができる。
本方法は、互いと組み換えることが可能である２つ、３つ、又はそれよりも多くの標的化ベクターを採用する。様々な実施形態において、標的化ベクターは、本明細書で別の箇所に記載される大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。そのような方法において、第１、第２、及び第３の標的化ベクターはそれぞれ、５’及び３’ホモロジーアームを含む。第１の標的化ベクターの３’ホモロジーアームは、第２の標的化ベクターの５’ホモロジーアームと重複する配列（即ち、重複配列）を含み、それは、第１のＬＴＶＥＣと第２のＬＴＶＥＣとの間の相同組み換えを可能にする。
二重標的化方法の場合、第１の標的化ベクターの５’ホモロジーアーム及び第２の標的化ベクターの３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメント（即ち、標的配列）に相同であり、それは、対応するゲノムセグメントとの第１及び第２の標的化ベクターの相同組み換えを促進し、標的ゲノム遺伝子座を修飾する。
三重標的化方法の場合、第２の標的化ベクターの３’ホモロジーアームは、第３の標的化ベクターの５’ホモロジーアームと重複する配列（即ち、重複配列）を含み、それは、第２のＬＴＶＥＣと第３のＬＴＶＥＣとの間の相同組み換えを可能にする。第１の標的化ベクターの５’ホモロジーアーム及び第３の標的化ベクターの３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメント（即ち、標的配列）に相同であり、それは、対応するゲノムセグメントとの第１及び第３の標的化ベクターの相同組み換えを促進し、標的ゲノム遺伝子座を修飾する。
ホモロジーアーム及び標的配列又は２つのホモロジーアームは、２つの領域が相同組み換え反応の基質として機能するために、相互に対して十分なレベルの配列同一性を共有するとき、相互に「対応する」又は「対応している」。用語「相同性」は、対応する配列に対して同一であるか、又は配列同一性を共有するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と標的化ベクター上で見られる対応するホモロジーアームとの間（即ち、重複配列）、又は２つのホモロジーアーム間の配列同一性は、相同組み換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、標的化ベクターのホモロジーアーム（若しくはそのフラグメント）、及び別の標的化ベクターの標的配列、又は標的ゲノム遺伝子座の標的配列（若しくはそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性であってもよい。
更に、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の相同性の対応領域は、開裂された標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを促進するために十分である任意の長さであってもよい。例えば、所与のホモロジーアーム及び／又は対応する標的配列は、ホモロジーアームが、細胞の標的ゲノム遺伝子座内又は別の標的化ベクター内の対応する標的配列との相同組み換えを受けるために十分な相同性を有するように、（例えば、本明細書の別の箇所に記載のＬＴＶＥＣベクターにおいて記載される）少なくとも約５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂ長、又はそれよりも長い、相同性の対応する領域を含むことができる。
第１の標的化ベクターの３’ホモロジーアーム及び第２の標的化ベクターの５’ホモロジーアーム、又は第２の標的化ベクターの３’ホモロジーアーム及び第３の標的化ベクターの５’ホモロジーアームの重複配列は、標的化ベクター間の相同組み換えを促進するのに十分である任意の長さであってもよい。例えば、ホモロジーアームの所与の重複配列は、ホモロジーアームの重複配列が、別の標的化ベクター内の対応する標的配列との相同組み換えを受けるために十分な相同性を有するように、少なくとも約１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂ長、又はそれよりも長い、対応する重複領域を含むことができる。一実施形態において、重複配列は、１〜５ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ〜約７０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ〜約７０ｋｂである。別の実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂである。一実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。別の実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。例えば、重複配列は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約２５ｋｂ、約２５ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約３５ｋｂ、約３５ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約４５ｋｂ、約４５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２０ｋｂ、約２２０ｋｂ〜約２４０ｋｂ、約２４０ｋｂ〜約２６０ｋｂ、約２６０ｋｂ〜約２８０ｋｂ、又は約２８０ｋｂ〜約３００ｋｂであってもよい。一例として、重複配列は、約２０ｋｂ〜約６０ｋｂであってもよい。あるいは、重複配列は、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２０ｋｂ、少なくとも２４０ｋｂ、少なくとも２６０ｋｂ、少なくとも２８０ｋｂ、又は少なくとも３００ｋｂであってもよい。
ホモロジーアームは、細胞起源の遺伝子座（例えば、標的化された遺伝子座）に対応してもよいか、又は、ホモロジーアームは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、又はＤＮＡの異種若しくは外因性の領域を含む、細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡの異種若しくは外因性のセグメントの領域に対応してもよい。あるいは、ホモロジーアームは、細胞中の標的化ベクター上の領域に対応することができる。標的化ベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、又は適切な宿主細胞中に含まれる任意の他の操作された領域に対応することができる。なお更に、標的化ベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリーの領域に対応してもよいか、又はそれに由来してもよい。ある特定の場合、標的化ベクターのホモロジーアームは、原核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜用哺乳動物、農業用哺乳動物、又は他の対象となる生物にとって天然、異種、又は外来性である遺伝子座に対応する。いくつかの場合において、ホモロジーアームは、ヌクレアーゼ剤によって誘発される切れ目若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いて標的化できないか、又は、誤って若しくは顕著に低い効率でのみ標的化される恐れがある、細胞内の遺伝子座に対応する。いくつかの場合において、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡに由来する。
いくつかの標的化ベクターにおいて、５’又は３’ホモロジーアームのうちの一方が標的化されたゲノム遺伝子座に対応する一方で、５’又は３’ホモロジーアームのうちのもう一方は、別の標的化ベクター上の領域に対応する。
いくつかの標的化ベクターにおいて、５’及び３’ホモロジーアームは、標的化されたゲノムに対応する。あるいは、ホモロジーアームは、関連したゲノム由来であってもよい。例えば、標的化されたゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、標的化アームは、第２の系統のマウスゲノム由来であり、第１の系統及び第２の系統は異なる。ある特定の場合、ホモロジーアームは、同じ動物のゲノム由来であるか、又は同じ系統のゲノム由来であり、例えば、標的化されたゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、標的化アームは、同じマウスから、又は同じ系統からのマウスゲノム由来である。
標的化ベクターのホモロジーアームは、対応する標的配列との相同組み換え事象を促進するために十分な任意の長さであってもよく、例えば、少なくとも１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂ長、又はそれを超える長さを含む。以下で更に詳細に説明されるように、大型標的化ベクターは、より長い長さの標的化アームを採用してもよい。
ヌクレアーゼ剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、標的遺伝子座の修飾を補助するために標的化ベクターと組み合わせて採用されてもよい。そのようなヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターと標的遺伝子座との間の相同組み換えを促進してもよい。ヌクレアーゼ剤が標的化ベクターと組み合わせて採用されるとき、標的化ベクターは、ヌクレアーゼ開裂部位における切れ目又は二本鎖切断の際に標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換えイベントの発生を促進するように、ヌクレアーゼ開裂部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームを含んでもよい。用語「ヌクレアーゼ開裂部位」は、切れ目又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって生じるＤＮＡ配列を含む（例えば、Ｃａｓ９開裂部位）。標的化ベクターの５’及び３’ホモロジーアームに対応する標的化された遺伝子座内の標的配列は、距離が認識部位における切れ目又は二本鎖切断の際に５’及び３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換えイベントの発生を促進するようなものであるとき、ヌクレアーゼ開裂部位に「十分に近接して位置」する。したがって、具体的な場合には、標的化ベクターの５’及び／又は３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、所与の認識部位の少なくとも１ヌクレオチド以内であるか、又は所与の認識部位の少なくとも１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂの範囲内である。いくつかの場合において、ヌクレアーゼ開裂部位は、標的配列のうち少なくとも片側又は両側に直接隣接する。
標的化ベクターのホモロジーアームに対応する標的配列とヌクレアーゼ開裂部位との位置関係は、変動してもよい。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ開裂部位に対して５’に位置してもよいか、標的配列は、認識部位に対して３’に位置してもよいか、又は、標的配列は、ヌクレアーゼ開裂部位に隣接してもよい。
（例えば、大型標的化ベクターを含む）標的化ベクターとヌクレアーゼ剤との併用は、標的化ベクター単独での使用と比較して、標的化効率の向上をもたらす場合がある。例えば、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と併用されるとき、標的化ベクターの標的化効率性は、標的化ベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、若しくは少なくとも１０倍増大され得るか、又は２〜１０倍などのこれらの整数から形成される範囲内で増大され得る。
Ｄ．大型標的化ベクター
いくつかの標的化ベクターは、「大型標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」であり、細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により通常使用される核酸配列よりも大きな核酸配列に相当し、かつ核酸配列に由来するホモロジーアームを含む標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣは、例えば、長さが少なくとも１０ｋｂであってもよく、又は５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの合計は、例えば、少なくとも１０ｋｂであってもよい。ＬＴＶＥＣはまた、細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により通常使用される核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸挿入物を含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、それらのサイズ制限のため、従来のプラスミド系標的化ベクターが対応することができない大型遺伝子座の修飾を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって引き起こされる切れ目若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いて標的化できないか、又は誤って若しくは顕著に低い効率性でのみ標的化される可能性がある、細胞の遺伝子座であってもよい（即ち、５’及び３’ホモロジーアームは、細胞の遺伝子座に対応してもよい）。
本明細書に提供される方法は、本明細書の別の箇所に記載される三元又は四元の組み換え事象で、互いと、かつ標的ゲノム遺伝子座と組み換えることが可能である、２つ又は３つのＬＴＶＥＣを採用する。これらの方法は、単一のＬＴＶＥＣを使用して達成され得ない大型遺伝子座の修飾を可能にする。
ＬＴＶＥＣの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びそれらを作製するための方法の例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、米国特許第６，５９６，５４１号、米国特許第７，１０５，３４８号、及び国際公開第ＷＯ ２００２／０３６７８９（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）号に記載され、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、直線形状又は円形形状であってもよい。
ＬＴＶＥＣは、例えば、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂを含む、任意の長さであってもよい。あるいは、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲ）による標的化イベントのスクリーニングを可能とするにはあまりに大きい恐れがある。
いくつかの場合において、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ核酸挿入物を含む。他の場合、核酸挿入物は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶことができる。いくつかの場合において、ＬＴＶＥＣは、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、又は約７５０ｋｂ〜約８００ｋｂに及ぶ核酸挿入物を含む。
いくつかのＬＴＶＥＣＳにおいて、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂである。いくつかのＬＴＶＥＣＳにおいて、５’ホモロジーアームは約１ｋｂ〜約１００ｋｂに及ぶ、かつ／又は３’ホモロジーアームは約１ｋｂ〜約１００ｋｂに及ぶ。５’及び３’ホモロジーアームの合計は、例えば、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。あるいは、各ホモロジーアームは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂであってもよい。同様に、５’及び３’ホモロジーアームの合計は、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂであってもよい。
いくつかの場合において、ＬＴＶＥＣ及び核酸挿入物は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの標的遺伝子座における内因性配列の欠失を可能にするように設計される。あるいは、欠失は、約３Ｍｂ〜約４Ｍｂ、約４Ｍｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ〜約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ〜約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ〜約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ〜約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ〜約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ〜約９０Ｍｂ、又は約９０Ｍｂ〜約１００Ｍｂであってもよい。あるいは、欠失は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
他の場合には、ＬＴＶＥＣ及び核酸挿入物は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶ外因性核酸配列の標的遺伝子座内への挿入を可能にするように設計されている。あるいは、挿入は、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、又は約７５０ｋｂ〜約８００ｋｂであってもよい。あるいは、挿入は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
更に他の場合には、核酸挿入物及び／又は欠失される内因性遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ以上である。
Ｅ．ゲノム及び標的ゲノム遺伝子座
本明細書に開示される方法によって修飾されたゲノム又はゲノム標的遺伝子座は、細胞内のＤＮＡの任意のセグメント又は領域を含むことができる。ゲノム又はゲノム標的遺伝子座は、細胞にとって天然であってもよく、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種若しくは外来性セグメントであってもよく、又はこれらの組み合わせであってもよい。ＤＮＡのそのような異種又は外因性セグメントは、導入遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、又はゲノムＤＮＡの異種若しくは外因性領域を含むことができる。
ゲノム又はゲノム標的遺伝子座はまた、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は適切な宿主細胞中に含まれる任意の他の操作された領域など、細胞内の染色体外ＤＮＡを含むことができる。
ＩＩＩ．ヌクレアーゼ剤
本明細書に提供される標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物は、所望の認識部位への切れ目又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤を採用することができる。
用語「ヌクレアーゼ剤の認識部位」は、切れ目又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘発されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、細胞に対して内因性（若しくは天然）であってもよく、又は認識部位は、細胞に対して外因性であってもよい。具体的な実施形態において、認識部位は、細胞に対して外因性であり、それにより、細胞のゲノム中で自然発生的ではない。なお更なる実施形態において、認識部位は、細胞に対して、かつ標的遺伝子座に位置付けられることが望まれる対象となるポリヌクレオチドに対して外因性である。更なる実施形態において、外因性又は内因性認識部位は、宿主細胞のゲノム中で一度のみ存在する。具体的な実施形態において、ゲノム内で一度のみ生じる内因性又は天然部位が特定される。次いで、そのような部位は、内因性認識部位において切れ目又は二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼ剤を設計するために使用されてもよい。
認識部位の長さは変動してもよく、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対については約３０〜３６ｂｐ（即ち、各ＺＦＮに対して約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）については約３６ｂｐ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡについては約２０ｂｐである認識部位を含む。
所望の認識部位への切れ目又は二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用されてもよい。自然発生的な若しくは生来のヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が目的の認識部位でニック又は二本鎖切断を誘発する限り、使用できる。あるいは、修飾又は操作されたヌクレアーゼ剤が採用され得る。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位での切れ目又は二本鎖切断を特異的に認識及び誘発するようにその天然の形態から操作される（修飾される、又はそれに由来する）ヌクレアーゼを含む。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の自然発生的なヌクレアーゼ剤由来であってもよく、又はそれは、人工的に作り出されるか、若しくは合成されてもよい。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質開裂剤中の１つのアミノ酸、又は核酸開裂剤中の１つのヌクレオチドほどわずかであってもよい。いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、認識部位での切れ目又は二本鎖切断を誘発し、この認識部位は、天然（操作されていない又は修飾されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではなかった。認識部位又は他のＤＮＡで切れ目又は二本鎖切断を生じさせることは、本明細書において、認識部位又は他のＤＮＡを「切断する」又は「開裂する」と称されてもよい。
例示的な認識部位の活性変異体及びフラグメントもまた提供される。そのような活性変異体は、所与の認識部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、生物活性を保持し、したがって、配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識かつ開裂されることが可能である。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＦｒｅｎｄｅｗｅｙ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６：２９５〜３０７）。
ヌクレアーゼ剤の認識部位は、標的遺伝子座の中又は近くのいかなる場所に位置付けられてもよい。認識部位は、遺伝子のコード領域内、又は遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は任意の非タンパク質コード領域の中に位置してもよい。具体的な実施形態において、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置付けられる。そのような位置は、選択マーカーのコード領域内、又は選択マーカーの発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。したがって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカー、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域のイントロン内に位置してもよい。具体的な実施形態において、認識部位における切れ目又は二本鎖切断は、選択マーカーの活性を妨害する。機能的な選択マーカーの存在又は非存在についてアッセイするための方法は、既知である。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核又は真核生物のゲノム中の特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用され得る、配列特異的ヌクレアーゼの種類である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然の、若しくは操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、又はその機能部を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させることによって作り出される。独特のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的なＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。国際公開第ＷＯ ２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８〜４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７〜７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３〜１４８を参照されたく、それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国第２０１１／０２３９３１５ Ａ１号、米国第２０１１／０２６９２３４ Ａ１号、米国第２０１１／０１４５９４０ Ａ１号、米国第２００３／０２３２４１０ Ａ１号、米国第２００５／０２０８４８９ Ａ１号、米国第２００５／００２６１５７ Ａ１号、米国第２００５／００６４４７４ Ａ１号、米国第２００６／０１８８９８７ Ａ１号、及び米国第２００６／００６３２３１ Ａ１号に開示される（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。様々な実施形態において、例えば、対象となる遺伝子座又は対象となるゲノム遺伝子座において、標的核酸配列中、又はその近くで切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列は、標的化ベクターによって修飾される配列にあるか、又はその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載されるような標的化ベクターによって修飾される標的核酸配列において、又はその近くで結合するように特異的に設計されるＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。
一実施形態において、ＴＡＬＥＮの各単量体は、２つの高度可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３〜３５個のＴＡＬ反復を含む。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態において、独立ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインとを含み、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインは、異なる長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、標的配列において二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作り出すように二量体化する。
本明細書に開示される様々な方法及び組成物で採用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を更に含むことができる。一実施形態において、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他の実施形態において、ＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態において、独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとを含み、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化し、二本鎖切断をする活性ヌクレアーゼ剤を形成する。例えば、米国第２００６０２４６５６７号、米国第２００８０１８２３３２号、米国第２００２００８１６１４号、米国第２００３００２１７７６、国際公開第ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２号、米国第２０１３０１２３４８４号、米国第２０１００２９１０４８号、国際公開第ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２号、及びＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７〜４０５を参照されたく、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
更に別の実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づく４つのファミリーに分類されており、このファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型性に対する耐性が注目すべき点である。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は、既知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９〜２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０〜９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４〜２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９〜９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。いくつかの実施例では、自然発生的変異体、及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／又は部位特異性の認識を修飾するための方法、並びに活性度をスクリーニングするための方法は、既知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２〜６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５〜９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３〜１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０〜９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１〜４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１〜８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、国際公開第ＷＯ２００５１０５９８９号、同第ＷＯ２００３０７８６１９号、同第ＷＯ２００６０９７８５４号、同第ＷＯ２００６０９７８５３号、同第ＷＯ２００６０９７７８４号、及び同第ＷＯ２００４０３１３４６号を参照されたい。
本明細書で使用してもよい任意のメガヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、又はこれらの任意の活性変異体若しくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態において、メガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全にマッチした標的配列を認識する。一実施形態において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態において、ホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態において、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
ヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼを更に含んでもよい。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識部位を認識するが、通常は、ヌクレアーゼ結合部位からの可変位置において開裂し、それは、開裂部位（認識部位）から数百塩基対離れていてもよい。ＩＩ型系において、制限活性は、任意のメチラーゼ活性とは無関係であり、開裂は、通常は、結合部位内、又はその近くの特定の部位において生じる。ほとんどのＩＩ型酵素が回文配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非回文認識部位を認識し、かつ認識部位の外側で開裂し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で２回配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識部位を認識し、片側で、かつ認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの定められた距離において開裂する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的化する。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８〜２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５〜１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１〜７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に更に記載され、分類されている。
様々な方法及び組成物において採用されるヌクレアーゼ剤はまた、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系又はそのような系の構成成分を含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、又はその活性を誘導する、転写物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型系であってもよい。本明細書に開示される方法及び組成物は、核酸の部位特異的な開裂のためのＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する。
本明細書に開示される方法で使用されるいくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非自然発生的である。「非自然発生的」な系は、系の１つ以上の構成成分がそれらの自然発生的な状態から変異若しくは突然変異されること、それらが本質的に自然に関連する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないこと、又はそれらが自然に関連していない少なくとも１つの他の構成成分と関連していることなど、人の手の関与を示すいかなるものをも含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、一緒に自然発生しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む、非自然発生的ＣＲＩＳＰＲ複合体を採用する。
Ｃａｓタンパク質は、概して、少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。そのようなドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下でより詳細に記載される）と相互作用することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量化ドメイン、及び他のドメインを含んでもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸開裂のための触媒活性を有する。開裂は、核酸分子の共有結合の切断を含む。開裂は、平滑末端又は互い違いの末端を生じさせることができ、それは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、完全開裂活性を有することができ、かつ標的ゲノム遺伝子座において二本鎖切断を行うことができるか（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）、又はそれは、標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を行うニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにこれらの相同体又は修飾バージョンが挙げられる。
いくつかの場合において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来である。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよいか、又はＣａｓ９タンパク質に由来してもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、通常は、保存された構造を有する４つの主要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属、ノカルジオプシス・ダソンビレイ、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム・ロセウム、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチラス・サリバリウス、ミクロシラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス属、クロコスファエラ・ワトソニイ、シアノセイス属、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココックス属、アセトハロビウム・アラビティカム、アンモニフェツクス・デゲンシイ、カルディセルロシルプター・ベシー、カンジデイタス・デサルホルディス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニイ、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガータム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレウス・クソノプラステス、オスキラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、又はアカリオクロリス・マリナ由来であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質はまた、黄色ブドウ球菌由来であってもよい。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのその他の例には、参照よりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１３１８３３号に記載されるＣａｓ９ファミリーメンバーが挙げられる。具体的な実施例では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質であるか、又はそれに由来する。化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２の下で見出すことができる。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（即ち、自然に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（即ち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の活性変異体又はフラグメントであってもよい。活性変異体又はフラグメントは、野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質又はこれらの一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の開裂部位において切断する能力を保持し、したがって、切れ目誘発又は二本鎖切断誘発活性を保持する。切れ目誘発又は二本鎖切断誘発活性に対するアッセイは既知であり、概して、開裂部位を含有するＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び／又は酵素活性を増加又は減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の任意の他の活性又は特性を変化させるように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、欠失、若しくは不活性化され得るか、あるいはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、又はＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、強化若しくは低減）するために切断され得る。
いくつかのＣａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２個のヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含んでもよい。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、ＤＮＡ中で二本鎖切断を行うために、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインのうちの一方又は両方は、それらがもはや機能的ではないか、又はヌクレアーゼ活性が低減しているように、欠失又は突然変異されてもよい。ヌクレアーゼドメインのうちの一方が欠失する又は突然変異する場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼと称してもよく、二本鎖切断ではなく、二本鎖ＤＮＡ内の標的配列において一本鎖切断を発生させることができる（即ち、相補鎖又は非相補鎖を開裂することができるが、両方ではない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失されるか又は突然変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を開裂する能力が低下することとなる（例えば、ヌクレアーゼヌルＣａｓタンパク質）。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の一例は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおける（Ｃａｓ９の位置１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの）Ｄ１０Ａ突然変異である。同様に、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおける（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニンへの）Ｈ９３９Ａ又は（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニンへの）Ｈ８４０Ａは、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例は、Ｓ．サーモフィルス由来のＣａｓ９への対応する突然変異を含む。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第ＷＯ ２０１３／１４１６８０号を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、又は全遺伝子合成などの周知の方法を使用して発生させてもよい。ニッカーゼを作り出す他の突然変異の例は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２Ａ１号及び同第ＷＯ２０１３／１４２５７８Ａ１号に見出すことができる。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、開裂ドメイン、後成的修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制因子ドメインと融合され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ ２０１４／０８９２９０号を参照されたい。Ｃａｓタンパク質はまた、増加又は減少した安定性を提供する異種ポリペプチドと融合されてもよい。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内に内部的に位置してもよい。
Ｃａｓ融合タンパク質の一例は、細胞内局在性を提供する異種ポリペプチドと融合されたＣａｓタンパク質である。そのような配列は、例えば、核を標的化するためのＳＶ４０ ＮＬＳなどの核局在シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質は、例えば、１つ以上の核局在シグナル（例えば、２つの核局在シグナル）を含むことができる。そのような細胞内局在シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどの場所に位置してもよい。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸の区間を含むことができ、一分配列又は二分配列であってもよい。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインを含んでもよい。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来してもよい。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／０８９２９０号を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置してよい。
Ｃａｓタンパク質はまた、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなど、追跡又は精製を容易にするための異種ポリペプチドを含んでもよい。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮａＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＲ））又はＤＮＡなど、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供されてもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物中のタンパク質への効率的な翻訳のために最適化されたコドンであってもよい。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されるとき、Ｃａｓタンパク質は、細胞中で一時的に、条件付きで、又は構成的に発現されてもよい。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結されてもよい。発現構築物には、遺伝子又は他の対象となる核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、かつそのような対象となる核酸配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物が挙げられる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター中にあってもよい。あるいは、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別であるベクター又はプラスミド中にあってもよい。発現構築物中で使用され得るプロモーターとしては、例えば、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター細胞中で活性なプロモーターが挙げられる。他のプロモーターの例は、本明細書の別の箇所で記載される。
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質と結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡは、２つの部分、即ち「ＤＮＡ標的化セグメント」と「タンパク質結合セグメント」とを含んでもよい。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの隣接区間など、分子のセグメント、セクション、又は領域を含む。いくつかのｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子、即ち「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」とを含む。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２Ａ１号、同第ＷＯ２０１４／０６５５９６Ａ１号、同第ＷＯ２０１４／０８９２９０Ａ１号、同第ＷＯ２０１４／０９３６２２Ａ２号、同第ＷＯ２０１４／０９９７５０Ａ２号、同第ＷＯ２０１３１４２５７８Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１４／１３１８３３Ａ１号を参照されたい。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、二重分子ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ反復」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「足場」）分子とを含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの区間の両方を含む。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドの区間を含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間に相補的であり、かつそれとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、標的化配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを追加的に提供する。細胞内での修飾のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計されてもよい。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７〜２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３〜２３９、及びＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９〜８２３を参照されたく、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーションを介して、配列特異的な様式で標的ＤＮＡと相互作用する（即ち、塩基対合）。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は異なってもよく、かつｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象となるｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡの任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾されてもよい。自然発生的ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９系及び生物によって異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチド長の２つの直列反復（ＤＲ）が隣接した、２１〜７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含有する（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１３１８３３号を参照されたい）。化膿レンサ球菌では、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’位置のＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズし、このｔｒａｃｒＲＮＡが次いでＣａｓ９タンパク質と結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長を有してもよい。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有してもよい。あるいは、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的化配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有してもよい。例えば、ＤＮＡ標的化配列（即ち、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメント内の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有してもよい。あるいは、ＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有してもよい。いくつかの場合において、ＤＮＡ標的化配列は、約２０ｎｔの長さを有してもよい。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長のｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び異なる長さであってもよい。それらは、一次転写産物又は処理された形態を含んでもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、若しくは二分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部若しくは一部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５以上、若しくはそれを超えるヌクレオチド）を含んでもよいか、又はそれからなっていてもよい。化膿レンサ球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２〜６０７、国際公開第ＷＯ ２０１４／０９３６６１号を参照されたく、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大で＋ｎ個のヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国第８，６９７，３５９号を参照されたい。
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性の割合は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であってもよい。いくつかの場合において、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも６０％であってもよい。一実施例では、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内の標的配列の５’末端における１４個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで下がる。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチド長であると見なしてもよい。別の実施例では、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内の標的配列の５’末端における７個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで下がる。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチド長であると見なしてもよい。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つの区間を含んでもよい。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象となるｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合したＣａｓタンパク質を、標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特性（例えば、修飾された又は調節された安定性、細胞内標的化、蛍光ラベルによる追跡、タンパク質又はタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する修飾又は配列を含んでもよい。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化鎖（即ち、３’ポリＡテール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にすること）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖（即ち、ヘアピン型）を形成する配列、細胞内部位（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に対してＲＮＡを標的化する修飾又は配列、追跡用に提供される修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部位への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むＤＮＡに作用するタンパク質）との結合部位を提供する修飾又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）として、又は１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかのＲＮＡの形態で、並びに任意に、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供されてもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが細胞に導入されるとき、ｇＲＮＡは、細胞中で一時的に、条件に応じて、又は構成的に発現されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結されてもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクター中にあってもよい。あるいは、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別であるベクター又はプラスミド中にあってもよい。そのような発現構築物中で使用され得るプロモーターとしては、例えば、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター細胞中で活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの場合において、プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法によって調製されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって調製され得る（例えば、国際公開第ＷＯ ２０１４／０８９２９０号及び同第ＷＯ ２０１４／０６５５９６号を参照されたく、それらのそれぞれは、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製された、合成的に生み出された分子であってもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に対する標的配列は、結合のための十分な条件が存在する場合には、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を含む。例えば、標的配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計される配列を含み、標的配列とＤＮＡ標的化配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、ただしハイブリダイゼーションを引き起こし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性があることを条件とする。標的配列は、以下でより詳細に記載される、Ｃａｓタンパク質のための開裂部位も含む。標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含んでもよく、それは、例えば、細胞の核若しくは細胞質内に、又はミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に位置してもよい。
標的ＤＮＡ内の標的配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡによって標的化され得る（即ち、それによって結合されてもよい、又はそれとハイブリダイズしてもよい、又はそれに相補的であってもよい）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞中に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１を参照されたい））。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ばれてもよく、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ばれてもよい。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列の内側又は外側の部位で核酸を開裂することができる。「開裂部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生じさせる核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、かつＣａｓタンパク質と複合体を形成されたｇＲＮＡを含む）は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列中、又はその近くで（例えば、そこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれを超える塩基対以内で）、一方又は両方の鎖の開裂をもたらしてもよい。開裂部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外側にある場合、開裂部位はなおも「標的配列」内にあると見なされる。開裂部位は、核酸の一方のみの鎖又は両方の鎖上にあってもよい。開裂部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生じさせる）、又はそれぞれの鎖上の異なる部位にあってもよい（互い違いの末端を生じさせる（即ち、オーバーハング））。互い違いの末端は、例えば、異なる鎖上の異なる開裂部位において一本鎖切断を生じさせ、したがって、二本鎖切断を生じさせる、２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生じ得る。例えば、突出配列が作り出されるように、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上で一本鎖切断を引き起こしてもよく、第２のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上で一本鎖切断を引き起こしてもよい。いくつかの場合において、第１の鎖上のニッカーゼの標的配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対だけ、第２の鎖上のニッカーゼの標的配列から隔てられている。
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的開裂は、標的ＤＮＡ中の（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じてもよい。ＰＡＭは、標的配列に隣接してもよい。任意選択的に、標的配列には、３’末端でＰＡＭが隣接してもよい。例えば、Ｃａｓ９の開裂部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流又は下流であってもよい。いくつかの場合において（例えば、化膿レンサ球菌からのＣａｓ９又は近縁のＣａｓ９が使用されるとき）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’であってもよく、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列のすぐ３’である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列のすぐ５’である。いくつかのそのような場合において、Ｎ１及びＮ２は相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ、又はＮ１＝Ｔ及びＮ２＝Ａ）。
標的配列の例は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列に加えたそのようなＤＮＡ配列を含む。標的配列の一例は、ＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（ＧＮ１〜２０Ｇｇ、配列番号１）のヌクレオチド配列を含む。５’末端におけるグアニンは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。標的配列の他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端において２つのグアニンヌクレオチドを含むことができる。例えば、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ ２０１４／０６５５９６号を参照されたい。他の標的配列は、５’Ｇ及び３’ＧＧを含む、配列番号１の４〜２２ヌクレオチド長を有してもよい。更に他の標的配列は、配列番号１の１４〜２０ヌクレオチド長を有してもよい。
標的配列は、細胞に対して内因性又は外因性の任意の核酸であってもよい。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列若しくは非コード配列（例えば、調節配列又はジャンクＤＮＡ）であってもよいか、又は両方を含んでもよい。
ヌクレアーゼ剤の活性変異体及びフラグメント（即ち、操作されたヌクレアーゼ剤）もまた提供される。そのような活性変異体は、天然ヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含んでもよく、活性変異体は、所望の認識部位において切断する能力を保持し、したがって、切れ目又は二本鎖切断誘発活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から修飾され、かつ天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位における切れ目又は二本鎖切断を認識及び誘発するように設計され得る。したがって、いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、対応する天然ヌクレアーゼ剤認識部位とは異なる認識部位において切れ目又は二本鎖切断を誘発する特異性を有する。切れ目又は二本鎖切断誘発活性に対するアッセイは既知であり、概して、認識部位を含有するＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野において既知の任意の手段によって細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されるとき、ヌクレアーゼ剤は、細胞中で一次的に、条件付きで、又は構成的に発現されてもよい。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中に含有され、かつ条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。
具体的な実施形態において、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態において、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが挿入ポリヌクレオチドを含む同じ標的化ベクター内にある一方で、他の場合には、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターとは別であるベクター又はプラスミド内にある。
ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通じて細胞に提供されるとき、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、対象となる細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は任意の他の宿主細胞を含む原核又は真核細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。
上記の様々な方法は、連続的に繰り返すことにより、染色体上の所与の標的遺伝子座への任意の数の核酸挿入物の標的組み込みが可能となる。したがって、様々な方法は、染色体上の標的遺伝子座に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の核酸挿入物の挿入を提供する。特定の実施形態において、そのような連続的なタイリング方法は、染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座内への、動物細胞又は哺乳類細胞（即ち、ヒト、非ヒト、げっ歯動物、マウス、サル、ラット、ハムスター、家畜哺乳動物、又は農業用動物）由来の大きいゲノム領域の再構成を可能にする。そのような場合、コード及び非コード領域の両方を含むゲノム領域の導入及び再構成は、所与の領域の複雑性が、少なくとも部分的に、コード領域、非コード領域、及び天然ゲノム領域内に見出されるコピー数多型を保持することによって維持されることを可能にする。したがって、様々な方法が、例えば、細胞内で「異種」又は「外因性」ゲノム領域を生成するための方法を提供する。
ＩＶ．選択マーカー
本明細書で提供される様々な方法及び組成物では、選択マーカーと組み合わせて、ヌクレアーゼ剤及びその対応する認識部位を採用することができる。本明細書に記載のように、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内への認識部位の配置により、標的遺伝子座での組み込みイベントの効率的な確認方法が提供され得る。更に、本明細書に記載の様々な方法では、ヌクレアーゼ認識部位を有する交替される選択マーカーが、導入効率及び効果の改善のために使用され、それにより、目的の複数のポリヌクレオチドが、所与の標的遺伝子座内に組み込まれる。
様々な選択マーカーが、本明細書に開示される方法及び組成物で使用できる。そのような選択マーカーは、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与できる。かかる選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）及びブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）が挙げられる。更に他の実施形態において、選択マーカーは、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現は、細胞に対する毒性を示す。かかる選択マーカーの非限定的な例としては、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。
一実施形態において、ヌクレアーゼ認識部位は、選択マーカーをコードする遺伝子内に位置付けられる。具体的な実施形態において、ヌクレアーゼ認識部位は、ハイグロマイシン遺伝子内に位置付けられる。
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。そのような発現カセット及びそれらの様々な制御成分は、本明細書の別の箇所で更に詳細に考察される。
Ｖ．プロモーター
本明細書に記載される様々な核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、例えば、多能性、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター細胞中で活性であってもよい。プロモーターは、例えば、構成的活性プロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間限定的プロモーター（例えば、発生段階調節プロモーター）、又は空間限定的プロモーター（例えば、細胞特異的若しくは組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターの例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ ２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節されるプロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節されるプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、若しくはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節されるプロモーター（例えば、ラットグルココルチコイドレセプター、エストロゲンレセプターのプロモーター、若しくはエクジソンレセプターのプロモーター）、又は金属調節されるプロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節されるプロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、及び光調節されるプロモーター（例えば、光誘導性プロモーター、又は光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、神経特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、又は免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーター若しくはＴ細胞プロモーター）であってもよい。
発生段階調節プロモーターとしては、例えば、胚発生段階中でのみ、又は成熟細胞中でのみ活性なプロモーターが挙げられる。
プロモーターはまた、細胞型に基づき選択され得る。例えば、様々な既知のプロモーターは、真核細胞、哺乳類細胞、非ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、多能性細胞、非ヒト多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又はＣＨＯ細胞中で用途を見出す。
ＶＩ．発現カセット
本明細書に提供される標的化系の様々な構成要素（即ち、ヌクレアーゼ剤、認識部位、核酸挿入物、対象となるポリヌクレオチド、標的化ベクター（即ち、ＬＴＶＥＣ）、選択マーカー、及び他の構成要素）を含むポリヌクレオチド又は核酸分子が、本明細書に提供される。
標的化系の様々な構成要素を含む組み換えポリヌクレオチドが更に提供される。用語「組み換えポリヌクレオチド」及び「組み換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において互換的に使用される。組み換え構築物は、核酸配列の人工又は異種の組み合わせ、例えば、自然界で一緒に見出されない制御配列及びコード配列を含む。他の実施形態において、組み換え構築物は、異なる源由来である制御配列及びコード配列、又は同じ源由来であるが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配列された制御配列及びコード配列を含んでもよい。そのような構築物は、それ自体で使用されてもよく、又はベクターと併用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるような宿主細胞を変換するために使用される方法によって決まる。例えば、プラスミドベクターが使用され得る。本発明においては、宿主細胞を好適に形質転換し、選択し、増殖させるのに必要な、何らかの単離された核酸断片を含む遺伝的要素が提供される。スクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析、又は表現型解析によって達成されてもよい。
具体的な実施形態において、本明細書に記載の標的化系の構成要素のうちの１つ以上は、原核細胞、真核細胞、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、又は対象となる他の種類の生物若しくは細胞における発現用の発現カセット中に提供され得る。カセットは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含むことができる。２つのタンパク質コード領域の結合に言及するために使用されるとき、「操作可能に連結された」は、コード領域が同じリーディングフレームにあることを意味する。別の例において、タンパク質をコードする核酸配列は、調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結させてもよく、それにより、適切な転写調節が維持される。
カセットは、生物に共導入される少なくとも１つの追加の目的ポリヌクレオチドを追加で含んでもよい。あるいは、追加の対象となるポリヌクレオチドが、複数の発現カセット上に提供され得る。そのような発現カセットは、組み換えポリヌクレオチドの挿入が制御領域の転写制御下にあるための複数の制限部位及び／又は組み換え部位が提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子を更に含有してもよい。
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、転写及び翻訳開始領域（即ち、プロモーター）、本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチド、並びに対象となる哺乳類細胞又は宿主細胞中で機能的な転写及び翻訳終止領域（即ち、終止領域）を含むことができる。調節領域（即ちプロモーター、転写調節領域及び翻訳終結領域）及び／又は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに、生来のものであっても類似のものであってもよい。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して又は互いに異種であってもよい。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、当該ポリヌクレオチドが由来する種と異なる種に由来するか、或いは同じ／類縁の種に由来するか、それらの１つ又は両方が、それらの元の形態及び／又は遺伝子座から実質的に修飾されるか、あるいは、プロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドについての生来のプロモーターでない。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチドは、完全に合成であってもよい。
終結領域は、転写開始領域に生来のものであってもよく、作動可能に連結された組み換えポリヌクレオチドに生来のものであってもよく、宿主細胞に生来のものであってもよく、又は、プロモーター、組み換えポリヌクレオチド、宿主細胞又はそのあらゆる組合せとは別の給源に由来する（即ち無縁の若しくは異種の）ものであってもよい。
発現カセットの調製において、適切な配向でＤＮＡ配列を提供するために、様々なＤＮＡフラグメントが操作されてもよい。この目的で、アダプター若しくはリンカーがＤＮＡフラグメントを結合するために採用されてもよく、又は好都合な制限部位、不必要なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するために、他の操作が関与してもよい。この場合、インビトロ変異導入、プライマー修復、制限酵素処理、アニーリング、再置換（例えば塩基転移及び塩基転換）を行ってもよい。
多くのプロモーターが、本明細書に提供される発現カセット中で使用され得る。プロモーターは、所望の結果に基づき選択され得る。対象となるポリヌクレオチドのタイミング、位置、及び／又は発現レベルを調節するために、発現カセット中の異なるプロモーターの使用によって、異なる適用が強化され得ることが認識される。そのような発現構築物はまた、必要に応じて、プロモーター制御領域（例えば、誘導性、構成的、環境若しくは発達制御、又は細胞若しくは組織特異的／選択的発現を与えるもの）、転写開始起始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡ処理シグナル、転写終止部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含有してもよい。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットは、形質転換された細胞の選択用の選択マーカーを含んでもよい。当該選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。
必要に応じて、本発明の方法及び組成物で使用される配列（即ち目的ポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤等）は、細胞内での更なる発現のために最適化され得る。即ち、目的遺伝子の発現向上のために、哺乳動物に好適なコドン、ヒトに好適なコドン、齧歯動物に好適なコドン、マウスに好適なコドン、ラットに好適なコドン等、所与の目的の細胞内での好ましいコドンを使用して合成され得る。
一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物から発現され、その核酸は、細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結されている。
ＶＩＩ．遺伝子修飾非ヒト動物を作製する方法
遺伝子修飾非ヒト動物は、本明細書に開示される様々な方法を採用して生成され得る。いくつかの場合において、遺伝子修飾非ヒト動物を生産する方法は、（１）本明細書に記載される方法を使用して、多能性細胞のゲノムを修飾することと、（２）遺伝子修飾多能性細胞を選択することと、（３）遺伝子修飾多能性細胞を宿主胚に導入することと、（４）遺伝子修飾多能性細胞を含む宿主胚を、代理母に着床させることと、を含む。遺伝子修飾多能性細胞からの子孫が生成される。ドナー細胞は、胚盤胞期又は前桑実胚期（即ち、４細胞期又は８細胞期）など、任意の段階において宿主胚に導入され得る。生殖細胞系を通じて遺伝子修飾を伝達することが可能である子孫が生成される。多能性細胞は、本明細書の別の箇所で考察されるＥＳ細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞）であってもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
核移植技術もまた、非ヒト哺乳動物を生産するために使用され得る。簡潔に、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、又は除核した卵母細胞を提供するステップと、（２）除核した卵母細胞と組み合わされるドナー細胞又は核を単離又は提供するステップと、（３）細胞又は核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成するステップと、（４）再構成細胞を動物の子宮に着床させて、胚を形成するステップと、（５）胚を発生させるステップと、を含むことができる。そのような方法において、卵母細胞は、概して、死亡動物から回収されるが、それらは、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかからも単離され得る。卵母細胞は、除核前に当業者に既知の様々な培地中で成熟させられ得る。卵母細胞の除核は、当業者に周知のいくつかの方法で実施され得る。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。融合は、接触／融合面（電気融合）にわたるＤＣ電気パルスの印加によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、又はセンダイウイルスなどの不活性化ウイルスによって誘発されてもよい。再構成細胞は、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、中、及び／又は後に、電気及び／又は非電気手段によって活性化され得る。活性化方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子による侵入、卵母細胞内の二価陽イオンのレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤などによる）細胞タンパク質のリン酸化の低減が挙げられる。活性化された再構成細胞又は胚は、当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移され得る。例えば、米国第２００８００９２２４９号、国際公開第ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国第２００４０１７７３９０号、国際公開第ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
本方法は、Ｆ０世代非ヒト動物を生産する方法を更に含むことができ、（１）標的化修飾を含む非ヒトＥＳ細胞を同定することと、（２）標的化修飾を含む非ヒトＥＳ細胞を、非ヒト宿主胚に導入することと、（３）代理母において非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含む。次いで、代理母は、標的化修飾を含むＦ０世代非ヒト動物を生産することができる。遺伝子修飾多能性又は全能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植されて、Ｆ０動物を生産することができる。遺伝子修飾ゲノム遺伝子座を有する動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を介して同定され得る。
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子修飾Ｆ０動物の細胞が標的化修飾を含む、遺伝子修飾非ヒトＦ０動物の生成を可能にする。Ｆ０動物を生産するために使用される方法に応じて、標的化遺伝子修飾を有するＦ０動物内の細胞数が変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介した、対応する生物からの前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入は、Ｆ０動物のより大きい割合の細胞集団が、標的化遺伝子修飾を有する細胞を含むことを可能にする。特定の場合、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の細胞寄与が、標的化修飾を有する細胞集団を含む。他の場合、Ｆ０動物の生殖細胞のうちの少なくとも１つ以上が標的化修飾を有する。
いくつかの場合において、遺伝子修飾Ｆ０動物の細胞は、標的化修飾に対してヘテロ接合であるが、又はヘテロ接合の化合物である。例えば、遺伝子修飾Ｆ０動物の細胞は、標的化修飾に対して半接合であってもよい。他の場合、遺伝子修飾Ｆ０動物の細胞は、標的化修飾に対してホモ接合である。
いくつかの場合において、本明細書に開示される方法及び組成物によって生成されたＦ０動物は、野生型動物に交配されて、標的化修飾に対してヘテロ接合であるＦ１世代を生成することができる。Ｆ１世代からの動物は、次いで、互いに交配されて、標的化修飾に対してホモ接合のＦ２動物を生産することができる。Ｆ１子孫は、標的化遺伝子修飾が存在するかを決定するための特異的なプライマー及び／又はプローブを使用して、遺伝子型決定され得る。
ＶＩＩＩ．核酸及びタンパク質を細胞に導入する方法
細胞への核酸の導入を可能にするための様々な方法及び組成物が本明細書に提供される。いくつかの場合において、核酸を導入するために採用される系は、特定のゲノム遺伝子座における標的化組み込みを可能にする。そのような系は、様々な構成要素を採用し、参照の便宜のため、用語「標的化組み込み系」は、広義に、組み込み事象に必要とされる全ての構成要素（例えば、様々なヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ開裂部位、核酸挿入物、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチドのうちの１つ以上）を含む。
本明細書に提供される方法は、細胞に、標的化ゲノム組み込み系の１つ以上の構成要素を含む１つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド構築物を導入することを含むことができる。「導入すること」は、配列が細胞の内部に接近するような様式で、細胞に配列（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を提示することを含む。本明細書に提供される方法は、核酸又はタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部に接近する限り、核酸又はタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存しない。様々な細胞型に核酸及びタンパク質を導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、及びウイルス媒介性方法が挙げられる。
いくつかの場合において、本方法及び組成物で採用される細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。「安定的に組み込まれた」又は「安定的に導入された」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込み、その子孫によって遺伝され得るような、細胞へのポリヌクレオチドの導入を含む。ＤＮＡ構築物又は標的化されたゲノム組み込み系の様々な構成成分の安定的な組み込みのために、任意のプロトコルが使用されてもよい。
トランスフェクションプロトコル並びに細胞中にポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、異なり得る。トランスフェクション方法は、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６〜６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０〜４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６〜９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥ−デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用した、化学ベースのトランスフェクション方法を含む。非化学的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースのトランスフェクションとしては、遺伝子銃、又は磁性補助トランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７〜２８）が挙げられる。ウイルス方法もまた、トランスフェクションのために使用され得る。
いくつかの場合において、細胞への核酸又はタンパク質の導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注入によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介トランスフェクションによって、又はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）によって仲介される。
細胞への核酸又はタンパク質の導入は、１回又はある期間にわたって複数回実施され得る。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、又はある期間にわたって少なくとも２０回実施され得る。
ヌクレアーゼ剤及び標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）の両方が細胞に導入されるとき、それらは、同時に導入され得る。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターとは別々に導入され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターの導入前に導入され得るか、又はそれは、標的化ベクターの導入後に導入され得る。２つ以上のＬＴＶＥＣが細胞に導入されるとき、それらは、同時に導入され得るか、あるいは、それらは、別々に導入され得る。
ＩＸ．細胞及び動物
本明細書に提供される様々な組成物及び方法は、動物由来の細胞などの細胞を採用する。そのような細胞は、非ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物由来であってもよい。そのような細胞は、例えば、菌性細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞を含む、真核細胞であってもよい。哺乳類細胞は、例えば、非ヒト哺乳類細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又はＣＨＯ細胞であってもよい。真核細胞は、全能性細胞、非ヒト多能性細胞（例えば、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞若しくはラットＥＳ細胞）又はヒト多能性細胞などの多能性細胞、あるいは非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞を含み、多能性細胞は、２つ以上の分化細胞型に成長する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性及び／又は全能性細胞は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であってもよい。胚性幹細胞は、胚への導入後に発達中の胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性又は多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来であってもよく、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。そのような細胞はまた、造血幹細胞又は神経幹細胞であってもよい。
真核細胞はまた、一次体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、又は未分化幹細胞ではない任意の細胞を含むことができる。
真核細胞はまた、一次細胞を含む。一次細胞は、生物、器官、又は組織から直接単離された細胞又は細胞の培養物を含む。一次細胞は、形質転換されてもなく、不死でもない細胞を含む。それらは、組織培養物中に以前に通されていないか、又は組織培養物中に以前に通されているが、組織培養物に無限に通されることが不可能である生物、器官、又は組織から得られた任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技術によって単離され得、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、単球、単核球、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞を含む。例えば、一次細胞は、結合組織、筋組織、神経系組織、又は上皮組織由来であってもよい。
真核細胞はまた、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常は無限に増殖しないが、突然変異又は変化によって、正常な細胞老化を回避しており、代わりに、分裂を経験し続けることができる、多細胞生物からの細胞を含む。そのような突然変異又は変化は、自然に生じ得るか、又は意図的に誘発され得る。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３細胞）、及びマウス胚線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多くの種類の不死化細胞が当該技術において周知である。
不死化又は一次細胞は、組み換え遺伝子又はタンパク質を培養するか、又は発現させるために通常使用される細胞を含む。
細胞、多能性及び／若しくは全能性細胞、ＥＳ細胞、ドナー細胞、並びに／又は宿主胚に関連した用語「動物」としては、哺乳動物、魚類、及び鳥類が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、雌ウシ、去勢雄ウシなどのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、並びにブタ及びイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガン、アヒルなどが挙げられる。家畜動物及び農業用動物もまた含まれる。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。
マウス多能性及び／又は全能性細胞は、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の混合、ＢＡＬＢ／ｃ系統、又はＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統由来であってもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６）を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。マウス多能性及び／又は全能性細胞はまた、上記の１２９系統及び上記のＣ５７ＢＬ／６系統の混合由来であってもよい（例えば、５０％の１２９及び５０％のＣ５７ＢＬ／６）。同様に、マウス多能性及び／又は全能性細胞は、上記の１２９系統の混合又は上記のＢＬ／６系統（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）の混合由来であってもよい。マウスＥＳ細胞の具体的な例は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９，１０２４〜１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい。
ラット多能性及び／又は全能性細胞は、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４若しくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統が挙げられる、任意のラット系統由来であってもよい。ラット多能性及び／又は全能性細胞はまた、上記で列挙された２つ以上の系統の混合由来の系統から得ることができる。例えば、ラット多能性及び／又は全能性細胞は、ＤＡ系統又はＡＣＩ系統由来であってもよい。ＡＣＩラット系統は、白色の腹及び足、並びにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する、黒いアグーチを有するものと特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコート及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。いくつかの場合において、ラット多能性及び／又は全能性細胞は、近交ラット系統由来である。例えば、２０１４年２月２０日出願の米国第２０１４／０２３５９３３ Ａ１号、及び２０１４年４月１６日出願の米国第２０１４／０３１０８２８ Ａ１号を参照されたく、それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ヒト多能性細胞の例としては、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、並びにプライム型ヒトｉＰＳ細胞及びナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞などのヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。例えば、２０１４年１０月１５日に出願され、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／５１５，５０３号を参照されたい。人工多能性幹細胞は、分化した成人細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞を含む。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、並びに／又はＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及び／若しくはＧｌｉｓ１などの関連転写因子を含んでもよい、リプログラミング因子の特定の一群を細胞に導入することによって発生させることができる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する小分子、又は系譜特異化剤の使用によって発生させてもよい。ヒトｉＰＳ細胞は、３種類の脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、又は内胚葉のうちいずれかの細胞に分化する能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ １２６：６６３〜６７６を参照されたい。プライム型ヒトＥＳ細胞及びプライム型ヒトｉＰＳ細胞は、着床後胚盤葉上層細胞の特徴に類似した特徴を発現し、系統仕様及び分化に関与する細胞を含む。ナイーブ型ヒトＥＳ細胞及びナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は、着床前胚の内部細胞塊のＥＳ細胞の特徴に類似した特徴を発現し、系統仕様に関与しない細胞を含む。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：４８７〜４９２を参照されたい。
宿主胚に着床した細胞は、「ドナー細胞」と称され得る。遺伝子修飾多能性及び／又は全能性細胞は、宿主胚と同じ系統由来又は異なる系統由来であってもよい。同様に、代理母は、遺伝子修飾多能性及び／若しくは全能性細胞並びに／又は宿主胚と同じ系統由来であってもよく、あるいは代理母は、遺伝子修飾多能性及び／若しくは全能性細胞並びに／又は宿主胚とは異なる系統由来であってもよい。
様々な宿主胚が、本明細書に開示される方法及び組成物において採用され得る。例えば、標的化遺伝子修飾を有する多能性及び／又は全能性細胞は、対応する生物に対して、前桑実胚期胚（例えば、８細胞期胚）に導入され得る。例えば、米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８／００７８０００ Ａ１号を参照されたく、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。他の場合、ドナーＥＳ細胞は、前桑実胚期、例えば、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、又は６４細胞期において宿主胚に着床されてもよい。宿主胚はまた、胚盤胞であってもよく、又は胚盤胞前胚、前桑実胚期胚、桑実胚期胚、コンパクションを起こしていない桑実胚期、若しくはコンパクションを起こした桑実胚期であってもよい。マウス胚を採用するとき、宿主胚の段階は、Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）「Ｔｈｅ Ｈｏｕｓｅ Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるＴｈｅｉｌｅｒ ｓｔａｇｅを参照して、Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｓｔａｇｅ １（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、及びＴＳ６であってもよい。例えば、Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｓｔａｇｅは、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、及びＴＳ４から選択され得る。いくつかの場合において、宿主胚は、透明帯を含み、ドナー細胞は、透明帯の孔を通じて宿主胚に導入されるＥＳ細胞である。他の場合、宿主胚は、帯なし胚である。更に他の場合、桑実胚期宿主胚は、凝集される。
Ｘ．修飾標的ゲノム遺伝子座を有する細胞を同定する方法
上記の方法のうちのいくつかは、修飾標的ゲノム遺伝子座（例えば、修飾ゲノム）を有する細胞を同定することを更に含む。様々な方法が、欠失又は挿入などの標的化修飾を有する細胞を同定するために使用され得る。そのような方法は、標的遺伝子座における標的化修飾を有する１つの細胞を同定することを含むことができる。修飾ゲノム遺伝子座を有するそのような細胞を同定するために、スクリーニングが行われ得る。
スクリーニングステップは、親染色体の対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施され得る。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１プライマーセットと、標的化されない参照遺伝子座を認識する第２プライマーセットとを採用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識するための蛍光プローブを含むことができる。
他の場合、標的化遺伝子修飾を有する細胞は、例えば、サザンブロット解析、ＤＮＡ配列決定法、ＰＣＲ解析、又は表現型解析を含む方法を使用して選択される。次いで、そのような細胞は、本明細書に記載される様々な方法及び組成物において採用される。
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）であるＩｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）への定量的ハイブリダイゼーション、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、又はＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。
スクリーニングステップはまた、概して、標的ゲノム遺伝子座以の外側のゲノム位置への核酸挿入物のランダム形質転換挿入から、標的ゲノム遺伝子座への核酸挿入物の正確な標的化挿入を区別するために使用されるアッセイであり、かつ単一の構築物への２つ以上の重複ＬＴＶＥＣの正確な集合を検出するためにも使用される、アーム特異的アッセイを含む。長距離ＰＣＲ又はサザンブロッティングなどの標的化修飾に対するスクリーニングのための従来のアッセイは、挿入された標的化ベクターを標的化遺伝子座に結合する。しかしながら、それらの大きいホモロジーアームサイズのため、ＬＴＶＥＣは、そのような従来のアッセイによるスクリーニングを可能にしない。ＬＴＶＥＣ標的化をスクリーニングするために、対立遺伝子の欠失（ＬＯＡ）及び対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイが使用され得る（例えば、全ての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第２０１４／０１７８８７９号及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７を参照されたい）。対立遺伝子の欠失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを反転させ、突然変異が向けられた天然遺伝子座のコピー数を定量化する。正確に標的化された細胞クローンにおいて、ＬＯＡアッセイは、２つの天然対立遺伝子のうちの一方を検出し（Ｘ又はＹ染色体上にない遺伝子に対して）、もう一方は、標的化修飾によって破壊される。同じ原理が、対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイとして逆に適用されて、挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化することができる。例えば、ＧＯＡ及びＬＯＡアッセイの組み合わせた使用は、天然標的遺伝子の欠失した１つのコピー及び薬物耐性遺伝子の獲得した１つのコピー、又は他の挿入されたマーカーを有するものとして、正確に標的化されたヘテロ接合クローンを示す。
一例として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が対立遺伝子定量化方法として使用され得るが、標的遺伝子のゼロ、１つ、及び２つのコピー間、又は核酸挿入物のゼロ、１つ、及び２つのコピー間の違いを確実に区別することができる任意の方法が、ＭＯＡアッセイを展開するために使用され得る。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）は、特に、参照遺伝子との比較によって、ゲノムＤＮＡ試料中のＤＮＡテンプレートのコピー数を定量化するために使用され得る（例えば、全ての目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第６，５９６，５４１号を参照されたい）。参照遺伝子は、標的遺伝子（複数可）又は遺伝子座（複数可）として、同じゲノムＤＮＡ中で定量化される。したがって、２つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅（それぞれその対応するプローブを有する）が実施される。一方の（登録商標）プローブが参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル）を決定する一方で、もう一方のプローブは、標的化の成功によって置き換えられる標的遺伝子（複数可）又は遺伝子座（複数可）の領域のＣｔを決定する（即ち、ＬＯＡアッセイ）。Ｃｔは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブのそれぞれに対する開始ＤＮＡの量を反映する量であり、即ち、あまり大量ではない配列が、閾値サイクルに到達するためにより多くのＰＣＲサイクルを必要とする。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応に対するテンプレート配列のコピー数を半分に減少させることは、約１のＣｔ単位の増加をもたらす。標的遺伝子（複数可）又は遺伝子座（複数可）の１つの対立遺伝子が相同組み換えによって置き換えられた、細胞中のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応は、非標的化細胞からのＤＮＡと比較して、参照遺伝子に対するＣｔの増加なしで、標的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応に対する１つのＣｔの増加をもたらす。ＧＯＡアッセイに対して、別のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、標的化の成功によって標的遺伝子（複数可）又は遺伝子座（複数可）を置き換えている、核酸挿入物のＣｔを決定するために使用され得る。
それは、ＬＴＶＥＣによって正確な標的化を検証するための有用で増強された標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイであり得る。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイは単独で、標的ゲノム遺伝子座のＣａｓ誘発欠失が、ゲノム中の別の場所でのＬＴＶＥＣのランダム組み込みと同時に起こるクローンと、正確に標的化された細胞クローンを区別しない可能性がある。標的化された細胞中の選択圧が選択カセットに基づくため、ゲノム中の別の場所でのＬＴＶＥＣのランダム形質転換組み込みは、概して、選択カセット及びＬＴＶＥＣの隣接領域を含むが、ＬＴＶＥＣのより遠位の領域を除外し得る。例えば、ＬＴＶＥＣの一部分がゲノムにランダムに組み込まれ、ＬＴＶＥＣが約５ｋｂ以上の長さの核酸挿入物を含み、選択カセットが３’ホモロジーアームに隣接する場合、いくつかの場合において、５’ホモロジーアームではなく３’ホモロジーアームが、選択カセットと形質転換で組み込まれる。あるいは、選択カセットが５’ホモロジーアームに隣接する場合、いくつかの場合において、３’ホモロジーアームではなく５’ホモロジーアームが、選択カセットと形質転換で組み込まれる。一例として、ＬＴＶＥＣの標的化組み込みを評価するために、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイが使用され、かつＧＯＡアッセイが選択カセット又はＬＴＶＥＣの任意の他の特有の（非アーム）領域に対してプローブを利用する場合、ＬＴＶＥＣのランダム形質転換組み込みと組み合わせた標的ゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合欠失は、標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣのヘテロ接合の標的化組み込みとして、同じ読み出しを示す。ＬＴＶＥＣによる正確な標的化を検証するために、アーム特異的アッセイは、ＬＯＡ及び／又はＧＯＡアッセイと併用され得る。
アーム特異的アッセイは、ＬＴＶＥＣホモロジーアーム中のＤＮＡテンプレートのコピー数を決定する。そのようなホモロジーアームは、別のＬＴＶＥＣと重複しないが、細胞中の標的配列と一致する、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームを含むことができる（例えば、マウス細胞中のゲノム標的配列と重複しているホモロジーアーム（ｍＡｒｍ））。そのようなホモロジーアームはまた、２つの重複ＬＴＶＥＣ中に存在する重複ホモロジーアームを含むことができる（例えば、第１のＬＴＶＥＣの３’ホモロジーアーム及び第２のＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアーム中の重複ヒト配列（ｈＡｒｍ））。複数の重複ＬＴＶＥＣが細胞に導入される実験に対して、スクリーニングは、概して、ＬＯＡアッセイ、全ての特有の挿入された配列に対するＧＯＡアッセイ、及び相同性の全ての領域に対するアーム特異的アッセイを含む（即ち、細胞中のＬＴＶＥＣと標的配列との間、及び２つの異なる重複ＬＴＶＥＣの間）。一例として、野生型マウス標的遺伝子座をヒト化するために、マウス細胞に導入される３つの重複ＬＴＶＥＣの場合、ヘテロ接合標的化挿入に対する予測されるコピー数は、以下の通りになる。５’ｍＡｒｍの２つのコピー（５’マウス標的配列と重複する相同性アーム）、ｈＡｒｍ１の１つのコピー（ＬＴＶＥＣ１と２との間の重複配列）、ｈＡｒｍ２の１つのコピー（ＬＴＶＥＣ２と３との間の重複配列）、及び３’ｍＡｒｍの２つのコピー（３’マウス標的配列と重複する相同性アーム）。上記の例において、３つ以上のｍＡｒｍコピー数は、概して、標的ゲノム遺伝子座におけるよりもむしろ、標的ゲノム遺伝子座の外側でのランダムに形質転換ＬＴＶＥＣ組み込みを示し、それは、望ましくない。正確に標的化されたクローンは、２つのｍＡｒｍコピー数を保持する。加えて、そのようなアーム特異的アッセイにおける２つ未満のｍＡｒｍコピー数は、概して、欠失のために標的化される領域を越えて延在する大きいＣａｓ誘発欠失を示し、それもまた望ましくない。同様に、ヘテロ接合標的化修飾に関して、ｈＡｒｍ１及びｈＡｒｍ２に対する１つのコピー数は、概して、３つ全てのＬＴＶＥＣが単一の構築物に集合したことを示す。
上記又は以下で引用した全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、あたかもそれぞれ個々のアイテムが参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されるように、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。異なるバージョンの配列がその時々においてアクセッション番号と関連付けられる場合、本願の有効出願日に当該アクセッション番号と関付けられたバージョンを意図する。有効出願日は、実際の出願日又は、該当する場合、アクセッション番号を参照する優先出願の出願日の早い方を意図する。同様に、異なるバージョンの出版物、ウェブサイトなどが異なる時点で公開される場合、別に指示がない限り、出願の有効出願日の直前に公開されたバージョンが有意である。本発明の機構、工程、要素、実施形態、又は態様はいずれも、別途記載のない限り、組み合わせて使用することができる。本発明が、明確さ及び理解の目的で例証及び実例として、ある程度詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲内である特定の変更及び修正が実施され得ることが明らかになるであろう。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製し、使用するかの完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものでも、以下の実験が、行われた全て又は唯一の実験であると示すことを意図するものでもない。使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気又はほぼ大気である。
実施例１：ジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせた、２つのＬＴＶＥＣを用いたＴＣＲアルファ遺伝子座の標的化
２つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）が単一の標的化ステップでゲノム遺伝子座を修飾するように、二重標的化系を設計した。図１に示されるように、ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体１４上にＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞を、二重標的化系によって標的化して、追加のＩｇκ可変遺伝子セグメントを含むＥＳ細胞を生成した。
図１に要約されるこの二重標的化アプローチは、標的遺伝子座において、又はその付近で二本鎖切断を行うエンドヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と一緒の、２つの異なる大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の、ＥＳ細胞への二重標的化又は共エレクトロポレーションを伴う。
このアプローチでは、第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ １７１０と表記）は、ヒトＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメントの配列を含む３’３０ｋｂホモロジーアームと、ヒトＶκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含む１２０ｋｂ配列と、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む５’２０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含んだ。第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ ６６００と表記）は、３’２０ｋｂ重複領域（第１のベクターと同様に、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む領域）と、ヒトＶκ１−１７〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む１４０ｋｂ配列と、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ選択カセットと、１５．５ｋｂ３’マウスＴＣＲ Ａホモロジーアームと、を含んだ。
標的ＴＣＲ Ａ遺伝子座における２つのＬＴＶＥＣの相同組み換えを促進するために、ハイグロマイシン耐性遺伝子内で標的配列を認識及び開裂する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を設計した。図１で生成されたＥＳ細胞（全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントに対してヘテロ接合のＭＡＩＤ ６５４８）を、ＺＦＮの各半分（１／２）を発現させる上記の２つの大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ６６００及びＭＡＩＤ１７００トリミング）及び２つのプラスミドでエレクトロポレーションし、それは、ハイグロマイシン耐性遺伝子中の認識配列に結合し、標的部位における二本鎖切断に触媒作用を及ぼす（ＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡｔｃｔｔａｇＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（配列番号２）（開裂部位は小文字）（表１を参照されたい）。ヌクレオチド配列ＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴｔａｇｃｃａＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（配列番号３）においてハイグロマイシン遺伝子を標的化するＺＦＮ（３／４）、及びヌクレオチド配列ＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧｃａｇｃｔｃＴＣＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡ（配列番号４）においてハイグロマイシン遺伝子を標的化するＺＦＮ（５／６）の２つの追加のＺＦＮを、ハイグロマイシンを標的化するために設計した（表１を参照されたい）。
Figure 0006840077
２つの大型標的化ベクターを相同組み換えによってＤＮＡ配列に挿入し、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを包囲する領域を置き換えた。得られたＥＳ細胞は、内在性ＴＣＲ Ａ遺伝子座において、ヒトＪκ１〜Ｊκ５及びＶκ４−１〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む、ヒト免疫グロブリン可変領域を含んだ。上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを用いて、図１に示され、かつ以下の表２に列挙されるプローブ及びプライマー（ＧＯＡ＝対立遺伝子の獲得、ＬＯＡ＝対立遺伝子の欠失、コピー数＝形質転換組み込み対標的化組み込みを追跡するために配列のコピー数を調査する、ｈＡｒｍ１＝第１の標的化ベクター（ＭＡＩＤ １７１０）の３０ｋｂ３’ホモロジーアーム、ｈＡｒｍ２＝第１（ＭＡＩＤ １７１０）及び第２（ＭＡＩＤ ６６００）の大型標的化ベクターの２０ｋｂ重複、ｍＡｒｍ＝第２の標的化ベクター（ＭＡＩＤ ６６００）の１５．５ｋｂ５’ホモロジーアーム、ＷＴマウス対照−マウスＴＣＲ Ａ遺伝子座に存在する配列）を使用して、２つの大型標的化ベクターの組み込みの成功を確認した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３〜４８）。アーム特異的アッセイとも称される、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム中の配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、マウスゲノムへのＬＴＶＥＣの正確な標的化を検証した。これらのアーム特異的アッセイのコピー数を決定することは、例えば、２つのｍＡｒｍコピー数を保持する正確に標的化されたＥＳクローンを、標的マウス遺伝子座のＣａｓ９誘発欠失がゲノム中の別の場所のＬＴＶＥＣのランダム組み込みと同時に起きる（その場合、ｍＡｒｍコピー数は３（又はそれよりも多く）である）クローンと区別するのに役立つための更なる明確化を提供した。
Figure 0006840077
得られた、ＥＳ細胞中の標的化遺伝子座は、以下の接合配列を有した（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表３））。
Figure 0006840077
単離されたＥＳ細胞コロニーの対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）スクリーニングは、スクリーニングされた９６０個のコロニーのうち、２７個の正確に標的化されたクローンの同定をもたらし、２．８１％の標的化効率であった。
追加の免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含むＴＣＲ Ａ遺伝子座を生成するための別の戦略は、連続的な大型標的化ベクターでの連続標的化を伴う（例えば、ＦＩＧ．２を参照されたい）。したがって、全てのヒトＪκ遺伝子セグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメント（ＭＡＩＤ ６５４８）に対してヘテロ接合のＥＳ細胞を、５’から３’の方向に、１５．５ｋｂ５’マウスホモロジーアーム、Ｆｒｔ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−Ｆｒｔ選択カセット、Ｖκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含む１２０ｋｂフラグメント、並びにＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメント（ＭＡＩＤ ６５４８配列中にも存在）を含む３０ｋｂ３’ヒトホモロジーアームを含む、大型標的化ベクターでエレクトロポレーションした。組み込みの成功を、上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを用いて、上記の表２に記載のプライマー及びプローブ、並びに図２に示されるＨｙｇ、ｈＩｇＫ５、ｈＩｇＫ６、ｈＩｇＫ１２、Ｎｅｏ、親１５４０ｍ３、親１５４０ｍ１を使用して確認した。具体的には、ＴＣＲＡ Ａｒｍ４及びｈＩｇＫ６プローブをアーム特異的プローブとして使用して、ＬＴＶＥＣの正確なゲノム標的化を立証した。組み込みの成功を確認するためにプライマー及びプローブ、ｈＩｇＫ１０の追加セットも使用され得る：順方向プライマー−ＣＧＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧ（配列番号６５）、プローブ−ＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴ（配列番号６６）、逆方向プライマー−ＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣ（配列番号６７）。
得られた、ＥＳ細胞中の標的化遺伝子座は、以下の接合配列を有した（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表４））。
Figure 0006840077
単離されたコロニーのＭＯＡスクリーニングは、スクリーニングされた４４０個のコロニーのうち、５個の正確に標的化されたクローンの同定をもたらし（ＬＴＶＥＣ単独）、１．１％の標的化効率であった。ＬＴＶＥＣ＋ＺＦＮ又はＬＴＶＥＣ＋ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９で標的化された、単離されたコロニーのスクリーニングに関する結果は、表９に示される。
図２に示される単一標的化の完了後に、ＥＳ細胞は、機能的ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントの全レパートリーになるために、追加のＶκを含む大型標的化ベクターで連続的に標的化されてもよい。
更に他の代替の戦略では、連続的な追加のヒトＩｇ Ｖκ遺伝子セグメントの二重又は単一標的化は、選択（例えば、ハイグロマイシン）カセット（複数可）の、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介又はＣＲＩＳＰＲ媒介破壊を伴う、二重（２つの大型標的化ベクター）、又は単一（１つの大型標的化ベクター）標的化スキームを使用して達成されてよい。
上記の標的化ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、前桑実胚期胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８−００７８０００ Ａ１号を参照されたい）。ドナーＥＳ細胞を含むマウス胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に着床されて、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを生産する。キメラヒトＩｇＫ Ｖ−マウスＴｃｒａ Ｃ遺伝子を独立して有するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスは、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を使用した遺伝子型判定によって同定される。
実施例２：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と組み合わせた２つのＬＴＶＥＣを使用したハイグロマイシン遺伝子の標的化
ジンクフィンガーヌクレアーゼを採用する実施例１に記載される二重標的化方法もまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いて実施した。
様々なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子内の様々な標的配列を（ＣＲＩＳＰＲ認識配列）を認識するように設計した。ハイグロマイシン遺伝子内のＣＲＩＳＰＲ認識配列は以下の通りであった。ｇＲＮＡ＃１：ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧ（配列番号７０）、ｇＲＮＡ＃６：ＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（配列番号７１）、ｇＲＮＡ＃１０：ＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ（配列番号７２）、及びｇＲＮＡ＃１６：ＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧ（配列番号７３）。ハイグロマイシン遺伝子内の認識配列の位置は、図３に示され、図３は、標的化ベクターＭＡＩＤ １５４５中のハイグロマイシンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介破壊を示す。ｇＲＮＡ＃１、ｇＲＮＡ＃６、ｇＲＮＡ＃１０、及びｇＲＮＡ＃１６をスクリーニングし、ハイグロマイシン遺伝子を特異的に標的化することが確認された（図３を参照されたい）。様々なハイグロマイシン特異的ｇＲＮＡを使用した一次スクリーニングからの結果は、表５に提供される。
Figure 0006840077
ＥＳ細胞、例えば、図１で生成されたＥＳ細胞（全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントに対してヘテロ接合のＭＡＩＤ ６５４８）を、単一ベクターと、又はハイグロマイシン耐性遺伝子内の標的部位を認識及び開裂する、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ＃１、ｇＲＮＡ＃６、ｇＲＮＡ＃１０、若しくはｇＲＮＡ＃１６）をコードする複数のベクターと一緒に、２つの大型標的化ベクター（実施例１に記載）でエレクトロポレーションした。
２つの大型標的化ベクターを相同組み換えによってＤＮＡ配列に挿入し、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを包囲する領域を置き換えた。２つの大型標的化ベクターの組み込みの成功を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用して確認した。
上記の標的化ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、前桑実胚期胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８−００７８０００ Ａ１号を参照されたい）。遺伝子修飾ＥＳ細胞を含むマウス胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に着床されて、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを生産する。ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスは、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を使用した遺伝子型判定によって同定される。
実施例３：ジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせた、３つのＬＴＶＥＣを用いたＴＣＲアルファ遺伝子座の標的化
３つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）が単一の標的化ステップでゲノム遺伝子座を修飾するように、三重標的化系を設計した。図４に示されるように、ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体上にＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞を、三重標的化系によって標的化して、追加のＩｇκ可変遺伝子セグメントを含むＥＳ細胞を生成した。
図４に要約されるこの三重標的化アプローチは、標的遺伝子座において、又はその付近で二本鎖切断を行うエンドヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＣａｓ９及びｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と一緒の、３つの異なる大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（ＭＡＩＤ ６６４７、ＭＡＩＤ ６６００、及びＭＡＩＤ １７１０）の、ＥＳ細胞への三重標的化又は共エレクトロポレーションを伴う。
このアプローチでは、第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ １７１０と表記）は、ヒトＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメントの配列を含む３’３０ｋｂホモロジーアームと、ヒトＶκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含んだ１２０ｋｂ配列と、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含んだ５’２０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含んだ。第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ ６６００と表記）は、３’ ２０ｋｂ重複領域（第１のベクターと同様に、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む領域）と、ヒトＶκ１−１７〜Ｖκ２−２４遺伝子セグメントを含む１４０ｋｂ配列と、ヒトＶκ３−２５〜Ｖκ２−３０を含んだ５’６０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含んだ。第３の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ ６６４７と表記）は、３’６０ｋｂ重複領域（第２のベクターと同様に、ヒトＶκ３−２５〜Ｖκ２−３０を含む領域）と、ヒトＶκ３−３１〜Ｖκ２−４０を含む９０ｋｂ配列と、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ選択カセットと、１５．５ｋｂ５’マウスＴＣＲ Ａホモロジーアームと、を含んだ。
標的ＴＣＲ Ａ遺伝子座における３つのＬＴＶＥＣの相同組み換えを促進するために、ハイグロマイシン耐性遺伝子内で標的配列を認識及び開裂する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を設計した。図４で生成されたＥＳ細胞（全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントに対してヘテロ接合のＭＡＩＤ ６５４８）を、ＺＦＮの各半分（１／２）を発現させる上記の３つの大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ６６００トリミング、ＭＡＩＤ１７００トリミング、及びＭＡＩＤ６６４７）及び２つのプラスミドでエレクトロポレーションし、それは、ハイグロマイシン耐性遺伝子中の認識配列に結合し、標的部位における二本鎖切断に触媒作用を及ぼす（ＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡｔｃｔｔａｇＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（配列番号２）（開裂部位は小文字）（表１を参照されたい）。
３つの大型標的化ベクターを相同組み換えによってＤＮＡ配列に挿入し、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを包囲する領域を置き換えた。得られたＥＳ細胞は、内在性ＴＣＲ Ａ遺伝子座において、ヒトＪκ１〜Ｊκ５及びＶκ４−１〜Ｖκ２−４０遺伝子セグメントを含む、ヒト免疫グロブリン可変領域を含んだ。上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを用いて、図４に示され、かつ上記の表２及び以下の６に列挙されるプローブ及びプライマー（ＧＯＡ＝対立遺伝子の獲得、ＬＯＡ＝対立遺伝子の欠失、コピー数＝形質転換組み込み対標的化組み込みを追跡するために配列のコピー数を調査する、ｈＡｒｍ１＝第１の標的化ベクター（ＭＡＩＤ １７１０）の３０ｋｂ３’ホモロジーアーム、ｈＡｒｍ２＝第１（ＭＡＩＤ １７１０）及び第２（ＭＡＩＤ ６６００）の大型標的化ベクターの２０ｋｂ重複、ｈＡｒｍ３＝第２（ＭＡＩＤ ６６００）及び第３（ＭＡＩＤ６６４７）の標的化ベクターの６０ｋｂ重複、ｍＡｒｍ＝第３の標的化ベクター（ＭＡＩＤ ６６４７）の１５．５ｋｂ５’ホモロジーアーム、ＷＴマウス対照−マウスＴＣＲ Ａ遺伝子座に存在する配列）を使用して、３つの大型標的化ベクターの組み込みの成功を確認した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３〜４８）。アーム特異的アッセイとも称される、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム中の配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、マウスゲノムへのＬＴＶＥＣの正確な標的化を検証した。これらのアーム特異的アッセイのコピー数を決定することは、マウスプローブ（ｍＡｒｍ）に対して２つのコピー数及びヒトプローブ（ｈＡｒｍ１）に対して１つのコピー数を保持した、正確に標的化されたＥＳクローンを、標的マウス遺伝子座のＣａｓ９誘発欠失がゲノム中の別の場所のＬＴＶＥＣのランダム組み込みと同時に起きる（その場合、マウスプローブ（ｍＡｒｍ）に対して３（又はそれよりも多く）のコピー数及びヒトプローブ（ｈＡｒｍ１）に対して２（又はそれよりも多く）のコピー数がある）クローンと区別するのに役立つための更なる明確化を提供した。所望の遺伝子座への相同組み換えによる３つのＬＴＶＥＣの正確な集合を検出するために、我々は、アーム特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを利用した。ｈＡｒｍ２及びｈＡｒｍ３に対して予測されたコピー数、１は、３つ全てのＬＴＶＥＣが単一の構築物に集合したことを示した。
Figure 0006840077
得られた、ＥＳ細胞中の標的化遺伝子座は、以下の接合配列を有した（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表７））。
Figure 0006840077
単離されたＥＳ細胞コロニーの対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）スクリーニングは、０．４％の標的化効率をもたらした（表８を参照されたい）。
Figure 0006840077
上記の標的化ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、前桑実胚期胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８−００７８０００ Ａ１号を参照されたい）。ドナーＥＳ細胞を含むマウス胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に着床されて、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを生産する。キメラヒトＩｇＫ Ｖ−マウスＴｃｒａ Ｃ遺伝子を独立して有するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスは、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を使用した遺伝子型判定によって同定される。
実施例４：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と組み合わせた３つのＬＴＶＥＣを使用したハイグロマイシン遺伝子の標的化
ジンクフィンガーヌクレアーゼを採用する実施例３に記載される三重標的化方法もまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いて実施した。
様々なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子内の様々な標的配列を（ＣＲＩＳＰＲ認識配列）を認識するように設計した。ハイグロマイシン遺伝子内のＣＲＩＳＰＲ認識配列は以下の通りであった。ｇＲＮＡ＃１：ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧ（配列番号７０）、ｇＲＮＡ＃６：ＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（配列番号７１）、ｇＲＮＡ＃１０：ＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧ（配列番号７２）、及びｇＲＮＡ＃１６：ＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧ（配列番号７３）。ハイグロマイシン遺伝子内の認識配列の位置は、図３に示される。ｇＲＮＡ＃１、ｇＲＮＡ＃６、ｇＲＮＡ＃１０、及びｇＲＮＡ＃１６をスクリーニングし、ハイグロマイシン遺伝子を特異的に標的化することが確認された（図３及び表５を参照されたい）。
ＭＡＩＤ ６５４８ ＥＳ細胞（全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントに対してヘテロ接合）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子内の標的部位を認識及び開裂するＣａｓ９及びｇＲＮＡ＃１６をコードするベクターと一緒に、実施例３に記載の３つの大型標的化ベクターでエレクトロポレーションした。
３つの大型標的化ベクターを相同組み換えによってＤＮＡ配列に挿入し、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを包囲する領域を置き換えた。３つの大型標的化ベクターの組み込みの成功を、実施例３に記載のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用して確認した。
得られた、ＥＳ細胞中の標的化遺伝子座は、表７に示される接合配列を有した（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である）。
単離されたＥＳ細胞コロニーの対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）スクリーニングは、０．４％の標的化効率をもたらした（表８を参照されたい）。
上記の標的化ＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、前桑実胚期胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８−００７８０００ Ａ１号を参照されたい）。遺伝子修飾ＥＳ細胞を含むマウス胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に着床されて、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを生産する。ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスは、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を使用した遺伝子型判定によって同定される。
実施例５：２つのＬＴＶＥＣ間の重複配列を介したＬＴＶＥＣ標的化の強化
実施例１に記載の二重標的化系を採用して、２つの大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を使用して、単一の標的化ステップでゲノム遺伝子座を修飾した。図１に示されるように、ハイグロマイシン選択カセットを含むマウス染色体１４上にＴＣＲアルファ遺伝子座のヘテロ接合型修飾を有する細胞を、二重標的化系によって標的化して、追加のＩｇκ可変遺伝子セグメントを含むＥＳ細胞を生成した。２つの異なるＬＴＶＥＣを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞中に一緒に共エレクトロポレーションした。任意に、エンドヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のいずれか）をコードする核酸を共エレクトロポレーションして、標的遺伝子座において、又はその付近で二本鎖切断を行った。
実施例１にあるように、ＬＴＶＥＣ（ＭＡＩＤ １７１０と表記）は、ヒトＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメントの配列を含んだ３’３０ｋｂホモロジーアームと、ヒトＶκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含んだ１２０ｋｂ配列と、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含んだ５’２０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含んだ。第２のＬＴＶＥＣ（ＭＡＩＤ ６６００と表記）は、３’２０ｋｂ重複領域（第１のベクターと同様に、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む領域）と、ヒトＶκ１−１７〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む１４０ｋｂ配列と、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ選択カセットと、１５．５ｋｂ３’マウスＴＣＲ Ａホモロジーアームと、を含んだ。
標的化の成功は、ＤＮＡ配列への相同組み換えによって２つのＬＴＶＥＣの挿入をもたらし、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを囲む領域を置換した。得られたＥＳ細胞は、内在性ＴＣＲ Ａ遺伝子座において、ヒトＪκ１〜Ｊκ５及びＶκ４−１〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む、ヒト免疫グロブリン可変領域を含んだ。上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを用いて、２つの大型標的化ベクターの組み込みの成功を、図１及び表２に示されるプローブ及びプライマーを使用して、確認した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３〜４８）。
比較として、実施例１に記載の単一のＬＴＶＥＣ系も採用して、単独で、又はＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と組み合わせてのいずれかで、単一のＬＴＶＥＣを使用して同じゲノム遺伝子座を修飾した（図２を参照されたい）。組み込みの成功を、上記のＴＡＱＭＡＮアッセイを用いて、上記の表２に列挙され、かつ図２に示されるプライマー及びプローブを使用して確認した。
表９は、単一のＬＴＶＥＣを使用した（単独で、ＺＦＮと、若しくはＣａｓ９と）、２つのＬＴＶＥＣを同時に使用した（単独で、ＺＦＮと、若しくはＣａｓ９と）、又は２つのＬＴＶＥＣ及び第３のＬＴＶＥＣを同時に使用した（単独で、ＺＦＮと、若しくはＣａｓ９と）、標的化実験における標的化効率を比較する。表９に示される標的化効率は、表２のＴＡＱＭＡＮプライマー及びプローブを使用した初期スクリーニング、確認スクリーニング、及び再確認スクリーニングを通じて正確に標的化されたことが決定された、スクリーニングされたＥＳＣクローンの割合である。単一のＬＴＶＥＣを単独で用いた標的化は、１．１％の正確に標的化されたクローンをもたらした。ＺＦＮを用いた開裂は、単一のＬＴＶＥＣの標的化効率を４．４％まで増加させ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた開裂は、単一のＬＴＶＥＣの標的化効率を５．５％まで増加させた。驚くべきことに、重複配列中で２０ｋｂを有する２つのＬＴＶＥＣを用いた標的化は、ヌクレアーゼを使用しなかったときでさえ、１．４％の標的化効率をもたらした。標的化効率は、ＺＦＮを使用したときに２．８１％まで増加し、Ｃａｓ９を使用したときに１．６％まで増加した。
Figure 0006840077
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目２）
前記第１の核酸挿入物及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それが、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方がヒト核酸である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、又は約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約５００ｋｂである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約３００ｋｂである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ又は少なくとも２０ｋｂである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方の前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、及び
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１のＬＴＶＥＣ及び前記第２のＬＴＶＥＣの組み合わせた使用が、単一ＬＴＶＥＣの使用と比較して標的化効率性の増大をもたらす、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記標的化効率性の増大が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１のＬＴＶＥＣ又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することと、
（ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、前記細胞に導入することであって、
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を含む標的化された細胞を選択することと、を含む、方法。
（項目１７）
前記第１の核挿入及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、前記第２の核挿入及び前記第２の３’ホモロジーアーム、並びに前記第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームが、前記隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上が前記細胞の種とは異なる種由来である、項目１６又は１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上がヒト核酸である、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約５０ｋｂ〜約７００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５５０ｋｂ、約５５０ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約６５０ｋｂ、又は約６５０ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約１００ｋｂ〜約７００ｋｂである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが約４００ｋｂである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的化された細胞が、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが約５ｋｂ〜約７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一であり、かつ／又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列が前記第３のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％同一である、項目１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂであり、かつ／又は前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも２０ｋｂである、項目１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みが、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失、あるいは、
（ｃ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、項目１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のＬＴＶＥＣ、前記第２のＬＴＶＥＣ、又は前記第３のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、項目１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的ゲノム遺伝子座における前記内因性配列の前記欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、又は約７００ｋｂ〜約８００ｋｂである、項目１２又は２７に記載の方法。
（項目３０）
細胞中の標的ゲノム遺伝子座における相同組み換えを強化するための方法であって、第１の核酸及び第２の核酸を前記細胞に導入することを含み、前記第１及び前記第２の核酸が重複ヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３１）
相同組み換えが、ヌクレアーゼ剤の使用なしで前記標的ゲノム遺伝子座において強化される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記標的ゲノム遺伝子座において、又はその付近で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を、前記細胞に導入することを更に含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼである、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、項目１〜２９及び３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、前記標的ゲノム遺伝子座における前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の前記相同組み換えを強化する、項目３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記相同組み換えの前記強化が少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の核酸の前記重複配列が、前記第２の核酸の前記重複配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％同一である、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記重複配列が約１ｋｂ〜約７０ｋｂである、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記重複配列が少なくとも２０ｋｂである、項目３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の核酸が、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、標的化ベクターであり、前記第２の核酸が、前記重複配列を除いて、前記標的ゲノム遺伝子座に相同であるヌクレオチド配列を含まない、項目３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記第１の核酸が、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の標的化ベクターであり、前記第２の核酸が、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２の標的化ベクターである、項目３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記第１の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目４１又は４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第２の標的化ベクターが、約２０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ第２の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記第１のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４３又は４４に記載の方法。
（項目４６）
前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜約２００ｋｂである、項目４４又は４５に記載の方法。
（項目４７）
前記重複配列が、前記第１の核酸の前記３’末端及び前記第２の核酸配列の前記５’末端に位置する、項目３０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記重複ヌクレオチド配列が、前記標的ゲノム遺伝子座への組み換え機構の誘引を促進する、項目３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞がヒト細胞である、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が非ヒト細胞である、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞が多能性細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、又は線維芽細胞である、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記哺乳類細胞がげっ歯類細胞である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
Ｆ０世代非ヒト動物を生産するための方法であって、
（ａ）非ヒト宿主胚に非ヒトＥＳ細胞を導入することであって、前記非ヒトＥＳ細胞が、項目１〜４８及び５０〜５５のいずれか一項に記載の方法によって生産されたものである、導入することと、
（ｂ）代理母において前記非ヒト宿主胚を懐胎させることと、を含み、
前記代理母が、前記修飾を含む前記Ｆ０世代非ヒト動物を生産する、方法。
（項目５７）
前記非ヒト動物がマウス又はラットである、項目５６に記載の方法。

Claims (23)

  1. インビトロでマウス胚性幹（ＥＳ）細胞若しくはラットＥＳ細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
    （ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞に導入することと、
    （ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣとを、前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞に導入することであって、
    前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも１００ｋｂであり、
    前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
    前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
    （ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を含む標的化されたマウスＥＳ細胞若しくは標的化されたラットＥＳ細胞を選択することと、を含む、方法。
  2. 前記第１の重複配列が少なくとも１ｋｂである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の核酸挿入物及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、それが、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み込みによって改質される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物がゲノムＤＮＡを含み、
    任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物が、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、１つ以上の発現カセット、又は部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含み、
    任意選択的に、前記ゲノムＤＮＡが、前記ゲノム標的遺伝子座における欠失のために標的化される配列に相同であるか、又はオルソロガスであり、
    任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の挿入が相同又はオルソロガスヒト核酸配列での非ヒト核酸配列の置き換えをもたらす、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. （Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、若しくは両方が前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞の種とは異なる種由来であり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、若しくは両方がヒト核酸である、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （Ｉ）前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、１２５ｋｂ〜１５０ｋｂ、１５０ｋｂ〜１７５ｋｂ、１７５ｋｂ〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜２２５ｋｂ、２２５ｋｂ〜２５０ｋｂ、２５０ｋｂ〜２７５ｋｂ、２７５ｋｂ〜３００ｋｂ、３００ｋｂ〜３５０ｋｂ、３５０ｋｂ〜４００ｋｂ、４００ｋｂ〜４５０ｋｂ、若しくは４５０ｋｂ〜５００ｋｂであるか、
    （ＩＩ）前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも２００ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物の組み合わせたサイズが３００ｋｂであるか、又は
    （ＩＩＩ）前記標的化されたマウスＥＳ細胞若しくは前記標的化されたラットＥＳ細胞が、前記第１の核酸挿入物及び前記第２の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが１００ｋｂ〜５００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. （Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と同一であり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが１ｋｂ〜７０ｋｂであり、及び／又は
    （ＩＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂである、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、又は両方の前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みが、
    （Ｉ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
    （ＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失であって、任意選択的に、前記欠失が５ｋｂ〜１０ｋｂ、１０ｋｂ〜２０ｋｂ、２０ｋｂ〜４０ｋｂ、４０ｋｂ〜６０ｋｂ、６０ｋｂ〜８０ｋｂ、８０ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１５０ｋｂ、１５０ｋｂ〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜３００ｋｂ、３００ｋｂ〜４００ｋｂ、４００ｋｂ〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜６００ｋｂ、６００ｋｂ〜７００ｋｂ、又は７００ｋｂ〜８００ｋｂである、欠失及び
    （ＩＩＩ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. （Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣ又は前記第２のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜２０ｋｂ、２０ｋｂ〜４０ｋｂ、４０ｋｂ〜６０ｋｂ、６０ｋｂ〜８０ｋｂ、８０ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１２０ｋｂ、又は１２０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、かつ前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、かつ前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂである、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. インビトロでマウスＥＳ細胞若しくはラットＥＳ細胞中の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
    （ａ）前記標的ゲノム遺伝子座内で一本鎖又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞に導入することと、
    （ｂ）長さが少なくとも１０ｋｂであり、第１の５’ホモロジーアーム及び第１の３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸挿入物を含む、第１の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第２の５’ホモロジーアーム及び第２の３’ホモロジーアームが隣接した第２の核酸挿入物を含む、第２のＬＴＶＥＣと、長さが少なくとも１０ｋｂであり、第３の５’ホモロジーアーム及び第３の３’ホモロジーアームが隣接した第３の核酸挿入物を含む、第３のＬＴＶＥＣとを、前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞に導入することであって、
    前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも１００ｋｂであり、
    前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の３’ホモロジーアームが、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の５’ホモロジーアームに相同の第１の重複配列を有し、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の３’ホモロジーアームが、前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の５’ホモロジーアームに相同の第２の重複配列を有し、前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の５’ホモロジーアーム及び前記第３のＬＴＶＥＣの前記第３の３’ホモロジーアームが、前記標的ゲノム遺伝子座内の対応するゲノムセグメントに相同であり、
    前記標的ゲノム遺伝子座が、前記対応するゲノムセグメント間の前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって修飾される、導入することと、
    （ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を含む標的化されたマウスＥＳ細胞若しくは標的化されたラットＥＳ細胞を選択することと、を含む、方法。
  11. 前記第１の重複配列が少なくとも１ｋｂであり、前記第２の重複配列が少なくとも１ｋｂである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第１の核挿入及び前記第１の３’ホモロジーアーム、並びに前記第２の核酸挿入物及び第２の５’ホモロジーアームが、隣接する核酸の重複フラグメントであり、前記第２の核挿入及び前記第２の３’ホモロジーアーム、並びに前記第３の核酸挿入物及び第３の５’ホモロジーアームが、前記隣接する核酸の重複フラグメントであり、それは、前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み込みによって改質される、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物及び／又は前記第３の核酸挿入物がゲノムＤＮＡを含み、
    任意選択的に、前記第１の核酸挿入物及び／又は前記第２の核酸挿入物及び／又は前記第３の核酸挿入物が、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、１つ以上の発現カセット、又は部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含み、
    任意選択的に、前記ゲノムＤＮＡが、前記ゲノム標的遺伝子座における欠失のために標的化される配列に相同であるか、又はオルソロガスであり、
    任意選択的に、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物及び前記第３の核酸挿入物の挿入が相同又はオルソロガスヒト核酸配列での非ヒト核酸配列の置き換えをもたらす、
    請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. （Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上が前記マウスＥＳ細胞若しくは前記ラットＥＳ細胞の種とは異なる種由来であり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上がヒト核酸である、
    請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. （Ｉ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、１２５ｋｂ〜１５０ｋｂ、１５０ｋｂ〜１７５ｋｂ、１７５ｋｂ〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜２２５ｋｂ、２２５ｋｂ〜２５０ｋｂ、２５０ｋｂ〜２７５ｋｂ、２７５ｋｂ〜３００ｋｂ、３００ｋｂ〜３５０ｋｂ、３５０ｋｂ〜４００ｋｂ、４００ｋｂ〜４５０ｋｂ、４５０ｋｂ〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜５５０ｋｂ、５５０ｋｂ〜６００ｋｂ、６００ｋｂ〜６５０ｋｂ、又は６５０ｋｂ〜７００ｋｂであるか、
    （ＩＩ）前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが少なくとも２００ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物の組み合わせたサイズが４００ｋｂであるか、又は
    （ＩＩＩ）前記標的化されたマウスＥＳ細胞若しくは前記標的化されたラットＥＳ細胞が、前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物を一緒に含む、ゲノムＤＮＡを含み、それらが１００ｋｂ〜７００ｋｂに及ぶ組み合わせたサイズを有する、
    請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. （Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列が、前記第２のＬＴＶＥＣの前記第１の重複配列と同一であり、かつ／若しくは前記第２のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列が前記第３のＬＴＶＥＣの前記第２の重複配列と同一であり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが１ｋｂ〜７０ｋｂであり、かつ／若しくは前記第２の重複配列の前記サイズが１ｋｂ〜７０ｋｂであり、及び／又は
    （ＩＩＩ）前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、かつ／若しくは、前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも１０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂであり、かつ／若しくは、前記第２の重複配列の前記サイズが少なくとも２０ｋｂである、
    請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記標的ゲノム遺伝子座への前記第１の核酸挿入物、前記第２の核酸挿入物、及び前記第３の核酸挿入物のうちの１つ以上の組み込みが、
    （Ｉ）前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加、
    （ＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座における内因性配列の欠失であって、任意選択的に、前記欠失が５ｋｂ〜１０ｋｂ、１０ｋｂ〜２０ｋｂ、２０ｋｂ〜４０ｋｂ、４０ｋｂ〜６０ｋｂ、６０ｋｂ〜８０ｋｂ、８０ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１５０ｋｂ、１５０ｋｂ〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜３００ｋｂ、３００ｋｂ〜４００ｋｂ、４００ｋｂ〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜６００ｋｂ、６００ｋｂ〜７００ｋｂ、又は７００ｋｂ〜８００ｋｂである、欠失あるいは、
    （ＩＩＩ）ノックイン、ノックアウト、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせ、のうちの１つ以上をもたらす、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. （Ｉ）前記第１のＬＴＶＥＣ、前記第２のＬＴＶＥＣ、又は前記第３のＬＴＶＥＣの前記５’及び前記３’ホモロジーアームの合計が１０ｋｂ〜２０ｋｂ、２０ｋｂ〜４０ｋｂ、４０ｋｂ〜６０ｋｂ、６０ｋｂ〜８０ｋｂ、８０ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１２０ｋｂ、又は１２０ｋｂ〜１５０ｋｂであり、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、かつ前記第３のＬＴＶＥＣが少なくとも５０ｋｂであり、任意選択的に、前記第１のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、前記第２のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂであり、かつ前記第３のＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂである、
    請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はメガヌクレアーゼである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とであり、任意選択的に、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記細胞が前記マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. マウス宿主胚に前記マウスＥＳ細胞を、またはラット宿主胚に前記ラットＥＳ細胞を導入することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. マウス若しくはラット代理母において前記マウス宿主胚若しくは前記ラット宿主胚を懐胎させることをさらに含み、前記マウス若しくはラット代理母が前記修飾された標的ゲノム遺伝子座を含むＦ０世代マウス若しくはラットを生産する、請求項２２に記載の方法。
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