JP6889762B2 - 標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物、並びに使用方法 - Google Patents
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Description
本願は、2014年6月26日出願の米国仮出願第62/017,582号及び2014年6月26日出願の米国仮出願第62/017,627号の利益を主張し、それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、多能性及び/又は全能性細胞を維持又は培養するための方法及び組成物、並びに細胞集団及びトランスジェニック動物を生成するための方法及び組成物に関する。
配列表の正式なコピーは、2015年6月25日に作成され、かつ14キロバイトのサイズを有する、ファイル名「463545SEQLIST.TXT」のASCII形式の配列表としてEFS−Web経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に出願される。このASCII形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
F0世代における繁殖力のあるXY雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非ヒト哺
乳類XY胚性幹(ES)細胞株を作製するための方法であって、
(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を含むように非ヒト
哺乳類XY ES細胞を修飾することと、
(b)F0世代における繁殖力のあるXY雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非
ヒト哺乳類XY ES細胞株を作製することを可能にする条件下で、前記修飾された非ヒ
ト哺乳類XY ES細胞を培養することと、を含む、方法。
(項目2)
(c)前記修飾された非ヒト哺乳類XY ES細胞を宿主胚内に導入することと、
(d)前記宿主胚を懐胎させることと、
(e)F0 XY雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を更に含み、性成熟に達すると、前
記F0 XY雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記非ヒト哺乳類XY ES細胞がげっ歯類由来である、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記非ヒト哺乳類XY ES細胞が129系統又はC57BL/6系統由来のマウスX
Y ES細胞である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記マウスXY ES細胞が、129系統に由来するY染色体を含む、項目5に記載の
方法。
(項目7)
前記マウスXY ES細胞がVGF1マウスES細胞である、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記Sryタンパク質のレベル及び/又は活性の前記減少が、前記Sry遺伝子を含む
ゲノム遺伝子座における標的化された遺伝子修飾に起因する、項目1〜7のいずれか一項
に記載の方法。
(項目9)
前記Sry遺伝子中の前記遺伝子修飾が、
(i)1つ以上のヌクレオチドの挿入と、
(ii)1つ以上のヌクレオチドの欠失と、
(iii)1つ以上のヌクレオチドの置換と、
(iv)ノックアウトと、
(v)ノックインと、
(vi)内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、又は異種核酸配列との置き換えと、
(vii)点突然変異と、
(viii)前記非ヒト哺乳類XY ES細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連
結された選択可能なマーカー及び/又はレポーター遺伝子の挿入と、
(ix)内因性Sryプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入と
、を含み、任意に、前記レポーター遺伝子がレポータータンパク質LacZをコードする
、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記非ヒト哺乳類XY ES細胞が、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Y染
色体上に標的ゲノム遺伝子座を含み、
前記標的ゲノム遺伝子座が前記Sry遺伝子であり、
修飾工程(a)が、
(i)前記非ヒト哺乳類XY ES細胞中に、(A)前記ヌクレアーゼ剤であって、前
記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する前記ヌクレアーゼ剤、及び(B)前
記認識部位に十分に近接して位置する第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2の
ホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む、標的化ベクターを導入するこ
とと、
(ii)前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記挿入ポリヌクレオチドを細
胞のゲノム中に含む、修飾された非ヒト哺乳類XY ES細胞を特定することと、を含む
、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目10に記載の
方法。
(項目12)
前記ヌクレアーゼ剤が、
(a)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(b)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、
(c)メガヌクレアーゼ、又は
(d)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(
Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)である、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Casタンパク質及び前記gRNAであり、前記Casタ
ンパク質がCas9であり、前記gRNAが、
(a)前記第1の認識部位を標的化するCRISPR RNA(crRNA)であって
、前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、CR
ISPR RNA(crRNA)と、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、項目1
2に記載の方法。
(項目14)
前記Sryタンパク質の前記レベル及び/又は活性が、前記細胞中に、前記Sryタン
パク質の前記レベル及び/又は活性を減少させるポリヌクレオチドを導入することによっ
て減少させられ、前記ポリヌクレオチドが、前記Sry mRNAの翻訳を防止するか、
前記Sry遺伝子の転写若しくは翻訳を阻止するポリペプチドをコードするか、又は前記
Sryタンパク質の前記活性を阻止するポリペプチドをコードする、項目1〜7のいずれ
か一項に記載の方法。
(項目15)
前記修飾された非ヒト哺乳類XY ES細胞が、前記Sryタンパク質の前記活性及び
/又はレベルを低減する条件付きSry対立遺伝子を含む、項目1〜7のいずれか一項に
記載の方法。
(項目16)
前記培養工程が、前記修飾された非ヒト哺乳類XY ES細胞を培養物中で維持するの
に好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、前記修飾された非ヒト哺乳類XY ES細
胞を培養することを含み、前記培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/k
g未満の浸透圧を示す低浸透圧培地である、項目1〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記低浸透圧培地が、以下の特徴、すなわち
(i)約11mS/cm〜約13mS/cmの導電率、
(ii)約50mM〜約110mMの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、
(iii)約17mM〜約30mMの炭酸塩濃度、並びに
(iv)約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃
度のうちの1つ以上を示す、項目16に記載の方法。
(項目18)
宿主胚内への前記修飾された非ヒト哺乳類XY ES細胞の導入及び続く前記宿主胚の
懐胎後に、前記F0非ヒト哺乳動物の少なくとも80%がXY雌であり、前記XY雌が、
性成熟に達すると繁殖力を持つ、項目1〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記F0 XY雌非ヒト哺乳動物がマウスであり、野生型マウスに交配されたときに繁
殖力を持つ、項目2に記載の方法。
(項目20)
前記野生型マウスがC57BL/6マウスである、項目19に記載の方法。
(項目21)
項目1〜20のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類XY ES細胞株を含む、インビト
ロ培養物。
(項目22)
F1世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、
(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性が減少したF0 XYの繁殖力のある
雌非ヒト哺乳動物を、同じES細胞クローン由来のF0 XY雄非ヒト哺乳動物コホート
クローン兄弟と交配させることであって、前記F0 XYの繁殖力のある雌非ヒト哺乳動
物及び前記F0 XY雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、前記遺伝子突然変異に関してヘテ
ロ接合性である、交配させることと、
(b)前記遺伝子修飾に関してホモ接合性であるF1子孫非ヒト哺乳動物を得ることと
、を含む、方法。
(項目23)
細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
(a)前記Y染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座を含む前記細胞を提供することであっ
て、前記標的ゲノム遺伝子座がヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む、提供することと
、
(b)前記細胞中に、第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーア
ームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む、標的化ベクターを導入することと、
(c)前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記挿入ポリヌクレオチドを細胞
のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
(項目24)
工程(b)が、前記細胞中に前記ヌクレアーゼ剤を導入することを更に含み、前記ヌク
レアーゼ剤が認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発し、前記第1及び第2の標的
部位が前記認識部位に十分に近接して位置する、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記第1のホモロジーアーム及び前記第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも4
kbであるが150kb未満である、項目23又は24に記載の方法。
(項目26)
前記第1のホモロジーアーム及び前記第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも1
0kbである、項目23又は24に記載の方法。
(項目27)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが、少なく
とも400bpであるが1000bp未満である、項目23又は24に記載の方法。
(項目28)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが約700
bp〜約800bpである、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記細胞が哺乳類細胞である、項目23〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記哺乳類細胞が非ヒト細胞である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記哺乳類細胞がげっ歯類由来である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記細胞が多能性細胞である、項目23〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記多能性細胞が人工多能性幹細胞(iPS)細胞又は非ヒト胚性幹(ES)細胞であ
る、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記多能性細胞がげっ歯類胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、マウスE
S細胞、又はラットES細胞である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目23〜35の
いずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記ヌクレアーゼ剤が、
(a)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(b)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、
(c)メガヌクレアーゼ、又は
(d)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(
Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)である、項目23〜35のいずれか一
項に記載の方法。
(項目38)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Casタンパク質及び前記gRNAであり、前記Casタ
ンパク質がCas9であり、前記gRNAが、
(a)前記第1の認識部位を標的化するCRISPR RNA(crRNA)であって
、前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、CR
ISPR RNA(crRNA)と、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、項目3
7に記載の方法。
(項目39)
前記挿入ポリヌクレオチドが約5kb〜約200kb、約200kb〜約250kb、
約250kb〜約300kb、約300kb〜約350kb、又は約350kb〜約40
0kbの長さである、項目23〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記挿入ポリヌクレオチドが、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌ
クレオチド、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸、又はプロモーターに操作可能
に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が、LacZ、mPlum
、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRe
d、mOrange、mKO、mCitrine、ビーナス、YPet、強化黄色蛍光タ
ンパク質(EYFP)、エメラルド、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)、CyPet
、シアン蛍光タンパク質(CFP)、セルリアン、T−サファイア、ルシフェラーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータ
ンパク質をコードする、項目23〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記修飾が、内因性核酸配列の欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、ドメイ
ンスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、制御配列スワップ、遺伝子スワッ
プ、又はこれらの組み合わせを含む、項目23〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記修飾が内因性核酸配列の欠失を含み、
(a)前記欠失が、約5kb〜約10kb、約10kb〜約20kb、約20kb〜約
40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100k
b、約100kb〜約150kb、若しくは約150kb〜約200kb、約200kb
〜約300kb、約300kb〜約400kb、約400kb〜約500kb、約500
kb〜約1Mb、約1Mb〜約1.5Mb、約1.5Mb〜約2Mb、約2Mb〜約2.
5Mb、若しくは約2.5Mb〜約3Mbに及ぶか、又は
(b)前記欠失が、少なくとも500kbである、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記修飾が、内因性核酸配列の外因性核酸配列との置き換えを含む、項目23〜42の
いずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記修飾が、内因性核酸配列の、相同又はオーソロガス核酸配列との置き換えを含む、
項目43に記載の方法。
(項目45)
前記Y染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Sry遺伝子、Uty遺伝子、Eif2
s3y遺伝子、Ddx3y遺伝子、Ube1y遺伝子、Tspy遺伝子、Usp9y遺伝
子、Zfy1遺伝子、Zfy2遺伝子、又は前記Kdm5d、Eif2s3y、Tspy
、Uty、Ddx3y、及びUsp9y遺伝子を包含する領域である、項目23〜44の
いずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記Y染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Sry遺伝子である、項目23〜44の
いずれか一項に記載の方法。
本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、コード及び非コードアミノ酸、並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。それらの用語はまた、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されているポリマーを含む。
ドナーES細胞及び宿主胚から非ヒト動物を作製するための方法が既知である。ドナーES細胞は、宿主胚に定着し、したがって、ドナーES細胞及び宿主胚によって形成される動物に部分的に、又は実質的に部分的に寄与する細胞の能力を強化する、ある特定の特徴のために選択される。形成された動物は、主にES細胞の遺伝子型(例えば、XY又はXX)に基づき、雄又は雌であり得る。
動物由来の様々なXY多能性及び/又は全能性細胞を含む様々な組成物及び方法が、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、用語「多能性細胞」は、2つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性及び/又は全能性XY細胞は、例えば、胚性幹(ES)細胞又は人工多能性幹(iPS)細胞であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」又は「ES細胞」は、胚内への導入後に発達中の胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性又は多能性細胞を含む。
ES細胞、マウスXY iPS細胞、ラットXY ES細胞、ラットXY iPS細胞、ハムスターXY ES細胞、ハムスターXY iPS細胞、サルXY ES細胞、サルXY iPS細胞、農業用哺乳類XY ES細胞、農業用XY iPS細胞、家畜哺乳類XY ES細胞、又は家畜XY iPS細胞である。更に、XY ES細胞又はXY iPS細胞は、近交系統、ハイブリッド系統、又は非近交系統由来であってもよい。多能性及び/又は全能性XY細胞がXYY核型又はXXY核型を含むことができることが、更に認識される。
F0世代におけるXYの繁殖力のある雌を促進する様々な方法及び組成物において採用される培地は、それが多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、ES細胞、iPS細胞、XY ES細胞、XY iPS細胞など)を維持するようなものである。用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」は、本明細書に記載される多能性及び/又は全能性細胞(ES細胞又はiPS細胞を含む)の特徴又は表現型のうちの少なくとも1つ以上の安定した保持を指す。そのような表現型は、細胞の多能性及び/又は全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、並びに他の機能的特徴を維持することを含むことができる。用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」はまた、細胞の増殖、又は培養されている細胞の数の増加を包含することができる。その用語は、細胞が分裂し、数を増加させ続ける場合も、そうでない場合もある一方で、細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件を更に企図する。
iPS細胞)を培養中で増殖させるか、又は維持するための基本培地に添加される要素を含む。例えば、多能性及び/又は全能性細胞を培養物中で増殖させるか、又は維持するのに好適な培地補充物としては、ウシ胎児血清(FBS)、グルタミン、抗生物質(複数可)、ペニシリン及びストレプトマイシン(例えば、penstrep)、ピルビン酸塩(例えば、ピルビン酸ナトリウム)、非必須アミノ酸(例えば、MEM NEAA)、2−メルカプトエタノール、並びに白血病阻止因子(LIF)が挙げられるがこれらに限定されない。
Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる標的化された遺伝子修飾を行うための様々な方法が使用され得る。例えば、1つの場合において、標的化された遺伝子修飾は、相同組み換え事象を介して標的化された遺伝子修飾を発生させる系を採用する。他の場合において、動物細胞は、標的化されたゲノム位置において一本鎖又は二本鎖切断を発生させるヌクレアーゼ剤を使用して修飾され得る。一本鎖又は二本鎖切断は、次いで、非相同末端結合経路(NHEJ)によって修復される。そのような系は、例えば、標的化された機能喪失型遺伝子修飾を発生させることにおいて用途を見出す。例えば、標的プラスミド、小さな標的化ベクター(smallTVEC)、又は大きな標的化ベクターの使用を含む、そのような標的化された遺伝子修飾を発生させるための非限定的な方法は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。また、Wang et al.(2013)Cell 153:910〜918、Mandalos et al.(2012)PLOS
ONE 7:e45768:1〜9、及びWang et al.(2013)Nat
Biotechnol.31:530〜532も参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
XY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)をインビトロ培養物中で維持又は培養するための方法が提供され、細胞は、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を含み、細胞は、本明細書に記載される条件下で、インビトロ培養物中で維持される。XY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)をインビトロ培養物中で維持又は培養するそのような方法は、宿主胚内への非ヒト動物XY ES細胞の導入及び続く宿主胚の懐胎後に、XY F0の繁殖力のある雌動物の数の増加を促進するような方法である。
本明細書に提供されるSryタンパク質のレベル及び/又は活性の減少を有するXY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)を採用する様々な方法及び組成物が、遺伝子修飾された動物を生成するために使用され得る。遺伝子修飾を導入するための様々な方法は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
F0世代における繁殖力のある雌XY非ヒト動物を作製するための方法が提供される。そのような方法は、(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を有するドナー非ヒト動物のXY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)を、XYの繁殖力のある雌ES細胞の発達を促進する培地中で維持又は培養することと、(b)宿主胚内に、ドナーXY非ヒト動物のXY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)を導入することと、(c)宿主胚を懐胎させることと、(d)F0 XY雌非ヒト動物を得ることとを含み、性成熟に達すると、F0 XY雌非ヒト動物は、繁殖力を持つ。特定の実施形態では、ドナー非ヒト動物のXYドナー細胞は、対象となるポリヌクレオチドにおいて少なくとも1つの追加の標的化された遺伝子修飾を含むことができる。そのような修飾は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
特定の実施形態では、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる遺伝子修飾を有するXY多能性及び/又は全能性細胞(すなわち、XY ES細胞又はXY iPS細胞)由来の、得られる雌の繁殖力のあるXY F0世代は、F1世代の子孫を得るために動物と交配させられる。特定の実施形態では、雌の繁殖力のあるXY F0は、野生型動物と交配させられる。一実施形態では、雌XY F0非ヒト哺乳動物は、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ。特定の実施形態では、野生型マウスは、C57BL/6である。F1子孫は、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性の減少を含む標的化された遺伝子修飾が存在するかを決定するための特異的なプライマー及び/又はプローブを使用して、遺伝子型決定され得る。更に、追加の標的化された遺伝子修飾がF0世代において存在した場合、F1子孫は、そのような修飾が存在するかを決定する特異的なプライマー及び/又はプローブを使用して、遺伝子型決定され得る。次いで、所望の使用のための適切なF1子孫が、特定され得る。特定の実施形態では、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を低減した遺伝子修飾を欠くF1子孫が選択される。他の実施形態では、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を低減した遺伝子修飾を欠き、かつ少なくとも1つの追加の標的化された遺伝子修飾を含むF1子孫が選択される。
細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする方法及び組成物が提供される。「困難な」ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする方法が更に提供される。用語「困難な遺伝子座」は、従来の遺伝子標的化戦略による標的化が難しい染色体領域を含む。そのような遺伝子座は、Y染色体、X染色体、又は常染色体上に位置し得る。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、遺伝子に乏しい、反復に富む、かつ/又は主に異質染色質の染色体領域内、又はそれに近接して位置する。例えば、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Bernardini et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:7600〜7605(2014)を参照されたい。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、染色体DNAへの接近可能性が染色質構造によって制限される染色体領域内、又はそれに近接して位置する。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、少なくとも約およそ20%、少なくとも約およそ30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、又は少なくとも約70%の異質染色質などの高い割合の異質染色質を特徴とする染色体領域内にあるか、又はそれに近接している。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、複製及び再配列を受けているか、又は反復若しくは逆方向反復の存在を特徴とする染色体領域内にあるか、又はそれに近接している。例えば、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gubbay et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7953〜7957(1992)を参照されたい。
用語「ヌクレアーゼ剤のための認識部位」は、ニック又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘発されるDNA配列を含む。ヌクレアーゼ剤のための認識部位は、細胞に対して内因性(若しくは天然)であってもよく、又は認識部位は、細胞に対して外因性であってもよい。特定の実施形態では、認識部位は、細胞に対して外因性であり、それにより、細胞のゲノム中で自然発生的ではない。なお更なる実施形態では、認識部位は、細胞に対して、かつ標的遺伝子座に位置付けられることが望まれる対象となるポリヌクレオチドに対して外因性である。更なる実施形態では、外因性又は内因性認識部位は、宿主細胞のゲノム中で一度のみ存在する。特定の実施形態では、ゲノム内で一度のみ生じる内因性又は天然部位が特定される。次いで、そのような部位は、内因性認識部位においてニック又は二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼ剤を設計するために使用され得る。
A1号、同第2005/0208489 A1号、同第2005/0026157 A1号、同第2005/0064474 A1号、同第2006/0188987 A1号、及び同第2006/0063231 A1号に開示される(それぞれが参照により本明細書に組み込まれる)。様々な実施形態では、例えば、対象となる遺伝子座又は対象となるゲノム遺伝子座において、標的核酸配列中、又はその近くで切断するTALエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列は、標的化ベクターによって修飾される配列にあるか、又はその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なTALヌクレアーゼには、本明細書に記載されるような標的化ベクターによって修飾される標的核酸配列において、又はその近くで結合するように特異的に設計されるTALヌクレアーゼが含まれる。
30:3870〜9、Sussman et al.,(2004)J Mol Biol 342:31〜41、Rosen et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:4791〜800、Chames et al.,(2005)Nucleic Acids Res 33:e178、Smith et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149、Gruen et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:e29、Chen and Zhao,(2005)Nucleic Acids Res 33:e154、国際公開第WO2005105989号、同第WO2003078619号、同第WO2006097854号、同第WO2006097853号、同第WO2006097784号、及び同第WO2004031346号を参照されたい。
Res 31:418〜20)、Roberts et al.,(2003)Nucleic Acids Res 31:1805〜12、及びBelfort et al.,(2002)Mobile DNA II,pp.761〜783,Eds.Craigie et al.,(ASM Press,Washington,DC)で更に記載及び分類される。
Mar;31(3):233〜9、及びCong L et al.Science 2013 Feb 15;339(6121):819〜23を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
Casタンパク質は、概して、少なくとも1つのRNA認識又は結合ドメインを含む。そのようなドメインは、ガイドRNA(gRNA、以下でより詳細に記載される)と相互作用することができる。Casタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNase又はRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量化ドメイン、及び他のドメインを含むことができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸開裂のための触媒活性を有する。開裂は、核酸分子の共有結合の切断を含む。開裂は、平滑末端又は段違いの末端を生じさせることができ、それは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
ス−セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム−シビリカム、ラクトバチラス−デルブリッキー、ラクトバチラス−サリバリウス、ミクロシラ−マリナ、バークホルデリア−バクテリウム、ポラロモナス−ナフタレニボランス、ポラロモナス属、クロコスファエラ−ワトソニイ、シアノセイス属、ミクロキスティス−エルギノーサ、シネココックス属、アセトハロビウム−アラビティカム、アンモニフェツクス−デゲンシイ、カルディセルロシルプター−ベシー、カンジデイタス−デサルホルディス、クロストリジウム−ボツリナム、クロストリジウム−ディフィシル、フィネゴルディア−マグナ、ナトロアナエロビウス−サーモフィルス、ペロトマクルム−サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス−カルダス、アシディチオバチルス−フェロオキシダンス、アロクロマチウム−ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス−ハロフィルス、ニトロソコッカス−ワトソニイ、シュードアルテロモナス−ハロプランクティス、クテドノバクター−ラセミファー、メタノハロビウム−エベスチガータム、アナベナ−バリアビリス、ノジュラリア−スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ−マキシマ、アルスロスピラ−プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレウス−クソノプラステス、オスキラトリア属、ペトロトガ−モビリス、サーモシフォ−アフリカヌス、又はAアカリオクロリス−マリナ由来であってもよい。Cas9ファミリーメンバーの追加の例は、参照よりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO 2014/131833号に記載される。化膿レンサ球菌からの、又はそれ由来のCas9タンパク質が、好ましい酵素である。化膿レンサ球菌からのCas9タンパク質には、SwissProt受託番号Q99ZW2が割り当てられている。
「ガイドRNA」又は「gRNA」は、Casタンパク質と結合し、Casタンパク質を標的DNA内の特定の位置に標的化するRNA分子を含む。ガイドRNAは、2つの部分、すなわち「DNA標的化セグメント」と「タンパク質結合セグメント」とを含むことができる。「セグメント」は、RNA中のヌクレオチドの隣接区間など、分子のセグメント、セクション、又は領域を含む。いくつかのgRNAは、2つの別々のRNA分子、すなわち「アクチベーターRNA」と「ターゲッターRNA」とを含む。他のgRNAは、「単一分子gRNA」、「単一ガイドRNA」、又は「sgRNA」とも呼ばれ得る、単一RNA分子(単一RNAポリヌクレオチド)である。例えば、国際公開第WO/2013/176772A1号、同第WO/2014/065596A1号、同第WO/2014/089290A1号、同第WO/2014/093622A2号、同第WO/2014/099750A2号、同第WO/2013142578A1号、及び同第WO 2014/131833A1号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。用語「ガイドRNA」及び「gRNA」は、二重分子gRNA及び単一分子gRNAの両方を含む。
用語「CRISPR RNA認識配列」は、gRNAのDNA標的化セグメントが結合する標的DNA中に存在する核酸配列を含むが、ただし、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、CRISPR RNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するように設計される配列を含み、CRISPR RNA認識配列とDNA標的化配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、ただしハイブリダイゼーションを引き起こし、かつCRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があることを条件とする。CRISPR RNA認識配列は、以下でより詳細に記載される、Casタンパク質のための開裂部位も含む。CRISPR RNA認識配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、それは、例えば、細胞の核若しくは細胞質内に、又はミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に位置し得る。
困難なゲノム遺伝子座又はY染色体の遺伝子座を修飾するための非限定的な方法は、少なくとも10kbの核酸配列を含む大きな標的化ベクター(LTVEC)の存在下で、Casタンパク質及びCRISPR RNAに染色体(すなわち、Y染色体)を曝露することを含み、Casタンパク質、CRISPR RNA、及びLTVECへの曝露に続いて、染色体(すなわち、Y染色体)は、少なくとも10kbの核酸配列を含むように修飾される。
Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする、様々な選択マーカーが、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。そのようなマーカーは、本明細書の別の個所で開示され、G418、ヒグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン、又はピューロマイシンなどの抗生物質への耐性を付与する選択マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。そのような発現カセット及びそれらの様々な制御成分は、本明細書の別の個所で更に詳細に考察される。
Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座における少なくとも1つの挿入ポリヌクレオチドの組み込みを可能にする、様々な方法及び組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座」は、挿入ポリヌクレオチドを組み込みたいY染色体上のDNAの任意のセグメント又は領域を含む。
上記で概説されたように、本明細書に提供される方法及び組成物は、単独で、又はヌクレアーゼ剤と組み合わせて標的化ベクターを採用する。「相同組み換え」は、従来、相同性の領域内の交差部位における2つのDNA分子間のDNAフラグメントの交換を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、「挿入ポリヌクレオチド」は、標的ゲノム遺伝子座において組み込むことが望まれるDNAのセグメントを含む。特定の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、Y染色体上にある。他の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、困難なゲノム遺伝子座である。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、対象となる1つ以上のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、1つ以上の発現カセットを含むことができる。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な制御成分と共に、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及び/又はレポーター遺伝子を含むことができる。挿入ポリヌクレオチド内に含まれ得る、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカー、及びレポーター遺伝子の非限定的な例は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
標的化ベクターは、Y染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座に、又は別の対象となる染色体上に挿入ポリヌクレオチドを導入するために採用される。標的化ベクターは、挿入ポリヌクレオチドを含み、挿入ポリヌクレオチドに隣接する上流及び下流ホモロジーアームを更に含む。挿入ポリヌクレオチドに隣接するホモロジーアームは、標的化されたゲノム遺伝子座内のゲノム領域に対応する。参照を容易にするために、標的化されたゲノム遺伝子座内の対応するゲノム領域は、本明細書において「標的部位」と称される。したがって、一実施例において、標的化ベクターは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の第1の認識部位に十分に近接して位置する第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した、第1の挿入ポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、それにより、標的化ベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと対応する標的部位との間で生じる相同組み換え事象を通じて、標的化されたゲノム遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの組み込みを補助する。
本明細書で使用される場合、用語「大きな標的化ベクター」又は「LTVEC」は、細胞中で相同標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、かつそれら由来である、及び/又は細胞中で相同組み換え標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、ホモロジーアームを含む、大きな標的化ベクターを含む。特定の実施形態では、LTVECのホモロジーアーム及び/又は挿入ポリヌクレオチドは、真核細胞のゲノム配列を含む。LTVECのサイズは、従来のアッセイ、例えば、サザンブロッティング及びロングレンジ(例えば、1kb〜5kb)PCRによって、標的化事象のスクリーニングを可能にするには大きすぎる。LTVECの例としては、細菌人工染色体(BAC)、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体(YAC)由来のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。LTVEC及びそれらを作製するための方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第6,586,251号、同第6,596,541号、同第7,105,348号、及び国際公開第WO 2002/036789号(PCT/US01/45375)号に記載され、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供され、(a)Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、(b)細胞中に、第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することと、(c)Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む。同様の方法が、困難な染色体遺伝子座を標的化するために実施され得る。本明細書の別の個所で詳細に考察されるように、特定の実施形態では、標的化ベクターの第1のホモロジーアーム及び第2のホモロジーアームの合計は、約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb〜約1kb、約1kb〜約1.5kb、約1.5kb〜約2kb、約2kb〜約3kb、約3kb〜約4kb、約4kb〜約5kb、約5kb〜約6kb、約6kb〜約7kb、約8kb〜約9kbであるか、又は少なくとも10kb若しくは少なくとも10kbかつ150kb未満である。特定の実施形態では、LTVECが採用される。他の特定の実施形態では、smallTVECが採用される。1つの非限定的な実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるXY F0の繁殖力のある雌の発達を促進する培地を採用し、それによりXY F0の繁殖力のある雌動物を生成して実施される。他の場合において、本明細書に記載される方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、Sry遺伝子における標的化された遺伝子修飾を生じさせるために採用される。
任意の対象となるポリヌクレオチドが様々な挿入ポリヌクレオチドに含有され、それにより、Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座において組み込まれてもよい。本明細書に開示される方法は、少なくとも1、2、3、4、5、6個、又はそれよりも多くの対象となるポリヌクレオチドが、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれることを可能にする。
上記で概説されたように、Y染色体上に位置する、困難な標的遺伝子座における対象となる1つ以上のポリヌクレオチドの標的化された遺伝子修飾、又はSryタンパク質のレベル及び/若しくは活性の減少を可能にするための方法及び組成物が、本明細書に提供される。Y染色体又は困難な標的染色体遺伝子座上の配列への標的化された遺伝子修飾に加えて、追加の標的化された遺伝子修飾が他の染色体に行われ得ることが更に認識される。これらの標的化された遺伝子修飾を可能にするそのような系は、様々な構成成分を採用することができ、参照を容易にするために、本明細書において、用語「標的化されたゲノム組み込み系」は、一般的に、組み込み事象のために必要とされる全ての構成成分を含む(すなわち、様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入DNAポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチド)。
本明細書に記載される様々な方法は、Y染色体に対して、又は細胞中の困難な標的遺伝子座に対して、ゲノム遺伝子座標的化系を採用する。そのような細胞としては、大腸菌を含む細菌細胞などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、又はマウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、トリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)細胞などが挙げられるがこれらに限定されない哺乳類細胞、及び家畜哺乳動物からの細胞、若しくは農業用哺乳動物からの細胞が挙げられる。いくつかの細胞は、非ヒト、特に、非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、好適な遺伝学的に修飾可能な多能性細胞が容易に入手可能ではない哺乳動物に対して、例えば、Oct3/4、Sox2、KLF4、Myc、Nanog、LIN28、及びGlis1が挙げられるがこれらに限定されない、多能性誘導因子の組み合わせの体細胞への導入を介して、体細胞を多能性細胞に再プログラミングするために、他の方法が採用される。そのような方法では、細胞はまた、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非ヒト細胞、げっ歯類、ラット、マウス、ハムスターからの細胞、線維芽細胞、又は任意の他の宿主細胞であってもよい。他の実施形態では、細胞は、多能性細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、非ヒト胚性幹(ES)細胞である。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹(iPS)細胞を含む多能性細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、ラット胚性幹(ES)細胞、ヒト胚(ES)細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞、げっ歯類胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、若しくはラット胚性幹(ES)細胞が挙げられる。
1.
(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を有する非ヒト哺乳類XY胚性幹(ES)細胞と、
(b)該非ヒト哺乳類ES細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地であって、以下の特徴、すなわち約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満の浸透圧、約11mS/cm〜約13mS/cmの導電率、約50mM〜約110mMの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約17mM〜約30mMの炭酸塩濃度、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに/又はこれらの任意の2つ以上の組み合わせのうちの1つ以上を示す、培地と、を含む、xインビトロ培養物。
2.該非ヒト哺乳類XY ES細胞がげっ歯類由来である、請求項1に記載のインビトロ培養物。
3.該げっ歯類がマウスである、請求項2に記載のインビトロ培養物。
4.該マウスXY ES細胞がVGF1マウスES細胞である、実施形態3に記載のインビトロ培養物。
5.該げっ歯類がラット又はハムスターである、実施形態2に記載のインビトロ培養物。
6.該Sryタンパク質のレベル及び/又は活性の該減少が、該Sry遺伝子中の遺伝子修飾による、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
7.該Sry遺伝子中の該遺伝子修飾が、1つ以上のヌクレオチドの挿入、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態6に記載のインビトロ培養物。
8.該非ヒト哺乳類ES細胞が、1つ、2つ、3つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
9.該標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態8に記載のインビトロ培養物。
10.該標的化された遺伝子修飾が、XY ES細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも1つの挿入を含む、実施形態8に記載のインビトロ培養物。
11.該標的化された遺伝子修飾が、常染色体上にある、実施形態8〜10のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
12.該基本培地が、50±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、及び218±22mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
13.該基本培地が、約3mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び218mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
14.該基本培地が、87±5mMのNaCl、18±5mMの炭酸塩、及び261±26mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
15.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、1.5mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び261mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
16.該基本培地が、110±5mMのNaCl、18±5mMの炭酸塩、及び294±29mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
17.該基本培地が、約6.4mg/mLのNaCl、1.5mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び294mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
18.該基本培地が、87±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、及び270±27mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
19.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び270mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
20.該基本培地が、87±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、86±5mMのグルコース、及び322±32mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
21.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、15.5mg/mLのグルコース、及び322mOsm/kgを示す、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
22.宿主胚内への該非ヒト哺乳類XY ES細胞の導入及び続く該宿主胚の懐胎後に、該F0非ヒト哺乳動物の少なくとも80%がXY雌であり、性成熟に達すると、該F0
XY雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、実施形態1〜21のいずれか1つに記載のインビトロ培養物。
23.F0世代における繁殖力のある雌XY非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
(a)非ヒト哺乳類ES細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を有するドナー非ヒト哺乳類XY胚性幹(ES)細胞を培養することであって、該培地が、以下のうちの1つ以上を含む特徴、すなわち約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満の浸透圧、約11mS/cm〜約13mS/cmの導電率、約50mM〜約110mMの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約17mM〜約30mMの炭酸塩濃度、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに/又はこれらの任意の2つ以上の組み合わせを示す、培養することと、
(b)該ドナーXY非ヒト哺乳類ES細胞を宿主胚内に導入することと、
(c)該宿主胚を懐胎させることと、
(d)F0 XY雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、該F0 XY雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、方法。
24.該非ヒト哺乳類XY ES細胞がげっ歯類由来である、実施形態23に記載の方法。
25.該げっ歯類がマウスである、実施形態24に記載の方法。
26.該マウスXY ES細胞がVGF1マウスES細胞である、実施形態25に記載の方法。
27.該げっ歯類がラット又はハムスターである、実施形態24に記載の方法。
28.該Sryタンパク質のレベル及び/又は活性の該減少が、該Sry遺伝子中の遺伝子修飾による、実施形態23〜27のいずれか1つに記載の方法。
29.該Sry遺伝子中の該遺伝子修飾が、1つ以上のヌクレオチドの挿入、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態28の方法。
30.該非ヒト哺乳類ES細胞が、1つ、2つ、3つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む、実施形態23〜29のいずれか1つに記載の方法。
31.該標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態30に記載の方法。
32.該標的化された遺伝子修飾が、該XY ES細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも1つの挿入を含む、実施形態30に記載の方法。
33.該標的化された遺伝子修飾が常染色体上にある、実施形態30〜32のいずれか1つに記載の方法。
34.該基本培地が、50±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、及び218±22mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
35.該基本培地が、約3mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び218mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
36.該基本培地が、87±5mMのNaCl、18±5mMの炭酸塩、及び261±26mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
37.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、1.5mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び261mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
38.該基本培地が、110±5mMのNaCl、18±5mMの炭酸塩、及び294±29mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
39.該基本培地が、約6.4mg/mLのNaCl、1.5mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び294mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
40.該基本培地が、87±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、及び270±27mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
41.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、及び270mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
42.該基本培地が、87±5mMのNaCl、26±5mMの炭酸塩、86±5mMのグルコース、及び322±32mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
43.該基本培地が、約5.1mg/mLのNaCl、2.2mg/mLの重炭酸ナトリウム、15.5mg/mLのグルコース、及び322mOsm/kgを示す、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
44.F1世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、(a)該Sryタンパク質のレベル及び/又は活性が減少したF0 XYの繁殖力のある雌を、同じES細胞クローン由来のコホートクローン兄弟であるF0 XY雄非ヒト哺乳動物と交配させることであって、該F0 XYの繁殖力のある雌の非ヒト哺乳動物及び該F0 XY雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、該遺伝子突然変異に関してヘテロ接合性である、交配させることと、(b)該遺伝子修飾に関してホモ接合性であるF1子孫マウスを得ることと、を含む、方法。
45.細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、(a)ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、(b)該細胞中に、(i)ヌクレアーゼ剤であって、第1の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び(ii)該第1の認識部位に十分に近接して位置する第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することであって、該第1のホモロジーアーム及び該第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも4kbであるが150kb未満である、導入することと、(c)該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
46.細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
(a)ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
(b)該細胞中に、第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することであって、該第1のホモロジーアーム及び該第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも4kbであるが150kb未満である、導入することと、
(c)該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
47.該細胞が哺乳類細胞である、実施形態45又は46に記載の方法。
48.該哺乳類細胞が非ヒト細胞である、実施形態47に記載の方法。
49.該哺乳類細胞がげっ歯類由来である、実施形態47に記載の方法。
50.該げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、実施形態49に記載の方法。
51.該細胞が多能性細胞である、実施形態45〜50のいずれか1つに記載の方法。
52.該哺乳類細胞が人工多能性幹(iPS)細胞である、実施形態45〜50のいずれか1つに記載の方法。
53.該多能性細胞が非ヒト胚性幹(ES)細胞である、実施形態51の方法。
54.該多能性細胞がげっ歯類胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、又はラット胚性幹(ES)細胞である、実施形態51の方法。
55.該ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、実施形態45及び47〜54のいずれか1つに記載の方法。
56.該ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である、実施形態45及び47〜54のいずれか1つに記載の方法。
57.該ヌクレアーゼ剤が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、実施形態45及び47〜54のいずれか1つに記載の方法。
58.該ヌクレアーゼ剤がメガヌクレアーゼである、実施形態45及び47〜54のいずれか1つに記載の方法。
59.該ヌクレアーゼ剤がCRISPR RNA誘導型Cas9エンドヌクレアーゼである、実施形態45及び47〜54のいずれか1つに記載の方法。
60.少なくとも10kbの核酸配列を含む大きな標的化ベクター(LTVEC)の存在下で、Casタンパク質及びCRISPR RNAにY染色体を曝露することを含む、該Y染色体を修飾するための方法であって、該Casタンパク質、該CRISPR RNA、及び該LTVECへの曝露に続いて、該Y染色体が少なくとも10kbの核酸配列を含むように修飾されることを含む、方法。
61.該LTVECが、少なくとも20kb、少なくとも30kb、少なくとも40kb、少なくとも50kb、少なくとも60kb、少なくとも70kb、少なくとも80kb、又は少なくとも90kbの核酸配列を含む、実施形態60に記載の方法。
62.該LTVECが、少なくとも100kb、少なくとも150kb、又は少なくとも200kbの核酸配列を含む、実施形態60に記載の方法。
63.Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、(a)該Y染色体上の該標的ゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞を提供することであって、該標的ゲノム遺伝子座は、ガイドRNA(gRNA)標的配列を含む、提供することと、(b)該哺乳類細胞中に、(i)該標的ゲノム遺伝子座に相同の標的化アームが隣接した第1の核酸を含む、大きな標的化ベクター(LTVEC)であって、少なくとも10kbである、LTVECと、(ii)Casタンパク質をコードする第2の核酸に操作可能に連結された第1のプロモーターを含む、第1の発現構築物と、(iii)該gRNA標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むガイドRNA(gRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする第3の核酸に操作可能に連結された第2のプロモーターを含む、第2の発現構築物と、を導入することであって、該第1及び第2のプロモーターは、該哺乳類細胞中で活性である、導入することと、(c)該Y染色体上の該標的ゲノム遺伝子座において標的化された遺伝子修飾を含む修飾された哺乳類細胞を特定することと、を含む、方法。
64.該LTVECが少なくとも15kb、少なくとも20kb、少なくとも30kb、少なくとも40kb、少なくとも50kb、少なくとも60kb、少なくとも70kb、少なくとも80kb、又は少なくとも90kbである、実施形態63に記載の方法。
65.該LTVECが少なくとも100kb、少なくとも150kb、又は少なくとも200kbである、実施形態63に記載の方法。
66.該哺乳類細胞が非ヒト哺乳類細胞である、実施形態63に記載の方法。
67.哺乳類細胞が線維芽細胞である、実施形態63に記載の方法。
68.該哺乳類細胞がげっ歯類由来である、実施形態63に記載の方法。
69.該げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、実施形態68に記載の方法。
70.該哺乳類細胞が多能性細胞である、実施形態63に記載の方法。
71.該多能性細胞が人工多能性幹(iPS)細胞である、実施形態70に記載の方法。
72.該多能性細胞がマウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞である、実施形態70に記載の方法。
73.該多能性細胞が発達制限されたヒト前駆細胞である、実施形態70に記載の方法。
74.該Casタンパク質がCas9タンパク質である、実施形態63に記載の方法。
75.該gRNA標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、実施形態74に記載の方法。
76.該LTVECの5’及び3’ホモロジーアームの合計が約10kb〜約150kbである、実施形態63に記載の方法。
77.該LTVECの該5’及び3’ホモロジーアームの合計が約10kb〜約20kb、約20kb〜約40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100kb、約100kb〜約120kb、又は約120kb〜150kbである、実施形態76に記載の方法。
78.該標的化された遺伝子修飾が、(a)内因性核酸配列の、相同若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、(b)内因性核酸配列の欠失、(c)欠失が約5kb〜約10kb、約10kb〜約20kb、約20kb〜約40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100kb、約100kb〜約150kb、若しくは約150kb〜約200kb、約200kb〜約300kb、約300kb〜約400kb、約400kb〜約500kb、約500kb〜約1Mb、約1Mb〜約1.5Mb、約1.5Mb〜約2Mb、約2Mb〜約2.5Mb、若しくは約2.5Mb〜約3Mbに及ぶ、内因性核酸配列の該欠失、(d)外因性核酸配列の挿入、(e)約5kb〜約10kb、約10kb〜約20kb、約20kb〜約40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100kb、約100kb〜約150kb、約150kb〜約200kb、約200kb〜約250kb、約250kb〜約300kb、約300kb〜約350kb、若しくは約350kb〜約400kbに及ぶ、外因性核酸配列の挿入、(f)相同若しくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、(g)ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、(h)部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子の挿入、(i)該哺乳類細胞中で活性な第3のプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子の挿入、又は(j)これらの組み合わせを含む、実施形態63に記載の方法。
79.該標的ゲノム遺伝子座が、(i)5’ホモロジーアームに相同である5’標的配列と、(ii)3’ホモロジーアームに相同である3’標的配列とを含む、実施形態63に記載の方法。
80.該5’標的配列及び該3’標的配列が少なくとも5kbであるが3Mb未満隔てられる、実施形態79に記載の方法。
81.該5’標的配列及び該3’標的配列が、少なくとも5kbであるが10kb未満、少なくとも10kbであるが20kb未満、少なくとも20kbであるが40kb未満、少なくとも40kbであるが60kb未満、少なくとも60kbであるが80kb未満、少なくとも約80kbであるが100kb未満、少なくとも100kbであるが150kb未満、又は少なくとも150kbであるが200kb未満、少なくとも約200kbであるが約300kb未満、少なくとも約300kbであるが約400kb未満、少なくとも約400kbであるが約500kb未満、少なくとも約500kbであるが約1Mb未満、少なくとも約1Mbであるが約1.5Mb未満、少なくとも約1.5Mbであるが約2Mb未満、少なくとも約2Mbであるが約2.5Mb未満、又は少なくとも約2.5Mbであるが約3Mb未満隔てられる、実施形態79に記載の方法。
82.該第1及び第2の発現構築物が単一核酸分子上にある、実施形態63に記載の方法。
83.該標的ゲノム遺伝子座がSry遺伝子座を含む、実施形態63に記載の方法。
84.非ヒト動物のY染色体の標的化された遺伝子修飾のための方法であって、(a)実施形態4に記載の方法に従って、非ヒト多能性細胞の該Y染色体上の対象となるゲノム遺伝子座を修飾し、それにより、該Y染色体上の標的化された遺伝子修飾を含む、遺伝子修飾された非ヒト多能性細胞を生み出すことと、(b)非ヒト宿主胚内に(a)の修飾された非ヒト多能性細胞を導入することと、(c)代理母において修飾された多能性細胞を含む該非ヒト宿主胚を懐胎させることとを含み、該代理母が、該標的化された遺伝子修飾を含むF0子孫を生み出し、該標的化された遺伝子修飾が、生殖系列を通じて伝達されることが可能である、方法。
85.該対象となるゲノム遺伝子座がSry遺伝子座を含む、実施形態84に記載の方法。
86.細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、(a)ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、(b)該細胞中に、(i)ヌクレアーゼ剤であって、第1の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び(ii)該第1の認識部位に十分に近接して位置する第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することであって、該第1のホモロジーアーム及び該第2のホモロジーアームの長さが、少なくとも400bpであるが1000bp未満である、導入することと、(c)該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
87.該第1のホモロジーアーム及び/又は該第2のホモロジーアームの該長さが約700bp〜約800bpである、実施形態86に記載の方法。
88.該修飾が内因性核酸配列の欠失を含む、実施形態86に記載の方法。
89.該欠失が約5kb〜約10kb、約10kb〜約20kb、約20kb〜約40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100kb、約100kb〜約150kb、又は約150kb〜約200kb、約200kb〜約300kb、約300kb〜約400kb、約400kb〜約500kb、約500kb〜約1Mb、約1Mb〜約1.5Mb、約1.5Mb〜約2Mb、約2Mb〜約2.5Mb、又は約2.5Mb〜約3Mbに及ぶ、実施形態88に記載の方法。
90.該欠失が少なくとも500kbである、実施形態88に記載の方法。
順番に、約700bpの上流ホモロジーアーム、βガラクトシダーゼコード配列(lacZ)、続いて、ポリアデニル化シグナル、第1のエクソン、第1のイントロン、及び第2のエクソンの一部を含む、ヒトユビキチンCプロモーターを含むloxP部位が隣接したネオマイシン耐性カセット、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列、及びポリアデニル化シグナル、並びに約650bpの下流ホモロジーアームを含む、標的化ベクターを用いて、SryのためのlacZ置き換え対立遺伝子を含む標的化された欠失を引き起こした。標的化ベクターを用いたSry遺伝子の正しい標的化によって作られた対立遺伝子は、βガラクトシダーゼコード配列がSry開始コドンにおいてインフレームで融合されるように、約1kbのSryオープンリーディングフレームの欠失、及びlacZ−neoカセットでの置き換えを含む。標的化ベクターを使用して、VGB6(別名、B6A6)C57BL/6及びVGF1(別名、F1H4)C57BL6/129 F1ハイブリッドES細胞株の両方においてSry遺伝子を標的化した。VGF1(F1H4)マウスES細胞は、雌C57BL/6NTacマウスを雄129S6/SvEvTacマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚由来であった。したがって、VGF1 ES細胞は、129S6/SvEvTacマウスからのY染色体を含有する。VGF1細胞株から生み出された雌XYマウスは、129S6/SvEvTacマウス由来のY染色体を含有する。
Cas9 DNAエンドヌクレアーゼと組み合わせた、TALEN又はCRISPRガイドRNAの作用によって、おそらく3bp〜1.2kb以上に及ぶ二本鎖DNA切断の非相同末端結合(NHEJ)修復の結果である、欠失突然変異を、Sry遺伝子中で引き起こした(図1を参照されたい)。Sry遺伝子中でTALEN及びCRISPR誘導性突然変異を含むES細胞はまた、NIH KOMPプロジェクトVG12778 LTVECのランダムトランスジェニック挿入(URL「velocigene.com/komp/detail/12778」でワールド・ワイド・ウェブ(www)上のインターネットを介して入手可能)を有し、それは、Sryコード配列の欠失、及びSry開始コドンとインフレームで融合されたlacZを含む挿入カセットでの置き換え、並びに38及び37kbのホモロジーアームが隣接し、かつbMQライブラリー(129S7/SvEv Brd−Hprt b−m2)からのBACに基づく、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。LTVECは、そのホモロジーアーム中に、Sryの発現のための全ての既知の制御要素を含む。そのlacZコードβガラクトシダーゼは、Sry遺伝子の組織特異的及び発達段階特異的発現のためのレポーターとしての役割を果たす。VGB6(別名、B6A6)及びVGF1(別名、F1H4)ES細胞株の両方において、LTVEC挿入を伴うTALEN及びCRISPR誘導性突然変異を引き起こした。
XYであり、かつSry突然変異を有したF0雌由来のF1子孫の遺伝子型決定によって、LTVECによるマウスSryの正しい標的化を確認又は否定した。Sry突然変異を有するLacZ/NeoカセットのF1マウスにおける共分離(Sry LOAアッセイによって評価されるような)は、正しい標的化を強く示唆する。LacZ/Neoが突然変異と共分離できないことは、元のクローンが、ゲノム中の別の箇所のLacZ/Neoトランスジェニック挿入に加えて、Sry欠失突然変異(TALENによって誘導された)を含んだことを示す。
図2に示されるように、Cas9 DNAエンドヌクレアーゼと組み合わせて、TALENヌクレアーゼ又はCRISPRガイドRNAのいずれかと共に、LTVEC又は小さな標的化ベクター(smallTVEC)のいずれかを用いて、SryのためのlacZ置き換え対立遺伝子を含む標的化された欠失を引き起こした。smallTVECは、順番に、約700〜800bpの上流ホモロジーアーム、βガラクトシダーゼコード配列(lacZ)、続いて、ポリアデニル化シグナル、第1のエクソン、第1のイントロン、及び第2のエクソンの一部を含む、ヒトユビキチンCプロモーターを含むloxP部位が隣接したネオマイシン耐性カセット、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列、及びポリアデニル化シグナル、並びに約700〜800bpの下流ホモロジーアームを含んだ。標的化ベクターを用いたSry遺伝子の正しい標的化によって作られた対立遺伝子は、βガラクトシダーゼコード配列がSry開始コドンにおいてインフレームで融合されるように、約1kbのSryオープンリーディングフレームの欠失、及びlacZ−neoカセットでの置き換えを含む。標的化ベクターを使用して、VGF1(別名、F1H4)C57BL6/129 F1ハイブリッドES細胞株及びVGB6 ES細胞株(別名、B6A6)中のSry遺伝子を標的化した。
図4に示されるように、Kdm5d及びUsp9y遺伝子を標的化するZFNを使用して、Y染色体上で500kb以上の大きい欠失を行った。表8は、Y染色体上のジンクフィンガー配列の例を提供する。
Kdm5d遺伝子とUsp9y遺伝子との間の領域を標的化するY染色体上の大きい欠失を、Cas9 DNAエンドヌクレアーゼと組み合わせてCRISPRガイドRNAを利用して行った。Kdm5d遺伝子及びUsp9y遺伝子を標的化するように、gRNAを設計した。Kdm5dを標的化するように、以下のgRNAを設計した。Kdm5dgA(ガイド番号1)UUUGCCGAAUAUGCUCUCGU(配列番号66)、Kdm5dgBガイド番号2)UUGCCGAAUAUGCUCUCGUG(配列番号67)、及びKdm5dgC(ガイド番号5)CGGGCAUCUCCAUACUCCCU(配列番号68)。Usp9yを標的化するように、以下のgRNAを設計した。Usp9ygA(ガイド番号1)UAGCUCGUUGUGUAGCACCU(配列番号69)、Usp9ygB(ガイド番号1)UAUAGUUUCUUCGGGGUAAC(配列番号70)、及びUsp9ygC(ガイド番号2)GGAUACCCUUCUAUAGGCCC(配列番号71)。
(項目1)
F0世代における繁殖力のあるXY雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非ヒト哺乳類XY胚性幹(ES)細胞株を作製するための方法であって、
(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性を減少させる修飾を含むように非ヒト哺乳類XY胚性幹(ES)細胞を修飾することと、
(b)F0世代における繁殖力のあるXY雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なES細胞株を作製することを可能にする条件下で、前記修飾されたES細胞を培養することと、を含む、方法。
(項目2)
F0世代における繁殖力のあるXY雌非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
(a)項目1に記載の非ヒト哺乳類XY ES細胞を宿主胚内に導入することと、
(b)前記宿主胚を懐胎させることと、
(c)F0 XY雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、前記F0 XY雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、方法。
(項目3)
前記非ヒト哺乳類XY ES細胞がげっ歯類由来である、項目1又は2に記載の方法。(項目4)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記マウスXY ES細胞が129系統由来である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記マウスXY ES細胞が、129系統に由来するY染色体を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記マウスXY ES細胞がVGF1マウスES細胞である、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記マウスXY ES細胞がC57BL/6系統由来である、項目4に記載の方法。
(項目9)
前記Sryタンパク質のレベル及び/又は活性の前記減少が、Sry遺伝子を含むゲノム遺伝子座における標的化された遺伝子修飾に起因する、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記Sry遺伝子における前記遺伝子修飾が、1つ以上のヌクレオチドの挿入、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、若しくは異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記Sry遺伝子の前記修飾が、前記非ヒト哺乳類ES細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー及び/又はレポーター遺伝子の挿入を含む、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記Sry遺伝子の前記修飾が、内因性Sryプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入を含む、項目1〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記レポーター遺伝子がレポータータンパク質LacZをコードする、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記標的化された遺伝子修飾が常染色体上にある、項目10に記載の方法。
(項目16)
前記培養工程が、前記非ヒト哺乳類ES細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、前記非ヒト哺乳類XY ES細胞を培養することを含み、前記培地が低浸透圧培地である、項目1〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記低浸透圧培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満の浸透圧を示す、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記低浸透圧培地が、以下の特徴、すなわち約11mS/cm〜約13mS/cmの導電率、約50mM〜約110mMの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、
約17mM〜約30mMの炭酸塩濃度、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに/又はこれらの任意の2つ以上の組み合わせのうちの1つ以上を示す、項目16に記載の方法。
(項目19)
宿主胚内への前記非ヒト哺乳類XY ES細胞の導入及び続く前記宿主胚の懐胎後に、前記F0非ヒト哺乳動物の少なくとも80%がXY雌であり、前記XY雌が、性成熟に達すると、前記F0 XY雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記非ヒト哺乳類XY ES細胞が、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Y染色体上に標的ゲノム遺伝子座を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する、項目1〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターの存在下で、前記ES細胞を前記ヌクレアーゼ剤に曝露することを更に含み、前記ヌクレアーゼ剤及び前記標的化ベクターへの曝露後、前記ES細胞が、前記挿入ポリヌクレオチドを含むように修飾される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記ヌクレアーゼ剤が、
(a)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(b)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)であるか、又は
(c)メガヌクレアーゼである、項目20に記載の方法。
(項目24)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)タンパク質と、ガイドRNA(gRNA)とを含む、項目20に記載の方法。
(項目25)
前記ガイドRNA(gRNA)が、(a)前記第1の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)RNA(crRNA)と、(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記Casタンパク質がCas9である、項目24に記載の方法。
(項目28)
項目1〜27のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類XY ES細胞株を含む、インビトロ培養物。
(項目29)
F1世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、
(a)Sryタンパク質のレベル及び/又は活性が減少したF0 XYの繁殖力のある雌を、同じES細胞クローン由来のコホートクローン兄弟であるF0 XY雄非ヒト哺乳動物と交配させることであって、前記F0 XYの繁殖力のある雌の非ヒト哺乳動物及び前記F0 XY雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、前記遺伝子突然変異に関してヘテロ接合性である、交配させることと、
(b)前記遺伝子修飾に関してホモ接合性であるF1子孫マウスを得ることと、を含む、方法。
(項目30)
細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
(a)ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
(b)前記細胞中に、
(i)前記ヌクレアーゼ剤であって、前記第1の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する前記ヌクレアーゼ剤、及び
(ii)前記第1の認識部位に十分に近接して位置する第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することと、
(c)前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
(項目31)
前記第1のホモロジーアーム及び前記第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも4kbであるが150kb未満である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが、少なくとも400bpであるが1000bp未満である、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが約700bp〜約800bpである、項目30に記載の方法。
(項目34)
細胞中のY染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
(a)ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
(b)前記細胞中に、第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した第1の挿入ポリヌクレオチドを含む、第1の標的化ベクターを導入することと、
(c)前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記第1の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも1つの細胞を特定することと、を含む、方法。
(項目35)
前記第1のホモロジーアーム及び前記第2のホモロジーアームの合計が、少なくとも4kbであるが150kb未満である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが、少なくとも400bpであるが1000bp未満である、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記第1のホモロジーアーム及び/又は前記第2のホモロジーアームの長さが約700bp〜約800bpである、項目34に記載の方法。
(項目38)
前記細胞が哺乳類細胞である、項目30又は34に記載の方法。
(項目39)
前記哺乳類細胞が非ヒト細胞である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記哺乳類細胞がげっ歯類由来である、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細胞が多能性細胞である、項目30又は34に記載の方法。
(項目43)
前記哺乳類細胞が人工多能性幹(iPS)細胞である、項目38に記載の方法。
(項目44)
前記多能性細胞が非ヒト胚性幹(ES)細胞である、項目42に記載の方法。
(項目45)
前記多能性細胞がげっ歯類胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、又はラット胚性幹(ES)細胞である、項目42に記載の方法。
(項目46)
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目30又は34に記載の方法。
(項目47)
前記ヌクレアーゼ剤が、
(a)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(b)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、又は
(c)メガヌクレアーゼである、項目30又は34に記載の方法。
(項目48)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)タンパク質と、ガイドRNA(gRNA)とを含む、項目30又は34に記載の方法。
(項目49)
前記ガイドRNA(gRNA)が、(a)前記第1の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)RNA(crRNA)と、(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とを含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記第1の認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記Casタンパク質がCas9である、項目48に記載の方法。
(項目52)
前記修飾が、内因性核酸配列の欠失を含む、項目30又は34に記載の方法。
(項目53)
前記欠失が、約5kb〜約10kb、約10kb〜約20kb、約20kb〜約40kb、約40kb〜約60kb、約60kb〜約80kb、約80kb〜約100kb、約100kb〜約150kb、又は約150kb〜約200kb、約200kb〜約300kb、約300kb〜約400kb、約400kb〜約500kb、約500kb〜約1Mb、約1Mb〜約1.5Mb、約1.5Mb〜約2Mb、約2Mb〜約2.5Mb、又は約2.5Mb〜約3Mbに及ぶ、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記欠失が少なくとも500kbである、項目52に記載の方法。
(項目55)
前記F0 XY雌非ヒト哺乳動物が、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ、項目2に記載の方法。
(項目56)
前記野生型マウスがC57BL/6である、項目55に記載の方法。
Claims (27)
- F0世代における繁殖力のある雌XYマウスを生み出すことが可能なマウスXY胚性幹(ES)細胞株を作製するための方法であって、
(a)マウスXY ES細胞を、内因性Sry遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾を含むように改変することであって、前記マウスXY ES細胞は、129S6系統由来のY染色体を含む、ことと、
(b)改変された前記マウスXY ES細胞を、F0世代における繁殖力のある雌XY非ヒト哺乳動物を生み出すことができるマウスXY ES細胞株を生み出す条件下で培養することとを含む、方法。 - 前記遺伝子修飾を、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを前記マウスXY ES細胞中に導入することによって生じさせ、ここで、前記ヌクレアーゼ剤は、前記Y染色体上の認識部位において、ニック又は二本鎖切断を誘発する、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、あるいは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)である、請求項2に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ剤がCasタンパク質及びgRNAであり、前記Casタンパク質がCas9タンパク質であり、前記gRNAは、
(a)前記認識部位を標的化するCRISPR RNA(crRNA)であって、前記認識部位にはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列が直接隣接する、crRNAと、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とを含む、請求項3に記載の方法。 - 前記gRNAは、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12を含む配列を標的化する、請求項4に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ剤がTALENである、請求項3に記載の方法。
- 前記TALENが、配列番号72を含む配列及び配列番号73を含む配列を標的化する、請求項6に記載の方法。
- 前記遺伝子修飾が、前記マウスXY ES細胞に、前記Y染色体上の標的ゲノム遺伝子座における第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターを導入することによって生じ、前記マウスXY ES細胞は、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のホモロジーアームは、400〜1000塩基対であり、前記第2のホモロジーアームは、400〜1000塩基対である、請求項8に記載の方法。
- 前記第1のホモロジーアーム及び前記第2のホモロジーアームの合計は、少なくとも10kbである、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子修飾が、前記マウスXY ES細胞に:
(i)Y染色体上の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドと;
(ii)Y染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座における第1及び第2の標的部位に対応する第1及び第2のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターと
を導入することによって生じ、
前記マウスXY ES細胞が、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記マウスXY ES細胞が、雌化培地中で培養されない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養する工程が、前記改変されたマウスXY ES細胞を、(1)3mg/mLの塩化ナトリウム及び2.2mg/mLの重炭酸ナトリウムを含み、218mOsm/kgの浸透圧を有する基本培地と;(2)前記改変されたマウスES細胞を培養物中で維持する補充物とを含む培地中で培養することを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- マウス宿主胚内への前記改変されたマウスXY ES細胞の導入、及び続くF0マウスを生み出すためのマウス宿主胚の懐胎後に、前記F0マウスの少なくとも60%が、性成熟に達すると繁殖力を持つXY雌である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- F0世代における繁殖力のある雌XYマウスを作製するための方法であって、
(a)マウスXY胚性幹(ES)細胞をマウス宿主胚に導入することであって、前記XY ES細胞は、129S6系統由来のY染色体と、内因性マウスSry遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾とを含む、導入することと;
(b)前記マウス宿主胚を懐胎させることと;
(c)前記マウス宿主胚の懐胎に続いてF0マウスを得ることであって、前記F0マウスの少なくとも60%が、性成熟に達すると繁殖力を持つXY雌である、得ることとを含む、方法。 - 前記マウス宿主胚は、前桑実胚である、請求項15に記載の方法。
- 前記F0 XY雌マウスが、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ、請求項15または16に記載の方法。
- 前記野生型マウスはC57BL/6マウスである、請求項17に記載の方法。
- 前記マウスXY ES細胞が、129S6系統及びC57BL/6系統の間の交配であるマウスから単離される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マウスXY ES細胞が、雌C57BL/6NTacマウスを雄129S6/SvEvTacマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚から単離される、請求項19に記載の方法。
- 前記マウスXY ES細胞が、VGF1マウスES細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記遺伝子修飾が、1つ以上のヌクレオチドの挿入、1つ以上のヌクレオチドの置換、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- (I)前記遺伝子修飾が、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、若しくは異種配列との置き換え、又はこれらの組み合わせをさらに含むか;
(II)前記遺伝子修飾が、選択可能なマーカーをコードする核酸及び/又は前記マウスXY ES細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含むか;または
(III)前記遺伝子修飾が、内因性Sryプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含む、請求項22に記載の方法。 - 前記XY ES細胞を、少なくとも1つの目的のポリヌクレオチドのさらなる標的化遺伝子修飾を含むように改変することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マウス宿主胚内への前記改変されたマウスXY ES細胞の導入、及び続く前記マウス宿主胚の懐胎後に、前記F0マウスの少なくとも80%が、性成熟に達すると繁殖力を持つXY雌である、請求項14〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記F0マウスの少なくとも90%が、性成熟に達すると繁殖力を持つXY雌である、請求項14〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記F0マウスの少なくとも95%が、性成熟に達すると繁殖力を持つXY雌である、請求項25に記載の方法。
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