JPWO2009048024A1 - 目的遺伝子を染色体外で高度に増幅させるためのベクターおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子(以下、適宜「目的遺伝子」という)の細胞内コピー数を1万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はIR/MARプラスミドに対して同一の遺伝子構築物(シス)として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物(トランス)として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した(特許文献1および非特許文献1参照)。そして、本発明者は当該知見に基づいて、IR/MARプラスミドと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞(例えば、ヒト由来がん細胞(COLO320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株)、CHO細胞等)にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子(BlasticidineあるいはNeomycine)を利用して選択するだけで、目的遺伝子を1万コピー程度に増幅できる系(以下、「高度遺伝子増幅系」という)を完成させるに至った。
本発明の一実施形態は、目的遺伝子を増幅させるための方法に関する。上記方法のことを「本発明の遺伝子増幅方法」と称する。
本発明の遺伝子増幅方法における導入工程は、後に説明する本発明のベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程である。
本発明の遺伝子増幅方法における「選抜工程」は、目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細には、本工程は、目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から後者の細胞を選抜する工程である。なお、薬剤耐性を指標として本工程を行う場合には、哺乳動物細胞を培地で培養する工程が含まれる場合があるが、本工程では目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の混合物を培養するのに対して、後述する目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞として既に選抜された細胞を培養する点において、両工程は明らかに相違する。かかる選抜工程によって、哺乳動物細胞に導入された目的遺伝子が高度に増幅された哺乳動物細胞を選抜することができる。
本発明の遺伝子増幅方法における「培養工程」は、上記選抜工程によって既に選抜された哺乳動物細胞(すなわち「形質転換細胞」)を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を増殖させることができ、所定の操作(転写誘導操作等)によって、目的遺伝子を発現させることによって、目的遺伝子がコードするタンパク質を生産することができる。
本発明における「精製工程」は、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法である。
<2.本発明のベクターおよびキット>
なお本発明は、上記で説示した本発明のベクター、当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子増幅キット(以下「本発明の遺伝子増幅キット」という)、および当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子発現キット(以下「本発明の遺伝子発現キット」という)をも包含する。
〔実施例1で使用するベクター〕
本実施例で使用する本発明のベクターはDHFR遺伝子座由来のIRとMARとを持つプラスミド(pSFV dhfr)を基に構築した。また、IRとMARを持たない対照プラスミド(pSFV―V)についても同様に構築した。なお、これらのプラスミドは、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」にすでに記載したプラスミドDNAである。具体的な本発明のベクターの構築方法を以下に記載する。
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。
実施例2は、特記しない限りにおいて、実施例1と同様の方法を用いて行われた。
本実施例で使用するベクターは、ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMARを有し、恒常的プロモーター(CMVプロモーター)の制御下に、GFP遺伝子を有するプラスミド(pΔBM-d2EGFP)を、Mlu Iで切断したのち、2か所の切断末端にヘアピン構造をとる合成DNAをライゲーションすることにより、両側にヘアピン構造を有するIR/MARプラスミド(「両側ヘアピンDNA」という)を構築した(図7を参照のこと)。上記ヘアピン構造をとる合成DNAの配列は、cgcgatatgctgcactgacgtcagtgcagcatat(34bp、配列番号2にその塩基配列を示す)であった。
上記の工程により構築した両側ヘアピンDNAを、COLO320DM細胞にリポフェクション法により導入した。遺伝子導入2日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン(フナコシ社製)で選択し、培養開始から75日経過したポリクローンの安定な形質転換細胞について、セルソーターを用いてGFPの発現量を計測した。また、比較対象として閉環状プラスミド(pΔBM-d2EGFp)も同様の方法で実験を行った。
図8にその結果を示す。図8(B)は、比較対象である閉環状プラスミド(pΔBM-d2EGFp、図中では「ccc」と表記する)が導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示す。図8(C)は、両側ヘアピンDNAが導入された形質転換細胞について、d2EGFP発現量をセルソーターで解析した結果を示す。図8(A)は、閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量(pΔBM-d2EGFp、図中では「ccc」と表記する)と、両側ヘアピンDNAが導入された形質転換細胞のd2EGFP発現量(図中では「hairpin」と表記する)とを示すヒストグラムである。
実施例3は、特記しない限りにおいて、実施例1および2と同様の方法を用いて行われた。
実施例2で構築した両側ヘアピンDNAを、COLO320DM細胞にリポフェクション法により導入した。遺伝子導入2日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン(フナコシ社製)で選択し、培養開始後70日経過したポリクローンの安定な形質転換細胞について、各種ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC阻害剤:butyrate、Trichostatin A(TSA)、MS−275、Oxamflatin、DMSO)またはDNAメチル化阻害剤(5-aza-2’-deoxycytidine:以下「5-aza」と表記する)を加えた。各阻害剤は、細胞培地に対する最終濃度が、butyrate(Sigma社製)は2mM、TSA(Sigma社製)は100nM、MS−275(Alexis Biochemicals社製)は3μM、Oxamflatin(Calbiochem社製)は0.1μg/ml、DMSO(ナカライテスク社製)は1.6容量%、5-aza(Sigma社製)は3μMになるよう加えた。阻害剤添加後、5日経過したポリクローンの細胞についてセルソーターを用いてGFPの発現量を計測した。また、比較対象として閉環状プラスミド(pΔBM-d2EGFp)も同様の方法で実験を行った。
図9にその結果を示す。図9には、両側ヘアピンDNAが導入された形質転換細胞(図中では「hairpin」と表記する)、およびヘアピン構造を有しない閉環状プラスミドが導入された形質転換細胞(pΔBM-d2EGFp、図中では「ccc」と表記する)について、各種阻害剤が実験系に添加された結果、および添加されていない結果(図中では「control」と表記する)がそれぞれ示されている。
Claims (12)
- 真核生物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域、および核マトリックス結合領域を具備するベクターであって、
直鎖状であり、かつ
少なくとも片側の末端の形状がヘアピン構造であることを特徴とするベクター。 - 両方の末端がヘアピン構造であることを特徴とする請求項1に記載のベクター。
- 上記哺乳動物複製開始領域が、c−myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか1つに由来する、請求項1または2に記載のベクター。
- 上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか1つに由来する、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のベクター。
- 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅するための方法であって、請求項1ないし4のいずれか1項に記載のベクターと、目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
- 上記目的遺伝子と、上記ベクターとをシスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 上記目的遺伝子と、上記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞。
- 請求項8に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
- ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびDNAメチル化阻害剤のいずれか1つ以上を含む培地中で、請求項8に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、目的遺伝子の発現方法。
- 目的遺伝子を増幅するためのキットであって、請求項1ないし4のいずれか1項に記載のベクターを含むことを特徴とするキット。
- 目的遺伝子を発現するためのキットであって、
請求項1ないし4のいずれか1項に記載のベクターと、
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびDNAメチル化阻害剤のいずれか1つ以上とを含むことを特徴とするキット。
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