JP2018502112A - 脳疾患を処置するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、必要性のある被験体においてハンチントン病（ＨＤ）を処置または防止するための方法であって、上記方法は、上記被験体の脳において、処置前の上記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程を包含する方法、および上記被験体の脳において、処置前の上記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程によって、ｍＨＴＴ関連代謝表現型および／または線条体萎縮の改善を調節するための方法を提供する。

Description

（関連出願）
本出願は、２０１４年１２月３０日に出願された米国仮出願第６２／０９８，０８５号の優先権の利益を主張し、当該出願は本明細書に参考として援用される。

（連邦政府による支援を受けた研究に関する陳述）
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＮＳ５０２１０およびＮＳ０５２７８９−Ｓ１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

（背景）
ハンチントン病（ＨＤ）は、タンパク質ハンチンチン（ＨＴＴ）（１９９３）をコードする、ハンチンチンのエキソン１においてＣＡＧ反復増殖によって引き起こされる致死的な常染色体優性神経変性疾患である。全組織および脳領域におけるＨＴＴ発現にも関わらず、線条体は、最も深刻かつ早期の変性を示す。変異体ＨＴＴ（ｍＨＴＴ）は、複数の細胞経路に負の影響を及ぼす（ミトコンドリア生合成（Ｃｕｉら、２００６；Ｔｓｕｎｅｍｉら、２０１２）、コレステロールホメオスタシス（ＫａｒａｓｉｎｓｋａおよびＨａｙｄｅｎ， ２０１１；ＶａｌｅｎｚａおよびＣａｔｔａｎｅｏ， ２０１１；Ｖａｌｅｎｚａら、２００５）、軸索成長（Ｌｉら、２００１）、およびシナプス形成（ＭｉｌｎｅｒｗｏｏｄおよびＲａｙｍｏｎｄ， ２０１０）が挙げられ、これらの全てが、ニューロンの機能不全および喪失に寄与し得る）。これら変化した表現型は、ある範囲の基礎的な生物学的プロセスを調節するコアとなる構成要素の破壊から生じ得る。このような一次的な病原性の事象を同定することは、治療の開発を促進する。

遺伝子移入は、細胞レベルおよび分子レベルの両方で生物学的事象および疾患プロセスの分析のための強力なツールとしていまや広く認識されている。より近年になって、ヒト疾患（遺伝性（例えば、ＡＤＡ欠損症）もしくは後天性（例えば、癌もしくは感染性疾患）のいずれも）の処置のための遺伝子治療の適用は、かなりの注目を集めた。改善された遺伝子移入技術の出現および欠損遺伝子関連の疾患の拡大し続けているライブラリーの同定に伴って、遺伝子治療は、処置の理論から実際の現実性へと急速に進化した。

伝統的には、遺伝子治療は、先天性の遺伝的エラーを矯正するために、外因性遺伝子が患者の細胞へと導入される手順として定義されている。４５００を超えるヒト疾患が遺伝性であると正確に分類されているが、ヒトゲノムにおける具体的変異が同定されているのは、これら疾患のうちの比較的僅かに関してである。近年まで、これらの希な遺伝的疾患は、遺伝子治療の努力のもっぱらの標的を代表していた。よって、今日までにＮＩＨが承認した遺伝子治療プロトコルのうちの大部分は、既知の先天的な遺伝的エラーを有する個体の体細胞に欠損遺伝子の機能的コピーを導入することを指向していた。ごく近年になって、研究者および臨床医は、大部分のヒトの癌、心血管疾患のある種の形態、および多くの変性疾患にもまた、重要な遺伝的構成要素があり、新規な遺伝子治療を設計することを目的として、「遺伝的障害」を考慮するべきであると認識し始めた。従って、遺伝子治療はより近年になって、新たな遺伝情報を罹患した生物に導入することによる疾患表現型の矯正として広く定義された。

インビボ遺伝子治療では、移入される遺伝子は、インサイチュでレシピエント生物の細胞へと、すなわち、レシピエント内に導入される。インビボ遺伝子治療は、いくつかの動物モデルで試験されてきた。いくらかの近年の刊行物は、器官および組織（例えば、筋肉、造血幹細胞、動脈壁、神経系、および肺）へのインサイチュでの直接遺伝子移入の実現性を報告した。骨格筋、心筋へのＤＮＡの直接注射、および脈管構造へのＤＮＡ−脂質複合体の注射はまた、インビボで挿入された遺伝子産物の検出可能な発現レベルを得ることが報告された。
中枢神経系の疾患の処置は、手に負えない問題のままである。このような疾患の例は、ハンチントン病である。この障害において欠損しているタンパク質は、静脈内に送達される場合には、血液脳関門を横断しないか、または脳へと直接送達される場合には、広く分布しない。先のデータは、ｍＴＯＲ経路の阻害が有益であり得ることを示した。しかし、本発明者らの研究は、これが有害であることを明らかにし、また、この経路を刺激する治療は何が有益であるかを示す。

Ｃｕｉら、Ｃｅｌｌ（２００６）１２７、５９〜６９ Ｔｓｕｎｅｍｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１２）４、１４２ｒａ１９７ Ｋａｒａｓｉｎｓｋａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（２０１１）７、５６１〜５７２

（要旨）
本発明は、ある種の実施形態において、必要性のある被験体において（例えば、疾患遺伝子を遺伝している被験体において）ハンチントン病（ＨＤ）を処置または防止するための方法を提供し、上記方法は、上記被験体の脳において、処置前の上記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程を包含する。ある種の実施形態において、上記被験体は、ミトコンドリア機能不全、異常なコレステロールホメオスタシス、線条体萎縮、ドパミンシグナル伝達障害および／または低下したオートファジーを有し得る。

本発明は、ある種の実施形態において、上記被験体の脳において、処置前の上記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程によって、ｍＨＴＴ関連代謝表現型および／または線条体萎縮の改善（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を調節するための方法を提供する。

本発明は、哺乳動物の脳細胞に治療剤を送達する方法を提供し、上記方法は、上記脳細胞に、一対のＡＡＶ逆方向末端反復の間に挿入される核酸を含むベクターを含むＡＡＶ粒子を投与し、それによって、上記核酸を上記脳細胞に送達する工程を包含する。ある種の実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ２／１である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２／５である。本明細書において使用される場合、用語ＡＡＶ２／１はＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１キャプシドを、用語ＡＡＶ２／２はＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ２キャプシドを、用語ＡＡＶ２／４はＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ４キャプシドを意味するように使用される等である。ある種の実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ５である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ６である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。ある種の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ１０である。

ある種の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、任意の参照ＡＡＶ血清タイプキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して、例えば、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して、または、例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ３キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、、または、例えば、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して少なくとも８０％相同性を有する。

ある種の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、任意の参照ＡＡＶ血清タイプキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して、例えば、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して、または、例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ３キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、、または、例えば、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、または、例えば、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して１００％相同性を有する。

ある種の実施形態において、上記被験体は、ヒトである。

ある種の実施形態において、上記治療剤は、治療用核酸である。ある種の実施形態において、上記治療剤は、タンパク質である。

ある種の実施形態において、上記薬剤は、上記被験体の脳へと投与される。ある種の実施形態において、上記薬剤は、脳において１〜５箇所に（例えば、脳において１箇所、２箇所または３箇所に）注射される。ある種の実施形態において、上記薬剤は、哺乳動物の線条体、皮質または脳室空間に投与される。

図１Ａ〜１Ｂ。ｍＴＯＲＣ１活性は、ＨＤヒトおよびマウス線条体において低下する。（Ａ）ｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、Ｒａｐｔｏｒ、およびｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６）のイムノブロットは、影響を受けていない個体（Ｎ＝６）と比較して、ＨＤを有する患者の線条体において低下したｍＴＯＲＣ１活性を示した（Ｎ＝１０；拡大シリーズについては、図Ｓ１Ａを参照のこと）。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｂ）６週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体溶解物に由来するｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、Ｒａｐｔｏｒ、およびｐＳ６のイムノブロット。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。パネルＡおよびＢのデンシトメトリー分析は、ＨＤ患者（Ｎ＝１０） 対 コントロール（Ｎ＝６）において、ならびに年齢および性別を合わせたＷＴ同腹仔（Ｎ＝４）と比較して６週齢のＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝４）において、低下したｐＳ６レベルを明らかにした。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。

図２Ａ〜２Ｇ。ｍＴＯＲＣ１経路の活性化は、ＨＤマウスにおける代謝関連欠損を矯正する。（Ａ）ウェスタンブロットは、未処置と比較して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置したＮ１７１−８２Ｑマウスにおいて増大したｐＳ６およびＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性を示す。マウスを、７週齢で注射し、線条体溶解物を、１０週齢で採取した。右、ＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性のデンシトメトリー定量（Ｎ＝４マウス／群；＊Ｐ＜０．０５、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定）。（Ｂ）７週齢においてＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置した１０週齢のＮ１７１−８２Ｑマウス由来の線条体ホモジネート中のＰＧＣ１−αのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側の大脳半球由来の線条体溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。（Ｃ〜Ｇ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後の１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスに由来する線条体ホモジネート中のＲＯＳ無毒化遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側大脳半球に由来する溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。 図２Ａ〜２Ｇ。ｍＴＯＲＣ１経路の活性化は、ＨＤマウスにおける代謝関連欠損を矯正する。（Ａ）ウェスタンブロットは、未処置と比較して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置したＮ１７１−８２Ｑマウスにおいて増大したｐＳ６およびＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性を示す。マウスを、７週齢で注射し、線条体溶解物を、１０週齢で採取した。右、ＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性のデンシトメトリー定量（Ｎ＝４マウス／群；＊Ｐ＜０．０５、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定）。（Ｂ）７週齢においてＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置した１０週齢のＮ１７１−８２Ｑマウス由来の線条体ホモジネート中のＰＧＣ１−αのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側の大脳半球由来の線条体溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。（Ｃ〜Ｇ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後の１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスに由来する線条体ホモジネート中のＲＯＳ無毒化遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側大脳半球に由来する溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。

図３Ａ〜３Ｆ。ｍＴＯＲは、ＨＤマウス線条体においてコレステロール生合成経路遺伝子を調節する。（ＡおよびＢ）通常培地中で増殖させたＷＴ（Ｑ７）および変異体（Ｑ１１１）線条体細胞を、２５０ｎＭ Ｔｏｒｉｎ１またはＤＭＳＯ（コントロール）で処置した。全細胞抽出物を、処置後２４時間で得た。ＨＭＧＣＲおよびＨＭＧＣＳ１の遺伝子発現レベルを、内因性β−アクチンに対して正規化した。（Ｃ〜Ｆ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後に、１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体ホモジネートに由来する脂質生成遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側大脳半球に由来する溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。 図３Ａ〜３Ｆ。ｍＴＯＲは、ＨＤマウス線条体においてコレステロール生合成経路遺伝子を調節する。（ＡおよびＢ）通常培地中で増殖させたＷＴ（Ｑ７）および変異体（Ｑ１１１）線条体細胞を、２５０ｎＭ Ｔｏｒｉｎ１またはＤＭＳＯ（コントロール）で処置した。全細胞抽出物を、処置後２４時間で得た。ＨＭＧＣＲおよびＨＭＧＣＳ１の遺伝子発現レベルを、内因性β−アクチンに対して正規化した。（Ｃ〜Ｆ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後に、１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体ホモジネートに由来する脂質生成遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側大脳半球に由来する溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。

図４Ａ〜４Ｄ。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおける基底オートファジーを増大させる。（ＡおよびＢ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後のＮ１７１−８２Ｑマウスに由来する線条体溶解物におけるオートファジー（ＬＣ３およびＢｅｃｌｉｎ１）の生化学的評価。線条体を、注射後３週間で採取した。注射していない対側線条体を、内部コントロールとして供する（Ｎ＝６ マウス／群）。代表的ウェスタンブロットおよびデンシトメトリー分析は、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したＮ１７１−８２Ｑマウス線条体において増大したＬＣ３ＩＩおよびＢｅｃｌｉｎ１レベルを明らかにした。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定。（Ｃ）左パネル：オートファゴソーム（矢印）およびオートリソソーム（２本の矢印）の代表的顕微鏡写真。スケールバーは、０．５μｍである。右パネル：ＡＡＶ．ｅＧＦＰおよびＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したＮ１７１−８２Ｑマウス（３匹の試験したマウス／群；７〜１０細胞／大脳半球／動物）に由来する線条体ニューロンにおいて検出されたオートファゴソームおよびオートリソソームの頻度。比は、計数した細胞の総数に対するオートファゴソームまたはオートリソソームの数を示す。（Ｄ）反対側の大脳半球へのＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ注射後のＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝３ マウス／群）に由来する線条体切片の微細構造ＴＥＭ分析。左パネル：コントロール処置線条体に由来する線条体ニューロンの代表的顕微鏡写真は、内質顆粒塊（ｅｎｄｏｐｌａｓｍ ｇｒａｎｕｌａｒ ｍａｓｓ）およびオルガネラを欠いた電子密度の低い（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｌｕｃｅｎｔ）細胞質を示す。右パネル：ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したニューロンは、オルガネラおよび内質顆粒塊が豊富な通常の細胞質を示す。スケールバーは、５μｍである。 図４Ａ〜４Ｄ。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおける基底オートファジーを増大させる。（ＡおよびＢ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後のＮ１７１−８２Ｑマウスに由来する線条体溶解物におけるオートファジー（ＬＣ３およびＢｅｃｌｉｎ１）の生化学的評価。線条体を、注射後３週間で採取した。注射していない対側線条体を、内部コントロールとして供する（Ｎ＝６ マウス／群）。代表的ウェスタンブロットおよびデンシトメトリー分析は、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したＮ１７１−８２Ｑマウス線条体において増大したＬＣ３ＩＩおよびＢｅｃｌｉｎ１レベルを明らかにした。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定。（Ｃ）左パネル：オートファゴソーム（矢印）およびオートリソソーム（２本の矢印）の代表的顕微鏡写真。スケールバーは、０．５μｍである。右パネル：ＡＡＶ．ｅＧＦＰおよびＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したＮ１７１−８２Ｑマウス（３匹の試験したマウス／群；７〜１０細胞／大脳半球／動物）に由来する線条体ニューロンにおいて検出されたオートファゴソームおよびオートリソソームの頻度。比は、計数した細胞の総数に対するオートファゴソームまたはオートリソソームの数を示す。（Ｄ）反対側の大脳半球へのＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ注射後のＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝３ マウス／群）に由来する線条体切片の微細構造ＴＥＭ分析。左パネル：コントロール処置線条体に由来する線条体ニューロンの代表的顕微鏡写真は、内質顆粒塊（ｅｎｄｏｐｌａｓｍ ｇｒａｎｕｌａｒ ｍａｓｓ）およびオルガネラを欠いた電子密度の低い（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｌｕｃｅｎｔ）細胞質を示す。右パネル：ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置したニューロンは、オルガネラおよび内質顆粒塊が豊富な通常の細胞質を示す。スケールバーは、５μｍである。

図５Ａ〜５Ｇ。ｍＴＯＲＣ１は、ｍＨＴＴ凝集物クリアランスに関与する遺伝子を調節する。（Ａ〜Ｆ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後の１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体ホモジネートに由来する遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。（ＡおよびＢ）ｍＨＴＴのＳＵＭＯ改変に関わる遺伝子の発現。（Ｃ〜Ｅ）ＩＫＫ関連遺伝子（Ｉｋｂｋｂ、Ｉｋｂｋａｐ、およびＩｋｂｋｅ）の発現。（Ｆ）ＨＤＡＣ４の発現。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｇ）左パネル、１０週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの海馬へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂおよびＡＡＶ．ｅＧＦＰの１回の片側注射の２週間後のＥＭ４８でのＮ１７１−８２Ｑマウス線条体の免疫組織化学染色（Ｎ＝４／処置群；スケールバー：５０μｍ）。右パネル、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、ＥＭ４８陽性凝集物を減少させた。矢印：Ｅｍ４８陽性凝集物。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。スチューデントのｔ検定。 図５Ａ〜５Ｇ。ｍＴＯＲＣ１は、ｍＨＴＴ凝集物クリアランスに関与する遺伝子を調節する。（Ａ〜Ｆ）７週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後の１０週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体ホモジネートに由来する遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。注射していない対側を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝８／群）。（ＡおよびＢ）ｍＨＴＴのＳＵＭＯ改変に関わる遺伝子の発現。（Ｃ〜Ｅ）ＩＫＫ関連遺伝子（Ｉｋｂｋｂ、Ｉｋｂｋａｐ、およびＩｋｂｋｅ）の発現。（Ｆ）ＨＤＡＣ４の発現。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｇ）左パネル、１０週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの海馬へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂおよびＡＡＶ．ｅＧＦＰの１回の片側注射の２週間後のＥＭ４８でのＮ１７１−８２Ｑマウス線条体の免疫組織化学染色（Ｎ＝４／処置群；スケールバー：５０μｍ）。右パネル、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、ＥＭ４８陽性凝集物を減少させた。矢印：Ｅｍ４８陽性凝集物。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。スチューデントのｔ検定。

図６Ａ〜６Ｅ。ｍＴＯＲＣ１は、ＭＳＮ増殖を促進し、ｍＨＴＴ誘発性運動表現型を妨げる。（Ａ）１１週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの線条体へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの１回の片側注射の２週間後の、抗ＤＡＲＰＰ−３２でのＭＳＮの免疫組織化学染色。マウスに、ビヒクルまたはＲＡＤ００１を２週間にわたって与えた。（ＢおよびＣ）（Ａ）におけるように処置した動物の組織に由来するＭＳＮ細胞面積および線条体容積の定量（Ｎ＝４／処置群；平均＋ＳＥＭ）。（Ｄ）６週齢でＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂを片側注射したＷＴマウス。注射後４週間で試験した場合、ＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰは、アンフェタミンに応答して同側性の回転行動を誘発した。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの共注射は、アンフェタミン投与後にＡＡＶ．ｍＨＴＴ誘発性同側性回転を変化させ、マウスは、対側の回転を示した（Ｎ＝４／処置群）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。スケールバー：１００μｍ（Ａ〜Ｄ）。（Ｅ）左パネル、（Ｄ）からのＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂを注射したマウスに由来する切片の抗ＤＡＲＰＰ−３２でのＭＳＮの免疫組織化学染色。対側の注射していない大脳半球を、コントロールとして示す。右パネル、ＭＳＮ面積の定量を、注射していない対側の線条体のパーセンテージとして表した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。スケールバー：５０μｍ。 図６Ａ〜６Ｅ。ｍＴＯＲＣ１は、ＭＳＮ増殖を促進し、ｍＨＴＴ誘発性運動表現型を妨げる。（Ａ）１１週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの線条体へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの１回の片側注射の２週間後の、抗ＤＡＲＰＰ−３２でのＭＳＮの免疫組織化学染色。マウスに、ビヒクルまたはＲＡＤ００１を２週間にわたって与えた。（ＢおよびＣ）（Ａ）におけるように処置した動物の組織に由来するＭＳＮ細胞面積および線条体容積の定量（Ｎ＝４／処置群；平均＋ＳＥＭ）。（Ｄ）６週齢でＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂを片側注射したＷＴマウス。注射後４週間で試験した場合、ＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰは、アンフェタミンに応答して同側性の回転行動を誘発した。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの共注射は、アンフェタミン投与後にＡＡＶ．ｍＨＴＴ誘発性同側性回転を変化させ、マウスは、対側の回転を示した（Ｎ＝４／処置群）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。スケールバー：１００μｍ（Ａ〜Ｄ）。（Ｅ）左パネル、（Ｄ）からのＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰまたはＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂを注射したマウスに由来する切片の抗ＤＡＲＰＰ−３２でのＭＳＮの免疫組織化学染色。対側の注射していない大脳半球を、コントロールとして示す。右パネル、ＭＳＮ面積の定量を、注射していない対側の線条体のパーセンテージとして表した。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。スケールバー：５０μｍ。

図７Ａ〜７Ｄ。線条体内Ｒｈｅｓ過剰発現は、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて疾患表現型を改善する。（Ａ）影響を受けていない個体（コントロール、Ｎ＝４）およびＨＤ患者（Ｎ＝１０）、ならびに６週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝５）およびＷＴ（Ｎ＝４）同腹仔の線条体溶解物に由来する内因性ＲｈｅｓレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｂ）７週齢での線条体へのＡＡＶ．Ｒｈｅｓ、ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ、または生理食塩水の両側の注射後のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスのロータロッド評価（１４週齢でＮ＝１０〜１４マウス／群；１８週齢でＮ＝６〜１３マウス／群）。１４週齢および１８週齢での３連続日のロータロッドデータを、落下までの潜時として示す。生理食塩水およびＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎを注射したＮ１７１−８２Ｑマウスは、１４週齢および１８週齢でのロータロッド上でのＡＡＶ．Ｒｈｅｓ注射Ｎ１７１−８２Ｑマウスと比較して、有意に実行が悪化した。ＮＳ＝統計的に有意でない。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定。（Ｃ）７週齢でのＡＡＶ．Ｒｈｅｓの片側注射およびＡＡＶ．ＧＦＰの対側の注射後のＮ１７１−８２Ｑマウス線条体組織切片のＤＡＲＰＰ−３２染色およびＭＳＮ面積の定量。組織を、１９週齢において採取した（Ｎ＝３ マウス／群；ＧＦＰ＝２４５細胞；Ｒｈｅｓ＝２５１細胞）。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。スケールバー：５０μｍ。（Ｄ）研究の最後（１９週齢）に採取した、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓまたは生理食塩水で処置したＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウス（ｎ＝６〜９／群）に由来する線条体におけるＰＧＣ−１αのｑＰＣＲ分析。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。 図７Ａ〜７Ｄ。線条体内Ｒｈｅｓ過剰発現は、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて疾患表現型を改善する。（Ａ）影響を受けていない個体（コントロール、Ｎ＝４）およびＨＤ患者（Ｎ＝１０）、ならびに６週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝５）およびＷＴ（Ｎ＝４）同腹仔の線条体溶解物に由来する内因性ＲｈｅｓレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｂ）７週齢での線条体へのＡＡＶ．Ｒｈｅｓ、ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ、または生理食塩水の両側の注射後のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスのロータロッド評価（１４週齢でＮ＝１０〜１４マウス／群；１８週齢でＮ＝６〜１３マウス／群）。１４週齢および１８週齢での３連続日のロータロッドデータを、落下までの潜時として示す。生理食塩水およびＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎを注射したＮ１７１−８２Ｑマウスは、１４週齢および１８週齢でのロータロッド上でのＡＡＶ．Ｒｈｅｓ注射Ｎ１７１−８２Ｑマウスと比較して、有意に実行が悪化した。ＮＳ＝統計的に有意でない。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定。（Ｃ）７週齢でのＡＡＶ．Ｒｈｅｓの片側注射およびＡＡＶ．ＧＦＰの対側の注射後のＮ１７１−８２Ｑマウス線条体組織切片のＤＡＲＰＰ−３２染色およびＭＳＮ面積の定量。組織を、１９週齢において採取した（Ｎ＝３ マウス／群；ＧＦＰ＝２４５細胞；Ｒｈｅｓ＝２５１細胞）。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。スケールバー：５０μｍ。（Ｄ）研究の最後（１９週齢）に採取した、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓまたは生理食塩水で処置したＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウス（ｎ＝６〜９／群）に由来する線条体におけるＰＧＣ−１αのｑＰＣＲ分析。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。

図８。ｍＴＯＲを障害した提唱される機構は、ＨＤにおける複雑な疾患表現型に寄与する。通常の生理学的条件下では、ｍＴＯＲは、ニューロン機能および生存にとって非常に重要である多様な生物学的プロセスを調節する。ＨＤにおいて、ｍＨＴＴは、ｍＴＯＲとの直接的相互作用によってｍＴＯＲＣ１機能を破壊し、複数の経路に負の影響を及ぼすことによってニューロン機能不全を引き起こす。線条体において、ｍＨＴＴはさらに、Ｒｈｅｓ（線条体で富化されるｍＴＯＲ調節因子）に干渉することによって、ｍＴＯＲＣ１活性を障害する。従って、ＲｈｅｓおよびｍＴＯＲＣ１活性の付随した喪失は、線条体組織をＨＤにおいて早期の変性に脆弱にし得る。

図Ｓ１Ａ〜Ｓ１Ｂ。ｍＴＯＲＣ１活性は、ＨＤヒトおよびマウス線条体において低下される。（Ａ）ウェスタンブロットは、影響を受けていない個体（Ｎ＝６）と比較して、ＨＤを有する患者（Ｎ＝１０）の線条体において低下したｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６）を示す。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した（図１Ａに関連）。（Ｂ）１４週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウス線条体溶解物に由来する内因性ｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６）の生化学的分析。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。デンシトメトリー分析は、年齢および性別を合わせたＷＴ同腹仔（Ｎ＝４）と比較して、１４週齢のＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝５）において低下したｐＳ６レベルを明らかにした。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。

図Ｓ２Ａ〜Ｓ２Ｈ。ＡＡＶ１は、マウスにおいて線条体ニューロンを効率的に形質導入する。ＨＤマウス線条体の代表的免疫組織化学写真は、６週齢でのＡＡＶ１．ｅＧＦＰ注射後の１８週齢のマウスにおいてニューロンの強い形質導入（ＮｅｕＮ）を示した。ＭｃＢｒｉｄｅら、ＰＮＡＳ： １０５（１５）：５８６８−７３， ２００８もまた参照のこと。（Ｂ〜Ｈ）ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体において代謝関連欠損を改善する。Ｂ）ウェスタンブロットは、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ処置動物と比較して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置したＮ１７１−８２Ｑマウスにおける線条体溶解物の増大したｐＳ６およびＤＡＲＰＰ−３２レベルを示す。マウスに１０週齢で注射し、組織を１３週齢で採取した。右、ＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性のデンシトメトリー定量（Ｎ＝４ マウス／群；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。（Ｃ〜Ｈ）１０週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射およびＡＡＶ．ｅＧＦＰの対側注射（Ｎ＝４／群）後の１３週齢Ｎ１７１−８２Ｑマウスの線条体ホモジネートに由来する代謝関連遺伝子およびＮ１７１−８２Ｑ導入遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。全ての遺伝子を、β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定。 図Ｓ２Ａ〜Ｓ２Ｈ。ＡＡＶ１は、マウスにおいて線条体ニューロンを効率的に形質導入する。ＨＤマウス線条体の代表的免疫組織化学写真は、６週齢でのＡＡＶ１．ｅＧＦＰ注射後の１８週齢のマウスにおいてニューロンの強い形質導入（ＮｅｕＮ）を示した。ＭｃＢｒｉｄｅら、ＰＮＡＳ： １０５（１５）：５８６８−７３， ２００８もまた参照のこと。（Ｂ〜Ｈ）ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体において代謝関連欠損を改善する。Ｂ）ウェスタンブロットは、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ処置動物と比較して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射で処置したＮ１７１−８２Ｑマウスにおける線条体溶解物の増大したｐＳ６およびＤＡＲＰＰ−３２レベルを示す。マウスに１０週齢で注射し、組織を１３週齢で採取した。右、ＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性のデンシトメトリー定量（Ｎ＝４ マウス／群；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。（Ｃ〜Ｈ）１０週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射およびＡＡＶ．ｅＧＦＰの対側注射（Ｎ＝４／群）後の１３週齢Ｎ１７１−８２Ｑマウスの線条体ホモジネートに由来する代謝関連遺伝子およびＮ１７１−８２Ｑ導入遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。全ての遺伝子を、β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定。

図Ｓ３Ａ−Ｓ３Ｆ。Ａ、Ｂ。Ｔｏｒｉｎ１は、ＨＤの線条体の細胞モデルにおいて代謝遺伝子発現を阻害する。通常の血清条件において増殖させたＱ７およびＱ１１１の線条体の細胞を、Ｔｏｒｉｎ１またはＤＭＳＯ（コントロール）で処置した。全細胞抽出物を２４時間後に得た。（Ａ）生化学的評価は、Ｔｏｒｉｎ１処置でのＱ７およびＱ１１１細胞において、低下したｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６およびｐ４Ｅ−ＢＰ１）、ＰＧＣ１−α、およびＤＡＲＰＰ−３２発現を示す。（Ｂ）Ｔｏｒｉｎ１処置の２４時間後のＣＲＥＢおよびその共活性化因子、ＴＯＲＣ１に関する代表的ウェスタンブロット。デンシトメトリー分析は、Ｔｏｒｉｎ１がＱ７およびＱ１１１細胞においてＴＯＲＣ１およびＣＲＥＢレベルを抑制したことを示す。値は、４回の独立した実験（Ｎ＝４／処置群）のビヒクル処置コントロールのパーセンテージ＋ＳＥＭである。内因性β−アクチンは、ローディングコントロールであった。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。スチューデントのｔ検定。Ｃ〜Ｆ。ｍＴＯＲは、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ処置のＨＤトランスジェニックマウス線条体に対してＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置のＨＤトランスジェニックマウス線条体においてコレステロール生合成遺伝子発現を変化させる。１０週齢でのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射後の１３週齢のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスの線条体ホモジネートに由来する脂質生成遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。ＡＡＶ．ｅＧＦＰ注射した対側の大脳半球の溶解物を、内部コントロールとして供した（Ｎ＝４／群）。全ての遺伝子を、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。Ｃ＝コントロール。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定。

図Ｓ４。基底オートファジーは、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体において増強される。１０週齢でのＡＡＶ．ｅＧＦＰの注射後のＮ１７１−８２ＱおよびＷＴマウスに由来する線条体溶解物におけるＬＣ３ＩＩの生化学的評価。線条体を、注射後３週間で採取した。デンシトメトリー分析は、ＷＴ（Ｎ＝５）と比較して、Ｎ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝９）の線条体において増大したＬＣ３ＩＩレベルを明らかにした。β−アクチンを、ローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。

図Ｓ５。海馬のＡＡＶ．ｅＧＦＰ形質導入。１０週齢での歯状回へのＡＡＶ１．ｅＧＦＰ注射の２週間後のＮ１７１−８２Ｑマウスの海馬におけるｅＧＦＰ発現。スケールバー：１ｍｍ（左）、１００μｍ（右）。

図Ｓ６Ａ〜Ｓ６Ｂ。ＲＡＤ００１は、Ｎ１７１−８２Ｑマウスの線条体におけるｍＴＯＲＣ１活性を阻害する。（Ａ）ビヒクル（２％ ＤＭＳＯ）またはｍＴＯＲＣ１インヒビターＲＡＤ００１を受けたＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝３ マウス／群）に由来する線条体溶解物におけるｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６）の生化学的評価。マウスを、２週間にわたって処置し、線条体を最後の用量の２４時間後に採取した。マウス由来のサンプルのイムノブロットのデンシトメトリー分析。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｂ）１１週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの線条体へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの１回の片側注射の２週間後の、ｐＳ６（緑色）およびＨｏｅｓｃｈｔ染色（青色）の免疫組織化学染色の代表的顕微鏡写真。マウスに、ビヒクル（Ｎ＝３）またはＲＡＤ００１（Ｎ＝４）を２週間にわたって与えた。スケールバー：２５μｍ。 図Ｓ６Ａ〜Ｓ６Ｂ。ＲＡＤ００１は、Ｎ１７１−８２Ｑマウスの線条体におけるｍＴＯＲＣ１活性を阻害する。（Ａ）ビヒクル（２％ ＤＭＳＯ）またはｍＴＯＲＣ１インヒビターＲＡＤ００１を受けたＮ１７１−８２Ｑマウス（Ｎ＝３ マウス／群）に由来する線条体溶解物におけるｍＴＯＲＣ１活性（ｐＳ６）の生化学的評価。マウスを、２週間にわたって処置し、線条体を最後の用量の２４時間後に採取した。マウス由来のサンプルのイムノブロットのデンシトメトリー分析。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。（Ｂ）１１週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスの線条体へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの１回の片側注射の２週間後の、ｐＳ６（緑色）およびＨｏｅｓｃｈｔ染色（青色）の免疫組織化学染色の代表的顕微鏡写真。マウスに、ビヒクル（Ｎ＝３）またはＲＡＤ００１（Ｎ＝４）を２週間にわたって与えた。スケールバー：２５μｍ。

図Ｓ７Ａ〜Ｓ７Ｃ。Ｒｈｅｓ発現レベルは、ＨＤトランスジェニックマウス線条体において低下される。（Ａ）１７週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝４）およびＷＴマウス（Ｎ＝６）における内因性線条体のＲｈｅｓレベル。Ｒｈｅｓ ｍＲＮＡアバンダンスを、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。（Ｂ）Ｒｈｅｂレベルは、６週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝５）およびＷＴマウス（Ｎ＝４）、ならびに１７週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝４）およびＷＴマウス（Ｎ＝６）に由来するＮ１７１−８２Ｑマウス線条体において変化しない。スチューデントのｔ検定。（Ｃ）Ｎ１７１−８２Ｑマウスは、５週齢および１０週齢において正常とは区別不能に機能する（Ｎ＝１０〜１４ マウス／群）。４連続日からのロータロッドデータは、落下までの潜時として示される。データは、平均＋ＳＥＭを表す。一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定。 図Ｓ７Ａ〜Ｓ７Ｃ。Ｒｈｅｓ発現レベルは、ＨＤトランスジェニックマウス線条体において低下される。（Ａ）１７週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝４）およびＷＴマウス（Ｎ＝６）における内因性線条体のＲｈｅｓレベル。Ｒｈｅｓ ｍＲＮＡアバンダンスを、内因性β−アクチンに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。（Ｂ）Ｒｈｅｂレベルは、６週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝５）およびＷＴマウス（Ｎ＝４）、ならびに１７週齢のＮ１７１−８２Ｑ（Ｎ＝４）およびＷＴマウス（Ｎ＝６）に由来するＮ１７１−８２Ｑマウス線条体において変化しない。スチューデントのｔ検定。（Ｃ）Ｎ１７１−８２Ｑマウスは、５週齢および１０週齢において正常とは区別不能に機能する（Ｎ＝１０〜１４ マウス／群）。４連続日からのロータロッドデータは、落下までの潜時として示される。データは、平均＋ＳＥＭを表す。一元配置分散分析とＴｕｋｅｙの事後検定。

図Ｓ８。ＲｈｅｓおよびＧＴＰアーゼ欠損Ｒｈｅｓ Ｓ３３ＮでのＮ１７１−８２Ｑマウス線条体の形質導入。線条体におけるＡＡＶ．Ｒｈｅｓ、ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ、または生理食塩水で形質導入したＮ１７１−８２ＱマウスにおけるｍＴＯＲＣ１活性（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）およびＲｈｅｓ導入遺伝子（Ｆｌａｇ）の代表的ウェスタンブロット。マウスに７週齢で注射し、線条体組織を注射後３週間で採取した。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。

（詳細な説明）
治療剤
ある種の実施形態において、本発明は、必要性のある被験体に治療剤を提供する。ある種の実施形態において、上記治療剤は、ｍＴＯＲＣ１調節因子を含む。

ある種の実施形態において、上記ｍＴＯＲＣ１調節因子は、Ｒｈｅｂ（脳で富化されるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｒａｓホモログ（ＲＨＥＢ）、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５６１４．３）である。Ｒｈｅｂ配列（コード配列は、太字で示される）：
。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｂは、配列番号１によってコードされるタンパク質に対して少なくとも９０％同一（例えば、配列番号１によってコードされるタンパク質に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｂは、上で太字で示される、Ｒｈｅｂコード配列である配列番号２によってコードされるタンパク質に対して少なくとも９０％同一（例えば、配列番号２によってコードされるタンパク質に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である。ある種の実施形態において、上記Ｒｈｅｂは、構成的に活性なＲｈｅｂ変異体（ｃａＲｈｅｂ；Ｓ１６Ｈ）である。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｂをコードする上記核酸は、配列番号１または２のフラグメントまたは改変体であるか、あるいは配列番号１または２と実質的同一性を有する。

ある種の実施形態において、上記ｍＴＯＲＣ１調節因子は、Ｒｈｅｓ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＲＡＳＤファミリー、メンバー２（ＲＡＳＤ２）、ｍＲＮＡ ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４３１０．３）である。Ｒｈｅｓ配列（コード配列は、太字で示される）：
。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｓは、配列番号３によってコードされるタンパク質に対して少なくとも９０％同一（例えば、配列番号３によってコードされるタンパク質に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｓは、上で太字で示される、Ｒｈｅｓコード配列である配列番号４によってコードされるタンパク質に対して少なくとも９０％同一（例えば、配列番号４によってコードされるタンパク質に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）である。ある種の実施形態において、Ｒｈｅｂをコードする上記核酸は、配列番号３または４のフラグメントまたは改変体であるか、あるいは配列番号３または４と実質的同一性を有する。

ある種の実施形態において、上記治療剤は、ウイルスベクター中に含まれる。ある種の実施形態において、上記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

発現カセットおよびベクター
本発明はまた、ＲｈｅｓまたはＲｈｅｂをコードする配列を含む発現カセットを提供する。

ある種の実施形態において、上記発現カセットは、プロモーターをさらに含む。ある種の実施形態において、上記プロモーターは、調節可能なプロモーターである。ある種の実施形態において、上記プロモーターは、構成性プロモーターである。ある種の実施形態において、上記プロモーターは、ＰＧＫ、ＣＭＶまたはＲＳＶのプロモーターである。

本発明は、上記の発現カセットを含むベクターを提供する。ある種の実施形態において、上記ベクターは、ウイルスベクターである。ある種の実施形態において、上記ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスモロニーベースのウイルスベクターである。

「発現カセット」とは、本明細書で使用される場合、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を誘導し得る核酸配列を意味し、上記核酸配列は、終結シグナルに作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。それはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含み得る。そのコード領域は通常、目的のタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。上記発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られてきたものであり得る。上記発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターの制御下にあってもよく、宿主細胞がある特定の刺激に曝される場合にのみ転写を開始する調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合には、上記プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官、または発生ステージに対して特異的であり得る。

「作動可能に連結される」とは、上記配列のうちの１つの機能が別のものによって影響を及ぼされるように、１つの核酸フラグメント上の核酸配列の会合をいう。例えば、調節性ＤＮＡ配列は、その調節性ＤＮＡ配列が、そのコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼす（すなわち、そのコード配列または機能的ＲＮＡが、上記プロモーターの転写制御下にある）ようにその２つの配列が置かれる場合に、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」かまたはその配列と「会合される」といわれる。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向において、調節性配列に作動可能に連結され得る。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小さな非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製するためにヘルパーウイルスに依存することで、この科の他のメンバーとは異なる。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、第１９染色体のｑアームへと位置特異的な様式で組み込まれ得る。ＡＡＶの約５ｋｂのゲノムは、プラス極性もしくはマイナス極性いずれかの１本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。上記ゲノムの末端は、ヘアピン構造へと折りたたまれ得、ウイルスＤＮＡ複製起点として働き得る短い逆方向末端反復である。物理的には、パルボウイルスビリオンは、エンベロープに包まれておらず、その正二十面体キャプシドは、直径約２０ｎｍである。

今日まで、多くの血清学的に異なるＡＡＶが同定されており、ヒトもしくは霊長類から１２種より多くが単離された。ＡＡＶ２のゲノムは、長さ４６８０ヌクレオチドであり、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。左のＯＲＦは、非構造Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ ４０、Ｒｅｐ ５２、Ｒｅｐ ６８およびＲｅｐ ７８をコードし、これらは、１本鎖の子孫ゲノムの生成に加えて、複製および転写の調節に関与する。さらに、上記Ｒｅｐタンパク質のうちの２つは、ヒト第１９染色体のｑアームの領域へとＡＡＶゲノムを優先的に組み込むことに関連した。Ｒｅｐ６８／７８はまた、ＮＴＰ結合活性、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することが示された。上記Ｒｅｐタンパク質は、核局在シグナルおよびいくつかの潜在的リン酸化部位を有する。これらキナーゼ部位のうちの１つの変異は、複製活性の喪失を生じた。

ゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製起点として働くＴ字形のヘアピン構造へと折りたたまれる可能性を有する短い逆方向末端反復（ＩＴＲ）である。上記ＩＴＲ領域内では、上記ＩＴＲの機能に中心的である２つのエレメント、ＧＡＧＣ反復モチーフおよび末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が説明されてきた。上記反復モチーフは、上記ＩＴＲが直線状コンホメーションもしくはヘアピンコンホメーションのいずれかにある場合に、Ｒｅｐを結合することが示された。この結合は、部位特異的および鎖特異的様式において起こる上記ｔｒｓでの切断のためにＲｅｐ６８／７８を適切な位置に置くように働く。複製におけるそれらの役割に加えて、これら２つのエレメントは、ウイルス組み込みに重要であるようである。第１９染色体組み込み部位内に含まれるのは、Ｒｅｐ結合部位と隣接するｔｒｓである。これらエレメントは、位置特異的組み込みに対して機能的かつ必須であることが示された。

ＡＡＶビリオンは、エンベロープに包まれていない、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３といわれる３種の関連タンパク質からなる、約２５ｎｍ直径の正二十面体粒子である。右のＯＲＦは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。これらタンパク質は、それぞれ、１：１：１０の比で見出され、全て右側のＯＲＦに由来する。上記キャプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび通常出ない開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失分析は、選択的スプライシングされたメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去もしくは変化が、感染性粒子の低下した収量を生じることを示した。上記ＶＰ３コード領域内の変異は、いかなる１本鎖子孫ＤＮＡも感染性粒子も生成できないことを生じる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードし得る。上記粒子は、ＡＡＶ２および他のＡＡＶキャプシドタンパク質（すなわち、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２のようなキメラタンパク質）を含む粒子であり得る。ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションは、上記ＡＡＶ２キャプシドを含む得られるウイルス粒子が、標準的方法によって慣用的に決定される場合にＡＡＶ１とは抗原的にもしくは免疫学的に異なったままである限りにおいて本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットは、ウイルス粒子がＡＡＶ１とは抗原的にもしくは免疫学的に異なるか否かを決定するために使用され得る。さらに、上記ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、ＡＡＶ１とは異なる組織向性を保持する。

ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ポリペプチド全体をコードするＡＡＶ２キャプシドポリペプチドは、全体的にみて、ＮＣ＿００１４０１に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＡＶ２キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列）と少なくとも約６３％相同性（もしくは同一性）を有し得る。上記キャプシドタンパク質は、ＮＣ００１４０１に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質と約７０％相同性、約７５％相同性、８０％相同性、８５％相同性、９０％相同性、９５％相同性、９８％相同性、９９％相同性、もしくはさらに１００％相同性を有し得る。上記キャプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に示されるヌクレオチド配列にコードされるタンパク質と約７０％同一性、約７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９８％同一性、９９％同一性、もしくはさらに１００％同一性を有し得る。上記粒子は、別のＡＡＶおよびＡＡＶ２キャプシドタンパク質、すなわち、キメラタンパク質を含む粒子であり得る。上記ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションは、上記ＡＡＶ２キャプシドを含む得られるウイルス粒子が標準的方法によって慣用的に決定され得る場合にＡＡＶ４とは抗原的にもしくは免疫学的に異なったままである限りにおいて、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットは、ウイルス粒子がＡＡＶ１とは抗原的にもしくは免疫学的に異なるか否かを決定するために使用され得る。さらに、上記ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、本明細書中の実施例において例証されるもののようなＡＡＶ１とは異なる組織向性を保持するが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子のものとは異なる組織向性を有し得る。

ある種の実施形態において、本発明は、一対のＡＡＶ２逆方向末端反復を含むベクターを含む、すなわち、キャプシド化するＡＡＶ２粒子をさらに提供する。ＡＡＶ２ ＩＴＲのヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。さらに、上記粒子は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２両方のキャプシドタンパク質、すなわち、キメラタンパク質を含む粒子であり得る。さらに、上記粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０）に由来する一対のＡＡＶ逆方向末端反復を含むベクターをキャプシド化する粒子であり得る。上記粒子の中にキャプシド化されたベクターは、上記逆方向末端反復の間に挿入される外因性核酸をさらに含み得る。

ＡＡＶの以下の特徴は、ＡＡＶを遺伝子移入にとって魅力的なベクターにしている。ＡＡＶベクターは、細胞ゲノムの中にインビトロで安定して組み込まれる；広い宿主範囲を有する；分裂している細胞および分裂していない細胞の両方にインビトロおよびインビボで形質導入され、その形質導入された遺伝子の高レベルの発現を維持することが示された。ウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨ、温度の変化に耐性であり、ＣｓＣｌ勾配でもしくは他の手段によって濃縮され得る。本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクター、および組換えＡＡＶビリオンを投与するための方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子であるか、またはＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２のうちの少なくとも１つの特有の核酸を含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含む粒子である。用語「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」内と考えられるには、上記ヌクレオチド配列は、上記ＡＡＶ２ ＩＴＲを上記ＡＡＶ１ ＩＴＲから区別する、本明細書で記載される一方の特徴もしくは両方の特徴を保持しなければならない：（１）３個の（ＡＡＶ１におけるようにむしろ４個の）「ＧＡＧＣ」反復および（２）上記ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｒｅｐ結合部位において、最初の２個の「ＧＡＧＣ」反復の中の４番目のヌクレオチドが、ＴではなくＣである。

上記タンパク質もしくは送達される予定の別の薬剤をコードする配列の発現を駆動するプロモーターは、公知の考慮事項（例えば、上記プロモーターに機能的に連結される核酸の発現のレベルおよび上記ベクターが使用される予定の細胞タイプ）によって選択される、任意の所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外因性プロモーターであっても内因性プロモーターであってもよい。プロモーターは、例えば、公知の強力なプロモーター（例えば、ＳＶ４０もしくは誘導性メタロチオネインプロモーター）、またはＡＡＶプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ５プロモーター）を含み得る。プロモーターのさらなる例としては、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスに由来するプロモーター、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器抱合体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などが挙げられる。追加的な例として、制御されたプロモーターが挙げられる。

上記ＡＡＶベクターは、上記プロモーターに機能的に連結された外因性（異種）核酸をさらに含み得る。「異種核酸」とは、任意の異種もしくは外因性の核酸が、細胞、組織もしくは生物の中に移入するためのベクターの中に挿入され得ることを意味する。上記核酸は、例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはアンチセンスＲＮＡをコードし得る。「機能的に連結される」とは、上記プロモーターが、当該分野で公知であるとおり、上記異種核酸の発現を促進し得ることになること（例えば、上記異種核酸に対する上記プロモーターの適切な配向）を意味する。さらに、上記異種核酸は、好ましくは、当該分野で公知であるとおり、機能的にコードする、すなわち、上記核酸が発現されることを可能にするために、上記核酸の発現に適切な配列を全て有する。上記核酸は、例えば、発現制御配列（例えば、エンハンサー）、および必須の情報プロセシング部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列）を含み得る。上記核酸は、パッケージされ得る核酸の大きさによってのみ限定される１種より多くの遺伝子産物をコードし得る。

本発明のある種の実施形態において、上記異種核酸は、上記ベクターが移入される被験体によって必要とされる、失われているもしくは欠損しているタンパク質に置き換わる有益なタンパク質、例えば、ＲｈｅｂまたはＲｈｅｓをコードし得る。

ＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。上記ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションは、上記ＡＡＶ１キャプシドを含む得られるウイルス粒子が標準的方法によって慣用的に決定され得るとおりに他のＡＡＶキャプシドとは抗原的にもしくは免疫学的に異なる限りにおいて、本明細書で企図される。具体的には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットは、ウイルス粒子が他のＡＡＶ血清タイプとは抗原的にもしくは免疫学的に異なるか否かを決定するために使用され得る。

用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、アミノ酸のポリマーをいい、全長タンパク質およびそのフラグメントを含む。従って、「タンパク質」および「ポリペプチド」はしばしば、本明細書で交換可能に使用される。置換は、中立的であることが公知のパラメーターによって選択され得る。当業者によって認識されるように、本発明はまた、アミノ酸配列におけるわずかなバリエーションもしくは他の特性を有するそれらポリペプチドを含む。このようなバリエーションは、対立遺伝子バリエーションとして（例えば、遺伝的多型に起因して）天然に生じ得るか、またはヒトの介入によって（例えば、誘導される点、欠失、挿入および置換変異体のような、クローニングされたＤＮＡ配列の変異誘発によって）生成され得る。アミノ酸配列における小さな変化が一般に好ましい（例えば、保存的アミノ酸置換、小さな内部欠失もしくは挿入、および分子の末端での付加もしくは欠失）。これら改変は、アミノ酸配列における変化を生じ得るか、サイレント変異を提供し得るか、制限部位を改変し得るか、または他の特定の変異を提供し得る。

本発明の方法は、核酸を細胞に送達するための方法を提供し、上記方法は、上記細胞に、一対のＡＡＶ逆方向末端反復の間に挿入される核酸を含むベクターを含むＡＡＶ粒子を投与し、それによって、上記核酸を上記細胞に送達する工程を包含する。上記細胞への投与は、任意の手段（単に上記粒子を上記細胞と接触させる、必要に応じて、望ましい液体（例えば、組織培養培地、もしくは緩衝化生理食塩水溶液）中に上記細胞と共に含められることを含む）によって達成され得る。上記粒子は、任意の望ましい時間の長さにわたって上記細胞と接触した状態のままにさせられ得、代表的には、上記粒子は、投与され、無期限に保持させられ得る。このようなインビトロの方法に関しては、上記ウイルスは、当該分野で公知でありかつ本明細書で例証されるように、標準的なウイルス形質導入法によって上記細胞に投与され得る。投与するウイルスの力価は、具体的には細胞タイプに依存して変動し得るが、一般に、ＡＡＶ形質導入に使用されるものに代表される。さらに、本発明の例で特定の細胞を形質導入するために使用される力価が利用され得る。上記細胞は、ヒト、ならびに他の大きな（非齧歯類）哺乳動物、例えば、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびイヌの任意の所望の細胞を含み得る。

より具体的には、本発明は、脳内の細胞、特に中型有棘ニューロンに核酸を送達する方法を提供し、上記方法は、一対のＡＡＶ逆方向末端反復の間に上記核酸が挿入され、それによって、上記核酸を上記細胞に送達する工程を包含する。

本発明は、さらに、被験体において核酸を細胞に送達する方法を提供し、上記方法は、上記被験体に、一対のＡＡＶ逆方向末端反復の間に挿入される核酸を含むＡＡＶ粒子を投与し、それによって、上記核酸を上記被験体における細胞に送達する工程を包含する。

被験体において核酸を線条体または皮質中のニューロンなどの脳細胞に送達するための方法もまた提供され、上記方法は、上記被験体に、一対のＡＡＶ逆方向末端反復の間に挿入される核酸を含むＡＡＶ粒子を投与し、それによって、上記被験体において上記核酸をニューロンまたは他の細胞に送達する工程を包含する。

本開示のある種の実施形態は、本明細書で記載されるとおりのウイルスベクターを含む細胞を提供する。
（ＡＡＶベクター）

一実施形態において、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターとは、アデノ随伴ウイルスをいい、天然に存在する野生型ウイルス自体もしくはその派生物をいうために使用され得る。この用語は、別段必要とされる場合を除いて、全てのサブタイプ、血清タイプおよび偽型（天然に存在する形態および組換え形態の両方）を網羅する。本明細書で使用される場合、用語「血清タイプ」とは、規定された抗血清とのキャプシドタンパク質反応性に基づいて同定され、他のＡＡＶから区別され得るＡＡＶをいい、例えば、霊長類ＡＡＶには８つの公知の血清タイプ、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−９およびＡＡＶｒｈ１０がある。例えば、血清タイプＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のキャップ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質ならびに同じＡＡＶ２血清タイプに由来する５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列を含むゲノムを含むＡＡＶをいうために使用される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清タイプに由来するキャプシドタンパク質および５’−３’ ＩＴＲの両方を有するＡＡＶをいうために使用され得るか、またはそれは、１つの血清タイプに由来するキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清タイプに由来する５’−３’ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ血清タイプ２由来のキャプシドおよびＡＡＶ血清タイプ５由来のＩＴＲ）を有するＡＡＶをいい得る。本明細書で例証される各例に関して、ベクター設計および生成の説明は、キャプシドおよび５’−３’
ＩＴＲ配列の血清タイプを記載する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルス（組換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶベクター」）ともいわれる）をいう。

「ＡＡＶウイルス」もしくは「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１種のＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質のうちの全てによる）およびキャプシド化されたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子をいう。上記粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド（例えば、哺乳動物細胞に送達される予定の導入遺伝子））を含む場合、それは、代表的には、「ｒＡＡＶ」といわれる。

一実施形態において、上記ＡＡＶ発現ベクターは、転写の指示において作動可能に連結される構成要素として、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を少なくとも提供するために公知の技術を使用して構築される。上記制御エレメントは、哺乳動物細胞において機能するように選択される。上記作動可能に連結される構成要素を含む得られた構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と（５’側および３’側で）隣接している。

「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」もしくは「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端で見出される当該分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒になって、２つの隣り合うＩＴＲの間に挿入されるヌクレオチド配列からの効率的切り出しおよびレスキュー、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みを提供する。

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変化していてもよい。さらに、上記ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清タイプ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などが挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターの中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ ＩＴＲは、それらが、意図されたとおりに、すなわち、宿主細胞ゲノムもしくはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が上記細胞に存在する場合には上記異種配列をレシピエント細胞ゲノムの中に組み込まれるのを可能にするように機能する限りにおいて、同じＡＡＶ血清タイプもしくは単離物と必ずしも同一である必要もないし、これらに由来する必要もない。

一実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清タイプ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などが挙げられるが、これらに限定されない）のうちのいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターの中で選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ ＩＴＲは、それらが、意図されたとおりに、すなわち、宿主細胞ゲノムもしくはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が上記細胞に存在する場合には上記ＤＮＡ分子をレシピエント細胞ゲノムの中に組み込まれるのを可能にするように機能する限りにおいて、同じＡＡＶ血清タイプもしくは単離物と必ずしも同一である必要もないし、これらに由来する必要もない。

一実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ２に由来し得る。ＡＡＶベクターで使用するための適切なＤＮＡ分子は、大きさ約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満であり、当該分野で公知である。

一実施形態において、上記選択されたヌクレオチド配列は、上記被験体においてその転写もしくは発現をインビボで統御する制御エレメントに作動可能に連結される。このような制御エレメントは、上記選択された遺伝子と通常会合している制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が使用され得る。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物遺伝子もしくはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）由来の配列はまた、本明細書での使用が見出される。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。

一実施形態において、異種プロモーターおよび他の制御エレメント（例えば、ＣＮＳ特異的および誘導性プロモーター、エンハンサーなど）は両方とも、特に有用である。異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来する遺伝子から単離されるものが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびａｕｆｉｎに関するＤＮＡ応答性エレメントが挙げられる。

一実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲによって境界が示された目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、上記選択された配列を、ＡＡＶゲノムから切り出された主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノムの中に直接挿入することによって構築され得る。上記ＡＡＶゲノムの他の部分はまた、上記ＩＴＲの十分な部分が保持されて、複製およびパッケージング機能を可能にする限りにおいて、欠失され得る。このような構築物は、当該分野で周知の技術を使用して設計され得る。

あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、上記ウイルスゲノムから、または同じものを含むＡＡＶベクターから切り出され得、標準的なライゲーション技術を使用して別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’側および３’側に融合され得る。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０℃（「粘着末端」ライゲーションに関して）で４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニット Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、もしくは１４℃（「平滑末端」ライゲーションに関して）で１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニット Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのいずれかの中で達成され得る。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、ＩＴＲを含む３０〜１００μｇ／ｍｌ 総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭ 総最終濃度）．ＡＡＶベクターで行われる。

さらに、キメラ遺伝子は、１種以上の選択された核酸配列の５’側および３’側に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように合成で生成され得る。哺乳動物ＣＮＳ細胞においてキメラ遺伝子配列を発現するために好ましいコドンが使用され得る。完全なキメラ配列は、標準的方法によって調製されたオリゴヌクレオチドを重ね合わせることからアセンブリされる。

ｒＡＡＶビリオンを生成するために、ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を使用して（例えば、トランスフェクションによって）、適切な宿主細胞へと導入される。多くのトランスフェクション技術が一般に、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。特に適切なトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、および高速マイクロインジェクションを使用する核酸送達が挙げられる。

一実施形態において、ｒＡＡＶビリオンを生成するために適した宿主細胞としては、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るか、もしくはレシピエントとして使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。上記用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされる細胞に言及する。安定なヒト細胞株に由来する細胞、２９３（例えば、アクセッション番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３の下でアメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手可能）は、本開示の実施において使用され得る。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡフラグメントで形質転換され、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現するヒト胚性腎臓細胞株である。上記２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成するために特に便利なプラットフォームを提供する。

「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識されている領域を意味する。これらＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニック生成、ＤＮＡヘリカーゼ活性およびＡＡＶ（もしくは他の異種）プロモーターからの転写の調節を含め、多くの機能を有することが示された。上記Ｒｅｐ発現産物は、上記ＡＡＶゲノムを複製するためにまとめて必要とされる。上記ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切なホモログとしては、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することも公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる。

「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識されている領域、もしくはその機能的ホモログを意味する。これらＣａｐ発現産物は、上記ウイルスゲノムをパッケージングするためにまとめて必要とされるパッケージング機能を供給する。

一実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、上記宿主細胞をＡＡＶヘルパー構築物で、上記ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前もしくはこれと同時のいずれかに、トランスフェクトすることによって、宿主細胞へと導入される。ＡＡＶヘルパー構築物は、このようにして、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供して、生産的なＡＡＶ感染に必要な、失われているＡＡＶ機能を補完するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、複製も、それら自体をパッケージすることもできない。これら構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、もしくはビリオンの形態にあり得る。多くのＡＡＶヘルパー構築物が使用されてきた（例えば、ＲｅｐおよびＣａｐ両方の発現産物をコードする、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５）。Ｒｅｐおよび／もしくはＣａｐ発現産物をコードする多くの他のベクターも記載されてきた。

ウイルスベクターの送達法は、上記ＡＡＶを被験体へと注射する工程を包含する。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボもしくはインビトロいずれかの形質導入技術を使用して、ＣＮＳの細胞へと導入され得る。インビトロで導入される場合、所望のレシピエント細胞は、被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、上記被験体へと再導入される。あるいは、共通遺伝子の細胞もしくは異種発生性の細胞は、それら細胞が上記被験体において不適切な免疫応答を生じない場合に使用され得る。

形質導入した細胞を被験体へ送達および導入するための適切な方法が、記載されてきた。例えば、細胞は、組換えＡＡＶビリオンと、ＣＮＳ細胞とを、例えば、適切な培地中で合わせることによってインビトロで形質導入され得、その目的のＤＮＡを有するそれら細胞のスクリーニングは、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来技術を使用して、または選択マーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。形質導入された細胞は、次いで、以下により十分に記載される薬学的組成物へと製剤化され得、上記組成物は、種々の技術によって、例えば、移植、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射および腹腔内注射によって、上記被験体に導入され得る。

一実施形態において、薬学的組成物は、目的の核酸の治療上有効な量、すなわち、問題の疾患状態の症状を低減もしくは改善するために十分な量もしくは所望の利益を付与するために十分な量を生じるために、十分な遺伝物質を含む。上記薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、これ自体が上記組成物を受容する個体にとって有害な抗体の生成を誘発せず、過度な毒性なしに投与され得る任意の薬剤を含む。薬学的に受容可能な賦形剤としては、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、および液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、そこに含まれ得る（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）で入手可能である。

１種より多くの導入遺伝子が上記送達されるウイルスベクターによって発現され得ることは、理解されるべきである。あるいは、別個のベクター（各々、１種以上の異なる導入遺伝子を発現する）がまた、本明細書で記載されるように、被験体に送達され得る。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターが、他の適切な組成物および治療と併用され得ることもまた、意図される。

本明細書の教示に鑑みれば当業者に明らかであるように、添加されなければならないウイルスベクターの有効量は、経験的に決定され得る。投与は、処置過程の間中ずっと、連続してもしくは間欠的に、１用量で行われ得る。最も有効な手段および投与量を決定するための方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、上記治療の組成物、標的細胞、および処置されている被験体に伴って変動する。１回もしくは複数回の投与は、処置している医師によって選択される投与レベルおよびパターンで行われ得る。

ある種の実施形態において、上記ｒＡＡＶは、１×１０^５〜１×１０^１６ｖｇ／ｍｌの約０．３〜２ｍｌの用量で投与される。ある種の実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^７〜１×１０^１４ｖｇ／ｍｌの１〜３ｍｌの用量で投与される。ある種の実施形態において、上記ｒＡＡＶは、１×１０^８〜１×１０^１３ｖｇ／ｍｌの約１〜２ｍｌの用量で投与される。

上記ｒＡＡＶ粒子を含む製剤は、ビヒクル中に上記ｒＡＡＶ粒子の有効量を含み、上記有効量は、当業者によって容易に決定される。上記ｒＡＡＶ粒子は、代表的には、上記組成物のうちの約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲に及び得るか、または適切であれば、さらにより高くてもよいしより低くてもよい。投与される予定の量は、処置が考慮されている動物もしくはヒト被験体の年齢、体重および身体的状態のような要因に依存する。有効な投与量は、用量応答曲線を確立する慣用的な試験を通じて、当業者によって確立され得る。上記被験体は、１以上の用量での上記ｒＡＡＶ粒子の投与によって処置される。複数の用量は、適切な酵素活性を維持するために必要とされる場合に、投与され得る。

水、水性生理食塩水、人工ＣＳＦ、もしくは他の公知の物質を含むビヒクルは、本発明とともに使用され得る。製剤を調製するために、精製された組成物が単離され得、凍結乾燥および安定化され得る。上記組成物は、次いで、適切な濃度へと調節され得、必要に応じて、抗炎症剤と合わせられ得、使用のためにパッケージされ得る。

本発明は、細胞における標的タンパク質のレベルを増大させるための方法を提供し、上記方法は、上記細胞における標的タンパク質のレベルを増大させるために十分な量でタンパク質、または上記のタンパク質をコードする核酸を細胞の中に導入することによる。ある種の実施形態において、標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％増大される。標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％増大される。

治療剤をコードする核酸
用語「核酸」とは、１本鎖もしくは２本鎖いずれかの形態にあり、糖、ホスフェートおよび塩基（プリンもしくはピリミジンのいずれかである）を含むモノマー（ヌクレオチド）から構成される、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドおよびこれらのポリマーをいう。特段限定されなければ、上記用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。別段示されなければ、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示される配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（もしくは全ての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／もしくはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することによって達成され得る。

「核酸フラグメント」とは、所定の核酸分子の一部である。生物の大部分におけるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝物質である一方で、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含まれる情報をタンパク質へと移すのに関与する。上記開示されるヌクレオチド配列およびそれらによってコードされるタンパク質もしくは部分長のタンパク質のフラグメントおよび改変体もまた、本発明によって包含される。「フラグメント」もしくは「一部分」とは、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または上記ポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の、全長もしくは全長未満を意味する。ある種の実施形態において、上記フラグメントもしくは一部分は、生物学的に機能的である（すなわち、ＲｈｅｂまたはＲｈｅｓの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％を保持する）。

分子の「改変体」とは、上記天然の分子の配列に実質的に類似である配列である。ヌクレオチド配列に関して、改変体は、遺伝コードの縮重が原因で、上記天然のタンパク質の同一なアミノ酸配列をコードするそれら配列を含む。これらのような天然に存在する対立遺伝子改変体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術のような分子生物学技術を使用して同定され得る。改変ヌクレオチド配列はまた、上記天然のタンパク質をコードする合成由来のヌクレオチド配列（例えば、部位指向性変異誘発を使用することによって生成されるもの）、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものを含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列改変体は、上記天然の（内因性の）ヌクレオチド配列と、少なくとも４０％、５０％、６０％、〜７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、〜７９％、一般には、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、〜９８％の配列同一性を有する。ある種の実施形態において、上気海変態は、生物学的に機能的である（すなわち、野生型ＲｈｅｓまたはＲｈｅｂの活性のうちの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％を保持する）。

特定の核酸配列の「保存的に改変された改変体」とは、同一なもしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードするそれら核酸配列をいう。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがあるコドンによって特定される全ての位置において、そのコドンは、コードされるタンパク質を変化させることなく、記載された対応するコドンのうちのいずれかに変化させ得る。この核酸バリエーションは、「サイレントバリエーション」であり、これは、「保存的に改変された改変体」のうちの１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書で記載されるあらゆる核酸配列はまた、別段注記される場合を除いて、あらゆる考えられるサイレントバリエーションを記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＴＧを除く）が、標準的な技術によって機能的に同一な分子を得るように改変され得ることを認識する。よって、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレントバリエーション」は、各記載される配列に内在する。

ポリヌクレオチド配列の用語「実質的同一性」は、あるポリヌクレオチドが、標準的パラメーターを使用して記載されるアラインメントプログラムのうちの１つを使用して、参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、もしくは７９％、または少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、もしくは８９％、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、もしくは９４％、もしくはさらには少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を包含することを意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の相当する同一性を決定するために適切に調節され得ることを認識する。これら目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、もしくはさらに少なくとも９５％の配列同一性を意味する。

ペプチドの状況での用語「実質的同一性」とは、あるペプチドが、特定された比較ウインドウにわたって参照配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、もしくは７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、もしくは８９％、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、もしくは９４％、またはさらには、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を包含することを示す。２つのペプチド配列が実質的に同一であるというしるしは、１つのペプチドがその第２のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であるということである。従って、ペプチドは、例えば、上記２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のペプチドに実質的に同一である。

（遺伝物質を細胞に導入するための方法）
上記外因性遺伝物質（例えば、１種以上の治療用タンパク質をコードするｃＤＮＡ）は、遺伝的に改変された細胞を提供するために、遺伝子移入法（例えば、トランスフェクションもしくは形質導入）によってインビボで細胞へと導入される。種々の発現ベクター（すなわち、標的細胞への外因性遺伝物質の送達を促進するためのビヒクル）は、当業者に公知である。
本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」とは、添加されたＤＮＡの組み込みによって、新たな遺伝物質を細胞が獲得することをいう。従って、トランスフェクションとは、物理的もしくは化学的な方法によって、細胞へと核酸を挿入することをいう。いくつかのトランスフェクション技術は、当業者に公知であり、以下が挙げられる：リン酸カルシウムＤＮＡ共沈；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション；およびタングステン粒子促進微粒子ボンバードメント。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈は、別の考えられるトランスフェクション法である。

対照的に、「細胞の形質導入」とは、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスを使用して、細胞に核酸を移入するプロセスをいう。核酸を細胞に移入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では導入キメラレトロウイルス（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）といわれる。上記レトロウイルス内に含まれる外因性遺伝物質は、上記形質導入された細胞のゲノムへと組み込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療剤をコードするｃＤＮＡを有するアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノムの中には上記外因性遺伝物質が組み込まれていないが、上記細胞内で染色体外に保持されている上記外因性遺伝物質を発現し得る。

代表的には、上記外因性遺伝物質は、異種遺伝子（通常は、上記治療用タンパク質をコードするエキソンを含むｃＤＮＡの形態にある）と一緒に、上記新たな遺伝子の転写を制御するためのプロモーターを含む。上記プロモーターは、特徴としては、転写を開始するために必要な特定のヌクレオチド配列を有する。必要に応じて、上記外因性遺伝物質は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされるさらなる配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含む。この考察目的で、「エンハンサー」は、単純に、コード配列と（シスで）連続して働いて、上記プロモーターによって必然的に決められる基本的な転写レベルを変化させる、任意の翻訳されないＤＮＡ配列である。上記外因性遺伝物質は、上記プロモーターから直ぐ下流に細胞ゲノムへと導入され得、その結果、上記プロモーターおよびコード配列は、上記コード配列の転写を可能にするように作動可能に連結される。レトロウイルス発現ベクターは、上記挿入される外因性遺伝子の転写を制御するために、外因性プロモーターエレメントを含み得る。このような外因性プロモーターとしては、構成性および誘導性両方のプロモーターが挙げられる。

天然に存在する構成性プロモーターは、必須の細胞機能の発現を制御する。結果として、構成性プロモーターの制御下にある遺伝子は、細胞増殖の全ての条件下で発現される。例示的な構成性プロモーターとしては、ある種の構成的もしくは「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーターのためのプロモーター、ならびに当業者に公知の他の構成性プロモーターが挙げられる。さらに、多くのウイルスプロモーターが、真核生物細胞において構成的に機能する。これらとしては、中でもとりわけ以下が挙げられる：ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）；ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。よって、上記で言及した構成性プロモーターのいずれも、異種遺伝子挿入物の転写を制御するために使用され得る。

誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導因子の存在下でのみ、もしくは誘導因子の存在下でより大きな程度へと発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある転写は、ある種の金属イオンの存在下で大きく増大される）。誘導性プロモーターは、それらの誘導因子が結合される場合に転写を刺激する応答性エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックＡＭＰに対するＲＥが存在する。特定のＲＥを含むプロモーターは、誘導性応答を得るために選択され得、いくらかの場合には、上記ＲＥ自体が、異なるプロモーターに結合され得、それによって、組換え遺伝子への誘導性を付与する。従って、適切なプロモーター（構成性 対 誘導性；強い 対 弱い）を選択することによって、上記遺伝的に改変された細胞における治療剤の存在および発現レベルの両方を制御することが可能である。上記治療剤をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、上記治療剤のインサイチュでの送達は、上記遺伝的に改変された細胞をインサイチュで上記治療剤の転写を可能にするための条件に曝すことによって、例えば、上記薬剤の転写を制御する誘導性プロモーターの特異的誘導因子の腹腔内注射によって、誘発される。例えば、上記メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子によってコードされる治療剤の遺伝的に改変された細胞によるインサイチュ発現は、上記遺伝的に改変された細胞と、適切な（すなわち、誘導する）金属イオンを含む溶液とをインサイチュで接触させることによって増強される。

よって、インサイチュで送達される治療剤の量は、以下のような要因を制御することによって調節される：（１）挿入される遺伝子の転写を統御するために使用されるプロモーターの性質（すなわち、上記プロモーターが構成性であるか誘導性であるか、強いのか弱いのか）；（２）上記細胞に挿入される外因性遺伝子のコピー数；（３）患者へと投与される（例えば、移植される）形質導入された／トランスフェクトされた細胞の数；（４）移植物（例えば、グラフトもしくは被包された発現系）の大きさ；（５）移植物の数；（６）上記形質導入された／トランスフェクトされた細胞もしくは移植物が適所に置かれる時間の長さ；および（７）上記遺伝的に改変された細胞による上記治療剤の生成速度。特定の治療剤の治療上有効な用量の送達のためのこれら因子の選択および最適化は、上記で開示される要因および上記患者の臨床プロフィールを考慮に入れれば、過度な実験なく、当業者の範囲内であると考えられる。

少なくとも１つのプロモーターおよび上記治療剤をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、上記発現ベクターは、上記発現ベクターでトランスフェクトもしくは形質導入される細胞の選択を促進するために、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。あるいは、上記細胞は、２以上の発現ベクター（少なくとも１つのベクターは、上記治療剤をコードする遺伝子を含み、他方のベクターは、選択遺伝子を含む）でトランスフェクトされる。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／もしくはシグナル配列（以下で記載）の選択は、過度な実験なく、当業者の範囲内であると考えられる。

上記治療剤は、細胞外、細胞内もしくは膜の位置への送達のために標的化され得る。上記遺伝子産物が上記細胞から分泌されることが望ましい場合、上記発現ベクターは、上記治療用遺伝子産物を上記細胞から細胞外環境へと分泌するための適切な分泌「シグナル」配列を含むように設計される。上記遺伝子産物が上記細胞内に保持されることが望ましい場合、この分泌シグナル配列は省かれる。類似の様式で、上記発現ベクターは、上記治療剤を上記細胞質膜内にアンカーするために「保持」シグナル配列を含むように構築され得る。例えば、全ての膜タンパク質は、疎水性の膜貫通領域を有し、これは、膜におけるタンパク質のトランスロケーションを止めさせ、上記タンパク質が分泌されないようにする。遺伝子産物を特定の位置に標的化するためのシグナル配列を含む発現ベクターの構築は、過度の実験の必要なく、当業者の範囲内であると考えられる。

処置方法
本開示のある種の実施形態は、哺乳動物において疾患を処置するための方法を提供し、上記方法は、タンパク質または本明細書で記載されるとおりのタンパク質をコードするベクターを上記哺乳動物に投与する工程を包含する。

ある種の実施形態において、上記哺乳動物は、ヒトである。

本開示のある種の実施形態は、哺乳動物においてハンチントン病を処置するために有用な医薬を調製するためのタンパク質または本明細書で記載されるとおりのタンパク質をコードするベクターの使用を提供する。

本開示はまた、本明細書で記載されるベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。上記細胞は、ヒトであり得、脳由来であり得る。

本開示のある種の局面は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、および遺伝子操作された細胞（インビボで改変）、およびこれらの使用に関する。特に、本開示は、遺伝子もしくはタンパク質治療のための方法であって、治療剤の治療上有効な用量の両方の全身送達を可能にするものに関する。

一局面によれば、治療剤を哺乳動物レシピエントにおいて発現するための細胞発現系が提供される。上記発現系（本明細書で「遺伝的に改変された細胞」ともいわれる）は、上記治療剤を発現するための細胞および発現ベクターを含む。発現ベクターとしては、ウイルス、プラスミド、および異種遺伝物質を細胞に送達するための他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。よって、用語「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、異種遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクルをいう。特に、上記発現ベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスもしくはレトロウイルスベクターである。

上記発現ベクターは、上記異種遺伝子の転写を制御するためのプロモーターをさらに含む。上記プロモーターは、誘導性プロモーター（以下で記載される）であり得る。上記発現系は、上記哺乳動物レシピエントへの投与に適している。上記発現系は、複数の不死化されていない遺伝的に改変された細胞（各細胞は、少なくとも１種の治療剤をコードする少なくとも１種の組換え遺伝子を含む）を含み得る。

上記細胞発現系は、インビボで形成される。さらに別の局面によれば、哺乳動物レシピエントをインビボで処置するための方法が提供される。上記方法は、異種遺伝子産物を発現するための発現ベクターをインサイチュで、例えば、静脈内投与を介して上記患者の細胞へと導入する工程を包含する。上記発現系をインビボで形成するために、上記治療剤を発現するための発現ベクターは、哺乳動物レシピエントへとインビボで（ｉ．ｖ．で）導入され、ここで上記ベクターは、血管系を介して脳へと移動する。

さらに別の局面によれば、哺乳動物レシピエントをインビボで処置するための方法が提供される。上記方法は、その標的タンパク質を上記患者にインビボで導入する工程を包含する。

上記異種遺伝子を発現するための発現ベクターは、上記異種遺伝子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターを含み得る。よって、上記治療剤のインサイチュでの送達は、上記細胞をインサイチュで上記異種遺伝子の転写を誘発する条件へと曝すことによって制御される。

上記ポリペプチドのうちの１つ（例えば、ＲｈｅｓまたはＲｈｅｂ）の「改変体」は、天然タンパク質に完全には同一でないポリペプチドである。このような改変タンパク質は、１もしくはそれより多くのアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によりアミノ酸配列を変化させることによって得られ得る。上記タンパク質のアミノ酸配列は、天然のポリペプチドと比較して、実質的に同じかもしくは改善された品質を有するポリペプチドを作り出すために、例えば、置換によって改変される。上記置換は、保存された置換であり得る。「保存された置換」は、あるアミノ酸の、類似の側鎖を有する別のアミノ酸での置換である。保存された置換は、アミノ酸の電荷もしくはアミノ酸の側鎖の大きさにおいて（あるいは、側鎖内の化学基の大きさ、電荷もしくは種類において）考えられる最小の変化を作製し、その結果、ペプチド全体がその空間的コンホメーションを保持するが、変化した生物学的活性を有するアミノ酸での置換である。例えば、一般的な保存された変化は、Ａｓｐ→Ｇｌｕ、ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｈｉｓ→Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＰｈｅ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ、およびＳｅｒ→Ｃｙｓ、ＴｈｒもしくはＧｌｙであり得る。アラニンは、他のアミノ酸の代わりにするために一般に使用される。２０個の必須アミノ酸は、以下のようにグループ分けされ得る：非極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；荷電されていない極性側鎖を有するグリシン、セリン、スレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニンおよびヒスチジン。

上記アミノ酸変化は、その相当する核酸配列のコドンを変化させることによって達成される。このようなポリペプチドが、生物学的活性を改変もしくは改善するために、上記ポリペプチド構造の中である種のアミノ酸の代わりに他のアミノ酸で置換することに基づいて得られ得ることは、公知である。例えば、代わりのアミノ酸の置換によって、小さなコンホメーション変化から、増大した活性を生じるポリペプチドが付与され得る。あるいは、ある種のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、他の分子へと連結されて、上記出発ポリペプチドの特性を他の目的に有用であるように十分保持するペプチド−分子結合体を提供し得る残基を提供するために使用され得る。

ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与するにあたって、アミノ酸の疎水性親水性指標が使用され得る。ここである種のアミノ酸は、類似の疽膵壊死親水性指標を有する他のアミノ酸で置換され得、類似の生物学的活性をなお保持し得ることが見出される。あるいは、類似のアミノ酸の置換は、特に、生成される予定のポリペプチドにおいて望ましい生物学的機能が、免疫学的実施形態における使用が意図されている場合に、親水性に基づいて行われ得る。その隣接するアミノ酸の親水性によって左右される場合、「タンパク質」の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性と相関する。よって、置換は、各アミノ酸に割り当てられた親水性に基づいて行われ得ることに注意する。

親水性指標もしくは疎水性親水性指標（これは、各アミノ酸に値を割り当てる）のいずれかを使用するにあたって、これら値が±２であるアミノ酸の置換を行うことが好ましく、±１は特に好ましく、±０．５以内にあるものが最も好ましい置換である。

上記改変タンパク質は、相当する天然のタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも約８０％、もしくはさらに少なくとも約９０％、しかし１００％未満の連続するアミノ酸配列相同性もしくは同一性を有する。

上記改変ポリペプチドのアミノ酸配列は、その天然のポリペプチドのアミノ酸配列に本質的は相当する。本明細書で使用される場合、「〜に本質的に相当する」とは、上記天然のタンパク質によって生成される応答と実質的に同じ生物学的応答を誘発するポリペプチド配列をいう。このような応答は、上記天然のタンパク質によって生成されるレベルのうちの少なくとも６０％であり得、さらには、天然のタンパク質によって生成されるレベルのうちの少なくとも８０％であり得る。

改変体は、その相当する天然のタンパク質に存在しないアミノ酸残基もしくはその相当する天然のタンパク質に対する欠失を含み得る。改変体はまた、その相当する天然のタンパク質と比較して、短縮された「フラグメント」、すなわち、全長タンパク質のうちの一部分のみであり得る。タンパク質改変体はまた、少なくとも１個のＤ−アミノ酸を有するペプチドを含む。

上記改変タンパク質は、上記改変タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列から発現され得る。「組換え」とは、遺伝子操作の目的で生成されるペプチドもしくは核酸として定義される。遺伝コードの縮重に起因して、個々のヌクレオチドは、コドンの中で容易に交換され得、同一のアミノ酸配列をなお生じ得ることは、当該分野で周知であることに注意すべきである。

本開示は、発現ベクターを細胞もしくは患者に投与することによって、哺乳動物において疾患を処置するための方法を提供する。上記遺伝子治療法に関して、分子生物学および遺伝子治療の当業者は、過度の実験なく、本開示の新規方法で使用される発現ベクターの適切な投与量および投与経路を決定し得る。

一実施形態によれば、上記細胞は、形質転換されるか、さもなければインビボで遺伝子改変される。上記哺乳動物レシピエント由来の細胞は、治療剤をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現するために外因性遺伝物質を含むベクターで、インビボで形質転換され（すなわち、形質導入もしくはトランスフェクトされ）、上記治療剤がインサイチュで送達される。

本明細書で使用される場合、「外因性遺伝物質」とは、核酸もしくはオリゴヌクレオチド（天然もしくは合成、すなわち上記細胞には天然では見出されないか；またはそれが上記細胞において天然に見出される場合、上記細胞によって生物学的に有意なレベルで転写もしくは発現されないもののいずれも）をいう。従って、「外因性遺伝物質」は、例えば、アンチセンスＲＮＡへと転写され得る天然に存在しない核酸、ならびに「異種遺伝子」（すなわち、同じタイプの天然に存在する細胞中で発現されないかもしくは生物学的に僅かなレベルで発現されるタンパク質をコードする遺伝子）を含む。

まとめると、用語「治療剤」としては、上記に挙げた条件と関連する薬剤、ならびにそれらの機能的等価物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「機能的等価物」とは、上記哺乳動物レシピエントに対して治療剤と同じもしくは改善された有益な効果を有する分子（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）（これが機能的等価物と考えられる）をいう。

上記で開示される治療剤および遺伝子置換療法に反応しやすい条件は、例証に過ぎず、本開示の範囲を限定するとは解釈されない。公知の条件を処置するための適切な治療剤の選択は、過度の実験なく、当業者の範囲内であるとみなされる。

本発明の薬剤の投与量、製剤および投与経路
本発明の薬剤は、ハンチントン病と関連する少なくとも１つの症状の低下を生じるように投与される。投与される量は、以下が挙げられるが、これらに限定されない種々の要因に依存して変動する：選択された組成物、特定の疾患、哺乳動物の体重、身体的状態、および年齢、ならびに防止または処置が達成されるべきであるか否か。このような要因は、当該分野で周知の動物モデルまたは他の試験系を使用して、臨床医によって容易に決定され得る。

本発明は、本発明の薬剤（例えば、ＲｈｅｓまたはＲｈｅｂ）、発現ベクター、またはウイルス粒子の投与によって、ハンチントン病を処置することを想定する。本発明に従う治療剤の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に公知の他の要因に依存して、連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよいし、一連の間隔を空けた用量であってもよい。局所投与および全身投与の両方が企図される。

本発明の治療剤を有する１もしくはこれより多くの適切な単位投与形態は、以下で考察されるように、持続放出（例えば、微小被包化を使用して）のために必要に応じて製剤化されてもよいし、種々の経路（非経口（静脈内経路および筋肉内経路によるものが挙げられる）が挙げられる）によって、および罹患組織への直接注射によって投与されてもよい。例えば、上記治療剤は、脳へと直接注射され得る。あるいは、上記治療剤は、脳および脊髄の状態のために髄腔内に導入され得る。上記製剤は、適切な場合、別個の単位投与形態において都合良く呈示されてもよく、また製薬では周知の方法のうちのいずれかによって調製されてもよい。このような方法は、上記治療剤と液体キャリア、固体マトリクス、半固体キャリア、微細分割された固体キャリアまたはこれらの組み合わせとを会合した状態にし、次いで、必要であれば、上記生成物を所望の送達系へと導入または成形する工程を含み得る。

本発明の治療剤が投与のために調製される場合、それらは、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と合わせて、薬学的製剤、または単位投与形態を形成し得る。このような製剤中の全活性成分は、上記製剤の０．１〜９９．９重量％を含む。「薬学的に受容可能な」は、上記製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害でないキャリア、希釈剤、賦形剤、および／または塩である。投与のための活性成分は、散剤または顆粒剤として；液剤、懸濁物またはエマルジョンとして呈示され得る。

本発明の治療剤を含む薬学的製剤は、周知のおよび容易に入手可能な成分を使用して、当該分野で公知の手順によって調製され得る。本発明の治療剤はまた、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路による非経口投与に適した液剤として製剤化され得る。

本発明の治療剤の薬学的製剤はまた、水性もしくは無水の液剤もしくは分散物の形態をとってもよいし、または代わりにエマルジョンまたは懸濁物の形態をとってもよい。

従って、上記治療剤は、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による）のために製剤化され得、アンプル、予め充填されたシリンジ、小容積注入容器中に単位用量形態で、または保存剤を添加した複数用量容器で呈示され得る。その活性成分は、油性または水性のビヒクル中の懸濁物、液剤、またはエマルジョンのような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、上記活性成分は、滅菌固体の無菌的単離によってまたは使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）での構成のために溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態にあり得る。

各投与形態の個々のエアロゾル用量の中に含まれる活性成分の単位含有量は、必要な有効量が複数の投与単位の投与によって達成され得るので、特定の適応症または疾患を処置するために有効な量をそれ自体で構成する必要はないことは、認識される。さらに、上記有効量は、その投与形態において、個々にまたは一連の投与のいずれかにおいて、上記用量未満を使用して達成され得る。

本発明の薬学的製剤は、任意選択の成分として、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、可溶化剤または乳化剤、および当該分野で周知のタイプの塩を含み得る。本発明の薬学的製剤において有用なキャリアおよび／または希釈剤の具体的な非限定的例としては、水および生理学的に受容可能な緩衝化生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水溶液ｐＨ７．０〜８．０）および水が挙げられる。

本発明はいまや、以下の非限定的実施例によって例証される。

実施例１
ハンチントン病マウスにおける異常なｍＴＯＲＣ１活性を復元させると、疾患表現型が改善する
ラパマイシンの機械的標的（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（ｍＴＯＲ）は、シグナルを統合して、細胞増殖および代謝を調節するセリン−スレオニンキナーゼである（ＬａｐｌａｎｔｅおよびＳａｂａｔｉｎｉ， ２０１２）。ｍＴＯＲは、２つの異なる複合体、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を形成する。栄養豊富な条件下では、ｍＴＯＲＣ１が活性化され、タンパク質翻訳および細胞増殖を促進する。対照的に、栄養中止すると、ｍＴＯＲＣ１は不活性化され、細胞生存機構としてのマクロオートファジー（以降はオートファジーといわれる）が開始される。ｍＴＯＲＣ１は、ミトコンドリア生合成を正に制御し（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００７）、コレステロール合成を制御することによって脂質ホメオスタシスを調節する（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２０１１；Ｐｏｒｓｔｍａｎｎら、２００８）。さらに、脳では、ｍＴＯＲＣ１は、髄鞘形成、軸索成長、および再生を促進し（Ｋｉｍら、２０１２；Ｐａｒｋら、２００８；Ｓｕｎら、２０１１）、そしてｍＴＯＲＣ１の鍵となる活性化因子である、脳で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）の遺伝的欠失は、皮質の厚みの低下および髄鞘形成の欠損を引き起こす（Ｚｏｕら、２０１１）。

線条体では、Ｒｈｅｓ（線条体で富化されるＲａｓホモログ）は、ｍＴＯＲＣ１の鍵となる活性化因子として働く（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２０１２）。Ｒｈｅｓの遺伝的ノックアウトは、ｍＴＯＲＣ１活性を低下し、Ｌ−ＤＯＰＡ誘発性ジスキネジアへの有害応答を弱める（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２０１２）。さらに、Ｒｈｅｓは、ＳＵＭＯ化（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）、ＨＤ病因論に関わるプロセス（Ｓｔｅｆｆａｎら、２００４）を促進する。インビトロでは、Ｒｈｅｓは、ｍＨＴＴのＳＵＭＯ化を促進して、細胞傷害性を誘発する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）。そしてｓｉＲＮＡで外因的に添加されたＲｈｅｓを低下させると、ｍＨＴＴフラグメントでトランスフェクトした細胞の生存が増大した（ＬｕおよびＰａｌａｃｉｎｏ， ２０１３；Ｓｅｒｅｄｅｎｉｎａら、２０１１）。インビボでは、Ｒｈｅｓの遺伝的除去は、神経毒素誘発性の４つの線条体病変から保護し（Ｍｅａｌｅｒら、２０１３）、Ｒ６／１ ＨＤマウスにおける運動症状の発生を一過性に遅らせる（Ｂａｉａｍｏｎｔｅら、２０１３）。Ｒｈｅｓは線条体において高度に発現される（Ｓｐａｎｏら、２００４）ので、Ｒｈｅｓ−ｍＨＴＴ相互作用がＨＤにおける顕著な線条体の変性の根底にあり得ると提唱されている。

しかし、他のデータは、ＨＤにおけるＲｈｅｓの病原における役割に疑問を投げかける。Ｒｈｅｓレベルは、ＨＤ患者尾状核において低下しており（Ｈｏｄｇｅｓら、２００６）、Ｒ６／１ ＨＤモデルにおけるＲｈｅｓ除去は、脳の変性を防止しない（Ｂａｉａｍｏｎｔｅら、２０１３）。さらに、Ｒｈｅｓ ＫＯマウスは、脳萎縮およびをＨＤマウスにおいて見出されるものに似た行動異常を発生させる（Ｂａｉａｍｏｎｔｅら、２０１３；Ｓｐａｎｏら、２００４）。さらに、Ｒｈｅｓは、ＨＤにおいて十分に確立された保護機構であるオートファジーを促進する（Ｍｅａｌｅｒら、２０１４）。従って、線条体のｍＴＯＲＣ１シグナル伝達を媒介するにあたってＲｈｅｓの極めて重要な機能を考慮して、本発明者らは、ＲｈｅｓおよびｍＴＯＲＣ１活性の付随した喪失がＨＤにおける早期の線条体病理に寄与し、そしてｍＴＯＲＣ１機能を増強すると、ＲｈｅｂまたはＲｈｅｓのアップレギュレーションを通じて、神経保護的になるという仮説を立てた。

この仮説を試験するために、本発明者らは、ＨＤトランスジェニックマウスの成体線条体においてＲｈｅｓおよびｍＴＯＲＣ１活性を急性に調節した。本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性化に伴う有益な効果を見出した（改善されたｍＨＴＴ関連代謝表現型および線条体萎縮の改善が挙げられる）。一致して、インビボでのｍＴＯＲＣ１活性またはＲｈｅｓレベルの回復は、保護的であった。さらに、本発明者らは、Ｒｈｅｓの神経保護的特性が、そのＧＴＰアーゼ活性活性に依存し、これがｍＴＯＲＣ１活性化のために必要とされるが、ＳＵＭＯ化関連活性には無関係であることを示した。まとめると、これらデータは、Ｒｈｅｓ／ｍＴＯＲＣ１活性の障害がＨＤにおける顕著な線条体病因に関連することを示唆し、そしてｍＴＯＲＣ１機能の障害がＨＤにおける複雑な疾患表現型の根底にある基礎的な機構を表し得ることを示唆する。

結果
ｍＴＯＲＣ１活性は、ＨＤの線条体において低下される
本発明者らの仮説の第１の試験として、本発明者らは、ＨＤ脳においてｍＴＯＲＣ１活性を調べた。本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性が、ｍＴＯＲＣ１活性の確立されたマーカーであるリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化（ｐＳ６）の低下によって検出されるように、ＨＤ患者およびＮ１７１−８２Ｑマウスに由来する線条体組織において低下されることを見出した（図１Ａ；図Ｓ１Ａ、Ｂ）。ＨＤマウスにおいて、ｍＴＯＲＣ１活性は、神経学的症状が始まる前に、６週齢で障害される（図１Ｂ）。低下したｍＴＯＲＣ１活性は、ｍＴＯＲ、またはｍＴＯＲ複合体の構成要素（例えば、ＲｉｃｔｏｒおよびＲａｐｔｏｒ）の低下した発現と関連しない（図１Ａ，Ｂ；図Ｓ１Ａ）。本発明者らは次に、線条体ニューロンを形質導入して（図Ｓ２Ａ）（ＭｃＢｒｉｄｅら、２００８）、ｍＴＯＲＣ１の十分に確立された正の調節因子であるＲｈｅｂを発現（ＬａｐｌａｎｔｅおよびＳａｂａｔｉｎｉ， ２０１２）するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作出した。このようにして、本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性化をインビボで急性に増強し得る。本発明者らは、マウス脳においてｍＴＯＲＣ１シグナル伝達を活性化することが以前に示された（Ｋｉｍら、２０１２；Ｚｏｕら、２０１１）構成的に活性なＲｈｅｂ変異体（ｃａＲｈｅｂ；Ｓ１６Ｈ）を使用した。Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体へのＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの片側注射は、注射後３週間で増大したｐＳ６によって示されるように、ｍＴＯＲＣ１活性を顕著に誘発した（図２Ａ）。ＤＡＲＰＰ−３２レベル（中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）におけるドパミンシグナル伝達の基礎的な構成要素）の選択的低下は、ＨＤマウスおよびヒト脳における病理的進行の指標である（Ｂｉｂｂら、２０００；Ｈｏｄｇｅｓら、２００６）。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ形質導入は、対側の注射していない組織と比較して、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体においてＤＡＲＰＰ−３２レベルの３３％増大を促進した（図２Ａ）。さらに、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、増大した場合に、ＨＤモデルにおいてミトコンドリア機能および運動欠陥を改善するミトコンドリア生合成のマスター調節因子である（Ｃｕｉら、２００６；Ｔｓｕｎｅｍｉら、２０１２）、ミトコンドリア転写調節因子、ＰＰＡＲγ共活性化因子１α（ＰＧＣ１−α）の発現をアップレギュレートした（図２Ｂ）。増大したミトコンドリア活性と一致して、活性酸素種無毒化（ＲＯＳ）遺伝子、ＳＯＤ２、ｃｙｔ−ｃ、およびＡＮＴ１のレベルも、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置脳において増大した（図２Ｃ〜Ｆ）。グルタチオンペルオキシダーゼ（ＨＤモデル生物において近年同定された神経保護抗酸化酵素（Ｍａｓｏｎら、２０１３））は、ｃａＲｈｅｂ形質導入後のＨＤ脳において選択的に増大した（図２Ｇ）。改善されたプロフィールは、ウイルス注射の間接的効果またはｍＨＴＴ導入遺伝子のダウンレギュレーションによって説明できなかった；類似の結果を、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ注射した脳をＡＡＶ．ｅＧＦＰ処置脳と比較した場合に得た。そしてｃａＲｈｅｂは、ｍＨＴＴ導入遺伝子発現に影響を及ぼさなかった（図Ｓ２Ｂ〜Ｈ）。本発明者らは次に、インビトロ研究を行い、ｍＴＯＲのＡＴＰ競合インヒビターであるＴｏｒｉｎ１で、拡大した（Ｑ１１１）および通常の（Ｑ７）Ｈｔｔを発現する線条体の細胞（Ｔｒｅｔｔｅｌら、２０００）を処理した。Ｔｏｒｉｎ１は、ラパマイシンによる阻害に抵抗性であるものを含むＴＯＲ機能を強力に阻害する（Ｔｈｏｒｅｅｎら、２００９）。Ｔｏｒｉｎ１処理は、Ｑ７細胞およびＱ１１１細胞においてｐＳ６およびｐ−４Ｅ−ＢＰ１レベル、ならびにＤＡＲＰＰ−３２発現を低下した（図Ｓ３Ａ）。Ｔｏｒｉｎ１はまた、ＰＧＣ１−α、ＰＧＣ１−α調節性遺伝子ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、および調節されたＣＲＥＢ１のトランスデューサー（ＴＯＲＣ１）を抑制した（図Ｓ３Ａ、Ｂ）。まとめると、本発明者らのインビトロおよびインビボでの結果は、ｍＴＯＲＣ１がＷＴおよび変異体ＨＴＴ対立遺伝子の状況において、ＰＧＣ１−αおよびＰＧＣ１−α調節性代謝遺伝子を調節することを示す。

ｍＴＯＲＣ１は、ＨＤ脳において脂質生成遺伝子発現を制御する
本発明者らは次に、ｍＴＯＲＣ１活性の障害が他のＨＤ特異的代謝経路変化の根底にあるか否かを決定した。異常なコレステロール生合成は、ＨＤマウスおよびヒト脳において観察されてきた（ＫａｒａｓｉｎｓｋａおよびＨａｙｄｅｎ、２０１１；ＶａｌｅｎｚａおよびＣａｔｔａｎｅｏ、２０１１）。脂質生合成に必要とされる遺伝子の発現は、ステロール調節性エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の核トランス活性化によって制御される。ｍＨＴＴは、細胞およびＨＤマウスにおいてＳＲＥＢＰの核トランスロケーションを阻害することが報告されている。これは、機能不全のコレステロール合成に寄与し得る（Ｖａｌｅｎｚａら、２００５）。ｍＴＯＲＣ１はまた、ＳＲＥＢＰトランス活性化を調節する（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２０１１；Ｐｏｒｓｔｍａｎｎら、２００８）。ｍＴＯＲＣ１活性の低下がＨＤの状況においてコレステロール合成を変化させるかを決定するために、本発明者らは、培養したＱ７またはＱ１１１線条体細胞にＴｏｒｉｎ１を適用した。Ｔｏｒｉｎ１は、変異体細胞株および正常な細胞株の両方においてＳＲＥＢＰ標的遺伝子ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）（コレステロール合成の律速酵素）およびＨＭＧＣＳ１の発現を低下させた（図３Ａ、Ｂ）。

Ｎ１７１−８２Ｑマウスでは、ＨＭＧＣＲは、コントロールと比較して、ＨＤ患者の脳において見出されたものに類似して（Ｈｏｄｇｅｓら、２００６）、有意に低下した（図３Ｃ）。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、ＨＭＧＣＲレベルを正常にし、そしてまた、ステロール生合成に必要とされる酵素：ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ１（ＨＭＧＣＳ１）、ラノステロール１４α−デメチラーゼ（ＣＹＰ５１）、および７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）の発現を増大させた（図３Ｃ〜Ｆ；図Ｓ３Ｃ〜Ｆ）。本発明者らのインビトロでの知見に類似して、線条体の脂質生成遺伝子発現のｍＴＯＲの調節は、ＨＴＴにおけるポリグルタミン拡大の状態とは無関係である。なぜならＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂはまた、ＷＴ線条体においてもこれらの遺伝子の発現を増大させたからである（図３Ｃ〜３Ｆ）。ＨＭＧＣＲ遺伝子発現の低下は、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて軽度であるが（プリオンプロモーターから発現される導入遺伝子）、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧＣＳ１、ＤＨＣＲ７、およびＣＹＰ５１の低下した発現は、ＨＤヒトおよび他のマウスモデルにおいて観察される（Ｈｏｄｇｅｓら、２００６；Ｖａｌｅｎｚａら、２００５）。まとめると、本発明者らの結果は、ｍＴＯＲＣ１が線条体において脂質生成遺伝子発現を促進することを示し、ｍＴＯＲＣ１活性の障害がＨＤにおける低下した脂質生成遺伝子発現に寄与し得ることを示唆する。

ｍＴＯＲＣ１は、ｍＨＴＴクリアランスに関係する経路を増強する
ｍＴＯＲＣ１活性は、一般に、オートファジー誘導の拮抗と関連するが、オートファジーは、ｍＴＯＲＣ１依存性および非依存性経路を通じて起こり得る。ＨＤに関連して、基底オートファジー活性は、ニューロン生存の維持および凝集物クリアランスの促進にとって極めて重要である（Ｊｅｏｎｇら、２００９；Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、２００４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００６）。よって、本発明者らは次に、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置ＨＤマウス線条体においてオートファジーに対するｍＴＯＲＣ１活性化の効果を試験した。本発明者らは、ＷＴマウスと比較して、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいてオートファゴソーム膜関連タンパク質、ＬＣ３−ＩＩの増大した基底レベルを見出した（図Ｓ４）。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置は、ＬＣ３−ＩＩ（図４Ａ）およびＢｅｃｌｉｎ−１（オートファジー誘導に必須のタンパク質）（図４Ｂ）のレベルを増大させた。増強されたオートファジーとオートファゴリソソーム成熟（ａｕｔｏｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の障害との間を区別するために、電子顕微鏡（ＥＭ）を使用して、一方の大脳半球においてＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂで、または他方の大脳半球においてＡＡＶ．ｅＧＦＰで処置したマウスの脳におけるオートファゴソームおよびオートリソソームの相対数を定量した。オートファゴソーム／オートリソソーム比は、大脳半球間で類似であった一方で、オートファゴソームおよびオートリソソームの両方が、コントロール処置した対側と比較して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置で増大した（図４Ｃ）。このことは、オートファジーが、インビボでの増大したｍＴＯＲＣ１活性の状況において活性化されることを示唆する。本発明者らはまた、コントロール処置した（ＡＡＶ．ｅＧＦＰ）Ｎ１７１−８２Ｑマウス脳が、核小体ストレスによって誘発される線条体病理に類似の表現型（Ｋｒｅｉｎｅｒら、２０１３）である電子密度の高い内質顆粒塊および細胞質オルガネラを枯渇していることに注意した（図４Ｄ）。逆にいえば、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ処置大脳半球における細胞は、富化された電子密度の高い細胞質オルガネラを示した。

近年の研究は、ｍＨＴＴのオートファジー／プロテアソーム分解は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を通じて起こることを示唆する（Ｊｅｏｎｇら、２００９；Ｊｉａら、２０１２；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら、２０１３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００９）。例えば、ＳＵＭＯ Ｅ３リガーゼＰＩＡＳ１は、細胞モデルにおいてｍＨＴＴへのＳＵＭＯ２結合体化を促進することによって、ｍＨＴＴ凝集物形成を増大させ、ｍＨＴＴタンパク質を発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａでのＰＩＡＳ１オルソログの低下は、保護的である（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら、２０１３）。本発明者らは、ＳＵＭＯ２レベルが１４週齢のＮ１７１−８２Ｑマウス線条体において上昇し、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂがＮ１７１−８２ＱマウスおよびＷＴコントロール同腹仔の両方においてＰＩＡＳ１およびＳＵＭＯ２発現を抑制することを見出した（図５Ａ、Ｂ）。本発明者らはまた、ｍＨＴＴ分解を誘発し、プロテアソームおよびリソソームによるクリアランスのためにｍＨＴＴを標的とするキナーゼであるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００９）を調べた。内因性ＩＫＫ関連遺伝子（Ｉｋｂｋｂ、Ｉｋｂｋａｐ、およびＩｋｂｋｅ）は、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体において減少し、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、それらの発現を回復させた（図５Ｃ〜Ｅ）。さらに、ＨＤＡＣ４は、ｍＨＴＴ凝集物形成の重要な調節因子であり、ＨＤＡＣ４の減少は、細胞質凝集物を低下し、ニューロン機能を改善し、ＨＤマウスの寿命を延ばす（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋら、２０１３）。ここで、本発明者らは、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ形質導入が、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体においてＨＤＡＣ４発現を低下することを見出した（図５Ｆ）。ＨＴＴフラグメント含有凝集物は、線条体中で少なくそして一貫していないが、Ｎ１７１−８２Ｑマウスの海馬では堅固に存在した。従って、本発明者らは、海馬での凝集物負荷を試験した。ＡＡＶは、海馬ニューロンを効率よく形質導入し（図Ｓ５）、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ注射動物は、ＡＡＶ．ｅＧＦＰ注射マウスと比較して、ｍＨＴＴクリアランスに関与する遺伝子に対するＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの観察された効果と一致して、有意に減少したｍＨＴＴ凝集物負荷を示した（図５Ｇ）。

増強されたｍＴＯＲＣ１活性は、線条体萎縮をレスキューし、ＨＤマウスにおける運動表現型を改善する
Ｎ１７１−８２Ｑマウスは、保存されたＭＳＮ数とともに著しい線条体萎縮を示す（Ｃｈｅｎｇら、２０１１；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９９９）。ｍＴＯＲＣ１活性が罹患した脳における線条体容積にどのようにして影響を及ぼすかを調べるために、本発明者らは、１１週齢（測定可能な線条体萎縮がある年齢）のＮ１７１−８２Ｑマウスの線条体への片側ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂ注射を行い（Ｃｈｅｎｇら、２０１１）、処置された大脳半球と処置されていない側とを比較した。ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂは、処置されていない対側の大脳半球と比較して、ＭＳＮ細胞サイズおよび線条体容積に正の影響を及ぼした（図６Ａ〜Ｃ）。ｃａＲｈｅｂがｍＴＯＲＣ１を通じて作用することを確認するために、本発明者らは、ＲＡＤ００１（公知のｍＴＯＲＣ１インヒビター（Ｆｏｘら、２０１０））を投与した。ＲＡＤ００１処置は、ｃａＲｈｅｂの形態上の効果を逆転させ、Ｓ６リン酸化を弱めた（図６Ａ〜６Ｃ；図Ｓ６Ａ、Ｂ）。さらに、本発明者らは、ｃａＲｈｅｂの非存在下での２週間のＲＡＤ００１処置が、Ｎ１７１−８２ＱマウスにおいてＭＳＮ萎縮の軽度ではあるが、有意な増悪を引き起こすことを見出した（図６Ａ、Ｂ）。これら結果は、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂがＭＳＮ増殖を促進するか、またはＭＳＮサイズを、ｍＴＯＲＣ１経路を通じて保存し、そしてインビボでのｍＴＯＲＣ１の障害がこの表現型を増悪させることを示唆する。

線条体のドパミン回路構成の障害は、ＨＤマウスにおいて運動症状と関連する（Ｂｉｂｂら、２０００；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００６）。従って、ドパミン経路に対するＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂの機能的影響を決定するために、本発明者らは、Ｎ１７１−８２Ｑマウスに片側注射し、アンフェタミン誘発性回転試験に上記マウスを供した。アンフェタミンは、ドパミン放出の引き金を引き、他方の大脳半球に対して一方の大脳半球において不均衡なドパミンシグナル伝達が存在する場合、マウスにおいて回転行動を誘発する。このために、本発明者らは、 ｍＨＴＴを発現するＡＡＶ（ＡＡＶ．ｍＨＴＴ）を、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂまたはコントロールウイルス（ＡＡＶ．ｅＧＦＰ）のいずれかとともに６週齢のＷＴマウスへと共注射した。ＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ＡＡＶ．ｅＧＦＰの片側注射は、ｍＨＴＴ毒性の徴候である注射した側へ向かう同側性回転を引き起こした（図６Ｄ）。対照的に、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂとＡＡＶ．ｍＨＴＴとの共注射は、同側性回転を誘発せず、代わりにマウスは、対側の回転を示した（図６Ｄ）。行動結果と一致して、ＡＡＶ．ｍＨＴＴ／ｅＧＦＰの注射は、処置されていない対側の線条体と比較してＭＳＮ萎縮を引き起こしたのに対して、ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂとＡＡＶ．ｍＨＴＴとの共注射は、ＭＳＮ萎縮を防止した（図６Ｅ）。従って、ｍＴＯＲＣ１活性の増強は、ｍＨＴＴ駆動性ニューロン萎縮およびドパミン経路障害に有益である。

Ｒｈｅｓ（線条体富化ｍＴＯＲ活性化因子）の外因性添加は、ＨＤトランスジェニックマウスにおけるｍＨＴＴ関連疾患表現型をレスキューする
線条体において、ｍＴＯＲは、線条体富化ＧＴＰアーゼタンパク質、Ｒｈｅｓによって主に調節される（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２０１２）。以前のインビトロ研究は、ＨＤにおいてＲｈｅｓの毒性の役割を暗示する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）が、そのインビボでの疾患関連性は不明である。本発明者らは、ＲｈｅｓレベルがＨＤヒトおよびマウス線条体において低下することを見出した（図７ＡおよびＳ７Ａ）。Ｒｈｅｂレベルは、低下しない（図Ｓ７Ｂ）。顕著なことには、Ｒｈｅｓは、神経学的症状の発生の前に有意に低下する；６週齢のＮ１７１−８２Ｑマウスは、臨床症状が１２〜１４週齢まで明らかでないとしても、野生型Ｒｈｅｓレベルの７３％を有する（図７ＡおよびＳ７Ｃ）。従って、本発明者らは、Ｒｈｅｓレベルの増強が、疾患表現型にどのように影響を及ぼすかを調べた。ｍＨＴＴのＮ末端フラグメントは、Ｒｈｅｓと相互作用し、インビトロで細胞傷害性を付与することが以前に示されたので、Ｎ１７１−８２Ｑモデルは、この疑問をインビボで試験するには理想的である（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）。ＲｈｅｓがＨＤ毒性の極めて重要な媒介因子である場合、Ｎ１７１−８２Ｑマウス線条体におけるＲｈｅｓの急性の過剰発現は、疾患表現型を増悪させると予測される。Ｒｈｅｓを発現するＡＡＶ（ＡＡＶ．Ｒｈｅｓ）を、７週齢のＮ１７１−８２ＱマウスおよびＷＴ同腹仔に注射した。以前のインビトロ研究から予測されたこととは対照的ではあるが、ＲｈｅｂによるｍＴＯＲＣ１活性化に関する本発明者らの知見と一致して、Ｒｈｅｓ過剰発現は、生理食塩水処置した疾患同腹仔と比較して、１４週齢および１８週齢においてロータロッド試験によって決定される場合、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて運動機能を改善した（図７Ｂ）。さらに、片側注射の後、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓは、コントロール処置した対側の大脳半球と比較して、ＭＳＮ細胞サイズを有意に増大させた（図７Ｃ）。Ｒｈｅｂに類似して、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓは、ミトコンドリア転写調節因子、ＰＧＣ１−αの発現をアップレギュレートした（図７Ｄ）．

細胞ベースのアッセイでは、Ｒｈｅｓは、ｍＨＴＴのＳＵＭＯ化を促進することによって、ｍＨＴＴ毒性を増強する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）。Ｒｈｅｓのインビボで観察される疾患改変効果がｍＴＯＲＣ１またはＳＵＭＯ化経路を介しているか否かを突き止めるために、本発明者らは、ＲｈｅｓＳ３３Ｎ（ＧＴＰアーゼ活性を破壊したＲｈｅｓ変異体）を発現するＡＡＶ（ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ）を生成したところ、ｍＴＯＲＣ１活性化を低下させたが、ＳＵＭＯ化調節活性はインタクトであった（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２０１２；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）。線条体注射後、ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ処置Ｎ１７１−８２Ｑマウスは、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓを注射したＮ１７１−８２Ｑマウスと比較して、低下したｍＴＯＲＣ１活性を示した（図Ｓ８）。ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎは、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて運動欠陥を改変できず、これは、コントロール処置したＮ１７１−８２Ｑマウスと同様に機能した（図７Ｂ）。顕著なことには、Ｒｈｅｓ Ｓ３３Ｎは、以前のインビトロでの観察（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）に基づいて推測されるとおり、さらなる行動増悪を引き起こさない。まとめると、これらデータは、ＲｈｅｓがｍＴＯＲＣ１活性化を介してＨＤ行動欠陥を部分的にレスキューすることを示唆する。

考察
累積的に、本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性の障害がＨＤと関連する種々の表現型変化の上流にあり、代謝および変性的な表現型の根底にあり得ることを示す。本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性化がＨＤマウスにおいてエネルギー代謝、オートファジー、および線条体の細胞機能を促進したことを見出している。ｍＴＯＲＣ１の神経保護的な役割と一致して、本発明者らは、Ｒｈｅｓ（線条体富化ｍＴＯＲ活性化因子）が神経学的症状の発生の前にＨＤ脳において減少し、そして外因的なＲｈｅｓ添加がＨＤマウスにおいて運動欠陥および脳病理を緩和することを見出している。顕著なことには、症候性ＨＤマウスにおいて線条体の細胞増殖および機能を促進する能力は、ｍＨＴＴ負荷（ｍＨＴＴ−ｌａｄｅｎ）ニューロンには可塑性があるという概念（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０００）を裏付け、ｍＴＯＲＣ１活性化を介する疾患発生の後に、線条体萎縮を改善する（ｒｅｖｅｒｔ）という可能性を強調する。ｍＨＴＴは、Ｒｈｅｓ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）およびｍＴＯＲ（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、２００４）を結合する傾向が増大しているので、ｍＨＴＴによるＲｈｅｓおよびｍＴＯＲ機能の付随した喪失は、ＨＤにおける早期の変性に対して線条体をより脆弱にし得ることは可能である（図８）。線条体容積がＨＤ患者における疾患進行の強力な予測変数である（Ｔａｂｒｉｚｉら、２０１３）ことを考慮すると、線条体のｍＴＯＲＣ１活性を正常なレベルへと回復させる治療は、疾患を緩和し得る。ｍＨＴＴがエネルギー生成に干渉する鍵となる疾患機構は、ＰＧＣ−１α活性の抑制であり、その発現は、ヒト尾状核およびＨＤトランスジェニックマウス線条体において低下している（Ｃｕｉら、２００６；Ｈｏｄｇｅｓら、２００６；Ｔｓｕｎｅｍｉら、２０１２）。低下したＰＧＣ−１αレベルはまた、ＨＤ脳を酸化的ストレスに対して感作し得る。なぜならＰＧＣ−１α ＫＯマウスにおけるドパミン作動性ニューロンは、ＭＰＴＰ媒介性酸化的損傷に対して脆弱であるからである（Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅら、２００６）。脳ＰＧＣ−１α発現の回復は、Ｒ６／２ ＨＤマウスにおける線条体萎縮を改善し（Ｃｕｉら、２００６）、Ｎ１７１−８２ＱおよびＲ６／２ ＨＤマウスモデルにおける運動表現型を改善する（Ｃｕｉら、２００６；ＴｓｕｎｅｍｉおよびＬａ Ｓｐａｄａ， ２０１１）。ｍＴＯＲがＨＤマウス脳におけるＰＧＣ−１α活性に正の調節因子であるという本発明者らの知見は、ＰＧＣ−１α活性を増強するための治療標的およびＰＧＣ−１α活性が障害され得る潜在的機構を提供する。

一見したところでは、これらデータは、ｍＴＯＲＣ１阻害が保護的であることを示すＨＤ分野における従来の見方（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、２００４；Ｒｏｓｃｉｃら、２０１１）に矛盾するようであり得る。ラパマイシンの全身送達によるｍＴＯＲＣ１の阻害は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＮ１７１−８２Ｑ ＨＤマウスにおける疾患表現型を弱める（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、２００４）。しかし、ラパマイシンによって誘発される行動改善が、脳におけるｍＴＯＲＣ１阻害よりむしろ骨格筋に対して有益な影響を示し得ることは、考えられる。これと一致して、ラパマイシンで処置したＲ６／２ ＨＤマウスでは、ロータロッド改善は一過性であり、促進された体重減少および高められた脳萎縮と関連した（Ｆｏｘら、２０１０）。興味深いことに、ｍＴＯＲＣ１活性は、Ｒ６／２マウス骨格筋において異常に上昇する（Ｓｈｅら、２０１１）。本発明者らのデータと一緒にすると、これらの知見は、バランスのとれたｍＴＯＲＣ１活性の回復が極めて重要であるという概念を裏付けかつｍＴＯＲ活性に対するｍＨＴＴの組織特異的効果が存在し得る；骨格筋とは異なり、脳のｍＴＯＲＣ１活性は、ＨＤにおいて既に障害されている、という興味深い点を提起する。

ｍＴＯＲＣ１増強が神経保護的であるという知見はまた、ＨＤモデルにおいて治療的であることが示された種々の薬剤の役割を裏付ける先の研究の機械論的基礎を提供する。例えば、ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢシグナル伝達の回復は、いくつかの前臨床的ＨＤモデルにおいて十分に確立された神経保護効果を有する（Ｊｉａｎｇら、２０１３；Ｓｉｍｍｏｎｓら、２０１３；Ｘｉｅら、２０１０；Ｚｕｃｃａｔｏら、２００１）。このシグナル伝達カスケードの生理学的帰結は、ｍＴＯＲＣ１活性化である（Ｔｒｏｃａ−Ｍａｒｉｎら、２０１１；Ｚｈｏｕら、２０１０）。さらに、ＲＮＡｉスクリーニングは、細胞およびｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＨＤモデルにおいて強力な疾患改変因子としてＬｋｂ−１を同定した（Ｓｃｈｕｌｔｅら、２０１１）。Ｌｋｂ−１は、ｍＴＯＲＣ１を負に調節する腫瘍抑制因子である（Ｓｈａｗら、２００４）。Ｌｋｂ−１の抑制は、一次ニューロンにおけるｍＨＴＴ誘発性の神経突起成長の形成異常を改善し、ｍＨＴＴ対立遺伝子を発現するｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、致死性および神経変性表現型をレスキューした（Ｓｃｈｕｌｔｅら、２０１１）。まとめると、これら結果は、再度ｍＴＯＲＣ１活性のバランスをとることが、ＨＤにおいて有益であるという本発明者らの見方と一致する。

オートファジーは、細胞ホメオスタシスおよびタンパク質クリアランスにとって必須である（ＷｏｎｇおよびＣｕｅｒｖｏ， ２０１０）。本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１活性化がＨＤマウス脳においてオートファジー活性を刺激し、ｍＨＴＴ変性の促進に関わる遺伝子（ＰＩＡＳ１、ＳＵＭＯ２、ＩＫＫ、およびＨＤＡＣ４）の発現を変化させることを見出している。これら結果は驚くべきことであり得る。なぜならｍＴＯＲＣ１は、オートファジーに対して阻害性であると一般に見做されているからである。しかし、近年の証拠は、オートファジーがｍＴＯＲ刺激条件下で起こり得（Ｎａｒｉｔａら、２０１１）、そして長期の飢餓条件下では、ｍＴＯＲの再活性化は、リソソームの形成を促進することを示し、これらは持続したオートファジーに必要とされる（Ｙｕら、２０１０）。本発明者らは、増強された基底オートファジーまたは品質管理オートファジーが、細胞増殖および代謝活性に対する必須の応答であり、飢餓誘発性オートファジーとは異なり、ｍＴＯＲＣ１活性化と一致すると推測している。ｍＴＯＲＣ１がオートファジーを誘発する正確な機構は不明であるが、本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１増強がｂｅｃｌｉｎ１レベル（オートファジー小胞核形成に関与する必須構成要素）を増大することを見出した。興味深いことに、ｂｅｃｌｉｎ １の過剰発現は、ｍＨＴＴ凝集物のオートファジークリアランスを誘発する（Ｓｈｏｊｉ−Ｋａｗａｔａら、２０１３）。さらに、本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１がＩＫＫ（ｍＨＴＴ変性を促進する公知のオートファジー誘発因子）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００９）の発現をアップレギュレートすることを見出している。さらに、ＩＧＦ１／Ａｋｔシグナル伝達の刺激（これは、翻って、ｍＴＯＲＣ１を活性化する）は、ｍＨＴＴリン酸化を誘発し、ｍＨＴＴ変性を標的とする（Ｈｕｍｂｅｒｔら、２００２；Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００６）。累積して、上記データは、ｍＨＴＴ変性の多様な機構が相互に関係し、ｍＴＯＲＣ１活性によって制御されることを示す。

線条体富化タンパク質、Ｒｈｅｓは、ｍＨＴＴのＳＵＭＯ化を促進することによって線条体変性を引き起こすと提唱されている；ＳＵＭＯ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｒｈｅｓ媒介性細胞障害性をインビトロで破壊する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）。Ｒｈｅｓの潜在的な毒性の役割とは対照的に、本発明者らは、Ｒｈｅｓ添加がＨＤマウスにおいて神経病理的および運動表現型を改善し、Ｒｈｅｓのこの神経保護的特性がそのＧＴＰアーゼ活性を要することを見出している。これは、インビトロ条件とは対照的であり、ここではＲｈｅｓのＧＴＰアーゼ活性は、ｍＨＴＴ媒介性細胞傷害性と関わらない。興味深いことに、本発明者らは、Ｒｈｅｓレベルのインビボでの低下は、ＨＤマウス線条体においてＳＵＭＯ１の代償的アップレギュレーションを引き起こすことを見出している（データは示さず）。これは、ＳＵＭＯ１およびＳＵＭＯ２改変タンパク質が、死後のＨＤヒト脳において蓄積しているという観察（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら、２０１３）と一致している。さらに、ＧＴＰアーゼ欠損であるが、ＳＵＭＯ化はインタクトなＲｈｅｓ変異体を過剰発現すると、以前のインビトロでの結果に基づいて推定されるとおり（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、２００９）、Ｎ１７１−８２Ｑマウスにおいて運動表現型が増悪しない。これは、ＭＳＮ毒性のインビボ調節因子が、単離された培養系でのものとは異なることを暗示する。

Ｒｈｅｓの細胞保護的役割と一致して、本発明者らは、ＲｈｅｓのｓｉＲＮＡノックダウンがトランスジェニックＨＤマウスにおいて線条体萎縮および行動表現型を増悪させることを近年報告した（Ｌｅｅら、２０１４）、他方で、他の研究は、Ｒｈｅｓ ＫＯマウスとＲ６／１マウスとを交配すると、ロータロッド欠陥が遅れることが示された（Ｂａｉａｍｏｎｔｅら、２０１３）。しかし、Ｒｈｅｓの遺伝的欠失は、Ｒ６／１マウスにおいて線条体萎縮を防止しない；そしてＲｈｅｓ ＫＯマウスは、ＨＤマウスに類似する重度の脳変性を示す（Ｂａｉａｍｏｎｔｅら、２０１３）。さらに、Ｒｈｅｓレベルは、ＨＤ患者およびＨＤマウスモデル線条体において低下しており、症候性のＨＤ患者は、影響を受けていない個体と比較して、線条体のＲｈｅｓの著しい８３％低下を示している（図７Ａ）。Ｒｈｅｓは、オートファジーを促進し（Ｍｅａｌｅｒら、２０１４）、細胞内鉄ホメオスタシスを調節する（Ｃｈｏｉら、２０１３）ことが近年示された。従って、Ｒｈｅｓを低下させるよりむしろ回復させることは、ＨＤ脳において有益であり得る。

ｍＴＯＲＣ１活性を正常にするとＨＤ表現型が改善されるという知見は、調節解除されたｍＴＯＲ活性を有する神経学的疾患の広い治療上の意義を有し得る。例えば、神経発生的障害（例えば、脆弱Ｘ精神遅滞および自閉症）は、一般に、機能亢進ｍＴＯＲＣ１活性と関連する；これらの状態におけるｍＴＯＲＣ１の抑制は、疾患表現型を改善する（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、２０１２；Ｔｓａｉら、２０１２）。対照的に、ニューロンのｍＴＯＲＣ１活性が低下する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合には、ｍＴＯＲＣ１の刺激は、変性プロセスを妨げる（Ｓａｘｅｎａら、２０１３）。従って、ｍＴＯＲＣ１機能のホメオスタシスレベルを回復させることは、神経学的疾患に広く有益であり得る。

まとめると、本発明者らの研究は、ｍＴＯＲＣ１経路に集中する、ＨＤにおける複雑な病理表現型の相互接続性への新たな洞察を提供する。そして、他の神経変性疾患分野での以前の研究と一緒に、ｍＴＯＲＣ１活性化の程度が治療有用性に関して注意深く制御されなければならないという観察が強調される。脳におけるｍＨＴＴの発現の低下は、ＨＤの状況においてｍＴＯＲＣ１活性をレスキューする直接的方法である一方で、ｍＴＯＲＣ１活性のバランスを再度とることは、治療的に有益であり得る。

実験手順
動物。全ての動物プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｎ１７１−８２Ｑマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から得、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／Ｊバックグラウンドに対して維持した。マウスを、変異体ヒトＨＴＴ導入遺伝子に特異的なプライマーを使用して遺伝子型決定し、ヘミ接合性および年齢を合わせた野生型同腹仔を、示された実験のために使用した。マウスを、１２時間の明／暗サイクルで制御された温度環境において飼育した。飼料および水は、自由に与えた。薬理学研究に関しては、ＲＡＤ００１を、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得、２％ ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍｌへと希釈し、−２０℃で貯蔵した。新たに解凍したビヒクルおよびＲＡＤ００１（３０μｍｏｌ／ｋｇ）を、以前に記載されたように（Ｆｏｘら、２０１０）、２週間にわたって胃管栄養法により１週間に３回与えた（月曜日、水曜日、および金曜日）。マウスを最後の用量の２４時間後に屠殺した。

プラスミドおよびＡＡＶ
ＡＡＶベクター血清タイプ１（ＡＡＶ２／１）を、この研究に使用した。ＲｈｅｓおよびＲｈｅｂのｃＤＮＡ配列を、マウス線条体ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。Ｆｌａｇエピトープを、ウェスタンブロット検出のためにＰＣＲによって３’末端に組み込んだ。ＧＴＰアーゼ不活性Ｒｈｅｓ変異体（ＲｈｅｓＳ３３Ｎ）および機能亢進Ｒｈｅｂ変異体（ｃａＲｈｅｂ；Ｓ１６Ｈ）を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指向性変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって生成した。変異誘発用のプライマーを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）に基づいて設計した。Ｒｈｅｓ、ＲｈｅｓＳ３３Ｎ、およびｃａＲｈｅｂ配列を、ＡＡＶ発現ベクターへとニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下でクローニングした。ＡＡＶ．ＲｈｅｓおよびＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎベクターはまた、ＩＲＥＳ配列の制御下で増強型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現する。さらに、Ｎ末端ｍｙｃタグ付きＮ１７１−８２Ｑ配列を、ｐＣＭＶＨＤ−Ｎ１７１−８２Ｑプラスミド（Ｈａｒｐｅｒら、２００５）からＰＣＲ増幅し、同じＡＡＶ発現ベクターへとクローニングして、ＡＡＶ．ｍＨＴＴを生成した。全てのＡＡＶは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅが生成した。上記ＡＡＶ力価を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した（Ｒｈｅｓ：３×１０^１２ ウイルスゲノム／ｍｌ、ＲｈｅｓＳ３３Ｎ：３×１０^１２ ウイルスゲノム／ｍｌ、ｃａＲｈｅｂ：３×１０^１２ ウイルスゲノム／ｍｌ、ｅＧＦＰ：３×１０^１２ ウイルスゲノム／ｍｌ、およびｍＨＴＴ（Ｎ１７１−８２Ｑ）：３×１０^１２ ウイルスゲノム／ｍｌ）。

注射
線条体に使用される定位座標は、ブレグマに対して０．８６ｍｍ吻側、正中に対して±１．８ｍｍ外側、頭蓋表面に対して３．５ｍｍ腹側である。Ｎ１７１−８２ＱマウスおよびＷＴ同腹仔に、７週齢において、ＡＡＶ．Ｒｈｅｓ、ＡＡＶ．ＲｈｅｓＳ３３Ｎ、または生理食塩水を注射した。全ての行動研究に関して、マウスには、５μｌのＡＡＶを両側に注射した。片側注射研究に関しては、ＡＡＶの５μｌ注射を使用した。海馬に使用した定位座標は、ブレグマに対してＡＰ：−２．０ｍｍ、ＭＬ：＋１．５ｍｍ、ＤＶ：−２．３ｍｍである；マウスに、１μｌのＡＡＶを片側に注射した。ＷＴマウスでのアンフェタミン誘発性回転試験に関しては、３μｌ ＡＡＶ．ｍＨＴＴを、２μｌ ＡＡＶ．ｃａＲｈｅｂまたは２μｌ ＡＡＶ．ｅＧＦＰのいずれかとともに線条体へと共注射した。全ての研究に関する注射速度は、０．２μｌ／分であった。標準的な承認された方法（Ｈａｒｐｅｒら、２００５；ＭｃＢｒｉｄｅら、２００８）を使用してマウスを示された年齢で屠殺した。

細胞培養およびトランスフェクション
全長ＨＴＴを有する変異体（Ｑ１１１）およびＷＴ（Ｑ７）線条体細胞（Ｔｒｅｔｔｅｌら、２０００）は、Ｍａｒｃｙ ＭａｃＤｏｎａｌｄ博士の厚意によりから提供された。このＱ７細胞およびＱ１１１細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）（１０％ ウシ胎仔血清、１％ 非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ジェネティシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を補充した）中で３７℃において増殖させた。ｍＴＯＲ阻害研究に関しては、細胞を、ＤＭＳＯまたは２５０ｎＭ Ｔｏｒｉｎ１（Ｔｏｃｒｉｓ， Ｂｒｉｓｔｏｌ， ＵＫ）で２４時間処理した。

マウス脳単離
組織学分析において使用したマウスを、ケタミン／キシラジンミックスで麻酔し、２０ｍｌの０．９％ 冷生理食塩水で、続いて、２０ｍｌの、０．１Ｍ ＰＯ４緩衝液中の４％ パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、一晩後固定し、４０μｍ厚の切片を集めた。分子分析に使用したマウスを、２０ｍｌの０．９％ 冷生理食塩水で灌流し、脳を取り出し、１ｍｍ厚冠状面スライスへとブロックにした。線条体の組織パンチを、組織コアラー（直径１．４ｍｍ）を使用して採取した。組織パンチを、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。

免疫組織化学および定量
浮いている４０μｍの冠状面脳切片を、中型有棘ニューロンまたはｍＨＴＴ凝集物の免疫組織化学染色のためにビオチン標識抗体を使用して加工処理した。切片を、５％ 通常ヤギ血清中で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体（ＤＡＲＰＰ−３２、１：２００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに一晩インキュベートし、洗浄した。ｍＨＴＴ凝集物を、ｅｍ４８抗体（１：２００、ｍＥＭ４８；Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＸ．Ｊ．Ｌｉから贈られた）で免疫染色した。Ｓ６リン酸化を、ホスホ−Ｓ６抗体（Ｓ２３５／２３６、１：３００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で検出した。切片を、ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスビオチン化ＩｇＧ二次抗体（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１時間、室温においてインキュベートし、次いで、アビジン−ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）で処理した。全ての手順において、一次抗体を削除したものをコントロールとして供した。染色した切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）に載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０光学顕微鏡およびＤＰ７０カメラを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）で画像を取り込んだ。各脳については、４つの代表的切片を選択し、７０ ＤＡＲＰＰ−３２陽性中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の面積を、各大脳半球から４０×対物レンズの下で、手作業で追跡した。ＤＡＲＰＰ−３２陽性ＭＳＮの面積を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ２− ＢＳＷソフトウェア（バージョン２．１）で定量した。同側の注射した側の平均ＭＳＮ面積を、対側のコントロール側と比較し、平均＋ＳＥＭとして表した。ＥＭ４８陽性含有物は、処置群に関して盲検にされた実験者が計数した。

立体解析学
線条体容積を、ポイント計測法とカヴァリエリ容積推定量とを使用して計算した（ＭｉｃｈｅｌおよびＣｒｕｚ−Ｏｒｉｖｅ， １９８８）。簡潔には、ＤＡＲＰＰ−３２染色した冠状面切片（４０μｍ厚）の画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０光学顕微鏡およびＤＰ７０カメラを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）で取り込んだ。グリッドパターン付きのアセテートシートを、ランダムな角度でその画像の上に置き、線条体の上を覆っているグリッドの交点の数を計測した。４８０μｍ間隔を置いた一連の切片のランダムな体系的セットを使用した。最低２００個の点を、５つの切片にわたって計数した。左および右の線条体の容積を、式、容積（対象）＝ΣＰ（対象）×ｔ×ａ（ｐ）（ここでΣＰ（対象）＝線条体の上を覆っている点の合計、ｔ＝切片間の距離、およびＡｐ＝面積／点）を使用することによって、点の数から同じ切片上で独立して決定した。

電子顕微鏡
マウスに麻酔し、生理食塩水溶液、続いて、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中２．５％ グルタルアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、２．５％ グルタルアルデヒド、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中で２４時間、後固定した。１００μｍ冠状面切片をビブラトームで切り出し、０．１Ｍ カコジレート中の１％ ＯｓＯ４で１時間固定し、１％ 酢酸ウラニルで染色し、脱水し、Ｅｐｏｎａｔｅ ８１２の中に包埋した。半薄１μｍ トルイジンブルー染色切片を、光学顕微鏡下で検鏡して、線条体を同定した。線条体の超薄切片（８０ｎｍ）を、ＪＥＯＬ ＥＸ １２００透過型電子顕微鏡で検鏡した。

ウェスタンブロット分析
マウス線条体を採取し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４５０界面活性剤、０．１％ ＳＤＳ界面活性剤、０．５％ デオキシコール酸、および１ｍＭ β−メルカプトエタノールとプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびホスファターゼインヒビター（ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とを含むＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。組織を、氷上でホモジナイズし、１４，０００ｇで２０分間スピンさせた。上清を分析に使用した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）によって決定し、タンパク質のうちの２０〜３０μｇを還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって４％〜１０％ アクリルアミドゲルで分離し、０．２μｍ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）に転写した。使用した一次抗体は以下のとおりであった：ＤＡＲＰＰ−３２（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：５０００）、Ｓ６（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ホスホ−Ｓ６（Ｓ２３５／２３６、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、４ＥＢＰ１（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ホスホ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔ３７／４６、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｍＴＯＲ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒｉｃｔｏｒ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒａｐｔｏｒ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＲＥＢ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＴＯＲＣ１（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＧＣ１−α（１：１０００、ａｂｃａｍ）、ＬＣ３（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、およびＢｅｃｌｉｎ１（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。使用した二次抗体は、ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧおよびＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であった。ブロットを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ， ＰＡ）を使用して発光（ｄｅｖｅｌｏｐ）させ、次いで、フィルムに曝した。タンパク質定量を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアまたはＶｅｒｓａＤｏｃＴＭ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｒ分析ソフトウェアを使用して行った。バンド密度を、同じサンプルおよびレーンのハウスキーピング（β−アクチン）バンドに対して正規化した。

脳サンプル
ヒト剖検脳組織の冠状面切片を、影響を受けていない個体およびＶｏｎｓａｔｔｅｌグレード２、３および４のＨＤを有する患者から得た（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｒｏｓｓ博士、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ ａｔ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｔａｕｂ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。組織を、１３〜４９時間の範囲に及ぶ死後間隔（ＰＭＩ）で急速凍結した。尾状核／被殻を、氷冷金属ステージに置いた凍結組織から切開し、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびホスファターゼインヒビター（ＰｈｏｓＳＴＯＰ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズした。溶解物を、１４，０００ｇで２０分間スピンさせた。その上清をウェスタンブロット分析のために集めた。さらなる凍結組織を、ＴＲＩｚｏｌを使用して、ＲＮＡ抽出のために加工処理した。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＲＮＡを、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌを使用して、線条体パンチから単離した。ランダムにプライムした第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を、製造業者のプロトコルに従って、５００ｎｇの総ＲＮＡを使用して行った（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）。リアルタイムＰＣＲを、配列検出システム（Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳＹＢＲ緑色ＰＣＲミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＴａｑＭａｎ ２× Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。以下のＴａｑｍａｎプライマー／プローブセットを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから得た：Ｒｈｅｓ（Ｍｍ０４２０９１７２＿ｍ１およびＨｓ０４１８８０９１＿ｍＨ）、ＰＧＣ１−α（Ｍｍ０１２０８８３５＿ｍ１）、およびＨＭＧＣＳ１（Ｍｍ０１３０４５６９＿ｍ１）、およびＨＤＡＣ４（Ｍｍ０１２９９５５７＿ｍ１）。ＳＹＢＲ緑色ＲＴ ＰＣＲのためのこれらプライマー配列は、要求に応じて入手可能である。相対的遺伝子発現を、β−アクチンに対して正規化するΔΔＣＴ法を使用して決定した。

行動試験
アンフェタミン誘発性回転アッセイ
マウスに、腹腔内アンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）を注射し、次いで、四角のプラスチック製活動チャンバ（５０×５０ｃｍ）の中央に個々に置いた。マウスを、２０分間このチャンバの中で慣れさせ、その後、アンフェタミン誘発を行った。次いで、天井に設置したビデオカメラによって回転行動を４０分間記録した。正味の回転を、４０分区切りで、同側まわりの回数−対側まわりの回数として表した。

加速型ロータロッド
雄性Ｎ１７１−８２Ｑマウスを、６週齢、そして次に、１０週齢、１４週齢、および１８週齢においてベースライン運動機能について試験した。各試験の前に、マウスをまず、ロータロッドの上で４分間慣らし、１時間休ませた。試験を４連続日にわたって１日あたり３回試行して行った（試行間の休憩は３０分間）。各試行に関して、マウスを、４分間かけて１分間あたり４〜４０回転まで加速するロッド上に置き、次いで、４０ｒｐｍにおいて速度を維持した。落下までの潜時（またはマウスが走ることなく２連続回転の間にしがみついていれば）、運動性能の点数付けとして使用した。試行を、３００秒で停止し、その時点でロータロッド上に残っているマウスを、３００秒と記録した。各日に各群について３回の試行からのデータを、平均±ＳＥＭとして示す。マウスを常に、明／暗サイクルの暗相において試験した。全ての行動実験を、マウス遺伝子型および処置について盲検にされた実験者で行った。

統計分析
データを、スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後検定分析を使用して分析して、個々の群間の有意差を評価した。全ての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｃを使用して行った。データは、平均±ＳＥＭとして表される。全ての場合において、Ｐ＜０．０５を有意と見做した。

全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に参考として援用される。前述の詳細において、本発明は、そのある種の好ましい実施形態に関連して記載され、多くの詳細が例証目的で示されてきた一方で、本発明がさらなる実施形態を許容し、ある種の本明細書で記載される詳細は、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変動し得ることは、当業者に明らかである。

本発明を記載する状況において用語「ａ（ある、１つの）」および「ａｎ（ある、１つの）」および「ｔｈｅ（上記、その、この）」および類似の指示物は、本明細書で別段示されなければ、もしくは状況が明らかに矛盾していなければ、単数形および複数形両方を網羅すると解釈されるべきである。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む、包含する）」、および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」は、別段示されなければ、開放系の用語（すなわち、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（〜が挙げられるが、これらに限定されない）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書で別段示されなければ、上記範囲内に入る各別個の値に対して個々に言及するための略記法として働くことが意図されるに過ぎず、各別個の値は、これらが個々に本明細書で記載されているかのように、本明細書に援用される。本明細書で記載される全ての方法は、本明細書で別段示されなければ、もしくは状況が別段明示的に矛盾しなければ、任意の適切な順序で行われ得る。任意のおよび全ての例、または本明細書で提供される例示的表現（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ（〜のような、例えば）」）の使用は、本発明をよりよく例証することが意図されているに過ぎず、別段特許請求されなければ、本発明の範囲に対する限定を与えない。本明細書中の表現は、どの特許請求されない要素をも本発明の実施に不可欠なものとして示すとは解釈されないものとする。

本発明の実施形態が、本発明を実施するために本発明者らに公知の最良の態様を含め、本明細書で記載される。それら実施形態のバリエーションは、前述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が適切な場合にこのようなバリエーションを使用することを予測し、本発明者らは、本発明に対して本明細書で具体的に記載されるとおり以外の別のものを実施する予定である。よって、本発明は、適用可能な法律によって許容されるとおり、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変および均等物を包含する。さらに、その全ての考えられるバリエーションにおいて上記で記載される要素の任意の組み合わせは、本明細書で別段示されなければ、さもなければ状況が明らかに矛盾しなければ、本発明によって包含される。

Claims (19)

1. 必要性のある被験体において（例えば、疾患遺伝子が遺伝している被験体において）ハンチントン病（ＨＤ）を処置または防止するための方法であって、前記方法は、前記被験体の脳において、処置前の前記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程を包含する、方法。
2. 前記被験体は、ミトコンドリア機能不全、異常なコレステロールホメオスタシス、線条体萎縮、ドパミンシグナル伝達障害および／または低下したオートファジーを有し得る、請求項１に記載の方法。
3. 必要性のある被験体においてｍＨＴＴ関連代謝表現型および／または線条体萎縮の改善を調節するための方法であって、前記方法は、前記被験体の脳において、処置前の前記被験体における機能またはレベルと比較して、ｍＴＯＲＣ１機能を活性化するおよび／または線条体で富化されるＲａｓホモログ（Ｒｈｅｓ）レベルを増大させる治療剤を投与する工程による、方法。
4. 前記治療剤は、ｍＴＯＲＣ１調節因子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ｍＴＯＲＣ１調節因子は、Ｒｈｅｂである、請求項４に記載の方法。
6. 前記Ｒｈｅｂは、構成的に活性なＲｈｅｂ変異体（ｃａＲｈｅｂ；Ｓ１６Ｈ）である、請求項５に記載の方法。
7. 前記治療剤は、ウイルスベクター中に含まれる、請求項６に記載の方法。
8. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項７に記載の方法。
9. 前記治療剤は、Ｒｈｅｓを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記治療剤は、ウイルスベクター中に含まれる、請求項９に記載の方法。
11. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６および／またはＡＡＶ９である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ２である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記治療剤は、前記被験体の脳へと、直接にまたは血流を介してかのいずれかで投与される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記治療剤は、前記被験体の線条体、皮質または脳室空間へと投与される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記被験体は、ヒトである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記薬剤は、ＣＮＳにおいて１〜５箇所に注射される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記薬剤は、脳において１箇所に注射される、請求項１８に記載の方法。