DE112013007239T5 - Adeno-assoziierte Virusvektoren, die zur Transduktion von adipösem Gewebe (Fettgewebe) nützlich sind - Google Patents

Adeno-assoziierte Virusvektoren, die zur Transduktion von adipösem Gewebe (Fettgewebe) nützlich sind Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Adeno-assoziierte Virusvektoren, die für die Transduktion von Fettgewebe nützlich sind. Die Erfindung betrifft auch Polynukleotide, Plasmide, Vektoren und Verfahren zur Herstellung solcher Adeno-assoziierten Virusvektoren. Die Erfindung betrifft auch Gentherapieverfahren, die für die Behandlung von Erkrankungen nützlich sind, die die Regulierung der Expressionslevel eines Gens erfordern.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV), die zur Transduktion von adipösem Gewebe nützlich sind. Die Vektoren können weißes oder braunes Fettgewebe gewebespezifisch transduzieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Fettgewebe ist zusätzlich zu dessen bereits bekannter Rolle als Fettspeicher und Modulator der Energiehomöostase kürzlich als ein maßgebliches metabolisches und endokrines Organ erkannt worden. Es ist vorgeschlagen worden, dass die beeinträchtigte Funktion des weißen Fettgewebes (WAT) sowie die verminderte Aktivität und Masse des braunen Fettgewebes (BAT) maßgeblich zur Entwicklung von Adipositas beitragen. Diesbezüglich sind im Menschen Adipozyten- und WAT-Fehlfunktion beschrieben worden. Darüber hinaus wurde über eine inverse Korrelation zwischen der BAT-Aktivität und dem Körper-Maß-Index (BMI) berichtet worden, siehe Yee J, et al., Lipids Health Dis. 2012, 11: 19–30, Ichimura A, et al., Nature 2012; 483: 350–354, Mazzatti D, et al., Arch. Physiol. Biochem. 2012; 118(3): 112–120, Cypess A, et al., N. Engl. J. Med. 2009; 360: 1509–1517 und van Marken Lichtenbelt W, et al., N. Engl. J. Med. 2009; 360: 1500–1508.
  • Das Auftreten von Adipositas ist während des letzten Jahrzehnts dramatisch angestiegen, bis es epidemische Ausmaße angenommen hatte. Schätzungsweise sind über 500 Millionen Individuen fettleibig. Adipositas ist heutzutage ein Hauptgesundheitsproblem der Öffentlichkeit, siehe IASO, ”Global Prevalence of Adult Obesity, Report IOTF 2008” (IASO, London, GB, 2009). Adipositas per se erhöht das Risiko der Mortalität und wurde lange Zeit im starken Maße mit der insulinresistenz und Typ 2-Diabetes in Verbindung gebracht, siehe Peeters A, et al., Ann. Intern. Med. 2003; 138: 24–32 und Moller D, et al., N. Engl. J. Med. 1991; 325: 938–948. Zusätzlich stellen die Adipozyten-Fehlfunktion und Adipositas auch wesentliche Risikofaktoren für bestimmte Arten von Krebs und viele andere schwere Erkrankungen, Herzleiden, Immunschwächen, Hypertension, Arthritis und neurodegenerative Erkrankungen dar, siehe Roberts D, et al., Annu. Rev. Med. 2010; 61: 301–316, Spiegelman B, et al., J. Biol. Chem. 1993; 268(10): 6823–6826, und Whitmer R, et al., Curr. Alzheimer Res. 2007; 4(2): 117–122.
  • Diät und Bewegung sind die Hauptstützen der Behandlungen für Adipositas, jedoch eine steigende Anzahl von Patienten benötigt auch therapeutisches Eingreifen mit Arzneimitteln, um Gewicht zu verlieren oder aufrechtzuerhalten. Die Therapie mit Arzneimitteln löst jedoch keinen unfreiwilligen noch wesentlichen Gewichtsverlust aus und zusätzlich weisen die anti-Adipositas-Medikamente durch ihre systemische Wirkungsweise wichtige Nebenwirkungen auf. Somit gibt es einen eiligen Bedarf an neuen und sicheren Ansätzen, um die derzeitige Adipositas-Epidemie zu verhindern oder zu bekämpfen. In diesem Zusammenhang ist das Entwirren und Ordnen der pathologischen Ereignisse, die die Grundlage für Adipositas bilden, entscheidend für die Entwicklung von neuen anti-Adipositas-Therapien. In vivo-Gentranster von Kandidaten-Genen in weißes und braunes Fettgewebe kann ein großes Potential bereitstellen, um einen Einblick in den molekularen Mechanismus zu gewinnen, der dem Auftreten und der Entwicklung von Adipositas unterliegt. Zusätzlich können die Gentherapieansätze, die Fettzellen als Ziel haben, neue Möglichkeiten für die zukünftige Behandlung von Adipositas und dessen verwandte Erkrankungen eröffnen, wobei die systemische Wirkung minimiert wird. Bisher ist jedoch der wirksame und spezifische Gentransfer bei weißem und braunem Fettgewebe illusorisch.
  • Kürzlich ist gezeigt worden, dass der AAV vom Serotyp 1 (AAV1) mäßig Maus WAT in vivo infiziert, wenn er mit einem nicht-ionischen, oberflächenaktiven Mittel oder Celastrol kombiniert wird, siehe Mizukami H, et al., Hum. Gene Ther. 2006; 17: 921–928 und Zhang F, et al., Gene Ther. 2011; 18: 128–134. Über andere AAV-Serotypen wie AAV6, AAV7, AAV8 oder AAV9 wurde berichtet, dass sie hochinfektiös sind, jedoch ihre Effizienz bei der Transduktion in Fettzellen unklar ist, siehe Gao G, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 11854–11859, Nakai H, et al., J. Virol. 2005; 79: 214–224, Pacak C, et al., Circ. Res. 2006; 99:e3-e9, Broekman M, et al., Neuroscience 2006; 138: 501–510, Wang Z, et al., Diabetes 2006; 55: 875–884, Taymans J, et al., Hum. Gene Ther. 2007; 18: 195–206, Bish L, et al., Hum. Gene Ther. 2008; 19: 1359–1368, und Lebherz C, et al., J. Gene Med. 2008; 10: 375–382. Somit besteht ein Bedarf für die Entwicklung von Vektoren, die eine spezifische Transduktion des Fettgewebes ermöglichen und darüber hinaus die Transduktion von bestimmten Fettzelltypen erlauben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Adeno-assoziierte Virusvektoren (AAV), die die Zuführung des Polynukleotids von Interesse zu spezifischen Typen von Fettzellen und deren Expression erlaubt. Die Verwendung des Fettgewebe-spezifischen, regulatorischen Elements der Erfindung beschränkt die Expression des Polynukleotids von Interesse entweder auf weißes Fettgewebe oder braunes Fettgewebe. Darüber hinaus ist bewiesen worden, dass die Vektoren der Erfindung bei der Behandlung von Fettgewebe nützlich ist, das mit Krankheiten in Verbindung steht, wie zum Beispiel Typ 2-Diabetes. Die erfinderischen Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen offenbart.
  • Hinterlegung von Mikroorganismen
  • Die Plasmide pAAV-mini/aP2-null and pAAV-mini/UCP1-null wurden am 8. Juni 2012 beim DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig, Deutschland, unter den Hinterlegungsnummern DSM 26057 beziehungsweise DSM 26058 hinterlegt.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Transduktion von weißen Adipozyten durch intra-eWAT-Verabreichung von AAV. A-B: Immunfärbung gegen grün fluoreszierendes Protein (GFP, in grün) in Sektionen von eWAT, behandelt mit AAV-CAG-GFP der Serotypen 1, 2, 4 und 5 mit oder ohne Pluronics F88 (A) und AAV-CAG-GFP der Serotypen 6, 7, 8 und 9 (B), blau Kerne. Pfeile zeigen die transduzierten Adipozyten an. Originalvergrößerung 100× (B, linke Seite) und 200× (A; B, rechte Seite). C: GFP-Gehalt in eWAT, behandelt mit AAV-CAG-GFP der Serotypen 1, 6, 7, 8 oder 9 (n = 5 pro Gruppe). Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SEM) gezeigt. RLU, relative Lichteinheiten. D: In toto X-gal-Färbung von eWAT, die AAV8-CMV-LacZ erhielten. Die X-gal-Färbung war über die transduzierten eWAT verteilt. Im Gegensatz dazu wurde keine X-gal-Färbung in eWAT von Tieren nachgewiesen, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden. E: Relative mHKII-Expressionslevel in isolierten Adipozyten, die von eWAT von Tieren erhalten wurden, die mit AAV9-CMV-mHKII- oder AAV9-CMV-null-Vektoren behandelt wurden. F: Basal und Insulin-stimulierte 2-[1-3H]Desoxy-D-glucase-Aufnahem durch isolierte Adipozyten von Mäusen, denen AAV9-CMV-null und AAV9-CMV-mHKII injiziert wurde. Die Adipozyten wurden von mindestens 5 Mäusen/Gruppe erhalten. G: Immunfärbung gegen GFP (braun) in Sektionen von inguinalem weißem Fettgewebe (iWAT) zwei Wochen nach der intra-iWAT-Verabreichung von 2 × 1011 vg von AAV8 oder AAV9-CAG-GFP-Vektoren. Originalvergrößerung × 100. H: GFP-Expressionslevel in iWAT zwei Wochen nach der Injektion von 2 × 1011 vg von AAV8 oder AAV9-CAG-GFP (n = 6). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001; #p < 0.05 vs AAV9-CMV-null bei gleicher Insulinkonzentration. Alle Analysen wurden zwei Wochen nach der intra-eWAT-Verabreichung von 2 × 1011 vg/eWAT durchgeführt.
  • 2: Spezifische Transduktion von weißen Adipozyten nach der intra-eWAT-Verabreichung von AAV mithilfe der regulatorischen Region mini/aP2. A: Immunfärbung gegen GFP (in braun) in eWAT, die 1012 vg/eWAT von AAV8 und AAV9-mini/aP2-GFP-Vektoren erhielten. Die Analysen wurden zwei Wochen nach der Injektion durchgeführt. Originalvergrößerung ×400. B: Zirkulierender HSeAP-Level. Eine Dosis von 4 × 1012 vg/Maus von AAV9-mini/aP2-hSeAP-Vektoren wurde bilateral in eWAT injiziert und die Messung des zirkulierenden HSeAP-Levels wurde bei verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion durchgeführt. RLU, relative Lichteinheiten. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. n = 3 (Kochsalzlösung) und n = 4 (AAV9-mini/aP2-SeAP). C: Relative hSeAP-Expressionslevel in Leber und eWAT ein Jahr nach der intra eWAT Verabreichung von 4 × 1012 vg/Maus von AAV9-mini/aP2-hSeAP. D: Die in vivo 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme durch eWAT, iBAT und Herz wurde zwei Wochen nach der intra-eWAT-Verabreichung von AAV9-mini/aP2-null- und AAV9-mini/aP2-mHKII-Vektoren (1,4. × 1012 vg/Maus) bestimmt. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. n = 7 Mäuse pro Gruppe. *p < 0,05.
  • 3: Transduktion von braunen Adipozyten durch intra-iBAT-Verabreichung von AAV. A: Immunfärbung von GFP (in braun) in Sektionen von iBAT, behandelt mit 2 × 109 vg/Maus von AAV8 oder AAV9-CAG-GFP. Originalvergrößerung × 200 und × 400 (Einsatz). B: Relative GFP-Expressionslevel in iBAT, das 2 × 109 vg/Maus von AAV8 oder AAV9-CAG-GFP erhielten. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. n = 5 Mäuse pro Gruppe. *p < 0,05. C: Relative Expressionslevel des rot fluoreszierenden Proteins (RFP) in iBAT, die 2 × 1010 vg/Maus von AAV4 oder AAV8-CMV-RFP oder 2 × 1010 vg/Maus von AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 oder AAV9-CMV-RFP erhielten. Die Transduktionsmuster sind ähnlich wie bei eWA, siehe 1. AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9 sind die wirksamsten Serotypen für die Transduktion von iBAT. D: Immunfärbung gegen RFP (in braun) in Sektionen von iBAT, behandelt mit 1011 vg/Maus von AAV9-CMV-RFP. Originalvergrößerung ×200 und ×400 (Einsatz). Die Analysen wurden durchgeführt zwei Wochen nach der Verabreichung von AAV.
  • 4: Spezifische Transduktion von braunen Adipozyten nach der intra-eWAT-Verabreichung von AAV mithilfe der regulatorischen Region mini/UCP1. A: Die Transduktion der braunen Adipozyten wurde durch Immunfärbung gegen GFP (in braun) zwei Wochen nach der Injektion von 2 × 1011 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP-Vektoren bestimmt. Originalvergrößerung ×200 and ×400 (Einsatz). B: Die in vivo 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme durch iBAT, eWA und Herz zwei Wochen nach der Verabreichung von AAV8-mini/UCP1-null- und AAV8-mini/UCP1-mHKII-Vektoren (7 × 1010 vg/Maus). n = 6 (AAV8-mini/UCP1-mHKII) und n = 10 (AAV8-mini/UCP1-null) Mäuse pro Gruppe. C-E: Relative mVEGF164 (C)-, gesamte mVEGF (D)- und mPECAMI(E)-Expressionslevel in iBAT, zwei Wochen nach der Zuführung von 2 × 1011 vg/Maus von AAV9-mini/UCP1-mVEGF164 oder AAV9-mini/UCP1-null – Vektoren. n = 5 Mäuse pro Gruppe. F: Immunfärbung gegen α-SMA (in braun) in iBAT zwei Wochen nach der Injektion von 2 × 1011 vg/Maus von AAV9-mini/UCP1-mVEGF164 oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren. Originalvergrößerung ×400. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. *p < 0.05. Rote Pfeilspitzen zeigen Kapillarstrukturen an.
  • 5: Transduktion von weißen und braunen Adipozyten durch systemische Zuführung von AAV-Vektoren zu mageren Mäusen. A: Immunfärbung gegen GFP (in grün) in eWAT-Sektionen; blaue Kerne. Originalvergrößerung × 100 (linke Seite) und × 200 (rechte Seite). B: Relative GFP-Expressionslevel in eWAT. C: GFP-Gehalt in eWAT. D: Immunfärbung gegen GFP (in braun) in iBAT-Sektionen. Originalvergrößerung ×200 and ×400 (Einlagen). E: Relative GFP-Expressionslevel in iBAT. F: GFP-Gehalt in iBAT. G-H: Relative GFP-Expressionslevel in inguinal (iWAT), retroperitoneal (rWAT), mesenterisch (mWAT), eWAT und iBAT nach iv-Verabreichung der Vektoren an ICR-Mäuse (G) und C57BI6-Mäuse (H) (ICR: n = 3 für AAV8 und n = 5 für AAV9; C57BI6: n = 4). Alle Analysen wurden nach der Verabreichung von 5 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-CAG-GFP-Vektoren in die Schwanzvene durchgeführt. AU, willkürliche Einheiten. RLU, relative Lichteinheiten.
  • 6: Spezifische Transduktion von braunen Adipozyten nach der systemischen Verabreichung von AAV mithilfe der regulatorischen Region mini/UCP1. A: Immunfärbung gegen GFP (in braun) in iBAT, die AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP-Vektoren erhielten. Originalvergrößerung ×200 and ×400 (Einlage). B-C: Relative mVEGF164(B)- und gesamte mVEGF(C)-Expressionslevel in iBAT, behandelt mit 2 × 1012 vg/Maus AAV9-mini/UCP1-mVEGF164- oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren zwei Monate nach der Injektion. D-E: VEGF164(B)- und PECAM1(C)-Expressionslevel in iBAT ein Monat nach der iv-Verabreichung von 8 × 1012 vg von AAV9-mini/UCP1-VEGF164-, oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren (n = 5). F-G: Immunfärbung gegen CD105 (braun) (D) und α-SMA (braun) (E) in den gleichen Kohorten wie in B-C. Rote Pfeilspitzen zeigen Blutgefäße an. Originalvergrößerung ×400 und ×1000 (Einlagen). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. n = 5 Mäuse pro Gruppe *p < 0.05.
  • 7: Die Transduktion von Adipozyten mithilfe der regulatorischen Region mini/aP2 und adipös-beschränkter Transgen-Expression nach der systemischen Verabreichung von AAV. A: Die Transduktion von braunen Adipozyten wurde mittels Immunfärbung gegen GFP (in braun) in iBAT-Sektionen von Tieren, die AAV8- oder AAV9-mini/aP2-GFP-Vektoren erhielten, bestimmt. Originalvergrößerung ×200 und ×400 (Einlagen). B-C: Transduktion von nicht-adipösem Gewebe wurde mittels Immunfärbung gegen GFP (in braun) zwei Wochen nach der Injektion bestimmt. Die GFP-Expression war minimal in der Leber und nicht vorhanden im Herz der Tiere, die mit AAV8- oder AAV9-mini/aP2-GFP (B) und AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP (C) behandelt wurden. Originalvergrößerung ×100 und ×400 (Einlagen). Alle Analysen wurden zwei Wochen nach der systemischen Injektion von 2 × 1012 vg/Maus durchgeführt.
  • 8: Off-Target-Transgen-Expression nach der intra-eWAT-Verabreichung von AAV. A: Immunfärbung gegen GFP (in braun) in iBAT von Tieren, die AAV9-CAG-GFP erhielten. Originalvergrößerung ×200 und ×400 (Einlagen). B: Relative GFP-Expressionslevel in iBAT und eWAT von Tieren, die mit AAV9-CAG-GFP behandelt wurden. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. n = 5 Mäuse pro Gruppe. *p < 0.05. C: Die Transduktion von nicht-adipösen Organen wurde mittels Immunfärbung gegen GFP (in grün) bestimmt. Die GFP-Expression war im Herz und der Leber von Tieren erkennbar, denen AAV7, AAV oder AAV9 injiziert wurde. Originalvergrößerung ×100. Die Analysen wurden zwei Wochen nach der intra-eWAT-Verabreichung von AAV-CAG-GFP-Vektoren (4 × 1011 vg/Maus) durchgeführt.
  • 9: Auf Fettgewebe beschränkte AAV-vermittelte Transgen-Expression mithilfe der regulatorischen Region mini/aP2. Keine GFP-Expression wurde bei der Immunfärbung gegen GFP in der Leber und dem Herz zwei Wochen nach der lokalen intra-eWAT-Verabreichung von 1012 vg von AAV8- und AAV9-mini/aP2-GFP-Vektoren nachgewiesen. Originalvergrößerung ×100.
  • 10: Transduktion von nicht-adipösen Organen durch intra-iBAT-Verabreichung von AAV-Vektoren. Die Transduktion von nicht-adipösen Organen wurde durch Immunfärbung gegen GFP (in braun) zwei Wochen nach der Injektion bestimmt. Die GFP-Expression war im Herz und der Leber von Tieren, denen intra-iBAT mit 2 × 109 vg/Maus von AAV8- und AAV9-CAG-GFP-Vektoren injiziert wurde, erkennbar. Originalvergrößerung ×200.
  • 11: Transduktion von braunen Adipozyten mithilfe der regulatorischen Region mini/aP2 und adipös-beschränkter Transgen-Expression nach der intra-iBAT-Verabreichung von AAV. A: Die Transduktion von braunen Adipozyten wurde mittels Immunfärbung gegen GFP (in braun) zwei Wochen nach der intra-iBAT-Zuführung von 2 × 1011 vg/Maus von AAV9-mini/aP2-GFP-Vektoren bestimmt. Originalvergrößerung ×200 und ×400 (Einlagen). B: Die Transduktion von nicht-adipösen Organen wurde durch Immunfärbung gegen GFP (in braun) zwei Wochen nach der Injektion AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP-Vektoren (2 × 1011 vg/Maus) lokal in iBAT bestimmt. Die GFP-Expression war gering in der Leber. Originalvergrößerung ×100 und ×400 (Einlagen).
  • 12: Breit gestreute Transgen-Expression nach der Zuführung von AAV in die Schwanzvene. Die Immunfärbung gegen GFP (in grün) zwei Wochen nach der Injektion von 5 × 1012 vg/Maus von AAV9-CAG-GFP-Vektoren über die Schwanzvene zeigte die Transduktion von Leber, Herz, Skelettmuskel, Testis und Niere; blau, Kerne. Originalvergrößerung ×200.
  • 13: Transduktion von WAT und BAT nach der systemischen Verabreichung von AAV-Vektoren an übergewichtige, diabetische Mäuse A-B: Immunfärbung gegen GFP (braun) in Sektionen von epididymalem weißen Fettgewebe (eWAT), inguinalem weißen Fettgewebe (iWAT) und interskapularem braunen Fettgewebe (iBAT) nach der iv-Verabreichung von 3 × 1012 vg von AAV8- oder AAV9-CAG-GFP-Vektoren an ob/ob (A)- und db/db-Mäuse (B). Originalvergrößerung ×200. (ob/ob: n = 4; db/db: n = 4). C-D: GFP-Expression in inguinalen (iWAT), retroperitonealen (rWAT), mesenterischen (mWAT), eWAT- und iBAT-Depots von den gleichen Kohorten von ob/ob (C)- und db/db-Mäusen (D). AU, willkürliche Einheiten. Alle Analysen wurden zwei Wochen nach der Zuführung des Vektors durchgeführt. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM gezeigt. *p < 0.05 vs. AAV9.
  • 14: Wirksame Adipozyten-Transduktion und Entfernen des Ziels der Transgen-Expression von Leber und Herz mit mirT-Sequenzen. GFP-Immunfärbung (braun) in epididymalem weißen Fettgewebe (eWAT), inguinalem weißen Fettgewebe (iWAT), interskapularen braunen Fettgewebe (iBAT), Leber und Herz zwei Wochen nach der iv-Verabreichung von 1012 vg von AAV9-CAG-GFP-, AAV9-CAG-GFP-miRT122-, AAV9-CAG-GFP-miRT1-, oder AAV9-CAG-GFP-doublemiRT-Vektoren. Originalvergrößerung ×100 (Leber und Herz), ×200 (eWAT und iWAT) und ×400 (iBAT und Einlagen).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart Vektoren, basierend auf den AAV6-, AAV7-AAV8- und AAV9-Serotypen des Adeno-assoziierten Virus, der in der Lage ist, den Gentransfer zu WAT oder BAT effizient zu vermitteln, wenn er lokal verabreicht wird; siehe 1B und 1C und 3A–3D. Die systemische Verabreichung dieser Vektoren führt auch zu einer effektiven Genzuführung sowohl in WAT als auch BAT; siehe 5A und 5D. Obwohl die durch die AAV8- und AAV9-Vektoren vermittelte Genzuführung effizient ist, ist sie nicht begrenzt auf Fettgewebe. Die vorliegende Erfindung offenbart, dass die Kombination der AAV8- und AAV9-Vektoren mit Fettgewebe-spezifischen Promotorregionen die spezifische Expression von Polynukleotiden von Interesse in Fettgewebe ermöglicht. Insbesondere führt die lokale Verabreichung von AAV8- oder AAV9-Vektoren, die eine Expressionskassette umfasst, worin heterologes Gen (z. B. GFP) unter der Kontrolle der regulatorischen Region mini/aP2 ist, zu dessen Expression in WAT ohne Expression in Leber und Herz; siehe 2A und 9. Zusätzlich führt die lokale Verabreichung von AAV8- oder AAV9-Vektoren, die eine Expressionskassette umfasst, worin heterologes Gen (z. B. GFP) unter der Kontrolle der regulatorischen Region mini/UCP1 ist, zu dessen Expression in BAT ohne Expression im Herz und nur geringer Expression in der Leber; siehe 4A und 11B. Somit stellt die lokale Verabreichung von Kombinationen, gebildet aus den Vektoren und Promotoren der Erfindung, einen sicheren Mechanismus für die Behandlung vieler Erkrankungen bereit, die auf der Transduktion von Fettzellen in vivo basieren.
  • Darüber hinaus stellt die systemische Verabreichung der Kombinationen der Erfindung einen alternativen Ansatz für die Transduktion von Fettzellen dar. Diesbezüglich offenbart die vorliegende Erfindung, dass die systemische Verabreichung von AAV8- oder AAV9-mini/UCP1- und AAV8- oder AAV9-mini/aP2-Kombinationen wirksam sind bei der effektiven Transduktion von BAT und WAT; siehe 6A und 7A. Unabhängig davon, welche der beiden regulatorischen Regionen verwendet wird, führt die systemische Verabreichung der Kombinationen der Erfindung zu einer hoch-beschränkten Expression des Palynukleotids von Interesse in Fettgewebe, ohne Expression im Herz und nur geringer Expression in der Leber; siehe 7B und 7C.
  • 1. Definition allgemeiner Begriffe und Ausdrücke
  • Die Begriffe ”Adeno-assoziierter Virus”, ”AAV-Virus”, ”AAV-Virion”, ”viraler AAV-Partikel” und ”AAV-Partikel”, so wie sie hierin austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf einen viralen Partikel, der aus mindestens einem AAV-Capsid-Protein (vorzugsweise aus allen Capsid-Proteinen eines bestimmten AAV-Serotyps) und einem encapsidierten Polynukleotid AAV-Genom zusammengesetzt ist. Wenn das Partikel ein heterologes Polynukleotid umfasst (d. h., ein anderes Polynukleotid als ein Wildtyp-AAV-Genom wie ein Transgen, das der Säugerzelle zugeführt werden soll), das von den AAV-invertierten terminalen Wiederholungen flankiert ist, wird darauf typischerweise als ein ”AAV-Vektorpartikel” oder ”AAV-Vektor” Bezug genommen. AAV bezieht sich auf Viren, die zu der Gattung Dependovirus der Parvoviridae-Familie gehören. Das AAV-Genom ist annähernd 4,7 Kilobasen lang und ist zusammengesetzt aus einzelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren (ssDNA), die entweder aus dem positiven oder negativen Strang bestehen. Das Genom umfasst invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) an beiden Enden des DNA-Strangs und zwei offene Leseraster (ORFs): rep und cap. Das rep-Leseraster ist aus vier überlappenden Genen aufgebaut, die Rep-Proteine kodieren, die für den AAV-Lebenszyklus erforderlich sind. Das cap-Leseraster enthält überlappende Nukleotidsequenzen von Capsid-Proteinen: VP1, VP2 und VP3, die zusammenwirken, um ein Capsid einer icosahedralen Symmetrie zu bilden; siehe Carter B, Adeno-associated virus and adeno-associated virus vectors for gene delivery, Lassic D, et al., Hrs., ”Gene Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies” (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, US, 2000) und Gao G, et al., J. Virol. 2004; 78(12): 6381–6388.
  • Der Begriff ”ITRs des Adeno-assoziierten Virus” oder ”AAV-ITRs”, so wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die invertierten terminalen Wiederholungen, die an beiden Enden des DANN-Stranges des Genoms eines Adeno-assoziierten Virus vorliegen. Die ITR-Sequenzen sind für die effiziente Vermehrung des AAV-Genoms erforderlich. Eine andere Eigenschaft dieser Sequenzen ist ihre Fähigkeit, eine Haarnadelstruktur auszubilden. Dieses Charakteristikum trägt dazu bei, dass sie sich selbst aneinanderlagern, wodurch die Primer-unabhängige Synthese des zweiten DNA-Strangs ermöglicht wird. Die ITRs haben sich sowohl für die Integration der Wildtyp-AAV-DNA in das Wirtszellgenom (d. h., Chromosom 19 im Menschen) und dem Schutz davor, als auch für die effiziente Encapsidierung der AAV-DNA kombiniert mit der Erzeugung eines voll assemblierten, Desoxyribonuklease-resistenten AAV-Partikels als erforderlich erwiesen.
  • Der Begriff ”AAV2”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Serotyp des Adeno-assoziierten Virus mit einer Genomsequenz, wie in der GenBank, Hinterlegungsnummer NC001401, definiert.
  • Der Begriff ”AAV-Vektor”, wie hierin verwendet, bezieht sich weiterhin auf einen Vektor, der ein oder mehrere Polynukleotid(e) von Interesse (oder Transgene) umfasst, die von terminalen AAV Wiederholungssequenzen (ITRs) flankiert sind. Solche AAV-Vektoren können repliziert und in einen infektiösen Viruspartikel verpackt werden, wenn sie in einer Wirtszelle vorliegen, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der rep- und cap-Genprodukte (d. h., AAV Rep- und Cap-Proteine) kodiert und exprimiert, und worin die Wirtszelle mit einem Vektor transfiziert wurde, der ein Protein des offenen Leserasters E4orf6 des Adenovirus kodiert und exprimiert. Wird ein AAV-Vektor in ein größeres Polynukleotid eingebaut (z. B. in ein Chromosom oder in einen anderen Vektor wie ein Plasmid, die zum Klonioren oder zur Transfektion verwendet werden), dann wird typischerweise auf den AAV-Vektor als ein ”Provektor” Bezug genommen. Der Provektor kann durch Replikation und Encapsidierung bei Vorhandensein von AAV-Verpackungsfunktionen und die notwendigen Helferfunktionen, die durch E4orf6 bereitgestellt werden, ”befreit” werden.
  • Der Begriff ”adipöses Gewebe” oder ”Fettgewebe”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Gewebe, das aus reifen Adipozyten (d. h., Fettzellen) und einer Kombination von kleinen Blutgefäßen, Nervengewebe, Lymphknoten und der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aufgebaut ist. Die SVF setzt sich aus Endothelzellen, Fibroblasten, Vorläuferzellen von Adipozyten (d. h., prä-Adipozyten) und Immunzellen wie Makrophagen und T-Zellen zusammen. In Säugern werden gewöhnlich zwei verschiedene Arten von Fettgewebe unterschieden: das weiße Fettgewebe (WAT) und das braune Fettgewebe (BAT). Das Fettgewebe wirkt primär als Energiespeicher in Form von Fett, unter Erzeugung von Hitze über nicht fröstelnder Thermogenese, und unter Sekretion von Adipokinen.
  • Der Begriff ”Fettzellen” oder ”Adipozyten”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Zelltypen, aus denen adipöses Gewebe zusammengesetzt ist und die darauf spezialisiert sind, Energie als Fett zu speichern, Hitze über nicht fröstelnder Thermogenese zu erzeugen und Adipokine zu sekretieren. Adipöses Zellgewebe schließt weiße Adipozyten und braune Adipozyten ein.
  • Der Begriff ”Fettgewebe-spezifische, transkriptionelle, regulatorische Region”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die als Promotor dient (d. h., die Expression einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz steuert, die mit dem Promotor funktionell verbunden ist), und welche die Expression einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz in spezifischen Gewebezellen, wie Adipozyten, beeinflusst. Die Fettgewebe-spezifische, transkriptionelle, regulatorische Region kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Der Begriff ”alkalische Phosphatase” oder ”AP”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Enzym (EC 3.1.3.1), das die Hydrolyse der Phosphatgruppen vieler Arten von Molekülen katalysiert, einschließlich Nukleotiden, Proteinen und Alkaloiden.
  • Der Begriff ”Angiogenese”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozess der Bildung neuer Blutgefäße aus anderen vorher Existierenden und schließt Prozesse der Vaskulogenese und Arteriogenese ein.
  • Der Begriff ”Arteriogenese”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Bildung, Wachstum und Entwicklung von Blutgefäßen mit einer glatten Muskelzwischenschicht.
  • Der Begriff ”braune Fettgewebezellen” oder ”braune Adipozyten”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Art von Adipozyten, die polygonal sind, und dadurch gekennzeichnet sind, dass Lipide in vielen kleineren ”multilokulären” Tröpfchen akkumulieren und einen hohen Gehalt an großen Mitochondrien verpackt mit laminaren Cristae innerhalb des Zytoplasmas aufweisen. Anders als weiße Adipozyten haben diese Zellen beträchtliches Zytoplasma. Der Kern ist rund und, obwohl er exzentrisch lokalisiert ist, ist er nicht in der Peripherie der Zelle. Die zahlreichen Mitochondrien der braunen Adipozyten und die reiche Vaskularität der braunen Fettdepots sind der Hauptgrund für die braune Farbe der BAT. Braune Adipozyten sind in klassischen BAT-Depots lokalisiert und sind für die Wärmeentwicklung über nicht fröstelnde Thermogenese verantwortlich; siehe Enerback S, N. Engl. J. Med. 2009; 360: 2021–2023.
  • Der Begriff ”regulatorische CAG-Region”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Kombination, gebildet durch das frühe Zytomegalievirus-Enhancerelement und den Huhn-β-Actin-Promotor; siehe Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1–11.
  • Der Begriff ”cap-Gen” oder ”AAV cap-Gen”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Gen, das ein Cap-Protein kodiert. Der Begriff ”Cap-Protein”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, das mindestens eine funktionelle Aktivität eines nativen AAV Cap-Proteins aufweist (z. B. VP1, VP2, VP3). Beispiele für funktionelle Aktivitäten von Cap-Proteinen (z. B. VP1, VP2, VP3) schließen die Fähigkeit ein, die Bildung eines Capsids zu induzieren, die Akkumulierung einzelsträngiger DNA zu erleichtern, die AAV DNA Verpackung in das Capsid (d. h., Encapsidierung) zu erleichtern, zelluläre Rezeptoren zu binden und den Eintritt des Virions in den Wirt zu erleichtern.
  • Der Begriff ”Capsid”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Struktur, in der das virale Genom verpackt wird. Ein Capsid besteht aus verschiedenen oligomeren strukturellen Untereinheiten, die aus Proteinen aufgebaut sind. Zum Beispiel hat AAV ein icosahedrales Capsid gebildet aus der Interaktion von drei Capsid-Proteinen: VP1, VP2 und VP3.
  • Der Begriff ”Zellzusammensetzung”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Material, das die Adipozyten der Erfindung und mindestens eine andere Komponente umfasst. Die Zusammensetzung kann als einzelne Formulierung oder in getrennten Formulierungen der jeweiligen Komponenten, die zur gemeinsamen Verwendung als ein Präparat kombiniert werden können, formuliert sein. Die Zusammensetzung kann ein ”Kit-of-Parts” sein, worin die jeweiligen Komponenten einzeln formuliert und verpackt sind.
  • Der Begriff ”konstitutiver Promotor”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Promotor, dessen Aktivität bei einem relativ konstanten Level in allen Zellen eines Organismus, oder während den meisten Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, mit geringem oder keinem Einfluss durch Umgebungsbedingungen der Zelle.
  • Der Begriff ”Enhancer”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein DNA-Sequenzelement, an das Transkriptionsfaktoren binden, um die Gen-Transkription zu verstärken.
  • Der Begriff ”Expressionskassette”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Serie von spezifischen Nukleinsäureelementen, welche die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Zielzelle erlauben.
  • Der Begriff ”Gene, die Helferfunktionen bereitstellen”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Gene, die Polypeptide kodieren, die Funktionen ausüben, von denen die Replikation von AAV abhängig ist (d. h., ”Helferfunktionen”). Die Helferfunktionen schliefen diejenigen Funktionen ein, die für die Replikation von AAV erforderlich sind, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, diejenigen Reste, die bei der Aktivierung der Gentranskription von AAV, dem Stadium spezifischen AAV mRNA-Splicing, der AAV DNA-Replikation, der Synthese von cap-Expressionsprodukten und dem Zusammenbau des AAV-Capsids involviert sind. Virus-basierte Zusatzfunktionen können von den bekannten Helferviren abgeleitet sein, wie Adenovirus, Herpesvirus (andere als Herpes Simplex Virus Typ-1) und Vaccinia-Virus. Helferfunktionen schließen ein, ohne darauf begrenzt zu sein, Adenovirus E1, E2a, VA und E4 oder Herpesvirus UL5, UL8, UL52 und UL29 und Herpesvirus-Polymerase.
  • Der Begriff ”Hexokinase” oder ”HK”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Enzym, das die Phosphorylierung von Hexosen unter Bildung von Hexosephosphat katalysiert. In den meisten Organismen ist Glucose das Hauptsubstrat von HK und Glucose-6-phosphat ist das wichtigste Produkt.
  • Der Begriff ”hoher Blutdruck” oder ”arterielle Hypertension”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen medizinischen Zustand, bei dem der Blutdruck in den Arterien erhöht ist. Der Blutdruck schließt zwei Messungen ein, systolisch und diastolisch, die davon abhängig sind, ob der Herzmuskel kontrahiert (Systole) oder zwischen den Schlägen relaxiert (Diastole). Der normale Blutdruck bei Ruhe liegt im Bereich von 100–140 mm Hg systolisch (Spitzenablesung) und 60–90 mmHg diastolisch (Minimumablesung). Hoher Blutdruck liegt vor, wenn er durchgehend über 140/90 mm Hg liegt. Hypertension wird klassifiziert als entweder primäre (essentielle) Hypertension oder sekundäre Hypertension; etwa 90–95% der Fälle werden als ”primäre Hypertension” klassifiziert, was bedeutet, dass hoher Blutdruck ohne offensichtliche medizinische Ursache vorliegt. Die verbleibenden 5–10% der Fälle (d. h., sekundäre Hypertension) werden durch andere Zustände verursacht, die die Nieren, Arterien, Herz oder das endokrine System beeinträchtigen. Von der Insulin-Resistenz, die bei Adipositas häufig vorkommt, wird ebenfalls angenommen, dass sie zu Hypertension beiträgt. Hypertension ist ein Hauptrisikofaktor für Schlaganfall, Myokardinfarkt (d. h., Herzinfarkt), Herzleiden, Aneurysma der Arterien (z. B. Aorta-Aneurysma), periphere arterielle Erkrankung und ist eine Ursache für chronische Nierenerkrankung. Selbst geringe Erhöhung des arteriellen Blutdrucks ist mit einer verkürzten Lebenserwartung verbunden.
  • Der Begriff ”Hyperglykämie”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Zustand, wo abnorm hohe Glucose-Spiegel im Blut im Bezug auf die Spiegel der Fasten-Basislinie vorliegen. Insbesondere tritt Hyperglykämie auf, wenn die Glucose-Spiegel im Blut beim Fasten durchgehend höher sind als 126 mg/dL, die postprandialen Glucose-Spiegel höher sind als 140 mg/dL, oder die Glucose-Spiegel im venösen Plasma 2 Stunden nach der Verabreichung einer Dosis von Glucose von 1,75 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht über 200 mg/dL ist.
  • Der Begriff ”Insulinresistenz”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Erkrankung, bei der Zellen nicht korrekt auf Insulin antworten. Als Ergebnis produziert der Körper mehr Insulin als Antwort auf die hohen Glucose-Spiegel im Blut. Patienten mit Insulinresistenz zeigen häufig hohe Glucose-Spiegel und hohe Spiegel an zirkulierendem Insulin. Insulinresistenz ist häufig verbunden mit Adipositas, Hypertension und Hyperlipidämie. Zusätzlich tritt Insulinresistenz häufig bei Patienten mit Typ 2-Diabetes auf.
  • Der Begriff ”lokal verabreicht”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung dem Patienten an oder nahe an einer spezifischen Stelle verabreicht werden.
  • Der Begriff ”Adipositas”, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft die von der WHO bereitgestellte Definition von Adipositas, basierend auf dem Körper Maß-Index (BMI), der aus dem Verhältnis des Gewichts einer Person (in kg) und dem Quadrat der Körpergröße in Metern besteht. Gemäß diesen Kriterien wird ein BMI niedriger als 18,5 kg/m2 als nicht ausreichendes Gewicht oder zu dünn angesehen, ein BMI von 18,5–24,9 kg/m2 als Normalgewicht angesehen, ein BMI von 25,0–29,9 kg/m2 als Grad 1 Übergewicht angesehen, ein BMI von 30,0–39,0 kg/m2 als Grad 2 Übergewicht angesehen und ein BMI größer oder gleich 40,0 kg/m2 als krankhafte Adipositas angesehen. Als Alternative gibt es andere Methoden, um den Grad von Adipositas Individuums zu bestimmen, wie der Durchmesser der Taille gemessen am Mittelpunkt zwischen der unteren Grenze der Rippen und der oberen Grenze des Beckens (in cm), die Dicke der Hautfalten und Bioimpedanzmessung, basierend auf dem Prinzip, dass eine schlanke Masse Elektrizität besser leitet als Fettmasse.
  • Der Begriff ”funktionell verknüpft”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die funktionelle Beziehung und die Lokalisierung einer Promotorsequenz im Hinblick auf ein Polynukleotid von Interesse (z. B. ein Promotor oder Enhancer Ist funktionell verknüpft mit einer kodierenden Sequenz, wenn die Transkription der Sequenz dadurch beeinflusst wird). Im Allgemeinen ist ein Promotor mit der Sequenz von Interesse fortlaufend funktionell verknüpft. Jedoch ein Enhancer muss nicht fortlaufend mit der Sequenz von Interesse lokalisiert sein, um deren Expression zu kontrollieren.
  • Die Begriffe ”pharmazeutisch verträglicher Träger,” ”pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel,” ”pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoff” oder ”pharmazeutisch verträgliches Vehikel”, so wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich auf einen nicht toxischen, festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Ummantelungsmaterial oder Formulierungshilfsstoffe eines beliebigen konventionellen Typs. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger Ist im Wesentlichen nicht toxisch für den Rezipienten bei den angewendeten Dosen und Konzentrationen und ist mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel. Die Anzahl und die Natur des pharmazeutisch verträglichen Trägers hängen von der gewünschten Verabreichungsform ab. Die pharmazeutisch verträglichen Träger sind bekannt und können über Verfahren hergestellt werden, die in den Fachkreisen gut bekannt sind; siehe Faulí i Trillo C, ”Tratado de Farmacia Galénica” (Ed. Luzán 5, S. A., Madrid, ES, 1993) and Gennaro A, Ed., ”Remington: The Science and Practice of Pharmacy” 20th ed. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, US, 2003).
  • Der Begriff ”Promotor”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment, das die Funktion hat, die Transkription von einem oder mehreren Polynukleotiden zu kontrollieren, die stromaufwärts von der/den Polynukleotidsequenz(en) ist, und der strukturell identifiziert werden kann durch das Vorhandensein einer Bindungsstelle für DNA-abhängige RNA-Polymerase, von Transkriptionsstartstellen und beliebige andere DNA-Sequenzen einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Repressor- und Aktivator-Protein-Bindungsstellen und beliebige andere im Fachgebiet bekannte Sequenzen, um direkt oder indirekt einzuwirken, um die Menge an Transkription des Promotors zu regulieren. Ein ”gewebespezifischer” Promotor ist nur wirksam in speziellen Typen von differenzierten Geweben.
  • Der Begriff ”Polynukleotid”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, entweder DNA oder RNA, das Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide enthält. Die Nukleinsäure kann doppelsträngig oder einzelsträngig ein, oder Anteile von sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Der Begriff ”Polynukleotid” schließt ein, ist jedoch nicht begrenz auf, Nukleinsäuresequenzen mit der Fähigkeit, ein Polypeptid zu kodieren, und Nukleinsäuresequenzen, die teilweise oder vollständig komplementär zu einem endogenen Polynukleotid der Zelle oder des damit behandelten Individuums ist, so dass sie nach deren Transkription ein RNA-Molekül erzeugt (z. B. microRNA, shRNA, siRNA), das in der Lage ist, zu hybridisieren und die Expression des endogenen Polynukleotids zu hemmen.
  • Der Begriff ”post-transkriptionelle, regulatorische Region”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Polynukleotid, das die Expression, Stabilisierung oder Lokalisierung der in der Kassette enthaltenen Sequenzen oder des resultierenden Genprodukts erleichtert.
  • Die Begriffe ”vorbeugen”, ”vorbeugend” und ”Prävention”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Hemmung des Auftretens oder das Vermindern des Vorkommens einer Krankheit in einem Individuum. Prävention kann vollständig (z. B. die komplette Abwesenheit von pathologischen Zellen in einem Individuum) oder teilweise sein. Prävention bezieht sich auch auf eine reduzierte Anfälligkeit für einen klinischen Zustand.
  • Der Begriff ”rekombinantes virales Genom”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein AAV-Genom, in dem mindestens ein fremdes Expressionskassetten-Polynukleotid in das natürlich vorkommende AAV-Genom eingeführt wurde.
  • Der Begriff ”rep-Gene” oder ”AAV-rep-Gen”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Gen, das ein Rep-Protein kodiert. Der Begriff ”Rep-Protein”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid mit mindestens einer funktionellen Aktivität eines nativen AAV Rep-Proteins (z. B. Rep 40, 52, 68, 78). Eine ”funktionelle Aktivität” eines Rep-Proteins (z. B. Rep 40, 52, 68, 78) ist jede Aktivität, die mit der physiologischen Funktion des Proteins verbunden ist, einschließlich dem Erleichtern der Replikation der DNA über Erkennung, Bindung und Aufgreifen des AAV-Ursprungs der DANN-Replikation sowie die DNA-Helicase-Aktivität. Zusätzliche Funktionen schließen die Modulation der Transkription von AAV (oder andere heterologe) Promotoren und ortsspezifische Integration von AAV DNA in ein Wirtschromosom ein.
  • Der Begriff ”Individuum”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Individuum, Pflanze oder Tier, wie Menschen, nicht menschliche Primaten (z. B. Schimpansen und andere Menschenaffen und andere Affenarten), Farmtiere (z. B. Vögel, Fische, Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen und Pferde), Haustiere (z. B. Hunde und Katzen) oder Labortiere (z. B. Nager wie Mäuse, Ratten und Meerschweinchen). Der Begriff kennzeichnet kein bestimmtes Alter oder Geschlecht. Der Begriff ”Begriff” schließt einen Embryo und einen Fötus ein.
  • Der Begriff ”systemisch verabreicht” und ”systemische Verabreichung”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung dem Individuum in einer nicht lokalisierten Art und Weise verabreicht werden. Die systemische Verabreichung der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können verschiedene Organe und Gewebe innerhalb des Körpers des Individuums erreichen, oder können nur bestimmte Organe oder Gewebe des Individuums erreichen. Zum Beispiel kann die intravenöse Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung in der Transduktion von mehr als einem Gewebe oder Organ in einem Individuum resultieren.
  • Der Begriff ”transkriptionelle, regulatorische Region”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment, das in der Lage ist, die Expression von einem oder mehreren Genen zu regulieren. Die regulatorischen Regionen der Polynukleotide der Erfindung schließen einen Promotor und einen Enhancer ein.
  • Der Begriff ”Transduktion”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess, bei dem eine fremde Nukleotidsequenz in eine Zelle mithilfe eines Virusvektors eingefügt wird.
  • Der Begriff ”Transfektion”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf das Einführen einer DNA in eine eukaryontische Zelle eines Rezipienten.
  • Der Begriff ”behandeln” oder ”Behandlung”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung der Erfindung zur Kontrolle des Fortschreitens der Krankheit, nachdem die klinischen Anzeichen aufgetreten sind. Die Kontrolle des Fortschreitens der Krankheit ist zu verstehen als vorteilhafte oder erwünschte klinische Resultate, die die Folgenden einschließen, jedoch nicht begrenzt darauf sind: Verminderung der Symptome, Reduktion der Dauer der Krankheit, Stabilisierung des pathologischen Zustands (insbesondere die Vermeidung von zusätzlicher Verschlechterung), Verzögerung des Fortschreitens der Krankheit, Verbesserung des pathologischen Zustands und Remission (sowohl partiell als auch vollständig). Die Kontrolle des Fortschreitens der Krankheit schließt auch die Verlängerung der Lebenszeit ein, verglichen mit der Lebenserwartung, wenn die Behandlung nicht angewendet wird.
  • Der Begriff ”Typ 2-Diabetes”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Erkrankung, die durch einen nicht adäquaten Anstieg des Glukose-Spiegels im Blut gekennzeichnet ist. Die chronische Hyperglykämie bei Diabetes ist mit Langzeitschäden, Fehlfunktion und dem Versagen verschiedener Organe verbunden, was zu einer Reihe von Komplikationen wie Retinopathie, Nephropathie und periphere Neuropathie führen kann. Typ 2-Diabetes wird durch Insulinresistenz in peripheren Geweben (hauptsächlich Skelettmuskel, Fettgewebe und Leber) und unpassender kompensatorischer Insulinsekretion, aufgrund der Kombination von verringerter β-Zellmasse und -Funktion verursacht. Zusätzlich zum Anstieg der Glucose-Konzentration wird durch fehlerhafte Insulinwirkung häufig ein Anstieg des Cholesterin- oder Triglycerid-Spiegels verursacht.
  • Der Begriff ”Vaskulogenese”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Bildung, das Wachstum, die Entwicklung oder Proliferation von Blutgefäßen, die von undifferenzierten oder differenzierten Zellen stammen.
  • Der Begriff ”Vektor”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Konstrukt, das in der Lage ist, ein oder mehrere Polynukleotide von Interesse einer Wirtszelle zuzuführen und gegebenenfalls zu exprimieren. Beispiele von Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Virusvektoren, nackte DNA- oder RNA-Expressionsvektoren, Plasmid-, Cosmid- oder Phagenvektoren, DNA- oder RNA-Expressionsvektoren, die mit kationischen, kondensierenden Mitteln verbunden sind, DNA- oder RNA-Expressionsvektoren, die in Liposomen eingekapselt sind, und bestimmte eukaryontische Zellen, wie Producer-Zellen. Die Vektoren können stabil und selbst-replizierend sein. Es gibt keine Beschränkungen in Bezug auf die Art des Vektors, der verwendet werden kann. Der Vektor kann ein Klonierungsvektor sein, der geeignet ist für die Ausbreitung und den Erhalt der Polynukleotide, Genkonstrukte oder Expressionsvektoren, eingebaut in verschiedene heterologe Organismen. Geeignete Vektoren schließen prokaryontische Expressionsvektoren (z. B. pUC18, pUC19, Bluescript und deren Derivate), mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEI, pCRI, RP4, Phage- und Shuttle-Vektoren (z. B. pSA3 and pAT28), und eukaryontische Expressionsvektoren, basierend auf Virusvektoren (z. B. Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren sowie Retroviren und Lentiviren), sowie nicht-virale Vektoren wie pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXI, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d und pTDTI ein.
  • Der Begriff ”VEGF”, wie hierin verwendet, bedeutet vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor. ”VEGF” schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf die VEGF-Varianten A, B, C, D, E und F; siehe Hamawy A, et al., Curr. Opin. Cardiol. 1999; 14: 515–522, Neufeld G, et al., Prog. Growth Factor Res. 1994; 5: 89–97, Olofsson B, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 2576–2581, Chilov D, et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 25176–25183, und Olofsson B, et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1999; 10: 528–535. Die VEGF A-Variante schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf die Isoformen VEGF164, VEGF128, VEGF145, VEGF167 VEGF165, VEGF189 und VEGF206; siehe Tischer E, et al., J. Biol. Chem. 1991; 266: 11947–11954 und Poltorak Z, et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 7151–7158. Der Begriff ”VEGF” schließt auch den vaskulären Permeabilitätsfaktor oder Vaskulotropin (VPF) ein; siehe Keck P, et al., Science 1989; 246: 1309–1312 und Senger D, et al., Science 1983; 219: 983–985. VPF ist derzeit im Fachgebiet bekannt als VEGF A. Andere Mitglieder der VEGF-Familie können auch verwendet werden, einschließlich der Plazenta-Wachstumsfaktoren PIGF I und II. Die Sequenzen von geeigneten VEGFs sind leicht erhältlich (z. B. National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/June 2012). Zum Beispiel schließen die loci der humanen VEGF-Familienmitglieder ein: VEGF-A-P15692 und NP003367; VEGF-B-NP003368, P49765, AAL79001, AAL79000, AAC50721, AAB06274, und AAH08818; VEGF-C-NP005420, P49767, S69207, AAB36425, und CAA63907; VEGF-D-NP004460, AAH27948, O43915, CAA03942, und BAA24264; VEGF-E-AAO88857; VEGF-F-2VPFF; PIGF-1-NP002623, AAH07789, AAH07255, AAH01422, P49763, CAA38698 und CAA70463; synthetische Konstrukte von Chain A-1FZVA und Chain B-1FZVB von PIGF-1; und PIGF-2-AAB25832 und AAB30462. Vorzugsweise ist VEGF humanen Ursprungs. VEGF von anderen Spezies, wie Maus, kann jedoch ebenfalls im Einklang mit der Erfindung verwendet werden.
  • Der Begriff ”weiße Fettgewebezelle” oder ”weißer Adipozyt”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Typ von Adipozyt, der polyhedral bis sphärisch ist, und der ein großes ”unilokulares” Lipid-Tröpfchen umgeben von einer dünnen Schicht von Zytoplasma enthält. Der Nukleus der Zellen ist flachgedrückt und in der Peripherie lokalisiert. Der Durchmesser der weißen Adipozyten ist variabel und liegt im Bereich zwischen 30 und 70 μm, entsprechend der Depotstelle. Das gespeicherte Fett ist in einem semi-flüssigen Zustand und ist hauptsächlich aus Triglyceriden und Cholesterylester zusammengesetzt. Weiße Adipozyten sekretieren viele Peptide und Proteine, gemeinsam bekannt als Adipokine, wie Resistin, Adiponectin und Leptin.
  • Der Begriff ”Woodchuck Hepatitis Virus post-transkriptionelle, regulatorische Element” oder ”WPRE”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die, wenn sie transkribiert wird, eine Tertiärstruktur ausbildet, die in der Lage ist, die Expression eines Gens zu fördern; siehe Lee Y, et al., Exp. Physiol. 2005; 90(1): 33–37 und Donello J, et al., J. Virol. 1998; 72(6): 5085–5092.
  • Der Begriff ”microRNAs” oder ”miRNAs”, wie hierin verwendet, sind kleine (–22-nt), evolutionär konservierte, regulatorische RNAs, die bei dem RNA-vermittelten Gen-Silencing auf post-transkriptioneller Ebene involviert sind; siehe Bartel DP. Cell 2004; 116: 281–297. Über Basenpaarung mit komplementären Regionen (meistens in der 3' nicht translatierten Region (3'UTR) der zellulären Boten-RNA (mRNA)), können die miRNAs bewirken, dass die mRNA-Translation unterdrückt wird, oder bei hoher Sequenzhomologie katalytischen Abbau der mRNA verursachen. Aufgrund der hoch differenzierten Gewebe-Expression von vielen miRNAs können zelluläre miRNAs genutzt werden, um gewebespezifisches Zielen der Gentherapie-Vektoren zu vermitteln. Durch gentechnisches Zusammenfügen von Tandem-Kopien von Zielelementen in den Virusvektoren, die perfekt komplementär zu den gewebespezifischen miRNAs (miRT) sind, kann die Transgen-Expression in unerwünschten Geweben effizient gehemmt werden.
  • 2. Adeno-assoziierte Virusvektoren, die Fettgewebe-spezifische Expression bereitstellen
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung einen Adeno-assoziierten Virusvektor (AAV-Vektor), der ein rekombinantes virales Genom umfasst, wobei das rekombinante virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine Fettgewebe-spezifische, transkriptionelle, regulatorische Region, funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse, umfasst.
  • AAV gemäß der vorliegenden Erfindung schließt einen beliebigen Serotyp der 42 bekannten Serotypen von AAV ein. Im Allgemeinen haben die Serotypen von AAV genomische Sequenzen mit deutlicher Homologie auf Aminosäure- und Nukleinsäure-Ebene, liefern eine identische Reihe von genetischen Funktionen, produzieren Virionen, die im Wesentlichen äquivalent in physikalischer und funktioneller Hinsicht sind und replizieren und assemblieren über praktisch identische Mechanismen. Insbesondere können die AAV der vorliegenden Erfindung zum Serotyp 1 von AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (einschließlich Typ 3A und 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Vogel-AAV, Rinder AAV, Hund AAV, Pferde-AAV, Schaf-AAV und jedem anderen AAV gehören. Beispiele von Sequenzen des Genoms von verschiedenen AAV-Serotypen können in der Literatur oder in öffentlichen Datenbanken wie GenBank gefunden werden; siehe GenBank Hinterlegungsnummern AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAVB), und AX753250.1 (AAV9). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Adeno-assoziierte Virusvektor der Erfindung von einem Serotyp, der ausgewählt Ist, aus der Gruppe, bestehend aus den AAV6-, AAV7-, AAV8- und AAV9-Serotypen.
  • Das Genom des AAV gemäß der Erfindung umfasst typischerweise die cis-wirkenden 5' und 3' invertierten terminalen Wiederholungssequenzen und eine Expressionskassette; siehe Tijsser P, Ed., ”Handbook of Parvoviruses” (CRC Press, Boca Raton, FL, US, 1990, pp. 155–168). Die ITR-Sequenzen sind etwa 145 Basenpaare lang. Vorzugsweise werden im Wesentlichen die gesamten Sequenzen in dem Molekül verwendet, die die ITRs kodieren, obwohl ein geringer Grad an Modifikation dieser Sequenzen erlaubt ist. Verfahren, um diese ITR-Sequenzen zu modifizieren, sind dem Fachmann bekannt; siehe Brown T, ”Gene Cloning” (Chapman & Hall, London, GB, 1995), Watson R, et al., ”Recombinant DNA”, 2. Auflage. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992), Alberts B, et al., ”Molecular Biology of the Cell” (Garland Publishing Inc., New York, NY, US, 2008), Innis M, et al., Hrs., ”PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications” (Academic Press Inc., San Diego, CA, US, 1990), Erlich H, Hrs., ”PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification” (Stockton Press, New York, NY, US, 1989), Sambrook J, et al., ”Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989), Bishop T, et al., ”Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, GB, 1987), Reznikoff W, Ed., ”Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US, 1987), Davis L, et al., ”Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, US, 1986), und Schleef M, Hrs., ”Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, OF, 2001). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Genom des AAV die 5'- und 3'-AAV-ITRs. In einer anderen Ausführungsform stammen die 5-' und 3'-AAV-ITRs von AAV2. In noch einer anderen Ausführungsform fehlt dem rekombinanten Genom des AAV das offene Leseraster von rep oder cap. In einer Ausführungsform sind die AAV2-ITRs so ausgewählt, dass sie ein Pseudotyp-AAV generieren (d. h., ein AAV mit einem Capsid und ITRs, die von verschiedenen Serotypen stammen).
  • Das Polynukleotid der Erfindung kann ITRs umfassen, die von einem beliebigen AAV-Serotyp stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ITRs abgeleitet von dem AAV2-Serotyp.
  • Der AAV der Erfindung schließt ein Capsid eines beliebigen Serotyps ein. In einer bestimmten Ausführungsform ist das Capsid abgeleitet von dem AAV der Gruppe, bestehend aus AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der AAV der Erfindung ein Capsid, das von den AAV8- oder AAV9-Serotypen abgeleitet ist. In einer weiteren Ausführungsform hat die VP1-Sequenz des AAV-Capsids die SEQ ID NO. 18; siehe GenBank-Hinterlegungsnummer AY530579.
  • In einigen Ausführungsformen kann ein AAV-Cap für die Verwendung bei den Verfahren der Erfindung durch Mutagenese (d. h., durch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen) von einem der vorher genannten AAV-Caps oder der kodierenden Nukleinsäuren erzeugt werden. In einigen Ausführungsformen ist der AAV-Cap mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% oder mehr, ähnlich zu einem der vorher erwähnten AAV-Caps.
  • In einigen Ausführungsformen ist das AAV-Cap chimär und umfasst Domänen von zwei, drei, vier oder mehr der vorher erwähnten AAV-Caps. In einigen Ausführungsformen ist der AAV-Cap ein Mosaik aus VP1-, VP2- und VP3-Monomeren, die von zwei oder drei verschiedenen AAVs oder einem rekombinanten AAV.?? In einigen Ausführungsformen umfasst eine rAAV-Zusammensetzung mehr als einen der vorher genannten Caps.
  • In einigen Ausführungsformen ist ein AAV-Cap zur Verwendung in einer rAAV-Zusammensetzung gentechnisch so konstruiert, dass es eine heterologe Sequenz oder eine andere Modifikation enthält. Zum Beispiel kann eine Peptid- oder Proteinsequenz, die selektives Zielen („targeting”) vermittelt, in ein Cap-Protein eingebaut werden. Alternativ oder zusätzlich kann der Cap chemisch so modifiziert sein, dass die Oberfläche des rAAV Polyethylen-glycolysiert (d. h., pegyliert) ist, was die Immunevasion? erleichtert. Das Cap-Protein kann auch mutagenisiert sein (z. B., um die natürliche Rezeptorbindung zu entfernen oder um ein immunogenes Epitop zu maskieren).
  • In einer anderen speziellen Ausführungsform ist der AAV-Vektor ein Pseudotyp-AAV-Vektor (d. h., der Vektor umfasst Sequenzen oder Komponenten, die von mindestens zwei unterschiedlichen AAV-Serotypen abstammen). In einer bestimmten Ausführungsform umfasst der Pseudotyp-AAV-Vektor ein AAV-Genom, das von einem AAV-Serotyp (z. B. AAV2) abgeleitet ist, und ein Capsid, das zumindest teilweise von einem unterschiedlichen AAV-Serotyp stammt. Spezielle Beispiele solcher Pseudotyp-AAV-Vektoren schließen ein, ohne Beschränkung, Vektoren, die ein Genom umfassen, das von einem beliebigen AAV-Serotyp stammt (z. B. von AAV1 bis AAV11), in einem von AAV6, AAV7, AAV8 oder AAV9-abgeleiteten Capsid.
  • In einer Ausführungsform enthält der AAV-Vektor einen Promotor mit zusätzlich mindestens einer Zielsequenz von mindestens einer miRNA, die ausgewählt sein kann aus der folgenden Liste: miR122 (miRBase Datenbank Hinterlegungsnummer MI0000442), miR152 (MI0000462), miR199 (MI0000242), miR215 (MI0000291), miR192 (MI0000234), miR148a (MI0000253), miR194 (MI0000488), miR1 (MI0000651), miRT133 (MI0000450), miR206 (MI0000490), miR208 (MI0000251), miR124 (MI0000443), miR125 (MI0000469), miR216 (MI0000292), miR130 (MI0000448). Die Sequenz-Referenzen sind erhalten worden von der miRBase (http://www.mirbase.org/, gemäß der Version von 31/07/2013).
  • In einer Ausführungsform enthält der AAV-Vektor einen Promotor mit zusätzlich mindestens einer miRNA-Zielsequenz, die ausgewählt sein kann aus der folgenden Liste:
  • Liste 1
    Figure DE112013007239T5_0002
  • Figure DE112013007239T5_0003
  • In einer Ausführungsform enthält der AAV-Vektor einen Promotor mit zusätzlich mindestens einer miRNA-Zielsequenz mit einer Homologie von 85% mit einer miRNA-Zielsequenz, ausgewählt aus der vorstehenden Liste 1.
  • In einer Ausführungsform enthält der AAV-Vektor einen Promotor mit zusätzlich mindestens einer miRNA-Zielsequenz, die ein funktionelles Äquivalent zu einer miRNA-Zielsequenz ist, die ausgewählt ist aus der vorstehenden Liste 1. In diesem Fall bedeutet der Begriff „funktionelles Äquivalent” jede Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, die gleichen miRNAs zu binden, die die Originalsequenz bindet. Zum Beispiel ist ein funktionelles Äquivalent von miRT122a jede Sequenz, die mit der gleichen Anzahl von miRNAs hybridisiert, die mit miRT122a hybridisieren würde. Die Nukleotidsequenz des funktionellen Äquivalents behält die relevante biologische Aktivität einer Referenz-mirT-Sequenz bei. Das bedeutet, dass ein funktionelles Äquivalent einer mirT-Sequenz die Fähigkeit haben würde, die Transgen-Expression in unerwünschten Geweben zu inhibieren, gleichermaßen wie die Referenz-mirT-Sequenz.
  • In einer anderen speziellen Ausführungsform kann die miRNA-Zielsequenz ausgewählt sein aus mirT122a (5'CAAACACCATTGTCACACTCCA3'), worauf Bezug genommen wird als SEQ ID NO: 19 oder mirT1 (5'TTACATACTTCTTTACATTCCA3'), worauf Bezug genommen wird als SEQ ID NO: 20.
  • Die transkriptionelle, regulatorische Region kann einen Promotor und gegebenenfalls eine Enhancer-Region umfassen. Vorzugsweise ist der Promotor spezifisch für Fettgewebe. Der Enhancer muss nicht notwendigerweise spezifisch für Fettgewebe sein. Alternativ kann die transkriptionelle, regulatorische Region einen Fettgewebe-spezifischen Promotor und einen Fettgewebe-spezifischen Enhancer umfassen.
  • In einer Ausführungsform ist der Fettgewebe-spezifische Promotor ein Fettgewebe-spezifischer Promotor, wie zum Beispiel das Adipozyten-Protein 2 (aP2, auch bekannt als Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4)), der PPARy-Promotor, der Adiponectin-Promotor, der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase(PEPCK)-Promotor, der Promotor, der von dem humanen Aromatase-Cytochrom p450 abgeleitet ist (p450arom), oder der Foxa-2-Promotor; siehe Graves R, et al., Genes Dev. 1991; 5: 428–437, Ross S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 9590–9594, Simpson E, et al., US 5,446,143 , Mahendroo M, et al., J. Biol. Chem. 1993; 268: 19463–19470, Simpson E, et al., Clin. Chem. 1993; 39: 317–324, und Sasaki H, et al., Cell 1994; 76: 103–115. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Fettgewebe-spezifischen aP2-Enhancer und dem Fettgewebe-spezifischen UCP1-Enhancer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fettgewebe-spezifische regulatorische Region des AAV gemäß der Erfindung den Fettgewebe-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen aP2-Promotor; siehe Rival Y, et al., J. Pharmacol, Exp. Ther. 2004: 311(2): 467–475. Die Region, umfassend Fettgewebe-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen aP2-Promotor, ist auch als ”mini/aP2 regulatorische Region” bekannt und wird gebildet aus dem basalen Promotor des aP2-Gens und dem Fettgewebe-spezifischen Enhancer des aP2-Gens. Vorzugsweise ist der aP2-Promotor von der Maus; siehe Graves R, et al., Mol. Cell Biol. 1992; 12(3): 1202–1208 und Ross S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 9590–9594. In einer bestimmten Ausführungsform hat die mini/aP2 regulatorische Region die Sequenz SEQ ID NO: 2.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fettgewebe-spezifische, regulatorische Region des AAV gemäß der Erfindung den Fettgewebe-spezifischen UCP1-Enhancer und den basalen UCP1-Promotor; siehe del Mar González-Barroso M, et al., J. Biol. Chem. 2000; 275(41): 31722–31732 und Rim J, et al., J. Biol. Chem. 2002; 277(37): 34589–34600. Die Region, umfassend den Fettgewebe-spezifischen UCP1-Enhancer und den basalen UCP1-Promotor, die auch als ”mini/UCP regulatorische Region” bekannt ist, und bezieht sich auf eine Kombination des basalen Promotors des UCP1-Gens und den Fettgewebe-spezifischen Enhancer des UCP1-Gens. Vorzugsweise wird ein UCP1-Promotor von Ratte verwendet; siehe Larose M, et al., J. Biol. Chem. 1996; 271(49): 31533–31542 und Cassard-Doulcier A, et al., Biochem. J. 1998; 333: 243–246. In einer bestimmten Ausführungsform hat die mini/UCP1 regulatorische Region die Sequenz SEQ ID NO: 3.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette, die einen Teil des AAV der Erfindung ausbildet, weiterhin Expressionskontrollsequenzen einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, geeignete Transkriptionssequenzen (d. h., Initiations-, Terminations-, Promotor- und Enhancer-Sequenzen), effiziente RNA Prozessierungssignale (z. B. Splicing- und Polyadenylierungssignale (polyA)), Sequenzen, die die Zytoplasma-mRNA stabilisieren, Sequenzen, die die Translationseffizienz verstärken (d. h., Kozak-Konsensus-Sequenz), Sequenzen, die die Proteinstabilität verbessern und, falls erwünscht, Sequenzen, die Sekretion des kodierten Produkts verbessern. In dem Fachgebiet ist eine große Anzahl an Expressionskontrollsequenzen bekannt, einschließlich Promotoren, die native, konstitutiv, induzierbar oder gewebespezifisch sein können, und gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette, die einen Teil des AAV der Erfindung ausbildet, weiterhin eine post-transkriptionelle, regulatorische Region. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die post-transkriptionelle, regulatorische Region die Woodchuck Hepatitis Virus post-transkriptionelle, regulatorische Region (WPRE) oder funktionelle Varianten oder Fragmente davon und PPT-CTS oder funktionelle Varianten oder Fragmente davon; siehe Zufferey R, et al., J. Virol. 1999; 73: 2886–2892 und Kappes J, et al., WO 2001/044481 . In einer bestimmten Ausführungsform ist die post-transkriptionelle, regulatorische Region WPRE.
  • Die Expressionskassette, die einen Teil des AAV der Erfindung ausbildet, umfasst ein ”Polynukleotid von Interesse”. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, das systemisch wirkt. In einer anderen Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, das auf oder in der Nachbarschaft einer Fettzelle wirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein, das auf oder in der Nachbarschaft einer Fettzelle wirkt, Hexokinase (HK), einschließlich jede der vier Säuger-HK-Isozyme (EC 2.7.1.1), die den subzellulären Lokalisierungen und der Kinetik im Hinblick auf die verschiedenen Substrate variieren. HK schließt beispielsweise ein: HK1 (GenBank Hinterlegungsnummers NP000179, NP277031, NP277032, NP277033, NP277035), HK2 (GenBank Hinterlegungsnummer NP000180), HK3 (GenBank Hinterlegungsnummer NP002106) und HK4 oder Glucokinase (GenBank Hinterlegungsnummern NP000153, NP277042, NP277043). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die HK Glucokinase, was hierin austauschbar mit Hexokinase 4 oder HK4 verwendet wird, und bezieht sich auf eine Isoform der Hexokinase mit einem Km für Glucose, der 100 mal höher ist als HK1, HK2 oder HK3.
  • In einer Ausführungsform ist das Protein, das auf oder in der Nachbarschaft einer Fettzelle wirkt, eine alkalische Phosphatase (AP), einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, den Intestinal-Typ oder IAP (GenBank Hinterlegungsnummer NP001622), den Placenta-Typ oder PLAP (GenBank Hinterlegungsnummer NP001623) und dem gewebeunspezifischen Isozym oder ALPL (GenBank Hinterlegungsnummern NP000469, NP001120973.2. und NP001170991.1). In einer anderen Ausführungsform ist das Protein, das auf oder in der Nachbarschaft einer Fettzelle wirkt, VEGF einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, die VEGF-Varianten A, B, C, D, E und F.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Polypeptid, das normalerweise von den Adipozyten erzeugt und sekretiert wird. In einer anderen Ausführungsform ist das Polypeptid, das normalerweise von den Adipozyten erzeugt und sekretiert wird, ein Adipsin (z. B. insbesondere ein Adipsin, das ein Serinprotease-Homolog ist), Adiponectin, Leptin, Resistin oder ein Proteinprodukt des ob-Gens.
  • Weitere nützliche Polynukleotide von Interesse schließen diejenigen ein, die Hormone und Wachstums- und Differenzierungsfaktoren kodieren einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Insulin, Glucagon, Wachstumshormon (GH), Parathyroidhormon (PTH), Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor (GRF), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), humanes Choriongonadotropin (hCG), Angiopoietine, Angiostatin, Granulozytenkolonie stimulierender Faktor (GCSF), Erythropoietin (EPO), Bindegewebe-Wachstumsfaktor (CTGF), basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Thrombozyten-stammender Wachstumsfaktor (PDGF), Insulin Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I und TGF-II), ein beliebiger der transformierenden Wachstumsfaktor a-Superfamilie, einschließlich TGFa, Activine, Inhibine oder ein beliebiger der Knochen-morphogenetischen Proteine (BMP) BMPs 1–15, ein beliebiger von Heregluin/Neuregulin/ARIA/neu-Differentierungsfaktor(NDF)-Familie von Wachstumsfaktoren, Nerven-Wachstumsfaktor (NGF), vom Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophine NT-3 und NT-4/5, ziliärer neurotropher Faktor (CNTF), von Gliazelllinen stammender neurotropher Faktor (GDNF), Neurturin, Agrin, jeder aus der Familie der Semaphorine/Collapsine, Netrin-1 und Netrin-2, Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Ephrine, Noggin, Sonic Hedgehog und Tyrosinhydroxylase.
  • Weitere nützliche Polynukleotide von Interesse schließen diejenigen ein, die Proteine kodieren, die das Immunsystem regulieren, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Zytokine und Lymphokine wie Thrombopoietin (TPO), Interleukine (IL) IL-1 bis I1-25 (z. B. IL-2, IL-4, IL-12 und IL-18), Monozytenattraktions-Protein, Leukämie-inhibierender Faktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, Fas-Ligand, Tumornekrose-Faktoren α und β, Interferone α, β und γ, Stammzell-Faktor, flk-2/flt3-Ligand. Genprodukte, die durch das Immunsystem erzeugt werden, sind bei der Erfindung ebenfalls nützlich. Diese schließen ein, ohne darauf begrenzt zu sein, Immunglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, chimäre Immunglobuline, humanisierte Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zellrezeptoren, chimäre T-Zellrezeptoren, Einzelketten-T-Zellrezeptoren, Klasse I und Klasse II MHC- und HLA-Moleküle, wie gentechnisch veränderte Immunglobuline und MHC- und HLA-Moleküle. Nützliche Genprodukte schließen auch regulatorische Komplementproteine, wie regulatorische Komplementproteine, Membran-Cofaktor-Protein (MCP), Zerfall-beschleunigende Faktoren (DAF), CRI, CF2 und CD59 ein.
  • Weiterhin nützliche Polynukleotide von Interesse schließen diejenigen ein, die einen beliebigen der Rezeptoren der Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Lymphokine, regulatorische Proteine und Proteine des Immunsystems kodieren. Die Erfindung umfasst Rezeptoren für Cholesterin-Regulation oder Lipid-Modulation, einschließlich des Rezeptors des Lipoproteins niedriger Dichte (LDL), des Rezeptors des Lipoproteins hoher Dichte (HDL), des Rezeptors des Lipoproteins sehr niedriger Dichte (VLDL) und der Scavenger-Rezeptoren. Die Erfindung umfasst auch Genprodukte wie die Mitglieder der Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie einschließlich Glucocorticoid-Rezeptoren und Östrogen-Rezeptoren, Vitamin D-Rezeptoren und andere nukleare Rezeptoren. Zusätzlich schließen nützliche Genprodukte Transkriptionsfaktoren ein, wie jun, fos, max, mad, Serum-Response-Faktor (SRF), AP1, AP2, myb, MyoD und Myogenin, ETS-box enthaltende Proteine, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-box bindende Proteine, Interferon-Regulationsfaktor (IRF-1), Wilms-Tumorprotein, ETS-bindendes Protein, STAT, GATA-box bindende Proteine (z. B. GATA-3) und die Forkhead-Familie der geflügelten Helix-Proteine.
  • Weitere nützliche Polynukleotide von Interesse schließen diejenigen ein, die Enzyme kodieren, die Carbamoyl-Synthetase I, Ornithin-Transcarbamylase, Arginosuccinat-Synthetase, Arginosuccinat-Lyase, Arginase, Fumarylacetacetat-Hydrolase, Phenylalanin-Hydroxylase, α-1 Antitrypsin, Glucose-6-phosphatase, Porphobilinogen-Deaminase, Cystathion-β-Synthase, verzweigt-kettige Ketosäure-Decarboxylase, Albumin, isoValeryl-coA-Dehydrogenase, Propionyl CoA-Carboxylase, Methyl-Malonyl CoA-Mutase, Glutaryl-CoA-dehydrogenase, Insulin, β-Glucosidase, Pyruvat-Carboxylat, hepatische Phosphorylase, Phosphorylase-Kinase, Glycin-Decarboxylase, T-Protein, eine zystische Fibrose Transmembran-Regulator(CFTR)-Sequenz und ein Dystrophin-Genprodukt (z. B. ein mini- oder mikro-Dystrophin). Noch weitere nützliche Polynukleotide von Interesse schließen Enzyme ein, die bei der Ersatztherapie nützlich sind, wie zum Beispiel Enzyme, die Mannose-6-phosphat für die Behandlung von lysosomalen Speicherkrankheiten enthalten (z. B. ein geeignetes Gen, das β-Glucuronidase (GUSB) kodiert).
  • Die Verpackungsgröße der AAV-Vektoren ist begrenzt auf die Größe des Eltern-Wildtyp-AAV-Genoms, dessen Größenbereiche vom AAV-Serotyp abhängen (d. h., von 4.087 bis 4.767); siehe Wu Z, et al., Mol. Ther. 2010; 7(1): 80–86. Zum Beispiel hat das Wildtyp-AAV-2 eine Genomgröße von 4.679 und das Wildtyp-AAV-6 hat eine Genomgröße von 4.683. In einigen Ausführungsformen kann die Klonierungskapazität des rekombinanten RNA-Vektors begrenzt sein und eine gewünschte Kodierungssequenz kann den vollständigen Austausch von 4,8 Kilobasen Virusgenom einschließen. Große Gene können daher in einigen Fällen für eine Standardverwendung eines rekombinanten AAV-Vektors ungeeignet sein. Dem Fachmann ist bewusst, dass Optionen zur Verfügung stehen, um die begrenzte Kodierungskapazität zu umgehen. Zum Beispiel können sich die AAV-ITRs von zwei Genomen aneinanderlagern, um Kopf zu Schwanz-Konkatamere zu bilden, die die Kapazität des Vektors fast verdoppeln. Das Einführen von Splice-Stellen ermöglicht das Entfernen der ITRs vom Transkript. Andere Möglichkeiten, um die begrenzte Kodierungskapazität zu umgehen, sind dem Fachmann bekannt.
  • 3. Therapeutische Verfahren basierend auf dem Tropismus von AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9 für adipöses Gewebe
  • In einem zweiten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung Adeno-assoziierte Virusvektoren der AAV6-, AAV7-, AAV8- und AAV9-Serotypen, die in der Lage sind, Fettgewebezellen wirksam zu transduzieren. Dieses Merkmal ermöglicht die Entwicklung von Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, welche die Expression eines Polypeptids von Interesse in Adipozyten erfordern oder von ihr profitieren. Insbesondere erleichtert diese Erkenntnis die Zuführung von Polypeptiden von Interesse zu einem Individuum, das es benötigt, durch Verabreichung der AAV-Vektoren der Erfindung an den Patienten, wodurch Adipozyten erzeugt werden, die in der Lage sind, das Polynukleotid von Interesse und dessen kodiertes Polypeptid in vivo zu exprimieren. Wenn das kodierte Polypeptid ein Sekretionspolypeptid ist, kann es durch die Adipozyten sekretiert werden, was die systemische Zuführung des Polypeptids auf diesem Wege erlaubt.
  • Somit stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform einen Adeno-assoziierten Virusvektor bereit, der ein rekombinantes, virales Genom umfasst, worin das rekombinante, virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine transkriptionelle, regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst, worin der Serotyp des AAV ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9 zur Verwendung für die Behandlung oder Prävention einer Krankheit, welche die Expression eines Polypeptids von Interesse in Adipozyten erfordert.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Adeno-assoziierten Virusvektor bereit, der ein rekombinantes, virales Genom umfasst, worin das rekombinante, virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine Fettgewebe-spezifische, transkriptionelle, regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst zur Verwendung für die Behandlung oder Prävention einer Krankheit, welche die Expression eines Polypeptids von Interesse erfordert.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Behandlung oder Prävention einer Krankheit in einem Individuum, welches die Expression eines Polypeptids von Interesse erfordert, bereit, das die Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virusvektors an das Individuum umfasst, der ein rekombinantes, virales Genom umfasst, wobei das rekombinante, virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine transkriptionelle, regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst, wobei der Serotyp des AAV ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Behandlung oder Prävention einer Krankheit in einem Individuum, welches die Expression eines Polypeptids von Interesse erfordert, bereit, das die Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virusvektors an das Individuum umfasst, der ein rekombinantes, virales Genom umfasst, wobei das rekombinante, virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine Fettgewebe-spezifische, transkriptionelle, regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst.
  • Das AAV zur Verwendung bei den therapeutischen Verfahren der Erfindung umfasst eine Expressionskassette, die ein Polynukleotid von Interesse und eine transkriptionelle, regulatorische Region umfasst. Die transkriptionelle, regulatorische Region kann eine Promotor- und gegebenenfalls ein Enhancer-Region umfassen.
  • In einer Ausführungsform ermöglicht die transkriptionelle, regulatorische Region die konstitutive Expression des Polynukleotids von Interesse. Beispiele für konstitutive Promotoren schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, den retroviralen Rous Sarcoma Virus (RSV) LTR-Promotor (gegebenenfalls mit dem RSV-Enhancer), der Zytomegalievirus(CMV)-Promotor (gegebenenfalls mit dem CMV-Enhancer), der SV40-Promotor, der Dihydrofolat-Reduktase-Promotor, der β-Actin-Promotor, der Phosphoglycerol-Kinase(PGK)-Promotor und der EFIa-Promotor; siehe Boshart M, et al., Cell 1985; 41: 521–530.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die transkriptionelle, regulatorische Region den β-Actin-Promotor. Der β-Actin-Promotor kann von jedem Säuger stammen, einschließlich Menschen und Nager oder Vögel, einschließlich Hühnern. Vorzugsweise wird ein β-Actin vom Huhn verwendet.
  • In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die transkriptionelle, regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region. Vorzugsweise ist die Enhancer-Region die CMV-Enhancer-Region.
  • In einer speziellen Ausführungsform ist die regulatorische Region eine CAG-regulatorische Region. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die CAG regulatorische Region die Sequenz SEQ ID NO: 1.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die transkriptionelle, regulatorische Region eine Fettgewebe-spezifische transkriptionelle, regulatorische Region.
  • Wenn der Promotor spezifisch für Fettgewebe ist, dann ist es nicht notwendig, dass auch der Enhancer Fettgewebe-spezifisch ist. Alternativ kann die transkriptionelle, regulatorische Region einen Fettgewebe-spezifischen Promotor und einen Fettgewebe-spezifischen Enhancer umfassen.
  • In einer Ausführungsform ist der Gewebe-spezifische Promotor ein Fettgewebe-spezifischer Promotor, wie zum Beispiel das Adipozyten-Protein 2 (aP2, auch bekannt als Fettsäure-bindendes Protein 4(FABP4))-Promotor, der PPARy-Promotor, der Adiponectin-Promotor, der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase(PEPCK)-Promotor, der Promotor, der von humanen Aromatase-Zytochrom p450 (p450arom) stammt und der Foxa-2-Promotor; siehe Graves (1991), Ross (1990), Simpson ( US 5,446,143 ), Mahendroo (1993), Simpson (1993) und Sasaki (1994), vorstehend In einer Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische, regulatorische Region des AAV gemäß der Erfindung den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor. in einer speziellen Ausführungsform hat die mini/aP2-regulatorische Region die Sequenz SEQ ID NO: 2.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische, regulatorische Region des AAV gemäß der Erfindung den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und den basalen Ratten-UCP1-Promotor. In einer speziellen Ausführungsform hat die mini/UCP1-regulatorische Region die Sequenz SEQ ID NO: 3.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette weiterhin eine post-transkriptionelle, regulatorische Region. in einer bevorzugten Ausführungsform ist die post-transkriptionelle, regulatorische Region WPRE oder funktionelle Fragmente oder Varianten davon und PPT-CTS oder funktionelle Fragmente oder Varianten davon.
  • Andere geeignete Polynukleotide von Interesse können in den AAV der Erfindung vektorisiert werden und für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen verwendet werden; siehe Tabelle 1. Tabelle 1 Polynukleotide von Interesse
    Erkrankung Gen Verabreichung Referenz
    Arthritis I1-1-Rezeptor-Antagonist, TNFR: Fc-Fusionsprotein (Etanercept), TGFβ1, systemisch Evans C, et al., Arthritis Res. Ther. 2008, 10(110): 515–526
    Typ 1-Diabetes IL-2 lokal Goudy K, et al., J. Immunol. 2011; 186(6): 3779–3786
    Typ 2-Diabetes Leptin, CNTF, LIF lokal oder systemisch Zolotukhin S, et al., WO 2001/094605
    Typ 2-Diabetes Angiotensin umwandelndes Enzym 2 (ACE) systemisch Acton L, et al., WO 2000/018899
    Typ 2-Diabetes Glucokinase regulatorisches Protein (GKRP) systemisch Caplan S, et al., US 20020065239
    Hoher Blutdruck Atriales natriuretisches Peptid (ANP) systemisch Therrien J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010; 107(3): 1178–1183
    Hoher Blutdruck Angiotensin Typ 1 Rezeptor Antisinn Angiotensin umwandelndes Enzym Antisinn β1-adrenergisch Rezeptor Antisinn systemisch Lu D, et al., Hypertension 1997; 3 30: 36–370 Phillips M, et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 2000; 33(6): 715–721
    Adipositas Anti-angiogene Verbindungen (Endostatin, Angiostatin, VEGFR Blockade, PLGF Blockade), lokal Cao D, Nature Rev. 2010; 9: 107–115
    Typ 2-Diabetes Insulin lokal Mudaliar S, et al., Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 2001; 30(4): 935–982
    Adipositas BDNF systemisch During M, et al., WO 2009/120978
    Adipositas BMP7 lokal oder systemisch Tseng Y, et al., Nature 2008; 54(7207): 1000–1004
    Adipositas FGF21 lokal oder systemisch Xu J, et al., Diabetes 2009; 58(1): 250-259
    Adipositas Cardiale natriuretische Peptide (NPs) lokal oder systemisch Bordicchia M, et al., J. Clin. Invest. 2012; 122(3): 1022–1036
    Adipositas/Typ 2-Diabetes Hexokinase oder Glucokinase lokal Otaegui P, et al., FASEB J. 2003; 17(14): 2097–2099
    Adipositas/Typ 2-Diabetes Hexokinase oder Glucokinase lokal Munoz S, et al., Diabetologia 2010; 53(11): 2417–2430
    Adipositas/Typ 2-Diabetes GLP-1 lokal Di Pasquale G, et al., PLoS One 2012; 7(7): e40074
    Adipositas/Typ 2-Diabetes PRDM16 lokal Seale P, et al., J. Clin. Invest. 2011; 121(1): 96–105
  • Der Begriff ”Erkrankung, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse erfordert”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede Krankheit, bei der die Expression des Polynukleotids von Interesse wünschenswert ist. Das Polynukleotid von Interesse, wie hierin beschrieben, kann ein Gen sein, das ein Polypeptid von Interesse kodiert, oder alternativ eine Nukleinsäuresequenz sein, die, wenn sie transkribiert wird, ein Molekül erzeugt, das in der Lage ist, die Expression eines endogenen Polynukleotids in einer Zelle zu modulieren. Somit kann die Krankheit, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse erfordert, eine Krankheit sein, bei der ein Anstieg oder Abfallen der Expressionslevel eines Gens wünschenswert ist.
  • Darüber hinaus kann das Polynukleotid von Interesse ein Protein kodieren, das sekretiert wird, und systemisch auf Adipozyten oder in deren unmittelbaren Nachbarschaft wirkt. In einer speziellen Ausführungsform ist die Krankheit, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse erfordert, eine Krankheit, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse adipöses Gewebe erfordert, stärker bevorzugt, in weißem adipösen oder braunem adipösen Gewebe.
  • Beispiel von Krankheiten, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse erfordern, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Adipositas, Hypoglykämie, Insulin resistenz, Typ 2-Diabetes, Bluthochdruck, Krebs, Herzleiden, Immunkrankheiten, Arthritis, Erkrankungen des zentralen Nervensystems und alters-bedingte Erkrankungen.
  • Der AAV der Erfindung hat sich als nützlich für die Gentherapie von Adipose-Gewebe-assoziierten Krankheiten erwiesen, wie die Zuführung von Hexokinase, vermittelt durch den AAV der Erfindung, sowohl in WAT als auch BAT, um die basale Glucose-Aufnahme zu steigern; siehe 2D und 4B. in einer speziellen Ausführungsform ist die Krankheit, die die Expression eines Polynukleotids von Interesse erfordert, somit eine Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Adipositas, Hypoglykämie, Insulinresistenz, Typ 2-Diabetes und Bluthochdruck.
  • Beispiele für Gene und die damit verbundenen Krankheitszustände schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Insulin für die Behandlung von Diabetes, CFTR für die Behandlung zystischer Fibrose, Factor IX für die Behandlung von Hämophilie B, Factor VIII für die Behandlung von Hämophilie A, Glucose-6-phosphatas, verbunden mit Glycogenose Typ 1A; Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase, verbunden mit Pepck-Defizienz; Galactose-1-phosphat-Uridyl-Transferase, verbunden mit Galactosämie; Phenylalanine-Hydroxylase, verbunden mit Phenylketonuria; verzweigt-kettige α-Ketosäure-Dehydrogenase, verbunden mit Ahornsirupkrankheit; Fumarylacetoacetat-Hydrolase, verbunden mit Tyrosinämie Typ 1; Methylmalonyl-CoA-Mutase, verbunden mit Methylmalonazidurie; Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase, verbunden mit Mittelketten-Acyl-CoA-Defizienz; Ornithin-Transcarbamylase, verbunden mit Ornithin-Transcarbamylase-Defizienz; Argininosuccinsäure-Synthetase, verbunden mit Citrullinämie; Lipoprotein niedriger Dichte-Rezeptorprotein, verbunden mit familiärer Hypercholesterolemie; UDP-Glucouronosyltransferase, verbunden mit Crigler-Najjar-Krankheit; Adenosinedeaminase, verbunden mit schwerer kombinierter Immundefizienz-Erkrankung; Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, verbunden mit Gout- und Lesch-Nyan-Syndrom; Biotimidase, verbunden mit Biotimidase-Defizienz; β-Glucocerebrosidase, verbunden mit Gaucher-Krankheit; β-Glucuronidase, verbunden mit Sly-Syndrom; Peroxisom-Membranprotein 70 kDa, verbunden mit Zellweger-Syndrom; Porphobilinogendeaminase, verbunden mit akuter intermittierender Porphyrie; alpha-1-Antitrypsin für die Behandlung von alpha-1-Antitrypsin-Defizienz (Emphysem); Erythropoietin für die Behandlung von Anämie aufgrund von Thalassemie oder Nierenversagen; vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, Angiopoietin-1 und Fibroblasten-Wachstumsfaktor für die Behandlung von ischämischen Erkrankungen; Inhibitoren der Signalwege von Thrombomodulin und Gewebefaktoren für die Behandlung von verstopften Blutgefäßen, wie zum Beispiel gesehen bei Artherosklerose, Thrombose oder Embolie; aromatische Aminosäuredecarboxylase (AADC) und Tyrosinhydroxylase (TH) für die Behandlung von Parkinson Krankheit; der β-adrenergische Rezeptor, Antisinn zu oder eine mutante Form von Phospholamban, das sarco(endo)plasmatische Reticulum Adenosintriphosphatas-2 (SERCA2) und die cardiale Adenylylcyclase für die Behandlung von kongestivem Herzversagen; ein Tumorsuppessorgen wie p53 für die Behandlung verschiedener Krebsarten; ein Zytokin wie eines der verschiedenen Interleukine für die Behandlung von inflammatorischen und Immunkrankheiten und Krebs; Dystrophin oder Minidystrophin und Utrophin oder Miniutrophin für die Behandlung von muskulären Dystrophien; Adenosindeaminase (ADA) für die Behandlung von Adenosindeaminase(ADA)-Defizienz; Huntingin (HTT) für die Behandlung von Huntington Krankheit; niedrige Dichte Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) oder Apolipoprotein B (APOB) für die Behandlung von familiärer Hypercholesterolämie; Phenyalaninhydroxylase (PAH) für die Behandlung von Phenylketonurie; polyzystische Nierenerkrankung 1 (PKD1) und polyzystische Nierenerkrankung 2 (PKD2) für die Behandlung von polyzystischer Nierenerkrankung; TNFR:Fc für die Behandlung von Arthritis; AAT für die Behandlung von erblichem Emphysem; Sarcoglycan für die Behandlung von muskulärer Dystrophy; GAD65 oder GAD67 für die Behandlung von Parkinson-Krankheit, AAC für die Behandlung von Canavan-Krankheit, CLN2 für die Behandlung von Batten-Krankheit, NGF für die Behandlung von Alzheimer; ein VEGF-Antagonist für die Behandlung von Makuladegeneration; IGF/HGF für die Behandlung von Herzinsuffizienz, NGF für die Behandlung von Krankheiten des zentralen Nervensystems; und neutralisierende Antikörper gegen HIV für die Behandlung von HIV, HIV-Infektion oder AIDS.
  • Beispiele für Polynukleotide von Interesse, die mit dem AAV der Erfindung zugeführt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Hexokinase, Glucokinase, UCP2, UCP3, PPAR-α, Leptin, Leptin-Rezeptor OB-Rb und GLP-1. In einer speziellen Ausführungsform ist das Gen von Interesse ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase (HK), Glucokinase (GK), alkalische Phosphatase (AP) und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). In einer weiteren Ausführungsform umfassen die AAV der Erfindung Polynukleotide, die Hexokinase oder Glucokinase exprimieren, die einem Individuum verabreicht werden, das es benötigt, für die Behandlung oder Prävention von Typ 2-Diabetes. In einer weiteren Ausführungsform werden die AAV der Erfindung, die Polynukleotide umfassen, die den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor exprimieren, einem Individuum verabreicht, das sie benötigt, für die Behandlung oder Prävention von Adipositas.
  • Veranschaulichende nicht-limitierende Beispiele von Erkrankungen, die mit den Verfahren der Erfindung behandelt werden können, schließen Adipositas, Hyperglykämie, Insulinresistenz, Typ 2-Diabetes, Bluthochdruck und arterielle Hypertension ein. Vorzugsweise kann Typ 2-Diabetes behandelt werden durch die Expression von Leptin entweder in der Nachbarschaft der Adipozyten oder systemisch, so dass es den Hypothalamus erreicht.
  • Zusätzlich haben sich die AAV der Erfindung als nützlich erwiesen für die gentechnische Veränderung von BAT, da die intra Ibat-Verabreichung von VEGF164 durch AAV9-mini/UCP1 zu einem einer Erhöhung bei den Expressionslevel von Gesamt-VEGF und zu einer angestiegenen Anzahl von Blutgefäßen in iBAT führt; siehe 4C–4F. In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung daher einen AAV oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Krankheit, die die Expression von VEGF erfordert, wie zum Beispiel einer Krankheit, deren Steuerung von der Induktion der Angiogenese, Arteriogenese oder Vaskulogenese profitieren kann. Beispiele für Krankheiten, die die Expression von VEGF erfordern, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, akute operative und traumatische Wunden, Verbrennungen, Verbrühungen, venöses Geschwür, arterielles Geschwür, Druckgeschwür (alias Decubitus Geschwür), diabetischer Ulkus, Wunden nach Bestrahlung, Hauttransplantate, Geschwüre gemischter Ätiologie und andere chronische oder nekrotische Wunden.
  • Darüber hinaus führt die intra Ewat-Verabreichung des hSeAP-Gens (d. h., humane von Placenta abgeleitete sekretierte, alkalische Phosphatase) mit dem AAV9-mini/aP2-Virusvektor zu einem verzögerten Anstieg der zirkulierenden Level von hSeAP. In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung daher einen AAV oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Krankheit, die die Expression von AP erfordert, wie zum Beispiel eine LPS (d. h., Lipopolysaccharid) vermittelte oder verschlimmernde Krankheit. Beispiele für Krankheiten, die die Expression von AP erfordern, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, entzündliche Darmerkrankung, Sepsis oder septischer Schock, systemisches inflammatorisches Response-Syndrom (SIRS), Meningitia, traumatischer hämorrhagischer Schock, Hum-Verletzungen, Herzoperationen oder cardiopulmonärer Bypass, Leberoperation oder -Transplant, Lebererkrankung, Pankreatitis, nekrotisierende Enterocolitis, Periodontal-Krankheit, Pneumonie, zystische Fibrose, Asthma, koronare Herzkrankheit, kongestives Herzversagen, Nierenversagen, hämolytisches urämisches Syndrom, Nierendialyse, Krebs, Alzheimer Krankheit und Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis und systemischer Lupus Erythematosus.
  • 4. Verfahren zur Transduktion von Zellen in vitro
  • In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transduzieren von Zellen in vitro unter Verwendung der AAV-Vektoren der Erfindung. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Transduzieren von Zellen in vitro, das das in Kontakt bringen der Zellen mit einem AAV umfasst, der ein rekombinantes virales Genom umfasst, worin das rekombinante virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine Adipose-Gewebe-spezifische transkriptionelle, regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Adeno-assoziierter Virusvektor, der bei dem Verfahren zum Transduzieren von Zellen in vitro verwendet wird, einen Serotyp, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9. In einer anderen Ausführungsform sind die Adeno-assoziierten Virus-ITRs AAV2 ITRs.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst der Adeno-assoziierter Virusvektor eine Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region. In nach einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region eine Promotorregion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem basalen Maus-aP2-Promotor und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region, die funktionell mit der Promotor-Region verknüpft ist. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (i) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor und
    • (ii) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette weiterhin eine post-transkriptionelle regulatorische Region. In noch einer anderen Ausführungsform ist die post-transkriptionelle regulatorische Region WPRE.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem sekretierten Protein, das systemisch wirkt, und einem Protein, das auf oder in unmittelbarer Nähe der Adipozyten wirkt. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Glucokinase, alkalische Phosphatase und vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transduzieren von Zellen in vitro mit einem AAV, der ein rekombinantes virales Genom umfasst, worin das rekombinante virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine transkriptionelle regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst, worin der Serotyp des AAV ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9.
  • In einer Ausführungsform sind die Adeno-assoziierten Virus-ITRs AAV2-ITRs.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst der Adeno-assoziierter Virusvektor ein rekombinantes Genom, das eine transkriptionelle regulatorische Region umfasst. In einer Ausführungsform ist die transkriptionelle regulatorische Region ein konstitutiver Promotor. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die konstitutive transkriptionelle regulatorische Region den Actin-Promotor. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die konstitutive transkriptionelle, regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region, funktionell verknüpft mit der Promotor-Region. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Enhancer-Region der Cytomegalie-Virus-Enhancer.
  • In einer Ausführungsform ist die transkriptionelle regulatorische Region eine Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region eine Promotor-Region, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem basalen Maus-aP2-Promotor und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region funktionell verknüpft mit der Promotor-Region. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Aadipose-spezifischen UCP1-Enhancer. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • i) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor und
    • ii) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette weiterhin eine post-transkriptionelle regulatorische Region. In noch einer anderen Ausführungsform ist die post-transkriptionelle, regulatorische Region WPRE.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem sekretierten Protein, das systemisch wirkt, und einem Protein, das auf oder in unmittelbarer Nähe von den Adipozyten wirkt. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform kodiert das Polynukleotid von Interesse ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Glucokinase, alkalischer Phosphatase und vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor.
  • Jegliche Zelle kann unter Verwendung der in vitro Verfahren der Erfindung transduziert werden. In einer speziellen Ausführungsform wird der AAV verwendet, um Zellen von adipösem Gewebe zu transduzieren. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle des adipösen Gewebes ein brauner Adipozyt oder ein weißer Adipozyt.
  • Wenn die in vitro-Verfahren zum Transduzieren von Zellen gemäß der Erfindung durchgeführt werden, um weiße Adipozyten zu transduzieren, dann umfasst die transkriptionelle regulatorische Region innerhalb des AAV vorzugsweise eine mini/aP2-regulatorische Region. In einer anderen Ausführungsform, wenn die in vitro-Verfahren zum Transduzieren von Zellen gemäß der Erfindung durchgeführt werden, um braune Adipozyten zu transduzieren, dann umfasst die transkriptionelle regulatorische Region innerhalb des AAV vorzugsweise eine Expressionskassette, die eine mini/UCP1-regulatorische Region umfasst.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung werden, um die Transgen-Expression durch die mini/aP2- und mini/UCP1-Promotoren zu verbessern, ein CAG-Promotor in Kombination mit den gewebespezifischen miRNA-Zielsequenzen verwendet, um höhere Expressionslevel im adipösem Gewebe zu erreichen und zu verhindern, dass Organe, die nicht Ziel der Transgenexpression sind, anzuvisieren. Dies führt zu einer weiteren Stärkung des Potentials der AAV-Vektoren, adipöses Gewebe genetisch zu manipulieren, wenn sie systemisch oder lokal verabreicht werden.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren der Zellen, die in vivo unter Verwendung der AAV Vektoren der Erfindung transduziert wurden, und sie in vitro zu kultivieren. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die isolierten transduzierten Zellen und die Zelle und die pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie umfassen.
  • 5. Transduzierte Adipozyten und Adipozyten-Zellzusammensetzungen, ex-vivo therapeutische Verfahren
  • In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung die Adipozyten, die durch die in vitro-Verfahren der Erfindung erhalten werden. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Zusammensetzungen von Zellen, die die Adipozyten, die durch die Verfahren der Erfindung erhalten werden, umfassen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Adipozyten oder Adipozyten-Zellzusammensetzungen, die das Genom eines AAV gemäß der Erfindung umfassen. Vorzugsweise ist mindestens 50% der Zellzusammensetzung von Adipozyten gemäß der Erfindung umfasst. Stärker bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% und 100% der Zellzusammensetzung ist von den Adipozyten gemäß der Erfindung umfasst.
  • Wie vorstehend ausgeführt, kann der AAV der Erfindung verwendet werden, um Zellen in vitro zu transduzieren, um ein Polynukleotid von Interesse in die Zellen einzuführen. Anschließend können die transduzierten Zellen in den menschlichen oder tierischen Körper implantiert werden, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erhalten.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung somit Adipozyten oder eine Zellzusammensetzung, die Adipozyten umfasst, die gemäß den Verfahren der Erfindung erhalten wurden, zur Verwendung in der Medizin.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Adipozyten oder eine Zellzusammensetzung, die Adipozyten umfasst, die gemäß den Verfahren der Erfindung erhalten wurden, zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit, die die Expression des Polynukleotids von Interesse erfordert.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit, die das Verabreichen der Adipozyten oder Zellzusammensetzung, die gemäß den Verfahren der Erfindung erhalten wurden, an ein Individuum, das sie benötigt. Beispiele von Krankheiten, denen mit diesem Ansatz entgegengewirkt werden können, sind vorstehend im Zusammenhang mit dem AAV der Erfindung definiert.
  • 6. Polynukleotide, Vektoren und Plasmide
  • In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung Polynukleotide, die zur Herstellung des AAV gemäß der Erfindung nützlich sind. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung somit ein Polynukleotid (”Polynukleotid der Erfindung”), das eine Expressionskassette flankiert, von den Adeno-assoziierten Virus-ITRs umfasst, worin die Expressionskassette weiterhin eine Adipose-gewebespezifische regulatorische Region umfasst, funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische regulatorische Region eine Promotor-Region, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem basalen Maus-aP2-Promotor und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  • in einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region, funktionell verknüpft mit der Promotor-Region. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die regulatorische Region ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • i) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor und
    • ii) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette des Polynukleotids der Erfindung weiterhin ein post-transkriptionelles regulatorisches Element. In noch einer anderen Ausführungsform ist die post-transkriptionelle regulatorische Region WPRE.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das in dem Polynukleotid der Erfindung eingeschlossene Polynukleotid von Interesse ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Glucokinase, alkalischer Phosphatase und vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor.
  • Das Polynukleotid der Erfindung kann in einen Vektor eingebaut werden, wie zum Beispiel ein Plasmid. In einer zusätzlichen Ausführungsform betrifft die Erfindung somit einen Vektor oder ein Plasmid, die das Polynukleotid der Erfindung umfassen. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe ”Vektor” und ”Plasmid” austauschbar.
  • In einer speziellen Ausführungsform ist das Polynukleotid der Erfindung in einen Adeno-assoziierten Virusvektor oder Plasmid eingebaut. Vorzugsweise sind alle anderen strukturellen und nicht strukturellen kodierenden Sequenzen, die für die Erzeugung des Adeno-assoziierten Virus notwendig sind, in dem viralen Vektor nicht vorhanden, da sie durch andere Vektoren in trans, wie einem Plasmid, oder durch stabiles Integrieren des Sequenzen in eine Verpackungs-Zelllinie, geliefert werden können.
  • Die Polynukleotide der Erfindung können erhalten werden durch molekularbiologische Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind; siehe Brown (1995), Watson (1992), Alberts (2008), Innis (1990), Erlich (1989), Sambrook (1989), Bishop (1987), Reznikoff (1987), Davis (1986) und Schleef (2001), vorstehend. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen AAV-Vektor, worin das Genom ein Polynukleotid der Erfindung umfasst.
  • 7. Verfahren zum Erhalt der AAV
  • In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zum Erhalt der AAV der Erfindung. Der AAV kann durch Einfügen der Polynukleotide der Erfindung in Zellen erhalten werden, die rep und cap konstitutiv exprimieren. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zum Erhalt eines Adeno-assoziierten Virusvektor, umfassend die Schritte:
    • (i) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polynukleotid der Erfindung, AAV-ITRs, AAV-cap-Proteine, AAV-rep-Proteine und virale oder zelluläre Proteine, wovon AAV für die Replikation abhängig ist, umfasst,
    • (ii) Aufrechterhalten der Zelle unter Bedingungen, die für den Zusammenbau des AAV geeignet sind, und
    • (iii) Reinigen des durch die Zelle produzierten Adeno-assoziierten Virusvektors.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische regulatorische Region, die Teil des Polynukleotids der Erfindung ist, eine Promoter-Region, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem basalen Maus-aP2-Promotor und dem basalen Ratten-UCP1-Promotor.
  • in einer anderen Ausführungsform umfasst die Adipose-gewebespezifische regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region funktionell verknüpft mit der Promotor-Region. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Enhancer-Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die regulatorische Region ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • i) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor und
    • ii) einem Polynukleotid, umfassend den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Expressionskassette des Polynukleotids der Erfindung weiterhin ein post-transkriptionelles regulatorisches Element. In noch einer anderen Ausführungsform ist die post-transkriptionelle regulatorische Region WPRE.
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert das in dem Polynukleotid der Erfindung eingeschlossene Polynukleotid von Interesse ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hexokinase, Glucokinase, alkalischer Phosphatase und vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor.
  • Die Herstellung des rekombinanten AAV (rAAV) zur Transgeneinführung in Vektoren ist kürzlich beschrieben worden; siehe Ayuso E, et al., Curr. Gene Ther. 2010; 10: 423–436, Okada T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20: 1013–1021, Zhang H, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20: 922–929, und Virag T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20: 807–817. Diese Protokolle können verwendet oder angepasst werden, um den AAV der Erfindung zu erzeugen. In einer Ausführungsform ist die Producer-Zelllinie transient transfiziert mit dem Polynukleotid der Erfindung (umfassend die Expressionskassette flankiert durch ITRs) und mit Konstrukt(en) die rep- und cap-Proteine kodieren und Helferfunktionen bereitstellen. In einer anderen Ausführungsform überträgt die Zelllinie stabil Helferfunktionen und ist transient transfiziert mit dem Polynukleotid der Erfindung (umfassend die Expressionskassette flankiert von ITRs) und mit Konstrukt(en) die rep- und cap-Proteine kodieren. In einer anderen Ausführungsform überträgt die Zelllinie stabil die rep- und cap-Proteine und die Helferfunktionen und ist transient transfiziert mit dem Polynukleotid der Erfindung. In einer anderen Ausführungsform überträgt die Zelllinie stabil die rep- und cap-Proteine und ist transient transfiziert mit dem Polynukleotid der Erfindung und einem Polynukleotid, das die Helferfunktionen kodiert. In noch einer anderen Ausführungsform überträgt die Zelllinie stabil das Polynukleotid der Erfindung, die rep- und cap-Protein und die Helferfunktionen. Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser und anderer AAV-Produktionssysteme sind in dem Fachgebiet beschrieben worden; siehe Muzyczka N, et al., US 5,139,941 , Zhou X, et al., US 5,741,683 , Samulski R, et al., US 6,057,152 , Samulski R, et al., US 6,204,059 , Samulski R, et al., US 6,268,213 , Rabinowitz J, et al., US 6,491,907 , Zolotukhin S, et al., US 6,660,514 , Shenk T, et al., US 6,951,753 , Snyder R, et al., US 7,094,604 , Rabinowitz J, et al., US 7,172,893 , Monahan P. et al., US 7,201,898 , Samulski R, et al., US 7,229,823 , und Ferrari F, et al., US 7,439,065 .
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Transgen-Zuführungskapazität des AAV durch Bereitstellen von AAV-ITRs von zwei Genomen, die sich aneinanderlagern, um Kopf-zu-Schwanz Concatamere zu bilden, gesteigert werden. Im Allgemeinen wird nach dem Eintritt des AAV in die Wirtszelle die einzelsträngige DNA, die das Transgen enthält, durch die DNA-Polymerase-Komplexe der Wirtszelle in doppelsträngige DNA umgewandelt, woraufhin die ITRs bei der Concatamer-Bildung im Kern helfen. Als eine Alternative kann der AAV so gestaltet sein, dass er ein selbst-komplementärer (sc) AAV ist, was es dem Virusvektor ermöglicht, den Schritt der Synthese des zweiten Stranges nach dem Eintritt in die Zielzelle zu umgehen, wodurch ein scAAV-Virusvektor mit schnellerer und potentiell höherer (z. B. bis zu 100-facher) Transgen-Expression bereitgestellt wird. Zum Beispiel kann der AAV so gentechnisch verändert sein, dass er ein Genom aufweist, das zwei verbundene einzelsträngige DNAs umfasst, die eine Transgeneinheit und deren Komplement kodiert, die nach der Zuführung in eine Zielzelle zusammenklappen können, wodurch eine doppelsträngige DNA erhalten wird, die die Transgen-Einheit von Interesse kodiert. Selbst-komplementäre AAVs sind in dem Fachgebiet beschrieben worden; siehe Carter B, US 6,596,535 , Carter B, US 7,125,717 , und Takano H, et al., US 7,456,683 .
  • Über Cap-Proteine ist berichtet worden, dass sie Effekte auf den Tropismus des Wirts, die Zell-, Gewebe- oder Organspezifität, die Rezeptornutzung, die Infektionseffizienz und Immunogenizität der AAV-Viren haben. Dem entsprechend kann ein AAV-Cap für die Verwendung in einem rAAV ausgewählt werden, der zum Beispiel die Spezies des Individuums (z. B. human oder nicht human), den immunologischen Zustand des Individuums, die Eignung des Individuums für Lang- oder Kurzzeitbehandlung oder eine spezielle therapeutische Anwendung in Betracht zieht (z. B. die Behandlung einer speziellen Krankheit oder Funktionsstörung, oder die Zuführung zu speziellen Zellen, Geweben oder Organen). In anderen Ausführungsformen basiert das rAAV-Cap aus Caps von zwei oder drei oder mehr AAV-Serotypen. In speziellen Ausführungsformen sind die AAV-cap-Gene abgeleitet von den Serotypen AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 oder AAV9. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die AAV-cap-Gene abgeleitet von den Serotypen AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9.
  • In einigen Ausführungsformen kann ein AAV-Cap für die Verwendung bei den Verfahren der Erfindung durch Mutagenese (d. h., durch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen) aus einem der vorher erwähnten AAV-Caps oder deren kodierende Nukleinsäure erzeugt werden. In einigen Ausführungsformen ist das AAV-Cap mindestens zu 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% oder mehr ähnlich zu einem oder mehreren der vorstehend erwähnten AAV-Caps.
  • In einigen Ausführungsformen ist das AAV-Cap chimär und umfasst Domänen von mindestens zwei der vorstehend erwähnten AAV-Caps. In einigen Ausführungsformen ist das AAV-Cap ein Mosaik aus VP1, VP2 und VP3-Monomeren aus zwei oder drei verschiedenen AAVs oder rekombinanten AAVs. In einigen Ausführungsformen umfasst eine rAAV-Zusammensetzung mehr als eine der vorstehend genannten Caps.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine AAV-Cap für die Verwendung in einer rAAV-Zusammensetzung so gestaltet, dass sie eine heterologe Sequenz oder eine andere Modifikation enthält. Zum Beispiel kann eine Peptid- oder Proteinsequenz, die selektives Zielen oder Immunevasion liefert, in ein Cap-Protein eingebaut werden. Alternativ oder zusätzlich kann das Cap chemisch modifiziert sein, so dass die Oberfläche des rAAV Polyethylen-glycolysiert (d, h., pegyliert) sein, wodurch Immunevasion erleichtert wird. Das Cap-Protein kann auch mutagenisiert sein (z. B. um die natürliche Rezeptorbindung zu entfernen, oder ein immunogenes Epitop zu maskieren).
  • In einer speziellen Ausführungsform sind die AAV-rep-Gene abgeleitet von den Serotypen AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 oder AAV9. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die AAV-rep- und cap-Gene abgeleitet von den Serotypen AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9.
  • Die Gene AAV-rep, AAV-cap und Gene, die Helferfunktionen liefern, könnenin die Zelle durch Einbau der Gene in einen Vektor, wie zum Beispiel ein Plasmid, und Einschleusen des Vektors in die Zelle eingefügt werden. Die Gene können in dasselbe Plasmid oder in unterschiedliche Plasmide eingebaut werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die AAV-rep und cap-Gene in ein Plasmid und die Gene, die Helferfunktionen bereitstellen, in ein anderes Plasmid eingebaut. Beispiele für Plasmide, die AAV-rep- und cap-Gene umfassen, die geeignet sind für die Verwendung bei den Verfahren der Erfindung, schließen die pHLP19- und pRep6cap6-Vektoren ein; siehe Colisi P, US 6,001,650 und Russell D, et al., US 6,156,303 . In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Gene, die Helferfunktionen liefern, von einem Adenovirus.
  • Das Polynukleotid der Erfindung und die Polynukleotide, die die AAV-rep- und cap-Gene, oder Gene, die Helferfunktionen bereitstellen, umfassen, können in die Zelle unter Verwendung eines beliebigen im Fachgebiet gut bekannten Verfahren eingebaut werden; siehe Ausubel F, et al., Hrs., ”Short Protocols in Molecular Biology”, 4. Ausgabe (John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, US, 1997), Brown (1995), Watson (1992), Alberts (2008), Innis (1990), Erlich (1989), Sambrook (1989), Bishop (1987), Reznikoff (1987), Davis (1986), und Schleef (2001), vorstehend. Beispiele für Transfektionsverfahren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, co-Präzipitation mit Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Polybren, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposom-vermittelte Fusion, Lipofektion, Retrovirus-Infektion und biolistische Transfektion. In einer speziellen Ausführungsform wird die Transfektion mittels co-Präzipitation mit Calciumphosphat durchgeführt. Wenn der Zelle die Expression von einem der AAV-rep- und cap-Gene und den Genen, die adenovirale Helferfunktionen bereitstellen, fehlt, können die Gene gleichzeitig mit dem Polynukleotid des ersten Aspekts der Erfindung in die Zelle eingeführt werden. Alternativ können die Gene vor oder nach der Einführung des Polynukleotids des ersten Aspekts der Erfindung eingeführt werden. In einer speziellen Ausführungsform werden die Zellen gleichzeitig mit drei Plasmiden transfiziert:
    • 1) einem Plasmid, das das Polynukleotid der Erfindung umfasst,
    • 2) einem Plasmid, das die AAV-rep- und cap-Gene umfasst,
    • 3) einem Plasmid, das die Gene, die Helferfunktionen bereitstellen, umfasst.
  • Verfahren zum Kultivieren der Verpackungszellen und exemplarische Bedingungen, die die Freisetzung der AAV-Vektorpartikel fördern, wie die Herstellung eines Zelllysats, können durchgeführt werden wie in den Beispielen hierin beschrieben. Producer-Zellen werden für einen geeigneten Zeitraum gezüchtet, um die Freisetzung der viralen Vektoren in das Medium zu fördern. Im Allgemeinen können die Zeilen für etwa 24 Stunden, etwa 36 Stunden, etwa 48 Stunden, etwa 72 Stunden, etwa 4 Tage, etwa 5 Tage, etwa 6 Tage, etwa 7 Tage, etwa 8 Tage, etwa 9 Tage, bis zu etwa 10 Tage gezüchtet werden. Nach etwa 10 Tagen (oder früher, abhängig von den Züchtungsbedingungen und speziellen Producer-Zelle, die verwendet wird) fallen die Produktionslevel im Allgemeinen deutlich ab. Im Allgemeinen wird die Züchtungszeit vom Zeitpunkt der Virusproduktion gemessen. Zum Beispiel im Fall von AAV beginnt die Virusproduktion im Allgemeinen, nachdem die Helfer-Virusfunktionen einer geeigneten Producer-Zelle zugeführt worden ist, wie hierin beschrieben. Im Allgemeinen werden die Zellen etwa 48 bis etwa 100, vorzugsweise etwa 48 bis etwa 96, vorzugsweise etwa 72 bis etwa 96, vorzugsweise etwa 68 bis etwa 72 Stunden nach der Helfer-Virusinfektion (oder nachdem die Virusproduktion beginnt) geerntet.
  • Der AAV der Erfindung kann erhalten werden sowohl von: i) den Zellen, die mit dem Polynukleotid der Erfindung transfiziert wurden als auch ii) dem Kulturmedium der Zellen nach einem Zeitraum nach der Transfektion, vorzugsweise 72 Stunden. Es kann ein beliebiges Reinigungsverfahren für den AAV aus den Zellen oder dem Kulturmedium verwendet werden, um den AAV der Erfindung zu erhalten. In einer speziellen Ausführungsform wird der AAV der Erfindung nach einem optimierten Verfahren basierend auf einem Polyethylenglycol-Fällungsschritt und zwei aufeinanderfolgende Cesiumchlorid(CsCI)-Gradienten gereinigt; siehe Ayuso, 2010, vorstehend. Der gereinigte AAV der Erfindung kann gegen PBS dialysiert, filtriert und bei –80°C gelagert werden. Die Titer der Virusgenome können über quantitative PCR nach dem Protokoll, das für das AAV2-Referenz-Standardmaterial beschrieben ist, unter Verwendung der linearisierten Plasmid-DNA als Standardkurve bestimmt werden; siehe Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21: 1273–1285.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiterhin Reinigungsschritte, wie die Behandlung des Zelllysats mit Benzonase, die Reinigung des Zelllysats über einen CsCI-Gradienten oder die Reinigung des Zelllysats unter Verwendung der Heparinsulphat-Chromatographie; siehe Halbert C, et al., Methods Mol. Biol. 2004; 246: 201–212.
  • Verschiedene natürlich vorkommende und rekombinante AAV, deren kodierende Nukleinsäuren, AAV-Cap- und Rep-Proteine und deren Sequenzen, sowie Verfahren für die Isolierung oder Erzeugung, die Verbreitung und Reinigung solcher AAV und insbesondere ihre Capside, die geeignet sind für die Herstellung der AAVs, sind dem Fachmann gut bekannt; siehe Gao, 2004, vorstehend, Russell D, et al., US 6,156,303 , Hildinger M, et al., US 7,056,502 , Gao G, et al., US 7,198,951 , Zolotukhin S, US 7,220,577 , Gao G, et al., US 7,235,393 , Gao G, et al., US 7,282,199 , Wilson J, et al., US 7,319,002 , Gao G, et al., US 7,790,449 , Gao G, et al., US 20030138772 , Gao G, et al., US 20080075740 , Hildinger M, et al., WO 2001/083692 , Wilson J, et al., WO 2003/014367 , Gao G, et al., WO 2003/042397 , Gao G, et al., WO 2003/052052 , Wilson J, et al., WO 2005/033321 , Vandenberghe 1, et al., WO 2006/110689 , Vandenberghe L, et al., WO 2007/127264 , und Vandenberghe L, et al., WO 2008/027084 .
  • 8. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die AAV der Erfindung können dem menschlichen oder tierischen Körper über konventionelle Methoden verabreicht werden, was die Formulierung der Vektoren in einer pharmazeutischen Zusammensetzung erfordert. In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung somit eine pharmazeutische Zusammensetzung (worauf nachfolgend unter ”pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung” Bezug genommen wird), die einen AAV umfasst, worin der AAV ein rekombinantes Virusgenom umfasst, worin das rekombinante Virusgenom eine Expressionskassette umfasst, die eine Adipose-gewebespezifische transkriptionelle, regulatorische Region, funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse, umfasst. Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung die Polynukleotide oder die Polypeptide der Erfindung umfassen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann eine therapeutisch wirksame Menge des AAV der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können für die Zuführung an Tiere oder für veterinäre Zwecke formuliert sein (z. B. Nutztiere (Rinder, Schweine, andere)) und andere nicht-humane Säuger sowie für menschliche Individuen. Der AAV kann mit einem physiologisch verträglichen Träger für die Verwendung zum Gentransfer und Gentherapie-Anwendungen formuliert sein. Die Dosierung der Formulierung kann als virale Partikel oder als Genomkopien gemessen und berechnet werden (”GC”)/virale Genome (”vg”).
  • Es kann jedes dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden, um die Genomkopie(GC)-Zahl der Virus-Zusammensetzungen der Erfindung zu bestimmen. Ein Verfahren zur Durchführung der AAV GC-Zahl-Titration ist wie folgt: Proben von gereinigtem AAV-Vektor werden zuerst mit DNase behandelt, um nicht encapsidierte AAV-Genom-DNA zu eliminieren oder kontaminierende Plasmid-DNA aus dem Produktionsprozess zu entfernen. Die DNase-resistenten Partikel werden dann einer Hitzebehandlung ausgesetzt, um das Genom aus dem Capsid freizusetzen. Die freigesetzten Genome werden anschließend quantifiziert über Echtzeit-PCR unter Verwendung von Primer/Sonden-Sets, die die spezifische Region des Virusgenoms anvisieren.
  • Die Virus-Zusammensetzungen können auch in Dosierungseinheiten formuliert sein, die eine Menge an Virusvektoren enthalten, die im Bereich von etwa 1.0 × 109 GC bis etwa 1.0 × 1015 GC (für die Behandlung eines mittleren Individuums von 70 kg Körpergewicht) und vorzugsweise 1.0 × 1012 GC bis 1.0 × 1014 GC für einen menschlichen Patienten liegen. Vorzugsweise ist die Dosis an Virus in der Formulierung 1.0 × 109 GC, 5.0 × 109 GC, 1.0 × 1010 GC, 5.0 × 1019 GC, 1.0 × 1011 GC, 5.0 × 1011 GC, 1.0 × 1012 GC, 5.0 × 1012 GC, or 1.0 × 1013 GC, 5.0 × 1013 GC, 1.0 × 1014 GC, 5.0 × 1014 GC, oder 1.0 × 1015 GC.
  • Die Virusvektoren können auf konventionelle Weise formuliert sein unter Verwendung von physiologisch verträglichen Trägern oder Exzipienten. Der AAV kann für die parenterale Verabreichung über Injektion (z. B. über Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert sein. Formulierungen für Injektion können als Dosierungseinheiten präsentiert werden (z. B. in Ampullen oder in Behältern für mehrfache Dosen) mit einem zusätzlichen Konservierungsmittel. Die Virus-Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen und können Formulierungsmittel wie Suspensions-, Stabilisierungs- oder Dispersionsmittel enthalten. Flüssige Präparate der AAV-Formulierungen können über konventionelle Hilfsmittel mit pharmazeutisch verträglichen Zusätzen hergestellt werden, wie Suspensionsmittel (z. B. Sorbitolsirup, Zellulosederivative oder hydrierte essbare Fette), Emulgatoren (z. B. Lecithin oder Acacia), nichtwässrige Vehikel (z. B. Mandelöl, ölhaltige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle) und Konservierungsmittel (z. B. Methyl- oder Propyl-p-Hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Die Präparate können auch Puffersalze enthalten. Alternativ können die Zusammensetzungen in Pulverform vorliegen für die Konstitution mit einem geeigneten Vehikel (z. B. steriles Pyrogen-freies Wasser) vor der Verwendung.
  • Ebenfalls umfasst ist die Verwendung von Arzneimittel-Hilfsstoffen in Kombination mit oder in Beimischung mit dem AAV der Erfindung. Arzneimittel-Hilfsstoffe, die angedacht sind, jedoch nicht begrenzend sind, sind Mineralsalze oder Mineralsalzgele, partikelförmige oder mikropartikelförmige Arzneimittel-Hilfsstoffe, Mucosa-Arzneimittel-Hilfsstoffe und immun-stimulatorische Arzneimittel-Hilfsstoffe.
  • Arzneimittel-Hilfsstoffe können einem Individuum als Mischung mit dem AAV der Erfindung verabreicht werden, oder in Kombination mit dem AAV verwendet werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung in der Nähe des Gewebes oder Organs verabreicht, dessen Zellen transduziert werden sollen. In einer speziellen Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung lokal in das weiße Fettgewebe (WAT) oder in das braune Fettgewebe (BAT) über intra-WAT- oder intra-BAT-Injektion verabreicht. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung systemisch verabreicht.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann mittels Routineverfahren formuliert werden als eine pharmazeutische Zusammensetzung, angepasst für intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung an Menschen. Präparate für die Injektion können in konventionellen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die geeignet sind für Lösung und Suspension in Flüssigkeiten vor der Injektion, oder als Emulsionen. Falls nötig können die Zusammensetzungen auch ein lokales Anästhetikum wie Lidocain enthalten, um Schmerz an der Injektionsstelle zu vermeiden. Wenn die Zusammensetzungen über Infiltration verabreicht werden sollen, können sie in einer Infiltrationsflasche verteilt werden, die Wasser oder Kochsalzlösung in pharmazeutischer Qualität enthält. Wenn die Zusammensetzung über Injektion verabreicht wird, kann eine Wasserampulle für die Injektion oder sterile Kochsalzlösung bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Der Begriff ”therapeutisch wirksame Menge” bezieht sich auf die berechnete Menge der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, um den gewünschten Effekt zu erzielen, und werden im Allgemeinen bestimmt, unter Anderem, über die eigenen Merkmale der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung und den therapeutischen Effekt, der erhalten werden soll. Die Menge der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, die bei der Behandlung einer Erkrankung wirksam sein wird, kann über klinische Standard-Techniken bestimmt werden, die hierin beschrieben sind oder anderweitig in dem Fachgebiet bekannt sind. Weiterhin können auch gegebenenfalls in vitro-Tests verwendet werden, um optimale Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die präzise Dosis, die in der Formulierung verwendet wird, hängt von dem Verabreichungsweg und der Schwere des Zustands ab und sollte von dem medizinischen Fachpersonal, abhängig von den jeweiligen Umständen des Patienten, entschieden werden. Die wirksamen Dosen können von einem Paar von Response-Kurven von Dosen extrapoliert werden, die von Modellen in in vitro Testsystemen oder bei Tieren erhalten wurden. Für systemische Verabreichung kann eine therapeutisch wirksame Dosis anfänglich von den in vitro-Tests abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen so formuliert sein, dass sie einen zirkulierenden Konzentrationsbereich erreicht, der den IC50-Wert einschließt, der in Zellkultur bestimmt wurde. Diese Information kann verwendet werden, um nützliche Dosen für Menschen präzise zu bestimmen. Die anfängliche Dosis kann auch von in vivo-Daten (z. B. Tiermodellen) abgeschätzt werden, unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Jemand mit normaler Erfahrung in dem Fachgebiet kann die Verabreichung an Menschen basierend auf den Tierdaten leicht optimieren.
  • Solch eine systemische Verabreichung schließt ein, ohne darauf beschränkt zu sein, jeden Verabreichungsweg, der nicht die direkte Injektion in das adipöse Gewebe bedeutet. Insbesondere schließt die systemische Verabreichung eine systemische Injektion der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung ein, wie intramuskuläre (im), intravaskulare (ie), intraarterielle (ia), intravenöse (iv), intraperitoneale (ip), subkutane oder transdermale Injektionen. Periphere Verabreichung schließt auch die orale Verabreichung der Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, Zuführung unter Verwendung von Implantaten oder die Verabreichung über Instillation über das respiratorische System (z. B. intranasal) unter Verwendung von Sprays, Aerosole oder jede andere geeignete Formulierung ein. Vorzugsweise ist die systemische Verabreichung via im-, ip-, ia- oder iv-Injektion. Am meisten bevorzugt werden die Polynukleotide, Vektoren, Polypeptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung via iv-Injektion verabreicht; siehe During M, WO 1996/040954 und Monahan P, et al., WO 2001/091803 .
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können als einzelne Dosis verabreicht werden, oder in speziellen Ausführungsformen der Erfindung können Mehrfach-Dosen (z. B. zwei, drei, vier oder mehr Verabreichungen) eingesetzt werden, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erreichen. Vorzugsweise sind die AAV, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung eingeschlossen sind, von unterschiedlichen Serotypen, wenn Mehrfach-Dosen erforderlich sind.
  • Alle hierin vorstehend genannten Veröffentlichungen sind hierdurch unter Bezugnahme vollständig eingeschlossen.
  • Während die vorangehende Erfindung in einigen Einzelheiten zum Zweck der Klarheit und zum besseren Verständnis beschrieben ist, ist für den Fachmann beim Lesen der Offenbarung ersichtlich, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail vorgenommen werden können, ohne vom tatsächlichen Schutzumfang der Erfindung und den angehängten Ansprüchen abzuweichen.
  • Allgemeine Verfahren
  • 1. Charakteristika der Subjekte
  • Männliche ICR-Mäuse, 8–12 Wochen alt, C57BI/6J Mäuse, 9–13 Wochen alt und B6.V-Lepob/OlaHsd (ob/ob)- und BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd(db/db)-Mäuse, 8 Wochen, als wurden verwendet. Die Mäuse wurden ad libitum mit einer Standart-Diät gefüttert (Teklad Global Diets®, Harlan Labs., Inc., Madison, WI, US) und unter Licht-Dunkelheit-Zyklen von 12 Std. (Licht an um 8:00 Uhr) gehalten. Für die Gewebeproben wurden die Mäuse mit dem Inhalatians-Anästhetikum Isofluran betäubt (IsoFlo®, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, US) und geköpft. Gewebe von Interesse geschnitten und bei –80°C oder mit Formalin bis zur Analyse aufbewahrt.
  • 2. Rekombinante AAV-Vektoren
  • Vektoren wurden mittels Standardverfahren durch dreifache Transfektion von HEK293-Zellen erzeugt; siehe Ayuso, 2010, vorstehend. Die Zellen wurden in 10 Rollflaschen (850 cm2, flat; CorningTM, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US) in DMEM 10% FBS bei 80% Konfluenz kultiviert und mittels der Calciumphosphat-Methode co-transfiziert mit einem Plasmid, das die Expressionskassette flankiert, von den AAV2-ITRs trägt, einem Helferplasmid, das das AAV2-rep-Gen und das AAV der Serotypen 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9-cap-Gen trägt, und einem Plasmid, das die Adenovirus-Helferfunktionen trägt. Transgene wurden verwendet: a) eGFP angetrieben durch: a1) den Hybrid-Cytomegalievirus-Enhancer/Huhn-β-Actin-konstitutive Promotor (GAG) und das WPRE regulatorische Element, a2) die Maus-mini/aP2-regulatorische Region oder a3) die Ratte-mini/UCP1-regulatorische Region; b) murine Hexokinase II (mHkII)-cDNA angetrieben durch: b1) den ubiquitären CMV-Promotor und WPRE, b2) die Maus-mini/aP2-regulatorische Region oder b3) die Ratte-mini/UCP1-regulatorische Region, c) humanes Placenta-abgeleitete sekretierte alkalische Phosphatase (hSeAP) angetrieben durch die Maus-mini/aP2-regulatorische Region und WPRE, d) murines VEGF164 angetrieben durch die Ratte- mini/UCP1-regulatorische Region und e) RFP angetrieben durch den ubiquitären CMV_Promotor; siehe Ross, 1990, Graves, 1992, und Cassard-Doulcier, 1998, vorstehend. Ein nicht-kodierendes Plasmid, das den CMV-Promotor (pAAV-MCS, StratageneTM, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, US), die mini/aP2-regulatorische Region oder die mini/UCP1-regulatorische Region und eine multiple Klonierungsstelle trägt wurde verwendet, um null-Partikel zu erzeugen. AAV wurde über ein optimiertes Verfahren, das auf einem Polyethylenglycol-Fällungsschritt und zwei aufeinanderfolgende Reinigungsschritte basierend auf Cäsiumchlorid(CsCI)-Gradienten, gereinigt. Diese zweite Generation des CsCI-basierenden Protokolls reduzierte leere AAV-Capside und DNA und Proteinverunreinigungen dramatisch; siehe Ayuso, 2010, vorstehend. Gereinigte AAV-Vektoren wurden gegen PBS dialysiert, filtriert und bei –80°C gelagert. Die Titer der viralen Genome wurden über quantitative PCR, gefolgt von dem Protokoll, das für die AAV2-Referenz-Standardmaterialien beschrieben ist, unter Verwendung linearisierter Plasmid-DNA als Standardkurve bestimmt; siehe Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21: 1273–1285. Die Vektoren wurden gemäß im Fachgebiet gut bekannten molekularbiologischen Techniken erzeugt; siehe Brown (1995), Watson (1992), Alberts (2008), Innis (1990), Erlich (1989), Sambrook (1989), Bishop (1987), Reznikoff (1987), Davis (1986) und Schleef (2001), vorstehend.
  • 3. In vivo intra-eWAT-Verabreichung von AAV-Vektoren
  • Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt. Eine Laparotomie wurde durchgeführt, um das epididymale weiße adipöse Gewebe dem Vektor auszusetzen. Die AAV-Vektoren wurden in Kochsalzlösung mit oder ohne 2% Pluronics F88 (BASF Corp., Florham Park, NJ, US) resuspendiert und direkt in die epididymalen Fettpolster injiziert. In jedes epididymale Fettpolster wurde zweimal 50 μL der AAV-Lösung injiziert (eine Injektion nahe den Testikeln und die andere in die Mitte des Fettpolsters). Das Abdomen wurde mit steriler Kochsalzlösung gespült und mit einem Zwei-Schicht-Ansatz geschlossen.
  • 4. In vivo intra-iBAT- und intra-iWAT-Verabreichung von AAV-Vektoren
  • Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt. Ein longitudinaler 1,5–2 cm langer Schnitt in dem interskapularen oder inguinalen Bereich wurde durchgeführt, um das iBAT oder iWAT dem Vektor auszusetzen. Um den Vektor über das gesamte Depot zu verteilen, erhielten iBAT oder iWAT 4 Injektionen von 10 μl der AAV-Lösung unter Verwendung einer Hamilton-Spritze. Die Haut wurde unter Verwendung des Ein-Schicht-Ansatzes geschlossen.
  • 5. Systemische Verabreichung von AAV-Vektoren
  • Die passende Menge der AAV-Lösung wurde in 200 μL Kochsalzlösung verdünnt und manuell in die laterale Schwanzvene injiziert, ohne zum Zeitpunkt der Zuführung Druck auszuüben. Vor der Injektion wurden die Tiere für wenige Minuten unter 250 W Infrarot-Wärmelampen gehalten (Philips NV, Amsterdam, NL), damit sich die Blutgefäße erweitern und das Sichtbarmachen zu erleichtern und um leichteren Zugang zur Schwanzvene zu haben. Ein Rückhaltegefäß aus Plastik (Harvard Apparatus, Holliston, MA, US) wurde verwendet, um das Tier für die Injektion zu sichern. Es wurde keine Anästhesie durchgeführt, da eine Rückhalteeinrichtung verwendet wurde. Eine 30-Gauge-Kanüle wurde verwendet, um die Tiere zu injizieren.
  • 6. Immunohistochemie
  • Zum Nachweis von GFP, RFP und α-SMA wurden die Gewebe für 12 bis 24 Stunden in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in Sektionen aufgeteilt. Die Sektionen wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, mit einem Ziege-anti-GFP-Antikörper (Abcam plc, Cambridge, MA, US) 1:300 verdünnt, mit einem Kaninchen-anti-RFP-antibody (Abcam plc, Cambridge, MA, US) 1/400 verdünnt oder mit einem Maus-anti-α-SMA-Antikörper (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US) 1/300 verdünnt. Ein biotinylierter Esel-anti-Ziege-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, US) 1:300 verdünnt, oder einem biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, US) 1/300 verdünnt oder einem biotinylierter Pferd-anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories, Burlingame, CA, US) 1/300 verdünnt als sekundäre Antikörper verwendet. Streptavidine Alexa Fluor 488 (Molecular Probes®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US) 1:300 verdünnt wurde als Fluorochrom verwendet und Hoescht-Bisbenzimid (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US) wurde zur nukleären Gegenfärbung verwendet. Alternativ wurde der ABC-Peroxidase-Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, US), 1:50 verdünnt, verwendet und die Sektionen wurden in Mayer's Hematoxylin gegengefärbt.
  • 7. Analyse der β-Galactosidase-Expression in eWAT-Proben
  • Um das Vorhandensein von β-Galactosidase in eWAT in toto nachzuweisen, wurden Gewebeproben für 1 Stunde in 4% Paraformaldehyd fixiert, zweimal in in PBS-Lösung gewaschen und anschließend in X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-β-D-galactopyranosid) in 5 mM K3Fe(CN)5, 5 mM K4Fe(CN)6, und 1 mM MgCl2 in PBS für 6-8 Std. bei Dunkelheit und 37°C inkubiert.
  • 8. GFP-Gehalt
  • Um den GFP-Gehalt zu bestimmen, wurden die Gewebe mechanisch in 1 ml Lysepuffer (50 mM/L Tris, 1% Nonidet P40, 0,25% Natriumdesoxycholat, 150 mM/L NaCl, 1 mM/L EDTA, in PBS, pH 7,4, sterilfiltriert) mit einem Polytron®-Typ-Gewebehomogenisator aufgebrochen und für 10 Minuten bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben bei 14.000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Gefäße überführt und der GFP-Gehalt in 100 μL dieser Lösung mit einem Lumineszenz-Spektrometer Flx800 (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, US) mit 488 nm Anregungswellenlänge und 512 nm Emissionswellenlänge gemessen. Die Werte für den Gesamt-GFP-Gehalt wurden über das Protein, das in der Probe enthalten war, korrigiert.
  • 9. Isolierung von Adipozyten aus epididymalen Fettpolstern
  • Die AAV-transduzierten Adipozyten wurden mittels Modifikation des Rodbell's-Verfahren isoliert; siehe Rodbell M, J. Biol. Chem. 1964; 239: 375–380. Isofluoran-anästhetisierte Mäuse wurden durch Köpfen getötet und epididymales WAT wurde zerkleinert und bei 37°C in Krebs-Ringer-Bicarbonat-HEPES-Puffer (KRBH), der 4% BSA (Fettsäure-frei), 0,5 mM/L Glucose und 0,5 mg/mL Collagenase Typ II (C6885; Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US) während 35–45 Minuten verdaut. Die Fettzellen wurden durch schonende Zentrifugation isoliert und drei Mal mit frischem Collagenase-freien KRBH ohne Glucose gewaschen. Die Adipozyten wurden in frischem KRBH ohne Glucose resuspendiert und Zellzahl wurde, wie kürzlich beschrieben, bestimmt; siehe DiGirolamo M, et al., Am. J. Physiol 1971; 221: 850–858.
  • 10. RNA-Analyse
  • Die Gesamt-RNA wurde erhalten von den isolierten Adipozyten, den Adipose-Depots oder der Leber unter Verwendung des QIAzol Lyse-Reagenz (Qiagen NV, Venlo, NL) beziehungsweise Tripure-Isolatierungs-Reagenz (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, US), und RNeasy Lipid Tissue Minikit (Qiagen NV, Venlo, NL). Um das restliche virale Genom zu eliminieren, wurde die Gesamt-RNA mit DNAse I (Qiagen NV, Venlo, NL) behandelt. Für die RT-PCR wurden 1 μg der RNA-Proben revers transkribiert unter Verwendung des Superscript VILO cDNA Synthesis-Kits (InvitrogenTM, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US). Echtzeit quantitative PCR wurde in einem SmartCyclerII® (Cepheid, Sunnyvale, USA) unter Verwendung des EXPRESS SYBRGreen qPCR-Supermix (InvitrogenTM, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US) durchgeführt. Die Sequenzen der Sinn- und Antisinn-Oligonukleotid-Primer sind:
    Figure DE112013007239T5_0004
  • Die Daten wurden mit 36B4-Werten normalisiert und, wie kürzlich beschrieben, analysiert; siehe Pfaffl M, Nucleic Acids Res. 2001; 29(9): e45.
  • 11. Glucose-Aufnahme ex vivo in isolierten Adipozyten
  • Für die von Mäusen isolierten Adipozyten wurde die 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose(2-DG; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, US)-Aufnahme bei verschiedenen Insulinkonzentrationen gemessen, wie kürzlich beschrieben; siehe Traxinger R, et al., J. Biol. Chem. 1989; 264: 8156–8163. In Kürze, isolierte Adipozyten wurden erhalten durch Collagenase-Verdau des epididymalen WAT von gefütterten Mäusen, wie kürzlich beschrieben. 250 μL Adipozyten-Suspension wurde mit KRBH + 4% BSA (Fettsäure-frei), 10 mM/L Desoxyglucose, 0,4 μCi 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose und verschiedenen Insulinkonzentrationen für 5 Minuten inkubiert. Letztendlich wurden die Adipozyten und das Inkubationsmedium über Siliconoil (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US) in Polypropylenröhrchen abgetrennt und die Radioaktivität in den Adipozyten-Proben wurde über Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse sind als pmol 2-[3H]-DG pro 106 Zelle pro Minute ausgedrückt.
  • 12. Glucose-Aufnahme in vivo
  • Der in vivo basale Glucose-Verwertungs-Index wurde bestimmt wie kürzlich beschrieben; siehe Franckhauser S, et al., Diabetes 2002; 51: 624–630. In Kürze, 148 GBq (4 μCi) des nicht-metabolisierbaren Glucose-Analogs Desoxy-D-[1,2-3H]glucose (2-DG; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, US) wurde in BSA-Zitrat-Puffer gemischt. Eine Flash-Injektion einer radioaktiv markierten Mischung wurde in die jugulare Vene der anästhetisierten (Ketamin + Xylazin), gefütterten Mäuse zum Zeitpunkt Null verabreicht. Die spezifische Blut-2-DG-Clearance wurde wie kürzlich beschrieben mit 25 μμL Blutproben (Schwanzvene) erhalten 1, 15 und 30 Minuten nach der Injektion bestimmt; siehe Somogyi M. J. Biol. Chem. 1945; 160: 69–73. Gewebeproben wurden 30 Minuten nach der Injektion entfernt. Der Glucose-Verwertungs-Index wurde bestimmt über die Messung der Akkumulierung der radioaktiv markierten Verbindungen; siehe Ferré P, et al., Biochem. J. 1985; 228: 103–110. Die Menge an 2-DG-6-Phosphat pro Milligramm Protein wurde geteilt durch das Integral des Konzentrationsverhältnisses von 2-DG zu der gemessenen nicht-markierten Glucose. Da die Werte nicht mit einer ”Diskriminierungs-Konstante” für 2-DG in Glucose metabolischen Signalwegen korrigiert wurden, sind die Ergebnisse ausgedrückt als der Index der Glucose-Verwertung in Picomol pro Milligramm Protein pro Minute.
  • 13. Messungen der hSeAP-Spiegel im Blut
  • Die zirkulierenden hSeAP-Spiegel wurden in 5 μL Serum unter Verwendung des Tropix® Phospha-LightTM Systems bestimmt (Applied BiosystemsTM, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US).
  • 14. Statistische Analyse
  • Alle Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SEM) ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden verglichen durch den Studenten-t-Test. Die Unterschiede wurden als wesentlich angesehen bei p < 0,05.
  • Beispiel 1
  • In vivo-Transduktion von weißen Adipozyten durch lokale Verabreichung von AAV
  • Um die Wirksamkeit der in vivo Transduktion von weißem Fettgewebe (WAT) mit AAV-Vektoren zu testen, wurden 4 × 1011 Virusgenome (vg)/Maus von AAV der Serotypen 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 und 9, die das Markerprotein GFP unter der Kontrolle des ubiquitären Promotors CAG (AAV-CAG-GFP) kodieren, bilateral in das epididymale weiße Fettgewebe (eWAT) von Mäusen mit oder ohne das nicht-ionische, oberflächenaktive Mittel Pluronics F88 injiziert; siehe Croyle M, et al., Mol. Ther. 2001; 4: 22–28, Gebhart C, et al., J. Control Release 2001; 73: 401–416, Mizukami H, et al., Hum. Gene Ther. 2006; 17: 921–928, und Sommer J, et al., Mol. Ther. 2003; 7: 122–128. Die Verabreichung von AAV1, AAV2, AAV4 und AAV5 ohne Pluronics F88 führte zu einem sehr niedrigen Prozentanteil von transduzierten weißen Adipozyten zwei Wochen nach der Injektion, getestet mittels Immunfärbung gegen GFP in eWAT. Darüber hinaus wurde keine Verbesserung bei der Effizienz der durch einen der getesteten AAV-Serotypen vermittelten Transduktion von Adipozyten erreicht bei Zugabe von Pluronics F88; siehe 1A. Daher wurde die Zugabe dieser nicht-ionischen, oberflächenaktiven Mittel bei den folgenden Experimenten ausgeschlossen. Unabhängig von der Zugabe von Pluronics F88 war AAV1 wirksamer als AAV2, AAV4 und AAV5 bei der Transduktion von eWAT in vivo; siehe Mizukami, 2006, vorstehend. Im Gegensatz zu den wenigen gestreuten Adipozyten und den kleinen Gruppen von Adipozyten, die durch AAV1 transduziert wurden, zeigten die Tiere, denen AAV6 und AAV7 injiziert wurde, große Gruppen von weißen GFP+-Adipozyten. Darüber hinaus zeigten die Tiere, denen AAV8 und AAV9 injiziert wurde, eine sehr viel größere Transduktion von eWAT und die überwiegende Mehrheit der Adipozyten pro eWAT-Region wurde transduziert; siehe 1B. Die Quantifizierung des GFP-Gehalts in eWAT über fluorometrische Analyse zwei Wochen nach der Verabreichung bestätigte ebenfalls, dass AAV der Serotypen 6, 7, 8 und 9 wirksamer sind als AAV1 bei der Transduktion von eWAT in vivo; siehe 1C. Bemerkenswert ist, dass epididymale Fettpolster, in die AAV8 und AAV9 injiziert wurden, den höchsten GFP-Gehalt ohne deutlich statistische Unterschiede zwischen ihnen zeigten; siehe 1C. Die Färbung mit dem LacZ-Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) zeigte eine großflächige Verteilung der transduzierten Adipozyten über das gesamte eWAT zwei Wochen nach der unilateralen intra-eWAT-Verabreichung von 2 × 1011 vg/Maus von AAV8, das das LacZ-Gen unter der Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors (AAV8-CMV-LacZ) kodiert; siehe 1D. Die lokale Verabreichung von AAV8 und AAV9-CAG-GFP-Vektoren in das inguinale WAT (iWAT) vermittelte ausgedehnte Transduktion von weißen und beigen Adipozyten in diesem Depot; siehe 1G und H. Alle zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass AAV8 und AAV9 die am meisten geeigneten Vektoren sind, um gentechnisch WAT in vivo herzustellen.
  • Zusätzlich resultierte die intra-eWAT-Verabreichung von AAV-Vektoren in einer Transduktion, die virtuell auf eWAT beschränkt ist. Zwei Wochen nach der Injektion zeigten die Tiere, die mit AAV1-, AAV6-, AAV7-, AAV8- oder AAV9-CAG-GFP behandelt wurden, keine Transduktion der mesenterischen, retroperitonealen und inguinalen Depots, wohingegen wenige braune GFP+-Adipozyten im iBAT der Mäuse vorhanden waren, denen AAV9 intra-eWAT injiziert wurde; siehe 8A. Die Transgen-Expression in BAT war jedoch minimal verglichen mit der, die in eWAT nachgewiesen wurde; siehe 8B. Im Hinblick auf die Transduktion von nicht-adipösem Gewebe, führte die intra-eWAT-Verabreichung von AAV7, AAV8 und AAV9-CAG-GFP auch zu signifikantem Genetransfer in Leber und Herz und zu einer geringfügigen Anzahl von exokrinen Zellen der Pankreas; siehe 8C.
  • Als Beleg für das Konzept, um zu bewerten, ob AAV-transduzierte Adipozyten in vivo ein realisierbares Modell ist, um die Adipozytenfunktion zu studieren, wurde 4 × 1011 vg/Maus der AAV9-Vektoren, das Mausenzym Hexokinase 11 (mHKII) unter der Kontrolle des ubiquitären Promotors CMV (AAV9-CMV-mHKII) kodiert, oder eine gleiche Dosis an AAV9-CMV-null-Vektoren bilateral in das eWAT von gesunden Mäusen injiziert. Zwei Wochen nach der Injektion zeigten isolierte Adipozyten von Tieren, die mit AAV9-CMV-mHKII behandelt wurden, einen 3-fachen Anstieg der Expression von mHKII verglichen mit Adipozyten von AAV9-CMV-null-injizierten Mäusen; siehe 1E. Um die Effekte einer AAV-vermittelten Überexpression von mHKII in Adipozyten zu analysieren, wurde ex vivo basale und Insulin-stimulierte 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme in isolierten Adipozyten bestimmt. In AAV9-CMV-mHKII-transduzierten Adipozyten war die basale 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme leicht angestiegen verglichen mit den AAV9-CMV-null-transduzierten Adipozyten. Im Gegensatz dazu führte die Insulin-Stimulation zu einem größeren Anstieg bei der 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme durch AAV9-CMV-mHKII-transduzierte Adipozyten verglichen mit den Adipozyten von Tieren, die mit AAV9-CMV-null-Vektoren behandelt wurden; siehe 1F.
  • Beispiel 2
  • In vivo AAV-vermittelte spezifische gentechnische Manipulation von weißen Adipozyten
  • Die Verwendung einer kurzen Version des Maus-Adipozyten-Protein 2 (mini/aP2)-Promotors, zusammengesetzt aus lediglich dem Adipozyten-spezifischen Enhancer in Verbindung mit dem aP2 basalen Promotor, wurde untersucht; siehe Ross, 1990 und Graues, 1992, vorstehend. Das Ziel dieses Tests war die AAV-vermittelte Transgen-Expression auf Adipozyten zu beschränken. Die unilaterale intra-eWAT Verabreichung von 1012 vg/Maus von AAV8 und AAV9, die GFP unter der Kontrolle der mini/aP2 regulatorischen Region kodieren, vermittelte die beschränkte Transduktion von weißen Adipozyten ohne nachweisbare GFP-Expression in der Leber und Herz zwei Wochen nach der Injektion; siehe 2A und 9.
  • Um den Zeitverlauf der durch die mini/aP2-regulatorische Region in Mäusen vermittelte Transgenexpression zu untersuchen, wurde eine Dosis von 4 × 1012 vg/Maus der AAV9-Vektoren, die humane von Placenta-stammende sekretierte alkalische Phosphatase(hSeAP)-cDNA unter der Kontrolle der mini/aP2-regulatorische Region (AAV9-mini/aP2-SeAP) kodiert, oder Kochsalzlösung wurde bilateral in eWAT injiziert, und die zirkulierenden hSeAP-Spiegel wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der AAV-Verabreichung gemessen. Zwei Wochen nach der AAV-Zuführung wurden hohe Spiegel an hSeAP im Blut gemessen, die progressiv bis zum Tag 40 angestiegen sind. Daraufhin blieben die hSeAP-Spiegel für einen Zeitraum von mindestens einem Jahr nach der Injektion gleich. Die Quantifizierung der hSeAP-Expressionslevel in der Leber und eWAT durch qPCR bestätigte, dass eWAT das Gewebe war, das verantwortlich war für die hauptsächliche Produktion von hSeAP; siehe 2B–2C.
  • Um festzustellen, ob AAV-vermittelte spezifische gentechnische Veränderung von weißen Adipozyten ein neues Hilfsmittel sein kann, um die Adipozyten-Funktion, -Differenzierung und -Metabolismus in vivo in Mäusen zu untersuchen, wurde 1,4 × 1012 vg/Maus der AAV9-Vektoren, die mHKII unter unter der Kontrolle der mini/aP2-regulatorischen Region (AAV9-mini/aP2-mHKII) kodieren oder eine gleiche Dosis von AAV9-mini/aP2-null-Vektoren an eWAT verabreicht. Zwei Wochen nach der Injektion wurde die in vivo basale 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme bestimmt. Tiere, die AAV9-mini/aP2-mHKII-Vektoren erhielten, zeigten angestiegene basale 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme durch eWAT verglichen mit Tieren, die mit AAV9-mini/aP2-null-Vektoren behandelt wurden. Kein Unterschied wurde bei der 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme unter basalen Bedingungen zwischen den Gruppen in iBAT und in Geweben, wie Herz, wo die Verwendung der mini/aP2-regulatorischen Region Transgenexpression erschwert, beobachtet; siehe 2D.
  • Beispiel 3
  • In vivo gentechnische Manipulation von braunen Adipozyten durch lokale Zuführung von AAV-Vektoren
  • Im Hinblick darauf, dass AAV8 und AAV9 die wirksamsten Vektoren waren bei der Vermittlung der gentechnischen Veränderung von weißen Adipozyten, wurde die Transduktion von braunen Adipozyten mit den gleichen Serotypen untersucht. Zwei Wochen nach der Verabreichung von 2 × 109 vg/Maus von AAV8- und AAV9-CAG-GFP-Vektoren in interskapuläres braunes Fettgewebe (iBAT) wurden zahlreiche braune GFP*-Adipozyten nachgewiesen; siehe 3A. Die Untersuchung der GFP-Expressionslevel über qPCR zeigte höhere Transduktionseffizienz von iBAT durch AAV8 im Vergleich zu AAV9 bei einer Dosis von 2 × 109 vg/Maus; siehe 3B. Nachdem die Transduktion der braunen Adipozyten unter der Verwendung der AAV8- und AAV9-Vektoren demonstriert worden ist, charakterisierten wir die in vivo Transduktionseffizienz von braunem Fettgewebe (BAT) mit den AAV-Serotypen 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 und 9. Zu diesem Zweck wurde eine Dosis von 1,2 × 1010 vg/Maus von AAV der Serotypen 4 und 8 oder eine Dosis von 1011 vg/Maus der AAV Serotypen 1, 2, 5, 6, 7, 8 und 9, die das Markerprotein RFP unter der Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors (AAV-CMV-RFP) in iBAT von Mäusen injiziert. Zwei Wochen nach der intra-iBAT-Verabreichung zeigte die Quantifizierung der RFP-Expressionslevel durch qPCR höhere Transduktionseffizienz von iBAT bei AAV7, AAV8 und AAV9 im Vergleich zu AAV1, 2, 4, 5 und 6; siehe 3C. In Übereinstimmung wurde großflächige Verteilung von braunen RFP+-Adipozyten in iBAT von Tieren nachgewiesen, die AAV9-Vektoren erhielten; siehe 3D.
  • Zusätzlich führte die intra-iBAT-Verabreichung von AAV in begrenzter Transduktion auf dieses Depot mit nicht nachweisbarer Transgenexpression in den epididymalen, mesenterischen, retroperitonealen und inguinalen Depots. In Bezug auf die Transduktion von nicht-adipösem Gewebe zeigten die Tiere, die intra-iBAT mit AAV7-, AAV8- und AAV9-Vektoren behandelt wurden, Transduktion von Herz und Leber, wohingegen die GFP-Expression nicht nachweisbar war in Pankreas, Dünndarm, Milz, Lunge, Niere, Skelettmuskel, Testis, Nebenhoden und Gehirn; siehe 10.
  • Beispiel 4
  • In vivo AAV-vermittelte spezifische, gentechnische Veränderung von braunen Adipozyten
  • Eine Mini-UCP1(mini/UCP1)-regulatorische Region, zusammengesetzt aus dem Enhancer, der braune Adipozyten-spezifische Expression vermittelt, und dem basalen Promotor des Ratten-UCP1-Gens wurde verwendet, um die Expression von Genen von Interesse in braunes Fettgewebe spezifisch zu vermitteln; siehe Boyer B, et al., Mol. Cell Biol. 1991; 11: 4147–4156, Kozak U, et al., Mol. Cell Biol. 1994; 14: 59–67, Cassard-Doulcier, 1998, und Larose, 1996, vorstehend. Zwei Wochen nach der intra-iBAT-Verabreichung von 2 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP-Vektoren wurde wirksame Transduktion von braunen Adipozyten erreicht; siehe 4A. Auf ähnliche Weise transduzierte die intra-iBAT-Zuführung von 2 × 1012 vg/Maus von AAV8- und AAV9-mini/aP2-GFP auch braune Adipozyten; siehe 11A. Darüber hinaus erzielte die mini/UCP1-regulatorische Region hohe Adipozyten-spezifische GFP-Expression unter vollständiger Beseitigung der AAV-vermittelten Expression im Herz und nur marginaler Vermittlung der Leber-Transduktion; siehe 11B.
  • Um zu untersuchen, ob die AAV-vermittelte Transduktion von iBAT ein neues Modell sein kann, um die Funktion der braunen Adipozyten zu studieren, wurde 7 × 1010 vg/Maus der AAV8-mini/UCP1-mHKII-Vektoren iBAT verabreicht. Die Tiere, die AAV8-mini/UCP1-mHKII-Vektoren erhielten, zeigten angestiegene basale 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme durch iBAT, verglichen mit den Tieren, die AAV8-mini/UCP1-null-Vektoren erhielten und zeigten keinen Unterschied bei der 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme unter basalen Bedingungen zwischen den Gruppen in eWAT und Herz; siehe 4B. Anschließend wurde 2 × 1011 vg/Maus der AAV9-mini/UCP1-VEGF164-Vektoren oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren intra-iBAT zugeführt. Zwei Wochen nach der Injektion zeigten die Tiere, die AAV9-mini/UCP1-VEGF164-Vektoren erhielten, Überexpression von VEGF164 und angestiegene Spiegel an Gesamt-VEGF in iBAT verglichen mit Tieren, die mit AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren behandelt wurden. Darüber hinaus wurde Überexpression von PECAM1 (ein herkömmlich verwendeter Endothelzell-Marker) in Tieren erhalten, die VEGF164 überexprimieren. Die Tiere, die mit AAV9-mini/UCP1-VEGF164.Vektoren behandelt wurden, zeigten eine angestiegene Anzahl von Blutgefäßen verglichen mit den Tieren, die AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren erhielten, wie durch Immunfärbung gegen α-SMA in iBAT demonstriert; siehe 4C–4F.
  • Beispiel 5
  • In vivo gentechnische Veränderung von weißen und braunen Adipozyten durch systemische Verabreichung von AAV8 und AAV9
  • Eine Dosis von 5 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-CAG-GFP-Vektoren wurde in die Schwanzvene von mageren Mäusen verabreicht. Die Transduktion der Fettdepots wurde zwei Wochen nach der Injektion untersucht. Die Immunfärbung gegen GFP der eWAT-Sektionen zeigte die AAV8- und AAV9-vermittelte Transduktion der weißen Adipozyten. Darüber hinaus zeigte die Messung der GFP-Expressionslevel und GFP-Gehalt ähnliche Transduktionseffizienz für sowohl AAV8 als auch AAV9. Weiterhin vermittelte die systemische Zuführung von 5 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-Vektoren die Transduktion der braunen Adipozyten des iBAT effizient. Die Messung der GFP-Expressionslevel über qPCR und des GFP-Gehalts über fluorometrische Analyse legen eine Tendenz in der Richtung nahe, dass AAV8 überlegene iBAT-Transduktionseffizenz zeigt als AAV9. Darüber hinaus zeigt die Messung der GFP-Expressionslevel über qPCR Gentransfer zu den inguinalen, retroperitonealen und mesenterischen Depots. Es wurden jedoch deutliche Unterschiede bei der Transduktionseffizienz zwischen den Depots beobachtet; siehe 5A–5H. Wichtig ist, dass die iv-Verabreichung von AAV8- oder AAV9-Vektoren zu diabetisch-adipösen ob/ob Mäusen oder db/db Mäusen auch zur gentechnischen Veränderung von WAT und BAT führte, mit ähnlicher Effizienz wie diejenige, die bei mageren Mäusen erhalten wurde; siehe 13. Die systemische Verabreichung der AAV8 oder AAV9-CAG-GFP-Vektoren transduzierte eine Reihe von nicht-adipösen Geweben; siehe 12.
  • Beispiel 6
  • In vivo spezifische gentechnische Veränderung von weißen und braunen Adipozyten mit AAV-mini/aP2- und AAV-mini/UCP1-Vektoren
  • Die systemische Zuführung von 2 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-mini/aP2-GFP führte zur Transduktion von weißen und braunen Adipozyten, obwohl niedrige Level an Transgenexpression erreicht wurden; siehe 7A. Im Gegensatz dazu vermittelte die systemische Verabreichung von 2 × 1012 vg/Maus von AAV8- oder AAV9-mini/UCP1-GFP-Vektoren eine deutliche Transduktion von braunen Adipozyten; siehe 6A. Zusätzlich wurde bei intravenös verabreichten AAV-mini/aP2-GFP- und MV-mini/UCP1-GFP-Vektoren die hohe Adipozyten-spezifische GFP-Expression beibehalten ohne nachweisbare Transgenexpression im Herz und marginaler Transduktion der Leber, was nur wenige verstreute GFP+-Hepatozyten zeigte; siehe 7B–7C.
  • Um weiterhin die gentechnische Veränderung von Adipozyten durch systemische Verabreichung von AAV zu zeigen, wurde 2 × 1012 vg von AAV9-mini/UCP1-VEGF164- oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren in die Schwanzvene injiziert. Zwei Monate nach der Injektion zeigten die Tiere, die AAV9-mini/UCP1-VEGF164-Vektoren erhielten, angestiegene Expression von VEGF164 und Gesamt-VEGF verglichen mit den Tieren, die mit AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren behandelt wurden; siehe 6B–6C. Zusätzlich wurde eine Dosis von 8 × 1012 vg von AAV9-mini/UCP1-VEGF164- oder AAV9-mini/UCP1-null-Vektoren in die Schwanzvene injiziert. Einen Monat nach der Injektion zeigten die Tiere, die 8 × 1012 vg von AAV9-mini/UCP1-VEGF164-Vektoren erhielten, angestiegene Expression von VEGF164 und PECAM1 und angestiegene Dichte der Blutgefäße; siehe 6D–6G.
  • Beispiel 7
  • In vivo spezifische gentechnische Veränderung von braunen Adipozyten mit AAV-mini/aP2-GK
  • Eine Dosis von 2 × 1011 vg/Maus von jeweils dem AAV9-Vektor, der das Ratten-Glucokinase-Enzym unter der Kontrolle der mini/aP2-regulatorischen Region kodiert, (AAV9-mini/aP2-rGK) oder einer gleichen Dosis von AAV9-mini/aP2-null-Vektoren, wurde lokal in das iBAT von Mäusen verabreicht. Zwei Wochen/ein Monat nach der Injektion wurde die in vivo basale und Insulin-stimulierte 2-[1-3H)Desoxy-D-glucose-Aufnahme bestimmt, um festzustellen, ob die Tiere, die AAV9-mini/aP2-rGK-Vektoren erhielten, angestiegene basale 2-[1-3H]Desoxy-D-glucose-Aufnahme insbesondere bei iBAT zeigen, verglichen mit Tieren, die mit AAV9-mini/aP2-null-Vektoren behandelt wurden.
  • Beispiel 8
  • Effiziente Adipozyten-Transduktion und Entfernen des Ziels für die Transgen-Expression von Leber und Herz mit mirT-Sequenzen nach systemischer Verabreichung von AAV-Vektoren
  • Eine Dosis von 1012 vg/Maus von AAV9-Vektoren, die das GFP-Markerprotein unter der Kontrolle des ubiquitären CAG-Promotors kodieren, (AAV9-CAG-GFP) oder den CAG-Promotor mit zusätzlichen vier Tandem-Zielstellen dem Leber-spezifischen miR122a (AAV9-CAG-GFP-miRT122), dem Herz-spezifischen miR1 (AAV9-CAG-GFP-miRT1) oder beiden (AAV9-CAG-GFP-doublemiRT), kloniert in die 3'UTR der Expressionskassette, wurde systemisch verabreicht. Zwei Wochen nach der Injektion wurden hohe Spiegel an GFP-Expression in den weißen und braunen Adipozyten der Mäuse beobachtet, die AAV9-CAG-GFP-, AAV9-CAG-GFP-miRT122-, AAV9-CAG-GFP-miRT1- oder AAV9-CAG-GFP-double-miRT-Vektoren erhielten. Im Gegensatz dazu wurde die GFP-Produktion in der Leber oder dem Herz fast vollständig unterdrückt in den Mäusen, die mit AAV9-CAG-GFP-miRT122- oder AAV9-CAG-GFP-miRT1-Vektoren behandelt wurden. Deutlich erkennbar war, dass die GFP-Produktion sowohl in der Leber als auch im Herz größtenteils von AAV9-CAG-GFP-double-miRT-behandelten Mäusen inhibiert wurde; siehe 14.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (39)

  1. Ein Adeno-assoziierter Virusvektor, der ein rekombinantes virales Genom umfasst, worin das rekombinante virale Genom eine Expressionskassette umfasst, die eine Fettgewebe-spezifische transkriptionelle regulatorische Region funktionell verknüpft mit einem Polynukleotid von Interesse umfasst.
  2. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 1, worin der Serotyp des AAV ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AAV6, AAV7, AAV8 und AAV9.
  3. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 1 oder 2, worin die Fettgewebe-spezifische transkriptionelle regulatorische Region eine Promotorregion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem basalen aP2-Promotor und dem basalen UCP1-Promotor umfasst.
  4. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 3, worin die Fettgewebe-spezifische transkriptionelle regulatorische Region weiterhin eine Enhancerregion funktionell verknüpft mit der Promotorregion umfasst.
  5. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 4, worin die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und dem Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer.
  6. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 5, worin die transkriptionelle regulatorische Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (iii) einem Polynukleotid umfassend den Adipose-spezifischen aP2-Enhancer und den basalen Maus-aP2-Promotor und (iv) einem Polynukleotid umfassend den Adipose-spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratte-UCP1-Promotor.
  7. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Expressionskassette weiterhin eine post-transkriptionelle regulatorische Region umfasst.
  8. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 7, worin die post-transkriptionelle regulatorische Region das Woodchuck Hepatitis Virus post-transkriptionelle regulatorische Element (WPRE) ist.
  9. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Polynukleotid von Interesse ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem sekretierten Protein, das systemisch wirkt und einem Protein, das auf oder im näheren Umkreis des Adipozyten wirkt.
  10. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Polynukleotid von Interesse ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hexokinase, Glukokinase, alkalische Phosphatase und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor.
  11. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Adeno-assoziierte Virus ITRs AAV2 ITRs sind.
  12. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der weiterhin mindestens eine miRNA-Zielsequenz umfasst.
  13. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 12, worin die mindestens eine miRNA-Zielsequenz mirT122a ist.
  14. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 12, worin die mindestens eine miRNA-Zielsequenz mirT1 ist.
  15. Der Adeno-assoziierte Virusvektor nach Anspruch 12, der mindestens eine Kopie von mirT1 und eine Kopie von mirT122a umfasst.
  16. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Adeno-assoziierten Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15 umfasst.
  17. Die Verwendung des Adeno-assoziierten Virusvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 16 in Medizin.
  18. Die Verwendung des Adeno-assoziierten Virusvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 16 bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung, die die Expression des Polynukleotide von Interesse in Fettgewebe erfordert.
  19. Die Verwendung des Adeno-assoziierten Virusvektors nach Anspruch 17, worin das Fettgewebe weißes Fettgewebe umfasst.
  20. Die Verwendung des Adeno-assoziierten Virusvektors nach Anspruch 17, worin das Fettgewebe braunes Fettgewebe umfasst.
  21. Die Verwendung des Adeno-assoziierten Virusvektors nach Anspruch 17, worin der Adeno-assoziierte Virusvektor oder die pharmazeutische Zusammensetzung systemisch oder lokal verabreicht wird.
  22. Ein in vitro-Verfahren zur Transduktion einer Zelle, welches das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Adeno-assoziierten Virusvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15 umfasst.
  23. Ein in vitro-Verfahren nach Anspruch 22, worin die Zelle ein Adipozyt ist.
  24. Ein in vitro-Verfahren nach Anspruch 22, worin der Adipozyt ein weißer Adipozyt oder ein brauner Adipozyt ist.
  25. Ein Adipozyt, der der über das Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24 erhalten wurde.
  26. Ein Polynukleotid, das eine Expressionskassette flankiert von den ITRs des Adeno-assoziierten Virusvektors, worin die Expressionskassette eine für Fettgewebe spezifische regulatorische Region funktionell verknüpft mit dem Polynukleotid von Interesse umfasst.
  27. Das Polynukleotid nach Anspruch 26, worin die für Fettgewebe spezifische regulatorische Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem basalen aP2-Promotor und dem basalen UCP1-Promotor.
  28. Das Polynukleotid nach Anspruch 27, worin die für Fettgewebe spezifische regulatorische Region weiterhin eine Enhancer-Region funktionell verknüpft mit der Promotor-Region umfasst.
  29. Das Polynukleotid nach Anspruch 28, worin die Enhancer-Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Fettgewebe spezifische aP2-Enhancer und dem Fettgewebe spezifische UCP1-Enhancer.
  30. Das Polynukleotid nach Anspruch 29, worin die regulatorische Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Polynukleotid umfassend dem Fettgewebe spezifischen aP2-Enhancer und dem basalen Maus-aP2-Promotor, und (ii) einem Polynukleotid umfassend dem Fettgewebe spezifischen UCP1-Enhancer und dem basalen Ratten-UCP1-Promotor.
  31. Das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 26 bis 30, worin die Expressionskassette weiterhin ein post-transkriptionelles regulatorisches Element umfasst.
  32. Das Polynukleotid nach Anspruch 31, worin die post-transkriptionelle regulatorische Region das Woodchuck Hepatitis Virus post-transkriptionelle regulatorische Element (WPRE) ist.
  33. Das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 26 bis 32, worin das Polynukleotid von Interesse ein Protein kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hexokinase, Glukokinase, alkalische Phosphatase und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor.
  34. Ein Vektor oder Plasmid umfassend ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 26 bis 33.
  35. Ein Adeno-assoziierter Virusvektor, der ein Virusgenom umfasst, das ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 26 bis 33 umfasst.
  36. Ein Verfahren zum Erhalt eines Adeno-assoziierten Virusvektors, das die Schritte umfasst: (iv) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 26 bis 33, AAV-cap-Proteine, AAV-rep-Proteine und virale Proteine, wovon AAV für die Replikation abhängig ist, umfasst, (v) Aufrechterhalten der Zelle unter Bedingungen, die für den Zusammenbau des AAV geeignet sind, und (vi) Reinigen des durch die Zelle produzierten Adeno-assoziierten Virusvektor.
  37. Das Verfahren nach Anspruch 36, worin die Proteine, wovon AAV für die Replikation abhängig ist, von einem Adenovirus stammen.
  38. Das Verfahren nach Anspruch 36 oder 34, worin die Adeno-assoziierten Virusvektor-rep- oder cap-Proteine von einem AAV-Serotyp stammen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den AAV6-, AAV7-, AAV8- und AAV9-Serotypen.
  39. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 38, worin Schritt (iii) weiterhin über einen Polyethylenglykol-Fällungsschritt oder eine Cäsiumchloridgradienten-Fraktionierung durchgeführt wird.
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