JP2020516644A - 腱および靱帯の損傷に対するｖｅｇｆ遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
ウイルスベクターとVEGF遺伝子またはその断片とを含む組成物、および線維性結合組織の損傷の治療のためにその組成物を用いる方法が提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年4月14日に提出された米国仮特許出願第62／485,647号に対する優先権の恩典を主張し、その内容はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
本出願は、2017年4月14日に提出された米国仮特許出願第62／485,647号に対する優先権の恩典を主張し、その内容はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
配列表
本明細書と同時に提出され、以下として特定される、コンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み入れられる：2018年4月11日に作成された、「021486-634001WO_Sequence_Listing_ST25.txt」と名付けられた49,152バイトのテキストファイル。
本明細書と同時に提出され、以下として特定される、コンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み入れられる：2018年4月11日に作成された、「021486-634001WO_Sequence_Listing_ST25.txt」と名付けられた49,152バイトのテキストファイル。
背景
腱損傷は人体に非常に多くみられる障害の一つであり、毎年2,000人に1人が罹患しており、手および手首に対する腱損傷には毎年2,700人に1人が罹患している。これらの腱損傷は、仕事、日常生活およびスポーツの活動による外傷、過用または加齢性変性が原因で起こりうる。腱、腱骨接合部および関連組織（靱帯など）に対する損傷は、身体の数多くの部位で起こりうる。そのような損傷のある人々は、救急治療室、外科入院病棟、外来診療所、およびリハビリテーション施設で治療される患者の大きな割合を占めている。損傷した腱は治癒不良であり；それらの外科的修復は往々にして、治癒能力が不十分であることに起因する、予測不能な断裂または四肢の動きの障害という結果に終わる。損傷した腱の治療は、腱それ自体の治癒能力が不十分であること、および生物学的な治癒強度を高めるための方法がないことが理由で、未だに医学における課題であり続けている。このため、腱損傷の患者に対する新規で効果的な治療法に対しては、極めて大きな需要がある。当技術分野におけるこれらの問題および他の問題に対する解決策が、本明細書において提供される。
腱損傷は人体に非常に多くみられる障害の一つであり、毎年2,000人に1人が罹患しており、手および手首に対する腱損傷には毎年2,700人に1人が罹患している。これらの腱損傷は、仕事、日常生活およびスポーツの活動による外傷、過用または加齢性変性が原因で起こりうる。腱、腱骨接合部および関連組織（靱帯など）に対する損傷は、身体の数多くの部位で起こりうる。そのような損傷のある人々は、救急治療室、外科入院病棟、外来診療所、およびリハビリテーション施設で治療される患者の大きな割合を占めている。損傷した腱は治癒不良であり；それらの外科的修復は往々にして、治癒能力が不十分であることに起因する、予測不能な断裂または四肢の動きの障害という結果に終わる。損傷した腱の治療は、腱それ自体の治癒能力が不十分であること、および生物学的な治癒強度を高めるための方法がないことが理由で、未だに医学における課題であり続けている。このため、腱損傷の患者に対する新規で効果的な治療法に対しては、極めて大きな需要がある。当技術分野におけるこれらの問題および他の問題に対する解決策が、本明細書において提供される。
概要
腱損傷および他の線維性結合組織（例えば、靱帯および筋膜）の損傷を治療するための組成物および方法が、本明細書において提供される。
腱損傷および他の線維性結合組織（例えば、靱帯および筋膜）の損傷を治療するための組成物および方法が、本明細書において提供される。
本発明は、その必要がある対象において線維性結合組織の損傷を治療する方法を提供する。諸態様において、本方法は、血管内皮増殖因子（VEGF）遺伝子またはその断片を含むポリヌクレオチドの治療的有効量を対象に投与する段階を含む。諸態様において、ポリヌクレオチドは、カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列をさらに含む。例えば、カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列は、SEQ ID NO：10の配列を含む。諸態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：11の配列を含む。ポリヌクレオチドは、局所的に、例えば、欠陥のある線維性結合組織の中または表面に直接的に、投与することができる。ポリヌクレオチドは、注射を介して投与することができる。ポリヌクレオチドは、溶液、ゲル、ペースト、粉末、または懸濁液として製剤化することができる。
本明細書に記載の方法によって治療することができる線維性結合組織は、靱帯、腱、筋膜またはそれらの任意の組み合わせでありうる。靱帯とは、骨を他の骨と結びつける線維性結合組織のことであり、関節靱帯、関節ラルア（articular larua）、線維性靱帯または真性靱帯としても知られる。腱（tendon）または腱（sinew）とは、通常は筋肉を骨と結びつけ、かつ張力に耐えることができる、強靭な帯状の線維性結合組織のことである。筋膜とは、皮膚の下にあって、筋肉および他の内臓を付着させ、安定させ、囲い込み、かつ分け隔てる、主としてコラーゲンである帯状またはシート状の結合組織のことである。靱帯は、それらがすべて結合組織で作られているという理由で、腱および筋膜と類似している。それらの違いは、それらが作り出す結びつきの違いにある：靱帯は1つの骨を別の骨と結びつけ、腱は筋肉を骨と結びつけ、筋膜は筋肉を他の筋肉と結びつける。
「対象」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであってよいが、これらの例には限定されない。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。対象は、靱帯、腱および／または筋膜の損傷（例えば、腱障害）を有すると以前に診断または特定されていて、かつ任意で、これらの損傷に対する治療的介入を既に受けたか、または受けているものであってよい。または対象は、靱帯、腱、および／または筋膜の損傷を有すると以前に診断されてはいないが、例えば仕事、日常生活またはスポーツの活動による外傷、過用、および／または加齢性変性が原因でそのような病状を発症するリスクを有するものであってもよい。
本明細書において用いうるように、「核酸」、「核酸分子」、「核酸オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸断片」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体、誘導体もしくは修飾物である、さまざまな長さを有してよい、一緒に共有結合的に連結した、ヌクレオチドの重合形態を非限定的に含むものとされる。種々のポリヌクレオチドが種々の三次元構造を有することができ、公知であるかまたは公知でない、さまざまな機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間DNA（ヘテロクロマチンDNAを非限定的に含む）、メッセンジャーRNA（mRNA）、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ある配列の単離されたDNA、ある配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。本発明の方法において有用なポリヌクレオチドは、天然の核酸配列およびそれらの変異体、人工的な核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含みうる。
ポリヌクレオチドは、典型的には、4種のヌクレオチド塩基：アデニン（A）；シトシン（C）；グアニン（G）；およびチミン（T）（ポリヌクレオチドがRNAである場合にはチミン（T）の代わりにウラシル（U））による特定の配列で構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である；または、この用語を、ポリヌクレオチド分子それ自体に対して適用することもできる。このアルファベット表現は、中央演算処理装置を有するコンピュータの中にあるデータベースに入力して、機能的ゲノミクスおよび相同性検索などのバイオインフォマティクス用途のために用いることができる。ポリヌクレオチドは、任意で、1つまたは複数の非標準的ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアラインメントが行われた2つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が現れる位置の数を決定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数によって除算し、この結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。
2つまたはそれを上回る核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、「同一な」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを下記のデフォールトのパラメーターで用いてまたは手作業によるアラインメントおよび目視の評価により測定して（例えば、NCBIのウェブサイト、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照されたい）、同一である、または、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドをある特定のパーセンテージで（すなわち、比較ウィンドウまたは指示された領域にわたって最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、指定された領域にわたって約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはより高い同一性で）有する、2つまたはそれを上回る配列または部分配列のことを指す。そのような配列を、その場合、「実質的に同一」であると言う。この定義はまた、試験配列の相補物のことも指しており、またはそれに対して適用することができる。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、さらには置換を有するものも含む。以下に述べるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮に入れることができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって存在し、またはより好ましくは、50〜100アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
本明細書において言及する「VEGF遺伝子」は、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGFタンパク質活性（例えば、VEGFと比較して少なくとも50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％活性の範囲内にある）を保っているその相同体または変異体をコードする、組換え型または天然型の遺伝子の任意のものを含む。諸態様において、変異体は、天然のVEGFポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％のアミノ酸配列同一性を有する。諸態様において、VEGFファミリーは、哺乳動物において5つのメンバーで構成される：VEGF-A、胎盤増殖因子（PGF）、VEGF-B、VEGF-CおよびVEGF-D。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子はVEGF-Aである。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、NCBI参照番号（NM_003376、NM_001025366、NM_001025367、NM_001025368、NM_001025369、NM_001025370、NM_001033756、NM_001171622、NM_001171623、NM_001171624、NM_001171625、NM_001171626、NM_001171627、NM_001171628、NM_001171629、NM_001171630、NM_001204384、NM_001204385、NM_001287044またはNM_001317010）によって特定される核酸またはそれらに対して実質的な同一性を有する変異体と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8または9の核酸配列と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：9の核酸配列と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。
諸態様において、本明細書に記載のいずれかの方法において用いられるVEGF遺伝子またはその断片は、ベクター（例えば、ウイルスベクター）の中にある。本明細書で用いる場合、「ベクター」という用語は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことを指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは付加的なDNAセグメントを連結することができる直鎖状または環状の二本鎖DNAループのことを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、この場合には付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらに機能的に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA手法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。しかし本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製能欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターといった他の形態も含むものとする。加えて、いくつかのウイルスベクターは、特定の細胞種を特異的または非特異的のいずれかで標的化することができる。複製能力のないウイルスベクターまたは複製能欠損性ウイルスベクターとは、それらの標的細胞を感染させてそれらのウイルス搭載物を送達することができるが、その後に細胞の溶解および死滅につながる典型的な溶解経路を継続することはできないウイルスベクターのことを指す。
本明細書において提供されるような「有効量」または「治療的有効量」とは、その意図する目的を達成するために有効な量のことを指す。特定の用途のために有効な実際の量は、特に、治療される病状に依存すると考えられる。疾患を治療するための方法において投与される場合、本明細書に記載の薬学的組成物は、所望の結果、例えば、疾患症状（例えば、腱、靱帯および／または筋膜の損傷）の軽減、除去、もしくはその症状の遅延を達成するため、または検出可能な治療効果もしくは抑制効果を示すための量で、VEGF遺伝子またはその断片を（かつ任意でウイルスベクターの中に）含むと考えられる。効果は、当技術分野において公知の任意のアッセイ方法によって検出することができる。対象にとっての厳密な有効量は、対象の体重、体格および健康状態；病状の性質および程度；ならびに投与のために選択される治療薬または治療薬の組み合わせに依存すると考えられる。所与の状況に対する治療的有効量は、臨床医の技能および判断の範囲内にある慣用的な実験によって決定することができる。諸態様において、治療しようとする疾患または病状は腱障害である。
本明細書で用いる場合、「治療すること」または「治療する」という用語は、疾患、病状または障害と闘うことを目的とする患者の管理およびケアを述べており、これには、疾患、病状もしくは障害の症状もしくは合併症を緩和するため、または疾患、病状もしくは障害を除去するための、本明細書に記載の組成物の投与が含まれる。「治療する」という用語はまた、インビトロでの細胞または動物モデルの治療も含む。
本明細書で用いる場合、「緩和する」という用語は、障害の徴候または症状の重症度が低下するプロセスを述べている。重要なこととして、徴候または症状は除去されなくとも緩和されうる。本発明の組成物または薬学的組成物の投与は、徴候または症状の除去をもたらしてもよいし、またはもたらすことができるが、除去が必要とされるわけではない。有効な投与量とは、徴候または症状の重症度を低下させることが予想されるべきである。例えば、複数の位置で起こる可能性のある腱障害などの障害の徴候または症状は、腱障害の重症度が複数の位置のうち少なくとも1つにおいて低下するならば、緩和される。
本発明はまた、ウイルスベクターとVEGF遺伝子またはその断片とを含む組成物も提供する。諸態様において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。諸態様において、ウイルスベクターはAAV 2型（AAV2）ベクターである。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8または9の核酸配列と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：9の核酸配列と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。本組成物はさらに、カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列を含みうる。諸態様において、カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列は、SEQ ID NO：10の核酸配列を含む。本明細書に記載の組成物は、溶液、ゲル、ペースト、粉末、または懸濁液として製剤化することができる。本明細書に記載の組成物は、線維性結合組織の中または表面に直接的に投与するために製剤化することができる。本明細書に記載の組成物は、注射を介する投与のために製剤化することができる。
本明細書に記載の組成物は精製することができる。精製された組成物は、重量比（乾燥重量）で、少なくとも約60％が関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、重量比で、少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約99％またはそれ以上が、関心対象の化合物である。純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定することができる。
「薬学的組成物」とは、組成物（例えば、VEGF遺伝子、または本明細書に記載のウイルスベクターの中にあるVEGF遺伝子）を対象に対する投与のために適した形態で含有する、製剤のことである。諸態様において、薬学的組成物はバルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、IVバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器の単一のポンプ、またはバイアルを含む、種々の形態のいずれかである。組成物の単位用量の中の活性成分（例えば、開示される核酸の製剤）の量は有効量であり、関与する特定の治療に応じて変化する。当業者は、患者の年齢および状態に応じて投与量に対して慣用的な変更を加えることが時折必要であることを理解するであろう。投与量はまた、投与の経路にも依存する。経口、肺、直腸、非経口、経皮的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、頬側、舌下、胸膜内、髄腔内、鼻腔内などを含む、種々の経路が想定される。本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤形には、散剤、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチおよび吸入剤が含まれる。諸態様において、活性のあるVEGF遺伝子は、薬学的に許容される担体、および必要とされる任意の保存料、緩衝剤または噴射剤と、無菌条件下で混合される。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲において、妥当なベネフィット／リスク比に対応し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適するような、化合物、アニオン、カチオン、材料、組成物、担体、および／または剤形のことを指す。
「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に安全で、無毒性で、かつ生物学的にも他の面でも望ましくないことのない薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、これには獣医学的使用ならびにヒトへの薬学的使用のために許容される賦形剤が含まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるような「薬学的に許容される賦形剤」には、1つおよび複数のそのような賦形剤の両方が含まれる。「薬学的に許容される賦形剤」の詳細な考察は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において見ることができる。治療用組成物中の薬学的に許容される賦形剤は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含有してもよい。加えて、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質が、そのような媒体中に存在してもよい。
本発明の薬学的組成物は、その意図する投与の経路と適合するように製剤化される。投与の経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮的（局所的）および経粘膜的投与が含まれる。
経口投与のために適した製剤は、（a）溶液剤、例えば、パッケージングされた核酸の有効量が、水、生理食塩水またはPEG 400などの希釈剤の中に懸濁されたものなど；（b）それぞれが所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含有する、カプセル、サシェ剤または錠剤；（c）適切な液体中にある懸濁剤；および（d）適した乳剤、からなることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存料、香味剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合性のある担体のうち1つまたは複数を含みうる。ロゼンジ形態は、香味剤、例えばスクロースなどの中にある活性成分、ならびに不活性基剤中に活性成分を含むパステル剤、例えば、活性成分に加えて、当技術分野において公知の担体を含む、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム乳剤、ゲルなどを含むことができる。
薬学的組成物はまた、タンパク質などの緩徐に代謝される大きな高分子、キトサンなどの多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス官能化セファロース（TM）、アガロース、セルロースなど）、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（油滴またはリポソームなど）も含みうる。加えて、これらの担体は、免疫賦活剤（すなわち、アジュバント）としても機能しうる。
直腸投与のために適した製剤には、例えば、座薬用基剤を伴うパッケージングされた核酸からなる座薬が含まれる。適した座薬用基剤には、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。加えて、選択した化合物と、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパラフィン炭化水素を含む基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。
例えば関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下の経路などによる非経口投与のために適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および、意図するレシピエントの血液に対して製剤を等張にする溶質を含んでもよい、水性および非水性の等張滅菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料を含んでもよい、水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実施に際しては、組成物を、例えば、静注により、経口的に、局部に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に、投与することができる。非経口投与、経口投与および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単回投与分または多回投与分が封入されたアンプルおよびバイアルなどの容器として用意することができる。
非経口、皮内または皮下適用のために用いられる液剤または懸濁剤は、以下の構成要素を含みうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの、張性の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整することができる。非経口用調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回用量バイアルに封入することができる。
化学療法治療のために現在用いられる周知の方法のうち多くで、本発明の薬学的組成物を対象に投与することができる。例えば、腱障害の治療のためには、本発明の組成物を腱の中に直接注入すること、血流もしくは体腔の中に注入すること、または経口的に服用すること、またはパッチを用いて皮膚を介して適用することができる。選択される用量は、有効な治療となるのに十分であるが、許容されない副作用を引き起こすほどには高くはないようにあるべきである。患者の病状（例えば、腱障害）の状態および健康状態は、好ましくは、治療中および治療後の妥当な期間にわたって綿密にモニタリングされるべきである。
本明細書で用いる場合、「単剤療法」とは、その必要がある対象に対する、単一の活性化合物または治療用化合物の投与のことを指す。好ましくは、単剤療法は、活性組成物（例えば、VEGF遺伝子、またはウイルスベクターもしくは本明細書に記載のいずれかの組成物の中にあるVEGF遺伝子）の治療的有効量の投与を伴うと考えられる。
本明細書で用いる場合、「併用療法」または「同時療法（co-therapy）」は、これらの治療薬の同時作用による有益な効果を得ることを意図する特定の治療レジメンの一部としての、本明細書に記載の組成物および少なくとも第2の薬剤の投与を含む。併用の有益な効果には、治療薬の組み合わせに起因する薬物動態学的または薬力学的な同時作用が非限定的に含まれうる。これらの治療薬を組み合わせての投与は、典型的には、規定の期間（選択される組み合わせに応じて、通常は数分間、数時間、数日間または数週間）にわたって行われる。
「併用療法」は、各治療薬が異なる時点で投与される逐次的な様式でのこれらの治療薬の投与と、実質的に同時の様式でのこれらの治療薬または治療薬のうち少なくとも2つの投与とを範囲に含むことを意図している。実質的に同時の投与は、例えば、各治療薬を定比率で有する単一のカプセルまたは治療薬のそれぞれについて複数の個々のカプセルを、対象に投与することによって、達成することができる。各治療薬の逐次的投与または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介しての直接吸収を非限定的に含む任意の適切な経路によって行うことができる。治療薬は、同じ経路によって、または複数の異なる経路によって投与することができる。例えば、選択された組み合わせの第1の治療薬を静脈内注射によって投与し、一方で、組み合わせの他の治療薬を経口投与してもよい。または、例えば、すべての治療薬を経口投与してもよく、またはすべての治療薬を静脈内注射によって投与してもよい。治療薬が投与される順序は厳密に重要というわけではない。
「併用療法」はまた、他の生物活性成分および非薬物療法（例えば、外科手術または放射線療法）とさらに組み合わせての、上記のような治療薬の投与も範囲に含む。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合には、非薬物治療は、治療薬と非薬物治療との組み合わせの同時作用による有益な効果が達成される限り、任意の適した時点で実施してよい。例えば、適切な症例において、非薬物治療が一時的に、あるいは数日間さらに数週間にわたって治療薬の投与から除去されても、有益な効果は得られ続ける。
本明細書に記載の組成物を、第2の抗生物質と組み合わせて投与してもよい。
本開示および添付の特許請求の範囲における単数形の不定冠詞または定冠詞（例えば、「1つの（a）」、「1つの（an）」、「その（the）」など）の使用は、この用語がその特定の場合において厳密に1つであって1つのみであることを意味するように意図されることが文脈から明らかである特定の場合を除き、「少なくとも1つ」を意味するという、特許における伝統的なアプローチに準拠する。同様に、「含む」という用語はオープンエンドであり、追加の項目、特徴、構成要素などを除外しない。本明細書において特定される参考文献は、特に指定のない限り、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
「含む」、「含有する」および「有する」、ならびにそれらの派生語などの用語は、包括的なオープンエンドの用語として、本明細書において互換的に用いられる。例えば、「含み」、「含有し」または「し」の使用は、いかなる要素が含まれる、有される、または含有されるにしても、その動詞を含む節の主題の範囲に含まれる唯一の要素ではないことを意味する。
別に定める場合を除き、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、当業者に対して、本発明において用いられる用語の多くについて一般的な定義を与える：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる場合、以下の用語は、別に特定する場合を除き、それらが持っているとみなされる意味を有する。
詳細な説明
腱損傷は人体に対する非常に多くみられる外傷の一つであり、手および手首に対する腱損傷は、この国だけでも年間100,000人を上回る人々に起こっている。重篤な腱断裂により、毎年100万日単位の労働損失が起こっている。年に100,000件を上回る損傷が起こり、患者1人当たり少なくとも3カ月の失業となり、再断裂率（その後の第2の手術を伴う）が10〜20％前後であるとすると、米国における手の腱損傷の推定費用は毎年12億ドルを上回る。実際のところ、腱の怪我は、最も費用のかかる怪我の種類の順位で第1位にランク付けされており、不十分なリハビリテーションに起因する甚大で永続的な身体障害が最終結果となることが非常に多い。これらの腱損傷は、仕事、日常生活およびスポーツの活動による外傷、過用または加齢性変性が原因で起こりうる。身体運動は往々にして、海軍、陸軍、空軍、プロスポーツ選手などの多くの専門家の毎日のスケジュールの大きな部分であるため、彼らは他のほとんどの者よりも腱損傷の発生率が高い傾向にあり、適正な治癒への需要が大きい。損傷した腱は治癒不良であり；それらの外科的修復は、往々にして、予測不能な断裂、または硬直もしくは癒着に起因する四肢の動きの障害という結果に終わる。腱、特に滑液嚢内鞘によって覆われたものは、血管供給が極めて限られているため、細胞充実性を欠いており、増殖因子活性が低い。腱機能の回復のためには早期の能動的運動が重要であるが、それは断裂のリスクを高める。損傷した腱の治療は、治癒能力が不十分であること、および治癒強度を高めるための方法がないことが理由で、未だに医学における課題であり続けている。このため、外科的に修復された腱の治癒環境を改善することは、これらの損傷に対する重要な要素であり、術後断裂率を低下させて、癒着形成をより少なくする可能性がある。
腱損傷は人体に対する非常に多くみられる外傷の一つであり、手および手首に対する腱損傷は、この国だけでも年間100,000人を上回る人々に起こっている。重篤な腱断裂により、毎年100万日単位の労働損失が起こっている。年に100,000件を上回る損傷が起こり、患者1人当たり少なくとも3カ月の失業となり、再断裂率（その後の第2の手術を伴う）が10〜20％前後であるとすると、米国における手の腱損傷の推定費用は毎年12億ドルを上回る。実際のところ、腱の怪我は、最も費用のかかる怪我の種類の順位で第1位にランク付けされており、不十分なリハビリテーションに起因する甚大で永続的な身体障害が最終結果となることが非常に多い。これらの腱損傷は、仕事、日常生活およびスポーツの活動による外傷、過用または加齢性変性が原因で起こりうる。身体運動は往々にして、海軍、陸軍、空軍、プロスポーツ選手などの多くの専門家の毎日のスケジュールの大きな部分であるため、彼らは他のほとんどの者よりも腱損傷の発生率が高い傾向にあり、適正な治癒への需要が大きい。損傷した腱は治癒不良であり；それらの外科的修復は、往々にして、予測不能な断裂、または硬直もしくは癒着に起因する四肢の動きの障害という結果に終わる。腱、特に滑液嚢内鞘によって覆われたものは、血管供給が極めて限られているため、細胞充実性を欠いており、増殖因子活性が低い。腱機能の回復のためには早期の能動的運動が重要であるが、それは断裂のリスクを高める。損傷した腱の治療は、治癒能力が不十分であること、および治癒強度を高めるための方法がないことが理由で、未だに医学における課題であり続けている。このため、外科的に修復された腱の治癒環境を改善することは、これらの損傷に対する重要な要素であり、術後断裂率を低下させて、癒着形成をより少なくする可能性がある。
これまでの10年で、本発明者らは、血管内皮増殖因子（VEGF）などの増殖因子遺伝子の、腱の中への送達が、治癒強度を強化し、癒着形成および断裂率を低下させる可能性があることを実証した。野生型アデノ随伴ウイルス（AAV）は、非病原性で広く普及した欠損ヒトパルボウイルスであり、いかなるヒト疾患も引き起こさない。その安全性および効率が理由となって、AAVは、臨床試験において有望なベクターとして用いられてきた。本発明者らの前臨床試験において、本発明者らは、損傷した腱に対するAAV2-VEGF（ヒトVEGF 165をコードするAAV血清型2ベクター）局所注射が、ニワトリ屈筋腱治癒モデルにおいて癒着形成を増加させることなく腱強度を有意に増加させることを実証した。さらに、治癒が完了した後に導入遺伝子発現は消失した。これらの知見は、AAV2-VEGF遺伝子移入が、腱固有の治癒能力が十分でないことに対する解決策となり得、かつ腱分離の患者に対する有効な治療の可能性をもたらし得ることを、強く示唆する。したがって、本発明者らの臨床試験は、修復した腱の断裂率の低下；雇用へのより早い復帰、および最も重要なことに、手の機能の最適な回復をもたらす可能性があり、この非常に大きな経済的影響を和らげると考えられる。
改良されたベクタープラスミド（例えば、AAV）中に、アンピシリン耐性とは干渉しないカナマイシンに対する耐性（KanR）を発現するゲノムインサートとともにVEGF遺伝子またはその断片を含む組成物が、本明細書において提供される。アンピシリン耐性は、VEGFをコードするプラスミドに関するスクリーニングの一手法として、ほとんどのAAVベクタープラスミドに用いられている。しかし、アンピシリンの使用は、アンピシリン耐性の導入が理論的可能性にせよ考えられる構築物は使用しないというFDAの指針／要求には、厳密に言えば準拠していない。
プラスミドの抗生物質選択は、プラスミドのスクリーニングおよび作製に最もよく用いられている手法である。例示的な態様においては、VEGFおよびKanRを含む構築物を、細菌である大腸菌（E. Coli）に導入する。続いて細菌細胞を、カナマイシンを含む増殖培地中で培養した。このようにして、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを含む細胞のみを生存させて増殖させることができた。増殖した細胞コロニーを収集して、インサートの突然変異を全く伴わない正しいクローニングであることを確かめるためにさらに分析した。
諸態様において、カナマイシン耐性遺伝子は、以下の核酸配列を含む。
また、ウイルスベクターの中にあるVEGF遺伝子またはその断片を含む組成物も、本明細書において提供される。諸態様において、ウイルスベクターはAAVベクターである。諸態様において、ウイルスベクターはAAV2ベクターである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームbである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームcである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームdである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームeである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームfである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームgである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-Aアイソフォームhである。
諸態様において、本明細書に記載の任意の組成物および方法に用いられるVEGF遺伝子は、以下の核酸配列を有するVEGF-AアイソフォームVEGF165である。
諸態様において、本明細書に記載の方法に用いられるVEGF遺伝子またはその断片は、天然のVEGF遺伝子と比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、50、100、150または200個の連続した核酸部分）にわたって、少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の核酸配列同一性を有する。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：1〜9の核酸配列のいずれか1つと実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：1〜9の核酸配列のいずれか1つの断片（例えば、1〜100、1〜150、1〜200、1〜250、1〜300、1〜350、1〜400、1〜450、1〜500、1〜550、1〜600、1〜650、1〜700ヌクレオチド長）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：1〜9の核酸配列のいずれか1つの変異体（例えば、天然のVEGF遺伝子に対して80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）の断片（例えば、1〜100、1〜150、1〜200、1〜250、1〜300、1〜350、1〜400、1〜450、1〜500、1〜550、1〜600、1〜650、1〜700）である。
諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：9の核酸配列と実質的に同一（例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：9の核酸配列の断片（例えば、1〜100、1〜150、1〜200、1〜250、1〜300、1〜350、1〜400、1〜450、1〜500）である。諸態様において、本明細書で用いられるVEGF遺伝子は、SEQ ID NO：9の核酸配列の変異体（例えば、天然のVEGF遺伝子に対して80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一）の断片（例えば、1〜100、1〜150、1〜200、1〜250、1〜300、1〜350、1〜400、1〜450、1〜500ヌクレオチド長）である。
諸態様において、本明細書に記載の核酸は、ベクター核酸の一部を形作る。典型的には、ベクターは、複製能力のないウイルスベクターである。例えば、複製能力のないウイルスベクターは、複製能力のないDNAウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスを非限定的に含む）である。例えば、複製能力のないウイルスベクターは、複製能力のないRNAウイルスベクター（複製能力のないレトロウイルスおよびレンチウイルスを非限定的に含む）である。諸態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス2型（AAV2）ベクターである。
諸態様において、ベクター核酸は、以下を含む配列を含む。
［下線部はVEGF遺伝子を指し示しており、太字の下線部はKanRインサートを指し示している］
さらに、本明細書において開示される組成物を、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤または担体との組み合わせで含む、薬学的組成物／製剤も提供される。
許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、典型的にはpH5.0〜8.0、最も多くの場合はpH6.0〜7.0であるリン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩などの緩衝剤；等張性にするための塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩；坑酸化剤、保存料、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート80などの親水性ポリマー、グリシンなどのアミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、および当業者に公知の他の標準的な成分（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980）を含む。
本明細書に記載されたような組成物を含む医薬製剤は、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なるであろう。諸態様において、投与は静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下であるか、または標的の部位の近位に施される。薬学的に許容される賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）のために適していてよい。
本明細書に記載されるような核酸の医薬製剤は、当技術分野において周知であって慣用的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。薬学的組成物は、GMP条件下で製造されることが好ましい。
本明細書に記載の薬学的組成物における、活性成分（すなわち、本明細書に記載の組成物）の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物および投与の様式にとって所望の治療反応を達成するのに有効であって患者に対して有毒ではない量の活性成分が得られるように変化させることができる。選択される投与量レベルは、使用される特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、使用される本明細書に記載の特定の組成物（例えば、核酸）の排出速度、治療の持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および過去の病歴、ならびに同様の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に応じて決まる。
医師または獣医師は、医薬製剤中で使用される本発明の核酸（例えば、任意でウイルスベクターの中にある、VEGF遺伝子）の用量を、所望の治療効果を達成するために必要であるよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やすことができる。一般に、本明細書に記載の組成物の有効用量は、治療しようとする具体的な疾患または病状、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、罹患生物（patient）がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および治療が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くのさまざまな要因に応じて変わる。治療投与量は、安全性および有効性を最適化するように微調整される必要がある。本発明の医薬製剤を用いる投与のためには、投与量は、宿主体重に対して約0.0001〜100mg／kg、より一般的には0.01〜5mg／kgである。例えば、投与量は、1mg／kg体重または10mg／kg体重または1〜10mg／kgの範囲内であってよい。例示的な治療レジメンは、2週間毎に1回、または1カ月毎に1回、または3〜6カ月毎に1回の投与を必要とする。
本明細書において提供される組成物は、複数の機会に投与することができる。個々の投薬の間の間隔は、毎週、毎月または毎年であってよい。また、間隔が、新規抗原に対する免疫応答を測定することによって示されるとおり不規則であってもよい。または、組成物を持続放出製剤として投与することもでき、この場合にはより低頻度の投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における組成物の半減期に応じて変化する。投与量および投与の頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変化しうる。予防的用途においては、比較的低い投与量が、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。患者によっては、それからの一生にわたって治療を受け続ける。治療的用途においては、疾患の進行が低下または停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が必要になることが時にある。その後に、患者に予防的レジメンを施すことができる。
本発明は、その必要がある対象において線維性結合組織の損傷を治療する方法を提供する。諸態様において、本方法は、本明細書に記載のいずれかの組成物、または血管内皮増殖因子（VEGF）遺伝子もしくはその断片を含むポリヌクレオチドの治療的有効量を対象に投与する段階を含む。
有効量および有効投与量という用語は、互換的に用いられる。有効量という用語は、所望の生理的反応を生じさせるために必要な任意の量と定義される。この場合に、例えば、所望の生理的反応は、VEGF遺伝子またはその断片が投与された場合に、本明細書に記載のVEGF遺伝子治療を受けていない対象の反応レベルと比較して、対象がより（例えば、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％またはそれ以上）反応性であることを含む。本方法において用いられる量は、治療しようとする病状の1つまたは複数の症状を低下させる。腱障害の例示的な症状には、疼痛、硬直、患部の脱力、患部における圧痛、発赤、熱感または腫脹が非限定的に含まれる。諸態様において、本方法において用いられる量は、他の治療法と比較して、またはいかなる治療も行わない場合の腱治癒のレベルと比較して、腱治癒を少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％またはそれ以上増加させる。諸態様において、本方法において用いられる量は、他の治療法と比較して、またはいかなる治療も行わない場合の腱強度のレベルと比較して、腱強度を少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％、150％、200％、250％またはそれ以上増加させる。
本明細書において提供される方法によれば、線維性結合組織の損傷は腱損傷である。諸態様において、腱損傷は腱障害である。諸態様において、腱損傷は腱周囲炎であり、これは腱とその鞘との間に位置する腱傍組織または腱周囲シートの炎症のことを指す。諸態様において、腱損傷は腱症のことであり、これには腱傍組織炎症および腱変性の組み合わせが両方とも存在する。諸態様において、腱損傷は腱炎であり、これは腱の炎症ならびに血管破裂を伴う変性のことを指す。諸態様において、腱損傷は腱分離である。
実施例1 ‐ bFGF遺伝子治療またはVEGF遺伝子治療は、腱の固有の治癒能力の不全を是正する
四肢運動の際には腱損傷がよくみられる。損傷した腱は治癒不良であり、生得的な治癒能力が不全であることが原因で、予測不能な断裂または動きの障害を往々にしてきたす。正常を上回る量のbFGFまたはVEGFを腱において内因性に産生させるための、アデノ随伴ウイルス2型（AAV2）ベクターを介した塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）遺伝子治療または血管内皮増殖因子（VEGF）遺伝子治療によって、本発明者らは、腱治癒能力の不全を効果的に是正することができた。この治療的アプローチは、治療を行った腱における第4週から第6週までのbFGFまたはVEGFの有意な増加を伴って（p＜0.05またはp＜0.01）、増殖因子活性の低さの実質的な緩和をもたらし、I型コラーゲンおよび他の細胞外分子の産生を有意に促進し（p＜0.01）、細胞増殖の速度を高め、かつ、（3）対照のものと比較して、腱強度をAAV2-bFGF治療後に第2週から68〜91％、AAV2-VEGF後に第3週から82〜210％、有意に増加させた（p＜0.05またはp＜0.01）。さらに、導入遺伝子の発現は、治癒が完了した後に消失した。これらの所見は、この遺伝子治療が、腱の固有の治癒能力の不全に対して希望の持てる解決策となること、および腱分離の患者に対する有効な治療の可能性をもたらすことを示している。
四肢運動の際には腱損傷がよくみられる。損傷した腱は治癒不良であり、生得的な治癒能力が不全であることが原因で、予測不能な断裂または動きの障害を往々にしてきたす。正常を上回る量のbFGFまたはVEGFを腱において内因性に産生させるための、アデノ随伴ウイルス2型（AAV2）ベクターを介した塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）遺伝子治療または血管内皮増殖因子（VEGF）遺伝子治療によって、本発明者らは、腱治癒能力の不全を効果的に是正することができた。この治療的アプローチは、治療を行った腱における第4週から第6週までのbFGFまたはVEGFの有意な増加を伴って（p＜0.05またはp＜0.01）、増殖因子活性の低さの実質的な緩和をもたらし、I型コラーゲンおよび他の細胞外分子の産生を有意に促進し（p＜0.01）、細胞増殖の速度を高め、かつ、（3）対照のものと比較して、腱強度をAAV2-bFGF治療後に第2週から68〜91％、AAV2-VEGF後に第3週から82〜210％、有意に増加させた（p＜0.05またはp＜0.01）。さらに、導入遺伝子の発現は、治癒が完了した後に消失した。これらの所見は、この遺伝子治療が、腱の固有の治癒能力の不全に対して希望の持てる解決策となること、および腱分離の患者に対する有効な治療の可能性をもたらすことを示している。
腱損傷は人体に非常に多くみられる障害の一つであり、毎年2,000人に1人が罹患しており、手および手首に対する腱損傷には毎年2,700人に1人が罹患している。これらの腱損傷は、仕事、日常生活およびスポーツの活動による外傷、過用または加齢性変性が原因で起こりうる。腱、腱骨接合部および関連組織（靱帯など）に対する損傷は、身体の数多くの部位で起こりうる。そのような損傷のある人々は、救急治療室、外科入院病棟、外来診療所、およびリハビリテーション施設で治療される患者の大きな割合を占めている。損傷した腱は治癒不良であり；それらの外科的修復は、往々にして、治癒能力が不十分であることに起因する、予測不能な断裂または四肢の動きの障害という結果に終わる。損傷した腱の治療は、腱それ自体の治癒能力が不十分であること、および生物学的な治癒強度を高めるための方法がないことが理由で、未だに医学における課題であり続けている。
腱、特に滑液嚢内鞘によって覆われたものは、血管供給が極めて限られているため、細胞充実性を欠いており、増殖因子活性が低い。これらの構造的または生物学的な特徴が、損傷後の腱の治癒強度が弱いことの理由となっている。動物モデルにおいていくつかの治療法に対する滑膜組織外腱の治癒反応がより優れることを指し示す予備的所見があるにもかかわらず、これまでのところ、損傷した腱に対する治療選択肢が、滑液嚢内腱の固有の治癒能力の不全を是正するのに十分であることは証明されていない。本発明者らは、早期の腱治癒期間の間に必要とされる正常を上回る量でこれらの因子を産生させる、選択した増殖因子遺伝子の腱への導入によって、滑液嚢内腱治癒の基礎にある基本的な問題を是正する、新たな治療的アプローチを開発することを目的とした。
本発明者らは、インビトロおよびインビボで腱治癒を促進する上での数多くの増殖因子遺伝子の移入の効率を検討し、血管内皮増殖因子（VEGF）が、腱細胞（腱線維芽細胞）増殖およびI型コラーゲン産生の最も効力のある刺激物質の一つであることを見いだした。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを本発明者らの研究における遺伝子送達媒体としたが、これはこのウイルスが非病原性であるためである。本発明者らは、AAV2型（AAV2）ベクターを用いたVEGF遺伝子の移入により、処置を行った腱において増殖因子、コラーゲンおよびそれらの修飾物質の産生を増強し、それが最終的には腱治癒における重大な期間にわたる治療力を有意に強化するとの仮説を立てた。本研究により、VEGF遺伝子治療が、固有の治癒能力の不全を是正し、外科手術後のより迅速かつよりロバストな腱治癒を招くこと、および損傷した腱を有する患者に対する効率的な生物学的治療様式となる可能性があることが示された。
結果
本発明者らは、ニワトリの屈筋腱、すなわち、深指屈筋（FDP）腱を完全に切断して、導入遺伝子（bFGF遺伝子またはVEGF遺伝子）を保有するAAV2ベクター、またはシャムAAV2ベクターを注入し、その直後に腱を外科的に修復した。ベクターは、腱切断の横断面を経由しての両側の腱断端に対するマイクロインジェクションによって腱に導入した。本発明者らは、注射を行っていない腱を非処置対照として用いた。
本発明者らは、ニワトリの屈筋腱、すなわち、深指屈筋（FDP）腱を完全に切断して、導入遺伝子（bFGF遺伝子またはVEGF遺伝子）を保有するAAV2ベクター、またはシャムAAV2ベクターを注入し、その直後に腱を外科的に修復した。ベクターは、腱切断の横断面を経由しての両側の腱断端に対するマイクロインジェクションによって腱に導入した。本発明者らは、注射を行っていない腱を非処置対照として用いた。
本発明者らは、横方向に切り裂いたニワトリ指屈筋腱に、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFの単回用量（2×109個のウイルス粒子／腱）を注入した。注射の用量は、同じニワトリ腱損傷および修復モデルを用いたパイロット試験に従って決定した。パイロット試験では、本発明者らは、2×107個、2×108個、2×109個および2×1010個のウイルス粒子（vp）を各腱に注入し、ベクターの量を2×107個から2×108個のvpまたはそれ以上に増やした場合には治癒強度が30〜40％増加することが見いだされるが、2×108個、2×109個または2×1010個のvpを注入した腱の間には統計学的な差は見いだされなかったことを見いだした（各用量について8例の腱、統計学的検定力＞0.80）。
bFGF遺伝子またはVEGF遺伝子の送達は、治癒中の腱において、bFGFの低下を妨げるか、またはVEGF遺伝子発現を増加させる。本発明者らは、16週間の期間にわたって、早期、中期および後期の腱治癒段階をカバーする8つの時点（第1週、第2週、第3週、第4週、第6週、第8週、第12週および第16週）で、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFまたはシャムAAV2ベクターが注入された腱、および非注射対照における腱を収集した。移入したbFGF遺伝子またはVEGF遺伝子のそれぞれの発現を分析するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）およびウエスタンブロットを行った。
ニワトリに対して送達されたbFGF遺伝子はラット由来のものであり、一方、VEGFはヒト由来であった。qPCRを用いてラットbFGFセグメントを特異的に増幅するプライマーを設計することによって、本発明者らは、手術後の第1週から第16週にかけての外因性bFGF遺伝子の発現レベルの変化を評価することができた（図1A）。bFGF導入遺伝子の発現は第1週には観察され、第2週から第8週にかけて徐々に増加し、その後は第8週から第12週にかけて低下した。bFGF導入遺伝子の発現は、第4週、第6週および第8週において、第1週、第2週および第12週よりも統計学的に高かった（p＜0.05またはp＜0.001）。bFGF導入遺伝子の発現は、第16週には検出不能となった。第1週〜第4週の時点で、内因性ニワトリbFGFの発現は、シャムベクターで処置したもの、または非注射対照におけるものと比較して、AAV2-bFGFで処置した腱において有意に増加した（p＜0.05またはp＜0.01）。非注射対照腱において、内因性bFGFの発現は、健常腱と比較して、損傷後の第1週から第5週にかけて有意に減少した（p＜0.05またはp＜0.01）。
マウス抗ラットbFGF抗体を用いたウエスタンブロット分析からは、第2週および第3週における導入遺伝子の同様の増加が示され、第4週から第8週にかけてピークとなり、第16週には外因性bFGFは検出不能であった（図1b、c）。免疫組織化学染色により、AAV2-bFGFで処置した腱のbFGFの総量の増加が立証された（図1D）。
同様に、ヒト由来のVEGF導入遺伝子は、第1週から第8週にかけて検出可能であり、第4週にピークとなり、VEGF導入遺伝子の発現は第4週に統計学的に最大であった（p＜0.05）（図1E）。第2週、第3週および第4週には、AAV2-VEGFで処置した腱における内因性VEGFの発現は、シャムベクターを注入した腱または非注射対照におけるものと比較して、有意に増加した（p＜0.01）。第2週から第12週にかけて、ヒトVEGFはマウス抗ヒト抗体を用いるウエスタンブロットによって腱で検出され、第4週から第8週にかけてピークとなった（図1F、G）。外因性VEGFの産生は、第16週には検出不能であった（図1G）。
本発明者らは、ニワトリbFGF遺伝子およびラットbFGF遺伝子において同一であるbFGF遺伝子のセグメントを増幅するために、一組のプライマーを用いた。本発明者らは、AAV2-bFGFを注入した腱において、内因性bFGF遺伝子および移入したbFGF遺伝子の両方の複合発現のレベルが治癒期間の早期および中期（第2週から第8週にかけて）に増加し、この期間にニワトリbFGF遺伝子がアップレギュレートされたことを見いだした。これらの増加は、損傷後の対照のbFGF遺伝子発現のダウンレギュレーションが実証されそのレベルが第8週まで低いままであった非注射対照とは、対照的であった。第2週から第8週にかけて、本発明者らはまた、ニワトリVEGF遺伝子およびヒトVEGF遺伝子の両方に共通の遺伝子のセグメントを増幅するプライマーを用いて、AAV2-VEGFを注入した腱におけるVEGF遺伝子の発現の有意な増加も見いだした。
bFGF遺伝子およびVEGF遺伝子の送達は、I型コラーゲン産生の早期の増加を生じさせ、III型コラーゲン産生および他の細胞外マトリックス遺伝子の発現をモジュレートする。腱修復の成功の主要な決定要因は、機械的強度の早期の獲得であり、これは修復部位を架橋するためのコラーゲンおよび他の細胞外マトリックス構成要素のロバストな合成に依存する。I型コラーゲンは、治癒強度の獲得のために特に重要である。修復した腱における早期でのIII型コラーゲンの存在は、それが無傷の腱または治癒中の腱の引っ張り強さに大して寄与しないことから、あまり好ましくない。腱強度を増強するという主要な目的は、I型コラーゲンを増加させてIII型コラーゲンを減少させることである。ウエスタンブロット分析により、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFで処置した腱におけるI型コラーゲンの発現の有意な増加が示され（図2A〜C）、AAV2-bFGFで処置した腱では第2週、第3週および第4週に（図2A）、AAV2-VEGFで処置した腱では第3週、第4週、第6週および第8週に（図2B）、有意な増加が示された（p＜0.01またはp＜0.001）。I型コラーゲンの量は、いずれの療法後にも第1週または第12週には有意に増加しなかった。どちらの療法後でも、III型コラーゲン遺伝子の発現は、手術後の早期の週、すなわち第1週および第2週には劇的にダウンレギュレートされた（p＜0.05またはp＜0.01）。加えて、III型コラーゲンのダウンレギュレーションは、AAV2-bFGF処置後の第3週および第4週にも存続した（図2D）。I型およびIIIコラーゲン遺伝子の発現は正常腱では極めてわずかであり、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子に比して、それぞれ0.22倍および0.07倍であった。いずれの遺伝子も、正常腱における発現のレベルは、外科的に修復された腱におけるものよりも有意に低かった（p＜0.001）。
本発明者らは、術後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週および第8週における、アグリカン（AGC）、デコリン（DCN）、フィブロネクチン（FN）、ラミニン（LN）およびフィブロモジュリン（FMOD）の遺伝子の発現を検討するために、qPCRを用いた。本発明者らは、AAV2-bFGF処置後の第4週、第6週および第8週（図2E〜G）、ならびにAAV2-VEGF処置後の第6週（図2F）における、FNの遺伝子発現の増加を特定した；同様の増加は、LNについても、AAV2-VEGF処置後の第1週および第2週に見いだされた（図2H、I）。AGC遺伝子、DCN遺伝子およびFMOD遺伝子の発現は、遺伝子治療によって有意には変化しなかった。
bFGF遺伝子およびVEGF遺伝子の送達は、治癒に有利なように腱の代謝をモジュレートする。細胞外マトリックスの代謝は、コラーゲンの産生および分解に影響を及ぼす。このことから、本発明者らは、代謝のいくつかの主な調節因子の遺伝子発現およびタンパク質産生を測定した。本発明者らは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）（MMP1、2、3および13）および組織メタロプロテイナーゼ阻害物質（TIMP）（TIMP2および3）の発現を、qPCRおよびウエスタンブロットを用いて評価した。
本発明者らは、非処置対照と比較した場合の、AAV2-bFGFで処置した腱における第3週および第4週での、ならびにAAV2-VEGFで処置した腱における第2週、第3週および第4週での、MMP1遺伝子の有意なダウンレギュレーションを見いだした（p＜0.01）（図3A）。MMP1遺伝子の発現は、正常腱において0.9±0.2倍（GAPDHに比して）であり、これは損傷した腱における第1週および第2週のそれと有意差はなかった。本発明者らは、AAV2-bFGFで処置した腱では第4週に（p＜0.01）、およびAAV2-VEGFで処置した腱では第1週から第4週にかけて（p＜0.05またはp＜0.01）、MMP3遺伝子の有意なダウンレギュレーションを見いだした。対照的に、TIMP2遺伝子の発現は、AAV2-bFGF処置後には第3週から第12週にかけて、およびAAV2-VEGF処置後には第2週から第8週にかけてアップレギュレートされた（図3B、C）。TIMP2遺伝子の発現は正常腱において0.01±0.01倍（GAPDHに比して）であり、これは損傷した腱における第1週とは有意差はなかった。TIMP3遺伝子の発現は、AAV2-bFGF処置後には第1週および第2週に、AAV2-VEGF処置後には第4週に一過性にアップレギュレートされたのみであった。
bFGF遺伝子またはVEGF遺伝子の送達は、腱線維芽細胞の増殖を増加させ、そのアポトーシスを妨げる。本発明者らは、増殖細胞核抗原（PCNA）染色を用いて、腱細胞の増殖を定量した。PCNA陽性細胞は、AAV2-bFGF処置またはAAV2-VEGF処置のいずれかの後の第2週および第3週に有意に増加した（図3Dおよび3E）。本発明者らはまた、腱の表面領域およびコア領域のアポトーシス細胞についても検討した。アポトーシス指数（AI）は、AAV2-bFGF処置またはAAV2-VEGF処置後の第1週および第2週には腱表面上で、AAV2-VEGF処置後の第1週にはコアで有意に低下した（図3F）。
bFGF遺伝子またはVEGF遺伝子の送達は、重大な治癒期間における治癒強度を強化する。Instron引っ張り試験機（Model 4411、Instron Inc., Norwood, MA.）を用いて、本発明者らは、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFが注入された腱の治癒強度を、術後の第0日、ならびに第1週、第2週、第3週、第4週、第6週および第8週に測定した。治癒強度は、腱治癒に対する実際の介入の効果の最も重要な機械的パラメーターである。強度の獲得は、治療法の最終的な目標である。第1週から第4週にかけて、非注射対照またはシャムベクター対照の腱は、強度の「獲得なし」を示すことが典型的であった。対照的に、AAV2-bFGF処置またはAAV2-VEGF処置のいずれの後にも、強度のより早期の増加が記録された。注目されることとして、AAV2-bFGF後の治癒強度は、非注射対照またはシャムベクター注射対照と比較して、第2週、第3週、第4週、第6週および第8週に有意に増加した（図4）。AAV2-VEGF注射の後に、腱の強度は第3週から増加し、第8週まで継続的に増加した。強度の増加は劇的であった−AAV2-bFGFで処置した腱では68〜91％の増加であり、AAV2-VEGFで処置した腱ではさらに大きく82〜210％の増加であった。AAV2-bFGFの有効性とAAV2-VEGFのそれとの比較において、本発明者らは、AAV2-bFGF処置後にはより早期に有意な効果を見いだした；しかし、AAV2-VEGFを注入した腱の強度増加の度合いは、第4週および第6週ではAAV2-bFGF注射のそれよりも大きかった（図4）。シャムベクターの注射は、非処置対照における腱と比較して、強度を有意には変化させなかった（p＞0.05、統計学的検定力＞0.80）。第8週の終わりには、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFのいずれで処置した腱の強度も、健常腱のそれとは統計学的に差がなかった（p＞0.05、統計学的検定力＞0.80）。ニワトリの健常FDP腱12例を試験した；最終的な強度は91±14Nであった。
処置群において、癒着の量および修復した足指を屈曲させるために必要な仕事量については有意な増加は見いだされなかった（p＞0.05、統計学的検定力＞0.85）（図5A〜D）。修復した腱の総断裂率は、いずれの対照群においても、処置群におけるよりも有意に大きかった（p＜0.01）（図5E、F）。
bFGFまたはVEGFの正常を上回る量の産生は、治癒が完了した後に停止する。本発明者らは、腱におけるラットbFGFまたはヒトVEGFを最長16週にわたって測定した（図1C、1G）；その時点で、腱治癒は完了していた。両方の遺伝子発現、および処置した腱に存在するbFGFタンパク質またはVEGFタンパク質の量は、第12週から第16週にかけてごくわずかであるかまたは検出不能なレベルに低下した（図1A〜C、E、F）。第16週には、処置した腱におけるbFGFおよびVEGFのレベルは、非注射対照におけるレベルまで戻った（図1D）。
組織学における腱構造。第8週およびその後に、本発明者らは、シャムベクターおよび非注射対照と比較して、処置した腱では、組織切片が、より規則的に整列したコラーゲンを伴う、より優れた構造的リモデリングを示すことを観察した。しかし、構造は第12週でも未だ正常ではなく、このことは構造的リモデリングには8週間または12週間よりも多くを要することを指し示している。第6週には、処置腱における細胞充実性が非注射対照におけるものよりもまだより顕著であり、コラーゲンは処置群においてよりロバストであるように思われた（図6A〜D）。
本研究では、AAV2ベクターを介してのbFGE遺伝子またはVEGF遺伝子のいずれかの送達により、早期および中期の治癒段階における腱強度が改善された。注目されることとして、この強度獲得は、付随する癒着形成の増加や腱滑りに対する抵抗力という代償を伴うことなく、達成される。この治療法は、腱強度を改善する上での非常に効率の高いやり方をもたらす。この治療的アプローチの影響は本発明者らの動物モデルにおいて印象的であり、68〜210％という強度の増加を生じさせたが、これは腱ギャップ形成または腱の分離を防ぐのに十分である可能性が高い。本研究は、固有の治癒能力が強化されかつ修復後の最初の数週間における腱強度回復の「獲得なし」期間が、腱が頻繁に破壊される期間における安定した獲得へと変換されうるやり方を、例証している。
非処置対照およびシャムベクター対照と比較して、AAV2-bFGFまたはAAV2-VEGFで処置した腱において、腱の動きに対する抵抗力および癒着の重症度のいずれについても増加は見いだされなかった。注目されることとして、III型コラーゲンの発現は、AAV2-bFGF処置後の第1週から第4週にかけて、およびAAV2-VEGF処置後の第1週から第2週にかけて、ダウンレギュレートされ（図2D）；その後III型コラーゲンの発現は、非注射対照と同一のレベルまで増加した。第6週のIII型コラーゲンの増加が癒着の量を増加させたとは考えられないが、なぜなら腱の周囲に形成される癒着は腱の治癒の最初の数週間に形成されるためである。治癒のより後期においては、癒着は増加しないがむしろリモデリングし、より大きな腱滑りがなされる。手術後の最初の数週間におけるIII型コラーゲンのダウンレギュレートは、より多くの量の成熟コラーゲン（I型コラーゲン）の付着を導き、これは強度のより早期の獲得に有利に働く。
細胞外マトリックス（およびその調節因子）の変化に関する本発明者らの所見は、処置した腱の強度の獲得のためのさらなる機構的説明を与える。AAV2-bFGF処置およびAAV2-VEGF処置により、MMPはダウンレギュレートされて、TIMPはアップレギュレートされた；これらの変化は両方とも、細胞外マトリックスの分解を遅らせるように作用する。加えて、腱線維芽細胞の増殖速度の増加は、細胞アポトーシスの阻害との対になっていた。このため、これらの治療法の機序は、腱細胞増殖の早期の増加が細胞アポトーシスの阻害と対になり、その後にIII型コラーゲンの阻害によるI型コラーゲンの正常を上回る産生、ならびにMMPおよびTIMPの活性の変化の結果としてのコラーゲン分解の全体的減速が起こるという可能性が高い。本発明者らの所見は、これらの分子イベントが、長く不活性な早期から中期までの治癒期間を生物学的にロバストな治癒期間へと効果的に変換し、それにより強度のめざましい獲得が導かれたことを示唆する。
この前臨床動物実験により、腱損傷を治療することに関する大きな有効性が実証された。AAVベクターの腱に対するマイクロインジェクションは簡便であるが、それでも有効である。AAVベクターは数多くの動物試験および臨床試験に用いられており、これまでのところは安全である。本発明者らは、これらのベクターが重要臓器（すなわち、脳、心臓、肺、肝臓、卵巣、その他）では発現されないことを立証した。本発明者らのデータは同様の治療有効性プロフィールを指し示しているが、本発明者らは、AAV2-bFGFとAAV2-VEGFとの間に幾分異なる効果があることを認めている。本発明者らの機械的試験により、いずれの治療法も治癒中の腱の周囲での癒着形成を増強しないことが示された。これらのすべての所見により、試験された両治療法が、臨床試験のための適切な候補となる。この研究により、両方の治療的アプローチが臨床試験のために適切であり、かつ臨床の場において腱修復に伴うさまざまな問題と闘うために滑液嚢内腱の弱い治癒能力を是正するという大きな見込みを有していることが、示された。
方法
ニワトリ腱損傷、外科的修復モデルおよび群の分割。動物実験は、Nantong大学の承認済みガイドライン、および国家実験動物規制に準拠して実施した。本研究は、Nantong大学の実験動物委員会によって承認された。
ニワトリ腱損傷、外科的修復モデルおよび群の分割。動物実験は、Nantong大学の承認済みガイドライン、および国家実験動物規制に準拠して実施した。本研究は、Nantong大学の実験動物委員会によって承認された。
動物。成体の白色レグホーン種ニワトリを実験モデルとして用いたが、これはニワトリ足指の屈筋腱がヒト手指におけるものに類似していて、指屈筋腱手術の調査のためにしばしば用いられるためである。本研究のために用いたニワトリ263羽のうち、ニワトリ12羽は健常腱における強度のデータを入手するために用い、ニワトリ53羽は外科的修復の直後の腱の強度を検査するため、または健常腱もしくは外科的修復のみを受けた腱における分子データおよび組織学的データを入手するために用いた。ニワトリ198羽（両足の396本の長足指）を、機械的試験のため、および／または遺伝子発現の分析、タンパク質のウエスタンブロット分析もしくは組織学的検討のための腱試料を採取するために用いた。
外科的手順および群。ニワトリの長足指を、手術時に施された種々の処置に応じて、4つの実験アームにランダムに割り付けた。ニワトリに、ケタミン（50mg／kg体重）の筋肉内注射によって麻酔を施した。足指を、無菌条件下および弾性包帯を用いる止血帯コントロール下で手術した。ヒトの手のゾーン2と同等である、近位指節間関節（PIP）と遠位指節間関節（DIP）との間にある足底皮膚に対してジグザグ切開を行った。腱鞘を経由する1.0cm長の縦切開により、鋭利なメスを用いて、足指を伸展させた上でPIP関節に対して約1.0cm遠位のレベルでFDP腱の横切断を行った。長足指を以下の通りに分割した。
第1群。非処置対照。腱にはいかなる注射も行わなかった。第2群。シャムベクター処置対照：20tlの生理食塩液中に希釈したAAV2シャムベクターの2×109個のvpを各腱に注入した。第3群。AAV2-bFGF注射群：20tlの生理食塩液中に希釈したAAV2-bFGFの2×109個のvpを各腱に注入した。第4群。AAV2-VEGF注射群：20tlの生理食塩液中に希釈したAAV2-VEGFの2×109個のvpを注入した。
切断した腱を、5-0縫合糸（Ethilon；Ethicon, Somerville, New Jersey）により、Kessler法の変法を用いて修復した。切開した鞘は開いたままとし、皮膚は断続縫合によって閉鎖した。手術した足指は、手術後に、粘着テープを用いて包帯材ラップにより半屈曲位にて固定した。
マイクロインジェクション針を、断裂した腱横断表面を通してのベクター注射のために、4つの部位（両方の腱断端の2つの部位）において0.5cmの深さで用いた。AAV2-bFGFベクターの5×108個の粒子を、4つの部位のそれぞれにおいて修復前の切断腱末端の断端に注入し、各腱における総注入用量を2×109個とした。
手術した足指を、術後第0日ならびに第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第12週および第16週における収集の時点に応じて、サブグループに分割した。
遺伝子移入ユニット−AAV2-bFGFおよびAAV2-VEGF−ベクターの構築および作製。一本鎖AAV2ベクターを用いた。AAV2-bFGFベクタープラスミドは、本発明者らが過去の刊行物に記載した通りに構築した。bFGF遺伝子はラット由来のものである（Gene bankアクセッション番号X07285）。AAV2-VEGFベクタープラスミドpAAV2-VEGFは、ヒトVEGF 165アイソフォームをコードするヒトVEGF遺伝子（Gene bankアクセッション番号AF486837）を、pAAV-MCS（Stratagene, La Jolla, Calif.）中に挿入することによって作製した。AAV2シャムベクタープラスミドはStratageneから購入した。AAV2-bFGF、AAV2-VEGFおよびシャムベクターは、Vector BioLabs（Philadelphia, Penn.）においてその後に作製されて精製された。
リアルタイムPCR。全RNAを単離して、相補性DNA（cDNA）へと逆転写させた。遺伝子の発現は、Eppendorf Mastercycler ep realplex（2S；Eppendorf, Hamburg, Germany）を用いる、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって分析した。転写の発現は、比較を標準化するためにGAPDH遺伝子に対して正規化した。
免疫組織化学法および免疫蛍光法。収集後に、腱に対して、4％パラホルムアルデヒドによる固定、パラフィン包埋、再水和、および4tm厚切片への縦断切片化を行った。免疫組織化学法は、切片内のラットbFGFを検出するために行った。標本は、4℃の加湿チャンバー内で、1：3000希釈したマウス抗ラットbFGF（05-118、Millipore Corp., Billerica, Mass.）、マウス抗ニワトリPCNA抗体（ab29、Abcam, Cambridge, Mass.）により、一晩かけて染色した。免疫蛍光法は、腱細胞の増殖を検討するために行った。PCNA染色がされた切片については、1：200希釈したフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンG（ICL, Inc、Newberg, Oregon）とともにインキュベートすることにより、PCNAタンパク質の局在を続いて描出した。
インサイチューTUNELアッセイ。組織学的組織切片における細胞死の検出は、TUNELアッセイキット（Roche, Mannheim, Germany）を製造元のプロトコールに従って用いることによって行った。パラフィン包埋した組織を切片化して、加湿チャンバー内で37℃で、TUNEL反応混合物とともに1時間インキュベートした。コンバーター-ペルオキシダーゼ（POD）溶液を適用し、スライドをインキュベートした。スライドは発色基質3,3-ジアミノベンジジン（DAB）の添加後に周囲温度でインキュベートして、Mayerのヘマトキシリンによって対比染色した。
ウエスタンブロット。腱試料をホモジネート化した。タンパク質含有量を正規化し、試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた上で、フッ化ポリビニリデン膜フィルター（Millipore Corp., Billerica, Mass.）に移行させた。フィルターを0.5％ Tween 20および5％脱脂乳を含むリン酸緩衝生理食塩水の中でインキュベートし、続いて一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。結合アフィニティ精製され、IRDye 800により標識された二次抗体とのインキュベーションの後に、ブロットを洗浄し、Odyssey imager（LI-COR, Inc., Lincoln, NE）によって免疫反応性タンパク質のスキャニングを行った。膜上の光学密度を測定し、内部対照（β-アクチン）と処置した試料との間の相対的な差を計算した。マウス抗ラットbFGF（Milipore Corp., Billerica, Mass.）、マウス抗ヒトVEGF（Santa Cruz, Dallas, Texas）、マウス抗ニワトリMMP2およびTIMP2（Abcam, Cambridge, Mass.）ならびにマウス抗ニワトリI型コラーゲンおよびIII型コラーゲン（Acris, San Diego, Calif.）をそれぞれ、種々のタンパク質を検出するための一次抗体として用いた。
腱の癒着組織の定量的スコアリング。確立されている類別方法を、癒着を巨視的に類別するために用いた。腱の連続切片化試料の三次元（3-D）再構築および整列のためにソフトウエア（Reconstruct、バージョン1.1.0.0；John C. Fiala, Boston, MA）を用いることによって、本発明者らは、試料中に記録された癒着の程度を検証することができた。本発明者らは、腱との癒着を1cmの長さにわたって再構築した。本発明者らは、腱の表面およびコアにおけるアポトーシス細胞の間の差異を検討するためのインサイチューTUNELアッセイによって染色された切片の整列のためにも同じ3-D再構築法を用いた。
治癒強度の生体力学的試験。本発明者らは、Instron引っ張り試験機（モデル4411；Instron Inc., Norwood, Mass.）における腱強度の検査のために、FDP腱をその全長にわたって収集した。終止FDP腱が結びついた末節骨を、装置の下方クランプにマウントした。近位腱末端を上方クランプにマウントした。2つのクランプの間の腱の長さは8cmであり、修復部位は中央に保たれた。腱を25mm／分の定速で直線的に引き離した。モニター上に示される荷重変位の急激な減少および修復部位での急な破壊によって指し示される最終的な破損が起こるまで、腱に対する荷重を連続測定した。力は最も近い0.1Nまで測定した。
腱に対する抵抗力の生体力学試験：屈曲の仕事量および滑り可動域。足指の動きに対する抵抗力を定量するための足指を膝関節での切断術によって収集し、試験機（Instron）の下方クランプに取り付けられたプラットフォームにマウントした。近位腱は上方クランプに結びつけた。腱滑りおよび足指屈曲の仕事量の両方が、癒着形成の重症度の機械的指標として、指の動きに対する抵抗力を指し示す。この設定を用いて、本発明者らは、固定荷重下でのFDP腱可動域、および足指屈曲の仕事量、すなわち完全伸展から70度の固定値まで足指を屈曲させるために必要なエネルギーを測定した。可動域の検査では、すべての足指関節を制限せずに、1回目の試行で腱可動域を検査し、2回目の試行では屈曲の仕事量とした。
定量および統計学。データは平均±SDとして表現される。ウエスタンブロット分析を行う際には、本発明者らは、標的バンドおよび対照バンドの密度を、コンピュータ支援の画像解析システムによって測定した。本発明者らは、PCNA陽性染色細胞の数を蛍光顕微鏡下で算定した。最終的な腱強度および滑り可動域は、モニターの直接的な読み取り値から入手した。荷重変位グラフは試験機によって記録し、指屈曲のために必要なエネルギーが屈曲の仕事量である。遺伝子発現、タンパク質の量、およびPCNA染色またはTUNEL染色の後の陽性染色細胞の数、癒着スコア、腱強度、屈曲の仕事量ならびに腱可動域の差は、二元配置繰り返し測定分散分析によって分析した。Holm-Bonferroni補正を加えたTukeyのHSD検定を、データ比較の各ペア間の有意性を検出するための事後検定として用いた。統計学的有意性に関する基準はP＜0.05とした。
Claims (20)
- その必要がある対象において線維性結合組織の損傷を治療する方法であって、血管内皮増殖因子（VEGF）またはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドの治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
- ポリヌクレオチドが、カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列をさらに含む、請求項1記載の方法。
- カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列が、SEQ ID NO：10の配列を含む、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO：11の配列を含む、請求項3記載の方法。
- VEGFがSEQ ID NO：1〜9のいずれか1つの核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- VEGFがSEQ ID NO：9の核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- 線維性結合組織が靱帯、腱、筋膜またはそれらの任意の組み合わせである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがウイルスベクターの中にある、請求項1記載の方法。
- ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス2型（AAV2）ベクターである、請求項8記載の方法。
- ポリヌクレオチドが前記線維性結合組織の中または表面に直接的に投与される、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドが注射を介して投与される、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、溶液、ゲル、ペースト、粉末または懸濁液として製剤化される、請求項1記載の方法。
- ウイルスベクターとVEGF遺伝子またはその断片とを含む、組成物。
- VEGF遺伝子がSEQ ID NO：1〜9のいずれか1つの核酸配列を含む、請求項13記載の組成物。
- VEGF遺伝子がSEQ ID NO：9の核酸配列を含む、請求項13記載の組成物。
- カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列をさらに含む、請求項13記載の組成物。
- カナマイシン耐性のための遺伝子産物をコードする配列が、SEQ ID NO：10の配列を含む、請求項16記載の組成物。
- 溶液、ゲル、ペースト、粉末または懸濁液として製剤化される、請求項13記載の組成物。
- 線維性結合組織の中または表面に直接的に投与するために製剤化される、請求項13記載の組成物。
- 注射を介した投与のために製剤化される、請求項13記載の組成物。
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