JP2002537790A - 核酸の組換えクローニングにおける使用のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、概して、核酸分子の組換えクローニングにおける使用のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、１以上の組換え部位またはそれらの一部をコードする核酸分子、１以上のこれらの組換え部位ヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて１以上のさらなる物理的ヌクレオチド配列または機能的ヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞、本発明の核酸分子を使用してポリペプチドを産生する方法、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるかまたは本発明の方法によって産生されるポリペプチドに関する。本発明はまた、本発明の１以上のポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合する抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、概して、組換えＤＮＡ技術に関する。より詳細には、本発明は、核
酸分子の組換えクローニングにおける使用のための組成物および方法に関する。
本発明は特に、１以上の組換え部位または１以上の部分的な組換え部位（特にａ
ｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ）をコードする核酸分子、ならび
にそれらのフラグメント、変異体、改変体および誘導体に関する。本発明はまた
、１以上の組換え部位ヌクレオチド配列が、１以上のさらなる物理的ヌクレオチ
ド配列または機能的ヌクレオチド配列と作動可能に連結した、このような核酸分
子に関する。本発明はまた、本発明のベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞、
本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびＲＮＡを産生する方
法、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるかまたは本発明の方法によ
って産生されるポリペプチド（これは、融合タンパク質であり得る）に関する。
本発明はまた、本発明の１以上のポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合
する抗体（これらは、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であり得る
）に関する。本発明はまた、特定の特徴を有するキメラＤＮＡ分子および／また
はＤＮＡセグメントを提供するための、核酸の組換えクローニング方法（インビ
ボおよびインビトロ）における、これらの核酸分子、ベクター、ポリペプチドお
よび抗体の使用に関する。より詳細には、本発明の抗体を使用して、本発明の核
酸分子もしくはベクターによってコードされるタンパク質または融合タンパク質
を同定および／または精製し得るか、あるいは本発明の核酸分子を同定および／
または精製し得る。

【０００２】 （関連技術） 部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物体（例
えば、ウイルスおよび細菌）に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼ
特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコン
ビナーゼ（いくつかの場合、会合タンパク質と共に）は、ＤＮＡ中の特定の塩基
配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換す
る。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、総称して「組換えタンパク質」と
いわれる（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）
。

【０００３】 種々の生物体由来の多くの組換え系が記載されている。例えば、Ｈｏｅｓｓら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７（１
９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９
１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）
：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１
）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１
）：２５（１９９２）；ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）を参照のこ
と。

【０００４】 これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒ
ｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６）；Ｖｏｚｉｙａｎｏ
ｖら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：９３０（１９９９））。おそらく
、これらのうち最も研究されているのは、バクテリオファージλ由来のインテグ
ラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７（１９９３）
）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂ
ｒｅｍｓｋｉ（１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、編：ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ
、Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９
０−１０９頁）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ
環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ ２９：２
２７−２３４（１９８２））である。

【０００５】 Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，６４０号）は、野生型組換え部位ａ
ｔｔＢおよびａｔｔＰを用いる酵素的部位特異的組換えによってタンパク質産生
ＤＮＡセグメントの組換えのための、λリコンビナーゼのインビボでの使用を開
示する。

【０００６】 ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ ５６：１４５−１５１（１
９８７））は、プロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との
間の分子内組換えのための、インビボでのλＩｎｔリコンビナーゼの使用を開示
する。これらの部位の配向はお互いに関して反転しているので、これは、目的の
遺伝子に関するプロモーター領域の非可逆的なフリッピングを引き起こす。

【０００７】 Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ ８８：２５−３６（１９９０）は、クロー
ン化されたＤＮＡ配列の外側かつ野生型ｌｏｘＰ部位の間に位置する制限部位を
含むバクテリオファージλアームを有する、ファージλベクターを開示する。Ｃ
ｒｅリコンビナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の、これらのファージベクター
への感染は、ｌｏｘＰ部位間の組換えおよびプラスミドレプリコン（クローン化
されたｃＤＮＡを含む）のインビボでの切除を生じる。

【０００８】 Ｐｏｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３９２−２３９８
（１９９４））は、選択可能なマーカーを有する部分的な発現ベクターを、ゲノ
ムＤＮＡに挿入し、２つの野生型ＦＲＴ認識配列に隣接させるための方法を開示
する。細胞中に存在するようなＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼは、所定の位置
でゲノムにベクターを組み込むために使用される。レプリコンが機能的である条
件下で、このクローン化されたゲノムＤＮＡは増幅され得る。

【０００９】 Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０６６号）は、部位間のインビボでの
組換えのための２つのｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡに対する、部位特異的リコンビ
ナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の使用を開示する。

【００１０】 Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：８１７−８２１（１９９３
））は、平滑末端化ＤＮＡのクローニングを容易にする方法を開示し、この方法
は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の存在下で、Ｃｒｅ部位特異的リコンビナーゼによっ
て作用する野生型ｌｏｃＰ部位を含む、脱リン酸化されたベクターとの分子間連
結を促進する条件を使用する。

【００１１】 Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＷＯ９３／１９１７２およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（９）：２２６５（１９９３））は、特定の抗体の軽鎖お
よび重鎖を、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘＰ５１１部位との間の異なるファージベクタ
ーにクローン化し、そして新しいＥ．ｃｏｌｉ細胞にトランスフェクトするため
に使用するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主細胞において２つの親分子（
１つのプラスミド、１つのファージ）に作用する）は、平衡状態にある４つの産
物：２つの異なる融合体（ｌｏｘＰ部位またはｌｏｘＰ５１１部位のいずれかで
組換えによって産生される）、および２つの娘分子を産生し、これらのうちの１
つは所望の産物であった。

【００１２】 ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４
６−１２７５１（１９９４））は、野生型およびスペーサー変異ＦＲＴ組換え部
位にそれぞれ隣接する、規定された染色体の位置で発現カセットを交換するイン
ビボ方法を開示する。二重相互乗換えは、部位特異的組換えについてのこのＦＬ
Ｐ／ＦＲＴ系を使用することによって、培養された哺乳動物細胞において媒介さ
れた。

【００１３】 Ｈａｒｔｌｅｙら（米国特許第５，８８８，７３２号）は、核酸セグメントお
よび分子の組換え交換のための組成物および方法（インビトロおよびインビボで
の種々の核酸分子の組換えクローニングにおける使用を含む）を開示し、この方
法は、野生型および変異組換え部位ならびに組換えタンパク質の組み合わせを使
用する。

【００１４】 トランスポザーゼ。酵素（トランスポザーゼ）のファミリーはまた、レプリコ
ン間の遺伝的情報を伝達するために使用されている。トランスポゾンは、構造的
に多様であり、単体または化合物として記載されているが、代表的に、逆の配向
でオーガナイズされたＤＮＡ配列に隣接するリコンビナーゼ遺伝子をコードする
。トランスポゾンの組込みは、ランダムであるかまたは非常に特異的であり得る
。Ｔｎ７（これは非常に部位特異的である）のような代表的なものは、レプリコ
ン間のＤＮＡセグメントのインビボでの移動に適応されている（Ｌｕｃｋｌｏｗ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。

【００１５】 ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３７
６５−３７７２（１９９４）は、レシピエントＤＮＡ分子へのＤＮＡセグメント
のインビトロでの挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示する。この系は
、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを使用する。目的のＤＮＡセグメ
ントは、トランスポゾン様要素ＴＹ１の末端間で、標準的な方法を用いてクロー
ン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下で、得られる要素は、第２の標的Ｄ
ＮＡ分子へランダムに組み込む。

【００１６】 （組換え部位）。上記の組換えタンパク質および／またはトランスポザーゼに
より媒介される組込み／組換え反応に対するキーはまた、組込み／組換え反応に
関与するＤＮＡ分子上の認識配列（しばしば「組換え部位」と呼ばれる）である
。これらの組換え部位は、組込みまたは組換えの初期段階の間に組換えタンパク
質により認識され、そして結合される関与する核酸分子上の、ＤＮＡの別個の部
分またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｓｅ）についてのこれらの組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対
コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆反復（リコンビナーゼ結合部位として作
用する）を含む３４塩基対配列である。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５；５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識
配列の別の例としては、組換えタンパク質λＩｎｔにより認識される、ａｔｔＢ
、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列が挙げられる。ａｔｔＢは、２つの９
塩基対コア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対オーバーラップ領域を含む約２５塩
基対配列であり、一方ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびａｒｍ型Ｉｎｔ
結合部位ならびに補助タンパク質の組込み宿主因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ
ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ）（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）につい
ての部位を含む約２４０塩基対配列である。Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと；本明細書中に
参考として援用される米国特許第５，８８８，７３２号もまた参照のこと。

【００１７】 （ＤＮＡクローニング）。ＤＮＡセグメントのクローニングは、現在では、多
くの研究所における日常の慣用的な仕事として、かつ多くの遺伝的分析における
前もって必要な工程として見出される。これらのクローニングの目的は、多様で
あるが、２つの一般的な目的が、考慮され得る：（１）比較的少量の公知のベク
ター（例えば、ｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）で行われる、大き
なＤＮＡまたはＲＮＡセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、ｍＲ
ＮＡなど）からのＤＮＡの最初のクローニング、および（２）これらのＤＮＡセ
グメントの機能的分析のために特殊化されたベクターへのサブクローニング。多
量の時間および努力が、最初のクローニングベクターからより特殊化されたベク
ターへのＤＮＡセグメントの移入において、両方とも費やされる。この移入は、
サブクローニングと呼ばれる。

【００１８】 クローニングのための基本的な方法は、長年の間公知であり、そしてその間に
ほとんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは、以下のようであ
る： （１）目的のＤＮＡを１つまたは１つの制限酵素を用いて消化する； （２）既知である場合、目的のＤＮＡセグメントをゲル精製する； （３）適切な場合、適切な制限酵素を用いる切断、アルカリホスファターゼを
用いる処理、ゲル精製などによりベクターを調製する； （４）切断されず、かつ自己連結したベクターのバックグラウンドを削除する
ための適切なコントロールとともに、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する； （５）生じたベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に導入する； （６）選択されたコロニーを取り、そして小さい培養物を一晩増殖させる； （７）ＤＮＡミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を作製する；そして （８）アガロースゲルでか（しばしば診断的な制限酵素消化の後に）またはＰ
ＣＲにより単離されたプラスミドを分析する。

【００１９】 ＤＮＡセグメントのサブクローニングのために使用される特殊化ベクターは、
機能的に多様である。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない： 種々の生物体において核酸分子を発現するためのベクター；核酸分子の発現を調
節するためのベクター；タンパク質精製において補助するためのタグまたは細胞
におけるタンパク質の追跡を可能にするためのタグを提供するためのベクター；
クローン化されたＤＮＡセグメントを改変する（例えば、欠失を生成する）ため
のベクター；プローブ（例えば、リボプローブ）の合成のためのベクター；ＤＮ
Ａ配列決定のためのテンプレートの調製のためのベクター；タンパク質コード領
域の同定のためのベクター；種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクタ
ー；目的のＤＮＡを大量に提供するためのベクターなど。特定の研究が、いくつ
かの異なる特殊化ベクターへ目的のＤＮＡセグメントをサブクローニングするこ
とを含むということは一般的である。

【００２０】 当該分野で公知のように、単純なサブクローニングは、１日で行われ得る（例
えば、ＤＮＡセグメントは、大きくなく、そして制限部位がサブクローニングベ
クターの制限部位と適合性である）。しかし、多くの他のサブクローニング（特
に未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配置、高い
バックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数週間かかり
得る。従って、ＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、しばしばできるだけ
少ない回数で行われるべき面倒な仕事とみなされる。

【００２１】 ＤＮＡセグメントのクローニングを容易にするためのいくつかの方法は、例え
ば、以下の参考文献に記載されテイル。

【００２２】 Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｇｅｎｅ １６：１９１（１９８１）は、酵母Ｄ
ＮＡのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開示す
る。これらのベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母ＤＮＡ
セグメントのクローンは、部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクタ
ーに連結され得る。元々のクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を
伝達する場合、選択性はカナマイシンであるため、形質転換の前に精製は全く必
要無い。

【００２３】 Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔら、Ｇｅｎｅ ４１：１２５（１９８６
）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内の独特のクローニング部位を有するサ
ブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主において、優性
感受性遺伝子におけるインサートまたは欠失を有するプラスミドのみが、ストレ
プトマイシン選択に耐える。

【００２４】 従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、
時間を浪費し、かつ比較的あてにならない。かなりの労働力が費やされ、そして
２日以上後に所望のサブクローンが、候補プラスミドの中に見出され得ない場合
には、全体のプロセスを、代替の条件を試して繰り返されなけれなならない。部
位特異的リコンビナーゼがインビボでＤＮＡを組換えるために使用されたが、イ
ンビトロでのこのような酵素の首尾良い使用は、いくつかの問題をこうむると予
測された。例えば、部位特異性および有効性は、インビトロでは異なると予測さ
れ；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてＤＮＡ基質および組換え
タンパク質のトポロジーは、インビトロでかなり異なると予測された（例えば、
Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：６６１−７３（１９９２）を参
照のこと）。インビボで何時間もの間続き得る反応は、インビトロでは酵素が不
活化する前にかなり少ない回数で起こると予測された。さらに、反応に関与する
核酸分子のトポロジー（すなわち、線状、コイル状、超コイル状など）の効果が
知られていなかったのと同様に、インビトロ反応におけるより長い時間のインキ
ュベーションの後の組換え酵素の安定性は知られていなかった。複数のＤＮＡ組
換え産物は、使用された生物学的宿主において、サブクローニングの不十分な信
頼性、特異性または有効性を生じると予測された。従って、インビトロ組換え反
応は、所望のレベルの産物を得るのに十分な有効性が期待されなかった。

【００２５】 従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超える利点を提供する代替の
サブクローニング系を提供する、切実な必要が長い間存在する。

【００２６】 （発明の要旨） 本発明は、１つ以上の組換え部位または１つ以上の部分的組換え部位、特にａ
ｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲならびにそれらのフラグメント、
変異体、改変体および誘導体をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、以
下を含むような核酸分子に関する：１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列また
はその部分、および１つ以上の付加的な物理的または機能的ヌクレオチド配列、
例えば、１つ以上の多重クローニング部位、１つ以上の転写終結部位、１つ以上
の転写調節配列（例えば、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、またはレプ
レッサ）、１つ以上の翻訳シグナル配列、融合パートナータンパク質またはペプ
チド（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ₆もしくはチオレドキシン）をコードする１つ以
上のヌクレオチド配列、１つ以上の選択マーカーまたはモジュール、局在化シグ
ナル（例えば、核局在化シグナルまたは分泌シグナル）をコードする１つ以上の
ヌクレオチド配列、１つ以上の複製起点，１つ以上のプロテアーゼ切断部位、遺
伝子または遺伝子の部分によりコードされる１つ以上の所望のタンパク質または
ペプチド、ならびに１つ以上の５’または３’ポリヌクレオチドテイル（特に、
ポリＧテイル）をコードするヌクレオチド配列。本発明はまた、１つ以上の組換
え部位ヌクレオチド配列が、１つ以上の付加的な物理的または機能的ヌクレオチ
ド配列に作動可能に連結されるような核酸分子に関する。

【００２７】 本発明はまた、本発明の組換え部位ヌクレオチド配列（またはその部分）を含
むプライマー核酸分子、ならびに１つ以上の標的特異的（例えば、１つ以上の遺
伝子特異的）プライマー核酸配列に連結されるようなプライマー核酸分子に関す
る。このようなプライマーはまた、（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどにより
）増幅されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的または相同な配列を含み得る。こ
のようなプライマーはまた、タンパク質遺伝子（リボソーム結合部位、局在化シ
グナル、プロテアーゼ切断部位、レプレッサ結合部位、プロモーター、転写終止
、終止コドンなど）の発現において有用な配列または配列の部分を含み得る。こ
のプライマーはまた、ＤＮＡ分子の操作において有用な配列または配列の部分（
制限部位、転位部位、配列決定のプライマーなど）を含み得る。本発明のプライ
マーは、核酸合成において使用され得、そして好ましくは核酸分子の増幅（例え
ば、ＰＣＲ）のために使用される。本発明のプライマーが、標的特異的または遺
伝子特異的配列（合成または増幅される標的内に含まれ、翻訳シグナル、遺伝子
配列、終止コドン、転写シグナル（例えば、プロモーター）などを含む任意の配
列）を含む場合、標的配列または遺伝子の増幅または合成は、達成され得る。従
って、本発明は、１つ以上の本発明のプライマーを核酸テンプレートと混合する
工程、およびその混合物をテンプレートの全てまたは部分に相補的な第１の核酸
分子を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する、核酸分
子の合成に関する。従って、本発明は、詳細には、核酸分子を合成する方法に関
し、この方法は、以下： （ａ）核酸テンプレートをポリメラーゼ活性を有するポリぺプチドおよび１つ
以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーと混合する工程；
ならびに （ｂ）この混合物を、テンプレートの全てまたは一部と相補的でありかつ好ま
しくは１つ以上の組換え部位またはその部分を含む第１の核酸分子を合成するの
に十分な条件下でインキュベートする工程、 を包含する。 本発明のこのような方法は、この第１の合成された核酸分子を、この第１の核酸
分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を合成するのに十分な条件下で
、インキュベートする工程をさらに包含し得る。このような合成は、その末端の
一方または両方に組換え部位またはその一部を有する第１の核酸分子を提供し得
る。

【００２８】 好ましい局面において、核酸分子の合成について、少なくとも２つのプライマ
ーが使用され、ここで各プライマーは、その末端において、および／または各プ
ライマーの内部配列内に相同な配列を含む（約２〜約５００塩基、好ましくは約
３〜約１００塩基、約４〜約５０塩基、約５〜２５塩基、そして最も好ましくは
約６〜約１８塩基の長さのオーバーラップする相同性を有し得る）。好ましい局
面において、第１のこのようなプライマーは、少なくとも１つの標的特異的配列
および少なくとも１つの組換え部位またはその部分を含み、一方第２のプライマ
ーは、少なくとも１つの組換え部位またはその部分を含む。好ましくは、第１の
プライマーと第２のプライマーとの間の相同性領域は、組換え部位の少なくとも
一部を含む。別の局面において、第１のプライマーと第２のプライマーとの間の
相同性領域は、１つ以上のさらなる配列（例えば、発現シグナル、翻訳開始モチ
ーフ、または増幅の際に所望の核酸配列に機能を付加する他の配列）を含み得る
。実際には、プライマーの二対が、核酸分子の合成または増幅のプライムをする
。好ましい局面において、合成されたかまたは増幅された核酸分子の全てまたは
少なくとも一部は、テンプレートの全てまたは一部に相同性であり、そして合成
されたかまたは増幅された分子の少なくとも一方の末端そして好ましくは両末端
に、組換え部位またはその一部をさらに含む。このような合成されたかまたは増
幅された核酸分子は、二重鎖または一重鎖であり得、そして本発明の組換えクロ
ーニング方法において使用され得る。本発明の相同性プライマーは、プライマー
の１つの組が任意の合成または増幅反応のために標準化され得るという実質的な
利点を提供する。すなわち、組換え部位配列（標的特異的配列を含まない）を提
供するプライマーは、予め作製され得、そして使用のために容易に入手可能であ
る。実際にこれにより所望の核酸分子を合成するかまたは増幅するために必要と
される標的特異的配列を含む、より短いあつらえたプライマーの使用が可能にな
る。従って、これにより、標的特異的プライマーを調製する際の時間および経費
が低減される（例えば、標的特異的配列を含むより短いプライマーが、調製され
得、そして合成反応において使用され得る）。他方では、標準化プライマーは、
大量に生成され得、経費を低減し、そして所望の核酸分子の合成を容易にするた
めに容易に（例えば、キットまたは製品として）提供され得る。

【００２９】 従って、１つの好ましい局面において、本発明は、１つ以上の核酸分子を合成
または増幅する方法に関し、この方法は、以下： （ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスク
リプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびにテンプレート特
異的（このテンプレートに相補的か、またはこのテンプレートにハイブリダイズ
し得る）配列を含む少なくとも１つの第１のプライマーおよび組換え部位の全て
または一部を含む少なくとも１つの第２のプライマーと混合する工程であって、
ここで第２のプライマーの少なくとも一部は、第１のプライマーの少なくとも一
部に相同性であるかまたは相補的である、工程；ならびに （ｂ）この混合物を、１つ以上の核酸分子を合成するかまたは増幅するのに十
分な条件下でインキュベートする工程であって、この１つ以上の核酸分子は、テ
ンプレートの全てまたは一部に相補的であり、かつこの分子の一方の末端および
好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位またはその部分を含む、工程、 を包含する。

【００３０】 より詳細には、本発明は、１つ以上の核酸分子を合成または増幅する方法に関
し、この方法は、以下： （ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスク
リプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびにテンプレート特
異的（このテンプレートに相補的であるか、またはこのテンプレートにハイブリ
ダイズし得る）配列および組換え部位の少なくとも一部を含む少なくとも１つの
第１のプライマー、ならびに組換え部位の全てまたは一部を含む少なくとも１つ
の第２のプライマーと混合する工程であって、ここで第２のプライマー上の組換
え部位の少なくとも一部が、第１のプライマー上の組換え部位の少なくとも一部
の相補的か、または相同性である、工程；ならびに （ｂ）この混合物を、１つ以上の核酸分子を合成するかまたは増幅するのに十
分な条件下でインキュベートする工程であって、この１つ以上の核酸分子は、テ
ンプレートの全てまたは一部に相補的であり、かつこの分子の一方の末端そして
好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位またはその一部を含む、工程、 を包含する。

【００３１】 より好ましい局面において、本発明は、１つ以上の核酸分子を増幅するか、ま
たは合成する方法に関し、この方法は、以下： （ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスク
リプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびに組換え部位の少
なくとも一部およびテンプレート特異的（テンプレートに相補的であるかまたは
テンプレートにハイブリダイズし得る）配列を含む１つ以上の第１のプライマー
と混合する工程； （ｂ）この混合物を、テンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上の核
酸分子を合成するかまたは増幅するのに十分な条件下でインキュベートする工程
であって、ここでこの分子が、この分子の一方の末端そして好ましくは両末端に
組換え部位の少なくとも一部を含む、工程； （ｃ）この分子を、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の第２のプライマー
と混合する工程であって、ここで第２のプライマーの組換え部位が、第１の核酸
分子上の組換え部位の少なくとも一部と相同性であるか、または相補的である、
工程；ならびに （ｄ）この混合物を、１つ以上の第２の核酸分子を合成するか、または増幅す
るのに十分な条件下でインキュベートする工程であって、この第２の核酸分子は
、第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的であり、そしてこの分子の一方の末
端そして好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位を含む、工程、 を包含する。

【００３２】 本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターまたは核
酸分子を含む宿主細胞、本発明の核酸分子によりコードされるポリぺプチドを作
製する方法、およびこれらの核酸分子にコードされるか、または本発明の方法に
より作製されるポリぺプチド（これは融合タンパク質であり得る）に関する。本
発明はまた、１つ以上の本発明のポリぺプチドまたはそのエピトープに結合する
抗体（これらは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る）に関す
る。本発明はまた、特定の特徴を有するキメラＤＮＡ分子および／またはＤＮＡ
セグメントを提供するための、インビトロおよびインビボで、核酸分子を組換え
クローニングするための方法における、これらの核酸分子、プライマー、ベクタ
ー、ポリぺプチドおよび抗体の使用に関する。

【００３３】 本発明の抗体は、ペプチドまたはタンパク質（本発明により作製される融合タ
ンパク質を含む）を同定および／または精製するための特定の使用、ならびに本
発明の核酸分子またはその部分を同定および／または精製するための特定の使用
を有し得る。

【００３４】 核酸分子のインビトロまたはインビボでの組換えクローニングのための方法は
、一般的に、キメラ核酸分子を提供するための、少なくとも１つの核酸分子（少
なくとも１つの組換え部位を有する）と第２の核酸分子（少なくとも１つの組換
え部位を有する）との間の組換えに関する。１つの局面において、この方法は、
キメラベクターを提供するための、第１のベクター（少なくとも１つの組換え部
位を有する）と第２のベクター（少なくとも１つの組換え部位を有する）との間
の組換えに関する。別の局面において、少なくとも１つの組換えを有する核酸分
子は、キメラベクターを提供するために、少なくとも１つの組換えを有するベク
ターと組み合わされる。もっとも好ましい局面において、組換えに使用された核
酸分子またはベクターは、２以上の組換え部位を含む。本発明のより好ましい実
施形態において、組換え方法は、目的反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）（本明細書中で「ＬＲ反応」としても言及される）に関し、この方法
において組換えは、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）クローンと目的ベクター（Ｄｅｓ
ｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）との間で生じる。このような反応は、発現ク
ローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）を作製するために目的の核酸分子
をエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）から目的ベクターに移す。具
体的には、本発明の方法はまた、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）反応またはゲートウ
ェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）反応（本明細書中で「ＢＰ反応」としても言及される）
に関し、この反応において、発現クローンは、エントリークローンを生成するた
めに、ドナー（Ｄｏｎｏｒ）ベクターと組換えられる。他の局面において、本発
明は、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）を少なくとも１つの核
酸分子（例えば、遺伝子または遺伝子の一部）と組み合わせることによってエン
トリークローンを調製する方法に関する。本発明はまた、目的のベクター内に１
以上（好ましくは、少なくとも２）の組換え部位を含むことによって、所望のベ
クターの目的ベクターへの転換に関する。より好ましい局面において、核酸分子
（例えば、カセット）（少なくとも２の組換え部位を有し、その部位は選択マー
カー（例えば、毒性遺伝子、または遺伝子またはエレメントを含む宿主細胞の生
存を防ぐ遺伝的エレメント、および／または核酸分子（例えば、遺伝子またはエ
レメントを含むベクターまたはプラスミド）の複製、分配、または遺伝率を防ぐ
）に隣接する）がベクターに添加され、本発明の目的ベクターが作製される。

【００３５】 本発明の使用のために好ましいベクターとしては、原核生物ベクター、真核生
物ベクター、またはベクター（種々の原核生物系および／または真核生物系との
間を往復し得る（例えば、シャトルベクター））が挙げられる。本発明の使用の
ための好ましい原核生物ベクターはとしては、グラム陽性細胞および／またはグ
ラム陰性細胞において増殖および／または複製し得るベクターが挙げられるがこ
れらに限定されない。これらのベクターとしては、以下の細菌が挙げられる：Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ属、ならびにＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ属、および好ましくは、Ｅ
．ｃｏｌｉ種。本発明の使用のための真核生物ベクターとしては、以下が挙げら
れる：増殖および／または複製するベクター、および酵母細胞、植物細胞、哺乳
動物細胞、（特にヒトおよびマウス）、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、魚類細
胞など。目的の特定のベクターとしては、クローニングベクター、配列決定ベク
ター、発現ベクター、融合ベクター、２ハイブリッドベクター、遺伝子治療ベク
ター、ファージディスプレイベクター、遺伝子標的ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、
ＹＡＣ、ＭＡＣ、および逆２ハイブリッドベクターが挙げられるが、これらに限
定されない。このようなベクターは、特定のベクターに依存して原核生物系およ
び／または真核生物系において使用され得る。

【００３６】 別の局面において、本発明は、本発明の方法を行う際に使用され得るキットに
関し、そしてより具体的には、クローニングキットまたはサブクローニングキッ
トおよびＬＲ反応（Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（例えば、発現クローンを作製する）を
行うためのキット、ＢＰ反応（例えば、エントリークローンを作製する）を行う
ためのキット、および本発明のエントリークローンおよび目的ベクター分子を作
製するためのキットに関する。このようなキットは、キャリアまたはレセプタク
ル（任意の数のコンテナをその中に受け、そして保有するために区画化されてい
る）を含み得る。このようなコンテナは、本発明の方法を行うための任意の数の
成分、またはこのような成分の組み合わせを含み得る。特に、本発明のキットは
、以下からなる群より選択される１以上の成分（または、その組み合わせ）を含
み得る：１以上の組換えタンパク質、または補助因子あるいはその組み合わせ、
１以上の組換えタンパク質、または補助因子あるいはその組み合わせ、１以上の
組成物（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ
ＭｉｘまたはＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｉｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉ
ｘ）、１以上の反応緩衝液、１以上のヌクレオチド、１以上の本発明のプライマ
ー、１以上の制限酵素、１以上のリガーゼ、ポリメラーゼ活性を有する１以上の
ポリペプチド（例えば、１以上の逆転写ポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラー
ゼ）、１以上のプロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼＫまたは他のプロテイ
ナーゼ）、１以上の目的ベクター分子、１以上のエントリークローン分子、１以
上の宿主細胞（例えば、コンピーテントセル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母
細胞、動物細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、な
どを含む）植物細胞、および最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＤＥ３．１宿主細胞
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＥＣＩＥＮＣＹ（登録商標）
ＤＢ３．１^TM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ））、本発明のキットを使用する
ための指示（例えば、本発明の方法を行うため）、など）。関連する局面のおい
て、本発明のキットは、以下を含み得る：１以上の組換え部位またはその一部を
コードする１以上の核酸分子、特に、本発明の１以上の組換え部位またはその一
部をコードするヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子。好ましくは、このよ
うな核酸分子は、少なくとも２つの組換え部位を含み、この部位は、選択マーカ
ー（例えば、毒性遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子）に隣接する。好ま
しい局面において、このような核酸分子は、カセットの形態（例えば、１以上、
そして好ましくは２以上の組換え部位またはその一部を含む直鎖状核酸分子）で
ある。

【００３７】 目的の核酸分子に組換え部位を挿入、または付加するためのキットは、１以上
のヌクレアーゼ（好ましくは、制限ヌクレアーゼ）、１以上のリガーゼ、１以上
のトポイソメラーゼ、１以上のポリメラーゼ、および１以上の組換え部位を含む
１以上の核酸分子またはアダプター含み得る。目的の１以上の核酸分子に組換え
部位を組み込むためのキットは、１以上の組換え部位を含む１以上の組換え配列
ならなる群より選択される１以上の成分（またはその組み合わせ）含み得る。こ
のような組換え配列は、１以上のトランスポゾン、統合ウイルス、相同性組換え
配列、ＲＮＡ分子、１以上の宿主細胞などを含み得る。

【００３８】 本発明のエントリークローン分子を作製するための方法は、任意の数または多
数の成分を含み得、そしてこのようなキットの組成物は、含まれる特定の方法に
依存して異なり得る。このような方法は、本発明の組換えクローニング方法によ
ってか、または従来の分子生物学技術（例えば、制限酵素消化および連結）を使
用して、目的の核酸分子をエントリーベクターまたはドナーベクターに挿入する
工程を含み得る。好ましい局面において、エントリークローンは、核酸増幅産物
または核酸合成産物を使用して作製される。増幅産物または合成産物からのエン
トリークローン分子を合成するためのキットは、１以上のドナーベクター（例え
ば、１以上のａｔｔＰベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（図４９）、ｐＤＮＯＲ２０
２（図５０）、ｐＤＯＮＲ２０３（図５１）、ｐＤＯＮＲ２０４（図５２）、ｐ
ＤＯＮＲ２０５（図５３）、ｐＤＯＮＲ２０６（図５３）、などが挙げられるが
、これらに限定されない））からなる群より選択される１以上の成分（またはそ
の組み合わせ）、ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（好ましくは
、ＤＮＡポリメラーゼおよび最も好ましくは熱安定性ポリメラーゼ）、１以上の
プロテイナーゼ、１以上の反応緩衝液、１以上のヌクレオチド、１以上の組換え
部位またはその一部を含む１以上のプライマー、および１以上のエントリークロ
ーンを作製するための指示を含み得る。

【００３９】 本発明の目的ベクターを作製するためのキットは、含まれる特定の方法に依存
して異なり得るこのようなキットの任意の数の成分および組成物を含み得る。こ
のような方法は、本発明の組換え方法または従来の分子生物学的技術（例えば、
制限エンドヌクレアーゼ消化および連結）を含み得る。好ましい局面において、
目的ベクターは、本発明の少なくとも１つの組換え部位（またはその一部）を含
む核酸分子（好ましくは、選択マーカーに隣接する少なくとも２つの組換え部位
またはその一部を含む核酸分子）を所望のベクターに挿入し、所望のベクターを
本発明の目的ベクターに転換することよって作製される。このようなキットは、
１以上の制限エンドヌクレアーゼ、１以上のリガーゼ、１以上のポリメラーゼ、
１以上のヌクレオチド、反応緩衝液、少なくとも１つの組換え部位またはその一
部を含む１以上の核酸分子（好ましくは、少なくとも１つの選択マーカー（例え
ば、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子および／また
は毒性遺伝子）を含むカセット）に隣接する少なくとも２つの組換え部位を含む
、少なくとも１つの核酸分子）、およびこのような目的ベクターの作製のための
指示からなる群より選択される少なくとも１つの成分（またはその組み合わせ）
を含み得る。

【００４０】 本発明はまた、本発明の核酸分子によって生成されるペプチドおよびタンパク
質（融合タンパク質であり得る）の同定および／または単離における本発明の抗
体を使用するのためのキット、および本発明の核酸分子またはその一部の同定お
よび／または単離のためキットに関する。このようなキットは、本発明の１以上
の抗体、１以上の検出可能な標識、１以上の固体支持体などからなる群より選択
される１以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。

【００４１】 本発明の他の好ましい実施形態は、当該分野で公知のことから、以下の本発明
の図面および記載から、および請求項から当業者には明らかである。

【００４２】 （発明の詳細な説明） （定義） 続く説明において、組換えＤＮＡ技術において使用される多くの用語は、広範
に利用される。このような用語が与えられるべき範囲を含む、本明細書および請
求の範囲の明らかなそして一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供さ
れる。

【００４３】 副産物は、クローン化またはサブクローン化されることを所望されるセグメン
トを欠く娘分子（組換えクローニングプロセスの間の２次的な組換え事象の後に
産生される新しいクローン）である。

【００４４】 共組込みは、親（出発）分子の両方を含む本発明の少なくとも１つの組換え中
間核酸分子である。通常、直線状である。いくつかの実施形態において、環状で
あり得る。ＲＮＡおよびポリペプチドは、適切な宿主細胞株（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＤＢ３．１（特に、Ｅ．ｃｏｌｉＬＩＢＲＡＲＹＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登
録商標）ＤＢ３．１^TMＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ））を用いて、そして共組
込み分子において見出される両方の選択マーカーについて選択した共組込みから
発現され得る。

【００４５】 宿主は、本発明の組換えクローニング産物、ベクター、または核酸分子のレシ
ピエントであり得る任意の原核生物または真核生物である。本明細書中で使用さ
れる用語として、「宿主」は、遺伝的に操作され得る原核生物または真核生物を
含む。このような宿主の例について、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。

【００４６】 挿入物は、所望される核酸セグメントまたは本発明の方法によって操作され得
る核酸セグメントの集団を含む。従って、用語挿入物は、特定の核酸（好ましく
は、ＤＮＡ）セグメントまたはセグメントの集団を含むことを意味される。この
ような挿入物は、１つ以上の核酸分子を含み得る。

【００４７】 挿入物ドナーは、挿入物を運ぶ本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡま
たはＤＮＡ）の１つである。挿入物ドナー分子は、組換え部位により両側に隣接
された挿入物を含む。挿入物ドナーは、直線状または環状であり得る。本発明の
１つの実施形態において、挿入物ドナーは、環状ＤＮＡ分子であり、そして組換
えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む（図１を参照のこと
）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団が、挿入物ドナーを作製するため
に使用される場合、挿入物ドナーの集団が生じ、そして本発明に従って使用され
得る。このような挿入物ドナー分子の例は、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMエントリーベクタ
ーであり、この例としては、図１０〜２０において描かれるそれらのエントリー
ベクター、およびライブラリークローンの産生のために、１つ以上のａｔｔＬ部
位（例えば、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２など）により、または１つ以上のａｔｔＢ
部位（例えば、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２など）により隣接された目的の遺伝子を
含む他のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。

【００４８】 産物は、組換えクローニングプロセスの間に、２次的な組換え事象後に産生さ
れるＡ配列およびＤ配列を含む所望される娘分子の１つである（図１を参照のこ
と）。この産物は、クローン化またはサブクローン化されるべき核酸を含む。本
発明に従って、挿入物ドナーの集団が使用される場合、産物分子の得られた集団
は、挿入物ドナーの挿入物の集団の全てまたは一部分を含み、そして好ましくは
、挿入物ドナーの元々の分子の代表的な集団を含む。

【００４９】 プロモーターは、開始コドンに近接して位置される、遺伝子の５’領域として
一般に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写は、プロ
モーター領域で開始される。転写の抑制性プロモーター速度は、抑制剤に応答し
て減少する。転写の誘導プロモーターの速度は、誘導剤に応答して増加する。転
写の構成性プロモーターの速度は、特に調節されないが、一般的な代謝状態の影
響下で変更し得る。

【００５０】 認識配列：認識配列は、タンパク質、化合物、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子（例
えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が、
認識し、そして結合する特定の配列である。本発明において、認識配列は、通常
、組換え部位をいう。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための認識配列は、８塩
基対コア配列に隣接している２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合
部位として働く）から構成される３４塩基対配列であるｌｏｘＰである。Ｓａｕ
ｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと。認識配列の他の例は、リ
コンビナーゼ酵素λインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配
列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２つの９塩基対コ
アタイプのＩｎｔ結合部位および１つの７塩基対オーバーラップ領域を含むおよ
そ２５塩基対配列である。ａｔｔＰは、コアタイプＩｎｔ結合部位およびアーム
（ａｒｍ）タイプＩｎｔ結合部位ならびに補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨ
Ｆ）、ＦＩＳおよびエキシジョナーゼ（Ｘｉｓ）についての部位を含む、およそ
２４０塩基対配列ある。Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと。
このような部位はまた、本発明の方法において、産物の産生を高める本発明に従
って、操作され得る。このような操作された部位が、Ｐ１ドメインまたはＨ１ド
メインを欠いて、組換え反応を不可逆にさせる（例えば、ａｔｔＲまたはａｔｔ
Ｐ）場合、このような部位は、これらの部位のドメインがいくつかの方法におい
て改変されていることを示す、指定されたａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’であり得
る。

【００５１】 組換えタンパク質としては、除去（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）タンパク質または組込
み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）タンパク質、酵素、補因子、または１つ以上の組
換え部位を含む組換え反応に関わる関連タンパク質が挙げられ、こらは、野生型
タンパク質（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）、または変
異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはそのフラグメントを含む融
合タンパク質）、フラグメント、およびその改変体であり得る。

【００５２】 組換え部位は、本発明の組換えクローニング方法によって、組込み（ｉｎｔｅ
ｇｒａｔｉｏｎ）／組換え反応に参加するＤＮＡ分子における認識配列である。
組換え部位は、組込みまたは組換えの開始段階の間に部位特異的組換えタンパク
質によって認識され、そして結合される、この参加する核酸分子におけるＤＮＡ
の個々の部分またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについて
の組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リ
コンビナーゼ結合部位として働く）から構成される３４塩基対配列であるｌｏｘ
Ｐである。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２
１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例としては、本明
細書中に記載される、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔ
ｔＲ配列、ならびにその変異体、フラグメント、改変体および誘導体が挙げられ
、これらは、組換えタンパク質λ Ｉｎｔによって、および補助タンパク質組込
み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよびエキシジョナーゼ（Ｘｉｓ）によって認識
される。Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０
７（１９９３）を参照のこと。

【００５３】 組換えクローニングは、本明細書中に記載される方法であり、これによって、
核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまたはインビ
ボで、交換され、挿入され、戻され（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換されまたは改変さ
れる。本明細書中における「インビトロ」および「インビボ」によって、それぞ
れ、宿主細胞の外（例えば、無細胞系）または宿主細胞の中（例えば、宿主細胞
によって発現される組換えタンパク質を使用して）で行われる組換えクローニン
グが意味される。

【００５４】 抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）カセットは、サブクローニングベクターに存在
するリプレッサーまたは選択マーカーを含む、核酸セグメントである。

【００５５】 選択マーカーは、あるものを、しばしば特定の条件下で、分子（例えば、レプ
リコン）またはその分子を含む細胞についてあるいはそれらに対して、選択を可
能にするＤＮＡセグメントである。これらのマーカーは、活性（例えば、限定さ
れないが、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生）をコードし得、または
ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物または無機組成物および有機化合物
または有機組成物などに対する結合部位を提供し得る。選択マーカーの実施例と
しては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）異なった毒性化合物
（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメン
ト；（２）レシピエント細胞においてその他の点で欠損している産物をコードす
るＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）
遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に
同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質、のような表現
型マーカー）；（５）細胞生存および／または機能に対して違ったふうに有害で
ある産物を結合するＤＮＡセグメント；（６）上記番号１〜５において記載され
るＤＮＡセグメントのいずれかの活性を、別のやり方で阻害するＤＮＡセグメン
ト（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する産物を
結合するＤＮＡセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望さ
れる分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント（例えば、
特定のタンパク質結合部位）；（９）他の非機能性（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌ）であり得る特定のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例え
ば、分子の部分母集団のＰＣＲ増幅について）；（１０）ＤＮＡセグメントであ
って、これが存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する耐
性または感受性を与えるＤＮＡセグメント；（１１）レシピエント細胞において
毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント；（１２）ＤＮＡセグメントを含
む核酸分子の複製、分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）または遺伝力（ｈｅｒｉｔａｂ
ｉｌｉｔｙ）を阻害するそのＤＮＡセグメント；および／または（１３）条件的
複製機能（例えば、特定の宿主または宿主細胞株における複製あるいは特定の環
境条件（例えば、温度、栄養条件など）下での複製）をコードするＤＮＡセグメ
ント。

【００５６】 選択スキームは、エントリークローン、またはベクター、目的ベクター、ドナ
ーベクター、発現クローンまたは発現ベクター、任意の中間体（例えば、共組込
み物またはレプリコン）、および／または副産物を含む混合物由来の所望された
産物の選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である。１つの好ましい
実施形態の選択スキームは、組換えクローニングの間に結合されるかまたは結合
されないいずれかの少なくとも２つの成分有する。１つの成分は、選択マーカー
である。他の成分は、選択マーカーのインビトロまたはインビボでの発現、ある
いは選択マーカーを運ぶプラスミドを保有する細胞（または核酸分子（例えば、
レプリコン））の生存を制御する。一般に、この制御エレメントは、選択マーカ
ーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現または活
性を制御する他の方法が使用され得る。リプレッサーが使用されるかまたはアク
チベーターが使用されるかは、マーカーが陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）選択につい
てかまたは陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）選択についてか、および種々のＤＮＡセグ
メントの正確な配置に依存し、それは当業者に容易に明らかである。好ましい要
求は、この選択スキームが、１つ以上の所望の産物のみの選択またはこれらのみ
についての富化を生じることである。本明細書中で定義されるように、ＤＮＡ分
子について選択する工程は、（ａ）所望されるＤＮＡ分子の存在について選択す
るかまたは富化する工程、および（ｂ）所望されるＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子
の存在に対して選択するかまたは富化する工程を包含する。

【００５７】 １つの実施形態において、選択スキーム（これは逆に行われ得る）は、３つの
形態のうちの１つをとり、これらは、図１よって議論される。第１は、選択マー
カーおよびリプレッサーと共に本明細書中で例示され、従って、セグメントＤを
有し、そしてセグメントＣを欠く分子に対して選択する。第２は、セグメントＣ
を有する分子に対して、およびセグメントＤを有する分子について選択する。第
２の形態の可能な実施形態は、インビトロの反応産物が導入されるべき細胞に毒
性遺伝子（ｇｅｎｅ ｔｏｘｉｃ）を運ぶＤＮＡセグメントを有する。毒性遺伝
子は、毒性（ｔｏｘｉｃ）遺伝子産物（毒性タンパク質または毒性ＲＮＡ）とし
て発現されるＤＮＡであり得るか、またはそれ自体毒性であり得、そして自然に
（ｏｆ ｉｔｓｅｌｆ）毒性であり得る（後者の場合、毒性遺伝子は、「遺伝特
性（ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｔｒａｉｔ）」のその古典的な定義を持つことが理解
される）。

【００５８】 このような毒性遺伝子産物の例は、当該分野で周知であり、そして以下を含む
が、これらに限定されない：制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）、ア
ポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１またはｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミ
リーのメンバー）、ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）の遺伝子を含むレトロウイ
ルス遺伝子、ＮＰ−１のようなディフェンシン、転換された反復ＤＮＡ配列また
は対向パリンドロームＤＮＡ配列、ΦＸ１７４またはバクテリアファージＴ４由
来の遺伝子のようなバクテリアファージリーシス遺伝子；ｒｐｓＬのような抗生
物質感受性遺伝子、ｐｈｅＳのような抗菌感受性遺伝子、プラスミドキラー遺伝
子、細菌に対して遺伝子産物の毒性を産生する真核生物転写ベクター遺伝子（例
えば、ＧＡＴＡ−１）および抑制機能の非存在下において、宿主を死滅させる遺
伝子（例えば、ｋｉｃＢ、ｃｃｄＢ、ΦＸ１７４Ｅ）（Ｌｉｕ，Ｑら、Ｃｕｒｒ
．Ｂｉｏｌ．８：１３００〜１３０９（１９９８））、ならびにレプリコン安定
性および／または複製に消極的に影響を及ぼす他の遺伝子。あるいは、毒性遺伝
子は、インビボで選択され得る（例えば、制限部位）。

【００５９】 誘導プロモーターに作動可能に結合される制限エンドヌクレアーゼについての
多くの遺伝子コードは、公知であり、そして本発明において使用され得る。例え
ば、米国特許第４，９６０，７０７号（ＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ）；同第５，
０００，３３３号、同第５，０８２，７８４号および同第５，１９２，６７５号
（ＫｐｎＩ）；同第５，４７，８００号（ＮｇｏＡＩＩＩおよびＮｇｏＡＩ）；
同第５，１７９，０１５号（ＦｓｐＩおよびＨａｅＩＩＩ）：同第５，２００，
３３３号（ＨａｅＩＩおよびＴａｑＩ）；同第５，２４８，６０５号（ＨｐａＩ
Ｉ）；同第５，３１２，７４６号（ＣｌａＩ）；同第５，２３１，０２１号およ
び同第５，３０４，４８０号（ＸｈｏＩおよびＸｈｏＩＩ）；同第５，３３４，
５２６号（ＡｌｕＩ）；同第５，４７０，７４０号（ＮｓｉＩ）；同第５，５３
４，４２８号（ＳｓｔＩ／ＳａｃＩ）；同第５，２０２，２４８号（ＮｃｏＩ）
；同第５，１３９，９４２号（ＮｄｅＩ）および同第５，０９８，８３９号（Ｐ
ａｃＩ）を参照のこと。Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９：２５３９〜２５６６(１９９１);およびＬｕｎｎｅｎ，Ｋ．Ｄ．ら、
Ｇｅｎｅ ７４：２５〜３２（１９８８）も参照のこと。

【００６０】 第２の形態において、セグメントＤは、選択可（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マー
カーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｏｎｏｒ）、
共挿入（Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）、および副産物（Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ）分子
を有する形質転換を排除するが、一方で選択マーカーは、この産物（Ｐｒｏｄｕ
ｃｔ）を含む細胞について、そして挿入ドナー（Ｉｎｓｅｒｔ Ｄｏｎｅｒ）の
みを有する細胞に対して、選択するために使用され得る。

【００６１】 第３の形態は、同一分子においてシスであるセグメントＡおよびＤの両方を有
する細胞を選択するが、異種分子においてトランスであるセグメントの両方を有
する細胞を選択しない。このことは、２つの不活性フラグメント（これらは各々
、セグメントＡおよびＤ上にある）に分裂される選択マーカーによって実施され
得る。

【００６２】 フラグメントは、組換え部位に比較して配置され、セグメントが組換え事象に
よって一緒にもたらされる場合、それらは、機能性選択マーカーを再構成する。
例えば、組換え事象は、プロモーターを構造核酸分子（例えば、遺伝子）と結合
させ得、構造核酸分子の２つのフラグメントを結合させ得るか、または生存に必
要なへテロ二量体遺伝子産物をコードする核酸分子を結合させ得るか、あるいは
レプリコンの部分を結合させ得る。

【００６３】 部位特異的リコンビナーゼ：は、少なくとも以下の４つの成分（ａｃｔｉｖｅ
ｓ）（またはそれらの組合せ）を代表的に有する型のリコンビナーゼである：（
１）１つまたは２つの特異的核酸配列の認識；（２）この配列（単数または複数
）の切断；（３）鎖交換に関するトポイソメラーゼ活性；および（４）切断され
た核酸の鎖を再び封じるリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ
ｉｎｉｏｉｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１〜５２７（１
９９４）を参照のこと。保存的な部位特異的組換えは、パートナー両方について
の高い配列特異性によって、相同性組換えと転移とを区別する。この鎖交換機構
は、ＤＮＡ合成の非存在下で特異的ＤＮＡ配列の切断および再結合を含む（Ｌａ
ｎｄｙ，Ａ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３〜９４
９）。

【００６４】 サブクローニングベクター：は、好ましくは適切なレプリコンを含む環状また
は直鎖状の核酸分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブ
クローニングベクター（図１中のセグメントＤ）はまた、クローン化ＤＮＡ挿入
物（図１中のセグメントＡ）に作用するか、またはこれと共に作用する最終産物
に組み込まれることが望ましい機能エレメントおよび／または制御エレメントを
含み得る。このサブクローニングベクターはまた、選択マーカー（好ましくはＤ
ＮＡ）を含み得る。

【００６５】 ベクター：は、挿入に対して有用な生物学的特性または生化学的特性を提供す
る核酸分子（好ましくはＤＮＡ）である。例としては、プラスミド、ファージ、
自動で繰り返す配列（ＡＲＳ）る配列、動原体およびインビトロまたは宿主にお
いて繰り返し得るか、または繰り返され得る配列、あるいは宿主細胞内で所望の
位置に所望の核酸セグメントを伝達し得る他の配列が挙げられ得る。ベクターは
、１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得、ここで、この配列は、ベ
クターの基本的な生物学的機能の欠失を伴なわない決定様式で切断され得、そし
てこの核酸フラグメントに、その複製およびクローニングをもたらすためにスプ
ライスされ得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣＲのための）、転
写開始部位および／または翻訳開始部位ならびに／あるいは調節部位、組換えシ
グナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同性
組換え、転移または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントの挿
入の方法（例えば、ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，
３３４，５７５号（本明細書中で全体が参考として援用される））、Ｔ：Ａクロ
ーニングなどを含むが、これらに限定されない）はまた、本発明に従って使用さ
れ得るクローニングベクターにフラグメントをクローニングするために適用され
得る。このクローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換さ
れる細胞を同定する際の使用に適切な１以上の選択マーカーを含み得る。

【００６６】 ベクタードナー：は、本発明の２つの親の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ）の１つである。この核酸分子は、所望の産物の一部となるＤＮＡベクター
を含むＤＮＡセグメントを有する。このベクタードナーは、サブクローニングベ
クターＤ（または、それは、挿入ベクターが既にクローニングベクター（例えば
、ＰＣＲについて、ａｔｔＢ部位を含むフラグメント；以下参照のこと）を含ま
ない場合、クローニングベクターと呼ばれ得る）および組換え部位にに隣接する
セグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、
選択スキームについて上記されるように、所望の産物の娘分子についての選択に
寄与するエレメントを含み得る。組換えシグナルは、同一であり得るか、または
異なり得、そして同じか、または異なるリコンビナーゼによって作用され得る。
さらに、ベクタードナーは、線状または環状であり得る。このようなベクタード
ナー分子の例としては、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベク
ターが挙げられ、図２１〜４７および９０〜９６中に示されるこれらの目的ベク
ターを含むが、これらに限定されない。

【００６７】 プライマー：は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の増幅または重合化の間、
ヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖ヌクレオチドまたは
二本鎖ヌクレオチドをいう。好ましい局面において、プライマーは、１以上の組
換え部位またはこのような組換え部位の一部を含む。組換え部位の一部は、目的
の組換え部位の、少なくとも２つの塩基（すなわち、塩基対「ｂｐ」と本明細書
中で省略される）、少なくとも５〜２００塩基、少なくとも１０〜１００塩基、
少なくとも１５〜７５塩基、少なくとも１５〜５０塩基、少なくとも１５〜２５
塩基、または少なくとも１６〜２５塩基を含み、以下および実施例において、さ
らに詳細に記載される。組換え部位の一部を使用する場合、組換え部位の欠損部
分は、新規に合成された核酸分子によるテンプレートとして提供され得る。この
ような組換え部位は、このプライマーの１つの末端または両末端内におよび／ま
たはそこにおいて配置され得る。好ましくは、さらなる配列は、組換えを増強ま
たは改良し、ならびに／あるいは組換えの間組換え部位を安定化するための組換
え部位（単数または複数）に隣接するプライマーに添加される。このような安定
化配列は、任意長の任意の配列（好ましくは、Ｇ／Ｃに富む配列）であり得る。
好ましくは、このような配列は、１〜約１０００塩基、１〜約５００塩基ならび
に１〜約１００塩基、１〜約６０塩基、１〜約２５塩基、１〜約１０塩基、２〜
約１０塩基および好ましくは約４塩基のサイズの範囲である。好ましくは、この
ような配列は、１塩基長より長く、そして好ましくは２塩基長より長い。

【００６８】 テンプレート：は、増幅、合成または配列決定される二本鎖核酸分子または一
本鎖核酸分子をいう。二本鎖分子の場合、第１および第２の鎖を形成するための
その鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が、増幅、合成、または配列決定さ
れるか、またはこの二本鎖分子が、テンプレートとして直接的に使用され得る前
に、実行される。一本鎖テンプレートについて、このテンプレートの一部に相補
的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼ
活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／また
は逆転写酵素）は、このテンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子を合
成し得る。あるいは、二本鎖テンプレートについて、１以上のプロモーターは、
このテンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製するための１以上
のポリメラーゼと組合せて使用され得る。本発明に従って、新規に合成された分
子は、元のテンプレート長と等しいかまたはこれより短くあり得る。さらに、核
酸テンプレートの集団は、合成または増幅の間使用され、元のテンプレート集団
の代表的な核酸分子の集団を産生し得る。

【００６９】 アダプター：は、オリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントもしくは１以上
の組換え部位（またはこのような組換え部位の部分）を含むセグメント（好まし
くはＤＮＡ）である。本発明に従って、これは、本明細書中で記載される環状ま
たは直線状挿入ドナー分子ならびに他の核酸分子に添加され得る。組換え部位の
一部を使用する場合、欠損部位は、挿入ドナー分子によって提供され得る。この
ようなアダプターは、環状または直線状分子内の任意の位置で添加され得るが、
このアダプターは、好ましくは、直線状分子の末端の１つまたは両末端において
またはその付近で、添加され得る。好ましくは、アダプターは、目的の特定の核
酸分子に（隣接する）両方の部位で位置づけられるように配置される。本発明に
従って、アダプターは、標準的組換え技術（例えば、制限的消化および連合）に
よって目的の核酸分子に添加され得る。例えば、アダプターは、適切な制限酵素
での第１の分子の消化によって環状分子に添加され得、切断部位でアダプターを
添加し、そして切断部位でアダプターを含む環状分子を再形成する。他の局面に
おいて、アダプターは、ＲＮＡ分子などの組込みによる、相同性組換えによって
添加され得る。あるいは、アダプターは、直線状分子の１以上の末端および好ま
しくはこの両方の末端に直接的に連合され得、それにより、１つの末端または両
方の末端でアダプターを有する直線分子（単数または複数）を生じる。本発明の
１つの局面において、アダプターは、直線状分子の集団（例えば、切断または消
化されているｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡ）に添加され、この集団
の全てまたは実質的部分の１つの末端および好ましくは両方の末端でアダプター
を含む直線状分子の集団を形成し得る。

【００７０】 アダプター−プライマー：は、１以上の組換え部位（またはこのような組換え
部位の一部）を含むプライマー分子であり、本発明に従って、本明細書中に記載
される環状または直線状の核酸分子に添加され得る。組替え部位の一部を使用す
る場合、欠損部位は、本発明の核酸分子（例えば、アダプター）によって提供さ
れ得る。このようなアダプター−プライマーは、環状または直線状分子内の任意
の位置で添加され得るが、このアダプター−プライマーは、好ましくは直線状分
子の１つの末端または両方の末端においてもしくはこの付近で添加され得る。本
発明の方法に従うこのようなアダプター−プライマーおよびその使用の例は、本
明細書中の実施例２５中に示される。このようなアダプター−プライマーは、種
々の状況において、かつ種々の技術（増幅（例えば、ＰＣＲ）、結合（例えば、
酵素的結合または化学的／合成的結合）、組換え（例えば、相同組換えまたは非
相同（非正統的）組換え）などを含むが、これらに限定されない）によって、環
状または直線状核酸分子に１以上の組換え部位またはその一部を添加するために
使用され得る。

【００７１】 ライブラリー：とは、核酸分子（環状または直線状）の収集をいう。１つの実
施形態において、ライブラリーは、複数の（すなわち、２つ以上の）ＤＮＡ分子
を含み得、これは、共通のソース（ｓｏｕｒｃｅ）生物体、ソース器官、ソース
組織またはソース細胞由来であってもなくてもよい。別の実施形態において、ラ
イブラリーは、生物体（「ゲノム」ライブライリー）のＤＮＡ含量のすべてまた
は一部もしくは有意な部分の代表であるか、または細胞、組織、器官または生物
体における発現された核酸分子（ｃＤＮＡライブラリー）のすべてまたは一部も
しくは有意な部分の核酸分子の代表のセットである。ライブラリーはまた、新規
な合成により作製されたランダム配列、１以上の配列の変異誘発などを含み得る
。このようなライブラリーは、１以上のベクターにおいて含まれても含まれなく
てもよい。

【００７２】 増幅：とは、ポリメラーゼを使用することでヌクレオチド配列の多くのコピー
を増大させるための任意のインビトロの方法をいう。核酸増幅は、ＤＮＡ分子お
よび／またはＲＮＡ分子、あるいはプライマーへのヌクレオチドの取り込みを生
じ、それによってテンプレートに相補的な新規の分子を形成する。形成された核
酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレ
ートとして使用され得る。本明細書中で使用される場合、１つの増幅反応は、多
数回の複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１つのＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の５〜１００「
サイクル」の変性および合成からなり得る。

【００７３】 オリゴヌクレオチド：とは、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリ
ボースの３’部分と隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの
５’部分との間でリン酸ジエステル結合によって結合される共有結合性のヌクレ
オチド配列を含む合成的分子または天然分子をいう。この用語は、この用語が特
異的にいう核酸分子の任意の特異的な長さを必要に示すこれらの用語のいずれか
を伴なわずに、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」と共に本明細書中
で交換可能に使用され得る。

【００７４】 ヌクレオチド：とは、塩基−糖−リン酸エステル結合をいう。ヌクレオチドは
、核酸分子の（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位である。用語ヌクレオチド
は、リボヌクレオシド三リン酸エステルＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよび
デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、
ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体）を含む。このような誘導体
としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ
−ｄＡＴＰが挙げられる。用語ヌクレオチドとはまた、本明細書中で使用される
場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステル（ｄｄＮＴＰ）およびその
誘導体をもいう。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステルの例示の例は、
ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含むが
、これらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、周知の技術に
よって非標識され得るかまたは検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、例
えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を
含む。

【００７５】 ハイブリダイゼーション：用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリ
ダイズする」とは、二本鎖分子を産生する２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＤＮ
Ａおよび／またはＲＮＡ）の塩基対をいう。本明細書中で使用される場合、２つ
の核酸分子は、ハイブリダイズされ得るが、この塩基対は、完全に相補的ではな
い。従って、ミスマッチ塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用される場合
、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。幾つかの局面において
、ハイブリダイゼーションは、「ストリンジェントな条件」下であるといわれる
。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件」に関しては、以下
：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン
酸トリナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌの変性、剪断サ
ケ精子ＤＮＡ、を含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション、続
いて約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を意味する。

【００７６】 本明細書中で使用される組換えＤＮＡ技術ならびに分子生物学および細胞生物
学の分野において使用される他の用語は、一般的に適用可能な分野の当業者に理
解される。

【００７７】 （概要） ２つの反応は、図１中に一般的に示される、本明細書中で「ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」としていわれる、本発明の組換えクローニング
系を構成する。これらの反応の第１であるＬＲ反応（図２）（本明細書中で目的
反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）としても交換可能にいわれ
得る）は、この系の主な経路である。ＬＲ反応は、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）ベ
クターまたはクローンと目的ベクターとの間の、本明細書中で記載されるＧＡＴ
ＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘのような組換えタ
ンパク質のカクテルによって媒介される、組換え反応である。この反応は、発現
クローンを産生するために、目的の核酸分子（これは、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡライブラリーまたはそのフラグメントであり得る）をエントリークローンか
ら発現ベクターへと転移する。

【００７８】 Ｌ、Ｒ、ＢおよびＰを標識された部位は、バクテリオファージλ組換えタンパ
ク質について、それぞれａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ組換え部
位である。バクテリオファージλ組換えタンパク質は、Ｃｌｏｎａｓｅカクテル
（本明細書中では多様に、「Ｃｌｏｎａｓｅ」または「ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＬＲ
Ｃｌｏｎａｓｅ^TMＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ」（本明細書中で記載されるように、ａ
ｔｔＢ×ａｔｔＰ組換え反応を媒介する組換えタンパク質混合物のため）として
言及される）を構成する。この組換えクローニング反応は、関連する、高度に特
異的な切断反応および結合反応に等価である。このような観点により、組換えタ
ンパク質は、エントリークローンにおける目的の核酸分子の左および右に対して
切断し、そして目的ベクターにこれを結合させ、新規な発現クローンを産生する
。

【００７９】 発現クローンにおける目的の核酸分子は、小さなａｔｔＢ１部位およびａｔｔ
Ｂ２部位によって隣接される。目的の核酸分子の配向およびリーディングフレー
ムは、サブクローニングを通して維持される。なぜなら、ａｔｔＬ１は、ａｔｔ
Ｒ１のみと反応し、そしてａｔｔＬ２は、ａｔｔＲ２とのみ反応するためである
。同様に、ａｔｔＢ１は、ａｔｔＰ１とのみ反応し、そしてａｔｔＢ２は、ａｔ
ｔＲ２とのみ反応する。従って、本発明はまた、特異的に変更または増強され得
る、（その改変体、フラグメント、変異体、および誘導体を含む）本発明の組換
え部位（またはその一部）を使用する、制御されたクローニングまたは方向性ク
ローニングの方法に関する。本発明はまた、任意の数の組換え部位パートナーま
たは組合せにより一般的に関する（ここで、各組換え部位は、その対応する組換
え部位に特異的でかつこれと相互作用する）。このような組換え部位は、好まし
くは、組換え部位を変異または改変することにより作製され、任意の数の必要な
特異性（例えば、ａｔｔＢ１−１０、ａｔｔＰ１−１０、ａｔｔＬ１−１０、ａ
ｔｔＲ１−１０など）を提供し、これらの非限定の例は、本明細書中の実施例に
詳細に記載される。

【００８０】 組換え反応物からのアリコートが、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）へ形質
転換され、そして適切な選択剤（例えば、メチシリンを含むか含まない、アンピ
シリンのような抗生物質）を含むプレート上に展開する場合、細胞は、コロニー
から所望のクローンを取り込む。未反応の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏ
ｎ Ｖｅｃｔｏｒ）は、アンピシリン耐性遺伝子を保有するが、アンピシリン耐
性コロニーを与えない。なぜならば、毒性遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）を含むか
らである。従って、アンピシリン耐性についての選択は、所望の産物を有するＥ
．ｃｏｌｉ細胞を選択し、通常、アンピシリンプレート上の９０％を超えるコロ
ニーを含む。

【００８１】 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ（または「ＧＡＴＥＷＡＹ^TM」）クローニン
グ反応（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関連して、目的の核酸分子は、
始めにエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）中にクローン化され、
エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）を作成する。複数の選択肢が、
エントリークローンを作成するために利用可能である。この選択肢としては、エ
ントリーベクターへの末端ａｔｔＢ組換え部位を有するＰＣＲ配列のクローン化
；ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ組換え反応の使用；エント
リーベクターへの組換えによるＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍベクターにおいて調製されたライブラリー由来の遺伝子の移入；ならびに標準
の組換えＤＮＡ方法による、制限酵素により生成したフラグメントおよびＰＣＲ
フラグメントのエントリーベクターへのクローン化が挙げられる。これらの試み
は、本明細書中でさらに詳細に議論される。

【００８２】 ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの重要な利点は、目的の核
酸分子（または、目的の核酸分子の集団でさえも）、およそ、約３０秒〜６０分
間（好ましくは、約１〜６０分、約１〜４５分、約１〜３０分、約２〜６０分、
約２〜４５分、約２〜３０分、約１〜２分、約３０〜６０分、約４５〜６０分、
または約３０〜４５分）の単純な反応で１つ以上の目的ベクター中に並行してサ
ブクローン化され得るエントリークローンとして存在することである。特に、本
明細書中の実施例に記載されるように、より大きな核酸分子が使用される場合、
より長い反応時間（例えば、２〜２４時間または一晩）は、組換え効率を増加し
得る。さらに、所望の発現クローンを保有する高い割合のコロニーが得られる。
このプロセスは、図３に概略的に図示され、これは、目的の分子が、複数の目的
ベクターに同時にまたは別々に移され得る、本発明の利点を示す。ＬＥ反応（Ｌ
Ｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、組み換えられる核酸分子の１つまたは両方は
、任意の位相幾何（例えば、直線状、緩んだ環状、ニックの環状、高次コイル状
など）を有し得るが、１つまたは両方は、好ましくは直線状である。

【００８３】 ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの第２の主要な経路は、Ｂ
Ｐ反応（ＢＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（図４）である。これはまた、エントリー反
応（Ｅｎｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）またはゲートウォード反応（Ｇａｔｅｗａ
ｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として本明細書中で交換可能にいわれる。このＢＰ反
応は、ドナープラスミド（Ｄｏｎｏｒ Ｐｌａｓｍｉｄ）と発現クローン（Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）（図２における副生物の対応物）を組み換え得
る。この反応は、エントリーベクターへ、発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｃｌｏｎｅ）中の目的の核酸分子（これは、直線状、コイル状、高次コイル状
などの種々の位相幾何のいずれかを有する）を移入し、新たなエントリークロー
ンを生成する。一旦、この目的の核酸分子がエントリーベクターへクローン化さ
れると、これは、上記のようにＬＥ反応（ＬＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を介して新
しい発現ベクターの移入され得る。ＢＰ反応において、組み換えられる核酸分子
の１つまたは両方は、任意の位相幾何（例えば、直線状、緩んだ環状、ニックの
環状、高次コイル状など）を有し得が、１つまたは両方は、好ましくは直線状で
ある。

【００８４】 ＢＰ反応の有用なバリエーションは、増幅（例えば、ＰＣＲ）の産物の迅速な
クローニングおよび発現または核酸合成を可能にする。末端の２５ｂｐのａｔｔ
Ｂ部位を含むプライマーを用いて合成された増幅（例えば、ＰＣＲ）の産物は、
ゲートウォードクローニング反応のための効率的な基質として機能する。このよ
うな増幅産物は、ドナーベクターと組み換えられ、エントリークローンを作成し
得る（図７を参照のこと）。この結果は、増幅フラグメントを含むエントリーク
ローンである。次いで、このようなエントリークローンは、（ＬＥ反応を介して
）目的ベクターと組み換えられ得、ＰＣＲ産物の発現クローンを得る。

【００８５】 ＬＲ反応のさらなる詳細が、図５Ａに示される。この反応を媒介するＧＡＴＥ
ＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素混合物（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）は、λ
組換えタンパク質である、Ｉｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）、Ｘｉｓ（Ｅｘｃｉｓ
ｉｏｎａｓｅ）およびＩＨＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｔ Ｆａｃｔｏ
ｒ）含む。対照的に、ＢＰ反応（図５Ｂ）を媒介するＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ
Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素混合物は、ＩｎｔおよびＩＨＦのみを含む。

【００８６】 各ベクターの組換え（ａｔｔ）部位は、親ベクターにより与えられる、２つの
異なるセグメントを含む。図５Ａおよび図５Ｂに記載される、各ａｔｔ部位の２
つの部分を分割している千鳥模様のラインは、組換え反応中にＩｎｔにより生成
される７塩基段差切断を示す。この構造は、図６においてより詳細に示され、こ
れは、エントリークローンのａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位と目的ベクターの
ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２との間の組換えにより生成される、発現クローンの
ａｔｔＢ組換え配列を示す。

【００８７】 発現クローン中の目的の核酸分子は、ａｔｔＢ部位に隣接し：ａｔｔＢ１は、
左（アミノ末端）に対応し、そしてａｔｔＢ２は、右（カルボキシ末端）に対応
する。Ｉｎｔにより生成される７塩基段差切断の左へのａｔｔＢ１中の塩基は、
目的ベクターに由来し、そして段差切断の右への塩基は、エントリーベクターに
由来する（図６を参照のこと）。この配列が、オープンリーディングフレームに
対応して３通りで示されることに注意。エントリーベクターにクローン化される
目的の核酸分子のリーディングフレームがａｔｔＢ１について示されるレーディ
ングフレームと位相が一致する場合、アミノ末端タンパク質融合物は、目的の核
酸分子とアミノ末端融合ドメインをコードするＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍ 目的ベクターとの間で作成され得る。３つ全てのリーディン
グフレームにおいてクローン化され得るエントリーベクターおよび目的ベクター
は、本明細書中で（特に、実施例において）より詳細に記載される。

【００８８】 このＬＲ反応は、種々の目的ベクターとエントリークローンを組換えることに
より、新たな発現ベクターに目的の所望の核酸分子の移入を可能にする。しかし
、ＬＲ反応または目的反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関
連して、目的の核酸分子は、好ましくは、始めにエントリークローンに変換され
る。エントリークローンは、図７に示されるように、いくつかの方法で作成され
得る。

【００８９】 １つの試みは、制限酵素およびリガーゼを用いて、標準の組換えＤＮＡ方法を
使用して、１つ以上のエントリーベクターに目的の核酸分子をクローン化するこ
とである。開始ＤＮＡフラグメントは、制限酵素消化によるかまたはＰＣＲ産物
として生成され得る。このフラグメントは、エントリーベクター中のａｔｔＬ１
とａｔｔＬ２組換え部位との間にクローン化される。不完全に消化されたエント
リーベクター由来のバックグラウンドコロニーを最小にするために提供される、
毒性または「死（ｄｅａｔｈ）」遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）は、排除され、そ
して目的の核酸分子により置換されるべきであることに注意。

【００９０】 エントリークローンを作成するための第２の試み（図７）は、本明細書中に詳
細に記載されるように、エントリーベクターにおいて（ゲノムまたはｃＤＮＡの
）ライブラリーを作成することである。次いで、このようなライブラリーは、例
えば、酵母細胞または哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞における、発現スク
リーニングのために、目的ベクターへ移入され得る。

【００９１】 エントリークローンを作成するための第３の試み（図７）は、発現ベクター（
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）において調製されるｃＤＮＡ分子または
ライブラリーから得られる発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）
を使用することである。ａｔｔＢ部位に隣接するこのようなｃＤＮＡまたはライ
ブラリーは、ＢＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎを介して、Ｄｏｎｏｒ Ｖｅｃｔｏｒと組
み換えられることにより、エントリーベクターへ導入され得る。所望ならば、全
体の発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）ライブラリーは、ＢＰ
Ｒｅａｃｔｉｏｎを介してエントリーベクターへ移入され得る。発現クローン
（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）ｃＤＮＡライブラリーはまた、本明細書
中で（特に、以下の実施例において）より詳細に記載されるように、種々の原核
および真核のＧＡＴＥＷＡＹ^TM媒介ベクター（例えば、ｐＥＸＰ５０１発現ベク
ター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）（図４８を参照のこと）、および
２−ハイブリッドおよびａｔｔＢライブラリーベクター）において構築され得る
。

【００９２】 エントリークローンを作成するための第４の（かつ潜在的に最も汎用性の）試
み（図７）は、増幅（例えば、ＰＣＲ）フラグメントクローニングによりエント
リーベクターへ目的の核酸分子についての配列を導入することである。この方法
は、図８に図示される。ＤＮＡ配列は、ａｔｔＢヌクレオチド配列（例えば、図
９に示される配列であるが、これらに限定されない）の１以上のｂｐ、２以上の
ｂｐ、３以上のｂｐ、４以上のｂｐ、５以上のｂｐ、好ましくは６以上のｂｐ、
より好ましくは６〜２５ｂｐ（特に１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｂｐ）を含むプライマー、な
らびに必要に応じて、１以上、２以上、３以上、４以上および最も好ましくは４
もしくは５以上のさらなる末端ヌクレオチド塩基（好ましくはグアニンである）
を使用して、以下および本明細書中の実施例において詳細に概説されるように、
（例えば、ＰＣＲを用いて）始めに増幅される。次いで、このＰＣＲ産物は、ａ
ｔｔＢ−ＰＣＲ産物が１以上のａｔｔＰ部位を含むドナーベクターと組み換えら
れるＢＰ反応を行うことによりエントリークローンに変換され得る。ＰＣＲフラ
グメントサブクローニングのためのこの試みおよびプロトコールの詳細は、実施
例８および２１〜２５に提供される。

【００９３】 種々のエントリークローンは、これらの方法により作成され得、クローニング
の選択肢の広範のアレイを提供し；多くの特定のエントリーベクターはまた、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）か
ら市販される。本明細書中の実施例は、選択されたエントリーベクターおよびこ
れらのクローニング部位の詳細のより徹底的な記載を提供する。特定の増幅のた
めに最終的なエントリーベクターを選択することは、実施例４で議論される。

【００９４】 エントリーベクターおよびＤｉｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒは、目的の
核酸分子のアミノ末端領域（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡライブラリーもくしは挿
入物、またはそれらのフラグメント）が、ａｔｔＬ１部位の次に位置するように
構築されるべきである。エントリーベクターは、好ましくは、ａｔｔＬ１部位の
上流のｒｒｎＢ転写ターミネーターを含む。この配列は、目的のクローン化され
た核酸分子の発現をＥ．ｃｏｌｉにおいて信頼されるように「オフ」にすること
を保証し、その結果、毒性遺伝子でさえも首尾よくクローン化し得る。従って、
エントリークローンは、転写的にサイレントであるように設計され得る。また、
エントリーベクター（およびこれによりエントリークローン）は、カナマイシン
抗生物質耐性（ｋａｎ^r）遺伝子を含み、形質転換後のエントリークローンを含
む宿主細胞の選択を容易にし得る。しかし、特定の適用においては、エントリー
クローンは、他の選択マーカーを含み得、これには、ゲンタマイシン耐性（ｇｅ
ｎ^r）遺伝子、またはテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ^r）が挙げられるが、
これらに限定ず、形質転換後のエントリークローンを含む宿主細胞の選択を容易
にする。

【００９５】 一旦、目的の核酸分子をエントリーベクターへクローン化すると、それは、目
的ベクターへ移され得る。図５Ａの上部右部分は、目的ベクターの概略図を示す
。この厚い矢印は、いくつかの機能を示す（通常、転写または翻訳）。これは、
このクローン中の目的の核酸分子に作用する。組換え反応中に、毒性または「死
」遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）を含む、ａｔｔＲ１とａｔｔｒ２との間の領域は
、ＤＮＡセグメントによりエントリークローンから置換される。アンピシリン耐
性（ａｍｐ^r）遺伝子（目的ベクター上に保有される）を必要とし、そしてまた
、死遺伝子を欠失した、組換え産物についての選択は、高い割合（大抵９０％を
超える）のコロニーが、正確な挿入物を含むことを保証する。

【００９６】 目的の核酸分子を目的ベクターへ移すために、その目的ベクターは、目的の所
望の核酸分子を含むエントリークローンと混合され、組換えタンパク質の反応混
合液（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍ
ｉｘ）が添加され、この混合物をインキュベート（好ましくは、以下に記載され
るように、例えば、大きな核酸分子の移入のために、特定の環境下で約６０分間
またはそれ以上、約２５℃にて）し、そして任意の標準の宿主細胞（例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉのような細菌細胞；昆虫細胞、哺乳動物細胞、線虫細胞などのような
動物細胞；植物細胞；および酵母細胞が挙げられる）株は、この反応混合物で形
質転換される。使用される宿主細胞は、所望の選択により決定される（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．か
ら市販される）は、ｃｃｄＢ死遺伝子を含むクローンの生存を可能にし、従って
、融合体分子を選択するために使用され得る。すなわち、分子は、エントリーク
ローンと目的ベクターとの間をハイブリッドする）。以下の実施例は、目的の核
酸分子および発現ＲＮＡの移入ならびに種々の宿主におけるそれらの核酸分子に
よりコードされるポリペプチドの発現におけるエントリーベクターおよび目的ベ
クターの使用のための、さらなる詳細およびプロトコルを提供する。

【００９７】 従って、本発明のクローニング系は、複数の利点を提供する： ・一旦、目的の核酸分子がＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍへ
クローン化されると、それは、リーディングフレームおよび配向に完全に忠実に
他のベクターの内外へ移され得る。すなわち、反応の進行によりエントリークロ
ーン中のａｔｔＬ１が、目的ベクター上のａｔｔＲ１と組み換えられるので、目
的の核酸分子の方向性は、維持されるかまたは、エントリークローン目的ベクタ
ーへから移入される際に制御され得る。それ故、このＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、目的の核酸分子の方向的クローニングの効果的かつ
簡便な方法を提供する。 ・一段階のクローニングまたはサブクローニング：Ｃｌｏｎａｓｅとエントリー
クローンおよび目的ベクターとを混合し、インキュベートし、そして形質転換す
る。 ・ａｔｔＢ部位をＰＣＲプライマーに付加することにより、インビトロ組換えに
より容易にＰＣＲ産物をクローン化する。次いで、これらのエントリークローン
を目的ベクターに直接移入する。このプロセスはまた、１工程で実施され得る（
以下の実施例を参照のこと）。 ・効果的な選択は、高い信頼度を与える：９０％以上（そして、しばしば９９％
以上）のコロニーは、その新たなベクター中の所望のＤＮＡを含む。 ・ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍベクターへの現存の標準ベ
クターの１工程転換。 ・ラージベクターまたはいくつかのクローニング部位を有するラージベクターに
同一である。 ・組換え部位が短く（２５ｂｐ）、そして終止コドンまたは第二の構造を含まな
いように操作され得る。 ・反応は、高処理能力適用（例えば、診断目的のためかまたは治療的候補物スク
リーニングのために）のために自動化され得る。 ・この反応は、経済的であり：０．３μｇの各ＤＮＡを使用し；制限酵素、ホス
ファターゼ、リガーゼまたはゲル精製を使用しない。反応は、ミニプレップＤＮ
Ａを使用して良好に進行する。 ・１回の実験で、１つ以上の目的ベクターへ、多重クローンを（およびライブラ
リーでさえも）移入する。 ・種々の目的ベクターが、生成され得、適用としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない： ・Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現：ネイティブなタンパク質；精製のた
めの、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６、チオレドキシンなどを有する融合タンパク質、または
１つ以上のエピトープタグ；Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現の際に有用
な任意のプロモーター（例えば、ｐｔｒｃ、λＰ_LおよびＴ７プロモーター）が
使用され得る ・真核細胞におけるタンパク質発現：ＣＭＶプロモーター、バキュロウイルス
（Ｈｉｓ６タグを有するかまたは有さない）、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウ
イルス、Ｔｅｔ調節 ・ＤＮＡ配列決定（全てｌａｃプロモーター）、ＲＮＡプローブ、ファージミ
ド（両鎖） ・種々のエントリーベクター（標準の組換えＤＮＡ方法による組換え的クローニ
ングエントリーのために）が生成され得る： ・Ｅ．ｃｏｌｉに対する遺伝子毒性について、ちょうど上流の強力な転写終止 ・３つのリーディングフレーム ・ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するか有さない ・原核生物および／または真核生物の翻訳についてのモチーフ ・市販のｃＤＮＡライブラリーと互換性がある ・発現スクリーニングのための２−ｈｙｂｒｉｄライブラリーおよびファージデ
ィスプレイライブラリーを含む発現クローンｃＤＮＡ（ａｔｔＢ）ライブラリー
はまた、構築され得る。

【００９８】 （組換え部位の配列） １つの局面では、本発明は、核酸分子に関する。これは、単離された核酸分子
であってもよいしなくてもよく、１つ以上の組換え部位またはその部分をコード
する１つ以上のヌクレオチド配列を含む。特に、本発明のこの局面は、ａｔｔＢ
、ａｔｔＰ、ａｔｔＬもしくはａｔｔＲ、またはこれらの組換え部位の配列の部
分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むそのような核酸分子に関する
。本発明はまた、このような核酸分子の変異体、誘導体およびフラグメントに関
する。他に記載されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによ
り決定され得る全てのヌクレオチド配列は、手動または自動のＤＮＡ配列決定（
例えば、当業者（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４４−４４８（１９７５）；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（
１９７７））に慣用的である方法に従う、ジデオキシ配列決定）を使用して決定
された。本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの
全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の概念的な翻訳によ
り推定された。従って、これらの試みにより決定される任意のＤＮＡ配列につい
て、当該分野において公知であるように、本明細書中で決定されるヌクレオチド
配列は、いくつかのエラーを含み得る。このような方法により決定されるヌクレ
オチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、
代表的に少なくとも約９０％同一であり、より代表的には少なくとも約９５％〜
少なくとも約９９．９％同一である。当該分野でもまた公知であるように、実際
の配列と比較した決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は
、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、挿入または欠
失の点に存在する、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる推定アミノ
酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配とは
完全に異なる。

【００９９】 他に記載されない限り、本明細書中に記載される各「ヌクレオチド配列」は、
デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示
される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によ
り、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの配列）に
ついて、およびＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド（ここで特定のデオキシリボ
ヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌク
レオチドウリジン（Ｕ）により置換される）について、意図される。従って、本
発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子お
よびそれらの対応する相補ＤＮＡ鎖、相補ＲＮＡ鎖または相補ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖
の本発明の配列に関する。

【０１００】 第１のこのような局面において、本発明は、ａｔｔＢ１、またはその変異体、
フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列
を有する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示された配列を有
するａｔｔＢ１ヌクレオチド配列（例えば、ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡ
ＡＡＧＣＡＧＧＣＴ）、あるいはａｔｔＢ１について図９に示されたヌクレオチ
ド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体
、あるいはその誘導体を含み得る。しかし当業者は、以下のことを理解する。本
発明の核酸分子に含まれるａｔｔＢ１配列中の１以上の塩基の、特定の変異、挿
入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まない
で作製され得る；それ故、ａｔｔＢ１配列中のこのような変異、挿入、または欠
損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。

【０１０１】 関連した局面において、本発明は、ａｔｔＢ２、またはその変異体、フラグメ
ント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核
酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔ
Ｂ２ヌクレオチド配列（例えば、ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧ
ＴＧＧＴ）、あるいはａｔｔＢ２について図９に示されたヌクレオチド配列に相
補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは
誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含ま
れるａｔｔＢ２配列中の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これ
らの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故
ａｔｔＢ２中のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の
範囲内に含まれる。

【０１０２】 ａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位を含む核酸分子を含む組換え宿主細胞（
ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６としても公知である、ベクターｐＥＸＰ５０１；図４８を
参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６）は、１９９
９年２月２７日に、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０１０８としてＡｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲ
Ｌ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒ
ｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１０６０４ ＵＳＡの収集に寄託された。寄託され
た核酸分子内のａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位は、核酸カセットに含まれ
、その核酸カセットは以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列
に関連する。

【０１０３】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＰ１、またはその変異体、フラ
グメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含
む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａ
ｔｔＰ１ヌクレオチド配列（例えば、

【０１０４】

【化４】 ）、あるいはａｔｔＰ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を
含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子内に含まれるａ
ｔｔＰ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分
子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔ
ｔＰ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の
範囲内に含まれる。

【０１０５】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＰ２、またはその変異体、フラ
グメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含
む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａ
ｔｔＰ２ヌクレオチド配列（例えば、

【０１０６】

【化５】 ）、あるいはａｔｔＰ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導
体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子内に含まれ
るａｔｔＰ２配列内の１以上の塩基の特定な変異、挿入、または欠損は、これら
の分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、
ａｔｔＰ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発
明の範囲内に含まれる。

【０１０７】 ａｔｔＰ１部位およびａｔｔＰ２部位を含む核酸分子（ｐＥＮＴＲ２１−ａｔ
ｔＰｋａｎまたはｐＡｔｔＰｋａｎとしてもまた公知であるａｔｔＰベクターｐ
ＤＯＮＲ２０１；図４９を参照のこと、）を含む組換え宿主細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＢ３．１（ｐＡｔｔＰｋａｎ）（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＡＨＫａｎ
）とも呼ばれる）は、１９９９年２月２７日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１
５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ Ｉｌｌ
ｉｎｏｉｓ ６１６０４ ＵＳＡの収集に受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３００９９と
して寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＰ１部位およびａｔｔＰ２部位
は、核酸カセットに含まれ、この核酸カセットは、以下でより詳細に記載される
１以上のさらなる機能的配列に関連する。

【０１０８】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＲ１またはその変異体、フラグ
メント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む
核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔ
ｔＲ１ヌクレオチド配列（例えば、

【０１０９】

【化６】 ）、あるいはａｔｔＲ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を
含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａｔ
ｔＲ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子
の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔ
Ｒ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸配列は、本発明の範
囲内に含まれる。

【０１１０】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＲ２、またはその変異体、フラ
グメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上の核酸配列を含む核酸分
子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＲ２
ヌクレオチド配列（例えば

【０１１１】

【化７】 ）、あるいはａｔｔＲ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導
体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸配列に含まれる
ａｔｔＲ２配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの
分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａ
ｔｔＲ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明
の範囲内に含まれる。

【０１１２】 リーディングフレームＡ、リーディングフレームＢ、ならびにリーディングフ
レームＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５１０１）（リーディングフ
レームＡ；図６４Ａを参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５
１０２）（リーディングフレームＢ；図６４Ｂを参照のこと）、およびＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５１０３）（リーディングフレームＣ；図６４Ｃ
を参照のこと）内のクローニング部位に並べられたａｔｔＲ１部位を含む組換え
宿主細胞株、および対応するａｔｔＲ２部位を含む組換え宿主細胞株は、１９９
９年２月２７日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ Ｕ
ＳＡの収集に、それぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０１０３、ＮＲＲＬ Ｂ−３
０１０４、およびＮＲＲＬ Ｂ−３０１０５として寄託された。寄託された核酸
分子内のａｔｔＲ１部位およびａｔｔＲ２部位は、核酸カセットに含まれ、この
核酸カセットは、以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関
連する。

【０１１３】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＬ１、またはその変異体、フラ
グメント、改変体、および誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む
核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔ
ｔＬ１ヌクレオチド配列（例えば、

【０１１４】

【化８】 ）、あるいはａｔｔＬ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体）
を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａ
ｔｔＬ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分
子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔ
ｔＬ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の
範囲内に含まれる。

【０１１５】 別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＬ２、またはその変異体、フラ
グメント、改変体、および誘導体をコードする１以上の核酸配列を含む核酸分子
を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＬ２ヌ
クレオチド配列（例えば、

【０１１６】

【化９】 ）、あるいはａｔｔＬ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導
体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれる
ａｔｔＬ２配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの
分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａ
ｔｔＬ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明
の範囲内に含まれる。

【０１１７】 リーディングフレームＡ、リーディングフレームＢ、ならびにリーディングフ
レームＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＥＮＴＲ１Ａ）（リーディングフレー
ムＡ；図１０を参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．１（ｐＥＮＴＲ２Ｂ）（
リーディングフレームＢ；図１１を参照のこと）およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＢ３．
１（ｐＥＮＴＲ３Ｃ）（リーディングフレームＣ；図１２を参照のこと）におけ
るクローニング部位に並べられたａｔｔＬ１部位を含む組換え宿主細胞、および
対応するａｔｔＬ２部位を含む組換え宿主細胞は、１９９９年２月２７日に、Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅ
ｅｔ Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ ＵＳＡの収集に、それぞ
れ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０１００、ＮＲＲＬ Ｂ−３０１０１、およびＮＲ
ＲＬ Ｂ−３０１０２として寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＬ１部
位およびａｔｔＬ２部位は、核酸カセットに含まれ、この核酸カセットは、以下
でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関連する。

【０１１８】 本明細書中に記載される各組換え部位配列あるいはその一部、または寄託され
たクローンに含まれるヌクレオチド配列カセットは、（例えば、本明細書中に記
載される組換えクローニング方法および／または当該分野で慣習的な標準的な制
限クローニング技術を使用して）クローン化され得るか、または目的のベクター
に挿入され得、例えばエントリーベクターまたは目的ベクター（目的の核酸分子
の所望のセグメント（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、またはｃＤＮＡライブラ
リー）を、所望のベクターまたは宿主細胞に移すために使用され得る）を産生す
るためにクローン化され得るか、挿入され得る。

【０１１９】 本明細書中に提供される情報（例えば、本明細書中に記載される組換え部位配
列に対するヌクレオチド配列）を使用して、１以上の組換え部位、またはその一
部をコードする本発明の単離された核酸分子は、標準的なクローニングおよびス
クリーニング手順（例えば、開始物質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡをクロ
ーニングするための手順）を使用して入手され得る。好ましくは、このような方
法としては、ＰＣＲに基づくクローニング方法（例えば、本明細書および以下の
実施例に記載されるようなプライマーを使用する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ））が挙げられる。あるいは、本明細書中で記載される組換え部位配列を含む
カセットを含むベクターがＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より市販されている。

【０１２０】 本発明はまた、１以上の組換え部位配列またはその一部、および１以上のさら
なるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関し、この核酸分子は、機能的部位また
は構造的部位（例えば、１以上のマルチクローニング部位、１以上の転写末端部
位、１以上の転写制御配列（プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどで
あり得る）、１以上の翻訳シグナル（例えば分泌シグナル配列）、１以上の複製
起点、１以上の融合パートナーペプチド（特に、グルタチオンＳトランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ₆）、およびチオレドキシン（Ｔｒ
ｘ））、１以上の選択マーカーまたはモジュール、局在化シグナルをコードする
１以上のヌクレオチド配列（例えば、核局在化シグナル、または分泌シグナル）
、１以上の複製起点、１以上のプロテアーゼ切断部位、目的のタンパク質または
ポリペプチドをコードする１以上の遺伝子または遺伝子の一部、および１以上の
５’ポリヌクレオチド伸長（特に、約１〜約２０、約２〜約１５、約３〜約１０
、約４〜約１０の長さの範囲のグアニン残基の伸長、そして最も好ましくは、組
換え部位ヌクレオチド配列の５’末端の４または５のグアニン残基の伸長））を
コードし得る。１以上のさらなる機能的配列または構造的配列は、本発明の核酸
分子に含まれる１以上の組換え部位配列に隣接しても、しなくてもよい。

【０１２１】 本発明のいくつかの核酸分子において、１以上のさらなる機能的部位または構
造的部位をコードする１以上のヌクレオチド配列は、組換え部位をコードするヌ
クレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、本発明の特定の核酸分子は
、本発明の組換え部位またはその一部をコードするヌクレオチド配列に作動可能
に連結されたプロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター、ファージλＰＬプ
ロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、および
当業者に知られた他の適切ｂなプロモーター）を有し得る。

【０１２２】 本発明の核酸分子（単離された核酸分子であり得る）は、ＲＮＡの形態（例え
ば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に産
生されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッドの形態であり得る。本発明の核酸分子は、２本鎖または１本鎖であり得る
。１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖であり得るか（センス鎖としても公知
である）、または非コード鎖であり得る（アンチセンス鎖としても言及される）
。本発明の核酸分子はまた、直鎖状、環状、コイル状、高次コイル状を含む、複
数の位相を有し得る。

【０１２３】 「単離された」核酸分子は、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子
、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分
子は、本発明の目的のために単離されているとみなされる。単離されたＤＮＡ分
子のさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持される組換えＤＮＡ分子が挙げ
られ、そしてこれらのＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ技術によって生成されていよ
うと、または合成化学技術によって生成されていようとも、溶液より（部分的ま
たは実質的に）精製される。単離されたＲＮＡ分子としては、インビボまたはイ
ンビトロでの本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物が挙げられる。

【０１２４】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の変異体、フラグメント、改変体、および
誘導体に関し、それらは、１以上の組換え部位の一部、アナログ、または誘導体
をコードする。改変体は天然に生じ得る（例えば、天然の対立形質改変体）。「
対立形質改変体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいく
つかの代替形態の１つを意図する（Ｌｅｗｉｎ，Ｂ編、ＧｅｎｅｓＩＩ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。非天然に生じる
改変体は、例えば本明細書中で以下に記載されるような当該分野で公知の突然変
異誘発技術を使用して生成され得る。

【０１２５】 このような改変体としては、ヌクレオチドまたはその一部の置換、欠損または
付加、、あるいはその組み合わせによって産生される改変体が挙げられる。置換
、欠損、または付加は、１以上のヌクレオチドに関与し得る。改変体は、コード
領域、非コード領域、または両方において変化され得る。コード領域における変
化は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、欠損および付加を生成
し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレント置換、付加、および欠損で
あり、それらは、コードされるポリペプチドまたはその一部の特性および活性を
変化しない。そしてそれらはまた、組換え反応において組換え部位核酸配列の反
応性を実質的に変化しない。保存的な置換もまた、この点において特に好ましい
。

【０１２６】 本発明の核酸分子の特に好ましい変異体、フラグメント、改変体および誘導体
としては、１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）内における１
つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換が挙げられるがこれらに限定
されない。このコア領域は、４つ全ての野生型λａｔｔ部位（ａｔｔＢ、ａｔｔ
Ｐ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）において同一である（米国出願第０８／６６３，
００２号、１９９６年６月７日出願（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）
、同第０９／００５，４７６号、１９９８年１月１２日出願、および同第０９／
１７７，３８７、１９９８年１０月２３日出願を参照し、これらはコア領域をよ
り詳細に記載し、そしてこれらの開示は、本明細書中に参考としてその全体が援
用される）。同様に、ａｔｔＢ１、ａｔｔＰ１、ａｔｔＬ１およびａｔｔＲ１に
おけるコア領域は、互いに同一であり、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ２お
よびａｔｔＲ２におけるコア領域も同様である。詳細には、この点において、こ
の１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）内で生じる７ｂｐオー
バーラップ領域（ＴＴＴＡＴＡＣ、これは、インテグラーゼタンパク質に対する
切断部位によって規定され、そして鎖の交換が起こる領域である）内における１
つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む核酸分子が好ましい。本発
明のこの局面に従うそのような好ましい変異体、フラグメント、改変体および誘
導体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：７ｂｐオーバ
ーラップ領域の位置１におけるチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シ
トシン、もしくはアデニンで置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の
位置２のチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはアデニ
ンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置３のチミジン
が、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンによって置換さ
れた核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置４のアデニンが、欠失されたか
、またはグアニン、シトシンもしくはチミジンによって置換された核酸分子；７
ｂｐオーバーラップ領域の位置５のチミジンが、欠失されたか、またはグアニン
、シトシンもしくはアデニンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラッ
プ領域の位置６のアデニンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしく
はチミジンによって置換された核酸分子；および、７ｂｐオーバーラップ領域の
位置７のシトシンが、欠失されたか、またはグアニン、チミジン、もしくはアデ
ニンによって置換された核酸分子；あるいは、この７ｂｐオーバーラップ領域内
の１つ以上のそのような欠失および／または置換の任意の組み合わせ。本明細書
中の実施例２１に詳細に記載したように、７ｂｐオーバーラップ（ＴＴＴＡＴＡ
Ｃ）の最初の３つの位置に置換が作製された本発明の核酸分子の変異体が、組換
え特異性に強く影響を与え、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）に置換が作製
された変異体核酸分子は、部分的にのみ組換え特異性を変化させ、そして７ｂｐ
オーバーラップの外であるが１５ｂｐコア領域内のいずれかのヌクレオチド置換
を含む変異体核酸分子は、組換え特異性には変化を与えないが、組換え効率に影
響を与えることが、本発明において見出された。

【０１２７】 ゆえに、さらなる局面において、本発明はまた、組換え特異性に影響を与える
１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列（詳細には、１５ｂｐコア領域内の７塩
基対オーバーラップに実質的に対応し得、組換え特異性に影響を与える１つ以上
の変異を有する１つ以上のヌクレオチド配列）を含む核酸分子に関する。詳細に
は、好ましいそのような分子は、コンセンサス配列（例えば、ＮＮＮＡＴＡＣ（
ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／ＵまたはＣで
あり得る）をいい、ただしコンセンサス配列における最初の３つのヌクレオチド
の１つが、Ｔ／Ｕである場合、最初の３つのヌクレオチドの他の２つのうちの少
なくとも１つは、Ｔ／Ｕではない））（本明細書において実施例２１に詳細に記
載する）を含み得る。

【０１２８】 関連する局面において、本発明はまた、組換え効率を増強する１つ以上の組換
え部位ヌクレオチド配列、詳細にはコア領域に実質的に対応し得かつ組換え効率
を増強する１つ以上の変異を有する１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子
に関する。「組換え効率を増強する」配列または変異は、組換え部位、好ましく
はコア領域（例えば、ａｔｔ組換え部位の１５ｂｐコア領域）内の配列または変
異を意味し、これは、組換え分子が、変異された配列もしくはコア領域を含まな
い分子（例えば、野生型の組換え部位コア領域配列を含む分子）と比較して変異
された配列またはコア領域を含む場合、クローニング効率の増加を生じる（代表
的には、試験配列の成功したクローニングを決定することによって（例えば、所
定のクローニング混合物に対するＣＦＵ／ｍｌを決定することによって）測定さ
れる）。より詳細には、所定の配列または変異が組換え効率を増強するか否かは
、本明細書中に記載されるような組換えクローニングにおける配列または変異を
用いて決定され得、そしてその配列または変異が、変異されていない（例えば、
野生型）配列と比較された場合に増強された組換えクローニング効率を提供する
か否かを決定する。多くの組換え部位（詳細には、ａｔｔ組換え部位）に対する
好ましいクローニング効率を増強する変異を決定する方法は、本明細書（例えば
実施例２２〜２５）に記載される。ｃａａｃｔｔｎｎｔｎｎｎａｎｎａａｇｔｔ
ｇ（ここで、「ｎ」は、任意のヌクレオチドを表す）のａｔｔＬコンセンサスコ
ア配列に対する好ましいこのような変異組換え部位の例としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：例えば

【０１２９】

【化１０】 。コア領域に加えａｔｔ部位の他の部分が、組換え効率に影響を与え得ることを
当業者は理解する。バクテリオファージλａｔｔＰ部位中（２つはａｔｔＲ（Ｐ
１およびＰ２）中、そして３つはａｔｔＬ（Ｐ’１、Ｐ’２およびＰ’３）中）
に、インテグラーゼタンパク質に対するアーム結合部位と呼ばれる５つが存在す
る。コア結合部位と比較すると、インテグラーゼタンパク質はアーム部位に高い
親和性で結合し、そしてそのタンパク質の２つの異なるドメインを介してコアお
よびアーム部位と相互作用する。コア結合部位を有するので、Ｃ／ＡＡＧＴＣＡ
ＣＴＡＴからなるアーム結合部位に対するコンセンサス配列は、５つのアーム結
合部位と７つの非ａｔｔ部位との配列比較から推察される（ＲｏｓｓおよびＬａ
ｎｄｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７７２４−７
７２８（１９８２））。各アーム部位は変異され、そして切除および組込み反応
におけるその効果に対して試験される（Ｎｕｍｒｙｃｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
．Ｒｅｓ．１８：３９５３（１９９０））。ゆえに、特定の部位が、異なる方法
で各反応に利用され、すなわち、Ｐ１およびＰ’３部位は、組込み反応に重要で
あるが、他の３つの部位は、程度を変えるための組込み反応に不要である。同様
に、Ｐ２、Ｐ’１およびＰ’２部位は、切除反応に最も重要であるが、Ｐ１およ
びＰ’３は、完全に不要である。興味深いことに、Ｐ２が変異される場合、野生
型ａｔｔＰ部位を用いたよりもより効果的に組込み反応が生じる。同様に、Ｐ１
およびＰ’３が変異される場合、切除反応がより効率的に生じる。インテグラー
ゼアーム結合部位を変異する刺激性の効果は、特定の組換え部位を競合または阻
害する部位か、または産物を出発物質に戻して転換する反応中で機能する部位を
除去することによって説明され得る。実際、ＸＩＳ独立ＬＲ反応に関する証拠が
存在する（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１５３：６７−７８（１９８１））。従って、ａｔｔ部位のコア領域における
改変に加えて、本発明は、インテグラーゼアーム型結合部位における１つ以上の
改変を含むａｔｔ部位の使用を意図する。いくつかの好ましい実施形態において
、１つ以上の変異が、１つ以上のＰ１、Ｐ’１、Ｐ２、Ｐ’２およびＰ’３部位
に導入され得る。いくつかの好ましい実施形態において、多重変異が、これらの
部位の１つ以上に導入され得る。好ましいこのような変異は、インビトロにおい
て組換えを増加する変異を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＢＰ反
応に対応する組込み型の組換えが増強されるように、変異がアーム型結合部位に
導入され得る。他の実施形態において、ＬＲ反応に対応する切除組換えが増強さ
れるように、変異がアーム型結合部位に導入され得る。当然、本明細書中に含ま
れる案内（詳細には、組換え特異性および効率に対して変異される組換え部位の
構築ならびに効果の評価）に基づいて、類似の変異または操作された配列が、本
明細書中に記載される他の組換え部位（ｌｏｘ、ＦＲＴなどを含むが、これらに
限定されない）に対して産生され得、そして本発明に従って使用される。例えば
、組換え効率を増強するコア結合部位を選択するために使用される変異誘発戦略
と類似して、同様の戦略が、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲのアーム、なら
びにｌｏｘ、ＦＲＴなどのような他の組換え部位中の類似性配列における変化を
選択するために使用され得、これは組換え効率を増強する。ゆえに、そのような
変異の構築および評価は、過度の実験を伴わずに十分に当業者の能力の範囲内で
ある。そのような変異を調製しかつ評価するある適切な方法論は、Ｎｕｍｒｙｃ
ｈら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１３
）：３９５３−３９５９に見いだされる。

【０１３０】 組換え効率を増強するのに適切であり得る他の変異配列および核酸分子は、本
明細書中の説明から明らかであるか、または本明細書中の説明の観点における分
子生物学の慣用的な実験および当該分野で容易に入手可能な情報のみを用いて、
当業者によって容易に決定され得る。

【０１３１】 遺伝暗号が当該分野において周知であるので、当業者にとってまた、過度の実
験なしで本明細書中に記載される核酸分子の縮重改変体を作製することは慣用で
ある。ゆえに、本明細書中に記載される組換え部位をコードする核酸配列の縮重
改変体を含む核酸分子はまた、本発明の範囲内に含まれる。

【０１３２】 本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載の組換え部位の１５ｂｐコア
領域内における７ｂｐオーバーラップ領域のヌクレオチド配列、または図９に示
されるようなａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、
ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１もしくはａｔｔＲ２のヌクレオチド配列（またはその部
分）、または任意のこれらのヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント、改
変体、変異体および誘導体に相補的なヌクレオチド配列に、少なくとも５０％同
一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少
なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、そしてよ
り好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。

【０１３３】 特定の組換え部位またはその部分をコードする参照ヌクレオチド配列に少なく
とも、例えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、
組換え部位をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり、
５つまでの点変異（例えば、挿入、置換または欠失）を含み得るポリヌクレオチ
ド配列以外は参照配列に同一であるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を意図
する。例えば、参照ａｔｔＢ１ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、ａｔｔＢ１参照配列にお
いて５％までのヌクレオチドが、欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得る
か、またはａｔｔＢ１参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの多くのヌクレオ
チドが、ａｔｔＢ１参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参
照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置またはこれらの末端位置間のい
ずれかで生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々にか、または参照配列内の
１つ以上の連続した群においてかのいずれかで広がる。

【０１３４】 実際の問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば所定の組換え部位のヌク
レオチド配列またはその部分に少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であ
るか否かは、初期配列整列のためのＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、続いて多
重配列整列のためのＥＳＥＥ 第３．０版 ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェ
ア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）のような公知のコンピュー
タープログラムを用いて簡便に決定され得る。あるいは、そのような決定は、Ｂ
ＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）（これは、２つの配列間の
最良な相同性セグメントを見いだすためにローカル相同性アルゴリズム（Ｓｍｉ
ｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））を使用する）を用いて
達成され得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に例えば９５％同一である
か否かを決定するための、ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意
の他の配列整列プログラムを使用する場合、パラメーターは、参照ヌクレオチド
配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算され、そして参照配列中の
ヌクレオチド全数の５％までの、相同性におけるギャップが可能になるように設
定される。

【０１３５】 本発明は、図９に示されるようなａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔ
ｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１またはａｔｔＲ２のヌクレオチド
配列、または寄託されたクローンのヌクレオチド配列に、少なくとも５０％、６
０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％同一である核酸分子に関し、これらが特定の機能ポリペプチド
をコードするか否かに関わらない。なぜなら、特定の核酸分子が特定の機能ポリ
ペプチドをコードしない場合でさえも、当業者は核酸分子を使用する方法（例え
ば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プ
ライマーとして）を理解するからである。

【０１３６】 変異はまた、部位特異的組換えを増強するためもしくは反応物の特性を変化さ
せるなどのために、組換え部位ヌクレオチド配列中に導入され得る。そのような
変異としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：コードされる誘導タ
ンパク質を可能にする翻訳終止コドンを伴わない組換え部位；同じタンパク質に
よって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位であって、その結果その組換え
部位が意図される多重反応を可能にするそれらの相同性パートナーと、大きくま
たは排他的に反応する、組換え部位；ならびに組換え部位のヘアピン形成を避け
るための変異。どの特定の反応が生じるかは、反応混合物中に特定のパートナー
が存在することによって特定化され得る。

【０１３７】 特定の変異を核酸配列中に導入するための手順は周知である。これらの多くが
、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９−１９９６）に記載される。変異は、オリゴヌク
レオチド中に設計され得、これはクローン化された配列を切除する改変に対して
使用され得るか、または増幅反応において使用され得る。所望の変異ＤＮＡまた
はＲＮＡを単離するために適切な選択方法が利用可能な場合、無作為変異誘発が
また利用され得る。所望の変異の存在は、周知の方法による核酸の配列決定によ
って確認され得る。

【０１３８】 以下の非限定の方法は、特定の組換え部位をコードする所定の核酸分子を改変
または変異するために使用され得、本発明に使用され得る変異部位を提供する： １．部位特異的（例えば、ａｔｔＰを提供するためのａｔｔＬおよびａｔｔＲ
）または他（例えば、相同性）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配列の組換え（
ここで、親ＤＮＡセグメントは、１つ以上の塩基改変を含み、最終的な変異され
た核酸分子を生じる）； ２．所望の核酸分子の直接的な、変異または（部位特異的、ＰＣＲ、ランダム
、偶発的などの）変異誘発； ３．親ＤＮＡ配列の（部位得的、ＰＣＲ、ランダム、偶発的などの）変異誘発
、 親ＤＮＡは、再び結合され、所望の核酸分子を生成する； ４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写；ならびに ５．所望の塩基変化または無作為な塩基変化を有する配列のデノボ合成（化学
合成）、続いて当該分野で慣用である方法に従う配列決定または機能的分析。

【０１３９】 変異組換え部位の機能性は、所望される特定の特徴に依存する方法で実施され
得る。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠失は、適切な融合タンパ
ク質を発現させることによって実施され得る。相同性パートナーの間の組換え特
異性は、適切な分子をインビトロ反応に導入し、そして本明細書中に記載される
かまたは当該分野で公知のような組換え産物に対してアッセイすることによって
実施され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳もしくは
転写開始シグナル、タンパク質結合部位、特定のコード配列および核酸塩基配列
の他の公知の機能性の存在または非存在を含み得る。組換え部位における特定の
機能特質に対する遺伝的選択スキームは、公知の方法工程に従って使用され得る
。例えば、（相互作用しない部位の対から）相互作用するパートナーを提供する
ための部位の改変は、その部位の間の組換えを介して、毒性物質をコードするＤ
ＮＡ配列の欠失を要求することによって達成され得る。同様に、翻訳終止配列、
タンパク質結合部位の存在または非存在などを除去する部位の選択が、当業者に
よって用意に工夫され得る。

【０１４０】 従って、本発明はまた、選択マーカーおよび／または所望のＤＮＡセグメント
に隣接し、少なくとも１つ、そして好ましくは少なくとも２つの本発明の操作さ
れた組換え部位ヌクレオチド配列を有する、少なくとも１つのＤＮＡセグメント
を含む核酸分子を提供し、ここで、少なくとも１つの上記組換え部位ヌクレオチ
ド配列は、共挿入されたＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成におけるインビトロの組
換えを増強する少なくとも１つの操作された変異を有する。そのような操作され
た変異は、本発明の組換え部位ヌクレオチド配列のコア配列の中であり得る；米
国出願第０８／４８６，１３９号（１９９５年６月７日出願）、同第０８／６６
３，００２号（１９９６年６月７日出願）（現在、米国特許第５，８８８，７３
２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日出願）および同第
０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日出願）を参照し、これらの開
示は、本明細書中にその全体が参考として全て援用される。

【０１４１】 好ましい実施形態において、組換え部位は、配列が異なりそして互いに相互作
用しないが、同じ配列（これは、互いに相互作用し得る）を含む部位は、互いの
組換えを阻害するように処理され得るかまたは操作され得ることが、理解される
。そのような概念は、本明細書中に考慮されそして援用される。例えば、タンパ
ク質結合部位（例えば、抗体結合部位、ヒストン結合部位、酵素結合部位または
任意の核酸分子結合タンパク質に対する結合部位）は、その部位の１つに隣接し
て操作され得る。操作された部位を認識するタンパク質の存在下において、リコ
ンビナーゼはその部位へのアクセスに失敗し、従って核酸分子内の別の組換え部
位が、優先的に使用される。共挿入の場合、この部位は、もはや反応し得ない。
なぜなら、例えばａｔｔＢからａｔｔＬに変化されているからである。共挿入の
分解の間またはその時、タンパク質は、不活性化され得（例えば、抗体、熱また
は緩衝液の交換によって）、そして第２の部位は組換えを起こし得る。

【０１４２】 本発明の核酸分子は、この組換えの少なくとも１つの増強を与える少なくとも
１つの変異を有し得、この増強は、実質的に以下からなる群から選択される：（
ｉ）組み込みを可能にすること；（ｉｉ）組換えを可能にすること；（ｉｉ）宿
主因子についての要件を軽減すること；（ｉｉｉ）この共統合ＤＮＡまたは産物
ＤＮＡ形成の有効性を向上させること；（ｉｖ）この共統合ＤＮＡまたは産物Ｄ
ＮＡ形成の特異性を向上させること；およびタンパク質結合部位を追加または欠
失させること。

【０１４３】 他の実施形態において、本発明の核酸分子は、ＰＣＲプライマー分子であり得
、これは本明細書中に記載される１つ以上の組換え部位配列またはそれらの部分
、特に、３’末端で、増幅されるべき標的核酸分子と特異的に相互作用する標的
特異的テンプレート配列に結合した、図９に示される配列（または図９に示され
る配列に相同な配列）、または改変体、フラグメント、それらの変異体または誘
導体を含む。本発明のこの局面に従うプライマー分子は、さらに、１つ以上（例
えば、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、５０、１００、５００、１００
０、またはそれより多い）のさらなる塩基を、それらの５’末端に含み得、そし
て好ましくは、１つ以上（特に４または５）のさらなる塩基を含み、これらの塩
基は、好ましくは、それらの５’末端において、本発明の組換えクローニング系
にプライマー分子を組み込む増幅産物の効率を増加するグアニンである。このよ
うな核酸分子およびプライマーは、本明細書中の実施例、特に実施例２２〜２５
に詳細に記載される。

【０１４４】 本発明の特定のプライマーは、図９に示されるように、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ
２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、またはａ
ｔｔＲ２配列中に１つ以上のヌクレオチド欠失を含み得る。このような局面にお
いて、例えば、ａｔｔＢ２プライマーが構築され得、ここで、図９に示されるａ
ｔｔＢ２配列の５’末端における初めの４ヌクレオチドのうち１つ以上は、欠失
している。従って、本発明のこの局面に従うプライマーは、以下の配列を有し得
る：

【０１４５】

【化１１】 ここで、プライマーの３’末端における「ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ．．．ｎ
」は、任意の長さ（例えば、１塩基から標的核酸分子（例えば、遺伝子）または
その部分の全ての塩基まで）の標的特異的配列を表し、この配列および長さは、
増幅されるべき標的核酸分子の同一性に依存する。

【０１４６】 本発明のこの局面に従うプライマー核酸分子は、図９に示される組換え部位配
列、またはそれらの部分を、標準ＰＣＲ標的特異的プライマーの５’末端に、当
該分野で周知の方法に従って連結することによって、合成的に生成され得る。あ
るいは、本発明のさらなるプライマー核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド塩基
（これは、好ましくは、本明細書中で記載されるａｔｔヌクレオチド配列の、１
つ以上、好ましくは５つ以上、そしてより好ましくは６つ以上の連続したヌクレ
オチドに対応する（例えば、本明細書中の実施例２０を参照のこと；米国出願第
０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日出願）（現在、米国特許第５，８
８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日出願）
、および同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日出願）もまた参
照のこと。これらの開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される
））を、標準ＰＣＲ標的特異的プライマーの５’末端に、当該分野で周知の方法
に従って付加することによって、合成的に生成され、本明細書中に記載の特異的
ヌクレオチド配列を有するプライマーを提供し得る。上記のように、本発明のこ
の局面に従うプライマー核酸分子はまた、それらの５’末端において、１、２、
３、４、５またはそれより多いさらなるヌクレオチド塩基を必要に応じて含み得
、そして好ましくは、それらの５’末端において、４つまたは５つのグアニンを
含む。１つの特に好ましいこのような局面において、本発明のプライマー核酸分
子は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマー分子の５’末端に結合し
た、図９に示されるａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２ヌクレオチド配列（またはそれ
らに対して相補的なヌクレオチド）の、１つ以上、好ましくは５つ以上、より好
ましくは６つ以上、さらにより好ましくは、６〜１８または６〜２５個、そして
最も好ましくは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したヌ
クレオチドまたはｂｐを含み得る。本発明のこの局面に従うプライマー核酸分子
には、以下のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２誘導プライ
マー核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない：

【０１４７】

【化１２】 ここで、プライマーの３’末端における「ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ．．．ｎ
」は、任意の長さ（例えば、１塩基から標的核酸分子（例えば、遺伝子）または
その部分の全ての塩基まで）の標的特異的配列を表し、この配列および長さは、
増幅されるべき標的核酸分子の同一性に依存する。

【０１４８】 もちろん、本明細書に詳細に記載されるものと類似のさらなるプライマー核酸
分子が、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマー分子の５’末端の連結
した、図９に示されるａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔ
ｔＲ１、またはａｔｔＲ２ヌクレオチド配列の、１つ以上、好ましくは５つ以上
、より好ましくは６つ以上、さらにより好ましくは１０個以上、１５個以上、２
０個以上、２５個以上、３０個以上など（全てまでおよび全てを含む）の連続し
たヌクレオチドまたはｂｐを使用して生成され得ることは、本明細書中に含まれ
る教示から当業者に明らかである。上記のように、このようなプライマー核酸分
子は、それらの５’末端において、１、２、３、４、５個またはそれより多いさ
らなるヌクレオチド塩基を必要に応じてさらに含み得、そして好ましくは、それ
らの５’末端で、４つのグアニンを含む。図９に示されるａｔｔＢ１、ａｔｔＢ
２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、およびａ
ｔｔＲ２配列を含む他のプライマー分子、またはそれらの部分は、本明細書中に
示されるガイダンスに従って、過度の実験を使用することなく、当業者によって
作製され得る。

【０１４９】 本明細書中に記載される本発明のプライマーは、本発明の組換えシステムを使
用するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのクローニング（以下の実施例８、１９お
よび２１〜２５に詳細に記載される）において使用するため、各末端において組
み替え部位配列により隣接した目的の核酸分子を有するＰＣＲフラグメントを産
生する際に有用である（以下の実施例９で詳細に記載される）。

【０１５０】 （ベクター） 本発明はまた、本明細書中で記載されるように、本発明の１つ以上の核酸分子
を含むベクターに関する。本発明によると、任意のベクターが、本発明のベクタ
ーを構築するために使用され得る。特に、当該分野で公知のベクターおよび市販
のベクター（およびそれらの改変体または誘導体）は、本発明の方法において使
用するために、１つ以上の組換え部位（もしくはそれらの部分）をコードする１
つ以上の核酸分子、または変異体、フラグメント、あるいはそれらの誘導体を含
むように、本発明に従って操作され得る。このようなベクターは、例えば以下か
ら得られ得る：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎ Ｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｅｐｉ
Ｃｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＲｅｓｅｒｃｈ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ。このようなベクターは、次いで、例えば、目的の核酸分子をクローニン
グまたはサブクローニングするために使用され得る。一般的なクラスの特定の目
的のベクターには、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、
発現ベクター、融合ベクター、トゥーハイブリッドベクター、逆トゥーハイブリ
ッドベクター、異なる宿主において使用するためのシャトルベクター、変異誘発
ベクター、転写ベクター、大きな挿入物を受容するためのベクターなどが挙げら
れる。

【０１５１】 目的の他のベクターには、ウイルス由来のベクター（Ｍ１３ベクター、細菌性
ファージλベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、アデノウイルスベクタ
ー、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージディスプレ
イベクター、組換えライブラリーベクター）、高い、低い、および調整可能なコ
ピー数のベクター、単一の宿主中の組換えにおける使用に適合性のレプリコンを
有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、ならびに真核生物エ
ピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が挙げられる。

【０１５２】 目的の特定のベクターには、原核生物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡＩＩ
、ｐｓＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉ
ｓＡ、ＢおよびＣ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎ
ｃ．）、ｐＧＥＭＥＸ−１、およびｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ
．））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫ
Ｋ２２３−３、ｐＧＥＸベクター、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、およびｐＭＣ
１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３
８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、およびｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにそれらの改変体および誘
導体が挙げられる。目的のベクターはまた、例えば、以下のような原核生物発現
ベクターから作製され得る：

【０１５３】

【化１３】 特定の目的の他のベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒ
ｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＳ（酵母人工染色体）、
ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＭＡＣ（哺乳動物人工染色体）、ｐＱＥ７０、ｐＱ
Ｅ６０、ｐＱＥ９（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐ
ｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥ
Ｔ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２
．０、およびｐＳＶＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）、ならびにそれらの改変体および誘導体が挙げられる。

【０１５４】 目的のさらなるベクターには、以下が挙げられる：

【０１５５】

【化１４】 特定の目的のトゥーハイブリッドベクターおよび逆トゥーハイブリッドベクタ
ーには、以下が挙げられる：

【０１５６】

【化１５】 特定の目的の酵母発現ベクターには、ｐＥＳＰ−１、ｐＥＳＰ−２、ｐＥＳＣ
−Ｈｉｓ、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＳ４０１、ｐＲＳ４０２、ｐＲＳ４１１、ｐＲＳ４１２、
ｐＲＳ４２１、ｐＲＳ４２２、ならびにそれらの改変体および誘導体が挙げられ
る。

【０１５７】 本発明によると、１つ以上の組換え部位、またはそれらの変異体、改変体、フ
ラグメント、もしくは誘導体をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターは
、標準的な分子生物学的方法を使用して、過度の実験を行うことなく、当業者に
よって産生され得る。例えば、本発明のベクターは、１つ以上の組換え部位（ま
たはそれらの変異体、フラグメント、改変体または誘導体）をコードする１つ以
上の核酸分子を、本明細書中に記載される１つ以上のベクターに、例えば、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２
）に記載される方法に従って導入することによって産生され得る。本発明の関連
の局面において、これらのベクターは、１つ以上の組換え部位（またはそれらの
部分）をコードする１つ以上の核酸分子に加えて、１つ以上のさらなる物理的ま
たは機能的ヌクレオチド配列（例えば、１つ以上の多クローニング部位をコード
する配列）、１つ以上の転写終結部位、１つ以上の転写調節配列（例えば、１つ
以上のプロモーター、エンハンサーまたはレプレッサ）、１つ以上の選択マーカ
ーまたはモジュール、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする１つ以
上の遺伝子または遺伝子の部分、１つ以上の転写シグナル配列、融合パートナー
タンパク質またはペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、
ＧＳＴ、Ｈｉｓ₆、またはチオレドキシン）、１つ以上の複製起点、および１つ
以上の５’または３’ポリヌクレオチドテール（特に、ポリＧ−テール）を含む
ように操作され得る。本発明のこの局面によると、１つ以上の組換え部位のヌク
レオチド配列（またはそれらの部分）は、必要に応じて、本明細書中に記載され
る１つ以上のさらなる物理的または機能的ヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れ得る。

【０１５８】 本発明のこの局面に従う好ましいベクターには、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：

【０１５９】

【化１６】 しかし、本発明はまた、本明細書中に詳細に示されていない他のベクターを包含
し、このベクターは１つ以上の組換え部位またはそれらの部分（あるいは、それ
らの変異体、フラグメント、改変体または誘導体）をコードする本発明の１つ以
上の単離された核酸分子を含み、そしてこのベクターは、１つ以上の組換え部位
またはその部分をコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に必要に応じて連結
され得る、本明細書中で記載される１つ以上のさらなる物理的または機能的ヌク
レオチド配列をさらに含み得ることが当業者に理解される。このようなさらなる
ベクターは、本明細書中に示されるガイダンスに従って、当業者によって産生さ
れ得る。

【０１６０】 （ポリメラーゼ） 本発明に従う使用のための逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド（す
なわち、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡ分子の合成を触媒し得るポリペプチド
）には、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫
ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素
、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ
）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウイルス逆
転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワ
ーモザイクウイルス逆転写酵素、および細菌逆転写酵素が含まれるがこれらに限
定されない。特に好ましいのは、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性においてまた実質的に減少
している逆転写酵素活性を有するポリペプチド（「ＲＮＡｓｅ Ｈ^-」ポリペプ
チド）である。「ＲＮＡ Ｈ活性において実質的に減少している」ポリペプチド
によって、野生型のＲＮａｓｅＨ活性またはＲＮａｓｅ Ｈ^-酵素（例えば、野
生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素）の約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％
、または５％未満、そして最も好ましくは約２％未満を有するポリペプチドが意
味される。ＲＮａｓｅＨ活性は、種々のアッセイ（例えば、米国特許第５，２４
４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ
．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １
４（５）：９１において記載されるようなアッセイ、これらのすべての開示は、
本明細書中で参考として十分に援用される）によって決定され得る。本発明にお
ける使用のための適切なＲＮＡｓｅＨ^-ポリペプチドは、以下を含むがこれらに
限定されない：Ｍ−ＭＬＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＡＭＶ
Ｈ^-逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＨＩＶ Ｈ^- 逆転写酵素、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ^TM逆転写酵素およびＴＨＥＲＭＯＳＣＲ
ＩＰＴ^TMＩＩ逆転写酵素、ならびにＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^TM Ｉ逆転写酵素お
よびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^TM ＩＩ逆転写酵素（これらは、例えば、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ）から入手可能である）。一般的には、ＰＣＴ出願公開ＷＯ ９８／４７９１
２を参照のこと。

【０１６１】 本発明の方法における使用のために適切な核酸ポリメラーゼ活性を有する他の
ポリペプチドには、高熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ
、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、およ
びＴ５ポリメラーゼ）、ならびに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（以下を含むがこれ
らに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ
（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ
（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ（またはＤＥ
ＥＰＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏ
ｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａ
ｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌ
ａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎ
ｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体）が含まれる。
このようなポリペプチドは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ
ｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）から市販されている。

【０１６２】 （宿主細胞） 本発明はまた、本発明の１つ以上の核酸分子またはベクター（特に、本明細書
中に詳細に記載される核酸分子またはベクター）を含む宿主細胞に関する。本発
明のこの局面に従って使用され得る代表的な宿主細胞には、以下が含まれるがこ
れらに限定されない：細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞。好まし
い細菌宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞および最も特定には、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５
α、ＤＢ３、ＤＢ３．１（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦ
ＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１^TMコンピテント細胞；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＤＢ４およびＤ
Ｂ５；１９９９年３月２日に出願された米国仮出願番号６０／１２２，３９２号
を参照のこと、この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．細胞（特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ細胞）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．細胞、Ｅｒｗｉｎ
ｉａ ｓｐｐ．細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．細胞、Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ細胞）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞）、およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳ．ｔ
ｙｐｈｉ細胞）が含まれる。好ましい宿主細胞には、昆虫細胞（最も好ましくは
、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓｐｏｄｐｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞およびＳｆ２１細胞ならびにＴｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）、線虫細胞（特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｃｅ細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（特に、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ細胞
）、爬虫類細胞、哺乳動物細胞（最も具体的には，ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖ
ＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞）が含まれる。好ましい酵母細胞には
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が含まれる。これらおよび他の適切な宿主細胞は、例え
ば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ
；Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている。

【０１６３】 本発明の核酸分子および／またはベクターを、本明細書中に記載する宿主細胞
に導入して、本発明の１つ以上の核酸分子および／またはベクターを含む宿主細
胞を産生するための方法は、当業者に知られている。例えば、本発明の核酸分子
および／またはベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、および形
質転換の周知の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。本発明の核酸分子およ
び／またはベクターは、単独でまたは他の核酸分子および／もしくはベクターと
ともに導入され得る。あるいは、本発明の核酸分子および／またはベクターは、
沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿物）として、または脂質との複合体中で
宿主細胞に導入され得る。エレクトロポレーションもまた、宿主に本発明の核酸
分子および／またはベクターを導入するために使用され得る。同様に、このよう
な分子は、化学的にコンピテントな細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入され得
る。ベクターがウイルスである場合、これは、インビトロでパッケージングされ
得るか、またはパッケージング細胞に導入され得、そしてパッケージングされた
ウイルスは、細胞に導入され得る。従って、本発明のこの局面に従って細胞に本
発明の核酸分子および／またはベクターを導入するために適切な広範な種々の技
術は、当業者に周知でありそして当業者に日常的である。このような技術は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、１６．３０−１６．５５頁（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．
Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．２１３−２３４頁（１９９２）、およびＷｉ
ｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．−Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）に十分に概説され
ており、これらは、これらの技術を詳述する多くの実験室マニュアルの例となる
ものであり、そしてこれらの関連する開示について、その全体が本明細書中で参
考として援用される。

【０１６４】 （ポリペプチド） 別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるポリペ
プチド（本発明の核酸分子のすべての可能なリーディングフレームによってコー
ドされるポリペプチドおよびアミノ酸配列を含む）、およびそのようなポリペプ
チドを産生する方法に関する。本発明のポリペプチドには、精製されたかまたは
単離された天然の産物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、
および高等植物細胞を含む）から組換え技術によって産生された生成物が含まれ
る。

【０１６５】 本発明のポリペプチドは、合成有機化学によって産生され得、そして好ましく
は、本発明のベクターまたは単離された核酸分子を含む１つ以上の本発明の宿主
細胞を使用する、標準的な組換え方法によって産生される。本発明に従って、ポ
リペプチドが、本発明の核酸分子に含まれるヌクレオチド配列の発現に好ましい
条件下で、本発明の宿主細胞（これは、本発明の１つ以上の核酸分子（好ましく
は発現ベクター中に含まれる）を含む）を培養することによって産生され、その
結果、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドが宿主細胞によって
産生される。本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド配列の発現に好まし
い条件」または「ポリペプチドの産生に好ましい条件」には、所定の宿主細胞に
よる組換えポリペプチドの産生のために必要とされる最適な生理的（例えば、温
度、湿度など）および栄養学的（例えば、培養培地、イオン）条件が含まれる。
種々の宿主細胞（原核（細菌）細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、およ
び植物細胞を含む）のためのこのような最適条件は、当業者に知られており、そ
して例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．、およびＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．−Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ
ｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（
１９８７）に見出され得る。

【０１６６】 いくつかの局面において、本発明のポリペプチドを単離または精製することが
（例えば、以下に記載されるような抗体の産生のために）所望され得、単離され
た形態の本発明のポリペプチドの産生を生じる。本発明のポリペプチドは、当該
分野において慣用的であるタンパク質精製の周知の方法によって組換え細胞培養
物から回収および単離され得る。これらの方法には、硫酸アンモニウム沈殿また
はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。例えば
、本発明の方法によって作製されるポリペプチド上のＨｉｓ６またはＧＳＴ融合
タグは、当業者によって知られているように、Ｈｉｓ６またはＧＳＴタグを有す
るポリペプチドを結合する適切なアフィニティークロマトグラフィーマトリック
スを使用して単離され得る。本発明のポリペプチドは、天然に精製された生成物
、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細
菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞）から組換え
技術によって産生された生成物を含む。組換え産生手順において使用される宿主
に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグ
リコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつか
の場合に、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基を
含み得る。

【０１６７】 本発明の単離されたポリペプチドは、１つ以上の組換え部位をコードする本発
明の核酸分子を含むポリヌクレオチドの１つ以上のリーディングフレームによっ
てコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。この核酸分子は以下を
含む：図９に示されるヌクレオチド配列（またはそれに相補的なヌクレオチド配
列）、もしくはそのフラグメント、改変体、変異体、および誘導体を有する、ａ
ｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａ
ｔｔＲ１、およびａｔｔＲ２；本明細書中に記載される寄託されたクローンに含
まれるポリヌクレオチドによってコードされる完全アミノ酸配列；ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下で図９に示されるような本発明の組換え部
位配列をコードするヌクレオチド配列（またはそれに相補的なヌクレオチド配列
）を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ
ードされるアミノ酸配列；または上記のポリペプチドの一部もしくはフラグメン
トを含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸分子。本発明はまた、
組換え部位ヌクレオチド配列または寄託されたクローンによってコードされるポ
リペプチドに連結される（代表的には、新生ポリペプチドを形成するペプチジル
結合による）１つ以上のさらなるアミノ酸を有するさらなるポリペプチドに関す
る。このようなさらなるアミノ酸残基は、１つ以上の機能的ペプチド配列（例え
ば、１つ以上の融合パートナーペプチド（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ₆、Ｔｒｘな
ど）など）を含み得る。

【０１６８】 本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴ
ペプチド」および「ポリペプチド」は、（一般的に理解されるように）同義語と
して考慮される。そして各用語は、文脈が必要とするように、交換可能に使用さ
れて、以下の特定の文脈で別に規定されていないかぎり、ペプチジル結合によっ
て結合される２つ以上のアミノ酸、好ましくは５つ以上のアミノ酸、またはより
好ましくは１０以上アミノ酸の鎖を示し得る。当該分野で一般的に理解されるよ
うに、本明細書中のすべてのペプチドの式または配列は、左から右に書かれ、そ
してアミノ末端からカルボキシ末端への方向で書かれる。

【０１６９】 本発明のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、ポリペプチドの構造およ
び機能に有意な効果なしで変化し得ることが、当業者によって理解される。配列
におけるこのような差違が意図される場合、構造および活性を決定するタンパク
質の決定的な領域が存在することを思い出すべきである。一般的に、類似の機能
を実行する残基が使用される場合、三次構造を形成する残基を置換することは可
能である。他の例において、変化がポリペプチドの決定的でない領域で起こる場
合には、残基の型は、完全に重要であるというわけではないかもしれない。

【０１７０】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドの改変体をさらに含む。この改変体
は、本明細書中に記載されるポリペプチドに対して実質的に構造的な相同性を示
すか、またはこれらのポリペプチドの特定の領域（例えば、以下で議論される部
分）を含む対立遺伝子改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、反転、
反復、および型置換（例えば、別の残基の代わりに１つの親水性残基に置換する
こと、しかし、規則として、強い疎水性については強い親水性とはしない）を含
み得る。小さな変化またはこのような「中性」または「保存性」アミノ酸置換は
、一般的に活性にほとんど影響を有さない。

【０１７１】 代表的な保存性置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌ
ｅの間で、１つの残基の別の残基への置換；水酸化残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交
換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド化残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間
の置換；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基Ｐｈｅおよ
びＴｙｒの間の置換である。

【０１７２】 従って、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ（例
えば、本明細書中に記載される組換え部位のヌクレオチド配列によってコードさ
れるペプチドを含むもの）は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存性アミノ酸
残基または非保存性アミノ酸残基（好ましくは、保存性アミノ酸残基）で置換さ
れたものであり、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによ
ってコードされ得るか、または遺伝コードによってコードされないアミノ酸（例
えば、デスモシン、シトルリン、オルニチンなど）であり得るもの；（ｉｉ）１
つ以上のアミノ酸残基が、アミノ酸の通常の「Ｒ」基に加えて、置換基（例えば
、リン酸基、水酸基、硫酸基、または他の基）を含むもの；（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例
えば、ポリエチレングリコール））と融合しているもの；または（ｉｖ）さらな
るアミノ酸が成熟ポリペプチド（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域ペプチド、リ
ーダーまたは分泌配列、成熟ポリペプチドの精製のために使用される配列（例え
ば、ＧＳＴ配列）またはプロタンパク質配列）と融合しているもの。このような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本発明に含まれることが意図され、
そして本明細書中の教示および本発明の時点における当該分野の状態から、当業
者の範囲内である。

【０１７３】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは、実質的に精製されている。本発明のポリペプチドの組換え産生バージ
ョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９
８８）に記載される１工程方法によって実質的に精製され得る。本明細書中で使
用される場合、用語「実質的に精製される」は、本発明の個々の調製物を意味し
、ここで夾雑タンパク質（すなわち、本明細書中に記載される個々のポリペプチ
ド、そのフラグメント、改変体、変異体、または誘導体ではないタンパク質）の
少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、または７５％、およ
びより好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量％）が調製
物から除去されていることを意味する。

【０１７４】 本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドに対して、少
なくとも約５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、より好
ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８
０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９
５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９
８％同一、または少なくとも約９９％同一であるポリペプチドを含む。例えば、
本発明の好ましいａｔｔＢｌ含有ポリペプチドは、図９において示される核酸配
列（またはこれに相補的な核酸配列）を有するａｔｔＢｌのヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチドの３つのリーディングフレームによってコードされるポリ
ペプチドに対して、本明細書中に記載される寄託されたｃＤＮＡクローンに含ま
れるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して、または、ス
トリンジェントな条件下で、図９において示される核酸配列（またはこれに相補
的な核酸配列）を有するａｔｔＢｌのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドに対して、少なくとも約５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５
％同一、より好ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、
少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、
少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、
少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一であるポリペプチドを
含む。類似のポリペプチドは調製され得、このポリペプチドは、図９に示される
ような本発明のａｔｔＢ２ポリペプチド、ａｔｔＰ１ポリペプチド、ａｔｔＰ２
ポリペプチド、ａｔｔＬ１ポリペプチド、ａｔｔＬ２ポリペプチド、ａｔｔＲ１
ポリペプチド、およびａｔｔＲ２ポリペプチドに対して、少なくとも約６５％同
一、より好ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少な
くとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少な
くとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少な
くとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。本発明のポリペプ
チドはまた、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５アミノ酸を有する、
上記に記載のポリペプチドの一部またはフラグメントを含む。

【０１７５】 本発明の所与のポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例え
ば、６５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチ
ド配列が、本発明の所与のポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸
当たり３５アミノ酸までの変化を含み得ること以外、ポリペプチドのアミノ酸配
列が、この参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸
配列と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために
、参照配列中に３５％までのアミノ酸残基が、失欠されるか、または別のアミノ
酸で置換され得るか、あるいは、参照配列中の総アミノ酸残基の３５％までの多
数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。この参照配列のこれらの変化は、
参照アミノ酸配列のアミノ（−Ｎ）末端または炭素（Ｃ−）末端位置、あるいは
、それらの末端位置間ならどこでも発生し得、参照配列または参照配列内の１以
上の連続基中のいずれか残基内で個々に分散される。実際の手段として、所与の
アミノ酸が、本発明の所与のポリペプチドのアミノ酸配列と、例えば、少なくと
も６５％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム（核酸配列同一
性の決定のための上記のプログラム）を慣用的に使用してか、またはより好まし
くは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を使
用して決定され得る。

【０１７６】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルまたはモレキュラーシーブゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして使用さ
れ得る。さらに、以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドを使用
して、タンパク質の発現、局在化、他の分子との相互作用を検出するため、また
は本発明のポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を単離するための種々のア
ッセイに有用であるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する。

【０１７７】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ含有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供し、これは、本発明の１以上のポリペプ
チドに対して特異的に結合する抗体（特にモノクローナル抗体）を産生するため
に使用され得る。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチド
の免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」
は、全タンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部と
して規定される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の少数の遺伝子座に限
定されると考えられている。一方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は
、「抗原エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、
抗原エピトープの数より一般に少ない（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を
参照のこと）。

【０１７８】 抗原性エピトープを含有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択について、タンパク質配列の一
部を擬態する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に擬態されたタンパク質
と反応する抗血清を誘発し得ることが周知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ
，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照の
こと）。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列
で頻繁に表現され、これらは、一連の単純な化学的ルールによって特徴付けされ
得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピト
ープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端に限定されない。極度に疎水性
であるペプチドおよび６以下の残基のペプチドは、一般に、擬態タンパク質に結
合する誘発抗体で効果的ではなく；より長いペプチド、特にプロリン残基を含む
ペプチドが、通常効果的である（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３））。

【０１７９】 上記のガイドラインに従ってデザインされた本発明のエピトープ含有ペプチド
およびポリペプチドは、好ましくは、少なくとも５つの配列を含み、より好まし
くは、少なくとも７つ以上のアミノ酸を本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内
に含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きな部分を含み
、約３０〜約５０個のアミノ酸、またはそれまでの任意の長さを含み、そして本
発明の所与のポリペプチドの総アミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチ
ドがまた、本発明のエピトープ含有ペプチドまたはポリペプチドと考えられ、そ
してまた擬態タンパク質と反応する誘導抗体に対して有用である。好ましくは、
エピトープ含有タンパク質のアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提
供するように選択される（すなわち、この配列は、比較的親水性の残基を含み、
そして高く疎水性の配列が、好ましくは、避けられる）；プロリン残基を含む配
列が、特に好ましい。

【０１８０】 本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するために使用され得る、
エピトープ含有ポリペプチドまたはペプチドの非制限例としては、本発明の１以
上の組換え部位コード核酸分子を含む、ポリヌクレオチドによってコードされた
アミノ酸配列を含むポリペプチドの特定のエピトープ含有領域（これらには、図
９に記載されるヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１
、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２（または
これらに相補的なヌクレオチド配列）をコードするものが挙げられる）；本明細
書中に記載される寄託されたクローン中に含まれる、ポリヌクレオチドの３つの
リーディングフレームによってコードされる完全なアミノ酸配列；ならびに図９
に記載される本発明の組換え部位領域（またはその一部）をコードするヌクレオ
チド配列（またはそれに相補的な核酸配列）を有するポリヌクレオチドに対して
、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドの全てのリーディングフレームによってコードされたアミノ酸配列
が挙げられる。本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するために使
用され得る、他のエピトープ含有ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、ＰＲ
ＯＴＥＡＮコンピュータソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ；Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用する本発明のポリペプチドの、Ｋｙｔｅ−Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ疎水性およびＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックスプロッ
トの構築を介して、本明細書中に記載される本発明のポリペプチドの一次アミノ
酸配列に基づく当業者に理解される。

【０１８１】 本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を
使用する組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製するために任意
の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ含有アミノ酸配列
は、組換え体の産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための
免疫化の間に、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る
。エピトープ含有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得
る（例えば、米国特許第４，６３１，２１１号、およびＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．
Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１
３５（１９８５）（これらの両方は、本明細書中でその全体が参考として援用さ
れる）を参照のこと）。

【０１８２】 当業者は、本名発明のポリペプチドおよびそのエピトープ含有フラグメントが
、当該分野で周知でかつ慣用の技術によって、支持体上で免疫化され得ることを
理解する。「固体支持体」とは、ペプチドが免疫化され得る任意の固体支持体を
意味する。このような固体支持体としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天
、デンプン、ナイロン、ビーズおよびマイクロタイタープレート。固体支持体へ
の本発明のペプチドの結合は、支持体にポリペプチドの１端または両端を結合す
ることによって達成され得得る。結合は、ペプチドの１以上の内部部位でさなれ
得る。多結合（ペプチドの内部と端部の両方）は、本発明に従って使用され得る
。アミノ酸連結基（例えば、一次アミノ酸、カルボキシル基、またはスルフヒド
リル（ＳＨ）基）を介してか、または化学連結基（例えば、スペーサを介する臭
化シアン（ＣＮＢｒ）連結を用いる）によって結合され得る。支持体への非共有
結合のために、ペプチドに親和性標識配列の付加には、例えば、ＧＳＴ（Ｓｍｉ
ｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９
８８））、ポリヒスチジン（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
．４１１：７７（１９８７））、またはビオチンが使用され得る。このような親
和性標識は、ペプチドの支持体への可逆的な結合のために使用され得る。このよ
うな免疫化ポリペプチドまたはフラグメントは、例えば、以下に記載されるよう
な、本発明の１以上のポリペプチド、あるいは本発明の１以上のポリペプチドに
結合する他のタンパク質またはペプチドを認識する他のタンパク質またはペプチ
ドに対して指向される抗体を単離のに有用であり得る。

【０１８３】 当業者がまた理解するように、本発明のポリペプチドおよび本明細書中に記載
されるそれらのエピトープ含有フラグメントは、１以上の融合パートナータンパ
ク質またはペプチド、あるいはその一部と組み合わされ得、これらには、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：ＧＳＴ、Ｈｉｓ₆、Ｔｒｘおよびイムノグ
ロブリン（Ｉｇ）の定常ドメインの一部、得られた化学的ポリペプチドまたは融
合ポリペプチド。これらの融合ポリペプチドは、分析フォーマットまたは診断フ
ォーマット（ハイスループットを含む）での使用のための本発明のポリペプチド
の精製（ＥＰ ０ ３９４ ８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３３１：８４−８６（１９８８））を容易にする。

【０１８４】 （抗体） 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチド（またはそのエピトープ
含有フラグメント）あるいは核酸分子（またはその一部）を認識およびそれらと
結合する抗体に関する。関連する局面において、本発明は、１以上の組換え部位
核酸配列またはその一部の全リーディングフレームによってコードされる１以上
のポリペプチドを認識およびそれらと結合する抗体、あるいは１以上の組換え部
位核酸配列またはその一部を含む、１以上の核酸分子に関し、これらとしては、
ａｔｔ部位（ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、
ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２などを含む）、ｌｏｘ部位（例えば、ｌｏ
ｘＰ、ｌｏｘＰ５１１など）、ＦＲＴなど、またはそれらの変異体（ｍｕｔａｎ
ｔ）、フラグメント、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）および誘導体が挙げられるが、
これらに限定されない。一般に、米国特許第５，８８８，７３２号（これは、本
明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。本発明の抗体は、
ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして当該分野で周知の方法に
従って、任意の種々の方法および種々の種によって調製され得る。例えば、米国
特許第５，５８７，２８７号；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：
７６７（１９８４）；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本明細書中に記載の
ポリペプチドまたは核酸分子のいずれかに特異的な抗体（例えば、組換え部位核
酸配列、あるいは本明細書中に記載されるか、または寄託されたクローンに含ま
れる、１以上の核酸分子によってコードされる１以上のポリペプチドに特異的に
結合する抗体）、融合ポリペプチドに対する抗体（例えば、本明細書中に記載さ
れるような本発明の、１以上の融合パートナータンパク質と１以上の組換え部位
ポリペプチドとの間の融合ポリペプチドに結合する抗体）などは、本発明のイン
タクトなポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらの１以上の抗原
性ポリペプチドフラグメントに対して産生され得る。

【０１８５】 本明細書において使用されるように、用語「抗体」（Ａｂ）は、以下に記載さ
れるような特別の内容を除いて、用語「ポリクローナル抗体」または「モノクロ
ーナル抗体」（ｍＡｂ）と交換可能に使用され得る。本明細書に使用されるよう
に、これらの用語は、インタクトな分子および抗体フラグメント（例えば、Ｆａ
ｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのような）を含むことを意味し、これらは
、本発明のポリペプチドまたは核酸分子、あるいはそれらの一部と特異的に結合
し得る。従って、本発明のインタクトな抗体に加えて、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂
および本明細書中に記載される抗体の他のフラグメント、ならびに本発明の１以
上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する他のペプチドおよびペプチ
ドフラグメントもまた、本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。こ
のような抗体フラグメントは、代表的に、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生
する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを産生する）のような酵素
を使用する、インタクトな抗体のタンパク質分解によって産生される。抗体フラ
グメント、およびペプチドまたはペプチドフラグメントもまた、組換えＤＮＡ技
術の適用または合成化学を通じて産生され得る。

【０１８６】 本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチド、ならびにそれらの核酸
分子またはそれらの一部を使用して、本明細書中に一般に記載されるように、当
該分野で周知の方法に従って、抗体を誘導し得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ
ら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。

【０１８７】 本発明のこの局面に従ったポリクローナル抗体は、本明細書中に記載される本
発明のポリペプチドまたは核酸分子あるいは標準技術に従ったそれらのタンパク
質の１以上で、動物を免疫化することにより作製され得る（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．
およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｋａ
ｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎ
ｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
４６８〜４６９頁（１９９５）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたは核
酸分子あるいはそれらのタンパク質を認識およびそれらと結合する抗体を産生す
るために、動物を、遊離ペプチドまたは遊離核酸分子で免疫化し得るが；ペプチ
ドを高分子キャリア（例えば、アルブミン、ＫＬＨ、または破傷風トキソイド（
特に、本発明の核酸分子またはそのタンパク質に対する抗体を産生するため；Ｈ
ａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（前出）、１５４頁を参照のこと））、あるいは
固相キャリア（例えば、ラテックスまたはガラスミクロビーズ（ｇｌａｓｓ ｍ
ｉｃｒｏｂｅａｄ）に結合することによって、抗体価が、ブーストされ得る。例
えば、システインを含むペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアに連
結され得る。一方で他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなさらなる一般
的な連結剤を使用してキャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスの
ような動物は、例えば、約１００μｇのペプチド、ポリヌクレオチド、またはキ
ャリアタンパク質、およびＦｒｅｕｎｄアジュバンドを含むエマルジョンの腹腔
内注射および／または皮内注射によって、遊離のペプチドまたは核酸分子（ポリ
ペプチド免疫原が、約２５アミノ酸より長い場合）あるいはキャリアに結合した
ペプチドまたは核酸分子のいずれかで免疫化され得る。例えば、固体支持体に吸
収された遊離ペプチドまたは核酸分子を使用するＥＬＳＡアッセイによって、検
出され得る抗体の有用な滴定量を提供するために、いくらかのブースター注射が
、例えば、約２週間おきに必要とされ得る。別のアプローチにおいて、本発明の
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドあるいはそれらの抗原性フラグメントの１
以上を発現する細胞は、慣用の免疫学的な方法に従って、ポリクローナル抗体を
含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。さらに別の方法におい
て、本発明の１以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調製は、本明細書
中に記載されるように調製および精製され、天然の汚染物を実質的に含まなくさ
せる。次いで、このような調製物は、より高い特異的活性のポリクローナル抗血
清を産生するために動物に導入され得る。使用される免疫化の方法に関係なく、
免疫化動物の血清中の抗体価は、抗ペプチドまたは抗ポリヌクレオチド抗体の選
択によって（例えば、固体支持体上でのペプチドまたはポリヌクレオチドの吸着
および当該分野で周知の方法に従って選択された抗体の溶出によって）増加され
得る。

【０１８８】 代替の方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または本発明の
１以上のポリペプチドに結合したそのフラグメント）である。このようなモノク
ローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６
：４９５（１９７５）：Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５
１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２
（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，
Ｎ．Ｙ．５６３〜６８１頁（１９８１））を使用して調製され得る。一般に、こ
のような手順は、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド（またはそれ
らのフラグメント）、あるいは本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド
（またはそれらのフラグメント）を発現する細胞で、動物（好ましくは、マウス
）を免疫化する工程を含む。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な
骨髄腫と融合する。本発明に従って任意の適切な骨髄腫細胞株が使用されるが；
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ₂Ｏを使
用することが、好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞がＨＡＴ培地中
で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌ．８０：
２２５−２３２（１９８１））によって記載されるような希釈法に限定すること
によってクローンされる。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリド
ーマ細胞をアッセイして、本発明のポリペプチドまたは核酸分子あるいはそれら
のフラグメントの１以上と結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する。従っ
て、本発明はまた、特に、本発明のポリペプチドまたは核酸分子の１以上を認識
およびこれらと結合する、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞および細胞株を産生する。

【０１８９】 あるいは、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントの１以上と結合し得
るさらなる抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて２工程の手順で産生さ
れ得る。このような方法は、抗体自体が抗原であり、従って、第２の抗体と結合
する抗体を得ることが可能であるという事実を用いて成される。この方法に従っ
て、上記で調製されるように、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの
１以上に対して特異的である抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫化する
ために使用される。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドー
マ細胞を産生し、そして本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの１以上
に対して特異的に抗体と結合し得る、抗体を産生するクローンを同定するために
分泌され得るこのハイブリドーマ細胞は、本発明自体のポリペプチドによって阻
害され得る。このような抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の１以上を認識する抗体に対して、抗イディオタイプ抗体を含み、そして本発明
のポリペプチドまたはポリペプチドの１以上に対して特異的なさらなる抗体の形
成を誘導するように、動物を免疫化するために使用され得る。

【０１９０】 使用のために、本発明の抗体は、必要に応じて、１以上の標識と共有結合また
は非共有結合で検出可能に標識化され得、これらとしては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：色素生産性試薬、酵素学的試薬、ラジオアイソトープ
試薬、同位体試薬、蛍光性試薬、毒性試薬、化学ルミネセンス試薬、または核磁
気共鳴定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）試薬または他の標識。

【０１９１】 適切な酵素ラベルの例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレ
アーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ
、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイ
ソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、
グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミ
ラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。

【０１９２】 適切な放射性同位体ラベルの例には、³Ｈ、¹¹¹Ｉｎ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵ Ｓ、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｔｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁵²Ｅｕ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃｕ
、²¹⁷Ｃｉ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁰⁹Ｐｄなどが挙げられる。¹¹¹Ｉｎは
、好ましい同位体であり、ここで、これは、肝臓による¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉラベル
化モノクロナール抗体の脱ハロゲン化の問題が回避されるために、インビボ画像
化において使用される。さらに、この放射性ヌクレオチドは、画像化のためのよ
り好ましいγ放射を有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ
．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチ
オシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを有するモノクロナール抗体に結合された^{11 1} Ｉｎは、非腫瘍組織（特に、肝臓）内への取り込みをほとんど示さず、そして
それによって、腫瘍限局化の特異性を増強し得る（Ｅｓｅｂａｎら，Ｊ．Ｎｕｃ
ｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。

【０１９３】 適切な非放射性同位体ラベルに例には、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｔｒお
よび⁵⁶Ｆｅが挙げられる。

【０１９４】 適切な蛍光ラベルの例には、¹⁵²Ｅｕラベル、フルオレセインラベル、イソチ
オシアネートラベル、ローダミンラベル、フィコエリトリンラベル、フィコシア
ニンラベル、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）ラベル、
ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）ラベル、緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）ラベル、およびフルオレサミンラベルが挙げられる。

【０１９５】 適切な毒素ラベルの例には、ジフテリア毒素、リシン、およびクロレラ毒素が
挙げられる。

【０１９６】 化学発光ラベルの例には、ルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）ラベル、イソルミナル
ラベル、芳香族アクリジニウムエステルラベル、イミダゾールラベル、アクリジ
ニウム塩ラベル、シュウ酸エステルラベル、ルシフェラーゼラベル、およびエク
オリンラベルが挙げられる。

【０１９７】 核磁気共鳴コンストラスティング（ｃｏｎｓｔｒａｓｔｉｎｇ）剤の例には、
Ｇｄ、Ｍｎ、および鉄のような重金属核が挙げられる。

【０１９８】 上記のラベルを本発明の抗体に結合させるための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅ
ｄｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６）、および
Ｓｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７）
によって提供される。後者において言及されたカップリング技術は、グルタルア
ルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒ
ドロキシ−スクシンイミドエステル法であり、これらの方法の全ては、本明細書
中で参考として援用される。

【０１９９】 本発明の抗体は、あるいは、例えば、このような固体相−固定化された抗体を
使用して、クロマトグラフ手順および他の免疫学的手順を容易にするために、固
体支持体に結合され得ることが当業者によって理解される。このような手順の中
には、本発明の抗体の使用が含まれ、本発明の核酸分子によってコードされる１
つ以上のエピトープを含むポリペプチド（これは、融合されたポリペプチドであ
り得るか、または本明細書中に記載される本発明の他のポリペプチドであり得る
）を単離するか、精製し、あるいは本発明の１つ以上の組換え部位配列またはそ
の一部分を含むポリヌクレオチドを単離するかまたは精製する。アフィニティー
クロマトグラフィーにより、例えば、固相支持体に結合される本発明の抗体を使
用する、ポリペプチド（そして、アナログ、ポリヌクレオチドによる）の単離お
よび精製のための方法は、当該分野で周知であり、そして当業者に知られている
。本発明の抗体をまた他の適用に使用して、例えば、１つ以上のタンパク質、ポ
リペプチド、ポリヌクレオチドを、構造的および／または機能的複合体へ架橋ま
たは結合し得る。１つのこのような使用において、本発明の抗体は、２つ以上の
個別のエピトープ結合領域を有し得、この領域は、例えば、抗体上の１つのエピ
トープ結合領域で第１のポリペプチド（これは、本発明のポリペプチドであり得
る）に結合し得、そして抗体上の第２のエピトープ結合領域で第２のポリペプチ
ド（これは、本発明のポリペプチドであり得る）を結合し得、それによって、第
１および第２のポリペプチドを互いに接近した近位にもたらし、その結果、第１
および第２のポリペプチドは、構造的におよび／または機能的に相互作用し得る
（例えば、酵素とその基質を連結して、酵素触媒を実施するか、またはエフェク
ター分子とそのレセプターを連結して、エフェクター分子のレセプターへの特異
的結合、あるいはレセプターによって媒介されるエフェクター分子に対する応答
を実施するか、または誘起する）。本発明の抗体についてのさらなる適用は、例
えば、固体支持体上での本発明の抗体、ポリペプチド、または核酸分子の大規模
なアレイの作製を含み、これによって、例えば、タンパク質の高スループットス
クリーニング、または本発明の核酸分子を含む宿主細胞によるＲＮＡ発現が容易
になる（当該分野で、「チップアレイ」プロトコールとして公知である；例えば
、米国特許第５，８５６，１０１号、同第５，８３７，８３２号、同第５，７７
０，４５６号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６３１，７３４号および同
第５，５９３，８３９号を参照のこと。これらは、ポリペプチド（抗体を含む）
およびポリヌクレオチドのチップアレイの作製および使用に関し、そしてこれら
の開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。「固体支持体」は
、抗体が固定化され得る任意の固体支持体を意図する。このような固体支持体に
は、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル
クロリド、ポリカルボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズおよびマイクロタイタ
ープレートが挙げられるが、これらに限定されない。ガラスから作製されたビー
ズ、ラテックスまたは磁気物質が好ましい。本発明の抗体の固体支持体への連結
は、支持体に抗体の一方または両方の末端を付着させることによって達成される
。付着はまた、抗体の１つ以上の内部部位でなされ得る。複数の付着（抗体の内
部および末端で）もまた、本発明に従って、使用され得る。付着は、アミノ酸連
結基（例えば、第１級アミン、カルボキシル基、スルヒドリル（ＳＨ）基）を介
し得るか、またはスペーサーを介するブロモシアン（ＣＮＢｒ）連結のような化
学連結基により得る。非結合的な付着において、ペプチド（例えば、ＧＳＴ（Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｄ．ＢおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ ６７：３１（１
９８８））、ポリヒスチジン（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇ．４１１：７７（１９８７））またはビオチン）に対する親和性タグ配列の添
加が使用され得る。あるいは、付着は、本発明の抗体（例えば、プロテインＡま
たはプロテインＧ）のＦｃ領域に結合するリガンドを使用することによって、達
成され得る。このような親和性タグは、抗体の支持体への可逆的な付着のために
使用され得る。ペプチドはまた、特異的リガンド−レセプター相互作用を介して
、または当業者に知られているファージディスプレイ方法論を使用して、本発明
のポリペプチドまたはそのフラグメントに結合するそれらの能力について認識さ
れ得る。

【０２００】 （キット） 別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、
宿主細胞、および抗体を作製する際に、そして組換えクローニング法において、
使用され得る。本発明のこの局面に従うキットは、１つ以上の容器を含み得、こ
の容器は、本発明の核酸分子、プライマー、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞
、または抗体の１以上を含み得る。特に、本発明のキットは、以下からなる群か
ら選択される１つ以上の成分（またはそれらの組み合わせ）を含み得る：１つ以
上の組換えタンパク質（例えば、Ｉｎｔ）または補助因子（例えば、ＩＨＦおよ
び／またはＸｉｓ）あるいはそれらの組み合わせ、１つ以上の組換えタンパク質
または補助因子またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の組成物（例えば、Ｇ
ＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ ＭｉｘまたはＧＡＴ
ＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）、１つ以上の目
的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）分子（本明細書中で記載
されるものを含む）、１つ以上のエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ
）またはエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）分子（本明細書中で
記載されるものを含む）、１つ以上のプライマー核酸分子（特に、本明細書中に
記載されるもの）、１つ以上の宿主細胞（例えば、コンピテント細胞（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）、酵母細胞、動物細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞
、鳥類細胞、魚類細胞などを含む）、植物細胞、および最も特に、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＢ３、ＤＢ３．１（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩ
ＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１^TM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｄ
Ｂ４およびＤＢ５；米国仮出願第６０／１２２，３９２号（１９９９年３月２日
提出）および対応する米国実用出願 （Ｈａｒｔｌｅｙら、「Ｃ
ｅｌｌｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｔｏｘｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ
Ｔｈｅｒｅｏｆ」（本願と同日））、これらの開示は、その全体が本明細書中で
参考として援用される）など。関連した局面において、本発明のキットは、１つ
以上の組換え部位またはその部分をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、本
発明の１つ以上の組換え部位（または、その部分）をコードするヌクレオチド配
列を含む１つ以上の核酸分子）、および特に、本明細書に記載される寄託された
クローンに含まれる核酸分子の１つ以上を含み得る。本発明のこの局面に従うキ
ットはまた、本発明の１つ以上の単離された核酸、本発明の１つ以上のベクター
、本発明の１つ以上のプライマー核酸分子、および／または本発明の１つ以上の
抗体を含み得る。本発明のキットは、さらに、核酸分子、ポリペプチド、ベクタ
ー、宿主細胞、または本発明の抗体との組合せにおいて有用な１つ以上のさらな
る成分を含む１つ以上のさらなる容器を含み得、このさらなる成分には、１つ以
上の緩衝液、１つ以上の洗剤、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペ
プチド、逆トランスクリプターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以
上のトランスフェクション試薬、１つ以上のヌクレオチドなどを含み得る。この
ようなキットは、本発明の核酸分子、プライマー、べクター、宿主細胞、ポリペ
プチド、抗体および組成物を有利に使用する任意のプロセスにおいて使用され得
る（例えば、核酸分子を合成する方法において（例えば、ＰＣＲのような増幅を
介して）、核酸分子をクローニングする方法において（好ましくは、本明細書に
記載される組換えクローニングを介して）など）。

【０２０１】 （組換えクローニングシステムの最適化） 組換えクローニングの方法における、本発明の核酸分子、または核酸分子を含
むベクターの有用性は、多くのアッセイ方法の任意の１つによって決定され得る
。例えば、本発明のエントリー（Ｅｎｔｒｙ）および目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉ
ｏｎ）ベクターは、機能するそれらの能力（すなわち、核酸分子、ＤＮＡセグメ
ント、遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはクローニングベクターから発現ベクター（Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）までのライブラリーの転移を媒介する）に
ついて、組換えクローニング反応を実施することによって評価され得る。この組
換えクローニング反応は、以下の実施例に詳細に記載され、そして米国出願第０
８／６６３，００２号（１９９６年６月７日に提出）（現在、米国特許第５，８
８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日提出）
、同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日提出）、および同第６
０／１０８，３２４号（１９９８年１１月１３日提出）に記載される。これらの
開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。あるいは、本発明に従
って作製されるエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）および目的ベ
クター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）の機能性は、これらのベクタ
ーの共挿入分子を組換えそして作り出す能力、または目的の核酸分子を転移させ
る能力を、以下の実施例１９に詳細に記載されるようなアッセイを使用して、評
価され得る。同様に、１つ以上の組換えタンパク質またはその組み合わせを含む
組成物（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ
ＭｉｘおよびＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉ
ｘ）の処方は、以下の実施例１８に記載されるようなアッセイを使用して最適化
され得る。

【０２０２】 （用途） 本発明の組成物、方法およびキットについての多くの適用が存在する。これら
の用途は、以下を含むが、それらに限定されない：ベクターを変更すること、遺
伝子産物を細胞内の位置に標的化すること、所望のタンパク質から融合タグを切
断すること、目的の核酸分子を調節遺伝配列（例えば、プロモーター、エンハン
サーなど）に操作可能に連結すること、融合タンパク質のための遺伝子を構築す
ること、コピー数を変更すること、レプリコンを変更すること、ファージにクロ
ーニングすること、ならびに、例えば、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤ
ＮＡをクローニングすること。さらに、本発明の核酸分子、ベクター、および宿
主細胞は、核酸分子によってコードされるポリペプチドの産生において、このよ
うなポリペプチドに対する抗体の産生において、所望の核酸配列の組換えクロー
ニングにおいて、そして本発明の核酸分子、ベクター、および宿主細胞の使用に
よって増強され得るか、または容易にされ得る他の適用において、使用され得る
。

【０２０３】 特に、本発明の核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、抗体およびキ
ットは、１つ以上の所望の核酸分子、またはＤＮＡセグメント（例えば、１つ以
上の遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリー）を、クローニングベク
ター（Ｖｅｃｔｏｒ）または発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏ
ｒ）に転移させる方法において使用され得、このクローニングＶｅｃｔｏｒまた
は発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）は、所望の核酸分子ま
たはＤＮＡセグメントのクローニングまたは増幅、またはそれらによってコード
させるポリペプチドの発現における使用のためのさらなる宿主細胞の形質転換に
おいて使用される。本発明の核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を有利に使用し
得るこのような組換えクローニング方法は、以下の実施例、および共有にかかる
米国出願第０８／４８６，１３９号（１９９５年６月７日に提出）、米国出願第
０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日に提出）（現在、米国特許第５，
８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日提出
）、同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日提出）、および同第
６０／１０８，３２４号（１９９８年１１月１３日提出）に詳細に記載され、こ
れらの全ての開示が、本明細書中でその全体が参考として援用される。

【０２０４】 本明細書に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適応は、
当業者に公知の情報の観点から本明細書中に含まれる発明の説明から容易に明ら
かであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく
なされ得ることが、関連分野の当業者によって理解される。ここで、本発明を詳
細に説明することは、本発明が、以下の実施例に対する参考によってより明確に
理解され、この実施例は、本明細書中で、例示のみの目的のために含まれ、そし
て本発明を制限することを意図しない。

【０２０５】 （実施例） （実施例１：バクテリオファージλの組換え反応） Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージλは、溶解ファージとして増殖し得、この場
合、宿主細胞は溶解し、子孫ウイルスを放出する。あるいは、λは、溶原化と呼
ばれるプロセス（図６０を参照のこと）によってその宿主のゲノムに組み込む。
この溶原状態において、ゲノムからのその切除を引き起こす条件が起こるまで、
ファージゲノムは、多くの世代において、娘細胞に伝えられ得る。この点で、ウ
イルスは、そのライフサイクルの溶解部に入る。溶解経路と溶原経路との間の切
換の制御は、分子生物学において、最も理解されたプロセスである（Ｍ．Ｐｔａ
ｓｈｎｅ、Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｗｉｔｃｈ、 Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ、１９
９２）。

【０２０６】 インビトロで実施される、λの組み込み的および切断的組換え反応は、本発明
の組換えクローニングシステムの基礎である。これらは、以下のように模式的に
表現され得る。

【０２０７】

【化１７】 ４つのａｔｔ部位は、反応を媒介するタンパク質のための結合部位を含む。野
生型ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ部位は、それぞれ約２４３
、２５、１００、および１６８塩基対を含む。

【０２０８】

【化１８】 反応（明細書中以下、「ＢＰ反応」といわれるか、あるいは、「エントリー（Ｅ
ｎｔｒｙ）反応」または「Ｇａｔｅｗａｙ反応」と等価である）は、タンパク質
ＩｎｔおよびＩＨＦによって媒介される。

【０２０９】

【化１９】 反応（本明細書中以下、「ＬＢ」反応といわれるが、あるいは、「目的（Ｄｅｓ
ｔｉｎａｔｉｏｎ）反応」と等価である）は、タンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦおよび
Ｘｉｓによって媒介される。Ｉｎｔ（インテグラーゼ）およびＸｉｓ（切出し酵
素）は、λゲノムによってコードされるが、ＩＨＦ（組込み宿主因子）は、Ｅ．
ｃｏｌｉタンパク質である。λ組換えの一般的な総説については、Ａ．Ｌａｎｄ
ｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９（１９８９）を参
照のこと。

【０２１０】 （実施例２：組換えクローニング系の組換え反応） ＬＲ反応−−エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）から目的ベクタ
ー（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）へのＤＮＡセグメントの交換−−
は、λ切断反応のインビトロバージョンである：

【０２１１】

【化２０】 この配置についての実施上の規則が存在する：ＬＲ反応後、本方法の１つの配
置において、ａｔｔ部位は、通常、機能的モチーフ（例えば、プロモーターまた
は融合タグ）を発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）中の目的の
核酸分子から分離し、そして２５ｂｐのａｔｔＢ部位は、ａｔｔＰ部位、ａｔｔ
Ｌ部位、およびａｔｔＲ部位よりもさらに小さい。

【０２１２】 組換え反応は保存性であること（すなわち、塩基対の正味の合成または損失は
存在しないこと）に留意のこと。組換え部位に隣接するＤＮＡセグメントは、ま
れにしか切り換えられない。野生型λ組換え部位を、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMクローニ
ングシステムの目的のために、以下のように修飾する： 特定の好ましい目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を作
製するために、ａｔｔＲの一部（４３ｂｐ）を除去して、切除反応を不可逆かつ
より効率的にした（Ｗ．Ｂｕｓｈｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９０６，
１９８５）。本発明の好ましい目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃ
ｔｏｒ）中のａｔｔＲ部位は、１２５ｂｐ長である。ａｔｔ部位のコア領域に、
以下の２つの理由のために変異を作製した：（１）終止コドンを除去するため、
および（２）組換え反応の特異性を確実にするため（すなわち、ａｔｔＲ１は、
ａａｔＬ１とのみ反応し、ａｔｔＲ２はａｔｔＬ２とのみ反応する、などである
）。

【０２１３】 他の変異を、ａｔｔＢ部位の１５ｂｐのコア領域に隣接する短い（５ｂｐ）領
域中に導入して、一本鎖型のａｔｔＢプラスミド（例えば、ファージミドｓｓＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡ）における二次構造形成を最小化した。目的ベクター（Ｄｅ
ｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした後の目的の核酸分子の
左および右へのａｔｔＢ１およびｓｔｔＢ２の配列を、図６に示す。

【０２１４】 図６１は、エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）および目的ベクタ
ー（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）が、ＬＲ反応において、いかにし
て組換えられて共組込み体（これは、２つの娘分子への第２の反応を通して分か
れる）を形成するかを例証する。２つの娘分子は、その対合の部位に関わらず同
一の一般的構造を有し、ａｔｔＬ１およびａｔｔＲ１またはａｔｔＬ２およびａ
ｔｔＲ２が、最初に反応して共組込み体を形成する。これらのセグメントは、親
の分子が両方とも環状であるか、一方が環状でありもう一方が線状であるか、ま
たは両方とも線状であるかに関わらず、これらの反応によってパートナーを交換
する。この実施例において、Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（これは、
死遺伝子ｃｃｄＢをもまた保有する）に保有されるアンピシリン耐性についての
選択は、所望のａｔｔＢ産物プラスミドについてのみ選択するための手段を提供
する。

【０２１５】 （実施例３：組換えクローニングシステムにおけるタンパク質発現） タンパク質は、インビボにおいて結果として２つのプロセス（転写（ＤＮＡか
らＲＮＡ）、および翻訳（ＲＮＡからタンパク質））から発現される。原核生物
および真核生物におけるタンパク質発現の説明についは、以下の実施例１３を参
照のこと。多くのベクター（ｐＵＣ、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＧｅｍ）は、青
白スクリーニング（ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）をするために
、転写されるｌａｃＺ遺伝子の妨害を使用する。これらのプラスミド、および多
くの発現ベクターは、クローン化された遺伝子の発現を制御するためにｌａｃプ
ロモーターを使用する。このｌａｃプロモーターからの転写は、誘導因子（ｉｎ
ｄｕｃｅｒ）ＩＰＴＧを添加することにより始動される。しかし、低レベルのＲ
ＮＡが、誘導因子の非存在下において生成される。すなわち、ｌａｃプロモータ
ーは、決して完全にオフの状態にあるというわけではない。この「漏洩」の結果
は、Ｅ．ｃｏｌｉに対してその発現が有害である遺伝子を、ｌａｃプロモーター
を含むベクターにクローニングすることが困難または不可能であることを証明し
得るか、あるいはそれらの遺伝子が不活性変異体としてのみクローン化され得る
ということである。

【０２１６】 他の遺伝子発現系とは対照的に、エントリベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏ
ｒ）にクローン化された核酸分子は、発現されないように設計され得る。ａｔｔ
Ｌ１部位のちょうど上流にある強力な転写終結因子ｒｒｎＢ（Ｏｒｏｓｚら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：６５３、（１９９１））の存在が、そのベ
クタープロモーター（薬剤耐性および複製起点）からの転写がクローン化された
遺伝子に到達しないようにしている。しかし、有毒遺伝子を目的ベクター（Ｄｅ
ｓｔｉｎａｔｏｉｎ Ｖｅｃｔｏｒ）にクローン化する場合、宿主は、ちょうど
他の発現系と同じように、不調をきたし得る。しかし、インビトロ組換えによる
サブクローニングの信頼性は、これが生じたことを認識することをより容易にし
、そして必要な場合、本発明の方法に従って別の発現オプションを試みることを
より容易にする。

【０２１７】 （実施例４：正しいエントリベクターの選択） 最良のベクターを選択する際になされなければならない２種類の選択が存在し
、（１）クローン化されるべき特定のＤＮＡフラグメントによって指図される選
択および（２）クローン化されたＤＮＡフラグメントを用いて達成される選択で
ある。これらの因子は、使用されるエントリベクターの選択において重要である
。なぜなら、所望される目的の核酸分子が、そのエントリベクターから目的ベク
ターに移動される場合、目的の核酸分子と、ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２（例え
ば図６において）のＩｎｔ切断部位との間の全ての塩基対が、同様に目的ベクタ
ーに移動する。目的ベクターに移動する結果として発現されないゲノミックＤＮ
Ａについて、これらの決定は、重要ではない。

【０２１８】 例えば、特定の翻訳開始シグナルを有するエントリベクターを使用する場合、
それらの配列は、所望の目的の核酸分子に対するアミノ末端融合が成されれば、
アミノ酸に翻訳される。所望の目的の核酸分子が、融合タンパク質、ネイティブ
タンパク質もしくは両方として発現される得るか否かは、翻訳開始配列がクロー
ン（ネイティブタンパク質）のａｔｔＢ部位の間に含まれなければならないか、
あるいは目的ベクター（融合タンパク質）によって供給されなければならないか
否かを指図する。特に、翻訳開始配列を含むエントリベクターは、これら部位に
おける翻訳の内部開始がＮ末端融合タンパク質の収率を減少させ得るので、融合
タンパク質の作製についてはあまり適切でないことを証明し得る。本発明の、組
成物および方法によって提供されるこれらの２つの型の発現を、図６２に例示す
る。

【０２１９】 エントリベクターは、おそらく、全ての用途について最適ではない。目的の核
酸分子が、任意のいくつかの最適なエントリベクターにクローン化され得る。

【０２２０】 １つの例として、ｐＥＮＴＲ７（図１６）およびｐＥＮＴＲ１１（図２０）を
考慮すると、これらは、以下を含むが、これらに限定されない種々の用途におい
て有用である： ・ほとんどの市販のライブラリーに由来するクローニングｃＤＮＡ。ｃｃｄＢ死
遺伝子の左側および右側に対する部位を選択し、その結果、クローン化されるべ
きＤＮＡが２つ以上のこれらの制限部位を有しない場合に、方向性のクローニン
グが可能である。 ・方向的な遺伝子のクローニング：ｃｃＢの左側にＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｍ
ｎＩ（平滑（ｂｌｕｎｔ））、またはＫｐｎＩ；右側にＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、Ｘ
ｂａＩ、またはＥｃｏＲＶ（平滑）。 ・ＸｍｎＩ部位において、平滑アミノ末端を有する遺伝子または遺伝子フラグメ
ントのクローニング。ＸｍｎＩ部位は、真核生物発現のために最も好ましい６つ
の塩基のうちの４つを有し（例えば、以下の実施例１３を参照のこと）、その結
果クローン化されるべきＤＮＡの最初の３塩基は、ＡＴＧであり、オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）は、それが適切な目的ベクターで転写される場合、
真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞）において発現され
る。さらに、ｐＥＮＴＲ１１において、ＡＴＧにて原核生物宿主細胞（特に、細
菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））のタンパク質合成を開始させるために、Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を８ｂｐ上流に配置する。 ・高度に特異的なＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）を使用して、ア
ミノ末端融合物（例えば、Ｈｉｓ₆、ＧＳＴまたはチオレドキシン）を切断する
工程。目的の核酸分子を、平滑ＸｍｎＩ部位でクローン化する場合、ＴＥＶ切断
は、発現されたタンパク質のアミノ末端側に２つのアミノ酸を残す。 ・制限酵素およびリガーゼを用いるクローニングの間に、未切断エントリベクタ
ー分子または一本鎖切断エントリベクターに対して、選択する工程。ｃｃＢ遺伝
子が、二重消化で除去されない場合、ｃｃＢ遺伝子は、ｃｃＢに対して細胞を耐
性にする変異を含まない任意のレシピエントＥ．ｃｏｌｉ細胞を殺す（例えば、
１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照の
こと（この開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される））。 ・全てのクローニング部位において、ＯＲＦを有するアミノ融合物を産生させる
工程。ｃｃｄＢ遺伝子の上流（ａｔｔＬ１リーディングフレーム内）には終止コ
ドンは存在しない。 さらに、ｐＥＮＴＲ１１はまた、以下の用途において、有用である； ・開始ＡＴＧにおいてＮｃｏＩ部位を有するｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ部位へクロー
ニングする工程。ＸｍｎＩ部位と同様に、この部位は、真核生物発現のために最
も好ましい６塩基のうちの４つを有している。また、ＡＴＧにて原核生物宿主細
胞（特に、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））のタンパク質合成を開始させる
ために、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を８ｂｐ上流に配置する。 ・カルボキシ末端融合物に対するリーディングフレームコンベンション（ｃｏｎ
ｖｅｎｔｉｏｎ）と同じ位相で配置されるＯＲＦを有するカルボキシ融合タンパ
ク質を産生する工程。

【０２２１】 表１は、エントリベクターのいくつか非限定例、およびそれらの特徴をいくつ
か列挙しており、そして図１０〜２０は、それらのクローニング部位を示す。表
１に列挙される全てのエントリベクターは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから商業的に入手可能で
ある。本明細書中では特に列挙されない他のエントリベクター（代替的特徴また
はさらなる特徴を含む）を、本明細書中に含まれる開示を考慮すると、分子生物
学および細胞生物学の慣用的な方法を使用して、当業者は作製し得る。

【０２２２】

【表１】 エントリベクターｐＥＮＴＲ１Ａ（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ｐＥＮＴＲ２Ｂ
（図１１Ａおよび１１Ｂ）ならびにｐＥＮＴＲ３Ｃ（図１２Ａおよび１２Ｂ）は
、制限部位が、異なるリーディングフレーム内にあるということを除いて、ほと
んど同一である。エントリベクターｐＥＮＴＲ４（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ｐ
ＥＮＴＲ５（図１４Ａおよび１４Ｂ）、ならびにｐＥＮＴＲ６（図１５Ａおよび
１５Ｂ）は、平滑ＤｒａＩ部位が、ＡＴＧメチオニンコドンを含む部位で置換さ
れている以外は、本質的にｐＥＮＴＲ１Ａと同一である（ｐＥＮＴＲ４において
はＮｃｏＩ、ｐＥＮＴＲ５においてはＮｄｅＩ、およびｐＥＮＴＲ６においては
ＳｐｈＩ）。開始ＡＴＧにこれらの部位の一つを含む核酸分子が、これらのエン
トリベクター内に簡便にクローン化され得る。ｐＥＮＴＲ４のＮｃｏＩ部位は、
真核生物細胞における核酸分子の発現のために特に有用である。なぜなら、Ｎｃ
ｏＩ部位は、効率的な翻訳を提供する多くの塩基を含むからである（以下の実施
例１３を参照のこと）。（ｐＥＮＴＲ５のＮｄｅＩ部位へクローン化される目的
の核酸分子は、真核生物細胞において高度に発現され得るとは予期されない。な
ぜなら、開始ＡＴＧから−３位にあるシトシンは、真核生物遺伝子においてはめ
ったにないからである）。

【０２２３】 エントリベクターｐＥＮＴＲ７（図１６Ａおよび１６Ｂ）、ｐＥＮＴＲ８（図
１７Ａおよび１７Ｂ）、ならびにｐＥＮＴＲ９（図１８Ａおよび１８Ｂ）は、ａ
ｔｔＬ１部位とクローニング部位との間にＴＥＶプロテアーゼに対する認識部位
を含む。ＸｍｎＩ（平滑）、ＮｃｏＩ、およびＮｄｅＩに対する切断部位はそれ
ぞれ、これらのエントリベクターにおいて一番多い５’部位である。アミノ融合
物は、核酸分子がこれらのエントリベクターにクローン化される場合、効率的に
除去され得る。ＴＥＶプロテアーゼは、非常に活性であり、かつ高度に特異的で
ある。

【０２２４】 （実施例５：リーディングフレームの制御） クローン化される核酸分子の発現において最も用心しなければならない課題の
一つは、リーディングフレームが正確であることを確認することである（リーデ
ィングフレームは、融合物が２つのＯＲＦ（例えば、目的の核酸分子とＨｉｓ６
もしくはＧＳＴドメインとの間）の間で作製される場合、重要である）。本発明
の目的のために、以下のコンベンションを採用した：任意のエントリベクターに
クローン化されたＤＮＡのリーディングフレームは、図１６Ａ、ｐＥＮＴＲ７に
示されるａｔｔＢ１部位の位相と同じ位相でなければならない。ａｔｔＬ１部位
の６つのＡは、２つのリジンコドン（ａａａ ａａａ）に分割されるということ
に注意する。アミノ融合物を作製する目的ベクターを、このリーディングフレー
ムにａｔｔＲ１部位を入れるように構築した。また、カルボキシ末端融合物のた
めの目的ベクターを構築し、それらのベクターとしては、Ｈｉｓ₆（ｐＤＥＳＴ
２３；図４３）、ＧＳＴ（ｐＤＥＳＴ２４；図４４）、またはチオレドキシン（
ｐＤＥＳＴ２５；図４５）Ｃ末端融合配列を含むベクターが挙げられる。

【０２２５】 従って、目的の核酸分子をエントリベクターにクローン化し、その結果ａｔｔ
Ｌ１部位内のａａａ ａａａリーディングフレームが、核酸分子のＯＲＦと同じ
位相である場合、アミノ末端融合物が、全ての融合タグについて自動的に正確に
位相が等しくされる。これは、通常の場合を越える有意な改善であり、ここで各
々の異なるベクターは、異なる制限部位および異なるリーディングフレームを有
し得る。

【０２２６】 エントリベクターおよび目的ベクターの最も適切な組み合わせの選び方の実際
的な例については、実施例１５を参照のこと。

【０２２７】 （材料） 他に示されない限り、本明細書中に含まれる残りの実施例において、以下の
材料を使用した。 ５×ＬＲ反応緩衝液： ２００〜２５０ｍＭ（好ましくは、２５０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５ ２５０〜３５０ｍＭ（好ましくは、３２０ｍＭ）ＮａＣｌ １．２５〜５ｍＭ（好ましくは、４．７５ｍＭ）ＥＤＴＡ １２．５〜３５ｍＭ（好ましくは２２〜３５ｍＭおよび最も好ましくは３５ｍ
Ｍ） スペルミジン−ＨＣｌ １ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素混合物： ４μｌ当たりの１×ＬＲ反応緩衝液： １５０ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｉｎｔ（１９９８年１１月１３日に
出願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１
２日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考とし
て全体が援用される）を参照のこと） ２５ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｘｉｓ（１９９８年１１月１３日に出
願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１２
日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考として
全体が援用される）を参照のこと） ３０ｎｇ ＩＨＦ ５０％ グリセロール ５×ＢＰ反応緩衝液： １２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ １１０ｍＭ ＮａＣｌ ２５ｍＭ ＥＤＴＡ ２５ｍＭ スペルミジン−ＨＣｌ ５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素混合物： ４μｌ当たりの１×ＢＰ反応緩衝液： ２００ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｉｎｔ（１９９８年１１月１３日に
出願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１
２日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考とし
て全体が援用される）を参照のこと） ８０ｎｇ ＩＨＦ ５０％ グリセロール １０×クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）停止溶液： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ ２ｍｇ／ｍｌ プロティナーゼＫ （実施例６：ＬＲ（「目的」）反応） 目的の核酸分子（そしてこの核酸分子は、最終的にはこの核酸分子によりコー
ドされるポリペプチドの産生のために宿主細胞内に導入され得る）を含む新しい
発現クローンを作製するために、目的の核酸分子を含む、本明細書中に記載され
るように調製されるエントリクローンまたはベクターを、目的ベクターと反応さ
せる。本実施例において、ａｔｔＬ部位に隣接するβ−Ｇａｌ遺伝子を、エント
リクローンから目的ベクターに移動する。 必要とされる材料： ・５×ＬＲ反応緩衝液 ・目的ベクター（好ましくは、線状化された）、７５〜１５０ｎｇ／μｌ ・目的の核酸分子を含む、エントリクローン、８μｌ以下のＴＥ緩衝液中１００
〜３００ｎｇ ・陽性コントロールエントリクローン（ｐＥＮＴＲ−β−Ｇａｌ）ＤＮＡ（以下
の注記を参照のこと） ・陽性コントロール目的ベクター、ｐＤＥＳＴ１（ｐＴｒｃ）、７５ｎｇ／μｌ ・ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素混合物（−８０℃にて保存） ・１０×クロナーゼ停止溶液 ・ｐＵＣ１９ＤＮＡ、１０ｐｇ／μｌ ・化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（能力：１×１０⁷ＣＦＵ／μｇ以上）
、４００μｌ ・ＬＢプレート含有アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびメチシリン（２０
０μｇ／ｍｌ）±Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ（以下を参照のこと） （注記） エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）ＤＮＡの調製：ＲＮａｓｅを
用いて処理したＭｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡが、十分働く。ＧＡＴＥＷＡＹ^TM反応
が、２０μｌの反応混合物当たり最適な約１００〜３００ｎｇのエントリークロ
ーン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）を有するようなので、クローンされるべきＤＮ
Ａの合理的に正確な定量化（±５０％）がアドバイスされる。

【０２２８】 陽性コントロールエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）、ｐＥＮＴ
Ｒ−β−Ｇａｌは、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびメチシリン（２０
０μｇ／ｍｌ）に加えて、ＩＰＴＧおよびＢｌｕｏ−ｇａｌ（またはＸ−ｇａｌ
）を含むＬＢプレート上の予期される青コロニー対白コロニーの数に基づくコロ
ニーの機能的分析を可能にする。β−ガラクトシダーゼは、大きなタンパク質で
あるので、ＳＤＳタンパク質ゲル上で、多くのより小さなタンパク質よりも顕著
ではないバンドをしばしば生じる。

【０２２９】 陽性コントロールエントリーベクター（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）ｐＥＮＴＥＲ−β−Ｇａｌにおいて、β−Ｇａｌの
コード配列は、ｐＥＮＴＲ１１（図２０Ａおよび２０Ｂ）にクローン化されてお
り、翻訳開始シグナルがＥ．ｃｏｌｉならび真核生物細胞における発現を可能に
する。陽性コントロール目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ
）（例えば、ｐＤＥＳＴ１（図２１））は、好ましくは直線化される。

【０２３０】 Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧプレートを調製するために、以下のプロトコルのい
ずれかが使用され得る： Ａ．ガラス棒を用いて、ＬＢ寒天プレートの表面上に、４０μｌのＤＭＦ中の
２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ（またはＢｌｕｏ−ｇａｌ）および４μｌの２００
ｍｇ／ｍｌ ＩＰＴＧを広げる。細胞をプレーティングする前に、３７℃で３〜
４時間寒天に液体を吸着させる。

【０２３１】 Ｂ．プレートに注ぐ直前に、液体ＬＢ寒天に約４５℃で、５０μｇ／ｍｌにす
るためにＸ−ｇａｌ（またはＢｌｕｏ−Ｇａｌ）（ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍｌ）を
、そして０．１〜１ｍＭにするためにＩＰＴＧ（水中で２００ｍＭ）を加える。
Ｘ−ｇａｌおよびＢｌｕｏ−Ｇａｌを光遮蔽した容器中に保存する。

【０２３２】 コロニーの色は、３７℃で一晩インキュベーションした後に、数時間５℃でプ
レートに配置することによって高められ得る。プロトコルＢは、Ａよりも一貫し
たコロニーの色を与え得るが、Ａは、選択されたプレートが、短い注目で必要と
される場合、より便利である。

【０２３３】 Ｃｌｏｎａｓｅ反応における組換えは、長時間続く。４５〜６０分のインキュ
ベーションが通常十分であるが、大きなＤＮＡを用いる反応、または親ＤＮＡの
両方がスーパーコイル化される反応、または低いコンピテンスの細胞に形質転換
される反応は、２５℃で２〜２４時間のような長いインキュベーション時間を用
いて改良され得る。

【０２３４】 （手順） １．以下のように反応を組み立てる（Ｃｌｏｎａｓｅ ＬＲを凍結貯蔵所から
移す前に、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ
（「Ｃｌｏｎａｓｅ ＬＲ」）以外全ての成分を室温で合わせる）：

【０２３５】

【表２】 ２．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを−
８０℃のフリーザーから移し、すぐに氷上に置く。Ｃｌｏｎａｓｅは溶かすのに
数分間のみかかる。

【０２３６】 ３．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘの４
μｌを反応物２番および４番に加える。

【０２３７】 ４．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを−
８０℃のフリーザーに戻す。

【０２３８】 ５．チューブを２５℃で少なくとも６０分間インキュベートする。

【０２３９】 ６．Ｃｌｏｎａｓｅ Ｓｔｏｐ溶液２μｌをすべての反応物に加える。２０分
間３７℃でインキュベートする。（この工程は、通常、１０〜２０倍、得たコロ
ニーの総数を増加する）。

【０２４０】 ７．２μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。１００
μｇ／ｍｌでアンピシリンを含むプレート上で選択する。

【０２４１】 （実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換） 本発明の組換えクローニングシステムを使用して調製されたクローニングベク
ターまたは発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を導入するた
めに、いずれかの標準Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換プロトコルが満足するはずである。
以下の工程は、最高の結果のために推奨される： １．コンピテント細胞の混合物およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ反応産物を、熱ショック工程の前に少なくとも１５分
静置させる。これは、組換えタンパク質がＤＮＡから解離するための時間を与え
、そして形質転換効率を向上する。

【０２４２】 ２．反応物を約１％〜５％の効率を期待する。すなわち、２μｌの反応物は、
少なくとも１００ｐｇの発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）プ
ラスミドを含むべきである（反応中の各親プラスミドの量、および引き続く希釈
を考慮する）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、１０⁷ＣＦＵ／μｇのコンピテンスを有す
る場合、全形質転換がアンピシリンプレート上に広げられるならば、１００ｐｇ
の所望のクローンプラスミドは、約１０００以上のクローンを与える。

【０２４３】 ３．コントロールｐＵＣ ＤＮＡ形質転換を常に行う。コロニーの数が予期し
たものでない場合、ｐＵＣ ＤＮＡ形質転換によって、問題があった場所の指示
が与えられる。

【０２４４】 （実施例８：ａｔｔＢ−ＰＣＲ産物の調製） 以下の実施例９に記載されるＰＣＲクローニング方法でのａｔｔＢ−ＰＣＲ産
物の調製のために、ａｔｔＢ１配列およびａｔｔＢ２配列を含むＰＣＲプライマ
ーを使用する。ａｔｔＢ１プライマー配列およびａｔｔＢ２プライマー配列は、
以下である： ａｔｔＢ１：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＣＴ−（テンプレート特異的配列）−３’ ａｔｔＢ２：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧ
ＧＴ−（テンプレート特異的配列）−３’ ａｔｔＢ１配列は、アミノプライマーに加えられるべきであり、ａｔｔＢ２配列
は、カルボキシプライマーに加えられるべきである。これらのプライマーのそれ
ぞれの５’末端の４グアニンは、本発明のクローニング方法における使用のため
に基質として、最小の２５ｂｐ ａｔｔＢ配列の効率を高める。

【０２４５】 標準ＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲ産物を調製し得る。以下の提案されたプロ
トコルは、ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇ
ｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃから市販（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を使用する。この酵素混合物は、
ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）の必要性を排除し、Ｔａｑに対する忠実
度を改善し、そしてゲノムテンプレート上においてさえ、２００ｂｐ〜１０ｋｂ
またはそれ以上のアンプリコンサイズの幅広い範囲の合成を可能にする。

【０２４６】 （必要とされる材料） ・ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉ
ｄｅｌｉｔｙ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ） ・テンプレートに特異的なａｔｔＢ１含有プライマー対およびａｔｔＢ２含有プ
ライマー対（上記を参照のこと） ・ＤＮＡテンプレート（直線化されたプラスミドまたはゲノムＤＮＡ） ・１０× Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ・１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 ・ＰＥＧ／ＭｇＣｌ₂ Ｍｉｘ（３０％ＰＥＧ８０００、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂） （手順） １．）反応を以下のように組み立てる：

【０２４７】

【表３】 ^*より多数のプラスミドテンプレートの使用は、より少ないサイクル（１０〜１
５）のＰＣＲを可能にし得る。

【０２４８】 ２．）適切に、二滴の鉱油を加える。

【０２４９】 ３．）３０秒間９４℃で変性させる。

【０２５０】 ４．）以下を２５サイクル行う： ９４℃を１５秒〜３０秒 ５５℃を１５秒〜３０秒 テンプレート１ｋｂ当たり６８℃を１分間。

【０２５１】 ５．）ＰＣＲ反応に続いて、産物の収率および均一性を評価するために、サイ
ズ標準（例えば、１Ｋｂ Ｐｌｕｓ Ｌａｄｄｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）および定量標準（例えば、Ｌｏｗ Ｍａｓｓ Ｌａｄｄｅ
ｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）とともに、１〜２μｌの反
応混合物をアガロースゲルに適用する。

【０２５２】 ＰＣＲ産物の精製は、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）へ効
率的にクローン化し得るａｔｔＢプライマーダイマーを除くために、推奨される
。以下のプロトコルは、ｆａｓｔであり、＜３００ｂｐのサイズのＤＮＡを除去
する： ６．）５０μｌのＰＣＲ反応物をＴＥを用いて２００μｌに希釈する。

【０２５３】 ７．）１００μｌ ＰＥＧ／ＭｇＣｌ₂溶液を加える。混合し、そして室温で
１０分間１３，０００ＲＰＭで素早く遠心分離する。上清を除く（ペレットは、
透明であり、見るのが困難である）。

【０２５４】 ８．）ペレットを５０μｌのＴＥに溶解し、ゲル上で回収をチェックする。

【０２５５】 開始ＰＣＲテンプレートが、Ｋａｎ^rについての遺伝子を含むプラスミドであ
る場合、未反応の残りの開始プラスミドが、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ反応の形質転換由来の偽陽性コロニーの潜在的な供給源であるの
で、プラスミドを分解するために、完了したＰＣＲ反応物を制限酵素ＤｐｎＩで
処理することが得策である。約５ユニットのＤｐｎＩを完了したＰＣＲ反応物に
添加し、そして１５分間３７℃でインキュベートすることによって、この潜在的
な問題は除去される。ＰＣＲ産物をＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍ反応において使用する前に、６５℃で１５分間ＤｐｎＩを熱不活性化する
。

【０２５６】 （実施例９：ＢＰ（「Ｇａｔｅｗａｒｄ」）反応を介するエントリーベクター
（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）へのａｔｔＢ−ＰＣＲのクローニング） ＰＣＲプライマーへの５’末端ａｔｔＢ配列の付加は、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｂ
Ｐ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘの存在下でのＤｏｎｏｒ（ａｔｔ
ｐ）Ｐｌａｓｍｉｄを用いた組換えに効率的な基質であるＰＣＲ産物の合成を可
能にする。この反応は、ＰＣＲ産物のエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏ
ｎｅ）を産生する（図８を参照のこと）。

【０２５７】 ａｔｔＢ ＰＣＲ基質を用いるＧａｔｅｗａｒｄ Ｃｌｏｎｉｎｇの条件は、
ａｔｔＢ−ＰＣＲ産物（図８を参照のこと）を発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｃｌｏｎｅ）の代わりに使用し、そしてａｔｔＢ−ＰＣＲ陽性コントロー
ル（ａｔｔＢ−ｔｅｔ^r）を発現クローン陽性コントロール（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｃｌｏｎｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＧＦＰ）の代わりに
使用することを除いて、ＢＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下の実施例１０を参照のこ
と）の条件と同じである。

【０２５８】 （必要とされる材料：） ・５×ＢＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ・所望のａｔｔＢ−ＰＣＲ産物ＤＮＡ、８μｌ以下のＴＥ中、５０〜１００ｎｇ
。 ・Ｄｏｎｏｒ（ａｔｔＰ）Ｐｌａｓｍｉｄ（図４９〜５４）、７５ｎｇ／μｌ、
スーパーコイルＤＮＡ。 ・ａｔｔＢ−ｔｅｔ^r ＰＣＲ産物陽性コントロール、２５ｎｇ／μｌ。 ・ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（−８０
℃で保存）。 ・１０×Ｃｌｏｎａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ。 ・ｐＵＣ１９ ＤＮＡ、１０ｐｇ／μｌ。 ・化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（コンピテンス：１×１０⁷ＣＦＵ／μ
ｇ以上）、４００μｌ。

【０２５９】 （注記：） ・ａｔｔＢ−ＰＣＲ ＤＮＡの調製：実施例８を参照のこと。 ・Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔｔＢ−ｔｅｔ^rＰＣＲ産物は、それ
自身のプロモーターとともに、ｐＢＲ３２２のｔｅｔ^r遺伝子の機能性コピーを
含む。コントロールＢＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎの形質転換物をカナマイシン（５０
μｇ／ｍｌ）プレート上（ｋａｎ^r Ｄｏｎｏｒ Ｐｌａｓｍｉｄを使用する場
合；図４９〜５２を参照のこと）に、または代替の選択試薬（例えば、ｇｅｎ^r
Ｄｏｎｏｒ Ｐｌａｓｍｉｄが使用される場合、ゲンタマイシン、図５４を参
照のこと）のプレートにプレートし、次いで、これらのコロニーの約５０個をテ
トラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を有するプレート上に摘み上げ、陽性コント
ロール反応由来のコロニーの機能性ｔｅｔ^rを含むエントリークローン（Ｅｎｔ
ｒｙ Ｃｌｏｎｅ）の割合が決定され得る（％発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｃｌｏｎｅ）＝（ｔｅｔ^r＋ｋａｎ^r（またはｇｅｎ^r）コロニーの数／ｋ
ａｎ^r（またはｇｅｎ^r）コロニー）。

【０２６０】 （手順：） １．反応を以下のように組み立てる。ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓ
ｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを凍結貯蔵所から移す前に、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｂ
Ｐ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ以外、全ての成分を合わせる。

【０２６１】

【表４】 ２．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを−
８０℃のフリーザーから移し、すぐに氷上に置く。Ｃｌｏｎａｓｅを溶かすには
数分だけかかる。

【０２６２】 ３．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘの４
μｌをサブクローニング反応に加え、混合する。

【０２６３】 ４．ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを−
８０℃のフリーザーに戻す。

【０２６４】 ５．２５℃で少なくとも６０分間インキュベートする。

【０２６５】 ６．２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２μｇ／μｌ）を全ての反応物に加
える。２０分間３７℃でインキュベートする。

【０２６６】 ７．上記の３．２により、２μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉに
形質転換する。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で選択する。

【０２６７】 （結果：） 初期の実験において、ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔＲおよびａｍｐＲを増幅する
ためのプライマーが、ｔｅｔＲ特異的標的配列またはａｍｐＲ特異的標的配列の
み、標的配列およびａｔｔＢ１（前進（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーについて）
配列またはａｔｔＢ２（逆プライマーについて）配列（図９に示される）、ある
いは４つのグアニジンの５’テールを有するａｔｔＢ１配列またはａｔｔＢ２配
列を含むように構築された。これらのプライマーの構築は、図６５に示される。
これらのプライマーを使用するｐＢＲ３２２由来のｔｅｔＲおよびａｍｐＲのＰ
ＣＲ増幅および本発明の組換えクローニングシステムを使用する宿主細胞へのＰ
ＣＲ産物のクローニングの後に、図６６に示される結果が得られた。これらの結
果は、ａｔｔＢ配列を含むプライマーが、テトラサイクリンプレートおよびアン
ピシリンプレート上で幾分多い数のコロニーを提供したことを示した。しかし、
ａｔｔＢ配列に加えて、プライマー上に、４または５グアニジンの５’伸長を含
むことは、図６６および６７に示されるように、有意により良いクローニングの
結果を提供した。これらの結果は、組換えクローニングを使用するＰＣＲ産物の
クローニングについて最適のプライマーが、４または５グアニン塩基の５’伸長
を有する組換え部位配列を含む。

【０２６８】 ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物とａｔｔＰ含有Ｄｏｎｏｒプラスミドとの間の最適化
学量論を決定するために、ＰＣＲ産物およびＤｏｎｏｒプラスミドの量が、ＢＰ
Ｒｅａｃｔｉｏｎの間で変化される実験が行われた。次いで、反応混合物は、
宿主細胞に形質転換され、上記のようにテトラサイクリンプレート上にプレート
された。結果は図６８に示される。これらの結果は、ｔｅｔ遺伝子のサイズ範囲
におけるＰＣＲ産物を用いた最適の組換えクローニングの結果について、ａｔｔ
Ｐ含有Ｄｏｎｏｒプラスミドの量が、約１００〜５００ｎｇ（最も好ましくは、
約２００〜３００ｎｇ）の間であり、一方、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物の最適濃度
が、２０μｌ反応当たり、約２５〜１００ｎｇ（最も好ましくは、約１００ｎｇ
）であることを示す。

【０２６９】 次いで、本発明の組換えクローニングアプローチによるクローニングの効率に
対するＰＣＲ産物のサイズの効果を試験するために実験を行った。ａｔｔＢ１お
よびａｔｔＢ２部位を、２５６ｂｐ、１ｋｂ、１．４ｋｂ、３．４ｋｂ、４．６
ｋｂ、６．９ｋｂおよび１０．１ｋｂのサイズで含むＰＣＲ産物を上記のように
調製し、そしてエントリーベクターにクローン化し、そして宿主細胞をクローン
化ＰＣＲ産物を含むエントリーベクターを用いて形質転換した。各ＰＣＲ産物に
ついてクローニング効率を、以下のように、ｐＵＣ１９陽性コントロールプラス
ミドのクローニングに対して計算した。

【０２７０】

【化２１】 図６９Ａ〜６９Ｃ（２５６ｂｐのＰＣＲフラグメントについて）、図７０Ａ〜
７０Ｃ（１ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）、７１Ａ〜７１Ｃ（１．４ｋｂ
ＰＣＲフラグメントについて）、図７２Ａ〜７２Ｃ（３．４ｋｂ ＰＣＲフラ
グメントについて）、図７３Ａ〜７３Ｃ（４．６ｋｂのＰＣＲフラグメントにつ
いて）、７４（６．９ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）および図７５〜７６
（１０．１ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）に、これらの実験の結果を示す
。これらの図に示された結果を、異なる重量およびモルの入力ＰＣＲ ＤＮＡに
ついて、図７７に要約した。

【０２７１】 ともに、これらの結果は、本発明の組換えクローニングシステムにおいて、ａ
ｔｔＢ含有ＰＣＲ産物が、比較的効率的に、約０．２５ｋｂから約５ｋｂまでの
クローンのサイズにわたることを証明する。ＰＣＲ産物が約５ｋｂより非効率的
に大きくなるにつれて（明らかに、融合体の遅い分解による）、組換え反応の間
のインキュベーション時間がより長くなり、これらのより大きなＰＣＲフラグメ
ントのクローニングの効率を改善する。あるいは、低レベルの入力ａｔｔｐドナ
ープラスミドおよびおそらくａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を使用することによって、
および／または融合体のより迅速な分解を補助するための反応条件を（例えば、
緩衝液条件）調整することによって、大きな（約５ｋｂより大きい）ＰＣＲフラ
グメントのクローニングの効率を改良することが可能であり得る。

【０２７２】 （実施例１０：ＢＰ反応） Ｇａｔｅｗａｒｄ（「エントリー（Ｅｎｔｒｙ）」）反応の１つの目的は、発
現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）をエントリークローンに変換
することである。これは、発現クローンｃＤＮＡライブラリーから個々の発現ク
ローンを単離し、そして目的の核酸分子を別の発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）にトランスファーすることを望むか、またはａｔｔＢもし
くはａｔｔＬライブラリーから分子の集団を移動することを所望する場合、有用
である。あるいは、発現クローンを変異し得、ここで１つ以上の新しい発現ベク
ターに目的の変異された核酸分子をトランスファーすることを所望する。両方の
場合において、目的の核酸分子をエントリークローンに変換することがまず必要
である。

【０２７３】 （必要とされる材料） ・５×ＢＰ反応緩衝液 ・発現クローンＤＮＡ、８μｌ以下のＴＥ中１００〜３００ｎｇ ・ドナー（ａｔｔｐ）ベクター、７５ｎｇ／μｌ、スーパーコイルＤＮＡ ・正のコントロールａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ ＤＮＡ、２５ｎｇ／μｌ ・ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（−８０
℃で保存） ・クロナーゼ停止溶液（Ｃｌｏｎａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（プロ
テイナーゼＫ、２μｇ／μｌ） （注意：） （発現クローンＤＮＡの調製：ＲＮアーゼワークスウェルで処理したＭｉｎｉ
ｐｒｅｐ ＤＮＡ） １．ＬＲ反応（実施例１４を参照のこと）と共に、ＢＰ反応は、反応するＤＮ
Ａのトポロジーによって強く影響される。一般的に、ＤＮＡが両方とも直鎖であ
るかまたは両方ともスーパーコイルである反応と比較して、ＤＮＡの一方が直鎖
であり他方がスーパーコイルである場合、最も効率的である。さらに、ａｔｔＢ
発現クローン（ベクター内のどこでも）を直線化することによって、一般的に、
ドナー（ａｔｔＰ）プラスミド（Ｄｏｎｏｒ（ａｔｔＰ）Ｐｌａｓｍｉｄ）を直
線化することより多くのコロニーを与える。発現クローンベクター内に適切な切
断部位を発見することが困難であることを示す場合、ａｔｔＰ１部位とａｔｔＰ
２部位との間で（例えば、ＮｃｏＩ部位で）ドナー（ａｔｔＰ）プラスミドを直
線化し得、ｃｃｄＢ遺伝子を回避する。ドナー（ａｔｔＰ）プラスミドのマップ
は、図４９〜５４に与えられる。

【０２７４】 （手順） １．以下の通りに反応を組み立てる。フリーザーからＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ
Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを除去する前に、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TMＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを除く全ての成分を室温で合わ
せる。

【０２７５】

【表５】 ２．−８０℃のフリーザーからＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを取り出し、直ぐに氷上に置く。この混合物は、たったの
２、３分で解凍した。

【０２７６】 ３．４μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍ
ｉｘをサブクローニング反応に加え、混合する。

【０２７７】 ４．−８０℃フリーザーにＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｍｉｘを戻す。

【０２７８】 ５．２５℃で、少なくとも６０分間チューブをインキュベートする。ａｔｔＢ
ＤＮＡおよびａｔｔＰ ＤＮＡの両方がスーパーコイルである場合、２５℃で
の２〜２４時間のインキュベーションを推薦する。

【０２７９】 ６．２μｌのクロナーゼ停止溶液（Ｃｌｏｎａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ）を加える。３７℃で１０分間インキュベートする。

【０２８０】 ７．上記のように、２μｌを１００μｌの適格なＥ．ｃｏｌｉに形質転換する
。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で選択する。

【０２８１】 （実施例１１：標準クローニング法を使用する、エントリーベクターへのＰＤ
Ｒ産物のクローニング） （ＰＣＲ産物のクローニングのためのエントリーベクターの調製） 本発明の全てのエントリーベクターは、「左」制限部位と「右」制限部位との
間のスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）として死の遺伝子ｃｃｄＢを含む。この配置
の利点は、両方の制限酵素で切断されなかったベクター由来のバックグラウンド
が実質的に存在しないことである。なぜなら、ｃｃｄＢ遺伝子の存在は、全ての
標準Ｅ．ｃｏｌｉ株を殺傷するためである。従って、ｃｃｄＢフラグメントを除
去するために、各エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）を２回切断
する必要がある。

【０２８２】 第２の制限酵素でエントリーベクターを消化した後、ホスファターゼ（子ウシ
腸管アルカリホスファターゼ、ＣＩＡＰ、または熱感受性アルカリホスファター
ゼ、ＴＳＡＰ）で反応を処理することを強く推薦する。このホスファターゼは、
反応混合物に直接添加され得、追加の時間インキュベートされ得、そして不活性
化され得る。この工程は、ベクターとｃｃｄＢフラグメントの両方を脱リン酸化
し、その結果、次のライゲーションの間、ｃｃｄＢフラグメントとエントリーベ
クターの終点についての目的のＤＮＡとの間に競合は少ない。

【０２８３】 （ＰＣＲ産物の平滑クローニング） 一般に、ＰＣＲ産物は、５’ホスファターゼを有さず（なぜなら、プライマー
は通常５’ＯＨであるため）、そしてそれらは、平滑末端化される必要はない（
この後者の点で、プライマーの配列が単一の３’塩基の付加に影響を及ぼす方法
についての議論については、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２０：１００６、１９９６を参照のこと）。以下のプロトコールは、これ
らの２つの欠陥を修復する。

【０２８４】 ０．５ｍｌのチューブにおいて、エタノールによって、約４０ｎｇのＰＣＲ産
物を沈殿させる（アガロースゲルから判断されるように）。

【０２８５】 １． １μｌの１０ｍＭ ｒＡＴＰ、１μｌの混合された２ｍＭ ｄＮＴＰ（
すなわち、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ、２ｍＭ ｄＴＴＰ、および２
ｍＭ ｄＧＴＰ）、２μｌの５×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（３５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ
ＫＣｌ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）１０単位Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ、１μｌ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、および１０μｌに合わせるための
水を含む１０μｌに、沈殿したＤＮＡを溶解する。

【０２８６】 ２． ３７℃で１０分間チューブをインキュベートし、次いで６５℃で１５分
間インキュベートし、冷却し、任意の凝縮物をチューブの先端にもたらすために
軽く遠心分離にかける。

【０２８７】 ３． ５μｌのＰＥＧ／ＭｇＣｌ₂溶液を加え、混合し、そして室温で１０分
間遠心分離する。上清を廃棄する。

【０２８８】 ４． ２μｌの５×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および約５０ｎ
ｇの平滑末端化したホスファターゼ処理エントリーベクターを含む１０μｌ中で
見えない沈殿物を溶解する。

【０２８９】 ５． ２５℃で１時間インキュベートし、次いで１０分間６５℃でインキュベ
ートする。９０μｌのＴＥを加え、１０μｌを５０〜１００μｌの適格なＥ．ｃ
ｏｌｉに形質転換する。

【０２９０】 ６． カナマイシン上に置く。

【０２９１】 （注意：） 上記プロトコールにおいて、工程ｂからｃは、同時に（Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼのエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を通して）ＰＣＲ産物の末端
を磨き、および（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して）５’末端をリン酸
化する。キナーゼを不活性化することが必要であり、その結果、工程ｅにおいて
平滑末端化され、脱リン酸化されたベクターは、自己ライゲートし得ない。工程
ｄ（ＰＥＧ沈殿）は、全ての小分子（プライマー、ヌクレオチド）を除去し、そ
してまたクローン化されたＰＣＲ産物の収量を５０倍改善することが見出された
。

【０２９２】 （制限酵素を用いる消化後のＰＣＲ産物のクローンニング） 制限酵素で消化されたＰＣＲ産物の効率的なクローニングは、３つの工程を包
含する：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化、制限酵素の効率的な切断、およ
び小さなＤＮＡフラグメントの除去。

【０２９３】 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮ
ＴＰのＲＥ消化への繰越は、ＰＣＲ産物をクローニングする際の成功率を低下さ
せる（Ｄ．Ｆｏｘら、ＦＯＣＵＳ２０（１）：１５、１９９８）。なぜなら、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼは、粘着性末端に充填し得、末端を平滑末端化するため
に塩基を加え得るためである。ＴａｑＱｕｅｎｃｈ^TM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可
能）またはフェノールによる抽出が、Ｔａｑを不活性化するために使用され得る
。

【０２９４】 効率的な制限酵素切断：各ＰＣＲプライマーの５’末端における過剰の塩基は
、ＰＣＲ産物の末端付近のＲＥ切断を補助する。安価なプライマーのアベイラビ
リティーによって、制限部位の５’側上の６〜９個の塩基を加えることは、末端
のほとんどが消化されることを保証する優れた投入である。５倍過剰の制限酵素
を用いた１時間以上のＤＮＡのインキュベーションは、成功を保証する。

【０２９５】 ライゲーション前の小分子の除去：プライマー、ヌクレオチド、プライマーダ
イマー、および制限酵素消化によって産生された小さなフラグメントは、クロー
ニングベクターへのＰＣＲ産物の所望されるライゲーションを、全て阻害し得る
かまたは競合し得る。このプロトコールは、小分子を除去するためにＰＥＧ沈殿
を使用する。

【０２９６】 （制限酵素を用いてＰＣＲ産物の末端を切断するためのプロトコール） １．ＰＣＲ産物中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化 オプションＡ：フェノールによる抽出 Ａ１．ＴＥで２００μｌにＰＣＲ反応物を希釈する。等容量のフェノール：ク
ロロホルム：イソアミルアルコールを加え、２０秒間激しく撹拌し、１分間室温
で遠心分離する。下相を廃棄する。

【０２９７】 Ａ２．ＤＮＡからフェノールを抽出し、以下の通りに濃縮する。等量の２−ブ
タノール（所望される場合、Ａｌｄｒｉｃｈの「Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ」で赤色に
着色する）を加え、軽く撹拌し、室温で軽く遠心分離する。ブタノール上相を廃
棄する。２−ブタノールを用いた抽出を繰り返す。この時点において、下水相の
容量は、顕著に減少するはずである。２−ブタノールの上相を廃棄する。

【０２９８】 Ａ３．エタノールで、上記抽出液の水相からＤＮＡを沈殿させる。２００μｌ
の適切な制限酵素（ＲＥ）緩衝液に溶解する。

【０２９９】 オプションＢ：ＴａｑＱｕｅｎｃｈによる不活性化 Ｂ１．エタノールで、適切な量のＰＣＲ産物（１００ｎｇ〜１μｇ）を沈殿さ
せ、２００μｌの適切なＲＥ緩衝液に溶解する。

【０３００】 Ｂ２．２μｌのＴａｑＱｕｅｎｃｈを加える。

【０３０１】 ２．１０〜５０単位の制限酵素を加え、少なくとも１時間インキュベートする
。ＰＣＲ産物の他端における消化のために緩衝液を交換する必要がある場合、エ
タノールで沈殿させる。

【０３０２】 ３．１／２容量のＰＥＧ／ＭｇＣｌ₂混合物をＲＥ消化に加える。十分に混合
し、直ぐに室温で１０分間遠心分離する。上清（ペレットは通常見えない）を廃
棄し、数分間再び遠心分離し、任意の残りの上清を廃棄する。

【０３０３】 ４．適切な容量（元の増幅反応におけるＰＣＲ産物の量に依存する）のＴＥに
ＤＮＡを溶解し、回収を確証するために、アガロースゲルにアリコートを塗布す
る。クローニングのために使用される２０〜１００ｎｇの適切なエントリーベク
ターを同じゲルに塗布する。

【０３０４】 （実施例１２：ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓの予想されるサイズの決定） 配列を電気的に切断しつなぎ合わせるソフトウェアプログラムにアクセスする
場合、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ組換え産物のサイズおよ
び制限パターンの予測を補助するために電気的クローンを生成し得る。

【０３０５】 ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ組換え反応において酵素Ｉｎ
ｔによって実施される切断工程およびライゲーション工程は、７−ｂｐ５’−末
端突出を形成する制限酵素切断を模倣し、続いて娘分子の末端を封じるライゲー
ション工程が実施される。クロナーゼカクテル中に存在する組換えタンパク質（
以下の実施例１９を参照のこと）は、全ての４つの型のａｔｔ部位内に存在する
１５ｂｐコア配列（種々の型のａｔｔ部位の各々に特徴的な他の隣接配列に加え
て）を認識する。

【０３０６】 これらの部位を、それらが制限部位であるかのように、ソフトプログラムで処
理することによって、種々の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔ
ｏｒ）によってエントリークローンを切断し得、そしてつなぎ合わせ得、そして
ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ反応からの予想される結果の正
確なマップおよび配列が得られ得る。

【０３０７】 （実施例１３：タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）） （タンパク質発現の簡単な概説） 転写：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中の最も通常使用されるプロモーターは、ｌ
ａｃプロモーターの改変体であり、そしてこれらはＩＰＴＧを成長培地に添加す
ることによって、刺激され得る。通常、発現が所望されるまでプロモーターをオ
フに維持することが良く、その結果、宿主細胞は、幾つかの異種タンパク質の過
多によってシック（ｓｉｃｋ）にならない。これは、Ｅ．ｃｏｌｉに使用される
ｌａｃプロモーターの場合において、合理的に容易である。ｌａｃリプレッサー
タンパク質を作製するために、ｌａｃＩ遺伝子（またはそのより増殖性関連の、
ｌａｃ^Iq遺伝子）を供給する必要があり、これは、プロモーター付近で結合し、
転写レベルを低く維持する。Ｅ．ｃｏｌｉ発現についての幾つかの目的ベクター
は、この目的のためにそれら自体のｌａｃＩ^q遺伝子を保有する。（しかし、ｌ
ａｃプロモーターは、ＩＰＴＧの非存在下においてでさえ、常にわずかに「ｏｎ
」である。） 真核細胞中における転写を制御することは、簡単または効率的とは程遠い。Ｂ
ｕｊａｒｄらのテトラサイクリン系は、最も成功したアプローチであり、目的ベ
クター（ｐＤＥＳＴ１１；図３１）の１つは、この機能を供給するために構築さ
れた。

【０３０８】 翻訳：リボソームは、ｍＲＮＡ内に存在する情報をタンパク質に変換する。リ
ボソームは、メチオニン（ＡＵＧ）コドンを探すＲＮＡ分子を走査し、これは、
ほぼ全ての新生タンパク質に取りかかる。しかし、リボソームは、始点のそれら
由来のタンパク質の中央においてメチオニンについてコードするＡＵＧコドン間
で区別し得なければならない。最もよく、リボソームは、１）最初にＲＮＡ中に
あり（５’末端に向けて）、そして２）適切な配列状況を有する、ＡＵＧを選択
する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、好まれる状況（最初に、ＳｈｉｎｅおよびＤａｌ
ｇａｒｎｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２２１（１９７５）によって
認識された）は、開始ＡＵＧ、特にＡＧＧＡＧＧまたは幾つかの改変体の５〜１
２塩基上流のプリンからの開始である。

【０３０９】 真核生物において、Ｋｏｚａｋ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６
７（１９９１））によって翻訳されたｍＲＮＡの調査は、開始メチオニンの周り
の、好ましい配列状況、ｇｃｃＡｃｃＡＴＧＣ、を明らかにし、ここで−３にお
けるＡは最も重要であり、＋４におけるプリン（ここで、ＡＴＧのＡは＋１であ
る）、好ましくは、Ｇは、次に最も影響力がある。−３においてＡを有すること
は、大部分のリボソームが、植物、昆虫、酵母、および哺乳動物中においてｍＲ
ＮＡの第１のＡＵＧを選択するのに十分である。（真核細胞におけるタンパク質
合成の開始の概説については、Ｐａｉｎ，Ｖ．Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．２３６：７４７−７７１、１９９６を参照のこと）。

【０３１０】 ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍのための翻訳シグナルの重要
性： まず、翻訳シグナル（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ、真核
細胞中のＫｏｚａｋ）は、開始ＡＴＧに接近しなければならない。ａｔｔＢ部位
は、２５塩基対長である。従って、翻訳シグナルが目的の核酸分子の天然ＡＴＧ
付近に所望される場合、それらは、目的の核酸分子のエントリークローン内に存
在しなければならない。さらに、エントリークローンから目的ベクターまで目的
の核酸分子が移動される場合、任意の翻訳シグナルは沿って移動する。この結果
は、エントリークローン中のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏおよび／またはＫｏ
ｚａｋ配列の存在または非存在が考慮されなければならず、最終的な目的ベクタ
ーが注意して使用される。

【０３１１】 第２に、リボソームは５’ＡＴＧを最もよく選択するが、内部ＡＴＧはまた、
タンパク質合成を開始するために使用される。この内部ＡＴＧの周りの翻訳状況
がよくなればなるほど、内部翻訳開始がより多く見られる。これは、ＧＡＴＥＷ
ＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍにおいて重要である。なぜなら、目的の核
酸分子のエントリークローンを作製し得、そしてＡＴＧ付近にＳｈｉｎｅ−Ｄａ
ｌｇａｒｎｏおよび／またはＫｏｚａｋ配列を有するように配列し得るからであ
る。このカセットが目的の核酸分子を転写する目的ベクター内に組換えされる際
、天然タンパク質が得られる。必要とされる場合、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ
ｏおよび／またはＫｏｚａｋ配列が同じ読み取りフレーム内に任意の停止シグナ
ルを含まないため、異なる目的ベクター内に融合タンパク質を作製し得る。しか
し、これらの内部翻訳シグナルの存在によって、有意な量の天然タンパク質が作
製され得、融合タンパク質を夾雑し得、そして融合タンパク質の収量を低下し得
る。これは、特に、Ｈｉｓ６のような短い融合タグの場合にあり得る。

【０３１２】 良好な妥協（ｇｏｏｄ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）が推奨され得る。ｐＥＮＴＲ
７（図１６）またはｐＥＮＴＲ８（図１７）のようなエントリーベクター（Ｅｎ
ｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）が選択される場合、コザック塩基がネイティブな真核生
物発現のために存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳のための状況は不十分であり、その
ため、アミノ末端融合物の収量が良好であるはずであり、そしてこの融合タンパ
ク質はＴＥＶプロテアーゼで消化されて、精製後にほぼネイティブなタンパク質
を作製し得る。

【０３１３】 （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の合成のために推奨される条件） Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中でタンパク質を作製する場合、少なくとも最初に、培養物を３７℃の代
わりに３０℃でインキュベートすることが賢明である。本発明者らの経験によっ
て、タンパク質は、３０℃では凝集物をあまり形成しないようであることが示さ
れる。さらに、３０℃で増殖させた細胞からのタンパク質の収量は、しばしば改
善される。

【０３１４】 発現することが困難であるタンパク質の収量もまた、一晩の培養物から直接収
集するのとは全く異なって、一晩増殖させたものからその朝開始した培養物を用
いて対数増殖期の中期の培養物を誘導することにより改善され得る。一晩の培養
物から直接収集する場合、この細胞は好ましくは、対数増殖期後期または静止増
殖期にあり、これは、不溶性凝集物の形成に好都合であり得る。

【０３１５】 （実施例１４：既存のベクターからの目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ
Ｖｅｃｔｏｒ）の構築） 目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ）は機能する。なぜ
なら、これらは、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）遺伝子および細胞死遺伝
子（ｄｅａｔｈ ｇｅｎｅ）ｃｃｄＢに隣接する２つの組換え部位（ａｔｔＲ１
およびａｔｔＲ２）を有するからである。ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍの組換え反応は、カセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）全体（ａｔｔＢ部
位の一部を含むいくつかの塩基を除く）を、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ
Ｖｅｃｔｏｒ）からの目的のＤＮＡセグメントと交換する。ａｔｔＲ１、ＣｍＲ
、ｃｃｄＢ遺伝子およびａｔｔＲ２は連続しているので、これらは、単一のＤＮ
Ａセグメントによって移動し得る。このカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）がプラス
ミド中にクローニングされる場合、このプラスミドが目的ベクター（Ｄｅｓｔｉ
ｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）となる。図６３は、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃａｓｓｅｔｔｅの模式図を示す；ベクターｐＥＺＣ１
５１０１、ｐＥＺＣ１５１０２およびｐＥＺＣ１５１０３に含まれる３つのリー
ディングフレームの全てにおけるａｔｔＲカセットを、それぞれ、図６４Ａ、図
６４Ｂおよび図６４Ｃに示す。

【０３１６】 目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を構築するためのプ
ロトコルを以下に表す。以下の点を心に留めておくこと： ・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な（そして本明細書中に参考と
して援用される、１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，
３９２号に詳細に記載される）Ｅ．ｃｏｌｉのＤＢ株のうちの１つ（例えば、Ｄ
Ｂ３．１、および特にＥ．ｃｏｌｉ ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（
登録商標）ＤＢ３．１^TM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ）において構築され、
そして増殖されなければならない。なぜなら、ｃｃｄＢ細胞死遺伝子は、ｃｃｄ
Ｂ遺伝子の存在下で生き延びるように変異していない全てのＥ．ｃｏｌｉ株を殺
傷するからである。

【０３１７】 ・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて融合タン
パク質を作製する場合、適切なリーディングフレームを有するＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍカセットを用いなければならない。このカセッ
トの末端のヌクレオチド配列を、図７８に示す。融合タンパク質ドメインのリー
ディングフレームは、６個のＡが２つのリジンコドンに翻訳されるように、ａｔ
ｔＲ１部位（アミノ末端融合物について）のコア領域とインフレームでなければ
ならない。Ｃ末端融合タンパク質については、ａｔｔＲ２部位のコア領域を通し
ての翻訳は、−ＴＡＣ−ＡＡＡ−とインフレームであって、−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
を生じるべきである。

【０３１８】 ・各リーディングフレームのカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子とｃｃｄＢ遺伝子との間に異なる独特の制限部位を有するこ
とに留意されたい（リーディングフレームＡについてはＭｌｕＩ、リーディング
フレームＢについてはＢｇｌＩＩ、そしてリーディングフレームＣについてはＸ
ｂａＩ；図６３を参照のこと）。

【０３１９】 ・大部分の標準的なベクターは、そのベクターのＭＣＳにエントリーカセット
（Ｅｎｔｒｙ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）を挿入することにより、目的ベクター（Ｄｅ
ｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）に変換され得る。

【０３２０】 （目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を作製するための
プロトコル） １．ベクターがアミノ融合タンパク質を作製する場合、「ａａａ ａａａ」ト
リプレットをａｔｔＲ１中に、融合タンパク質のトリプレットと相を合わせて維
持することが必要である。どのエントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ ｃａｓｓｅｔ
ｔｅ）を使用するかを以下の通りに決定する： ａ．）エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ ｃａｓｓｅｔｔｅ）をクローニング
する制限部位付近の既存のベクターのヌクレオチド配列を完全に書く。これらは
、融合ドメインのアミノ酸配列に対応するトリプレットで書かれなければならな い 。

【０３２１】 ｂ．）切断し、そして平滑にした後（すなわち、突出する５’末端にフィルイ
ンした後または突出する３’末端を研磨した後）の制限部位末端に対応する配列
を通して垂直な線を画く。

【０３２２】 ｃ．）適切なリーディングフレームカセットを選択する： ・平滑末端のコード配列が、完全なコドントリプレットの後で終わった場合、
リーディングフレームＡカセットを用いる。図７８、図７９および図８０を参照
のこと。

【０３２３】 ・平滑末端のコード配列が単一の塩基で終わった場合、リーディングフレーム
Ｂカセットを用いる。図７８、図７９および図８１を参照のこと。

【０３２４】 ・平滑末端のコード配列が２つの塩基で終わった場合、リーディングフレーム
Ｃカセットを用いる。図７８、図７９、図８２Ａ〜Ｂおよび図８３Ａ〜Ｃを参照
のこと。

【０３２５】 ２．１〜５の微生物の既存のプラスミドを、（ａｔｔ部位に隣接する）目的の
核酸分子が組換え反応の後にあることを望む位置で切断する。注：この工程で、
可能な限り多くのＭＣＳ制限部位を除去した方がよい。このことは、ＧＡＴＥＷ
ＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃａｓｓｅｔｔｅ内の制限酵素部位が
、新たなプラスミド中で唯一である可能性をより高くする。このことは、目的ベ
クター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を線状化するために重要であ
る（実施例１４、下記）。

【０３２６】 ３．５’リン酸をアルカリホスファターゼを用いて除去する。このことは強制
的なことではないが、このことは、成功の確率を増大させる。

【０３２７】 ４．末端を、フィルイン反応または研磨反応を用いて平滑にする。例えば、制
限酵素で切断し、エタノールで沈澱させた１μｇのベクターＤＮＡに以下を添加
する： ｉ．２０μｌの５×Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１
６５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）、３３０ｍＭ酢酸Ｎａ、５０ｍＭ酢
酸Ｍｇ、５００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２．５ｍＭ ＤＴＴ） ｉｉ．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス ｉｉｉ．１単位のＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｖ．１００μｌの最終体積にするための水 ｖ．３７℃にて１５分間インキュベートする。

【０３２８】 ５．ｄＮＴＰおよび小さなＤＮＡフラグメントを除去する：エタノール沈殿を
行い（０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む３倍の体積の室温のエタノールを添加し、
充分に混合し、充分に混合し、ｓ室温にて５〜１０分間にわたり直ちに遠心分離
する）、湿った沈殿物を２００μｌのＴＥ中に溶解し、１００μｌの３０％ Ｐ
ＥＧ ８０００、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を添加し、室温にて１０分間にわたって
直ちに遠心分離し、上清を捨て、数秒間、再度遠心分離し、全ての残りの液体を
捨てる。

【０３２９】 ６．１マイクロリットルあたり１０〜５０ｎｇの最終濃度になるようにＤＮＡ
を溶解する。２０〜１００ｎｇを超コイルプラスミドおよび直鎖状のサイズ標準
の隣でゲルにアプライして、切断および回収を確認する。この切断は、１００％
完全である必要はない。なぜなら、エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ Ｃａｓｓ
ｅｔｔｅ）上のクロラムフェニコールマーカーについて選択するからである。

【０３３０】 ７．１０μｌの連結反応物中で、１０〜５０ｎｇのベクター、１０〜２０ｎｇ
のエントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）（図７９）およびリガ
ーゼ緩衝液中の０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを合わせる。１時間（または
一晩、いずれか最も便利な方）後、１μｌを、ｇｙｒＡ４６２変異を有するコン
ピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞のＤＢ株（本明細書中に参考として援用される、１
９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照のこ
と）の１つ、好ましくはＤＢ３．１、そして最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＬＩ
ＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１^TM Ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ Ｃｅｌｌに形質転換する。エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ Ｃａｓｓｅ
ｔｔｅ）上のｃｃｄＢ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子の存在下で生き延びるように変
異していない他の株のＥ．ｃｏｌｉを殺傷する。

【０３３１】 ８．ＳＯＣ培地中での発現後、１０μｌおよび１００μｌをクロラムフェニコ
ール含有（３０μｇ／ｍｌ）プレートにプレーティングし、３７℃にてインキュ
ベートする。

【０３３２】 ９．コロニーを拾い、ミニプレップＤＮＡを作製する。このミニプレップをＲ
Ｎａｓｅ Ａで処理し、そしてＴＥ中で保存する。適切な制限酵素を用いて切断
して、このカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）の方向を決定する。このプラスミドの
タンパク質発現機能のアミノ末端の隣にａｔｔＲ１部位を有するクローンを選択
する。

【０３３３】 （目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を用いることにつ
いての注意） ・本発明者らは、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）が
直鎖状であるかまたは弛緩している場合、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ反応物から約１０倍多くのコロニーが生じることを見出した。使用
するコンピテント細胞が、非常にコンピテントである（１マイクログラムあたり
１０⁸を超える）場合、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ
）を直鎖化することはそれほど必須ではない。

【０３３４】 ・直鎖化のために用いられる部位は、エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ Ｃａ
ｓｓｅｔｔｅ）内になければならない。各カセット内で１回または２回切断する
部位を図８０〜８２に示す。

【０３３５】 ・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）のミニプレップは
、ＲＮａｓｅで処理する限り、良好に作動する。大部分のＤＢ株がｅｎｄＡ−で
ある（本明細書中に参考として援用される、１９９９年３月２日に出願された米
国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照のこと）ので、ミニプレップは、事前
のフェノール抽出を伴わずに制限酵素を用いて消化され得る。

【０３３６】 ・ミニプレップＤＮＡのＯＤ₂₆₀の読み取りは、ＲＮＡおよびリボヌクレオチ
ドが、例えば、ＰＥＧ沈澱によって除去されていなければ、不正確である。

【０３３７】 （実施例１５：適切なエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）およ
び目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）を選択する際のいく
つかのオプション：一例） いくつかの適用では、目的の核酸分子を２つの形態で発現させることが所望さ
れ得る：Ｅ．ｃｏｌｉ中でアミノ末端融合物として、そして真核生物細胞中でネ
イティブタンパク質として。このことは、いくつかの方法のうちのいずれかによ
って達成され得る： オプション１：選択は、目的の核酸分子およびこの核酸分子を含むフラグメン
ト、ならびに入手可能なエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）に依
存する。真核生物の翻訳については、Ｋｏｚａｋ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６６：１９８６７，１９９１）によるコンセンサス塩基を開始メチオニン（ＡＴ
Ｇ）コドンの付近に必要とする。全てのエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅ
ｃｔｏｒ）は、このモチーフをＸｍｎＩ部位（平滑カッター）の上流に提供する
。１つのオプションは、目的の核酸分子をそのＡＴＧを伴ってＰＣＲによって増
幅し、アミノ末端を平滑にし、そして天然の停止コドン、続いて「右側の」制限
部位（ｐＥＮＴＲベクターのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶまた
はＸｂａＩ）のうちの１つを含むカルボキシ末端を平滑にすることである。

【０３３８】 目的の核酸分子が、例えば、ＸｈｏＩ部位を有さないことがわかっている場合
、この構造を有するＰＣＲ産物を作製し得る：

【０３３９】

【化２２】 ＸｈｏＩで切断した後、このフラグメントは、クローニングする準備ができて
いる：

【０３４０】

【化２３】 （この例に従う場合、アミノオリゴ上にリン酸をつけることを忘れないように。
） オプション２：このＰＣＲ産物は、２つのエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ
Ｖｅｃｔｏｒ）にＸｍｎＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローニングされて、所
望の産物を生じ得る：ｐＥＮＴＲ１Ａ（図１０Ａ、図１０Ｂ）またはｐＥＮＴＲ
７（図１６Ａ、図１６Ｂ）。ｐＥＮＴＲ１Ａにクローニングする場合、アミノ融
合物は、最少数のアミノ酸を、融合ドメインと目的の核酸分子との間に有するが
、この融合物は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて除去され得ない。ｐＥＮＴＲ７に
おけるクローンについて逆もまた正しい。すなわち、アミノ融合物は、融合物と
目的の核酸分子との間でより多くのアミノ酸を犠牲にしてＴＥＶプロテアーゼを
用いて切断され得る。

【０３４１】 この実施例では、本発明者らは、本発明者らの仮想の目的の核酸分子をＸｍｎ
Ｉ部位とＸｈｏＩ部位との間でｐＥＮＴＲ７にクローニングすることにする。一
旦このことが達成されたら、エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）ｐ
ＥＮＴＲ７を用いたいくつかの任意のプロトコルが続き得る： オプション３：目的の核酸分子がＰＣＲを用いて増幅されたので、目的の核酸
分子を配列決定することが所望され得る。これを行うために、エントリーベクタ
ー（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）由来の目的の核酸分子を、標準的な配列決定プ
ライマーについてのプライミング部位を有するベクター中に移入する。このよう
なベクターは、ｐＤＥＳＴ６である（図２６Ａ、図２６Ｂ）。この目的ベクター
（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）は、目的の核酸分子を、ｌａｃプロ
モーター（これは、漏出性である−−上記の実施例３を参照のこと）とは逆の方
向に配置する。遺伝子産物がＥ．ｃｏｌｉに対して毒性である場合、この目的ベ
クター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）はその毒性を最小にする。

【０３４２】 オプション４：配列決定を続ける間、目的の核酸分子をＣＭＶプロモーターベ
クター（ｐＤＥＳＴ７、図２７；またはｐＤＥＳＴ１２、図３２）中に、または
バキュロウイルスベクター（ｐＤＥＳＴ８、図２８；またはｐＤＥＳＴ１０、図
３０）中に昆虫細胞における発現のために組換えることにより、例えば、ＣＨＯ
細胞における目的の核酸分子の発現をチェックすることを望み得る。これらのベ
クターは両方とも、目的の核酸分子のコード配列を転写し、ＸｍｎＩ部位の上流
のコザック塩基を用いてこれをＰＣＲ産物のＡＴＧから翻訳する。

【０３４３】 オプション５：例えば、抗体を作製するためにタンパク質を精製することを望
む場合、目的の核酸分子をＨｉｓ６融合物ベクターｐＤＥＳＴ２（図２２）中に
クローニングし得る。目的の核酸分子は、ｐＥＮＴＲ７（図１６）のＴＥＶプロ
テアーゼ切断ドメインの下流にクローニングされるので、産生されるタンパク質
のアミノ酸配列は、以下である：

【０３４４】

【化２４】 目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）およびエントリーベ
クター（Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ）を作製するために用いられたａｔｔＢ部位
および制限部位は、下線の１１アミノ酸（ＧＩＴＳＬＹＫＫＡＧＦ）中に翻訳さ
れる。ＴＥＶプロテアーゼでの切断（矢印）は、２つのアミノ酸ＧＴを遺伝子産
物のアミノ末端に残す。

【０３４５】 平滑（アミノ）−ＸｈｏＩ（カルボキシ）フラグメントとしてｐＥＮＴＲ７（
図１６）中にクローニングされ、次いでＨｉｓ６融合ベクターｐＤＥＳＴ２（図
２２）中への組換えによってクローニングされた、目的の核酸分子の例クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子について、図５５を
参照のこと。

【０３４６】 オプション６：Ｈｉｓ６融合タンパク質が不溶性である場合、続けて、そして
ＧＳＴ融合を試み得る。適切な目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターはｐＤ
ＥＳＴ３（図２３）である。

【０３４７】 オプション７：ＲＮＡプローブを作製することを必要とし、そしてＳＰ６ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを好む場合、ｐＳＰＯＲＴ＋（ｐＤＥＳＴ５（図２５Ａ、図２
５Ｂ））中にクローニングされた目的の核酸分子を用いてトップ鎖ＲＮＡを作製
し得、そしてｐＳＰＯＲＴ（−）（ｐＤＥＳＴ６（図２６Ａ、２６Ｂ））中にク
ローニングされた目的の核酸分子を用いてボトム鎖ＲＮＡを作製し得る。Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼについての対向するプロ
モーターもまたこれらのクローン中に存在する。

【０３４８】 オプション８：目的の核酸分子を種々の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏ
ｎ Ｖｅｃｔｏｒ）中に同じ実験でクローニングすることはしばしばやりがいが
ある。例えば、コロニーの数が、種々の組換え反応物をＥ．ｃｏｌｉ中に形質転
換したときに広範に変動する場合、これは、目的の核酸分子がある状況では毒性
であることの指標であり得る。（この問題は、ポジティブなコントロール遺伝子
を各目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）について用いる場
合、より明白に明らかである。）詳細には、目的の核酸分子を、ｐＤＥＳＴ５に
組換えたときよりもｐＤＥＳＴ６に組換えたときにより多くのコロニーが得られ
る場合、ｌａｃプロモーターの漏出性が、ｐＳＰＯＲＴ「＋」中で目的の核酸分
子のいくらかの発現を引き起こすという良好な機会が存在する（目的の核酸分子
は逆方向で存在するので、これは、ｐＤＥＳＴ６中では有害ではない）。

【０３４９】 （実施例１６：組換えクローニング反応を介した発現クローンへのＰＣＲ産物
（または発現クローン）の１チューブ移入の実証） 本明細書中に記載されるＢｘＰ組換え（エントリー（Ｅｎｔｒｙ）またはＧａ
ｔｅｗａｒｄ）反応では、アンピシリン耐性を付与するプラスミドにおけるａｔ
ｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位が隣接したＤＮＡセグメントを、カナマイシン
耐性を付与するａｔｔＰプラスミドへの組換えによって移入し、このことは、産
物分子をもたらし、ここで、ＤＮＡセグメントには、ａｔｔＬ部位（ａｔｔＬ１
およびａｔｔＬ２）が隣接していた。この産物プラスミドは、「ａｔｔＬエント
リークローン（ａｔｔＬ Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）」分子を含む。なぜなら、
これは、「ａｔｔＲ目的ベクター（ａｔｔＲ Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃ
ｔｏｒ）」分子とＬｘＲ（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）反応を介して反応し得、Ｄ
ＮＡセグメントの新規な（アンピシリン耐性）ベクターへの移入をもたらすから
である。以前に記載された例では、ＢｘＰ反応産物をＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換
し、カナマイシン耐性コロニーを選択し、これらのコロニーを液体培養中で増殖
させ、そしてミニプレップＤＮＡを調製し、その後、このＤＮＡを目的ベクター
（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）とＬｘＲ反応において反応させるこ
とが必要であった。

【０３５０】 以下の実験の目的は、ＢｘＰ反応（ＢｘＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物を直接Ｌ
ｘＲ反応物（ＬｘＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に添加することによって形質転換工程
およびミニプレップＤＮＡ工程を除去することであった。これは、ａｔｔＢ部位
に隣接したＤＮＡセグメントが、プラスミドの代わりにＰＣＲ産物である場合、
特に適切である。なぜなら、ａｔｔＢプラスミドは（一般に）アンピシリン耐性
遺伝子を保有するが、ＰＣＲ産物は、形質転換によってアンピシリン耐性コロニ
ーを与えることができないからである。従って、ＢｘＰ反応（ＢｘＰ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）におけるａｔｔＢ部位に隣接したＰＣＲ産物の使用は、その後のＬｘ
Ｒ反応（ＬｘＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の所望のａｔｔＢ産物によってコードされ
るアンピシリン耐性について選択することを可能にする。

【０３５１】 以下の２つの反応を調製した：反応Ａ、ネガティブコントロール（非ａｔｔＢ
ＰＣＲ産物）（８μｌ）が、５０ｎｇのｐＥＺＣ７１０２（ａｔｔＰ ドナー
プラスミドであり、カナマイシン耐性を付与する）および２μｌのＢｘＰ Ｃｌ
ｏｎａｓｅ（２２ｎｇ／μｌ Ｉｎｔタンパク質および８ｎｇ／μｌ ＩＨＦタ
ンパク質）をＢｘＰ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐＨ７．８）、７０
ｍＭ ＫＣＩ、５ｍＭ スペルミジン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ）中に含んだ。反応Ｂ（２４μｌ）が、１５０ｎｇ ｐＥＺＣ７１０
２、６μｌ ＢｘＰ Ｃｌｏｎａｓｅ、および１２０ｎｇのａｔｔＢ−ｔｅｔ−
ＰＣＲ産物を、反応Ａと同じ緩衝液中に含んだ。このａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ
産物は、プラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだ。この
産物を、ａｔｔＢ１部位またはａｔｔＢ２部位のいずれかを含みかつ上記のよう
にその５’末端に４つのＧを有する２つのプライマーを用いて増幅した。

【０３５２】 この２つの反応を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらの反
応物のアリコートを、ＬｘＲ反応またはＬｘＲ反応の適切なコントロールを含む
新規な成分に添加した。５つの新規な反応をこのようにして生成した： 反応１：５μｌの反応Ａを、２５ｎｇのＮｃｏＩ切断したｐＥＺＣ８４０２（
ａｔｔＲ目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）プラスミド）
をＬｘＲ緩衝液（３７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐＨ７．７）、１６．５ｍ
Ｍ ＮａＣＩ、３５ｍＭ ＫＣＩ、５ｍＭスペルミジン、３７５μｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ）中に含み、そして１μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを含む、５μｌのＬｘＲ反応物に添加した（総容量１０μ
ｌ）。

【０３５３】 反応２：反応１と同じ。ただし、反応Ｂ（ポジティブ）のうちの５μｌを、反
応Ａ（ネガティブ）の代わりに添加した。

【０３５４】 反応３：反応２と同じ。ただし、ＮｃｏＩ切断したｐＥＺＣ８４０２およびＧ
ＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘの量を２倍に
し、それぞれ、５０ｎｇおよび２μｌにした。

【０３５５】 反応４：反応２と同じ。ただし、２５ｎｇのｐＥＺ１１１０４（ポジティブコ
ントロールのａｔｔＬエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ Ｃｌｏｎｅ）プラスミ
ド）を反応Ｂのアリコートに加えて添加した。

【０３５６】 反応５：ポジティブコントロールＬｘＲ反応。２５ｎｇのＮｃｏＩ切断したｐ
ＥＺＣ８４０２、２５ｎｇのｐＥＺ１１１０４、３７．５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７．７）、１６．５ｍＭのＮａＣＩ、３５ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭのスペ
ルミジン、３７５μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ
Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを、総容量５μｌにて含む。

【０３５７】 ５つの反応すべてを、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、上記の
５つの反応の各々の１μｌのアリコート、および反応Ｂの残りの容量（標準Ｂｘ
Ｐ反応）からの１μｌを、５０μｌのコンピテントＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉを形
質転換するために使用した。ＤＮＡおよび細胞を、氷上で１５分間インキュベー
トし、４２℃で４５秒間ヒートショックし、そして４５０μｌのＳＯＣを添加し
た。各チューブを、３７℃で振盪しながら６０分間インキュベートした。各形質
転換の１００μｌおよび４００μｌのアリコートを、５０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンまたは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンのいずれかを含むＬＢプレート上に
プレーティングした（表２を参照のこと）。１０ｐｇのｐＵＣ１９ ＤＮＡを用
いた形質転換（ＬＢ−ａｍｐ₁₀₀上にプレーティングした）が、ＤＨ５α細胞の
形質転換効率に関するコントロールとして役立った。３７℃で一晩のインキュベ
ーション後、各プレート上のコロニーの数を測定した。

【０３５８】 これらの反応の結果を、表２に示す。

【０３５９】

【表６】 反応３から得られた４３コロニーのうちの３４個を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中に釣菌し、そしてこれ
らの培養物を、３７℃で振盪しつつ一晩増殖させた。３４個の培養物のうちの２
７個が、少なくとも中程度の増殖を生じ、そしてこれらのうちの２４個を使用し
、標準的プロトコルを使用して、ミニプレップＤＮＡを調製した。これらの２４
個のＤＮＡを、１％アガロースゲル上でスーパーコイルド（ＳＣ）ＤＮＡとして
まず分析して、インサートを有するものを同定し、そしてそのインサートのサイ
ズを評価した。この２４個のサンプルのうちの１５個が、ｔｅｔｘ７１０２がｐ
ＥＺＣ８４０２と正しく組換えてｔｅｔｘ８４０２を生じる場合に推測されるサ
イズ（５５５３ｂｐ）のＳＣ ＤＮＡを示した。これらのサンプルのうちの１つ
は、２つのプラスミドを含み、１つは、約５５００ｂｐそして１つは約３５００
ｂｐであった。残りのクローンの大多数は、約４１００ｂｐのサイズであった。

【０３６０】 推定サイズ（約５５００ｂｐ）のＳＣ ＤＮＡを示す１５個のクローンすべて
を、制限エンドヌクレアーゼを用いての２つの別個の二重切断によって分析して
、予測産物ｔｅｔｘ８４０２の構造を確認した。（プラスミド地図、図５７〜５
９を参照のこと）。１組の切断において、このＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏ
ＲＩで処理した。これれは、両方のａｔｔＢ部位のちょうど外側でこの推定産物
を切断して、１４７５ｂｐのフラグメント上にあるｔｅｔ^rインサートを解放す
るはずである。第２の組の切断において、このＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＮｒｕ
Ｉで切断した。ＮｒｕＩは、サブクローン化されたｔｅｔ^rインサート内で非対
称的に切断し、そしてＮｏｔＩとともに、１０１９ｂｐのフラグメントを解放す
る。

【０３６１】 二重制限切断により分析した１５個のクローンのうち、１４個が、予測産物の
フラグメントの推定サイズを示した。

【０３６２】 （解釈） 反応ＢのＤＮＡ成分であるｐＥＺＣ７１０２およびａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ
が、図５６に示される。ＢｘＰ反応Ｂの所望の産物は、ｔｅｔｘ７１０２であり
、これは、図５７に示される。このＬｘＲ反応は、ＢｘＰ反応の産物であるｔｅ
ｔｘ７１０２（図５７）を、図５８に示される目的ベクターであるｐＥＺＣ８４
０２と組換える。ｔｅｔｘ７１０２およびｐＥＺＣ８４０２を用いるＬｘＲ反応
は、図５９に示される所望の産物ｔｅｔｘ８４０２を生じると推測される。

【０３６３】 反応２は、ＢｘＰ反応およびＬｘＲ反応を含み、ネガティブコントロール反応
のコロニーより多いコロニーをほんの少しかしか生じなかった。対照的に、反応
３は、２倍量のｐＥＺＣ８４０２（図５８）およびＬｘＲ Ｃｌｉｎａｓｅを用
い、多数のコロニーを生じた。これらのコロニーをさらに、制限消化により分析
して、予測産物の存在を確認した。反応４は、混合ＢｘＰ＋ＬｘＲ反応において
、既知の量のａｔｔＬエントリークローンプラスミドを含んだ。しかし、反応４
は、同じＤＮＡをＬｘＲ反応単独において使用した場合（反応６）に得られるコ
ロニーの約１％しか生じなかった。この結果は、このＬｘＲ反応が、ＢｘＰ反応
の成分によって阻害され得ることを示唆する。

【０３６４】 反応３の産物の制限エンドヌクレアーゼ分析によって、かなり大きい比率のコ
ロニー（分析した３４個のうちの１４個）が、所望のｔｅｔ^rサブクローンであ
るｔｅｔｘ８４０２を含むことが明らかになった（図５９）。

【０３６５】 上記の結果は、最初にＢｘＰ組換え反応、続いてＬｘＲ組換え反応を−−同じ
チューブにて−−適切な緩衝液混合物、組換えタンパク質、およびＤＮＡを完了
したＢｘＰ反応に単に添加することによって実施するという、可能性を確立する
。この方法は、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を別個の発現クローンに転換するより速
い方法として有用であることを証明し、これらを目的ベクターと組換える前にま
ず中間体ａｔｔＬ−ＰＣＲインサートサブクローンを単離する必要性を排除する
はずである。これは、これらの反応の自動化適用に特に有益であることを証明し
得る。

【０３６６】 この同じ１つのチューブでのアプローチによって、ａｔｔＢプラスミドクロー
ンに含まれる核酸分子を、新規な機能性ベクターに迅速に移入することも可能で
ある。上記の例におけるように、ＢｘＰ反応にて生成されるａｔｔＬサブクロー
ンを、ＬｘＲ反応において種々の目的ベクターと直接組換え得る。ａｔｔＢ含有
ＰＣＲ産物の代わりにａｔｔＢプラスミドを使用するためのさらなる唯一の要件
は、使用される目的ベクターが、ａｔｔＢプラスミド自体およびａｔｔＰベクタ
ー上に存在するものと異なる選択マーカーを含まなければならないことである。

【０３６７】 １つのチューブでの反応のための２つの代替的プロトコルもまた、有用である
こと、および上記の条件よりもいくらか最適であることを証明する。

【０３６８】 代替法１： 反応緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ Ｎａ
ＣＩ、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭスペルミジン、および２００μｇ／
ｍｌのＢＳＡを含んだ。ＰＣＲ産物（１００ｎｇ）＋ａｔｔＰドナープラスミド
（１００ｎｇ）＋ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ＋目的ベクター（１００ｎｇ）を１６（または３）時間インキュベーショ
ンした後、２μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ （１０μｌの反応混合物あたり）を添加し、そしてその混合物を２５
℃でさらに６（または２）時間インキュベートした。次いで、停止溶液を上記の
ように添加し、そしてその混合物を上記のように３７℃でインキュベートし、そ
して１μｌを用いてエレクトロコンピテント宿主細胞に、エレクトロポレーショ
ンにより直接形質転換した。この一連の実験の結果は、より長いインキュベーシ
ョン時間（ＢＰ反応については３時間に対して６時間、ＬＲ反応については２時
間に対して６時間）が、短い方のインキュベーション時間に関して得られる約２
倍の多さのコロニーを生じた。２つの独立した遺伝子を用いると、正確なクロー
ニングパターンを有する１０個／１０個のコロニーが得られた。

【０３６９】 代替法２： 代替法１についての上記の反応条件下で、標準ＢＰ反応を、２５で２時間実施
した。このＢＰ反応後、以下の成分を、反応混合物に総容量７μｌにて添加した
： ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＣｌ ５μｇ／ｍｌ Ｘｉｓ−Ｈｉｓ６ １５％グリセロール 約１０００ｎｇの目的ベクター。 次いで、この反応混合物を、２５℃で２時間インキュベートし、そして２．５μ
ｌの停止溶液（２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＬを含む）を添加し、その混合物
を、さらに１０分間３７℃でインキュベートした。次いで、化学的にコンピテン
トな宿主細胞を、２μｌの反応混合物で形質転換するか、またはエレクトロコン
ピテントな宿主細胞（例えば、ＥＭａｘ ＤＨ１０Ｂ細胞；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、２５〜４０μｌの細胞あたり２μｌの反応混
合物でエレクトロポレーションした。形質転換後、混合物をＳＯＣで希釈し、３
７℃でインキュベートし、そして上記のように、その目的ベクターおよびエント
リークローン上の選択マーカーについて選択する培地上にプレーティングした（
Ｂ×Ｐ反応産物）。代替法１について記載される結果と類似の結果が、これらの
反応条件を用いて得られた−−正確に組換えられた反応産物を含むより高レベル
のコロニーが、観察された。

【０３７０】 （実施例１７：組換えクローニング反応を介する、発現クローン（Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｅ）へのＰＣＲ産物（または発現クローン）の１つのチュ
ーブでの移入の実証） 組換えクローニングによる、発現クローンへのＰＣＲ産物ＤＮＡ（または発現
クローン）の１つのチューブでの移入もまた、実施例１６に記載される手順から
改変された手順を使用して達成した。この手順は、以下の通りである： ・標準ＢＰ（Ｇａｔｅｗａｒｄ）反応（実施例９および１０）を、２０μｌの
容量で、２５℃で１時間実施する。

【０３７１】 ・インキュベーションが終了した後、その２０μｌの総容量から１０μｌアリ
コートを採取し、そして１μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２ｍｇ／ｍｌ）を
添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。この第１のアリコートを
、形質転換およびＢＰ反応分析のゲルアッセイのために使用し得る。カナマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上にＢＰ反応形質転換をプレーティン
グする。

【０３７２】 ・以下の試薬を、ＢＰ反応の残りの１０μｌアリコートに添加する： １μｌの０．７５Ｍ ＮａＣｌ ２μｌの目的ベクター（１５０ｎｇ／μｌ） ４μｌのＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM（融解および短い混合の後） ・すべての試薬をよく混合し、そして２５℃で３時間インキュベートする。イ
ンキュベーションの終わりに、この反応を１．７μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ（２ｍｇ／ｍｌ）で停止し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。

【０３７３】 ・完了した反応物２μｌを１００μｌのコンピテント細胞に形質転換する。１
００μｌおよび４００μｌを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプ
レート上にプレーティングする。

【０３７４】 （注記） ・コンピテント細胞が１０⁸ＣＦＵ／μｇ未満であり、そして十分なコロニー
を獲得することが問題である場合は、そのＢＰ反応物を６〜２０時間インキュベ
ートすることによって、収量を数倍改善し得る。エレクトロポレーションもまた
、化学的形質転換よりも良好なコロニー結果を生じ得る。

【０３７５】 ・約５〜６ｋｂよりも大きいＰＣＲ産物は、このＢＰ反応において有意により
低いクローニング効率を示す。この場合、本発明者らは、ＢＰ工程およびＬＲ工
程の両方について、より長いインキュベーション時間を使用することを薦める。

【０３７６】 ・インサート遺伝子をいくつかの目的ベクター中に同時に移すことを所望する
場合は、各目的ベクターに添加するために１０μｌのアリコートを有するように
、最初のＢＰ反応容量をスケールアップする。

【０３７７】 （実施例１８：ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎａｓｅ^TM酵素組成物の最適化） ＩｎｔおよびＩＨＦ（ＢＰ反応について）を含む酵素組成物を、標準の機能的
組換えクローニング反応（ＢＰ反応）を使用して、以下のプロトコルによって、
ａｔｔｂ含有プラスミドとａｔｔＰ含有プラスミドとの間で最適化した。

【０３７８】 （材料および方法） （基質） ＡｔｔＰ−スーパーコイルドｐＤＯＮＲ２０１ ＡｔｔＢ−線状の約１Ｋｂの[³Ｈ]ＰＣＲ産物（ｐＥＺＣ７５０１から増幅し
た） （タンパク質） ＩｎｔＨ６−−Ｈｉｓ₆−カルボキシタグ化λインテグラ−ゼ（Ｉｎｔｅｇｒ
ａｓｅ） ＩＨＦ−−組換え宿主因子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｈｏｓｔ Ｆａｃｔｏ
ｒ） （Ｃｌｏｎａｓｅ） ５０ｎｇ／μｌのＩｎｔＨ６および２０ｎｇ／μｌのＩＨＦを、２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｉ（ｐＨ７．５）、２２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５ｍＭスペルミジン、および５０％グリセロール中に混合し
ている。

【０３７９】 （反応混合物（総容量４０μｌ） １０００ｎｇのＡｔｔＰプラスミド ６００ｎｇのＡｔｔＢ[³Ｈ]ＰＣＲ産物 ８μｌのＣｌｏｎａｓｅ（４００ｎｇ ＩｎｔＨ６、１６０ｎｇ ＩＨＦ）が
、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５ｍＭスペルミジン、５ｍＭ ＤＴＴ中にあ
る。

【０３８０】 反応混合物を、２５℃で１時間インキュベートし、４μｌの２μｇ／μｌのプ
ロテイナーゼＫを添加し、そして混合物を、さらに２０分間３７℃でインキュベ
ートした。次いで、混合物を、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコールで抽出した。次いでその水層を、収集し、そして０．１容量の３Ｍ酢
酸ナトリウムおよび２容量の冷１００％エタノールを添加した。次いで、チュー
ブを、微小遠心機にて、最大ＲＰＭで、室温で１０分間遠心分離した。エタノー
ルをデカントし、そしてペレットを７０％エタノールでリンスし、そして上記の
ように再遠心分離した。エタノールをデカントし、そしてペレットを５〜１０分
間風乾し、次いで、２０μｌの、３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．８）、６
６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍ
Ｍ ＡＴＰ中に溶解し、次いで、２単位のエキソヌクレアーゼＶ（例えば、Ｐｌ
ａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
）を添加し、そしてその混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。

【０３８１】 次いで、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃフィルター上に３０μｌの反応混合物をス
ポットし、フィルターを１０％ ＴＣＡ＋１％ ＮａＰＰｉで１回、１０分間洗
浄し、５％ＴＣＡで３回、各５分間洗浄し、そしてエタノールで２回、各５分間
洗浄することによって、サンプルを、ＴＣＡ洗浄した。次いで、フィルターを加
熱ランプ下で乾燥させ、シンチレーションバイアル中に移し、そしてβ液体シン
チレーション計数管（ＬＳＣ）にて計数した。

【０３８２】 このアッセイの背後にある原理は、エキソヌクレアーゼＶ切断の後、二本鎖環
状ＤＮＡのみが、酸不溶性形態で残存することである。遊離末端を有するすべて
のＤＮＡ基質および産物が切断されて酸可溶性形態になり、フィルター上に残存
しない。従って、分子内組み込みおよび分子間組み込みの両方が完了した後に環
状形態である、³Ｈ標識ａｔｔＢ線状ＤＮＡのみが、切断に対して抵抗性であり
、そして酸不溶性産物として回収される。従って、このＣｌｏｎａｓｅ組成物に
おける最適な酵素処方物および緩衝液処方物は、最高レベルの環状化した³Ｈ標
識ａｔｔＢ含有配列を、ＬＳＣ中の最高のｃｐｍによって測定した場合に生じた
処方物である。このアッセイは、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ組成物（Ｉｎｔ＋ＩＨＦ）の最適化のために設計したが、
同じ型のアッセイを、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｍｉｘ組成物（Ｉｎｔ＋ＩＨＦ＋Ｘｉｓ）を最適にするために実施し得、た
だし、その反応混合物は、１０００ｎｇのＡｔｔＲ（ＡｔｔＰの代わり）および
６００ｎｇのＡｔｔＬ（ＡｔｔＢの代わり）、および４０ｎｇのＨｉｓ⁶−カル
ボキシタグ化Ｘｉｓ（ＸｉｓＨ６）を、ＩｎｔＨ６およびＩＨＦに加えて含む。

【０３８３】 （実施例１９：エントリーベクターおよび目的ベクターの機能性の試験） 本発明の特定のベクターの機能性の評価の一環として、そのベクターが組換わ
る能力を機能的に試験することが重要である。この評価は、組換えクローニング
反応を（図２、４、および５Ａおよび５Ｂに図式化され、そして本明細書中に記
載され、そして共有に係る米国特許出願番号０８／４８６，１３９（１９９５年
６月７日出願）、同０８／６６３，００２（１９９６年６月７日出願）（現在米
国特許第５，８８８，７３２号）、同０９／００５，４７６（１９９８年１月１
２日出願）、および同０９／１７７，３８７（１９９８年１０月２３日出願）（
これらのすべての開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記
載されるように）実施し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてコロニー形成単位
をスコア化することによって、実行し得る。しかし、代替的アッセイもまた、ア
ガロースゲル電気泳動による所定のエントリーベクターまたは目的ベクターの機
能性のより迅速でより簡単な評価を可能にするために実施し得る。以下が、この
ようなインビトロアッセイの説明である。

【０３８４】 （材料および方法：） プラスミドテンプレートｐＥＺＣ１３０１（図８４）およびｐＥＺＣ１３１３
（図８５）（各々、単一の野生型ａｔｔ部位を含む）を、それぞれ、ａｔｔＬま
たはａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物の生成のために使用した。プラスミドテンプ
レートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖状にし、フェノール抽出し、エタノール沈殿
して、１ｎｇ／μｌの濃度までＴＥ中に溶解した。

【０３８５】

【表７】 ＰＣＲプライマーを、５００ｐｍｏｌ／μｌの濃度までＴＥ中に溶解した。プラ
イマー混合物を調製した。プライマー混合物を調製し、これは、ａｔｔＬ１＋ａ
ｔｔＬｒｉｇｈｔプライマー、ａｔｔＬ２＋ａｔｔＬｒｉｇｈｔプライマー、ａ
ｔｔＲ１＋ａｔｔＲｒｉｇｈｔプライマー、およびａｔｔＲ２＋ａｔｔＲｒｉｇ
ｈｔプライマーからなり、各混合物は、２０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマーを含
んでいた。

【０３８６】 （ＰＣＲ反応：） １μｌのプラスミドテンプレート（１ｎｇ） １μｌのプライマー対（各々、２０ピコモル） ３μｌのＨ２Ｏ ４５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（登録商標）（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。

【０３８７】 （サイクリング条件（ＭＪサーモサイクラーで行った）：） ９５℃／２分 ９４℃／３０秒 ５８℃／３０秒および７２℃／１．５分間の２５サイクル ７２℃／５分 ５℃／維持。

【０３８８】 得られたａｔｔＬ ＰＣＲ産物は１．５ｋｂであり、そして得られたａｔｔＲ ＰＣＲ産物は、１．０ｋｂであった。

【０３８９】 ＰＣＲ反応物を、１５０μｌのＨ₂Ｏおよび１００μｌの３×ＰＥＧ／ＭｇＣ
ｌ₂溶液を添加することによりＰＥＧ／ＭｇＣｌ₂沈澱し、次いで、遠心分離した
。このＰＣＲ産物を５０μｌのＴＥ中に溶解した。ＰＣＲ産物の定量を、これを
１μｌ、ゲル電気泳動で行い、５０〜１００ｎｇ／μｌであると評価した。

【０３９０】 ａｔｔＬまたはａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物の、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMプラスミ
ドとの組換え反応を以下の通りに行った： ８μｌのＨ２Ｏ ２μｌのａｔｔＬまたはａｔｔＲのＰＣＲ産物（１００〜２００ｎｇ） ２μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TMプラスミド（１００ｎｇ） ４μｌの５×目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）緩衝液 ４μｌのＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 総容量２０μｌ（反応を、構成成分の容量を上記で示した量の約１／４に調節
することにより総容量５μｌにスケールダウンし得るが、化学量論性は同じに維
持する）。

【０３９１】 Ｃｌｏｎａｓｅ反応物を２５℃で２時間インキュベートした。２μｌのプロテ
イナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）を添加して、反応を停止させる。次いで、１０μｌ
を１％アガロースゲル上で泳動する。陽性コントロール反応を、ａｔｔＬ１ Ｐ
ＣＲ産物（１．０ｋｂ）とａｔｔＲ１ ＰＣＲ産物（１．５ｋｂ）とを反応させ
、そしてａｔｔＬ２ ＰＣＲ産物とａｔｔＲ２産物とを同様に反応させることに
より行って、より大きな（２．５ｋｂ）組換え反応産物の形成を観察した。陰性
コントロールを、ａｔｔＬ１ ＰＣＲ産物とａｔｔＲ２ ＰＣＲ産物とを反応さ
せ、そしてその逆もまた同様に反応させるか、またはａｔｔＬ ＰＣＲ産物とａ
ｔｔＬプラスミドとの反応になどより行った。

【０３９２】 代替的アッセイにおいて、ａｔｔＢ エントリーベクターを試験するために、
単一のａｔｔＰ部位を含有するプラスミドを用いた。単一のａｔｔ部位を含有す
るプラスミドをまた、全てのエントリーおよび目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）
ベクター（すなわち、それらは、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ
を含む）を試験するために、一般に、組換え基質として使用し得た。これは、Ｐ
ＣＲ反応を行う必要性を排除する。

【０３９３】 （結果：） 目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）およびエントリー（Ｅｎｔｒｙ）プラスミド
は、適切なａｔｔ含有ＰＣＲ産物と反応した場合、直鎖状の組換え分子を形成し
、この組換え分子は、ａｔｔＬのＰＣＲ産物も、ａｔｔＲのＰＣＲ産物も含まな
いコントロール反応物と比較した場合に、アガロースゲル上で容易に視覚化され
得た。従って、本発明に従って構築された目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）およ
びエントリーベクターの機能性は、図２、４、ならびに５Ａおよび５Ｂに記載さ
れるように、目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）またはエントリーいずれかの組換
え反応を行うことによって決定されうるか、または本実施例に記載の直鎖化アッ
セイを行うことによりより迅速に決定されうる。

【０３９４】 （実施例２０：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ アダプター−プライマーを用いたＰＣＲ
クローニング） 本明細書中に記載のように、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，ＭＤ）を用いたＰＣＲ産物のクローニングは、ＰＣＲ反応において使用さ
れる遺伝子特異的プライマーの末端にａｔｔＢ部位（ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ
２）の付加を必要とする。先の実施例において記載されたプロトコルは、ユーザ
ーが、遺伝子特異的プライマーに２９ｂｐ（ａｔｔＢ部位を含有する２５ｂｐお
よび４つのＧ残基）を付加することを示唆する。アダプターに特定の重複を含む
より短い遺伝子特異的プライマーを組み合わせてＵｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢ
アダプター−プライマーを用い、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を作製することは、Ｇ
ＡＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの高容量ユーザーに有
利である。以下の実験は、６ｂｐ〜１８ｂｐの種々の長さの重複を含むＵｎｉｖ
ｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを
用いて、このストラテジーの有用性を実証する。この結果により、１０ｂｐ〜１
８ｂｐの重複を有する遺伝子特異的プライマーが、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔ
Ｂアダプター−プライマーとともにＰＣＲ増幅に首尾よく使用されて、全長ＰＣ
Ｒ産物が作製されうることを実証する。次いで、これらのＰＣＲ産物を、ＧＡＴ
ＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて特定の配向におい
て高い忠実度で首尾よくクローニングし得る。

【０３９５】 （材料および方法：） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマーが、ＰＣＲ反応物中に
部分的ａｔｔＢ部位を含む遺伝子特異的プライマーとともに使用されて、全長Ｐ
ＣＲ産物を生成しうることを実証するために、ヒトヘモグロビンｃＤＮＡの小さ
な２５６ｂｐ領域を標的として選択し、その結果、中間サイズの産物は、アガロ
ースゲル電気泳動により全長産物とは区別し得る。

【０３９６】 以下のオリゴヌクレオチドを使用した：

【０３９７】

【化２５】 これらの実験の目的は、単純かつ効率的なＵｎｉｖｅｒｓａｌアダプターＰＣ
Ｒ方法を開発して、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ
における使用のために適切な、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を生成することであった
。反応混合物およびサーモサイクリング条件は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌアダプター
ＰＣＲ方法が、いずれのＰＣＲ産物クローニング適用に対しても慣用的に適用可
能であり得るように単純かつ効率的であるはずである。

【０３９８】 １８ｂｐおよび１５ｂｐ重複を含有する遺伝子特異的プライマーをＵｎｉｖｅ
ｒｓａｌ ａｔｔＢプライマーとともに使用して、優先的に全長ＰＣＲ産物を首
尾よく増幅し得るＰＣＲ反応条件を最初に見いだした。これらの条件は以下に概
略を述べる： １０ピコモルの遺伝子特異的プライマー １０ピコモルのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマー １ｎｇの、ヒトヘモグロビンｃＤＮＡ含有プラスミド １００ｎｇのヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ ５μｌの１０×ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＨｉＦｉ（登録商標）反応緩衝液
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） ２μｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ １μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２μｌのＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＨｉＦｉ（登録商標）（１．０ユニ
ット） Ｈ₂Ｏで総反応容量を５０μｌにする。

【０３９９】 （サイクリング条件：）

【０４００】

【表８】 この方法の効率を評価するために、５０μｌのＰＣＲ反応物のうち２μｌ（１
／２５）を３％アガロースゲル−１０００ゲルで電気泳動した。１２ｂｐ以下の
重複では、１つＵｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプターを含むか、またはＵｎ
ｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプターを含まない、より小さな中間産物がこの反
応で目立った。ＰＣＲ反応条件のさらなる最適化は、遺伝子特異的プライマーお
よびＵｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマーの量を滴定すること
によって得た。ＰＣＲ反応系を、添加したプライマーの量が以下であったことを
除いて、以下に概説するように設定した： ０、１、３または１０ピコモルの遺伝子特異的プライマー ０、１０、３０または１００ピコモルのアダプター−プライマー。

【０４０１】 （サイクリング条件：）

【０４０２】

【表９】 制限量の遺伝子特異的プライマー（３ピコモル）および過剰なアダプター−プ
ライマー（３０ピコモル）の使用により、より小さな中間産物の量が減少した。
これらの反応条件を使用して、目立った全長ＰＣＲ産物を得るために必要な重複
は、１２ｂｐに減少した。遺伝子特異的プライマーおよびアダプタープライマー
の量を、以下のＰＣＲ反応においてさらに最適化した： ０、１、２または３ピコモルの遺伝子特異的プライマー ０、３０、４０または５０ピコモルのアダプター−プライマー。

【０４０３】 （サイクリング条件：）

【０４０４】

【表１０】 ２ピコモルの遺伝子特異的プライマーおよび４０ピコモルのアダプター−プラ
イマーの使用により、中間産物の量はさらに減少し、そして１１ｂｐの重複を含
有する遺伝子特異的プライマーを有する全長ＰＣＲ産物が目立って生じた。ＰＣ
Ｒ反応の成功を、アダプターなしのコントロールを行うことにより任意のＰＣＲ
増幅物において評価しうる。制限量の遺伝子特異的プライマーの使用により、１
／２５〜１／１０のＰＣＲ反応物が標準的なアガロースゲル上で電気泳動した場
合に、わずかに見えるバンドまたはほとんど見えないバンドが得られるはずであ
る。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマーの添加は、はるかに
多くの全収量の産物を伴う強いＰＣＲ反応産物を生じるはずである。

【０４０５】 １８ｂｐ、１５ｂｐ、１２ｂｐ、１１ｂｐおよび１０ｂｐ重複の遺伝子特異的
プライマーを使用した反応からのＰＣＲ産物は、ＣＯＮＣＥＲＴ（登録商標）Ｒ
ａｐｉｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して精製し
た（５００ｂｐより大きなＰＣＲ産物をＰＥＧ沈澱しうる）。精製したＰＣＲ産
物を、引き続き、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
を用いてａｔｔＰ含有プラスミドベクターにクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉに形質転換した。コロニーを選択し、そして適切な抗生物質培地上で計数し、
そして正しい挿入物および配向についてＰＣＲによりスクリーニングした。

【０４０６】 ヒトβグロビン（Ｈｇｂ）遺伝子の一部のプラスミドクローンのａｔｔＢアダ
プターＰＣＲからの未処理の（ｒａｗ）ＰＣＲ産物（未精製）も、ＧＡＴＥＷＡ
Ｙ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ反応において使用した。完全ａｔ
ｔＢ Ｂ１／Ｂ２−Ｈｇｂ、１２Ｂ１／Ｂ２、１１Ｂ１／Ｂ２および１０Ｂ１／
Ｂ２のａｔｔＢ重複Ｈｇｂプライマーで生成したＰＣＲ産物を、ＧＡＴＥＷＡＹ ^TM ｐＥＮＴＲ２１ ａｔｔＰベクター（図４９）に首尾よくクローニングした
。各々から２４コロニー（合計２４×４＝９６）を試験し、そして各々をＰＣＲ
により正確な挿入物を含むことを確認した。ｃｆｕ／ｍｌで表したクローニング
効率を以下に示す：

【０４０７】

【表１１】 興味深いことに、重複ＰＣＲ産物は、完全ａｔｔＢ ＰＣＲ産物より高効率で
クローニングされた。おそらく、そしてアガロースゲル上で可視化することによ
り確認されるように、アダプターＰＣＲ産物は、完全ａｔｔＢＰＣＲ産物よりわ
ずかに明瞭であった。コロニー生成量（ｏｕｔｐｕｔ）の差異はまた、インタク
トなａｔｔＢ部位を有するＰＣＲ産物分子の割合を反映しうる。

【０４０８】 ａｔｔＢアダプターＰＣＲ方法を使用すると、１２ｂｐ ａｔｔＢ重複を有す
るＰＣＲプライマーを使用して、白血球ｃＤＮＡライブラリーおよびＨｅＬａの
総ＲＮＡから調製した第１鎖ｃＤＮＡから、異なるサイズのｃＤＮＡを増幅した
（１〜４ｋｂの範囲）。４つのｃＤＮＡのうち３つをこの方法により増幅し得た
が、非特異的増幅産物もまた観察された（いくつかの条件下で遺伝子特異的増幅
を妨害した）。この非特異的産物は、ａｔｔＢアダプター−プライマー単独を含
有するが、いずれの遺伝子特異的重複プライマーも存在しない反応系において増
幅した。この非特異的増幅産物は、ＰＣＲ反応のストリンジェンシーを増大させ
、そしてａｔｔＢアダプターＰＣＲプライマー濃度を低下させることにより減少
した。

【０４０９】 これらの結果は、この実施例に記載されるアダプター−プライマーＰＣＲアプ
ローチがクローニングした遺伝子について十分に機能することを示す。これらの
結果はまた、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍと適合
するＰＣＲ産物を増幅するために単純かつ効率的な方法の開発を実証した。ＧＡ
ＴＥＷＡＹ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、部分的にＵｎｉｖｅ
ｒｓａｌ ａｔｔＢアダプター−プライマーと重複するより短い遺伝子特異的プ
ライマーの使用を可能にする。慣用的ＰＣＲクローニング適用において、１２ｂ
ｐ重複の使用が推奨されている。そのため、この実施例に記載の方法は、１７残
基以上までに遺伝子特異的プライマーの長さを減少し、結果としてＧＡＴＥＷＡ
Ｙ^TM ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの高容量ユーザーに対するオリゴ
ヌクレオチド費用のかなりの節減を生じる。さらに、この実施例に記載の方法お
よびアッセイを使用すると、当業者は、他の組換え部位に基づくまたはこれを含
む類似のプライマー−アダプターまたはそのフラグメント（例えば、ａｔｔＬ、
ａｔｔＲ、ａｔｔＰ、ｌｏｘ、ＦＲＴなど）を、慣用的な実験法のみを用いて設
計および使用しうる。

【０４１０】 （実施例２１：バクテリオファージλ ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の変異分
析：部位特異的組換えにおけるａｔｔ部位特異性の決定因子） ａｔｔ部位特異性の決定因子を調査するために、バクテリオファージλ ａｔ
ｔＬおよびａｔｔＲ部位を体系的に変異誘発した。本明細書中に示されるように
、特異性の決定因子を、１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）
内の７ｂｐの重複領域（ＴＴＴＡＴＡＣ、これは、インテグラーゼタンパク質の
切断部位により規定され、そして鎖交換が生じる領域である）に対して以前に位
置づけた。この１５ｂｐコア領域は、４つのλａｔｔ部位全て（すなわち、ａｔ
ｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）で同一である。しかし、このコア領
域は、これまで体系的に変異誘発されておらず、そして変異がａｔｔ部位特異性
における独特な変化を生じることを正確に規定するとは考察されてこなかった。

【０４１１】 従って、部位特異性に対するａｔｔ配列の効果を試験するために、変異ａｔｔ
ＬおよびａｔｔＲ部位をＰＣＲにより生成し、そしてインビトロ部位特異的組換
えアッセイにおいて試験した。このようにして、コアａｔｔ部位の７ｂｐ重複領
域内の全ての可能な単一塩基対変化を生成し、１５ｂｐコアａｔｔ部位ではない
７ｂｐ重複の外側で５つのさらなる変化もまた生成した。各ａｔｔＬ ＰＣＲ基
質を、ａｔｔＲ ＰＣＲ基質の各々とともに、インビトロ組換えアッセイにおい
て試験した。

【０４１２】 （方法） 変異体ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位の組換えの効率および特異性の両方を
試験するために、単純なインビトロの部位特異的組換えアッセイを開発した。ａ
ｔｔＬおよびａｔｔＲのコア領域は、これらの部位の端部近くにあるので、所望
のヌクレオチド塩基変化をＰＣＲプライマー内に取り込み、そして変異体ａｔｔ
ＬおよびａｔｔＲ部位を含む一連のＰＣＲ産物を生成することが可能であった。
ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物を、ＧＡＴＥＷＡＹ^TM ＬＲ Ｃ
ｌｏｎａｓｅ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とのインビトロ反応における基質とし
て使用した。１．５ｋｂのａｔｔＬ ＰＣＲ産物と、１．０ｋｂのａｔｔＲ Ｐ
ＣＴ産物との間の組換えは、２．５ｋｂの組換え分子を生じ、これを、アガロー
スゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色を使用して、モニターした。

【０４１３】 プラスミドテンプレートｐＥＺＣ１３０１（図８４）およびｐＥＺＣ１３１３
（図８５）（各々が単一の野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位をそれぞれ含む）
を、組換え基質の生成のために使用した。以下の列挙は、Ｌ×Ｒ Ｃｌｏｎａｓ
ｅ反応における基質として使用したａｔｔＬ ＰＣＲ産物を生成するためのＰＣ
Ｒ反応において使用したプライマーを示す（大文字は、野生型配列からの変化を
示し、そして下線は、１５ｂｐコアａｔｔ部位内の７ｂｐオーバーラップ領域を
表す；類似のセットのＰＣＲプライマーを使用して、マッチング変位を含むａｔ
ｔＲ ＰＣＲ産物を調製した）： ＧＡＴＥＷＡＹ^TM部位（注：ＧＡＴＥＷＡＹ^TMプラスミド内のａｔｔＬ２配列
は「ａｃｃｃａ」で開始し、一方でこの例におけるａｔｔＬ部位は、「ａｇｃｃ
ｔ」で開始し、コア領域の外側の野生型ａｔｔＬを反映する。）：

【０４１４】

【化２６】 注：最初の９の塩基がｇｇｇｇ ａｇｃｃａであるさらなるベクター（すなわ
ち、１５ｂｐコア領域にすぐ先行する位置のチミンをアデニンで置換する）（こ
れは、上で概説した単一の塩基対の置換（または欠失）を含んでも含まなくても
よく、またこれらの実験において使用され得る）。

【０４１５】 ａｔｔＬ含有ＰＣＲ産物およびａｔｔＲ含有ＰＣＲ産物の組換え反応を、以下
のように実施した：

【０４１６】

【表１２】 Ｃｌｏｎａｓｅ反応物を、２５℃で２時間インキュベートした。 ２μｌの１０×Ｃｌｏｎａｓｅ停止溶液（プロテイナーゼＫ、２ｍｇ／ｍｌ）を
添加して、この反応を停止した。 １０μｌを１％アガロースゲル上で泳動した。

【０４１７】 （結果） 各ａｔｔＬ ＰＣＲ基質を、ａｔｔＲ ＰＣＲ基質の各々を用いて、インビト
ロ組換えアッセイで試験した。７ｂｐオーバーラップの最初の３つの位置（ＴＴ Ｔ ＡＴＡＣ）での変化は、組換えの特異性を強力に変化させた。これらの変異ａ
ｔｔ部位の各々は、野生型と同程度に、その同種パートナー変異体のみで組換え
られた；これらは他のいかなるａｔｔ部位変異によっても検出可能には組換えら
れなかった。対照的に、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）の変化は、部分的
にのみ特異性を変化させた；これらの変異体は、その同種の変異ａｔｔ部位なら
びに野生型ａｔｔ部位で組換えられ、そして７ｂｐオーバーラップの最初の３つ
の位置に変異を有する部位以外の他の全ての変異ａｔｔ部位で部分的に組換えら
れた。７ｂｐオーバーラップの外側での変化は、組換えの特異性に影響を与えず
、いくらかは組換えの効率に影響を与えることが見出された。

【０４１８】 これらの結果に基づいて、ａｔｔ部位特異性に関する以下の規則が決定された
： ・７ｂｐオーバーラップにおける変化のみが、特異性に影響を与える。 ・最初の３つの位置における変化が、特異性に強力に影響を与える。 ・最後の４つの位置における変化が、特異性に弱く影響を与える。

【０４１９】 組換え反応の全体の効率に影響を与えた変異もまた、本方法によって評価され
た。これらの実験において、ａｔｔＬＴ１Ａ基質およびａｔｔＬＣ７Ｔ基質でわ
ずかに増加した（２倍未満）組換え効率が、これらの基質がその同種ａｔｔＲパ
ートナーと反応した場合に、観察された。ａｔｔＬＡ６Ｇ、ａｔｔＬ１４および
ａｔｔＬ１５を含む、組換え効率（約２〜３倍）を減少させる変異もまた観察さ
れた。これらの変異は、恐らく、コアａｔｔ部位で結合するＩｎｔタンパク質に
影響を与える変化を反映する。

【０４２０】 これらの実験の結果は、７ｂｐの最初の３つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）におけ
る変化が、組換えの特異性を強力に変化させた（すなわち、１つ以上の変異を最
初の３つのチミジンに有するａｔｔ配列は、その同種パートナーとのみ組換わり
、そして他のいかなるａｔｔ部位変異とも交差反応しない）ことを実証する。対
照的に、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）における変異は、部分的にのみ特
異性を変化させた（すなわち、１つ以上の変異を最後の４つの塩基位置に有する
ａｔｔ配列は、７ｂｐオーバーラップの最初の３つの位置の１つ以上に変異を有
する部位以外の、野生型ａｔｔ部位および全ての他の変異ａｔｔ部位と部分的に
交差反応する）。７ｂｐオーバーラップの外側の変異は、組換えの特異性に影響
を与えないことがわかり、いくらかは組換えの効率に影響を与える（すなわち、
組換えの効率の減少を引き起こす）ことがわかった。

【０４２１】 （実施例２２： ＧＡＴＥＷＡＹ^TM クローニング反応のクローニング効率を
増加させるａｔｔ部位変異の発見） ａｔｔ部位特異性の決定を理解するために設計される実験において、ａｔｔＬ
のコア領域における点変異を作製した。次いで、これらの変異ａｔｔＬ配列を含
む核酸分子を、ＬＲ反応において、同種ａｔｔＲ部位（すなわち、ａｔｔＬ部位
の変異に対応する変異を含むａｔｔＲ部位）を含む核酸分子と反応させ、そして
組換え効率を上記のように決定した。ａｔｔ部位のコア領域に位置するいくつか
の変異を、組換え反応の効率をわずかに増加した（２倍未満）かまたは減少した
（２倍〜４倍の間）のいずれかと記載した（表３）。

【０４２２】

【表１３】 これらの変異は、恐らく、インテグラーゼタンパク質のコアａｔｔ部位を結合
するための相対的親和性を、それぞれ増加または減少させるいずれかの変化を反
映することもまた、注目された。インテグラーゼコア結合部位のコンセンサス配
列（ＣＡＡＣＴＴＮＮＴ）は、文献で推定されているが、直接的には試験されて
いない（例えば、ＲｏｓｓおよびＬａｎｄｙ、Ｃｅｌｌ ３３：２６１−２７２
（１９８３）を参照のこと）。このコンセンサスコアインテグラーゼ結合配列は
、ａｔｔＰおよびａｔｔＢに見出される４つのコアａｔｔ部位の各々の配列、な
らびにコア配列に類似し、そしてインビトロでインテグラーゼが結合することが
示された５つの非ａｔｔ部位の配列を比較することによって、確立された。これ
らの実験は、インテグラーゼのコアａｔｔ部位への結合を増加させる、従ってＧ
ＡＴＥＷＡＹ^TMクローニング反応の効率を増加させる、多くのａｔｔ部位変異が
同定され得ることを示唆する。

【０４２３】 （実施例２３： 組換え効率に対するコア領域変異の効果） ａｔｔ部位コア領域における変異のクローニング効率を直接比較するために、
単一の塩基の変化を、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２ ＰＣＲ産物のａｔｔＢ
２部位に作製した。次いで、これらの変異ａｔｔＢ２配列を含む核酸分子を、Ｂ
Ｐ反応において、非同種ａｔｔＰ部位（すなわち、野生型ａｔｔＰ２）を含む核
酸分子と反応させ、そして組換え効率を上記のように決定した。標準的なａｔｔ
Ｂ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２ ＰＣＲ産物と比較した、これらの変異ａｔｔＢ２含
有ＰＣＲ産物のクローニング効率を、表４に示す。

【０４２４】

【表１４】 上記で注目したように、ａｔｔＢ２．２部位における単一の塩基の変化は、ａ
ｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２ ＰＣＲ産物と比較して、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−
ａｔｔＢ２．２ ＰＣＲ産物のクローニング効率を１３１％に増加させた。興味
深いことに、この変異は、ａｔｔＢ２のインテグラーゼコア結合部位を、提案さ
れるコンセンサス配列にさらに近くマッチする配列に変化させる。

【０４２５】 さらなる実験を実施して、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２ ＰＣＲ産物のク
ローニング効率を、インテグラーゼコア結合部位の提案されるコンセンサス配列
（実施例２２を参照のこと）を含むａｔｔＢ部位を含むＰＣＲ産物と、直接比較
した。以下のａｔｔＢ部位を使用して、ａｔｔＢ−ＴＥＴ ＰＣＲ産物を増幅し
た：

【０４２６】

【化２７】 ＢＰ反応を、３００ｎｇ（１００ｆｍｏｌｅ）のｐＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ
）と、２０μｌ容量の８０ｎｇ（８０ｆｍｏｌｅ）のａｔｔＢ−ＴＥＴ ＰＣＲ
産物との間で、２５℃で１．５時間のインキュベーションによって実施し、ｐＥ
ＮＴＲ２０１−ＴＥＴ エントリークローンを作製した。上記ａｔｔＢ部位の、
ＢＰ反応におけるクローニング効率の比較を、表５に示す。

【０４２７】

【表１５】 これらの結果は、インテグラーゼコア結合部位に関して提案されるコンセン
サス配列と完全にマッチする配列を含むａｔｔＢ ＰＣＲ産物が、標準的なＧａ
ｔｅｗａｙ ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２ ＰＣＲ産物より４倍高い効率で、エ
ントリークローンを産生し得ることを実証する。

【０４２８】 次いで、上記で産生されたエントリークローンを、ＬＲ反応（２０μｌ容量の
それぞれのｐＥＮＴＲ２０１−ＴＥＴ エントリークローンの５０ｎｇ（７７ｆ
ｍｏｌｅ）と混合した３００ｎｇ（６４ｆｍｏｌｅ）ｐＤＥＳＴ２０；２５℃で
１時間インキュベートした）を介してｐＤＥＳＴ２０（図４０Ａ）へと変換した
。これらの反応に関するクローニングの効率を、表６で比較する。

【０４２９】

【表１６】 これらの結果は、ａｔｔＢ１．６およびａｔｔＢ２．１０中に導入された、遺
伝子をエントリークローン（ｅｎｔｒｙ ｃｌｏｎｅ）に移入させる変異が、Ｌ
Ｒ反応の効率をわずかに上昇させることを実証する。従って、本発明は、組換え
効率を上昇させるａｔｔＢ部位での変異のみならず、ＢＰ反応によって作製され
るａｔｔＬ部位を生じる対応する変異をもまた包含する。

【０４３０】 一定範囲のＰＣＲ産物量にわたるａｔｔＢ１．６−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２．１０
ＰＣＲ産物のクローニング効率の上昇を試験するために、上記の実験と類似の
実験を実施した。この実験では、ａｔｔＢ ＰＣＲ産物の量を反応混合物中に滴
定した。この結果を表７に示す。

【０４３１】

【表１７】 これらの結果は、２０ｎｇの量において、標準のａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔ
Ｂ２ ＰＣＲ産物と比較してａｔｔＢ１．６−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２．１０ ＰＣ
Ｒ産物で、６倍程度高いクローニング効率における上昇が達成されることを実証
する。

【０４３２】 （実施例２４：最適組換え効率のためのａｔｔＢ配列必要要件の決定） ａｔｔＢについての配列必要要件を試験するため、そしてどのａｔｔＢ部位が
縮重ａｔｔＢ部位の集団の中から最高に効率良くクローン化するかを決定するた
めに、一連の実験を実施した。ａｔｔＢ部位の中のＢ−アームにおいて５塩基の
縮重性を含んだ縮重ＰＣＲプライマーを設計した。従って、これらの縮重配列は
、ＢＰ反応において遺伝子をエントリークローンに移入し、引き続いてＬＲ反応
においてこの遺伝子を発現クローンに移入する。従って、縮重ａｔｔＢおよびａ
ｔｔＬ部位の集団は、かなり多数のサイクルでａｔｔＢからａｔｔＬに行きつ戻
りつしつつ循環され得る。各移入工程で反応条件を変更することにより（例えば
、反応時間を減少させることにより、および／またはＤＮＡ濃度を減少させるこ
とにより）、反応は、各サイクルでますますよりストリンジェントになされ得、
従って、より効率的に反応するａｔｔＢおよびａｔｔＬ部位の集団に富化され得
る。

【０４３３】 以下の縮重ＰＣＲプライマーを使用して、ｐＵＣ１８からｌａｃＺαフラグメ
ントを含んだ５００ｂｐのフラグメントを増幅した（各プライマーのａｔｔＢ部
分のみを示す）：

【０４３４】

【化２８】 縮重ａｔｔ部位の開始集団のサイズは、４⁵すなわち１０２４分子である。２つ
のＢＰ反応および２つのＬＲ反応を通して、４つの異なる集団を移入した。各反
応の形質転換後、適切な選択抗生物質を含有する液体培地において増殖すること
によって、形質転換体の集団を増幅した。このクローンの集団から、アルカリ溶
解ミニプレップ法によってＤＮＡを調製し、そして次の反応に用いた。ＢＰおよ
びＬＲクローニング反応の結果を以下に示す。

【０４３５】

【表１８】 これらの結果は、各々の連続した移入で、ａｔｔ部位の集団全体のクローニン
グ効率が上昇し、そしてａｔｔＢ部位の規定において相当量の可撓性が存在する
ことを実証する。特定のクローンを、上記反応から単離し得、組換え効率につい
て個々に試験し得、そして配列決定し得る。次いで、このような新たな特異性を
、既知の例と比較して、新たな組換え特異性を有する新たな配列の設計を導き得
る。さらに、本明細書中に記載される富化およびスクリーニングのプロトコール
に基づいて、当業者は、このような配列を含む核酸分子を使用する組換え反応に
おいて特異性の上昇を生じさせる他の組換え部位（例えば、他のａｔｔ部位、ｌ
ｏｘ、ＦＲＴなど）における配列を容易に同定し得、そしてそれを使用し得る。

【０４３６】 （実施例２５：ａｔｔ部位ＰＣＲアダプタープライマーの設計） ５’末端に１２ｂｐのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２を有する遺伝子特異的プラ
イマーを設計するために、さらなる研究を実施した。ａｔｔを含むプライマーに
ついての最適プライマー設計は、任意のＰＣＲプライマーについての最適プライ
マー設計と同じである：プライマーの遺伝子特異的部分は、理想的には、５０ｍ
Ｍ塩で５０℃より高いＴｍを有するべきである（Ｔｍの計算は、式５９．９＋４
１（％ＧＣ）−６７５／ｎに基づく）。 プライマー：

【０４３７】

【化２９】 （プロトコール） （１）２００ｎｇのｃＤＮＡライブラリーまたは１ｎｇのプラスミドクローン
ＤＮＡ（あるいは、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが使用され得る）と１０ｐｍｏｌ
の遺伝子特異的プライマーとを５０μｌのＰＣＲ反応物中で、ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるもの
）を使用して、混合する（１０ｐｍｏｌより多い遺伝子特異的プライマーの添加
は、ａｔｔＢ ＰＣＲ産物の収率を減少し得る）。さらに、ＲＮＡが使用される
場合には、標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコールに従うべきであ
る：例えば、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ １１：６０（１９８９）
；Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｗ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３
０：７６６１（１９９１）；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｗ．Ｎ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ２０：７８２（１９９６）；ならびに米国特許出願番号０９／０６４
，０５７（１９９８年４月２２日出願）（これらのすべての開示が、本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと。

【０４３８】 （１^stＰＣＲプロフィール）

【０４３９】

【表１９】 （２）各々３５ｐｍｏｌのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２アダプタープライマー
を含む４０μｌのＰＣＲ反応混合物に、１０μｌを移す。

【０４４０】 （２^ndＰＣＲプロフィール）

【０４４１】

【表２０】 （留意点） １．生成されたａｔｔＢ ＰＣＲ産物の収率を評価するために、アダプターなし
のプライマーコントロールを実施することが有用である。 ２．直線化されたテンプレートは通常、わずかにより高いＰＣＲ産物収率を生じ
る。

【０４４２】 （実施例２６：ＧＡＴＥＷＡＹ^TMクローニングシステムを使用する１チューブ
組換えクローニング） ＧＡＴＥＷＡＹ^TMクローニングシステムを使用して、より容易かつより迅速な
クローニングを提供するために、本発明者らは、ＢＰおよびＬＲ反応が、単一チ
ューブ内で実施され得るプロトコール（「１チューブ」プロトコール）を設計し
た。以下が、このような１チューブプロトコールの例である：本実施例では、Ｂ
Ｐ反応のアリコートを、ＬＲ成分を添加する前に採取するが、ＢＰおよびＬＲ反
応は、最初にＢＰのアリコートを採取することを伴わずに、１チューブプロトコ
ールにおいて実施され得る。

【０４４３】

【表２１】 上記成分を単一チューブ内で混合した後、反応混合物を２５℃で４時間インキ
ュベートした。反応混合物の５μｌのアリコートを取り出し、そして０．５μｌ
の１０×停止溶液をこの反応混合物に添加し、そして３７℃で１０分間インキュ
ベートした。次いで、コンピテント細胞を、１００μｌの細胞あたり１〜２μｌ
のＢＰ反応物を用いて形質転換した；この形質転換は、個々のエントリークロー
ン（Ｅｎｔｒｙ ｃｌｏｎｅ）の単離およびＢＰ反応効率の定量のためのエント
リークローン（Ｅｎｔｒｙ ｃｌｏｎｅ）のコロニーを産生した。

【０４４４】 残存する２０μｌのＢＰ反応混合物に、ＬＲ反応の以下の成分を添加した。

【０４４５】

【表２２】 上記成分を単一チューブ内で混合した後、反応混合物を２５℃で２時間インキ
ュベートした。３μｌの１０×停止溶液を添加し、そしてこの混合物を３７℃で
１０分間インキュベートした。次いで、コンピテント細胞を、１００μｌの細胞
あたり１〜２μｌの反応混合物を用いて形質転換した。

【０４４６】 （留意点） １．所望される場合、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）
を、開始ＢＰ反応に添加し得る。 ２．所望される場合、反応を１／２倍スケールダウンし得る。 ３．ＢＰおよび／またはＬＲ反応についてより短いインキュベーション時間が用
いられ得る（所望される反応のクローニング効率に対して増減する）が、より少
ないコロニー数を代表的に生じる。 ４．得られるコロニー数を数倍増加させるために、ＢＰ反応物を６〜２０時間イ
ンキュベートし、そしてＬＲ反応を３時間まで増加させる。エレクトロポレーシ
ョンはまた、１〜２μｌのＰＫ処理反応混合物で十分に作用する。 ５．約５ｋｂより長いＰＣＲ産物は、ＢＰ反応において有意により低いクローニ
ング効率を示し得る。この場合、ＢＰおよびＬＲ工程の両方について、より長い
インキュベーション時間（例えば、６〜１８時間）で１チューブ反応を使用する
ことを本発明者らは推奨する。

【０４４７】 （実施例２７：ＬＲ反応の間の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅ
ｃｔｏｒ）の緩和） ＬＲ反応をさらに最適化するために、ＬＲ反応緩衝液の組成を上記から改変し
、そしてこの改変された緩衝液をプロトコールにおいて使用して、ＬＲ反応の間
の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）の酵素的緩和の影響
を試験した。

【０４４８】 ＬＲ反応は、５×ＢＰ反応緩衝液（実施例５を参照のこと）をＬＲ反応に使用
したことを除いて、通常通り（例えば、実施例６を参照のこと）に設定した。Ｌ
Ｒ反応の間の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）の緩和を
達成するために、トポイソメラーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ：カタログ番号３８０４２−０１６）を、
反応物中の総ＤＮＡ １μｇあたり約１５Ｕの最終濃度で、この反応混合物に添
加した（例えば、２０μｌのＬＲ反応物中で合計４００ｎｇのＤＮＡを有する反
応混合物に対して、約６ユニットのトポイソメラーゼＩを添加した）。反応混合
物を以下のように設定した。

【０４４９】

【表２３】 反応混合物を２５℃で１時間インキュベートし、次いで、２μｌの２μｇ／μ
ｌのプロテイナーゼＫを添加し、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベー
トしてＬＲ反応を停止した。次いで、コンピテント細胞を、前述の実施例に記載
のように形質転換した。これらの研究の結果により、トポイソメラーゼＩを使用
するＬＲ反応での基質の緩和が、トポイソメラーゼＩの包含を伴わずに実施され
たＬＲ反応と比較して、コロニー産生において２〜１０倍の増加を生じることが
実証された。

【０４５０】 ここで、理解の明瞭さのために例証および実施例によって幾分詳細に本発明を
完全に記載してきたが、本発明またはその任意の特定の実施形態の範囲に影響す
ることなく、幅広くかつ等価な範囲の条件、処方および他のパラメーターで本発
明を改変または変更することによって、同じことが実施され得ること、そしてこ
のような改変または変更が、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図
されることは、当業者に明らかである。

【０４５１】 本明細書中で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係
する分野の当業者の技術のレベルの指標であり、そして個々の各刊行物、特許ま
たは特許出願が、参考として援用されると明確かつ個々に示される場合と同程度
に、本明細書中で参考として援用される。

【０４５２】

【表２４】

【０４５３】

【表２５】

【０４５４】

【表２６】

【０４５５】

【表２７】

【０４５６】

【表２８】

【０４５７】

【表２９】

【０４５８】

【表３０】

【０４５９】

【表３１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の一般的な方法の１つを示し、ここで開始（親）ＤＮＡ分子は
、環状または直鎖状であり得る。目標は、新しいサブクローニングベクターＤを
、本来のクローニングベクターＢと交換することである。１つ実施形態において
、ＡＤについて、かつ全ての他の分子（融合体（Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）を含
む）に対して選択することが望ましい。四角と丸は、組換え部位である：例えば
、ｌｏｘ（例えば、ｌｏｘＰ）部位、ａｔｔ部位、など。例えば、セグメントＤ
は、発現シグナル、タンパク質融合ドメイン、新しい薬剤マーカー、新しい複製
起点、またはＤＮＡのマッピングあるいは配列決定のための特定化された機能を
含み得る。融合体分子が、セグメントＡ（挿入物）に隣接するセグメントＤ（目
的ベクター）を含み、それによってＤ内の機能的エレメントが、Ａ内の挿入物と
並列することに注意するべきである。このような分子は、セグメントＢ＋Ｄ内の
選択マーカーについて選択することによって、インビトロで（例えば、プロモー
ターが、インビトロ転写／翻訳のための遺伝子に隣接して位置する場合に）、ま
たはインビボで（ｃｃｄＢ保有ベクターを増殖可能な細胞内での単離後）直接使
用され得る。当業者は、この１段階方法は、本発明の特定の想像された適用にお
いて有用であることを理解する。

【図２】 図２は、本発明の組換えクローニング系のより詳細な描写であり、本明細書中
では「ＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」と言及される。この
図は、「目的反応」（本明細書中において「ＬＲ反応」とも言及され得る）を介
する発現クローンの産生を示す。ａｔｔＬ１部位とａｔｔＬ２部位との間に局在
化した目的のＤＮＡ分子（例えば、遺伝子）を含むｋａｎ^rベクター（本明細書
中において「エントリークローン」とも言及される）は、ａｔｔＲ１部位とａｔ
ｔＲ２部位の間に局在化した毒性または「死」遺伝子を含む、ａｍｐ^rベクター
（本明細書において「目的ベクター」と言及される）と、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＬＲ
Ｃｌｏｎａｓｅ^TMＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓの混合
物）の存在下で反応される。２５℃で約６０分間のインキュベーション後、この
反応は、ａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位との間に部位局在化した目的のＤＮＡ
分子、およびｋａｎ^r副産物を含むａｍｐ^r発現クローン、ならびに中間体を得る
。次いで、反応混合物は、細胞をアンピシリンを含む培地にプレートし、そして
ａｍｐ^rコロニーを選ぶことによって選択され得る目的の核酸分子を含む宿主細
胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクローンに形質転換され得る。

【図３】 図３は、種々の発現クローンを産生するためのエントリークローンからの多重
型の目的ベクターへの核酸分子のクローニングの概略図である。所定のエントリ
ークローンと異なる型の目的ベクター（示さず）との間の組換えは、図２に示さ
れるＬＲ反応を介して、種々の適用および宿主細胞型における使用についての複
数の異なる発現クローンを産生する。

【図４】 図４は、「ＢＰ反応」（本明細書中において「エントリー反応」または「ゲー
トウェイ（Ｇａｔｅｗａｒｄ）反応」とも言及される）を介するエントリークロ
ーンの産生の詳細な図である。この図において示される例において、ａｔｔＢ１
部位とａｔｔＢ２部位との間に局在化した目的のＤＮＡ分子（例えば、遺伝子）
を含むａｍｐ^r発現ベクターは、ｋａｎ^rドナーベクター（例えば、ａｔｔＰベク
ター；本明細書中では、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^TMＥｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ（ＩｎｔおよびＩＨＦの混合物）の存在下で、ａｔｔＰ１部位とａｔｔ
Ｐ２部位との間に局在化した毒性または「死」遺伝子を含むＧＡＴＡＷＡＹ^TMｐ
ＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ〜Ｃを参照のこと））と反応される。２５℃で６０分
のインキュベーション後、反応は、ａｔｔＬ１とａｔｔＬ２部位との間に局在化
した目的のＤＮＡ分子を含むｋａｎ^rエントリークローン、およびａｍｐ^r副産物
遺伝子を与える。次いでエントリークローンは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）に形質転換され得、そしてエントリークローンを含むクローン（および従っ
て目的の核酸分子）は、細胞をカナマイシン含有培地にプレートし、そしてｋａ
ｎ^rコロニーを選ぶことによって選択され得る。この図はｋａｎ^rドナーベクター
の使用の例を示すが、本明細書中に記載されるように他の選択マーカー（例えば
、ゲンタマイシン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー）を含むドナー
ベクターを使用することもまた可能である。

【図５】 図５は、ＬＲ（「目的」）反応（図５Ａ）、およびＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎ
ｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＢＰ（「エントリー」または「ゲートウェイ」）反応（
図５Ｂ）のより詳細な概略図であり、各反応の反応物質、産物、および副産物を
示す。

【図６】 図６は、発現クローンを作製するための目的ベクターへのサブクローニング後
の目的の遺伝子に隣接するａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位の配列を示す。

【図７】 図７は、本発明の組成物および方法を使用するエントリークローンを作製する
ための４つの方法の概略図である：１．制限酵素およびリガーゼを使用する；２
．ａｔｔＬエントリーベクター内に調整されたｃＤＮＡライブラリーで開始する
；３．Ｂ×Ｐ反応を介してａｔｔＢ発現ベクター内に調整されたライブラリー由
来の発現クローンを使用する；および４．Ｂ×Ｐ反応を介して末端ａｔｔＢ部位
を有するＰＣＲフラグメントの組換えクローニング。アプローチ３および４は、
選択マーカー（例えば、ｋａｎ^r、ｇｅｎ^r、ｔｅｔ^rなど）を保有するエントリ
ークローンを提供するドナーベクター（本明細書中では、ａｔｔＰベクター（例
えば、ｐＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０２（図
５０Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０３（図５１Ａ〜Ｃを参照のこと）、
ｐＤＯＮＲ２０４（図５２Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０５（図５３Ａ
〜Ｃを参照のこと）、またはｐＤＯＮＲ２０６（図５４Ａ〜Ｃを参照のこと））
）との組換えに依存する。

【図８】 図８は、Ｂ×Ｐ（エントリーまたはゲートウェイ）反応によるＰＣＲ産物のク
ローニングの概略図である。２５ｂｐの末端ａｔｔＢ部位（＋４つのＧ）を有す
るＰＣＲ産物は、Ｂ×Ｐ反応のための基質として示される。遺伝子のａｔｔＢ−
ＰＣＲ産物とドナーベクターとの間の組換え（ｋａｎ^rを保有するエントリーベ
クターに寄与する）は、ＰＣＲ産物のエントリークローンを生じる。

【図９】 図９は、本明細書中で、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、
ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２として示される組換え部
位のヌクレオチド配列の表である。配列は、従来的に５’〜３’に記載される。

【図１０】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバック
ボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１
０Ａに示す。図１０は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａの物理的マップおよ
びクローニング部位（図１０Ａ）、およびヌクレオチド配列（図１０Ｂ）の概略
図である。

【図１１】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１１に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１１は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ２Ｂのクローニング部位（図１１Ａ）およびヌクレオチド配列（図１１
Ｂ）の概略図である。

【図１２】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１２に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１２は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ３Ｒのクローニング部位（図１２Ａ）およびヌクレオチド配列（図１２
Ｂ）の概略図である。

【図１３】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１３に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１３は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ４のクローニング部位（図１３Ａ）およびヌクレオチド配列（図１３Ｂ
）の概略図である。

【図１４】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１４に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１４は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ５のクローニング部位（図１４Ａ）およびヌクレオチド配列（図１４Ｂ
）の概略図である。

【図１５】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１５に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１５は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ６のクローニング部位（図１５Ａ）およびヌクレオチド配列（図１５Ｂ
）の概略図である。

【図１６】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１６に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１６は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ７のクローニング部位（図１６Ａ）およびヌクレオチド配列（図１６Ｂ
）の概略図である。

【図１７】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１７に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１７は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ８のクローニング部位（図１７Ａ）およびヌクレオチド配列（図１７Ｂ
）の概略図である。

【図１８】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１８に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１８は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ９のクローニング部位（図１８Ａ）およびヌクレオチド配列（図１８ｂ
）の概略図である。

【図１９】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図１９に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図１９は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ１０のクローニング部位（図１９Ａ）およびヌクレオチド配列（図１９
Ｂ）の概略図である。

【図２０】 本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバッ
クボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図
１０Ａに示される。図２０に示される他のエントリーベクターについて、各図の
セットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａな
ど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異な
る。プラスミドバックボーンは、同一である。図２０は、エントリーベクターｐ
ＥＮＴＲ１１のクローニング部位（図１９Ａ）およびヌクレオチド配列（図２０
Ｂ）の概略図である。

【図２１】 図２１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１の開始コドンから−３５と−１０のプロ
モーター配列を示す物理的マップおよびＴｒｃ発現カセット（図２１Ａ）、およ
びヌクレオチド配列（図２１Ｂ〜Ｄ）の概略図である。このベクターはまた、ｐ
Ｔｒｃ−ＤＥＳＴ１とも言われる。

【図２２】 図２２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２の、物理的マップ、および開始コドンか
ら−３５および−１０でのプロモーター配列を示すＨｉｓ６発現カセットの概略
的描写（図２２Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２２Ｂ〜Ｄ）である。この
ベクターはまた、ｐＨｉｓ６−ＤＥＳＴ２としても好ましくあり得る。

【図２３】 図２３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３の、物理的マップ、および開始コドンか
ら−３５および−１０でのプロモーター配列を示すＧＳＴ発現カセットの概略的
描写（図２３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２３Ｂ〜Ｄ）である。このベ
クターはまた、ｐＧＳＴ−ＤＥＳＴ３としても好ましくあり得る。

【図２４】 図２４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ４の、物理的マップ、および開始コドンか
ら−３５および−１０でのプロモーター配列ならびにＴＥＶプロテアーゼ切断部
位を示すＨｉｓ６−Ｔｒｘ発現カセットの概略的描写（図２４Ａ）、ならびにヌ
クレオチド配列（図２４Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴｒｘ−ＤＥ
ＳＴ４としても好ましくあり得る。

【図２５】 図２５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ５のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位（図
２５Ａ）、物理的マップの概略的描写（図２５Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列
（図２５Ｃ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＳＰＯＲＴ（＋）−ＤＥＳＴ
５としても好ましくあり得る。

【図２６】 図２６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ６のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位（図
２６Ａ）、物理的マップの概略的描写（図２６Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列
（図２６Ｃ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＳＰＯＲＴ（−）−ＤＥＳＴ
６としても好ましくあり得る。

【図２７】 図２７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ７のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモーター
、および物理的マップの概略的描写（図２７Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（
図２７Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ７としても好
ましくあり得る。

【図２８】 図２８は、目的ベクターｐＤＥＳＴ８のａｔｔＲ１部位、バキュロウイルスポ
リヘドリンプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図２８Ａ）、なら
びにヌクレオチド配列（図２８Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦａｓ
ｔＢａｃ−ＤＥＳＴ８としても好ましくあり得る。

【図２９】 図２９は、目的ベクターｐＤＥＳＴ９のａｔｔＲ１部位、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆ
ｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図２
９Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２９Ｂ〜Ｅ）である。このベクターはま
た、ｐＳＦＶ−ＤＥＳＴ９としても好ましくあり得る。

【図３０】 図３０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１０のａｔｔＲ１部位、バキュロウイルス
ポリヘドリンプロモーター、Ｈｉｓ６融合ドメイン、および物理的マップの概略
的描写（図３０Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３０Ｂ〜Ｄ）である。この
ベクターはまた、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ−ＤＥＳＴ１０としても好ましくあり得
る。

【図３１】 図３１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１１の、テトラサイクリン調節ＣＭＶプロ
モーターを含むａｔｔＲ１部位および物理的マップの概略的描写（図３１Ａ）、
ならびにヌクレオチド配列（図３１Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴ
ｅｔ−ＤＥＳＴ１１としても好ましくあり得る。

【図３２】 図３２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１２．２のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモ
ーターのｍＲＮＡの開始、および物理的マップの概略的描写（図３２Ａ）、なら
びにヌクレオチド配列（図３２Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶ
ｎｅｏ−ＤＥＳＴ１２、ｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ１２、またはｐＤＥＳＴ１２として
も好ましくあり得る。

【図３３】 図３３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１３のａｔｔＲ１部位、λＰ_Lプロモータ
ー、および物理的マップの概略的描写（図３３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列
（図３３Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐλＰ_L−ＤＥＳＴ１３として
も好ましくあり得る。

【図３４】 図３４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１４のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター
、および物理的マップの概略的描写（図３４Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（
図３４Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＰＴ７−ＤＥＳＴ１４としても
好ましくあり得る。

【図３５】 図３５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１５のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター
、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図３５Ａ
）、ならびにヌクレオチド配列（図３５Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、
ｐＴ７ ＧＳＴ−ＤＥＳＴ１５としても好ましくあり得る。

【図３６】 図３６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１６のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター
、およびＮ末端チオレドキシン融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（
図３６Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３６Ｂ〜Ｄ）である。このベクター
はまた、ｐＴ７ Ｔｒｘ−ＤＥＳＴ１６としても好ましくあり得る。

【図３７】 図３７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１７のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター
、およびＮ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図３７
Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３７Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた
、ｐＴ７ Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ１７としても好ましくあり得る。

【図３８】 図３８は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１８のａｔｔＲ１部位およびｐ１０バキュ
ロウイルスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図３８Ａ）、な
らびにヌクレオチド配列（図３８Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦＢ
ｐ１０−ＤＥＳＴ１８としても好ましくあり得る。

【図３９】 図３９は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１９のａｔｔＲ１部位、および３９ｋバキ
ュロウイルスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図３９Ａ）、
ならびにヌクレオチド配列（図３９Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦ
Ｂ３９ｋ−ＤＥＳＴ１９としても好ましくあり得る。

【図４０】 図４０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２０のａｔｔＲ１部位、ｐｏｌｈバキュロ
ウイルスプロモーター、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物
理的マップ（図４０Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４０Ｂ〜Ｄ）である。
このベクターはまた、ｐＦＢ ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２０としても好ましくあり得る
。

【図４１】 図４１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２１の、ＤＮＡ結合ドメインを有する２ハ
イブリッドベクター、ａｔｔＲ１部位、およびＡＤＨスプロモーターの概略的描
写、ならびに物理的マップ（図４１Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４１Ｂ
〜Ｅ）である。このベクターはまた、ｐＤＢ Ｌｅｕ−ＤＥＳＴ２１としても好
ましくあり得る。

【図４２】 図４２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２２の、活性化ドメインを有する２ハイブ
リッドベクター、ａｔｔＲ１部位、およびＡＤＨスプロモーターの概略的描写、
ならびに物理的マップ（図４２Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４２Ｂ〜Ｄ
）である。このベクターはまた、ｐＰＣ８６−ＤＥＳＴ２２としても好ましくあ
り得る。

【図４３】 図４３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２３のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、
Ｔ７プロモーター、およびＣ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理
的マップ（図４３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４３Ｂ〜Ｄ）である。こ
のベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−Ｈｉｓ６−ＤＥＳＴ２３としても好ましく
あり得る。

【図４４】 図４４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２４のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、
Ｔ７プロモーター、およびＣ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的
マップ（図４４Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４４Ｂ〜Ｄ）である。この
ベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２４としても好ましくあり
得る。

【図４５】 図４５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２５のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、
Ｔ７プロモーター、およびＣ末端チオレドキシン融合配列の概略的描写、ならび
に物理的マップ（図４５Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４５Ｂ〜Ｄ）であ
る。このベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−Ｔｒｘ−ＤＥＳＴ２５としても好ま
しくあり得る。

【図４６】 図４６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２６のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモータ
ー、およびＮ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４
６Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４６Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはま
た、ｐＣＭＶ−ＳＰｎｅｏ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ２６としても好ましくあり得る。

【図４７】 図４７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２７のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモータ
ー、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４７
Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４７Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた
、ｐＣＭＶ−Ｓｐｎｅｏ−ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２７としても好ましくあり得る。

【図４８】 図４８は、ａｔｔＢクローニングベクタープラスミドｐＥＸＰ５０１について
の物理的マップ（図４８Ａ）、クローニング部位（図４８Ｂ）、およびヌクレオ
チド配列（図４８Ｃ〜Ｄ）の描写である。このベクターは、本明細書中でｐＣＭ
Ｖ・ＳＰＯＲＴ６、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６として
同等に好ましくあり得る。

【図４９】 図４９は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラ
スミドｐＤＯＮＲ２０１についての物理的マップの描写（図４９Ａ）、およびヌ
クレオチド配列（図４９Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐＡｔｔＰｋａ
ｎｒドナープラスミド、またはｐＡｔｔＰｋａｎドナープラスミドとしても好ま
しくあり得る。

【図５０】 図５０は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラ
スミドｐＤＯＮＲ２０２についての物理的マップ（図５０Ａ）、およびヌクレオ
チド配列（図５０Ｂ〜Ｃ）の描写である。

【図５１】 図５１は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラ
スミドｐＤＯＮＲ２０３についての物理的マップ（図５１Ａ）、およびヌクレオ
チド配列（図５１Ｂ〜Ｃ）の描写である。

【図５２】 図５２は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラ
スミドｐＤＯＮＲ２０４についての物理的マップ（図５２Ａ）、およびヌクレオ
チド配列（図５２Ｂ〜Ｃ）の描写である。

【図５３】 図５３は、ＢＰ反応においてテトラサイクリン耐性ベクターを提供するドナー
プラスミドｐＤＯＮＲ２０５についての物理的マップ（図５３Ａ）、およびヌク
レオチド配列（図５３Ｂ〜Ｃ）の描写である。

【図５４】 図５４は、ＢＰ反応においてゲンタマイシン耐性ベクターを提供するドナープ
ラスミドｐＤＯＮＲ２０６についての物理的マップ（図５４Ａ）、およびヌクレ
オチド配列（図５４Ｂ〜Ｃ）の描写である。このベクターはまた、ｐＥＮＴＲ２
２ ａｔｔＰドナープラスミド、ｐＡｔｔＰＧｅｎｒドナープラスミド、または
ｐＡｔｔＰｇｅｎｔドナープラスミドとしても好ましくあり得る。

【図５５】 図５５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２（図２２）中にサブクローニングされた
ＣＡＴのエントリークローン（ｐＥＮＴＲ７）の、ａｔｔＢ１部位、および物理
的マップを示す。

【図５６】 図５６は、実施例１６、ｐＥＺＣ７１０２およびａｔｔＢ−ｔｅｒ−ＰＣＲに
記載される単一チューブＢｘＰ反応の反応ＢのＤＮＡ成分を示す。

【図５７】 図５７は、実施例１６、ｔｅｔｘ７１０２に記載の単一チューブＢｘＰ反応の
、反応Ｂの所望される産物の物理的マップである。

【図５８】 図５８は、目的ベクターｐＥＺＣ８４０２の物理的マップである。

【図５９】 図５９は、ｔｅｔｘ７１０２（図５７）およびｐＥＺＣ８４０２（図５８）を
用いるＬｘＲ反応から生じる、予期されるｔｅｔ^rサブクローン産物、ｔｅｔｘ
８４０２の物理的マップである。

【図６０】 図６０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるバクテリオファージλ組換え経路の概略的描
写である。

【図６１】 図６１は、ＬＲ反応に加わるＤＮＡ分子の概略的描写である。ａｔｔＬ１およ
びａｔｔＲ１またはａｔｔＬ２およびａｔｔＲ２が最初に再結合するか否かに依
存して、ＬＲ反応（このうち１つのみが本明細書で示される）の間に、２つの異
なる同時統合物が形成する。１つの局面において、本発明は、目的の核酸分子の
指向性クローニングを提供する。なぜなら、組換え部位は特異性を伴って反応す
るためである（ａｔｔＬ１はａｔｔＲ１と反応し；ａｔｔＬ２はａｔｔＲ２と反
応し；ａｔｔＢ１はａｔｔＰ１と反応し；そしてａｔｔＢ２はａｔｔＰ２と反応
する）。したがって、この部位の位置決めは、所望の配向で組換えフラグメント
を有する所望のベクターの作成を可能にする。

【図６２】 図６２は、組換えクローニング方法および本発明の組成物を使用する、自然の
タンパク質および融合タンパク質の発現の描写である。上の図は、天然のタンパ
ク質の発現を示し、全ての翻訳開始シグナルはａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位
との間に含まれている；そのために、これらのシグナルはエントリークローンの
開始において存在しなくてはならない。下の図は、融合タンパク質の発現を示す
（本明細書では、融合タンパク質を作製するために、リボソームがａｔｔＢ１お
よびａｔｔＢ２を通って読み取るように、Ｎ末端およびＣ末端の融合タグの両方
の発現を示す）。天然のタンパク質発現ベクターとは異なり、Ｎ末端融合ベクタ
ーは、ａｔｔＢ１部位の上流の翻訳開始シグナルを有する。

【図６３】 図６３は、３つのＧＡＴＥＷＡＹ^TMクローニングシステムカセットの概略的描
写である。３つの平滑末端カセットが示され、これは標準的発現ベクターを目的
ベクターに変換する。示される各々のカセットは、３つの可能なリーディングフ
レームのうち１つのアミノ末端融合物を提供し、そしてその各々が、示されるよ
うな特有の制限切断部位を有する。

【図６４】 図６４は、３つのａｔｔＲリーディングフレームカセット、ｐＥＺＣ１５１０
１（リーディングフレームＡ；図６４Ａ）、ｐＥＺＣ１５１０２（リーディング
フレームＢ；図６４Ｂ）、およびｐＥＺＣ１５１０３（リーディングフレームＣ
；図６４Ｃ）を含むプラスミドの物理的マップを示す。

【図６５】 図６５は、本発明のクローニング方法によって、ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔ^r
およびａｍｐ^r遺伝子を増幅するために使用されるａｔｔＢプライマーを示す。

【図６６】 図６６は、図６５に示されるプライマーを使用して作製されたｔｅｔ^rおよび
ａｍｐ^rＰＣＲ産物の、組換えクローニングの結果を列挙する表である。

【図６７】 図６７は、ＰＣＲ産物のクローニング効率上のＰＣＲプライマーの５’末端上
に含まれるグアニン（Ｇ’ｓ）数の効果を示すグラフである。しかし、グアニン
の近くの他のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｕまたはこれらの組合わせを含む）は
、ＰＣＲ産物のクローニング効率を増大するために、ＰＣＲプライマー上の５’
伸長としてしようされ得ることが注目される。

【図６８】 図６８は、ＢｘＰ反応におけるａｔｔＰおよびａｔｔＢ反応物の種々の量の滴
定、およびＰＣＲ産物のクローニング効率の効果を示すグラフである。

【図６９】 図６９は、２５６ｂｐのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図
６９Ａ）またはモル数（図６９Ｂ）の効果、および２５６ｂｐのＰＣＲ産物の、
ドナーベクターへのクローニングの効率（図６９Ｃ）を示す一連のグラフである
。

【図７０】 図７０は、１ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図７０
Ａ）またはモル数（図７０Ｂ）の効果、および１ｋｂのＰＣＲ産物の、ドナーベ
クターへのクローニングの効率（図７０Ｃ）を示す一連のグラフである。

【図７１】 図７１は、１．４ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図
７１Ａ）またはモル数（図７１Ｂ）の効果、および１．４ｋｂのＰＣＲ産物の、
ドナーベクターへのクローニングの効率（図７１Ｃ）を示す一連のグラフである
。

【図７２】 図７２は、３．４ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図
７２Ａ）またはモル数（図７２Ｂ）の効果、および３．４ｋｂのＰＣＲ産物の、
ドナーベクターへのクローニングの効率（図７２Ｃ）を示す一連のグラフである
。

【図７３】 図７３は、４．６ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図
７３Ａ）またはモル数（図７３Ｂ）の効果、および４．６ｋｂのＰＣＲ産物の、
ドナーベクターへのクローニングの効率（図７３Ｃ）を示す一連のグラフである
。

【図７４】 図７４は、ＢｘＰ反応における６．９ｋｂのＰＣＲ産物の滴定の臭化エチジウ
ム染色ゲルの写真である。

【図７５】 図７５は、１０．１ｋｂのＰＣＲ産物のドナーベクターへのクローニングの際
のコロニー形成の際の、１０．１ｋｂのＰＣＲ産物の種々の量の効果を示すグラ
フである。

【図７６】 図７６は、ＢｘＰ反応における１０．１ｋｂのＰＣＲ産物の滴定の臭化エチジ
ウム染色ゲルの写真である。

【図７７】 図７７は、０．２５６ｋｂ〜６．９ｋｂのサイズ範囲のＰＣＲフラグメントに
ついての、図６９〜７４に示されるＰＣＲ産物クローニング効率実験の結果を要
約した表である。

【図７８】 図７８は、ａｔｔＲカセットの末端での配列を示す。Ｃｍ^r−ｃｃｄＢカセッ
トによって寄与される配列が示され、これは隣接ａｔｔＲ部位の外側末端を含む
（囲み）。Ｉｎｔについてのねじれ切断部位が囲み領域において示される。エン
トリークローンでの組換えに続いて、ａｔｔＲ部位の外側の配列のみが、発現ク
ローンの得られたａｔｔＢ部位に寄与する。両方の末端の下線部の配列は、融合
タンパク質についての異なるリーディングフレームを示す（２つの代替のリーデ
ィングフレームＣカセットと共に、リーディングフレームＡ、Ｂ、またはＣが示
される）。

【図７９】 図７９は、コードされたタンパク質のアミノ末端で、融合コドンを提供し得る
いくつかの異なるａｔｔＲカセット（リーディングフレームＡ，Ｂ，またはＣに
おいて）を示す。

【図８０】 図８０は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＡカセットにおけるシング
ルカット制限部位を示す。

【図８１】 図８１は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＢカセットにおけるシング
ルカット制限部位を示す。

【図８２】 図８２は、図７８に示される本発明の２つの代替のａｔｔＲリーディングフレ
ームＣカセットにおけるシングルカット制限部位を示す（図８２Ａおよび８２Ｂ
）。

【図８３】 図８３は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＣカセット（図７８および
８２の代替Ａ）を含む、ａｔｔＲリーディングフレームＣ親プラスミドｐｒｆＣ
親ＩＩＩについての、物理的マップ（図８３Ａ）、およびヌクレオチド配列（図
８３Ｂ〜Ｃ）を示す。

【図８４】 図８４は、プラスミドｐＥＺＣ１３０１の物理的マップである。

【図８５】 図８５は、プラスミドｐＥＺＣ１３１３の物理的マップである。

【図８６】 図８６は、プラスミドｐＥＺ１４０３２の物理的マップである。

【図８７】 図８７は、プラスミドｐＭＡＢ５８の物理的マップである。

【図８８】 図８８は、プラスミドｐＭＡＢ６２の物理的マップである。

【図８９】 図８９は、本発明の２対の相同プライマーを使用する合成反応を示す。

【図９０】 図９０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２８の物理的マップの概略的描写（図９０
Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９０Ｂ〜Ｄ）である。

【図９１】 図９１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２９の、物理的地図の概略図（図９１Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９１Ｂ−Ｄ）である。

【図９２】 図９２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３０の、物理的地図の概略図（図９２Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９２Ｂ−Ｄ）である。

【図９３】 図９３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３１の、物理的地図の概略図（図９３Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９３Ｂ−Ｄ）である。

【図９４】 図９４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３２の、物理的地図の概略図（図９４Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９４Ｂ−Ｅ）である。

【図９５】 図９５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３３の、物理的地図の概略図（図９５Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９５Ｂ−Ｄ）である。

【図９６】 図９６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３４の、物理的地図の概略図（図９６Ａ）
、およびヌクレオチド配列（図９６Ｂ−Ｄ）である。

【図９７】 図９７は、ＢＰ反応においてゲンタマイシン耐性ベクターを提供する（ｄｏｎ
ａｔｅ）ドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０７について、物理的地図の描写（図９
７Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９７Ｂ−Ｃ）の描写（ｄｅｐｉｃｔｉｏｎ
）である。

【図９８】 図９８は、２−ハイブリッドベクターｐＭＡＢ８５の、物理的地図の概略図（
図９８Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９８Ｂ−Ｄ）である。

【図９９】 図９９は、２−ハイブリッドベクターｐＭＡＢ８６の、物理的地図の概略図（
図９９Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９９Ｂ−Ｄ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１３６，７４４ (32)優先日 平成11年５月28日(1999．5．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 テンプル， ギャリー エフ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， ワシントン グローブ， リッジ ロー ド 114 (72)発明者 チェオ， デイビッド アメリカ合衆国 メリーランド 20851， ロックビル， ナンバー21， バルティ モア ロード 2006 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA04 CA05 DA06 EA03 EA04 FA01 FA02 FA06 GA07 GA11 HA08 4B065 AA26X AB01 AC14 BA02 CA24 4H045 AA10 BA41 FA72 FA73 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図９に記載のａｔｔＢ１ヌクレオチド配列、図９に記載のａ
   ｔｔＢ２ヌクレオチド配列、図９に記載のａｔｔＰ１ヌクレオチド配列、図９に
   記載のａｔｔＰ２ヌクレオチド配列、図９に記載のａｔｔＬ１ヌクレオチド配列
   、図９に記載のａｔｔＬ２ヌクレオチド配列、図９に記載のａｔｔＲ１ヌクレオ
   チド配列、図９に記載のａｔｔＲ２ヌクレオチド配列、それらに相補的なポリヌ
   クレオチド、およびそれらの変異体、フラグメントまたは誘導体からなるヌクレ
   オチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 図９に記載のａｔｔＢ１ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 図９に記載のａｔｔＢ２ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 図９に記載のａｔｔＰ１ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 図９に記載のａｔｔＰ２ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 図９に記載のａｔｔＬ１ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 図９に記載のａｔｔＬ２ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
8. 【請求項８】 図９に記載のａｔｔＲ１ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
9. 【請求項９】 図９に記載のａｔｔＲ２ヌクレオチド配列、それに相補的な
   ポリヌクレオチド、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体もしくは誘導
   体を含む、単離された核酸分子。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、１以上の
    マルチプルクローニング部位、１以上の局在化シグナル、１以上の転写終結部位
    、１以上の転写調節配列、１以上の翻訳シグナル、１以上の複製起点、１以上の
    融合パートナーペプチドをコードする核酸分子、１以上のプロテアーゼ切断部位
    、および１以上の５’ポリヌクレオチド伸長からなる群から選択される、１以上
    の機能的または構造的ヌクレオチド配列をさらに含む、核酸分子。
11. 【請求項１１】 前記転写調節配列が、プロモーター、エンハンサー、また
    はリプレッサーである、請求項１０に記載の核酸分子。
12. 【請求項１２】 前記融合パートナーペプチドをコードする核酸分子が、グ
    ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ₆）
    、またはチオレドキシン（Ｔｒｘ）をコードする、請求項１０に記載の核酸分子
    。
13. 【請求項１３】 前記５’ポリヌクレオチド伸長が、１〜５個のヌクレオチ
    ド塩基からなる、請求項１０に記載の核酸分子。
14. 【請求項１４】 前記５’ポリヌクレオチド伸長が、４または５個のグアニ
    ンヌクレオチド塩基からなる、請求項１３に記載の核酸分子。
15. 【請求項１５】 標的ヌクレオチド配列を増幅させるために適切なプライマ
    ー核酸分子であって、該標的ヌクレオチド配列を増幅させる際に有用な標的特異
    的ヌクレオチド配列に連結された、請求項１に記載の単離された核酸分子または
    その一部を含む、プライマー核酸分子。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のプライマー核酸分子であって、ここで
    該プライマーは、図９に示される配列もしくはその一部を有するａｔｔＢ１ヌク
    レオチド配列、または図９に示される配列もしくはその一部に相補的なポリヌク
    レオチドを含む、プライマー核酸分子。
17. 【請求項１７】 請求項１５に記載のプライマー核酸分子であって、ここで
    該プライマーは、図９に示される配列もしくはその一部を有するａｔｔＢ２ヌク
    レオチド配列、または図９に示される配列もしくはその一部に相補的なポリヌク
    レオチドを含む、プライマー核酸分子。
18. 【請求項１８】 ４または５個のグアニン塩基の５’末端伸長をさらに含む
    、請求項１５に記載のプライマー核酸分子。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
20. 【請求項２０】 前記ベクターが発現ベクターである、請求項１９に記載の
    ベクター。
21. 【請求項２１】 請求項１に記載の単離された核酸分子または請求項１９に
    記載のベクターを含む、宿主細胞。
22. 【請求項２２】 １以上の核酸分子を合成または増幅する方法であって、以
    下の工程： （ａ）１以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性
    を有する少なくとも１つのポリペプチド、ならびに該テンプレートに相補的であ
    るか、または該テンプレートにハイブリダイズし得るテンプレート特異的配列を
    含む、少なくとも１つの第１のプライマー、および組換え部位のすべてまたは一
    部を含む、少なくとも１つの第２のプライマーと混合する工程であって、ここで
    該第２のプライマーの少なくとも一部は、該第１のプライマーの少なくとも一部
    に相同的であるかまたは相補的である、工程；ならびに （ｂ）該混合物を、該テンプレートのすべてまたは一部に相補的であり、かつ
    その一方または両方の末端に１以上の組換え部位またはその一部を含む、１以上
    の核酸分子を合成または増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程、 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 １以上の核酸分子を合成または増幅する方法であって、以
    下の工程： （ａ）１以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性
    を有する少なくとも１つのポリペプチド、ならびに該テンプレートに相補的であ
    るか、または該テンプレートにハイブリダイズし得るテンプレート特異的配列お
    よび組換え部位の少なくとも一部を含む、少なくとも１つの第１のプライマー、
    および組換え部位のすべてまたは一部を含む、少なくとも１つの第２のプライマ
    ーと混合する工程であって、ここで該第２のプライマーの該組換え部位の少なく
    とも一部は、該第１のプライマーの該組換え部位の少なくとも一部に相補的であ
    るかまたは相同的である、工程；ならびに （ｂ）該混合物を、該テンプレートのすべてまたは一部に相補的であり、かつ
    その一方または両方の末端に１以上の組換え部位またはその一部を含む、１以上
    の核酸分子を合成または増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程、 を包含する、方法。
24. 【請求項２４】 １以上の核酸分子を増幅または合成する方法であって、以
    下の工程： （ａ）１以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆転写酵素活性
    を有する少なくとも１つのポリペプチド、ならびに組換え部位の少なくとも一部
    および該テンプレートに相補的であるか、またはハイブリダイズし得るテンプレ
    ート特異的配列を含む１以上の第１のプライマーと混合する工程： （ｂ）該混合物を、該テンプレートのすべてまたは一部に相補的であり、その
    一方または両方に組換え部位の少なくとも一部を含む、１以上の第１の核酸分子
    を合成または増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程； （ｃ）該分子を、１以上の組換え部位を含む１以上の第２のプライマーと混合
    する工程であって、該第２のプライマーの該組換え部位は、該第１の核酸分子の
    該組換え部位の少なくとも一部に相同的であるかまたは相補的である、工程；な
    らびに （ｄ）該混合物を、該第１の核酸分子のすべてまたは一部と相補的であり、か
    つその一方または両方の末端に１以上の組換え部位を含む、１以上の第２の核酸
    分子を合成または増幅するに十分な条件下でインキュベートする工程、 を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された核酸分
    子によってコードされるポリペプチド。
26. 【請求項２６】 １以上のａｔｔ組換え部位を含む単離された核酸分子であ
    って、該組換え部位は、そのコア領域において、少なくとも１つの変異を含み、
    該変異が、該組換え部位と第２のａｔｔ組換え部位との間の相互作用の特異性を
    増加させる、核酸分子。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の単離された核酸分子であって、ここで
    前記変異は、前記組換え部位の前記コア領域の７塩基対重複領域における、少な
    くとも１つのヌクレオチドの少なくとも１つの置換変異である、核酸分子。
28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の単離された核酸分子であって、ここで
    前記核酸分子は、配列ＮＮＮＡＴＡＣを含み、ここで「Ｎ」は、任意のヌクレオ
    チドをいい、ただし、コンセンサス配列における最初の３つのヌクレオチドのう
    ちの１つがＴ／Ｕである場合、次いで該最初の３つのヌクレオチドの他の２つの
    うち少なくとも１つがＴ／Ｕではない、核酸分子。
29. 【請求項２９】 １以上の変異ａｔｔ組換え部位を含む単離された核酸分子
    であって、該組換え部位は、そのコア領域において、少なくとも１つの変異を含
    み、該変異は、該変異ａｔｔ組換え部位を含む第１の核酸分子と、該変異ａｔｔ
    組換え部位と相互作用する第２の組換え部位を含む第２の核酸分子との間の組換
    えの効率を増強する、核酸分子。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の単離された核酸分子であって、ここで
    前記変異ａｔｔ組換え部位は、ヌクレオチド配列： 【化１】 （ここで「ｎ」は、任意のヌクレオチドを表す）を有するコア領域を含む変異ａ
    ｔｔＬ部位である、核酸分子。
31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の単離された核酸分子であって、ここで
    前記変異ａｔｔＬ組換え部位は、以下： 【化２】 から選択されるヌクレオチド配列を有するコア領域を含む、核酸分子。
32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の単離された核酸分子であって、ここで
    前記変異ａｔｔ組換え部位は、以下： 【化３】 からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するコア領域を含む、核酸分子
    。
33. 【請求項３３】 ｐＥＮＴＲ１Ａ、ｐＥＮＴＲ２Ｂ、ｐＥＮＴＲ３Ｃ、ｐＥ
    ＮＴＲ４、ｐＥＮＴＲ５、ｐＥＮＴＲ６、ｐＥＮＴＲ７、ｐＥＮＴＲ８、ｐＥＮ
    ＴＲ９、ｐＥＮＴＲ１０、ｐＥＮＴＲ１１、ｐＤＥＳＴ１、ｐＤＥＳＴ２、ｐＤ
    ＥＳＴ３、ｐＤＥＳＴ４、ｐＤＥＳＴ５、ｐＤＥＳＴ６、ｐＤＥＳＴ７、ｐＤＥ
    ＳＴ８、ｐＤＥＳＴ９、ｐＤＥＳＴ１０、ｐＤＥＳＴ１１、ｐＤＥＳＴ１２．２
    （ｐＤＥＳＴ１２としても知られる）、ｐＤＥＳＴ１３、ｐＤＥＳＴ１４、ｐＤ
    ＥＳＴ１５、ｐＤＥＳＴ１６、ｐＤＥＳＴ１７、ｐＤＥＳＴ１８、ｐＤＥＳＴ１
    ９、ｐＤＥＳＴ２０、ｐＤＥＳＴ２１、ｐＤＥＳＴ２２、ｐＤＥＳＴ２３、ｐＤ
    ＥＳＴ２４、ｐＤＥＳＴ２５、ｐＤＥＳＴ２６、ｐＤＥＳＴ２７、ｐＤＥＳＴ２
    ８、ｐＤＥＳＴ２９、ｐＤＥＳＴ３０、ｐＤＥＳＴ３１、ｐＤＥＳＴ３２、ｐＤ
    ＥＳＴ３３、ｐＤＥＳＴ３４、ｐＤＯＮＲ２０１（ｐＥＮＴＲ２１ ａｔｔＰベ
    クターまたはｐＡｔｔＰｋａｎドナーベクターとしても知られる）、ｐＤＯＮＲ
    ２０２、ｐＤＯＮＲ２０３（ｐＥＺ１５８１２としても知られる）、ｐＤＯＮＲ
    ２０４、ｐＤＯＮＲ２０５、ｐＤＯＮＲ２０６（ｐＥＮＴＲ２２ ａｔｔＰベク
    ターまたはｐＡｔｔＰｇｅｎドナーベクターとしても知られる）、ｐＤＯＮＲ２
    ０７、ｐＭＡＢ５８、ｐＭＡＢ６２、ｐＭＡＢ８５およびｐＭＡＢ８６からなる
    群から選択される、ベクター。
34. 【請求項３４】 請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
35. 【請求項３５】 請求項３３に記載のベクターによってコードされるポリペ
    プチド。
36. 【請求項３６】 核酸分子の合成における使用のためのキットであって、該
    キットは、請求項１〜１０、２６および２９のいずれか１項に記載の単離された
    核酸分子を含む、キット。
37. 【請求項３７】 核酸分子の合成における使用のためのキットであって、該
    キットは、請求項１５または１８に記載のプライマーを含む、キット。
38. 【請求項３８】 核酸分子のクローニングにおける使用のためのキットであ
    って、該キットは、請求項１９または３３に記載のベクターを含む、キット。