WO2004053123A1 - ｃＤＮＡにコードされるＯＲＦの効率的な組換え方法、並びにそれに用いる鋳型ベクター、トラップベクター及びプライマー - Google Patents

ｃＤＮＡにコードされるＯＲＦの効率的な組換え方法、並びにそれに用いる鋳型ベクター、トラップベクター及びプライマー Download PDF

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Takahiro Nagase
Daisuke Nakajima
Osamu Ohara
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Kazusa Dna Research Institute Foundation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
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    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention relates to an efficient recombination method of ORF encoded by cDNA, and a mirror vector, a trap vector, a primer and the like used for the method.
  • Gene cloning is an indispensable technique for genetic research as a means to separate and amplify specific genes or DNA.
  • the genome which is also called "functional genomics”
  • the genome which is also called "functional genomics”
  • a fragment vector containing a target gene is digested with an appropriate restriction enzyme, and the fragment is also digested with a restriction enzyme, a plasmid vector, a bacteriophage-derived cosmid vector and a bacteriophage P1 vector 1.
  • a recombinant DNA molecule is prepared by inserting it into an appropriate cloning vector such as a bacterial artificial chromosome (BAC) or a P1-derived artificial chromosome (PAC). Molecules have been grown using bacteria such as E. coli and hosts such as phages to obtain large amounts of recombinant DNA molecules.
  • a restriction enzyme site is present at an appropriate position to appropriately cut out a fragment containing the gene to be cloned (target DNA region).
  • the DNA sequence of the target gene or the like can be obtained by a method called PCR, which is an in vitro reaction using DNA designed by DNA synthase and a primer designed based on a known amino acid sequence or base sequence. Large quantities can be obtained.
  • the purpose of the present invention is to solve the above-mentioned problems observed in the excision of a gene or amplification of a DNA region by PCR. That is, in the present invention, using a homologous recombination reaction, target ORF, for example, A method for accurately, quickly and conveniently clone a target ORF (gene) that encodes a protein, particularly a long ORF of several thousand bp in cDNA, and its use It is an object to provide means such as various vectors. Disclosure of the invention
  • the present invention comprises a replication origin, a first drug resistance gene, a first primer binding sequence, a second primer binding sequence, and a first and a second primer binding sequence.
  • the present invention provides, as a second embodiment, a first primer consisting of an antisense sequence of the 5 'terminal sequence of the target ORF and an antisense sequence of the first primer binding to the third side thereof; (3)
  • the present invention relates to a PCR primer for preparing a trap vector, comprising a second primer comprising a sense sequence of a terminal sequence and a sense sequence of a second primer-binding sequence bound to the 3 ′ side thereof.
  • a kit for preparing a trap vector including the above-mentioned mirror vector for trap vector and a PCR primer, and a PCR using the kit for preparing a trap vector.
  • the present invention relates to a method for producing a linear trap vector.
  • a method for preparing a closing vector containing the target ORF in a trap vector by a homologous recombination reaction between the trap vector and the target ORF According to.
  • the present invention relates to a cleaning vector obtained by the above-mentioned cleaning method.
  • the present invention relates to a method for cloning a target ORF, comprising growing the above cloning vector.
  • the present invention relates to the gene itself encoded by the target ORF thus cloned.
  • Figure 1 shows the structure of the PCR product containing the attB site.
  • FIG. 2 shows a scheme of each step of preparing a cloning vector containing a target 0RF using homologous recombination of the present invention.
  • FIG. 3 is a continuation of FIG. 2 and shows a scheme of each step of preparing a cloning vector containing a target 0RF using homologous recombination of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph showing the result of electrophoresis confirming the in vitro transcription / translation reaction product of T7DESThg00295N1 (about 210 kDa / nd).
  • FIG. 5 is a photograph obtained by Western blotting analysis of a protein obtained from a cultured cell expressing a clone obtained by the ORFT trap method of the present invention using an anti-GJ antibody.
  • the “origin of replication” is a sequence required for the mirror vector and the trap vector produced therefrom to be replicated in the host. Any sequence known to those skilled in the art can be selected according to the host used.
  • a “drug resistance gene” is any sequence that has the function of allowing a vector containing this gene to grow on a suitable selection medium, for example, antibiotics such as kinamicin, ampicillin, and chloramphenicol. Resistance genes.
  • first primer-binding sequence and “second primer-binding sequence” Represents a sequence which is complementary to the first primer and the second primer of the present invention, respectively, and is necessary for preparing a linear trap vector by PCR.
  • the first primer binding sequence is a translation of a eukaryote.
  • Including at least a portion of the Kozak consensus sequence, including the initiation codon, allows the final cloned target ORF to be translated in eukaryotic cells.
  • a Shine-Dalgarino sequence which is a liposome binding site in Escherichia coli, at an appropriate position 5 ′ upstream of the Kozak consensus sequence (for example, a position 3 to 10 bases away from the initiation codon).
  • the ORF region can be translated in E. coli.
  • the second primer binding sequence preferably contains a TGN or TAN (N is G, A, T or C) sequence.
  • N is G, A, T or C
  • a trap vector (Native type) in which only the target ORF is translated as a protein is obtained.
  • TGT sequence of the winter stop codon
  • this portion is read-through, and if this is followed by an appropriate RF, a trap vector (Fusion type) which is translated as a fusion protein is used. can get.
  • the protein encoded by the target ORF and the tag peptide can be linked. Fusion protein is expressed, and these can be easily purified using an antibody against tag peptide or affinity chromatography, or expressed or recognized in cultured cells, and localized in cells.
  • Native type and Fusion type trap vectors can be simultaneously obtained.
  • the final two types of cloning vectors can be cleaved at the restriction enzyme site by further adding a restriction enzyme site containing a TGN or TAN sequence.
  • the restriction enzyme sites There is no particular restriction on the restriction, and those obtained by substitution of one or two bases with a stop codon are preferred. For example, Xbal, SraBI, Bell, Fspl, Mscl, Nrul, and "BspHI" can be mentioned.
  • the first primer-binding sequence and the second primer-binding sequence Although the number of base sequences is not particularly limited, it is composed of at least 5 bases, more preferably 7 to 25 bases, and the first primer binding sequence is at least a part of the Kozak consensus sequence and the Shine-Dalgarno sequence.
  • the “suicide gene” flanked by the first and second primer binding sequences does not allow the host cell transformed with the mirror vector for trap vector containing this gene to grow.
  • any known gene to those skilled in the art for example, c cdB iPhilippe Bernard, et al "Gene, Vo.148, Positive-selection vectors usmg the F Plasmid ccdB killer gene, p p.71-74)
  • the first drug resistance is further added between the first and second primer binding sequences.
  • Vectors can be readily prepared by those skilled in the art using known methods in genetic engineering, ie, starting from a suitable E. coli plasmid vector or phage-derived vector known to those skilled in the art.
  • a suitable E. coli plasmid vector or phage-derived vector known to those skilled in the art.
  • To make a mirror vector for the trap vector of the present invention or use the restriction enzyme, PCR, or Gateway TM technology for the trap vector of the present invention. It is also possible to create a mold vector.
  • the type V vector for the trap vector of the present invention can be prepared using the type III reaction in the site-specific recombination system of ⁇ phage.
  • an appropriate starting vector having an origin of replication, a first drug resistance gene, and attPl and attP2 regions, and functions as a first primer-binding sequence and a second primer binding sequence between the attBl and attB2 regions.
  • a first primer-binding sequence and a second primer binding sequence between the attBl and attB2 regions.
  • a second drug resistance gene and a suicide gene between attL1 and attL2 using a restriction enzyme treatment, the first primer sequence and the second primer sequence between attL1 and attL2 are further reduced.
  • a mirror vector for a trap vector containing a binding sequence can be created.
  • the nucleotide sequence fragment can be prepared by an appropriate method known to those skilled in the art, such as PCR.
  • a PCR primer for preparing a trap vector according to the present invention a first primer comprising an antisense sequence of the 5 ′ terminal sequence of the target ORF and an antisense sequence of the first primer binding sequence bound to the 3 ′ side thereof
  • a second primer consisting of the sense sequence of the 3 ′ terminal sequence of the target ORF and the sense sequence of the second primer binding sequence bound to the 3 ′ side of the target ORF.
  • Homologous recombination reaction significantly occurs between the trap vector obtained by the PCR reaction and the target ORF, and as a result, the target 0 RF can be accurately and efficiently incorporated into the trap vector.
  • a linear trap vector can be prepared by PCR using a kit containing the above-mentioned mirror vector for trap vector 1 and the above-mentioned PCR primer.
  • PCR itself is a well-known technique in the art, such as PCR conditions. Those skilled in the art can appropriately select and easily implement the method.
  • the kit may appropriately contain other reagents necessary for PCR, such as a buffer and a polymerase.
  • the target ORF can be provided in any form.
  • the target ORF may be part of the genome, or may be derived from a plasmid vector, a cosmid vector derived from ⁇ bacteriophage, a bacteriophage ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 vector, a bacterial artificial chromosome (BAC), and a ⁇ ⁇ 1 It can be provided in the form of cDNA inserted into various coding vectors such as artificial chromosomes (PAC).
  • Target 0 RF is likely to contain a gene that encodes the genetic information of the protein.
  • a preferred target ORF is a cDNA contained in a vector, and in particular, a target ORF that is a long chain cDNA having a base having a length of several thousand bp or more and up to 10,000 thousands bp. Cloning can be advantageously performed. The homologous recombination reaction itself is known to those skilled in the art.
  • Bacteria can be co-transformed with a vector containing the F region region, and a homologous recombination reaction can be performed in the bacteria.
  • a homologous recombination reaction the use of Rec BCD may cause digestion of linear DNA fragments due to its strong exonuclease activity. Reaction is preferred.
  • culturing the thus transformed bacteria under appropriate temperature and time conditions for example, at 37 ° C. for about 1 to several hours, a regenerated colony can be obtained.
  • a bacterium containing the cloning vector of the present invention can be grown to obtain a target ORF. Can be cloned.
  • the turbidity at the time of collection (wavelength 600 nm) was set lower (about 0.3-0.4) By setting to, more regenerated colonies can be obtained.
  • a bacterium such as Escherichia coli having a high homologous recombination activity is preferably used as a bacterium used for preparing a closing vector containing a target ORF by a homologous recombination reaction.
  • An example of such an Escherichia coli having a high homologous recombination activity is the sbcA strain expressing RecE / RecT (Clark, AJ et al., Genes of the RecE and RecF pathways of conjugational recombination in Escheric hia coll, Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.49, 453-462; Hall, SD, Kane, MR & Kolodner, R.D "Identification and characterization of the Es chericnia coli RecT protein encoded by the RecE region that promotes ren aturation homologous single-stranded DNA, J.
  • Bacteriol. 175, 277-287
  • JC869 and JC9664 It is also possible to transform an appropriate Escherichia coli strain with a plasmid having the ecT gene and use the transformed Escherichia coli strain. Examples are described in the non-patent documents 1 and 2.
  • the target ORF can be cloned.
  • the cloning method of the present invention does not require purification and isolation of DNA or the like containing the target 0RF in advance, and Since the target 0RF is amplified using the replication mechanism in Escherichia coli, there is no possibility that the mutation of the base sequence due to Taq polymerase, which occurs in the amplification by conventional PCR, occurs.
  • the cloning vector of the present invention can function as an entry clone in Gateway TM technology (cloning kit).
  • Gateway TM technology cloning kit
  • the desired ORF is maintained while maintaining the target ORF by the LR reaction, which is a site-specific recombination reaction of phage, between the entry clone and various destination vectors.
  • An expression clone linked to a promoter, a tag, or the like for the expression system is obtained in high throughput.
  • a transcription regulatory sequence such as a promoter is previously placed at an appropriate position in the mirror vector for trap vector of the present invention.
  • the closing vector of the present invention can be used immediately as an expression vector that functions in an expression system corresponding to the promoter or the like.
  • the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Various genetic manipulations in the examples were performed according to methods well known to those skilled in the art described in the above-mentioned “Latest Protocol of Molecular Biology” (edited by Frederick M. Ausubel et al., (1987)).
  • the figures show schemes (1) to (7) of each step described in the following examples.
  • PCR 50 ⁇ l volume (51 dTP (2.5 mM 6 & (3 ⁇ 4), 51 10 ⁇ PGR Buffer (M ⁇ plus), ⁇ PI (100 pmol / ⁇ /), ⁇ ; ⁇ 2 (100 pmol / ul) , 0.5 / ⁇ 1 LA Taq (Takara), 37.5 ⁇ 1 DDW) PGR reaction after denaturation at 94 ° C for 3 min, denaturation at 94 ° C for 15 sec, annealing at 30 ° C for 30 sec, extension at 68 ° C for 15 sec This was followed by 10 cycles of denaturation at 94 ° C for 15 sec, 20 cycles of denaturation at 55 ° C for 30 sec, and extension at 68 ° C for 15 sec, followed by cooling at 4 ° C.
  • the PCR product containing the attB site (Fig. 1)
  • the PCR solution containing the sequence shown in (1) above was purified using a Concert Rapid PCR purification kit from Invitrogen using 50/1 TE (10 mM ris (pH 8.0), O.lmM EDTA). Eluted.
  • the PCR product containing the attB site was introduced into pDONR221 donor-vector-1 (Invitrogen) by BP reaction.
  • the reaction was performed in a volume of 101 (5 yd of PCR product containing attB site ⁇ of pDONR201 (150 ng / Ad), 2 il of 5xBPbuffer, 2/1 of BP Clonase Enzyme Mix). After leaving for lhr at room temperature, lycd ProteinaseK was added and incubated at 37 ° C for 10 min.
  • the BP reaction solution of 11 and 25 zl of a DH5 calcium method combination cell (LIBRAEY EFFICIENCY DH5) were mixed and left on ice for 30 minutes.
  • the ccd gene was introduced into the Notl site of the pENTR + PCR product. Notl digestion of ⁇ + PCR product with 50 l volume (43 l pENTR + PCR product, 2 ⁇ NotI (Takara), 5 ⁇ l Hbuffer (Takara)) (37 ° C, 3 hr), followed by PCI treatment And treated with ethanol / chloroform / isoamyl alcohol), followed by ethanol precipitation.
  • a trap vector for subcloning the ORF was prepared by PCR from mouse hg00295 containing the myosin light chain kinase gene. PCR was performed in a volume of 501 (5 xl dNTP (2.5 mM each), 5 yl 10xLA PGR BufferCM ⁇ plus), 5 ⁇ P3 (lOpmol / ⁇ ), 5 ⁇ P4 (lOpmol / ⁇ ), 0.5 1 LA Taq (Takara), 24.5yU. 1 DDW).
  • the base sequences of the first primer (P 3) and the second primer (P 4) used for PCR are as follows, and their structures are shown in (5) in FIG.
  • pENTRhg00295Nl entity clone obtained by subcloning the ORF from clone hg00295 containing the myosin light chain kinase gene into the entry vector of the Gateway system was obtained.
  • the Notl digest of 5 g of clone ig00295 dissolved in 2 ⁇ l of sterile water and the trap vector for 500 ng of hg00295 prepared above were collected from 201 Escherichia coli strain JC8679 (available from Human Science Research Resource Bank). (Registration number: YG-HT017)) was transformed by the electoral poration method (BioRad E.
  • the ORF portion of hg00295 of pENTRhg00295Nl was replaced with the Nrul-Ncol site of pT7DEST (pET-DEST42 (Invitrogen) and the Nrul-Ncol site of pDEST24 (Invitrogen), which is a destination vector. (Converted to a mouse).
  • the LR reaction was performed in a 201 system (lENT pENTRhg00295Nl (279 ng / jLLl), 2 ⁇ l pT7DEST EcoR digest (20 ng / Ad), ⁇ 1 5xLR Buffer, 9 ⁇ l sterile water, 4 ⁇ l LR clonase mix). Performed at room temperature for 1 hour.
  • the product of pT7DESThg00295Nl was confirmed by in vitro transcription / translation reaction.
  • Prome A TNT Quick Coupled Transcripiton / Translation Systems from Moga was used.
  • the transcription / translation reaction was performed in a 50> l system (40 Ad TNT Quick Master Mix, ⁇ ⁇ 1 mM methionine, 51 pT7DESThg00295Nl (208 ng / ycd), 2 ⁇ ⁇ FluoroTect (Promega), 2 / I Nuclease- 30 in free water).
  • C 90 min.
  • the in vitro transcription-translation reaction product was confirmed by SDS-PAGE of Laemli.
  • Example 1 10 more genes were cloned by the method of the present invention. The results are summarized in Table 1 below. As is evident from the results in Table 1, 0 RF consisting of a very large number of bases in the range of about 7,000 to 10,000 was successfully and accurately and quickly and conveniently analyzed.
  • a trap vector for subcloning 0RF was prepared by PCR. Furthermore, the ORFs were subcloned from the clone (hk08136) and the clone (hj00081) containing each of the above genes into the entry vector of the Gateway system by recombination reaction in E. coli, and the clone was an entry clone. (PENTRA1400F1) and (pENTRA1158F1) were obtained.
  • the membrane was immersed in TBST (0.05% Tween20 in TBS (20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl)) for 10 minutes, and then immersed in a blocking solution (10% BSA in TBS) for 1 hour. After immersing in a primary antibody (GFP antiserum, Invitrogen Corp.) solution diluted 5000 times with a blocking solution for 1 hour, washing was performed four times with TBST for 5 minutes and with TBS for 5 minutes for 4 times. Next, the plate was immersed for 1 hour in a secondary antibody (alkaline phosphatase-fused anti-rabbit IgG antibody, CAPPELs Auroras Ohio, USA) solution diluted 4000 times with the blocking solution.
  • TBST 0.05% Tween20 in TBS (20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl)
  • lane 1 is a fusion protein of OL-protease doherin (Genbank accession no. AB037821) and GFP
  • lane 2 is a sodium channel; fusion of 5 subunits (Genbank accession no. AB032984) and GFP.
  • the proteins were electrophoresed, positive bands of about 140 kDa and about 50 kDa were confirmed, respectively, which corresponded to the expected molecular weights of 141,188 Da and 53,146 Da, respectively. It was considered that the full length of the fusion protein with was expressed.
  • a target ORF for example, a cDNA contained in a vector, particularly, a long ORF having several thousand bp or more.
  • a target ORF for example, a cDNA contained in a vector, particularly, a long ORF having several thousand bp or more.
  • the linear trap vector prepared in the present invention there is a 5 ′ unterminated sequence and a 3 ′ terminal sequence of the target 0RF, so that a homologous pair between this trap vector and the target ORF
  • a cloning vector containing only the target ORF in the trap vector can be prepared.
  • UTR untranslated region
  • the cloning vector of the present invention created using the vector It can function as an entry clone.
  • homologous recombination between the entry clone and various destination vectors (LR reaction) maintains the target ORF and links to promoters, tags, etc. for the desired various expression systems. Expression clone becomes high-throughput

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Abstract

　本発明は、従来の制限酵素によるＤＮＡ領域（又は遺伝子）の切り出し、又はＰＣＲによるＤＮＡ領域の増幅にみられる上記の問題点を解決することを目的とする。　本発明は、相同組換え反応を利用し、標的ＯＲＦ、例えば、蛋白質をコードしているような標的ＯＲＦであって、特に、ｃＤＮＡ中の数千ｂｐにも及ぶ長鎖ＯＲＦを正確、迅速、且つ簡便にクローニングする方法、及びそれに用いる各種ベクター等の手段を提供する。

Description

明 細 書 c D N Aにコードされる O R Fの効率的な組換え方法、 並びにそれに用いる鏡型 ベクター、 トラップベクタ一及びプライマー 技術分野
本発明は、 c D N Aにコードされる O R Fの効率的な組換え方法、並びにそれに 用いる鏡型べクタ一、 トラップベクタ一及びブライマ一等に関する。 背景技術
遺伝子のクロ一ニングは特定遺伝子又は D N Aを分離 ·増幅させるための手段 として、遺伝子研究に必須の技術である。特に、 ヒトゲノム計画における大規模 シークエンジングによって、 2 0 0 1年 2月にヒトゲノムドラフト配列が公開さ れた今日、 次の大きな課題の一つである 「ファンクショナル 'ゲノミクス」 とも 呼ばれるような、 ゲノムに含まれる遺伝子の機能を解析する研究において、数千 b pに達する大きな塩基配列を有する遺伝子を正確にクロ一ニングすることが非 常に重要な課題となっている。 従来、遺伝子のクロ一ニングにおいては、 目的遺伝子を含む断片を適当な制限 酵素で切断し、 その断片を同じく制限酵素で切断したプラスミドベクタ一及び入 バクテリオファージ由来のコスミドベクター、バクテリオファージ P 1ベクタ一、 細菌人工染色体（ B A C )、及び P 1由来人工染色体 ( P A C )等の適当なク口一 ニングベクターに挿入して組換え D N A分子 （組換えべクタ一） を作成し、 この 組換え D N A分子を大腸菌等の細菌、 ファージ等の宿主を利用して増殖させて大 量の組換え D N A分子を得ていた。 しかしながら、 この方法ではクローニングの対象となる遺伝子（標的 D N A 域） を含む断片を適切に切り出す為に適当な位置に制限酵素部位が存在している 必要があり、 更に、制限酵素で切り出した断片をクロ一ニングベクターに挿入す る前にそれらを精製することが必要である。 その為に、数千 b pに達する大きな 塩基配列を有する遺伝子をクローニングすることは技術的に困難であつた。 或いは、 D N A合成酵素による D N A合成を利用し、既知のアミノ酸配列又は 塩基配列に基づき設計されたプライマ一を用いて試験管内反応である P C Rと呼 ばれる方法によって、 目的とする遺伝子等の D N A配列が大量得られるようにな つている。 しかしながら、 この P C Rにおいては、 D N A合成酵素による D N A合成に際 して、 4 0 0〜5 0 0 0塩基に一つの割合で読み違いが起こるといわれ、 その結 果、増幅された遺伝子配列の正確性■再現性に問題がある。 最近、 このような問題点を解決する技術として、 下記の非特許文献 1及び非特 許文献 2に記載されたような、相同組換えの原理を利用した新たな遺伝子ク口一 ニング方法が提案された。
[非特許文献 1 ]
Youming Zhang他著、 NATURE BIOCHEMISTRY, Vol. 18， "DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli", 2000, pp.1314-1317
[非特許文献 2 ]
Joep P.P. Muyrers他著、 TRENDS in Biochemical sciences Vol.26, "Techniq ues： Recombinogenic engineering-new options for cloning and maimpulatin g DNA", pp.325-331. 本発明は、従来の制限酵素による D N A領域（又は遺伝子） の切り出し、 又は P C Rによる D N A領域の増幅にみられる上記の問題点を解決することを目的と する。即ち、本発明においては、相同組換え反応を利用し、標的 O R F、例えば、 蛋白質をコードしているような標的 O R F (遺伝子） であって、特に、 c D N A 中の数千 b pにも及ぶ長鎖 O R Fを正確、迅速、且つ簡便にクロ一ニングする方 法、 及びそれに用いる各種べクタ一等の手段を提供することを目的とする。 発明の開示
即ち、本発明は第一の態様として、 複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、第一プ ライマ一結合配列、第二プライマ一結合配列及び、第一及び第二のプライマー結 合配列に挟まれた自殺遺伝子を含むことを特徴とする、 トラップベクタ一用鐃型 ベクタ一に係る。 本発明は第二の態様として、標的 O R Fの 5 ' 末端配列のアンチセンス配列及 びその 3， 側に結合した第一のブラィマ一結合配列のァンチセンス配列から成る 第一プライマ一、並びに、該 O R Fの 3， 末端配列のセンス配列及びその 3 ' 側 に結合した第二のプライマ一結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから 成る、 卜ラップべクタ一作成用 P C Rプライマーに係る。 本発明は第三の態様として、 上記トラップベクタ一用鏡型べクタ一及び P C R プライマ一を含むトラップベクタ一作成用キッ卜、 並びに、 該卜ラップべクタ一 作成用キッ卜を用いて P C Rにより直鎖状のトラヅプベクターを作成する方法に 係る。 更に、第四の態様として、 上記トラップベクタ一と標的 O R Fのとの間での相 同組換え反応により、該標的 O R Fを卜ラップべクタ一内に含むクロ一ニングべ クタ一を作成する方法に係る。 更に、第五の態様として、 上記クロ一ニング法により得られたクロ一ニングべ クタ一に係る。 更に、 第六の態様として、上記クローニングベクタ一を増殖させることから成 る、標的 O R Fのクローニング法に係る。 又、 第七の態様として、 こうしてクロ一ニングされた標的 O R Fにコードされ る遺伝子自体に係る。 図面の簡単な説明
図 1は attB部位入り： PCR産物の構造を示す。
図 2は本発明の相同組換えを利用した標的 0 R Fを含むクローニングベクター を作成する各工程のスキームを示す。
図 3は図 2の続きであって、本発明の相同組換えを利用した標的 0 R Fを含む クローニングベクターを作成する各工程のスキームを示す。
図 4は T7DESThg00295Nlの試験管内転写翻訳反応産物（約 210kDa/ ンド） を確認する電気泳動の結果を示す写真である。
図 5は本発明の ORFT trap法で得られたクローンを発現させた培養細胞から 得た蛋白質を抗 GJ 抗体を用いてウエスタンブロッテイング解析して得られた 写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の第一の態様である卜ラップベクター用鐃型べクタ一において、 「複製 起点」 は鏡型ベクター及びそれから作成される卜ラップべクタ一が宿主内で複製 される為に必要な配列であり、使用する宿主に応じて当業者に周知の任意の配列 を選択することが出来る。「薬物耐性遺伝子」とは、この遺伝子を含むベクタ一を 適当な選択培地で増殖可能とさせる機能を有する任意の配列であり、例えば、 力 ナマイシン、 アンピシリン、及びクロラムフエニコ一ルのような抗生物質に対す る耐性遺伝子を挙げることが出来る。 本明細書において、 「第一ブライマ—結合配列」及び「第二プライマー結合配列」 は、 夫々、本発明の第一プライマ一及び第二プライマーと相補的に結合し、 P C Rにより直鎖状の卜ラップべクターを作成するために必要な配列を意味する。従 つて、 このような配列はブライマ一と相補的な結合を形成することが出来る配列 であれば特に制限はないが、 その好適例として、例えば、第一プライマー結合配 列が真核生物の翻訳開始コドンを含むコザヅクコンセンサス配列の少なくとも一 部を含むことによって、最終的にクローニングされた標的 O R Fを真核細胞内で 翻訳させることが可能となる。更に、 このコザックコンセンサス配列の 5 ' 上流 側の適当な位置 （例えば、 開始コドンから 3 ~ 1 0塩基離れた位置） に大腸菌に おけるリポソー厶結合部位であるシャイン ·ダルガ一ノ配列を含むことによって、 O R F領域を大腸菌内で翻訳させることも可能となる。 一方、第二プライマー結合配列には T G N又は T A N ( Nは G， A , T又は C ) 配列が含まれていることが好ましい。 $冬止コドンである T G A、 丁 又は丁 Gの配列を含む第二プライマ—結合配列を使用した場合には、標的 O R Fのみが 蛋白質として翻訳される卜ラップべクタ一 （Native型） が得られ、 又、 T G T 等のその他の配列を含む場合には、 この部分がリードスルーされてその後ろに更 に適当な〇 R Fが続く場合には融合蛋白質として翻訳される卜ラップベクター (Fusion型） が得られる。従って、 例えば、 標的 O R Fの下流に、適当なタグ ぺプチド （ 6 X H "i s， F L A G， 及び H A等） をコ一ドする塩基配列を結合さ せることによって、標的 O R Fがコードする蛋白質とタグペプチドとの融合蛋白 質が発現され、 タグぺプチドに対する抗体又はァフィ二テイクロマ卜グラフィ等 を利用してこれらを容易に精製したり、 又は培養細胞内で発現ないし認識させ細 胞内での局在などを解析することが出来る。上記各配列を含む 2種類の第二ブラ ィマ一結合配列をミックスプライマ一として合成して使用することにより、 同時 に Native型及び Fusion型の卜ラップべクタ一を得ることが出来る。最終的に得 られる 2種類のクローニングベクタ一は、 T G N又は T A N配列を含む制限酵素 部位を更に含ませることによって、 その制限酵素部位で切断することにより、 こ の両方の型のクローンを容易に同定■分離することが出来る。 この制限酵素部位 に特に制限はなく、終止コドンとの 1〜2塩基の置換によって得られるものが好 ましい。例えば、 Xbal, SraBI, Bell, Fspl, Mscl, Nrul,及び "BspHI等を挙げる ことが出来る。 プライマーとの結合が特異的に行われる限り、 第一プライマ一結合配列及び第 二のプライマ一結合配列の塩基配列の数に特に制限はないが、 少なくとも 5個の 塩基から成り、 より好ましくは 7〜2 5塩基から成り、第一プライマ—結合配列 はコザックコンセンサス配列及びシャイン■ダルガーノ配列の少なくとも一部を 含むことが好ましい。 第一及び第二のプライマー結合配列に挟まれた「自殺遺伝子」 は、 この遺伝子 を含むトラップベクタ一用鏡型べクタ一で形質転換された宿主細胞を増殖させな いようにする為に使用するものであり、当業者に周知の任意の遺伝子、例えば、 c cdB iPhilippe Bernard, et al" Gene, Vo.148, Positive-selection vectors usm g the F Plasmid ccdB killer gene, pp.71-74)等を挙げることが出来る。 更に、本発明の卜ラップべクタ一用鏡型べクタ一において、第一及び第二のプ ライマー結合配列の間に更に第一の薬物耐性遺伝子とは別の種類の第二の薬物耐 性遺伝子を挟むことによって、 卜ラップべクタ一用鏡型べク夕一の調製を容易に 行うことが出来る。 本発明の卜ラップベクター用鏡型べクタ一は、 当業者であれば、遺伝子工学に おいて公知の手段で容易に作成することが出来る。即ち、 当業者に公知の適当な 大腸菌のプラスミドベクタ一又はファージ由来のベクタ一から出発して本発明の 卜ラップべクタ一用鏡型べクタ一を作成することが出来る。或いは、制限酵素、 P C R、 又は G a t e w a y (商標） テクノロジ一を利用して本発明の卜ラップ ベクター用鎳型べクタ一を作成することも可能である。 例えば、 以下の実施例に示すように、 λファージの部位特異的組換えシステム における Β Ρ反応を用いて本発明の卜ラップべクタ一用錶型べクタ一を作成する ことが出来る。
この場合には、複製起点、第一の薬物耐性遺伝子、 並びに、 attPl及び attP2 領域を有する適当な出発ベクターと、 attBl及び attB2領域の間に第一プライマ —結合配列及び第二プライマー結合配列として機能する配列 （例えば、 コザヅク コンセンサス配列の少なくとも一部、 シャイン 'ダルガーノ配列の少なくとも一 部、 T G N又は T A N等を含む塩基配列断片） との間で λファージの部位特異的 組換え反応である B P反応を行わせ、 更に、 第二の薬物耐性遺伝子と自殺遺伝子 を attLl及びに attL2の間に制限酵素処理を用いて挿入することにより、 attLl及 びに attL2の間第一ブラィマ一結合配列及び第二ブライマ一結合配列を含む卜ラ ヅプベクタ一用鏡型べクタ一を作成することが出来る。尚、上記塩基配列断片は、 例えば、 P C R等の当業者に公知の適当な方法で作成することが出来る。 本発明の卜ラップべクタ一作成用 P C Rプライマ一として、標的 O R Fの 5 ' 末端配列のァンチセンス配列及びその 3 ' 側に結合した第一のブラィマ一結合配 列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、 並びに、該標的 O R Fの 3 ' 未 端配列のセンス配列及びその 3 ' 側に結合した第二のブラィマ一結合配列のセン ス配列から成る第二プライマーを使用する。 P C R反応で得られるトラップべク ターと標的 O R Fとの間で相同組換え反応が有意に生起し、 その結果、該標的 0 R Fを卜ラップべクタ一内に正確かつ効率的に取り込むことができる限り、標的 0 R Fの 5 '末端配列及び 3 '末端配列の塩基の数に特に制限はない。通常、夫々、 少なくとも 1 0個の塩基を有することが好ましく、 夫々、 2 5個〜 6 0個程度の 塩基を有していることが更に好ましい。 錶型として上記トラップベクタ一用鏡型べクタ一及び上記 P C Rプライマ一を 含むキッ卜使用して P C Rにより直鎖状のトラップベクタ一を作成することがで きる。 P C R自体は当該技術分野において周知の技術であり、 P C Rの条件など 当業者が適宜選択して容易に実施することが出来る。 尚、該キヅ卜には緩衝液、 ポリメラーゼ等のその他の P C Rに必要な試薬類が適宜含むことが出来る。 こうして作成された直鎖状のトラップベクタ一の両端には、該標的 0 R Fの 5 ' 末端配列及び該標的 0 R Fの 3 ' 未端配列があるので、 この卜ラップベクターと 標的 0 R Fとの間での相同組換え反応により、該標的 0 R Fのみをトラップべク ター内に取り込み、 その結果、 クロ一ニングベクターを作成することが出来る。 通常の発現系においては、 0 R F領域の上流及び下流には非翻訳領域 ( U T R ) が存在し、 0 R F領域が蛋白質に翻訳される際にこの U T Rが様々な影響を及ぼ し、蛋白質発現の妨げとなる場合が知られている。 これに対して、本発明で作成 したクロ一ニングベクターに含まれる標的 0 R Fの上流及び下流には不要な非翻 訳領域（ U T R ) が存在しないようにすることが可能であり、 各発現系で発現す る際に上記のような問題が回避することができる。 本発明において、標的 O R Fは任意の形態で提供することができる。例えば、 標的 O R Fはゲノムの一部であってもよいし、 又は、 プラスミドベクタ一、 λバ クテリオファージ由来のコスミドベクタ一、 バクテリオファージ Ρ 1ベクター、 細菌人工染色体（ B A C )、及び Ρ 1由来人工染色体（ P A C )等の各種ク口一二 ングベクタ一に揷入された c D N Aの状態で提供することが出来る。或いは、合 成された D N Aの一部でも良い。 標的 0 R Fには蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれている可能性が 高い。本発明において、 好ましい標的 O R Fはべクタ一に含有された c D N Aで あり、特に、数千 b p以上で一万数千 b pにも及ぶ長さの塩基を有する長鎖 c D N Aである標的 O R Fを有利にクロ一ニングすることが出来る。 相同組換え反応自体は当業者に公知である。具体的には、 例えば、 エレクトロ ポレーション等の当業者に周知の適当な方法を用いて、 卜ラップべクタ一と O R F領域領域を含有するべクタ一で細菌を共形質転換し、該細菌内で相同組換え反 応を行わせることが出来る。相同組換え反応において、 R e c B C Dを利用する とその強力なェクソヌクレア一ゼ活性により直鎖状 D N A断片が消化されてしま う虞があるために、 R e c E及び R e c T酵素による相同組換え反応が好ましい。 このようにして形質転換した細菌を適当な温度及び時間の条件下、例えば、 3 7 °Cで 1〜数時間程度培養することによって、再生コロニ一を得ることができる。 こうして得られた再生コロニーの一部を第一の薬物耐性遺伝子に対応する薬物を 含む適当な培地中で培養することによって、 本発明のクローニングベクタ一を含 む細菌を増殖させることにより、標的 O R Fのクロ一ニングを行うことが出来る。 又、 上記の共形質転換に使用するコンビテント細胞の調製時において、 集菌時の 濁度（波長 6 0 0nm) を通常の値（約 0.5-0.6 ) に比べて低め （約 0.3-0.4) に設 定することよって、再生コロニー数がより多く得られる。 従って、本発明において、相同組換え反応により標的 O R Fを含むクロ一ニン グベクタ一を作成する際に使用する細菌としては、 このような相同組換え活性の 高い大腸菌等の細菌が好ましい。 このような相同組換え活性の高い大腸菌の例と して、 R e c E/ R e c Tを発現する s b c A株 (Clark, A.J. et al., Genes of the RecE and RecF pathways of conjugational recombination in Escheric hia coll, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 49, 453-462; Hall, S.D., K ane, M.R & Kolodner, R. D" Identification and characterization of the Es chericnia coli RecT protein encoded by the RecE region that promotes ren aturation homologous single-stranded DNA, J. Bacteriol., 175, 277-287)、 具体的には、 J C 8 6 7 9及び J C 9 6 0 4等を挙げることが出来る。更に、 R e c E/R e c T遺伝子を有するプラスミドで適当な大腸菌株を形質転換し、 そ れを利用することも可能である。 このようにして形質転換して得られた相同組換 え活性の高い大腸菌の幾つかの例が、前記非特許文献 1及び 2に記載されている。 このように、 本発明のクローニングベクターを適当な宿主系で増殖させること により、標的 O R Fのクロ一ニングを行うことが出来る。従って、本発明のクロ —ニング法では、制限酵素を使用して D N Aをクロ一ニングする従来の方法とは 異なり、予め標的 0 R Fを含む D N A等を精製'単離する必要がなく、又、大腸菌 体内の複製メカニズムを利用して標的 0 R Fを増幅するので、従来の P C Rによ る増幅に見られる T a qポリメラーゼによる塩基配列の変異が発生する可能性が ない。 更に、既に記載したように、 入ファージの部位特異的組換えシステムにおける B P反応を用いて作成された、 attLl及びに attL2の間に第一プライマ一結合配列 及び第二ブラィマ一結合配列を含むトラップベクタ一用鐃型べクタ一を用いた場 合には、本発明のクローニングベクタ一は G a t e w a y (商標） テクノロジ一 (クローニングキ ポ Ϊ)におけるエントリークローンとして機能することが出来る。 この G a t e w a yテクノロジ一においては、 エントリ一クローンと各種デステ イネ一シヨンべクタ一との間の; ファージの部位特異的組換え反応である L R反 応によって、標的 O R Fを維持しながら、所望の各発現系に対するプロモーター、 タグ等に連結した発現クローンがハイスループッ卜に得られる。 尚、 このような G a t e w a yテクノロジ一で使用するェントリ一クローンと しての機能は持たないが、本発明のトラップベクタ一用鏡型ベクターの適当な位 置にプロモータ一等の転写調節配列を予め揷入させておくことにより、本発明の クロ一ニングベクターはそのプロモータ一等に応じた発現系で機能する発現べク ターとして直ちに使用することが出来る。 以下に、 実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限 定されるものではない。実施例における各種遺伝子操作は、 上記の 「分子生物学 の最新プロ卜コール」（Frederick M. Ausubelら編、 （1987》等に記載されている 当業者に周知の方法に従った。 尚、 図に以下の実施例に記載する各工程のスキーム （1 )〜（7 ) を示す。 実施例 1
( 1 ) attB部位入り PCR産物 (products) の作成
PCRは 50μ1の容量（5 1の d TP(2.5mM 6&(¾)，5 1の10^ PGR Buffer(M ^ plus), Ιμλの PI (lOOpmol/μΙ ), Ιμλの； Ρ2 (100pmol/ul), 0.5/^1 LA Taq (Takara), 37·5μ1の DDW)でおこなった。 PGR反応は、 94°C 3minで変性後、 94°C 15sec変性、 30°C 30secアニーリング、 68°C 15sec伸長を lOcycle行い、続けて 9 4°C 15sec変性、 55°C 30secァ二-リング、 68°C 15sec伸長を 20cycle行い、 4°C で保冷した。 こうして得られた attB部位入り PCR産物（図 1の （ 1 )で示され る配列） を含む PCR溶液の精製は、 インビ卜ロジェン社の Concert Rapid PCR purification kitを用い、 50 /1の TE(10mM ris(pH8.0)， O.lmM EDTA)に溶出 した。
( 2 ) pENTR+PCR産物 (products) の作成
BP反応により、 attB部位入り PCR産物を pDONR221ドナ一ベクタ一（ィンビ トロジェン社)に揷入した。反応は 10 1の容量 (5 y dの attB部位入り PCR産物 Ιμλの pDONR201(150ng/Ad )， 2 ilの 5xBPbuffer， 2/ 1の BP Clonase Enzy me Mix)でおこなった。室温で lhr放置した後、 lycdの ProteinaseKを加えて 37°C で lOmin保温した。 1 1の BP反応液と 25 zlの DH5 カルシウム法用コンビテン 卜セル (ィンビトロジェン社 LIBRAEY EFFICIENCY DH5ひ）を混合した後、氷 上で 30min放置した。 42°Cで 30secヒ一卜ショヅクを行った後、 氷上で 2min冷却 した。 SOCを 200 /1加え 37°Cで lhr培養し、 10 1を 50 Ug/mlカナマイシンプレ -卜に塗布し 87個の再生コロニーを得た。コロニーを 50/Ct g/mlのカナマイシンを 含む 2mlの LB液体培地に接種し、 振盪培養 (37°C， O/N)した後、 インビ卜ロジェ ン社の Concert Rapid Plasmid purification kitを使用して pENTR+PCR産物 を 75μ1 (119ng/ l )得た。 ( 3 ) 及び ( 4 ) トラップべクター用錶型べクタ一 （Template for Trap vector ) の作成
pENTR+PCR産物の Notlサイ卜に ccd遺伝子を導入した。 ρΕΝΊΈ+PCR産物 を 50 lの容量 (43 lの pENTR+PCR product, 2μΙの NotI(Takara)， 5μ1の Hbuffer(Takara))で Notl消化 (37°C, 3hr)した後、 PCI処理 (フエノ一ル /クロロホ ルム /イソァミルアルコールで処理)し、 エタノール沈澱を行った。 これを 100 l の容量 (88 1の DNA溶液， 10 Adの 10xAPbuffer(Takara)， 2JUL\の星 aline pho sphatase (Takara))で脱リン酸化処理 (65°C， 30min)し、 PCI処理した後 30 1 の TEに溶角军した。 両端に Notlサイトを付カロした Cn ccd断片 (pDONR201の 843b p-2617bpを Notlサイ 卜付き PCRプライマ一で増幅したもの)を準備した。 これら を 8 1の容量（0.5 Adの ρΕΝΊΈ+PCR productの Notl消化産物 (脱リン酸化処 理)と 2.5 1の Notlサイ 卜を付加した Cn ccd断片， 2 1の 2xIigation buffer(Pr omega社 pGEMT-E Kit), Ιμΐの T4 DNA Hgase(Promega pGEMT-E Kit))で ligation (室温， 3.5hr)した。この ligation液 1 1 と lO lの DB3.1カルシウム法用 コンビテントセル (ィンビトロジェン社 LIBRARY EFFICIENCY DB3.1 Comp etent Cells)を混合し、 氷上に 30mi 保冷後、 42°Cで 45secヒートショヅクを行しヽ、 氷上で 2min冷却した。 SOCを ΙΟΟμΙ加え 37°Cで 30min± 養した後、 100 1を 5 OyUg/mlのカナマイシンおよび 25yUg/mlのクロラムフエ二コールを含むプレー卜 に塗布した。再生したコロニ一を SO g/mlのカナマイシンおよび 25
Figure imgf000014_0001
口 ラムフエ二コールを含む 2mlの LB液体培地中で振盪培養 (37°C， 0/N)し、 BRL社 の kitを使用してプラスミドを調製した。結果、 卜ラップベクター用鐃型べクタ一 を 75 1 (367ng/ l )得た。
( 5 ) 及び ( 6 ) トラップベクタ一 （Trap vector) の作成
ミオシン軽鎖キナ一ゼ遺伝子を含むク口一ン hg00295からその ORFをサブク ローニングするためのトラップベクタ一を PCRにより作成した。 PCRは 50 1の 容量 (5 xlの dNTP(2.5mM each)，5y lの 10xLA PGR BufferCM^ plus), 5μϊ の P3 (lOpmol/μΙ ), 5μ.Ιの P4 (lOpmol/ Ι ), 0.5 1 LA Taq(Takara),24.5yU. 1の DDW)でおこなった。 PCR反応は、 94°C 5minで変性後、 94°C 30sec変性、 4 0。C 30secァニ一リング、 72°C 2min伸長を 5cycle行い、続けて 94°C 30sec変性、 55°C 30secァニ一リング、 72°C2mi 伸長を 20cycle行い、 4。Cで保冷した。 卜ラッ プベクタ一を含む PCR溶液の精製は、 インビトロジェン社の Concert Rapid PC R purification kitを用 ( 50 1の TE(10mMTris(pH8.0)， O.lmM EDTA)に溶出 した。
尚、 P C Rに用いた第一プライマー （P 3 )及び第二プライマ一 （P 4 ) の塩 基配列は下記の通りであり、 その構成は図 3中、 （5 ) に示した。
プライマ一 P 3 (配列番号 1 )：
5?-g t ttg gaa atg tg , gac gag gca acc age ttc aca tec ccc atg gtt cta tc-3' (下線部は、 P 3に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の 5 ' 末端配列のアン チセンス配列を示す）
プライマー P 4 (配列番号 2 )：
5'-acg atg gag aa ggt gaa ggg gaa ggg gaa gag gaa gaa gag tgw cta gac cca-3'
(下線部は、 P 4に含まれるミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の 3 ' 末端配列のセン ス配列を示す）
( 7 ) pENTRhg00295Nlの作成
大腸菌内の相同組み換え反応により、 ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子含むクロ一 ン hg00295からその ORFを Gatewayシステムのェン卜リ一ベクターにサブクロ —ニングした pENTRhg00295Nl (ェン卜リ一クローン） を得た。 2μ1の滅菌水 に溶解した 5 gのクロ一 ig00295の Notl消化物と、上記で作成した 500ngの h g00295用のトラップベクタ一を、 20 1の大腸菌 JC8679株（ヒューマンサイエ ンス研究資源バンクから分譲（登録番号： YG - HT017)) に、エレク卜口ポ一レ ーション法 (BioRad社製 E.coli pulser 1.67kv， 5.0msec, lmm cuvette)で形質転 換した。 200 1の SOCを加え、土咅養 (37°C，lhr)した後、 100 1を 50Ad mlカナマ イシンプレー卜に塗布し、 300個余りの再生コロニーを得た。 10個のコロニーを 5 OyCtg/mlのカナマイシンを含む 2mlの LB液ィ *±咅地に接種し、振盪培養 (37°C, 0 N) した後、 インビトロジェン社の Concert Rapid Plasmid purification kitを使用 してプラスミドを調製した。 Xbal消化を行った結果、 4個が Xbal消化され 6個が X bal消化できなかった。 これらのクローンに関しては ORFの末端とべクタ一の境 界領域をチェックすることにより、 Xbal消化されたク口一ンは、 Fusion型、 Xba I消化されなかったものは、 Native型であることが分かった。 6個の Native型のク ローンの一つを pENTRhg00295Nl (279ng/ 1 )とした。 pT7DESThg00295Nlの作成
LR反応により pENTRhg00295Nlの hg00295の ORF部分をデスティネーショ ン（Destination)ベクタ一である pT7DEST(pET-DEST42(ィンビ卜口ジェン社) の Nrul-Ncolサイ卜を pDEST24(ィンビトロジェン社)の Nrul-Ncolサイ卜に変換 したもの)に移した。 LR反応は、 20 1の系 （lAdの pENTRhg00295Nl (279 ng/jLLl )， 2μ1の pT7DESTの EcoR消化物 (20ng/Ad), ^1の 5xLR Buffer, 9ul の滅菌水， 4μ1の LR clonase mix)で室温で一時間行った。その後、 2 1の； Prot einaseKを加えて 37°Cで lOmin保温した。 ΙμΛの LR反応液と 50ulの DH5ひカル シゥム法用コンビテントセル (ィンビ卜ロジェン社 LIBRARY EFFICIENCY D H5ひ)を混合した後、氷上で 30min放置した。 42°Cで 30secヒ一トショヅクを行つ た後、氷上で 2min冷却した。 SOCを 450 1加え 37°Cで lhr±S養し、 200/^1を 50 g/mlのアンピシリンプレー卜に塗布し 300個余りの再生コロニーを得た。 コ口 二一を 50y g/mlのァンピシリンを含む 2mlの LB液体培地に接種し、 振盪培養 (3 7°C, O N)した後、 BRL社の Concert Rapid Plasmid purification kitを使用して 発現クローンである pT7DESThg00295Nlを 75 l (120ng/yCtl )得た。このプラス ミド溶液を Phenol7Chloroform/isoamylalcohol(PCI)処理した後、 EtOH沈澱を行 い 10 Ad (208ng/Ml )のヌクレア一ゼフリ一ウォータ一に溶解した。 pT7DESThg00295Nlの試験管内転写翻訳反応産物の確認
試験管内転写翻訳反応により pT7DESThg00295Nlの産物を確認した。 プロメ ガ社の TNT Quick Coupled Transcripiton/Translation Systemsを用いた。転写 翻訳反応は、 50> lの系 (40 Adの TNT Quick Master Mix, Ιμΐ Φ1 mM methi onine, 5 1の pT7DESThg00295Nl (208ng/ycd ), 2μ\の FluoroTect (プロメガ 社)， 2 /Iの Nuclease-free water)で 30。C， 90min行った。続いて、 レムリの SDS -PAGEにより試験管内転写翻訳反応産物を確認した。 2 1の転写翻訳産物と 3 1のリン酸バッファ一液と 1/ dの 6xサンプルバッファ一と Ο.ΐμΐの 2-メルカプ トェタノ一ル (14.4M)を混合した泳動サンプルを、 3分間沸騰水中で変性し、 7.5% の SDS-PAGEミニゲル（8.5cmx8.5cm)で、電気泳動 (40mAで 1時間）した。マーカ —は、バイ才ラド社のカレイドスコ一 Prestained Standardsを 5 1泳動した。 ゲルを無蛍光ガラス板にのせた後、 FluorImager595(モレキユラ一ダイナミクス 社、 検出条件 PMT Voltage 700, Exitation Filter 488nm, Em. Filter 530DF3 0)を用いていて約 210kDaパンドを検出した （図 4 )。 この結果は、 ミオシン軽鎖 キナ一ゼ蛋白質の計算上の分子量は、 210，130Daによく一致していた。 実施例 2
実施例 1と同様にして、 更に 1 0種の遺伝子を本発明方法によってクロ一ニン グした。その結果を以下の表 1にまとめて示す。表 1の結果から明らかなように、 約 7，000〜 1万数千の範囲の非常に多数の塩基数から成る 0 R Fを正確、迅速、 且つ簡便にク口一ニングすることに成功した。
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実施例 3
±咅養細胞での発現、 完全長蛋白質の発現
実施例 1と同様の方法で、 トラップベクタ一用鏡型べクタ一及び以下の表 2に 示したプライマーを使用して、 夫々、 0L -プロ卜力ドヘリン （0L- protocadherin: Genbank accession no. AB037821)及びナトリウムチャンネル サブュニヅ卜 （S odium channel β subunit: Genbank accession no. AB032984)の 0 R Fをサブ クロ一ニングするためのトラップベクタ一を PCRにより作成した。更に、 大腸 菌内の組換え反応により、上記各遺伝子を含むクローン（hk08136)及びクローン (hj00081) からそれらの OR Fを Gatewayシステムのェン卜リ一ベクタ一にサブ クローニングしエントリークローンである、 （pENTRA1400F1)及び（pENTRA1158F 1) を得た。
Figure imgf000020_0001
更に実施例 1と同様に、 上記の各エントリークローンに含まれる夫々の遺伝子 の 0 R Fを LR反応により pcDNADEST47 (Invitrogen, Carlsbad, CA、 USA、 CMVプロモータ一を有し、目的の蛋白質の C未に GFPを融合させた蛋白質を生成 する）に移した。プラスミドの希釈液 20Ad(4 g)に 250 1の¾ 11-匪]^(111 0§ en Corp.)を加えた。 10 1の力チ才ン脂質トランスフエクシヨン試薬 (LipofectA MINE 2000s Invitrogen Corp.s Carlsbads CA、 USA)と 250μ1の Opti-MEM を混ぜ合わせた。 プラスミドとトランスフエクション試薬の溶液を混合し、 室温 に 30分間置いた後、 6ゥエルプレ一卜中で 80-90%コンフルェン卜になった Flp In 293細胞 (Invitrogen Corp.)にふりかけトランスフエクシヨンした。 卜ランスフエクションから 3日後、 100 1の4 8&11¾)16 buffer (Aus bel, R， B rent, K, Kingston, R., Moore, D., Seidman, F., Smith, . and Struhl, K. (1987). Current protocols in molecular biology. New York, JOHN WILEY & SONS.)を細胞に加えることにより細胞を溶解し、 ポリスマンを使って細胞液 を回収した。超音波を加え (TAITEC VP-5S型、 OUTPUT CONTROL 10、 20 秒間)、細胞液の粘性がなくなることを確認した （DNAの断片化）。 次に、 8%の アクリルアミドゲルを用いて SDS-PAGE を行った。泳動後のゲルをプロッティ ング/ ヅファ一 (25mMTris、 192mMグリシン、 20%メタノール)に 15分間浸した 後、 PVDF膜 (Pall Corp., East Hills, NY、 USA)に 100mA定電流で 1時間転写 した (BE-300型、 BIOCRAFT、 TOKYO、 JAPAN)。膜を TBST(0.05%Tween20 in TBS(20mMTris-Cl, 150mMNaCl))に 10分間浸した後、ブロッキング液 (10%B SA inTBS)に 1時間浸した。ブロッキング液で 5000倍に希釈した一次抗体 (GFP 抗血清、 Invitrogen Corp.)液に 1時間浸した後、 TBSTで 10分間、 TBSで 5分間 4回の洗浄をおこなつた。 次にプロヅキング液で 4000倍に希釈した二次抗体 (ァ ルカリホスファタ一ゼ融合抗ゥサギ IgG抗体、 CAPPELs Auroras Ohio, USA) 液に 1時間浸した。 TBSTで 10分間、 TBSで 5分間 4回の洗浄をおこなった後、基 質溶液 (Western blue, Promega Corp.、 Madison WI、 USA)を加え 60分間発 色反応した。 その結果を図 5に示す。 図 5のレーン 1には OL-プロ卜力ドヘリン（Genbank accession no. AB0378 21)と GFPとの融合蛋白質、 レーン 2にはナトリウムチャンネル；5サブュニヅ卜 (Genbank accession no. AB032984) と GFPとの融合蛋白質が泳動されている が、 それぞれ約 140kDaおよび約 50kDaの陽性バンドが確認でき、 それぞれの予 想された分子量である 141，188Da及び 53，146Da に一致していたため、 それぞ れの蛋白質と GFPとの融合蛋白質の全長が発現していると考えられた。 産業上の利用可能性
本発明によって、 該標的 ORF、例えば、 ベクタ一に含有された cDN Aであ つて、特に、数千 bp以上を有する長鎖 OR Fを正確、迅速、且つ簡便にクロー ニングすることが可能となる。 本発明で作成される直鎖状のトラップベクターの両端には、該標的 0 R Fの 5 ' 未端配列及び 3' 末端配列があるので、 このトラップベクターと標的 OR Fとの 間での相同組換え反応により、該標的 OR Fのみをトラップベクター内に取り込 んだクローニングベクタ一を作成することが出来る。 その結果、 OR F領域の上 流及び下流に存在する非翻訳領域 (UTR) の転写による悪影響を回避すること が出来る。 更に、本発明のクロ一ニング法では、 予め標的 OR Fを含む DN A等を精製- 単離する必要がなく、 又、標的 0 R Fを大腸菌体内の複製メカニズムを利用して 増幅するので、従来の P C Rによる増幅に見られる変異が発生する可能性がない。 特に、 λファージの部位特異的組換えシステムにおける B P反応を用いて作成 した、 attLl及びに attL2の間に第一ブラィマ一結合配列及び第二ブラィマ一結合 配列を含む卜ラップべクタ一用鏡型べクタ一を用いて作成された本発明のク口一 ニングベクターは、 Ga t ewayテクノロジ一 （クローニング技術） における ェン卜リークローンとして機能することが出来る。 この G atewayテクノロ ジ一において、 ェントリークローンと各種デスティネーションベクターとの間の 相同組換え （L R反応） によって、 標的 OR Fを維持しながら、 所望の各種発現 系に対するプロモータ一、 タグ等に連結した発現クローンがハイスループヅ卜に

Claims

請 求 の 範 囲
1 - 複製起点、 第一の薬物耐性遺伝子、第一プライマー結合配列、第二プライマ —結合配列及び、第一及び第二のブライマ一結合配列に挟まれた自殺遺伝子を含 むことを特徴とする、 卜ラップベクター用鏡型ベクター。
2. 第一プライマ一結合配列がコザックコンセンサス配列の少なくとも一部を含 み、及び、第二プライマー結合配列が TGN又は TAN (Nは G， A， T又は C) 配列を含む、請求項 1に記載の卜ラップべクタ一用鏡型べクタ一。
3. コザックコンセンサス配列の 5 '上流側にシャイン■ダルガ一ノ配列を含む、 請求項 1または 2に記載のトラップベクター用鐃型べクタ一。
4. TGN又は TAN配列を含む制限酵素部位を更に含む、 請求項 1〜3のいず れか一項に記載の卜ラップべクタ一用鏡型べクタ一。
5. 第一プライマ一結合配列及び第二のプライマー結合配列が少なくとも 5個の 塩基から成る、請求項 1〜4のいずれか一項に記載のトラップベクター用鐃型。
6. 第一及び第二のプライマ一結合配列の間に更に第二の薬物耐性遺伝子が挟ま れた、上記請求項のいずれか一項に記載の卜ラップべクター用鍀型べクタ一。
7 · attLl及びに attL2の間に第一ブラィマ一結合配列及び第二ブラィマ一結合配 列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載のトラップベクタ一用鏡型べクタ一。
8. 久ファージの部位特異的組換えシステムにおける B P反応を用いて作成され たことを特徴とする、請求項 7記載のトラップベクタ一用鏡型ベクター。
9. 標的 0 R Fの 5 ' 末端配列のァンチセンス配列及びその 3 ' 側に結合した第 —のプライマ一結合配列のアンチセンス配列から成る第一プライマー、並びに、 該標的 OR Fの 3' 末端配列のセンス配列及びその 3' 側に結合した第二のブラ イマ一結合配列のセンス配列から成る第二プライマーから成る、 卜ラップべクタ —作成用 PCRプライマー。
10. 標的 OR Fの 5' 末端配列及び 3' 末端配列が夫々、 少なくとも 1 0個の 塩基を有する、 請求項 9に記載の卜ラップべクタ一作成用 P C Rプライマー。
1 1. 請求項 1〜8記載のトラップベクター用鏡型ベクター、及び、請求項 9又 は 1 0に記載の PGRプライマ一を含む、 トラップベクター作成用キット。
1 2. 請求項 1 1記載のトラップベクタ一作成用キットを用いて PCRにより直 鎖状の卜ラップベクターを作成する方法。
1 3. 請求項 1 2に記載の方法により得られた卜ラップベクターと標的 OR Fと の間での相同組換え反応により、該標的 OR Fを卜ラップべクタ一内に含むクロ —ニングベクタ一を作成する方法。
14. 相同組換え反応が R e c E/R e c T酵素によるものである、請求項 1 3 記載の方法。
1 5. 標的 OR Fが cDNAである、 請求項 1 3又は 14記載の^法。
1 6. 標的 OR Fがべクタ一に含有されている、請求項 1 3〜1 5のいずれか一 項に記載の方法。
1 7. 標的 OR Fに蛋白質の遺伝情報をコードする遺伝子が含まれていことを特 徴する、請求項 1 3-16のいずれか一項に記載の方法。
18.トラップベクタ一と標的 OR Fを含有するベクターで細菌を共形質転換し、 該細菌内で相同組換え反応を行う、請求項 1 4〜1 7のいずれか一項に記載の方 法。
1 9. 共形質転換した細菌を 1〜数時間程度培養することによって再生コロニー を得ることを含む、請求項 18記載の方法。
20. 細菌が相同組換え活性の高い大腸菌である、請求項 1 8又は 1 9記載の方 法。
21. 請求項 1 3〜20のいずれか一項に記載の方法により得られたクローニン グベクター。
22. Gat e wayテクノロジ一におけるエントリ一クローンとして機能する ことを特徴とする、請求項 21記載のクローニングベクタ一。
23. 請求項 21又は 22に記載のクローニングベクタ一を増殖させることから 成る、標的 OR Fのクロ一ニング法。
24. 請求項 23記載の方法でクローニングされた標的 0 R Fにコードされる遺 伝子。
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