CN110305885A - 利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法和试剂盒。本发明使用PCR和菌体内同源重组的机制相结合，摆脱了载体构建中对DNA酶切和连接的依赖；引入ccdB致死基因，简化了阳性克隆的筛选。本发明可用于高通量的载体构建，具有省时、省力、低成本的优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法和试剂盒。
背景技术
质粒是现代生物学研究的基本工具，已经应用到生命科学研究与医疗健康发展的各个方面，如文库建立、蛋白表达、基因治疗、基因编辑和DNA疫苗等方方面面。分子克隆技术是将扩增的目的DNA片段插入到目的质粒载体的过程，是现代生物医学研究的核心技术之一，质粒构建几乎成为所有生物医学基础研究的首要工作。随着第三代基因测序技术的推广，大量数字化基因信息需要转化为生物医学基础研究所必须的各种重组质粒。快速建立单个基因的多用途载体库，成为了很多研究者的迫切需求。
传统分子克隆技术依赖多种生物工程酶，且需要体外连接反应，并存在菌落验证假阳性的问题，其工作流程繁琐、复杂、费时、费力，已经不适应现代生物医学基础研究的需求。
借助同源重组的方法能够避免传统分子克隆技术所依赖的核酸内切酶和连接酶。其基本原理是，通过带有同源序列的2对引物分别PCR扩增质粒载体和目的基因，分别带有线性质粒载体和线性目的基因的PCR产物(其中线性质粒载体和线性目的基因带有同源序列，该同源序列是由PCR引物引入的)，再将前述2种PCR产物同时转入到感受态细胞内，使其中的线性质粒载体与线性目的基因发生同源重组，再通过抗生素筛选(质粒载体中带有该抗生素的抗性基因)，即可得到阳性重组载体。但是，该方法具有假阳性的缺点：PCR产物中仍然带有一部分未扩增的环状空载体，环状空载体与线性目的基因不会发生重组，带有该环状空载体的感受态细胞仍然可以在抗生素筛选下形成克隆，因而产生了假阳性。
发明内容
为了杜绝重组质粒构建的过程中，空载体导致的假阳性，本发明提供了以下技术方案：
本发明首先提供了一种利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，包括以下步骤：
a、PCR扩增ccdB基因表达盒子、表达载体和目的基因，得到含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物、含线性表达载体的PCR产物和含线性目的基因的PCR产物；所用到的引物为：(1)ccdB基因表达盒子的扩增引物ccdB-HF和ccdB-HR；(2)载体扩增引物HF和HR；(3)扩增目的基因的引物gene-HF和gene-HR；
b、将步骤a得到的含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物与含线性表达载体的PCR产物混合后转入耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素A和抗生素B的培养基中培养，线性ccdB基因表达盒子与线性表达载体发生同源重组，得到带ccdB基因表达盒子的环状载体；抗生素A和抗生素B不同；
c、使用载体扩增引物扩增步骤b得到的带ccdB基因表达盒子的环状载体，得到含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物；
d、将步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物与步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物混合后转入不耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素B的培养基中培养，线性目的基因与删除ccdB基因表达盒子的线性载体同源重组，得带有目的基因的环状载体；
步骤a所述的ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；
步骤a中ccdB基因表达盒子的扩增引物序列以及扩增目的基因的引物序列均包括2个片段：(I)能够扩增ccdB基因表达盒子或目的基因的片段，(II)能够与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；
所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段。
如前述的重组质粒的方法，所述片段(II)的长度为18nt。
如前述的重组质粒的方法，所述同源重组的序列是载体扩增引物与表达载体配对的全部序列。
如前述的重组质粒的方法，步骤b中所述感受态细胞为大肠杆菌DB3.1的感受态细胞。
如前述的重组质粒的方法，所述抗生素A是氯霉素。
如前述的重组质粒的方法，所述ccdB基因表达盒子DNA序列如SEQ ID NO：14所示。
如前述的重组质粒的方法，步骤a所述的表达载体的数量为2个以上，表达载体携带一段36bp以上的固定序列，该固定序列能被引物HF和HR匹配扩增出载体的全长。
如前述的重组质粒的方法，步骤d所述感受态细胞为大肠杆菌菌株DH5α的感受态细胞。
如前述的重组质粒的方法，步骤d中，“步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物”与“步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物”的摩尔比为2∶1。
如前述的重组质粒的方法，还包括步骤e：挑选单克隆菌落进行菌液PCR验证，提取质粒并测序鉴定，得到含有相同基因的不同功能用途的重组表达质粒。
基于前述构建重组质粒的方法，本发明还提供了一种利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒，包括：
1)带ccdB基因表达盒子的环状载体：由ccdB基因表达盒子和表达载体构成；
2)载体扩增引物HF和HR；
所述载体扩增引物用于扩增表达载体；
所述ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；所述表达载体不含抗生素A的抗性基因，而含有抗生素B的抗性基因。
如前述的试剂盒，它还包括：
耐受ccdB蛋白的感受态细胞。
如前述的试剂盒，所述耐受ccdB蛋白的感受态细胞是大肠杆菌DB3.1的感受态细胞。
如前述的试剂盒，所述抗生素A是氯霉素。
如前述的试剂盒，所述ccdB基因表达盒子的序列如SEQ ID NO：14所示。
本发明还提供了前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)设计目的基因扩增引物gene-HF与gene-HR，其序列均包括2个片段：(I)用于扩增目的基因的片段，(II)用于与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段；
(2)使用HF和HR扩增带ccdB基因表达盒子的环状载体，使用gene-HF和gene-HR扩增目的基因片段；
(3)将步骤(2)中的扩增产物混合，转化入对ccdB敏感的感受态细胞，于含有抗生素B的培养基中培养；
(4)挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，纯化，即得。
如前述的试剂盒的使用方法，步骤(1)所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的全部片段。
如前述的试剂盒的使用方法，步骤(1)所述同源重组的序列长度为18nt。
如前述的试剂盒的使用方法，步骤(3)中混合的扩增产物中，目的基因的扩增产物的物质的量为环状载体扩增产物的2倍。
如前述的试剂盒的使用方法，步骤(3)所述的感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
在构建重组质粒的方法上，现有技术与本发的对比如下：
现有技术技术路线为：
以环状空载体为模板，PCR得线性空载体A，再将线性化空载体A与目的基因同源重组，得到带目的基因的环状重组载体。
而本发明技术路线则分为2部分：
1)以环状空载体为模板，PCR得线性空载体A，再将线性化空载体A与ccdB基因表达盒子重组，得到带有ccdB基因表达盒子的重组载体；
2)以带有ccdB基因表达盒子的重组载体为模板，PCR得线性化空载体B(删除ccdB基因表达盒子的那一段序列)，再将线性化空载体B与目的基因同源重组，得到带目的基因的环状重组载体。
前述的线性化空载体A和B的主要成分一致，都是空载体经过PCR线性化的产物。但是所含杂质不同，线性化空载体A中的杂质是(未被扩增的)环状空载体，线性化空载体B中的杂质是(未被扩增的)带有ccdB基因表达盒子的重组载体。环状空载体会使宿主细胞具有抗生素抗性，而产生假阳性；但带有ccdB基因表达盒子的重组载体由于带有致死基因，会抑制宿主细胞生长，而避免了前述假阳性。
总之，相比现有技术，本发明额外多了一个中间步骤，得到的中间产物的主要成分不变，但由于产生的杂质改变，大大降低了假阳性率(理论上假阳性率为0)。
本发明将上述方法转化为试剂盒产品，使用起来更加方便。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明不依赖于任何限制性内切酶，无需体外连接反应过程，可实现高通量自动化操作，具有高效低耗，随机误差低等优点。
2)本发明使用ccdB致死基因反向筛选快速克隆，杜绝了空载体产生的假阳性，可节省传统的验证阳性菌落的步骤，省时省力。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法设计示意图；所述insert为插入的目的基因。
图2、利用引物Mqo-HF和Mqo-HR扩增目的基因Mqo的得到的PCR产物(Mqo)和Mqo-HF和Mqo-HR2扩增目的基因Mqo得到的PCR产物(Mqo-dTAA)的琼脂糖凝胶电泳图。
图3、利用引物HF和HR线性化扩增12种携带ccdB基因表达盒子的不同表达载体的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图4、从Mqo基因与12种携带ccdB基因表达盒子不同表达载体混合转化涂布的平板，随机各挑取3个单克隆进行菌液PCR验证产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1使用本发明方法进行利用ccdB基因反向筛选的快速克隆Mqo基因多载体
本实施例使用的载体分别有质粒载体：pFastV1～V12为商业化载体插入一段共同序列得到的。所对应商业化载体依次是：pET28a pET29a、pET30b、pET33b、pET28aMBP、pET28aMBPC、pGEX6p-1、pGEX4T-1、pETDuet1、pCold1、pET15b、pET32a。各载体携带卡那霉素抗性基因。
所述共同的序列：ctggtgccgc gcggcagcgg aggaggaatc atcatc(SEQ ID NO：1)。本实施例中，HF和HR引物便是通过匹配该“共同的序列”进行扩增的。
验证前述质粒载体序列的通用引物如表1和表2所示。
各种试剂和载体均为常规市售。其中，MCLab DNA Polymerase Mix来自北京擎科生物科技有限公司成都分公司，Utaq DNA Polymerase Mix来自成北京庄盟生物科技有限公司，Dpn I限制性内切酶来自宝生物工程(大连)有限公司，DH5a、DB3.1感受态细胞来自北京华越洋生物有限公司。
表1 12种原核表达载体插入验证通用引物表
表2通用引物序列信息
本实施例中的ccdB基因表达盒子携带的抗生素抗性基因为氯霉素抗性基因，整个表达盒子的DNA序列如表3所示。
表3 ccdB基因表达盒子DNA序列表
本实施例中使用的引物序列见表4，目的基因信息见表5。
表4实施例1使用的各种引物序列
注：划实线的序列相同，划虚线的序列相同。
表5实施例1使用的目的基因信息
具体的过程为：
1、构建携带ccdB基因表达盒子的高通量表达载体pFastB1-B12。
根据表3中ccdB基因表达盒子的DNA序列设计扩增目的基因ccdB基因表达盒子的引物(ccdB-HF和ccdb-HR)和载体扩增引物(HF和HR)，具体见表4。使用对应的引物，得到含有ccdB基因表达盒子的PCR产物、以及分别含有pFastV1-V12线性化载体的PCR产物。
将前述两种产物分别混合，转入到耐受ccdB蛋白的大肠杆菌DB3.1的感受态细胞，在含有卡那霉素和氯霉素的培养基中培养，挑取阳性单克隆，培养，提质粒，纯化得到携带致死性ccdB基因表达盒子的pFastB1-B12载体。简要过程如图1所示。所有重组质粒经过DNA测序验证，ccdB基因表达盒子序列插入成功。
2、根据表5中Mqo基因的序列，设计合成扩增目的基因引物，具体见表4。其中，Mqo-HF和Mqo-HR扩增的DNA片段用于插入含有碳端亲和标签载体pFastB1、B3、B5、B7、B9、B10、B11、B12。Mqo-HF和Mqo-HR2扩增的DNA片段用于插入含有碳端亲和标签载体pFastB2、B4、B6、B8。
3、使用Mqo-HF和Mqo-HR/HR2扩增目的基因，使用HR和HF扩增携带ccdB基因表达盒子的高通量表达载体(pFastB1-B12载体)，得到含目的基因的PCR产物和含线性载体的PCR产物。PCR反应体系如下：(1)1μL正向引物(20μM)和1μL反向引物(20μM)；(2)6ng含有目的基因(或者pFastB1-B12载体)的DNA模板；(3)24μL MCLab DNA Polymerase Mix；(4)24μL超纯水。
PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，延伸温度为72℃，持续时间按15s/bp设定；循环数为18～25。
含目的基因Mqo或含pFastB1-B12的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2和图3，获得了条带单一的DNA片段，可以用于下一步分子克隆实验。
4、将前述含目的基因Mqo的PCR产物分别与含pFastB1-B12的PCR产物按2∶1的摩尔比混合，得混合物。具体的，线性化载体加入的质量按照公式“载体碱基对数目×0.01＝载体加入的质量(单位：ng)”，而线性化基因加入的质量按照公式“基因碱基对数目×0.02＝基因加入的质量(单位：ng)”。载体和基因加入的体积分别根据计算所需的加入质量除以纯化后的PCR产物浓度，最后加入无菌超纯水补足至10μL。
5、用上一步的混合物转化DH5α感受态细胞，在含有氯霉素的培养基培养。
6、第二天，常规方法挑取单克隆菌落溶于10μL超纯水作为菌液PCR模板，每个平板挑选3个菌落，进行高通量菌液PCR验证。在预混的10μL UTaq-Mix酶体系中加入通用正反引物各0.1μL(20μM)，再分别加入0.5μL菌液模板，根据基因片段大小设定延伸时间，循环数设置为30，进行PCR扩增。PCR结束后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对于在理论分子量大小位置出现单一的DNA条带视为阳性菌落。对于PCR验证成功的阳性菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃220rpm震荡培养12～18h后提取质粒送公司测序鉴定，获得重组成功的含有Mqo基因的不同表达载体质粒，如图4所示。
对于菌液PCR结果，克隆阳性率很高，通过每个平板随机挑取3个克隆，一次性获得了含有Mqo基因的9个不同原核表达载体，分别是pFastB2、B3、B4、B5、B7、B8、B9、B10、B12，可用于后续对Mqo的蛋白表达筛选，进而研究Mqo蛋白功能和结构。后续经过测序确认，通过一次克隆通过获得9种同一基因不同表达载体的重组质粒，实现了高通量构建含有同一基因的不同表达载体。
实施例2本发明的试剂盒
本发明的试剂盒由如下组分构成：
(1)引物HF和HR，同实施例1的HF和HR；
(2)带ccdB基因表达盒子的环状载体，同实施例1中的pFastB1-B12载体。
综上，本发明可以摆脱对限制性内切酶的依赖，且无需体外连接反应，假阳性率低，高效快速地将基因构建到多个载体中。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒
<130> GYKH1227-2019P016807CC
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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gattatgcgg ccgtgtacaa 20
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ggcagggatc ttagattctg 20
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<212> DNA
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<400> 14
ggcgaaaatg agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa 60
gatcactacc gggcgtattt tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 120
tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac 180
attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 240
ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 300
acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg 360
agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa 420
cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt 480
cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga 540
atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg 600
ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg 660
acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg 720
tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaaa 780
cgccgcgtgg atccggctta ctaaaagcca gataacagta tgcgtatttg cgcgctgatt 840
tttgcggtat aagaatatat actgatatgt atacccgaag tatgtcaaaa agaggtatgc 900
tatgaagcag cgtattacag tgacagttga cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata 960
tatgatgtca atatctccgg tctggtaagc acaaccatgc agaatgaagc ccgtcgtctg 1020
cgtgccgaac gctggaaagc ggaaaatcag gaagggatgg ctgaggtcgc ccggtttatt 1080
gaaatgaacg gctcttttgc tgacgagaac aggggctggt gaaatgcagt ttaaggttta 1140
cacctataaa agagagagcc gttatcgtct gtttgtggat gtacagagtg atattattga 1200
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ctcccgtgaa ctttacccgg tggtgcatat cggggatgaa agctggcgca tgatgaccac 1320
cgatatggcc agtgtgccgg tctccgttat cggggaagaa gtggctgatc tcagccaccg 1380
cgaaaatgac atcaaaaacg ccattaacct gatgttctgg ggaatataa 1429
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<210> 18
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<400> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctggtgccgc gcggcagcat gtcagaccta gccaga 36
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgatgatt cctcctcctc atgcggcacc taacttca 38
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gatgatgatt cctcctcctg cggcacctaa cttcagcg 38
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<211> 1482
<212> DNA
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atgtcagacc tagccagaac cgacgtcgtg ctgatcggtg cgggcatcat gagcgccacg 60
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tggtcatgga gcaccaaggc gctgaagtta ggtgccgcat ga 1482
Claims (10)
1.一种利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒，其特征在于，包括：
1)带ccdB基因表达盒子的环状载体：由ccdB基因表达盒子和表达载体构成；
2)载体扩增引物HF和HR；
所述载体扩增引物用于扩增表达载体；
所述ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；所述表达载体不含抗生素A的抗性基因，而含有抗生素B的抗性基因。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它还包括：
耐受ccdB蛋白的感受态细胞。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述耐受ccdB蛋白的感受态细胞是大肠杆菌DB3.1的感受态细胞。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗生素A是氯霉素。
5.如权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述ccdB基因表达盒子的序列如SEQID NO：14所示。
6.权利要求1～5任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计目的基因扩增引物gene-HF与gene-HR，其序列均包括2个片段：(I)用于扩增目的基因的片段，(II)用于与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段；
(2)使用HF和HR扩增带ccdB基因表达盒子的环状载体，使用gene-HF和gene-HR扩增目的基因片段；
(3)将步骤(2)中的扩增产物混合，转化入对ccdB敏感的感受态细胞，于含有抗生素B的培养基中培养；
(4)挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，纯化，即得。
7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的全部片段。
8.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述同源重组的序列长度为18nt。
9.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)中混合的扩增产物中，目的基因的扩增产物的物质的量为环状载体扩增产物的2倍。
10.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述的感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
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Cited By (1)
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| CN118620932A (zh) * | 2024-08-12 | 2024-09-10 | 南昌大学第一附属医院 | 基于SacB基因的载体质粒及其构建方法和应用 |
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-
2019
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