CN117043344A

CN117043344A - 载体、使用了该载体的直链状共价闭合dna的制备方法、细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞

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Publication number: CN117043344A
Application number: CN202280022277.7A
Authority: CN
Inventors: 西辉之; 前田博文; 北野光昭
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2023-11-10

Abstract

本发明提供具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体、使用了该载体的直链状共价闭合DNA的制备方法、细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞，所述细小病毒载体的制备方法包括：将具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列的载体导入第1宿主的基因导入工序、以及将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的转染工序，所述细小病毒载体产生细胞是通过直链状共价闭合DNA得到的表达编码蛋白质的核酸序列的细小病毒载体，通过定量PCR法定量时的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数在上述细小病毒载体产生细胞的培养上清中为10％以下，或者在上述细小病毒载体产生细胞的细胞溶解液中为1％以下。

Description

载体、使用了该载体的直链状共价闭合DNA的制备方法、细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞

技术领域

本发明涉及载体、使用了该载体的直链状共价闭合DNA的制备方法、细小病毒(parvovirus)载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞。

背景技术

在对于组织、细胞的基因递送技术中，广泛使用了DNA载体作为非病毒性载体。

作为上述DNA载体，通常使用了制备方法简易的双链环状质粒DNA载体，但仍然存在以下课题：编码抗生素耐性蛋白的基因、复制因子序列这样的宿主来源的核酸序列的残留所导致的免疫原性的隐患、细胞内的目标蛋白的表达衰减(非专利文献1)。

另一方面，末端未封闭的直链状的双链DNA载体可以使用PCR反应等而简易地制备，但由于缺乏核酸酶耐性，因此在细胞内外会被迅速分解。

为了解决这样的课题，报告了排除宿主来源的核酸序列而减小了DNA载体的尺寸的微环(minicircle)等双链环状DNA载体及其制备方法(非专利文献2、3)、以及作为用发卡结构将双链DNA的末端闭合的载体的直链状共价闭合DNA的制备方法(专利文献1、2)。

对于这些载体而言，从以下方面考虑是非常有益的：与一般的双链环状质粒DNA载体相比，由于尺寸小，因此向细胞导入的效率增高；由于不包含宿主来源的核酸序列等不必要的碱基序列，因此可抑制免疫原性等的风险；可期待高品质的基因递送；可期待细胞内的目标蛋白的持续表达。

因此，如果能够开发这些DNA载体的革新性制备技术，则能够期待在广泛的行业中得到发展。

然而，在制备微环的情况下，发生DNA载体向宿主基因组中的随机导入、DNA载体的低生产性成为课题(非专利文献2、3)。

另外，在通过使用了重组大肠杆菌的方法制备直链状共价闭合DNA的情况(专利文献1)下，存在酶基因向大肠杆菌基因组的导入、上述酶所识别的特殊序列的必要性、可能发生向宿主基因组中随机导入DNA载体、DNA载体的低生产性这样的新问题和复杂性。此外，与微环相比，直链状共价闭合DNA的生产性显示出非常低。

另一方面，在通过于体外(in vitro)环境下利用DNA聚合酶将作为模板的DNA扩增并利用酶进行处理的方法来制备直链状共价闭合DNA的情况(专利文献2)下，存在生产成本的上升、处理工序的复杂、基于DNA聚合酶的模板DNA的扩增过程中可能出现突变这样的新的问题。

因此，尚不知晓能够以高效率简便地生产的直链状共价闭合DNA的制备方法。

另外，属于细小病毒科的腺相关病毒(AAV)载体是在基因治疗的领域中开发最多的载体之一。

重组腺相关病毒(rAAV)载体一般通过将3种双链环状质粒DNA载体(包含目标基因的载体、包含包装基因的载体、包含腺病毒辅助(helper)基因的载体)同时转染至HEK293细胞、昆虫细胞中而制备。

在制备使用了上述双链环状质粒DNA载体的rAAV载体时，已知编码抗生素耐性蛋白的基因、复制因子序列、包装基因、腺病毒辅助基因会被错误地包装(非专利文献4)，存在可自我复制的AAV(rcAAV)载体可能以杂质的形式混入、由宿主来源的核酸序列的残留导致的免疫原性的隐患这样的课题。

关于DNA载体，如上所述，已知被称为微环的双链环状DNA载体、直链状共价闭合DNA。这些载体可以期待与一般的双链环状质粒DNA载体相比向细胞的导入效率更高、免疫原性等的风险受到抑制、高品质的基因递送等。

然而，在制备微环的情况(非专利文献5)下，DNA载体的生产性低，此外，制备微环时所需要的同源重组序列及纯化用序列被末端倒位序列(ITR)包夹而残留，因此发生了rAAV载体的错误包装。

作为制备rAAV载体的方法，也报告了将需要的核酸序列导入细胞的基因组内的方法(专利文献3)，但根据上述的原因，ITR附近的序列被错误包装的可能性、以及在全部一起被导入单一基因座的情况下同时制备rcAAV载体并混入的风险提高。

这样，尚不知晓使用了实质上不包含不需要的序列的直链状共价闭合DNA的、能够以高效率简便地生产的高品质的细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利公报第9290778号

专利文献2：美国专利公报第9109250号

专利文献3：日本特表2020-517238

非专利文献

非专利文献1：Mol Ther.2004 10:269-78

非专利文献2：Gene Ther.1999 6:209-18

非专利文献3：Mol Ther.2012 21:131-8

非专利文献4：JOURNAL OF VIROLOGY.2003 Jan:776-781

非专利文献5：Mol Ther-Nucleic Acids.2016 5:e355

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于解决以往的上述各问题，实现以下的目的。即，本发明的目的在于提供能够以高效率简便地生产的直链状共价闭合DNA的制备方法、以及使用了实质上不包含不需要的序列的直链状共价闭合DNA的能够以高效率简便地生产的高品质的细小病毒载体的制备方法及细小病毒载体产生细胞。

解决课题的方法

本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，通过使用具有编码前端粒酶(protelomerase)的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体，可以提供能够以高效率简便地生产的直链状共价闭合DNA的制备方法，通过包括将载体导入第1宿主的基因导入工序、以及将由上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的转染工序的细小病毒载体的制备方法，可以提供使用了实质上不包含不需要的序列的直链状共价闭合DN A的能够以高效率简便地生产的高品质的细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

本发明是基于本发明人等的上述见解而完成的，作为上述解决课题的方法，如以下所述。即，

＜1＞一种载体，其具有：编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

＜2＞一种直链状共价闭合DNA的制备方法，该方法具有将载体导入宿主的基因导入工序，所述载体具有：编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

＜3＞一种细小病毒载体的制备方法，该方法包括：将载体导入第1宿主的基因导入工序、以及将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DN A转染至第2宿主的转染工序，所述载体具有：编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

＜4＞一种细小病毒载体产生细胞，其中，上述细小病毒载体是通过直链状共价闭合DNA得到的表达编码蛋白质的核酸序列的细小病毒载体，通过定量PCR法定量时，相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数，上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数在上述细小病毒载体产生细胞的培养上清中为10％以下，或者在上述细小病毒载体产生细胞的细胞溶解液中为1％以下。

发明的效果

根据本发明，能够解决以往的上述各问题，实现上述目的，可以提供能够以高效率简便地生产的直链状共价闭合DNA的制备方法、用于该方法的载体、以及使用了实质上不包含不需要的序列的直链状共价闭合DNA的能够以高效率简便地生产的高品质的细小病毒载体的制备方法及细小病毒载体产生细胞。

附图说明

图1是示出实施例1-1及实施例2-1中的pAAV-Venus_telRL_ara_TelN的载体图谱的图。

图2是示出实施例1-3中得到的DNA的基于电泳法的评价结果的图。

图3是示出实施例1-4中得到的DNA的基于电泳法的评价结果的图。

图4是示出实施例1-5中的pAAV-Venus_telRL_IPTG_TelN的载体图谱的图。

图5是示出实施例2-2中的pRC2-mi342_telRL_ara_TelN的载体图谱图。

图6是示出实施例2-3中的pHelper_telRL_ara_TelN的载体图谱的图。

图7是示出实施例2-4中的pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper的载体图谱的图。

图8是示出实施例2-6中的DNA的基于电泳法的评价结果的图。

图9是示出实施例2-7中的DNA的基于电泳法的评价结果的图。

具体实施方式

(载体)

上述载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及编码蛋白质的核酸序列，可以进一步具有其它序列。

上述载体可以作为直链状共价闭合DNA制备用载体而使用。

在本发明中，“直链状共价闭合DNA(linear covalently closed DNA)”是指具有末端由发卡结构闭合的结构的直链状的双链DNA，简称为LCC DNA。

在本发明中，“载体”是指人工构建的核酸分子。

在本发明中，“核酸”也可以称为“多核苷酸”，是指DNA或RNA，优选为DNA。DNA可以为单链DNA，也可以是双链DNA。

作为上述载体的结构，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：环状质粒载体、直链状DNA载体、人工染色体等。其中，优选为环状质粒载体，更优选为双链环状质粒DNA载体。

在本发明中，“双链环状质粒DNA”是指在细胞内复制的环状的双链DNA质粒。

＜编码前端粒酶的核酸序列＞

在本发明中，“前端粒酶”是指，为了制备直链状共价闭合DNA而能够将特定的回文序列(前端粒酶所识别的核酸序列)切断并使其再结合的多肽。

作为上述前端粒酶，只要是具有上述功能的多肽即可，没有特别限定，可以列举例如：放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)来源的前端粒酶(TelA前端粒酶、ACCESSIONNo.AAK88254)、Halomonas virus HAP1来源的前端粒酶(ACCESSION No.ABY90402)、Vibriovirus VP882来源的前端粒酶(ACC ESSION No.ABM73418)、Klebsiella phage phiKO2来源的前端粒酶(TelK前端粒酶、ACCESSION No.AAR83042)、普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)来源的前端粒酶(ACCESSION No.QKJ91773)、Feldmannia species virus来源的前端粒酶(ACCESSION No.ACH46812)、Vibrio phage vB_VpaM_MAR来源的前端粒酶(ACCESSIONNo.AFV81380)、Yersinia phage PY54来源的前端粒酶(Tel前端粒酶、ACCESSIONNo.CAD91792)、Escherichia virus N15来源的前端粒酶(TelN前端粒酶、ACCESSIONNo.AAB81106)、或者它们的突变体等。

另外，原本为前端粒酶，但将通过人工修饰或突变而丧失了其功能的前端粒酶也包含于本发明的前端粒酶。

其中，优选为TelA前端粒酶、TelK前端粒酶、Tel前端粒酶、TelN前端粒酶、或其突变体，更优选为TelN前端粒酶或其突变体。

作为上述突变体，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，与原氨基酸序列的同一性优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为99％以上。

在本发明中，“多肽”是指2个以上氨基酸形成肽键而成的物质，除了蛋白质以外，还包含肽、被称为寡肽的链长短的物质。

在本发明中，“编码前端粒酶的核酸序列”是指，针对由构成前端粒酶的氨基酸序列形成的多肽而基于密码子表设计的核酸序列，该核酸序列通过转录及翻译而生成多肽。

作为上述编码前端粒酶的核酸序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为编码TelA前端粒酶、TelK前端粒酶、Tel前端粒酶、TelN前端粒酶或其突变体的核酸序列，更优选为编码TelN前端粒酶或其突变体的核酸序列，进一步优选为序列号1所示的核酸序列或其突变体。

作为上述突变体，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，与原核酸序列的同一性优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为99％以上。

＜前端粒酶所识别的一对核酸序列＞

在本发明中，“前端粒酶所识别的一对核酸序列”是指，为了制备直链状共价闭合DNA，前端粒酶所识别、将该部位切断、且末端再结合的核酸序列对。

作为上述前端粒酶所识别的核酸序列，可以举出例如特定的回文序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为TelA前端粒酶所识别的核酸序列、TelK前端粒酶所识别的核酸序列、Tel前端粒酶所识别的核酸序列、或TelN前端粒酶所识别的核酸序列，更优选为TelN前端粒酶所识别的核酸序列，进一步优选为序列号2所示的核酸序列(telRL序列)、或其突变体。

＜编码蛋白质的核酸序列＞

上述编码蛋白质的核酸序列是位于前端粒酶所识别的一对核酸序列之间的核酸序列。

即，在上述编码蛋白质的核酸序列之前存在前端粒酶所识别的核酸序列，在上述编码蛋白质的核酸序列之后也存在前端粒酶所识别的核酸序列。

在本发明中，“编码蛋白质的核酸序列(基因)”不仅包含宿主细胞、病毒所具有的核酸中的DNA，也包含其mRNA及cDNA，代表性地可以为DN A，特别是可以为基因组DNA。

上述“编码蛋白质的核酸序列(基因)”不论功能区域的区别如何，例如可以仅包含外显子，也可以包含外显子及内含子。在上述“编码蛋白质的核酸序列(基因)”为RNA的实施方式中，核酸序列中的任意1个以上或全部的胸腺嘧啶(T)可以替换为尿嘧啶(U)。

在本发明中，“编码蛋白质的核酸序列(基因)”是指编码细胞所生产的多肽的基因，多肽可以是细胞的内源性多肽，也可以是异源多肽。

作为上述编码蛋白质的核酸序列(基因)，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以是待导入至载体的目标基因。

作为上述待导入至载体的目标基因所编码的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：构成病毒的多肽、动物、植物、菌类、藻类、细菌、病毒等所产生的多肽、以及它们的部分肽片段等。它们可以作为细胞/基因治疗药、疫苗、疾病治疗药等而使用。

作为构成上述病毒的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：构成细小病毒的多肽、构成腺相关病毒(AAV)的多肽、构成腺病毒的多肽、构成冠状病毒的多肽、构成逆转录病毒的多肽、构成慢病毒的多肽、构成疱疹病毒的多肽、构成脊髓灰质炎病毒的多肽、构成乳头瘤病毒的多肽、构成痘苗病毒的多肽、构成痘病毒的多肽等。

作为上述构成腺相关病毒(AAV)的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：腺相关病毒来源的VP1、腺相关病毒来源的VP2、腺相关病毒来源的VP3、腺相关病毒来源的Rep(Rep protein)、腺相关病毒来源的Cap(Capsid protein)、腺相关病毒来源的AAP、腺相关病毒来源的MAAP等。

作为上述构成腺病毒的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：腺病毒来源的E2A、腺病毒来源的E4、腺病毒来源的VA、腺病毒来源的E1A、腺病毒来源的E1B等。

作为上述构成冠状病毒的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：冠状病毒的刺突多肽、冠状病毒的核苷酸衣壳多肽、冠状病毒的膜多肽、冠状病毒的包膜多肽等。

作为上述动物、植物、菌类、藻类、细菌、病毒等产生的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：植酸酶、淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、肽酶、核酸酶、氧化酶、乳糖酶、木聚糖酶、胰蛋白酶、果胶酶、异构酶等酶、蛋白A、蛋白G、蛋白L等抗体结合性蛋白、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、美洲驼抗体、羊驼抗体、单链抗体、重链抗体、多价抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fc、Fc融合蛋白、双特异性抗体、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)₂、二硫键Fv(sdFv)、Diabody、抗体样分子靶肽(微抗体)等抗体或抗体片段、其它功能性蛋白质等抗体、抗体片段以外的化合物与抗体片段的复合体(抗体样分子)、人血清白蛋白等血清白蛋白、人上皮生长因子等上皮生长因子、胰岛素、生长激素、促红细胞生成素、干扰素、凝血因子VIII、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板生成素、IL-1、IL-6、组织纤溶酶原激活因子(TPA)、尿激酶、瘦素、干细胞生长因子(SCF)、蚕丝蛋白、荧光蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、水蛭素等。

如上所述，本发明的载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。这里，各核酸序列的种类没有特别限定，可以具有1、2、3种或更多种类的序列。

＜其它序列＞

作为上述其它序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：LacI基因、AraC基因等编码激活蛋白或阻遏蛋白的核酸序列、用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列、包含1个以上限制酶识别部位的克隆位点、用于利用Clontech公司的In-Fusion克隆系统、New England Biolabs公司的Gibson Assembly系统等的重叠区域、编码抗生素耐性蛋白的核酸序列等选择标志基因的核酸序列等。上述克隆位点、重叠区域、选择标志基因的核酸序列等序列可以是能够添加这些序列的形态(例如，包含能够添加这些序列的包含1个以上限制酶识别部位的克隆位点的形态)的核酸分子。

作为上述LacI基因序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为序列号23所示的核酸序列或其突变体。

作为上述AraC基因序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为序列号3所示的核酸序列或其突变体。

在本发明中，“用于控制表达的核酸序列”也称为“启动子”，是指位于编码上述多肽的核酸序列的上游的核酸序列区域，除RNA聚合酶以外，还通过转录的促进、抑制相关的各种转录调节因子与该区域结合或作用，读取编码作为模板的上述多肽的核酸序列，合成(转录)互补的RNA。

作为用于控制上述表达的核酸序列，只要是在选择的条件下能够发生表达的序列即可，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：热诱导启动子(lambda PR、lambda PL等)、阿拉伯糖诱导启动子(araBAD启动子等)、IPTG诱导启动子(LAC启动子、LACUV5启动子、TAC启动子、Trc启动子、LPP启动子等)、T7启动子、低温诱导启动子(cspA启动子等)、Trp启动子、鼠李糖诱导启动子(rhaT启动子等)、proU启动子、prpB启动子、phoA启动子、recA启动子、tetA启动子、cadA启动子、或它们的突变体等。

作为上述突变体的获得方法，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：使激活物或阻遏物所结合的核酸序列发生置换、插入、添加或缺失的方法、使转录因子所结合的核酸序列发生置换、插入、添加或缺失的方法、使RNA聚合酶所结合的核酸序列发生置换、插入、添加或缺失的方法、使核糖体所结合的核酸序列发生置换、插入、添加或缺失的方法、为了提高或降低信使RNA的稳定化而使从转录起始点至起始密码子的核酸序列发生置换、插入、添加或缺失的方法、将上述核酸序列文库化而进行筛选的方法、使多个启动子连接、融合的方法等。

其中，优选为IPTG诱导启动子、阿拉伯糖诱导启动子，更优选为阿拉伯糖诱导启动子，进一步优选为序列号4所示的核酸序列或其突变体。

＜载体的制备方法＞

作为上述载体的制备方法，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：全合成法、PCR法、使用Clontech公司的In-Fusion克隆系统、New England Biolabs公司的Gibson Assembly系统等的方法。

(直链状共价闭合DNA的制备方法)

上述直链状共价闭合DNA的制备方法具有基因导入工序，可以进一步具有其它工序A。

＜基因导入工序＞

上述基因导入工序为将载体导入宿主的工序，所示载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列的载体如上所述。

作为上述宿主，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举：古细菌；大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等真细菌；动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、霉菌、酵母细胞等真核生物、病毒等，其中，优选为真细菌，更优选为大肠杆菌。

作为上述大肠杆菌，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为埃希氏菌(Eschericia)属，更优选为大肠杆菌(Eschericia coli)，更优选为Esche ricia coli K-12株、Eschericia coli B株等。另外，可以使用市售的大肠杆菌株、生物资源中心的大肠杆菌株。

作为上述市售的大肠杆菌株、生物资源中心的大肠杆菌株，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：JM109株、DH5株、DH5α株、DH10B株、NEB10β株、HST08株、HST16CR株、HB101株、W3110株、MG1655株、BL21株、BL21 DE3株等。这些菌株可以从NewEnglandBiolabs公司、Takara Bio公司、Thermo Fisher Scientific公司、东洋纺株式会社、ATCC(American Type Culture Collection)、NBRP(National Bio Resou rceProject)等获得。

另外，在本发明中，也可以使用来自这些大肠杆菌株的诱导株，可以列举例如：在甲硫氨酸营养缺陷型的情况下为JW3973株(可以由NBRP获得)、在亮氨酸营养缺陷型的情况下为JW2806株(可以由NBRP获得)、在半胱氨酸营养缺陷型的情况下为JW3582株(可以由NBRP获得)、在硫胺素及组氨酸营养缺陷型的情况下为ME5305株(可以由NBRP获得)等。

在本发明中，“基因导入工序”是指通过给定的载体对宿主进行转化的工序。通过利用本发明的载体对宿主进行转化，能够制备直链状共价闭合DNA。

在本发明中，“转化”是指将载体导入宿主。

上述将载体导入宿主的方法、即转化法可以适当使用公知的方法，例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以举出热休克法、电穿孔法等，并不特别限定于此。

在后述的实施例中，通过制备具有编码前端粒酶的核酸序列(序列号1)、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列(序列号2)、以及位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列(序列号5)的载体，并且将该载体转化至大肠杆菌NEB10β株，从而制备了直链状共价闭合DNA。

＜其它工序A＞

作为上述其它工序A，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：在基因导入工序后诱导上述前端粒酶的表达的表达诱导工序、直链状共价闭合DNA的纯化工序等。

作为上述在基因导入工序后诱导上述前端粒酶的表达的表达诱导工序，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以举出例如，在导入了基因的宿主的培养液中添加表达诱导剂的方法等。

作为用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列，在使用了阿拉伯糖诱导启动子的情况下，可以使用阿拉伯糖作为上述表达诱导剂。

作为用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列，在使用了IPTG诱导启动子的情况下，可以使用IPTG作为上述表达诱导剂。

作为上述直链状共价闭合DNA的纯化工序，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：使用市售的试剂盒进行纯化的方法、使用阳离子色谱法及阴离子色谱法、尺寸排除色谱法、过滤器、超滤膜来纯化细胞溶解液的方法等。

(细小病毒载体的制备方法)

上述细小病毒载体的制备方法包括基因导入工序及转染工序，可以进一步包括其它工序B。

＜细小病毒＞

在本发明中，“细小病毒”是指细小病毒科的病毒，是在衣壳内具有直链状单链DNA、且形成正二十面体的结构的病毒。

作为上述细小病毒的种类，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：犬细小病毒、猫细小病毒、牛细小病毒、细小病毒B19、博卡病毒、浓核病毒、腺相关病毒(AAV)等，其中，优选为腺相关病毒(AAV)。

作为上述腺相关病毒(AAV)，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、AAV血清型14(AAV14)、AAV血清型rh10(AAVr h10)、或它们的突变体等，其中，优选为AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、或其突变体，更优选为AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型9(AAV9)、或其突变体。

作为上述腺相关病毒的突变体，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，与原氨基酸序列的同一性优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为99％以上。

构成上述细小病毒的氨基酸可以是天然的，也可以是非天然的，可以经过修饰。另外，细小病毒的氨基酸序列可以施加人工修饰，也可以从头(de-novo)设计。

＜基因导入工序＞

上述基因导入工序是将载体导入第1宿主的工序，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

在本发明中，“基因导入工序”是指利用给定的载体对第1宿主进行转化的工序。通过利用本发明的载体对第1宿主进行转化，可以制备直链状共价闭合DNA。

在本发明中，“转化”是指将载体导入第1宿主。

将上述载体导入第1宿主的方法、即转化法可以适当使用公知的方法，例如，在使用大肠杆菌作为上述第1宿主的情况下，可以列举热休克法、电穿孔法等，但并不特别限定于此。

＜＜载体＞＞

如上所述，上述载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及编码蛋白质的核酸序列，可以进一步具有其它序列。

上述载体可以作为直链状共价闭合DNA制备用载体而使用。

在本发明中，“直链状共价闭合DNA(linear covalently closed DNA)”是指具有末端通过发卡结构闭合的结构的直链状的双链DNA，可简称为LC C DNA。

在本发明中，“载体”是指人工构建的核酸分子。

在本发明中，“核酸”也可以称为“多核苷酸”，是指DNA或RNA，优选为DNA。DNA可以为单链DNA，也可以为双链DNA。

＜＜＜编码前端粒酶的核酸序列＞＞＞

如上所述，在本发明中，“前端粒酶”是指为了制备直链状共价闭合DNA而能够将特定的回文序列(前端粒酶所识别的核酸序列)切断并使其再结合的多肽。

作为上述前端粒酶，只要是具有上述功能的多肽即可，没有特别限定，可以列举例如：放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)来源的前端粒酶(TelA前端粒酶、ACCESSIONNo.AAK88254)、Halomonas virus HAP1来源的前端粒酶(ACCESSION No.ABY90402)、Vibriovirus VP882来源的前端粒酶(ACC ESSION No.ABM73418)、Klebsiella phage phiKO2来源的前端粒酶(TelK前端粒酶、ACCESSION No.AAR83042)、Rhizobium pusense来源的前端粒酶(ACCESSION No.QKJ91773)、Feldmannia species virus来源的前端粒酶(ACCESSIONNo.ACH46812)、Vibrio phage vB_VpaM_MAR来源的前端粒酶(ACCESSION No.AFV81380)、Yersinia phage PY54来源的前端粒酶(Tel前端粒酶、ACCESSION No.CAD91792)、Escherichia virus N15来源的前端粒酶(TelN前端粒酶、ACCESSION No.AAB81106)、或它们的突变体等。

作为上述编码前端粒酶的核酸序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为编码TelA前端粒酶、TelK前端粒酶、Tel前端粒酶、TelN前端粒酶、或其突变体的核酸序列，更优选为编码TelN前端粒酶或其突变体的核酸序列，进一步优选为序列号1所示的核酸序列或其突变体。

＜＜＜前端粒酶所识别的一对核酸序列＞＞＞

如上所述，在本发明中，“前端粒酶所识别的一对核酸序列”是指，为了制备直链状共价闭合DNA，前端粒酶所识别、将该部位切断、且末端再结合的核酸序列对。

＜＜＜编码蛋白质的核酸序列＞＞＞

上述“编码蛋白质的核酸序列(基因)”是指编码细胞所生产的多肽的基因，多肽可以是细胞的内源性多肽，也可以是异源多肽。

作为上述编码蛋白质的核酸序列(基因)，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为导入至细小病毒载体的目标基因(编码目标蛋白的核酸序列)、Rep(Repprotein)基因、Cap(Capsid protein)基因等包装基因、或腺病毒辅助基因等辅助基因。也可以将这些基因组合使用。

作为上述导入至细小病毒载体的目标基因所编码的多肽(目标蛋白)，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：动物、植物、菌类、藻类、细菌、病毒等所产生的多肽、以及它们的部分肽片段等。它们可以作为细胞/基因治疗药、疫苗、疾病治疗药等而使用。

作为上述动物、植物、菌类、藻类、细菌、病毒等所产生的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：植酸酶、淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、肽酶、核酸酶、氧化酶、乳糖酶、木聚糖酶、胰蛋白酶、果胶酶、异构酶等酶、蛋白A、蛋白G、蛋白L等抗体结合性蛋白、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、美洲驼抗体、羊驼抗体、单链抗体、重链抗体、多价抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、Fc融合蛋白质、双特异性抗体、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)₂、二硫键Fv(sdFv)、Diabody、抗体样分子靶肽(微抗体)等抗体或抗体片段、其它功能性蛋白质等抗体、抗体片段以外的化合物与抗体片段的复合体(抗体样分子)、人血清白蛋白等血清白蛋白、人上皮生长因子等上皮生长因子、胰岛素、生长激素、促红细胞生成素、干扰素、凝血因子VIII、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板生成素、IL-1、IL-6、组织纤溶酶原激活因子(TPA)、尿激酶、瘦素、干细胞生长因子(SCF)、蚕丝蛋白、荧光蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、水蛭素等。

作为上述包装基因所编码的多肽(包装蛋白)，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：Rep(Rep protein)、Cap(Capsid protein)等，其中，优选为细小病毒来源的Rep、细小病毒来源的Cap等构成细小病毒的多肽。

作为上述构成细小病毒的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：构成犬细小病毒的多肽、构成猫细小病毒的多肽、构成牛细小病毒的多肽、构成细小病毒B19的多肽、构成博卡病毒的多肽、构成浓核病毒的多肽、构成腺相关病毒(AAV)的多肽等，优选为构成腺相关病毒(AAV)的多肽。

作为上述构成腺相关病毒(AAV)的多肽，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：腺相关病毒来源的VP1、腺相关病毒来源的VP2、腺相关病毒来源的VP3、腺相关病毒来源的Rep、腺相关病毒来源的Ca p、腺相关病毒来源的AAP、腺相关病毒来源的MAAP等。

其中，优选为腺相关病毒来源的Rep、或腺相关病毒来源的Cap，更优选为腺相关病毒来源的Rep、以及腺相关病毒来源的Cap。

作为上述辅助基因所编码的多肽(辅助蛋白(helper protein))，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以举出例如腺病毒辅助蛋白等。作为上述腺病毒辅助蛋白，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：腺病毒来源的E2A、腺病毒来源的E4、腺病毒来源的VA、腺病毒来源的E1A、腺病毒来源的E1B等。

其中，优选为腺病毒来源的E2A、腺病毒来源的E4、或腺病毒来源的VA，更优选为腺病毒来源的E2A、腺病毒来源的E4、以及腺病毒来源的VA。

＜＜＜其它序列＞＞＞

作为上述其它序列，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：LacI基因、AraC基因等编码激活蛋白或阻遏蛋白的核酸序列、用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列、包含1个以上限制酶识别部位的克隆位点、用于利用Clontech公司的In-Fusion克隆系统、New England Biolabs公司的Gibson Assembly系统等的重叠区域、编码AmpR等抗生素耐性蛋白的核酸序列等选择标志基因的核酸序列、宿主的复制因子序列等。上述克隆位点、重叠区域、选择标志基因的核酸序列等序列可以是能够添加这些序列的形态(例如，包含含有能够添加这些序列的1个以上限制酶识别部位的克隆位点的形态)的核酸分子。

＜＜＜载体的制备方法＞＞＞

＜＜第1宿主＞＞

作为上述第1宿主，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举：古细菌；大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等真细菌；动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、霉菌、酵母细胞等真核生物、病毒等，其中，优选为真细菌，更优选为大肠杆菌。

作为上述大肠杆菌，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，优选为埃希氏菌属，更优选为大肠杆菌(Eschericia coli)，更优选为Eschericia coli K-12株、Eschericia coli B株等。另外，可以使用市售的大肠杆菌株、生物资源中心的大肠杆菌株。

另外，本发明中，也可以使用来自这些大肠杆菌株的诱导株，可以列举例如：在甲硫氨酸营养缺陷型的情况下为JW3973株(可以由NBRP获得)、在亮氨酸营养缺陷型的情况下为JW2806株(可以由NBRP获得)、在半胱氨酸营养缺陷型的情况下为JW3582株(可以由NBRP获得)、在硫胺素及组氨酸营养缺陷型的情况下为ME5305株(可以由NBRP获得)等。

在后述的实施例中，通过制备载体并将该载体转化至大肠杆菌NEB10β株，从而制备了直链状共价闭合DNA，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列(序列号1)、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列(序列号2)、位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列(序列号5)。

另外，在后述的实施例中，通过制备载体并将该载体转化至大肠杆菌NEB10β株，从而制备了直链状共价闭合DNA，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列(序列号1)、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列(序列号2)、以及位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白的核酸序列(Rep：序列号12、Ca p：序列号13)。

另外，在后述的实施例中，通过制备载体并将该载体转化至大肠杆菌NEB10β株，从而制备了直链状共价闭合DNA，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列(序列号1)、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列(序列号2)、以及位于上述一对核酸序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列(E2A：序列号14、E4：序列号15、VA：序列号16)。

另外，在后述的实施例中，通过制备载体并将该载体转化至大肠杆菌NEB10β株，从而制备了直链状共价闭合DNA，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列(序列号1)、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列(序列号2)、以及位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白质及辅助蛋白的核酸序列。

＜转染工序＞

上述转染工序是将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的工序。

＜＜第2宿主＞＞

作为上述第2宿主，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：HEK293细胞、HEK293T细胞、Hela细胞、CHO细胞、iPS细胞、间充质干细胞等动物细胞、竹培养细胞、烟草培养细胞等植物细胞、Sf9细胞等昆虫细胞、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞、毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞等酵母细胞、大肠杆菌等真细菌等，其中，优选为动物细胞或昆虫细胞，更优选为HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、Sf9细胞。

另外，可以使用市售的动物细胞、生物资源中心的动物细胞。

作为上述市售的动物细胞、生物资源中心的动物细胞，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：FreeStyle 293F、FreeStyle CHO-S、Expi293F等。

这些细胞可以从Thermo Fisher Scientific公司、东洋纺株式会社、Takar a Bio公司、理化学研究所、ATCC(American Type Culture Collection)等获得。

＜＜转染＞＞

作为将上述直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的方法，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：基于阳离子性脂质的导入法、磷酸钙共沉淀法、基于DEAE葡聚糖的导入法、基于阳离子性聚合物的导入法、基于病毒的导入法、电穿孔法、基于纳米粒子的导入法、直接显微注射法、基于激光的导入法等，其中，优选为基于聚乙烯亚胺(PEI)这样的阳离子性聚合物的导入法。

作为上述细小病毒载体的制备方法的具体例，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：细小病毒载体的制备方法，该方法包括，在上述基因导入工序中，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，以及，在上述转染工序中，将通过上述基因导入工序得到的包含上述编码目标蛋白的核酸序列(目标基因)的直链状共价闭合DNA、包含上述编码包装蛋白的核酸序列(包装基因)的直链状共价闭合DNA、以及包含上述编码辅助蛋白的核酸序列(辅助基因)的直链状共价闭合DNA这3种直链状共价闭合DNA中的任一种或全部转染至第2宿主；细小病毒载体的制备方法，该方法包括，在上述基因导入工序中，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，以及，在上述转染工序中，将通过上述基因导入工序得到的包含上述编码目标蛋白的核酸序列(目标基因)的直链状共价闭合DNA、以及包含上述编码包装蛋白的核酸序列及编码辅助蛋白的核酸序列(包装基因及辅助基因)的直链状共价闭合DNA这2种直链状共价闭合DNA中的任一种或全部转染至第2宿主；等。

在后述的实施例2-8中，通过将得到的3种直链状共价闭合DNA转染至HEK293T细胞，制备了细小病毒科的腺相关病毒载体。

在后述的实施例2-9中，通过将得到的2种直链状共价闭合DNA转染至HEK293T细胞，制备了细小病毒科的腺相关病毒载体。

通过上述细小病毒载体的制备方法，可以提供使用了实质上不包含不需要的序列的直链状共价闭合DNA的能够以高效率简便地生产的高品质的细小病毒载体的制备方法。

作为上述不必要的序列，只要是上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列、即不以插入细小病毒载体的衣壳为目的的核酸序列即可，没有特别限制，可以列举例如：编码AmpR等抗生素耐性蛋白的核酸序列、宿主的复制因子序列、包装基因、辅助基因、编码前端粒酶的核酸序列、编码激活物或阻遏物的核酸序列、用于控制前端粒酶的表达的核酸序列等。

在上述细小病毒载体的制备方法中，作为将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的工序后的上述第2宿主的培养上清中的除上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数，优选为10％以下、更优选为5％以下、进一步优选为2.5％以下、特别优选为1％以下。

在上述细小病毒载体的制备方法中，作为将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的工序后的上述第2宿主的细胞溶解液中的除上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数，优选为1％以下、更优选为0.5％以下、进一步优选为0.1％以下、特别优选为0.01％以下。

在本发明中，“载体基因组(vg)”是指病毒的衣壳内存在的核酸，在细小病毒的情况下，是指衣壳内的直链状单链DNA。作为测定样品内存在多少病毒的方法，可以以病毒的物理滴度表示上述载体基因组的数量。

上述培养上清中的除上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数通过定量PCR法如下所述进行测定。

以HEK293T细胞(由ATCC获得)为6.3×10⁵个的方式接种于10cm培养皿，在5％CO₂存在下于37℃培养3天。在3天后，进行转染，在5％CO₂存在下于37℃培养4天。在4天后，回收培养皿的培养液。添加3mL的PBS溶液并回收。添加1mL的Accutase溶液(Innovative CellTechnologies公司制)，使细胞剥离，回收细胞悬浮液。添加6mL的PBS溶液并回收。将汇总的回收液离心分离，回收上清。在上述上清中添加包含40％PEG8000(Sigma-Ald rich公司制)的2.5M NaCl溶液8mL，在冰上静置2小时。在离心分离后去除上清，在颗粒中添加包含0.1％TritonX100的PBS溶液1mL，将其在4℃下搅拌处理20分钟。添加1μL的KANEKA Endonuclease(株式会社钟化制、KE N02500、＞250U/μL)溶液和7.5μL的1M MgCl₂溶液，在37℃下静置30分钟。在静置后，添加15μL的0.5M EDTA溶液。通过离心分离回收上清，制成来自上清的样品(培养上清)。使用得到的来自上清的样品(培养上清)，通过定量PCR法之一的实时PCR法(Quantstudio、SYBR Green法)进行上述编码蛋白质的核酸序列、以及作为上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的编码抗生素耐性蛋白的基因的载体基因组数测定，相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数，计算出上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数。

上述细胞溶解液中的除上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数通过定量PCR法如下所述进行测定。

以HEK293T细胞(由ATCC获得)为6.3×10⁵个的方式接种于10cm培养皿，在5％CO₂存在下于37℃培养3天。在3天后，进行转染，在5％CO₂存在下于37℃培养4天。在4天后，去除培养皿的培养液。添加3mL的PBS溶液，并去除。添加1mL的Accutase溶液(Innovative CellTechnologies公司制)，使细胞剥离，回收细胞悬浮液。添加6mL的PBS溶液并回收。将汇总的回收液离心分离，回收细胞。在上述细胞中添加包含0.1％TritonX100的PBS溶液1mL，将其在4℃下搅拌处理20分钟。添加1μL的KANEKA Endo nuclease(株式会社钟化制、KEN02500、＞250U/μL)溶液和7.5μL的1M Mg Cl₂溶液，在37℃下静置30分钟。在静置后，添加15μL的0.5M EDTA溶液。通过离心分离回收上清，制成来自细胞的样品(细胞溶解液)。使用得到的来自细胞的样品(细胞溶解液)，通过定量PCR法之一的实时PCR法(Quant studio、SYBRGreen法)进行上述编码蛋白质的核酸序列、以及作为上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的编码抗生素耐性蛋白的基因的载体基因组数测定，相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数，计算出上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数。

作为上述编码抗生素耐性蛋白的基因，可以使用编码AmpR的基因(amp R)等编码上述直链状共价闭合DNA制备用载体所具有的抗生素耐性蛋白的基因。编码AmpR的基因(ampR)的情况下，作为实时PCR法的引物，使用引物11(序列号21)及引物12(序列号22)。

在后述的比较例1中，通过将环状质粒DNA转染至HEK293T细胞，制备了在来自上清的样品(培养上清)中上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为14.4％的细小病毒科的腺相关病毒载体。

另外，在后述的比较例1中，通过将环状质粒DNA转染至HEK293T细胞，制备了在来自细胞的样品(细胞溶解液)中上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为1.2％的细小病毒科的腺相关病毒载体。

另一方面，在后述的实施例2-8及2-9中，通过将得到的直链状共价闭合DNA转染至HEK293T细胞，制备了在来自上清的样品(培养上清)及来自细胞的样品(细胞溶解液)中完全检测不到上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数(检测限以下)的细小病毒科的腺相关病毒载体。

＜其它工序B＞

作为上述其它工序B，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以举出例如，在基因导入工序后诱导上述前端粒酶的表达的表达诱导工序、直链状共价闭合DNA的纯化工序等。

作为在上述基因导入工序后诱导上述前端粒酶的表达的表达诱导工序，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以举出例如，在导入了基因的第1宿主的培养液中添加表达诱导剂的方法等。

作为上述直链状共价闭合DNA的纯化工序，没有特别限制，可以根据目的而适当选择，可以列举例如：使用市售的试剂盒进行纯化的方法、使用阳离子色谱法及阴离子色谱法、尺寸排除色谱法、过滤器、超滤膜将细胞溶解液进行纯化的方法等。

(细小病毒载体)

上述细小病毒载体可通过上述的细小病毒载体的制备方法而制备。

上述细小病毒载体可以作为细胞/基因治疗药、疫苗、疾病治疗药用载体而使用。

上述细小病毒载体可以直接使用，也可以预先实施磷酸化、甲基化、脂质修饰、糖链添加、脱酰胺化等翻译后修饰，还可以在制备后实施糖链添加、低分子化合物添加、PEG化等引起药理学变化的修饰、添加酶、同位素等的功能的修饰而使用。另外，可以使用各种制剂化处理。

(细小病毒载体产生细胞)

上述细小病毒载体产生细胞是产生细小病毒载体的细胞。

上述细小病毒载体是通过直链状共价闭合DNA而得到的表达编码蛋白质的核酸序列的细小病毒载体，通过定量PCR法定量时的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数在上述细小病毒载体产生细胞的培养上清中为10％以下，或者在上述细小病毒载体产生细胞的细胞溶解液中为1％以下。

上述细小病毒载体产生细胞可以通过将由上述的基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主而得到。

上述基因导入工序、上述第2宿主、上述转染、上述通过定量PCR法定量的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数、以及其测定方法如上所述。

实施例

以下，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

以下的实施例中使用的重组DNA技术相关的详细操作方法等记载于以下的书中：Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Ass ociates andWiley-Interscience)。

＜制造例1-1：载体的制备所使用的各种基因的制备＞

载体的构建中利用的编码Escherichia virus N15来源的前端粒酶(TelN前端粒酶)的核酸序列(序列号1)以合成DNA作为模板通过PCR而制备。上述合成DNA通过合成以序列重叠的方式设计的多个寡核苷酸、并在退火后使用DNA连接酶、DNA聚合酶使其延伸至目标链长的方法等而制备，也可以利用各公司所提供的人工基因合成服务而获得。

作为载体的构建中利用的前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)，全合成了核酸片段(序列号2)。

载体的构建中利用的由启动子控制的AraC基因(序列号3)以合成DNA作为模板通过PCR而制备。上述合成DNA通过合成以序列重叠的方式设计的多个寡核苷酸、并在退火后使用DNA连接酶、DNA聚合酶使其延伸至目标链长的方法等而制备，也可以利用各公司所提供的人工基因合成服务而获得。

作为载体的构建中利用的阿拉伯糖诱导启动子，全合成了核酸片段(序列号4)。

载体的构建中利用的编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列(序列号5)以合成DNA作为模板通过PCR而制备。上述合成DNA通过合成以序列重叠的方式设计的多个寡核苷酸、并在退火后使用DNA连接酶、DNA聚合酶使其延伸至目标链长的方法等而制备，也可以利用各公司所提供的人工基因合成服务而获得。

编码TelN前端粒酶的核酸序列使用引物1(序列号6正向引物)及引物2(序列号7反向引物)通过PCR制备，由启动子控制的AraC基因使用引物3(序列号8正向引物)及引物4(序列号9反向引物)通过PCR制备，编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列使用引物5(序列号10正向引物)及引物6(序列号11反向引物)通过PCR制备。

上述PCR中使用了Prime STAR MAX DNA Polymerase(Takara Bio公司制)等，反应条件按照附带的手册中记载的方法进行。

＜实施例1-1：直链状共价闭合DNA制备用载体的构建＞

在实施例1-1中，大肠杆菌的转化所使用的双链环状质粒通过将构建的载体导入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞(Takara Bio公司制、9057)、并将得到的转化体进行培养、扩增而制备。

来自于质粒保持株的质粒的制备使用FastGene Plasmid Mini Kit(NIPP ONGenetics公司制)而进行。

对于编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列(序列号5)，通过使用了引物5(序列号10)及引物6(序列号11)的PCR制备核酸片段，构建了替换编码pAAV-GFPControl Plasmid(CELLBiolabs公司制)的绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列后的pAAV-Venus。

接着，通过全合成制备了前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)的核酸片段(序列号2)，插入至pAAV-Venus的PciI位点及KasI位点，构建了pAAV-Venus_telRL。

接着，对于编码TelN前端粒酶的核酸序列(序列号1)，通过使用了引物1(序列号6)及引物2(序列号7)的PCR制备核酸片段，对于由启动子控制的AraC基因(序列号3)，通过使用了引物3(序列号8)及引物4(序列号9)的PCR制备核酸片段，通过全合成制备阿拉伯糖诱导启动子的核酸片段(序列号4)，将它们分别插入至pAAV-Venus_telRL的PsiI位点，构建了pAAV-Venus_tel RL_ara_TelN(图1)。

上述pAAV-Venus_telRL_ara_TelN载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在阿拉伯糖诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，作为编码目标蛋白的核酸序列，编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列位于上述telRL序列之间。

图1的telRL为前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)。图1的IT R为末端倒位序列。图1的CMV启动子为巨细胞病毒来源的启动子。图1的Venus为编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列。图1的PolyA为与信使RNA的聚腺苷酸化相关的序列。图1的AraC为由启动子控制的AraC基因序列。图1的阿拉伯糖诱导型启动子(Arabinose inducible Promoter)为阿拉伯糖诱导启动子的核酸序列。图1的TelN为编码TelN前端粒酶的核酸序列。图1的ampR为编码抗生素耐性蛋白(AmpR)的核酸序列。

＜实施例1-2：转化大肠杆菌的获得＞

使用实施例1-1中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pAAV-Venus_telRL_ara_TelN如下所述对大肠杆菌进行了转化。

将大肠杆菌NEB10β株的感受态细胞(New England Biolabs公司制、C3019H)溶液25μL与100pg的pAAV-Venus_telRL_ara_TelN混合，在冰上静置30分钟。

在静置30分钟后，以42℃进行45秒钟热处理，在冰上静置2分钟。

在静置2分钟后，添加SOC培养基225μL，将大肠杆菌涂布于LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％干燥酵母提取物、1％氯化钠、0.005％羧苄青霉素二钠(NACALAI TESQUE公司制))，选择在37℃下静置培养1天期间生长的菌株，得到了导入有直链状共价闭合DNA制备用载体pAAV-Venus_telRL_ara_TelN的大肠杆菌。

＜实施例1-3：转化大肠杆菌的培养＞

将通过实施例1-2得到的转化大肠杆菌接种于2mL的Plusgrow II培养基(4％Plusgrow II(NACALAI TESQUE公司制)、0.005％羧苄青霉素二钠)，将其在37℃下振荡培养6小时后，得到了前培养液。

在50mL的Plusgrow II培养基(4％Plusgrow II、0.005％羧苄青霉素二钠)中将前培养液100μL进行传代培养，将其在37℃下振荡培养16小时。

在振荡培养16小时后，添加50mL的Plusgrow II培养基(4％Plusgrow II、0.005％羧苄青霉素二钠)及1mL的阿拉伯糖溶液(10％阿拉伯糖)，将其在37℃下振荡培养1小时。在1小时振荡培养后，通过离心分离回收了菌体。

＜＜基于电泳法的直链状共价闭合DNA的评价＞＞

由实施例1-3中得到的大肠杆菌菌体制备的直链状共价闭合DNA的评价通过电泳法按照以下所示的方法进行。

来自于大肠杆菌菌体的DNA的制备使用FastGene Plasmid Mini Kit(NI PPONGenetics公司制)进行。将得到的DNA溶液加入至通过TAE缓冲液制备的1％琼脂糖凝胶的孔中，以100V进行了40分钟电泳。染色使用了核酸染色剂，检测使用了UV光。将结果示于图2的泳道3。

除了未添加上述1mL阿拉伯糖溶液以外同样地进行培养，将由培养的大肠杆菌菌体得到的DNA的评价结果示于图2的泳道2。

在图2的结果中，从添加有阿拉伯糖的培养液来源的大肠杆菌菌体(泳道3)确认到了直链状共价闭合DNA来源的2个条带(具有编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带、以及具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带)，与此相对，从未添加阿拉伯糖的培养液来源的大肠杆菌菌体(泳道2)没有确认到直链状共价闭合DNA来源的条带，仅确认到了环状质粒DNA来源的条带。图2的泳道1为DNA标志(1kb DNA Ladder、Takara Bio公司制、3412A)。

这表明，TelN前端粒酶将TelN前端粒酶所识别的telRL序列进行切断/再结合，制备了具有位于telRL序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA。

＜实施例1-4：直链状共价闭合DNA的纯化＞

用限制酶EcoRV及BclI对实施例1-3中得到的直链状共价闭合DNA进行处理，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG.公司制)将直链状共价闭合DNA进行了纯化。由此，通过上述限制酶将具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA及直链状共价闭合DNA制备用载体的2个部位切断。

接着，利用Exonuclease(New England Biolabs公司制)进行处理，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG.公司制)将直链状共价闭合DNA进行了纯化。由此，从单链或双链DN A的末端分解了核苷酸。

＜＜基于电泳法的直链状共价闭合DNA的评价＞＞

实施例1-4中得到的直链状共价闭合DNA的评价通过电泳法按照以下所示的方法进行。

将得到的DNA溶液加入至通过TAE缓冲液制备的1％琼脂糖凝胶的孔中，以100V进行了40分钟电泳。染色使用了核酸染色剂，检测使用了UV光。将结果示于图3(泳道3、4、5)。

图3的泳道1为DNA标志(1kb DNA Ladder、Takara Bio公司制、3412A)，泳道2为限制酶未处理及Exonuclease未处理样品，泳道3为限制酶处理及Exonuclease未处理样品，泳道4为限制酶未处理及Exonuclease处理样品、泳道5为限制酶处理及Exonuclease处理样品。

在图3的结果中，在泳道4中未确认到由Exonuclease引起的分解，在泳道5中仅确认到了具有位于telRL序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带，因此表明，限制酶将具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA切断，Exonuclease从单链或双链DNA的末端分解了核苷酸。即，表明实施例1-3中得到的直链状共价闭合DNA的末端可靠地闭合。

＜实施例1-5：直链状共价闭合DNA制备用载体的构建＞

对于编码TelN前端粒酶的核酸序列(序列号1)，通过使用了引物1(序列号6)及引物2(序列号7)的PCR制备核酸片段，通过全合成制备了由启动子控制的LacI基因(序列号23)及IPTG诱导启动子的核酸片段(序列号24)，将它们分别插入实施例1-1中构建的pAAV-Venus_telRL的PsiI位点，构建了pAAV-Venus_telRL_IPTG_TelN(图4)。

上述pAAV-Venus_telRL_IPTG_TelN载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在IPTG诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，作为编码目标蛋白的核酸序列，编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列位于上述telRL序列之间。

图4的telRL为前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)。图4的IT R为末端倒位序列。图4的CMV启动子为巨细胞病毒来源的启动子。图4的Venus为编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列。图4的PolyA为与信使RNA的聚腺苷酸化相关的序列。图4的LacI为由启动子控制的LacI基因序列。图4的IPTG诱导型启动子(IPTG inducible Promoter)为IPTG诱导启动子的核酸序列。图4的TelN为编码TelN前端粒酶的核酸序列。图4的ampR为编码抗生素耐性蛋白(AmpR)的核酸序列。

＜实施例1-6：转化大肠杆菌的获得＞

使用实施例1-5中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pAAV-Venus_telRL_IPTG_TelN，如下所述对大肠杆菌进行了转化。

将大肠杆菌JM109株的感受态细胞(Takara Bio公司制、9052)或DH5α株的感受态细胞(Takara Bio公司制、9057)溶液50μL与100pg的pAAV-Ven us_telRL_IPTG_TelN混合，在冰上静置30分钟。

静置30分钟后，以42℃进行45秒钟的热处理，在冰上静置2分钟。

静置2分钟后，添加SOC培养基450μL，将大肠杆菌涂布于LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％干燥酵母提取物、1％氯化钠、0.005％羧苄青霉素二钠(NACALAI TESQUE公司制))，选择在37℃下静置培养1天期间生长的菌株，得到了导入有直链状共价闭合DNA制备用载体pAAV-Venus_telRL_IPT G_TelN的大肠杆菌。

在以下的实施例2-1、2-2、2-3及2-4中，大肠杆菌的转化所使用的质粒通过将构建的载体导入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞(Takara Bio公司制、9057)、并将得到的转化体进行培养、扩增而制备。来自于质粒保持株的质粒的制备使用了FastGene Plasmid MiniKit(NIPPON Genetics公司制)而进行。

＜制造例2-1：载体的制备所使用的各种基因的制备＞

＜实施例2-1：具有目标基因的载体的构建＞

上述pAAV-Venus_telRL_ara_TelN载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在阿拉伯糖诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，作为编码目标蛋白的核酸序列(目标基因)，编码荧光蛋白(Venus)的核酸序列位于上述telRL序列之间。

＜实施例2-2：具有包装基因的载体的构建＞

通过全合成制备前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)的核酸片段(序列号2)，插入至pRC2-mi342(Takara Bio公司制)的EcoRV位点及SnaB I位点，制备了pRC2-mi342_telRL。

接着，对于编码TelN前端粒酶的核酸序列(序列号1)，通过使用了引物1(序列号6)及引物2(序列号7)的PCR制备核酸片段，对于由启动子控制的AraC基因(序列号3)，通过使用了引物3(序列号8)及引物4(序列号9)的PCR制备核酸片段，通过全合成制备阿拉伯糖诱导启动子的核酸片段(序列号4)，将它们分别插入至pRC2-mi342_telRL的SmaI位点，构建了pRC2-mi342_tel RL_ara_TelN(图5)。

上述pRC2-mi342_telRL_ara_TelN载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在阿拉伯糖诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，编码包装蛋白的核酸序列(Rep：序列号12、Cap：序列号13)位于上述telRL序列之间。

图5的Rep为编码腺相关病毒的包装蛋白Rep的核酸序列。图5的Cap为编码腺相关病毒的包装蛋白Cap的核酸序列。

＜实施例2-3：具有辅助基因的载体的构建＞

通过全合成制备前端粒酶所识别的一对核酸序列(telRL序列)的核酸片段(序列号2)，插入至pHelper(Takara Bio公司制)的BamHI位点及SalI位点，构建了pHelper_telRL。

接着，对于编码TelN前端粒酶的核酸序列(序列号1)，通过使用了引物1(序列号6)及引物2(序列号7)的PCR制备核酸片段，对于由启动子控制的AraC基因(序列号3)，通过使用了引物3(序列号8)及引物4(序列号9)的PCR制备核酸片段，通过全合成制备阿拉伯糖诱导启动子的核酸片段(序列号4)，将它们分别插入至pHelper_telRL的NdeI位点，构建了pHelper_telRL_ara_TelN(图6)。

上述pHelper_telRL_ara_TelN载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在阿拉伯糖诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，编码辅助蛋白的核酸序列(E2A：序列号14、E4：序列号15、VA：序列号16)位于上述tel RL序列之间。

图6的E2A为编码腺病毒的辅助蛋白E2A的核酸序列。图6的E4为编码腺病毒的辅助蛋白E4的核酸序列。图6的VA为编码腺病毒的辅助蛋白VA的核酸序列。

＜实施例2-4：具有包装基因及辅助基因的载体的构建＞

对于编码辅助蛋白质的核酸序列，通过以pHelper(Takara Bio公司制)作为模板且使用了引物7(序列号17正向引物)及引物8(序列号18反向引物)的PCR制备核酸片段，插入至实施例2-2中得到的pRC2-mi342_telRL_ara_TelN的NdeI位点，构建了pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper(图7)。

上述pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper载体为直链状共价闭合DNA制备用载体，被设计为使得TelN前端粒酶在阿拉伯糖诱导启动子控制下进行表达。另外，作为上述前端粒酶所识别的一对核酸序列，使用telRL序列，编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列位于上述telRL序列之间。

图7的Helper为编码腺病毒的辅助蛋白E2A/E4/VA的核酸序列。

＜实施例2-5：转化大肠杆菌的获得＞

使用实施例2-1中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pAAV-Venus_telRL_ara_TelN、实施例2-2中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pR C2-mi342_telRL_ara_TelN、实施例2-3中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pHelper_telRL_ara_TelN、或实施例2-4中构建的直链状共价闭合DNA制备用载体pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper，如下所述对大肠杆菌进行了转化。

将大肠杆菌NEB10β株的感受态细胞(New England Biolabs公司制、C3019H)溶液25μL、与包含100pg的上述pAAV-Venus_telRL_ara_TelN、100pg的上述pRC2-mi342_telRL_ara_TelN、100pg的上述pHelper_telRL_ara_TelN、或100pg的上述pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper的直链状共价闭合DNA制备用载体溶液进行混合，在冰上静置30分钟。

在静置2分钟后，添加SOC培养基225μL，将大肠杆菌涂布于LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％干燥酵母提取物、1％氯化钠、0.005％羧苄青霉素二钠(NACALAI TESQUE公司制))，选择在37℃下静置培养1天期间生长的菌株，得到了导入有上述直链状共价闭合DNA制备用载体的大肠杆菌。

＜实施例2-6：转化大肠杆菌的培养＞

将通过实施例2-5得到的转化大肠杆菌接种于2mL的Plusgrow II培养基(4％Plusgrow II(NACALAI TESQUE公司制)、0.005％羧苄青霉素二钠)，将其在37℃下振荡培养6小时后，得到了前培养液。

＜＜基于电泳法的直链状共价闭合DNA的评价＞＞

由实施例2-6中得到的大肠杆菌菌体制备的直链状共价闭合DNA的评价通过电泳法按照以下所示的方法进行。

来自于大肠杆菌菌体的DNA的制备使用FastGene Plasmid Mini Kit(NI PPONGenetics公司制)进行。将得到的DNA溶液加入至通过TAE缓冲液制备的1％琼脂糖凝胶的孔中，以100V进行了40分钟电泳。染色使用了核酸染色剂，检测使用了UV光。将结果示于图8的泳道3、5、7、9。

除了未添加上述1mL阿拉伯糖溶液以外，同样地进行培养，将由培养的大肠杆菌菌体得到的DNA的评价结果示于图8的泳道2、4、6、8。

图8的泳道1为DNA标志(1kb DNA Ladder、Takara Bio公司制、3412A)，泳道3为pAAV-Venus_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道5为pHelper_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道7为pRC2-mi342_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道9为pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper来源的样品，泳道2为未添加阿拉伯糖溶液的pAAV-Venus_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道4为未添加阿拉伯糖溶液的pHelper_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道6为未添加阿拉伯糖溶液的pRC2-mi342_telRL_ara_TelN来源的样品，泳道8为未添加阿拉伯糖溶液的pRC2-mi342_telRL_ara_TelN_Helper来源的样品。

在图8的结果中，从添加有阿拉伯糖的培养液来源的大肠杆菌菌体(泳道3、5、7、9)确认到了直链状共价闭合DNA来源的2个条带(图8中以箭头表示的具有编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带、具有编码包装蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带、具有编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带、或具有编码包装蛋白质及辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带、以及具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带)，与此相对，从未添加阿拉伯糖的培养液来源的大肠杆菌菌体(泳道2、4、6、8)没有确认到直链状共价闭合DNA来源的条带，仅确认到了环状质粒DNA来源的条带。

这表明，通过将具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列的载体导入作为第1宿主的大肠杆菌，TelN前端粒酶将TelN前端粒酶所识别的telRL序列进行切断/再结合，制备了具有位于telRL序列之间且编码目标蛋白的核酸序列、位于telRL序列之间且编码包装蛋白的核酸序列、位于tel RL序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列、或位于telRL序列之间且编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA。

＜实施例2-7：直链状共价闭合DNA的纯化＞

通过限制酶BstZ17I(New England Biolabs公司制)对实施例2-6中得到的直链状共价闭合DNA进行处理，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit(MACHEREY-NAGELGmbH&Co.KG.公司制)将直链状共价闭合DNA进行了纯化。由此，具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA及直链状共价闭合DNA制备用载体在其BstZ17I识别位点被切断。

接着，通过Exonuclease(New England Biolabs公司制)进行处理，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG.公司制)将直链状共价闭合DNA进行了纯化。由此，从单链或双链DNA的末端分解了核苷酸。

＜＜基于电泳法的直链状共价闭合DNA的评价＞＞

实施例2-7中得到的直链状共价闭合DNA的评价通过电泳法按照以下所示的方法进行。

将得到的DNA溶液加入至通过TAE缓冲液制备的1％琼脂糖凝胶的孔中，以100V进行了40分钟电泳。染色使用了核酸染色剂，检测使用了UV光。将结果示于图9(泳道2、3、4、5)。

这里，将具有位于telRL序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA设为Venus_LCC_DNA，将具有位于telRL序列之间且编码包装蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA设为RC2_LCC_DNA，将具有位于telRL序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA设为H elper_LCC_DNA，将具有位于telRL序列之间且编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA设为RC2_Helper_LCC_DNA。

图9的泳道1为DNA标志(1kb DNA Ladder、Takara Bio公司制、3412A)，泳道2为Venus_LCC_DNA，泳道3为Helper_LCC_DNA，泳道4为RC2_LCC_DNA，泳道5为RC2_Helper_LCC_DNA。

在图9的结果中，分别确认到了具有位于telRL序列之间且编码蛋白质的核酸序列的直链状共价闭合DNA来源的条带，与此相对，未确认到具有编码TelN前端粒酶的核酸序列的直链状共价闭合DNA及直链状共价闭合D NA制备用载体来源的条带。

这表明，限制酶BstZ17I将编码TelN前端粒酶的核酸序列切断，Exonu clease从单链或双链DNA的末端分解了核苷酸。即，表明实施例2-6中得到的直链状共价闭合DNA的末端可靠地闭合。

＜实施例2-8：腺相关病毒载体的制备＞

使用实施例2-7中得到的直链状共价闭合DNA，如下所述制备了腺相关病毒载体。

以HEK293T细胞(由ATCC获得)为6.3×10⁵个的方式接种于10cm培养皿，在5％CO₂存在下于37℃培养3天。

在3天后，将6μg的Venus_LCC_DNA、6μg的RC2_LCC_DNA、12μg的Helper_LCC_DNA混合，将其作为A液。将包含72μg的PEI(Polysciences公司制)的溶液作为B液。将上述A液与B液混合，在室温下静置15分钟。

向更换了培养基的HEK293T细胞添加上述A液B液混合物，在5％CO₂存在下于37℃间培养4天。

在4天后，回收了培养皿的培养液。添加3mL的PBS溶液并回收。添加1mL的Accutase溶液(Innovative Cell Technologies公司制)，使细胞剥离，回收了细胞悬浮液。添加6mL的PBS溶液并回收。将汇总的回收液离心分离，回收了上清和细胞。

＜＜基于定量PCR法的腺相关病毒载体的载体基因组数测定评价＞＞

实施例2-8中得到的腺相关病毒载体的载体基因组数测定评价通过定量PCR法之一的实时PCR法按照以下所示的方法进行。

在上述上清中添加包含40％ PEG8000(Sigma-Aldrich公司制)的2.5M Na Cl溶液8mL，在冰上静置2小时。在离心分离后去除上清，向颗粒添加包含0.1％TritonX100的PBS溶液1mL，将其在4℃下搅拌处理20分钟。添加1μL的KANEKA Endonuclease(株式会社钟化制、KEN02500、＞250U/μL)溶液和7.5μL的1M MgCl₂溶液，在37℃下静置30分钟。在静置后，添加15μL的0.5M EDTA溶液。通过离心分离回收上清，制成来自上清的样品(培养上清)。

向上述细胞添加包含0.1％TritonX100的PBS溶液1mL，将其在4℃下搅拌处理20分钟。添加1μL的KANEKA Endonuclease(株式会社钟化制、KE N02500、＞250U/μL)溶液和7.5μL的1M MgCl₂溶液，在37℃下静置30分钟。在静置后，添加15μL的0.5M EDTA溶液。通过离心分离回收上清，制成了来自细胞的样品(细胞溶解液)。

使用得到的来自上清的样品和来自细胞的样品，通过实时PCR法(Quant studio、SYBR Green法)进行了上述编码目标蛋白的核酸序列(目标基因)的载体基因组数测定。引物使用了引物9(序列号19正向引物)及引物10(序列号20反向引物)。将每个培养皿的腺相关病毒载体的载体基因组数(vg/dish)的结果示于表1。

[表1]

另外，为了评价腺相关病毒载体的错误包装，通过同样的方法评价了作为上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的编码抗生素耐性蛋白(AmpR)的基因(ampR)的载体基因组数测定。引物使用了引物11(序列号21正向引物)及引物12(序列号22反向引物)。将结果示于表2。

[表2]

ND:未检测到

＜实施例2-9：腺相关病毒载体的制备＞

在3天后，将8μg的Venus_LCC_DNA、16μg的RC2_Helper_LCC_DN A混合，将其作为A液。将包含72μg的PEI(Polysciences公司制)的溶液作为B液。将上述A液与B液混合，在室温下静置15分钟。

向更换了培养基的HEK293T细胞添加上述A液B液混合物，在5％CO₂存在下于37℃培养4天。

在4天后，回收了培养皿的培养液。添加3mL的PBS溶液并回收。添加1mL的Accutase溶液(Innovative Cell Technologies公司制)，使细胞剥离，回收了细胞悬浮液。添加6mL的PBS溶液并回收。将汇总的回收液离心分离，回收了细胞和上清。

得到的腺相关病毒载体的载体基因组数测定评价通过实时PCR法与实施例2-8同样地进行。将结果示于表1及表2。

＜比较例2-1：腺相关病毒载体的制备＞

使用环状质粒DNA，如下所述制备了腺相关病毒载体。

在3天后，将6μg的pAAV-Venus、6μg的pRC2-mi342、12μg的pHelp er混合，将其作为A液。将包含72μg的PEI(Polysciences公司制)的溶液作为B液。将上述A液与B液混合，在室温下静置15分钟。

对于表1的结果，在实施例2-8中，通过将得到的3种直链状共价闭合DNA转染至HEK293T细胞，制备了细小病毒科的腺相关病毒载体。另外，在实施例2-9中，通过将得到的2种直链状共价闭合DNA转染至HEK293T细胞，制备了细小病毒科的腺相关病毒载体。

对于使用了直链状共价闭合DNA时(实施例2-8、2-9)的腺相关病毒载体的目标基因的载体基因组数而言，在来自上清的样品及来自细胞的样品中，与使用了环状质粒DNA时(比较例1)的载体基因组数相比为同等以上。

对于表2的结果，在比较例1中，通过将环状质粒DNA转染至HEK293T细胞，在来自上清的样品中，作为上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的编码抗生素耐性蛋白(AmpR)的基因(ampR)的载体基因组数(2.02×10¹⁰vg/dish)相对于表1的上述编码目标蛋白的核酸序列(目标基因)的载体基因组数(1.40×10¹¹vg/dish)为14.4％。另外，在来自细胞的样品中，上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数(3.42×10⁹vg/dish)相对于表1的上述包括目标蛋白的核酸序列(目标基因)的载体基因组数(2.75×10¹¹vg/dish)为1.2％。

另一方面，在表2的结果中，对于使用直链状共价闭合DNA制备的腺相关病毒载体(实施例2-8、2-9)的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列(不必要的序列)的载体基因组数而言，在来自上清的样品及来自细胞的样品中，与使用环状质粒DNA制备的腺相关病毒载体(比较例1)相比，大幅减少，完全没有检测到(检测限以下)。

该表1及表2的结果表明，通过使转染至第2宿主的载体为直链状共价闭合DNA，由于与环状质粒DNA相比尺寸更小，因此，向第2宿主的转染效率增高，细小病毒科的腺相关病毒载体的目标基因的载体基因组数上升。另外，由于不包含宿主来源的核酸序列等不必要的碱基序列，因此表明能够制备高品质的细小病毒科的腺相关病毒载体。

作为本发明的方式，可以举出例如以下方式。

＜1＞一种载体，其具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

＜2＞根据上述＜1＞所述的载体，其为直链状共价闭合DNA制备用载体。

＜3＞根据上述＜1＞或＜2＞所述的载体，其为双链环状质粒DNA载体。

＜4＞根据上述＜1＞～＜3＞中任一项所述的载体，其包含用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列。

＜5＞一种直链状共价闭合DNA的制备方法，该方法包括：

将载体导入宿主的基因导入工序，所述载体具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

＜6＞根据上述＜5＞所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，其中，

上述载体为双链环状质粒DNA载体。

＜7＞根据上述＜5＞或＜6＞所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，其中，

上述载体包含用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列。

＜8＞根据上述＜7＞所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，该方法包括：

在上述基因导入工序后诱导上述前端粒酶的表达的表达诱导工序。

＜9＞一种细小病毒载体的制备方法，该方法包括：

将具有编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于上述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列的载体导入第1宿主的基因导入工序；以及

将通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的转染工序。

＜10＞根据上述＜9＞所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述编码蛋白质的核酸序列为编码导入上述细小病毒载体的目标蛋白的核酸序列、编码包装蛋白的核酸序列、以及编码辅助蛋白的核酸序列中的任意核酸序列。

＜11＞根据上述＜9＞或＜10＞所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在上述基因导入工序中，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主；并且

在上述转染工序中，将通过上述基因导入工序得到的包含上述编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、包含上述编码包装蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、以及包含上述编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA这3种直链状共价闭合DNA转染至第2宿主。

＜12＞根据上述＜9＞或＜10＞所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在上述基因导入工序中，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，将具有上述编码前端粒酶的核酸序列、上述前端粒酶所识别的一对核酸序列、位于上述一对核酸序列之间且编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主；并且

在上述转染工序中，将通过上述基因导入工序得到的包含上述编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、以及包含上述编码包装蛋白的核酸序列及编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA这2种直链状共价闭合DNA转染至第2宿主。

＜13＞根据上述＜9＞～＜12＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述载体为双链环状质粒DNA载体。

＜14＞根据上述＜9＞～＜13＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述载体包含用于控制上述前端粒酶的表达的核酸序列。

＜15＞根据上述＜14＞所述的细小病毒载体的制备方法，该方法包括：

＜16＞根据上述＜10＞～＜15＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述包装蛋白质包含Rep或Cap。

＜17＞根据上述＜10＞～＜15＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述辅助蛋白包含腺病毒辅助蛋白。

＜18＞根据上述＜9＞～＜17＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在转染了通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA的第2宿主的培养上清中，通过定量PCR法定量时的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为10％以下，或者在转染了通过上述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA的第2宿主的细胞溶解液中，通过定量PCR法定量时的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为1％以下。

＜19＞根据上述＜9＞～＜18＞中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

上述细小病毒载体为腺相关病毒载体。

＜20＞一种细小病毒载体产生细胞，其中，

上述细小病毒载体是通过直链状共价闭合DNA得到的表达编码蛋白质的核酸序列的细小病毒载体，通过定量PCR法定量时的上述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于上述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数在上述细小病毒载体产生细胞的培养上清中为10％以下，或者在上述细小病毒载体产生细胞的细胞溶解液中为1％以下。

序列表

<110> 株式会社钟化(KANEKA CORPORATION)

<120> 载体、使用了该载体的直链状共价闭合DNA的制备方法、细小病毒载体的制备方法、以及细小病毒载体产生细胞

<130> B200604

<150> JP 2021-054930

<151> 2021-03-29

<150> JP 2021-054970

<151> 2021-03-29

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1896

<212> DNA

<213> Escherichia virus N15

<220>

<223> TelN

<400> 1

atgagcaagg taaaaatcgg tgagttgatc aacacgcttg tgaatgaggt agaggcaatt 60

gatgcctcag accgcccaca aggcgacaaa acgaagagaa ttaaagccgc agccgcacgg 120

tataagaacg cgttatttaa tgataaaaga aagttccgtg ggaaaggatt gcagaaaaga 180

ataaccgcga atacttttaa cgcctatatg agcagggcaa gaaagcggtt tgatgataaa 240

ttacatcata gctttgataa aaatattaat aaattatcgg aaaagtatcc tctttacagc 300

gaagaattat cttcatggct ttctatgcct acggctaata ttcgccagca catgtcatcg 360

ttacaatcta aattgaaaga aataatgccg cttgccgaag agttatcaaa tgtaagaata 420

ggctctaaag gcagtgatgc aaaaatagca agactaataa aaaaatatcc agattggagt 480

tttgctctta gtgatttaaa cagtgatgat tggaaggagc gccgtgacta tctttataag 540

ttattccaac aaggctctgc gttgttagaa gaactacacc agctcaaggt caaccatgag 600

gttctgtacc atctgcagct aagccctgcg gagcgtacat ctatacagca acgatgggcc 660

gatgttctgc gcgagaagaa gcgtaatgtt gtggttattg actacccaac atacatgcag 720

tctatctatg atattttgaa taatcctgcg actttattta gtttaaacac tcgttctgga 780

atggcacctt tggcctttgc tctggctgcg gtatcagggc gaagaatgat tgagataatg 840

tttcagggtg aatttgccgt ttcaggaaag tatacggtta atttctcagg gcaagctaaa 900

aaacgctctg aagataaaag cgtaaccaga acgatttata ctttatgcga agcaaaatta 960

ttcgttgaat tattaacaga attgcgttct tgctctgctg catctgattt cgatgaggtt 1020

gttaaaggat atggaaagga tgatacaagg tctgagaacg gcaggataaa tgctatttta 1080

gcaaaagcat ttaacccttg ggttaaatca tttttcggcg atgaccgtcg tgtttataaa 1140

gatagccgcg ctatttacgc tcgcatcgct tatgagatgt tcttccgcgt cgatccacgg 1200

tggaaaaacg tcgacgagga tgtgttcttc atggagattc tcggacacga cgatgagaac 1260

acccagctgc actataagca gttcaagctg gccaacttct ccagaacctg gcgacctgaa 1320

gttggggatg aaaacaccag gctggtggct ctgcagaaac tggacgatga aatgccaggc 1380

tttgccagag gtgacgctgg cgtccgtctc catgaaaccg ttaagcagct ggtggagcag 1440

gacccatcag caaaaataac caacagcact ctccgggcct ttaaatttag cccgacgatg 1500

attagccggt acctggagtt tgccgctgat gcattggggc agttcgttgg cgagaacggg 1560

cagtggcagc tgaagataga gacacctgca atcgtcctgc ctgatgaaga atccgttgag 1620

accatcgacg aaccggatga tgagtcccaa gacgacgagc tggatgaaga tgaaattgag 1680

ctcgacgagg gtggcggcga tgaaccaacc gaagaggaag ggccagaaga acatcagcca 1740

actgctctaa aacccgtctt caagcctgca aaaaataacg gggacggaac gtacaagata 1800

gagtttgaat acgatggaaa gcattatgcc tggtccggcc ccgccgatag ccctatggcc 1860

gcaatgcgat ccgcatggga aacgtactac agctaa 1896

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> telRL

<400> 2

tatcagcaca caattgccca ttatacgcgc gtataatgga ctattgtgtg ctgata 56

<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AraC

<400> 3

gctaatctta tggataaaaa tgctatggca tagcaaagtg tgacgccgtg caaataatca 60

atgtggactt ttctgccgtg attatagaca cttttgttac gcgtttttgt catggctttg 120

gtcccgcttt gttacagaat gcttttaata agcggggtta ccggtttggt tagcgagaag 180

agccagtaaa agacgcagtg acggcaatgt ctgatgcaat atggacaatt ggtttcttct 240

ctgaatggcg ggagtatgaa aagtatggct gaagcgcaaa atgatcccct gctgccggga 300

tactcgttta atgcccatct ggtggcgggt ttaacgccga ttgaggccaa cggttatctc 360

gattttttta tcgaccgacc gctgggaatg aaaggttata ttctcaatct caccattcgc 420

ggtcaggggg tggtgaaaaa tcagggacga gaatttgttt gccgaccggg tgatattttg 480

ctgttcccgc caggagagat tcatcactac ggtcgtcatc cggaggctcg cgaatggtat 540

caccagtggg tttactttcg tccgcgcgcc tactggcatg aatggcttaa ctggccgtca 600

atatttgcca atacggggtt ctttcgcccg gatgaagcgc accagccgca tttcagcgac 660

ctgtttgggc aaatcattaa cgccgggcaa ggggaagggc gctattcgga gctgctggcg 720

ataaatctgc ttgagcaatt gttactgcgg cgcatggaag cgattaacga gtcgctccat 780

ccaccgatgg ataatcgggt acgcgaggct tgtcagtaca tcagcgatca cctggcagac 840

agcaattttg atatcgccag cgtcgcacag catgtttgct tgtcgccgtc gcgtctgtca 900

catcttttcc gccagcagtt agggattagc gtcttaagct ggcgcgagga ccaacgtatc 960

agccaggcga agctgctttt gagcaccacc cggatgccta tcgccaccgt cggtcgcaat 1020

gttggttttg acgatcaact ctatttctcg cgggtattta aaaaatgcac cggggccagc 1080

ccgagcgagt tccgtgccgg ttgtgaagaa aaagtgaatg atgtagccgt caagttgtca 1140

taa 1143

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 4

tacctgacgc tttttatcgc aactctctac tgtttctcca tacccgtttt tttgg 55

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Venus

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagct gatctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TelN Fw

<400> 6

atgagcaagg taaaaatcgg tgag 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TelN Re

<400> 7

ttagctgtag tacgtttccc atg 23

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AraC Fw

<400> 8

gctaatctta tggataaaaa tgctatg 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AraC Re

<400> 9

ttatgacaac ttgacggcta catc 24

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Venus Fw

<400> 10

atggtgagca agggcgagg 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Venus Re

<400> 11

ttacttgtac agctcgtcca tg 22

<210> 12

<211> 1866

<212> DNA

<213> 腺病毒相关病毒

<220>

<223> Rep

<400> 12

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataa 1866

<210> 13

<211> 2208

<212> DNA

<213> 腺病毒相关病毒

<220>

<223> Cap

<400> 13

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420

ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480

aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540

tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600

aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660

gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780

tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840

tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900

aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960

aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020

caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080

tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140

aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200

cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260

cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320

tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380

cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440

ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500

tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560

ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620

atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680

gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740

accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800

cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860

attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920

caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980

ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040

gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100

acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160

tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208

<210> 14

<211> 5336

<212> DNA

<213> 腺病毒

<220>

<223> E2A

<400> 14

ggtacccaac tccatgctta acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccagga 60

acagctctac agcttcctgg agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat 120

taggagcgcc acttcttttt gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctaggagaca 180

ctttcaataa aggcaaatgt ttttatttgt acactctcgg gtgattattt accccccacc 240

cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct atgcgccact 300

ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg cacaaccatc 360

cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa cgcgtttagc 420

aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc gcgcgagttg 480

cgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac gctggccagc 540

acgctcttgt cggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag ggcgaacgga 600

gtcaactttg gtagctgcct tcccaaaaag ggtgcatgcc caggctttga gttgcactcg 660

caccgtagtg gcatcagaag gtgaccgtgc ccggtctggg cgttaggata cagcgcctgc 720

atgaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttg cgccttcaga gaagaacatg 780

ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcatgcac gcagcacctt 840

gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac gatcttggcc 900

ttgctagact gctccttcag cgcgcgctgc ccgttttcgc tcgtcacatc catttcaatc 960

acgtgctcct tatttatcat aatgctcccg tgtagacact taagctcgcc ttcgatctca 1020

gcgcagcggt gcagccacaa cgcgcagccc gtgggctcgt ggtgcttgta ggttacctct 1080

gcaaacgact gcaggtacgc ctgcaggaat cgccccatca tcgtcacaaa ggtcttgttg 1140

ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttta gccaggtctt gcatacggcc 1200

gccagagctt ccacttggtc aggcagtagc ttgaagtttg cctttagatc gttatccacg 1260

tggtacttgt ccatcaacgc gcgcgcagcc tccatgccct tctcccacgc agacacgatc 1320

ggcaggctca gcgggtttat caccgtgctt tcactttccg cttcactgga ctcttccttt 1380

tcctcttgcg tccgcatacc ccgcgccact gggtcgtctt cattcagccg ccgcaccgtg 1440

cgcttacctc ccttgccgtg cttgattagc accggtgggt tgctgaaacc caccatttgt 1500

agcgccacat cttctctttc ttcctcgctg tccacgatca cctctgggga tggcgggcgc 1560

tcgggcttgg gagaggggcg cttctttttc tttttggacg caatggccaa atccgccgtc 1620

gaggtcgatg gccgcgggct gggtgtgcgc ggcaccagcg catcttgtga cgagtcttct 1680

tcgtcctcgg actcgagacg ccgcctcagc cgcttttttg ggggcgcgcg gggaggcggc 1740

ggcgacggcg acggggacga cacgtcctcc atggttggtg gacgtcgcgc cgcaccgcgt 1800

ccgcgctcgg gggtggtttc gcgctgctcc tcttcccgac tggccatttc cttctcctat 1860

aggcagaaaa agatcatgga gtcagtcgag aaggaggaca gcctaaccgc cccctttgag 1920

ttcgccacca ccgcctccac cgatgccgcc aacgcgccta ccaccttccc cgtcgaggca 1980

cccccgcttg aggaggagga agtgattatc gagcaggacc caggttttgt aagcgaagac 2040

gacgaggatc gctcagtacc aacagaggat aaaaagcaag accaggacga cgcagaggca 2100

aacgaggaac aagtcgggcg gggggaccaa aggcatggcg actacctaga tgtgggagac 2160

gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag tgcgccatta tctgcgacgc gttgcaagag 2220

cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat gtcagccttg cctacgaacg ccacctgttc 2280

tcaccgcgcg taccccccaa acgccaagaa aacggcacat gcgagcccaa cccgcgcctc 2340

aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag gtgcttgcca cctatcacat ctttttccaa 2400

aactgcaaga tacccctatc ctgccgtgcc aaccgcagcc gagcggacaa gcagctggcc 2460

ttgcggcagg gcgctgtcat acctgatatc gcctcgctcg acgaagtgcc aaaaatcttt 2520

gagggtcttg gacgcgacga gaaacgcgcg gcaaacgctc tgcaacaaga aaacagcgaa 2580

aatgaaagtc actgtggagt gctggtggaa cttgagggtg acaacgcgcg cctagccgtg 2640

ctgaaacgca gcatcgaggt cacccacttt gcctacccgg cacttaacct accccccaag 2700

gttatgagca cagtcatgag cgagctgatc gtgcgccgtg cacgacccct ggagagggat 2760

gcaaacttgc aagaacaaac cgaggagggc ctacccgcag ttggcgatga gcagctggcg 2820

cgctggcttg agacgcgcga gcctgccgac ttggaggagc gacgcaagct aatgatggcc 2880

gcagtgcttg ttaccgtgga gcttgagtgc atgcagcggt tctttgctga cccggagatg 2940

cagcgcaagc tagaggaaac gttgcactac acctttcgcc agggctacgt gcgccaggcc 3000

tgcaaaattt ccaacgtgga gctctgcaac ctggtctcct accttggaat tttgcacgaa 3060

aaccgcctcg ggcaaaacgt gcttcattcc acgctcaagg gcgaggcgcg ccgcgactac 3120

gtccgcgact gcgtttactt atttctgtgc tacacctggc aaacggccat gggcgtgtgg 3180

cagcaatgcc tggaggagcg caacctaaag gagctgcaga agctgctaaa gcaaaacttg 3240

aaggacctat ggacggcctt caacgagcgc tccgtggccg cgcacctggc ggacattatc 3300

ttccccgaac gcctgcttaa aaccctgcaa cagggtctgc cagacttcac cagtcaaagc 3360

atgttgcaaa actttaggaa ctttatccta gagcgttcag gaattctgcc cgccacctgc 3420

tgtgcgcttc ctagcgactt tgtgcccatt aagtaccgtg aatgccctcc gccgctttgg 3480

ggtcactgct accttctgca gctagccaac taccttgcct accactccga catcatggaa 3540

gacgtgagcg gtgacggcct actggagtgt cactgtcgct gcaacctatg caccccgcac 3600

cgctccctgg tctgcaattc gcaactgctt agcgaaagtc aaattatcgg tacctttgag 3660

ctgcagggtc cctcgcctga cgaaaagtcc gcggctccgg ggttgaaact cactccgggg 3720

ctgtggacgt cggcttacct tcgcaaattt gtacctgagg actaccacgc ccacgagatt 3780

aggttctacg aagaccaatc ccgcccgcca aatgcggagc ttaccgcctg cgtcattacc 3840

cagggccaca tccttggcca attgcaagcc atcaacaaag cccgccaaga gtttctgcta 3900

cgaaagggac ggggggttta cctggacccc cagtccggcg aggagctcaa cccaatcccc 3960

ccgccgccgc agccctatca gcagccgcgg gcccttgctt cccaggatgg cacccaaaaa 4020

gaagctgcag ctgccgccgc cgccacccac ggacgaggag gaatactggg acagtcaggc 4080

agaggaggtt ttggacgagg aggaggagat gatggaagac tgggacagcc tagacgaagc 4140

ttccgaggcc gaagaggtgt cagacgaaac accgtcaccc tcggtcgcat tcccctcgcc 4200

ggcgccccag aaattggcaa ccgttcccag catcgctaca acctccgctc ctcaggcgcc 4260

gccggcactg cctgttcgcc gacccaaccg tagatgggac accactggaa ccagggccgg 4320

taagtctaag cagccgccgc cgttagccca agagcaacaa cagcgccaag gctaccgctc 4380

gtggcgcggg cacaagaacg ccatagttgc ttgcttgcaa gactgtgggg gcaacatctc 4440

cttcgcccgc cgctttcttc tctaccatca cggcgtggcc ttcccccgta acatcctgca 4500

ttactaccgt catctctaca gcccctactg caccggcggc agcggcagcg gcagcaacag 4560

cagcggtcac acagaagcaa aggcgaccgg atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat 4620

ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat 4680

cgacccgcga gcttagaaat aggatttttc ccactctgta tgctatattt caacaaagca 4740

ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa acaggtctct gcgctccctc acccgcagct 4800

gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct 4860

tcagcaaata ctgcgcgctg actcttaagg actagtttcg cgccctttct caaatttaag 4920

cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca 4980

ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg 5040

cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca 5100

tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc accgaaaccg aattctcctc gaacaggcgg 5160

ctattaccac cacacctcgt aataacctta atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt 5220

accaggaaag tcccgctccc accactgtgg tacttcccag agacgcccag gccgaagttc 5280

agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg gcggctttcg tcacagggtg cggtcg 5336

<210> 15

<211> 3201

<212> DNA

<213> 腺病毒

<220>

<223> E4

<400> 15

cccgggcgtt ttagggcgga gtaacttgca tgtattggga attgtagttt ttttaaaatg 60

ggaagtgacg tatcgtggga aaacggaagt gaagatttga ggaagttgtg ggttttttgg 120

ctttcgtttc tgggcgtagg ttcgcgtgcg gttttctggg tgttttttgt ggactttaac 180

cgttacgtca ttttttagtc ctatatatac tcgctctgta cttggccctt tttacactgt 240

gactgattga gctggtgccg tgtcgagtgg tgttttttaa taggtttttt tactggtaag 300

gctgactgtt atggctgccg ctgtggaagc gctgtatgtt gttctggagc gggagggtgc 360

tattttgcct aggcaggagg gtttttcagg tgtttatgtg tttttctctc ctattaattt 420

tgttatacct cctatggggg ctgtaatgtt gtctctacgc ctgcgggtat gtattccccc 480

gggctatttc ggtcgctttt tagcactgac cgatgttaac caacctgatg tgtttaccga 540

gtcttacatt atgactccgg acatgaccga ggaactgtcg gtggtgcttt ttaatcacgg 600

tgaccagttt ttttacggtc acgccggcat ggccgtagtc cgtcttatgc ttataagggt 660

tgtttttcct gttgtaagac aggcttctaa tgtttaaatg tttttttttt tgttatttta 720

ttttgtgttt aatgcaggaa cccgcagaca tgtttgagag aaaaatggtg tctttttctg 780

tggtggttcc ggaacttacc tgcctttatc tgcatgagca tgactacgat gtgcttgctt 840

ttttgcgcga ggctttgcct gattttttga gcagcacctt gcattttata tcgccgccca 900

tgcaacaagc ttacataggg gctacgctgg ttagcatagc tccgagtatg cgtgtcataa 960

tcagtgtggg ttcttttgtc atggttcctg gcggggaagt ggccgcgctg gtccgtgcag 1020

acctgcacga ttatgttcag ctggccctgc gaagggacct acgggatcgc ggtatttttg 1080

ttaatgttcc gcttttgaat cttatacagg tctgtgagga acctgaattt ttgcaatcat 1140

gattcgctgc ttgaggctga aggtggaggg cgctctggag cagattttta caatggccgg 1200

acttaatatt cgggatttgc ttagagacat attgataagg tggcgagatg aaaattattt 1260

gggcatggtt gaaggtgctg gaatgtttat agaggagatt caccctgaag ggtttagcct 1320

ttacgtccac ttggacgtga gggcagtttg ccttttggaa gccattgtgc aacatcttac 1380

aaatgccatt atctgttctt tggctgtaga gtttgaccac gccaccggag gggagcgcgt 1440

tcacttaata gatcttcatt ttgaggtttt ggataatctt ttggaataaa aaaaaaaaaa 1500

catggttctt ccagctcttc ccgctcctcc cgtgtgtgac tcgcagaacg aatgtgtagg 1560

ttggctgggt gtggcttatt ctgcggtggt ggatgttatc agggcagcgg cgcatgaagg 1620

agtttacata gaacccgaag ccagggggcg cctggatgct ttgagagagt ggatatacta 1680

caactactac acagagcgag ctaagcgacg agaccggaga cgcagatctg tttgtcacgc 1740

ccgcacctgg ttttgcttca ggaaatatga ctacgtccgg cgttccattt ggcatgacac 1800

tacgaccaac acgatctcgg ttgtctcggc gcactccgta cagtagggat cgcctacctc 1860

cttttgagac agagacccgc gctaccatac tggaggatca tccgctgctg cccgaatgta 1920

acactttgac aatgcacaac gtgagttacg tgcgaggtct tccctgcagt gtgggattta 1980

cgctgattca ggaatgggtt gttccctggg atatggttct gacgcgggag gagcttgtaa 2040

tcctgaggaa gtgtatgcac gtgtgcctgt gttgtgccaa cattgatatc atgacgagca 2100

tgatgatcca tggttacgag tcctgggctc tccactgtca ttgttccagt cccggttccc 2160

tgcagtgcat agccggcggg caggttttgg ccagctggtt taggatggtg gtggatggcg 2220

ccatgtttaa tcagaggttt atatggtacc gggaggtggt gaattacaac atgccaaaag 2280

aggtaatgtt tatgtccagc gtgtttatga ggggtcgcca cttaatctac ctgcgcttgt 2340

ggtatgatgg ccacgtgggt tctgtggtcc ccgccatgag ctttggatac agcgccttgc 2400

actgtgggat tttgaacaat attgtggtgc tgtgctgcag ttactgtgct gatttaagtg 2460

agatcagggt gcgctgctgt gcccggagga caaggcgtct catgctgcgg gcggtgcgaa 2520

tcatcgctga ggagaccact gccatgttgt attcctgcag gacggagcgg cggcggcagc 2580

agtttattcg cgcgctgctg cagcaccacc gccctatcct gatgcacgat tatgactcta 2640

cccccatgta ggcgtggact tccccttcgc cgcccgttga gcaaccgcaa gttggacagc 2700

agcctgtggc tcagcagctg gacagcgaca tgaacttaag cgagctgccc ggggagttta 2760

ttaatatcac tgatgagcgt ttggctcgac aggaaaccgt gtggaatata acacctaaga 2820

atatgtctgt tacccatgat atgatgcttt ttaaggccag ccggggagaa aggactgtgt 2880

actctgtgtg ttgggaggga ggtggcaggt tgaatactag ggttctgtga gtttgattaa 2940

ggtacggtga tcaatataag ctatgtggtg gtggggctat actactgaat gaaaaatgac 3000

ttgaaatttt ctgcaattga aaaataaaca cgttgaaaca taacatgcaa caggttcacg 3060

attctttatt cctgggcaat gtaggagaag gtgtaagagt tggtagcaaa agtttcagtg 3120

gtgtattttc cactttccca ggaccatgta aaagacatag agtaagtgct tacctcgcta 3180

gtttctgtgg attcactaga a 3201

<210> 16

<211> 743

<212> DNA

<213> 腺病毒

<220>

<223> VA

<400> 16

tcgatgtagg atgttgcccc tcctgacgcg gtaggagaag gggagggtgc cctgcatgtc 60

tgccgctgct cttgctcttg ccgctgctga ggaggggggc gcatctgccg cagcaccgga 120

tgcatctggg aaaagcaaaa aaggggctcg tccctgtttc cggaggaatt tgcaagcggg 180

gtcttgcatg acggggaggc aaacccccgt tcgccgcagt ccggccggcc cgagactcga 240

accgggggtc ctgcgactca acccttggaa aataaccctc cggctacagg gagcgagcca 300

cttaatgctt tcgctttcca gcctaaccgc ttacgccgcg cgcggccagt ggccaaaaaa 360

gctagcgcag cagccgccgc gcctggaagg aagccaaaag gagcgctccc ccgttgtctg 420

acgtcgcaca cctgggttcg acacgcgggc ggtaaccgca tggatcacgg cggacggccg 480

gatccggggt tcgaaccccg gtcgtccgcc atgataccct tgcgaattta tccaccagac 540

cacggaagag tgcccgctta caggctctcc ttttgcacgg tctagagcgt caacgactgc 600

gcacgcctca ccggccagag cgtcccgacc atggagcact ttttgccgct gcgcaacatc 660

tggaaccgcg tccgcgactt tccgcgcgcc tccaccaccg ccgccggcat cacctggatg 720

tccaggtaca tctacggatt acg 743

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Helper Fw

<400> 17

gtacatcaag tgtatcatat gggtacccaa ctccatgctt aac 43

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Helper Re

<400> 18

agggggcgta cttggcatat ggtcgacgta atccgtagat gtacc 45

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Venus Fw

<400> 19

cacaacgtct atatcaccg 19

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Venus Re

<400> 20

tgtgatcgcg cttctc 16

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Amp Fw

<400> 21

atcccgtatt gacgcc 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Amp Re

<400> 22

cgctcgtcgt ttggta 16

<210> 23

<211> 1292

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LacI

<400> 23

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt 1140

tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta 1200

ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat 1260

gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg cc 1292

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子

<400> 24

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgga 35

Claims

1.一种载体，其具有：

编码前端粒酶的核酸序列、

所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及

位于所述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的载体，其为直链状共价闭合DNA制备用载体。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其为双链环状质粒DNA载体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的载体，其包含用于控制所述前端粒酶的表达的核酸序列。

5.一种直链状共价闭合DNA的制备方法，该方法包括：

将载体导入宿主的基因导入工序，所述载体具有：

编码前端粒酶的核酸序列、

所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及

位于所述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

6.根据权利要求5所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，其中，

所述载体为双链环状质粒DNA载体。

7.根据权利要求5或6所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，其中，

所述载体包含用于控制所述前端粒酶的表达的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的直链状共价闭合DNA的制备方法，该方法包括：

在所述基因导入工序后诱导所述前端粒酶的表达的表达诱导工序。

9.一种细小病毒载体的制备方法，该方法包括：

将载体导入第1宿主的基因导入工序、以及

将通过所述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA转染至第2宿主的转染工序，

所述载体具有：

编码前端粒酶的核酸序列、

所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及

位于所述一对核酸序列之间且编码蛋白质的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述编码蛋白质的核酸序列为编码导入所述细小病毒载体的目标蛋白的核酸序列、编码包装蛋白的核酸序列、以及编码辅助蛋白的核酸序列中的任意核酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在所述基因导入工序中，

将具有所述编码前端粒酶的核酸序列、所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于所述一对核酸序列之间且编码目标蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，

将具有所述编码前端粒酶的核酸序列、所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于所述一对核酸序列之间且编码包装蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主，

将具有所述编码前端粒酶的核酸序列、所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于所述一对核酸序列之间且编码辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主；并且

在所述转染工序中，将通过所述基因导入工序得到的包含所述编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、包含所述编码包装蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、以及包含所述编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA这3种直链状共价闭合DNA转染至第2宿主。

12.根据权利要求9或10所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在所述基因导入工序中，

将具有所述编码前端粒酶的核酸序列、所述前端粒酶所识别的一对核酸序列、以及位于所述一对核酸序列之间且编码包装蛋白及辅助蛋白的核酸序列的载体导入第1宿主；并且

在所述转染工序中，将通过所述基因导入工序得到的包含所述编码目标蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA、以及包含所述编码包装蛋白的核酸序列及编码辅助蛋白的核酸序列的直链状共价闭合DNA这2种直链状共价闭合DNA转染至第2宿主。

13.根据权利要求9～12中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述载体为双链环状质粒DNA载体。

14.根据权利要求9～13中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述载体包含用于控制所述前端粒酶的表达的核酸序列。

15.根据权利要求14所述的细小病毒载体的制备方法，该方法包括：

16.根据权利要求10～15中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述包装蛋白质包含Rep或Cap。

17.根据权利要求10～15中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述辅助蛋白包含腺病毒辅助蛋白。

18.根据权利要求9～17中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

在转染了通过所述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA的第2宿主的培养上清中，通过定量PCR法定量时的所述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于所述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为10％以下，或者在转染了通过所述基因导入工序得到的直链状共价闭合DNA的第2宿主的细胞溶解液中，通过定量PCR法定量时的所述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于所述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数为1％以下。

19.根据权利要求9～18中任一项所述的细小病毒载体的制备方法，其中，

所述细小病毒为腺相关病毒。

20.一种细小病毒载体产生细胞，其中，

所述细小病毒载体是通过直链状共价闭合DNA得到的表达编码蛋白质的核酸序列的细小病毒载体，

通过定量PCR法定量时的所述编码蛋白质的核酸序列以外的序列的载体基因组数相对于所述编码蛋白质的核酸序列的载体基因组数在所述细小病毒载体产生细胞的培养上清中为10％以下，或者在所述细小病毒载体产生细胞的细胞溶解液中为1％以下。