JP2004500061A - 組換えクローニングにおける独自の選択性を有する複数の組換え部位の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野に関する。具体的には、本発明は、好ましくは、固有の特異性を有する組換え部位を用いて、組換え部位を含む複数の核酸分子を結合することに関する。本発明はまた、組換えクローニング方法を用いて、このような結合した核酸分子をクローニングすることに関する。本発明はまた、複数のペプチドを結合すること、および組換え部位の使用を介するペプチドと核酸分子の連結に関する。他の分子および化合物、または分子および化合物の連結はまた、本発明に従って、組換え部位を介して結合され得る。このようなペプチド、核酸ならびに他の分子および/または化合物(あるいはそれらの組合せ)はまた、本発明に従う1つまたは多くの支持体あるいは構造体に、組換えを介して結合もしくは連結され得る。
【0002】
(関連する分野)
(部位特異的リコンビナーゼ)
部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物(例えば、ウイルスおよび細菌)において存在するタンパク質であり、そしてエンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方の特性を有すると特徴づけられた。これらのリコンビナーゼは、(いくつかの場合において関連タンパク質とともに)核酸分子における塩基の特異的な配列を認識し、そしてこれらのセグメントに隣接する核酸セグメントを交換する。これらのリコンビナーゼおよび関連タンパク質は、総称して、「組換えタンパク質(recombination protein)」と呼ぶ(例えば、以下を参照のこと:Landy,A.,Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993))。
【0003】
種々の生物由来の多くの組換え系は、記載された。例えば、Hoessら、Nuclei Acids Research 14(6):2287(1986);Abremskiら、J.Biol.Chem.261(1):391(1986);Campbell、J.Bacteriol.174(23):7495(1992);Qianら、J.Biol.Chem.267(11):7794(1992);Arakiら、J.Mol.Biol.225(1):25(1992);MaeserおよびKahnman、Mol.Gen.Genet.230:170−176(1991);Espositoら、Nucl.Acids Res.25(18):3605(1997)を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら、EMBO J.5:433−440(1986);Voziyanovら、Nucl.Acids Res.27:930(1999))。これらの最も研究されたものは、おそらく、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系(Landy,A.Current Opinions in Genetics and Devel.3:699−707(1993))、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAbremski(1990)In Nuceleic Acids and Biology、第4巻、編:EcksteinおよびLilley、Berlin−Heidelberg:Springer−Verlag;90頁〜109頁)、ならびにSaccharomyces cerevisiae2μ環(circle)プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell 29:227−234(1982))である。
【0004】
(トランスポゾン)
トランスポゾンは、移動性遺伝エレメントである。トランスポゾンは、構造的に可変性であり、単純または複合体(compound)として記載されるが、代表的に、逆方向に構成されるDNA配列が隣接する転位触媒酵素(トランスポザーゼと呼ばれる)をコードする。トランスポゾンの特性のより詳しい議論について、以下を参照することができる:D.J.Sherratt,編.,Oxford University Press(1995)ならびにMobile DNA,D.E.BergおよびM.M.Howe,編,American Society for Microbiology(1989),Washington,DC。これらの文献は、両方とも、本明細書中で具体的に参考として援用される。
【0005】
トランスポゾンは、標的DNAにDNAを挿入するために使用されている。一般的規則として、トランスポゾンの標的DNAへの挿入は、無作為事象である。この規則の一つの例外は、トランスポゾンTn7の挿入である。トランスポゾンTn7は、それ自体をE.coliゲノムにおける特定の部位へと、その生活環の一部として組み込む(Stellwagen,A.E.,およびCraig,N.L.,Trends in Biochemical Sciences 23:486−490,1998,これは本明細書において具体的に参考として援用される)。この部位特異的な挿入は、バキュロウイルスゲノムを操作するためにインビボで使用されてきた(Lucklowら(J.Virol.67:4566−4579(1993)。これは、本明細書において参考として具体的に援用される)。Tn7のこの部位特異性は、その特徴がアクセプターDNA分子における無作為位置への移動である転位エレメントには型にははまらない。この出願の目的のために、転位(transposition)とは、そうではないと特定しない限り無作為または準無作為の移動をいうが、他方、組換えは、部位特異的な組換え事象をいうために使用される。従って、部位特異的なTn7のatt Tn7部位への挿入は、組換え事象と称されるが、他方、Tn7の無作為挿入は、転位事象と称される。
【0006】
York,ら(Nucleic Acids Research,26(8):1927−1933,(1998))は、Tn5を用いたプラスミド内の分子内転位に基づくネスティングされた(nested)欠失の生成のためのインビトロ方法を開示する。2つの19塩基対Tn5トランスポザーゼ認識配列および標的DNA配列が隣接するカナマイシン耐性遺伝子を含むベクターは、精製されたトランスポザーゼタンパク質の存在下でインビトロでインキュベートされた。使用された低濃度のDNAの条件下で、分子内転位反応が優先し、そしてこれを使用して標的DNAにおけるネスティングされた(nested)欠失のセットが首尾よく生成された。この著者は、認識配列に隣接する3つすべての読み枠に終止シグナルを含めることによって、この系がこの標的DNAによってコードされるタンパク質においてC末端短縮型(truncation)を生成するために使用され得ることを示唆した。さらに、この著者は、Hisタグおよびキナーゼ領域を含めることによって、さらなる分析のためのN末端欠失タンパク質を生成するために使用され得ることを示唆した。
【0007】
Devineら,(Nucleic Acids Research,22:3765−3772(1994)および米国特許第5,677,170号および同第5,843,772号(これらはすべて、本明細書において参考として具体的に援用される)は、インビトロでレシピエントDNA分子へとDNAセグメントを挿入するための人工トランスポゾンの構築を開示する。このシステムは、酵母TY1ウイルス様粒子の挿入触媒酵素を、トランスポザーゼ活性の供給源として利用する。目的のDNAセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様のエレメントTY1の末端の間にクローニングされる。TY1挿入触媒酵素の存在下で、得られるエレメントは、第二の標的DNA分子に無作為に組み込まれる。
【0008】
移動性遺伝エレメントの別のクラスは、インテグロン(integron)である。インテグロンは、通常、可変配列に隣接する5’保存配列および3’保存配列からなる。代表的に、5’保存配列は、インテグラーゼタンパク質のためのコード情報を含む。インテグラーゼタンパク質は、種々のattI、attCを含む組換え部位および他のタイプの部位で、部位特異的組換えを触媒し得る(Franciaら、J.Bacteriology 181(21):6844−6849、1999、および本明細書中で引用される引用文献を参照のこと)。
【0009】
(組換え部位)
上記の反応は、組換え、転移または統合と呼ばれるようと、そしてリコンビナーゼまたはインテグラーゼによって触媒されようと、これらは、特異的な認識配列の主要な特性を共有し、しばしば、反応に関わる核酸分子上の「組換え部位」と呼ばれる。これらの組換え部位は、組み込みおよび組換えの最初の段階の間、組換えタンパク質によって認識および結合される、関与核酸分子における核酸の異なる切片またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼのための組換え部位は、loxPであり、これは、34塩基対配列であり、8塩基対のコア配列に隣接する、2つの13塩基対の反転反復(これは、リコンビナーゼ結合部位として働く)からなる。(Sauer,B.,Curr.Opin.Biotech.5:521−527(1994)の図1を参照のこと。)認識配列の他の例としては、attB、attP、attL、およびattRの配列が挙げられる。これは、組換えタンパク質λ Intにより認識される。attBは、約25塩基対の配列であり、2つの9塩基対コア型Int結合部位および7塩基対重複領域を含むが、他方attPは、約240塩基対配列であり、これは、コア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位ならびに補助的タンパク質のための組み込み宿主因子(IHF)、FISおよび除去酵素(excisionase)(Xis)のための部位を含む。(Landy,Curr.Opin.Biotech.3:699−707(1993)を参照のこと。)
(終止コドンおよびサプレッサーtRNA)
3つのコドンは、遺伝子の末端にシグナルを伝えるために、真核生物と原核生物の両方によって使用される。mRNAに転写される場合、これらのコドンは、以下の配列を有する:UAG(アンバー)、UGA(オパール)およびUAA(オーカー)。ほとんどの環境下では、細胞は、これらのコドンを認識するtRNA分子を含まない。従って、mRNAを翻訳するリボソームがこれらのコドンの1つに到達する場合、リボソームは、RNAを引き止め、そして脱落させ(fall of)し、mRNAの翻訳を終結させる。mRNAからのリボソームの放出は、特定の因子によって媒介される(S.Mottagui−Tabar、NAR 26(11)、2789、1998)。インフレームの終止コドン(TAA、TAGまたはTGA)を有する遺伝子は、通常、ネイティブのカルボキシ末端によってタンパク質をコードする。しかし、サプレッサーtRNAは、アミノ酸の挿入および終止コドンを後の翻訳の継続を引き起こし得る。
【0010】
本来、何が終止コドンであるか認識する変異体tRNA分子は、mRNA分子の翻訳終結を抑制し、そしてサプレッサーtRNAと呼ばれる。多くの子のようなサプレッサーtRNAが発見された。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アンバー終止コドンの翻訳の終結を抑制するsupE、supP、supD、supFおよびsupZサプレッサー、オーカー終止コドンの機能を抑制するsupB、glT、supL、supNおよびsupMサプレッサー、ならびにオパール終止コドンの機能を抑制するglyT、trpTおよびSu−9。一般に、サプレッサーtRNAは、tRNAのアンチコドンループに1以上の変異を含み、これは、tRNAが、終止コドンとして本来機能するコドンと塩基対になることを可能にする。変異体tRNAは、その同族のアミノ酸残基でチャージされ、そして同族のアミノ酸残基は、終止コドンが出会う場合、翻訳ポリペプチド内に挿入される。サプレッサーtRNAのより詳細な議論としては、読者は、Eggertssonら(1988)Microbiological Review 52(3):354−374,およびEngleerg−Kuklaら(1996)Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology、第60章、909頁〜921頁、Neidhardtら編、ASM Press、Washington DCを参照し得る。
【0011】
終結サプレッサーの効率を増強する(すなわち、終止コドンを介する読み合わせ(read through)を増加させる)変異は、同定された。これらとしては、以下が挙げられるが、これらの限定されない:uar遺伝子(prfA遺伝子としても公知)における変異、ups遺伝子における変異、sueA、sueBおよびsueC遺伝子における変異、rpsD(ramA)およびrpsE(spcA)遺伝子における変異、ならびにrplL遺伝子における変異。
【0012】
本来の環境下で、宿主細胞は、終止コドンおよび/または抑制が有効過ぎる場合、健常であると予期される。これは、ゲノム(重要な画分)にある何千もの、または何万もの遺伝子は、3つの終止コドンの1つを天然に有しているからであり;これらの完全な読み合わせ(read−through)は、多くの異常なタンパク質を生じ、これらのタンパク質は、そのカルボキシ末端にさらなるアミノ酸を含む。tRNAを抑制するいくらかのレベルが存在する場合、アミノ酸の取り込みとリボソームの放出との間に競争がある。より高いレベルのtRNAは、より読み合わせを引き起こし得るが、他の因子(例えば、コドン状況(context))が抑制の有効性に影響を与え得る。
【0013】
生物は、本来、tRNAに対する複数の遺伝子を有する。遺伝暗号の重複性(多くのアミノ酸に対する複数のコドン)と組み合わせて、サプレッサーtRNA状態に対する1つのtRNA遺伝子の変異は、高レベルの抑制を引き起こさない。TAA終止コドンは、最も強力であり、そして抑制するのが最も難しい。TGAは、最も脆弱であり、そして天然に(E.coliにおいて)3%の程度までリークする。ATG(アンバー)コドンは、比較的密接(tight)であり、抑制なしで、〜1%の読み取りを有する。さらに、アンバーコドンは、天然に存在するサプレッサー変異体によって、50%のオーダーで、有効性を抑制し得る。
【0014】
抑制は、最近およびバクテリオファージにおいて、数十年の間研究されてきた。さらに、抑制は、酵母、ハエ、植物および他の真核生物(哺乳動物細胞を含む)において公知である。例えば、Caponeら(Molecular andd Cellular Biology 6(9):3059−3067、1986)は、哺乳動物tRNA由来のサプレッサーtRNAは、哺乳動物細胞において終止コドンを抑制するために使用され得ることを示した。セリン27に対するコドンの位置に終止コドンを有するE.coliクロラムフェニコールアセチルトランスファーゼ(cat)遺伝子の複製は、ヒトセリンtRNAをコードする遺伝子(これは、この遺伝子のアンバー、オーカーまたはオパールサプレッサー誘導体を形成するために変異された)と共に哺乳動物細胞へトランスフェクトされた。cat遺伝子の首尾良い発現が観察された。誘導哺乳動物アンバーサプレッサーは、ポリオウイルスのレプリカーゼ遺伝子における変異を抑制するために使用され、そしてサプレッサーを発現するセルラインは、首尾良く使用され、変異したウイルスを増殖した(Sedivyら(1987)Cell 50:379−389)。サプレッサーtRNAによる終止コドンの抑制の有効性に対する状況(context)の影響は、E.coliと比較した場合、哺乳動物細胞において難しいことが示された(Phillips−Honesら(1995)Molecular and Cellular Biology 15(12):6593−6600、Martinら、(1993)Biochemical Society Transactions 21:)。いくつかのヒトの疾患は、必須遺伝子における無意味な変異によって引き起こされるので、遺伝子治療のための抑制の可能性は、長い間認識されてきた(Templeら(1982)Nature 296(5857):537−40)。ジフテリア毒素A遺伝子に導入された単一および2つの無意味な変異の抑制は、毒素遺伝子治療のためのバイナリシステムに基づいて使用された(Robinsonら(1995)Human Gene Therapy 6:137−143)。
【0015】
(従来の核酸クローニング)
核酸セグメントのクローニングは、現在では、多くの研究所における日常の慣用的な仕事として、かつ多くの遺伝的分析における前もって必要な工程として起こる。これらのクローニングの目的は、多様であるが、2つの一般的な目的が、考慮され得る:(1)比較的少量の公知のベクター(例えば、pUC、pGem、pBlueScript)で行われる、大きなDNAまたはRNAセグメント(染色体、YAC、PCRフラグメント、mRNAなど)からの核酸の最初のクローニング、および(2)これらの核酸セグメントの機能的分析のために特殊化されたベクターへのサブクローニング。多量の時間および努力が、最初のクローニングベクターからより特殊化されたベクターへの核酸セグメントの移入において、両方とも費やされる。この移入は、サブクローニングと呼ばれる。
【0016】
クローニングのための基本的な方法は、長年の間公知であり、そしてその間にほとんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは、以下のようである:
(1)目的のDNAを1つまたは2つの制限酵素を用いて消化する;
(2)既知である場合、目的のDNAセグメントをゲル精製する;
(3)適切な場合、適切な制限酵素を用いる切断、アルカリホスファターゼを用いる処理、ゲル精製などによりベクターを調製する;
(4)切断されず、かつ自己連結したベクターのバックグラウンドを削除するための適切なコントロールとともに、核酸セグメントをベクターに連結する;
(5)生じたベクターをE.coli宿主細胞に導入する;
(6)選択されたコロニーを取り、そして小さい培養物を一晩増殖させる;
(7)DNAミニプレップ(miniprep)を作製する;そして
(8)アガロースゲルでか(しばしば診断的な制限酵素消化の後に)またはPCRにより単離されたプラスミドを分析する。
【0017】
核酸セグメントのサブクローニングのために使用される特殊化ベクターは、機能的に多様である。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない:種々の生物において核酸分子を発現するためのベクター;核酸分子の発現を調節するためのベクター;タンパク質精製において補助するためのタグまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可能にするためのタグを提供するためのベクター;クローン化されたDNAセグメントを改変する(例えば、欠失を生成する)ためのベクター;プローブ(例えば、リボプローブ)の合成のためのベクター;DNA配列決定のためのテンプレートの調製のためのベクター;タンパク質コード領域の同定のためのベクター;種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクター;目的のDNAを大量に提供するためのベクターなど。特定の研究が、いくつかの異なる特殊化ベクターへ目的の核酸セグメントをサブクローニングすることを含むということは一般的である。
【0018】
当該分野で公知のように、単純なサブクローニングは、1日で行われ得る(例えば、核酸セグメントは、大きくなく、そして制限部位がサブクローニングベクターの制限部位と適合性である)。しかし、多くの他のサブクローニング(特に未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング)は、数週間かかり得る。最も退屈で時間を費やす型のサブクローニングの1つとしては、所望のクローンを構築するために、ベクターにいくつかの核酸セグメントを引き続いて添加することが挙げられる。この型のクローニングの1つの例は、遺伝子ターゲティングベクターの構築における。遺伝子ターゲティングベクターは、代表的に、2つの核酸セグメントを含み、各々は、その標的遺伝子の一部分と同じで、選択可能なマーカーに隣接する。このようなベクターを構築するために、各セグメントを、連続的にクローニングすることが必要であり得る(すなわち、最初に標的遺伝子の1つの遺伝子フラグメントが、次いで選択可能マーカーが、そしてそれから第2のフラグメントが、ベクターに挿入される)。これは、クローニングされる各フラグメントに対して、多くの消化、精製、連結および単離の工程を要し得る。従って、核酸フラグメントのサブクローニングは、しばしばできるだけ少ない回数で行われるべき面倒な仕事とみなされる。
【0019】
核酸セグメントのクローニングを容易にするためのいくつかの方法は、例えば、以下の参考文献に記載されている。
【0020】
Ferguson,J.ら,Gene 16:191(1981)は、酵母核酸のフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開示する。これらのベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母核酸セグメントのクローンは、部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクターに連結され得る。元々のクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を伝達する場合、選択性はカナマイシンに対するため、形質転換の前に精製は全く必要無い。
【0021】
Hashimoto−Gotoh,Tら、Gene 41:125(1986)は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内の独特のクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示し;ストレプトマイシン耐性宿主において、優性感受性遺伝子におけるインサートまたは欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択に耐える。
【0022】
これらの方法によって提供される改善点にもかかわらず、制限酵素および連結酵素を用いる伝統的なサブクローニングは、時間がかかり、おそして比較的信頼できない。かなりの骨折りがなされ、そして2日以上後には、所望のサブクローンは、候補プラスミドの間に見出され得ない場合、全体のプロセスは、試みられた代替の条件で繰り返さなければならない。
【0023】
(組換えクローニング)
規定された組換え部位で組換えを利用するクローニングシステムは、上に列挙する関連適用において、および米国出願第09/177,387号(1998年10月23日出願);米国出願第09/517,466号(2000年3月2日出願);ならびに米国出願第5,888,732号および同6,143,557号(これらは、全て、具体的に本明細書中で参考として援用される)において以前に記載された。簡潔に言うと、BATEWAYTM Cloning System(これは、本出願および関連出願の節で言及される出願において記載される)は、インビボまたはインビトロで所望の核酸分子をクローニングするために、少なくとも1つの組換え部位を含むベクターを利用する。より具体的には、このシステムは、バクテリオファージλ系に基づく少なくとも2つの異なる部位特異的組換え部位(例えば、att1およびatt2(これは野生型(att0)部位から変異される))を含むベクターを利用する。各変異した部位は、同じ型その同族のパートナーatt部位(すなわち、その結合パートナー組換え部位)に対して固有の特異性を有し(例えば、attP1を有するattB1、またはattR1を有するattL1部位)、そして他の変異型の組換え部位または野生型att0部位と相互反応しない。異なる部位特異性は、所望の分子の指向性クローニングまたは連結を可能にし、従って、クローニングされた分子の所望の配向を提供する。組換え部位が隣接する核酸フラグメントは、レシピエントプラスミド分子(時々、Destination Vectorと呼ばれる)のatt部位が隣接する検出可能なマーカー(例えば、ccdB)を交換することによって、GATEWAYTMシステムを用いてクローニングおよびサブクローニングされる。次いで、所望のクローンは、ccdB選択性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーに対するポジティブ選択によって選択される。ネガティブ選択のための同様なストラテジー(例えば、毒素遺伝子の使用)は、哺乳動物および昆虫におけるチミジンキナーゼ(TK)のような他の生物において使用され得る。
【0024】
att部位のコア領域において特定の残基を変異させることは、多くの異なるatt部位を生じ得る。GATEWAYTMにおいて利用されるatt1およびatt2部位と同様に、さらなる変異は各々、同じ変異を保有する同族のパートナーatt部位とのみ組換えされ、そして他の変異体または野生型att部位と相互反応しない固有の特異性を有する新規のatt部位を潜在的に生成する。新規の変異指したatt部位(例えば、attB 1−10、attP 1−10、attR 1−10およびattL 1−10)は、以前の特許出願番号09/517,466号(2000年3月2日に出願)において記載され、これは、本明細書中で参考として具体的に援用される。固有の特異性を有する他の組換え部位(すなわち、第1の部位は、その対応する部位と組換えをし、そして異なる特異性を有する第2の部位とは組換えしないか、または実質的には組換えしない)は、本発明を実施するために使用され得る。適切な組換え部位の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:loxP部位;loxp部位変異体、改変体または誘導体(例えば、loxP511)(米国特許第5,851,808号を参照);frt部位;frt部位変異体、改変体または誘導体;dif部位;dif部位変異体、改変体または誘導体;psi部位;psi部位変異体、改変体または誘導体;cer部位;およびcer部位変異体、改変体または誘導体。本発明は、複数の核酸分子またはセグメントを結合あるいは連結するために、そしてより具体的には、このような複数(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200など)のセグメントを、1以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200など)の組換え部位を含む1以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12など)のベクター(例えば、Destination Vectorを含む任意のGATEWAYTM Vector)にクローニングするために、このような組換え部位を用いる新規な方法を提供する。
【0025】
(発明の簡単な要旨)
本発明は、通常、組換え部位(その部位の少なくとも1つは、各分子またはセグメント上に存在する)間の組換え反応によって、2以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200など)の核酸のセグメントまたは分子を結合または連結するための材料および方法を提供する。本発明に従って、複数の核酸分子を結合するためのこのような組換え反応は、インビボ(例えば、細胞、組織あるいは生物内)またはインビトロ(例えば、細胞遊離(cell−free)系)で行われ得る。従って、本発明は、核酸分子の新規または固有な組合せを生成するための方法に関し、そしてこのような方法によって作製された核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含む宿主および宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関し、そして本発明を実行するための組成物および本発明の方法を実行する間に作製される組成物に関する。
【0026】
本発明の方法によって作製される核酸分子は、当業者に公知の任意の目的のために使用され得る。例えば、本発明の核酸分子は、核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドを発現するために使用され得、そして本発明の方法によって結合される異なる配列を発現することによって新規の融合タンパク質を作製するために使用され得る。このような発現は、細胞において、または周知のインビトロ発現/転写系を用いることによって、達成され得る。1つの局面において、本発明の方法によって結合されるべき少なくとも1つ(そして好ましくは2以上)の核酸分子またはセグメントは、少なくとも2つの組換え部位を含むが、各分子は、複数の組換え部位を含み得る(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)。このような組換え部位(これは、同じでよく、または異なってもよい)は、各核酸分子またはセグメントの種々の位置に配置され得、そして本発明において使用される核酸は、種々のサイズを有し得、そして環状、高次コイル状、線状などを含む異なる形態であり得る。本発明において使用される核酸分子はまた、この分子が宿主細胞においてベクターとして機能することを可能にする1以上のベクターまたは1以上の配列を含み得る(例えば、複製の起点)。本発明の核酸分子はまた、構造的または他の非表現機能を果たす非コードセグメント(例えば、イントロンセグメント、未翻訳セグメントまたは他のセグメント)を含み得る。
【0027】
好ましい局面において、本発明における使用のための核酸分子またはセグメントは、その分子の少なくとも1つの末端またはその近くに、少なくとも1つの組換え部位を有する線状分子であり、そして好ましくは、その分子の両方の末端またはその近くに少なくとも1つの組換え部位を含む。別の好ましい局面において、複数の組換え部位が目的の核酸分子上に配置される場合、このような部位は、その分子上でお互いに実質的には組換えしないか、または組換えしない。この実施形態において、対応する結合パートナー組換え部位は、好ましくは、本発明の方法によって結合または連結されるべき1以上の他の核酸分子上に位置する。例えば、本発明で使用される第1の核酸分子は、少なくとも第1の組換え部位および第2の組換え部位を含み得、そして第2の核酸分子は、少なくとも第3の組換え部位および第4の組換え部位を含み得、ここで、第1の部位および第2の部位は、お互いに組換えせず、そして第3の部位および第4の部位は、お互いに組換えしないが、第1の部位および第3の部位および/または第2の部位および第4の部位は組換えし得る。
【0028】
本発明の方法によって結合されるべき核酸分子(すなわち、「開始分子」)は、開始分子の全てまたは一部分を含む1以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、75、100、200など)のハイブリッド分子(例えば、「産物核酸分子」)を産生するために使用され得る。開始分子は、任意の供給源に由来するか、任意の方法によって産生される任意の核酸分子であり得る。このような分子は、天然の供給源(例えば、細胞(例えば、細菌細胞のような原核生物細胞、真菌細胞(例えば、酵母細胞)のような真核生物細胞、植物細胞、動物細胞(例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞など)、ウイルス、組織、任意の動物または非動物供給源由来の器官および生物)に由来し得るか、もしくは、非天然(例えば、誘導核酸)であり得るか、あるいは合成的に由来され得る。このような分子はまた、原核細胞および真核細胞ベクター、プラスミド、組込み配列(例えば、トランスポゾン)、ファージまたはウイルスベクター、ファージミド、コスミドなどを含み得る。本発明における使用のためのセグメントまたは分子は、PCRによる増幅、天然の供給源からの単離、化学合成、より大きな核酸分子(例えば、ゲノムまたはcDNA)の剪断または制限消化、転写、逆方向転写などが挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の手法によって産生され得、そして組換え部位は、組換え部位を含むアダプターの連結、組換え部位を含むアダプターのトポイソメラーゼとの連結、組換え部位を含むアダプタープライマーのトポイソメラーゼとの連結、組換え部位を含むプライマーを用いる増幅または核酸合成、組換え部位を含む核酸分子(例えば、トランスポゾンまたは組込み配列)の挿入または組込みなどが挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の手法によってこのような分子に加えられ得る。好ましい局面において、本発明において使用される核酸分子は、核酸ライブラリーまたはcDNAライブラリーのような分子集団である。
【0029】
本発明における使用のための組換え部位は、1以上の組換えタンパク質によって媒介されるかまたは触媒される組換え反応に関わる核酸分子上の任意の認識配列であり得る.1より多い(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の組換え部位を利用する本発明のこのような実施形態において、このような組換え部位は、同じであってもよく、または異っていてもよく、そしてお互いに組換えしてもよく、あるいはお互いに組換えしないか、または実質的には組換えしなくてもよい。本発明によって熟考される組換え部位はまた、野生型または天然に存在する組換え部位の変異体、誘導体または改変体を含む。好ましい組換え部位改変としては、組換えを増強するものが挙げられ、このような増強は、以下からなる群から選択される:実質的に(i)組込み組換えを支持すること;(ii)切除(excisive)組換えを支持すること;(iii)宿主因子についての要件を軽減すること;(iv)共統合または産物形成の有効性を向上させること;および(v)共統合または産物形成の特異性を向上させること。
【0030】
組換え部位への好ましい改変としては、組換え特異性を増強するもの、1以上の終止コドンを除去するもの、および/またはヘアピン(hair−pin)形成を避けるものが挙げられる。所望の改変はまた、改変された組換え部位にわたって翻訳または転写が起こる場合、転写または翻訳産物(例えば、mRNAまたはタンパク質)についての所望のアミノ酸変化を含むため、組換え部位に対してなされ得る。本発明に従って使用される好ましい組換え部位としては、att部位、frt部位、dif部位、psi部位、cer部位、およびlox部位あるいはそれらの変異体、誘導体および改変体(またはそれらの組換え体)が挙げられる。本発明によって熟考される組換え部位はまた、このような組換え部位の部分を含む。使用される組換え部位特異性に依存して、本発明は、連結した分子の所望の配向を提供するために、核酸分子の指向性結合、または結合した分子の無作為な配向を生成するために、非指向性結合を可能とする。
【0031】
特定の実施形態において、化合物においてお互いに組換えし、そして本発明の方法において使用される組換え部位は、同一の7つの塩基対重複領域を有するatt部位を含む。本発明の特定の実施形態において、これらの7つの塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドは、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む:
【0032】
【数1】
各開始核酸分子は、1以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)に加えて、種々の配列(またはそれらの組合せ)を含み得、これは、以下が挙げられるが、これらに限定されない:プライマー部位としての使用に適切な配列(例えば、配列決定プライマーまたは増幅プライマーのようなプライマーが、核酸合成、増幅または配列決定を開始するためにハイブリダイズされ得る配列)、転写または翻訳シグナルあるいは調節配列(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)、リボソーム結合部位、Kozak配列、開始コドン、転写および/または翻訳終止シグナル(例えば、終止コドン)(これは、1以上のサプレッサーtRNA分子によって最適に抑制され得る)、複製の起点、選択可能なマーカー、およびタンパク質融合(例えば、N末端またはカルボキシ末端)を作製するために使用され得る遺伝子または遺伝子の部分(例えば、グルタチオンS−tランスフェラーゼ(GST)、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ヒスチジンタグ(HIS6)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YEP)、シアン蛍光タンパク質(BFP)、読み取り枠(ORF)配列、および相同組換えにおける使用のため(例えば、遺伝子ターゲティングにおける使用のため)の配列を含む、種々の分子生物学技術において所望され得るかまたは使用され得る目的の任意の他の配列。
【0033】
1つの局面において、本発明は、(a) 1つ以上の組換え部位を包含する少なくとも1つの標的核酸分子を有する1つ以上の組換え部位を包含する少なくとも第1の集団を混合する工程;そして(b)少なくとも第1の集団の幾つかのまたは全ての標的核酸分子を、全てのまたは幾つかの標的核酸分子と組換えさせる工程、その結果、ハイブリッド核酸分子の集団を形成する工程、を包含するハイブリッド核酸分子の集団を産生するための方法を提供する。上述の方法のある特定の実施形態において、この組換えは、ハイブリッド核酸分子を産生する組換えを支持する条件下で、核酸分子に第一の集団および1つ以上の組換えタンパク質を有する標的核酸の混合によって起こされる。他の特定の実施形態において、本発明は、1つ以上の組換え部位を包含する核酸分子の少なくとも第2の集団を有するハイブリッド核酸分子を混合する工程をさらに包含し、産生核酸分子の第2の集団を産生する。あるいは、第1の集団、第2の集団および標的核酸分子は、組換えを通じてハイブリッド集団を形成するために一緒に混合され得る。さらなる特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、上述の方法によって、産生されるハイブリッド核酸分子の集団を選択する工程を包含する。なおさらなる特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、核酸分子の第1の集団に対して、標的核酸分子に対しておよび/または核酸分子の第2の集団に対して、ハイブリッド核酸分子の集団を選択する工程を包含する。
【0034】
関連する実施形態において、本発明は、第1の組換え部位を包含する第1の核酸セグメント、第2および第3の組換え部位を包含する第2の核酸セグメントならびに第4の組換え部位を包含する第3の核酸セグメントの組換えのための方法を提供する。ここで、第1の、第2のまたは第3の核酸セグメントは、同一の核酸セグメントまたは核酸分子の集団であり得る、その結果、組換えは、第1、第2および第3の核酸セグメントを包含する閉環産物または開環産物を産生する。さらに、組換え産物のメンバーは、オリゴヌクレオチドを使用して増幅され得る。このオリゴヌクレオチドは、組換え部位を含むかまたは含まないかのいずれかで、そして第1の核酸セグメントまたは第2の核酸セグメントと同質かまたは異質である。従って、例えば、第1の核酸セグメントおよび第3の核酸セグメントに対して特異的なプライマーを使用する増幅の実行によって、第1−第2−第3のハイブリッド分子を包含する産生物は、増幅され得る。ここで、他の所望の分子(例えば、第1−第2ハイブリッド分子を包含する産生物)は増幅されない。このようにして、増幅は、所望の産生物のためにおよび所望しない産生物に対する選択に使用され得る。このような増幅は、任意の所望の産生物または組換え反応の中間体の選択のために設計され得る。例えば、4つの異なる分子(例えば、A、B、CおよびD)は、結合され得、そして種々の中間体産生物は、所望の産生物(例えば、A−B−Cが、増幅される場合、分子Aおよび分子Cに対応するプライマー、そしてA−Bが増幅された場合、AおよびBである)を増幅するために設計されたプライマーを使用して選択され得る(A−B−C)。次いで、この得られた増幅産生物は、クローンされ得る。関連する実施形態において、この上記のプロセスは、2つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10,11,12,13,14など)の核酸セグメントを使用して実行され得る。
【0035】
別の局面において、本発明は、(a) 1つ以上の組換え部位を包含する核酸分子の少なくとも第1の集団を、1つ以上の組換え部位を包含する核酸分子の少なくとも第2の集団と混合する工程;そして(b) 少なくとも第1の集団の幾つかのまたは全ての核酸分子を、少なくとも第2の集団の幾つかのまたは全ての核酸分子と組換えさせる工程、その結果、ハイブリッド核酸分子の1つ以上の集団を形成する工程、を包含するハイブリッド核酸分子の集団の産生方法を提供する。上述の方法のある特定の実施形態において、組換えは、これらの組換えを支持する条件下で、核酸分子の第1の集団および核酸分子の第2の集団と、1つ以上の組換えタンパク質との混合によって起きる。他の特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、核酸分子の第1の集団および核酸分子の第2の集団を、1つ以上の組換え部位を包含する核酸分子の少なくとも第3の集団と混合する工程を包含する。さらなる他の特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、ハイブリッド核酸分子の集団を選択する工程を包含する。なお他の特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、ハイブリッド核酸分子の集団ならびに核酸分子の第1、第2および/または第3の集団を選択する工程を包含する。さらなる特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、融合分子および/または副産分子に対して選択する工程を包含する。
【0036】
本発明は、さらに、上述の方法によって産生されたハイブリッド核酸分子の集団およびハイブリッド核酸分子の上記集団を包含する組換え宿主細胞の集団を包含する。
【0037】
ある実施形態において、本発明の実施において使用された組換えタンパク質は、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3 resolvase、TndX、XerC、XerDおよびΦC31からなる群から選択された1つ以上のタンパク質を含む。特定の実施形態において、この組換え部位は、lox部位;psi部位;dif部位;cer部位;frt部位;att部位ならびに変異体(mutants)、変異体(variants)、および組換えを起こすための能力を保持するこれら組換え部位の誘導体からなる群から選択された1つ以上の組換え部位を含む。
【0038】
特定の局面において、本発明は、1つ以上の停止コドンの抑制によって融合タンパク質の制御された発現を可能にする。本発明に従えって、本発明によって結合された1つ以上の開始コドン(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12など)は、1つ以上の停止コドンを含み得る、この停止コドンは、次の結合された開始コドンを通じて、第1の開始コドンからの発現を可能にするために抑制し得る。例えば、本発明によって結合される第1−第2−第3の開始コドン(このような第1および第2の分子のそれぞれが、停止コドンを含む場合)は、それぞれの停止コドンの抑制によって、結合された分子によってコードされた3つからなる融合タンパク質を発現し得る。さらに、本発明は、選択された停止コドンの抑制の改変によって選択的なまたは制御された融合タンパク質発現を可能にする。従って、第1−第2−第3の分子の第2と第3の分子との間ではなく、第1と第2の分子との間の停止コドンの抑制によって、第1の分子および第2の分子によってコードされた融合タンパク質が、3つからなる融合よりむしろ産生され得る。従って、異なる停止コドンおよび抑制の可変制御の使用は、種々の融合タンパク質の産生または目的の結合された開始核酸分子の全てのまたは異なる部分によって、コードされるその部分の産生を可能にする。1つの局面において、停止コドンは、開始核酸分子内か、または開始分子によって含まれる組換え部位内のどこかに含まれ得る。好ましくは、このような停止コドンは、分子内に内部的に含まれ得るが、このような停止コドンは、目的の開始分子の末端か、その近くに位置する。別の局面において、1つ以上の開始核酸分子は、目的の標的遺伝子またはオープンリーディングフレームの全てまたは部分のコード配列を含み得る。ここで、このコード配列は、停止コドンに続く。次いで、停止コドンは、第2の開始分子の結合を可能にする組換え部位に続き得る。この型の幾つかの実施形態において、停止コドンは、必要ならば、サプレッサーtRNA分子によって抑制され得る。サプレッサーtRNA分子をコードする遺伝子は、目的の標的遺伝子を含む同じベクターにおいて、異なるベクターにおいて、またはコード配列を含むベクターが、挿入された宿主細胞の染色体において提供され得る。幾つかの実施形態において、サプレッサーtRNAの1つ以上のコピー(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50などのコピー)は、提供され得る。幾つかの実施形態において、サプレッサーtRNAの転写物は、制御可能な(例えば、誘導可能な、または制止可能な)プロモーターの制御下であり得る。
【0039】
1つの局面において、従って、本発明は、1つ以上の融合タンパク質(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、30、50など)の発現の以下を包含する方法に関連する:
(a) 少なくとも1つの組換え部位および少なくとも1つの停止コドン(好ましくは、組換え部位および/または停止コドンは、その第1の核酸分子の終端(単数または複数)に、またはその近くに位置する)を包含する少なくとも第1の核酸分子、および少なくとも1つ組換え部位(これは、好ましくは、その第2の核酸分子の終端(単数または複数)に、またはその近くに位置する)を包含する第2の核酸分子を得る工程;
(b) その第1のおよび第2の核酸分子を、その組換え部位の組換えを通じて、組換えさせる工程、その結果、その少なくとも1つの停止コドンおよびその第1のおよび第2の核酸分子のすべてまたは一部を包含する第3の核酸分子を産生する工程、ついで、
(c) その第3の分子にコードされた1つ以上のペプチドまたはタンパク質(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を発現する工程、一方で、その1つ以上の停止コドンを抑制する工程。
【0040】
さらに、本明細書中に記載の組換え部位(例えば、種々の組換え特異性を有する組換え部位)は、1、2、またはすべてのスリーホワードリーディングフレームまたはリバースリーディングフレームにおいて停止コドンを含み得る。このような終止コドンは、上述のように抑制され得る。さらに、適切な実施例において、このような組換え部位は、1、2、および/またはすべてのスリーホワードリーディングフレームおよび/またはリバースリーディングフレームにおける停止コドンを除去するように設計され得る。
【0041】
別の局面において、本発明は、以下を包含するタンパク質を合成する方法を提供する、(a)停止コドンに続くコード配列を含む少なくとも第1の核酸分子を提供する工程;(b)必要であれば、停止コドンに続くコード配列を含む少なくとも第2の核酸分子を提供する工程;(c)組換えを起こす工程、その結果、核酸分子は、結合される;(d)フレーム内に結合された2つのコード配列を改変型ベクターを産生するため、ベクターにその結合された核酸分子を挿入する工程;(e)改変型ベクターを有するサプレッサーtRNAを発現する宿主細胞に形質転換する工程;そして(f)2つのコード配列の発現を起こす工程、その結果、コード配列の両方の少なくとも一部にコードされる融合タンパク質が産生される、ここで、(a)および(b)の核酸分子は、少なくとも1つの組換え部位によってそれぞれ隣接される。さらに、融合された核酸分子またはベクターは、少なくとも1つの抑制可能な停止コドン(例えば、amberコドン、opelコドン、および/またはochreコドン)を含み得る。さらに、第1のかまたは第2のいずれかの核酸分子は、すでに、上述の方法の出願の前にベクターに存在し得る。本発明の特定の実施形態において、ベクターおよび/または宿主細胞は、少なくとも1つのサプレッサーtRNA分子をコードする遺伝子を含む。他の特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに宿主細胞に、少なくとも1つのサプレッサーtRNA分子をコードする遺伝子を含む核酸分子を形質転換する工程を含む。なお他の特定の実施形態において、融合タンパク質は、少なくともベクターの一部をコードするN−またはC−末端標識(例えば、グルタチオン S−トランスフェラーゼ、βーグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、藍色蛍光タンパク質、マルト−ス結合タンパク質、6−ヒスチジン標識、エピトープ標識など)を含み得る。
【0042】
本発明は、1つ以上の融合タンパク質(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、30、50など)の発現の以下を包含する方法に関連する:
(a) 少なくとも1つの組換え部位および少なくとも1つの停止コドン(好ましくは、組換え部位は、その第1の核酸分子の終端(単数または複数)に、またはその近くに位置する)を包含する少なくとも第1の核酸分子、および少なくとも1つ組換え部位(これは、好ましくは、その第2の核酸分子の終端(単数または複数)に、またはその近くに位置する)を包含する第2の核酸分子を得る工程;
(b) その第1のおよび第2の核酸分子を、その組換え部位の組換えを通じて、組換えさせる工程、その結果、その少なくとも1つの停止コドンおよびその第1のおよび第2の核酸分子のすべてまたは一部を包含する第3の核酸分子を産生する肯定;ついで、
(c) その第3の核酸分子にコードされた1つ以上のペプチドまたはタンパク質(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を発現する工程。このようなある実施形態において、発現された融合タンパク質の少なくとも一部は、第3の核酸分子によってコードされ、そして、少なくとも別の部分は、第1のおよび/または第2の核酸分子の少なくとも一部によってコードされ得る。このような融合タンパク質は、核酸の翻訳によって産生され得る。これは、第1の核酸分子と第2の核酸分子との間に位置する組換え部位に対応する。従って、融合タンパク質は、2つ以上の核酸セグメントを結合して使用される組換え部位に対応する「リーディングスルー」mRNAによって発現され得る。本発明は、さらに、本発明の方法およびこのような融合タンパク質をコードするmRNAおよび本発明の方法によって生産される融合タンパク質を含む。
【0043】
より詳細に以下に議論されるように、上で議論される方法は、異なる核酸セグメントによってコードされる融合タンパク質およびこのような融合タンパク質をコードする核酸分子の用意に使用され得る。従って、1つの一般的な局面において、本発明は、2つ以上の核酸セグメントの結合によって産生される核酸分子の発現によって用意された融合タンパク質の産生のための方法を提供する。関連する実施形態において、本発明は、2つ以上の核酸セグメントの結合のよって産生される核酸分子の発現によって用意される融合RNAの産生のための方法を提供する。これらのRNAは、mRNAであり得、または、機能をコードするタンパク質以外に活性を有する非翻訳RNAであり得る。このようなRNAの例として、リボエンザイムおよびtRNAが挙げられる。本発明は、さらに、本発明の方法によって産生された核酸分子、これら発現産生物の産生のための方法、これら核酸分子を含む組換え宿主細胞およびこれら宿主細胞を作製するための方法を提供する。より詳細に以下に議論されるように、本発明は、さらに、核酸分子および特定の活性または機能を持つ発現産生物を同定するためのスクリーニングされ得るコンビナトリアルライブラリーを提供する。
【0044】
1つの特定の局面において、本発明は、2つの核酸分子またはその部分(これらそれぞれは、少なくとも1つの組換え部位を含む)を、1つの核酸分子において存在する組換え部位と、他の核酸分子において存在する組換え部位とを組換えさせる条件下で分子をインキュベートすることによって、1つ以上の産生核酸分子に結合するための方法および材料を提供する。この組換え部位は、好ましくは、開始核酸分子の末端か、またはその近くに位置する。従って、開始分子を有する組換え部位の位置に依存して、作製された産生分子は、組換え部位(これは、好ましくは、新しい組換え部位である)によって結合された第1のおよび第2の開始分子の全てかまたは部分を含む。例えば、attB1組換え部位とattP1組換え部位との間の組換えは、attL1組換え部位および/またはattR1の産生に起因する。
【0045】
別の特定の局面において、本発明は、2つ以上の核酸分子(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を、1つ以上の産生核酸分子(1、2、3、4、5、7、10、12など)と結合するための材料および方法を提供する。ここで、各開始核酸分子は、少なくとも1つの組換え部位を有し、少なくとも開始核酸分子の中の1つは、少なくとも2つに組換え部位を有する。組換え部位は、好ましくは、開始核酸分子の末端か、その近くに位置される。従って、本発明は、少なくとも2つの核酸分子の結合の方法を提供する。ここで、少なくとも第1の組換え部位は、少なくとも1つの組換え部位を含み、少なくとも第2の組換え部位は、少なくとも2つ以上のの組換え部位を含む。この分子は、1つ以上の産生分子を作製するために開始分子のすべてまたは部分を組換えに十分な条件下で、少なくとも1つの組換え部位の存在中にインキュベートされる。従って、作製された産生分子は、組換え部位(これは、好ましくは、新しい組換え部位である)によって結合されたそれぞれの開始分子の全てまたは部分を含む。
【0046】
別の特定の局面において、本発明は、少なくとも3つの核酸分子(例えば、2、3、4、5、7、10,12,15,20,30,50など)の結合の方法を提供する。ここで、この分子は、少なくとも1つの組換え部位を有し、そして少なくとも開始分子の中の1つは、少なくとも2つの組換え部位を含む。少なくとも1つの組換えタンパク質の存在下でのこのような分子のインキュベートは、開始分子の全てまたは部分を含む1つ以上の産生分子(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12,15、20,30、50など)を提供する。ここで、各分子は、組換え部位(これは、好ましくは、新しい組換え部位である)によって結合される。
【0047】
別の特定の局面において、本発明は、2つ以上の核酸分子(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12,15、20,30、50など)を結合するための組成物および方法を提供する。少なくともこの核酸分子の2つ(好ましくは、核酸分子のすべて)は、2つ以上の組換え部位を有する。各分子に位置する組換え部位は、好ましくは、開始核酸分子の終端か、またはその近くに位置する。本発明の方法に従って、2つ以上の核酸分子またはその部分は、組換え部位(これは、好ましくは、新しい組換え部位である)によって結合される各開始分子の全てまたは部分を含む1つ以上の産生分子を形成するために組換え反応(少なくとも1つの組換えタンパク質の存在下でインキュベート)によって結合される。
【0048】
別の特定の局面において、本発明は、少なくとも第1、第2および第3の核酸分子の提供を含む少なくとも3つの核酸分子を結合するための組成物および方法を提供する。ここで、第1の核酸分子は少なくとも第1の組換え部位を含み、第2の核酸分子は少なくとも第2のおよび第3の組換え部位を含み、そして第3の核酸分子は少なくとも第4の組換え部位を含む。ここで、第1の組換え部位は、第2の組換え部位の組換えが可能であり、第3の組換え部位は、第4の組換え部位の組換え、および少なくとも1つの組換え反応を行うことが可能である。その結果、第1の組換え部位と第2の組換え部位および第3の組換え部位と第4の組換え部位が、1つ以上のの産生分子を作製するために分子の全てまたは部分の併用によって結合し直す。
【0049】
従って、本発明は、一般に、n個の核酸分子または核酸セグメントの併用の方法に関連する。ここで、nは、1より大きい整数であり(例えば、2、3,4,5,6,7,8,9,10,12、15、18、20,30,40、50など)、n番目の核酸分子または核酸セグメントを通じて1番目を提供する工程(少なくとも2つの組換え部位を有する2からn−1までの各分子および少なくとも1つの組換え部位を有する分子1ならびに分子n(および好ましくは、少なくとも2つの組換え部位を有する分子n)、そして、セグメントまたは分子の全てまたは部分にn番目の分子またはセグメントを通じて各1番目の全てまたは部分を包含する1以上の産生核酸分子を形成するために組換えを起こさせる条件下で、分子またはセグメントを、n番目の分子またはセグメントを通じて各1番目の全てまたは部分を包含する1以上の産生核酸分子にを形成するために組換え1以上の組換えタンパク質(例えば、2、3、4など)と結合させる工程を包含する組換え部位を通じての分子の結合(例えば、第1の分子における第1の組換え部位と5第2の分子における第2の組換え部位との相互作用)は、好ましくは、2つの分子の結合での新しい組換え部位を作製し、そして、各分子が、次の分子に結合する各分子において新しい組換え部位を作製し得る。例えば、各分子が、少なくとも2つ組換え部位を有し、多数の分子(例えば、第1または「x」分子、第2または「y」分子および第3または「z」分子)を結合する場合、組換え部位によって結合されたy:x:zを含むハイブリッド核酸分子を産生するために、x分子における第1の組換え部位は、Y分子における第2の組換え部位と相互作用し、そしてX分子における第2の組換え部位は、Z分子における第1の組換え部位に相互作用する。もちろん、他の組換え現象は、例えば、x:y:z、x:z:y、y:z:x、z:x:yおよび/またはz:y:zあるいは、組換え部位によって結合された、そのフラグメントを含むハイブリッド分子を産生し得る。さらなる分子は、産生分子に位置する1つ以上の組換え部位と、別の分子に位置する少なくとも1つの組換え部位間との組換えによって産生分子に加えられ得る(例えば、z分子における第2の組換え部位と、f分子などにおける第1の組換え部位との相互作用、および/またはy分子における第1の組換え部位と、分子などにおける第2の組換え部位との相互作用)。さらに、y:x:z(または、上記される他の配列)を含むハイブリッド核酸分子は、yおよびzの自由な末端における組換え部位の相互作用によって計算され得る。さらなる開始分子の全てまたは部分は、経時的にまたは同時に起こり得る。
【0050】
例えば、核酸セグメントが、終端(単数または複数)を含む本発明の方法によって結合された場合(これは、組換え部位を含まない)、この終端(単数または複数)は、リガーゼまたはトポイソメラーゼを使用して、同じ核酸セグメントまたは別の核酸分子に結合され得る(例えば、ワクチンウイルストポイソメラーゼ;米国特許第5,766,891号参照のこと、上記の文献は、全て、その全体が参考として本明細書中に援用される)。
【0051】
多重分子の結合に加えて、本発明はまた、産生分子に含まれる1つ以上の分子(またはその組換え体)を交換する手段を提供する。例えば、産生分子を含む任意の1つ以上のn分子は、1つ以上の組換えを含む異なる(m)の全てまたは部分を有する組換えによって交換または置換され得る。従って、1つの実施例において、mは、第1の組換え部位隣接x(例えば、yとzの間の組換え部位)を有するmにおける第1の組換え部位の組換えおよび第2の組換え部位隣接x(例えば、xとzの間の組換え部位)を有するmにおける第2の組換え部位の組換えによって上記のy:x:z分子においてxに交換され、y:m:zをを産生し得る。多重置換または多重交換は、置換されるべき分子内または分子上に1つ以上の組換え部位を有するこのような分子における1つ以上の組換え部位の組換えによって本発明の任意の核酸分子内または核酸分子上に作製され得る。さらに、本発明の産生分子における種々のサイズの1つ以上の欠失(例えば、2、3、4、5、7,10、12など)は、欠失の産生のための目的の分子内に2つ以上の組換え部位の組換えによって達成され得る。例えば、上述のy:x:z(または他のその配列)内に欠失を作製するために、x分子に隣接する組換え部位の組換えは、x分子が欠失されることから新しい分子を作製する;すなわち、その新しい分子は、y:zを含む。従って、多重欠失、多重置換および欠失の置換あるいは目的の分子の種々の部分の置換は、目的の分子内に有向の組換えによって達成され得る。
【0052】
さらに、本発明はまた、1つ以上の分子(またはその組換え体)を産生分子に挿入する手段を提供する。例えば、例示のために上記した分子y:x:zを使用すれば、1つ以上の組換えを含む分子wは、yとxとの間に挿入され、新しい分子:y:w:x:zを作製し得る。1つの特定の実施形態において、分子wは、loxP部位によって隣接され、そして分子wの挿入は、w分子におけるloxP部位とy分子およびx分子において対応するloxP部位との間でのCreリコンビナーゼによって媒介される。当業者が認識するように、上の多数の変異体が、可能であり、本発明の範囲に含まれる。例えば、1つ以上の組換え部位を含む分子oは、yとxとの間に挿入され、開始分子に依存する、y:o:x:zまたはy:o:w:x:zのいずれかを含む新しい分子を形成し得る。本明細書中に記載の方法を使用して、実質的に多数の分子のいずれかに、他の分子を挿入される。さらに、これらの方法を経時的に使用して、例えば、多様な構造を持つ分子を用意し得る。
【0053】
本発明の方法によって産生された産生分子は、開始核酸分子または開始核酸セグメント、分子内における組換え部位の位置および部位の組換えのオダーに依存する、開始分子(またはその部分)の任意の組換えを含み得、そして任意のサイズであり得、ぞして任意の形態(例えば、環状、直鎖状、スーパーコイル状など)内にあり得る。
【0054】
重要なことに、本発明は、核酸分子(公知または非公知)の集団が、目的の1つ以上(2、3、4、5、7、10、12,15,20,30、50など)の公知または非公知の目標配列と、または他の核酸分子(公知または非公知)の集団と組換え得る手段を提供する。その結果、唯一のおよび/または新規な分子(例えば、ハイブリッド分子)からのコンビナトリアル分子(例えば、コンビナトリアルライブラリー)の集団およびこれら分子によってコードされるタンパク質またはペプチドを作製することは、得られ得、そしてさらに分析され得る。
【0055】
好ましい局面において、本発明に従ってコンビナトリアルライブラリーの作製に使用された核酸分子の集団は、少なくとも1つの(および好ましくは2つ以上の)組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10,12など)を有するセグメントまたは分子の集団を含む。このような分子の集団は、好ましくは、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリー(またはその部分)あるいは無作為な核酸、増幅産物(例えば、種々のプライマーで産生されたPCR産物)および結合されたドメイン(同じタンパク質または異なるタンパク質とは、異なるタンパク質ドメインをコードする核酸)から得られ、このような組換え部位を含む。従って、本発明に従って、組換え部位を含む分子の第1の集団は、組換えを通して(有向なおよび/または無作為な配向によって)結合または併用され得る。この組換えは、目的の少なくとも1つの標的配列を、または組換え部位を含む分子も第2の集団を有し、分子の第3の集団またはハイブリッド分子を産生する。
【0056】
本発明に従って、種々のソースからの分子の多重集団は、多重時に併用され、配列の多重組換えを有する分子を含む新しい集団を産生し得る。例えば、第1の集団、第2の集団および第3の集団は、併用され、3つからなる分子(例えば、第1の集団、第2の集団および第3の集団からのセグメントの全てまたは部分を含む第4の集団の分子のいくつかまたは全て)の無作為な集団を含む第4の集団を産生する。
【0057】
好ましい局面において、組み合わせの方法によって、産生された分子(例えば、第3の集合)の新しく産生された集団は、優先的に選択され、そして本来の分子から(例えば、標的分子、ならびに第1および第2の集団分子)ならびに所望の産生分子(例えば、融合物および/または副産物分子)から選択または単離され得る。このような選択は、所望の核酸融合体(診断用プライマーでのPCR)の存在および/または所望の核酸融合体によってコードされるタンパク質の所望の活性の存在のアッセイまたは選択によって達成され得る。このような選択性はまた、陽性選択および/または陰性選択によって達成される。1つ以上の毒性の遺伝子(例えば、2、3、4、5、7、10など)は、好ましくは、このような陰性選択スキームにおいて本発明に従って使用される。
【0058】
所望の融合産物(核酸および/またはタンパク質)および陽性選択および/または陰性選択の組み合わせはまた、本発明において使用され得る。従って、本発明は、リコンビナショナルクローニングおよび挿入ドナー、ベクタードナーおよび融合物または、融合の類似物の集団に対しての選択、挿入ドナー、ベクタードナー、副産物および/または融合体の集団に対する選択および産生分子(図1を参照のこと)の集団に対する選択によって産生された産生分子(またはさらに産生分子の特定のクラスまたは特定の産生分子)の集団を選択するための手段を提供する。
【0059】
図2を参照すると、本発明のリコンビナショナルライブラリー方法において、セグメントAによって提示された本発明の分子の第1の集団は、挿入ドナー分子の1つの集団として提供され得、一方で、セグメントBによって提示された、第2の分子の集団は、挿入ドナー分子に第2の集団を提供され得る。これらのセグメントが線状フラグメントとして、示される一方で、線状フラグメントは、巨大分子内(例えば、プラスミドにおけるセグメント)のセグメントととして提供される。
【0060】
当業者は、この状況において、図1に示される1つ以外の融合体分子が、産生され得ることを理解する。例えば、セグメントA挿入ドナー分子およびセグメントB挿入ドナー分子を含む融合体は、形成され得る。さらに、セグメントA挿入ドナー分子および/またはセグメントB挿入ドナー分子ならびにベクタードナー分子は、形成され得る。本発明の選択方法は、挿入ドナー分子に対する、および種々の融合分子に対するならびに産生分子として参照され得るハイブリッド分子の新しく産生された集団に対する選択を可能にする。逆に、選択方法は、産生物に対しておよび挿入ドナー/ベクタードナー、副産物、および/または融合体に対する選択を可能にする。
【0061】
従って、本発明は、以下:
(a) 1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10,12など)を含む目的の少なくとも1つの標的核酸分子と、1つ以上の組換え部位例えば、2、3、4、5、7、10,12など)を含む核酸分子の第1の集団とを混合する工程;
(b) その少なくとも第1の集団の核酸分子のいくつかまたは全てを、目的のその標的分子のいくつかまたは全てと(好ましくは無作為に)組換えさせる工程、その結果、ハイブリッド分子の第3の集合を形成する工程;そして、
(c) 必要に応じて、ハイブリッド分子のその第3の集合を特異的に選択する工程、
を包含するハイブリッド核酸分子集団を産生するための方法に関連する。
【0062】
本発明に従って、第3の集合によって含まれるハイブリッド分子は、好ましくは、第1の集合から得られた全てまたは部分および標的分子の全てまたは部分を含む。結合される分子における配向は、必要性に依存して、有効な方法または、無作為な方法においてあり得る。
【0063】
1つの局面において、上記のその第3の集団の産生に使用される標的分子は、DNA結合ドメインまたは転写活性化ドメインであり得る。その結果、ハイブリッド分子の第3の集団は、当該分野で公知である2−ハイブリッド法において使用され得る。
【0064】
本発明は、以下:
(a) 1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10,12など)を含む核酸分子の少なくとも第1の集団および1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10,12など)を含む核酸分子の少なくとも第2の集団を得る工程;
(b) その少なくとも第1の集団の分子のいくつかまたは全てを、少なくともその第2の集団の分子のいくつかまたは全てと(好ましくは無作為に)組換えさせる工程、その結果、ハイブリッド分子の第3の集合を形成する工程;そして、
(c) 必要に応じて、ハイブリッド分子のその第3の集合を特異的に選択する工程;
を包含するコンビナトリアル分子の集団の作製の方法により特異的に関連する。
【0065】
本発明に従って、第3の集団によって含まれるハイブリッド分子のそれぞれまたは多くが、好ましくは、第1の集団から得られた分子の全てまたは部分および第2の集団から得られた分子の全てまたは部分を含む。結合された分子の配向は、必要性に依存して、有効な方法または無作為な方法においてあり得る。
【0066】
本発明の組み合わせ方法に従って使用される核酸分子の集団は、合成ライブラリー、ゲノムライブラリー、またはcDNAライブラリー(またはその部分)、ランダム合成配列、または変性オリゴヌクレオチド、ドメインなどを含む。好ましくは、使用される核酸分子の集団は、分子の無作為な集団を含み、それぞれが、互いに、好ましくは、組換えを起こさない少なくとも2つの組換え部位および各分子の両終端かまたはその近くに、好ましくは、位置する少なくとも2つの組換え部位を有する。本発明の方法による分子の集団のランダムリコンビネーションは、有意な配列多様性を有する分子の集団を産生するための強力な技術を提供する。例えば、約106配列を有する第1の集団を、約106配列を有する第2の集団との組換えは、約1012配列を有する第3の集合に起因する。
【0067】
本発明は、ライブラリーメンバーの核酸分子のセグメントが変更されたコンビナトリアルライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法をさらに提供する。このような変更としては、核酸セグメントの変異、シャッフリング、挿入、および/または欠失が挙げられる。詳細には、本発明は、このような変更を有するメンバーを含む核酸ライブラリーを調製するための方法、および既存のライブラリーにおいてこのような変更を誘導するための方法を提供する。関連の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたコンビナトリアルライブラリー、特定の機能または活性を有する発現産物をコードするメンバーを同定するためのこのようなライブラリーのスクリーニング方法、およびこれらのライブラリーの発現産物(例えば、RNA、タンパク質など)を包含する。
【0068】
さらに、上記の局面に関連して、本発明は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、10、15)の核酸セグメントを含む核酸分子の集団を生成するための方法を提供する。この核酸セグメントは同じものであり、そして核酸分子の1つ以上の集団のメンバー由来の1つ以上の核酸セグメントである。このような核酸分子を生成するための方法の1つは、2つの組み換え部位を含むベクターの使用を包含する。特定の機能または活性(例えば、シグナルペプチド活性、DNA結合活性、特定のリガンドに対する親和性など)を有するタンパク質をコードする第一の核酸セグメントを、第一の組み換え部位に挿入し、そして第二の核酸セグメント(核酸分子の集団に由来する)を第二の組み換え部位に挿入する。さらに、これらの核酸セグメントを、転写を調節する配列に作動可能に連結し、これによって融合ペプチドおよびこの融合配列によって生成されるRNA分子を生成する。次いで、得られたコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、特定の機能または活性(例えば、転写活性化活性;DNA結合活性;マルチマー(多量体)を形成する能力;細胞内小区画(例えば、小胞体、核、ミトコンドリア、葉緑体、細胞膜など)への局在化;など)を有する発現産物をコードする核酸分子を同定し得る。3つ以上(例えば、3、4、5、6、8、10など)の核酸セグメントを、上記のような方法において用いる場合、1つ以上の核酸セグメントが、一定に保たれ得、そして1つ以上の核酸セグメントが、核酸分子の1つ以上の集団のメンバーから誘導され得る。例えば、A−B−C−Dと示される、4つの部分の分子を構築するにおいて、AおよびDは、公知の機能を有する公知の分子(例えば、HIS6プロモーター、転写シグナルまたは翻訳シグナル、選択マーカーなどのようなタグ)であり得るが、一方、分子BおよびCは、核酸分子の1つ以上の集団に由来し得る。
【0069】
本発明のいずれの生成分子も、多数の標準的分子生物学技術またはこのような技術の組み合わせにおいて(インビトロまたはインビボで)、さらに操作され、分析されまたは用いられ得る。これらの技術としては、配列決定、増幅、核酸合成、RNA転写物作成(例えば、T7プロモーターまたはSP6プロモーターのようなRNAプロモーターを用いる生成分子の転写を通じて)、タンパク質またはペプチドの発現(例えば、融合タンパク質発現、抗体発現、ホルモン発現など)、タンパク質間相互作用(2−ハイブリッドまたは逆2−ハイブリッド分析)、相同組み換えまたは遺伝子標的、ならびにコンビナトリアルライブラリー分析および操作が挙げられる。本発明はまた、1つ以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のベクターへの本発明の核酸分子のクローニング(好ましくは組み換えによる)、または特定の機能的ベクター配列(例えば、複製起点)の付加による本発明の核酸分子のベクターへの変換に関する。好ましい局面において、組み換えは、インビトロ(例えば、無細胞系で)達成され、そしてさらなる操作または分析が、インビトロで直接実施される。従って、さらなる分析および操作は、本発明の分子を宿主細胞に導入する能力、および/または宿主細胞中で維持される能力によっては制限されない。従って、インビトロにおいて直接本発明の分子をさらに操作するかまたは分析することによって、より短時間かつより高スループットが、達成され得る。あるいは、インビトロ分析または操作は、宿主細胞を通過した後になされ得るか、またはインビボで(例えば、宿主細胞、組織、器官または生物体において)直接なされ得る。
【0070】
本発明による核酸合成工程は、以下を包含する:
(a)目的の核酸分子または核酸テンプレートを、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のプライマーおよび1つ以上(例えば、1、2、3、または4)のヌクレオチドと混合して混合物を形成する工程;ならびに
(b)この混合物を、この分子またはテンプレートの全てまたは一部と相補的な核酸分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程。
【0071】
次いで、合成した分子は、この第1の合成された分子の全てまたは一部に相補的な核酸分子のさらなる合成のためのテンプレートとして用いられ得る。従って、二本鎖核酸分子(例えば、DNA)が調製され得る。好ましくは、このような第二の合成工程は、この第一の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第二の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、1つ以上のプライマーおよび1つ以上のヌクレオチドの存在下で実施される。代表的には、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の核酸分子の合成は、1つ以上のポリメラーゼ(好ましくは、熱安定性であっても中温性であってもよい、DNAポリメラーゼ)の存在下で実施するが、逆転写酵素をまた、このような合成反応において用い得る。従って、さらなる核酸分子の合成のためのテンプレートとして用いられる核酸分子は、RNA、mRNA、DNA、または非中性核酸分子もしくは核酸分子誘導体であり得る。本発明による核酸合成は、生成分子への1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のプライマーセットの組み込みによって促進され得る。この組み込みは、このようなプライマーセットを含む出発核酸分子の使用による。従って、本発明の使用により、プライマーセットは、出発分子内のプライマーセットの位置およびこの生成分子における出発分子の付加の順番に依存して、生成分子中の多数の所望の位置に付加され得る。
【0072】
本発明による配列決定工程は、以下を包含する:
(a)配列決定すべき核酸分子を、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のプライマー、1つ以上(例えば、1、2、3、または4)のヌクレオチド、および1つ以上(例えば、1、2、3、4、または5)の終止剤、と混合して混合物を形成する工程;
(b)この混合物を、配列決定すべきこの分子の全てまたは一部と相補的な分子集団を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程;ならびに
(c)この集団を分離して、配列決定すべきこの分子の全てまたは一部の核酸分子を決定する工程。
【0073】
このような配列決定工程は、好ましくは、1つ以上のポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素)および1つ以上のプライマーの存在下で実施する。配列決定工程のための好ましい終止剤としては、ジデオキシヌクレオチド(ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP、およびそれらの誘導体)のようなヌクレオチド誘導体が挙げられる。本発明による核酸配列決定は、生成分子への1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の配列決定プライマーセットの組み込みによって促進され得る。この組み込みは、このようなプライマーセットを含む出発核酸分子の使用による。従って、本発明の使用により、配列決定プライマーセットは、出発分子内のプライマーセットの位置およびこの生成分子における出発分子の付加の順番に依存して、生成分子中の多数の所望の位置に付加され得る。
【0074】
本発明によるタンパク質発現工程は、以下を包含する:
(a)1つ以上(例えば、1、2、3、または4)のシグナルを含む、発現すべき核酸分子を決定する工程;および
(b)この発現シグナルの制御下でこの核酸分子を全てまたは一部を発現し、これによってこの分子またはその部分によってコードされたペプチドまたはタンパク質を生成する工程。
【0075】
この文脈では、この発現シグナルは、発現されるべき配列に作動可能に連結されていると言ってもよい。発現されたタンパク質またはペプチドは、宿主細胞において(インビボで)発現され得るが、発現は、当該分野で周知の技術を用いてインビトロで(例えば、無細胞発現系で)実施され得る。タンパク質またはペプチドの発現の際、このタンパク質またはペプチド産物は、必要に応じて単離または精製され得る。さらに、発現されたタンパク質またはペプチドは、種々のタンパク質分析技術において用いられ得る。この技術としては、2−ハイブリッド相互作用、タンパク質機能分析、およびアゴニスト/アンタゴニスト−タンパク質相互作用(例えば、薬物、化合物または他のペプチドを通じたタンパク質機能の刺激または阻害)が挙げられる。さらに、発現されたタンパク質またはペプチドをスクリーニングして、特定の生物学的活性を有するものを同定し得る。このような活性の例としては、核酸分子(例えば、DNAまたはRNA)またはタンパク質もしくはペプチドに対する結合親和性が挙げられる。詳細には、発現されたタンパク質またはペプチドをスクリーニングして、他のタンパク質またはそれ自体に対する結合親和性を有するものを同定し得る。それ自体に対する結合親和性を有するタンパク質またはペプチドは、一般に、多量体または凝集物を形成し得る。それ自体および/または他のタンパク質に対して結合親和性を有するタンパク質またはペプチドはしばしば、抗体、スプライスソーム(splicesome)、多サブユニット酵素、リボソームなどのような複数のタンパク質の複合体を形成し得るか、またはその形成に参加し得る。上記の発現されたタンパク質またはペプチド、これらのタンパク質をコードする核酸分子、これらの核酸分子を作成する方法が、これらの核酸分子を含む組み換え宿主細胞を生成する方法、これらの方法によって生成される組み換え宿主細胞、およびこの発現されたタンパク質またはペプチドを生成する方法が、本発明の範囲にさらに含まれる。
【0076】
本発明によって、そして詳細には、本発明のコンビナトリアル分子の発現から生成された、新規かつ特有なハイブリッドタンパク質またはペプチド(例えば、融合タンパク質)は、一般に多数の出願に有用であり得る。より詳細には、当業者が理解するように、本発明のハイブリッドタンパク質またはペプチドは、実際にいずれかの機能を実施するものを同定するように設計および選択され得る。これらのタンパク質が用いられ得る適用の例としては、治療剤、工業的製造(例えば、アミノ酸または炭水化物の微生物合成)、低分子同定および精製(例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる)などが挙げられる。
【0077】
本発明によるタンパク質発現は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、10、12、15、など)の転写シグナルもしくは翻訳シグナル、または調節配列、開始コドン、終止シグナル、スプライスドナー/アクセプター配列(例えば、イントロン配列)などを生成分子に組み込むことによって促進され得る。この組み込みは、このような配列を含む出発核酸分子の使用による。従って、本発明の使用により、発現配列は、出発分子内のこのような配列の位置およびこの生成分子における出発分子の付加の順番に依存して、生成分子中の1または多数の所望の位置に付加され得る。
【0078】
別の局面において、本発明は、核酸分子の間の相同組み換えを実施するための方法を提供する。この方法は、以下を包含する:(a)1つ以上の組み換え部位を含む第一の核酸分子と、少なくとも1つの標的核酸分子と混合する工程であって、ここでこの第一の核酸分子および標的核酸分子は、1つ以上の相同性配列を有する、工程;ならびに(b)この第一の核酸分子および標的核酸分子を、相同組み換えによって組み換えさせる、工程。本発明の特定の実施形態において、本発明の相同組み換え方法は、標的核酸分子にこの第一の核酸分子の全てまたは一部を移入する。本発明の特定の実施形態において、この第一の核酸分子は、この標的核酸分子の配列に相同である2つ以上の配列を含む。他の特定の実施形態において、この第一の核酸分子の相同配列は、少なくとも1つの選択マーカー、および/または1つ以上の組み換え部位に隣接する。さらに他の特定の実施形態において、この第一の核酸分子の相同配列は、組み換え部位に隣接される少なくとも1つの選択マーカーに隣接する。さらなる特定の実施形態において、この第一の相同配列は、転写を調節する核酸セグメントに隣接する。
【0079】
さらに、本発明による相同組み換えは、以下を包含する:
(a)1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、10、12、15、20、30、50など)の組み換え部位を含む本発明の少なくとも第一の核酸分子(これは、好ましくは生成分子である)を、少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、10、12など)の標的核酸分子と混合する工程であって、ここでこの第一の分子および標的分子は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、など)の相同性配列を有する、工程;ならびに
(b)この第一の核酸分子および標的核酸分子を相同組み換えによって組み換えさせる工程。
【0080】
このような相同組み換えは、インビトロ(例えば、無細胞系)で生じ得る、が好ましくは、インビボ(例えば、宿主細胞)で達成される。好ましくは、相同組み換えは、組み換え部位を含む本発明の核酸分子(第一の核酸分子)の全てまたは一部を、相同配列を含む標的核酸分子の1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7など)の位置に移入する。このような相同組み換えの選択を、陽性選択または陰性選択によって促進し、所望の産物について、および/または所望されない産物に対して選択し得る。好ましい局面において、本発明の核酸分子は、少なくとも1つの選択マーカーおよび少なくとも2つの配列(標的分子に相同である)を含む。好ましくは、第一の分子は、少なくとも1つの選択マーカーに隣接する少なくとも2つの相同な配列を含む。
【0081】
従って、本発明は、目的の配列または遺伝子、特に動物(ヒトのような動物を含む)、植物、昆虫、細菌、酵母などのような宿主もしくは宿主細胞内の遺伝子または配列、またはこのような宿主もしくは宿主細胞内のウイルスなどの外来因子の配列を、ノックアウトするかまたは変異する(または既存の配列を変化して、例えば、野生型配列に対して変異配列に変換する)ために用いられ得る、核酸分子を標的する遺伝子またはベクター、の構築を容易にする。このような遺伝子標的化は好ましくは、このような宿主細胞のゲノム上の配列を標的化する工程を包含し得る。このような遺伝子標的化は、インビトロ(例えば、無細胞系)またはインビボ(例えば、宿主細胞)において実施され得る。従って、好ましい局面において、本発明は、ヌクレオチド配列または遺伝子を標的化または変異する方法に関し、この方法は、以下:
(a)1つ以上の組み換え部位(そして好ましくは、1つ以上の選択マーカー)を含む、本発明の少なくとも1つの核酸分子を獲得する工程であって、ここでこの分子は、本発明の分子上に、標的遺伝子または目的のヌクレオチド配列に相同な1つ以上のヌクレオチド配列(この1つ以上の相同な配列は、好ましくは1つ以上の、例えば、1、2、3、4、5、7、10などの選択マーカーに隣接する)を含む、工程;ならびに
(b)この標的ヌクレオチド配列または目的の遺伝子と本発明のこの分子との間の1つ以上の、例えば、1、2、3、4、5、7、10などの部位で相同組み換えを生じるのに十分な条件下で、この分子を1つ以上の標的遺伝子または目的のヌクレオチド配列(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)と接触させて、これによりこの標的ヌクレオチドまたは遺伝子内の本発明の分子の全てまたは一部の挿入を生じさせる工程、
を包含する。
【0082】
このような標的化方法は、標的核酸または遺伝子の欠失、活性化、不活化、部分的不活化、または部分的活性化を生じ得、その結果、標的核酸または遺伝子によって正常に発現された発現産物(代表的にはタンパク質またはペプチド)は、生成されないか、またはより高いレベルもしくはより低いレベルで生成されるか、あるいは多少の活性を生じるかまたは不活性なもしくは部分的に不活性な発現産物を生じ得る変更されたタンパク質配列を有する。好ましくは、本発明の分子上に存在する選択可能マーカーは、相同組み換え事象が首尾よい候補物(例えば、宿主細胞)の選択を容易にする。従って、本発明は、本発明の標的方法により生成される改変された核酸分子または遺伝子を含む、宿主細胞、組織、器官および動物(例えば、トランスジェニック動物)を生成するための方法を提供する。この改変された核酸または遺伝子は、好ましくは、本発明の核酸分子によって提供される少なくとも1つの組み換え部位、および/または少なくとも1つの選択マーカーを含む。
【0083】
従って、本発明は、詳細には、核酸または遺伝子を標的化または変異する方法に関し、この方法は以下:
(a)標的核酸または目的の遺伝子に相同な1つ以上の配列に隣接する、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)、および少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、7、10など)の選択マーカーを含む、本発明の少なくとも1つの核酸分子を獲得する工程;
(b)この分子と、1つ以上の標的核酸または目的の遺伝子(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)とを、標的核酸または目的の遺伝子とこの核酸分子との間の1つ以上の部位で相同組み換えを生じるのに十分な条件下で、接触させて、これによりこの標的核酸または目的の遺伝子内の本発明の核酸分子の全てまたは一部の挿入を生じさせる(そして好ましくは、少なくとも1つの選択マーカーおよび/または少なくとも1つの組み換え部位の挿入を生じる)工程;ならびに
(c)本発明の核酸分子の全てまたは一部を含む、標的核酸または目的の遺伝子について、または本発明の核酸分子の全てまたは一部を含む、標的核酸または遺伝子を含む宿主細胞について、必要に応じて選択する工程、
を包含する。
【0084】
好ましくは、上記の方法において用いられる選択マーカーは、陽性選択マーカー(例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、およびG−418耐性マーカーのような抗生物質耐性マーカー)である。
【0085】
1つの一般的局面において、本発明は、標的遺伝子またはヌクレオチドを標的化または変異する方法を提供し、この方法は、以下:(a)1つ以上の組み換え部位および1つ以上の選択マーカーを含む少なくとも第一の核酸分子を獲得する工程であって、ここでこの第一の核酸分子は、この標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相同な1つ以上のヌクレオチド配列を含む、工程;ならびに(b)この第一の核酸分子と、標的遺伝子またはヌクレオチド配列とを、標的遺伝子またはヌクレオチド配列と第一の核酸分子との間の1つ以上の部位で相同組み換えを生じるのに十分な条件下で、接触させて、これによりこの遺伝子またはヌクレオチド配列内のこの第一の核酸分子の全てまたは一部の挿入を生じさせる工程、を包含する。本発明の特定の実施形態において、第一の核酸分子は、この相同な配列に隣接する少なくとも1つの選択マーカーを含む。さらなる特定の実施形態において、標的遺伝子またはヌクレオチド配列は、相同組み換えの結果として不活性化される。なおさらなる特定の実施形態において、本発明の方法はさらに、この標的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む宿主細胞を選択する工程を包含する。
【0086】
いくつかの特定の実施形態において、この標的遺伝子またはヌクレオチド配列に相同であるこの第一の核酸分子の1つ以上のヌクレオチド配列の1つ以上は、この標的遺伝子またはヌクレオチド配列に100%同一ではない。言い換えれば、相同組み換えを容易にする核酸セグメントは、100%の配列同一性を共有する必要性はない。しかし、概して、これらの核酸セグメントは、その相同性の領域において、少なくとも70%(例えば、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%)の同一性を共有する。
【0087】
組み換えられる核酸分子(すなわち、この標的遺伝子またはヌクレオチド配列)に対して100%の配列同一性を共有しない相同組み換えを容易にするための核酸セグメントの使用は、多くの場合利点があり得る。このような場合の1例は、相同な核酸が、遺伝子である標的ヌクレオチド配列の一部に対応し、そして相同組み換えがこの標的ヌクレオチド配列における1つ以上の配列変更を誘導する場合である。関連の実施例では、相同な核酸は、遺伝子全体を示す標的ヌクレオチド配列に対応し得る。従って、相同組み換えは、標的遺伝子の置換を生じる。このような場合の別の例は、相同組み換えが第一の核酸分子の1つ以上の相同ヌクレオチドに比べて生じることである部位で異なるヌクレオチド配列を有する、生物体上で相同組み換えを実施することを当業者が追求する場合である。これらの配列における差異は、例えば、相同組み換えが生じることが意図される生物体が第一の核酸分子の相同なヌクレオチド配列が得られる生物体とは異なる株または種である場合、またはこの生物体が組み換え遺伝子座で異なる遺伝子型を有する場合に生じ得る。
【0088】
さらに、組み換えを容易にする相同領域の長さは、サイズで変化し得るが、一般に、少なくとも15ヌクレオチド長(例えば、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも800ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも2500ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも3500ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも4500ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも5500ヌクレオチド、少なくとも6000ヌクレオチド、少なくとも6000ヌクレオチドなど)である。
【0089】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法によって産生される組み換え宿主細胞を提供する。この宿主は、原核生物宿主(例えば、細菌)でも、真核生物(例えば、真菌(例えば、酵母)、植物、または動物(例えば、昆虫、ヒトを含む哺乳動物など)宿主でもよい。
【0090】
本発明の別の局面において、本発明による標的核酸または遺伝子へ導入された組み換え部位は、この標的核酸または目的の遺伝子に挿入された核酸分子の全てまたは一部を切り出すか、置換するか、または取り除くために用いられ得る。従って、本発明は、このような核酸分子のインビトロまたはインビボ除去を可能にし、従って標的核酸または遺伝子の再活性化を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記のように導入された変更を含む核酸または遺伝子の同定および単離後、本発明の分子上に存在する選択マーカーが除去され得る。
【0091】
本発明はまた、本発明の出発核酸分子もしくは生成核酸分子を、1つ以上のベクター中にクローニングするための方法、または本発明の生成分子を1つ以上のベクター中に変換する方法を提供する。1つの局面において、出発材料は、1つ以上の生成分子を作成するために組み換えられ、そしてこのような生成分子は、1つ以上のベクター中に(好ましくは組み換えによって)クローニングされる。別の局面において、出発物質は、1つ以上のベクター中に直接クローニングされ、その結果多数の出発分子が、ベクター内で連結され、これにより本発明の生成分子を含有するベクターを作成する。別の局面においては、出発分子は、1つ以上のベクター中に直接クローニングされ、その結果出発分子はベクター内で連結されない(すなわち、出発分子は、ベクター配列によって分離される)。なお別の局面において、生成分子および出発分子の組み合わせは、任意の順序で1つ以上のベクター中にクローニングされ得、これにより元の出発分子および生成分子の組み合わせから生じる新しい生成分子を含むベクターを作成する。
【0092】
従って、本発明は、クローニング方法に関し、この方法は、以下:
(a)組み換え部位を含む本発明の少なくとも1つの核酸分子(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、など)を獲得する工程;および
(b)1つ以上のベクター(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15など)へのこの分子の全てまたは一部をトランスファー(移入)する工程、を包含する。
【0093】
好ましくは、このようなベクターは、1つ以上の組み換え部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を含み、そしてこのようなベクターへのこの分子の移入は、好ましくは、このベクターの1つ以上の部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10など)と、本発明の分子上の1つ以上の部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10など)との間の組み換えによって達成される。べつの局面において、本発明の生成分子は、必要なベクター配列(例えば、複製起点)を含むことにより、ベクターとして機能する分子に転換され得る。従って、本発明により、このようなベクター配列は、このような配列を含む出発分子の使用を通じて生成分子中に組み込まれ得る。このようなベクター配列は、出発分子内の配列の位置、および生成分子中の出発分子の付加の順番に依存して、生成分子中の1つまたは多数の所望の位置で付加され得る。従って、本発明は、ベクター中で所望され得る多数の機能的エレメントを組み合わせる(好ましくは組み換えを通じて)ことにより、所望のベクターのカスタム(受注)構築を可能にする。このベクター配列を含む生成分子は、線状形態であってもよいし、または生成分子内の組み換え部位の組み換えによって、または当該分野で周知の連結技術によって、環状または高次コイル(スーパーコイル)に変換されてもよい。好ましくは、このような生成分子の環状化は、この分子を環状化するために、この生成分子の両方の末端でまたはその付近で組み換え部位を組み換えることにより、またはこの生成分子の末端を連結することにより達成される。理解されるように、線状または環状の生成分子は、さらなる操作のために1つ以上の宿主または宿主細胞中に導入され得る。
【0094】
用いた場合に、本発明において有用なベクター配列は、以下を含み得る:1つまたは多数のエレメントおよび/または機能的配列および/または部位(またはそれらの組み合わせ)。これは以下を含む:1つ以上の配列決定または増幅プライマー部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10、など)、翻訳終止サプレッサー活性を付与する1つ以上の配列(例えば、1、2、3、4、5、7、10、など)(このような配列は、サプレッサーtRNA分子をコードする)、1つ以上の選択マーカー(例えば、1、2、3、4、5、7、10の毒性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、など)、1つ以上の転写または翻訳部位またはシグナル(例えば、1、2、3、4、5、7、10、など)、1つ以上の転写または翻訳終止部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12など)、1つ以上のスプライシング部位(例えば、1、2、3、4、5、7、10、など)(これは、例えば、組み換え部位またはこのような部位から翻訳されたタンパク質に対応するRNAの切り出しを可能にする)、1つ以上のタグ配列(例えば、HIS6、GST、GUS、GFP、YFP、CFP、エピトープタグなど)、1つ以上の制限酵素部位(例えば、マルチクローニング部位)、1つ以上の複製起点(例えば、1、2、3、4、5、7、10、など)、1つ以上の組み換え部位(またはその部分)(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)。本発明において用いたベクター配列はまた、上記のような所望の融合タンパク質の発現を可能にするために抑制され得る終止コドンを含み得る。従って、本発明により、ベクター配列を用いて、このようなエレメント、機能的配列、および/または部位の1つ以上を、本発明の任意の核酸分子に導入し得、そしてこのような配列は、このような核酸分子をさらに操作または分析するために用いられ得る。例えば、ベクターによって提供されるプライマー部位(好ましくは、このようなベクター中にクローニングされたインサートの両側に配置される)によって、このベクター中にクローニングされた生成分子の全てまたは一部の配列決定または増幅が可能になる。
【0095】
さらに、このベクターに含まれる転写配列または調節配列により、このベクター中にクローニングされた生成分子の全てまたは一部によってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現が可能になる。同様に、このベクターによって提供される遺伝子、遺伝子の部分または配列タグ(例えば、GUS、GST、GFP、YFP、CFP、Hisタグ、エピトープタグなど)により、このベクター中にクローニングされた生成分子を用いて遺伝子融合物の集団を作成することが可能になり、またこのようなベクター中にクローニングされた生成配列と組み合わせて、このベクターによって提供された配列タグによってコードされた多数のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生成が可能になる。このような遺伝子、遺伝子の一部または配列タグは、必要に応じてサプレスされた終止コドンと組み合わせて用いられ、このベクター中にクローニングされている目的の配列によってコードされた融合タンパク質、およびベクターが供給した遺伝子またはタグ配列の制御された発現を可能にし得る。
【0096】
対照的に、このベクターは1つ以上の組み換え部位、1つ以上の終止コドン、および1つ以上のタグ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、このタグ配列は、組み換え部位に隣接され得る。必要に応じて、抑制可能な終止コドンが、タグの配列中に、または組み換え部位の配列に組み込まれ、目的の遺伝子に対するタグ配列の制御された付加を可能にし得る。このタイプの実施形態において、目的の遺伝子は、組み換えクローニングによってこのベクター中に挿入され得、その結果、タグおよび目的の遺伝子のコード配列は、同じ読み取り枠(リーディングフレーム)内である。
【0097】
目的の遺伝子は、翻訳開始シグナル(例えば、シャインダルガーノ配列、Kozak配列および/またはIRSE配列)とともに提供されて、終止コドンが抑制されない場合、ネイティブなN末端でこの遺伝子の発現を可能にし得る。さらに、融合タンパク質の成分をコードする核酸セグメントの間に存在する組み換え部位は、融合タンパク質読み取り枠の中で、終止コドンをコードしないか、または終止コドンをコードしない、いずれかに設計され得る。目的の遺伝子はまた、コード配列の3’末端で終止コドン(例えば、抑制可能終止コドン)とともに提供され得る。同様に、融合タンパク質が、複数の核酸セグメント(例えば、3、4、5、6、8、10などのセグメント)から生成される場合、終止コドンをコードする核酸は、各核酸セグメントの間で除かれ得、そして所望の場合、終止コドンをコードする核酸は、融合タンパク質コード領域の3’末端に配置され得る。
【0098】
いくつかの実施形態において、タグ配列は、目的の遺伝子のN末端およびC末端の両方で提供され得る。必要に応じて、N末端のタグ配列は、終止コドンとともに提供され得、そして目的の遺伝子は、終止コドンとともに提供され得、タグはC末端で終止コドンとともに提供され得る。終止コドンは、同じであっても異なってもよい。
【0099】
いくつかの実施形態において、N末端タグの終止コドンは、目的の遺伝子の終止コドンとは異なる。この型の実施形態において、終止コドンの1つまたは両方に対応するサプレッサーtRNAが提供され得る。両方が提供される場合、それぞれのサプレッサーtRNAは、同じベクター上に、異なるベクター上に、または宿主細胞ゲノム中に独立して提供され得る。サプレッサーtRNAは、両方が同じ様式で提供される必要はない、例えば、1つは、目的の遺伝子を含むベクター上に提供され得るが、もう一方は、宿主細胞ゲノム中に提供され得る。
【0100】
発現シグナル(例えば、プロモーター)の位置に依存して、発現中の終止コドンの抑制により、発現されたタンパク質のN末端および/またはC末端でタグ配列を有する融合ペプチドの生成が可能になる。終止コドンを抑制しないことにより、目的の配列の発現は、Nおよび/またはC末端のタグ配列なしに達成され得る。従って、本発明は、必要に応じて、融合タンパク質の制御された発現のために、組み換えを通じて、目的の遺伝子または配列(例えば、1、2、3、4、5、6、10、またはそれ以上のORF)を含有するベクターの効率的な構築を可能にする。
【0101】
好ましくは、本発明によってクローニングまたは構築される、本発明の出発核酸分子または生成分子は、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム(ORF)(例えば、1、2、3、4、5、7、10、12、または15ORF)を含む。このような出発分子または生成分子はまた、機能的配列(例えば、プライマー部位、転写もしくは翻訳の部位またはシグナル、終止部位(例えば、必要に応じて抑制され得る終止コドン)、複製起点など)を含み得、そして好ましくは遺伝子発現を調節する配列(転写調節配列を含む)および内部リボソーム進入部位(internal ribosome entry sites)(IRES)として機能する配列を含む。好ましくは、少なくとも1つの出発分子もしくは生成分子および/またはベクターは、プロモーターとして機能する配列を含む。このような出発分子もしくは生成分子および/またはベクターはまた、転写終止配列、選択マーカー、制限酵素認識部位などを含み得る。
【0102】
いくつかの実施形態において、出発物または生成物および/またはベクターは、同じ選択可能なマーカーの2つのコピーを含み、各々のコピーには、2つの組換え部位が隣接する。他の実施形態において、出発物または生成物および/またはベクターは、各々2つの組換え部位が隣接する2つの異なる選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態において、1以上の選択可能なマーカーは、ネガティブマーカーであり得る(例えば、ccdB、kicB、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデミアーゼなど)。
【0103】
1つの局面において、本発明は、核酸分子をクローニングする方法を提供し、以下の工程を包含する:(a)第1および第2の組換え部位が隣接する第1の核酸セグメントを提供する工程;(b)第3および第4の組換え部位が隣接する第2の核酸セグメントを提供する工程であって、第1または第2の組換え部位のいずれかは、第3または第4の組換え部位のいずれかと組換えし得る、工程;(c)組換え反応を行い、その結果、2つの核酸セグメンが単一の核酸分子に組換えされる工程;および(d)単一の核酸分子をクローニングする工程。これらの方法のある特定の実施形態において、第1の組換え部位は、第2および第4の組換え部位と組換えし得ず、そして第2の組換え部位は、第1および第3の組換え部位と組換えし得ない。
【0104】
ある局面において、本発明は、少なくとも第1および第2の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子、ならびに少なくとも第3および第4の組換え部位を含む少なくとも第2の核酸分子を提供する工程を包含するクローニング方法を提供し、ここで、第1または第2の組換え部位のいずれかは、第3および第4の組換え部位のいずれかと組換えし得、そして2つの核酸分子が1以上の生成核酸分子へと組換えし得、そして生成核酸分子を1以上のベクターにクローニングし得る。好ましくは、組換え部位は、第1および/または第2の核酸分子に隣接する。さらに、クローニング工程は、好ましくは、1以上の組換え部位を含むベクターへの核酸分子の組換え反応によって達成されるが、このようなクローニング工程は、当該分野において周知の標準的連結反応によって達成され得る。1つの局面において、クローニング工程は、未処理の部位と組換えし得ない組換え部位を有するベクターとの最初の組換え反応において反応しなかった生成核酸分子の部位間で組換え反応を行う工程を包含する。
【0105】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、核酸分子をクローニングする方法を提供する;(a)少なくとも第1および第2の組換え部位が隣接する第1の核酸セグメント、ならびに少なくとも第3および第4の組換え部位が隣接する第2の核酸セグメントを提供する工程であって、第1および第2の核酸が隣接する第1の組換え部位は、第1および第2の核酸セグメントが隣接する他の部位のいずれとも組換えし得ない、工程;(b)少なくとも第5、第6、第7および第8の組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、少なくとも第5、第6、第7および第8の組換え部位の各々は、少なくとも第1、第2、第3および/または第4の組換え部位と組換えし得る、工程;ならびに(c)組換え反応を行い、その結果、2つの核酸セグメントがベクターに第1および第2の核酸セグメントを組込みされ、それによって第1および第2の核酸セグメントをクローニングする工程。
【0106】
別のある局面において、本発明は、以下の工程を包含するクローニングする方法を提供する;少なくとも第1および第2の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子、ならびに少なくとも第3および第4の組換え部位を含む少なくとも第2の核酸分子を提供する工程(ここで、第1、第2、第3または第4の組換え部位はいずれも、他の部位にいずれとも組換えし得ない)、少なくとも第5、第6、第7および第8の組換え部位を含む1以上(例えば、2、3、4、5、7、12など)のベクター(ここで、第5、第6、第7および第8の組換え部位の各々は、第1、第2、第3または第4の組換え部位の1つと組換えし得る)を提供する工程、ならびに組換え反応を行い、その結果、少なくともこの第1および第2の分子がこのベクターに組込みされる工程。さらなる局面において、この方法は、少なくとも1つのさらなる核酸分子(例えば、少なくとも第3の核酸分子)のクローニングを可能にし得、ここで、この核酸には、第9および第10の組換え部位が隣接し、そしてこのベクターは、第9または第10の組換え部位と組換え得る第11および第12の組換え部位を含む。
【0107】
本発明はまた、特に、以下の工程を包含するクローニング方法に関する:第1、第2、および第3の核酸分子を提供する工程(ここで、第1の核酸分子には、少なくとも第1および第2の組換え部位が隣接し、第2の核酸分子には、少なくとも第3および第4の組換え部位が隣接し、そして第3の核酸分子には、少なくとも第5および第6の組換え部位が隣接し、ここで、第2の組換え部位は、第3の組換え部位と組換えし得、かつ第4の組換え部位は、第5の組換え部位と組換えし得る)、少なくとも第7および第8の組換え部位を有するベクターを提供する工程(ここで、第7の組換え部位は、第1の組換え部位と反応し得、かつ第8の組換え部位は、第6の組換え部位と反応し得る)、ならびに少なくとも1つの組換え反応を行い、その結果、第2および第3の組換え部位が組換えし、第4および第5の組換え部位が組換えし、第1および第7の組換え部位組換えし、かつ第6および第8の組換え部位が組換えし、それによって、このベクターに第1、第2および第3核酸セグメントをクローニングする工程。
【0108】
別のある局面において、本発明は、以下の工程を包含するクローニング方法を提供する:少なくとも第1、第2および第3の核酸分子を提供する工程(ここで、第1の核酸分子には、第1および第2の組換え部位が隣接し、第2の核酸分子には、第3および第4の組換え部位が隣接し、かつ第3の核酸分子には、第5および第6の組換え部位が隣接し、ここで、第2の組換え部位は、第3の組換え部位と組換えし得、かつ第1、第4、第5または第6の組換え部位のいずれも、第1〜第6の組換え部位のいずれとも組換えし得ない)、少なくとも第1の選択可能なマーカーに隣接する第7および第8の組換え部位を含み、かつ少なくとも第2の選択可能なマーカーに隣接する第9および第10の組換え部位を含む(ここで、第7〜第10の組換え部位のいずれも、第7〜第10の組換え部位のいずれとも組換えし得ない)1以上のベクターを提供する工程、第2および第3の組換え部位が組換えし、第1および第4の組換え部位が第7および第8の組換え部位と組換えし、かつ第5および第6の組換え部位が第9および第10の組換え部位と組換えし、それによって、第1、第2および第3の核酸セグメントをクローニングする工程。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、同じであってもよく、または異なってもよい。さらに、この1以上(例えば、2、3、4、5、7など)の選択可能なマーカーは、ネガティブマーカーであり得る。
【0109】
本発明はまた、n個の核酸セグメントをクローニングする方法を提供し、ここで、nは、1より大きな整数であって、以下の工程を包含する:(a)n個の核酸セグメントを提供する工程(各セグメントには、お互いに組換えしない2つの組換え部位が隣接する);(b)2n個の組換え部位を含むベクターを提供する工程(ここで、2n個の組換え部位の各々は、核酸セグメントの1つに隣接する組換え部位の1つと組換えし得る);ならびに(c)組換え反応を行い、その結果、n個の核酸セグメントが、ベクターに組換えし、それによってn個の核酸セグメントをクローニングする工程。特定の実施形態において、n個の核酸セグメントとベクターとの間の組換え反応は、組換えを助ける条件下で、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。別の特定の実施形態において、nは2、3、4または5である。
【0110】
従って、本発明は、通常、n個の核酸分子をクローニングする方法を提供し、ここで、nは、1より大きな整数であり、この方法は、以下の工程を包含する:n個の核酸分子を提供する工程(各分子は、少なくとも1つ、そして好ましくは2つの組換え部位(この2つの組換え部位は、好ましくはn個の核酸分子に隣接する)を含む)、1以上の組換え部位(そして好ましくは2n個の組換え部位)を含む少なくとも1つのベクターを提供する工程(ここで、組換え部位を含むベクターは、n個の分子の組換え部位と組換えし得る)、および組換え反応を行い、その結果、n個の核酸分子がこのベクターに挿入され、それによってn個の核酸セグメントをクローニングする工程。n個の分子は、ベクターにおいて、お互いに隣り合って、または隣接して挿入されてもよく、またはベクター内の異なる位置に挿入されてもよい。本発明に従うクローニングのために使用されるベクターは、好ましくは、同じかまたは異なる選択可能なマーカーのn個のコピーを含み、これらの各々のコピーには、少なくとも2つの組換え部位が隣接する。好ましくは、1以上の選択可能なマーカーは、ネガティブ選択可能なマーカーである。
【0111】
本発明はまた、通常、n個の核酸分子をクローニングする方法に関し、ここで、nは、1より大きな整数であり、この方法は、以下の工程を包含する:第1〜第nの核酸分子を提供する工程(ここで、各分子には、少なくとも2つの組換え部位が隣接し、個の組換え部位は、第iのセグメントに隣接する2つの組換え部位の1つのniが第ni−1のセグメントに隣接する組換え部位の1つと反応し、そして第iのセグメントに隣接する2つの組換え部位のもう1つのniが第ni+1のセグメントに隣接する組換え部位の1つと反応する)、少なくとも2つの組換え部位を含むベクターを提供する工程(ここで、ベクター上の2つの組換え部位の1つは、第1の核酸セグメントの部位の1つと反応し、そしてベクター上の別の部位は、第nの核酸セグメント上の組換え部位と反応する)。
【0112】
本発明の方法によってクローニングされた核酸分子/セグメントは、異なる型であり得、そして必要性に依存して、および存在する機能エレメントに依存して異なる機能を有し得る。1つの局面において、本発明に従ってクローニングされた核酸セグメントの少なくとも1つは、転写を調節し得る配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど)に、作動可能に連結される。例えば、核酸セグメントの少なくとも1つは、誘導プロモーターまたは構成プロモーターのいずれかであるプロモーターに作動可能に連結される。なお他の特定の実施形態において、クローニングされたセグメントから産生されたRNAの翻訳は、融合タンパク質あるいは単一のタンパク質の全てまたは一部分のいずれかの産生を引き起こす。さらなる特定の実施形態において、少なくとも1つの核酸セグメントは、読み取り枠の全てまたは一部分をコードし、そして核酸セグメントの少なくとも1つは、転写を調節し得る配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど)を含む。さらなる実施形態において、核酸セグメントの少なくとも1つは、転写時にセンスRNA鎖を産生し、そして核酸セグメントの少なくとも1つは、翻訳時にアンチセンスRNA鎖を産生する。関連する実施形態において、センスRNAおよびアンチセンスRNAは、少なくとも1つの相補領域を有し、そしてお互いにハイブリダイズし得る。他の特定の実施形態において、核酸分子の少なくとも2つの転写は、単一のRNAまたは2つの別のRNAの産生を引き起こす。種々の特定の実施形態において、これらの核酸セグメントは、お互いに連結されてもよいし、または同じ核酸分子内で空間的に離れていてもよい。特定の実施形態において、核酸セグメントは、1以上のライブラリーの核酸分子を含む。さらに、これらのライブラリーは、cDNA、合成DNAまたはゲノムDNAを含み得る。さらに、これらのライブラリーの核酸分子は、抗体分子の可変ドメイン(例えば、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメイン)をコードし得る。特定の実施形態において、本発明は、1以上の活性(例えば、細胞からの分泌、細胞(sub−cellular)局在性(例えば、小胞体、核、ミトコンドリア、葉緑体、細胞膜などに対する局在性)、リガンド結合活性(例えば、核酸、細胞表面レセプター、可溶タンパク質、金属イオン、構造エレメント、タンパク質相互作用ドメインなどに対する小分子結合活性)、酵素活性など)を有する1以上の抗原および/またはタンパク質に対する結合特異性を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明の方法を用いてクローニングされた核酸分子/セグメントは、上に言及した1以上の活性を有し得る。
【0113】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法を提供する:(a)少なくとも第1、第2および第3の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、第1および第2の核酸セグメントには、少なくとも第1および第2の組換え部位が隣接し、第2の核酸セグメントには、少なくとも第3および第4の組換え部位が隣接し、かつ第3の核酸セグメントには、少なくとも第5および第6の組換え部位が隣接し、ここで、第2の組換え部位は、第3の組換え部位と組換えし得、かつ第1、第4または第6の組換え部位のいずれも、第1〜第6の組換え部位のいずれとも組換えし得ない、工程;(b)少なくとも第1のネガティブな選択可能なマーカーに隣接する少なくとも第7および第8の組換え部位を含み、かつ少なくとも第2のネガティブな選択可能なマーカーに隣接する少なくとも第9および第10の組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで、第7〜第10の組換え部位のいずれも、第7〜第10の組換え部位のいずれとも組換えし得ない、工程;(c)第1の組換え反応を行い、その結果、第2および第3の組換え部位が組換えする工程;および(d)第2の組換え反応を行い、その結果、第1および第4の組換え部位が第7および第8の組換え部位と組換えし、そして第5および第6の組換え部位が第9および第10の組換え部位と組換えし、それによって、第1、第2および第3の核酸セグメントをクローニングする工程。関連する実施形態において、第1および第2の組換え反応は、組換えを助ける条件下で、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。このような第1および第2の組換え反応は、同時または連続して実行され得る。
【0114】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法を提供する:(a)第1、第2および第3の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、第1の核酸セグメントには、第1および第2の組換え部位が隣接し、第2の核酸セグメントには、第3および第4の組換え部位が隣接し、かつ第3の核酸セグメントには、第5および第6の組換え部位が隣接し、ここで、第2の組換え部位は、第3の組換え部位と組換えし得、かつ第4の組換え部位は、第5の組換え部位と組換えし得る、工程;(b)第7および第8の組換え部位を含むベクターを提供する工程;ならびに(c)少なくとも1つの組換え反応を行い、その結果、第2および第3の組換え部位が組換えし、かつ、第4および第5の組換え部位が組換えし、かつ第1および第6の組換え部位が、それぞれ、第7および第8の組換え部位組換えし、それによって、第1、第2および第3の核酸セグメントをクローニングする工程。関連する実施形態において、組換え反応は、組換えを助ける条件の下、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。特定の実施形態において、お互いに組換えする組換え部位は、同一の7つの塩基対重複領域を有するatt部位を含む。
【0115】
別の実施形態において、本発明は、n個の核酸フラグメントをクローニングする方法を提供し、ここで、nは、2より大きな整数であり、この方法は、以下の工程を包含する:(a)第1〜第nの核酸セグメントを提供する工程(ここで、各セグメントには、2つの組換え部位が隣接し、組換え部位が選択され、その結果、第iのセグメントに隣接する2つの組換え部位の1つniが、第ni−1のセグメントに隣接する組換え部位の1つと反応し、そして第iのセグメントに隣接する他方の組換え部位が、第ni+1のセグメントに隣接する組換え部位の1つと反応する);(b)少なくとも2つの組換え部位を含むベクターを提供する工程(ここで、ベクター上の2つの組換え部位の1つは、第1の核酸セグメントようの部位の1つと反応し、そしてベクター上の別の部位は、第nの核酸セグメント上の組換え部位と反応する);ならびに(c)少なくとも1つの組換え反応を行い、その結果、全核酸フラグメントが、ベクターに組換えされる工程。特定の実施形態において、組換え反応は、組換えを助ける条件の下、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。
【0116】
上記の方法の特定の実施形態において、複数の核酸セグメントは、別の核酸分子に挿入される。このような方法の多くのバリエーションが可能であり、特定の実施形態において、異なる特異性を有する組換え部位を含む核酸セグメント(例えば、attL1およびattL2)は、1セットより多い同族組換え部位(例えば、attR1およびattR2)を含むベクターに挿入され、この各セットは、ネガティブな選択マーカーに隣接する。従って、同族部位の組換えは、1以上の組換え部位で進行中の組換えを有する核酸分子を選択するために使用され得る。ベクターに挿入された核酸セグメントは、同じであってもよく、または異なってもよい。さらに、これらの核酸セグメントは、発現生成物をコードし得、または転写制御配列であり得る。核酸セグメントが発現生成物をコードする場合、本発明のベクターは、コピー数を増幅するため、またはコードされた生成物の発現を増加させるために使用され得る。さらに、核酸セグメントが真っ直ぐの配向と逆の配向の両方で挿入される場合、本発明のベクターは、例えば、本明細書中に他の部分に記載されるように、RNAiを発現するために使用され得る。核酸セグメントが、転写を調節する配列(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)をコードする場合、本発明のベクターは、複数の調節エレメントを発現生成物をコードする核酸に作動可能に連結して配置するために使用され得る。この性質のベクターは、例えば、転写を活性化するタンパク質に対する複数の結合部位を提供することによって、発現生成物の発現を増加するために使用され得る。同様に、この性質のベクターは、転写を阻害するタンパク質に対する複数の結合部位を提供することによって、発現生成物の発現を減少させるために使用され得る。この性質のベクターは、例えば、転写の調節に関連する因子をコードする核酸分子の複数のコピーを発現することによって、発現生成物の発現を増加または減少させるために使用され得る。上記に関連する他の実施形態は、当業者に明白である。
【0117】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法を提供する:(a)核酸分子の第1の集団を提供する工程であって、ここで、このような分子の全てまたは一部分には、少なくとも第1および第2の組換え部位が隣接する、工程;(b)少なくとも第3および第4の組換え部位が隣接する少なくとも1つの核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、第1または第2の組換え部位のいずれかは、第3または第4の組換え部位のいずれかと組換えし得る、工程;(c)組換えを行い、その結果、この集団の核酸分子の全てまたは一部分がセグメントと組換えされ、核酸分子の第2の集団を形成する工程;および(d)核酸分子の第2の集団をクローニングする工程。関連する実施形態において、組換え反応は、組換えを助ける条件の下、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。特定の実施形態において、核酸分子の第2の集団は、融合タンパク質をコードする。特定の実施形態において、核酸セグメントは、以下の全てまたは一部分をコードする配列(好ましくはN末端および/またはC末端タグ配列)を含むポリペプチドをコードする:免疫グロブリンのFc部分、抗体、β−グルクロニダーゼ、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質など)、転写活性化ドメイン、翻訳に関わるタンパク質またはドメイン、タンパク質局在化タグ、タンパク質安定化または不安定化配列、タンパク質相互作用ドメイン、DNAに対する結合ドメイン、タンパク質基質、精製タグ(例えば、エピトープタグ、マルトース結合タンパク質、6ヒスチジンタグ、グルタチオンS−トランスフェラーゼなど)およびエピトープタグ。
【0118】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法を提供する:(a)核酸分子の第1の集団を提供する工程であって、ここで、このような分子の全てまたは一部分には、少なくとも第1および第2の組換え部位が隣接する、工程;(b)核酸分子の第2の集団を提供する工程であって、ここで、このような分子の全てまたは一部分には、少なくとも第3および第4の組換え部位が隣接し、ここで、第1または第2の組換え部位のいずれかは、第3または第4の組換え部位のいずれかと組換えし得る、工程;(c)組換え反応を行い、その結果、第1の集団の分子の全てまたは一部分が第2の集団からの1以上の分子と組換えされ、核酸分子の第3の集団を形成する、工程;ならびに(d)核酸分子の第3の集団をクローニングする工程。関連する実施形態において、組換え反応は、組換えを助ける条件の下、1以上の組換えタンパク質の存在下で行われる。
【0119】
従って、本発明は通常、核酸の少なくとも2つのセグメントを連結する(核酸分子の集団を連結することも含む)方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:(a)少なくとも2つの核酸のセグメント(この1つまたは両方は、核酸の集団またはライブラリーから誘導される)を提供する工程であって、各セグメントは、別のセグメント上に存在する組換え部位と組換えし得る少なくとも1つの組換え部位を含む、工程;および(b)組換え部位間に組換えを引き起こす条件下で、セグメントと1以上の組換えタンパク質とを接触させる工程であって、それによって、セグメントが連結される、工程。本発明はさらに、このような方法によって調製された連結された核酸セグメント(またはセグメントの集団)を含む組成物、このような連結された核酸セグメントを含む宿主または宿主細胞(これは、宿主細胞または組換え宿主細胞の集団であり得る)、およびこのような宿主または宿主細胞を(例えば、本発明の生成分子でこのような細胞を形質転換またはトランスフェクトすることによって)作製する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の方法はさらに、連結された核酸セグメントと1以上のベクターに挿入する工程を包含する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主または宿主細胞に関する。さらなる特定の実施形態において、核酸の2つのセグメントの少なくとも1つは、1以上の同定可能な活性を有する発現生成物をコードする(例えば、選択可能なマーカー、酵素、リボザイムなど)。さらに他の実施形態において、核酸の2つのセグメントの少なくとも1つは、読み取り枠(ORF)の全てまたは一部分を含む。別の局面において、核酸の2つのセグメントの少なくとも1つは、転写を調節し得る配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど)を含む。特定の局面において、1つのセグメントはORFをコードし、そして他は、転写および/または翻訳を調節し得る配列をコードし、そして組換え反応は、このような配列が作動可能に連結されることを可能にする。さらに他の特定の実施形態において、1以上の核酸セグメントは、選択可能なマーカーをコードするか、または複製の起点を含む。さらなる特定の実施形態において、核酸セグメントのいくつかまたは全ては、1以上のライブラリーの核酸分子を含む。ある特定の実施形態において、その1以上のライブラリーは、抗体分子の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態において、核酸セグメントの少なくとも1つは、抗体分子の可変ドメインに接続するためのポリペプチドリンカーをコードし、そして/または1以上のライブラリーは、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本発明の方法はさらに、1以上の同定可能な活性(例えば、1以上の抗原に対する結合特異性、酵素活性、選択可能なマーカーに関連する活性など)を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するための、少なくとも1つのスクリーニング工程を包含する。従って、本発明は、(異なるセグメントを可変に連結すること、ならびに/もしくはセグメントを置換および/または欠失することによって)改変された発現生成物を産生するために使用され、そして所望の活性について発現生成物を分析する。本発明に従って、遺伝子の部分および/または多くの遺伝子は、新規のタンパク質または新規の化合物と発現するために、そして目的の活性を選択するために連結され得る。本明細書中に記載される場合、このような連結された分子の置換および/または欠失はまた、試験のための変更されたるかまたは改変されたタンパク質あるいは化合物を産生するために使用され得る。1つの局面において、生物学的経路は、例えば、特定の経路において異なる酵素または変異酵素を使用するために、本発明の方法によって改変され得る(例えば、同じ生物学的経路における反応に関与する異なる酵素または変異酵素に連結する)。本発明に従う生物学的経路に対するこのような改変は、(1)抗生物質または糖質のような潜在的に新規な化合物の産生、あるいは(2)タンパク質の翻訳後の固有の改変を引き起こす。本発明はまた、多量体の酵素複合体のサブユニットを操作または変化することによって、新規の酵素の産生を可能にする。他の特定の実施形態において、本発明はまた、細胞の特性を変える方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される方法によって産生された細胞核酸セグメントへ導入する工程を包含する。ある特定の実施形態において、本発明の方法によって変化されるかまたは産生された細胞は、真菌細胞か細菌細胞かのいずれかである(例えば、Escherichia coli)。
【0120】
本発明はさらに、生物学的経路を変化するため、および新しい生物学的経路を生成するための方法を提供する。例えば、特定の経路(例えば、抗生物質の産生を引き起こす経路)の生成物に関する生成物をコードする遺伝子は、本発明の方法を用いて変化され得る。これらの変化としては、その経路に関与する生成物をコードする1以上の遺伝子の欠失、置換、および/または変異が挙げられる。さらに、遺伝子の領域は、欠失または変化され得、引き続いて、例えば、特定の性質(例えば、特定のメチル化パターン)を有する経路生成物を同定するために、スクリーニングされ得る。さらに、同様だが、異なる機能を実施する異なる生物の遺伝子は、新規な生成物を産生するために組合わされ得る。さらに、これらの生成物は、特定の機能的性質(例えば、酵素反応を阻害する能力、特異的なリガンドに対する結合親和性、抗菌活性、抗ウイルス活性など)についてスクリーニングすることによって同定され得る。従って、本発明は、1つの局面において、本発明の核酸分子の発現生成物によって産生される化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【0121】
さらに、特定の生物学的経路またはプロセスに関与する1以上の発現生成物をコードする核酸セグメントが1以上の核酸分子に構築される場合、これらの分子の領域(例えば、発現生成物をコードする領域)は、例えば、さらなる発現生成物を発現するか核酸分子、または生物学的経路またはプロセスに関与する1以上の発現生成物を発現しない核酸分子を生成するために、欠失あるいは置換され得る。さらに、特定の生物学的経路またはプロセスに関与する1以上の発現生成物をコードする核酸セグメントは、単一のユニットとして欠失または挿入され得る。これらの方法は、新規の生成物を産生およびスクリーニングする際に適用が見い出される。特に、本発明はまた、本明細書中に記載される核酸分子の発現生成物によって産生される新規な生成物を含む。
【0122】
別の局面において、本発明は、同じ生物学的プロセスまたは生物学的経路に関与する遺伝子産物をコードする2以上の核酸セグメントを含む核酸分子を調製および同定するための方法を提供し、以下の工程を包含する:(a)核酸分子の第1の集団を提供する工程であって、この第1の集団は、第1の集団の他の核酸分子と組換えし得る少なくとも1つの組換え部位を含む、工程;(b)核酸分子を組換えさせ、そして核酸分子の第2の集団を作製させる条件下で、第1の集団の核酸分子と1以上の組換えタンパク質とを接触させる工程;および(c)同じプロセスまたは経路に関与する2以上の生成物をコードする核酸分子を同定するために、核酸分子の第2の集団をスクリーニングする工程。本発明の特定の実施形態において、同じプロセスまたは経路に関与する2以上の核酸分子は、タンパク質またはタンパク質複合体の2つの異なるドメインをコードする。他の特定の実施形態において、タンパク質は、一本鎖の抗原結合タンパク質である。さらに他の特定の実施形態において、タンパク質複合体は、抗体分子または少なくとも2つの一本鎖抗原結合タンパク質を含む多価の抗原結合タンパク質を含む。本発明はさらに、異なるかまたは無関係の生物学的プロセスまたは生物学的経路に慣用する遺伝子産物をコードする2以上の核酸セグメントを含む核酸分子を調製および同定するために、上に記載された方法と同様の方法を提供する。
【0123】
本発明の方法はまた、細胞および/または組織における遺伝子の発現プロフィールを決定するために利用され得る。1つの実施形態において、RNAは、細胞および/または組織から得ることができ、そしてcDNAを生成するために使用され得る。次いで、これらのcDNA分子は、お互いに連結され得、そして細胞および/または組織において発現する遺伝子、ならびにこれらの細胞および/または組織におけるRNA種の蔓延を同定するために配列決定され得る。従って、1つの局面において、本発明は、特定の細胞および/または組織において発現される遺伝子、および他のRNA種の量と比較する場合のこれらの細胞および/または組織に存在する特定のRNA種の相対量を同定するための方法を提供する。以下に記載されるように、このような方法は、種々の用途のために使用され得、これは、診断、遺伝子発見、特定の細胞および/または組織型に発現する遺伝子の同定、特定の細胞(例えば、病理学的な状態に関係する細胞)において過剰発現または過少発現する遺伝子の同定、遺伝子発現を変化させる因子(例えば、治療因子)を同定するための因子のスクリーニングなど。さらに、本発明の方法によって得られた配列データを公のデータベースに登録された核酸配列と比較することによって、特定のRNA種またはセグメントが転写される遺伝子を同定することが、しばしば可能である。通常、配列データの約10のヌクレオチドぐらいが、RNAが転写された遺伝子を同定するために必要とされる。
【0124】
従って、特定の局面において、本発明は、細胞または組織における遺伝子発現プロフィールを決定するための方法を提供し、以下の工程を包含する;(a)細胞または組織から得られるRNAから、少なくとも1つの集団のcDNA分子を生成する工程(ここで、この集団の個々のcDNA分子は、同じかまたは異なるcDNAの集団の個々のメンバー上に存在する少なくとも1つの組換え部位と組換えし得る少なくとも2つの組換え部位をふくむ);(b)核酸分子に結合を引き起こす条件下で、(a)の核酸分子を2以上の組換えタンパク質と接触させる工程;および(c)結合した核酸分子の配列を決定する工程。本発明の特定の実施形態において、結合したcDNA分子は挿入部位に隣接する配列決定プライマー結合部位を含むベクターに導入される。さらに他の特定の実施形態において、結合したcDNA分子は、attB組換え部位によって分離される。さらなる特定の実施形態において、結合したcDNA分子は、細胞または組織から得られるRNAに対応する約10のヌクレオチドと約30のヌクレオチドとの間に含まれる。
【0125】
一旦、RNA発現生成物に対応するcDNAの配列が決定された場合、これらの配列は、どの遺伝子がその特定の細胞および/または組織に発現するか、および個々の遺伝子の発現レベルを決定するために、既知の遺伝子の配列を含むデータベースと比較され得る。さらに、遺伝子の発現レベルは、特定の条件下で本発明方法を用いて決定され得、これらの条件が1以上の遺伝子の発現の変化を引き起こすか否かを決定する。このような条件の例としては、細胞遺伝子発現産物の減少した活性、栄養素の制限および/または奪取、熱ショック、低温、高または低イオン強度を有する溶液との接触、化学薬剤(例えば、抗生物質、化学療法薬、金属イオン、突然変異原など)への暴露、電離放射線などが挙げられる。従って、本発明は、特定の刺激の結果として発現に変化を示す遺伝子を同定するための方法を提供する。
【0126】
本発明はさらに、細胞代謝(例えば、病理学的状態)に関与する遺伝子を同定するための方法を提供する。例えば、本発明の方法は、特定の株の細胞または異常な表現型を示す細胞の発現プロフィールを決定するために使用され得る。特定の株の細胞または異常な表現型を示す細胞の発現プロフィールは、別の株の細胞または異常な表現型を示さない細胞(本明細書中で「参照細胞」と呼ばれる)の発現プロフィールと比較される。特定の株または異常な表現型を示す細胞の遺伝子の発現プロフィールの適切な参照細胞との比較によって、その株または異常な表現型に関係する発現特性が決定され得る。従って、1つの特定の実施形態において、本発明は、診断方法を提供し、ここで、異常な表現型(例えば、癌性)を示す患者の細胞の遺伝子発現プロフィールは、異常な表現型を示さない細胞(例えば、参照細胞)の遺伝子発現プロフィールと比較される。
【0127】
別の特定の局面において、本発明は治療薬(例えば、免疫刺激薬)のスクリーニングのための方法を提供し、(a)候補の治療薬に対して細胞(例えば、ヒト細胞)を暴露する工程、(b)暴露された細胞の遺伝子発現プロフィールを測定する工程、(c)候補の治療薬に対して暴露されていない細胞(例えば、参照細胞)の遺伝子発現プロフィールに対して、遺伝子発現プロフィールを比較する工程を包含する。本発明はさらに、上記の方法によって同定される治療薬を含む。
【0128】
別の局面において、本発明は、組換え分子および/または化合物あるいは分子集団および/または他の分子に対する化合物、化合物および/または支持体(好ましくは個体もしくは半個体)を接触または結合させるための方法を提供する。本発明の使用に好ましい分子および化合物は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、化学的化合物、薬物、脂質、リポタンパク質、糖質、ホルモン、ステロイド、抗体(またはそれらの一部)、抗原、酵素(例えば、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ等)、多糖類、ヌクレオシドおよびそれらの誘導体、ヌクレオチドおよびそれらの誘導体、アミノ酸およびそれらの誘導体、脂肪酸、レセプター、リガンド、ハプテン、小さい分子(例えば、―COOHのような活性化基)、結合分子(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン(strepavidin)、プロテインA、プロテインBなど)、成長因子、金属イオン、サイトカイン、リボザイム、または核酸分子、(例えば、RNA、DNA、DNA/RNAハイブリッド、cDNA、またはcDNAライブラリー、2本鎖核酸、線状核酸、環状核酸、スーパーコイル状核酸など)および前記のものの2つ以上の組み合わせを含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、分子は直接的または間接的に支持体に結合し得る。さらに、分子は共有結合または非共有結合のいずれかによって、支持体に結合し得る。説明の目的のために、核酸分子から支持体への間接的な非共有結合の結合の1つの例は、核酸分子に対して高い結合親和力を示すタンパク質は直接的に支持体に結合することにある。次いで、このタンパク質を含む支持体は、適した条件下で核酸分子と結合し、タンパク質を介する支持体に対する核酸分子の非共有結合的な接触を生じる。核酸分子/タンパク質相互作用の間のこの結合は、配列特異的または非特異的である。
【0129】
別の局面において、本発明は少なくとも1つの第1の核酸分子を含む支持体(その支持体に対して結合する、または結合しない)を提供し、ここで第1の核酸分子は1つ以上の組換え部位またはそれらの一部を含む。特定の実施形態において、本発明の支持体はさらに、少なくとも1つの第2の核酸分子、または少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質分子、または第1の核酸分子上の組換え部位を介して支持体に結合する他の化合物を含む。
【0130】
本発明はまた、本発明の支持体に関係して、(支持体に対して結合するか、または結合しないかのいずれかである)少なくとも1つの組換え部位を含む1つ以上の核酸分子、1つ以上の組換えタンパク質、および1つ以上のペプチドまたは少なくとも1つの組換え部位を含む化合物、からなる群から選択される1つ以上の成分をふくむ。
【0131】
別の局面において、本発明は、一つ以上の核酸分子、タンパクもしくはペプチド分子、または他の化合物を法を、支持体に接触または結合させる方法を提供し、その方法は(a)少なくとも1つの組換え部位含む少なくとも1つの核酸分子、タンパクもしくはペプチド分子、または他の化合物、またはこのような分子のあるいは化合物の集団を得る工程、および少なくとも1つの組換え部位を含む支持体を得る工程;および(b)支持体を含む組換え部位の全てまたは一部と組換えるために、少なくとも1つの核酸分子、タンパクもしくはペプチド分子、または他の化合物、またはこのような分子のあるいは化合物の集団において、いくつかのまたは全ての組換え部位を生じる工程を包含する。特定の実施形態において、方法はさらに、一つ以上の核酸分子を支持体に接触または結合させる工程を包含する。他の特定の実施形態において、1つの核酸分子のみが支持体に直接結合する。なお他の特定の実施形態において、核酸分子はマイクロアレイを形成する。なおさらに特定の実施形態において、マイクロアレイはDNAチップを形成する。本発明はさらに、上記の方法によって調製される支持体を提供する。特定の実施形態において、本発明の支持体は、個体または半個体のいずれかであり得る。さらに、上記で考察されたように、核酸分子は支持体に直接的または間接的に結合し得る。また上記で考察したように、核酸分子は支持体に共有結合または非共有結合のいずれかで支持体に結合し得る。さらに、核酸分子は、タンパク質または小さい分子(例えば、−COOHのような活性化基を有する分子)への結合を介して支持体に結合し得る。さらに、核酸分子は、不安定または不安定でない結合を介して支持体に結合し得る。
【0132】
別の局面において、本発明は目的の2つ以上の分子または化合物を結合(link)または結合(connect)するための方法を提供し、(a)目的の第1および第2の分子または化合物を提供する工程、目的の第1および第2の分子または化合物の各々は、少なくとも1つの組換え部位を含む;(b)目的の第2の分子における組換え部位のいくつかまたは全てを組換えるために、目的の第1の分子または化合物における組換え部位のいくつかまたは全てを生じる工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、この方法はさらに、組換え部位を含む核酸を、目的の第1および第2の分子または化合物に対して接触させる工程を包含する。1つの別の特定の実施形態において、目的の少なくとも1つの核酸または化合物は、タンパク質もしくはペプチド、核酸、糖質、ステロイド、または脂質を含む。
【0133】
いくつかの実施形態において、本発明の一つ以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の化合物および/または分子は、1つ以上例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の組換え部位をまたはそれらの一部を含み得る。このような分子および/または化合物は、標識されていないか、当該分野で公知の方法によってまたは検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、放射標識、質量標識、蛍光標識、化学発光法による標識、および酵素標識を含むがこれに限定されない。このような標識の使用は、支持体上の分子および/または化合物の存在または非存在の検出をさせ得る。このように、本発明は一般的に、任意の数の分子および/または化合物、あるいは分子集団および/または化合物集団を支持体に接触させる工程、およびこの方法によって作られた支持体に関係している。従って、このような化合物および/または分子、組換え部位またはその一部を含む核酸リンカーを介して支持体または構造に接触し得る。このようなリンカーは好ましくは小さい(例えば、5、20、30、50、100、200、300、400、または500塩基対長)。
【0134】
従って、本発明は、本発明のこの局面に従って使用され得る1つまたはいくらかの組換え部位(またはそれらの一部)を含む支持体を含む。従って、支持体に加えられる、または接触させられる、または結合させられる1つ以上の組換え部位またはそれらの一部を有する、1つまたはいくらかの核酸分子、またはタンパク質、ペプチドおよび/または他の分子および/または化合物は、それによって、組換え部位を含む支持体との組換え反応によって組換えられ、それによって目的の一つ以上の核酸分子、タンパク質、ペプチドおよび/または他の分子および/または化合物を含む支持体を作成される。目的の分子および/または化合物を支持体に結合させる組換え反応は、好ましくはインビトロで、目的の支持体および分子および/または化合物を少なくとも1つの組換えタンパク質と接触させる(支持体上に存在する少なくとも1つの組換え部位を用いる、目的の分子および/または化合物上の少なくとも1つの組換え部位の、組換えを起こすのに十分な条件の下で)ことによって達成され得る。本発明のこの局面は特に、1つ以上(例えば、2,3,4,5,7,10,12など)の支持体において核酸、またはタンパク質および/または他の分子および/または化合物のアレイを作成する場合に、支持体または支持体の種々の部分に対する組換えを通じて、いくらかの同一または異なる目的の核酸、タンパク質および/または他の分子および/または化合物の結合の容易さに関して、有用である。従って、本発明は、1つ以上例えば、2,3,4,5,7,10,12、15,20,30,50など)の核酸またはタンパク質分子および/または他の分子および/または化合物の支持体への接触あるいは結合の方法に関係して、以下の工程を包含する:
(a)少なくとも1つの組換え部位を含む、少なくとも最初の分子および/または化合物あるいは分子集団および/または化合物集団(例えば、本発明の出発(starting)核酸分子)を得る工程、および少なくとも1つの組換え部位を含む支持体(それはまた、本発明の出発分子であり得る)を得る工程;そして
(b)前記の少なくとも最初の分子および/または化合物あるいは分子集団および/または化合物集団上に、支持体上の組換え部位の全てまたは一部を用いて組換えるための、いくつかのまたは全ての組換え部位を生じる工程。
【0135】
一旦、その分子および/または化合物を支持体に加えると、支持体上のこのような分子および/または化合物の、存在あるいは非存在あるいは位置は、決定され得る(例えば、検出可能な標識を用いて)。さらに、支持体に結合する分子および/または化合物は、周知の技術によって、さらに操作され得る。
【0136】
本発明に従う1つまたは複数の分子および/または化合物の支持体への結合に加えて、本発明はまた、支持体によって含まれる1つ以上の分子および/または化合物の置換、挿入、または欠失を可能にする。本明細書中で考察されるように、インサートの分子および/または化合物内の特定の部位の組換えを起し、分子および/または化合物の全てまたは一部が、除去されるか、またはインサートのほかの分子および/または化合物を用いて置換され得る。従って、分子の全部または一部の、支持体への付加に加えて、組換えはインサートの分子および/または化合物の全部あるいは一部を、支持体から除去するまたは置換するために使用され得る。
【0137】
支持体に付加される、または支持体から除去される分子および/または化合物はさらに、本発明に従って、そして本明細書中に記載のように、操作されるか、あるいは分析される。例えば、結合体に付加されている、あるいは結合体から除去される分子および/または化合物のさらなる分析または操作は、配列決定、ハイブリダイゼーション(DNA、RNAなど)、増幅、核酸合成、タンパク質発現またはペプチド発現、タンパク質―DNA相互作用(2ハイブリッド分析または逆(reverse)2ハイブリッド分析)、他の分子および/または化合物、ホモログ組換えとの相互作用または結合の研究、または遺伝子ターゲッティング、ならびに組換えライブラリー分析および組換えライブラリー操作、を含む。このような操作は、分子および/または化合物が支持体に結合する間に、あるいは分子および/または化合物が支持体から除去された後に、達成される。
【0138】
本発明に従って、核酸を支持体に接触させるために、周知の技術によって、任意の個体または半個体が使用され得、そして組換え部位(またはその一部)を含む配列が付加される。さらに、組換え部位は、当該分野で周知の方法によって、目的の核酸、タンパク質、および/または他の分子および/または化合物に加えられ得る。さらに、任意の野生型または変異型組換え部位、または同一のまたは異なる組換え部位の組換えは、目的の分子および/または化合物を支持体に加える、または支持体から除去するために使用され得る。
【0139】
本発明はまた、1つ以上の組換え部位またはそれらの一部を含む任意の支持体、ならびに前記支持体に結合している1つ以上の組換え部位(またはそれらの一部)を含む、核酸、タンパク質分子および/または他の分子および/または化合物を含む支持体、に関係している。
【0140】
本発明はまた、本発明のこのような支持体を含む組成物に関係している。このような組成物はさらに、1つ以上の組換えタンパク質(好ましくは部位特異的な組換えタンパク質)、適した緩衝剤(例えば、組換えを引き起こすための)、核酸、タンパク質分子、および/または他の分子および/または化合物(好ましくは、支持体に非結合であり得る組換え部位を含む)、および本発明に従って、組換え部位を組換えるために使用され得る他の試薬、およびそれらの組み合わせを含む。本発明はまた、本発明の支持体、またはそれに接触する核酸、またはタンパク質分子または他の分子および/または化合物のさらなる操作および分析における使用のための組成物に関係している。さらなる操作および分析は、支持体に結合する間、または支持体から除去した後に、核酸、タンパク質、および/または他の分子および/または化合物において行われ得る。このような組成物は適した緩衝液および酵素(例えば、制限酵素、ポリメラーゼ、リガーゼ、組換えタンパク質など)を含み得る。
【0141】
別の局面において、本発明は一つ以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50)の分子および/または化合物あるいは分子集団および/または化合物集団を、一つ以上の同一の分子、または異なる分子および/または化合物あるいは分子集団および/または化合物に接触させるまたは結合させるための方法を提供する。従って、本発明は一般的に、組換えによって、任意のいくらかの分子および/または化合物あるいは分子集団または化合物集団の結合に関係している。本明細書中に記載されるように、このような結合された分子および/または化合物は、標識されないか、または検出可能に標識され得る。さらに、このような結合された分子および/または化合物は、共有結合で、または非共有結合で結合され得る。適した分子および/または化合物は、核酸、タンパク質またはペプチド、化学的化合物、薬物、脂質、リポタンパク質、ホルモンなどのような本明細書に記載されるものを含む。1つの実施形態において、同一の分子および/または化合物、あるいは同一型の分子および/または化合物(例えば、タンパク質―タンパク質、核酸―核酸など)は、組換えを通じて結合され得る。従って、1つの局面において、小さい分子および/またはタンパク質は組換え部位に結合され、そして次いで種々の組み合わせで互いに結合され得る。
【0142】
別の局面において、異なる分子および/または化合物、あるいは異なる型の分子および/または化合物(例えば、タンパク質―核酸、核酸―リガンド、タンパク質―リガンドなど)は、組換えを通じて結合され得る。さらに、組換えを通じて結合された分子および/または化合物(例えば、タンパク質―タンパク質、核酸―リガンドなど)は、本明細書で記載されるような組換えを通じて、支持体または構造へ接触され得る。従って、生産された分子および/または化合物(必要に応じて支持体に結合される)は、1つ以上の組換え部位(またはそれらの一部)によって結合され得る。このような組換え部位(またはそれらの一部)は、従来の技術を使用して、タンパク質、ペプチド、糖質、ステロイド、および/または脂質あるいはそれらの組み合わせのような分子に接触し得、そして、生じた組換え部位を含む分子および/または化合物が本発明を使用して結合され得る。さらに、結果的に生じた、結合された分子および/または化合物が1つ以上の組換えを介して、組換え部位を含む他の分子および/または化合物へ接触され得る。例えば、組換え部位を含む核酸は、目的の分子に接触し得、そして組換え部位を含む第2の核酸は目的の第2の分子に接触され得る。部位の間の組換えは、小さい核酸リンカーを介して、結果的に2つの分子の接触を生じる。核酸リンカーは、必要性に依存する任意の長さであるが、好ましくは小さくあり得る(例えば、約5〜約500bp長)。この方法論を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、ステロイドおよび/または脂質、またはそれらの組み合わせは、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、ステロイドおよび/または脂質、またはそれらの組み合わせに接触され得る。従って、本発明は、2つ以上の分子および/または化合物を結合させる方法を提供し、以下の工程を含む:
(a)少なくとも第1および第2の分子および/または化合物(少なくとも1つの組換え部位(またはそれらの一部)を含んでいる前記分子および/または化合物のそれぞれ)を得る工程;および
(b)前記第1の分子および/または化合物における組換え部位(またはそれらの部分)の全部または部分を用いて組換えるために、前記第1の分子および/または化合物における組換え部位(またはそれらの一部)のいくつかまたは全てを生じる工程。
【0143】
いくつかの好ましい実施形態において、組換え部位は、従来の接合技術をしようすることによって、目的の分子に接触させられ得る。例えば、組換え部位を含むオリゴヌクレオチドは、1つ以上(例えば、2、3、4、5、7、10など)の反応性官能基部分を含むように合成され得、これは同一または異なり得る。適した反応性官能基部分は、アミノ基、エポキシ基、ビニル基、チオール類などを含むがこれに限定されない。1つ以上の反応性官能基部分を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野において慣例的である。一旦合成されると、1つ以上(例えば、2、3、4、5、7、10など)の反応性官能基部分を含むオリゴヌクレオチドは、目的の分子または化合物上に存在する1つ以上の反応基に接触し得る。このオリゴヌクレオチドは、1つ以上の反応性官能基部分が1つ以上の反応性官能基と反応することによって、直接的に接触し得る。いくつかの実施形態において、この接触は、オリゴヌクレオチド上に存在する1つ以上の反応性官能基部分、および目的の分子上に存在する1つ以上の反応性基と結合し得る適した結合基を使用するときに、効果を及ぼされ得る。当業者は、オリゴヌクレオチド上の反応性官能的部分が目的の分子および/または化合物上の反応性官能基部分と同じ、または異なり得る。目的の分子に対するオリゴヌクレオチドの接合のための適した試薬および技術は、Hermanson、Bioconjugate Techniques、Academic Press Inc.,San Diego,CA、1996中で見出される。
【0144】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関係していて、そして特に、本発明の産物核酸分子、または本発明の他の結合分子および/または化合物(例えば、タンパク質―タンパク質、核酸―タンパク質)、またはこのような産物核酸を含む支持体、もしくは分子および/または化合物に結合された支持体を作製する場合に使用するためである。本発明はまた、核酸、タンパク質、および/または他の分子および/または化合物を1以上の支持体へ(もしくは支持体から)付加するおよび/または除去するおよび/または置換するための、本発明の方法に従って、本発明の組み合わせライブラリーを作製および使用するための、そして相同組換え(特に、遺伝子ターゲッティング)を行うための、キットに関係している。本発明のキットはまた、本発明の方法によって生産された組換えを有する分子および/または化合物をさらに操作するための、さらなる成分を含む。本発明のキットは、本発明の一つ以上の核酸分子(特に、1つ以上の組換え部位を含んでいて、そして必要に応じて1つ以上の反応性官能基部分を含んでいる、出発分子)、本発明の1つ以上の分子および/または化合物、または本発明の一つ以上の支持体、および/または本発明の1つ以上のベクターを含み得る。このようなキットは、必要に応じて、1つ以上(例えば2、3、4、5など)の宿主細胞、1つ以上の宿主細胞へ分子または化合物を誘導(例えば、トランスフェクションまたは形質転換による)するのための一つ以上の試薬、1つ以上の核酸、1つ以上(例えば2、3、4、5など)のポリメラーゼおよび/または逆転写酵素、1つ以上(例えば2、3、4、5など)の適したバッファー、1つ以上(例えば2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)のプライマー、1つ以上(例えば2、3、4、5、7,10など)の終結因子、組み合わせライブラリーを作製するための1つ以上(例えば2、3、4、5、7,10、12、15、20、30、50など)の分子集団、および1つ以上(例えば2、3、4、5、7,10、12、15、20、30、50など)の組み合わせライブラリー、を含む群からなるさらなる成分を含み得る。
【0145】
別の局面において、本発明は核酸セグメントの結合、欠失、または置換するためのキットを提供し、これらのキットは、(1)1つ以上の組換えタンパク質または1つ以上の組換えタンパク質を含む成分、および(2)組換え部位を含む1つ以上の核酸分子(好ましくは、少なくとも2つの異なる組換え特異性を有するベクター)、からなる群から選択される少なくとも1つ以上の成分を含む。本発明のキットはまた、(a)さらなる組換え部位を含むさらなる核酸分子;(b)リガーゼ活性を有する1つ以上の酵素;(c)ポリメラーゼ活性を有する1つ以上の酵素;(d)逆転写酵素活性を有する1つ以上の酵素;(e)制限エンドヌクレアーゼ活性を有する1つ以上の酵素;(f)1つ以上のプライマー;(g)1つ以上の核酸ライブラリー;(h)1つ以上の支持体;(i)1つ以上のバッファー;(j)1つ以上の洗浄剤または洗浄を含む溶液;(k);1つ以上のヌクレオチド;(l)1つ以上の終結因子;(m)1つ以上のトランスフェクション試薬;(n);1つ以上の宿主細胞;および(o)キットの成分を使用するための説明書、からなる群から選択される1つ以上の成分を含み得る。
【0146】
さらに、本発明のキットは、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3レソルバーゼ、ΦC31、TndX、XerC、およびXerDからなる群から選択される1つ以上の組換えタンパク質を含み得る。
【0147】
さらに、本発明のキットの組換え部位は、一般的に、重なる7塩基対の重複領域(overlap region)を有するatt部位を含む各々に、異なる組換え特異性を有する。本発明の特定の実施形態において、7塩基対の最初の3ヌクレオチドまたは、AAA、AAC、AAG、AAT、ACA、ACC、ACG、ACT、AGA、AGC、AGG、AGT、ATA、ATC、ATG、ATT、CAA、CAC、CAG、CAT、CCA、CCC、CCG、CCT、CGA、CGC、CGG、CGT、CTA、CTC、CTG、CTT、GAA、GAC、GAG、GAT、GCA、GCC、GCG、GCT、GGA、GGC、GGG、GGT、GTA、GTC、GTG、GTT、TAA、TAC、TAG、TAT、TCA、TCC、TCG、TCT、TGA、TGC、TGG、TGT、TTA、TTC、TTG、およびTTTからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0148】
特定の実施形態において、本発明のキットはatt間での組換えを触媒し得る1つ以上の組換えタンパク質を含んでいる成分を含む。関連した実施形態において、これらの成分は、attB ×attP(BP)反応、attL ×attR(LR)反応、またはBP反応およびLR反応の両方を触媒し得る1つ以上の組換えタンパク質を含む成分を、含む。
【0149】
本発明のキットで提供される核酸ライブラリーは、cDNAまたはゲノムライブラリーを含み得る。さらに、これらのライブラリーは、抗体の軽鎖および重鎖の種々のドメインをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【0150】
本発明はまた、本発明の方法を行うための組成物、および本発明の方法を行っている間に生じた組成物に関係し得る。特に、本発明は、本発明の方法(これらの核酸分子を含んでいる宿主細胞を調整する方法)によって調製された核酸分子、これらの方法によって調製された宿主細胞、およびこれらの核酸分子によってコードされている産物(これらの核酸分子によってコードされている核酸(例えば、RNA、タンパク質など))(例えば、RNA、タンパク質など)を生産するためのこれらの宿主細胞を使用する方法を含む。
【0151】
本発明の組成物、方法およびキットが好ましく調製され、そしてλファージの部位特異的な組換えシステムおよび、さらに好ましくはInvitrogen Corp.,Life Technologies Division(Rockville,Maryland)から入手可能なGATEWAYTM Recombinational Cloning Systemを使用して行われる。
GATEWAYTM Cloning Technology Instruction Manual(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division)は、このシステムをさらに詳しく記載し、そして本明細書中にその全体が参考文献として援用される。
【0152】
本発明の、他の好ましい実施形態は、当該分野で公知のものを参照して、本発明の以下の図および説明を参照して、および請求項の範囲を参照して、当業者に明らかである。
【0153】
(発明の詳細な説明)
(定義)
続く説明において、組換えDNA技術において使用される多くの用語は、広範に利用される。このような用語が与えられるべき範囲を含む、本明細書および請求の範囲の明らかなそして一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【0154】
遺伝子:本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、タンパク質、または非翻訳RNA(例えば、rRNA、tRNA、アンチセンスRNA)の発現に必要な情報を含む核酸をいう。遺伝子がタンパク質をコードする場合、それは、プロモーターおよび構造的な遺伝子オープンリーディングフレーム配列(ORF)、ならびにタンパク質の発現に関与する他の配列を含む。もちろん、当業者に明瞭に明らかであるように、遺伝子産物の生成に必要な転写および翻訳機構は、遺伝子の定義内に含まれない。遺伝子が非翻訳RNAをコードする場合、それは、プロモーターおよび非翻訳RNAをコードする核酸を含む。
【0155】
構造遺伝子:本明細書中で使用される場合、句「構造遺伝子」は、メッセンジャーRNAに転写される核酸配列をいい、メッセンジャーRNAは、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される。
【0156】
宿主:本明細書中で使用される場合、用語「宿主」は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意の核酸分子のレシピエントであり得る任意の原核生物または真核生物をいう。核酸分子は、構造遺伝子、転写調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど)および/または複製の起点を含み得るがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主」および「組換え宿主細胞」は、交換可能に使用され得る。このような宿主の例としては、、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratoy Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982)を参照のこと。
【0157】
転写調節配列:本明細書中で使用される場合、句「転写調節配列」は、任意の形態または構造の、核酸分子において含まれるヌクレオチドの機能的ストレッチをいい、これは、(1)1つ以上の構造遺伝子(例えば、2、3、4、5、7、10など)のメッセンジャーRNAへの転写、または(2)1つ以上の遺伝子の非翻訳RNAへの転写を調節するように作用する。転写調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【0158】
プロモーター:本明細書中で使用される場合、プロモーターは、転写調節配列の例であって、そして、具体的には、開始コドンまたは非翻訳RNAをコードする核酸に近接して位置される、遺伝子の5’領域として一般に記載される核酸である。隣接する核酸セグメントの転写は、プロモーター領域で開始される。転写の抑制性プロモーター速度は、抑制剤に応答して減少する。転写の誘導プロモーターの速度は、誘導剤に応答して増加する。転写の構成性プロモーターの速度は、特に調節されないが、一般的な代謝状態の影響下で変更し得る。
【0159】
挿入物:本明細書中で使用される場合、用語「挿入物」は、より大きい核酸分子の一部である所望の核酸セグメントをいう。多くの例では、挿入物は、より大きい核酸分子に導入される。例えば、図2において、ccdBおよびDNA−Aと標識された核酸セグメントは、そこに示されるより大きい核酸分子に関する核酸挿入物である。多くの場合において、挿入物は、組換え部位に隣接する(例えば、各末端における少なくとも1つの組換え部位)。しかし、特定の実施形態において、挿入物は、一方の末端の組換え部位のみを含む。
【0160】
標的核酸分子:本明細書中で使用される場合、句「標的核酸分子」は、目的の核酸セグメント、好ましくは、本発明の化合物および方法を使用する際に作用される核酸をいう。このような標的核酸分子は、好ましくは、1つ以上の遺伝子(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)または遺伝子の一部を含む。
【0161】
挿入物ドナー:本明細書中で使用される場合、句「挿入物ドナー」は、挿入物を保有する本発明の2つの親核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)の1つをいう(図1を参照のこと)。挿入物ドナー分子は、組換え部位により両側に隣接された挿入物を含む。挿入物ドナーは、直線状または環状であり得る。本発明の1つの実施形態において、挿入物ドナーは、環状核酸分子であり、必要に応じてスーパーコイル化され、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む。挿入物の集団または核酸セグメントの集団が、挿入物ドナーを作製するために使用される場合、挿入物ドナーの集団が生じ、そして本発明に従って使用され得る。
【0162】
産物:本明細書中で使用される場合、用語「産物」は、組換えクローニングプロセスの間に、2次的な組換え事象後に産生されるA配列およびD配列を含む所望される娘分子の1つをいう(図1を参照のこと)。この産物は、クローン化またはサブクローン化されるべき核酸を含む。本発明に従って、挿入物ドナーの集団が使用される場合、産物分子の得られた集団は、挿入物ドナーの挿入物の集団の全てまたは一部分を含み、そして好ましくは、挿入物ドナーの元々の分子の代表的な集団を含む。
【0163】
副産物:本明細書中で使用される場合、用語「副産物」は、クローン化またはサブクローン化されることが所望であるセグメントを欠く、娘分子(組換え的なクローニングプロセス間の第2の組換え事象後に生成される新しいクローン)をいう。
【0164】
融合体:本明細書中で使用される場合、用語「融合体」は、両方の親(出発)分子を含む本発明の少なくとも1つの組換え中間核酸分子である。融合体は、直線状または環状であり得る。RNAおよびポリペプチドは、適切な宿主細胞株(例えば、E.coli DB3.1(特に、E.coli LIBRARYEFFICIENCY(登録商標)DB3.1TMCompetent Cell))を用いて、そして融合体分子において見出される両方の選択マーカーについて選択した融合体から発現され得る。
【0165】
認識配列:本明細書中で使用される場合、句「認識配列」は、タンパク質、化合物、DNA、またはRNA分子(例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、またはリコンビナーゼ)が、認識し、そして結合する特定の配列である。本発明において、認識配列は、通常、組換え部位をいう。例えば、Creリコンビナーゼのための認識配列は、8塩基対コア配列に隣接している2つの13塩基対逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位として働く)から構成される34塩基対配列であるloxPである。Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521−527(1994)の図1を参照のこと。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼにより認識されるattB配列、attP配列、attL配列、およびattR配列である。attBは、2つの9塩基対コアタイプのInt結合部位および1つの7塩基対オーバーラップ領域を含むおよそ25塩基対配列である。attPは、コアタイプInt結合部位およびアーム(arm)タイプInt結合部位ならびに補助タンパク質組込み宿主因子(IHF)、FISおよびエキシジョナーゼ(Xis)についての部位を含む、およそ240塩基対配列ある。Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993)を参照のこと。このような部位はまた、本発明の方法において、産物の産生を高める本発明に従って、操作され得る。例えば、このような操作された部位が、P1ドメインまたはH1ドメインを欠いて、組換え反応を不可逆にさせる(例えば、attRまたはattP)場合、このような部位は、これらの部位のドメインがいくつかの方法において改変されていることを示す、指定されたattR’またはattP’であり得る。
【0166】
組換えタンパク質:本明細書中で使用される場合、句「組換えタンパク質」としては、除去(excisive)タンパク質または組込み(integrative)タンパク質、酵素、補因子、または1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を含む組換え反応に関わる関連タンパク質が挙げられ、これらは、野生型タンパク質(Landy、Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993)を参照のこと)、または変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはそのフラグメントを含む融合タンパク質)、フラグメント、およびその改変体であり得る。組換えタンパク質の例としては、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3レソルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、およびParAが挙げられる。
【0167】
組換え部位:本明細書中で使用される場合、句「組換え部位」は、組換えタンパク質による組込み(integration)/組換え反応に参加する核酸分子上の認識配列をいう。組換え部位は、組込みまたは組換えの開始段階の間に部位特異的組換えタンパク質によって認識され、そして結合される、この参加する核酸分子における核酸の個々の部分またはセグメントである。例えば、Creリコンビナーゼについての組換え部位は、8塩基対コア配列に隣接する2つの13塩基対逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位として働く)から構成される34塩基対配列であるloxPである。Sauer,B.,Curr.Opin.Biotech.5:521−527(1994)の図1を参照のこと。認識配列の他の例としては、本明細書中に記載される、attB配列、attP配列、attL配列、およびattR配列、ならびにその変異体、フラグメント、改変体および誘導体が挙げられ、これらは、組換えタンパク質λ Intによって、および補助タンパク質組込み宿主因子(IHF)、FISおよびエキシジョナーゼ(Xis)によって認識される。Landy,Curr.Opin.Biotech.3:699−707(1993)を参照のこと。
【0168】
組換え部位は、任意の多数の公知の方法によって分子に添加され得る。例えば、組換え部位は、平滑末端ライゲーション、完全または部分的にランダムなプライマーを用いて行なわれたPCR、または組換え部位が隣接する制限部位を使用するベクターに核酸分子を挿入することによって核酸分子に添加され得る。
【0169】
組換えクローニング:本明細書中で使用される場合、句「組換えクローニング」は、米国特許第5,888,732号および同6,143,557号(これらの内容は、本明細書中で参考として完全に援用される)において記載されるような方法をいい、これによって、核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまたはインビボで、交換され、挿入され、戻され(replace)、置換されまたは改変される。好ましくは、このようなクローニング方法は、インビトロ方法である。
【0170】
抑制(repression)カセット:本明細書中で使用される場合、句「抑制カセット」は、サブクローニングベクターに存在するリプレッサーまたは選択マーカーを含む、核酸セグメントをいう。
【0171】
選択マーカー:本明細書中で使用される場合、句「選択マーカー」は、あるものを、しばしば特定の条件下で、分子(例えば、レプリコン)またはその分子を含む細胞についてあるいはそれらに対して、選択を可能にする核酸セグメントである。これらのマーカーは、活性(例えば、限定されないが、RNA、ペプチド、またはタンパク質の産生)をコードし得、またはRNA、ペプチド、タンパク質、無機化合物または無機組成物および有機化合物または有機組成物などに対する結合部位を提供し得る。選択マーカーの実施例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:(1)別の毒性化合物(例えば、抗生物質)に対する耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント;(2)レシピエント細胞においてその他の点で欠損している産物をコードする核酸セグメント(例えば、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー);(3)遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント;(4)容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント(例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(REF)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、および細胞表面タンパク質、のような表現型マーカー);(5)細胞生存および/または機能に対して違ったふうに有害である産物を結合する核酸セグメント;(6)上記番号1〜5において記載される核酸セグメントのいずれかの活性を、別のやり方で阻害する核酸セグメント(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド);(7)基質を改変する産物を結合する核酸セグメント(例えば、制限エンドヌクレアーゼ);(8)所望される分子を単離または同定するために使用され得る核酸セグメント(例えば、特定のタンパク質結合部位);(9)他の非機能性(non−functional)であり得る特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント(例えば、分子の部分母集団のPCR増幅について);(10)核酸セグメントであって、これが存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する耐性または感受性を与えるDNAセグメント;(11)レシピエント細胞において毒性である産物(例えば、Diphteria toxin)または比較的毒性でない化合物を毒性化合物に変換する産物(例えば、ヘルペス単純チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)をコードする核酸セグメント;(12)核酸セグメントを含む核酸分子の複製、分配(partition)または遺伝力(heritability)を阻害するそのDNAセグメント;および/または(13)条件的複製機能(例えば、特定の宿主または宿主細胞株における複製あるいは特定の環境条件(例えば、温度、栄養条件など)下での複製)をコードする核酸セグメント。
【0172】
選択スキーム:本明細書中で使用される場合、句「選択スキーム」は、所望の核酸分子またはそれらと接触する宿主細胞(特に、産物、あるいは、エントリークローン、またはベクター、目的ベクター、ドナーベクター、発現クローンまたは発現ベクター、任意の中間体(例えば、融合体またはレプリコン)、および/または副産物を含む混合物由来の産物)の選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である。1つの局面において、本発明の選択スキームは、1つ以上の選択マーカーに依存する。1つの好ましい実施形態の選択スキームは、組換えクローニングの間に結合されるかまたは結合されないいずれかの少なくとも2つの成分を有する。1つの成分は、選択マーカーである。他の成分は、選択マーカーのインビトロまたはインビボでの発現、あるいは選択マーカーを運ぶプラスミドを保有する細胞(または核酸分子(例えば、レプリコン))の生存を制御する。一般に、この制御エレメントは、選択マーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現または活性を制御する他の方法が使用され得る。リプレッサーが使用されるかまたはアクチベーターが使用されるかは、マーカーが陽性(positive)選択についてかまたは陰性(negative)選択についてか、および種々の核酸セグメントの正確な配置に依存し、それは当業者に容易に明らかである。いくつかの好ましい実施形態において、この選択スキームが、1つ以上の所望の核酸分子のみの選択またはこれらのみについての富化を生じることである。本明細書中で定義されるように、核酸分子について選択する工程は、(a)所望される核酸分子の存在について選択するかまたは富化する工程(「陽性選択スキーム」といわれる)、および(b)所望される核酸分子でない核酸分子の存在に対して選択するかまたは富化する工程(「陰性選択スキーム」といわれる)を包含する。
【0173】
1つの実施形態において、選択スキーム(これは逆に行われ得る)は、3つの形態のうちの1つをとり、これらは、図1よって議論される。第1は、選択マーカーおよびリプレッサーと共に本明細書中で例示され、従って、セグメントDを有し、そしてセグメントCを欠く分子に対して選択する。第2は、セグメントCを有する分子に対して、およびセグメントDを有する分子について選択する。第2の形態の可能な実施形態は、インビトロの反応産物が導入されるべき細胞に毒性遺伝子(gene toxic)を運ぶ核酸セグメントを有する。毒性遺伝子は、毒性(toxic)遺伝子産物(毒性タンパク質または毒性RNA)として発現される核酸であり得るか、またはそれ自体毒性であり得、そして自然に(of itself)毒性であり得る(後者の場合、毒性遺伝子は、「遺伝特性(heritable trait)」のその古典的な定義を持つことが理解される)。
【0174】
このような毒性遺伝子産物の例は、当該分野で周知であり、そして以下を含むが、これらに限定されない:制限エンドヌクレアーゼ(例えば、DpnI、Nla3など)、アポトーシス関連遺伝子(例えば、ASK1またはbcl−2/ced−9ファミリーのメンバー)、ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)の遺伝子を含むレトロウイルス遺伝子、NP−1のようなディフェンシン、転換された反復DNA配列または対向パリンドローム核酸配列、ΦX174またはバクテリアファージT4由来の遺伝子のようなバクテリアファージリーシス遺伝子;rpsLのような抗生物質感受性遺伝子;pheSのような抗菌感受性遺伝子、プラスミドキラー遺伝子、細菌に対して遺伝子産物の毒性を産生する真核生物転写ベクター遺伝子(例えば、GATA−1);抑制機能の非存在下において、宿主を死滅させる遺伝子(例えば、kicB、ccdB、ΦX174E)(Liu,Qら、Curr.Biol.8:1300〜1309(1998))、ならびにレプリコン安定性および/または複製に消極的に影響を及ぼす他の遺伝子。あるいは、毒性遺伝子は、インビボで選択され得る(例えば、制限部位)。
【0175】
誘導プロモーターに作動可能に結合される制限エンドヌクレアーゼについての多くの遺伝子コードは、公知であり、そして本発明において使用され得る。例えば、米国特許第4,960,707号(DpnIおよびDpnII);同第5,000,333号、同第5,082,784号および同第5,192,675号(KpnI);同第5,47,800号(NgoAIIIおよびNgoAI);同第5,179,015号(FspIおよびHaeIII):同第5,200,333号(HaeIIおよびTaqI);同第5,248,605号(HpaII);同第5,312,746号(ClaI);同第5,231,021号および同第5,304,480号(XhoIおよびXhoII);同第5,334,526号(AluI);同第5,470,740号(NsiI);同第5,534,428号(SstI/SacI);同第5,202,248号(NcoI);同第5,139,942号(NdeI)および同第5,098,839号(PacI)を参照のこと。Wilson,G.G.、Nucl.Acids Res.19:2539〜2566(1991);およびLunnen,K.D.ら、Gene 74:25〜32(1988)も参照のこと。
【0176】
第2の形態において、セグメントDは、選択可(Selectable)マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー(Vector Donor)、融合体(Cointegrate)、および副産物(Byproduct)分子を有する形質転換を排除するが、一方で選択マーカーは、この産物(Product)を含む細胞について、そして挿入ドナー(Insert Doner)のみを有する細胞に対して、選択するために使用され得る。
【0177】
第3の形態は、同一分子においてシスであるセグメントAおよびDの両方を有する細胞を選択するが、異種分子においてトランスであるセグメントの両方を有する細胞を選択しない。このことは、2つの不活性フラグメント(これらは各々、セグメントAおよびD上にある)に分裂される選択マーカーによって実施され得る。
【0178】
フラグメントは、組換え部位に比較して配置され、セグメントが組換え事象によって一緒にもたらされる場合、それらは、機能性選択マーカーを再構成する。例えば、組換え事象は、プロモーターを構造核酸分子(例えば、遺伝子)と結合させ得、構造核酸分子の2つのフラグメントを結合させ得るか、または生存に必要なへテロ二量体遺伝子産物をコードする核酸分子を結合させ得るか、あるいはレプリコンの部分を結合させ得る。
【0179】
部位特異的リコンビナーゼ:本明細書中で使用される場合、句「部位特異的リコンビナーゼ」は、少なくとも以下の4つの成分(actives)(またはそれらの組合せ)を代表的に有する型のリコンビナーゼである:(1)特異的核酸配列の認識;(2)この配列(単数または複数)の切断;(3)鎖交換に関するトポイソメラーゼ活性;および(4)切断された核酸の鎖を再び封じるリガーゼ活性。Sauer,B.Current Opinioins in Biotechnology 5:521〜527(1994)を参照のこと。保存的な部位特異的組換えは、パートナー両方についての高い配列特異性によって、相同性組換えと転移とを区別する。この鎖交換機構は、DNA合成の非存在下で特異的核酸配列の切断および再結合を含む(Landy,A(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913〜949)。
【0180】
相同組換え:本明細書中で使用される場合、句「相同組換え」は、類似のヌクレオチド配列を有する核酸分子が、ヌクレオチド鎖を結合および交換するプロセスをいう。従って、第2の核酸分子の所定の位置での相同組換えに関与するのに効果的な第1の核酸分子のヌクレオチド配列は、第1の核酸分子と第2の核酸分子の規定の位置との間のヌクレオチド鎖の交換を容易にするヌクレオチド配列を有する。従って、第1の核酸は、一般的に、ヌクレオチド塩基対形成を促進する第2の核酸分子の一部に十分に相補的なヌクレオチド配列を有する。
【0181】
相同組換えは、2つの組換えパートナー核酸分子における相同配列を必要とするが、任意の特定の配列を必要としない。上記に示されるように、例えば、att部位のような組換え部位で発生する部位特異的組換えは、本明細書中で使用される句のように、「相同組換え」であると考えられていない。
【0182】
ベクター:本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、挿入に対して有用な生物学的特性または生化学的特性を提供する核酸分子(好ましくはDNA)である。例としては、プラスミド、ファージ、自律的に複製する配列(ARS)配列、動原体およびインビトロまたは宿主において複製し得るか、または複製され得る配列、あるいは宿主細胞内で所望の位置に所望の核酸セグメントを伝達し得る他の配列が挙げられ得る。ベクターは、1以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、2、3、4、5、7、10など)を有し得、ここで、この配列は、ベクターの基本的な生物学的機能の欠失を伴なわない決定様式で切断され得、そしてベクター中に、この核酸フラグメントは、その複製およびクローニングをもたらすためにスプライスされ得る。ベクターは、プライマー部位(例えば、PCRのための)、転写開始部位および/または翻訳開始部位ならびに/あるいは調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、組換え、転移または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントの挿入の方法(例えば、PCRフラグメントのウラシルN−グリコシダーゼ(UDG)クローニング(米国特許第5,334,575号および第5,888,795号(その両方が、本明細書中で全体が参考として援用される))、T:Aクローニングなどを含むが、これらに限定されない)はまた、本発明に従って使用され得るクローニングベクターにフラグメントをクローニングするために適用され得る。このクローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換される細胞を同定する際の使用に適切な1以上の選択マーカー(例えば、2、3、4、5、7、10など)を含み得る。
【0183】
サブクローニングベクター:本明細書中で使用される場合、句「サブクローニングベクター」は、好ましくは適切なレプリコンを含む環状または直鎖状の核酸分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクローニングベクター(図1中のセグメントD)はまた、クローン化核酸挿入物(図1中のセグメントA)に作用するか、またはこれと共に作用する最終産物に取り込まれることが望ましい機能エレメントおよび/または調節エレメントを含み得る。このサブクローニングベクターはまた、選択マーカー(好ましくはDNA)を含み得る。
【0184】
(ベクタードナー)
本明細書中で使用する場合、句「ベクタードナー」とは、本発明の2つの親核酸分子の1つをいう。この親核酸分子は、所望の産物の一部分となるべき核酸ベクターを含む核酸分節を所有する。ベクタードナーは、サブクローニングベクターD(または挿入ドナーがすでにクローニングベクターを含む場合、クローニングベクターと呼ばれ得る)および組み換え部位の側に位置する分節C(図1を参照のこと)を含む。分節Cおよび/またはDは、選択スキームについて上記されるように所望の産物娘分子に対する選択の一助となるエレメントを含み得る。組み換えシグナルは、同じかまたは異なってあり得、そして同じ組み換え体または異なる組み換え体によって作用され得る。さらに、ベクタードナーは、直鎖または環状であり得る。
【0185】
(プライマー)
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドをいう。この一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、核酸分子(例えば、DNA分子)の増幅または重合の間にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される。1つの局面において、プライマーは、配列決定プライマー(例えば、普遍配列決定プライマー)であり得る。別の局面において、プライマーは、組み換え部位またはその部分を含み得る。
【0186】
(アダプター)
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントもしくは分節(好ましくはDNA)をいう。このオリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントもしくは分節は、1つ以上の組み換え部位(またはこのような組み換え部位の部分)を含む。本発明に従うこのオリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントもしくは分節は、環状または直鎖挿入ドナー分子および本明細書中に記載される他の核酸分子に付加され得る。組み換え部位の部分を使用する場合、ミッシング部分は、挿入ドナー分子によって提供され得る。このようなアダプターは、環状または直鎖分子内の任意の位置で付加され得るが、アダプターは、好ましくは直鎖分子の1つのもしくは両方の末端でまたは付近で付加される。好ましくはアダプターは、目的の特定の核酸分子の(側に位置する)両方の側に位置されるように配置される。本発明に従う場合、アダプターは、標準的な組み換え技術(例えば、制限消化および結合)によって目的の核酸分子に付加され得る。例えば、アダプターは、始めに適切な制限酵素を用いて分子を消化することによって環状分子に付加され得、切断部位でアダプターを付加し、そして切断部位でアダプターを含む環状分子を再形成する。他の局面において、アダプターは、相同性組み換えによって、RNA分子の組み込みによってなどで付加され得る。あついは、アダプターは、1つまたは両方の末端でアダプターを有する直鎖分子の1つ以上のそして好ましくは両方の末端に直接結合され得る。本発明の1つの局面において、アダプターは、直鎖分子の集団(例えば、cDNAライブラリーまたは切断されたもしくは消化されたゲノムDNA)に付加され、それによって集団の全てのもしくは実質な部分の1つそして好ましくは両方の末端でアダプターを含む直鎖分子の集団を形成し得る。
【0187】
(アダプター−プライマー)
本明細書で使用される場合、句「アダプター−プライマー」は、1つ以上の組み換え部位(またはこのような組み換え部位の部分)を含むプライマー分子をいう。本発明に従うこのプライマー分子は、本明細書中に記載の環状または直鎖核酸分子に付加され得る。組み換え部位の部分を使用する場合、ミッシング部分は、本発明の核酸分子(例えば、アダプター)によって提供され得る。このようなアダプター−プライマーは、環状または直鎖分子中の任意の位置で付加され得るが、アダプター−プライマーは、好ましくは直鎖分子の1つのもしくは両方の末端でまたは付近で付加される。このようなアダプター−プライマーの例および本発明の方法に従うそれらの使用は、本明細書中の実施例8に記載される。このようなアダプター−プライマーは、使用され種々の状況においておよび種々の技術(増幅(例えば、PCR)、結合(例えば、酵素的結合または化学的/合成的結合)、組み換え(例えば、相同性組み換えまたは非相同性(異常)組み換え)などが挙げられるが、これらに限定されない)によって1つ以上の組み換え部位またはそれらの部分を環状もしくは直鎖核酸分子に付加する。
【0188】
(テンプレート)
本明細書で使用される場合、用語「テンプレート」とは、増幅、合成、または配列決定される二重鎖または単鎖核酸分子をいう。二重鎖DNA分子の場合、第1および第2の鎖を形成するためのこの鎖の変性は、好ましくはこれらの分子が増幅、合成、および配列決定される前であるか、または二重鎖分子は直接テンプレートとして使用され得る。単鎖テンプレートの場合、プライマーは、少なくともテンプレートの部分に相補的に、適切な条件の元でハイブリダイズし、そしてポリメラーゼ活性を有する1つ以上のポリペプチド(例えば、2、3、4、5、または7つのDNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素)は次いで、テンプレートの全てまたは部分と相補的な分子を合成する。あるいは、二重鎖テンプレートについて、1つ以上の転写制御配列(例えば、2、3、4、5、7、またはそれ以上のプロモーター)を1つ以上のポリメラーゼとの組み合わせに使用して、テンプレートの全てまたは部分に相補的な核酸分子を作製し得る。新規に合成された分子は、本発明に従って、本来のテンプレートと比較して、長さが同じか、またはそれよりも短いものであり得る。新規に合成された分子の、ミスマッチの組み込み、あるいは合成または伸長の間の鎖の損失は、1つまたは多くのミスマッチの塩基対を生じ得る。従って、この合成された分子は、テンプレートに正確に相補的である必要はない。さらに、核酸テンプレートの集団を、合成または増幅の間に使用して、本来のテンプレート集団の典型的な代表の核酸分子の集団を産生し得る。
【0189】
(組み込み)
本明細書中で使用される場合、用語「組み込み」は、核酸(例えば、DNA)分子またはプライマーの部分を生じることを意味する。
【0190】
(ライブラリー)
本明細書中で使用される場合、用語「ライブラリー」とは、核酸分子(環状または直線状)の集合をいう。1つの実施形態において、ライブラリーは複数の核酸分子(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50、100、200、500、1000、5000、またはそれ以上)を含み、これは共通の供給源生物、期間、組織、または細胞に由来し得るかまたは由来し得ない。別の実施形態において、ライブラリーは、全てまたは部分、または生物の核酸含有量の多くの部分の代表(「ゲノム」ライブラリー)、あるいは、細胞、組織、器官または生物内において、発現される核酸分子(cDNAライブラリーまたはそれらから誘導されるセグメント)の全てまたは部分、または多くの部分のの代表的な核酸分子のセットである。ライブラリーはまた、デノボ合成、1つ以上の核酸分子の突然変異誘発などによって作製される、ランダムな配列を有する核酸分子を含む。このようなライブラリーは、1つ以上のベクター(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)に含まれ得るか、または含まれ得ない。
【0191】
(増幅)
本明細書中で使用される場合、「増幅」は、多くの核酸分子のコピーを、ポリメラーゼ活性を有する1つ以上のポリペプチドを使用して(例えば、1、2、3、4、またはそれ以上の核酸分子ポリメラーゼまたは逆転写酵素)増加するための、任意のインビトロの方法をいう。核酸の増幅は、ヌクレオチドのDNAおよび/またはRNA分子またはプライマーへのヌクレオチドの組み込みを生じ、それによってテンプレートに相補的な新しい核酸分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートを、テンプレートとして使用して、さらなる核酸分子を合成し得る。本明細書中で使用される場合、1つの増幅反応は、核酸の複製の多くの周からなる。DNA増幅反応には、例えば、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)が挙げられる。1つのPCR反応は、DNA分子の変性および合成の、5〜100回転からなる。
【0192】
(ヌクレオチド)
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸の組合わせをいう。ヌクレオチドは核酸分子(DNAまたはRNA)のモノマー単位である。用語ヌクレオチドには、リボヌクレオシド三リン酸ATP、UTP、CTP、GTPおよび、例えばdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の誘導体を含む。このような誘導体には、例えば、[αS]dATP、7−デアザ(deaza)−dGTPおよび7−デアザdATPが挙げられる。本明細書中で使用される用語ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体をいう。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示された例は、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPが挙げられるが、それらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は標識され得ないか、または公知の技術によって検出可能に標識され得る。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。
【0193】
(核酸分子)
本明細書中で使用される場合、句「核酸分子」は、全長ポリペプチドまたは任意の長さのポリペプチドのフラグメントをコードし得るか、または何もコードしない、任意の長さの、連続する核酸(リボNTP、dNTPまたはddNTP、またはそれらの組合わせ)の配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され得、そしてRNAとDNAの両方を含む。
【0194】
(オリゴヌクレオチド)
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、1つのヌクレオチドのペントースの3’部位と隣接するヌクレオチドのペントースの5’部位との間のリン酸ジエステル結合によって結合された、共有結合されたヌクレオチドの配列を含む、合成または天然分子をいう。
【0195】
(ポリペプチド)
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、任意の長さの、連続するアミノ酸の配列をいう。用語「ペプチド」または「オリゴペプチド」または「タンパク質」は、本明細書中では、用語「ポリペプチド」と交換可能に使用される。
【0196】
(ハイブリダイゼーション)
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」は、2つの相補的な単鎖核酸分子(RNAおよび/またはDNA)の塩基対が、二重鎖分子を形成することをいう。本明細書中で使用される場合、塩基対が完全に相補的でないにもかかわらず、2つの核酸分子はハイブリダイズし得る。従って、ミスマッチした塩基は、当該分野で周知であり、使用される適切な条件で、2つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。いくつかの局面において、ハイブリダイゼーションは、「ストリンジェントな条件」下で行うといわれている。本明細書中で使用される用語「ストリンジェントな条件」は、42℃一晩のインキュベートを、以下:50%ホルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルド溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性、剪断されたサケ精子DNAが含まれる溶液中で、それに続いてフィルターを、0.1×SSC中で65℃で洗うことを意味する。
【0197】
本明細書で使用される、組換え核酸技術および分子および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、一般に当業者に理解される。
【0198】
(概要)
本発明は、方法、組成物、および2つ以上のセグメントまたは核酸分子または他の分子および/または化合物(またはこれらの組合わせ)の組換え結合のためのキットに関する。本発明はまた、好ましくは組換え部位またはそれらの部分を介する、このような連結された核酸分子または他の分子および/または化合物が1つ以上の支持体または構造に、結合することに関する。従って、本発明は一般に、多数の核酸または他の分子および/または化合物が、1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、40など)またはそれらの部分を含む核酸リンカーを介して、連結することに関する。
【0199】
本発明によって産生された、連結された産物は多数の同じまたは異なる核酸または他の分子および/または化合物を、開始物質に依存して含み得る。このような開始物質には、任意の核酸(または、ペプチド核酸(PNA)などのそれらの誘導体)、化学化合物、検出可能な標識分子(例えば、蛍光分子および化学発光分子)、薬物、ペプチドまたはタンパク質、脂質、炭水化物、および、他の分子および/または1つ以上の組換え部位を含む化合物またはそれらの部分が挙げられるが、それらに限定されない。本発明に関する1つ以上のこのような組換え部位を介して、多数または、このような開始分子および/または化合物の組合わせは、本発明の産物を連結するように、連結され得る。さらに、特定の部分の欠失または置換、あるいは本発明の連結された産物の組成物は、組換えによって達成される。
【0200】
いくつかの実施形態において、連結されたセグメントは、好ましくは組換えクローニング方法によるだけでなく、相同組換えによって、例えばベクターのような異なる核酸分子に挿入される。従って、いくつかの実施形態において、組換え反応および、連結された2つ以上のセグメントのベクター中への組換えクローニングによる挿入によって、2つ以上の核酸セグメント(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)を組み合わせることによって、本発明は核酸分子(RNAまたはDNA)の構築に関する。
【0201】
連結された核酸分子が、さらに組換え反応によってさらなる核酸分子と結合する実施形態において、2つの組換え事象のタイミング、すなわちセグメントの結合およびベクター中へのセグメントの挿入は、重要ではない。すなわち、例えば、ベクター中への挿入の前に2つ以上の核酸セグメントがお互いに連結するか、または、それぞれのセグメント上の組換え部位が最初にベクター上の組換え部位と反応し、続いて核酸セグメント上の組換え部位が、セグメントを連結するためにお互い同士反応するかどうかは、本発明にとって重要ではない。さらに、核酸セグメントは、ベクターの1つまたは多数の部分でクローン化し得、そしてお互いに隣接して挿入される必要はなく、にもかかわらず、いくつかの実施形態において、ベクターとの2つ以上のこのようなセグメントの連結は、好ましい。
【0202】
本発明に従って、組換えクローニングは、効率的な選択および連結された核酸セグメントを含む分子(特にベクター)の単離を可能にする。従って、2つ以上の目的の核酸セグメントは、連結され得、そして必要に応じて、結合核酸分子のさらなる操作に適した単一ベクター中に挿入され得る。
【0203】
基本的な実施形態において、それぞれ少なくとも1つの組換え部位を含む、少なくとも2つの核酸セグメントは、2つの分子の全てまたは部分の結合に影響するように、分子中の組換え部位の位置に依存して、適切な組換えタンパク質と接触する。個々の核酸セグメントは、種々の配列(プライマー部位として適切な配列(例えば、配列決定プライマーまたは増幅プライマーのようなプライマーのための配列は、核酸の合成、増幅、または配列決定を惹起するようにハイブリダイズし得る)、転写または翻訳シグナル、またはプロモーターおよび/またはエンハンサーなどの調節配列、リボゾーム結合部位、Kozak配列、開始コドン、停止コドンなどの終末シグナル、複製起点、組換え部位(またはその部分)、選択マーカー、ならびに、GST、GUS、GFP、YFP、CFP、マルトース結合タンパク質、6ヒスチジン(HIS6)、エピトープ、ハプテンなどやそれらの組合わせなどのタンパク質融合(N末端またはC末端)を生成する遺伝子または遺伝子の部分を含むが、それらに限定されない)を含む。このようなセグメントのクローニングのために使用されるベクターは、これらの機能的な配列(例えば、プロモーター、プライマー部位など)を含む。このような配列を含むセグメントを組合わせ、そして必要に応じて配列を1つ以上のベクター(たとえば、2、3、4、5、7、10、12、15など)にクローニングしたあと、この分子は、標的核酸分子の配列決定または増幅(すなわち、組み込み配列によって導入されるプライマー部位の少なくとも1つを使用して)、標的核酸分子の変異(すなわち、標的核酸分子中、または標的核酸分子上の挿入、欠失、または置換によって)、相同組換えによる別の分子の挿入、標的核酸分子の転写、および標的核酸分子またはそれらのタンパク質からのタンパク質発現(すなわち、セグメントおよび/またはベクターによって含まれる翻訳および/または転写シグナルの発現によって)を含む、種々の方法で操作され得る。
【0204】
本発明はまた、開示された組換えクローニング方法を使用した、組合わせライブラリーの産生に関する。従って、1つ以上の結合された核酸セグメントは、核酸ライブラリーを含み得る。このようなライブラリーは、例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列をコードする配列の順列と一致した核酸分子を含む。この順列は、単一配列からなる別の核酸セグメントと結合し得、またあるいは、第2の核酸セグメントはまた、別のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の順列に一致したライブラリーで有り得、そしてそれは2つのセグメントの結合は、2つのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の順列の全ての可能な組み合わせを示すライブラリーを産生する。これらの核酸セグメントは、連続し得るか、または連続し得ない。組合わせライブラリーの使用の多くの例は、当該分野で公知である(例えば、Waterhauseら、Nucleic Acid Res.1993.第21巻9号、2265〜2266、Tsurushitaら、Gene、1996、第172巻1号、59〜63、Persson、Int.Rev.Immunol、1993 10:2〜3 153〜63、Chanockら、Infect Agents Dis 1993、6月2日:3 118〜31、Burioniら、Res Virol 1997 Mar〜Apr 148:2161〜4、Leung、Thromb.Haemost.1995 Jul 74:1 373〜6、Sandhu、Crit.Rev.Biotechnol.1992、12:5〜6 437〜62 および米国特許第5,733,743号、同5,871,907号、および5,858,657号(これらの全ては特に本明細書中に参考として援用される)を参考のこと)。
【0205】
方法に使用される1つ以上の核酸セグメント、および本発明の組成物が変異する場合、これらのセグメントは、(1)変異の指示された数または(2)変異の支持された数の平均のどちらかを含む。さらに、これらの変異は、核酸セグメントそれ自体またはその発現産物(例えば、このような核酸セグメントのポリペプチド)の参照と共に記録される。例えば、ライブラリーの核酸分子は、平均で少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%、本来のライブラリーの対応する核酸分子と同一である、核酸分子を産生するように変異し得る。同様に、ライブラリーの核酸分子は、平均で少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%、本来のライブラリーの対応する核酸分子によってコードされるポリペプチドに同一である、ポリペプチドをコードする核酸分子を産生するように変異する。
【0206】
(組換え部位)
本発明において使用される組換え部位は、組換え反応における基質として役に立ちうる任意の核酸であり得る。このような組換え部位は、野生型または天然に存在する組換え部位、あるいは、改変体、変異体、誘導体、または改変組換え部位であり得る。本発明における使用のための組換え部位の例には、ファージ−λ組換え部位(例えばattP、attB、attL、およびattRおよびそれらの改変体または変異体)、ならびに、例えばphi80、P22、P2、186、P4およびP1(例えばloxPおよびloxP511などのlox部位を含む)などの他のバクテリオファージ由来の組換え部位が挙げられるが、これらに限定されない。改変att部位(例えば、attB 1〜10、attP 1〜10、attR 1〜10、attL 1〜10)は、以下の実施例9および先の米国特許出願第60/136,744号、1999年5月28日提出、米国出願第09/517,466号、2000年3月2日提出(これらは特に本明細書中で参考として援用される)に記載される。独特の特異性を有する他の組換え部位(すなわち、第1の部位は、対応する部位と組換え、異なる特異性を有する第2の部位は組換えない)は、当該分野で公知であり、そしてそれを使用して本発明を実行する。これらの系のための対応する組換えタンパク質を、本発明に従って、指示された組換え部位と共に使用する。本発明において使用するための組換え部位および組換えタンパク質を提供するほかの系には、Saccharomyces cervisiae由来のFLP/FRT系、レソルバーゼファミリー(例えば、γδ、TndX、TnpX、Tn3レソルバーゼ、Hin、Hjc、Gin、SpCCE1、ParA、およびCin)、およびIS231ならびに他のBacillus thuringiensis転移性要素が挙げられる。本発明において使用するための他の適切な組換え系には、E.coli中のXerCおよびXerDリコンビナーゼおよびpsi、difおよびcer組換え部位が挙げられる。他の適切な組換え部位には、米国特許第5,851,808号ElledgeおよびLiu公開(これらは特に本明細書中で参考として援用される)で見出される。本発明において使用するための好ましい組換えタンパク質および変異、変更、改変、または誘導組換え部位には、米国特許第5,888,732号および同6,143,557号、および米国出願第09/438,358号(1999年11月12日提出)、基礎となる米国仮出願第60/108,324号(1998年11月13日提出)、および米国出願第09/517,466(2000年3月2日提出)、基礎となる米国仮出願第60/136,744号(1999年5月28日提出)に記載される部位、ならびに、Invitrogen Corp.Life Technologies Division(Rockville、MD)から入手可能であるGATWAYTM Cloning Technology(これら全ての開示は、その全体が特に本明細書中で参考として援用される)に関連する部位が挙げられる。
【0207】
本発明の実行において使用され得る組換え部位の代表的な例は、上記に引用されるatt部位が挙げられる。本発明は、他のatt部位と特異的に組換え得るatt部位は、領域と重なる7塩基対中、またはその近くの改変ヌクレオチドによって構築され得る。従って、本発明の方法、組成物、およびベクターの使用に適切な組換え部位には、15塩基対コア領域(GCTTTTTTATACTAA(配列番号37))(これは、全ての4つの野生型λatt部位、attB、attP、attL、およびattR(米国出願第08/663,002号(1999年6月7日提出)(現在の米国特許第5,888,732号)、および09/177,387号(1998年10月23日提出)、(これらはコア領域についてさらに詳細に記載し、これらの開示はその全体が本明細書中で参考として援用される)を参考のこと)において同一である)中の1、2、3、4、またはそれより多くのヌクレオチド塩基の挿入、欠失、または置換の部位が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の方法、組成物、およびベクターにおいて使用するために適切な組換え部位は、15塩基対コア領域に、少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である、15塩基対コア領域(GCTTTTTTATACTAA(配列番号37))中の1、2、3、4、またはそれより多くのヌクレオチド塩基の挿入、欠失、または置換の部位が挙げられる。
【0208】
類似して、attB1、attP1、attL1、およびattR1におけるコア領域は、attB2、attP2、attL2、およびattR2におけるコア領域もそうであるように、互いに同一である。本発明での使用に適切な核酸分子はまた、この15塩基対コア領域(GCTTTTTTATACTAA(配列番号37))内に存在する7塩基対の重複領域(TTTATAC、これは、インテグラーゼタンパク質に対する切断部位によって定義され、そして鎖交換が起こる領域である)内の1つ、2つ、3つ、4つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む核酸分子を含む。このような変異、フラグメント、改変体、および誘導体の例としては、以下における核酸分子を含むがこれらに限定されない:(1)7塩基対の重複領域の位置1でのチミンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換されている;(2)7塩基対の重複領域の位置2でのチミンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換されている;(3)7塩基対の重複領域の位置3でのチミンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換されている;(4)7塩基対の重複領域の位置4でのアデニンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはチミンで置換されている;(5)7塩基対の重複領域の位置5でのチミンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換されている;(6)7塩基対の重複領域の位置6でのアデニンが、欠失されているか、またはグアニン、シトシン、またはチミンで置換されている;(7)7塩基対の重複領域の位置7でのシトシンが、欠失されているか、またはグアニン、チミン、またはアデニンで置換されている;あるいは、この7塩基対の重複領域の内での1つ以上のこのような欠失および/または置換の任意の組合せ。上記の7塩基対の重複領域のヌクレオチド配列は、以下の表1に示される。
【0209】
以下の実施例9〜12に記載されるように、改変されたatt部位は、以下を実施するよう構築されている:(1)7塩基対の重複領域(TTTATAC)の最初の3つの位置内でなされた置換は、組換えの特異性に非常に影響し、(2)この最後の4つにおいてなされた置換(TTTATAC)は、部分的でのみ組換えの特異性を改変し、そして(3)7塩基対の重複の外側であるが、15塩基対のコア領域内の他の箇所におけるヌクレオチド置換は、組換えの特異性に影響を及ぼさないが、組換えの効率には影響する。従って、核酸分子および本発明の方法としては、組換えの特異性に影響を及ぼす1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10以上の組換え部位を含むこれらが挙げられ、特に、1つ以上(1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10、20、30、40、50など)の異なる組換え部位は、15塩基対のコア領域内での7塩基対の重複に実質的に対応し得、組換えの特異性に影響を及ぼす1つ以上の変異を有する。特に好ましいこのような分子は、コンセンサス配列(例えば、NNNATAC、ここで、「N」とは、任意のヌクレオチド(即ち、A、G、T/UまたはC)をいう)を含み得る。コンセンサス配列における最初の3つのヌクレオチドの1つが、T/Uである場合、最初の3つのヌクレオチドの残りの2つのうちの少なくとも1つは、なるべくT/Uではない。
【0210】
各att部位(attB、attP、attL、およびattR)のコア配列は、インテグラーゼ結合部位、インテグラーゼ切断部位、および特異性を決定する配列からなる機能的ユニットに分けられ得る。以下の実施例12において議論されるように、特異性の決定は、インテグラーゼ上鎖(top strand)切断部位に続く最初の3つの位置によって定義される。これらの3つの位置は、以下の参照配列において下線で示される:CAACTTTTTATACAAAGTTG(配列番号38)。7塩基対の重複領域の最初の3つのヌクレオチドと同じ配列を有する他のatt部位と非常に高い特異性で組換えられるこれらの3つの位置の改変(可能性のある64の組合せ)は、表1に示される。
【0211】
(表1.組換え特異性を改変する7塩基対のatt部位重複領域の最初の3つの改変)
【0212】
【表1】
本発明の方法、組成物、およびベクターにおいて適切な7塩基対のatt部位重複領域の代表的な例は、表2に示される。本発明はさらに、表2に示された1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、8つ、10,20,30,40,50、など)のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。従って、例えば、1つの局面において、本発明は、ヌクレオチド配列(GAAATAC、GATATAC、ACAATAC、またはTGCATAC)を含む核酸分子を提供する。しかし、特定の実施形態において、本発明は、本明細書の図24A〜25Cまたは実施例9において示されたatt部位コア領域を含む核酸分子を含まない。
【0213】
(表2.本発明に用いる場合に適切な7塩基対のatt部位重複領域の代表的な例)
【0214】
【表2】
上記のように、上記で議論された3塩基対領域への3’に位置するヌクレオチドの改変もまた、組換えの特異性に影響を及ぼす。例えば、7塩基対の重複の最後の4つの位置内での改変もまた、組換えの特異性に影響を及ぼす。
【0215】
本発明は、従って、同起源のパートナー(cognate partner)、ならびに、これらの組換え部位を含む分子と組換える組換え部位およびこれらの部位を生成し、同定し、そして用いるための方法、を提供する。このような部位を同定するために使用され得る方法は、以下の実施例12に示される。このような組換え部位の例としては、同起源のパートナーと会合し、そして組換える、塩基対の重複領域を含むatt部位が挙げられる。このような7塩基対の重複領域の特定の例であるヌクレオチド配列は、上記の表2に示される。
【0216】
さらに、本発明の実施形態としては、以下を含む単離された核酸分子が挙げられる:上記の表2に示された7塩基対の重複領域のヌクレオチド配列または配列番号37に示された15塩基対のコア領域に対して少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、もしくは少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列、ならびに、これらのヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列、、または、そのフラグメント、改変体、変異体、および誘導体を含む。本発明のさらなる実施形態としては、これらの核酸分子を含む組成物およびベクター、およびこれらの核酸分子を使用するための方法が挙げられる。
【0217】
少なくとも、例えば、特定の組換え部位またはその一部をコードする参照ヌクレオチド配列に対して95%「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、この組換え部位をコードする参照ヌクレオチド配列の、各100ヌクレオチドあたり5箇所までの変異(例えば、挿入、置換、または欠失)を含み得るポリヌクレオチド配列を除いて、参照配列に同一であることが意図される。例えば、参照attB1ヌクレオチド配列(配列番号5)に対して少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るため、attB1参照配列中のヌクレオチドの5%までが、欠失もしくは別のヌクレオチドと置換され得るか、またはattB1参照配列中の総ヌクレオチド数の5%までが、attB1参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’末端位もしくは3’末端位で生じ得るか、またはこれらの末端位間のいずれかの箇所で生じ得、参照配列中のヌクレオチド間か、または参照配列内の1つ以上の隣接基中のいずれかで個々に分散され得る。
【0218】
部分的問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、所定の組換え部位のヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のいずれであろうと、所定の組換え部位のヌクレオチド配列またはその一部は慣習的に公知のコンピュータープログラム(例えば、初期の配列アライメント(alignment)のためのDNAsisソフトウェア(Hitachi Software,San Bruno,California)、これに続く、複数配列アライメントのためのESEEバージョン3.0 DNA/タンパク質配列ソフトウェア(cabot@trog.mbb.sfu.ca))を用いて決定され得る。あるいは、このような決定は、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)を用いて達成され得,これは、2つの配列間が相同である最善のセグメントを見出すために局所的な相同性アルゴリズム(SmithおよびWaterman,Advances in Applied Mathematics 2:482−489(1981))を利用する。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に対して95%相同であるかどうかを決定するためにDNAsis、ESEE、BESTFITまたは任意のほかの配列アライメントプログラムを用いて、これらのパラメータをセットし、その結果、同一である割合は、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列中のヌクレオチド総数の5%までの相同性におけるギャップ(gap)が、許容される。
【0219】
上記のように、1つの局面において、本発明はさらに、本発明の核酸分子を用いる使用に適切な組換え部位を構築および/または同定するための方法、ならびにこれらの方法によって構築および/または同定される組換え部位を提供する。簡潔には、本発明は、他の組換え部位を用いて組換え得る組換え部位を構築および/または同定するための方法を提供する。例えば、本発明は、組換え部位を構築し、そしてこれらの組換え部位が他の組換え部位と組換えるかどうかを同定するための方法を提供する。組換え活性についてスクリーニングされる組換え部位および特異性は、いくらでもある手段(部位指向性変異誘発およびランダムな核酸合成を含む)によって構築され得る。
【0220】
本発明はさらに、「単使用」組換え部位を提供し、これは、1回の組換えを行い、次で、低頻度での組換え(例えば、続く組換え反応において、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または少なくとも1000倍、より低い組換え活性を有する)を行うか、または本質的に組換えを行えないかのいずれかである。本発明はまた、これらの部位を含む核酸分子を生成し、そして用いる方法を提供する。このような単使用組換え部位を生成し、同定するために使用され得る方法の例を、以下に示す。
【0221】
att系コアインテグラーゼ結合領域は、以下の核酸配列を有する、割り込まれた反復領域が反転された7塩基対:
−−−−−−>・・・・・・・<−−−−−−
caactttnnnnnnnaaagttg(配列番号39)
ならびに、完全または不完全な反復を含み得るそれらの変形物を含む。
【0222】
反復要素は、caac/gttgセグメント(下線)(これは中央の未決定配列(そのヌクレオチドは、文字「n」で表される)から遠位である)、およびttt/aaaセグメント(これは中央の未決定配列から近位である)を構成する、2つの遠位および/または近位の「ドメイン」に分割し得る。
【0223】
中央の未決定領域の片側または両側の、遠位および/または近位ドメインの配列組成における変化は、組換え反応の結果に影響を与え得る。影響の範囲および規模は、生成された特異的変化の機能、ならびに、特に組換え事象(例えば、LR反応対BR反応)である。
【0224】
例えば、attB部位は、以下の核酸配列を含むように変化すると考えられる:
−−−−−−>・・・・・・・<−−−−−−
caactttnnnnnnnaaacaag(配列番号40)
は、機能的に同族のattPと相互作用があり、attLおよびattRを生成する。しかし、「caag」(上記に示される配列の左側に位置する)を含むセグメントを獲得する後者の2つの組換え部位は、後に起こる組換え事象を非機能的にする。上記は、1つの組換え事象に従事した後でatt部位を非機能的にする、コアの結合配列の組み込みの多くの可能な変化のほんの1つである。従って、頓用の組換え部位のは、att部位の領域に重なる、反復領域が組み込まれた7塩基対において、ヌクレオチドを変化することによって調製され得る。この領域を図式化すると以下のように表される:
CAAC TTT[7塩基対重なり領域]AAA GTTG。
【0225】
頓用の組換え部位の生成において、1、2、3、4またはそれ以上のヌクレオチドの配列CAACTTTまたはAAAGTTG(すなわち、反復領域が反転された7塩基対)は、他のヌクレオチドと置換し得るか、または全部を欠失し得る。これらの反復領域が反転された7塩基対は、相補的なお互いに関係する配列を表す。従って、変更は、頓用組換え領域を生成するために、反復領域が反転された7塩基対のいずれかにおいて起こる。さらに、DNAが二重鎖であり、ならびに1つの反復領域が反転された7塩基対が存在する場合、他の反復領域が反転された7塩基対は、他方の鎖上に存在する。
【0226】
例示のために配列CAACTTTを使用すると、頓用組換え領域を形成し得る反復領域が反転された7塩基対の例は、以下の核酸分子を含むがそれらに限定されない:(1)反復領域が反転された7塩基対の第1位のシトシンを欠失するか、あるいはグアニン、アデニン、またはチミンで置換する;(2)反復領域が反転された7塩基対の第2位のアデニンを欠失するか、あるいはグアニン、シトシン、またはチミンで置換する;(3)反復領域が反転された7塩基対の第3位のアデニンを欠失するか、あるいはグアニン、シトシン、またはチミンで置換する;(4)反復領域が反転された7塩基対の第4位のシトシンを欠失するか、あるいはグアニン、アデニン、またはチミンで置換する;(5)反復領域が反転された7塩基対の第5位のチミンを欠失するか、あるいはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換する;(6)反復領域が反転された7塩基対の第6位のチミンを欠失するか、あるいはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換する;(7)反復領域が反転された7塩基対の第7位のチミンを欠失するか、あるいはグアニン、シトシン、またはアデニンで置換する;または1、2、3、4またはそれ以上のこのような欠失および/またはこの7塩基対領域における置換の組み合わせ。反復領域が反転された7塩基対の核酸配列の代表的な例を、以下の表3に列挙する。
【0227】
【表3】
頓用組換え部位を形成する核酸配列の代表的な例もまた、表4、1節に列挙される核酸配列と、表4、2節に列挙される核酸配列との組み合わせによって調整される。頓用組み合わせ部位もまた、これらの領域で内面的に、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7など)のヌクレオチドを挿入することによって調製し得る。
【0228】
【表4】
特定の核酸配列セグメントに関連する組換え事象を阻害しようとする、ほとんどの例において、変更された配列は、核酸セグメントの近位に位置する。例示のために以下の略図を使用すると:
=5’核酸セグメント3’=caac ttt[7塩基対重なり領域]AAA GTTG、反復領域が反転された7塩基対(すなわち、caac ttt)を示す小文字のヌクレオチド配列は、3’末における組換え(すなわち、核酸セグメントに関連する近位末端)を阻害しようとする場合、一般に、挿入、欠失および/または置換によって、頓用組換え部位を形成するように変更された配列を有する。従って、単一組換え反応を使用して、例えば、核酸セグメントを別の核酸分子に組み込み得、次いでその組換え部位は効果的に非機能的になり、その部位のさらなる組換え反応の実行を阻害する。同様に、頓用組換え部位は、核酸セグメントの両端に位置し得るので、その核酸セグメントは別の核酸分子に組み込まれるか、または環状化され得、そしてリコンビナーゼの存在においてさえも組み込まれたままか、または環状化されたままである。
【0229】
多くの方法を使用して、機能的な活性のための潜在的な頓用組換え部位をスクリーニングし得る(例えば、置換組換え事象を受けることの失敗に続いて、1つの組換え事象を受ける)。例えば、単一組換え事象の後に非機能的となる組換え部位を確認するために、組換え部位のスクリーニングに関連して、第1の組換え反応は、ネガティブ選択マーカーが1つ以上の潜在的欠損組換え部位に連結されたプラスミドの生成を実行し得る。次いで、そのプラスミドは、組換え部位に同様に連結されたポジティブ選択マーカーを含む別の核酸分子と、反応する。従って、この選択系は、組換えがネガティブ選択に感受性がある分子および組換えの起こらない分子がポジティブ選択によって向こうへ選択され得るように、設計される。次いで、このような系を使用して、所望の頓用コア部位変異体を直接選択し得る。
【0230】
当業者が理解するように、多くのスクリーニングアッセイが、上記に記載される結果と同様の結果を得られるように、設計され得る。多くの例において、これらのアッセイは、最初の組換え事象が生じ、次いで、続く組換え事象が生じ得ない組換え部位が同定されるように、またはこのような組換え部位を含む分子が選択されるように、設計される。関連するスクリーニングアッセイは、第2の組換え事象が起こる核酸分子に対する選択が生じる。さらに、上記に記載したように、スクリーニングアッセイは、引き続く組換え事象が起こる分子に対する選択、そして、引き続く組換え事象の起こらなかった分子の選択がある場所に、設計される。
【0231】
頓用組換え部位は、多くの数の核酸セグメントが相互に結合するかまたは複合組換え反応が起こる場合、組換えの頻度の減少、または阻害に特に有用である。従って、本発明は、頓用組換え部位を含む核酸、ならびにこれらの部位を使用する組換えを実行する方法を、さらに含む。
【0232】
(本発明の核酸分子の構築および使用)
以下に詳細に記載するように、1つの局面において、本発明は、特定の機能または活性を有する核酸分子を構築するモジュラー系を提供する。本発明は、核酸分子の集団を、1つ以上の公知または非公知の目的の標的配列(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、40など)に、または他の(公知または非公知の)核酸分子の集団に結合させ、それによって、独特および/または新規の分子(例えば、ハイブリッド分子)、ならびにこれらの分子によってコードされるタンパク質またはペプチドが得られ、そしてさらに分析される組合わせ分子(例えば、組合わせライブラリー(combinatorial libraries))の集団を作製するための方法を提供する。
【0233】
本発明は、また、1つよりも多くの核酸の挿入(例えば、2、3、4、5、6、8、10、12、15、20、40、50個などの挿入)を含むベクターを調製する方法を含む。本発明の1つの一般的な実施形態において、本発明のベクターは以下のように調整される。最終的に目標ベクターに挿入される核酸分子を獲得する(例えば、購入する、PCRによって調製する、または逆転写酵素を使用するcDNAの調製によって調製する)。適切な組換え部位は、核酸分子の5’末端または3’末端に合成中に組み込まれるか、または後に添加されるかのどちらかである。複数の核酸挿入を含むベクターを調製しようとする場合、1つの反応混合液または一連の反応混合液において、これらの挿入はベクターに挿入され得る。例えば、図16に示すように、複数の核酸分子セグメントは、末端と末端が連結され、そして実行された反応を使用して、例えば、単一反応混合物中において、ベクター中に挿入され得る。この反応混合物中の核酸セグメントは、これらの5’末端および3’末端の組換え部位が、特異的な順番および特異的な5’から3’への配向における、目的ベクターへの挿入が生じるように、設計され得る。あるいは、核酸セグメントは、これらが、順番、配向(すなわち、5’から3’への配向)挿入の数、および/または重複挿入を考慮せずに、目的ベクターに挿入するように設計される。
【0234】
さらに、いくつかの例において、1つ以上の核酸セグメントは、1つの末端のみに組換え部位を有する。また、所望する場合、この末端またはこれらの末端は、例えば、リガーゼまたはトポイソメラーゼの使用によって、他の核酸セグメントに連結され得る。例として、その5’末端にあるattR1部位を有する直線核酸分子は、attL1およびattL2部位に隣接するccdB遺伝子を含む目的ベクターと組換え得る。LR反応の前、間、後に、例えば制限酵素によって、ccdB遺伝子の逆側であるattR2部位の側で、目的ベクターは切断され得る。従って、目的遺伝子は、切断され、組換えを受けた後は直鎖状である。さらに、核酸分子のattR1部位は、核酸分子を含む直鎖状ベクターを賛成するために、目的遺伝子のattL1部位と組換えを受ける。次いで、生じた直鎖状産物は、リガーゼまたはトポイソメラーゼのような酵素を使用して、環状化され得る。
【0235】
本発明の別の局面を例示するために、図16に示される実施形態を使用すると、5’末端のattL1部位および3’末端のattL3部位を有する第1のDNAセグメントは、5’末端のattR3部位および3’末端のattL4部位を有する第2のDNAセグメントとの組換えによって、結合される。5’末端のattR4部位および3’末端のattL5部位を有する第3のDNAセグメントは、第2のDNAセグメントの3’末端のattL4部位との組換えによって結合される。5’末端のattR5部位および3’末端のattL2部位を有する第4のDNAセグメントは、第3のDNAセグメントの3’末端のattL5部位との組換えによって結合される。目的ベクターは、ccdB遺伝子に隣接するattR1部位およびattR2を含む。従って、LR CLONASETMとの反応において、第1、第2、第3および第4のDNAセグメントは、挿入ベクター中に挿入されるが、attB1、attB3、attB4、attB5およびattB2部位と隣接するかまたは分離する。luxオペロンの構築を含む同様のプロセスは、図17A〜17Bに示され、そして以下の実施例18に記載される。
【0236】
当業者が理解するように、図16に示されるプロセスの複数の変異は可能である。例えば、attB、attP、attL、およびattR部位、ならびに他の組換え部位の種々の組合わせは、使用され得る。同様に、種々の選択マーカー、複製の起点、プロモーター、および他の遺伝的要素は使用され得る。さらに、真核生物の染色体(例えば、転移因子)への挿入を可能にする領域は、これらのベクターに付加され得る。
【0237】
複数のDNAセグメントをベクターに挿入するための多反応プロセスの一例は、図18に示される。この例示的な実施形態において、3つのDNAセグメントを、2つの分かれた反応混合物の中で、お互いに組換える。次いで、これらの混合物中で生成された産物は、2つの反応混合物の産物の間の組換え、およびベクター(例えば、目的ベクター)中への連結産物の挿入の、両方を促進する状態下で、共に混合される。この実施形態は次の利点を有する:(1)DNAセグメントが、別のベクターへの前挿入をすることなしに、直接目的ベクターに挿入され得ること、(2)同じatt部位、ならびに他の組換え部位が使用して、ベクターへの挿入のために、連結したDNAセグメントそれぞれが調製され得る。
【0238】
当業者が理解するように、本明細書に記載されるプロセスの複数の変異は可能である。例えば、頓用組換え部位を使用して、個々の核酸セグメントを連結し得る。従って、除去または減少する潜在的な問題は、所望しない組換え反応が起こる核酸セグメントのアレイに関連する。さらに、上記に記載されるプロセスを使用して、多くの個々の核酸分子を、種々の方法で共に連結し得る。例えば、核酸セグメントは、ランダムに、または所定の順番で、セグメントの5’から3’起点を考慮、または考慮しない両方で、連結され得る。
【0239】
さらに、1つ以上の核酸セグメントの同一のコピーは、別の核酸分子に組み込まれ得る。従って、本発明はまた、単一核酸セグメントの複数のコピーを含む核酸分子を提供する。さらに、これらのセグメントの5’末端および3’末端に位置する組換え部位の選択を使用して、例えばベクターに連結し、次いで挿入する、同一の核酸セグメントの正確な数を決定し得る。次いで、このようなベクターは、例えば自己複製し得るか、またはその宿主細胞に通常存在する1つ以上の核酸分子に挿入し得る宿主細胞に挿入され得る(例えば、部位特異的な組換えまたは相同組換え)。
【0240】
核酸セグメントの複数のコピーを含む核酸分子を使用して、例えば、特定の分子のコピー数を増幅し得る。従って、本発明はまた、遺伝子増幅の方法、核酸セグメントの複数のコピーを含む核酸分子、および本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【0241】
別の例として、2つの異なる核酸セグメントを、本発明のプロセスを使用して連結し得る。組換え部位は、これらのセグメント、例えば連結によって変更されるセグメント(例えば、セグメントA+セグメントB+セグメントA+セグメントBなど)の上に位置し得る。このような構造を有する核酸分子は、産生される発現産物の量を増大するために核酸分子のコピー数の増大を使用とする場合、特に有用である。このような例において、「セグメントA」は、例えば、誘導性プロモーターを含む核酸分子であり得、そして「セグメントB」は、例えば、ORFを含む核酸分子で有り得る。従って、細胞は、上記の構造を含むものを調整し得ず、そして誘導シグナルの欠失において、セグメントBの産物の実質的な量を発現し得ず、しかし誘導においてはこの産物の高いレベルを産生し得る。このような系は、セグメントB発現産物が細胞にとって毒性である場合、特に有用である。従って、上記に列挙した方法は、セグメントB発現産物から生じる有害な影響の欠損において、セグメントBを含む細胞の構築および維持のために使用し得る。次いで、さらに、セグメントBに存在するORFの発現の誘導を使用して、例えば、高レベルのセグメントB発現産物を一時的に産生する。
【0242】
ベクター中に複数のDNAセグメントを挿入するための多段階プロセスの別の例は、図19に示される。この実施形態において、3つのDNAセグメントは別々の組換え反応においてお互いに連結し、次いで別々のベクターにLRおよびBR CLONASETM反応を使用して挿入される。これらの2つのベクターの構築の後、この挿入されたDNAセグメントは、LR反応を使用して別のベクターにトランスフェクトされる。これは、単一の目的ベクター(Destination Vector)に挿入された全ての6つのDNAセグメントを生じる。当業者が理解するように、図19に示されるプロセスの多くの変異は可能であり、これは本発明の範囲内に含まれる。
【0243】
単段階の本発明の方法を使用して連結され得る多くの遺伝子は、一般に、使用され得る異なる特異性を有する多くの組換え部位によって限定される。さらに、上記に記載され、図18および図19に図解的に示されるように、組換え部位は、核酸セグメントが1つの反応で連結されるように、そして後の反応では組換えが起こらないように選択される。例えば、再び図18に列挙されるプロセスを参考のために使用すると、指令された核酸セグメントの一連のコンカテマーが、attLおよびattR部位、ならびにLR CLONASETMを使用して調整され得る。次いで、これらのコンカテマーは、相互に、および必要に応じて他の核酸分子と、別の反応を使用して、連結し得る。多くのこのプロセスの変異が可能である。
【0244】
同様に、一旦、別の核酸分子に組み込まれると、頓用組換え部位を使用して、続いて起こる組換え反応の実施から核酸セグメントを阻害し得る。頓用組換え部位の使用は、基本的に無制限な数の個々の核酸セグメントから調製された核酸分子の産生を可能にする。
【0245】
1つの局面において、本発明はさらに、単一集団において、核酸分子とお互いに、あるいは他の分子または分子の集団と結合し、それによって、独特および/または新規の分子(例えば、ハイブリッド分子)、ならびにこれらの分子によってコードされるタンパク質またはペプチドがまた得られ、そしてさらに分析され得る組合わせ分子(例えば、組合わせライブラリー)の集団を作製するための方法を提供する。本発明はさらに、核酸分子の集団を、特定の活性を有する集団、または特定の活性を有する発現産物(例えば、RNAまたはポリペプチド)をコードする集団を同定するために、スクリーニングする方法を提供する。従って、本発明の方法を使用して、機能的なドメイン(例えば、SH3ドメイン、抗体結合部位、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド、酵素的活性部位)をコードする核酸セグメントを、お互いに対する種々の結合で結合し得、そして特定の活性を有するこれらの方法の産物を同定し得る。
【0246】
例えば、転写制御配列を含む核酸セグメントは、以下の方法によって同定される。ゲノムDNAライブラリーの核酸分子は、これらの5’末端および3’末端上の組換え部位を含むように改変される。次いで、これらの核酸分子は目的遺伝子に挿入されるので、これらは選択マーカーを5’に配置する。従って、その選択マーカーの発現は、マーカーが、その転写を活性化させる核酸分子と作動可能に連結しているベクター中で起こる。従って、本発明は、転写を活性化しうる、単離された核酸分子を提供する。多くの例において、転写を活性化するこれらの核酸分子は、本発明の方法および/または組成物を使用して同定される。
【0247】
さらに、いくつかの転写制御配列は、組織特異的な様式で遺伝子発現を活性化するので、本発明の方法を使用して、組織特異的転写制御配列を同定し得る。例えば、特定の細胞型または組織型において転写を活性化する転写制御配列を同定しようとする場合、上記のスクリーニングプロセスが、その細胞型または組織型において実行され得る。同様に、ある特定の時間で、特定の発育段階で、または特定の条件下におけるインキュベート(例えば、特定の温度で)で、細胞において転写を活性化する制御配列を同定しようとする場合、上記のスクリーニングプロセスは、適切な時間で、特定の発育段階で、または特定の条件下におけるインキュベートで、実行され得る。一旦、転写を活性化する配列が、このような方法を使用して同定されると、その転写調節配列は、その同定および/または選択の生じた細胞型または条件下とは他の、細胞型または条件下で転写を活性化し得るかを、試験され決定され得る。従って、1つの一般の局面において、本発明は、転写制御配列を構築および/または同定するための方法、ならびに、発現産物をコードする核酸セグメントと作動可能に連結する本発明の方法によって、およびこのような分子を調整する方法によって同定された転写制御配列を含む核酸分子を提供する。
【0248】
上記に記載される方法と同様の方法を使用して、複製の起点を同定し得る。従って、本発明はさらに、複製の起点を含む核酸分子を同定するための方法、ならびに、本発明の方法およびこのような分子を調整するための方法によって同定された複製の起点を含む核酸分子を含む。
【0249】
従って、以下の実施例1で議論されるように、本発明は、組合わせライブラリーの構築のために特に適する。例えば、本発明の方法をまた使用して、特定の性質または活性を有するタンパク質を発現するために使用され得る、新しい核酸分子を産生するための、タンパク質のドメインおよび領域をコードする核酸分子を「シャッフル」し得る。このような実施形態において、タンパク質の部分をコードする核酸セグメントは、連結され、そして次いで1つ以上の性質または活性のためにスクリーニングされる。
【0250】
これらの組合わせライブラリーにおける核酸セグメントは、任意の数の方法(mRNAの逆転写を含む)によって、調製される。これらのライブラリーにおける核酸セグメントの改変された形式は、誤り傾向の(error prone)PCRなどの方法を用いて産生され得る。多くの応用において、タンパク質の亜集団をコードするために、これらのライブラリーにおける核酸セグメントにとって、これは望ましい。この場合、方法は、全長ORFを含まない大部分の核酸セグメントの集団を産生するように調製され得る。これは、例えばcDNAライブラリーを剪断し、そして次いで剪断された分子を分離すること(例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を使用する)によって、実行され得る。次いで、例えば、300と600の間のヌクレオチドの長さのフラグメント(潜在的に100〜200アミノ酸残基をコードするフラグメント)は、組換えられ、ベクターに転写制御配列とともに作動可能に連結されるように挿入され得る。次いで、このような組み合わせライブラリーの個々のメンバーのポリペプチド発現産物は、その産物の特定の性質および活性はスクリーニングされ、同定される。
【0251】
本発明はさらに、ゲノムDNA由来のエキソン核酸を使用して産生される組合わせライブラリーを、産生するための方法を提供する。イントロン/エキソンスプライシング境界は、当該分野で既知である;従って、ゲノム中のエキソンの位置を、慣習的な、当該分野で公知の方法を使用して、過度の実験をすることなしに同定し得る。さらに、イントロン/エキソンスプライシング境界に対応するプライマーを使用して、エキソン配列に対応する核酸分子を産生し得る。例えば、イントロン/エキソンスプライシング境界に対応するプライマーを使用して、エキソン配列に対応する核酸分子を、PCRを使用して産生し得る。組換え部位は次いで、リガーゼを使用して、または組換え部位を含むプライマーを使用して配列を増幅することで、生じるPCR産物の末端を付加され得る。このPCR産物は次いで、組換え反応を使用してお互いに連結され、そして発現ベクターに挿入され得る。生じる組合わせライブラリーは次いで、例えば、特定の機能または活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためにスクリーニングされ得る。さらに、組合わせライブラリーの核酸分子の発現産物(例えば、RNAまたはタンパク質)における、組換え部位は、本明細書中のいずれかに記載されるスプライシングによって除去され得る。
【0252】
さらに、組合わせライブラリーを産生するために使用される核酸分子、ならびに組合わせライブラリーそれ自体は、対応する元の核酸分子と、平均して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である核酸分子を産生するために変異し得る。同様に、組合わせライブラリーを産生するために使用される核酸分子は、対応する元の核酸分子と、平均して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である核酸分子を産生するために変異し得る。
【0253】
1つの局面において、本発明は、生物学的プロセスまたは生物学的経路の、ドミナント/ネガティブサプレッサーを産生および同定する方法を提供する。例えば、上記に記載される組合わせライブラリーは、ドミナント/ネガティブ活性のためにスクリーニングされ得る。一般に、ドミナント/ネガティブ活性は、生物学的プロセスまたは生物学的経路の抑制を生じる。ほとんどの例において、ドミナント/ネガティブサプレッサーは、細胞成分との相互作用を介してこれらの影響を表す。例えば、多くのドミナント/ネガティブサプレッサーは、1つ以上の細胞タンパク質に関連する結合活性を有するドメインを含むが、細胞タンパク質に関連する他の活性を有さない。理論によって、結合されることを意図しないのに、細胞における発現で、ドミナント/ネガティブサプレッサーは一般に1つ以上の細胞リガンドと相互作用し、そして細胞タンパク質によって活性を遮断する。従って、ドミナント/ネガティブサプレッサーが通常のプロセスで妨げられると考えられる1つのメカニズムは、リガンドシーケンストレーション(sequenstration)による。
【0254】
ドミナント/ネガティブ活性は、単一アミノ酸残基の変異、またはタンパク質の領域全体の欠失などの、野生型タンパク質における変異によって与えられる。Ouryら、J.Biol.Chem。275:22611〜22614(2000)は、例えば、ドミナント/ネガティブ活性が単一アミノ酸残基の欠失の結果生じる、ドミナント/ネガティブレセプターについて記載する。
【0255】
タンパク質フラグメントはまた、ドミナント/ネガティブ活性を有する。例えば、McNellisら、Plant Cell 8:1491〜1503(1996)は、Arabidopsis の実生において発現される場合の、ドミナント/ネガティブ活性を有する構成的な光形態形成1タンパク質(constitutive photomorphogenic 1 protein)(COP1)のN末端フラグメントについて記載する。
【0256】
任意の数のアッセイを使用して、ドミナント/ネガティブ活性をスクリーニングしうる。Maemuraら、J.Biol.Chem.274:31565〜31570(1999)は、例えば、ドミナント/ネガティブ活性を有する、内因性PASドメインタンパク質1(EPAS1)といわれる転写因子の変異の欠失について記載する。特に、Maemuraらは、細胞におけるEPAS1変異の発現が、VEGF mRNA産生の誘導、野生型EPAS1に関連する活性を抑制する。
【0257】
本発明はまた、特定の機能または活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を同定するための方法、ならびに、これらの方法によって生成された核酸分子、これらの核酸分子の発現産物、およびこれらの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。このような機能または活性は、細胞からの分泌、酵素活性、リガンド結合活性(例えば、金属イオンに対する結合親和性、細胞表面レセプター、核酸、可溶性タンパク質)、および、準細胞局在(例えば、ミトコンドリア、葉緑体、小胞体などの局在)の発現産物の、標的への能力を含む。これらの核酸分子を同定するためのアッセイは、一般に、ポリペプチドに関連する活性の機能を同定するように設計される。
【0258】
本発明はまた、他のポリペプチドと相互作用する領域を有する、ポリペプチドをコードする核酸分子を同定するための方法を提供する。このような方法の1つの例には、2ハイブリッドアッセイが挙げられる。(例えば、Fieldsら、米国特許第5,667,793号(この開示の全体は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。より特異的には、核酸分子は、別のポリペプチド(例えば、Gal4−C末端ドメイン)と、タンパク質またはリガンドが求められるタンパク質の領域に非常に近位にある場合、特定の機能を表すポリペプチド(例えば、Gal4−N末端ドメイン)の間の融合タンパク質をコードする本発明の方法を使用して調整され得る。前の文において参照された他のポリペプチドと、組合わせライブラリーによってコードされるタンパク質セグメントの間の融合をコードする他の核酸分子は、次いで、調製される。従って、所望のリガンドをコードする組合わせライブラリーにおける核酸セグメントは、お互いに非常に近位の2つのポリペプチドをもたらすことで与えられる、関連した活性のために、スクリーニングによって同定され得る。
【0259】
ファージおよび細菌の表面表示ライブラリー(surface display libraries)はまた、特定の機能的活性(例えば、特定のリガンドのための結合活性)を有するドメインを同定するために、本発明の方法によって産生され得る。例えば、Kimら、Appl.Environ.Microbiol.66:788〜793(2000)は、カルボキシメチルセルラーゼ(CMCase)の改良された改変体のための、選択的スクリーニングの細胞の表面表示方法について記載する。この方法に関して、変異CMCase遺伝子のライブラリーは、シャッフルし、氷核生成タンパク質(ice nucleation protein)(Inp)と融合するDNAによって産生され、これは細菌細胞表面の上に表示される融合タンパク質を生じる。
【0260】
従って、本発明の方法は、タンパク質、あるいは他のタンパク質と相互作用するかまたは特定の機能的活性を有するタンパク質領域をコードする核酸セグメントを同定するための方法、ならびに、このような方法によって同定された核酸セグメントおよびこれらの核酸セグメントのポリペプチド発現産物を提供する。1つの局面において、本発明の方法は、特定のタンパク質と相互作用する、または特定の活性を有する発現産物をコードする、個々の核酸分子を同定するために、組合わせライブラリーの産生およびこれらのライブラリーのスクリーニングを含む。多くの例において、上記に記載される組合わせライブラリーは、融合タンパク質をコードする。
【0261】
従って、本発明の方法を使用して、タンパク質および特定の性質、機能、または活性を有するタンパク質改変体をコードする核酸分子を調製および同定し得る。容易にアッセイし得るタンパク質の性質の1つの例は、溶解性である。例えば、GFPによって産生される蛍光は、不溶性GFP融合タンパク質が産生される場合、クエンチされる。さらに、比較的少数のタンパク質のアミノ酸残基における改変は(例えば、1、2、3、4など)、適切に位置する場合、そのタンパク質の溶解性を改変し得る。従って、GFP融合タンパク質を発現する組合わせライブラリーを使用して、タンパク質および改変された溶解性を有するタンパク質改変体を単離し得る。1つの特定の実施形態において、単一の、不溶性のポリペプチドの改変体と融合するGFPを発現するように設計された組合わせライブラリーを使用して、ポリペプチドの可溶性改変体をコードする核酸分子を単離し得る。
【0262】
本発明の方法を使用して、2つ以上の核酸セグメントを含む核酸分子を構築し得、ここで1つの核酸セグメント発現が、1つの他の核酸セグメントの発現によって促進される。例えば、1つの核酸セグメントは、T7ポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結し得、そして他の核酸セグメントはT7ポリメラーゼをコードする。従って、T7ポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結する核酸セグメントは、T7ポリメラーゼの発現で、発現する。このような系の多くの変形は、本発明の範囲内にある。例えば、成分をコードする核酸または上記で言われる特定の活性を有する核酸は、1つ以上の核酸セグメントが挿入されたベクター中に存在する。
【0263】
本発明の方法をまた使用して、複数サブユニット酵素の、1つより多くのサブユニット核酸分子を構築し得る。さらに、この酵素のサブユニットのそれぞれの発現は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって調節される。同じプロモーターを使用して2つ以上のタンパク質をコードする核酸の発現を促進する場合、このmRNAは、例えば、3’から5’のもっともコードする配列であるRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を可能にする、1つ以上の内部リボソームエントリー部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【0264】
本発明の方法を使用して、広範の種々の特定のインサートを含む、核酸分子および細胞を構築し得る。従って、1局面において、本発明を使用して、特定の産物をコードする複数の遺伝子を含む、核酸分子および細胞を提供し得る。これらの方法は、特定の特質を有する核酸分子および生物の産生を可能にする。例えば、実施例18において以下で議論されるように、特定の生物学的経路に関連する遺伝子の全てを含む核酸が調製され得る。このような遺伝子は、異なる転写調節配列または同一の転写調節配列の1以上のコピーにそれぞれ連結され得る。さらに、同一または異なる生物学的経路または生物学的プロセスに関連する遺伝子は、同一または異なる環境条件下の同一または異なる含有薬剤の存在中、あるいは同一または異なる細胞型中で転写を容易にする、転写調節配列に作動的に連結され得る。さらに、遺伝子が、経路またはプロセスに関連するポリペプチド発現産物をコードする場合、1以上のこれらの発現産物は、融合タンパク質として発現され得る。さらに、細胞は、本発明の方法を使用して構築され得、これは、1つの異なる生物学的経路または生物学的プロセスに関連する遺伝子産物をコードする、挿入された核酸セグメントを含む。
【0265】
例えば、多部位組換え系で構築された複数核酸セグメントアレイ中の、1以上の特定の核酸セグメントを改変するために、本発明の方法が使用され得る。luxオペロン構築物の使用は、例示として図17に示され、ここで、各遺伝子は、異なる組換え特異性を有するattB部位によって隣接される場合、分子中の1以上の特定の核酸セグメントは、別の核酸セグメントで置換され得る。例えば、図17Bにおいて示される、luxオペロン構築物中の第2コード領域は、オペロンを含むベクターを、適切なプラスミド(例えば、pDONRプラスミド)で反応させることによって置換し得、その結果、luxDは、attRx−ccdB−cat−attRyを含むエレメントで置換され、ベクター(すなわち、アウトプット構築物)を作製し、ここで、先に、luxDによって占有された遺伝子座は、attLx−遺伝子−attLy構築物を有するEntryクローンに対するアクセプター領域となる。次いで、この産物ベクターは、attLx−遺伝子−attLy Entryクローンと反応し得、これにより、attRx−ccdB−cat−attRyカセットの、attBxおよびattByに隣接する新規の遺伝子での置換物が得られる。関連する実施形態において、attLx−遺伝子−attLyの一般的構築物を含むEntryクローンの集団は、上記のように調製された産物ベクターと反応し、アウトプット構造物の集団が産生され、この集団中の任意の所定の構築物に対して、attRx−ccdB−cat−attRyを含むセグメントは、attBxおよびattByに隣接する別の核酸セグメントによって置換された。この集団中の任意の所定のアウトプット構築物において、このattRx−ccdB−cat−attRyカセットは、attBxおよびattByに隣接する新規の遺伝子によって置換された。従って、所定の核酸セグメントアレイの構築物を、並行様式で変更し得、一方で、オペロン構築物中の他の遺伝子は、実質的にこれらの操作によって影響されないままである。
【0266】
さらに、1以上の特定の生物学的プロセスまたは経路に関連する、発現産物をコードする核酸セグメントは、支持体上で組換えられ得る。例えば、組換え部位が存在する遊離端を有し、そして生物学的経路またはプロセスに関連する3種の酵素の一つをコードする第1核酸分子は、支持体に結合され得る。支持体に結合された核酸分子で組換えられ得る、少なくとも1つの末端上に組換え部位を有するライブラリーの核酸分子は、組換えを容易にする条件下で支持体と接触され得、第1核酸分子への第2核酸分子の付着に導く。類似のプロセスが使用され、第2核酸分子の遊離端への第3核酸分子を付着させる。次いで、これらより得られた核酸産物は、生物学的活性についてアッセイする前に支持体から放出されるか、またはこのようなアッセイが実施される一方で、この核酸産物が支持体に付着したままとなる。実施され得るアッセイの例は、特定の核酸分子が存在するかどうかを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ、接続された核酸分子のポリペプチド発現産物についてのアッセイ、または接続された核酸分子のポリペプチド発現産物(例えば、タキソール、アミノ酸、炭水化物など)によって産生された目的産物についてのアッセイである。
【0267】
上記に関連する実施形態において、核酸セグメントは、上記の支持体を不規則に循環する。従って、第2核酸分子が、第1核酸分子で組換えられた後、例えば、第2組換え反応は、第2核酸分子を放出するために使用され得る。
【0268】
従って、1局面において、本発明は、核酸分子環での組換えを実施するための方法を提供し、ここで、少なくとも1個の核酸分子は、支持体に結合される。本発明は、支持体(例えば、固体および半固体支持体)上でこれらの核酸分子を組換えることによって、同一の生物学的プロセスまたは経路に関連する核酸分子を同定するための方法をさらに提供する。従って、本発明は、特定の生物学的プロセスまたは経路に関連する発現産物をコードする核酸分子を同定するために、核酸ライブラリーをスクリーニングするための方法、これらの方法によって同定された核酸分子、この核酸分子から産生された発現産物、ならびにこれらの生物学的プロセスまたは経路によって産生された産物を提供する。
【0269】
句「生化学的経路」および「生物学的経路」は、生体または細胞によって運搬される任意の系列の関連する生化学的反応を言及する。このような経路としては、生合成経路または生分解性経路、あるいはエネルギー発生または変換の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【0270】
本発明の核酸分子は、広範の種々の適用に使用され得る。例えば、本発明の方法は、オペロンの構造遺伝子の全てを含む、Destination Vectorを調製するために使用され得る。下記の実施例18で議論されるように、このluxオペロンは、生物発光細菌Vibrio fischeri由来のluxCDABEをコードする核酸を使用して、再構築されている。
【0271】
さらに、上記のように、同一または異なる生物学的経路またはプロセスの一部である複数のタンパク質を含む、本発明の核酸分子の発現産物は、融合タンパク質として生成され得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にするアミノ酸(例えば、6His tag)、融合タンパク質を特定の細胞コンパートメントに「標的する」アミノ酸(例えば、シグナルペプチド)、可溶化を容易にするアミノ酸(例えば、マルト−ス結合タンパク質)、および/またはクローン化遺伝子の発現産物の特性を改変させるアミノ酸(例えば、抗体分子のFcタンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFG)、またはシアン蛍光タンパク質(CFP))を含み得る。
【0272】
本発明の方法をまた使用して、発現の際に、1以上の特性、機能または活性を有する融合タンパク質を産生する、核酸分子を調製し得る。このような核酸分子の1例は、目的のポリペプチド、Pseudomonas体外毒素のDomain II、および目的の細胞型への融合タンパク質の結合を促進しるポリペプチドを含む、3種のコンパートメント融合タンパク質をコードする分子である。Pseudomonas体外毒素のDomain IIは、しばしば、融合タンパク質に、細胞膜に転移させる能力を与える。従って、この発現産物が設計され得る結果として、この両方は、特定の細胞型に局在化し、そして細胞膜を通過する。この型の発現産物は、例えば、目的のポリペプチドが細胞障害性である場合(例えば、アポトーシスを誘導する場合)、特に有用である。上記のタンパク質と類似のタンパク質をコードする核酸分子は、米国特許第5,328,984号に記載されている。
【0273】
さらに、発現産物は、このような様式で産生され、細胞からの搬出を容易にする。例えば、これらの発現産物は、細胞からタンパク質を搬出する際に生じるシグナルタンパク質を含む、融合タンパク質であり得る。細胞搬出が所望され得る1つの適用は、搬出されるべきタンパク質が、細胞内基質と相互作用する酵素である場合である。
【0274】
1局面において、本発明の、同一または異なる生物学的経路またはプロセスに関連する1以上の発現タンパク質をコードする核酸分子を調製する方法ならびにこれらの核酸分子およびこのような生物学的経路またはプロセスから得られる産物を提供する。例えば、本発明を使用して、同一または異なる生物学的プロセスに関連する複数のタンパク質を搬出する細胞を構築する。従って、1局面において、本発明は、細胞中で複数の核酸セグメントをクローニングするためのシステムを提供し、これにより、これらの核酸セグメントの発現産物の1以上(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50など)の遺伝子産物を搬出する。さらに、これらの発現産物は、細胞外媒体(例えば、培養培地、土壌、塩水湿地など)中で、機能を実施し得る(例えば、化学反応を触媒し得る)。
【0275】
核酸分子が、本発明の方法を使用して調製および/または発現される場合、これらの核酸分子は、同一または異なるプロセス(例えば、生合成経路、生分解性経路)に関連する発現産物をコードし得る。以下に例示されるように、広範の種々の機能特性を生物に提供しようとする場合、この核酸分子は、この生物と比較的関係のない特性を与える発現産物をコードし得る。
【0276】
さらに、核酸分子は、所望の目的産物を導く生合成経路の部分の全てをコードする本発明の方法を使用して、調製され得る。さらに、本発明の方法は、独特な性質を有する発現産物をコードする核酸分子を生成するために使用され得る。従って、本発明はまた、生物学的経路またはプロセスの新規な目的産物を産生する方法を提供する。このことに関して、本発明の目的は、同定した新規な化合物(治療剤を含む)を産生するために有用である。従って、1つの局面において、本発明は、これらの方法によって同定された薬物発見方法および治療剤をさらに提供する。
【0277】
本発明の方法によって再構築および/または改変された生物学的経路またはプロセスによって産生され得る目的産物の例としては、化学療法剤(例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、タキソール)、炭水化物、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、リボザイム、および膜結合細胞小器官、および各々の新規な形態が挙げられる。従って、本発明の方法を使用して、広範の種々の天然化合物およびこれらの化合物の改変形態を産生する能力を細胞に与える核酸を調製し得る。これらの化合物の例としては、以下の広範のクラスに入るものが挙げられる:抗細菌治療剤、抗ウイルス治療剤、抗寄生虫治療剤、抗真菌治療剤、抗マラリア剤、抗アメーバ治療剤、および抗腫瘍治療剤。
【0278】
微生物が抗生物質に対して耐性を発達させる迅速な速度に起因して、新規な抗生物質の開発のための大きな必要性が存在する。さらに、微生物は、天然に存在しない等価物が存在する新規な抗生物質に対して、より穏やかに耐性を発達させることが仮定されている。従って、1局面において、本発明は、新規な抗生物質を産生するための方法、および本発明の方法によって産生された抗生物質を提供する。
【0279】
本発明の方法を使用して産生され得る生物の1例は、新規な抗生物質を産生する生物である。Stassiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7305−7309(1998)には、Saccharopolyspora erythraceaの一般に遺伝子操作された細胞によって産生された、新規なエチル−置換エリスロマイシン誘導体の産生を記載する。従って、本発明の方法は、新規な抗生物質を産生するタンパク質をコードする細胞遺伝子エレメントに挿入するために使用され得る。本発明は、これらの方法によって産生された細胞、抗生物質を産生するための細胞を使用するための方法、および本発明の方法によって産生された抗生物質を含む。
【0280】
複数の治療剤の生合成経路に関連する産物をコードする核酸分子は、当該分野で公知である。例えば、β−ラクタム抗生物質の生合成に関連する遺伝子および酵素は、例えば、Martin,Appl.Microbiol.Biotechnol.50(1):1−15(1998)に記載される。従って、特定の局面において、本発明は、これらの抗生物質を産生するための方法、これらの抗生物質の改変形態、および抗生物質自体を含む。
【0281】
本発明は、抗細菌治療剤、抗ウイルス治療剤、抗寄生虫治療剤、抗真菌治療剤、抗マラリア剤、抗アメーバ治療剤、および抗腫瘍治療剤ならびにこれらの薬剤の改変形態、ならびにこれらの薬剤自体を産生するための方法を提供する。抗細菌治療剤の例としては、以下が挙げられる:ペニシリン、アンピシリン、アモキシリン、クロキサシリン、エピシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファラジン(cepharadine)、セファゾリン、セファクロール、セフォキシチン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフィネノキシン(cefinenoxine)、セフトリアキソン、モキサラクタムn、イミペネム、クラブラネート(clavulanate)、チメンチン(timentin)、スルバクタム、エリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、メトロニダゾール(metronidazole)、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、キノロン類、リファンピン、スルホンアミド、バシトラシン、ポリミキシンB、バンコマイシン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アンホテリシンB、シクロセリン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、イソニアジド、エタンブトール、およびナリジクス酸、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0282】
抗ウイルス治療剤の例としては、以下が挙げられる:アシクロビル、イドクスウリジン,リバビリン、トリフルリジン、ビダラビン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン、ジドブジンおよびガンシクロビル、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0283】
抗寄生虫治療剤としては、以下が挙げられる:ビチオノール,ジエチルカルバマジンシトレート、メベンダゾール、メトリホナート、ニトロサミン、ニリダゾール、オキサムニキン(および他のキニン誘導体)、クエン酸ピペラジン、プラジカンテル、ピランテルパモエートおよびチアベンダゾール、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0284】
抗真菌治療剤の例としては、以下が挙げられる:アンホテリシンB、クロトリマゾール、硝酸エコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ケトコナゾールおよびミコナゾール、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。抗真菌化合物はまた、アキュレアシンA(aculeacin A)およびパプロカンジン(papulocandin B)が挙げられる(例えば、Komiyamaら、Biol.Pharm.Bull.(1998)21(10):1013−1019を参照のこと)。
【0285】
抗マラリア治療剤の例としては、以下が挙げられる:クロロキン HCl、リン酸プリマキン、ピリメタミン、硫酸キニーネおよびキナクリン HCl、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0286】
抗アメーバ治療剤の例としては、以下が挙げられる:デヒドロエメチンジヒドロクロリド、ヨードキノールおよび硫酸パラモマイシン、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0287】
抗腫瘍治療剤の例としては、以下が挙げられる:アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン,メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトーテン、プロカルバジン HCl、チオグアニン,硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチン、ならびにこれらの化合物の各々の誘導体および改変形態。
【0288】
さらなる抗微生物剤は、ペプチドを含む。抗微生物ペプチドの例は、米国特許第6,040,435号およびHancockら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 97:8856−8861(2000)に開示される。
【0289】
核酸分子はまた、複数タンパク質複合体の1以上のサブユニットをコードする、本発明の方法を使用して調製され得る。このような複数タンパク質複合体の例としては、スプライスソーム、リボソーム、ヒト26プロテオソーム、および酵母RNAポリメラーゼIIIが挙げられる(例えば、Saitoら,Gene 203(2):241−250(1997);Floresら,Proc.Natl.Acad Sci.USA96(14):7815−7820(1999)を参照のこと)。
【0290】
本発明の方法はまた、天然に存在しない産物およびこれらの産物の改変体(例えば、新規の改変体)の部分合成のために使用され得る。例えば、特定の反応を触媒する酵素を発現する微生物は、これらの生物が通常産生しない前駆体から共有され得る。これらの前駆体が、微生物によって発現された酵素に対する基質として作用する場合、新規な化合物が産生され得る。このタイプの「供給」手順は、新規な抗生物質を産生するために過去において使用されていた。1局面において、このタイプの供給は、上述のコンビナトリアルライブラリーによってコードされた酵素を発現する微生物と組合せて使用される。
【0291】
本発明の方法は、(1)または(2)のいずれかのために使用され得る:(1)新規な経路を細胞に導入するため、または(2)存在する細胞経路を変え、その結果、例えば、1以上のさらなる触媒工程(例えば、2、3、5、7、10など)を、産物の合成の間に生じさせるため。本発明の方法のこのような適用の1例は、細胞によって天然で産生されるタンパク質の改変を含む。この例において、タンパク質を改変する1以上の触媒工程をコードする遺伝子(例えば、移植後の改変反応に関連する酵素をコードする遺伝子)は、細胞中に導入される。例えば、ADP−リボシル化、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、ユビキチン結合、セリンのDアラニンへの改変、ビオチン化、アシル化、アミド化、ホルミル化、カルボキシル化、GPIアルコール形成、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化に関連する酵素をコードする核酸が、細胞に挿入され得る。タンパク質の翻訳後の改変は、以下において議論されている:PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993;Wold,F.,POST−TRANSLATIONALPROTEIN MODIFICATIONS:PERSPECTIVES AND PROSPECTS,1−12頁 inPost−translational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson編,Academic Press,New York,1983;Seifterら,「Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors」,Meth.Enzymol.(1990)182:626−646およびRattanら,「Protein Synthesis:Post−translational Modifications and Aging」,Ann.NY Acad Sci.(1992)663:48−62。
【0292】
本発明の方法を使用して、例えば、シグナル伝達経路に関連するタンパク質をコードする核酸分子を含む細胞を産生する。さらに、これらの細胞は、シグナル伝達する細胞を調節する薬剤をスクリーニングするために使用される。例えば、細胞は、腫瘍壊死因子(TNF)に応答するのに必要な成分の全てを発現する、本発明の方法を使用して産生され得る。次いで、これらの細胞は、TNF媒介応答(TNFアゴニスト)を誘導するかまたはTNF媒介応答(TNFアンタゴニスト)を遮断する薬剤をスクリーニングするために使用され得る。従って、細胞リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストについてスクリーニングするために使用され得る細胞を産生するための方法、ならびにこのような方法によって産生された細胞は、本発明の範囲内に含まれる。細胞リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために本発明の細胞を使用するための方法、ならびに本発明の方法によって同定されたアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明の範囲内にさらに含まれる。
【0293】
上記のように、本発明の方法をまた使用して、炭水化物およびアミノ酸のような栄養分を産生する核酸および細胞を産生する。炭水化物およびアミノ酸、ならびに他の炭素供給源は、多数の目的のために使用され得る。例えば、微生物、哺乳動物の細胞および植物の細胞を成長させるための培地成分を調製するための炭水化物およびアミノ酸。さらに、これらの化合物は、ヒトおよびリバーストック(liverstock)の両方に対して、食物産物に添加され得る。炭水化物およびアミノ酸の使用の1つの特定の例は、幼児の栄養処方の調製においてである(例えば、Highmanら、米国特許第6,120,814号を参照のこと)。従って、本発明は、本発明の方法を使用して産生された炭素供給源を使用して作製される、食物産物(例えば、幼児処方)をさらに提供する。
【0294】
本発明の方法を使用して調製された細胞を使用して産生し得る炭素供給源としては、炭水化物(例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、およびスターチ加水分解物)、有機酸(例えば、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、および乳酸)、アルコール(グリセロール、1,3−プロパンジオール、およびエタノール)、脂質、脂肪酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびアミノ酸が挙げられる(例えば、Skralyら、Appl.Environ Microbiol.64:98−105(1998)を参照のこと)。
【0295】
本発明の方法を使用して産生され得る生物の1例は、エタノールを産生する能力を獲得した生物である。Dengら、Appl.Environ.Microbiol.65:523−528(1999)は、例えば、エタノールを産生するために遺伝子操作したCyanobacteriaを記載する。従って、本発明の方法は、エタノールの産生に関連するタンパク質をコードする遺伝子エレメントを細胞に挿入するために使用され得る。本発明は、これらの方法によって産生された細胞およびエタノールを産生するためにこのような細胞を使用するための方法をさらに含む。
【0296】
本発明の方法を使用して産生され得る生物の別の例は、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)または増加した量のポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)のいずれかを産生するための能力を獲得した生物である。ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)は、細胞から抽出した、可塑性を有する化合物である(例えば、Madisonら、Microbiol.Molec.Biol.Rev.63:21−53(1999)を参照のこと)。従って、本発明の方法は、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)の産生に関連するタンパク質をコードする遺伝子エレメントを細胞に挿入するために使用され得る。本発明は、これらの方法によって産生された細胞、ならびにポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)誘導体、およびポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)から形成された化合物を産生するためにこのような細胞を使用する方法を含む。
【0297】
本発明の方法を使用して調製された細胞を使用して産生され得るアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、プロリン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、およびグリシンが挙げられる。かなりの数の生物中で、アミノ酸およびアミノ酸前駆体の生合成に関連する遺伝子および酵素は、当該分野で公知である(例えば、G.N.Cohen,「The Common Pathway to Lysine,Methionine and Threonine」第147−171頁 in Amino Acids:Biosynthesis and Genetic Regulation,K.M.Herrmannand R.L.Somerville編,Addison−Welesley Publishing Co.,Inc.,Reading,Mass.(1983)を参照のこと)。
【0298】
新規な化合物を産生するために細胞を改変することに加えて、本発明の方法はまた、細胞を遺伝子操作するために使用され得、この結果、細胞の正常な代謝の産物を過剰産生するか、または過小産生する。例えば、Donnellyらの米国特許第5,770435号は、増加した量のコハク酸を産生するE.coliの変異体株を記載した。本発明の方法は、例えば、コハク酸の生合成経路において酵素をコードする核酸分子を構築するために使用され得る。さらに、これらの酵素の1以上の発現は、転写レベルで調節され得る。従って、これらの核酸分子を上記のE.coli細胞への導入は、コハク酸の生合成経路中で1以上の遺伝子の増幅から効果的に生じる。さらに、これらの1以上の遺伝子は、誘導可能なプロモーター(例えば、lacIプロモーター)に作動可能に連結され得、その結果、増加したコハク酸が、減少したシグナル(例えば、IPTG)の存在下でのみ生じる。
【0299】
本発明の方法はまた、製造工程において使用され得る成分および前駆体を産生する、核酸および細胞を産生するために使用され得る。これらの成分の例としては、プラスチック、プラスチック様化合物(例えば、ポリケチド)、石けん、肥料、紙、合成ゴム、色素、インクなどが挙げられる。本発明はまた、本発明の方法および細胞によって産生される成分および前駆体を含む。
【0300】
同様に、本発明の方法によって調製された核酸分子はまた、例えば、1以上の内在性遺伝子の発現を下方制御するために使用され得る。本発明の1の例は、本発明の方法によって調製された核酸インサートが、アンチセンスRNAを産生するために転写される場合である。さらに、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は、制御可能なプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0301】
従って、本発明は、細胞の正常な代謝の産物を箇条産生または過小産生する細胞を産生するための方法、ならびにこれらの方法によって産生される細胞をさらに含む。
【0302】
上記のように、本発明の方法によって調製される核酸分子は、生物が特定の特性を有するように、生物の物理学的特徴を改変するために使用され得る。例えば、特定のグリコシル化パターンを有する組換えタンパク質または天然のタンパク質のいずれかを産生するために必要とされる特定の酵素を欠く細胞は、本発明のベクターを使用して細胞中に導入され得る。タンパク質のグルコシル化パターンは、ある程度まで、細胞型および種特異性であることが見出された(例えば、Jarvisら、Curr.Opin.Biotechnol.9:528−533(1998)を参照のこと)。従って、1局面において、本発明は、改変されたグリコシル化経路を示す細胞を産生するための方法、ならびにこれらの方法によって産生された細胞およびこれらの細胞によって産生されたグリコシル化化合物を提供する。このプロセスは、一般に、「グリコシル化遺伝子操作」と呼ばれている。Stanley,Glycobiology2:99−107(1992)。
【0303】
例えば、タンパク質をグリコシル化しない細菌細胞は、タンパク質をグリコシル化する酵素を産生するために、本発明の方法を使用して改変され得る。このような酵素の例としては、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α2,3−シアリルトランスフェラーゼ、α1,3−フルコシルトランスフェラーゼIIIおよびVI、およびα1,2−マンノシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【0304】
別の局面において、本発明は、これらの細胞によって合成された化合物の増加した産生に導く、改変した代謝特性を示す細胞、ならびにこれらの方法によって産生された細胞およびこれらの細胞によって産生された産物を産生するための方法を提供する。このような方法の1つの例により、生物学的経路に関して、増加した前駆体の量を産生する細胞の集団が得られる。これらのプロセスは、代謝性チャネリングまたはファンネリング(funneling)として本明細書中で言及されている。例えば、増加した量のセリンを産生する細胞を産生しようとする場合、3−ホスホグリセレートの産生に導く経路の酵素をコードする核酸分子が、この細胞に挿入され得る。必要に応じて、3−ホスホグリセレートのセリンへの変換に関連する酵素をコードする核酸分子が、この細胞中に挿入され得る。前駆体の増加した細胞内濃度を含む、遺伝子操作した細胞が、化合物を利用する場合、考慮のために有用であるパラメータは、特定の経路および経路流動における、速度限定セットを含む(例えば、Kholodenkoら、Biochenol.Bioeng.59:239−247(1997)を参照のこと)。
【0305】
ポリケチドは、一連の濃縮および続く改変を介して、2炭素ユニットから合成された多様な化合物の大きなファミリーを表す。ポリケチドは、多くの型の生物において産生され、これには、真菌および複数の細菌、特に、放線菌類が挙げられる。多様な活性を有する複数の化合物を含む、広範の種々のポリケチド構造体およびポリケチドが存在する(例えば、PCT公開番号WO93/13663;WO95/08548;WO96/40968;97/02358;および98/27203;米国特許第4.874,748号;同第5,063,155号;同第5,098,837号;同第5,149,639号;同第5,672,491号;および同第5,712,146号;ならびにFuetら,1994,Biochemistry 33:9321−9326;McDanielら,1993,Science262:1546−1550;およびRohr,1995,Angew.Chem.Int.編.Engl.34:881−888(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。
【0306】
ポリケチドシンターゼ(PKS)は、共通の機械的戦略を使用して、構造的に多様な天然な産物を構築し、この戦略は、最終の反応産物を構築する一連の脱炭酸反応の間に、ポリケチドを固定するためのシステイン残基に依存する。PKSは、一般に、脂肪酸の生合成と密接に並行である、生合成のプロセスにおいて、プロピオニル−CoAおよびメチルマロニル−CoAのような単純な手順から、複合体天然産物のアセンブリを触媒する。ポリケチドの例は、カリスタチンA(callystatin A)、アンサトリエニンA(ansatrienin A)、アクチノルホジン(actinorhodin)、ラパマイシン、メチマイシン(methymycin)、およびピクロマイシン(pikromycin)が挙げられる。
【0307】
1局面において、本発明は、1以上のPKSをコードする核酸分子を調製するための方法、ならびにこれらの核酸分子を含む細胞および得られるポリケチド産物を提供する。本発明は、組合せライブラリーを使用して新規なPKSを産生するための方法およびこれらの新規なPSKによって産生された産物(例えば、新規なマクロライド抗体)、ならびにこれらの新規のPSK産物を産生するための方法をさらに提供する。
【0308】
本発明の方法はまた、種々の薬剤の毒性を減少させるのに有用である、微生物の菌株を構築するために使用され得る。このような薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:石油−ベースの汚染物質(例えば、塩素処理した脂肪酸化合物および塩素処理していない脂肪酸化合物(例えば、C5−C36)、塩素処理した芳香族化合物および塩素処理していない芳香族化合物(例えば、C9−C22)、粗製油、精製油、重油(例えば、2,4および6号の重油)、ディーゼル油、ガソリン、流体油、灯油、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、およびキシレン、トリメチルベンゼン、ナフタレン、アントラセン、アセナフタレン、ベンゾ(a)アントラセン、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(b)フルオランテン、ベンゾ(g,h,i)ペリレン、ベンゾ(k)フルオランテン、ピレン、メチレンクロリド、1,1−ジクロロエタン、クロロホルム、1,2−ジクロロプロパン、ジブロモクロロメタン、1,1,2−トリクロロエタン、2−クロロエチルビニルエーテル、テトラクロロエタン(PCE)、クロロベンゼン、1,2−ジクロロエタン、1,1,1−トリクロロエタン、ブロモジクロロメタン、trans−1,3−ジクロロプロペン、cis−1,3−ジクロロプロペン、ブロモホルム、クロロメタン、ブロモエタン、塩化ビニル、クロロエタン、1,1−ジクロロエタン、trasn−1,2−ジクロロエタン、トリクロロエタン(TCE)、ジクロロベンゼン、cis−1,2−ジクロロエタン、ジブロモメタン、1,4−ジクロロブタン、1,2,3−トリクロロプロパン、ブロモクロロメタン、2,2−ジクロロプロパン、1,2−ジブロモエタン、1,3−ジクロロプロパン、ブロモベンゼン、クロロトルエン、トリクロロベンゼン、trans−1,4−ジクロロ−2−ブテンおよびブチルベンゼン。
【0309】
本発明の方法を使用して産生され得る生物の例は、トルエンを分解する生物である。Pankeら、Appl.Envron.Microbiol.64:748−715(1998)は、トルエンおよび数種のトルエン誘導体をベンゾエートに変換するPseudomonas puidaの株を記載する。従って、本発明の方法は、トルエンおよびその誘導体を、毒性の低い化合物に変換するタンパク質をコードする細胞遺伝子エレメントに挿入され得る。本発明は、これらの方法によって産生された細胞、トルエンおよび数種のトルエン誘導体を毒性の低い化合物に変換するためにこのような細胞を使用するための方法をさらに含む。
【0310】
本発明の方法はまた、解毒する非石油剤(例えば、重金属イオン(例えば、水銀、銅、カドミウム、銀、金、酸化テルル鉱、透セッコウ、およびウラニウム))として適切な生物を調製するために使用され得る。例えば、水銀が、解毒され得る方法は、揮発を介しておよび金属性水銀を生成するための水銀イオンの減少を含む。細菌による解毒に関連する遺伝子は、Miller、「Bacterial Detoxification of Hg(II) and Organomercurials」、Essays Biochem.34:17−30(1999)に記載される。
【0311】
重金属イオン解毒システムの別の例は、Rhodobacter spharoideの菌株中で同定されている(例えば、O’Garaら、Appl.Environ.Microbiol.63(12):4713−4720(1997)を参照のこと)。この菌株中の酸化テルル鉱耐性は、2つの遺伝子座によって与えられるようである。第1遺伝子座は、4つの遺伝子を含み;これらの遺伝子の2つ(すなわち、trgAおよびtrgB)は、別の細菌中に挿入される場合、増加した酸化テルル鉱耐性を与える。この遺伝子座(cysK(システインシンターゼ))において別の遺伝子座の破壊は、減少した酸化テルル鉱耐性を生じる。この第2の遺伝子座は、tel遺伝子を含む。telAの不活性化は、野生型菌株と比較して、有意に減少した酸化テルル鉱耐性を生じる。
【0312】
解毒剤となり得る微生物は、例えば、米国特許第6,110,372号に記載されている。バイオメディエーション適用に適切である微生物は、Pseudomonadaceaeファミリー、Actinomycetesファミリー、Micrococcaceaeファミリー、Vibrionaceaeファミリー,Rhizobiaceaeファミリー、Cytophagaceaeファミリー、およびCorynebacteriumファミリーの微生物が挙げられる。バイオメディエーション適用のために、本発明の方法を使用して改変した後に、使用するために適切な生物の特定の例としては、以下が挙げられる:Pseudomonas rubrisubalbicans、Pseudomonas aeruginosa、Variovorax paradoxus、Nocardia asteroides、Deinococcus radiodurans、Nocardia restricta、Chryseobacterium indologenes、Comamonas acidovorans、Acidovorax delafieldii、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus erydropolis、Aureobacterium esteroaromaticum、Aureobacterium saperdae、Micrococcus varians、Micrococcus kristinae、Aeromonas caviae、Stenotrophomonas maltophilia、Sphingobacterium thalpophilum、Clavibacter michiganense、Alcaligenes xylosoxydans、Corynebacterium aquaticum BおよびCytophagajohnsonae。
【0313】
バイオレメディエーションのために適切な生物体としてはさらに、植物が挙げられる。例えば、Meagherら、米国特許第5,965,796号は、金属イオン耐性タンパク質を発現し、そして銅、水銀、金、カドミウム、鉛および銀のような金属イオンを減少するトランスジェニック植物を記載する。さらに、植物キレート体をコードする遺伝子は、植物キレート体合成を増加させるために植物に導入される。植物キレート体は、封鎖によって金属イオンを解毒するグルタチオン誘導体である。多数の植物種由来の遺伝子は、植物キレート体合成に関与し、そしてCorbett「Phytochelatin Biosynthesis and Phytochelatin in Heavy−Metal Detoxification」、Curr.Opin.Plant Biol.3(3):211−216(2000)で議論される。
【0314】
本発明の方法による改変後のバイオレメンディエーション適用のために適切な特定の植物としては、Lepidium sativum、Brassica juncea、Brassica oleracea、Brassica rapa、Acena sativa、Triticum aestivum、Helianthus annuus、Colonial bentgrass、Kentucky bluegrass、多年生ドクムギ、クリーピングベントグラス(creeping bentgrass)、Bermudagrass、Buffalograss、センチペデグラス(centipedegrass)、スイッチグラス(switch grass)、日本芝、海岸パニックグラス(coastal panicgrass)、ほうれん草、モロコシおよびトウモロコシが挙げられる。トランスジェニック植物を生成するための方法は、当該分野で公知であり、上記のように、例えば、Meagherらの米国特許第5,965,796号に記載される。
【0315】
本発明の方法はまた、多様な特徴を有し、かなりの数の挿入された遺伝子を含む生物体を調製するために使用され得る。上記のように、本発明の方法は、ほとんど制限されていない数の核酸セグメントを細胞に挿入するために使用され得る。例えば、特定の実施形態において、本発明は、殺虫性タンパク質(例えば、Bacillus thurginiensisの殺虫性タンパク質)を発現する細胞を産生するための方法を提供する(例えば、Schnepfら、Microbiol.Molec.Biol.Rev.62:775〜806(1998)を参照のこと)。従って、本発明の方法は、殺虫性タンパク質をコードする細胞ゲノムエレメントに挿入するために使用され得る。本発明はさらに、これらの方法によって産生された細胞、および殺虫性タンパク質を産生するためにこのような細胞を使用するための方法を包含する。本発明はさらに、昆虫集団を制御するために、本発明の方法によって産生された細胞(例えば、細菌細胞または植物細胞)および殺虫性タンパク質を使用するための方法を包含する。特定の実施形態において、本発明によって産生され、本発明の方法において使用される細胞は、植物細胞である。
【0316】
従って、1つの局面において、本発明の方法は、1つ以上のORF、および/または1つ以上の非タンパク質発現産物(例えば、tRNAまたはリボザイムのような機能的RNA)をコードする核酸セグメントを含む核酸分子を調製するために使用され得る。本発明のほとんどの実施形態において、ORFおよび/または1つ以上の非タンパク質発現産物をコードする核酸セグメントの数は、一般的に、約1と約300との間の範囲(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300など)である。1つ以上のORFおよび/または1つ以上の非タンパク質発現産物をコードする核酸セグメントを含む核酸分子は、生物体を上記のような特定の特徴を有するように変化させるために特に有用である。
【0317】
多数の因子(存在する機能的セグメントの数を含む)に依存して、本発明の核酸分子のサイズはかなり変化するが、一般的に、約0.5kb〜約300kbの間の範囲(例えば、約0.5kb、約1kb、約2kb、約3kb、約4kb、約5kb、約7kb、約10kb、約12kb、約15kb、約20kb、約40kb、約60kb、約80kb、約100kb、約200kb、約300kb、など)である。
【0318】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を動物(例えば、ヒト)および動物細胞(例えばヒト細胞)に導入するための方法を、遺伝子治療プロトコルの一部としてさらに提供する。遺伝子治療とは、発現された核酸分子または発現可能な核酸分子を被験体に投与することによって行われる治療をいう。本発明の多くの実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも1つの治療効果を媒介する1つ以上のタンパク質をコードする。従って、本発明は、遺伝子治療において使用するための核酸分子および方法を提供する。
【0319】
本発明の核酸分子は、細胞のゲノムに存在する遺伝子を置換するか、そのような遺伝子を欠失するか、または異種遺伝子または遺伝子の群を挿入するように設計された遺伝子治療ベクターを調製するために使用され得る。本発明の核酸分子が、遺伝子(単数または複数)を欠失または置換するように機能する場合、欠失または置換されたこの遺伝子(単数または複数)は、「正常な」表現型または異常な表現型のいずれかの発現を導き得る。異常な表現型の一例は、嚢胞性線維症である。さらに、遺伝子治療ベクターは、細胞中で安定に保持される(例えば、相同性組換えによる細胞核酸への組込み)か、または細胞中に不安定に保持され得る。
【0320】
さらに、本発明の核酸分子は、「異常な」表現型もしくは相補体を抑制するか、または内因性遺伝子の発現から生じる「正常な」表現型を補充するために使用され得る。異常な表現型を抑制するように設計された本発明の核酸の一例は、核酸分子の発現産物が優性/陰性活性を有する核酸である。正常な表現型を補充するように設計された本発明の核酸分子の一例は、核酸分子の導入が細胞に存在する遺伝子の複製を有効に生じる核酸である。
【0321】
さらに、本発明の核酸分子は、特定の生物学的経路(例えば、リジン、スレオニンなどのような核酸の生合成)の各工程に関与する発現産物、またはこのような工程の1つまたは数個に関連する発現産物をコードする核酸セグメントを細胞に挿入するために使用され得る。このような核酸分子は、このような経路において発現産物をコードする遺伝子を事実上増幅するか、通常は細胞中に見出されない経路に関与する発現産物をコードする細胞に遺伝子を挿入するか、または細胞における特定の生物学的経路の1つ以上の工程に関与する1つ以上の遺伝子を置換するように設計され得る。従って、本発明の遺伝子治療ベクターは、1つ以上の産物(例えば、1、2、3、4、5、8、10、15個など)の産生を生じる核酸を含み得る。このようなベクター、特に1より多い産物の産生を生じるベクターは、1より多い遺伝子の発現および/または発現の欠失から生じる疾患および/または状態、あるいは1より多い疾患および/または状態の処置のために特に有用である。
【0322】
従って、関連の局面において、本発明は、1つ以上の発現ベクター(例えば、1つ以上の融合タンパク質)を発現する遺伝子治療ベクター、このようなベクターを産生するための方法、本発明のベクターを使用して遺伝子治療を行うための方法、このようなベクターの発現産物(例えば、コードされたRNAおよび/またはタンパク質、および本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0323】
遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspielら、1993、Clinical Pharmacy 12:488−505;Wu and Wu、1991、Biotherapy 3:87−95;Tolstoshev、1993、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596;Mulligan,1993、Science 260:926−932;およびMorganおよびAnderson,1993、Ann.Rev.Biochem.62:191−217;May,1993,TIBTECH 11(5):155−215を参照のこと。組換えDNA技術の分野で一般的に公知の方法が使用され得、そしてAusubelら編、1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sones,NY;およびKriegler,1990,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NYに記載される。
【0324】
本発明の核酸分子の患者への送達は、患者が核酸または核酸保有ベクターに直接暴露される場合、直接的であるか、細胞が最初にインビトロにおいて核酸で形質転換され、次いで患者に移植される場合、間接的である。これらの2つのアプローチが、それぞれインビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として公知である。
【0325】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、インビボで直接投与され、ここでこれらは1つ以上の発現産物を産生するように発現される。これは、当該分野で公知の多数の方法(例えば、発現ベクターを構築し、それが細胞内であるように(例えば、欠失または弱毒化レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを使用する感染によって)、投与することによって((米国特許第4,980,286号を参照のこと)、裸のDNAの直接注射によって、微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃;Biolistic,Dupont)の使用によって、脂質または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤でのコーティング、リポソーム、微粒子またはマイクロカプセルへのカプセル化によって、またはリガンド物質に結合した形態のベクターをレセプター媒介性エンドサイトーシスに投与することによって核に侵入することが公知のペプチドに結合してそれらを投与することによって(例えば、Wu and Wu、1987,J.Biol.Chem.262:4429−4432を参照のこと)(これは、レセプターを特異的に発現する細胞型を標的化するために使用され得る)など)によって達成され得る。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、特定のレセプターを標的化することによって細胞の特異的な取込みおよび発現についてインビボで標的化され得る(例えば、PCT公開WO92/06180(1992年4月16日(Wuら);WO92/22635(1992年12月23日)(Wilsonら);WO92/20316(1992年11月26日)(Findeisら);WO93/14188(1993年7月22日)(Clarkeら);WO93/20221(1993年10月14日(Young)を参照のこと)。あるいは、本発明の核酸分子は、細胞内に導入され得、そして相同性組換えによって発現のための宿主細胞DNAに組み込まれ得る(KollerおよびSmithies、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932−9835;Zijlstrara,1989,Nature 342:435−438)。このような用途に適切なこのような核酸構築物の例は、図21Cおよび22Bに示される。
【0326】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体または他の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る(Millerら、1993,Meth.Enxymol.217:581−599を参照のこと)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みのために必要ではないレトロウイルス配列を欠失するために使用されている。遺伝子治療に使用される抗体をコードする核酸配列は、1つ以上のベクターにクローン化され、このベクターは、患者へのこの遺伝子の送達を促進する。レトロウイルスベクターについての詳細は、Boesenら、1994,Biotherapy 6:291−302に見出され得、これは、幹細胞を化学治療に対して耐性にするために、造血幹細胞にmdr1遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の文献は、Clowesら、1994,J.Clin.Invest.93:644−651;Kiemら、1994,Blood 83:1467−1473;SalmonsおよびGunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129−141;ならびにGrossmanおよびWilson,1993,Curr.Opin.Genetics and Devel.3:110−114である。
【0327】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮に遺伝子を送達するために特に魅力的なビヒクルであり、この溶暗ベクターの使用は、本発明の範囲内である。アデノウイルスは、本来、軽い疾患を生じる気道上皮に感染する。アデノウイルスベースの送達系のための他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染し得る利点を有する。KozarskyおよびWilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499−503は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の総説を示す。Boutら、1994,Human Gene Therapy 5:3−10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移送するためにアデノウイルスベクターを使用することを例示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスベクターの使用の他の例は、Rosenfeldら、1991,Science 252:431−434;Rosenfeldra,1992,Cell 68:143−155;Mastrangeliら、1993,J.Clin.Invest.91:225−234;PCT公開番号WO94/12649およびWO96/17053;米国特許第5,998,205号;およびWangら、1995,Gene Therapy 2:775−783(これら全ての開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される)に見出され得る。一実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【0328】
アデノ随伴ウイルス(AAV)およびヘルペスウイルス、ならびにこれらのウイルスから調製されたベクターがまた、遺伝子治療における使用について提案された(Walshら、1993,Proc.Soc.Exp.Med.204:289−300;米国特許第5,436,146号;Wagstaffら、Gene Ther.5:1566−70(1998))。ヘルペスウイルスベクターは、遺伝子発現が神経細胞において所望される用途に特に有用である。
【0329】
遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはウイルス感染のような方法によって、組織培地中の細胞に遺伝子を転移する工程を包含する。通常、転移方法は、選択マーカーを細胞に転移する工程を包含する。これらの細胞は、次いで、採取された細胞を単離するために選択下におかれ、そして移送された遺伝子を発現する。これらの細胞は、次いで、患者に送達される。
【0330】
この実施形態において、核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に細胞に導入される。このような導入は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得、これには、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、ウイルスまたはこの核酸配列を含むバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロセル媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合などが挙げられるが、これらに限定されない。異種遺伝子を細胞に導入するための多数の技術は、当該分野で公知であり(例えば、LoefflerおよびBehr、1993,Meth.Enzymol.217:599−618;Cohenら、1993,Meth.Enzymol.217:618−644;Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69−92を参照のこと)、そして本発明に従って使用され得るが、ただし、レシピエント細胞の必要な発生的機能および生理学的機能は、破壊されない。この技術は、細胞への核酸の安定な転移を提供するべきであり、その結果、核酸は、この細胞によって発現可能であり、そして必要に応じて、この細胞の子孫によって遺伝性かつ発現可能である。
【0331】
得られた組換え細胞は、当該分野で公知の様々な方法によって、患者に送達され得る。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または前駆細胞)は、一般的に、静脈内投与される。使用を想定された細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当業者によって決定され得る。
【0332】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、そしてこれには、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞、例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、単核細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または前駆細胞(例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる細胞)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0333】
特定の実施形態において、遺伝子治療のために使用される細胞は、患者に対して自系である。
【0334】
組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において、抗体または他の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列は、細胞に導入され、その結果、これらは、細胞またはそれらの子孫によって発現可能であり、そしてこの組換え細胞は、次いで、治療的効果のために、インビボで投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が使用される。任意の幹細胞および/または前駆細胞(これらは、単離されそしてインビトロで維持され得る)は、本発明のこの実施形態に従って、潜在的に使用され得る(例えば、PCT公開WO94/08598(1994年4月28日);StempleおよびAnderson,1992,Cell 71:973−985;Rheinwald,1980,Meth.Cell Bio.21A:229;およびPittelkowおよびScott,1986,Mayo Clinic Proc.61:771を参照のこと)。
【0335】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的のために導入される核酸分子は、コード領域に作動可能に連結された誘発性プロモーターを含み、その結果、この核酸分子の発現は、形質転換の適切な誘導因子の存在または非存在を制御することによって制御可能である。
【0336】
本発明の核酸分子はまた、トランスジェニック生物(例えば、動物および植物)を産生するために使用され得る。任意の種の動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシおよび非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー)が挙げられるが、これらに限定されない)は、トランスジェニック動物を生成するために使用され得る。さらに、任意の種の植物(例えば、Lepidium sativum、Brassica juncea、Brassica oleracea、Brassica rapa、Acena sativa、Triticum aestivum、Helianthus annuus、Colonial bentgrass、Kentucky bluegrass、多年生ドクムギ、クリーピングベントグラス、Bermudagrass、Buffalograss、センチペデグラス、スイッチグラス、日本芝、海岸パニックグラス、ほうれん草、モロコシおよびトウモロコシが挙げられるがこれらに限定されない)は、トランスジェニック植物を生成するために使用され得る。
【0337】
当該分野で公知の任意の技術を使用して、本発明の核酸を生物体に導入して、トランスジェニック生物の始祖株を産生し得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:前核ミクロ注入(Patersonら、Appl.Microbiol.Biotechnol.40:691−698(1994);Carverら、Biotechnology(NY)11:1263−1270(1993);Wrightら、Biotechnology(NY)9:830−834(1991);およびHoppeら、米国特許第4,873,191号(1989));胚芽株(Van der Puttenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6148−6152(1985))、未分化胚芽細胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子転移;胎児性幹細胞における遺伝子標的化(Thompsonら、Cell 56:313−321(1989));細胞または胚のエレクトロポレーション(Lo,Mol.Cell.Biol.3:1803−1814(1983));遺伝子銃を使用する本発明のポリヌクレオチドの導入(例えば、Ulmerら、Science 259:1745(1993)を参照のこと);核酸構築物の胎児性多能性幹細胞への導入および幹細胞の胚盤胞への転移(Lavitranoら、Cell 57:717−723(1989))など。このような技術の総説については、Gordon、「Transgenic Animals」、Intl.Rev.Cytol.115:171−229(1989)(これは、その全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。このパラグラフで引用される文献の各々の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。米国特許第5,464,764号(Capecchiら、Positive−Negative Selection Methods and Vectors);米国特許第5,631,153号(Capecchiら、Cell and Non−Human Organisms Containing Predetermined Genomic Modifications and Positive−Negative Selection Methods and Vectors for Making Same);米国特許第4,736,866号(Lederら、Transgenic Non−Human ANIMALS);および米国特許第4,873,191号(Wagnerら、Genetic Transformation of Zygotes)(これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される)もまた参照のこと。
【0338】
当該分野で公知の任意の技術(例えば、静止状態に誘発された培養した胚細胞、胎児細胞または成体細胞由来の除核母細胞への核移入)を使用して、本発明の核酸分子を含むトランスジェニッククローンを産生し得る(Compellら、Nature 380:64−66(1996);Wilmutら、Nature 385:810−813(1997)(これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される)。
【0339】
本発明は、本発明の核酸分子をトランスジェニック生物の全ての細胞に有するトランスジェニック生物、ならびに全ての細胞ではないがそれらの核酸分子を有する生物(すなわち、モザイク生物またはキメラ)を提供する。本発明の核酸分子は、単一のコピーとして、またはコンカテマーのような複数のコピーとして(例えば、頭部−頭部タンデムまたは頭部−尾部タンデム)組み込まれ得る。本発明の核酸分子はまた、例えば、Laskoらの教示(Laskoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232−6236(1992))によって、特定および細胞型に選択的に導入され、そして特定の細胞型において活性化され得る。このような細胞型特異的活性化のために必要な制御配列は、本発明の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。本発明の核酸分子が内在性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、これは通常、遺伝子ターゲッティングによって行われる。簡潔には、このような技術が使用される場合、この内在性遺伝子に対して相同性のいくつかのヌクレオチド配列は、染色体配列との相当性組換えによって組み込む目的のため、およびこの内在性遺伝子のヌクレオチド配列の機能を分裂するために、設計される。本発明の核酸分子はまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Guらの教示(Guら、Science 265:103−106(1994))によって、この細胞型のみにおいて内因性遺伝子を不活性化する。このような細胞型特異的不活性化のために必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。このパラグラフで引用される文献の各々の内容は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
【0340】
一旦、トランスジェニック生物が産生されると、組換え遺伝子の発現は、標準的な技術を使用してアッセイされる。最初のスクリーニングは、本発明の核酸分子の組込みが起こったことを確認するために生物組織を分析するサザンロット分析またはPCR技術によって達成され得る。本発明の核酸分子のmRNA発現のレベルはまた、技術(生物体から得られる組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素−PCR(rt−PCRが挙げられるが、これらに限定されない)を使用して評価され得る。組織のサンプルはまた、本発明の核酸分子を発現する場合、これらの核酸分子の発現産物に対して特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価される。
【0341】
一旦、創始生物が産生されると、これらは特定の生物体を産生するために、勾配、同系交配、異系交配、または雑交配される。このような交配ストラテジーの例としては、別個の株を樹立するための1つより多い組込み部位を有する創始生物の異系交配;本発明の核酸分子の各コピーの追加の発現の効果により、より高いレベルで本発明の核酸分子を発現する複合トランスジェニック生物を産生するための、別個の株の同系交配;発現を増大し、かつDNA分析による生物体のスクリーニングの必要性を排除するために、所定の組込み部位に対してホモ接合性の生物外を産生するヘテロ接合性トランスジェニック生物の交差;複合ヘテロ接合性株またはホモ接合性株を産生する別個のホモ接合性株の交差;ならびに目的の実験モデルに適切な別のバックグラウンドに本発明の核酸分子を配置する交配が挙げられる。
【0342】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」生物は、本発明の核酸分子の発現産物の生物学的機能を組み立てるのに有用なモデル系(例えば、動物モデル系)、本発明の核酸分子の発現産物の異常な発現に関連した状態および/または障害の研究、およびこのような状態および/または障害を回復するために有効な化合物のスクリーニングを含むが、これらに限定されない用途を有する。
【0343】
当業者が理解するように、本発明の核酸分子が後生物に導入される多くの場合において、発現産物をコードする配列を、発現産物の産生が所望される組織特異的転写制御配列(例えば、組織特異的プロモーター)に作動可能に連結することが望ましい。このようなプロモーターを使用して、所望の組織におけるこれらの発現産物の産生を促進し得る。かなりの数の組織特異的プロモーターは、当該分野で公知である。さらに、組織特異的転写制御配列を同定するための方法は、本明細書中の別の箇所で記載される。
【0344】
(宿主細胞)
本発明はまた、本発明の1つ以上の核酸分子またはベクター(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、40個など)を含む宿主細胞、特に、本明細書中で詳述される核酸分子およびベクターに関する。本発明のこの局面に従って使用され得る代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい細菌宿主細胞としては、Escherichia spp.細胞(特に、E.coli細胞、さらに詳細には、E.coli株、DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1(好ましくは、E.coli LIBRARY EFFICIENCY(登録商標)DB3.1TM Competent Cell;Invitrogen Corp.,Life Technologies Division,Rockville,MD)、DB4およびDB5(米国特許第09/518,188(2000年3月2日出願)、および米国仮出願60/122,392(1999年3月2日出願)(これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される))、Bacillus spp.細胞(特に、B.subtilisおよびB.megaterium細胞)、Streptomyces spp.細胞、Erwinia spp.細胞、Klebsiella spp.細胞、Serratia spp.細胞(特に、S.marcessans細胞)、Pseudomonas spp.細胞(特に、p.aeruginosa細胞)、およびSalmonella spp.細胞(特に、S.typhimuriumおよびS.typhi細胞)が挙げられる。好ましい動物宿主細胞としては、昆虫細胞(最も具体的には、Drosophila melanogaster細胞、Spodoptera frugiperda Sf9およびSf21細胞、およびTrichoplusa High−Five細胞)、線虫細胞(tkウニ、C.elegans細胞)、鳥類細胞、両生類細胞(特に、Xenopus laevis細胞)、は虫類細胞、および哺乳動物細胞(最も具体的には、NIH3T3、CHO、COS、VERO、BHKおよびヒト細胞)が挙げられる。好ましい酵母細胞としては、Saccharomyces cerevisiae細胞およびPichia pastoris細胞が挙げられる。これらおよび他の適切な宿主細胞は、例えば、Invitrogen Corp.、Life Technologies Division(Rockville,Maryland)、American Type Culture Collection(Manassas,Virginia)、およびArgicultural Research Culture Collection(NRRL;Peoria,Illiois)から市販されている。
【0345】
本発明の核酸分子および/またはベクターを本明細書中に記載される宿主細胞に導入して、本発明の核酸分子および/またはベクターの1つ以上を含む宿主細胞を産生するための方法は、当業者によく知られている。例えば、本発明の核酸分子および/またはベクターは、感染、形質導入、エレクトロポレーション、トランスフェクションおよび形質転換のような周知の技術を使用して、宿主細胞に導入され得る。本発明の核酸分子および/またはベクターは、単独でか、または他の核酸分子および/またはベクターおよび/またはタンパク質、pHupチドもしくはRNAと共に導入され得る。あるいは、本発明の核酸分子および/またはベクターは、沈殿物(例えば、リン酸カルシウム沈殿物)として、または脂質との複合体の形態で宿主細胞に導入され得る。エレクトロポレーションはまた、本発明の核酸分子および/またはベクターを宿主に導入するために使用され得る。同様に、このような分子は、E.coli.のようなコンピテント細胞に化学的に導入され得る。ベクターがウイルスである場合、これはインビトロでパッケージングされるか、またはパッケージング細胞に導入され得、そしてこのパッケージングされたウイルスは、細胞に形質導入され得る。本発明の核酸分子は、1つ以上のパッケージングシグナル(例えば、ウイルス核酸分子のパッケージングを指向するウイルスパッケージングシグナル)を含みそして/またはコードし得る。従って、本発明の核酸分子および/またはベクターを、本発明のこの局面に従って導入するために適切な多種多様な技術は周知であり、そして当業者に慣用的である。このような技術は、例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbar,NY:Cold Spring Harbar Laboratory Press,16.30−16.55頁(1989)、Watson,J.D.ら、Recombinant DNA、第2版、New York:W.H.Freeman and Co.,213−234頁(1992)、およびWinnacker,E.L.Frome Genes to Ckones,New York:VCH Publishers(1987)(これらは、これらの技術を詳述する多くの研究室マニュアルの例示であり、その全体が本明細書中で参考として援用される)に詳細に総説される。
【0346】
(ポリメラーゼ)
本発明で使用するためのポリメラーゼとしては、ポリメラーゼ(DNAおよびRNAポリメラーゼ)、および逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。DNAポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:Thermus thermophilus(Tth)DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus(Taq)ポリメラーゼ、ThermotogaNeopolitana(Tne)DNAポリメラーゼ、Thermotoga maritima(Tma)DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(TliまたはVENTTM)DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosus(Pfu)DNAポリメラーゼ、DEEPVENTTM DNAポリメラーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)DNAポリメラーゼ、Pyrococcus sp KOD2(KOD)DNAポリメラーゼ、Bacillus sterothermophilus(Bst)DNAポリメラーゼ、Bacillus caldophilus(Bca)DNAポリメラーゼ、Sulfolobus acidocaldarius(Sac)DNAポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum(Tac)DNAポリメラーゼ、Thermus flavus(Tfl/Tub)DNAポリメラーゼ、Thermus ruber(Tru)DNAポリメラーゼ、Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNAポリメラーゼ、Methanobacteriumthermoautotrophicum(Mth)DNAポリメラーゼ、マイコバクテリウムDNAポリメラーゼ(Mtb、Mlep)、E.coli pol I DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、および一般的なpol I型DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体。T3、T5、T7およびSP6、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体のようなRNAポリメラーゼはまた、本発明に従って使用され得る。
【0347】
本発明において使用される核酸ポリメラーゼは、中温性または高温性であり、そして好ましくは、高温性であり得る。好ましい中温性DNAポリメラーゼとしては、DNAポリメラーゼ(およびそれらのそれぞれのKlenowフラグメント)のPol Iファミリーが挙げられ、これらのいずれかは、生物体(例えば、E.coli、H.influenzae、D.radiodurans、H.pylori、C.aurantiacus、R.prowazekii、T.pallidum、Synechocystis sp.、B.subtilis、L.lactis、S.pneumoniae、M.tuberculosis、M.leprae、M.smegmatis、Bacteriophage L5、phi−C31、T7、T3、T5、SP01、SP02、S.cerevisiae MIP−1由来のミトコンドリア、および真核生物C.elegans、およびD.melanogaster(Astatke,M.ら、1998,J.Mol.Biol.278,147−165)、任意の供給源から単離されたpol III型DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、誘導体または改変体など)から単離され得る。本発明の方法および組成物において使用され得る好ましい高温性DNAポリメラーゼとしては、Taq、Tne、Tma、Pfu、KOD、Thl、Tth、Stoffelフラグメント、VENTTMおよびDEEPVENTTMDNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体が挙げられる(米国特許第5,436,149号;米国特許第4,889,818号;米国特許第4,965,188号;米国特許第5,079,352号;米国特許第5,614,365号;米国特許第5,374,553号;米国特許第5,270,179号;米国特許第5,047,342号;米国特許第5,512,462号;WO92/06188;WO92/06200;WO96/10640;WO97/09451;Barnes,W.M.Gene 112:29−35(1992);Lawyer,F.C.ら、PCR Meth.Appl.2:275−287(1993);Flaman,J.M.ら、Nucl.Acids Res.22(15):3259−3260(1994))。
【0348】
本発明において使用するための逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を含む。このような酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、B型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイク逆転写酵素、細菌性逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(Saiki,R.K.ら、Science 239:487−491(1988);米国特許第4,889,818および同第4,965,188号)、Tne DNAポリメラーゼ(WO96/10640およびWO97/09451)、Tma DNAポリメラーゼ(米国特許第5,374,553号)、ならびにそれらの変異体、改変体または誘導体(例えば、WO97/09451およびWO98/47912を参照のこと)。本発明において使用するために好ましい酵素としては、RNase H活性を減少したか、実質的に減少したか、または排除した酵素が挙げられる。「RNase H活性が実質的に減少した」酵素とは、対応する野生型またはRNase H+酵素(例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス(M−MLV)、鳥類骨髄芽球症ウイルス(AMV)またはラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素)のRNase H活性の、約20%未満、より好ましくは、約15%、10%、または5%未満、最も好ましくは、約2%未満を有する酵素を意味する。任意の酵素のRNase H活性は、例えば、米国特許第5,244,797号(Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265(1988))およびGerard,G.F.ら、FOCUS 14(5):91(1992)(これら全ての開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される)に記載されるような様々なアッセイによって決定され得る。本発明において使用するために特に好ましいポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:M−MLV H−逆転写酵素、RSV H−逆転写酵素、AMV H−逆転写酵素、RAV(ラウス肉腫ウイルス)H−逆転写酵素、MAV(骨髄芽球症関連ウイルス)H−逆転写酵素、およびHIV H−逆転写酵素(米国特許第5,244,797号およびWO98/47912を参照のこと)。しかし、リボ核酸からDNA分子を産生し得る任意の酵素(すなわち、逆転写酵素活性を有する)は、本発明の組成物、方法およびキットで等しく使用され得ることが、当業者に理解される。
【0349】
本発明で使用するためのポリメラーゼ活性を有する酵素は、例えば、Invitrogen Corp.、Life Technologies Division(Rockville,Maryland)、Perkin−Elmer(Branchburg,New Jersey)、New England BioLabs(Beverly,Massachusetts)、またはBoehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)から市販される。本発明で使用するための逆転写酵素活性を有する酵素は、例えば、Invitrogen Corp.、Life Technologies Division(Rockville,Maryland)、Pharmacia(Piscataway,New Jersey)、Sigma(Saint Louis,Missouri)、またはBoehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)から市販される。あるいは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素は、当業者に周知の天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な方法に従って、それらの天然のウイルス供給源または細菌供給源から単離され得る(例えば、Houts,G.E.ら、J.Virol.29:517(1979)を参照のこと)。さらに、このようなポリメラーゼ/逆転写酵素は、当業者に周知である組換えDNA技術によって調製され得る(例えば、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res.16:265(1988);米国特許第5,244,797号;WO98/47912;Soltis,D.A.およびSkalka,A.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3372−3376(1988)を参照のこと)。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有する酵素の例としては、本願に記載される任意の酵素が挙げられ得る。
【0350】
(支持体およびアレイ)
本発明に従う使用のための支持体は、任意の支持体または1つ以上の組換え部位もしくはその一部を含む核酸分子に結合するのに適切なマトリクスであり得る。このような分子は、任意の技術または当該分野において周知の技術の任意の組合せによって、本発明の支持体に付加または結合(共有結合的または非共有結合的)され得る。本発明の支持体としては、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン(マイクロタイタープレートを含む)、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、およびナイロンが挙げられ得る。本発明の支持体は、ビーズ、フィルター、膜、シート、フリット、プラグ、カラムなどを含む任意の形態または構成であり得る。固体支持体は、マルチウェルチューブ(例えば、マイクロタイタープレート)(例えば、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、および384ウェルプレート)もまた含む。好ましいビーズは、ガラス、ラテックス、または磁性材料(磁性ビーズ、常磁性ビーズ、もしくは超常磁性)から作製される。
【0351】
好ましい局面において、本発明の方法は、タンパク質アレイもしくは核酸分子(RNAもしくはDNA)アレイ、または他の分子アレイ、化合物アレイ、および/もしくは基板アレイを調製するために使用され得る。このようなアレイは、マイクロプレート、ガラススライド、または標準的なブロッティング膜上に形成され得、そして、このアレイの型式および設計に依存して、マイクロアレイ、または遺伝子チップとして引用され得るこのようなアレイのための使用としては、遺伝子の発見、遺伝子の発現の性質決定、遺伝子型決定(genotyping)(SNP分析、薬理遺伝学、毒性遺伝学(toxicogenetics))、およびナノテクノロジー装置の準備が挙げられる。
【0352】
核酸アレイの合成および使用、ならびに、支持体への核酸の一般的な結合は、記載されている(例えば、米国特許第5,436,327号,米国特許第5,800,992号,米国特許第5,445,934号,米国特許第5,763,170号,米国特許第5,599,695号,および米国特許第5,837,832を参照のこと)。基板上に位置的に定義された部位に種々の試薬が結合するための自動化プロセスは、Pirrungら,米国特許第5,143,854号およびBarrettら,米国特許第5,252,743号に提供される。例えば、ジスルフィド改変オリゴヌクレオチドは、ジスルフィド結合を用いて固体支持体に対して共有結合し得る。(Rogersら,Anal.Biochem.266:23−30(1999)を参照のこと)。さらに、ジスルフィド改変オリゴヌクレオチドは、固体相合成を用いるペプチド核酸(PNA)であり得る。(Aldrian−Herradaら,J.Pept.Sci.4:266−281(1998)を参照のこと)。従って、1つ以上の組換え部位またはその一部を含む核酸分子は、1つ以上の支持体に付加され得(またはこのような支持体上でアレイ中に付加され得る)、そして核酸、タンパク質、または、他の分子および/もしくは化合物は、本発明の組換え方法を介してこのような支持体に付加され得る。目的の分子に対する核酸の結合は、当該分野において公知であり、従って、従来技術の1つは、本発明に従う支持体への結合(アレイ型式においてかまたは他における)のための組換え部位(またはその一部)を含む分子および/または化合物を産生し得る。
【0353】
本質的に、任意の考えられ得る支持体は、本発明において使用され得る。この支持体は、生物学的、非生物学的、有機的、非有機的、またはこれらのいずれかの組合せであり得る(粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チュービング、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する)。この支持体は、任意の利便な形状(例えば、ディスク、四角、球、円、など)を有する。この支持体は、平坦であることが好ましいが、様々な代替の表面構成を有し得る。例えば、この支持体は、合成または他の反応に使用され得る増加した領域または減少した領域を含み得る。この支持体およびその表面は、本明細書において記載される反応を実施するための堅い支持体を好ましく形成する。この支持体およびその表面はまた、適切な軽く吸収する特徴を提供するために選択される。例えば、この支持体は、重合化されたLangmuir Blodgett filmで、官能基化されたガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SIN4、改変されたシリコン、または多種多様なゲルもしくはポリマー(例えば、(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)2フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカルボネート)の任意の1つ、あるいはそれらの組合せであり得る。他の支持体材料は、本開示の概要において当業者にとって容易に明白である。好ましい実施形態において、この支持体は、平坦なガラスまたは単一結晶シリコンである。
【0354】
従って、本発明は、支持体に結合した核酸分子のアレイを調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの核酸分子は、1つ以上の(例えば、1つ、2つ、3つ、または4つ)それらの末端に組換え部位を有する。いくつかのさらなる実施形態において、1つの核酸分子は、支持体または支持体の特異的部分に直接的に結合され、そして1つ以上のさらなる核酸分子は、支持体に直接的に結合した核酸分子への結合を経て支持体に間接的に結合する。このような場合、支持体に直接的に結合した核酸分子は、核酸アレイが構成され得る周辺の核形成の部位を提供する。
【0355】
本発明はさらに、互いに支持体に結合するため、および同じ支持体に一緒に結合する分子に結合するための方法を提供する。このようなプロセスの1つの実施形態の非限定実例について図11を用いて、RS6が設計する組換え部位が、この図のより低い位置において支持体に結合したことが示されたA/B組成物上のRS5部位の末端に位置し得る。さらに、同一の組成物はまた、同じかまたは異なる支持体の別の部分に結合され得る。次いで、RS6部位間の組換えを用いて、2つの組成物が結合され、それによって、同じ支持体に結合した2つの組成物間の結合、または異なる支持体に結合した2つの組成物間の結合のいずれかを形成する。従って、本発明は、組換え部位を用いて支持体に結合する1つ以上の組成物を結合することによって同じ支持体に結合した化合物が架橋するための方法を提供する。本発明はまた、組換え部位を要求するこれらの支持体に結合した1つ以上の組成物を結合することによって、別々の支持体に架橋するための方法を提供する。
【0356】
1つの局面において、本発明は、本発明の方法によって産生される核酸分子を含む支持体を提供する。多数の実施形態において、これらの支持体の核酸分子は、少なくとも1つの組換え部位を含む。いくつかの実施形態において、この組換え部位は、支持体への核酸分子の結合の前に、組換えを受ける。これらの結合した核酸分子は、例えば、他の核酸分子(例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、結合した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子)、および結合した核酸分子に対して結合する結合性を有するタンパク質を同定するのに有用である。発現産物はまた、これらの結合した核酸分子(核酸分子が支持体に結合したままである場合)から産生され得る。従って、本発明の組成物および方法を用いて、発現産物およびこれらの発現産物によって産生される産物を同定し得る。
【0357】
他の実施形態において、支持体に結合する核酸分子は、支持体への核酸分子の結合の後に組換えを受ける。すでに議論されたように、従って、これらの結合した核酸分子を用いて、1つまたは特定の多数の生物学的プロセスまたは生物学的経路に関連する発現産物をコードする核酸分子を同定され得る。
【0358】
さらに、支持体に結合した核酸分子は、これらの支持体から遊離され得る。
核酸分子を遊離するための方法は、結合した核酸分子にハイブリダイズした核酸分子の分離を誘導するための、制限消化、組換え、および条件の変化(例えば、温度、塩濃度など)を含む。従って、本発明の方法は、核酸分子が核酸分子の単離のために結合した支持体の使用を含む。
【0359】
上記のように、1つの局面において、本発明は、同じ生物学的プロセスまたは同じ生物学的経路に関連する発現産物をコードする核酸分子を同定するための核酸ライブラリーをスクリーニングするための方法を提供する。特定の実施形態において、このような方法は以下を含む:(1)少なくとも1つの組換え部位を有する核酸が支持体に結合する工程、(2)ライブラリーの核酸分子と結合した核酸分子に結合する工程(ここで、このライブラリーの個々の核酸は、結合した核酸分子とこのライブラリーの核酸分子間の組換えを容易にする条件下で、少なくとも1つの組換え部位を含む)、および(3)組換えによって形成される核酸分子の発現産物、またはこれらの核酸の発現産物によって産生される産物のいずれかをスクリーニングする工程。
【0360】
支持体に核酸分子が結合することによって形成され得る組成物の例としては、「遺伝子チップ」(しばしば、当該分野において「DNAマイクロアレイ」または「ゲノムチップ」として引用される)がある(米国特許第5,412,087号および米国特許第5,889,165号,ならびにPCT公開番号WO 97/02357,WO 97/43450,WO 98/20967,WO 99/05574,WO 99/05591,およびWO 99/40105を参照のこと、この開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される)。本発明の種々の実施形態において、これらの遺伝子チップは、本明細書に記載される2次元の核酸アレイおよび3次元の核酸アレイを含み得る。
【0361】
アドレス可能な(adressability)本発明の核酸アレイとは、特定の核酸配列に結合する分子または化合物が、アレイに結合し得ることを意味する。従って、組成物(例えば、タンパク質および他の核酸)は、本発明の核酸アレイにおいて特異的な位置(location)/位置(position)に結合し得る。
【0362】
従って、1つの局面において、本発明は、以下を含む親和性(affinity)精製方法を提供する:(1)少なくとも1つの組換えを含む核酸分子が結合する支持体を提供する工程、(2)組換え反応を用いて支持体に1つ以上のさらなる核酸分子が結合する工程、(3)支持体に結合した核酸に対して分子または化合物が容易に結合する条件下で、支持体に結合した核酸分子に対して結合する結合性を有する分子または化合物を含む組成物と支持体が結合する工程、(4)結合した分子または化合物の遊離を容易にする条件の変化、および(5)遊離した分子または化合物を収集する工程。
【0363】
(核酸合成、増幅および配列決定の方法)
本発明は、核酸分子(例えば、DNA(cDNAを含む)分子およびRNA分子)の合成を包含する任意の方法を組合せて使用され得る。このような方法としては、核酸合成方法、核酸増幅方法および核酸配列決定方法が挙げられるがそれらに限定されない。このような方法を使用して、本発明において使用される分子(例えば、開始分子))を調製し得るか、または本発明によって産生される分子もしくはベクターをさらに操作し得る。
【0364】
本発明のこの局面に従う核酸合成方法は、1つ以上(2つ、3つ、4つ、5つ、7つ、10、12、15など)の工程を包含し得る。例えば、本発明は核酸分子を合成するための以下の工程を含む方法を提供する:(a)核酸テンプレート(例えば、本発明の核酸分子または核酸ベクター)と、1つ以上のプライマー(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、7つ、10、12、15、20、30、35など)および1つ以上(2つ、3つ、4つ、5つ、7つなど)のポリメラーゼ活性もしくは逆転写酵素活性を有する酵素とを混合して、混合物を形成する工程;ならびに(b)この混合物を、このテンプレートの全てまたは一部に相補的な第一の核酸分子が生成するに十分な条件下でインキュベートする工程。本発明のこの局面に従って、核酸テンプレートは、cDNA分子またはcDNAライブラリーのようなDNA分子、あるいはmRNAのようなRNA分子であり得る。例えば、pH、温度、イオン強度およびインキュベーション時間といった合成を可能とするのに十分な条件は、当業者により最適化され得る。所望の場合、組換え部位は、合成の間または合成の後、このような合成された分子に付加され得る(1997年10月24日に出願された米国州特許出願60/065,930に基づく、1998年10月23日に出願された米国特許出願番号09/177,387を参照のこと)。
【0365】
本発明に従って、標的核酸またはテンプレート核酸の分子またはライブラリーは、天然の供給源(例えば、種々の細胞、組織、器官または生物)から得られた核酸分子から調製され得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞としては、原核生物細胞(細菌細胞(以下の属の種の細菌を含む:Escherichia、Bacillus、Serratia、Salmonella、Staphylococcus、Streptococcus、Clostridium、Chlamydia、Neisseria、Treponema、Mycoplasma、Borrelia、Legionella、Pseudomonas、Mycobacterium、Helicobacter、Erwinia、Agrobacterium、Rhizobium、およびStreptomyces))または真核生物細胞(真菌(特に酵母)、植物、原生動物および他の寄生虫、ならびに動物(昆虫(特に、Drosophila spp.細胞)、線虫(特にCaenorhabditis elegans細胞)、および哺乳動物(特にヒト細胞)を含む)が挙げられる。
【0366】
当然、有利に使用され得る核酸合成の他の技術は、当業者に容易に明白である。
【0367】
本発明の他の局面において、本発明は、核酸分子を増幅するための方法または配列決定のための方法とを組み合わせて使用され得る。本発明のこの局面に従う核酸増幅方法は、ワンステップ(例えば、ワンステップRT−PCR)またはツーステップ(例えば、ツーステップRT−PCR)逆転写酵素増幅反応として当該分野において一般的に知られる方法において、逆転写酵素活性を有する、1つ以上のポリペプチドの使用を包含し得る。長い核酸分子(すなわち、約3〜5Kb長より長い)の増幅のために、WO 98/06736およびWO 95/16028に記載されるようなDNAポリメラーゼの組合せが使用され得る。
【0368】
本発明に従う増幅方法は、1つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、7つ、10、12、15、20、30、50、100、など)の工程を包含し得る。例えば、本発明は、核酸分子を増幅するための以下の工程を含む方法を提供する:(a)1つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、7つ、10、など)の核酸テンプレート(例えば、組み込み配列を含む標的分子)と、ポリメラーゼ活性を有する1つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、7つ、10、など)の酵素とを混合する工程;および(b)その混合物を、ポリメラーゼ活性を有する酵素がそのテンプレートの全てまたは一部に相補的な1つ以上の核酸分子を増幅することを可能にするに十分な条件下で、インキュベートする工程。本発明はまた、このような方法によって増幅された核酸分子を提供する。所望される場合、組換え部位は、増幅プロセスの間または増幅プロセス後にこのような増幅された分子が付加され得る。
【0369】
核酸分子またはフラグメントの増幅および分析のための一般的な方法は、当業者に周知である(例えば、以下を参照のこと:米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;および同第4,800,159号;Innis,M.A.ら,編,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,San Diego,California:Academic Press,Inc.(1990);Griffin,H.G.,およびGriffin,A.M.,編,PCR Technology:Current Innovations,Boca Raton,Florida:CRC Press(1994))。例えば、本発明に従って使用され得る増幅方法は、PCR(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号)、鎖置換増幅(SDA;米国特許第5,455,166号;EP 0 684 315)、および核酸配列ベース増幅(NASBA;米国特許第5,409,818号;EP 0 329 822)が挙げられる。
【0370】
代表的には、これらの増幅方法は、以下の工程を包含する:(a)ポリメラーゼ活性を有する1つ以上の酵素を、1つ以上のプライマー配列の存在下で、核酸サンプルと混合する工程、および(b)その核酸サンプルを増幅して、増幅された核酸フラグメントの収集物を生成する工程(好ましくは、これは、PCRまたは等価な自動増幅技術による)。
【0371】
本発明の方法による増幅または合成の後、増幅または合成された核酸フラグメントは、さらなる使用および特徴付けのために単離され得る。この工程は、通常、大きさによるか、または任意の物理的もしくは生化学的な手段(ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(サイズ分離、アフィニティーおよび免疫クロマトグラフィーを含む)、密度勾配遠心分離および免疫吸着を含む)による、増幅または合成された核酸フラグメントの分離によって達成される。ゲル電気泳動による核酸フラグメントの分離は、特に好ましい。なぜなら、それは、多数の核酸フラグメントの高感度な分離の、迅速かつ高度の再現性のある手段を提供するからであり、そしていくつかの核酸サンプルにおけるフラグメントの直接的で、同時の比較を可能にするからである。このアプローチは、別の好ましい実施形態において、これらのフラグメント、または本発明の方法によって増幅もしくは合成された任意の核酸フラグメントを単離および特徴付けすることへと拡張され得る。従って、本発明はまた、本発明の増幅または合成方法によって生成された核酸分子を単離することにも関する。
【0372】
この実施形態において、増幅または合成された1つ以上の核酸フラグメントのは、ゲルから取り出され、これは、電気溶出または物理的切り出しのような標準的な技術に従って、同定(上記参照)するために使用された。次いで、単離された特有の核酸フラグメントは、種々の原核生物(細菌)または真核生物(酵母、植物または動物(ヒトおよび他の哺乳動物を含む))の細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適切な標準的なベクター(発現ベクターを含む)に挿入され得る。あるいは、本発明の方法によって生成された核酸分子は、当該分野において標準的である以下および他に記載される方法によって(例えば、配列決定(すなわち、核酸フラグメントのヌクレオチド配列を決定すること)によって)、さらに特徴づけられ得る(例えば、以下を参照のこと:米国特許第4,962,022号および同第5,498,523号、これらは、DNA配列決定の方法に関する)。
【0373】
本発明に従う核酸配列決定は、1つ以上の工程を包含する。例えば、本発明は、核酸分子の配列決定のための以下の工程を含む方法と組み合わされ得る:(a)ポリメラーゼ活性を有する酵素と、配列決定されるべき核酸分子、1つ以上のプライマー、1つ以上のヌクレオチドおよび1つ以上の終結因子(例えば、ジデオキシヌクレオチド)を混合して、混合物を形成する工程;(b)その混合物を、配列決定されるべき分子の全てまたは一部に対して相補的な分子の集団を合成するに十分な条件下で、インキュベートする工程;および(c)その集団を分離して、配列決定されるべき分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定するためにこの群を分離する工程。
【0374】
使用され得る核酸配列決定の技術は、米国特許第4,962,022号および同第5,498,523号に開示される技術のようなジデオキシ配列決定方法を包含する。
【0375】
(キット)
別の局面において、本発明は、本発明とともに使用され得るキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、1つ以上の容器を含み得る。この容器は、以下からなる群より選択される1つ以上の成分を含み得る:1つ以上の本発明の核酸分子またはベクター、1つ以上のプライマー、本発明の分子および/または化合物、本発明の支持体、1つ以上のポリメラーゼ、1つ以上の逆転写酵素、1つ以上の挿入触媒酵素、1つ以上の組換えタンパク質(または本発明の方法を実施するための他の酵素)、1つ以上の緩衝剤、1つ以上の界面活性剤、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼ、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上の終結因子(例えば、ddNTP)、1つ以上のトランスフェクション試薬、ピロホスファターゼなど。
【0376】
本発明の種々の核酸分子またはベクターは、本発明を用いて使用され得る。さらに、本発明のモジュール性に起因して、これらの核酸分子およびベクターは、広範囲な方法において結合され得る。本発明のキットにおいて供給され得る核酸分子の例としては、プロモーター、シグナルペプチド、エンハンサー、リプレッサー、選択マーカー、転写シグナル、翻訳シグナル、プライマーハイブリダイゼーション部位(例えば、シークエンスまたはPCRのための)、組換え部位、制限部位およびポリリンカー、サプレッサーtRNAの存在下で翻訳末端を抑制する部位、融合タンパク質の調製のためにドメインおよび/または領域(例えば、6Hisタグ)をコードする配列、複製の起点、テロマー、動原体、などを含む核酸分子が挙げられる。同様に、ライブラリーは、本発明のキットにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、複製可能な核酸分子の形態中に存在し得るか、または、これらのライブラリーは、複製の起点と会合されない核酸分子を含み得る。当業者が認識するように、ライブラリーの核酸分子および他の核酸分子(これらは、複製の起源に会合しない)はいずれも、複製の起源を有する他の核酸分子に挿入され得るか、または、消耗キット構成成分である。
【0377】
さらに、いくつかの実施形態において、本発明のキットにおいて供給されるライブラリーとしては、以下の2つの構成成分が挙げられる:(1)これらのライブラリーの核酸分子、および(2)5’組換え部位および/または3’組換え部位、この場合、ライブラリーの核酸分子は、5’組換え部位および/または3’組換え部位とともに供給され、これらの分子をベクター中に挿入することを可能とし、このベクターもまた、組換え反応に用いるキットの構成成分として供給され得る。他の実施形態において、組換え部位は、使用前にこれらのライブラリーの核酸分子に結合され得る(例えば、リガーゼ(これもまた、このキットとともに供給され得る)の使用によって)。このような場合、組換え部位を生じるために使用され得る核酸分子は、このキットとともに供給され得る。
【0378】
本発明のキットにおいて供給されるベクターは、非常に変化され得る。ほとんどの例において、これらのベクターは、複製の起点、少なくとも1つの選択マーカー、および少なくとも1つの組換え部位を含む。例えば、本発明のキットにおいて供給されるベクターは、3つの異なる位置で核酸分子の挿入を可能とする4つの組換え部位を有し得る。この型のベクターは、図6に図解的に示される。本発明のキットにおいて供給されるベクターのほかの性質は、本明細書中の他の箇所に記載される。
【0379】
本発明のキットはまた、プライマーとともに供給され得る。これらのプライマーは、一般に、特定のヌクレオチド配列を有する分子にアニーリングするように設計される。例えば、これらのプライマーは、PCRにおいて特定の核酸分子を増幅するための使用のために設計され得る。さらに、本発明のキットとともに供給されるプライマーは、ベクター配列にハイブリダイズするよう設計されたプライマーをシークエンスし得る。従って、このようなプライマーは、一般に、ベクター中に挿入された核酸分子をシークエンスするためのキットの一部として供給される。
【0380】
1つ以上の緩衝液(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、8つ、10、15)は、本発明のキットにおいて供給され得る。これらの緩衝液は、作動(working)濃度で供給され得るか、または濃縮形態で供給され得、次いでこの作動濃度まで希釈される。これらの緩衝液は、しばしば、塩、金属イオン、補因子、金属イオンキレート化試薬などを、この緩衝液において、この緩衝液自体または分子のいずれかの安定化して活性を増強するために含む。さらに、これらの緩衝液は。乾燥した形態または含水形態で供給され得る。緩衝液が乾燥した形態で供給される場合、これらの緩衝液は、一般に、使用前に、水中に溶解される。本発明のキットの使用に適切な緩衝液の例は、以下の例において示される。
【0381】
本発明での使用に適切な支持体(例えば、固体支持体、半固体支持体、ビーズ、マルチウェルチューブ、など、上記により詳細に記載される)もまた、本発明のキットとともに供給される。本発明のプロセスにおける支持体の使用の例示は、図10〜13に示される。
【0382】
本発明のキットは、上記かまたは本明細書中の他の箇所で示されたこの構成成分の任意の組合せを実質的に含み得る。当業者が理解するように、本発明のキットとともに供給されるこの構成成分は、このキットのための意図される使用にともなって変化する。従って、キットは、この適用に示された種々の機能を実施するために設計され得、そしてこのようなキットの構成成分は、それに従って変化する。
【0383】
当業者は、本明細書において記載される方法および適用に対して他の適切な改変および適用は、当業者に公知の情報を考慮して本明細書において含まれる本発明の説明から容易に明かであり、そしてそのような改変および適用は、本発明の範囲またはその任意の実施形態からも逸脱することなくなされ得ることを理解する。本発明を今や詳細に説明したので、本発明は、以下の実施例を参照してより明確に理解される。この実施例は、例示の目的のみで本明細書中に含まれ、そして本発明を限定することは意図するものではない。
【0384】
1995年6月7日に出願された米国特許出願番号08/486,139 (現在、放棄された),1996年6月7日に出願された米国特許出願番号 08/663,002(現在米国特許第5,888,732号),1999年1月20日に出願された米国特許出願番号09/233,492,2000年11月7日に刊行された米国特許第6,143,557号,1997年10月24日に出願された米国特許出願番号60/065,930,1998年10月23日に出願された米国特許出願番号09/177,387,1999年4月22日に出願された米国特許出願番号09/296,280,1999年4月22日に出願された米国特許出願番号09/296,281,1998年11月13日に出願された米国特許出願番号60/108,324,1999年11月12日に出願された米国特許出願番号09/438,358,2000年10月25日に出願された米国特許出願番号09/695,065,1999年11月2日に出願された米国特許出願番号09/432,085,1999年3月2日に出願された米国特許出願番号60/122,389,1999年3月23日に出願された米国特許出願番号60/126,049,1999年5月28日に出願された米国特許出願番号60/136,744,1999年3月2日に出願された米国特許出願番号60/122,392,および1999年10月25日に出願された米国特許出願番号60/161,403の開示のこの全体は、本明細書において参考として援用される。
【0385】
(実施例)
(実施例1:LR反応を用いた2つの核酸セグメントの同時クローニング)
2つの核酸セグメントは、本発明の方法を用いて単一反応においてクローン化され得る。本発明の方法としては、以下の工程を含み得る:第1組換え部位および第2組換え部位によって隣接される第1核酸セグメントを提供する工程、第3組換え部位および第4組換え部位によって隣接される第2核酸セグメントを提供する工程、(ここで、この第1組換え部位または第2組換え部位のいずれかは、第3組換え部位または第4組変え部位のいずれかを用いて組換えることが可能である)、組換え反応を行い、その結果、2つの核酸セグメントが単一の核酸分子に組換えらる工程、ならびに単一核酸分子をクローン化する工程。
【0386】
図2を参考に、組換え部位によって隣接された2つの核酸セグメントは、提供され得る。当業者は、この核酸セグメントが、個々のフラグメントとしてか、またはより大きい核酸の一部としてのいずれかで提供され得、そして環状であり得、そして必要に応じてスーパーコイル化され得るか、または直鎖であり得る。この部位は選択され得、その結果、反応する部位の対(reactive pair of site)の1つのメンバーは、2つのセグメントそれぞれによって隣接される。
【0387】
「反応する部位の対」によって意味されることは、適切な酵素および補因子の存在下で組換え得る2つの組換え部位である。例えば、いくつかの好ましい実施形態において、一方の核酸分子がattR部位を含み得、他方がattR部位と反応するattL部位を含む。LR反応の産物が2つの分子(これらの一方がattB部位を含み、そしてこれらの一方がattP部位を含む)である場合、開始attL部位および開始attR部位の配向性を変化し得、その結果、結合後、これらの2つの開始核酸セグメントは、attB部位またはattP部位のいずれかを含む核酸配列によって分離される。
【0388】
いくつかの好ましい実施形態において、これらの部位は、変化され得、その結果、2つの開始核酸セグメントは、組換え反応後、attB部位によって分離される。他の好ましい実施形態において、他の組換え系由来の組換え部位は、使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、1つ以上の組換え部位は、lox部位またはlox誘導体であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、1つより多い組換え系由来の組換え部位は、同じ構築物中で用いられ得る。例えば、1つ以上の組換え部位はatt部位であり得、一方、他はlox部位であり得る。異なる組換え系由来の部位の種々の組合せは、当業者に考慮され得、そしてこのような組合せは、本発明の範囲内にあるべきであると考えられる。
【0389】
図2に示されるように、核酸セグメントA(DNA−A)は、独特の特異性を有する組換え部位(例えば、attL1部位およびattL3部位)によって隣接され得、そして核酸セグメントB(DNA−B)は、組換え部位(例えば、attR3部位およびattL2部位)によって隣接され得る。具体的な目的として、これらのセグメントは、DNAとして示される。これは、他の核酸を除外して、本発明の実施において使用された核酸をDNAに限定して解釈されるべきではない。さらに、これにおいて、および、以下の実施例において、この組換え部位(すなわち、L1、L3、R1、R3など)の設計は、使用された組換え部位が異なる特異性を有することを単に伝達することを意図するものであって、本発明を具体的に引用された部位として限定して解釈されるべきではない。当業者は、具体的に例示される部位に代わって他の部位の対を容易に代用し得る。
【0390】
attR3部位およびattL3部位は、反応する部位の対を含む。独特な組換え部位の他の対を使用して、核酸セグメントを隣接し得る。例えば、lox部位は、1つの反応する対として用いられ得、一方、他方の反応する対がatt部位であり得、そして適切な組換えタンパク質が、この反応に含まれた。同様に、上記で議論された組換え部位は、種々の組合せで使用され得る。この実施形態において、決定的な性質は、各セグメントに隣接する組換え部位(反応する部位の対の1つのメンバー)が、この例(L3およびR3のLR対)において、1つの核酸セグメント上に存在し、そして、反応する対の他のメンバーが、他の核酸セグメント上に存在する性質のみである。この2つのセグメントは、適切な酵素および目的の(Destination)ベクターを用いて接触され得る。
【0391】
目的のベクターは、2つの組換え部位によって隣接される適切な選択マーカーを含む。いくつかの実施形態において、この選択マーカーは、ネガティブな選択マーカーであり得る(例えば、毒性遺伝子(例えば、ccdB))。目的のベクター中の1つの部位は、1つの核酸セグメント上に存在する1つの部位と互換性があり、一方、目的のベクター中に存在する他方の互換性部位は、他方の核酸セグメント上に存在する。
【0392】
2つの開始核酸セグメント間の組換えの欠如(開始核酸セグメントのいずれでもない)は、目的のベクター中のこれらの部位の両方と互換性のある組換え部位を有する。従って、開始核酸セグメントはいずれも、目的のベクター中に存在する選択マーカーに置換され得ない。
【0393】
反応混合物を、約60分〜約16時間、約25℃にてインキュベートし得る。反応混合物の全てまたはその一部を用いて、コンピテント微生物および所望の構築物の存在をスクリーニングした微生物に形質転換する。
【0394】
いくつかの実施形態において、目的のベクターは、ネガティブ選択マーカーを含み、そして形質転換された微生物は、目的のベクター上に存在するネガティブ選択マーカーに感受性がある。形質転換された微生物を、所望の組換え産物を含まない微生物に対してネガティブ選択を可能にする条件下で増殖させる。
【0395】
図2において、得られた所望の産物は、attB3部位によって分離され、そして目的のベクター骨格中にクローン化されたDNA−AおよびDNA−Bからなる。この実施形態において、反応の同じ型(すなわちLR反応)を使用して、2つのフラグメントを結合し得、そして目的のベクター中に結合したフラグメントを挿入し得る。
【0396】
いくつかの実施形態において、1つ以上の核酸セグメントの配向性を制御する必要はなくてもよく、そして同じ特異性を有する組換え部位は、このセグメントの両末端上で使用され得る。
【0397】
図2を参考に、セグメントBに関するセグメントAの配向性が重要でない場合、セグメントAは、逆方向反復として配向された両末端上のL1部位によって隣接され得、そしてセグメントAに結合されるべきセグメントBの末端は、R1部位と配置され得る。これは、セグメントAとセグメントBとの間での組合せライブラリーの形成においてさらなる複雑性を生じることで有用であり得る。それは、これらのセグメントの結合が、種々の配向性を生じ得、そして得られた結合したセグメントの1つまたはその両方が、1つ以上のライブラリー由来であり得、ランダムな配向性におけるハイブリッド分子を含む新しい集団またはライブラリーは、本発明に従って構築され得る。
【0398】
本実施例において、2つの開始核酸セグメント間の組換えは、目的のベクターを用いた組換え反応の前に生じるとして示されるが、この組換え反応の順番は重要ではない。従って、いくつかの実施形態において、これらのセグメント間の組換え反応を行うこと、および結合したセグメントを単離することが所望され得る。結合したセグメントは、直接的に使用され得る(例えば、増幅され得るか、シークエンスされ得るか、または、Sykesら(Nature Biotechnology 17:355−359,1999)によって教授されるように直鎖の発現エレメントとして使用され得る)。いくつかの実施形態において、これらの結合したセグメントは、Tawfikら(Nature Biotechnology 16:652−656,1998)によって教授されるようにカプセル化され得、続いて、1つ以上の所望の性質についてアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、結合したセグメントは、例えば、プロモーター(例えば、1つのセグメント上のT7プロモーターまたはSP6プロモーター)を含むことによってインビトロでのRNAの発現のために使用され得る。このようなインビトロにおいて発現されたRNAは、必要に応じてインビトロでの翻訳系(例えば、ウサギ網状赤血球溶解液)中で翻訳され得る。
【0399】
必要に応じて、結合したセグメントはさらにデスティネーションベクター(Destination Vector)と反応して、結合したセグメントのベクターへの挿入を生じ得る。いくつかの例では、セグメントおよびベクターの1つを含む中間体を単離することが所望され得る。セグメントのベクターへの挿入について、2つのセグメントを結合する組換え反応がセグメントとデスティネーションベクターの間の組換え反応前に起こるかまたは反応後に起こるかということは、本発明の実施に重要ではない。
【0400】
本発明に従うと、3つの組換え反応(すなわち、セグメントAおよびデスティネーションベクターの間での反応、セグメントBおよびデスティネーションベクターの間での反応、およびセグメントAおよびセグメントBの間での反応)の全てが、好ましくは、核酸を産生するために起こり、ここで2つの開始核酸セグメントの両方が、今度は例えば、二つの分子に結合させる。いくつかの実施形態において、組換え部位は選択され得、その結果ベクターへの挿入後、結合したセグメントに隣接する組換え部位は、1対の反応性部位を形成し、そして結合されたセグメントを、適切な組換えタンパク質と隣接部位の反応によってベクターから切り取る。
【0401】
図2を参照して、セグメントB上のL2部位は、セグメントBに関して反対の方向にあるL1部位(すなわち、組換え部位が、セグメントに隣接しなかったということを示すボックスの長い部分)によって置換し、そしてベクター中のR2部位は、逆方向のR1部位によって置換し、組換え反応がベクター中のattP1を産生した。次に、attP1部位は、結合されたセグメントの他の末端のattB1と反応可能であった。従って、結合したセグメントをBP反応に適切な組換えタンパク質を使用して切り取った。
【0402】
本発明の実施形態は、コンビナトリアルライブラリーの構築に特に適する。いくつかの好ましい実施形態において、図2のそれぞれの核酸セグメントは、ライブラリーを表し得、そのそれぞれは、スクリーニングされるべき既知または未知の核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、1以上のセグメントは、所定のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の1以上の順列をコードする配列を有し得る。いくつかの実施形態において、各セグメントは、タンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの配列の種々の順列を表すライブら隣接−を有し得る。例えば、1つのセグメントは、抗体軽鎖の種々のドメインの変異した形態を表し、一方他のセグメントは抗体重鎖の変異した形態を表し得る。従って、組換えは、各々独特の配列組み合わせ(従って、独特の結合特性)を潜在的に含む分子集団(例えば、抗体、単鎖抗原結合タンパク質など)を生成する。
【0403】
他の好ましい実施形態において、セグメントの1つは、単一核酸配列を表し得、一方、もう一方はライブラリーを表し得る。生じる組換えは、配列集団であり、そのすべてが共通の1つの部分を有し、他の部分では異なる。この型の実施形態は、融合構築物のライブラリー作製に有用である。例えば、DNA−A発現を指向する調節配列(すなわち、プライマー)および精製タグをコードする配列を含み得る。適切な精製タグとして、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、エピトープ、エピトープのような規定されたアミノ酸配列、ハプテン、6のヒスチジン(HIS6)などが挙げられるが限定ではない。DNA−Bは、目的のタンパク質の変異された形態のライブラリーを含む。結果として生じる構築物を所望の特性(例えば、酵素的活性またはリガンド結合)についてアッセイし得る。
【0404】
あるいは、DNA−Bは、生じる融合分子の共通部分を含み得る。いくつかの実施形態において、上記方法を使用してプロモーター領域の融合または構造遺伝子の5’末端または3’末端それぞれへの転写終結シグナルを容易にし得、例えば、構造遺伝子に対する組織特異的プロモーターを付加することによって異なる細胞内容物おける発現のために設計された発現カセットを作製し得る。
【0405】
いくつかの実施形態において、1以上のセグメントは、ランダムペプチドライブラリーのメンバーをコードする配列を表し得る。このアプローチを使用して、例えば、所望の特定の特性を有する分子集団を作製し得る。例えば、1つのセグメントは、DNA結合ドメインをコードする配列を含み得、一方、他のセグメントは、ランダムタンパク質ライブラリーを表す。生じる集団は、目的の標的遺伝子の発現を調節する能力についてスクリーニングされ得る。他の実施形態において、両方のセグメントはランダムタンパク質ライブラリーのメンバーをコードする配列を表し、そして結果として生じる合成タンパク質(すなわち、融合タンパク質)は、例えば、特定のリガンドまたはレセプターとの結合、もしくはいくつかの酵素的活性の保有のような任意の所望の特性についてアッセイされ得る。
【0406】
核酸セグメントがアミノ酸配列をコードする必要はない。例えば、両方のセグメントは、タンパク質に翻訳されないRNA分子の転写に関与し得る。このことは、tRNA分子、リボザイム、およびアンチセンス分子の構築に有用である。あるいは、1つのセグメントは、翻訳されないRNA分子の転写に関与し得るが、一方はタンパク質をコードする。例えば、DNA−Aは、タンパク質の発現を増強する翻訳されないリーダー配列(例えば、脳心筋炎ウイルスリーダー配列(EMCリーダー))に関与し得るが、DNA−Bは、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、リーダー配列を含むセグメントは、アミノ酸配列をコードする配列をさらに含み得る。例えば、DNA−Aは、EMCリーダー配列に対応する核酸配列および精製タグを有し、一方、DNA−Bは、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列を有する。
【0407】
上記プロセスは、単鎖抗原結合タンパク質のコンビナトリアルライブラリーの調製に特に有用である。単鎖抗原結合タンパク質の調製方法は、当該分野で公知である(例えば、PCT公開番号 WO 94/07921を参照のこと(その開示全体が本明細書中で参考として援用される))。図解するために図6に示される構築物を使用して、DNA−Aは、例えば、抗体軽鎖可変ドメインの変異した形態をコードし得、そしてDNA−Bは、例えば、抗体軽鎖可変ドメインの変異した形態をコードし得る。さらに、DNAとDNA−Bの間に介在する核酸は、軽鎖および重鎖を連結するペプチドリンカーをコードし得る。次に、単鎖抗原結合タンパク質を発現する細胞をスクリーニングし、特定の抗原に結合する分子を産生するこれらを同定し得る。
【0408】
多数の上記バリエーションが可能である。例えば、図6に示された構築物を使用する代わりに、図2に示されるような構築物を組換え部位に包埋されているリンカーペプチドコード領域とともに使用し得る。これは、組換え部位に包埋された上記機能性の1つの例である。
【0409】
別の実施例として、2つの抗体軽鎖および2つの抗体重鎖から構成される単鎖抗原結合タンパク質がまた生成され得る。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、多価抗原結合複合体と結合し、そして多価抗原結合複合体を形成するために設計され得る。図解のための図2に示される構築物を使用してDNA−AおよびDNA−Bはそれぞれ、例えば、抗体軽鎖の可変ドメインの変異した形態をコードし得る。4つの核酸挿入物の挿入のために設計された同類のベクター中の同じ部位またはベクター中の別の部位で、DNA−AおよびDNA−Bはそれぞれ、例えば、抗体重鎖の可変ドメインの変異した形態をコードする。次に単鎖抗原結合タンパク質の両方を発現する細胞をスクリーニングし、例えば、特定の抗原に特異性を有する多価抗原結合複合体を産生するこれらを同定し得る。
【0410】
従って、本発明の方法を使用して、特定のエピトープに特異性を有する抗原結合タンパク質(例えば、抗体および/もしくは抗原フラグメントまたは可変重ドメインもしくは可変軽ドメインを含む抗体フラグメント複合体)を産生する細胞を同定するためのコンビナトリアルライブラリーを調製およびスクリーニングし得る。本発明の方法はまた、抗原結合タンパク質を調製するための方法を提供し、そして本発明の方法により抗原結合タンパク質が調製される。
【0411】
(実施例2:セグメントを結合するためのLR反応およびセグメントをベクターに挿入するためのBP反応を使用する2つの核酸フラグメントの同時クローニング)
図3に示されるように、attB組換え部位に隣接する第1の核酸セグメントおよびattL組換え部位は、第1の核酸セグメント上に存在し、そして第1のセグメント上に存在するattBと同じかまたは異なり得るattB部位に隣接するattL部位と適合性のattR組換え部位に隣接する第2の核酸セグメントに結合され得る。図3は、2つのattB部位が異なる実施形態を示す。2つのセグメントは、BP反応においてattP部位を含むベクターと接触し得る。
【0412】
引続くLR反応は、attP部位またはattB部位(LR反応産物)のいずれかによって分離されたDNA−AおよびDNA−Bからなる産物を生成し、ベクター骨格にクローン化される。図3に示される実施形態において、attL部位およびattR部位は、組換え上のセグメントの間のattBを生成するようにアレンジされる。他の実施形態において、attLおよびattRは、組換え上のセグメントの間のattP部位を産生するように別々に配向され得る。好ましい実施形態において、組換え後、2つのセグメントは、attB部位によって分離され得る。
【0413】
当業者は、必要以上の実験なしに上記反応を導入するための条件を容易に最適化し得る。代表的な反応において、約50ng〜約1000ngのベクターを適切な反応条件下でクローン化されるべきフラグメントと接触され得る。各フラグメントは、約25:1〜約1:25のベクター:フラグメントのモル比で存在し得る。いくつかの実施形態において、1以上のフラグメントは、約10:1〜1:10のベクター:フラグメントのモル比で存在し得る。好ましい実施形態において、各フラグメントは、約1:1のベクター:フラグメントモル比で存在し得る。
【0414】
代表的には、核酸を、水性の緩衝液に溶解し得、反応混合物に添加し得る。1つの適切な条件設定は、4μlのCLONASETM酵素混合物(例えば、Invitrogen Corp.,Life Technologies Division、カタログ番号11791〜019および11789〜013)、4μlの5倍反応緩衝液および核酸ならびに最終用量20μlになるまでの水である。これは、代表的には、20μlのBP反応において約200ngのIntおよび約80ngのIHFならびに約150ngのInt、約25ngのIHFならびに20μlのLR反応中の約30ngのXisの包含物を生じる。
【0415】
いくつかの好ましい実施形態で、特にattR部位で組換えられるべきattL部位において、最終反応混合物は、組換え酵素および組合されるべき核酸に加えて約50mM Tris HCl(pH7.5)、約1mM EDTA、約1mg/ml BSA,約75mM NaClおよび約7.5mM スペルミジンを含み得る。他の好ましい実施形態で、特にattB部位で組換えられるべきattP部位において、最終反応混合物は、組換え酵素および組合されるべき核酸に加えて約25mM Tris HCl(pH7.5)、約5mM EDTA、約1mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA),約22mM NaClおよび約5mM スペルミジンを含み得る。
【0416】
BP反応およびLR反応の間に核酸を精製することなしにその両方を導入することが望まれる場合、BP反応が最初に導入され得、次に反応条件を、LR CLONASETM酵素および濃縮NaClの添加により約50mM NaCl、約3.8mM スペルミジン、約3.4mM EDTAおよぼ約0.7mg/mlに調整した。反応溶液は、適切な温度(例えば、25℃)で約60分〜16時間インキュベーションし得る。組換え反応後、この溶液を使用してコンピテントな宿主細胞に形質転換し、そしてこの宿主細胞を上記のようにスクリーニングし得た。
【0417】
1本のチューブで行われる2工程の反応でPCR産物の発現クローンへの直接的な転移を容易にする「1チューブ」反応プロトコルの1つの例は、以下である。このプロセスはまた、1つの発現クローンプラスミド骨格からもう1つへの遺伝子の転移のために使用され得る。発現クローンは、第1にプラスミド骨格中で直線化されBP反応について最適なトポロジーを達成し、そして共形質転換に起因する偽陽性コロニーを排除し得る。
【0418】
25μlBP反応混合物を以下の成分を含有する1.5mlチューブに調製する:
【0419】
【表5】
チューブの内容物を混合し、25℃で4時間以上インキュベートする。PCR産物が、GATEWAYTMpDONRまたはpDESTベクター上に存在する選択マーカー(kanrまたはampr)を含むプラスミドテンプレートから増幅される場合、PCR産物は、制限エンドヌクレアーゼDpnIで処理され、プラスミドまで分解され得る。このようなプラスミドはGATEWAYTM反応の形質転換における偽陽性コロニーの潜在的な供給源である。さらに、PCRまたは開始発現コロニーについてのテンプレートが、最終デスティネーションベクター(すなわち、ampr)として同じ選択マーカーを有する場合、100μlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートすることを使用してLR反応工程へ持ち越された偽陽性コロニーの量を決定し得る。
【0420】
5μlの反応混合物を別のチューブに移し、このチューブに0.5μlのプロテインキナーゼK溶液を添加する。次に、このチューブを10分間、37℃でインキュベートする。次に、100μlのコンピテント細胞を1〜2μlの混合物で形質転換し、50μg/mlカナマイシンを含むLBプレート上にプレートする。これは、個々のエントリーコロニーの単離およびBP反応効率の評価のためのコロニーを産生する。
【0421】
以下の成分を残っている蒸気20μlのBP反応に添加する。
【0422】
【表6】
次に、混合物を25℃で2時間インキュベートし、その後、次に3μlのプロテインキナーゼK溶液を10分間37℃でさらにインキュベーションする。次に1〜2μlのこの混合物を使用して、100μlのコンピテント細胞を形質転換し、次にこの細胞を100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートする。
【0423】
(実施例3:BP反応およびそれに続くLR反応におけるattLおよびattRの反応性対にattBbuiを変換することによってフラグメントを使用するPCR産物のクローニング)
実施例2に記載したストラテジーと同様のストラテジーを使用して、2つのPCR産物を組換え得、そしてそれらを同時にベクター骨格へクローン化し得る。attL部位およびattR部位は、それぞれ100塩基対長および125塩基対長であり、attB部位が25塩基対長であるので、attB部位をPCRプライマーへ組込むことが望まれ得る。転移される核酸セグメントに関するattB部位の配向に依存して、attB部位は、BP反応によりattL部位またはattR部位のいずれかに転換され得る。従って、attB PCRプライマーにおけるattB部位の配向は、attB部位がattLまたはattRに転換されるか否かを決定する。このことは、GATEWAYTMシステムおよび独特の特異性を有する複数のatt部位の利用において顕著な可動性のある本発明の方法を提供する。
【0424】
図4に示されるように、各々異なる特異性(例えば、attB1およびattB3による)を有する変異したattB部位に隣接するセグメントAおよび異なる特異性の変異したattBに隣接するセグメントBからなる2つのセグメント(ここでセグメントA上に存在する1つのattB部位は、セグメントB(例えば、セグメントBは、attB3部位およびattB2部位を含み得る)上に存在するattBの1つと同一である)は、結合し、そしてベクターに挿入され得る。このセグメントは、個々にまたはBP反応におけるベクターを含む2つのattP部位と共にのいずれかで反応させ得る。あるいは、attP部位は、直線状のセグメント上に存在し得る。1つのベクターは、セグメントA(例えば、attP1部位およびattP3部位)上に存在するattB部位に適合性のattP部位を含む。attBと適合性のattP部位を含む他のベクターは、セグメントB(例えば、attP3部位およびattP2部位)上に存在する。直線状のセグメントを使用してattP部位を提供する場合、各attP部位は、セグメント上に提供され得る。attR3部位がDNA−Bセグメントの5’末端で生成され、そしてattL3部位がセグメントAの3’末端で生成されるようなattB3部位およびattP3部位の配向である。生じるエントリークローンは、引続くLR反応においてデスティネーションベクターと混合され、attB3によって分離されたDNA−AおよびDNA−Bからなる産物を生成し、デスティネーションベクター骨格にクローン化される。
【0425】
この基本スキームを使用して2つのセグメント、attR3フラグメントB−attL2エントリークローンと反応させるattL1フラグメントA−attL3エントリークローンを連結させ、そして連結したフラグメントをデスティネーションベクターへ挿入する。適切なエントリークローンを作製するために、attP1−ccdB−attP3およびattP3R−ccdB−attP2からなるドナーベクターを構築し、その結果これらをattB部位をattL部位およびattR部位へ転換するために適切なattB PCR産物と反応し得る。attP3Rの名称を使用して、セグメント上のattR部位の産生を生じる同族のattB部位を有するDNAセグメントとの反応であるようなattP3部位の配向を示す。これは、点描および線で描かれたセグメントB上のattB3の切片をセグメントAと比較して逆にした方向により図4に表わされる。セグメントB上の点描された部分は、セグメントと隣接し、一方、セグメントA上の線で描かれた部分はセグメントと隣接する。
【0426】
この方法論をDNAセグメントを構築することによって例証した。このDNAセグメントにおいて、テトラサイクリン耐性遺伝子(tet)をβガラクトシダーゼ遺伝子と組換え、その結果、2つの遺伝子を産物中のattB部位によって分離した。tet遺伝子を5’attB1末端および3’attB3末端でPCR増幅した。lacZ遺伝子を5’attB3R末端および3’attB2末端でPCR増幅した。2つのPCR産物をポリエチレングリコール(PEG)で沈殿させた。B1−tet−B3 PCR産物をattP1−ccdB−attP3ドナーベクターと混合し、attL1−tet−attL3エントリークローンを作製する標準的なプロトコルを使用してBP CLONASETMと反応させた。標準的な技術を使用して正確なtetエントリークローンを単離し、プラスミドDNAを調製した。同様の様式で、attB3R−lacZ−attB2 PCR産物をattP3R−ccdB−attP2ドナーベクターと混合し、BP CLONASETMと反応させてattR3−lacZ−attL2エントリークローンを作製した。
【0427】
単一ベクターにおける2つのセグメントを結合するために、LR CLONASETM反応を以下の成分を含む20μlの反応用量で調製した:60ng(25fmol)の高次コイルtetエントリークローン;75ng(20fmol)の高次コイルlacZエントリークローン;NcoIで直線化した150ng(35fmol)のpDEST6(その開示全体が参考として本明細書中で援用されるPCT公開 WO 00/52027に記載される);4μlの反応緩衝液および4μlのLR CLONASETM。最終反応混合物は、51mM Tris HCl、1mM EDTA、1mg/ml BSA、76mM NaCl、7.5mM スペルミジン、160ngのInt、35ngのIHFおよび35ngのXisを含有した。反応を25℃で一昼夜インキュベーションし、2μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)で停止させた。2μlのアルコートを使用して、100μlのE.coli DH5α細胞を形質転換し、アンピシリンおよびXGalを含むLBプレートにプレートする。形質転換混合物において約35,000のコロニーが、1.6×108cfu/μgのpUC DNAの効率で生成した。すべてのコロニーは、lacZ遺伝子の存在を示す青色で現れた。24のコロニーをテトラサイクリンおよびXGalを含むプレート上に画線描画した。試験したすべてのコロニー(24/24)はテトラサイクリンに耐性であった。12のコロニーを使用して少量の調製物(mini prep)についてアンピシリンを含むLBブロス2mlを接種した。12/12の少量の調製物は、正確な大きさ(7kb)の二次コイルプラスミドを含有した。
【0428】
いくつかの実施形態において、例えば、図5に示されるように、2つのセグメントを、セグメント上の1つの組換え部位を異なる組換え部位に転換するために、単一の組換え部位を含むベクターと反応させ得る。いくつかの実施形態において、attB部位を含むセグメントは、attP部位を有する標的ベクターと反応させ得る。例えば、、セグメントAおよびセグメントBを一緒または別個のいずれかで、セグメント上のattB3部位をattL3およびattR3にそれぞれ転換するためにattP3部位を有するベクターと反応させる。これは、続く2つのセグメント間のLR反応のために行われ、attB部位によって結合されるこれらを生じる。セグメントを、ベクターを含むattP部位と、組換え反応前、組換え反応と同時、組換え反応後に結合させ、attL1およびattL3に隣接するDNA−AならびにattR3およびattL2に隣接するDNA−Bからなる同時組込み分子を生成する部位に転換し得る。続くLR反応は、ベクター骨格にクローン化されたattB3によって分離されたDNA−AおよびDNA−Bからなるクローン産物を生成する。
【0429】
いくつかの実施形態において、attBを転換するために設計されたattP部位を使用して、より短いセグメント(例えば、制限フラグメント、オリゴヌクレオチドの二重鎖、またはPCRフラグメント)として提供され得るattL部位およびattR部位の反応性対にセグメントを連結させる。BP反応において直線上フラグメントに関連する反応は、一昼夜のインキュベーションのようなより長いインキュベーション時間を必要とし得る。
【0430】
attB部位のattL部位またはattR部位への転換はまた、PCR単独で達成し得る。attL部位またはattR部位を含むPCRプライマーを使用して、末端上にattB部位を含むセグメントを増幅し得る。attL部位およびattR部位の配列は、attB部位の配列の一部を含むため、この場合、attBは、オーバーラップ領域として働き、その領域にattR PCRプライマーをアニール化し得る。アニール化したattLプライマーまたはattRプライマーはattL部位またはattR部位の末端にアニールする隣接プライマーを使用してPCR産物の末端を介して、全長PCR産物のPCR増幅のための融合テンプレートを産生する。PCR反応のためのプライマーは、単鎖オリゴヌクレオチドとして提供され得る。いくつかの好ましい実施形態において、このプライマーは、二重鎖、例えば、attL部位またはattR部位のいずれかに増幅するためのPCR反応産物として提供され得る。
【0431】
(実施例4:同一ベクターの異なる場所への2以上の核酸フラグメントのクローニング)
2以上の核酸フラグメントは、各選択マーカーに隣接する組換え部位の複数のセットを有するベクターの異なる領域へ同時にクローン化され得る。いくつかの実施形態において、1以上の選択マーカーは、ネガティブ選択マーカーであり得る。
【0432】
図6に示されるように、分散したフラグメントまたは巨大核酸分子(例えば、プラスミド)として示され得る2つの核酸セグメントAおよびBは、同一のデスティネーションベクターへ同時にクローン化され得る。核酸セグメントA(DNA−A)は、お互いに組換えが起こらない組換え部位(例えば、attL1およびattL2)に隣接し、核酸セグメントB(DNA−B)は、お互いに組換えが起こらず、そしてセグメントAに隣接する部位(例えば、attL3およびattL4)で組換えが起こらない組換え部位に隣接し、LR反応におけるデスティネーションベクターと結合され得る。デスティネーションベクターは、組換え部位の2対を含み、各対は、1つのセグメントに隣接する部位と組換えるように選択される。例として、図6は、それぞれがccdBネガティブ選択マーカーに隣接するattR部位の2対(attR1/attR2およびattR3/attR4)を示す。3つの核酸を、単一のLR反応において結合させ得る。生じる産物は、attB部位の対に隣接するDNA−AおよびDNA−Bからなり、デスティネーションベクターの遠位領域にクローン化される。
【0433】
図7に示されるように、セグメントをベクターに挿入する類似の方法は、BP反応を使用して達成され得る。例えば、DNA−Aに隣接した組換え部位attB1およびattB2は、DNA−Bに隣接した組換え部位attB3およびattB4ならびにBP反応におけるattP部位を含むベクターと結合し得る。生じる産物は、ベクターの遠位領域にクローン化されたattL部位の対の間のDNA−AおよびDNA−Bからなる。いくつかの実施形態において、セグメントを連続して標的ベクターに挿入すること、および1つのセグメントのみを含む中間体分子を単離することが望まれ得る。
【0434】
すべての部位が同一の組換えシステムに由来することは、必要ではない。例えば、1つのセグメントは、lox部位に隣接し得、一方、他のセグメントはatt部位に隣接し得る。セグメントは、1つの末端上にlox部位を、そして他の末端上にatt部位または1つの末端上にfrt部位を有し得る。部位の種々の組合せは、当業者によって予見され得、このような組合せは、本発明の範囲内である。
【0435】
いくつかの実施形態において、図6および図7に示される反応における中間体を単離することが望まれ得る。例えば、挿入されたセグメントの1つのみを有するベクターを単離することが望まれ得る。この中間体は、第2のセグメントを挿入するための次の組換え反応における基質として使用され得るかまたはそのように役立ち得る。
【0436】
いくつかの実施形態において、本発明はn核酸セグメントをクローニングする方法である。ここでnは、1より大きい整数であり、nの核酸セグメントを提供する工程を包含し、各セグメントは独特の2つの組換え部位に隣接し、2nの組換え部位を含むベクターを提供する。ここで、2nの組換え部位のそれぞれは、1つの核酸セグメントに隣接する組換え部位の1つと組換え得、組換え反応を導入し得る。その結果、n核酸セグメントは、ベクターに組換えられ、それによってn核酸セグメントをクローニングする。さらなる実施形態において、このベクターは、nの選択マーカーのコピーを含み、各コピーは2つの組換え部位に隣接する。他の実施形態において、このベクターは、2以上の異なる選択マーカーを含み、そのそれぞれが、2つの組換え部位に隣接する。いくつかの実施形態において、1以上の選択マーカーは、ネガティブ選択マーカーであり得る。
【0437】
いくつかの実施形態において、本発明は、クローニング方法を提供し、この方法は、第1、第2および第3の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで第1の核酸セグメントが第1および第2の組換え部位に隣接し、第2の核酸セグメントが、第3および第4の組換え部位に隣接し、第3の核酸セグメントが、第5および第6の組換え部位に隣接し、ここで第2の組換え部位が第3の組換え微で組換え可能であり、そして第1、第4、第5または第6のいづれの組換え部位も第1から第6の組換え部位のいずれかで組換えできない工程、第1の選択マーカーに隣接する第7および第8の組換え部位および第2の選択マーカーに隣接する第9および第10の組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで第7から第10の組換え部位のいずれも第7から第10の組換え部位で組換えられない工程、第1の組換え反応を導入する工程であって、その結果、第2および第3の組換え部位が組換えられる工程、および第2の組換え反応を導入する工程であって、その結果、第1および第4の組換え部位が第7および第8の組換え部位でそれぞれ組換えられ、そして第5および第6の組換え部位が第9および第10の組換え部位で組み替えられ、それによって第1、第2および第3の核酸セグメントをクローニングする工程を包含する。
【0438】
いくつかの実施形態において、核酸セグメントは、プライマーとして機能する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第1および第2の核酸セグメントは、ポリペプチドをコードする配列を含み得、組換えあ両方のポリペプチドを同一のリーディングフレームに置く。いくつかの実施形態において、核酸セグメントは、転写終結配列として機能する配列を含み得る。
【0439】
本発明は、核酸およびタンパク質の構築物を調節するための非常に汎用性のある方法を提供する。挿入された核酸セグメントおよびベクターの両方が、産物分子に所望の特性を与えるように選択された配列を含み得る。図6および図7に例証されたこれらの実施形態において、1以上の挿入されたセグメントに隣接するベクターの部分および挿入されたセグメントを分離するベクターの部分は、1以上の選択された配列を含み得る。
【0440】
いくつかの実施形態において、選択された配列は、リボザイム、エピトープタグ、構造ドメイン、選択マーカー、内部リボザイムエントリー配列、プロモーター、エンハンサー、組換え部位などをコードし得る。いくつかの実施形態において、挿入されたセグメントを分離するベクターの部分は、核酸セグメントを挿入するために使用される組換え部位に加えて、組換え部位の反応性対に隣接する1以上の選択マーカーを含み得る。
【0441】
この方法論は、遺伝子標的ベクターの構築に特に良好に適する。例えば、組換え部位の対間のベクターのセグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子のような1以上の選択マーカーをコードし得る。セグメントAおよびセグメントBは、分裂するべき遺伝子標的の部分に同一かまたは実質的に同一であるように選択された核酸配列を含み得る。組換え反応の後、デスティネーションベクターは、ポジティブ選択マーカーに隣接する目的の遺伝子の2つの部分を含む。次に、このベクターは、従来の任意の技術(例えば、トランスフェクション)を使用して細胞に挿入され得るとすぐにベクター上に存在する目的の遺伝子の部分は、遺伝子のゲノムコピーと相同な部分と組換えられ得る。挿入されたベクターを含む細胞は、選択マーカーによって与えられる1以上の特性(例えば、選択マーカーがネオマイシン耐性遺伝子である場合において、G−418に対するそれらの耐性)に基いて選択され得る。
【0442】
いくつかの実施形態において、1以上のネガティブ選択マーカーは、標的遺伝子セグメントおよびポジティブ選択マーカーを含まないデスティネーションベクターの部分に含まれ得る。1位徐のネガティブ選択マーカーの存在は、全デスティネーションベクターが、ゲノムに挿入された細胞に対する選択またはデスティネーションベクターが、染色体外に保持される細胞に対する選択を可能にする。
【0443】
いくかの好ましい実施形態において、さらなる組換え部位は、核酸セグメントを挿入するために使用される組換え部位に隣接する場所に位置され得る。この型の分子は、遺伝子標的用途に有用であり、ここで、標的後に選択マーカーを標的遺伝子から除去することが望ましい、これはいわゆる「ヒットアンドラン(hit and run)」方法論である。当業者は、相同配列を含むセグメントが遺伝子配列に対応する必要性がないことを理解する。いくつかの例では、この配列は、遺伝子以外の染色体位置に相同であるように選択され得る。
【0444】
この方法論はまた、二重シストロン発現ベクターの構築に良好に適する。いくつかの実施形態において、二重シストロン発現エレメントを含み、ここで、2つの構造遺伝子は単一のプロモーターから発現され、内部エントリー配列によって分離される(参考として詳細に援用されるIRES、Encarnacion Current Opinion in Biotechnology 10:458〜464(1999)を参照のこと)。このようなベクターを使用して、単一の構築物〜2つのタンパク質を発現し得る。
【0445】
いくつかの実施形態において、1以上の核酸セグメントの配向を制御する必要はなく、同一の特異性の組換え部位がセグメントの両方の末端に使用され得る。図6を参照して、セグメントBに関するセグメントAの配向が重要でなかった場合、セグメントAは、両方の末端上のL1部位に隣接し得、そのベクターは2つのR1部位を備えた。このことは、セグメントAおよびセグメントBの間のコンビナトリアルライブラリーの形成においてさらなる複雑さを生成することにおいて有用であり得る。
【0446】
(実施例5:ベクターにおける単一部位への複数フラグメントの結合)
いくつかの実施形態において、本発明は、n核酸セグメント(ここで、nは、1より大きい整数)をクローニングする以下の工程を含む方法を提供する:第1核酸セグメントから第n核酸セグメント(3つの特有の組換え部位に隣接された各セグメント)を提供する工程であって、ここで、第iセグメントに隣接している2つの組換え部位のうちの1つ(ni)は、第ni−1セグメントに隣接している組換え部位の1つと反応し、そして第i番目のセグメントに隣接している他方の組換え部位は、第ni+1セグメントに隣接している組換え部位の1つと反応するように、この組換え部位が選択される工程、少なくとも2つの組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで、このベクター上の2つの組換え部位のうちの1つが第1核酸セグメント上の部位の1つと反応し、そしてこのベクター上の別の部位が第n核酸セグメント上の組換え部位と反応する工程。以下の工程を含むクローニング方法を提供することが、本発明のさらなる目的である:第1核酸セグメント、第2核酸セグメント、および第3核酸セグメントを提供する工程であって、ここで第1核酸セグメントは、第1組換え部位および第2組換え部位によって隣接され、この第2核酸セグメントは、第3組換え部位および第4組換え部位によって隣接され、そして第3核酸セグメントは、第5組換え部位および第6組換え部位によって隣接され、ここで第2組換え部位は、第3組換え部位と組換え可能であり、そして第4組換え部位は、第5組換え部位と組換え可能である工程、第7組換え部位は第1組換え部位と反応可能であり、そして第8組換え部位は第6組換え部位と反応可能であるような少なくとも第7組換え部位および第8組換え部位を有するベクターを提供する工程、ならびに、第2組換え部位と第3組換え部位が結合し、第4組換え部位と第5組換え部位が結合し、第1組換え部位と第7組換え部位が結合し、そして第6組換え部位と第8組換え部位が結合するような、少なくとも1つの組換え反応を行う工程であって、それによって第1核酸セグメント、第2核酸セグメント、および第3核酸セグメントをクローニングする工程。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの核酸セグメントは、プロモーターとして機能する配列を含む。
【0447】
いくつかの実施形態において、少なくとも2つの核酸セグメントは、ポリペプチドをコードする配列を含み、そして組換えは、同じリーディングフレーム中の両ポリペプチドに配置する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの核酸セグメントは、転写終結配列として機能する配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラグメントは、複製の起点(origin)を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラグメントは、選択マーカーをコードする配列を含む。
【0448】
この実施形態は、n=3の場合について、図8および図9に例示される。この実施形態において、本発明は、以下の工程を含むクローニング方法を提供する:第1核酸セグメント、第2核酸セグメント、および第3核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、第1核酸セグメントは、第2組換え部位および第2組換え部位によって隣接され、第2核酸セグメントは、第3組換え部位および第4組換え部位によって隣接され、そして第3核酸セグメントは、第5組換え部位および第6組換え部位によって隣接され、ここで、第2組換え部位は、第3組換え部位と組換え可能であり、そして第4組換え部位は、第5組換え部位と組換え可能である工程、第7組換え部位および第8組換え部位を含むベクターを提供する工程、そして、第2組換え部位および第3組換え部位を第7組換え部位および第8組換え部位にそれぞれ組換え、第4組換え部位および第5組換え部位を第7組換え部位および第8組換え部位にそれぞれ組換え、ならびに第1組換え部位および第6組換え部位を第7組換え部位および第8組換え部位にそれぞれ組換える工程であり、それによって第1核酸セグメント、第2核酸セグメント、第3核酸セグメントをクローニングする工程。
【0449】
上記で議論されるように、所定のセグメントの配向性が重要でない場合、本発明は、所定のセグメントの両末端上に同一の特異性を有する組換え部位を配置し、それに応じて隣接セグメントの組換え部位および/またはベクター中の組換え部位を調節することによって改変され得る。
【0450】
単一ベクター中の2つのフラグメントの組合せについて上記で議論された有用性に加えて、この型の実施形態は、種々の機能を含む個々のフラグメント由来のベクターの構築に対して有用である。従って、本発明は、ベクターの構築についての組み立て方法を提供する。
【0451】
いくつかの実施形態において、少なくとも1つの核酸セグメントは、プロモーターとして機能する配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも2つの核酸セグメントは、ポリペプチドをコードする配列を含み、組換えは、同じリーディングフレーム中の両ポリペプチドに配置する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの核酸セグメントは、転写終結配列として機能する配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラグメントは、複製起点を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラグメントは、選択マーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、フラグメントは、1つ以上の機能をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、フラグメントは、複製起点をコードする配列および選択マーカーをコードする配列を含み得る。
【0452】
複数の核酸セグメントがベクター中に本発明の方法を用いて挿入される場合、これらのセグメントの発現は、同じ調節配列または異なる調節配列によって引き起こされ得る。図20Aは、2つの挿入されたDNAセグメントを含むベクターの1つの例を示し、このベクターの発現は、異なるプロモーター(すなわち、2つの異なるT7プロモーター)によって誘導される。
【0453】
本発明の方法を用いて、また、インビボで遺伝子のサイレンシングを可能とする構築物を産生し得る。サイレンシング遺伝子の1つの方法は、二本鎖RNAの産生物(RNA干渉(interference)(RNAi)と名付けられる)を含む。(例えば、Metteら,EMBO J.,19:5194−5201(2000)を参照のこと)。本発明の方法は、分子(例えば、RNAi)を生成する多数の方法に使用され得る。従って、本発明の核酸分子の発現産物を用いて、遺伝子発現をサイレンス(silence)し得る。
【0454】
RNAiを産生するように設計された構築物の1つの例は、図20Bに示される。この構築物において、DNAセグメントは、両鎖に対応するRNAが2つの別々の転写物を産生されるように、ベクター中に挿入される。RNAiを産生するように設計された構築物の別の例は、図20Cに示される。この構築物において、DNAセグメントの2つのコピーは、両鎖に対応するRNAが再び産生されるように、ベクター中に挿入される。なお、RNAiを産生するように設計された構築物の別の例は、図20Dに示される。この構築物において、DNAセグメントの2つのコピーは、両鎖に対応するRNAが単一(single)転写物として産生されるように、ベクター中に挿入される。図20Eに示される典型的なベクター系は、2つのベクター(各々のベクターは、同じDNAセグメントのコピーを含む)を含む。これらのDNAセグメントの1つの発現は、センスRNAの産生物を生じ、一方、この他の発現は、アンチセンスRNAの産生物を生じる。従って、図20B〜図20Eに示されるベクターから産生されたRNA鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有し、そして、生理学的条件下で、各々にハイブリダイズするか、または分子内にハイブリダイズするのどちらかである。
【0455】
RNAiを産生するように設計された核酸セグメント(例えば、図20B〜図20Eに示されるベクター)は、全長遺伝子またはオープンリーディングフレームリーディングフレームに対応する必要はない。例えば、核酸セグメントがORFに対応する場合、このセグメントは、このORFの一部にのみ対応し得る(例えば、ORFの5’末端または3’末端での50ヌクレオチド)。さらに、図20B〜図20EがRNAiを産生するために設計されたベクターを示す場合、核酸セグメントはまた、他の形態において同じ機能を果たし得る(例えば、宿主細胞の染色体中に挿入される場合)。
【0456】
化合物(RNAiおよびアンチセンスRNA)の使用を含む遺伝子サイレンシング方法は、例えば、遺伝子の機能を同定するために特に有用である。より具体的には、遺伝子のサイレンシング方法を使用して、細胞または生物体において1つ以上の遺伝子の発現を減少し得るか、または阻止し得る。次いで、遺伝子機能の選択的阻害に関連する形質発現(phenotypic manifestation)を使用して、「サイレンシングされた(silenced)」遺伝子または遺伝子に対する役割を与え得る。例として、Chuangら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97:4985−4990(2000)は、RNAiのインビボでの産生が、Arabidospsis thalianaにおける遺伝子活性を変化し得ることを実証している。従って、本発明は、RNAiおよびアンチセンスRNAの発現を含む細胞および組織における核酸分子の発現を調節する方法を提供する。本発明はさらに、一方の鎖または両鎖のDNA分子に対応するRNAを産生するために使用され得る核酸分子を調製するための方法を提供する。
【0457】
同様に、本発明は、リボザイムに関連する遺伝子サイレンシングのための化合物および方法に関する。詳細には、本発明は、以下を含むアンチセンスRNA/リボザイム融合を提供する:(1)標的遺伝子に対応するアンチセンスRNA、および(2)RNAを切断する1つ以上のリボザイム(例えば、ハンマーヘッド(hammerhead)リボザイム、ヘアピン(hairpin)リボザイム、δリボザイム、Tetrahymena L−21リボザイム、など)。さらに、これらの融合物を発現するベクター、これらのベクターを産生するための方法、および、遺伝子発現を抑制するようにこれらのベクターを用いるための方法が、本発明によって提供される。
【0458】
1つの実施形態において、目的の(Destination)ベクターは、ccdB遺伝子(ここで、ccdB遺伝子は、aatR部位によって隣接される)の隣に位置するリボザイムをコードするベクターを構築される。LR反応を用いて、ccdB遺伝子を、発現の際にアンチセンスRNA分子を産生する核酸セグメント分子で置換する。従って、この発現産物は、attB部位によってコードされる介在配列によってリボザイムに融合するアンチセンス配列の産生物を生じる。下記の実施例13において議論されるように、このattB部位は、転写物から除去され得、所望の場合、または、特定の場合、このリボザイムをコードする核酸セグメントは、attB部位に組み込まれ得る。
【0459】
リボザイムに融合するアンチセンス分子の発現を用いて、例えば、細胞において特定のRNA分子を切断し得る。これは、転写物のアンチセンスRNA部分が特定のmRNA分子に対してハイブリダイズするように設計され得る。さらに、この転写物のリボザイム部分は、ハイブリダイズされているこのRNA分子を切断するよう設計され得る。例えば、このリボザイムは、二本鎖RNAを切断するリボザイムの1つであり得る(例えば、Tetrahymena L−21リボザイム)。
【0460】
(実施例6:融合タンパク質を生成するためのサプレッサーtRNAの使用) 近来開発された上記の組換えクローニング技術は、1つのベクターのバックグラウンド(background)から1つ以上の他のベクターのバックグラウンドまでの標的核酸の迅速な移動を許容する。この組換え事象は、部位特異的であり、標的核酸の配向性およびそのリーディングフレームは、このベクターに関して制御され得る。この制御は、標的核酸上に存在する配列とこのベクター上に存在する配列との間で融合物の構築を簡単なものにする。
【0461】
一般的な用語において、遺伝子は、4つの形態で発現され得る:アミノ末端およびカルボキシ末端の両方で天然のままか、いずれかの末端で改変されるか、または両末端で改変される形態。目的の標的遺伝子を含む構築物は、オープンリーディングフレーム(すなわち、ORF)のN末端メチオニンATGコドンおよびカルボキシル末端での終止(stop)コドンを含む(例えば、ATG−ORF−終止)。頻繁に、この遺伝子の構築物は、転写開始配列(tis)を含み、この配列は、ATGの上流に位置し、ATGは、この遺伝子の発現を可能とする(例えば、tis−ATG−ORF−終止)。この順序の構築物は、同じアミノ酸および天然で、クローン化されていない、タンパク質におけるようなカルボキシアミノ酸を含むタンパク質として遺伝子の発現を可能とする。このような構築物がフレーム中でアミノ末端タンパク質タグ(tag)(例えば、GST)と融合される場合、このタグは、それ自体のtisを有し(例えば、tis−ATG−タグ−tis−ATG−ORF−終止)、そしてORFのtisを含む塩基は、タグとORFとの間をアミノ酸に翻訳される。さらに、翻訳開始のいくつかのレベルは、所望のタンパク質を混入する天然のタンパク質発現の特定の量を生じるmRNAの内部(すなわち、ORFのATGであり、タグのATGではない)において推定され得る。
DNA(より低い場合(lower case)):tis1−atg−タグ−tis2−atg−orf−終止
【0462】
【化1】
タンパク質(より上の場合(upper case)):ATG−タグ−TIS2−ATG−ORF(tis1および終止は、翻訳されない)+混入しているATG−ORF(tis2でのORFの翻訳)。
【0463】
組換えクローニングを用いて、目的のORFのC末端および/またはN末端へのフレーム融合を可能とする組換え部位に隣接するタグを含むベクターの構築をすることは、当業者にとっては簡単な事である。
【0464】
種々のベクター中の多数のクローンを迅速に生成する能力を与えるために、当該分野において、この遺伝子の構築物それ自体を操作する必要なく、単一クローン化遺伝子を発現させ得る方法の数を最大にする必要がある。本発明は、この必要性を、終止コドンでの翻訳の終結を抑制する1つ以上のサプレッサーtRNAを用いて、標的遺伝子に対するC末端および/またはN末端の融合物が発現を制御するための材料および方法を提供することによって達成する。従って、本発明は、組換え部位で隣接するよう調製される遺伝子構築物を含む材料および方法を提供する。
【0465】
この構築物は、好ましくは、目的のタンパク質をコードする遺伝子のC末端で終止コドンをコードする配列を用いて調製される。いくつかの実施形態において、終止コドンは、例えば、この遺伝子に隣接する組換え部位内で、この遺伝子に隣接して位置され得る。標的遺伝子の構築物は、種々のC末端タグまたはN末端タグ(例えば、GFP、GST、His Tag、GUS、など)を目的の遺伝子に提供し得る種々のベクターの組換えを介して移行され得る。終止コドンが、この遺伝子のカルボキシ末端に位置される場合、「天然の」カルボキシ末端アミノ酸配列を有するこの遺伝子の発現は、非抑制条件(すなわち、サプレッサーtRNAが発現されない場合)下で生じ、一方、このカルボキシ融合タンパク質としてのこの遺伝子の発現は、抑制条件下で生じる。本発明は、アンバーサプレッサーsupFを用いて例示される。このsupFは、UAG終止コドンを認識するよう変異された特定のチロシンtRNA遺伝子(tyrT)である。当業者は、他のサプレッサーおよび他の終止コドンが本発明の実施においてしようされ得ることを理解する。
【0466】
本実施例において、抑制する(suppressing)tRNAをコードする遺伝子は、発現されるべき標的遺伝子由来のベクター中に組み込まれている。他の実施形態において、サプレッサーtRNAについての遺伝子は、宿主細胞のゲノム中に存在し得る。なお他の実施形態において、サプレッサーについての遺伝子は、別々のベクター上に位置され得、トランス(trans)で提供され得る。この型の実施形態において、サプレッサー遺伝子を含むベクターは、この遺伝子構築物を含むベクターと互換性があるように選択された複製起点を有し得る。このような互換性ベクターの選択および調製は、当該分野の従来技術の範囲内である。当業者は、トランスでのサプレッサーtRNAを提供するための適切なベクターが、適切な抗生物質耐性マーカーの選択を含み得る。例えば、標的遺伝子を発現するベクターが1つの抗生物質に対する抗生物質耐性マーカーを含む場合、サプレッサーtRNAを提供するために使用されるベクターは、2つ目の抗生物質に対する耐性をコードし得る。これは、両ベクターを含む宿主細胞についての選択を許容する。
【0467】
いくつかの好ましい実施形態において、サプレッサーtRNAの1つ以上のコピーが、上記の実施形態の全てにおいて提供され得る。例えば、宿主細胞がサプレッサーtRNAをコードする遺伝子の複数のコピーを含むことが提供され得る。あるいは、同じプロモーターまたは異なるプロモーター下のサプレッサーtRNAの複数の遺伝子コピーは、目的の標的遺伝子として、同じベクターバックグラウンドにおいて提供され得る。いくつかの実施形態において、サプレッサーtRNAの複数のコピーは、目的の標的遺伝子を含むような1つの使用よりも、異なるベクターにおいて提供され得る。他の実施形態において、サプレッサーtRNA遺伝子の1つ以上のコピーは、宿主細胞のゲノムにおけるかもしくは上記の組合せにおける、目的のタンパク質に関する遺伝子を含むベクターならびに/または別のベクターで提供される。サプレッサーtRNA遺伝子の1つより多いコピーが提供される場合、この遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現するために使用されるプロモーターと同じであり得るか、または異なり得る、同じプロモーターまたは異なるプロモーターから発現され得る。
【0468】
いくつかの実施形態において、2つ以上の異なるサプレッサーtRNA遺伝子は、提供され得る。この型の実施形態において、1つ以上の個々のサプレッサーは、複数のコピーにおいて提供され得、そして特定のサプレッサーtRNA遺伝子のコピー数は、別のサプレッサーtRNA遺伝子と同じであり得るか、または異なり得る。各サプレッサーtRNA遺伝子(任意の他のサプレッサーtRNA遺伝子と関係なく)は、目的の遺伝子を発現するために使用されるベクターおよび/もしくは異なるベクターで、ならびに/または宿主細胞のゲノムにおいて、提供され得る。所定のtRNA遺伝子は、いくつかの実施形態において、1つより多い場所において提供され得る。例えば、サプレッサーtRNAは、目的の遺伝子を含むベクターで提供され得、一方、1つ以上のさらなるコピーは、さらなるベクターで、および/または、宿主細胞のゲノムにおいて、提供され得る。サプレッサーtRNA遺伝子の1つ以上のコピーが提供される場合、この遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現するために使用されるプロモーターと、同じであり得るかまたは異なり得、そして異なるtRNA遺伝子を発現するために使用されるプロモーターと、同じであり得るかまたは異なり得る。
【0469】
図14を参考に、GUS遺伝子を、TAGコドンによって分離されるGST遺伝子を用いてフレームにおいてクローン化した。プラスミドはまた、サプレッサーtRNAを発現するsupF遺伝子を含んでいた。このプラスミドを、宿主細胞に導入した。この細胞では、約60%のGUS遺伝子がGSTタグを含む融合タンパク質として発現した。コントロール実験において、supF遺伝子を欠くベクターから発現された場合、同じGUS−終止コドン−GST構築物を有するプラスミドは、融合タンパク質を検出可能な量で発現しなかった。この実施例のいて、supF遺伝子は、GUS−GST融合物を含むmRNAの一部として発現された。tRNAが一般により大きなRNA分子からプロセスされるため、この順序の構築を用いて、本発明のサプレッサーtRNAを発現し得る。他の実施形態において、tRNA配列を含むRNAは、目的の遺伝子を含むmRNAから別々に発現され得る。
【0470】
本発明のいくつかの実施形態において、目的の標的遺伝子およびサプレッサーtRNAを発現する遺伝子は、同じプロモーターによって制御され得る。他の実施形態において、目的の標的遺伝子は、サプレッサーtRNAよりも異なるプロモーターから発現され得る。当業者は、特定の環境下で、調節可能なプロモーターを用いてサプレッサーtRNAおよび/または標的遺伝子の発現を制御することが所望され得ることを理解する。例えば、目的の標的遺伝子および/またはサプレッサーtRNAを発現する遺伝子のいずれかは、プロモーター(例えば、lacプロモーターまたはその誘導体(例えば、tacプロモーター))によって制御され得る。示された実施形態において、目的の標的遺伝子およびサプレッサーtRNA遺伝子の両方は、t7RNAポリメラーゼプロモーターから発現される。T7RNAポリメラーゼの導入は、目的の遺伝子(この場合、GUS)および1つのRNA分子の一部としてサプレッサーtRNAを発現するsupF遺伝子の両方の発現を刺激する。
【0471】
いくつかの好ましい実施形態において、サプレッサーtRNA遺伝子の発現は、目的の遺伝子のプロモーターとは異なるプロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現の前にサプレッサー遺伝子の発現を可能とし得る。これは、終止コドンの抑制によって融合タンパク質の発現を可能とする必要がない前に、サプレッサーのレベルを高いレベルにまで増加させることを可能とする。例えば、本発明の実施形態において、サプレッサー遺伝子がIPTGを用いて誘導可能なプロモーターによって制御される場合、標的遺伝子は、T7RNAポリメラーゼプロモーターによって制御され、T7RNAポリメラーゼの発現は、IPTG(例えば、NaCl)以外の誘導シグナルを有する誘導可能なプロモーターによって制御される。T7RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導前にIPTGを用いてサプレッサーtRNA遺伝子の発現および目的の遺伝子の引き続く発現を刺激し得る。いくつかの好ましい実施形態において、サプレッサーtRNA遺伝子の発現は、T7RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導前の約15分〜約1時間誘導され得る。好ましい実施形態において、T7RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導前のサプレッサーtRNAの発現は、約15分〜約30分間誘導され得る。示される特定の実施形態において、T7RNAポリメラーゼ遺伝子の発現は、塩で誘導可能なプロモーターの制御下にある。塩で誘導可能なプロモーターの制御下のT7RNAポリメラーゼ遺伝子の誘導可能なコピーを有する細胞株は、BL21 SI株の指定下でInvitrogen Corp.,Life Technologies Divisionから入手可能である。
【0472】
いくつかの好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子およびサプレッサーtRNAの発現は、フィードバックループの形態において整えられ得る。例えば、目的の標的遺伝子は、T7RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に位置され得、一方、サプレッサー遺伝子は、T7プロモーターおよびlacプロモーターの両方の制御下であり、そしてT7RNAポリメラーゼ遺伝子自体は、T7プロモーターおよびlacプロモーターの両方によって転写され、そしてT7RNAポリメラーゼ遺伝子は、正常なチロシン終止コドン(例えば、(883のうち)28番目のコドン)を置換するアンバー終止の変異を有する。非活性T7RNAポリメラーゼは、サプレッサーレベルが顕著な抑制をかなり十分に生じる前に生じ得る。T7RNAポリメラーゼは、サプレッサー遺伝子およびそれ自体を発現するため、このポリペプチドの発現は迅速に上昇する。他の好ましい実施形態において、サプレッサー遺伝子のみがT7RNAポリメラーゼプロモーターから発現される。この型の実施形態は、T7RNAポリメラーゼを過剰量産生することなく高いレベルのサプレッサーを生じる。他の好ましい実施形態において、T7RNAポリメラーゼ遺伝子は、1つより多いアンバー終止の変異を有する(例えば、図14Bを参照のこと)。これは、活性T7RNAポリメラーゼが産生される前に高いレベルのサプレッサーが要求される。
【0473】
本発明のいくつかの実施形態において、1つより多いサプレッサーtRNAによって抑制可能な1つより多い終止コドンを有することが所望され得る。図15を参考に、ベクターは、同じ構築物から目的のタンパク質のN末端および/またはC末端の融合物の調節可能な発現を可能とするように構築され得る。最初のタグ配列(図1のTAG1)は、図中の矢印によって示されるプロモーターから発現される。このタグ配列は、タグとして同じリーディングフレーム中の終止コドンを含む。終止コドン1は、タグ配列中のどこかに位置され得、好ましくは、タグ配列のC末端にか、またはC末端付近に位置される。この終止コドンはまた、組換え部位RS1中にかまたは内部リボソーム侵入配列(internal ribosome entry sequence)(IRES)に位置され得る。この構築物はまた、終止コドン2を含む目的の遺伝子(GENE)を含む。最初のタグおよび目的の遺伝子は、好ましくは同じリーディングフレーム中に存在するが、目的の遺伝子が本発明の範囲内であるような、同じリーディングフレーム中に最初のタグをもたらすフレームシフトを生じる配列を包含する。終止コドン2は、目的の遺伝子として同じリーディングフレーム中に存在し、そして好ましくは、この遺伝子に対するコード配列の末端でかまたはその付近で位置される。終止コドン2は、必要に応じて組換え部位RS2内に位置され得る。この構築物はまた、図15のTAG2によって示される目的の遺伝子と同じリーディングフレーム中の第2タグ配列を含み、そして第2タグ配列は、必要に応じて第2タグと同じリーディングフレーム中に終止コドン3を含み得る。転写終結は、第2タグのコード配列後に構築物中に含まれ得る(図15に示されない)。終止コドン1、終止コドン2、および終止コドン3は、同じであり得るかまたは異なり得る。いくつかの実施形態において、終止コドン1、終止コドン2、および終止コドン3は、異なる。1および2が異なる実施形態において、同じ構築物を用いて、N末端の融合物、C末端融合物、および適切なサプレッサーtRNAの発現を変化することによって天然のタンパク質を発現し得る。例えば、天然のタンパク質を発現するため、サプレッサーtRNAは、発現されず、そしてタンパク質の発現は、IRESによって制御される。N末端の融合物が所望される場合、終止コドン1を抑制するサプレッサーtRNAは、発現され、一方、終止コドン2を抑制するtRNAをC末端の融合物を産生するために発現される。いくつかの例において、終止コドン1および終止コドン2の両方を抑制するサプレッサーtRNAが発現され得る目的の二重タグ化タンパク質を発現することが所望され得る。
【0474】
本発明は、明確に理解することの目的とした図解および実施例によって、いくつか詳細に記載されており、本発明の範囲またはその特定の実施形態に影響することなく、条件、処方、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲内で、本発明を改変または変更することによって、同様に実施し得ること、ならびに、このような改変また変更が、添付した請求項の範囲内に包含されるべきであることを意図することは、当業者に明白である。
【0475】
(実施例7:エントリー(Entry)ベクターおよび目的(Destination)ベクターの機能性試験)
本発明の特定の機能性の評価の一部として、ベクターが組換える能力を機能的に試験することは重要である。この評価は、組換えのクローニング反応を実施することによって、E.coliを形質転換することによって、そしてコロニーの形成ユニットをスコアする(scoring)ことによって、実施され得る。しかし、また、代替アッセイを実施して、アガロースゲル電気泳動によって所定の侵入ベクターおよび目的のベクターの機能性の、より迅速な、より単純な評価を可能とし得る。以下は、このようなインビトロアッセイの説明である。
【0476】
(材料および方法)
プラスミドテンプレートpEZC1301およびpEZC1313(PCT公開 WO 00/52027において記載され、この全体の開示は、本明細書において参考として援用される)(各々、野生型att部位を含む)を、attL部位またはattR部位を各々含むPCR産物の生成のために用いた。プラスミドテンプレートを、AlwNIを用いて直鎖化し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、そして、1ng/μlの濃度までTEに溶解した。
【0477】
(PCRプライマー(大文字は、野生型からの塩基の変更を示す):)
【0478】
【化2】
PCRプライマーを、500pmol/μlの濃度までTEに溶解した。プライマー混合物を調製し、これは、attL1+attLrightプライマー、attL2+attLrightプライマー、attR1+attRrightプライマー、およびattR2+attRrightプライマーからなり、各混合物は、20pmol/μlの各プライマーを含む。
【0479】
(PCR反応:)
1μlのプラスミドテンプレート(1ng)
1μlのプライマー対(各々、20pmol)
3μlのH2O
45μlのPlatinum PCR SuperMix(登録商標)(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division)。
【0480】
(サイクリング条件(MJサーモサイクラーで実施した):)
95℃/2分
94℃/30秒
58℃/30秒および72℃/1.5分間の25サイクル
72℃/5分
5℃/維持。
【0481】
得られたattL PCR産物は1.5kbであり、そして得られたattR PCR産物は、1.0kbであった。
【0482】
PCR反応物を、150μlのH2Oおよび100μlの3×PEG/MgCl2溶液を添加することによりPEG/MgCl2沈澱し、次いで、遠心分離した。このPCR産物を50μlのTE中に溶解した。PCR産物の定量を、これを1μl、ゲル電気泳動で行い、50〜100ng/μlであると評価した。
【0483】
attL部位またはattR部位を含むPCR産物の、GATEWAYTMプラスミドとの組換え反応を以下の通りに行った:
8μlのH2O
2μlのattLまたはattRのPCR産物(100〜200ng)
2μlのGATEWAYTMプラスミド(100ng)
4μlの5×目的(Destination)緩衝液
4μlのGATEWAYTM LR ClonaseTM Enzyme Mix
総容量20μl(この反応を、構成成分の容量を上記で示した量の約1/4に調節することにより総容量5μlにスケールダウンし得るが、化学量論性は同じに維持する)。
【0484】
Clonase反応物を25℃で2時間インキュベートした。2μlのプロテイナーゼK(2mg/ml)を添加して、反応を停止させる。次いで、10μlを1%アガロースゲル上で泳動する。陽性コントロール反応を、attL1 PCR産物(1.0kb)とattR1 PCR産物(1.5kb)とを反応させ、そしてattL2 PCR産物とattR2産物とを同様に反応させることにより行って、より大きな(2.5kb)組換え産物の形成を観察した。陰性コントロールを、attL1 PCR産物とattR2 PCR産物とを反応させ、そしてその逆もまた同様に反応させるか、またはattL PCR産物とattLプラスミドとの反応になどより行った。
【0485】
代替アッセイにおいて、attB エントリーベクターを試験するために、単一のattP部位を含有するプラスミドを用いた。単一のatt部位を含有するプラスミドをまた、全てのエントリーベクターおよび目的(Destination)ベクター(すなわち、それらは、attL、attR、attBおよびattPを含む)を試験するために、一般に、組換え基質として使用し得た。これは、PCR反応を行う必要性を排除する。
【0486】
(結果:)
目的(Destination)およびエントリー(Entry)プラスミドは、適切なatt含有PCR産物と反応した場合、直鎖状の組換え分子を形成し、この組換え分子は、attLのPCR産物も、attRのPCR産物も含まないコントロール反応物と比較した場合に、アガロースゲル上で容易に視覚化され得た。従って、本発明に従って構築された目的(Destination)およびエントリーベクターの機能性は、図2、4、ならびに5Aおよび5Bに記載されるように、目的(Destination)またはエントリーいずれかの組換え反応を行うことによって決定されうるか、または本実施例に記載の直鎖化アッセイを行うことによりより迅速に決定されうる。
【0487】
(実施例8:Universal アダプター−プライマーを用いたPCRクローニング)
本明細書に記載されるように、GATEWAYTM PCR Cloning System(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division;Rockville,MD)を用いたPCR産物のクローニングは、PCR反応において使用される遺伝子特異的プライマーの末端にattB部位(attB1およびattB2)の付加を必要とする。有効なデータは、ユーザーが、遺伝子特異的プライマーに29bp(attB部位を含有する25bpに4つのG残基を加えて)を付加することを示唆する。アダプターに特定の重複を含むより短い遺伝子特異的プライマーを組み合わせてUniversal attBアダプター−プライマーを用い、attB含有PCR産物を生成することは、GATEWAYTM PCR Cloning Systemの高容量ユーザーに有利である。以下の実験は、6bp〜18bpの種々の長さの重複を含むUniversal attBアダプター−プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、このストラテジーの有用性を実証する。この結果により、10bp〜18bpの重複を有する遺伝子特異的プライマーが、Universal attBアダプター−プライマーとともにPCR増幅に首尾よく使用されて、全長PCR産物が生成され得ることを実証する。次いで、これらのPCR産物を、GATEWAYTM PCR Cloning Systemを用いて特定の配向において高い忠実度で首尾よくクローニン化し得る。
【0488】
(方法および結果:)
Universal attBアダプター−プライマーが、PCR反応物中に部分的attB部位を含む遺伝子特異的プライマーとともに使用されて、全長PCR産物を生成し得ることを実証するために、ヒトヘモグロビンcDNAの小さな256bp領域を標的として選択し、その結果、中間サイズの産物は、アガロースゲル電気泳動により全長産物と分離し得る。
【0489】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した:
【0490】
【化3】
これらの実験の目的は、単純かつ効率的なUniversalアダプターPCR方法を開発して、GATEWAYTM PCR Cloning Systemにおける使用に適切な、attB含有PCR産物を生成することであった。反応混合物およびサーモサイクリング条件は、UniversalアダプターPCR方法が、いずれのPCR産物クローニング適用に対しても慣用的に適用可能であり得るように単純かつ効率的であるべきである。
【0491】
18bpおよび15bp重複を含有する遺伝子特異的プライマーをUniversal attBプライマーとともに使用して、優先的に全長PCR産物を首尾よく増幅し得るPCR反応条件を最初に見出した。これらの条件は以下に概略を述べる:
10pmolesの遺伝子特異的プライマー
10pmolesのUniversal attBアダプター−プライマー
1ngのヒトヘモグロビンcDNA含有プラスミド
100ngのヒト白血球cDNAライブラリーDNA
5μlの10×PLATINUM Taq HiFi(登録商標)反応緩衝液(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division)
2μlの50mM MgSO4
1μlの10mM dNTP
0.2μlのPLATINUM Taq HiFi(登録商標)(1.0ユニット)
H2Oで総反応容量を50μlにする。
【0492】
(サイクリング条件:)
【0493】
【化4】
この方法の効率を評価するために、50μlのPCR反応物のうち2μl(1/25)を3%アガロースゲル−1000ゲルで電気泳動した。12bp以下の重複では、Universal attBアダプターを1つ含むか、またはUniversal attBアダプターを含まない、より小さな中間産物がこの反応で目立った。PCR反応条件のさらなる最適化は、遺伝子特異的プライマーおよびUniversal attBアダプター−プライマーの量を滴定することによって得た。PCR反応を、添加したプライマーの量を除いて、上記に概説するように設定した:
0、1、3または10pmolesの遺伝子特異的プライマー
0、10、30または100pmolesのアダプター−プライマー。
【0494】
(サイクリング条件:)
【0495】
【化5】
制限量の遺伝子特異的プライマー(3pmoles)および過剰なアダプター−プライマー(30pmoles)の使用により、より小さな中間産物の量が減少した。これらの反応条件を使用して、目立った全長PCR産物を得るために必要な重複は、12bpに減少した。遺伝子特異的プライマーおよびアダプタープライマーの量を、以下のPCR反応においてさらに最適化した:
0、1、2または3pmolesの遺伝子特異的プライマー
0、30、40または50pmolesのアダプター−プライマー。
【0496】
(サイクリング条件:)
【0497】
【化6】
2pmolesの遺伝子特異的プライマーおよび40pmolesのアダプター−プライマーの使用により、中間産物の量はさらに減少し、そして11bpの重複を含有する遺伝子特異的プライマーを有する全長PCR産物が目立って生じた。PCR反応の成功を、アダプターなしのコントロールを実施することにより任意のPCR増幅物において評価しうる。制限量の遺伝子特異的プライマーの使用により、1/25〜1/10のPCR反応物が標準的なアガロースゲル上で電気泳動した場合に、わずかに見えるバンドまたはほとんど見えないバンドが得られるはずである。Universal attBアダプター−プライマーの添加は、はるかに多くの全収量の産物を有する強いPCR反応産物を生じるはずである。
【0498】
18bp、15bp、12bp、11bpおよび10bp重複の遺伝子特異的プライマーを使用した反応からのPCR産物は、CONCERT(登録商標)Rapid PCR Purification Systemを使用して精製した(500bpより大きなPCR産物をPEG沈澱しうる)。精製したPCR産物を、引き続き、GATEWAYTM PCR Cloning System(Invitrogen Corp.、Life Technologies,Inc.;Rockville,MD)を用いてattP含有プラスミドベクターにクローニングし、そしてE.coliに形質転換した。コロニーを選択し、そして適切な抗生物質培地上で計数し、そして正しい挿入物および配向についてPCRによりスクリーニングした。
【0499】
ヒトβグロビン(Hgb)遺伝子の一部のプラスミドクローンのattBアダプターPCRからの未処理の(raw)PCR産物(未精製)も、GATEWAYTM PCR Cloning System反応において使用した。完全attB B1/B2−Hgb、12B1/B2、11B1/B2および10B1/B2のattB重複Hgbプライマーで生成したPCR産物を、GATEWAYTM pENTR21 attPベクター(PCT公開 WO00/52027に記載されており、この公開の全体は本明細書中で参考として援用される)に首尾よくクローニングした。各々から24コロニー(合計24×4=96)を試験し、そして各々をPCRにより正確な挿入物を含むことを確認した。cfu/mlで表したクローニング効率を以下に示す:
【0500】
【表7】
興味深いことに、重複PCR産物は、完全attB PCR産物より高効率でクローニングされた。おそらく、そしてアガロースゲル上で可視化することにより確認されるように、アダプターPCR産物は、完全attBPCR産物よりわずかに明瞭であった。コロニー生成量(output)の差異はまた、インタクトなattB部位を有するPCR産物分子の割合を反映しうる。
【0501】
attBアダプターPCR方法を使用すると、12bp attB重複を有するPCRプライマーを使用して、白血球cDNAライブラリーおよびHeLaの総RNAから調製した第1鎖cDNAから、異なるサイズのcDNAを増幅した(1〜4kbの範囲)。4つのcDNAのうち3つをこの方法により増幅し得たが、非特異的増幅産物もまた観察された(いくつかの条件下で遺伝子特異的増幅を妨害した)。この非特異的産物は、attBアダプター−プライマー単独を含有するが、いずれの遺伝子特異的重複プライマーも存在しない反応系において増幅した。この非特異的増幅産物は、PCR反応のストリンジェンシーを増大させ、そしてattBアダプターPCRプライマー濃度を低下させることにより減少した。
【0502】
これらの結果は、この実施例に記載されるアダプター−プライマーPCRアプローチがクローニングした遺伝子について十分に機能することを示す。これらの結果はまた、GATEWAYTM PCR Cloning Systemと適合するPCR産物を増幅するために単純かつ効率的な方法の開発を実証した。GATEWAYTM PCR Cloning Systemは、部分的にUniversal attBアダプター−プライマーと重複するより短い遺伝子特異的プライマーの使用を可能にする。慣用的PCRクローニング適用において、12bp重複の使用が推奨されている。そのため、この実施例に記載の方法は、17残基以上までに遺伝子特異的プライマーの長さを減少し、結果としてGATEWAYTM PCR Cloning Systemの高容量ユーザーに対するオリゴヌクレオチド費用のかなりの節減を生じる。さらに、この実施例に記載の方法およびアッセイを使用すると、当業者は、他の組換え部位に基づくまたはこれを含む類似のプライマー−アダプターまたはそのフラグメント(例えば、attL、attR、attP、lox、FRTなど)を、慣用的な実験法のみを用いて設計および使用しうる。
【0503】
PCRプライマーの端に、29塩基を加えるかわりとして、attB PCR産物が、2ステップPCR(two step PCR)のプロトコルの使用により、テンプレート特異的なプライマーに加えられたわずか12塩基のattBを含むプライマーを用いて、産生され得る。この第1工程において、12塩基のattBを含む、テンプレート特異的なプライマーを、PCRの10サイクルにおいて使用して、標的遺伝子を増幅する。このPCR反応の部分は、普遍的なattBアダプタープライマーを含む、第2のPCR反応に移行され、完全なattB PCR産物が増幅される。
【0504】
12塩基のattB1およびattB2を5’端で持つテンプレート特異的なプライマーが以下に示すように設計される:
【0505】
【表8】
このプライマーのテンプレート特異的な部分は、一般的に、50℃を超えるTmを有するように設計される。最適なアニーリング温度は、プライマーのテンプレート特異的な部分のTmにより決定される。
【0506】
【表9】
10pmoleそれぞれのテンプレート特異的プライマーおよび適量のテンプレートDNAを含む50μlPCR反応が調製される。このPCR反応混合物を含むチューブが熱循環器(thermal cycler)の中に95℃で置かれ、そして2分間インキュベートされる。
【0507】
10サイクルのPCRは以下のように実行される:
変性 94℃で、15秒間
アニーリング 50〜60℃で30秒間
伸長 68℃で、1分/kbの標的単位複製配列
10μlのPCR反応生成物は、attB1アダプタープライマーおよびattB2アダプタープライマーを各40pmole含有する、40μlのPCR反応混合物の中に移入される。この混合物を含むチューブは、従って、熱循環器内にいて95℃で置かれ、そして1分間インキュベートされる。
【0508】
5サイクルのPCRを以下のように実行される:
変性 94℃で、15秒間
アニーリング 45℃で、30秒間
伸長 68℃で、1分/kbの標的単位複製配列
15〜20サイクルのPCRを、さらに、以下のように実行する:
変性 94℃で、15秒間
アニーリング 55℃で、30秒間
伸長 68℃で、1分/kbの標的単位複製配列
増幅された生成物は、さらに、アガロースゲル電気泳動により分析する
(実施例9:バクテリオファージλ attLおよびattR部位の変異分析:部位特異的組換えにおけるatt部位特異性の決定因子)
att部位特異性の決定因子を調査するために、バクテリオファージλ attLおよびattR部位を体系的に変異誘発し、そしてどの変異がatt部位特異性における独特の変化を生み出すかということを正確に定義するためにこれらを調べた。本明細書中に示されるように、特異性の決定因子を、15bpコア領域(GCTTTTTTATACTAA(配列番号37))内の7bpの重複領域(TTTATAC、これは、インテグラーゼタンパク質の切断部位により規定され、そして鎖交換が生じる領域である)に対して以前に位置づけた。この15bpコア領域は、4つのλatt部位全て(すなわち、attB、attP、attLおよびattR)で同一である。
【0509】
従って、部位特異性に対するatt配列の効果を試験するために、変異attLおよびattR部位をPCRにより生成し、そしてインビトロ部位特異的組換えアッセイにおいて試験した。このようにして、コアatt部位の7bp重複領域内の全ての可能な単一塩基対変化を生成し、15bpコアatt部位内であるが、7bp重複の外側で5つのさらなる変化もまた生成した。各attL PCR基質を、attR PCR基質の各々とともに、インビトロ組換えアッセイにおいて試験した。
【0510】
(方法)
変異体attL部位およびattR部位の組換えの効率および特異性の両方を試験するために、単純なインビトロの部位特異的組換えアッセイを開発した。attLおよびattRのコア領域は、これらの部位の端部近くにあるので、所望のヌクレオチド塩基変化をPCRプライマー内に取り込み、そして変異体attLおよびattR部位を含む一連のPCR産物を生成することが可能であった。attLおよびattR部位を含むPCR産物を、GATEWAYTM LR ClonaseTM Enzyme Mix(Life Technologies,Inc.;Rockville,MD)とのインビトロ反応における基質として使用した。1.5kbのattL PCR産物と、1.0kbのattR PCR産物との間の組換えは、2.5kbの組換え分子を生じ、これを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色を使用して、モニターした。
【0511】
プラスミドテンプレートpEZC1301およびpEZC1313(PCT公開 WO00/52027に記載されており、この開示全体が本明細書中で参考として援用される)(各々が単一の野生型attLおよびattR部位をそれぞれ含む)を、組換え基質の生成のために使用した。以下の列挙は、LR CLONASETM反応における基質として使用したattL PCR産物を生成するためのPCR反応において使用したプライマーを示す(大文字は、野生型配列からの変化を示し、そして下線は、15bpコアatt部位内の7bpオーバーラップ領域を表す;類似のセットのPCRプライマーを使用して、マッチング変位を含むattR PCR産物を調製した):
GATEWAYTM部位(注:GATEWAYTMプラスミド内のattL2配列は「accca」で開始し、一方でこの例におけるattL部位は、「agcct」で開始し、コア領域の外側の野生型attLを反映する。):
【0512】
【化7】
注:最初の9の塩基がgggg agccaであるさらなるベクター(すなわち、15bpコア領域にすぐ先行する位置のチミンをアデニンで置換する)(これは、上で概説した単一の塩基対の置換(または欠失)を含んでも含まなくてもよく、またこれらの実験において使用され得る)。
【0513】
attL含有PCR産物およびattR含有PCR産物の組換え反応を、以下のように実施した:
8μlのH2O
2μlのattL PCR産物
2μlのattR PCR産物
4μlの5×緩衝液
4μlのGATEWAYTM LRCLONASETM Enzyme Mix
総容量 20μl
CLONASETM反応物を、25℃で2時間インキュベートした。
【0514】
2μlの10×Clonase停止溶液(プロテイナーゼK、2mg/ml)を添加して、この反応を停止した。
【0515】
10μlの反応混合物を1%アガロースゲル上で泳動した。
【0516】
(結果)
各attL PCR基質を、attR PCR基質の各々を用いて、インビトロ組換えアッセイで試験した。7bpオーバーラップの最初の3つの位置(TTTATAC)での変化は、組換えの特異性を強力に変化させた。これらの変異att部位の各々は、野生型と同程度に、その同種パートナー変異体のみで組換えられた;これらは他のいかなるatt部位変異によっても検出可能には組換えられなかった。対照的に、最後の4つの位置(TTTATAC)の変化は、部分的にのみ特異性を変化させた;これらの変異体は、その同種の変異att部位ならびに野生型att部位で組換えられ、そして7bpオーバーラップの最初の3つの位置に変異を有する部位以外の他の全ての変異att部位で部分的に組換えられた。7bpオーバーラップの外側での変化は、組換えの特異性に影響を与えず、いくらかは組換えの効率に影響を与えることが見出された。
【0517】
これらの結果に基づいて、att部位特異性に関する以下の規則が決定された:
・7bpオーバーラップにおける変化のみが、特異性に影響を与える。
・最初の3つの位置における変化が、特異性に強力に影響を与える。
・最後の4つの位置における変化が、特異性に弱く影響を与える。
【0518】
組換え反応の全体の効率に影響を与えた変異もまた、本方法によって評価された。これらの実験において、attLT1A基質およびattLC7T基質でわずかに増加した(2倍未満)組換え効率が、これらの基質がその同種attRパートナーと反応した場合に、観察された。attLA6G、attL14およびattL15を含む、組換え効率(約2〜3倍)を減少させる変異もまた観察された。これらの変異は、恐らく、コアatt部位で結合するIntタンパク質に影響を与える変化を反映する。
【0519】
これらの実験の結果は、7bpの最初の3つの位置(TTTATAC)における変化が、組換えの特異性を強力に変化させた(すなわち、1つ以上の変異を最初の3つのチミジンに有するatt配列は、その同種パートナーとのみ組換わり、そして他のいかなるatt部位変異とも交差反応しない)ことを実証する。対照的に、最後の4つの位置(TTTATAC)における変異は、部分的にのみ特異性を変化させた(すなわち、1つ以上の変異を最後の4つの塩基位置に有するatt配列は、7bpオーバーラップの最初の3つの位置の1つ以上に変異を有する部位以外の、野生型att部位および全ての他の変異att部位と部分的に交差反応する)。7bpオーバーラップの外側の変異は、組換えの特異性に影響を与えないことがわかり、いくらかは組換えの効率に影響を与える(すなわち、組換えの効率の減少を引き起こす)ことがわかった。
【0520】
(実施例10: GATEWAYTM クローニング反応のクローニング効率を増加させるatt部位変異の発見)
att部位特異性の決定因子を理解するために設計される実験において、attLのコア領域における点変異を作製した。次いで、これらの変異attL配列を含む核酸分子を、LR反応において、同種attR部位(すなわち、attL部位の変異に対応する変異を含むattR部位)を含む核酸分子と反応させ、そして組換え効率を上記のように決定した。att部位のコア領域に位置するいくつかの変異を、組換え反応の効率をわずかに増加した(2倍未満)かまたは減少した(2倍〜4倍の間)のいずれかであると示された(表5)。
【0521】
【表10】
これらの変異は、恐らく、インテグラーゼタンパク質のコアatt部位を結合するための相対的親和性を、それぞれ増加または減少させるいずれかの変化を反映することもまた、注目された。インテグラーゼコア結合部位のコンセンサス配列(CAACTTNNT)は、文献で推定されているが、直接的には試験されていない(例えば、RossおよびLandy、Cell 33:261−272(1983)を参照のこと)。このコンセンサスコアインテグラーゼ結合配列は、attPおよびattBに見出される4つのコアatt部位の各々の配列、ならびにコア配列に類似し、そしてインビトロでインテグラーゼが結合することが示された5つの非att部位の配列を比較することによって、確立された。これらの実験は、インテグラーゼのコアatt部位への結合を増加させる、従ってGATEWAYTMクローニング反応の効率を増加させる、多くのatt部位変異が同定され得ることを示唆する。
【0522】
(実施例11: 組換え効率に対するコア領域変異の効果)
att部位コア領域における変異のクローニング効率を直接比較するために、単一の塩基の変化を、attB1−tet−attB2 PCR産物のattB2部位に作製した。次いで、これらの変異attB2配列を含む核酸分子を、BP反応において、非同種attP部位(すなわち、野生型attP2)を含む核酸分子と反応させ、そして組換え効率を上記のように決定した。標準的なattB1−tet−attB2 PCR産物と比較した、これらの変異attB2含有PCR産物のクローニング効率を、表6に示す。
【0523】
【表11】
上記で注目したように、attB2.2部位における単一の塩基の変化は、attB1−tet−attB2 PCR産物と比較して、attB1−tet−attB2.2 PCR産物のクローニング効率を131%に増加させた。興味深いことに、この変異は、attB2のインテグラーゼコア結合部位を、提案されるコンセンサス配列にさらに近くマッチする配列に変化させる。
【0524】
さらなる実験を実施して、attB1−tet−attB2 PCR産物のクローニング効率を、インテグラーゼコア結合部位の提案されるコンセンサス配列を含むattB部位を含むPCR産物と、直接比較した。以下のattB部位を使用して、attB−tet PCR産物を増幅した:
【0525】
【化8】
BP反応を、300ng(100fmole)のpDONR201(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、Cat.No.11798−014)と、20μl容量の80ng(80fmole)のattB−TET PCR産物との間で、25℃で1.5時間のインキュベーションによって実施し、pENTR201−TET エントリークローンを作製した。上記attB部位の、BP反応におけるクローニング効率の比較を、表7に示す。
【0526】
【表12】
これらの結果は、インテグラーゼコア結合部位に関して提案されたコンセンサス配列と完全にマッチする配列を含むattB PCR産物が、標準的なGATEWAYTM attB1およびattB2 PCR産物より4倍高い効率で、エントリークローンを産生し得ることを実証する。
【0527】
次いで、上記で産生されたエントリークローンを、LR反応(20μl容量のそれぞれのpENTR201−tet エントリークローンの50ng(77fmole)と混合した300ng(64fmole)pDEST20;25℃で1時間インキュベートした)を介してpDEST20(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、Cat.No.11807−013)へと変換した。これらの反応に関するクローニングの効率を、表8で比較する。
【0528】
【表13】
これらの結果は、attB1.6およびattB2.10中に導入された変異であって、この遺伝子をエントリークローン(entry clone)に移入させる変異が、LR反応の効率をわずかに上昇させることを実証する。従って、本発明は、組換え効率を上昇させるattB部位での変異のみならず、BP反応によって作製されるattL部位を生じる対応する変異をもまた包含する。
【0529】
一定範囲のPCR産物量にわたるattB1.6−tet−attB2.10 PCR産物のクローニング効率の上昇を試験するために、上記の実験と類似の実験を実施した。この実験では、attB PCR産物の量を反応混合物中に滴定した。この結果を表9に示す。
【0530】
【表14】
これらの結果は、20ngの量において、標準のattB1−tet−attB2 PCR産物と比較してattB1.6−tet−attB2.10 PCR産物で、6倍程度高いクローニング効率における上昇が達成されることを実証する。
【0531】
(実施例12:最適組換え効率のためのattB配列必要要件の決定)
attBについての配列必要要件を試験するため、そしてどのattB部位が縮重attB部位の集団の中から最高に効率良くクローン化するかを決定するために、一連の実験を実施した。attB部位の中のB−アームにおいて5塩基の縮重性を含んだ縮重PCRプライマーを設計した。従って、これらの縮重配列は、BP反応において遺伝子をエントリークローンに移入し、引き続いてLR反応においてこの遺伝子を発現クローンに移入する。従って、縮重attBおよびattL部位の集団は、かなり多数のサイクルでattBからattLに行きつ戻りつしつつ循環され得る。各移入工程で反応条件を変更することにより(例えば、反応時間を減少させることにより、および/またはDNA濃度を減少させることにより)、反応は、各サイクルでますますよりストリンジェントになされ得、従って、より効率的に反応するattBおよびattL部位の集団に富化され得る。
【0532】
以下の縮重PCRプライマーを使用して、pUC18からlacZαフラグメントを含んだ500bpのフラグメントを増幅した(各プライマーのattB部分のみを示す):
【0533】
【化9】
<u> </u>縮重att部位の開始集団のサイズは、45すなわち1024分子である。2つのBP反応および2つのLR反応を通して、4つの異なる集団を移入した。各反応の形質転換後、適切な選択抗生物質を含有する液体培地において増殖することによって、形質転換体の集団を増幅した。このクローンの集団から、アルカリ溶解ミニプレップ法によってDNAを調製し、そして次の反応に用いた。BPおよびLRクローニング反応の結果を以下に示す。
【0534】
【表15】
これらの結果は、各々の連続した移入で、att部位の集団全体のクローニング効率が上昇し、そしてattB部位の規定において相当量の可撓性が存在することを実証する。特定のクローンを、上記反応から単離し得、組換え効率について個々に試験し得、そして配列決定し得る。次いで、このような新たな特異性を、既知の例と比較して、新たな組換え特異性を有する新たな配列の設計を導き得る。さらに、本明細書中に記載される富化およびスクリーニングのプロトコールに基づいて、当業者は、このような配列を含む核酸分子を使用する組換え反応において特異性の上昇を生じさせる他の組換え部位(例えば、他のatt部位、lox、FRTなど)における配列を容易に同定し得、そしてそれを使用し得る。
【0535】
(実施例13:組換え部位における機能成分の組込み)
本発明で使用される組換え部位はまた、組込まれた機能または性質を有し得る。組込まれた機能性は、組換え部位のヌクレオチド配列により与えられた機能または性質(これは、組換え効率または特異性に直接的には、結びついていない)である。例えば、組換え部位がタンパク質をコードする配列(例えば、インテイン(intein)をコードする配列)、イントロン/エキソンスプライス部位、複製開始点、および/または終止コドンを含み得る。一般に、組換え部位を構成する核酸の伸長が長いほど、その部位は、組込まれる機能または性質の取り込みに対して修正されやすい。逆に、より長い組換え部位は、所望の機能または性質を妨害する特徴(例えば、終止コドン)をより有しやすい。さらに、1つ超える(例えば、2、3、4、5など)組込まれた機能または性質を有する組換え部位もまた、調製され得る。
【0536】
以下で説明されるように、ある局面において、本発明は、RNA分子由来の組換え部位によりコードされたヌクレオチド配列の除去についての方法を提供する。このような方法の一つの例は、イントロン/エキソンスプライス部位の使用を採用して、RNA転写物由来の組換え部位にコードされているRNAを取り除く。さらに、以下で説明するように、これらのイントロン/エキソンスプライス部位をコードするヌクレオチド配列は、RNA分子から切出された配列をコードする組換え部位に、完全にまたは部分的に組込まれ得るか、またはこれらのイントロ/エキソンスプライス部位は、隣接核酸配列にコードされ得る。同様に、あるイントロン/エキソンスプラス部位は、組換え部位にコードされ得、そして別のイントロン/エキソンスプライス部位は他のヌクレオチド配列にコードされ得る(例えば、ベクターまたは目的の核酸の核酸配列)。核酸のスプライシングは以下の刊行物で議論されている:R.Reed、Curr.Opin.Genet.Devel.6:215−220(1996);S Mount、Nucl.Acids.Res. 10;459−472、(1982);P.Sharp、Cell 77:805−815(1994);K.NelsonおよびM.Green、Genes and Devel.23:319−329(1988);およびT.CooperおよびW.Mattox、Am.J.Hum.Genet.61:259−266(1997)。
【0537】
いくつかの例では、RNA転写物から組換え部位に対応するRNAまたは組換え部位にコードされているアミノ酸残基のいずれかを取り除くことは有利である。このような配列の除去は、いくつかの方法で実施され、そしてRNAレベルまたタンパク質レベルのいずれかにおいて、起こり得る。組換え部位から転写されたRNAを除去することが、一般的に有利である一つの例は、ORFが、ベクターに、ORFにコードされたアミノ酸残基とベクターによりコードされたアミノ酸残基の間に、融合タンパク質(例えばGFP)の発現を招くことを意図された方向で挿入された核酸分子の場合である。このような例では、ORFとベクターがコードする配列との間に介在する組換え部位の存在は、結果として以下の組換え部位を生じる:(1)mRNAに、さらなるアミノ酸残基をその発現生成物に包含することを生じるコドンを与える組換え部位、(2)mRNAに、所望の融合タンパク質の産生を妨げる終止コドンを与える組換え配列、および/または(3)mRNAの読み枠をシフトして、その結果2つのタンパク質を「フレーム内」で融合しない組換え部位。
【0538】
mRNA分子から組換え部位を取り除く一つの方法は、イントロン/エキソンスプライス部位(すなわち、スプライス供与部位およびスプライス受容部位)の使用を包含する。スプライス部位は、多くの配置において適切にその位置を取り得る。例として、N末端のGFP融合を伴って挿入されたORFを発現するように設計されたDestination Vectorを使用して、第1のスプライス部位がGFPをコードしている配列に対して3’に位置するベクター配列によりコードされ得、そして第2のスプライス部位が、GFPコード配列をORFのコード配列から分離する組換え部位に部分的に組込まれ得る。さらに、第2のスプライス部位は、組換え部位の3’末端に隣接し得るか、または、組換え部位に対して、3’側の近距離(例えば、2、4、8、10、20ヌクレオチド)に位置付けられ得るかのいずれかである。さらに、組換え部位の長さに依存して、第2のスプライス部位は、全体が組換え部位に組込まれ得る。
【0539】
上に記載した方法の改変は、複数の核酸セグメント(これは、発現の際、融合タンパク質の産生を招く)の結合を含む。ある特定の実施例において、ある核酸セグメントは、GFPおよび目的のORFを含む他の核酸セグメントをコードしてる。これらのセグメントのそれぞれが、組換え配列に隣接している。さらに、GFPをコードしている核酸セグメントは、その3’末端近傍にイントロン/エキソンスプライス部位を含み、そして目的のORFを含む核酸セグメントもまた、その5’末端近傍にイントロン/エキソンスプライス部位を含む。組換えの際に、GFPをコードする核酸セグメントは、目的のORFをコードする核酸セグメントの5’側に位置している。さらに、これら2つの核酸セグメントは、イントロン/エキソンスプライス部位に隣接した組換え部位により分離される。従って、介在する組換え部位の切出しは、融合mRNAの転写後に起こる。従って、ある局面においては、発明は、組換え部位から転写されたRNAを、本明細書に記載の核酸より生じた転写物から、除去する方法に関する。
【0540】
イントロン/エキソンスプライス部位を、核酸セグメントへ導入するために用いられ得る一つの方法は、PCRの使用によるものである。例えば、プライマーが用いられ得、目的のORFに対応して、そして組換え部位およびイントロン/エキソンスプライス部位の両方を含む核酸セグメントを生成し得る。
【0541】
上記の方法はまた、他の核酸セグメントと組換られた核酸セグメントが、翻訳可能な形式で生成されないRNAをコードしている場合に、組換え部位に対応するRNAを除去するために用いられ得る。このような事例の一つの例は、核酸セグメントが、アンチセンスRNAの産生を招くような様式でベクターに挿入される場合である。以下で議論するように、このアンチセンスRNAは、例えば、リボザイムをコードするRNAと、融合され得る。従って、本発明はまた、そのような分子から、組換え部位に対応するRNAを除去する方法を提供する。
【0542】
本発明はさらに、タンパク質スプライシングによるタンパク質発現産物から、組換え部位によりコードされるアミノ酸配列を除去する方法を提供する。タンパク質スプライシング部位をコードする核酸配列は、全体、または部分的に、タンパク質から切出されるアミノ酸配列をコードする組換え部位に組込まれ得るか、または、タンパク質スプライス部位は隣接する核酸配列にコードされ得る。同様に、一つのタンパク質スプラス部位は、組換え部位にコードされ得、そして別のタンパク質スプライス部位は、他のヌクレオチド配列にコードされ得る(例えば、ベクターの核酸配列または目的の核酸配列)。
【0543】
タンパク質スプライシングが、タンパク質分子からインテインの切出しおよび隣接するセグメントの連結により、起こり得ることがこれまで示されてきた。(Derbyshireら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:1356−1357(1998)を参照のこと)。簡潔に言うと、インテインは、自己触媒スプライシング過程により、タンパク質から翻訳後に切出されるアミノ酸セグメントである。多数のインテインのコンセンサス配列がこれまで同定されている(例えば、Peterら、Nucleic Acids Res.27:346−347(1999)を参照のこと)。
【0544】
イントロン/エキソンスプライシングと同様に、N末端およびC末端のインテインモチーフは、タンパク質スプライシングに関与することがこれまで示されてきた。従って、本発明はさらに、タンパク質スプライシングによって、タンパク質発現産物から、組換え部位にコードされるアミノ酸残基を除去するための組成物および方法を提供する。特に、本発明のこの局面は、インテインスプライス部位を、2つのコード領域の間に位置する組換え部位の5’端および3’端の両方にコードする、核酸配列のポジショニングに関連する。したがって、タンパク質発現産物は、適切な条件下でインキュベートされる場合、これらの組換え部位によりコードされているアミノ酸残基は、切出される。
【0545】
タンパク質スプライシングは、組換え部位によりコードされたアミノ酸配列の全てまたは部分を除去するために用いられ得る。インテインをコードする核酸配列は、全体または部分的に、組換え部位に組込まれ得るか、またはそのような部位に隣接し得る。ある状況において、組換え部位によりコードされているアミノ酸配列のN末端および/またはC末端を越えて、多くのアミノ酸残基を除去することが所望され得る。このような例において、インテインをコードする配列は、組換え部位に対して、5’側および/または3’側から、ある距離(例えば、30、50、75、100など)に位置付けられ得る。
【0546】
インテイン切出しにとって適切な条件は、その特有なインテインを伴って変化する一方、Chongら(Gene 192:271−281(1997))
は、改変したSaccharomyces cerevisiaeのインテイン(これはSce VMAインテインと呼ばれる)が、多くの薬剤(1、4−ジチオトレイトール(DDT)、β−メルカプトエタノールおよびシステインを含む)により、自己開裂(self−cleavage)を受けるように誘導され得ることを実証した。例えば、インテインの切出し/スプライシングは、30mMDTTの存在下で、4℃にて16時間のインキュベーションにより誘導され得る。
【0547】
(実施例14:真核細胞におけるPre−mRNAスプライシングによるRNA転写物からのatt部位の除去)
後生動物細胞におけるコンセンサスRNA配列は、pre−mRNA転写物のスプライシングにより、イントロンの除去をする必要があり、次のような3つの要素を含む。
【0548】
1).イントロンの5’端;エキソン−AG|GTRAGT−イントロン;ここで「|」は、イントロンとエキソンの境界を意味し、そして、R=プリンヌクレオチドである。この要素は、本明細書中では(GT)として表す。
【0549】
2).イントロンの3’端:イントロン−Yn−N−CAG|G−エキソン;ここでYn=10〜12ヌクレオチドのピリミジンリッチ配列である。この要素は、本明細書中では、(Yn−AG)として表す。
【0550】
3)イントロン内の分岐点において、(Yn−AG)にたいして5’側の約20〜40塩基:YNRA*Y;ここでYはピリミジンヌクレオチドであり、そしてA*は分岐点のアデノシンであり、これはRNAラリアットを形成するエステル交換反応に関わる。この要素は、本明細書中では、(BP−A*)として表す。
【0551】
上記で示した下線を引いた配列は、保存性が高い配列であり、そして一般には、スプライシング活性について必要とされていると考えられている;コンセンサス配列の中の他のヌクレオチドは、より保存性は高くない。
【0552】
(1.attBスプライシング)
これらのスプライシング要素は、 GATEWAYTM att部位含有ベクターを用いて、少なくとも以下の3つの方法で結合され得、attB1部位をRNAスプライシングで除去し得る。
【0553】
(方法1:(GT)−−−(BP−A*)[attB1](Yn−AG)−−ORF)
この方法において、(BP−A*)要素は、attB1の端のすぐ5’に位置し、(Yn−AG)コンセンサスは、attB1配列の3’端と合わせられ、そしてattB配列のコアに隣接する5’のヌクレオチドの可撓性を活用する。(GT)コンセンサスは、都合良く、(BP−A*)から10ヌクレオチド以上上流に位置し得る。
【0554】
この配置は、これが、attB部位の3’端とORFをコードする配列の間に最小配列の付加を要求するという利点がある。このアプローチの使用に伴う可能性のある困難は、(Yn−AG)中のピリミジンリッチ配列は、attB1配列(比較的プリンリッチである)とオーバーラップすることである。従って、ある例においては、効率的なスプライシングを可能にするためのattB1部位において十分な変化(CまたはTへ)は、効率的なBxP組換えと両立し得ない。
【0555】
attB1の中の組換え開裂部位に対して5’端に位置する配列は、Destination Vectorにより導かれ、その一方で、この部位の3’側の配列は(ほとんど場合において)、attB−PCR産物により誘導される。スプライシング反応が、N末端のタンパク質をコードするRNA(Destination Vectorにより導かれる)を、他のORFをコードするRNA(Entry Cloneにより導かれる)に融合することを意図していた場合、(GT)および(Yn−AG)のポジショニングは、一般に、スプライスされた産物が所望の翻訳読み枠を保持するように位置付けられる。
【0556】
(方法2:(GT)−−−(BP−A*)[attB1](Yn−AG)−−ORF)
この方法では、(Yn−AG)コンセンサスが、attB1部位のすぐ隣にある;その結果として、(BP−A*)中の分岐点A*は、一般にattB1に近接していることを必要とする。従って、(Yn−AG)中のAGからの距離は、一般に約40ヌクレオチド未満である。
【0557】
(Yn−AG)配列は、プライマーアダプターの部分として加え得、そしてEntry Cloneは、attB−PCRを用いて構築され得る。さらに、このプライマーは、効率的なスプライシングに有利に働くコンセンサス(Yn−AG)配列を用いて設計され得る。いくつかの例において、(BP−A*)と(Yn−AG)間のattB1配列の存在は、スプライシングを干渉し得る。このような場合において、attB1配列は、より最適なスプライシング配列を提供するために変異させ得る。
【0558】
(方法3:(GT)−−−[attB1]−(BP−A*)−−−(Yn−AG)−−ORF)
この方法は、最適なスプライシング配列および(BP−A*)−−−(Yn−AG)を含む一体化された要素のための間隔を選択することを可能にする配置を採用する。この組合せの最小サイズは、約20ヌクレオチドであると期待される。それゆえ、この配列は、45〜50ヌクレオチドのattB1プライマーアダプターとして、通常はPCR産物に加えられる。
【0559】
同様の考えが、スプライシングを可能にしてattB2部位をmRNAから除去する配列の設計に適用される。しかし、この場合、(BP−A*)および(Yn−AG)がDestination Vectorにより導かれるので、最も魅力的な選択肢は以下のとおりである:
ORF−(GT)[attB2]−−(BP−A*)−−(Yn−AG)、ここで(GT)とattB2の間の配列は、最小化され、attB2−PCRアダプタープライマーのサイズを減少させる。特定の使用に適切な最小化された配列は、実験的に本明細書に記載の方法を用いて、決定され得る。
【0560】
attB部位をスプライスするベクターを生成する別の方法は、attB1部位およびattB2部位に隣接するスプライシングシグナルを含むベクターを直接的に構築することである。上に記載したアプローチとの主要な違いは、attBプライマーアダプター(BおよびCの中)を使用して、ここで加えられた任意の配列が、attB部位の間に位置する多数のクローニング部位の近くの、ベクター自体の中に事前に組込まれる。
【0561】
(2.attLスプライシング)
attL1およびattL2部位をコードしている配列を、RNAスプライシングによって転写物から取り除き得る。しかしながら、100ヌクレオチド長のattLは、配列要素のスプライシングを整列させるための選択において制限をおく。この距離は一般的にattL1(BP−A)と(Yn−AG)との間のattL1の配置に対して大きすぎる。1つの使用し得る代替手段は、これらの要素のいずれかまたは両方をaatL1の変異されたバージョンの中にはめ込み得ることである。別の方法はこれらの要素を(例えば、(BP―A*))および(Yn−AG)をattB−アダプタープライマーおよび(GT)によって与えられ得ること、および(GT)がattPがドナープラスミドによって提供され得ることである。B×P反応中のこれらの要素の組換えによって、attB1をスプライシングするためのスプライシング部位を有する完全なクローンが、生成される。
【0562】
同様に、aatL2のスプライシングについて、(GT)および(BP―A*)の間に与えられる配列の長さに対して実質的な制限はない。そして、aatB2において(GT)を提供し得、一方(BP―A*)および(Yn−AG)はaatPドナーベクターによって与えられる。このような使用について、一般的に、attPドナーベクターは真核生物のプロモーターを含む必要があり、そして一般的に、rrnB転写終結配列を取り除く必要がある。(GT)および(BP−A*)の間のaatL2配列の逆効果についての可能性は低いようにみえるが、しかし個別の基準にもちづいて決定する必要があり得る。
【0563】
Entry Clone転写物からのaatL配列のスプライシングの潜在的な利点は、使用者が、デスティネーションベクターへのさらなるサブクローニングに対する必要もなく、PCR産物を直接的にEntry Cloneとしてクローン化および発現し得ることである。さらに、本発明者らのaatL1配列中の終結コドンの存在(これは、L×R組換えを減少させることなく取り除くことが困難であるようにみえる)は、N末端ペプチドと融合されたORFの翻訳に帰結することはない。
【0564】
上記には、GATEWAYTMシステムを用いるRNAスプライシングのいくつかの適用(それは、融合タンパク質の、ORFとN末端配列との間のaatB1を取り除くこと、およびORF配列とN末端配列との間のaatB2を取り除くことである)を記載している。他の適用が当該分野で明らかである。さらに、1つのこのような適用は、真核生物の発現ベクター中の複数のタンパク質ドメインをコードしている配列(種々のドメインをコードしているORFがatt部位配列によって切り離されるところ)の間に置かれた(GATEWAYTM組換えに基づくサブクローニング反応を行うことの結果として)att配列を取り除くための、RNAスプライシングプロセスの使用である。このようなベクターは、複数特異性のatt部位(att1、att2、att3、att4など)を用いて、GATEWAYTM組換えによって容易に構築され得る。この方法はタンパク質融合迅速な構築、およびタンパク質ドメインをコードしているDNA配列のシャフリングを可能にするが、組換え産物は概して、これらのドメインの間に存在している25bpのattB部位(または100bpのatt部位)(しばしば、この除去が所望される)を含んでいる。複数のタンパク質ドメイン間のatt部位を除去するためのスプライシングの使用はまた、GATEWAYTM組換え反応を使用するattBおよびattP部位の間のこれらの構築物を作成することを実用的にし、attLおよびattR部位を生成する。これは、att配列のどちらの型(attBまたはattL)も、適切に設計されたベクター中のRNAスプライシング反応によって除去し得る。他の状況において、attRおよび/またはattP部位によって除去するためにもまた、役立つ。
【0565】
第2の適用は、大量のまたは少量のmRNAのコピーを得ることの、共通の問題を解決する。いくつかのmRNAは、それらの大きなサイズおよび/または少量のために、それらの全体において逆転写(cDNAへ)することが困難である。しばしば、cDNAの末端の1方または両方が得られるが、完全な配列を1つの分子として得られない。完全なmRNAの配列を共に構成するcDNAの2つ以上の異なる部分が入手可能な場合、これらのcDNAの配列を決定し得、そしてPCRプライマーを合成する。次いで、attBプライマーの使用して、完全な転写産物の各々の重複していない部分はPCRによって増幅し得る。次いで、これらの増幅された配列を、GATEWAYTM組換えを使用する正しい順序で、組み換え得る。このような組換え産物は、正しい順番で様々な配列を含んでいるが、att部位によって切り離されない。適切な転写プロモーターおよび終結シグナルを生じるとき、このような構築物を、インビトロのスプライシング反応中における使用のためのインビトロのRNAを調製するため、または後生動物細胞を、転写を可能にする適切な構築物を用いてトランスフェクトした後に、細胞内でのmRNAをスプライシングするために、使用し得る。従って、この方法で、確実なmRNAの転写物を生産し得る。このようなmRNA転写物を、スプライシングされた転写物によってコードされるタンパク質の生物学的機能の研究のために、直接的に使用し得る。あるいは、転写物をこの方法で多量に生産し得るので、スプライシングされたRNAのcDNAコピーを生産することがさらに実行可能になる。このdDNA(それは間に存在しているaat配列を有さない)は、適切なスプライシング機構を欠いている細胞(例えば、E.coli)内でコードされたタンパク質を生産するために有用である。
【0566】
この技術の第3の適用は、適切な組織源が少量であるまたは欠如していることに帰因して、入手することが困難であるmRNAのレプリカを生産することを可能にする。タンパク質をコードしている後生動物のほとんどの遺伝子は、イントロン配列から切り離されたエキソン配列からなる。遺伝子のエキソン―イントロン境界は、バイオインフォマティックスアルゴリズムによってゲノムDNA配列から正しく予想し得るときはいつも、att部位配列によって隣接されるPCR産物は、エキソン配列を含むを合成し得る。これらの産物に隣接しているatt配列の適した設計を使用して、GATEWAYTMを使用することによって、正しい転写のリーディングフレームを示しながら、それらを互いに適した順序で結合し得る。適した転写シグナルを含むことによって、これらの構造は順序づけられたエキソン配列(att配列によってそれぞれ切り離された)を含むRNA転写物を合成するためのテンプレートとして役立ち得る。適したスプライシングシグナルがこれらの構築物に含まれている場合、生産された転写物を、後生動物細胞のスプライシング反応によってプロセスし、自然に誘導されたmRNA配列に対応する核酸を生成させる。この方法では、最初にmRNAを細胞から単離する必要性を排除し得る。さらに、上記に記載されたように作製された転写物のスプライシングからこのようなmRNAを生産する細胞が生物学的機能の研究のために、またはcDNAを生産する所望されるmRNAの源として直接的に使用され得る。あるいは、これらの構築物を、正確に構成されたスプライシング抽出物を使用して、インビトロでスプライシングし得た。
【0567】
(実施例15:細胞の遺伝子発現プロフィールの決定)
本発明はさらに、複数のcDNA配列をクローニングし、そしてシークエンスするための組成物および方法を提供し得る。一般的には、これらの方法は、cDNAのコンカテマーを生じる工程、および個々のインサートのヌクレオチド配列を決定するために、これらの分子における配列決定反応を行う工程を含む。このような方法は特に、遺伝子発現プロフィール(特に細胞および/または組織の)を決定するために有用である。このような方法、および記載された方法によって生産されるベクターの1つの例は、図23に示す。
【0568】
図23中に示したベクターは、attB部位によって互いに結合されている
一連の比較的短い(例えば、10,15,20,25,30,45、または50ヌクレオチド長)cDNAインサートを含む。図23中に示したベクターはまた、cDNAのインサート部位の各側に隣接している配列決定プライマー部位を含む。
【0569】
細胞中または組織中における遺伝子発現を示す核酸分子は、多数の方法(機械的な剪断、1つまたは組み合わせた制限酵素(例えば、NlaIII、Sau3Aなど)を用いた消化、配列特異性をほとんどまたは全く有さないエンドヌクレアーゼ(例えば、ミクロコッカルエンドヌクレアーゼ、DNAseIなど)を用いた消化を含む)で比較的小さいフラグメントに破壊される。一般的に、条件は特定の平均的な大きさの核酸ラグメントが生産される調整される。さらに、所望されるなら、ベクターに挿入する前に、特定の大きさの核酸フラグメントが単離され得る。大きさに基づく核酸分子を分離する方法は、当該分野で公知であり、そしてカラムクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動(例えば、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動)を含む。
【0570】
核酸配列データは、本発明の方法によって結合され、そして当該分野で公知の標準的な方法を用いて配列決定ベクター(sequencing vector)中に挿入された核酸の配列決定によって得られ得る。ほとんどの例において、配列決定ベクター中の核酸インサート、または配列決定される鎖の5’から3’の方向は、細胞または組織の遺伝子発現プロフィールの決定付けに関連性がない。そして、このことは一般的に、配列核酸セグメントのまたは配列決定された鎖の方向に関わらず、配列決定された核酸が誘導されることからの、mRNAの同定を可能にするからである。
【0571】
従って、本発明は、細胞または組織の遺伝子発現プロフィールを決定するための方法を提供する。1つの局面において、本発明は、細胞または組織の遺伝子発現プロフィールを決定するための方法を提供し、(a)細胞または組織から得られるRNAからcDNA分子の1つ以上の集団を生じる工程、ここで、これらの集団の個々のcDNA分子は、組換え可能(cDNA分子の同一のまたは異なる集団の個々のメンバーにおいて存在する少なくとも1つの組換え部位を用いて)な少なくとも2つの組換え部位、(b)(a)核酸分子の結合を引き起こす条件下で、の核酸分子を1つ以上の組換えタンパク質を結合させる工程、および(c)結合された核酸分子の配列を決定する工程。
【0572】
(実施例16:TetおよびLacZ遺伝子をクローン化するためのGATEWAYTMの使用)
標準的方法によって合成されたPCRプライマーへ、以下のatt部位を加えた。attB1部位およびattB2部位を標準的GATEWAYTMリーディングフレームとして示し(GATEWAYTM GATEWAYTM Cloning Technology Institution Manual(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division)を参照のこと)、以下に示した。att5のリーディングフレームを、適切なように変更し得る。リーディングフレームの選択を、融合タンパク質を生じるために使用する。
【0573】
【表16】
tet遺伝子(5’−attB1および3’−attB5)およびlacZ遺伝子をコードしている核酸フラグメントをPCRによって増幅し、ポリエチレングリコールを使用して、以下のように沈殿する。TE(150μl)をPCR反応液(50μl)へ加えた後、30%PEG8000(30mM MgCl2)(100μl)を加えた。次いで、溶液を混合し、約10,000xgで、室温において、15分間遠心した。次いで、PEG溶液を除去し、そしてその沈殿物をTE中に溶解した。
【0574】
B1−tet−B5 PCR産物をattP1−ccdB−attP5ドナーベクター(pDONR−P1/P5)と混合し、そして標準のプロトコール(本明細書中の実施例3を参照のこと)を用いてBP CLONASETMと反応させ、attL1−tet−attL5エントリークローンを生じた。B5R−lacZ−B2PCR産物をattP5R−ccdB−attP2ドナーベクター(pDONR−P5R/P2)と混合し、BP CLONASETMと反応させ、attR5−lacZ−attL2エントリークローンを生じた。
【0575】
25℃で1〜4時間インキュベーションした後、2μlのプロテインキナーゼK(2mg/ml)を加え、BP反応を停止させた。次いで、DH5α細胞をLRベクター(すなわちエントリークローン)で形質転換し、そしてLB−kanプレート上にプレーティングした。そのプレートを25℃で一晩中インキュベートした。ミニプレップDNAを、個々のDH5αクローンから調製し、アガロース電気泳動によって定量した。
【0576】
LR CLONASETM反応液を、以下の成分を含む20μlの反応容量で調製した:
スーパーコイル状のtetエントリークローン 60ng(25fmoles)
スーパーコイル状のlacZエントリークローン 75ng(20fmoles)
線状(NcoIを用いて)のpDEST6(PCT公開番号WO00/52027中に記載され、公開の全体が本明細書中で参考文献として援用される)
150ng(35fmoles)
LR4反応緩衝液 4μl
LR CLONASETM 4μl
反応液を25℃で一晩中インキュベートし、そして2μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)で停止した。2μlを使用して、DH5α細胞(100μl)へ形質転換し、そしてXGalを含むLBampプレート上にプレーティングした。pUC DNAの1.6x108cfu/μlの力価にある細胞を含む形質転換混合液中に約35,000コロニーを生じた。全てのコロニーはlacZ遺伝子の存在を示す青色を呈した。24コロニーはテトラサイクリンおよびXGalを含んでいるプレート上で画線した。24コロニーの中24コロニーがテトラサイクリン耐性遺伝子であった。15コロニーを使用し、ミニプレップのためのLB amp培養液(2ml)接種した。15/15ミニプレップは正しい大きさ(8.8kb)のスーパーコイル状プラスミドを含んでいた。3ミニプレップDNAをEcoRVで消化した。結合パターンが正しい方向でクローン化された2つのフラグメントと一致したことが観察された。
【0577】
生じた核酸産物は、共に結合され、そしてデスティネーションベクターへクローン化された、2つのフラグメントからなる。これらの2つのフラグメントの構造(デスティネーションベクターへ挿入されたように)は、以下のようである(矢印は、重複配列に対するattB部位の方向を示す):
attB1→tet←attB5−lacZ←attB2
(実施例17:Tet、Lac、およびNeo遺伝子をクローン化するためのGATEWAYTMの使用)
以下のattB部位を、標準的な方法によって合成されたPCR産物に加える。attB部位およびattB2部位は、標準的なGATEWAYTMリーディングフレーム(GATEWAYTM GATEWAYTM Cloning Technology Institution Manual(Invitrogen Corp.,Life Technologies Division)を参照のこと)に示され、そして以下に示した。attB部位およびattB2部位のリーディングフレームは、使用者によって指定される。
【0578】
【表17】
tet遺伝子をコードしている核酸フラグメント(5’−attB1および3’−attB5でプライミング(prime)された)、Neo遺伝子(5’−attBRおよび3’−attB21Rでプライミングされた)、およびlacZ遺伝子(5’−attB21および3’−attB2プライミングされた)を、PCRによって増幅し、そしてポリエチレングリコールを使用して沈殿した。
【0579】
B1−tet−B5 PCR産物をattP1−ccdB−attP5ドナーベクター(pDONR−P1/P5)と混合し、そして標準のプロトコールを用いてBP CLONASETMと反応させ、attL1−tet−attL3エントリークローンを生じた。B5R−Neo−B21R PCR産物をattP5−ccdB−attP21Rドナーベクター(pDONR−P5R/P21R)と混合し、そしてBP CLONASETMと反応させ、attR5−Neo−attR21エントリークローンを生じた。B21−lacZ−B2PCR産物をattP21−ccdB−attP2ドナーベクター(pDONR−P21/P2)と混合し、そしてBP CLONASETMと反応させ、attL21−lacZ−attL2エントリークローンを生じた。
【0580】
LR CLONASETM反応液を、以下の成分を含む20μlの反応容量で調製した:
スーパーコイル状のtetエントリークローン 40ng(17fmoles)
スーパーコイル状または線状(VspI消化)Neoエントリークローン
スーパーコイル状のlacZエントリークローン 75ng(20fmoles)
NcoIで線状化されたpDEST6 150ng(35fmoles)
LR4反応緩衝液(200mM Tris HCl(pH7.5)、4.75mM EDTA、4.8mg/ml BSA、445mM NaCl、47.5m Mスペルミジン) 4μl
LR CLONASETM 4μl
反応液を25℃で一晩中インキュベートし、そして2μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)を用いて停止した。2μlを使用して、DH5αLE細胞(100μl)へ形質転換し、そしてXGalを含むLBampプレート上にプレーティングした。スーパーコイル状導入遺伝子を含む形質転換混合液中に約3,200コロニーを生じた。5,300コロニーが、VspI処理されたNeoエントリークローンを含んでいる反応液を有する形質転換混合液中で、生じた。コンピーテント細胞の力価は、1.2x108cfu/μlのpUC DNAであった。全てのコロニーはlacZ遺伝子の存在を示す青色を呈した。9コロニーはXGalを含んでいるtetプレート上で画線した。9コロニーの中9コロニーがテトラサイクリン耐性遺伝子であった。15コロニーを使用し、ミニプレップのためのLBamp培養液(2ml)接種した。9の中9ミニプレップは正しい大きさ(11kb)のスーパーコイル状プラスミドを含んでいた。9ミニプレップDNAをEcoRVで消化した。結合パターンが正しい方向でクローン化された3つのフラグメントと一致したことが観察された。
【0581】
生じた核酸産物は、共に結合され、そしてデスティネーションベクターへクローン化された、3つのフラグメントからなる。これらの3つのフラグメントの構造(デスティネーションベクターへ挿入されたように)は、以下のようである(矢印は、重複配列に対するattB部位の方向を示す):
attB1→tet←attB5−Neo−attB21→lacZ←attB2
(実施例18:Luxオペロンをクローン化するための、GATEWAYTMの使用、および異なる特異性を有する複数のatt部位)
ビブリオフィシェリ(Vibrio fischeria)ゲノム遺伝子のLuxオペロン遺伝子(luxA、luxB、luxC、luxD、およびluxE)を、直ぐ下に列挙した、各々のオープンリーディングフレームの5’末端にある最適なシャイン‐ダルガーノ配列およびコザック配列(ggaggtatataccatg(遺伝子番号118))、ならびに3’末端にあるT7プロモーターおよび終止コドン(gaagctatagtgagtcgtatta)を誘導するプライマーを使用して増幅した。
【0582】
【表18】
さらにPCR反応産物を、PCR産物の末端にatt部位を加えたプライマー部位として、シャイン‐ダルガーノ配列およびT7プロモーター配列を利用して、
直ぐ下に列挙されたattB−SD配列およびattB−T7アダプタープライマーを用いて、増幅した。
【0583】
【表19】
この方法において、以下のattPCR産物を生じた:
attB1.6−SD−luxC−T7−attB5
attB5R−SD−luxD−T7−attB11
attB11R−SD−luxA−T7−attB17
attB17R−SD−luxB−T7−attB21
attB21R−SD−luxE−T7−attB2.10
各々のattB PCR産物をポリエチレングリコールで沈殿し、そして適したattプラスミドで反応させ、lux ORFのエントリークローンを生じた。
【0584】
【表20】
反応液を25℃で一晩中インキュベートした。各々の反応液を、2μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)を加えることによって止させ、37℃で10分間インキュベートした。各々の反応液の2μlを使用して、LEDH5α細胞へ形質転換した。そして各々の形質転換体の100μl(1/10)を50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。適切なpENTR−luxクローンを、迅速なミニプレップ分析によって決定されるそれぞれの反応液から単離された。
【0585】
luxAエントリークローン(pENTR−luxA)をVspIで消化し、プラスミド骨格中でプラスミドを線状化した。等量(40ng)の5つのluxエントリークローンの各々を、LR4緩衝液およびLRクロナーゼを含むシグナルLR反応液中で、150ngのpDEST14と混合する。クロナーゼ反応液を含まない、およびpENTRlux反応液を含まないものからなるネガティブコントロール反応液を調製した。
【0586】
【表21】
反応液を25℃で一晩中インキュベートした。各々の反応液を、4μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)を加えることによって止させ、37℃で10分間インキュベートした。各々の反応液の2μlを使用して、LEDH5αLE細胞へ形質転換した。そして各々の形質転換体の100μl(1/10)を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。適切なpENTR−luxクローンを、迅速なミニプレップ分析によって決定されるそれぞれの反応液から単離された。
【0587】
反応液1(コロニーなし)について、形質転換はコロニーを生じなかった、反応液2(pENTRluxA DNAなし)については約200コロニーを生じ、そしておよび反応液3(完全な反応液)については約2500コロニーを生じた。全ての10クローンを、スーパーコイル状プラスミドDNAの大きさ(10.3kb)に基づいて、および診断的制限消化によって正しいことを決定した。合成luxオペロン構築物をBL21SI細胞に形質転換し、そしてルシフェラーゼを発光測定(luminometry)によってモニターした。4つの独立した単離物をBL21SI細胞の中で滴定塩誘導光(titratable salt−inducible light)を生じることを実証した。pUC DNAを含むBL21SI細胞中において、光は検出されなかった。光の出力が生じ、そして生きたE.coli細胞の中で検出されたので、全ての5つのlux遺伝子の機能的活性を確認した。
【0588】
(実施例19:pDONRベクターの生成)
上記の例(luxオペロンクローニング)中のように、ベクター要素のエントリークローンをattBPCRクローニングによって生成した。エントリークローンを、4つのベクター要素のエントリークローンが共に反応するとき、各々のベクター要素が共に結合し、新しいベクター(図26A−28B)を組み立てるように、設計した。この例において、2つの新しいattP DONORベクターを構築した。
【0589】
attB PCR産物の以下のセットを生成した:
attB21R−attP1−ccdB−cat−attP2−attB5
attB5R−kan−attB11
attB5R−amp−attB11
attB11R−loxP−attB17
attB17R−pUC ori−attB21
各々のattPCR産物を、PEG沈殿によって精製し、そして適したattプラスミドと反応させ、それぞれのベクター要素のエントリークローンを以下のように生じた:
【0590】
【表22】
反応液を25℃で一晩中インキュベートした。各々の反応液を、2μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)を加えることによって止させ、37℃で10分間インキュベートした。各々の反応液の2μlを使用して、LEDH5α細胞へ形質転換した。そして各々の形質転換体の100μl(1/10)を50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。コロニーを選択し、そして以下のpENTRクローンを、迅速なミニプレップ分析によって単離するために使用した:
pENTR−attR21−attP1−ccdB−cat−attP2−attL5(反応液2から単離した)
pENTR−attR5−kan−attL11(反応液4から単離した)
pENTR−attR5−amp−att11(反応液6から単離した)
pENTR−attR11−loxP−attL17(反応液8から単離した)
pENTR−attR17−ori−attL211(反応液10から単離した)
attR21−attP1−ccdB−cat−attP−attL5エントリークローンをVspIで消化し、プラスミド骨格状のプラスミドを線状化した。等量(40ng)の5つのluxエントリークローンの各々を、LR4緩衝液およびLRクロナーゼを含む単一なLR反応液中で混合する。クロナーゼ反応液を含まない、およびpENTR―attR21−attP1−ccdB−cat−attP2−attL5 DNAを含まない反応液からなるネガティブコントロール反応液を調製した。
【0591】
【表23】
反応液を25℃で一晩中インキュベートした。4μlのプロテインキナーゼK溶液(2mg/ml)を各々の反応液へ加え、2μlをDB3.1細胞を形質転換するために用いた。100μl(1/10)の形質転換体を、20μg/mlクロラムフェニコールおよび50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレート(反応液1、2および3)、または20μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレート(反応液4)上にプレーティングした。
【0592】
形質転換は、反応液3および4について、約5000および10,000コロニーを生成し、反応液1について約500コロニー(クロナーゼなし)および反応液2(pENTR−attR21−attP1−ccdB−cat−attP2−attL5 DNAなし)について80コロニーのネガティブコントロールとそれぞれ比較した。反応液3および4の両方から全てのクローンが選択され、ミニプレップ分析によって試験した。クローンの全てをスーパーコイル状プラスミドDNAの大きさに基づいて、および診断的制限消化によって正しいことを決定した。attB PCR産物をクローン化する能力を試験することによって、集められたベクターが機能的であることを示した。
【0593】
(実施例20:複数部位(multisite)GATEWAY
attP部位(図26A)の以下の配列を含む4attP DONORプラスミドを、構築した:
【0594】
【表24】
プラスミドを、attP部位およびattP DONORベクターのPCR増幅によって、適する制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーを使用して構築した。各々のPCR産物を適切な制限酵素を用いて消化した。消化されたattP CONORベクターPCR産物を脱リン酸化し、消化されたattP部位に結合した。attP部位を含んでいるプラスミドからなるライゲーションの産物を、両方向でpDONORベクターにクローン化した。
【0595】
続いで、上記に記載されたttPプラスミドをPCR反応のテンプレートとして使用した(図26B)。att部位のコアに特異的にアニーリングするプライマーを使用してPCRを行い、次いで、PCR産物の末端に、任意の所望される特異性のattLおよびattR部位を作製した(実施例9の方法中で使用したプライマーを参照のこと)。各々の新しいattP DONORベクターについて、2つのこのようなPCR産物を生じ、1つはプラスミド骨格(ori−kan)で、および2つ目はccdBおよびcat遺伝子からなる。PCR産物を生じ、そしてLRクロナーゼ反応液中で共に反応させ、任意の方向性および特異性のattP部位を含む新しいプラスミドを生じた。
【0596】
本明細書中に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示し、そして個々の各刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されることが、具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、基本的な組換えクローニング反応の概略表現である。
【図2】
図2は、LR組換え反応を行うことによって2つの核酸セグメントをクローン化するための本発明の使用の概略表現である。
【図3】
図3は、LR組換え反応を使用してセグメントを接合し、次いで、接合されたフラグメントを、BP組換え反応を使用して、目標べクター(Destination Vector)に挿入するために、2つの核酸セグメントをクローン化するための本発明の使用の概略表現である。
【図4】
図4は、BP反応の後にLR反応を行うことによって、2つの核酸セグメントをクローン化するための本発明の使用の概略表現である。
【図5】
図5は、1つのセグメント上のattL部位、および別のセグメント上のattRを生成するための第次BP反応と、それに続くそれらのセグメントを結合させるためのLR反応を行うことによってクローン化される、attB部位を有する2つの核酸セグメントの概略表現である。このプロセスののバリエーションにおいて、P1、P2、および/またはP3はオリゴヌクレオチドまたは線状に伸びたヌクレオチドであり得る。
【図6】
図6は、LR反応を使用して、2つの核酸セグメントをデスティネーションベクター中の2つの離れた部位へクローン化する概略表現である。
【図7】
図7は、BP反応を使用して、2つの核酸セグメントをベクター中の2つの離れた部位へクローン化する概略表現である。
【図8】
図8は、BP反応利用して、3つのベクターへ3つの核酸セグメントをクローン化するLR反応を使用する3つのセグメントの1つのベクターへのクローン化し、そしてatt部位で切り離されるセグメントを生じる概略表現である。
【図9】
図9は、BP反応利用して、3つの核酸セグメントを1つのベクターへクローン化し、そしてattR部位で切り離されるセグメントを生じる概略表現である。
【図10】
図10は、組換えによって、1つ以上の同一または異なる分子(核酸、タンパク質/ペプチド、糖質、および/または化合物)を支持体(support)(影つきの部分shaded box)へ加える概略表現である。白抜きの部分(open box)は組換え部位を表している。
【図11】
図11は、多分子および/または化合物(AおよびB)の接合の概略表現である。この図で使用したラベルは図10中のこれらに対応する。AおよびBの添加同時であるか、または続いて起こり得る。
【図12】
図12は、支持体から分子または化合物(A)の一部を除去する概略表現である。この図で使用したラベルは図10中のこれらに対応する。
【図13】
図13は、分子または化合物(A)の一部を、第2の分子または化合物(C)で置換する概略表現である。この図で使用したラベルは図10中のこれらに対応する。
【図14A】
図14Aは、インサートの遺伝子に対してC末端融合を提供するための構築を示したプラスミドマップである。SupFは抑制機能をコードする。したがって、SupFが発現するとき、GUS−GST融合タンパク質が生産される。この分子のバリエーションにおいて、GUSは任意の遺伝子であり得る。
【図14B】
図14Bは、遺伝子抑制および発現の両方を制御するための方法の概略表現である。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子は、チロシンコドンの代わりに、1つ以上(2つが示されている)のアンバー終止コドン(「am」とラベルされる)を含んでいる。誘導出来るプロモーターの漏出性(非誘導性)(Leaky)転写は、活性なT7 RNAポリメラーゼを生産するという結果になる。誘導時、十分なsupFは活性なT7 RNAポリメラーゼを生成する生産され、これによってsupFの発現の増加を生じ、これによって活性なT7 RNAポリメラーゼの発現のさらなる増加がもたらされる。T7 RNAポリメラーゼはさらに、遺伝の発現を誘導する。さらに、SupFの発現は、アンバー終止コドンの妨害の抑制によって、遺伝子発現産物へC末端タグを付加する結果を生じる。
【図15】
図15は、インサート遺伝子のN末端および/またはC末端融合の生産のための構築を示したプラスミドマップである。丸で囲った数字はそれぞれアンバーコドン、オーカーコドン、またはオパールコドンを表す。これらの終止コドンの抑制は、N末端、C末端、または両方の末端において融合タグの発現を生じる。抑制が内場合、ネイティブなタンパク質が生成される。
【図16】
図16は、LR反応を用いて、デスティネーションベクターへ4つの別個のDNAセグメントの単一ステップの挿入の概略表現である。特に、attL1部位を5’末端に、そしてattL3部位を3’末端に有している第1のDNAセグメントは、attR3を5’末端に、そしてattL4部位を3’末端に有する第2のDNAセグメントへ結合する。次いで、第2のDNAセグメントを、attR4部位を5’末端に、そしてattL5を3’末端に有している第3のセグメントに結合する。次いで、第3のDNAセグメントは、attR5部位を5’末端に、そしてattL2を3’末端に有する第4のDNAセグメントに結合する。したがって、LR CLONASETMを用いた反応では、第1、第2、第3、および第4のDNAセグメントはデスティネーションベクター(attR1部位およびattR2部位に隣接するccdB遺伝子を含んでいる)へ挿入される。
【図17A】
図17Aは、実施例18で以下に示した方法にしたがって調製されたluxオペロンの構築の概略表現である。本発明に基づいて、一つ以上のオペロンの遺伝子は置換され得、または1つ以上の改変されたオペロンを構築するための組換えを通じて欠失され得、次いで、宿主細胞における活性および/または効果について試験した。あるいは、他の遺伝子(改変体および変異体を含む)は、目的の1つ以上の遺伝子を置換するためのオペロンの最初の構築において使用され得、それゆえ、1つ以上のオペロンを生産する。
【図17B】
図17Bは、実施例18で以下に示した方法にしたがって調製されたluxオペロンの構築の概略表現である。本発明に基づいて、一つ以上のオペロンの遺伝子は置換され得、または1つ以上の改変されたオペロンを構築するための組換えを通じて欠失され得、次いで、宿主細胞における活性および/または効果について試験した。あるいは、他の遺伝子(改変体および変異体を含む)は、目的の1つ以上の遺伝子を置換するためのオペロンの最初の構築において使用され得、それゆえ、1つ以上のオペロンを生産する。
【図18】
図18は、2つの工程(1つのベクタープロセス)を経て、6つの個別のDNAフラグメントのベクターへの挿入をベクターへ挿入する概略表現である。特に、5’末端にattL1部位、そして3’末端部位にattL3を有する第1のDNAセグメント(DNA−A)が、第2のDNAセグメントに結合している。次いで、第2のセグメントは、5’末端にattL5部位、そして3’末端部位にattL3を有する第3のDNAセグメント(DNA−C)に結合している。5’末端にattR1部位、そして3’末端部位にattL3を有する第4のDNAセグメント(DNA−D)は、5’末端にattR3部位、そして3’末端部位にattL4を有する第5のDNAセグメント(DNA−E)に結合する。次いで、第5のDNAセグメントは、5’末端にattR4部位、そして3’末端部位にattL2を有する第6のDNAセグメント(DNA−F)に結合する。次いで、生じた2つの分子(すなわち、DNA−A−DNA−B−DNA−CおよびDNA−D−DNA−E−DNA−F)は挿入ベクターへ挿入される。上の反応の各々は、LR CLONASETMによって触媒される。LR反応はまた、結合されたDNAセグメントをデスティネーションベクター(attR1部位およびattR2部位に隣接するccdB遺伝子を含んでいる)へ挿入するために用いられる。挿入されるDNAセグメントは互いおよびベクターから、aatB1、aatB2、aatB3、aatB4、aatB5、よおびaatB2部位で切り離される。複合体に関して図6に記載したように、組み立てられたセグメントは連続的または非連続的な部位に挿入され得る。
【図19】
図19は、2つの工程、2つのベクタープロセスを用いる、ベクターへの6つの別々のDNAセグメントの挿入の概略図である。特に、5’末端にattB1部位そして3’末端にattL3部位を有する第1のDNAセグメント(DNA−A)は、5’末端にattR3部位そして3’末端にattL4部位を有する第2のDNAセグメント(DNA−B)に連結される。次いで、第2のDNAセグメントは、5’末端にattR4部位そして3’末端にattB5部位を有する第3のDNAセグメント(DNA−C)に連結される。次いで、連結されたDNAセグメントは、attP1およびattP5部位を含むベクターに挿入される。さらに、5’末端にattB5部位そして3’末端にattL3部位を有する第4のDNAセグメント(DNA−D)は、5’末端にattR3部位そして3’末端にattL4部位を有する第5のDNAセグメント(DNA−E)に連結される。次いで、第5のDNAセグメントは、5’末端にattR4部位そして3’末端にattB2部位を有する第6のDNAセグメント(DNA−F)に連結される。次いで、連結されたDNAセグメントは、attP1およびattP2を含むベクターに挿入される。
記載されるように、2つのプラスミドの構築後、プラスミドの各々は、3つの挿入されたDNAセグメントを含み、これらのプラスミドは、LR CLONASETMと反応させて、attB部位が隣接する6つのDNAフラグメントを含む別のプラスミドを産生する(すなわち、B1−DNA−A−B3−DNA−B−B4−DNA−C−B5−DNA−D−B3−B1−DNA−E−B4−DNA−F−B2)。
【図20A】
図20Aは、2つの異なったDNA挿入物を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。このベクターの転写は、T7プロモーターにより、異なった方向で駆動される。生成されるべき転写物の型に依存して、DNA−Aおよび/またはDNA−Bのいずれかは、センスまたはアンチセンスRNAのいずれかの生成を生じる配向で存在し得る。
【図20B】
図20Bは、1つのDNA挿入物を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。このベクターの転写物は、T7プロモーターにより、2つの異なった方向で駆動される。従って、一方のプロモーターによって駆動される転写によって生成されたRNAは、センスRNAであり、他方のプロモーターによって駆動された転写によって生成されたRNAは、アンチセンスRNAである。
【図20C】
図20Cは、同一のヌクレオチド配列(すなわち、DNA−A)を有する2つの異なったDNA挿入物を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。このベクターの転写は、2つの別々のT7プロモーターによって、異なった方向で駆動される。この実施例においては、一方のプロモーターによって駆動される転写によって生成されるRNAは、センスRNAであり、他方のプロモーターによって駆動される転写によって生成されたRNAは、アンチセンスRNAである。
【図20D】
図20Dは、反対の配向で、同一のヌクレオチド配列(すなわち、DNA−A)を有する2つのDNA挿入物を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。このベクターの転写は、一方のT7プロモーターによって駆動される。転写終止シグナルは、DNA−Aの2つのコピーとDNA−A挿入物間に存在しない。一方のセグメントの転写は、センスRNAを生成し、そして、他方の転写は、アンチセンスRNAを生成する。このベクターから生成されるRNAは、分子内ハイブリダイゼーションを起こし、従って、ヘアピンターンを有する二重鎖分子を形成する。
【図20E】
図20Eは、本発明の2つの例示的なベクターの概略図である。このベクターの各々は、同一のヌクレオチド配列(すなわち、DNA−A)を有するDNA挿入物を含む。これらの挿入物の転写は、センスおよびアンチセンスRNAの生成を生じ、次いで、これらは、ハイブリダイズして二重鎖標準RNA分子を形成する。
【図21A】
図21Aは、3つの挿入物(「プロモーター」、「コード配列」、および「Kanr」と標識される)を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。この実施例において、挿入されたプロモーターは、コード配列の発現を駆動する。さらに、挿入されたDNAセグメントは、ベクターを含む宿主細胞にカナマイシンに対する耐性を付与する。以下により詳細に記載されるように、かなりの数のベクター成分(例えば、選択マーカー(例えば、カナマイシン耐性遺伝子)カセット、oriカセット、プロモーターカセット、タグ配列カセットなど)が挿入され得るかまたは本発明のベクターを構築するために使用され得る。
【図21B】
図21Bは、4つの挿入物(「プロモーター1」、「コード配列1」、「プロモーター2」、および「コード配列2」と標識される)を含む本発明の例示的なベクターの概略図である。この実施例において、プロモーター1は、コード配列1の発現を駆動し、そして、プロモーター2は、コード配列2の発現を駆動する。
【図21C】
図21Cは、相同組換えについての本発明の例示的なベクターの概略図である。このベクターは、4つの挿入物を含む(「5’相同性」、「NEO」、「DNA−A」、および「3’相同性」と標識される)。この実施例における5’および3’相同性領域は、ネオマイシン耐性マーカー(「NEO」)およびDNAセグメント(「DNA−A」)の挿入のために選択された染色体領域に相同性である。この型の標的化ベクターは、標的化された核酸分子に存在する核酸を挿入、欠失および/または置換するように設計され得る。
【図22】
図22Aおよび22Bは、本発明の標的化ベクターを調製するためのプロセスの概略図を示す。
【図23】
図23は、ランダムプライムされた第1鎖の逆転写を用いて増幅し、次いで、PCRでランダムプライムしたmRNAを示す。これらの増幅産物は、n個のプールに分割され、そして各プールは、異なった対のattB部位を有するランダムプライマーを用いて増幅した。接尾語「R」は、いくつかのattB部位が、逆位配向で存在し得ることを示す。標準または逆位配向のいずれかを有するattB部位は、別々のプールで使用され、attB部位が、標準または逆位配向のいずれかで連結されている増幅産物を生成する。これらの部位が逆位attP部位と反応する場合、attR部位が、attL部位の代わりにEntry Cloneにおいて形成される。従って、標準または逆位attRを用いる反応プールは、attRおよびattL部位が隣接する分子の混合物を生成する。増幅産物は、ゲル精製によって大きさを分け、次いで、GATEWAYTMBP反応を用いてクローン化してEntry Cloneを作製する。各クローンは、attL部位、attR部位、またはattLおよびaatRが隣接する小さい挿入物を含み、使用されるattB部位およびattP部位の配向に依存する。EntryCloneが一緒に混合される場合、適切なDestination Vectorにクローン化され得るコンカテマー由来の挿入物クローンは、n個の挿入物を与え、各挿入物は、attB部位によって分離される。多数のコンカテマーの配列決定は、元々のサンプル中に存在するmRNA分子のプロフィールを生成する。
【図24A】
図24Aは、本発明の方法および組成物における使用に適したいくつかのatt部位(配列番号1〜36)の配列を示す。
【図24B】
図24Bは、本発明の方法および組成物における使用に適したいくつかのatt部位(配列番号1〜36)の配列を示す。
【図24C】
図24Cは、本発明の方法および組成物における使用に適したいくつかのatt部位(配列番号1〜36)の配列を示す。
【図25】
図25A〜Bは、N末端タグまたは配列(N−タグ)、オープンリーディングフレーム(ORF)、C末端タグまたは配列(C−タグ)、選択マーカー(amp)、プラスミド複製の起点(ori)および他のベクターエレメント(例えば、loxP部位)を含む挿入物を含むEntry Cloneの回収を示す。各Entry Cloneベクターエレメント挿入物は、attLまたはattR部位に隣接し、その結果、これらのベクターエレメントは共に連結され得、そしてLR Clonase反応液中で新しいベクター構築物を形成する(図25Bに示される)。
【図26】
図26A〜Bは、任意の配向および特異性のattP部位を含むattP DONORプラスミドを構築するためのプロセスを示す。図26Aは、2つの配向の直接反復および2つの配向の逆位反復attP部位からなるattP DONORプラスミド中のattPの4つの配列を示す。図26Aに示される4つのattP DONORプラスミドは、attP部位のコアに特異的にアニールするPCRプライマーを用いるPCR反応のための鋳型として使用され得、従って、PCR産物の末端の任意の所望の特異性のattLまたはattR部位を作製する。各新しいattP DONORベクターを構築するために、2つのこのようなPCR産物が生成される。プラスミド骨格からなる産物(ori−kan)およびccdBおよびcat遺伝子からなる第2の産物。PCR産物をLR Clonase反応液中で共に反応し、任意のatt部位特異性を有する任意の配向のattP部位を有する新しいプラスミドを生成する。
【図27A】
図27Aは、2つの核酸セグメント(AおよびB)を連結するためのプロセスを示す。このセグメントは、2つの類似した構成のプラスミドにクローン化された。各セグメントは、2つの組換え部位が隣接する。各プラスミド上のセグメントの1つは、他方のプラスミド上のその同族のパートナーと反応し得るが、他の2つの組換え部位は、存在するいずれの他の部位とも反応しない。各プラスミドは、条件的であり得るかまたはあり得ない独特の複製起点を保有する。各プラスミドはまた、ポジティブおよびネガティブ選択マーカー(それぞれ、+smXおよびsmY)の両方を保有し、特定のマーカーに連結されたエレメントに対して、およびそれについて選択可能である。最後に、各プラスミドは、第3の組換え部位(この実施例におけるloxP)、所望でないエレメントの欠失および所望のエレメントの保持を可能にするように適切に位置される。この実施例において、2つのプラスミドは、Gateway L×R反応を介してL2およびR2で最初に融合される。この結果は、B2組換え部位を介するセグメントAおよびBの近位、およびP2組換え部位を介するsm1およびoriBの近位を生じる。一連のプラスミドエレメントに隣接する骨格中の2つのloxP部位が、第2のパネルに記載される。Creタンパク質の添加は、単一の大きいプラスミドを2つの小さいプラスミドに分解する。これらうちの1つは、oriAがsm2および+sm4に現在連結される、連結したAおよびBセグメントを保有する所望のプラスミドである。他方は、不必要なおよび/または所望でないエレメントのセットを保有する。適切な宿主の形質転換および引き続く適切な遺伝子選択の負担は、所望でないプラスミドの喪失を生じるが、所望のプラスミドは維持される。
【図27B】
図27Bは、上記の図27Aに示されるように、構築された2つのキメラ核酸セグメント、A−BおよびC−Dを連結するためのプロセスを示す。このセグメントは、2つの類似した構成のプラスミドにクローン化された。各セグメントは、2つの組換え部位が隣接する。各プラスミド上のセグメントの1つは、他方のプラスミド上のその同族のパートナーと反応し得るが、他の2つの組換え部位は、存在するいずれの他の部位とも反応しない。この実施例において、2つのプラスミドは、Gateway L×R反応を介してL2およびR2で最初に融合される。この結果は、B2組換え部位を介するセグメントAおよびBの近位、およびP2組換え部位を介するsm1およびoriBの近位を生じる。一連のプラスミドエレメントに隣接する骨格中の2つのloxP部位が、第2のパネルに記載される。Creタンパク質の添加は、単一の大きいプラスミドを2つの小さいプラスミドに分解する。これらうちの一方は、oriAがsm2および+sm4に現在連結される、連結したA−BおよびC−Dセグメントを保有する所望のプラスミドである。他方は、不必要なおよび/または所望でないエレメントのセットを保有する。適切な宿主の形質転換および引き続く適切な遺伝子選択の負担は、所望でないプラスミドの喪失を生じるが、所望のプラスミドは維持される。
Claims (142)
- ハイブリッド核酸分子の集団を産生する方法であって、以下:
(a)1以上の組換え部位を含む核酸分子の少なくとも第1の集団を、1以上の組換え部位を含む少なくとも1つの標的核酸分子と混合する工程;および
(b)該少なくとも第1の集団のいくつかあるいは全ての該核酸分子を、該標的核酸分子の全てあるいはいくつかと組換え、それによって該ハイブリッド核酸分子の集団を形成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、該方法が核酸分子の前記第1の集団および前記標的核酸分子を、組換えを支持する条件下において1以上の組換えタンパク質と混合することによって該組換えが生じる工程を包含する、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで、前記組換えタンパク質が、以下:
(a)Cre;
(b)Int;
(c)IHF;
(d)Xis;
(e)Fis;
(f)Hin;
(g)Gin;
(h)Cin;
(i)Th3 resolvase;
(j)TndX;
(k)XerC;および
(l)XerD
からなる群より選択される1以上のタンパク質を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、該方法がさらに、核酸分子の前記第1の集団および前記標的核酸分子を、1以上の組換え部位を含む核酸分子の少なくとも第2の集団と混合する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記組換え部位が、以下:
(a)lox部位;
(b)psi部位;
(c)dif部位;
(d)cer部位;
(e)frt部位;
(f)att部位;および
(g)組換えを起こす能力を保持した(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の組換え部位の変異体、改変体、および誘導体
からなる群より選択される1以上の組換え部位を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、該方法がさらに、前記ハイブリッド核酸分子の前記集団を選択する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、該方法がさらに、前記ハイブリッド核酸分子の前記集団を選択し、そして核酸分子の第1の前記集団ではないものおよび前記標的核酸分子ではないものを選択する工程を包含する、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、該方法がさらに、融合体分子および副産物分子ではないものを選択する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法によって産生される、前記ハイブリッド核酸分子の集団を含む、組成物。
- 請求項1に記載の方法によって産生される、前記ハイブリッド核酸分子の集団を含む組換え宿主細胞の、集団。
- 請求項1に記載の方法によって産生される前記ハイブリッド核酸分子の集団を宿主細胞中にの導入する工程を含む、組換え宿主細胞の集団を作製する方法。
- ハイブリッド核酸分子の集団を産生する方法であって、以下:
(a)1以上の組換え部位を含む核酸分子の少なくとも第1の集団を、1以上の組換え部位を含む核酸分子の少なくとも第2の集団と混合する工程;および
(b)該少なくとも第1の集団のいくつかまたは全ての該核酸分子を少なくとも該第2の集団の全てまたはいくつかの核酸分子と組換え、それによって該ハイブリッド核酸分子の集団を形成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項12に記載の方法であって、ここで、核酸分子の前記第1の集団および核酸分子の前記第2の集団を、前記組換えを支持する条件下において、1以上の組換えタンパク質と混合することによって該組換えが生じる、方法。
- 核酸分子間において相同組換えを行う方法であって、以下:
(a)1以上の組換え部位を含む少なくとも第1の核酸分子を少なくとも1つの標的核酸分子と混合する工程であって、ここで該第1の核酸分子および該標的核酸分子が1以上の相同性配列を有する、工程;および
(b)第1の核酸分子および標的核酸分子を、相同性組換えによって組換える工程、
を包含する、方法。 - 請求項14に記載の方法であって、ここで、前記相同組換えにより前記第1の核酸分子の全てまたは一部の前記標的核酸分子への移転を生じる、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、ここで、前記第1の核酸分子が前記標的核酸分子の配列に相同である2以上の配列を含む、方法。
- 標的遺伝子または標的ヌクレオチド配列を標的化または変異する方法であって、以下:
(a)1以上の組換え部位および1以上の選択マーカーを含む少なくとも1つの第1の核酸分子を得る工程であって、ここで該第1の核酸分子が、該標的遺伝子または該標的ヌクレオチド配列に対して相同である1以上の核酸配列を含む工程;ならびに
(b)該第1の核酸分子を、該標的遺伝子または該標的ヌクレオチド配列と該第1の核酸分子間の1以上の部位において相同組換えを生じさせるのに十分な条件下で、1以上の標的遺伝子または標的核酸配列と接触し、それによって該標的遺伝子または該標的ヌクレオチド配列に、該第1の核酸分子の全てまたは一部を挿入させる工程、
を含む、方法。 - 前記標的遺伝子または前記標的ヌクレオチド配列が不活性化されている、請求項17に記載の方法。
- 前記標的遺伝子または前記標的ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を選択する工程をさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 請求項19に記載の方法によって産生された、組換え宿主細胞。
- 核酸分子をクローニングする方法であって、以下:
(a)第1の組換え部位および第2の組換え部位に隣接する第1の核酸セグメントを提供する工程;
(b)第3の組換え部位および第4の組換え部位に隣接する第2の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで該第1の組換え部位および該第2の組換え部位のいずれかが、該第3の組換え部位および該第4の組換え部位のいずれかと組換わり得る工程;
(c)該2つの核酸セグメントが1つの核酸分子へと組換えられるような組換え反応を導く工程;および
(d)該1つの核酸分子をクローニングする工程、
を包含する、方法。 - 核酸分子をクローニングする方法であって、以下:
(a)第1の組換え部位および第2の組換え部位に隣接した第1の核酸セグメントならびに第3の組換え部位および第4の組換え部位に隣接した第2の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで該第1の核酸セグメントおよび該第2の核酸セグメントに隣接する組換え部位のいずれもが、該第1の核酸セグメントおよび該第2の核酸セグメントに隣接する他のいずれの部位とも組換わり得ない工程;
(b)第5、第6、第7および第8の組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで第5、第6、第7および第8の該組換え部位のそれぞれが、第1、第2、第3あるいは第4の該組換え部位の1つと組換わり得る工程;ならびに
(c)該2つの核酸セグメントが該ベクターへ組換えられるような組換え反応を導き、これによって該第1の核酸セグメントおよび該第2の核酸セグメントをクローニングする工程
を含む、方法。 - n個の核酸セグメントをクローニングする方法であって、ここでnは、1より大きい整数であって、以下:
(a)n個の核酸セグメントを提供する工程であって、各フラグメントが、互いと組換わらない2つの組換え部位に隣接する工程;
(b)2n個の組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで該2n個の組換え部位のそれぞれが、該核酸セグメントの1つに隣接する組換え部位の1つと組換わり得る工程;および
(c)該n個の核酸セグメントが該ベクターへ組換えられるような組換え反応を誘導し、これによって該n個の核酸セグメントをクローニングする工程
を含む、方法。 - 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記n個の核酸セグメントと前記ベクターとの間の組換え反応が、該組換えを支持する条件下で1以上の前記組換えタンパク質の存在下で導かれる、方法。
- 請求項24に記載の方法であって、ここで前記組換えタンパク質が、以下:
(a)Cre;
(b)Int;
(c)IHF;
(d)Xis;
(e)Fis;
(f)Hin;
(g)Gin;
(h)Cin;
(i)Tn3 resolvase;
(j)TndX;
(k)XerC;および
(l)XerD
からなる群より選択される1以上のタンパク質を含む、方法。 - 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記核酸セグメントおよび前記ベクターの前記組換え部位が、以下:
(a)lox部位;
(b)psi部位;
(c)dif部位;
(d)cer部位;
(e)frt部位;
(f)att部位;および
(g)組換えを受ける能力を保持した(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の該組換え部位の変異体、改変体、および誘導体
からなる群より選択される1以上の組換え部位を含む、方法。 - nが2、3、4または5である、請求項23に記載の方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写を制御し得る配列に作動可能に連結されている、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、ここで、転写を制御し得る前記配列が、以下:
(a)プロモーター;
(b)エンハンサー;および
(c)リプレッサー
からなる群より選択される、方法。 - 請求項29に記載の方法であって、ここで、前記プロモーターが誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターのいずれかである、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記クローニングされた核酸セグメントより産生されたRNAの翻訳が融合タンパク質の産生を生じる、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、少なくとも1つの前記核酸セグメントがオープンリーディングフレームの全てまたは部分をコードし、そして少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写を制御し得る配列を含む、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写においてセンスRNA鎖を産生し、そして少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写においてアンチセンスRNA鎖を産生する、方法。
- 請求項33に記載の方法であって、ここで、前記センスRNAおよび前記アンチセンスRNAが少なくとも1つの相補性領域を含み、そして該センスRNAおよび該アンチセンスRNAが互いにハイブリダイズし得る、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、少なくとも2つの核酸セグメントの転写が単一RNAの産生を生じる、方法。
- 請求項35に記載の方法であって、ここで、少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写においてセンスRNA鎖を産生し、そして少なくとも1つの前記核酸セグメントが転写においてアンチセンスRNA鎖を産生する、方法。
- 請求項36に記載の方法であって、ここで、前記センスRNAおよび前記アンチセンスRNAが少なくとも1つの相補性領域を含み、そして該センスRNAおよび該アンチセンスRNAが互いにハイブリダイズし得る、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記核酸セグメントが1以上のライブラリーの核酸分子を含む、方法。
- 請求項38に記載の方法であって、ここで、前記1以上のライブラリーがcDNAまたはゲノムDNAのいずれかを含む。方法。
- 請求項38に記載の方法であって、ここで、前記1以上のライブラリーが抗体分子の可変ドメインをコードする核酸分子を含む、方法。
- 請求項40に記載の方法であって、ここで、前記1以上のライブラリーが抗体軽鎖および抗体重鎖の可変ドメインをコードする核酸分子を含む、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、該方法がさらに、1以上の抗原に対する結合特異性を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためにスクリーニングする工程を包含する、方法。
- 請求項23に記載の方法であって、該方法がさらに、1以上の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためにスクリーニングする工程を包含する、方法。
- 請求項43に記載の方法であって、ここで、前記活性が、以下:
(a)細胞からの分泌;
(b)細胞下局在性;
(c)リガンド結合活性;および
(d)酵素的活性
からなる群より選択される、1以上の活性を含む、方法。 - 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が小胞体、核、ミトコンドリア、葉緑体または細胞膜に局在する、方法。
- 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、以下:
(a)核酸;
(b)細胞表面レセプター;
(c)可溶性タンパク質;および
(d)金属イオン
からなる群より選択されるリガンドを結合する、方法。 - 少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法であって、該方法が、以下:
(a)第1の核酸セグメント、第2の核酸セグメントおよび第3の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、該第1の核酸セグメントが第1組換え部位および第2組換え部位に隣接し、該第2の核酸セグメントが第3組換え部位および第4組換え部位に隣接し、そして該第3の核酸セグメントが第5組換え部位および第6組換え部位に隣接し、ここで該第2組換え部位が該第3組換え部位と組換え可能であり、そして該第1組換え部位、該第4組換え部位、該第5組換え部位または該第6組換え部位のいずれも、該第1組換え部位〜該第6組換え部位のいずれとも組換えし得ない工程;
(b)第7組換え部位および第8組換え部位に隣接する第1の陰性選択可能マーカーを含み、かつ第9組換え部位および第10組換え部位に隣接する第2の陰性選択可能マーカーを含むベクターを提供する工程であって、ここで、該第7組換え部位〜該第10組換え部位のいずれも、該第7組換え部位〜該第10組換え部位のいずれとも組換えし得ない工程;
(c)該第2組換え部位と該第3と組換え部位が組換わるような第1の組換え反応を実施する工程;ならびに
(d)該第1組換え部位および該第4組換え部位が該第7組換え部位および該第8組換え部位と組換わり、そして該第5組換え部位および該第6組換え部位が該第9組換え部位および該第10組換え部位と組換わるような第2の組換え反応を実施する工程であって、そのことによって該第1の核酸セグメント、該第2の核酸セグメントおよび該第3の核酸セグメントをクローニングする、工程
を包含する、方法。 - 少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法であって、該方法が、以下:
(a)第1の核酸セグメント、第2の核酸セグメントおよび第3の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、該第1の核酸セグメントが第1組換え部位および第2組換え部位に隣接し、該第2の核酸セグメントが第3組換え部位および第4組換え部位に隣接し、そして該第3の核酸セグメントが第5および第6の組換え部位に隣接し、ここで該第2組換え部位が該第3組換え部位と組換え可能であり、そして該第4組換え部位が該第5組換え部位と組換え可能である工程;
(b)第7組換え部位および第8組換え部位を含むベクターを提供する工程;ならびに
(c)該第2組換え部位および該第3組換え部位,ならびに該第4組換え部位および該第5組換え部位、ならびに該第1組換え部位および該第6組換え部位が、それぞれ該第7組換え部位および該第8組換え部位と組換わるような少なくとも1つの組換え反応を実施する工程であって、このことによって、第1の核酸セグメント、第2の核酸セグメントおよび第3の核酸セグメントをクローニングする、工程
を包含する、方法。 - 請求項48に記載の方法であって、ここで、前記組換え反応が、組換えに有利な条件下で1つ以上の組換えタンパク質の存在下において実施される、方法。
- n個の核酸フラグメントをクローニングする方法であって、nは、2より大きい整数であり、以下:
(a)第1から第nの核酸セグメントを提供する工程であって、各セグメントが2つの組換え部位に隣接し、ここで組換え部位が第iセグメントであるniに隣接する2つの組換え部位のうちの1つが、第ni−1セグメントに隣接する組換え部位の1つと反応し、そして該第iセグメントに隣接する他の組換え部位が第ni+1セグメントに隣接する組換え部位の1つと反応するように選択される、工程;
(b)少なくとも2つの組換え部位を含むベクターを提供する工程であって、ここで、該ベクター上の該2つの組換え部位の1つが該第1の核酸セグメント上部位の1つと反応し、そして該ベクター上の別の部位が該第nの核酸セグメント上の組換え部位と反応する、工程;ならびに
(c)全ての核酸フラグメントがベクター中に組換えられるような少なくとも1つの組換え反応を実施する工程
を含む、方法。 - 請求項50に記載の方法であって、ここで、前記組換え反応が、組換えに有利な条件下で1つ以上の組換えタンパク質の存在下において実施される、方法。
- 請求項51に記載の方法であって、ここで前記組換えタンパク質が、以下:
(a)Cre;
(b)Int;
(c)IHF;
(d)Xis;
(e)Fis;
(f)Hin;
(g)Gin;
(h)Cin;
(i)Tn3 resolvase;
(j)TndX;
(k)XerC;および
(l)XerD
からなる群より選択される1以上のタンパク質を含む、方法。 - 請求項50に記載の方法であって、ここで、前記核酸セグメントおよび前記ベクターの前記組換え部位が、以下:
(a)lox部位;
(b)psi部位;
(c)dif部位;
(d)cer部位;
(e)frt部位;
(f)att部位;および
(g)組換えを受ける能力を保持した(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の該組換え部位の変異体、改変体、および誘導体
からなる群より選択される1以上の組換え部位を含む、方法。 - 請求項53に記載の方法であって、ここで、互いに組換わる前記組換え部位が、同一の7塩基対の重複領域を有するatt部位を有する、方法。
- 請求項47に記載の方法によって産生される、核酸分子。
- 少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法であって、該方法は:
(a)核酸分子の第1の集団を供給し、ここで、このような分子の全てまたは一部分が、第1の組換え部位および第2の組換え部位によって隣接される、工程;
(b)第3の組換え部位および第4の組換え部位によって隣接される、少なくとも1つの核酸セグメントを供給し、ここで、該第1の組換え部位または該第2の組換え部位のいずれかが、該第3の組換え部位および該第4の組換え部位のいずれかと組換わり得る、工程;
(c)核酸分子の第2の集団を形成するために、前記集団における前記核酸分子の全てまたは一部分が該セグメントと組換えられるような組換え反応を行う、工程;および、
(d)核酸分子の該第2の集団をクローニングする、工程、
を包含する、方法。 - 核酸分子の第2の集団が融合タンパク質をコードする、請求項56に記載の方法。
- 請求項56に記載の方法であって、ここで前記核酸セグメントが以下:
(a)免疫グロブリンのFc部分;
(b)β−グルクロニダーゼ;
(c)蛍光タンパク質;
(d)精製タグ;および、
(e)エピトープタグ、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、方法。 - 請求項58に記載の方法であって、ここで前記核酸セグメントが以下:
(a)緑色蛍光タンパク質;
(b)黄色蛍光タンパク質;
(c)赤色蛍光タンパク質;および、
(d)シアン蛍光タンパク質、
からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする、方法。 - 請求項58に記載の方法であって、ここで前記核酸セグメントが以下:
(a)エピトープタグ;
(b)マルトース結合タンパク質;
(c)His6タグ;および、
(d)グルタチオンSトランスフェラーゼ、
からなる群から選択される精製タグをコードする、方法。 - 請求項56に記載の方法によって産生される、核酸分子。
- 少なくとも1つの核酸分子をクローニングする方法であって、該方法は:
(a)核酸分子の第1の集団を供給する工程であって、ここで、このような分子の全てまたは一部分が、少なくとも第1の組換え部位および第2の組換え部位によって隣接される、工程;
(b)核酸分子の第2の集団を供給する工程であって、ここで、このような分子の全てまたは一部分が、第3の組換え部位および第4の組換え部位によって隣接され、ここで、該第1の組換え部位または該第2の組換え部位のいずれかが、該第3の組換え部位または該第4の組換え部位のいずれかと組換わり得る、工程;
(c)核酸分子の第3の集団を形成するために、該第1の集団における該分子の全てまたは一部分が該第2の集団からの1つ以上の分子と組換えられるような組換え反応を行う、工程;および、
(d)核酸分子の該第3の集団をクローニングする、工程、
を包含する、方法。 - 組換えに有利な条件下において1つ以上の組換えタンパク質の存在下で、前記組換え反応が行われる、請求項62に記載の方法。
- 核酸の2つのセグメントを連結する方法であって、該方法は:
(a)核酸の2つのセグメントを供給する工程であって、各セグメントは、他方のセグメントが存在する組換え部位と組換わり得る、少なくとも一方の組換え部位を含む、工程;および、
(b)該組換え部位の間で組換えを引き起こし、それによって該セグメントを連結する条件下で、1つ以上の組換えタンパク質と該セグメントとを接触する、工程、
を包含する、方法。 - 前記連結した核酸セグメントをベクターに挿入する工程をさらに包含する、請求項64に記載の方法。
- 前記2つの核酸セグメントの1つがライブラリーの核酸分子である、請求項65に記載の方法。
- 前記2つの核酸セグメントの1つが、1つ以上の同定可能な活性を有する発現産物をコードする、請求項65に記載の方法。
- 前記発現産物が選択マーカーまたは酵素である、請求項64に記載の方法。
- 前記発現産物がリボザイムである、請求項64に記載の方法。
- 前記2つの核酸セグメントの1つが、オープンリーディングフレームの全てまたは一部を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記2つの核酸セグメントの1つが、転写を調節し得る配列を含む、請求項64に記載の方法。
- 請求項71に記載の方法であって、ここで、転写を調節し得る前記配列が以下:
(a)プロモーター;
(b)エンハンサー;および、
(c)レプレッサ、
からなる群より選択される、方法。 - 前記プロモーターが誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターのいずれかである、請求項72に記載の方法。
- 請求項64に記載の方法によって調製される前記連結した核酸セグメントを含有する、組成物。
- 請求項64に記載の方法によって調製される前記連結した核酸セグメントを含む、組換え宿主細胞の集団。
- 組換え宿主細胞の集団を作製する方法であって、該方法は、請求項64に記載の方法によって調製される前記連結した核酸セグメントを、宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
- nが2よりも大きい整数である、n個の核酸セグメントを連結する方法であって、該方法は:
(a)各セグメントが、2つの組換え部位によって隣接される、1〜n番目の核酸セグメントを提供する工程であって、ここで、i番目のセグメントに隣接する該2つの組換え部位の一方(ni)が、ni−1番目のセグメントに隣接する該組換え部位の1つと反応し、そして該i番目のセグメントに隣接する他方の組換え部位が、ni+1番目のセグメントに隣接する該組換え部位の1つと反応するように、該組換え部位が選択される、工程;および、
(b)該セグメントを連結させる条件下で、該セグメントを1つ以上の組換えタンパク質と接触させる、工程、
を包含する、方法。 - 請求項77に記載の方法であって、ここで前記組換えタンパク質が、以下:
(a)Cre;
(b)Int;
(c)IHF;
(d)Xis;
(e)Fis;
(f)Hin;
(g)Gin;
(h)Cin;
(i)Tn3レソルバーゼ;
(j)TndX;
(k)XerC;および、
(l)XerD、
からなる群より選択される1つ以上のタンパク質を含む、方法。 - 各々と組換わる前記組換え部位が、同一の7つの塩基対重複領域を有するatt部位を含む、請求項77に記載の方法。
- 請求項79に記載の方法であって、ここで、各々と組換わる前記組換え部位の前記7つの塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下:
(a)AAA;
(b)AAC;
(c)AAG;
(d)AAT;
(e)ACA;
(f)ACC;
(g)ACG;
(h)ACT;
(i)AGA;
(j)AGC;
(k)AGG;
(l)AGT;
(m)ATA;
(n)ATC;
(o)ATG;および、
(p)ATT、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 請求項79に記載の方法であって、ここで、各々と組換わる前記組換え部位の前記7つの塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下:
(a)CAA;
(b)CAC;
(c)CAG;
(d)CAT;
(e)CCA;
(f)CCC;
(g)CCG;
(h)CCT;
(i)CGA;
(j)CGC;
(k)CGG;
(l)CGT;
(m)CTA;
(n)CTC;
(o)CTG;および、
(p)CTT、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 請求項79に記載の方法であって、ここで、各々と組換わる前記組換え部位の前記7つの塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下:
(a)GAA;
(b)GAC;
(c)GAG;
(d)GAT;
(e)GCA;
(f)GCC;
(g)GCG;
(h)GCT;
(i)GGA;
(j)GGC;
(k)GGG;
(l)GGT;
(m)GTA;
(n)GTC;
(o)GTG;および、
(p)GTT、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 請求項79に記載の方法であって、ここで、各々と組換わる前記組換え部位の前記7つの塩基対重複領域の最初の3つのヌクレオチドが、以下:
(a)TAA;
(b)TAC;
(c)TAG;
(d)TAT;
(e)TCA;
(f)TCC;
(g)TCG;
(h)TCT;
(i)TGA;
(j)TGC;
(k)TGG;
(l)TGT;
(m)TTA;
(n)TTC;
(o)TTG;および、
(p)TTT、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 工程(b)において連結された前記核酸セグメントをベクターに導入する工程をさらに包含する、請求項77に記載の方法。
- 前記連結された核酸セグメントが、環状分子を形成するために分子内組換えを起こす請求項77に記載の方法。
- 前記環状分子を形成するために組換えを起こす前記組換え部位が、1つ以上の前記核酸セグメントの5’末端および3’末端に位置する、請求項85に記載の方法。
- 1つ以上の前記核酸セグメントが選択マーカーをコードする、請求項77に記載の方法。
- 1つ以上の前記核酸セグメントが、複製起点を含む、請求項77に記載の方法。
- いくつかまたは全ての前記核酸セグメントが、1つ以上のライブラリーの核酸分子を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記1つ以上のライブラリーが、抗体分子の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項77に記載の方法。
- 少なくとも1つ以上の前記核酸セグメントが、抗体分子の可変ドメインを結合するためのポリペプチドリンカーをコードする、請求項90に記載の方法。
- 前記1つ以上のライブラリーが、抗体軽鎖および抗体重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項91に記載の方法。
- 1つ以上の同定可能な活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためにスクリーニングする工程をさらに含む、請求項77に記載の方法。
- 前記1つ以上の同定可能な活性が、1つ以上の抗原に対する結合特異性を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記1つ以上の同定可能な活性が、酵素活性を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記1つ以上の同定可能な活性が、選択マーカーと関係する活性を含む、請求項93に記載の方法。
- 少なくとも2つの前記核酸セグメントが、同じ生化学的経路または生物学的プロセスに関与する発現産物をコードする、請求項77に記載の方法。
- 前記核酸セグメントが、多量体酵素複合体の少なくとも2つの異なるサブユニットをコードする、請求項97に記載の方法。
- 前記核酸セグメントが、同じ生化学的経路において反応に関与する少なくとも2つの異なる酵素をコードする、請求項77に記載の方法。
- 前記生化学的経路が、抗生物質または炭水化物の産生を引き起こす、請求項77に記載の方法。
- 請求項77に記載の方法によって連結される核酸セグメントを含有する、組成物。
- 請求項77に記載の方法によって連結される核酸セグメントを含む、組換え宿主細胞の集団。
- 組換え宿主細胞の集団を作製する方法であって、該方法は、請求項77に記載の方法によって連結される核酸セグメントを宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
- 細胞の特性を変化させる方法であって、該方法は、請求項77に記載の方法によって連結される核酸セグメントを該細胞に導入する工程を包含する、方法。
- 前記生化学的経路が、タンパク質の翻訳後の改変を引き起こす、請求項99に記載の方法。
- 前記翻訳後の改変が、糖鎖形成またはシアル化である、請求項105に記載の方法。
- 前記細胞が細菌性細胞である、請求項106に記載の方法。
- タンパク質を合成する方法であって、該方法は:
(a)核酸分子を提供する工程であって、該核酸分子は、停止コドンが後に続くコード配列を含み、ここで、該核酸分子は少なくとも1つの組換え部位によって隣接される、工程;
(b)ベクターを提供する工程であって、該ベクターは少なくとも1つ以上の組換え部位およびコード配列を含む、工程;
(c)該核酸分子が該ベクターに挿入され、インフレームで連結される前記2つのコード配列を有する改変型ベクターを産生するような組換えを生じる、工程;
(d)該改変型ベクターで、サプレッサtRNAを発現する宿主細胞を形質転換する、工程;および、
(e)該コード配列の両方の少なくとも一部分によってコードされる融合タンパク質が産生されるような、該2つのコード配列の発現を引き起こす、工程、
を包含し、ここで、該核酸分子または該ベクターのいずれかが、少なくとも1つの抑制停止コドンを含む、方法。 - 前記停止コドンがアンバーコドン、オパールコドンおよびオーカーコドンからなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
- 前記ベクターが、少なくとも1つのサプレッサtRNA分子をコードする遺伝子を含む、請求項108に記載の方法。
- 前記宿主細胞の染色体が、少なくとも1つのサプレッサtRNA分子をコードする遺伝子を含む、請求項108に記載の方法。
- 請求項108に記載の方法であって、該方法は、核酸分子で前記宿主細胞を形質転換する工程をさらに包含し、該核酸分子は、少なくとも1つのサプレッサtRNA分子をコードする遺伝子を含む、方法。
- 前記融合タンパク質が、前記ベクターの少なくとも一部分によってコードされるN末端タグまたはC末端タグを含む、請求項108に記載の方法。
- 請求項113に記載の方法であって、前記タグが以下:
(a)グルタチオンSトランスフェラーゼ;
(b)β−グルクロニダーゼ;
(c)緑色蛍光タンパク質;
(d)黄色蛍光タンパク質;
(e)赤色蛍光タンパク質;
(f)シアン蛍光タンパク質;
(g)マルトース結合タンパク質;
(h)His6タグ;および、
(i)エピトープタグ、
からなる群から選択される、方法。 - 細胞または組織における遺伝子発現プロフィールを決定するための方法であって、該方法は:
(a)該細胞または組織から得たRNAから、cDNA分子の少なくとも1つの集団を生じる工程であって、ここで、該集団の個々のcDNA分子は、cDNA分子の同じまたは異なる集団の個々のメンバーに存在する少なくとも1つの組換え部位と組換わり得る、少なくとも2つの組換え部位を含む、工程;
(b)核酸分子を連結させる条件下で、(a)の核酸分子を、1つ以上の組換えタンパク質と接触させる、工程;および、
(c)該連結した核酸分子の配列を決定する、工程、
を包含する、方法。 - 前記連結したcDNA分子が、挿入部位に隣接する配列決定プライマー結合部位を含むベクターに挿入される、請求項115に記載の方法。
- 前記連結したcDNA分子が、attB組換え部位によって分離される、請求項115に記載の方法。
- 各々と組換わる前記attB組換え部位が、7つの塩基対重複領域を有する、請求項117に記載の方法。
- 前記連結したcDNA分子が、前記細胞または組織から得たRNAに対応する、約10個と約30個との間のヌクレオチドを含む、請求項115に記載の方法。
- 同じ生物学的プロセスまたは生物学的経路に関与する遺伝子産物をコードする、2つ以上の核酸セグメントを含む核酸分子を調製および同定する方法であって、該方法は:
(a)核酸分子の第1の集団を提供する工程であって、該核酸分子は、該第1の集団における他の核酸分子と組換わり得る、1つ以上の組換え部位を含む、工程;
(b)該核酸分子を組換えさせ、そして核酸分子の第2の集団を作製させる条件下で、1つ以上の組換えタンパク質と該第1の集団の該核酸分子とを接触する、工程;および、
(c)核酸分子の該第2の集団をスクリーニングし、同じプロセスまたは経路に関与する2つ以上の産物をコードする核酸分子を同定する、工程、
を包含する、方法。 - 同じプロセスまたは経路に関与する2つ以上の産物をコードする前記核酸分子が、タンパク質またはタンパク質複合体の2つの異なるドメインをコードする、請求項120に記載の方法。
- 前記タンパク質が一本鎖抗原結合タンパク質である、請求項121に記載の方法。
- 請求項122に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質複合体は、抗体分子または多価抗原結合タンパク質を含み、該抗体分子または該多価抗原結合タンパク質は少なくとも2つの一本鎖抗原結合タンパク質を含む、方法。
- 請求項120に記載の方法によって産生される、核酸分子。
- 支持体であって、該支持体は少なくとも1つの第1の核酸分子を含み、ここで、該第1の核酸分子は、1つ以上の組換え部位またはその一部分を含む、支持体。
- 前記第1の核酸分子の組換え部位を介して前記支持体に結合する、少なくとも1つの第2の核酸分子、または少なくとも1つのペプチドもしくはタンパク質分子をさらに含む、請求項125に記載の支持体。
- 組成物であって、該組成物は、請求項125に記載の前記支持体および少なくとも1つの組換え部位もしくはその一部分を有する、少なくとも1つの第2の核酸分子、またはタンパク質もしくはペプチド分子を含有する、組成物。
- 1つ以上の核酸分子、タンパク質もしくはペプチド分子、または他の化合物を、支持体に付着または結合する方法であって、該方法は:
(a)少なくとも1つの核酸分子、タンパク質もしくはペプチド分子、他の化合物あるいはこのような分子または化合物の集団を得る工程であって、該化合物は、少なくとも1つの組換え部位を含む、工程、および支持体を得る工程であって、該支持体は少なくとも1つの組換え部位を含む、工程;ならびに、
(b)少なくとも1つの核酸分子、タンパク質もしくはペプチド分子、他の化合物、あるいはこのような分子または化合物の集団のいくつかまたは全ての該組換え部位を、該支持体を構成する該組換え部位の全てまたは一部分と組換えさせる、工程、
を包含する、方法。 - 各々と組換わる前記組換え部位が、同一の7つの塩基対重複領域を有するatt部位を含む、請求項128に記載の方法。
- 1つ以上の核酸分子を前記支持体に付着または結合する工程を包含する、請求項128に記載の方法。
- 1つの核酸分子のみが前記支持体に直接的に連結される、請求項128に記載の方法。
- 前記核酸分子がミクロアレイを形成する、請求項131に記載の方法。
- 前記ミクロアレイがDNAチップを形成する、請求項132に記載の方法。
- 請求項128に記載の方法によって調製される、支持体。
- 固体または半固体のいずれかである、請求項134に記載の支持体。
- 2つ以上の目的分子または目的化合物を連結または結合する方法であって、該方法は:
(a)少なくとも第1および第2の目的分子または目的化合物を提供する工程であって、該第1および第2の目的分子または目的化合物の各々は、少なくとも1つの組換え部位を含む、工程;および、
(b)該第1の目的分子または目的化合物のいくつかまたは全ての該組換え部位を、該第2の目的分子または目的化合物のいくつかまたは全ての該組換え部位と組換えさせる、工程、
を包含する、方法。 - 請求項136に記載の方法であって、該方法は核酸を付着する工程をさらに包含し、該核酸は、前記第1および第2の目的分子または目的化合物に対する組換え部位を含む、方法。
- 請求項136に記載の方法であって、ここで、前記目的分子または目的化合物の少なくとも1つが、以下:
(a)炭水化物;
(b)ステロイド;および、
(c)脂質、
からなる群より選択される分子または化合物である、方法。 - 核酸セグメントを連結、欠失または置換するためのキットであって、該キットは、(1)1つ以上の組換えタンパク質または1つ以上の組換えタンパク質を含有する組成物、(2)少なくとも2つの異なる組換え特異性を有する1つ以上の組換え部位を含む、少なくとも1つの核酸分子、(3)以下:
(a)さらなる組換え部位を含む核酸分子;
(b)リガーゼ活性を有する1つ以上の酵素;
(c)ポリメラーゼ活性を有する1つ以上の酵素;
(d)逆トランスクリプターゼ活性を有する1つ以上の酵素;
(e)制限エンドヌクレアーゼ活性を有する1つ以上の酵素;
(f)1つ以上のプライマー;
(g)1つ以上の核酸ライブラリー;
(h)1つ以上の支持体;
(i)1つ以上の緩衝液;
(j)1つ以上の界面活性剤または界面活性剤を含む溶液;
(k)1つ以上のヌクレオチド;
(l)1つ以上の終止因子;
(m)1つ以上のトランスフェクション試薬;
(n)1つ以上の宿主細胞;および、
(o)キット成分を使用するための指示書、
からなる群から選択される1つ以上の成分、
を含む、キット。 - 前記組換え部位が、少なくとも3つの異なる組換え特異性を有し、その各々が異なる7つの塩基対重複領域を有するatt部位を含む、請求項139に記載のキット。
- 1つ以上の組換えタンパク質を含有する前記組成物が、att部位の間の組換えに触媒作用を及ぼし得る、請求項139に記載のキット。
- 前記組成物が、BP反応、LR反応またはBP反応とLR反応との両方に触媒作用を及ぼし得る、1つ以上の組換えタンパク質を含有する、請求項139に記載のキット。
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