JP4731078B2 - 転位および組換えを使用して核酸分子を操作および配列決定する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、概して、組換えＤＮＡ技術に関する。より詳細には、本発明は、概して、核酸分子の構築および操作において使用するための組成物、キットおよび方法に関する。本発明の方法は、インビトロまたはインビボの組み込みおよび組換えの事象を使用して、所望の核酸分子を構築および／または選択することを包含する。この所望の核酸分子は、多数の分子生物学技術（配列決定技術、操作および変異誘発を含む）によってさらに操作され得る。
【０００２】
（関連する分野）
（部位特異的リコンビナーゼ）
部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物（例えば、ウイルスおよび細菌）において存在するタンパク質であり、そしてエンドヌクレアーゼおよびリガーゼの両方の特性を有すると特徴づけられた。これらのリコンビナーゼは、（いくつかの場合において関連タンパク質とともに）ＤＮＡにおける塩基の特異的な配列を認識し、そしてこれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換する。このリコンビナーゼおよび関連タンパク質は、総称して、「組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ぶ（例えば、以下を参照のこと：Ｌａｎｄｙ，Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３））。
【０００３】
種々の生物由来の多くの組換え系が記載されている。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）；Ｍａｅｓｅｒ ａｎｄ Ｋａｈｎｍａｎｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６）（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６）；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：９３０（１９９９））。おそらく、これらのうち最もよく研究されたのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７（１９９３））、バクテリオファージＰＩからのＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（Ｈｏｅｓｓ ａｎｄ Ａｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）Ｉｎ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４．Ｅｄｓ．：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，ＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．９０−１０９）、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２９：２２７−２３４（１９８２））である。
【０００４】
（トランスポゾン）
トランスポゾンは、移動性遺伝エレメントである。トランスポゾンは、構造的に可変性であり、単純または複合体（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として記載されるが、代表的に、逆方向に構成されるＤＮＡ配列が隣接する転位触媒酵素（トランスポザーゼと呼ばれる）をコードする。トランスポゾンの特性のより詳しい議論について、以下を参照することができる：Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．Ｊ．Ｓｈｅｒｒａｔｔ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）ａｎｄ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ，Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｈｏｗｅ，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ。これらの文献は、両方とも、具体的に参考として援用される。
【０００５】
トランスポゾンは、標的ＤＮＡ配列にＤＮＡを挿入するために使用されている。一般的規則として、トランスポゾンの標的ＤＮＡへの挿入は、無作為事象である。この規則の一つの例外は、トランスポゾンＴｎ７の挿入である。トランスポゾンＴｎ７は、それ自体をＥ．ｃｏｌｉゲノムにおける特定の部位へと、その生活環の一部として組み込む（Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ａ．Ｅ．，およびＣｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．,Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３：４８６−４９０，１９９８，これは本明細書において具体的に参考として援用される）。この部位特異的な挿入は、バキュロウイルスゲノムを操作するためにインビボで使用されてきた（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３）。これは、本明細書において参考として具体的に援用される）。Ｔｎ７のこの部位特異性は、その特徴がアクセプターＤＮＡ分子における無作為位置への移動である転位エレメントには珍しい。この出願の目的のために、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）とは、そうではないと特定しない限り無作為または準無作為の移動をいうが、他方、組換えは、部位特異的な組換え事象をいうために使用される。従って、部位特異的なＴｎ７のａｔｔ Ｔｎ７部位への挿入は、組換え事象と称されるが、他方、Ｔｎ７の無作為挿入は、転位事象と称される。
【０００６】
Ｙｏｒｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（８）：１９２７−１９３３，（１９９８））は、Ｔｎ５を用いたプラスミド事象内の分子内転位に基づくネスティッド欠失の生成のためのインビトロ方法を開示する。２つの１９塩基対Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列および標的ＤＮＡ配列に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を含むベクターは、精製されたトランスポザーゼタンパク質の存在下でインビトロでインキュベートされた。使用された低濃度のＤＮＡの条件下で、分子内転位反応が優先し、そしてこれを使用して標的ＤＮＡにおけるネスティッド欠失のセットが首尾よく生成された。この著者は、認識配列に隣接する３つすべての読み枠に終止シグナルを含めることによって、この系がこの標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質においてＣ末端短縮型を生成するために使用され得ることを示唆した。さらに、この著者は、Ｈｉｓタグおよびキナーゼ領域を含めることによって、さらなる分析のためのＮ末端欠失タンパク質を生成するために使用され得ることを示唆した。
【０００７】
Ｄｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：３７６５−３７７２（１９９４）および米国特許第５，６７７，１７０号および同第５，８４３，７７２号（これらはすべて、本明細書において参考として具体的に援用される）は、インビトロでレシピエントＤＮＡ分子へとＤＮＡセグメントを挿入するための人工トランスポゾンの構築を開示する。このシステムは、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子の挿入触媒酵素を、トランスポザーゼ活性の供給源として利用する。目的のＤＮＡセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン様のエレメントＴＹ１の末端の間にクローニングされる。ＴＹ１挿入触媒酵素の存在下で、得られるエレメントは、第二の標的ＤＮＡ分子に無作為に組み込まれる。
【０００８】
（組換え部位）
上記の組換えタンパク質によって媒介される組換え反応の重要な特徴は、組換え反応に関与するＤＮＡ分子における、しばしば「組換え部位」と呼ばれる、認識配列である。これらの組換え部位は、組換えの間の組換えタンパク質によって認識および結合される、関与核酸分子におけるＤＮＡの異なる切片またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、３４塩基対配列であり、８塩基対のコア配列に隣接する、２つの１３塩基対の反転反復（これは、リコンビナーゼ結合部位として働く）からなる。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例としては、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲの配列が挙げられる。これは、組換えタンパク質１Ｉｎｔにより認識される。ａｔｔＢは、約２５塩基対の配列であり、２つの９塩基対コア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対重複領域を含むが、他方ａｔｔＰは、約２４０塩基対配列であり、これは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型Ｉｎｔ結合部位ならびに補助的タンパク質のための組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）（Ｘｉｓ）のための部位を含む。以下を参照のこと：Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）。
【０００９】
（核酸配列決定）
歴史的には、２つの主要な技術を使用して核酸が配列決定されてきた。共同開発者に従い「ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ配列決定」とよばれる第一の方法において（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−５６４，１９７７）、ＤＮＡは放射標識され、４つのサンプルへと分割され、そしてＤＮＡの特定のヌクレオチド塩基を選択的に破壊し、そして破壊の部位で分子を切断する化学物質で処理する。ゲル電気泳動およびそのゲルをＸ線フィルムに露出することによって、得られたフラグメントを異なるバンドに分離することによってもとのＤＮＡ分子の配列がフィルムから読まれ得る。この技術を使用して、特定の複雑なＤＮＡ分子の配列が決定された。これには、霊長類ウイルスＳＶ４０（Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３−１２０，１９７８；Ｒｅｄｄｙ，Ｖ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００：４９４−５０２，１９７８）および細菌プラスミドｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｇ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３：７７−９０，１９７９）が含まれる。その共同開発者に従い「Ｓａｎｇｅｒ配列決定」と称される配列決定のための代替技術（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４４−４４８，１９７５）もまた、伝統的に使用されてきた。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を使用する。これは、反応を終結させるジデオキシヌクレオシド三リン酸（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）および短いプライマー（これらのいずれかは検出可能に標識され得る）の混合物と組み合わせたとき４つのジデオキシ塩基の一つで特異的に終結する新たに合成された、一連のＤＮＡフラグメントを生じる。次いで、これらのフラグメントは、ゲル電気泳動で解像され、そしてその配列は、上記のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ配列決定について記載されるように、決定される。４つの別個の反応（各々ｄｄＮＴＰについて一つ）を行うことによって、さらにかなり複雑なＤＮＡ分子の配列が迅速に決定され得る（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６５：６７８−６９５，１９７７ ；Ｂａｍｅｓ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５３８−５５６，１９８７）。
【００１０】
数年間にわたりこれらの配列決定法が使用されてきたが、Ｍａｘａｍ／ＧｉｌｂｅｒｔおよびＳａｎｇｅｒの配列決定法は、しばしば、時間がかかり、高価であり、そして配列決定に誤差が生じやすい。より最近になって、核酸分子のヌクレオチド配列の決定は、増幅ベースの方法を用いて行われている。そのような方法で最も一般的に使用されるものは、おそらく、自動化されたＰＣＲ方法論において使用される比較的高温で活性を保持するＤＮＡポリメラーゼのような、特に熱安定性酵素を用いたＭｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）によって記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に依存する（以下を参照のこと：Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）。核酸配列決定、特にジデオキシ配列決定（例えば、サイクル配列決定）の自動化方法の増幅ベースの方法は、標準的なＳａｎｇｅｒ配列決定において生成される単一のオリゴヌクレオチドとは対照的に、各々のテンプレートから多数のジデオキシ終結したオリゴヌクレオチドの合成を生じる単一プライマーおよびｄｄＮＴＰと組み合わせたＰＣＲ適用における熱安定性ポリメラーゼおよび温度サイクルを利用する。１テンプレートあたりの多数のオリゴヌクレオチドの合成により提供される感受性の上昇に加え、自動化配列決定におけるより高い変性温度の使用はまた、配列決定効率を改善し（すなわち、より少ない誤取り込みが生じる）、そしてＣＧリッチであるか、または顕著な二次構造を含むテンプレートの配列決定を可能にする。
【００１１】
標準的なＳａｎｇｅｒの配列決定方法および増幅ベースの技術の両方の重要な要件は、その配列決定プライマーがハイブリダイズする部位におけるＤＮＡ配列の知見である。目的のフラグメントに隣接するベクターにおけるプライマー部位を用いて既知ベクター中の小さなフラグメントを配列決定することが可能である一方で、より大きなフラグメントの配列決定は、いくらかよりやっかいである。
【００１２】
この問題を回避する１つの可能な方法は、初期配列決定反応において決定される配列に相補的な配列を有する新たなプライマーを合成することである。この技術は、しばしば、目的の遺伝子を「ウォーキング」すると称される。
【００１３】
遺伝子をウォーキングすることの代替は、目的のＤＮＡ分子におけるネスティッド欠失のセットを作製することである（以下を参照のこと：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ ２８（３）：３５１−９，１９８４）。挿入物を含むベクターは、その挿入物とそのベクターとの一つの接合点において切断される。次いで、得られた線状ＤＮＡ分子を、その挿入物の末端から塩基を除去するエキソヌクレアーゼとともにインキュベートする。インキュベーション時間を変動させることにより、挿入物から取り除かれる塩基数を変動させ得る。これにより、その挿入物の漸進的に少ない一連のＤＮＡが生じる。ヌクレアーゼ処理したＤＮＡの連結および形質転換の後、クローンの収集物を、ベクターにおけるプライミング部位に隣接する新たな配列を有するように単離し得これにより挿入物の全体を、消化の部位に隣接するベクター配列にハイブリダイズするプライマーを用いて配列決定することを可能にする。
【００１４】
最近開発された技術において、トランスポゾンを用いて、未知配列のより大きなＤＮＡ分子中に既知の小ＤＮＡ分子が挿入されている。既知配列をプライマー認識部位として用い、そしてその挿入されたトランスポゾンに隣接するより大きなＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が、標準的な配列決定方法を用いて決定され得る。Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１２４７−１２５０，，１９９０）は、標的ＤＮＡ中へのｇｄトランスポゾンのインビボ挿入を利用した、そのような一つの系を記載する。目的のＤＮＡは、「ミニプラスミド」中にクローニングされて、ベクターＤＮＡではなく標的ＤＮＡ中にトランスポゾンの挿入を変更する。
【００１５】
配列決定適用のためのインビトロトランスポゾン挿入系は、米国特許第５，７２８，５５１号中でＤｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．により記載されている。これは、本明細書において具体的に参考として援用される。「プライマーアイランド」人工トランスポゾン（ＰＡＲＴ）と呼ばれる人工トランスポゾンは、トランスポザーゼの存在下で標的ＤＮＡを含むベクターと反応される。得られた集団をスクリーニングして、標的ＤＮＡ中のＰＡＲＴを含む分子を同定し、そして標的中のＰＡＲＴの位置がマッピングされる。標的ＤＮＡ中に適切に間隔を開けられたＰＡＲＴを有するベクターの集団が選択され、そして標的のＤＮＡ配列がＰＡＲＴ中の配列にハイブリダイズするプライマーを用いて決定される。
【００１６】
標的ＤＮＡ分子中にトランスポゾンを挿入することが可能である一方で、この技術に基づく配列決定技術は、顕著な限定という欠点を有する。ベクターを含む標的ＤＮＡ中にトランスポゾンを挿入することの無作為性の特性により、ベクター中へのトランスポゾンの頻繁な挿入も生じる。結果として、現在の方法は、標的ＤＮＡ中に適切な挿入物を含むクローンを同定するため、またはベクターの反復配列決定を受容するために、面倒なソート手順（例えば、制限マッピングによる）を必要とする。両方の方法が、配列決定計画の努力および専門性に対して顕著に増強する。
【００１７】
従って、先行技術の方法に制限を克服し、より迅速で、効率よく、かつ経済的な、核酸分子のヌクレオチド配列決定を提供する代替の配列決定系について、当該分野において必要性が存在する。この必要性および他の必要性は、本発明によって満たされる。
【００１８】
（発明の簡単な要旨）
本発明は概して、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。この核酸は、少なくとも１つの組み込み配列および少なくとも１つの組換え部位を含み、その組換え部位は、その組み込み配列の中および／または外側（例えば、隣接する）に配置され得る。本発明に従って、組み込み配列は、組換えまたは組み込みにより、目的の核酸分子の一部になる、任意の核酸分子を包含し得る。組み込み配列の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：トランスポゾン、挿入配列、組み込みウイルス、ホーミングイントロン、または他の組み込みエレメント、あるいはこれらの種々の組合せ。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組み込み配列は、挿入配列またはトランスポゾンあるいはその誘導体であり得る。１つの局面において、少なくとも２つの組換え部位（これは、同じまたは異なり得る）は、組み込み配列の外側に核酸分子中に含まれ、そして好ましくはその組み込み配列の両側に隣接する。別の局面において、少なくとも２つの組換え部位（これは、同じまたは異なり得る）は、組み込み配列中に含まれる。本発明は具体的には、組換え部位に隣接する標的核酸配列、およびその標的配列中に挿入される少なくとも１つの組み込み配列を含む、核酸分子（好ましくは、ベクター）を提供する。本発明に従って、組換え配列を使用して、目的の分子を有する配列を交換し得、目的の分子から配列を欠失させ得、目的の分子中に配列を組み込み得、または他の方法で、目的の分子を同定し得、操作し得、分析し得および／もしくは選択し得る。
【００１９】
別の局面において、相同組換えを利用した種々の戦略が標的配列中に目的のＤＮＡセグメントを挿入するためのトランスポゾンに対する代替物を提供し得る。これらは、インビボまたはインビトロで達成され得る。Ｙｕ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０００ Ｍａｙ ２３；９７（１１）：５９７８−８３）は、標的配列に対する相同性を含むＤＮＡセグメントは、所定のＤＮＡ配列中に効率的に組み込まれ得ることが示された。そのようなアプローチを用いて組換え部位、選択マーカー、機能性エレメントを標的配列の規定された位置中に組み込み得る。同様に、インビトロ異種二重鎖形成および修復反応を用いることのいくつかの報告は、標的配列中に遺伝子および他のＤＮＡセグメントを挿入するために使用されている（Ｖｏｌｋｏｖ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９ Ｓｅｐ １５；２７（１８）：ｅｌ８）。従って、組換え部位に隣接する完全または部分的な相同性を規定するオリゴヌクレオチドを用いて、指向される、部分的に指向される、または無作為の組み込み部位の挿入物を含む標的配列の集団を生成し得る。
【００２０】
本発明において使用するための組換え部位は、組換えタンパク質による組換え反応に関与する核酸分子における任意の認識配列であり得る。１を超える組換え部位を利用する本発明のこれらの実施形態において、そのような組換え部位は、同じかまたは異なり得、そして互いに組換わり得るか、または互いに組換わらなくてもよく、実質的に組換わらなくてもよい。本発明によって企図される組換え部位はまた、野生型または天然に存在する組換え部位の変異体、誘導体または改変体を包含する。好ましい組換え部位の改変は、組換えを増強するものを包含する。そのような増強は、実質的に以下からなる群より選択される：（ｉ）組み込み組換え（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を優先させること；（ｉｉ）除去組換え（ｅｘｃｉｓｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を優先させること；（ｉｉｉ）宿主因子に対する要件を軽減すること；（ｉｖ）同時組み込み（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）または生成物形成の効率の増加；および（ｖ）同時組み込みおよび／または生成物形成の特異性の増加。好ましい改変としては、組換え特異性を増強する改変、組換え部位またはその部分（または組換え部分もしくはその部分を含む核酸分子）が増幅（例えば、ＰＣＲによる）についてのプライマー部位として働くことを可能にする改変、１つ以上の終止コドンを取り去る改変、ならびに／あるいはヘアピン形成を回避する改変が挙げられる。本発明に従って使用される好ましい組換え部位としては、ａｔｔ部位、ＦＲＴ部位およびｌｏｘ部位、またはそれらの変異体、誘導体、フラグメント、部分および改変体（またはそれらの組合せ）が挙げられる。本発明により企図される組換え部位はまた、そのような組換え部位の一部を含む。
【００２１】
本発明の組み込み配列は、１つまたは多数のエレメントおよび／もしくは機能的配列および／もしくは部位（またはその組合せ）を包含し得る。これらには、目的の１つ以上の配列決定プライマーもしくは増幅プライマーに相補的な１つ以上の配列（例えば、プライマー部位または増幅プライマー部位を配列決定すること）、１つ以上の選択マーカー（例えば、毒性遺伝子、抗生物質耐性、遺伝子など）、１つ以上の転写部位もしくは翻訳部位もしくはシグナル、１つ以上の転写終結部位もしくは翻訳終結部位、１つ以上の複製起点、１つ以上の組換え部位（またはその部分）などが含まれる。１つの実施形態において、組み込み配列は、１つ以上の組換え部位（またはその部分）および１つ以上の選択マーカーを含み得る。従って、本発明に従って、組み込み配列を使用して、１つ以上の組換え部位（もしくはその部分）または他の目的の部位もしくは配列を任意の核酸分子に組み込み得る。組み込み配列は、本発明に従って、インビボまたはインビトロの組み込みにより導入され得る。本発明の方法は、同じであっても異なっていてもよい、１つ以上の組み込み配列を利用し得る。従って、異なる機能部位もしくはシグナルを伴う異なる配列の使用は、本発明により企図される。
【００２２】
本発明はまた、標的核酸配列に、組み込み配列を挿入する方法を提供する。この方法は、組換え部位に隣接する目的の標的配列を、その標的配列中に組み込みもしくは挿入することを少なくとも１つのその組み込み配列に生じさせるに十分な条件下で、少なくとも１つの組み込み配列とともにインキュベートする工程、および必要に応じて、その少なくとも１つの組み込み配列を含むその標的配列を選択する工程を包含する。本発明に従って、そのような標的配列は、好ましくは、ベクターにより含まれ、そして好ましい組み込み配列は、１つ以上のトランスポゾンである。少なくとも１つの組み込み配列を含む標的配列の選択は、好ましくは、目的の標的配列に隣接する組み込み部位の使用により達成され得る。好ましい局面において、組換えクローニングを用いて、組み込み配列を含む標的配列を転移および選択する。本発明に従って、そのような方法は、好ましくは、以下の工程を包含する：
（ａ）組換え部位またはその一部に隣接し、かつ少なくとも１つの組み込み配列もしくはその一部を含む標的配列を、第一核酸分子から第二核酸分子へと転移する工程；および
（ｂ）組換え部位またはその一部に隣接するこの標的配列を含むその第二核酸分子を選択する工程。
【００２３】
好ましい局面において、その第一および／または第二の核酸分子は、ベクターである。例えば、この第二の核酸分子の選択は、組み込み配列および／または標的配列によって含まれる、１つ以上の選択マーカーを用いることにより達成され得る。第二の核酸分子によって含まれる１つ以上の選択マーカーはまた、本発明に従った選択スキームによって利用され得る。あるいは、またはそれに加え、ネガティブ選択もまた使用して、目的の標的配列を含まない第二の核酸分子を排除選択（ｓｅｌｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ）し得る。好ましい局面において、組換えクローニングを使用して、少なくとも１つの組み込み部位を含む標的配列をベクターに転移する。好ましくは、そのベクターまたは組み込み配列によって含まれる選択マーカーを組み合わせて使用して、所望の生成物である、標的配列／組み込み配列を含むベクターを選択する。このようにして、所望されない生成物、例えば、挿入された組み込み配列のない標的配列を含むベクターが選択排除される。
【００２４】
本発明のさらなる局面において、組み込み配列を含む選択された標的配列は、標的配列のさらなる操作のために使用される。そのような局面において、本発明は、組み込み配列の無作為組み込みによる所望の配列の無作為挿入を可能にする。これを使用して、標的配列を操作または分析し得る。例えば、組み込み配列により含まれる配列決定プライマー部位の標的配列への無作為挿入により、その標的配列の種々の部分または全部の配列決定を可能にする。１つの局面において、標的からの配列情報の一部を使用して、そのような部分配列の配列重複を分析および比較することによって、その標的の核酸配列全体を決定し得る。あるいは、組み込み配列により含まれる増幅プライマー部位の標的配列中への無作為挿入により、その標的配列の部分または全部の増幅が可能となるが、他方、組み込み配列により含まれる転写配列または制御配列の無作為挿入により、標的配列の種々の部分または全部からのタンパク質またはポリペプチドの発現が可能となる。同様に、遺伝子（例えば、ＧＵＳ、ＧＳＴ、ＧＦＰなど）または遺伝子の一部の無作為挿入により、目的の標的配列についての遺伝子融合物の集団を作製することが可能になる。さらに、組み込み配列により含まれる組換え部位（またはその部分）の無作為挿入によって、目的の標的配列の欠失変異体の集団を作成することが可能になる。必要に応じて、この標的配列の欠失部分がクローニングされ得る。従って、本発明は、標的核酸分子の全部または一部を操作または分析（例えば、配列決定、増幅、欠失、変異、発現分析など）する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）組換え部位またはその部分に隣接し、そして少なくとも組み込み配列またはその一部を含む、標的配列を選択する工程；および
（ｂ）その組み込み配列を含むその標的配列の少なくとも一部を、操作または分析（例えば、配列決定、増幅、変異、発現分析など）する工程。
【００２５】
好ましい局面において、そのような操作または分析は、組み込み配列内に含まれる１つ以上の部位によって開始されるか、または達成される。
【００２６】
配列決定工程は、本発明に従って、以下の工程を包含し得る：
（ａ）配列決定されるべき核酸分子を、１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結因子と混合して混合物を形成する工程；
（ｂ）配列決定されるべきその分子の全部または一部に相補的な分子の集団を合成するに十分な条件下でその混合物をインキュベートする工程；および
（ｃ）その集団を分離して、配列決定されるべきその分子の全部または一部のヌクレオチド配列を決定する工程。
【００２７】
より詳細には、本発明の配列決定方法は以下の工程を包含する：
（ａ）第一の核酸分子に対してプライマーをハイブリダイズする工程；
（ｂ）その分子を、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結因子に接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、その第一の核酸分子の全部または一部に相補的な核酸分子の集団を合成するに十分な条件下でインキュベートする工程であって、その合成された分子は、その第一の分子より長さが短く、そしてその合成された分子は、その３’末端に終結因子を含む、工程；および
（ｄ）その第一の分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定され得るようにその合成された分子を大きさにしたがって分離する工程。
【００２８】
本発明はまた、目的の核酸分子において欠失を作製する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：少なくとも第一の組換え部位を含む核酸分子を、少なくとも第二の組換え部位を含む組み込み配列に、その組み込み配列の少なくとも１つがその核酸分子に挿入される条件下で接触する工程、および少なくともその第一の組換え部位および第二の組換え部位の組換えを生じさせ、それによりその核酸分子の少なくとも一部の欠失を生じさせる工程。いくつかの実施形態において、その標的核酸分子の欠失された部分は、クローニングされ得る。好ましい局面において、新たな組換え部位は、欠失の点において作製される。例えば、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の組換えは、ａｔｔＬまたはａｔｔＲの何れかの部位を、その欠失部位において形成し得る。次いで、そのような新たな組換え部位は、そのような新たな組換え部位を含む標的またはベクター配列のさらなる操作のために使用され得る。好ましい局面において、目的の核酸分子は、標的配列を含むベクターであり得る。この局面において、その標的配列および／またはベクター配列は、その第一の組換え部位および組み込み配列を含み得、いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、第二の組換え部位を含む。この局面において、その標的配列は、少なくとも第一の組換え部位を含むベクターへとまず挿入され得る。別の局面において、第一の組換え部位および第二の組換え部位は、１つ以上の組み込み配列によりその標的配列および／またはベクターに取り込まれ得る。標的配列内の１つ以上の位置への組み込み配列の挿入後、欠失変異体の集団は、組換え部位の間の組換えを起こすことによって作製され得る。異なる大きさおよび異なる位置の他の欠失は、標的配列および／または目的のベクター内の異なる位置においてさらなる組換え部位を含ませることによって達成され得る。従って、第三、第四および／または第五の組換え部位は、標的またはベクター配列内に異なる位置に挿入され得る（例えば、そのような異なる組換え部位を含むさらなる組み込み配列による）。そのような部位の間の組換えを起こすことにより、標的またはベクター配列のさらなる欠失の生成が可能になる。例えば、欠失は、第一の組換え部位と第二の組換え部位との間の組換えをまず生じさせて、欠失の点において第一の欠失および新たな組換え部位（第三の組換え部位）を生成すること、標的またはベクターの配列において第四の組換え部位を挿入すること（好ましくは、１つ以上の組換え部位を含む組み込み配列の挿入による）、およびその第三の組換え部位とその第四の組換え部位との間の組換えを起こして第二の欠失を生成させること、およびその欠失の点において新たな組換え部位（例えば、第五の組換え部位）を生成することによって連続的に標的またはベクターの配列において行われ得る。このプロセスは、標的および／または目的のベクター配列において多数の欠失を生成するために任意の多数回反復され得る。
【００２９】
本発明は、目的の核酸分子において配列を置換または交換するための方法を提供する。この方法は、少なくとも第一の組換え部位を含む核酸分子を、少なくとも第二の組換え部位を含む組み込み配列に、その核酸分子にその組換え配列の少なくとも一つが挿入されるような条件下で、接触させる工程、ならびにその第一の組換え部位および第二の組換え部位に隣接するその分子における１つ以上の配列の、組換え部位に隣接する少なくとも第二の核酸分子との置き換えを生じさせる工程を包含する。いくつかの実施形態において、標的配列および第二の核酸分子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、そしてその組換え事象は、コードされたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、同じ読み枠に配置する。そのような第二の分子は、１つ以上の遺伝子または遺伝子の一部を含み得る。好ましい局面において、そのような置換を作製するための目的の核酸分子は、標的配列を含むベクターである。この局面において、その標的配列および／またはベクター配列は、その第一の組換え部位を含み、そして組み込み配列（好ましくは、トランスポゾン）は、第二の組換え部位を含む。この局面において、その標的配列は、少なくとも第一の組換え部位を含むベクター中に挿入され得る。別の局面において、第一の組換え部位および第二の組換え部位は、１つ以上の組み込み配列によって、標的配列および／またはベクターに取り込まれ得る。標的配列内の１つ以上の位置に組み込み配列を挿入した後、融合物の集団は、その第一の組換え部位と第二の組換え部位に隣接する分子が、組換え部位に隣接する第二の核酸分子の集団への置き換えをさせることによって作製され得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、１つ以上の組換え部位は、以下の工程を包含する方法によって、目的の核酸分子に加えられ得る：
（ａ）１つ以上の核酸分子を、１つ以上の組換え部位またはその一部を含む、１つ以上の組み込み配列に接触させる工程；および
（ｂ）この混合物を、組み込み配列を含むその組換え部位のその核酸分子への取り込みをさせるに十分な条件下でインキュベートする工程。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態において、１つ以上の核酸分子は、１つ以上の組み込み配列と、インビトロで接触される。
【００３２】
一旦そのような１つ以上の組換え部位（および／またはその一部）が、目的の核酸分子の取り込まれると、その組換え部位を用いて、そのような組換え部位に隣接する核酸分子を転移させ得る。従って、本発明に従って、組換え部位またはその部分を含む組み込み配列の無作為挿入によって、多数の組換え部位（またはその部分）の、目的の分子への取り込みを可能にする。組換えクローニングを通じたそのような組換え部位の使用は、組換え部位に隣接する分子の一部を１つ以上のベクターに転移させるための方法を提供する。例えば、第一の組換え部位および第二の組換え部位（これは、好ましくは、互いに組換えされない）に隣接する、１つまたは多数の目的の分子は、第三の組換え部位および第四の組換え部位（これは、好ましくは、互いに組換えされない）を含むベクターと、第一の組換え部位が第三の組換え部位との組換え、および第二の組換え部位が第四の組換え部位との組換えを可能にするに十分な条件下で混合する。次いで、ベクターおよび組換え部位に隣接する核酸分子を含む所望の生成物は、本発明に従って選択され得る。好ましい局面において、分子の集団は、１つ以上のベクターへと目的の多数の分子を転移することによって生成され得る。従って、本発明は、出発遺伝子材料の全部または一部の代表であり得るライブラリーの構築を提供する。好ましい局面において、そのようなライブラリーは、本発明を用いてｃＤＮＡ、ゲノムまたは染色体遺伝子材料から調製され得る。
【００３３】
別の局面において、目的の核酸分子に取り込まれる組換え部位は、別個の核酸分子またはベクターへと転移させる必要なしに直接組換えられ得る。従って、組換え部位に隣接する分子は、組換え部位の組換えの際に環状化し得る。好ましくは、環状分子は再環化に際して新たな組換え部位を含む。従って、目的の核酸分子内に配置される第一の組換え部位と第二の組換え部位とを組換えることによって、組換え部位にもともと隣接していた核酸分子を含む新たに環化された分子が生成され得る。好ましい局面において、環化分子は、少なくとも一つの複製起点を含み、その結果、その分子は、宿主細胞において自己複製し得るか、または宿主細胞内においてベクターとして機能し得る。この環化した分子はまた、１つ以上の選択マーカーを含み得る。１つの局面において、１つ以上の複製起点および／または選択マーカーは、１つ以上の組み込み配列により提供される。従って、組換えの際に、その分子は好ましくは、少なくとも一つの組換え部位、少なくとも一つの選択マーカー、目的の核酸分子および１つの複製起点を含む。従って、本発明は、組換え部位を使用して目的の元の核酸分子の部分を含む１つのベクターまたはベクターの集団を生成し得る方法を提供する。このようにして、本発明は、ｃＤＮＡ、ゲノムまたは染色体のＤＮＡのような出発遺伝子材料のライブラリーの効率よい調製を可能にする。
【００３４】
関連する局面において、本発明は、少なくとも環化されるべき分子内の第一の組換え部位および第二の組換え部位を組換えることによって線状核酸分子が環化され得る方法を提供する。好ましくは、第一の組換え部位および第二の組換え部位は、その線状分子の末端またはその付近に配置される。好ましい局面において、その組換え部位は、アダプター（これは、少なくとも一つの組換え部位またはその一部を含む）のその分子の一方または両方の末端への連結によっておよび／または組換え部位またはその一部を含むプライマーを用いてその線状分子を増幅することによって線状分子の末端またはその付近に取り込まれる。あるいは、共有結合したトポイロメラーゼを含むＤＮＡセグメントを使用して、リンカー（例えば、少なくとも一つの組換え部位またはその一部を含むもの）または他のＤＮＡセグメントを他の線状ＤＮＡセグメントの末端に結合し得る（Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２６７８（１９９４））。別の局面において、アダプターの付加およびプライマーを用いた増幅の組合せを用いて、その分子の末端へ組換え部位を取り込ませ得る。このようにして、その線状分子の第一の末端またはその付近に第一の組換え部位を、およびその線状分子の第二の末端またはその付近に第二の組換え部位を含む線状分子が生成され得る。本発明に従って、これらの組換え部位の組換えは、環状分子を提供する。好ましくは、環状分子は、再環化の点において新たな組換え部位を含む。好ましい局面において、環状分子は、複製起点および／または少なくとも一つの選択マーカーを含む。一つの局面において、複製起点、選択マーカー、転写シグナルなどのような１つ以上の機能的部位を含む、一つ以上の組み込み配列は、線状または環化の分子に組み込まれて、そのような分子に機能的配列を提供し得る。別の局面において、組み込み配列（これは、好ましくはトランスポゾンである）は、複製起点、および必要に応じて少なくとも一つの選択マーカーをそのような線状分子または環状分子へと取り込む。
【００３５】
本発明はまた、本発明の方法を実施するため、および特に、核酸を増幅および配列決定する際、欠失を作製する際、変異を生成する際、および目的の核酸分子に組換え部位を挿入する際に使用するためのキットに関する。これらのキットは、本発明の組み込み配列および／またはベクターのような、本発明の１つ以上の核酸分子を含み得る。このようなキットは、必要に応じて、１つ以上のさらなる成分を含み得る。このさらなる成分は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素、１つ以上の適切な緩衝剤、１つ以上のプライマーならびに１つ以上の終結因子（例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド）からなる群より選択される。
【００３６】
本発明の組成物、方法およびキットは、好ましくは、ファージλ部位特異的組換え系、そして最も好ましくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能なＧＡＴＥＷＡＹ^TM組換えクローニング技術を用いて調製および実施される。
【００３７】
本発明の他の好ましい実施形態は、当該分野において知られる事項に鑑み、以下の図面および本発明の説明に鑑み、ならびに特許請求の範囲に鑑み、当業者に明らかである。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の説明において、分子生物学において使用される多数の用語が広汎に利用される。そのような用語によって与えられる範囲を含め、明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００３９】
増幅：本明細書において用いられるとき、増幅は、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、１つ以上の核酸ポリメラーゼまたは１つ以上の逆転写酵素）を使用することにより、ヌクレオチド配列の多数コピーをを増加させるための任意のインビトロ方法である。核酸増幅は、ヌクレオチドのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの分子またはプライマーへの取り込みを生じ、それにより、テンプレートに相補的な新たな核酸分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書において使用されるとき、１つの増幅反応は、多くの回の核酸複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。１つのＰＣＲ反応は、５から１００サイクルのＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。
【００４０】
遺伝子：本明細書において使用されるとき、遺伝子は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含む核酸配列である。それは、プロモーターおよび構造遺伝子ならびにそのタンパク質の発現に関与する他の配列を含む。
【００４１】
宿主：本明細書において使用されるとき、宿主は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意の核酸分子のレシピエントである任意の原核生物または真核生物の生物である。その核酸分子は、構造遺伝子、転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）および／または複製起点（ｏｒｉ）を含み得るがそれらに限定されない。本明細書において使用されるとき、用語「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主」および「組換え宿主細胞」は、互換的に使用され得る。そのような宿主の例について、以下を参照のこと：Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）。
【００４２】
ハイブリダイゼーション：本明細書において使用されるとき、用語ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズすることは、２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）を塩基対合して二本鎖分子を与えることをいう。本明細書において使用されるとき、２つの核酸分子は、塩基対合が、完全に相補的ではなくてもハイブリダイズされ得る。従って、ミスマッチ塩基は、当該分野において周知の適切な条件が使用される場合、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションが妨げられる。いくつかの局面において、ハイブリダイゼーションは、「ストリンジェント条件」下にあるといわれる。本明細書において使用されるとき「ストリンジェント条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液において４２℃での一晩のインキュベーション、続いてそのフィルターを０．１×ＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することを意味する。
【００４３】
取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ）：本明細書において使用されるとき、取り込みは、核酸（例えば、ＤＮＡ）分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００４４】
挿入物：本明細書において使用されるとき、挿入物は、より大きな核酸分子の一部である所望の核酸セグメントである。挿入物は、本発明に従って標的核酸分子であり得る。
【００４５】
挿入物ドナー：本明細書において使用されるとき、挿入物ドナーは、挿入物を有する、本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一方である。挿入物ドナー分子は、組換え部位の両側に隣接する挿入物を含む。挿入物ドナーは、線状であってもよく環状であってもよい。本発明の一つの実施形態において、挿入物ドナーは、環状ＤＮＡ分子であり、そしてさらに、組換えシグナルの外側にクローニングベクター配列を含む（図１を参照のこと）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団を使用して、挿入物ドナーを作製する場合、挿入物ドナーの集団が生成し、そしてこれを本発明に従って使用され得る。
【００４６】
組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）配列：本明細書において使用されるとき、組み込み配列は、標的核酸分子へ無作為に挿入し得る任意のヌクレオチド配列である。組換え配列はまた、移動性の遺伝エレメントとして当該分野において公知である。当業者に公知の任意の組み込み配列を使用して、本発明を実施し得る。これには、以下が挙げられるがそれらに限定されない：トランスポゾン（転位エレメント）、組み込みウイルス（例えば、レトロウイルス）、ＩＳエレメント、レトロトランスポゾン、結合性トランスポゾン、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＰエレメント、細菌ビルレンス因子、または真核生物についての移動性遺伝エレメント（例えば、ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｃ ＩおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）。当業者に公知の他の移動性遺伝エレメントもまた、本発明に従って使用され得る。
【００４７】
ライブラリー：本明細書において使用されるとき、ライブラリーは、核酸分子（環状または線状）の収集物である。１つの実施形態において、ライブラリーは、複数（すなわち、２つ以上）の核酸分子を含み得、これは、一般的な供給源細胞、器官、組織または細胞に由来してもしなくもよい。別の実施形態において、ライブラリーは、生物の核酸内容物の全部または部分または有意な部分（「ゲノム」ライブラリー）の代表物であるか、あるいは細胞、組織、器官または生物において発現された核酸分子の全部または部分または有意な部分（ｃＤＮＡライブラリー）の核酸分子代表物のセットである。他の実施形態において、ライブラリーは、標的内の種々の位置に挿入物を含む標的ＤＮＡ分子を含み得る。ライブラリーはまた、デノボ合成、１つ以上の配列の変異誘発などによって作製される無作為配列を含む。そのようなライブラリーは、１つ以上のベクターに含まれていても含まれていなくてもよい。
【００４８】
ヌクレオチド：本明細書において使用されるとき、ヌクレオチドは、塩基−糖−ホスフェートの組合せである。ヌクレオチドは、核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位である。この用語ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸であるＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはその誘導体を含む。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。この用語ヌクレオチドは、本明細書において使用されるときはまた、ジデオキシリボヌクレオシド（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をも指す。ジデオキシヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるがそれらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、標識されていなくてもよく、周知技術により検出可能に標識されていてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生体発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド：本明細書において使用されるとき、オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と、隣接するヌクレオチドのペントースの５’位との間のホスホジエステル結合によって結合された、ヌクレオチドの共有結合された配列を含む、合成または天然の分子である。
【００５０】
プライマー：本明細書において使用されるとき、プライマーは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の増幅または重合化の間に、ヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長する、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。一つの局面において、そのプライマーは、配列決定プライマー（例えば、ユニバーサル配列決定プライマー）であり得る。別の局面において、そのプライマーは、組換え部位またはその一部を含み得る。
【００５１】
生成物（産物）：本明細書において使用されるとき、生成物は、組換えクローニングプロセス（図１を参照のこと）の間の第二の組換え事象の後に生成される、ＡおよびＤの配列を含む所望の娘分子の生成物である。この生成物は、クローニングまたはサブクローニングされるべき核酸を含む。本発明に従って、挿入ドナーの集団が使用されるとき、生成物分子の得られた集団は、挿入物ドナーの挿入物の集団の全部または一部を含み、そして好ましくは、挿入物ドナー野本の分子の代表的な集合を含む。
【００５２】
プロモーター：本明細書において使用されるとき、プロモーターは、転写調節配列の一例であり、そして詳細には、開始コドンの近位に配置される遺伝子の５’領域として一般的に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写は、プロモーター領域において開始される。抑制プロモーターの転写の速度は、抑制因子に応答して低下する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導因子に応答して上昇する。構成的プロモーターの転写速度は、特に調節されないが、それは、一般的な代謝条件の影響下で変動し得る。
【００５３】
認識配列：本明細書において使用されるとき、認識配列は、タンパク質、化学化合物、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼまたはリコンビナーゼ）が認識し結合する特定の配列である。本発明において、認識配列は、通常組換え部位をいう。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについての認識配列は、ｌｏｘＰであり、これは、３４塩基対配列であり、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の反転反復（これは、リコンビナーゼ結合部位として働く）を含む。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲの配列であり、これは、リコンビナーゼ酵素Ｉインテグラーゼによって認識される。ａｔｔＢは、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対の重複領域を含む、約２５塩基対配列である。ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型Ｉｎｔ結合部位ならびに補助タンパク質である組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）についての部位を含む、約２４０塩基対配列である。以下を参照のこと：Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）。そのような部位はまた、本発明に従って操作されて、本発明の方法における生成物の生産を増強し得る。そのように操作された部位が、組換え反応を不可逆にするＰ１ドメインもＨ１ドメインも含まない場合（例えば、ａｔｔＲまたはａｔｔＰ）、何らかの方法でこれらの部位のドメインが改変されたことを示すためにそのような部位は、ａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’と称する。
【００５４】
組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）タンパク質：本明細書において使用されるとき、組換えタンパク質は、切断または組み込みのタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質であって、１つ以上の組換え部位を含む組換え反応に関与するものを含み、これは、野生型タンパク質（以下を参照のこと：Ｓｅｅ Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３））、またはその変異体、誘導体、フラグメントおよび改変体であり得る。
【００５５】
組換え部位：本明細書において使用されるとき、組換え部位は、組換えタンパク質によって組み込み／組換えの反応に関与する核酸分子における認識配列である。組換え部位は、組み込みまたは組換えの開始段階の間に部位特異的組換えタンパク質によって認識および結合される、関与する核酸分子における異なる切片またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについての組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、３４塩基対配列であり、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の反転反復（これは、リコンビナーゼ結合部位として働く）を含む。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例は、本明細書において記載されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲの配列、ならびにその変異体、フラグメント、改変体および誘導体であり、これは、リコンビナーゼ酵素Ｉインテグラーゼによって、および補助タンパク質である組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）によって認識される。以下を参照のこと：Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）。
【００５６】
組換えクローニング：本明細書において使用されるとき、組換えクローニングは、米国特許第５，８８８，７３２号（その内容は、全体が参考として本明細書において援用される）に記載されるような方法である。ここでは、核酸分子のセグメントまたはそのような分子の集団は、インビトロまたはインビボで、交換、挿入、置換、置き換えまたは改変される。好ましくは、そのようなクローニング方法はインビトロ方法である。
【００５７】
抑制カセット：本明細書において使用されるとき、抑制カセットは、サブクローニングベクターに存在するリプレッサーまたは選択マーカーを含む、核酸セグメントである。
【００５８】
選択マーカー：本明細書において使用されるとき、選択マーカーは、しばしば、特定条件下で、分子（例えば、レプリコン）またはそれを含む細胞についてまたはそれを排除して選択することを可能にする核酸セグメントである。これらのマーカーは、活性（例えば、ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質の生成であるがこれらに限定されない）をコードし得るか、あるいはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物、有機化合物または組成物などについての結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：（１）そうでなければ毒性化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（２）そうでなければレシピエント細胞において欠如する産物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードするＤＮＡセグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に同定され得る産物（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）をコードするＤＮＡセグメント；（５）そうでなければ細胞生存および／または機能に有害な産物に結合するＤＮＡセグメント；（６）上記番号１−５において記載されるＤＮＡセグメントのいずれかの活性をそうでなければ阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合するＤＮＡセグメント；（８）所望の分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位）；（９）そうでなければ非機能性であり得る特定のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のため）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を、直接または間接的に付与するＤＮＡセグメント；ならびに／または（１１）レシピエント細胞において毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント。
【００５９】
選択スキーム：本明細書において記載されるように、選択スキームは、混合物から所望の産物または分子の選択、富化または同定を可能にする任意の方法である。いくつかの好ましい実施形態において、選択スキームは、１つ以上の所望の生成物または分子のみについて選択またはその富化を生じる。本明細書において定義されるように、ＤＮＡ分子について選択するとは、（ａ）所望のＤＮＡ分子の存在について選択または富化すること、および（ｂ）所望のＤＮＡ分子ではないＤＮＡ分子の存在を排除して選択または富化することを包含する。
【００６０】
１つの実施形態において、選択スキーム（これは、逆で行われ得る）は、３つの形態のうちの１つを採り得、これを、図１の観点で考察する。第一は、本明細書において選択マーカーおよびそのリプレッサーを用いて例示されるように、セグメントＤを有し、そしてセグメントＣを欠如する分子について選択する。第二は、セグメントＣを有する分子を排除選択し、そしてセグメントＤを有する分子について選択する。第二の形態の可能な実施形態は、そのインビトロ反応生成物が導入されるべき細胞にとって毒性である遺伝子を有するＤＮＡセグメントを有する。毒性遺伝子は、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはＲＮＡ）として発現されるＤＮＡであり得るか、またはそれ自体においておよびそれ自体が毒性であり得る（後者の場合、毒性遺伝子は、「遺伝的形質」のその古典的な定義を有すると理解される）。
【００６１】
そのような毒性遺伝子産物の例は、当該分野において周知であり、そして以下が挙げられるがそれらに限定されない：制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１またはｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ ファミリーのメンバー）、レトロウイルス遺伝子（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の遺伝子を含む）、デフェンシン（例えば、ＮＰ−１）、反転反復または対合パリンドロームＤＮＡ配列、バクテリオファージ溶解遺伝子（例えば、ｆＸ１７４またはバクテリオファージＴ４からの遺伝子）；抗生物質感受性遺伝子（例えば、ｒｐｓＬ）、抗微生物剤感受性遺伝子（例えば、ｐｈｅＳ）、プラスミドキラー遺伝子、宿主細胞にとって毒性である遺伝子産物を生成する真核生物転写ベクター遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ−１）、および抑制機能の非存在下で宿主を殺傷する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢ、ｃｃｄＢ、ｆＸ１７４ Ｅ）（Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１３００−１３０９（１９９８））、ならびにレプリコンの安定性および／または複製に負に影響を与える他の遺伝子。毒性遺伝子は、あるいは、インビトロで選択可能であり得る（例えば、制限部位）。
【００６２】
誘導性プロモーターに作動可能に連結された制限エンドヌクレアーゼをコードする多くの遺伝子が知られており、そして本発明において使用され得る。例えば、以下を参照のこと：米国特許第４，９６０，７０７号（ＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ）；同第５，０００，３３３号、同第５，０８２，７８４号および同第５，１９２，６７５号（ＫｐｎＩ）；同第５，１４７，８００号（ＮｇｏＡＩＩＩおよびＮｇｏＡＩ）；同第５，１７９，０１５号（ＦｓｐｌおよびＨａｅＩＩＩ）：同第５，２００，３３３号（ＨａｅＩＩおよびＴａｑＩ）；同第５，２４８，６０５号（ＨｐａＩＩ）；同第５，３１２，７４６号（ＣｌａＩ）；同第５，２３１，０２１号および同第５，３０４，４８０号（ＸｈｏＩおよびＸｈｏＩＩ）；同第５，３３４，５２６号（ＡｌｕＩ）；同第５，４７０，７４０号（ＮｓｉＩ）；同第５，５３４，４２８号（ＳｓｔＩ／ＳａｃＩ）；同第５，２０２，２４８号（ＮｃｏＩ）；同第５，１３９，９４２号（ＮｄｅＩ）；ならびに同第５，０９８，８３９号（ＰａｃＩ）。以下もまた参照のこと：Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２５３９−２５６６（１９９１）；および Ｌｕｎｎｅｎ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７４：２５−３２（１９８８）。
【００６３】
第二の形態において、セグメントＤは、選択マーカーを有する。この毒性遺伝子は、ベクタードナー、共取り込みおよび副生成物の分子を有する形質転換体を除去するが、他方、選択マーカーを使用して、生成物を含む細胞を選択し得、そして挿入物ドナーのみを有する細胞を選択排除し得る。
【００６４】
第三の形態は、セグメントＡおよびセグメントＤの両方を同じ分子においてシスで有する細胞を選択するが、異なる分子においてトランスで両方のセグメントを有する細胞は選択しない。これは、セグメントＡおよびセグメントＤにおいて、２つの不活性フラグメントをそれぞれ一つずつ分割される選択マーカーによって具現化され得る。このフラグメントは、そのセグメントが組換え事象によって一緒にされるとき、それらが機能的選択マーカーを構成する組換え部位に比較してそのように配置される。例えば、この組換え事象は、プロモーターを構造核酸分子（例えば、遺伝子）と連結し得、構造核酸分子の２つのフラグメントを連結し得るか、または生存に必要なヘテロダイマー遺伝子産物をコードする核酸分子を連結し得るか、あるいはレプリコンの一部を連結し得る。
【００６５】
部位特異的リコンビナーゼ：本明細書において使用されるとき、部位特異的なリコンビナーゼは、少なくとも以下の４つの活性（またはその組合せ）を代表的に有する型のリコンビナーゼである：１）１または２の特定の核酸配列の認識；（２）この配列（単数または複数）の切断；（３）鎖交換に関与するトポイソメラーゼ；および（４）核酸の切断された鎖を再結合するリガーゼ活性。以下を参照のこと：Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）。保存的部位特異的組換えは、相同組換えおよび転位とは、両方のパートナーについて高度の特異性により識別される。鎖交換機構は、ＤＮＡ合成の存在下での特定のＤＮＡ配列の切断および再結合を包含する（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９）。
【００６６】
構造遺伝子：本明細書において使用されるとき、構造遺伝子とは、メッセンジャーＲＮＡに転写され、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳される、核酸配列をいう。
【００６７】
サブクローニングベクター：本明細書において使用されるとき、サブクローニングベクターは、環状核酸分子または線状核酸分子を含むクローニングベクターであって、好ましくは、適切なレプリコンを含む。本発明において、サブクローニングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、クローニングされたＤＮＡ挿入物（図１におけるセグメントＡ）に対してまたはそれとともに作用する最終産物へと、取り込まれることが所望される機能エレメントおよび／または調節エレメントを含み得る。サブクローニングベクターはまた、選択マーカーを含み得る。
【００６８】
標的核酸分子：本明細書において使用されるように、標的核酸分子は、本発明を用いる際に作用することになる、目的の核酸セグメント（好ましくはＤＮＡ）である。
【００６９】
テンプレート：本明細書において使用されるとき、テンプレートは、二本鎖または一本鎖の核酸分子であって、増幅、合成または配列決定されるべきものである。二本鎖ＤＮＡ分子の場合において、第一の鎖および第二の鎖へとその鎖を変性することは、好ましくは、これらの分子が増幅、合成または配列決定され得る前に行われ、あるいは二本鎖分子は、直接テンプレートとして使用され得る。一本鎖テンプレートについて、そのテンプレートの少なくとも一部に対して相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いでポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）は、テンプレートの全部または一部に対して相補的な分子を合成し得る。あるいは、二本鎖テンプレートについて、１つ以上の転写調節配列（例えば、１つ以上のプロモーター）は、１つ以上のポリメラーゼと組み合わせて使用されて、そのテンプレートの全部または一部に相補的な核酸分子を作製し得る。新たに合成される分子は、本発明に従って、もとのテンプレートに比較して同じかまたは短くあり得る。新たに合成された分子の合成または伸長の間のミスマッチ取り込みまたは鎖の滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）は、１または多数のミスマッチ塩基対を生じ得る。従って、合成分子は、テンプレートに精確に相補的である必要はない。さらに、核酸テンプレートの集団は、合成または増幅の間に用いられて、元のテンプレート集団の代表的な代表である核酸分子の集団を生成し得る。
【００７０】
転写調節配列：本明細書において使用されるとき、転写調節配列は、任意の形態または構造の、核酸分子において含まれるヌクレオチドの機能的ストレッチであって、１つ以上の構造遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写を調節するように作用するものである。転写調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどが挙げられるがそれらに限定されない。「転写調節配列」、「転写部位」および「転写シグナル」は、互換的に使用され得る。
【００７１】
ベクター：本明細書において使用されるとき、ベクターは、挿入物に対して、有用な生物学的または生化学的な特性を提供する、核酸分子（好ましくはＤＮＡ）である。例としては、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、およびインビトロまたは宿主細胞において複製し得または複製され得るか、または縮主細胞内の所望の位置に所望の核酸セグメントを運搬し得る、他の配列が挙げられる。ベクターは、そのベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく、決定可能な様式でその配列が切断され得、そして核酸フラグメントがスプライシングされてその複製およびクローニングが達成され得る、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクターは、例えば、ＰＣＲ、転写および／または翻訳の開始および調節の部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどのためのプライマー部位をさらに提供し得る。明らかに、相同組換え、転位または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントを挿入する方法（例えば、ＰＣＲセグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号、本明細書においてその全体が参考として援用される）、Ｔ：Ａクローニングなど（しかし、これらに限定されない））もまた適用されて、本発明に従って使用されるべきクローニングベクターへとクローニングされ得る。そのクローニングベクターは、そのクローニングベクターを用いて形質転換される細胞の同定において使用するために適切な、１つ以上の選択マーカーをさらに含み得る。
【００７２】
ベクタードナー：本明細書において使用されるとき、ベクタードナーは、本発明の２つの親の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一方であって、所望の生成物の部分になるべき、ベクターを含むセグメントを有するものである。ベクタードナーは、サブクローニングベクターＤ（または、それは、その挿入物ドナーがクローニングベクターはまだ含まない場合クローニングベクターと呼ばれ得る）および組換え部位に隣接するセグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記されるように、所望の生成物の娘分子について選択することに寄与するエレメントを含み得る。この組換えシグナルは、同じであってもよく異なっていてもよく、そして同じまたは異なるリコンビナーゼによって作用し得る。さらに、ベクタードナーは、線状または環状であり得る。
【００７３】
本明細書において使用される、組換えＤＮＡ技術および分子生物学および細胞生物学の分野において使用される他の用語は、適用可能な分野における当業者によって一般的に理解される。
【００７４】
（概説）
本発明は、少なくとも１つの組み込み配列（例えば、トランスポゾン）を標的核酸分子へと挿入すること、および続いてその改変された標的核酸分子を組換えクローニングを用いてベクターへと転移させることによる、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の構築に関する。本発明に従って、組換えクローニングにより、組み込み配列の全部または一部を含む標的配列を含む分子（特にベクター）の効率よい選択および同定が可能になる。従って、目的の部位または配列（組み込み配列によって含まれる）は、標的配列に挿入され得、これにより、標的核酸分子のさらなる操作が可能になる。標的核酸配列に導入されるべき、本発明の組み込み配列は、プライマー部位（プライマー（例えば、配列決定プライマーまたは増幅プライマー）がハイブリダイズして、核酸合成、増幅または配列決定を開始し得る配列）、転写シグナル、翻訳シグナル、または調節配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳達成配列（例えば、Ｋｏｚａｋ配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列）、開始コドン、複製起点、終止シグナル（例えば、終止コドン）、組換え部位（またはその一部）、選択マーカーおよびタンパク質融合体（例えば、Ｎまたはカルボキシ末端）を作製する遺伝子または遺伝子の一部（例えば、ＧＳＴ、ＧＵＳ、ＧＦＰ）、あるいはその組合せのような任意の数の機能配列またはその組合せを包含し得る。そのような目的の配列の挿入後、その分子は、種々の方法（標的配列の全部または一部の配列決定または増幅（すなわち、組み込み配列によって導入された少なくとも１つのまたはそのプライマー部位を用いることによる）を含む）、その標的配列の変異（すなわち、標的配列の挿入、欠失または置換）、および標的配列またはその一部からのタンパク質発現（すなわち、翻訳シグナルおよび／または転写シグナルの挿入による）において操作され得る。
【００７５】
本発明はまた、その分子に組換え部位含有組み込み配列を挿入すること、および組換えクローニングを行うことかまたは挿入された組換え部位の組換えを生じさせることによって、核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）をクローニングすることに関する。従って、少なくとも１つの組換え部位を含む１つ以上の組み込み配列は、目的の分子内に挿入されて、そのような分子またはその一部の組換えクローニングまたはクローニングを可能にし得る。この局面において、組み込み配列はまた、他の目的の機能配列（例えば、プライマー部位、転写シグナル、翻訳シグナル、終止シグナル、選択マーカー、複製起点など、上記）を含んで、本発明のこの方法によって得られた分子のさらなる操作を可能にし得る。
【００７６】
本発明において使用するための組換え部位は、組換え反応に関与する任意の認識配列であり得る。そのような組換え部位は、同じであってもよく異なっていてもよく、そして野生型または天然に存在する組換え部位でも、改変もしくは変異体の組換え部位であってもよい。本発明において使用するための組換え部位の例としては、ファージλ組換え部位（例えば、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ、ならびにその変異体および誘導体）、および他のバクテリオファージ（例えば、ＰＩ、ｐｈｉ８０、Ｐ２２，Ｐ２，１８６，Ｐ４およびＰＩからの組換え部位（ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ５１１のようなｌｏｘ部位を含む）が挙げられるがそれらに限定されない。これらの系について対応する組換えタンパク質は、本発明に従って、指定された組換え部位とともに使用され得る。本発明において使用するための組換え部位および組換えタンパク質を提供する他の系は、Ｓａｃｃｈａｒｍｙｃｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅからのＦＬＰ／ＦＲＴ系、レソルバーゼ（ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）ファミリー（例えば、ｇｄ、Ｔｎ３レソルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、およびＣｉｎ）ならびにＩＳ２３１および他のＢａｃｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ転位エレメントを包含する。本発明において使用するための、好ましい組換えタンパク質および変異体もしくは改変された組換え部位は、米国特許第５，８８８，７３２号、同時係属中の米国特許出願番号０９／４３８，３５８号（１９９１年１１月１２日出願）、および同時係属中の米国特許出願０９／５１７，４６６（２０００年３月２日出願）、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能なＧＡＴＥＷＡＹ^TM Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙとともに使用されるものを包含する。
【００７７】
（組み込み配列）
当業者に公知の任意の組み込み配列を本発明の実施において使用し得る。組み込み配列はまた、当該分野において移動性遺伝子エレメントとして知られる。いくつかのこの間ＩＩ実施形態において、組み込み配列は、トランスポゾン（転位エレメント）であり得る。当業者に知られる任意のトランスポゾン配列は、本発明における使用に適切であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の使用に適切なトランスポゾンとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｔｎ３ファミリートランスポゾン、Ｔｎ３、ＴｎＡ、ｇｄ、Ｔｎ１０００、Ｔｎ５、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０ならびにその誘導体および変異体。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、組み込み配列は、組み込みウイルスであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、組み込みウイルスは、λ型ファージであり得る。λ型ファージは、以下を含むようであるが、それらに限定されない：コリファージ（例えば、Ｉ、２１、４３４，ｆ８０およびＨＫ０２２）およびサルモネラファージ（例えば、Ｐ２２）。他の好ましい実施形態において、組み込みウイルスは、１に関連しないファージ（例えば、Ｍｕ−１、Ｐ２およびＰ４）であり得る。当業者に公知の他の組み込みウイルスも、本発明の実施において使用され得る。
【００７９】
さらなる好ましい実施形態において、組み込み配列は、ＩＳエレメント（例えば、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ４、ＩＳ５）ならびにその誘導体および変異体であり得る。他の実施形態において、組み込み配列は、レトロウイルス、レトロトランスポゾン、結合性トランスポゾン、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＰエレメント、細菌ビルレンス因子、または真核生物についての移動性遺伝エレメント（例えば、ｍａｒｉｎｅｒ、ＴｃＩおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）。当業者に公知の他の移動性遺伝エレメントもまた、本発明に従って使用され得る。
【００８０】
（複製起点）
複製起点（ｏｒｉ）は、核酸分子の複製が開始する、核酸分子におけるヌクレオチド配列である。本明細書において使用されるとき、ファージ複製起点は、規定可能な複製起点および核酸分子の複製に必要な１つ以上の接合制御エレメントを含むようである。複製の間のＤＮＡ合成の規定可能な出発点および隣接する制御エレメント（単数または複数）の組合せはまた、レプリコンと呼ばれ得る。本発明において使用するために適切なレプリコンは、ｐＭＢＩレプリコン、ｐ１５Ａレプリコン、ｐＳＣ１０１レプリコン、ＣｏｌＥ１レプリコン、Ｒ６Ｋレプリコン、Ｆレプリコン、Ｐ１レプリコン、Ｒｔｓ１レプリコン、ｐＣｏｌＶ−Ｋ３０レプリコン、Ｉｄｖレプリコン、ｐＩＰ５２２レプリコン、Ｒ１１６２／ＲＳＦ１０１０レプリコン、ＲＫ２レプリコン、ｐＳａレプリコン、およびＲＡ１レプリコンを包含するが、それらに限定されない。本発明の実施に対して適切なレプリコンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的なレプリコンには限定されない。他の生物において機能的なレプリコンとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＰＳ１０レプリコン、ｐＣＴＴ１レプリコン、ｐＷＶ０２レプリコン、ｐＦ３ＡレプリコンおよびｐＩＰ４０４レプリコン。真核生物において使用するために適切なレプリコンは、非限定的に、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、両生類細胞または任意の以下に記載の宿主細胞を含み、本発明と関連して使用され得る。
【００８１】
（宿主細胞）
本発明はまた、１つ以上の本発明の核酸分子またはベクター、特に本明細書において詳細に記載された核酸分子およびベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の局面に従って使用され得る代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられる芽それらに限定されない。好ましい細菌宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．細胞（特にＥ．ｃｏｌｉ細胞、最も詳細にはＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５ａ、ＤＢ３、ＤＢ３．１（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＩＢＲＡＲＹ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標） ＤＢ３．１^TM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＤＢ４およびＤＢ５（以下を参照のこと：米国特許出願第５１８，１８８号（２０００年３月１８日出願）（その開示は本明細書においてその全体が参考として援用される）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ株（例えば、米国特許仮出願第６０／１３９，８８９号（１９９９年６月２２日出願）において記載される上記のもの））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．細胞（特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．細胞、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐｐ．細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．細胞、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ細胞）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞）、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳ．ｔｙｐｈｉ細胞）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい動物宿主細胞としては、昆虫細胞（最も詳細には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞およびＳｆ２１細胞ならびにＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）、線虫細胞（特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ 細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（特に、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ細胞）、爬虫類細胞、および哺乳動物細胞（最も詳細には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞およびヒト細胞）が挙げられる。好ましい酵母宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 細胞が挙げられる。これらおよび他の適切な宿主細胞は市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ），、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））。
【００８２】
本明細書において記載される、本発明の核酸分子および／またはベクターを宿主細胞に導入して、本発明の１つ以上の核酸分子および／またはベクターを含む宿主細胞を生成するための方法は、当業者には周知・慣用されている。例えば、本発明の核酸分子および／またはベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、および形質転換の周知技術を用いて宿主細胞へと導入され得る。本発明の核酸分子および／またはベクターは、単独で、または他の核酸分子および／またはベクターとともに導入され得る。あるいは、本発明の核酸分子および／またはベクターは、沈降物（例えば、リン酸カルシウム沈降物）または脂質との複合物として宿主細胞へと導入され得る。エレクトロポレーションもまた、本発明の核酸分子および／またはベクターを宿主に導入するために使用され得る。同様に、そのような分子は、化学的にコンピテントな細胞へと導入され得る。いくつかの好ましい実施形態において、化学的にコンピテントな細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ細胞）である。そのベクターがウイルスである場合、それは、インビトロでパッケージングされ得るか、またはパッケージング細胞へと導入され得、そしてそのパッケージングされたウイルスは、細胞へと形質導入され得る。それゆえ、本発明のこの局面に従って、本発明の核酸分子および／またはベクターを宿主に導入するために適切な広汎な種々の技術は当業者に周知でありそして慣用されている。そのような技術は、例えば以下において詳細に概説されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６．３０−１６．５５（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐｐ．２１３−２３４（１９９２），ａｎｄ Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．−Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）。これらは、これらの技術を詳述する多くのラボマニュアルの例示であり、そして本明細書においてその関連する開示についてその全体が参考として援用される。
【００８３】
（ポリメラーゼ）
本発明において使用するためのポリメラーゼとしては、ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ）、および逆転写酵素挙げられるがそれらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｔｈｅｒｎｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ^TM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ^TMＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ＫＯＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｒｎｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ^TM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、および一般的なｐｏｌ Ｉ型のＤＮＡポリメラーゼならびにそれらの変異体、改変体および誘導体。ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６ならびにその変異体、改変体および誘導体）もまた、本発明に従って使用され得る。
【００８４】
本発明において使用される核酸は、中温性であっても好熱性であってもよく、そして好ましくは好熱性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｏｌ ＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ（およびそのそれぞれのＫｌｅｎｏｗフラグメント）（以下のような生物から単離され得るもののいずれか：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、バクテリオファージＬ５、ｐｈｉ−Ｃ３１、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰ０１、ＳＰ０２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＩＰ−１、真核生物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからのミトコンドリア（Ａｓｔａｔｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８，１４７−１６５）、任意の供給源について単離されたｐｏｌ ＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、誘導体または改変体などが挙げられる。本発明の方法および組成物において使用され得る好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅフラグメント、ＶＥＮＴ^TMおよびＤＥＥＰＶＥＮＴ^TMのＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＷＯ ９２／０６１８８；ＷＯ ９２／０６２００；ＷＯ ９６／１０６４０；ＷＯ ９７／０９４５１；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。
【００８５】
本発明において使用するための逆転写酵素としては、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。そのような酵素としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＷＯ ９６／１０６４０ および ＷＯ ９７／０９４５１）、Ｔｍａ ＤＮＡ ポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号、ならびにその変異体、改変体または誘導体（例えば、以下を参照のこと：ＷＯ ９７／０９４５１およびＷＯ ９８／４７９１２）。本発明において使用するための好ましい酵素としては、ＲＮａｓｅＨ活性が減少したか、実質的に減少したかまたは除去された酵素が挙げられる。「ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少した」酵素とは、野生型またはＲＮａｓｅＨ⁺酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の逆転写酵素）に対応するＲＮａｓｅＨ活性の約２０％未満、より好ましくは、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満、そして最も好ましくは、約２％未満をその酵素が有することを意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、種々のアッセイにより決定され得る（例えば、以下に記載されるアッセイ：米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）。これらのすべての開示は、本明細書において完全に参考として援用される）。本発明において使用するための特に好ましいポリペプチドとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｍ−ＭＬＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ^-逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）Ｈ^-逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽細胞症関連ウイルス）Ｈ^-逆転写酵素およびＨＩＶ Ｈ^-逆転写酵素以下を参照のこと：米国特許第５，２４４，７９７号およびＷＯ ９８／４７９１２）。しかし、当業者は、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が本発明の組成物、方法およびキットにおいて等価に使用され得ることを理解する。
【００８６】
本発明において使用するためのポリメラーゼ活性を有する酵素は、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ），Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から）。本発明において使用するための逆転写酵素活性を有する酵素は、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から）。あるいは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性を有する逆転写酵素は、当業者に周知の天然タンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従ってその天然のウイルスまたは細菌の供給源から単離され得る（例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９））。さらに、そのようなポリメラーゼ／逆転写酵素は、当業者に慣用される組換えＤＮＡ技術により調製され得る（例えば、以下を参照のこと：Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；米国特許第５，２４４，７９７号；ＷＯ ９８／４７９１２；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２−３３７６（１９８８））。ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を有する酵素の例としては、本願に記載される任意の酵素が挙げられ得る。
【００８７】
（核酸合成、増幅および配列決定の方法）
本発明は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）分子およびＲＮＡ分子）の合成を包含する任意の方法とともに使用され得る。そのような方法としては、核酸合成方法、核酸増幅方法および核酸配列決定方法が挙げられる芽それらに限定されない。
【００８８】
本発明のこの局面に従った核酸合成方法は、１つ以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は核酸分子を合成するための方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）核酸テンプレート（例えば、組み込み配列を含む標的分子）と、１つ以上のプライマーおよび１つ以上のポリメラーゼ活性もしくは逆転写酵素活性を有する酵素と混合して、混合物を形成する工程；ならびに（ｂ）その混合物を、そのテンプレートの全部または一部に相補的な第一の核酸分子が生成するに十分な条件下でインキュベートする工程。本発明のこの局面に従って、核酸テンプレートは、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーのようなＤＮＡ分子、あるいはｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子であり得る。ｐＨ、温度、イオン強度およびインキュベーション時間のような合成を可能にするに十分な条件は、当業者により最適化され得る。
【００８９】
本発明に従って、標的またはテンプレートの核酸分子またはライブラリーは、天然の供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官または生物）から得られた核酸分子から調製され得る。
【００９０】
核酸分子の供給源として使用され得る細胞としては、原核生物細胞（細菌細胞（以下の属の種の細菌を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））または真核生物細胞（真菌（特に酵母）、植物、原生動物および他の寄生動物、ならびに昆虫（特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞）、線虫（特にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ細胞）、および哺乳動物（特にヒト細胞）を含む動物の細胞を含む）が挙げられる。
【００９１】
当然、有利に使用され得る核酸合成の他の技術は、当業者に容易に明白である。
【００９２】
本発明の他の局面において、本発明は、核酸分子の増幅または配列決定のための方法と組み合わせて使用され得る。本発明のこの局面に従った核酸増幅方法は、ワンステップ（例えば、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ）またはツーステップ（例えば、ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）逆転写酵素増幅反応として当該分野において一般的に知られる方法において、逆転写酵素活性を有する、１つ以上のポリペプチドの使用を包含し得る。長い核酸分子（すなわち、約３−５Ｋｂ長より長い）の増幅のために、ＷＯ ９８／０６７３６およびＷＯ ９５／１６０２８に記載されるようなＤＮＡポリメラーゼの組合せが使用され得る。
【００９３】
本発明に従う増幅方法は、１つ以上の工程を包含し得る。例えば、本発明は、核酸分子を増幅するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸テンプレート（例えば、組み込み配列を含む標的分子）と、ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素とを混合する工程；および（ｂ）その混合物を、ポリメラーゼ活性を有する酵素がそのテンプレートの全部または一部に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅することを可能にするに十分な条件下で、インキュベートする工程。本発明はまた、そのような方法によって増幅された核酸分子を提供する。
【００９４】
核酸分子またはフラグメントの増幅および分析のための一般的な方法は、当業者に周知である（例えば、以下を参照のこと：米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，８００，１５９号；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。例えば、本発明に従って使用され得る増幅方法は、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号；ＥＰ ０ ６８４ ３１５）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；ＥＰ ０ ３２９ ８２２）が挙げられる。
【００９５】
代表的には、これらの増幅方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ポリメラーゼ活性を有する１つ以上の酵素を、１つ以上のプライマー配列の存在下で、核酸サンプルと混合する工程、および（ｂ）その核酸サンプルを増幅して、増幅された核酸フラグメントの収集物を生成する工程（好ましくは、これは、ＰＣＲまたは等価な自動増幅技術による）。
【００９６】
本発明の方法による増幅または合成の後、増幅または合成された核酸フラグメントは、さらなる使用および特徴付けのために単離され得る。この工程は、通常、大きさまたは任意の物理的もしくは生化学的な手段（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（サイズ分離、アフィニティーおよび免疫クロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心分離および免疫吸着を含むによる、増幅または合成された核酸フラグメントの分離によって達成される。ゲル電気泳動による核酸フラグメントの分離は、特に好ましい。なぜなら、それは、多数の核酸フラグメントの高感度な分離の、迅速かつ高度の再現性のある手段を提供するからであり、そしていくつかの核酸サンプルにおけるフラグメントの直接で、同時の比較を可能にするからである。このアプローチは、別の好ましい実施形態において、これらのフラグメントまたは本発明の方法によって増幅もしくは合成された任意の核酸フラグメントを単離および特徴付けすることへと拡張され得る。従って、本発明はまた、本発明の増幅または合成方法によって生成された単離核酸分子にも関する。
【００９７】
この実施形態において、増幅または合成された核酸フラグメントの１つ以上は、ゲルから取り出され、これは、電気溶出または物理的切り出しのような標準的な技術に従って、同定（上記参照）するために使用された。次いで、単離された特有の核酸フラグメントは、種々の原核生物（細菌）または真核生物（酵母、植物または動物（ヒトおよび他の哺乳動物を含む））の細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適切な標準的なベクター（発現ベクターを含む）に挿入され得る。あるいは、本発明の方法によって生成された核酸分子は、例えば、当該分野において標準的であるとして以下および他の箇所に記載される方法による配列決定（すなわち、核酸フラグメントのヌクレオチド配列を決定すること）によって、さらに特徴づけられ得る（例えば、以下を参照のこと：米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号、これらは、ＤＮＡ配列決定の方法に関する）。
【００９８】
本発明に従った核酸配列決定は、１つ以上の工程を包含する。例えば、本発明は、核酸分子の配列決定のための方法と組み合わされ得る。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）ポリメラーゼ活性を有する酵素と、配列決定されるべき核酸分子、１つ以上のプライマー、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上の終結因子（例えば、ジデオキシヌクレオチド）を混合して、混合物を形成する工程；（ｂ）その混合物を、配列決定されるべき分子の全部または一部に対して相補的な分子の集団を合成するに十分な条件下で、インキュベートする工程；および（ｃ）その集団を分離して、配列決定されるべき分子の全部または一部のヌクレオチド配列を決定する工程。
【００９９】
使用され得る核酸配列決定の技術は、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号に開示される技術のような持デオキシ配列決定方法を包含する。
【０１００】
（キット）
別の局面において、本発明は、本発明とともに使用され得るキットを提供する。本発明のこの局面に従うキットは、１つ以上の容器を含み得る。この容器は、以下からなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る：１つ以上の本発明の核酸分子またはベクター、１つ以上のポリメラーゼ、１つ以上の逆転写酵素、１つ以上の挿入触媒酵素、１つ以上の組換えタンパク質（または本発明の方法を実施するための他の酵素）、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の終結因子（例えば、ｄｄＮＴＰ）、１つ以上のトランスフェクション試薬、ピロホスファターゼなど。本発明のキットはまた、本発明の方法を実施するための指示書を備え得る。
【０１０１】
当業者は、本明細書において記載される方法および適用に対して他の適切な改変および適用は、当業者に知られる情報に鑑み本明細書において含まれる本発明の説明から容易に明かであり、そしてそのような改変および適用は、本発明の範囲からもその任意の実施形態からも逸脱することなくなされ得ることを理解する。本発明を今や詳細に説明したので、本発明は、以下の実施例を参照してより明確に理解される。この実施例は、例示の目的のみで含まれ、そして本発明を限定することは意図しない。
【０１０２】
（実施例）
（実施例１：トランスポゾン含有標的ＤＮＡ分子の構築）
標的分子を、ＧＡＴＥＷＡＹ^TMクローニングシステムの方法および手順に従って記載されるように、組換えクローニングに適した第１のベクターにクローン化した（米国特許第５，８８８，７３２号、米国特許出願第０９／４３８，３５８号および同第０９／５１７，４６６号、ならびにＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｖｅｒｓｉｏｎ １ ａｎｄ ２）と表題を付けられた取扱説明書を参照のこと（これらの全ては、その全体を本明細書中で参照として援用される））。簡潔に言うと、標的ＤＮＡ分子を、この標的分子を組換え部位に隣接させるように適切なベクターに挿入する。いくつかの実施形態において、この組換え部位は、互いに組換えをなし得ない。この標的を含有する第１のベクターを、トランスポゾンのような組み込み配列、緩衝塩、イオンなどのような適切な補因子、ならびに標的ＤＮＡ分子へのこの組み込み配列の挿入を触媒する酵素を含有する溶液と接触させる。あるいは、Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、８８：１２４７−１２５０、１９９１（特に本明細書中で参照として援用される））により記載される、ｇｄベースのトランスポゾンを挿入するためのプラスミドの接合伝達のようなインビボでの反応において、トランスポゾンを標的ＤＮＡに挿入し得る。本実施例は、標的ＤＮＡへのトランスポゾンのインビトロ挿入に関するが、当業者は、対応する反応が当業者に公知の方法を用いてインビトロで実行され得ることを理解する。このような対応する方法は、本発明の範囲内であるとみなされる。トランスポゾンのＤＮＡ配列は、挿入を触媒する酵素の基質として作用する末端配列を含み、そしてこの酵素は、標的ＤＮＡ分子へのトランスポゾンの挿入を触媒する。上述のように、挿入を触媒する酵素はまた、ベクターへのトランスポゾンの挿入も同様に触媒する。転位反応の結果は、図２に示されるような、このベクターおよび標的ＤＮＡにおいて、多様な場所にトランスポゾンが挿入されている分子の集合である。この標的ＤＮＡ配列は、２つの組換え部位（ＲＳ₁およびＲＳ₂）に隣接される。この組み込み配列は、選択マーカー（ＳＭ２）およびそれぞれの末端でプライマー結合配列を含むように示される。当業者は、これらの特徴の改変およびさらなる特徴の含有が、本発明の範囲内であることを理解する。この挿入反応は無作為であるので、この組み込み配列は、示されるように標的およびベクターの両方に挿入し得る。
【０１０３】
本発明における使用に適切なトランスポゾンは、１つ以上の選択マーカーを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のトランスポゾンは、毒性遺伝子を含み得る。この毒性遺伝子は、自殺遺伝子（すなわち、この遺伝子が発現された場合はいつでも感受性のある生物に対して致死的である）であり得るか、またはこの毒性遺伝子は、条件的に致死的（すなわち、この遺伝子が発現され、そしていくつかの付加的な因子が存在する場合のみ、感受性のある生物に対して致死的である）であり得る。さらに、本発明の配列決定法における使用に適切なトランスポゾンは、プライマーと結合するのに適切な１つ以上の配列を含み得る。プライマーは、このトランスポゾンに隣接する標的ＤＮＡ分子の配列を決定するために用いられ得るか、またはＰＣＲのような他の目的のために用いられ得る。配列決定されるかまたは増幅されるＤＮＡとプライマーとのインキュベーションで形成されるプライマー：ＤＮＡの二重鎖が、引き続き行なわれる反応（すなわち、配列決定またはＰＣＲ）を可能にするのに十分安定である限り、適切な配列は、任意の長さの配列であり得る。このプライマー結合部位の実際のヌクレオチド配列は、それが知られている限り重要ではない。適切なプライマー結合配列の選択およびその後の反応のための適切な反応条件の決定は、当業者にとって慣用的作業である。
【０１０４】
標的の部分をクローン化するためのＤＮＡ標的分子への挿入のために適切なトランスポゾンは、１つ以上の組換え部位またはそれらの部分を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のトランスポゾンは、２つの組換え部位を含みこれらは、同じであっても異なってもよい。この２つの部位は、互いに反対方向に存在し得る。
【０１０５】
クローニングの適用に適切なトランスポゾンは、複製起点を含み得る。いくつかの実施形態において、複製起点は、本発明の実施において用いられる１つ以上のベクターにおける複製起点と適合性があるように選択され得る。このことは、このトランスポゾン由来の複製起点を含む核酸分子が、このベクターもまた含む細胞において安定に維持されることを可能にする。他の実施形態において、複製起点は、ベクターの複製起点と不適合であるように選択され得る。このことは、ベクターと、核酸分子を含むトランスポゾンの分離を容易にする。複製起点の配列および特徴は、当業者に周知である。適切な複製起点の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９４年（これは特に本明細書中で参照として援用される）に見出される。他の適切な複製起点は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。本発明で用いられる複製起点は、種々の生物において、それらを含む核酸分子の複製を指向し得る。いくつかの実施形態において、複製起点は、前述のような原核生物宿主細胞で機能し得る。他の実施形態において、複製起点は、真核生物宿主細胞で機能し得る。
【０１０６】
本発明における使用に適切なトランスポゾンは、１つ以上の制限酵素に対する基質として働く１つ以上の部位を含むＤＮＡ配列を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明で用いられるトランスポゾンは、まれに切断をする制限酵素（「レアカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）」と呼ばれる）の基質として働く部位を含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、ベクタードナーもまた、１つ以上のレアカッターに対する部位を提供し得る。いくつかの実施形態において、ベクタードナーには、２つのレアカッター部位が提供され得、これらは、同じであっても異なってもよく、そして組換え部位に隣接する。
【０１０７】
本発明のトランスポゾンは、１より多い前述の特徴を含み得る。例えば、トランスポゾンは、組換え部位に加えて複製起点を含み得、そしてさらに、１つ以上のプライマー結合配列、選択マーカーおよび／または自殺遺伝子を含み得る。他の有用な特徴の組み合わせは、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内である。
【０１０８】
いくつかのこのましい実施形態において、この転位反応における標的を含有する第１のベクターに対するトランスポゾンのモル比は、約２５：１から約１：２５の範囲である。好ましい実施形態において、モル比は、約１０：１から約１：１０の範囲である。このモル比は、１つのトランスポゾンがＤＮＡ標的に挿入されることを確実にするために、変更され得る。第１のベクターの大きさが、標的に比べて大きい場合、標的ＤＮＡへの挿入を得るために、各第１の標的含有ベクターへの複数の挿入に有利なように反応を傾かせるように、より高いトランスポゾン：ベクターの比を有することが望ましくあり得る。逆に、標的ＤＮＡの大きさがベクターに比べて大きい場合、トランスポゾン：ベクターの比を減少することが望ましくあり得る。
【０１０９】
代表的なインビトロでの転位反応物は、トランスポゾン、標的を含有する第１のベクター、イオン、緩衝剤などを含み得る。適切な反応条件は、約１００〜５００ｎｇのトランスポゾンおよび約１ｍｇの第１の標的含有ベクターであり得る。この反応は、約０．５ｍＭから約２５０ｍＭの濃度で二価金属イオンを含み得る。好ましい実施形態において、ＭｇＣｌ₂が二価金属イオンの供給源であり得、そして約１ｍＭから約５０ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭから約２０ｍＭの濃度で存在し得る。この反応溶液はまた、約１ｍＭから約１００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭから約５０ｍＭそして最も好ましくは約１０ｍＭから約２５ｍＭの濃度で緩衝剤を含み得る。適切な緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。この反応溶液はまた、約０．１ｍＭから約５ｍＭ、好ましくは約１ｍＭの濃度で、還元剤（例えば、ｂ−メルカプトエタノール（ｂ−ＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、またはジチオエリトリトール（ＤＴＥ））を含み得る。この反応溶液のｐＨは、約６．５から約８．５、好ましくは約７．５であり得る。この反応溶液は、約１ｍＭから約１００ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約２５ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭの濃度で一価カチオンを含み得る。適切な一価カチオンの供給源としては、ＫＣＬおよびＮａＣｌが挙げられ得る。適切な反応条件の設定は、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴおよび挿入反応を触媒するのに十分な挿入触媒酵素活性である。適切な反応条件は、組み込み配列／挿入触媒酵素の供給源の組み合わせに依存して変化する。当業者は、公知の種々の挿入触媒酵素が、各酵素に特異的な条件下で最適な活性を有することを理解する。所定の酵素に対する反応条件の決定および最適化は、当業者による慣用的実験により決定され得る。反応条件は、トランスポゾンおよびベクターの大きさ、ならびに挿入触媒酵素調製物の活性に基いて変更され得る。いくつかの実施形態において、この転位反応は、この反応において存在する核酸種の有効な濃度を増大する試薬の存在下で実行され得る。この種の適切な試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。適切なＰＥＧは、ＰＥＧ８０００である。この反応混合物は、適切な温度（例えば、約２０℃から約３７℃）、適切な期間（例えば、約１５分から約１６時間）でインキュベートされ得る。所定のトランスポゾン、標的および挿入触媒酵素調製物に対する最適な温度およびインキュベーション時間は、当業者による慣用的実験により決定され得る。
【０１１０】
転位反応についてのインキュベーションの後、ＤＮＡは、そのまま用いられ得るか、または当業者に公知の方法により精製され得る。精製されずに用いられる場合、この挿入触媒酵素は、例えば、６５℃で２０分間の加熱により不活性化され得る。この転位反応物からの適切なＤＮＡの精製についての方法として、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿、シリカ（例えば、ＣＯＮＣＥＲＴ^TM ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能））を用いた抽出、または当業者により用いられる他の任意の精製スキームが挙げられる。
【０１１１】
転位反応が十分に有効である場合、このトランスポゾンを含有する標的ＤＮＡ分子を含む第１のベクターの十分な分子が生成され、引き続く組換え反応に対する基質として働く。他の場合では、この転位反応において生成した分子でコンピテントな宿主生物を形質転換し、そしてこの形質転換された生物を増殖させてこの反応産物を増幅させることが必要であり得る。この形質転換された生物は、増殖中の生物におけるトランスポゾン上に存在する選択マーカーの存在を確証するために、抗生物質のような適切な選択薬剤の存在下で増殖され得る。増幅工程は、当該分野で慣用的なものであり、当業者は適切な生物および形質転換条件を選択し得、そして過度の実験を伴うことなく増幅反応産物を単離し得る。
【０１１２】
（実施例２：トランスポゾン含有標的分子とベクタードナーとの組換え）
第１のベクター中のトランスポゾン含有の標的ＤＮＡ分子は、組換えクローニングを用いて第２のベクターへ転位され得る。図３に示されるように、前述の実施例に記載される挿入反応産物を、ベクタードナーと呼ばれる第２のベクターと混合し得る。ベクタードナーは、図３においてＲＳ₃およびＲＳ₄として示される組換え部位を含む。これらの組換え部位は、第１のベクターにおいて存在する組換え部位と適合性がある。この混合物が、適切な組換えタンパク質と接触された場合、標的ＤＮＡ分子は、第２のベクターに転位される。図３に示される実施形態において、このベクタードナーは、組換え部位の間に毒性遺伝子を含み、さらに組換え部位の外側に選択マーカー（ＳＭ₃）を含む。適切なベクタードナー分子の調製については、Ｈａｒｔｌｅｙらに発行された米国特許第５，８８８，７３２号中に記載され、およびＧＡＴＥＷＡＹ^TMＣｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｖｅｒｓｉｏｎ１ ａｎｄ ２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能）と表題を付けられた取扱説明書に従う。
【０１１３】
第１および第２のベクターは、適切な緩衝液中でインキュベートされる。反応条件は、用いられる特定のベクターおよび組換えタンパク質に対して最適化され得る。この反応溶液は、所望のｐＨを維持し得る濃度で緩衝剤を含み得る。この緩衝剤の濃度は、約１ｍＭから約１００ｍＭであり得る。好ましくは、約１０ｍＭから約５０ｍＭであり得る。適切な緩衝剤はＴｒｉｓである。反応溶液のｐＨは、用いられる組換え酵素の至適ｐＨに依存して変更し得る。好ましい実施形態において、反応溶液のｐＨは、約６．５から約８．５であり、より好ましくは、約７．０から８．０であり、そして最も好ましくは、７．５である。この反応溶液は、約１ｍＭから約１００ｍＭ、好ましくは約５ｍＭから約５０ｍＭ、そして最も好ましくは、約２０ｍＭから約３５ｍＭの濃度で一価カチオンを含有し得る。適切な一価カチオンの供給源は、ＮａＣｌである。この反応溶液はまた、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭから約５ｍＭの濃度でスペルミジンを含有し得る。この反応溶液はまた、約５０ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１００ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約５００ｍｇ／ｍｌの濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み得る。この反応溶液はまた、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭから約５ｍＭの濃度でキレート剤を含み得る。反応条件の１つの適切な設定は、５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３３ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのスペルミジン・ＨＣｌおよび５００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンである。この組換え部位が、ａｔｔＬおよびａｔｔＲの誘導体である場合、反応条件は、２５ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのスペルミジン・ＨＣＬおよび１ｍＭ／ｍｌのＢＳＡを含み得る。この反応溶液を約２５℃で約６０分間インキュベートし、次いでプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）と共に１０分間インキュベートし、組換えタンパク質を不活性化する。この組換え反応の効率の増大は、組換え反応の前にベクターを線状にすることにより実現する。これは、適切な制限酵素で消化することにより達成され得る。あるいは、トポイソメラーゼＩがこの組換え反応に加えられ得る。組換え反応の後、反応混合物を用いてコンピテントな宿主生物を形質転換し得る。形質転換された宿主を、適切な選択薬剤の存在下で増殖し、所望の反応産物の存在を確かめ得る。例えば、形質転換された宿主のための増殖培地は、この実施形態において２つの抗生物質を含有し得、ここで、トランスポゾンがその抗生物質の一方に対する耐性をコードし、そして第２のベクターがもう一方の抗生物質に対する耐性をコードする。図３に示される実施形態において、このトランスポゾンは、選択マーカーＳＭ₂を保有し、一方このベクタードナーは、ＳＭ₃を保有する。このシナリオにおいて、第１のベクターは、さらに第３の抗生物質に対する耐性、すなわちＳＭ₁をコードし得る。この増殖条件はまた、毒性遺伝子の非存在について選択する。これらの条件下で増殖し得る任意の生物は、トランスポゾン由来の選択マーカーおよび第２のベクター由来の選択マーカーの両方を含有し、そして毒性遺伝子を含有しない。これらの分子は、第１のベクターと第２のベクターとの間の組換え、および融合中間体の分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の結果である。図３に示されるように、この生成分子は、挿入を含有し、組換え部位に隣接される標的ＤＮＡを含有し、これらの組換え部位は、本来の隣接部位とベクタードナー中の部位との組換えの生成物（ＲＳ₁₊₃およびＲＳ₂₊₄として示される）である。例えば、本来の隣接部位が、ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２であり、そしてベクタードナー上の部位が、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２である場合、生成される分子は、標的配列についてのそれらの部位の方向性に依存して、ａｔｔＢ１またはａｔｔＰ１のいずれかにより一方の末端で隣接され、そしてａｔｔＢ２またはａｔｔＰ２のいずれかにより他方で隣接される標的核酸を含有する。特定の好ましい実施形態において、生成される分子は、異なる変異ａｔｔＢ部位によって隣接される標的核酸を含有し得る。
【０１１４】
あるいは、この組換え反応の後、混合物をインビトロで使用して、標的をさらに操作し得る。トランスポゾン含有ＤＮＡセグメントが転位されたベクターに対するオリゴヌクレオチドを、このトランスポゾンと相補的なオリゴヌクレオチドと共に使用して、ベクターからトランスポゾン挿入部位へ伸長したアンプリコンの集団を生成し得る。これらのセグメントは、クローン化され得（例えば、このオリゴヌクレオチドが組換え部位を含有する場合か、またはこのベクターがトポイソメラーゼにより変換（ｃｈａｒｇｅ）される場合）そしてさらに操作または配列決定され得る。別のこのような局面において、増幅前に、この集団の個々のメンバーはまた、分離され得、増幅され得、そしてその増幅産物が直接的に配列決定され得、それによってこのＤＮＡセグメントをクローン化および増幅する必要性が排除される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、この標的ＤＮＡは、適切な宿主細胞に導入された場合に、１つ以上の目的の生物学的活性の発現を生じる配列を有し得る。例えば、この標的ＤＮＡ配列の導入は、特定の酵素活性の発現を生じ得る。これらの実施形態において、組換え反応混合物で形質転換した宿主細胞を、目的の生物学的活性が存在しないことについて選択することが望ましくあり得、このようにしてこのトランスポゾンがその生物学的活性の発現のために必要な配列に挿入されたクローンを同定する。このことは、より大きな標的ＤＮＡ配列内でのこの活性をコードする配列の位置についての情報を提供する。このことは、特に、標的配列が大きい場合（例えば、標的配列が、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはゲノムフラグメントである場合）に有用である。
【０１１６】
このトランスポゾン含有標的ＤＮＡ分子の配列は、この標的ＤＮＡ分子にトランスポゾン配列の一部に結合するプライマーを接触させ、次いで当業者に公知の任意の適切な配列決定プロトコルを実行することにより決定され得る。
【０１１７】
配列決定の適用に関して、本発明が、標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入に代わる、または標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入に加えた、ベクター配列へのトランスポゾンの挿入により提示される障壁に打ち勝つということに注目することが重要である。簡単に言うと、図２は、標的含有ベクター分子へのたった１つの挿入を描いている；しかし、当業者は、複数の挿入もまた可能であることを理解する。転位反応の完了後に標的ＤＮＡを第２のベクターに移動させる組換え工程は、このベクターの配列決定についての問題を効果的に排除する。なぜなら、第１のベクター配列は、この組換え反応から回収されないからである。これは、ベクターへの挿入により、繰り返しこのベクターを配列決定することを必要とするかまたは、トランスポゾンがベクターに挿入されているクローンを除去するために退屈なスクリーニング手順を実施することを必要とする先行技術とは対照的である。トランスポゾンがベクターおよび標的配列に挿入されるこれらの場合において、生じた分子は先行技術の方法では用いられ得ない。なぜなら、配列決定される同じ分子内の２つのプライマー結合部位の存在が、生成物の不鮮明な混合物を生じることからである。本方法は、開始のＤＮＡ分子のトランスポゾン含有ベクター部分を除去するので、配列決定され得るより多くの分子が、所定の転位反応から回収され得る。
【０１１８】
（実施例３：挿入および組換えを使用する大きな核酸分子の操作）
本発明の方法は、図４Ａに示されるゲノムＤＮＡのような大きいＤＮＡの分子のセグメントをクローニングするために使用され得る。ゲノムＤＮＡに加えて、本発明の方法は、任意のより大きなＤＮＡ分子のセグメントのクローニングを可能にする。従って、本発明のこの実施形態は、ゲノムＤＮＡで例示されるが、当業者は、任意の大きなＤＮＡ分子由来のセグメントが、これらの方法を使用してクローニングされ得ることを理解する。例えば、大きいＤＮＡ分子は、ＹＡＣ、ＢＡＣまたは任意の単離された染色体またはその部分であり得る。
【０１１９】
ゲノムＤＮＡは、目的の生物から単離され、そして１つ以上の組換え部位を含むトランスポゾンおよび挿入触媒酵素に、トランスポゾンのゲノムＤＮＡへの組み込みを引き起こす条件下で接触される。次いで、ゲノムＤＮＡが、トランスポゾンの組換え部位と適合した組換え部位を有するベクタードナーと接触される（図４Ａ）。あるいは、トランスポゾンおよびベクタードナーにおける組換え部位が、トランスポゾンのみがベクタードナーと生産的に反応しえないように配向され得る（図４Ｂ）。適切な組換えタンパク質の存在下でのインキュベーションの後、反応混合物が、コンピテントな宿主細胞を形質転換するために使用され得る。この形質転換された宿主細胞は、ベクタードナー上の選択マーカーの存在について、および毒性遺伝子の存在に対して選択される条件下で増殖される。いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、組換え事象が、ゲノムＤＮＡとともに選択マーカーをベクタードナーに転移するように改変され得る。トランスポゾンの構成が、図５に示される。
【０１２０】
ゲノムＤＮＡのクローニングに関係する実施形態に適切なトランスポゾンは、２つの組換え部位を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、組換え部位は同じ配列を有し、そして逆の方向（すなわち、逆方向繰返し単位）である。この実施形態を使用するゲノムＤＮＡのクローニングの概略図を、図６に示す。いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、毒性ＤＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み得る。この型のトランスポゾンは、トランスポゾンの組換えクローニングまたはゲノムフラグメントの組換えクローニングを阻害する際に有用であり、このゲノムフラグメントは、クローニングのための組換え部位を提供されたトランスポゾン間に配置されるさらなるトランスポゾンを有する。他の好ましい実施形態において、組換え部位は、異なる配列を有し得、そして逆の配向にあり得る。トランスポゾンの挿入後、ゲノムＤＮＡは、トランスポゾン上の組換え部位とベクタードナー上の組換え部位との間の組換えを生じる条件下で、ベクタードナー分子と接触され、このベクタードナー分子は、トランスポゾンおよび適切な組換えタンパク質における部位と適合する組換え部位を有する。形質転換およびスクリーニングを、上記のように実施し得る。いくつかの実施形態において、ベクタードナー上に、トランスポゾンとベクタードナーを組換えるために使用される部位とは異なる特異性を有する１つ以上の更なる組換え部位を含むことが所望され得る（図６）。これらのさらなる部位は、クローニングされたＤＮＡのさらなる操作のために使用され得る。例えば、クローニングされたＤＮＡを、異なるベクターに移動させることが所望され得、これは、さらなる組換え部位を使用して達成され得る。
【０１２１】
いくつかの好ましい実施形態において、ゲノムクローニングに使用されるトランスポゾンは複製起点を含み得る。１つ以上の組換え部位および複製起点をさらに含むトランスポゾンが、ゲノムＤＮＡに挿入される。トランスポゾン上に存在する組換え部位は、隣接するトランスポゾン上に存在する組換え部位と組換えられ得、２つの組換え部位の間のフラグメントの切除を生じる。切除された分子は、複製起点を有する環状分子であるので、この切除された分子は、宿主細胞において安定に維持され得る。切除された分子の選択を容易にするために、本発明のトランスポゾンは、必要に応じて、１つ以上の選択マーカーを含む。この型のいくつかの実施形態において、トランスポゾンの２つの個別の集団をゲノムＤＮＡに組込むことが所望され得る。好ましい実施形態において、１つの集団は、組換え部位および複製起点を含み得るが、一方で、他のトランスポゾンは、選択マーカーおよび組換え部位を含み得る。２つの隣接するトランスポゾン上に存在する組換え部位の間の組換えが、目的のＤＮＡに加えて、複製起点および選択マーカーを含むＤＮＡ分子を生成する。このような分子は、選択マーカーに１つ以上について選択された適切な宿主細胞系列に形質転換され得る。これは、図７に模式的に示される。
【０１２２】
組込み反応に存在するゲノムＤＮＡの濃度とトランスポゾンの濃度との比は、ベクタードナーに形質転換されるゲノムＤＮＡフラグメントの大きさを制御するように変化され得る。トランスポゾンの濃度を増加させることによって、ゲノムＤＮＡフラグメントの平均の大きさが減少され得る。
【０１２３】
（実施例４：転移および組換えを使用するサブクローンの構築）
トランスポゾンを含む標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡの配列全体未満を含むクローンを構築するために使用され得る。このようなより小さいクローンは、一般に、命名されたサブクローンである。トランスポゾンは、組換え部位を含むか、または組換え部位に隣接する標的ＤＮＡに挿入されて、図８Ａの上部に示される分子を生成し得る。このトランスポゾンは、標的分子の組換え部位とは異なる１つ以上の組換え部位を含み得、そして１つ以上の選択マーカーをさらに含み得る。次いで、この分子は、トランスポゾンおよび標的と組換えられる組換え部位を含む１つまたは２つのベクタードナーと接触される。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含むベクターが、さらなる組換え部位を備え得、一方で、ベクタードナーは、これらのさらなる部位と組換えられる組換え部位を含む。組換えが行われ、次いで、組換え反応において生成された核酸が宿主細胞に挿入される。形質転換反応の部分を、種々の選択培地上にプレートすることによって、所望のサブクローンが、図８Ａに示されるように単離され得る。
【０１２４】
図８Ｂに示される、いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡのセグメントが、置換され得る。例えば、ＲＳ₁およびＲＳ₂に隣接する標的ＤＮＡのセグメントが、置換配列と交換され得る。この置換配列は、置換されたセグメントとは異なる大きさであり得る。従って、標的ＤＮＡの大きなセグメントと、小さい置換配列との交換は、標的配列の一部分の欠失を生じる。置換配列は、標的配列に、任意の好ましい特性（所望の生物学的活性の発現を含むが、これに限定されない）を導入する。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態において、組換え部位、複製起点および選択マーカーを含むトランスポゾンは、標的分子に組込まれる。トランスポゾン上に存在する組換え分子は、標的ＤＮＡ分子を含むベクター上に存在する組換え部位と適合するように選択される。トランスポゾンの挿入の後、組換えが、ベクタードナーの非存在下で行われる。この結果は、トランスポゾンに存在する組換え部位とベクターに存在する組換え部位との間のＤＮＡの切除である。標的ＤＮＡの切除部分は、複製起点および選択マーカーを含むために、この切除部分は、宿主細胞に挿入され、そして安定に維持される。この結果は、標的ＤＮＡの切除部分をサブクローニングすることである。これを、図９に模式的に示す。
【０１２６】
（実施例５：転移および組換えを使用するＰＣＲフラグメントのクローニング）
本発明の方法を使用して、ＰＣＲフラグメントをクローニングし得る。組換え配列（またはその部分）を含むプライマーを使用して、標的ＤＮＡ配列を増幅する（米国仮特許出願番号６０／０６５，９３０（１９９７年１０月２４日出願）および米国特許出願番号０９／１７７，３８４を参考のこと）。あるいは、ＰＣＲプライマーが、例えば、制限酵素についての認識配列を含むことによって、連結可能な末端の生成を可能にする配列を有し得る。組換え部位（または連結可能な部位）に隣接する得られた線状フラグメントは、選択マーカーまたは複製起点を含むトランスポゾンと反応される。トランスポゾンの組込み後、組換え反応（連結反応）が、行われる。この結果は、複製起点および選択マーカーを有する環状分子である。あるいは、分子は、最初に環化され得、続いてトランスポゾンの組込みに供され得る。この環状分子が、コンピテントな宿主細胞に形質転換され、そして維持され得る。この方法は、遺伝子標的化ベクターの構築のために特に有用である。この型のいくつかの実施形態において、トランスポゾンは、ネオマイシンに対する耐性を与える選択マーカーを含み得、そしてこの選択マーカーを含む細胞が、Ｇ−４１８を用いて選択され得る。この方法の模式図は、図１０に示される。図１０に示される実施形態において、標的ＤＮＡ分子が、ＲＳ₁およびＲＳ₂によって示される組換え部位を含むプライマーを使用して増幅される。組込み配列が増幅産物に挿入され、次いで、この増幅産物が、組換え事象によって環化される。他の実施形態において、組込み産物を含む増幅産物が、増幅産物の組換え部位と適合する組込み部位を有する別の核酸分子と反応され得る。
【０１２７】
（実施例６：標的ＤＮＡ分子における欠失の構築）
２つの異なる非反応性組換え部位に隣接する標的ＤＮＡ分子を含むベクターが、標的ＤＮＡ分子への、またはベクターへの、または両方への、トランスポゾンの挿入を引き起こす条件下で、トランスポゾンおよび挿入−触媒酵素と接触される。トランスポゾンは、標的ＤＮＡ分子に隣接する組換え部位および配列決定プライマー結合部位のうちの１つと適合性の組換え部位を含むように構築され得る。さらに、トランスポゾンは、図１１に示されるように分布される、選択マーカーをコードする配列および毒性遺伝子をコードする配列を含み得る。
【０１２８】
標的ＤＮＡ分子を含むベクターへのトランスポゾンの挿入の後に、組換え反応が、トランスポゾン上に存在する組換え部位とベクター上に存在する適合可能な組換え部位との間で実施され得る。図１１を参照して、これは、ＲＳ₃とＲＳ₂との間の組換えである。組換え反応混合物を使用して、毒性遺伝子に対して感受性であるコンピテントな宿主細胞を形質転換し、そして形質転換された宿主細胞が、トランスポゾン上に存在する選択マーカーおよびベクター上に存在する選択マーカーを使用する選択のための適切な試薬を含むプレート上に広げられる。トランスポゾン中の組換え部位が、ベクター中の同族組換え部位に対して、逆方向にあるような、トランスポゾンのベクター配列への挿入またはトランスポゾンの標的ＤＮＡへの挿入は、毒性遺伝子を保持する分子を生じ、従って、形質転換の際にコロニーを生成しない。トランスポゾンの組換え部位が、ベクター上の組換え部位と同じ配向を有するように、トランスポゾンが標的ＤＮＡに挿入される場合、標的ＤＮＡの一部分および毒性遺伝子を含むトランスポゾンの一部分が欠失される。得られた欠失プラスミドは、形質転換の際にコロニーを生成する。プラスミドは、ポジティブなコロニーから回収され得、そして標的ＤＮＡのどれくらいが欠失されたかをアッセイするために、回収されたプラスミドのサイズが、ゲル電気泳動によって決定され得る。必要に応じて、プラスミドが、従来の技術を使用する制限マッピングによって分析され得る。
【０１２９】
あるいは、図１２に示されるように、欠失された配列が回収され得る。１つ以上の組換え部位を含む挿入エレメントが、組換え部位を含む分子の標的領域に挿入される。ベクタードナーと接触される場合、挿入エレメント上の組換え部位と標的分子上の組換え部位と標的分子上の組換え部位との間の領域が、ベクタードナーに転移され、もともとの標的の欠失部分のクローニングを生じる。
【０１３０】
（実施例７：固体支持体上での核酸分子の集団の生成）
本発明の方法は、さらに、固体基板に付着された分子の集団を生成するために使用され得る。このアプローチは、集団のメンバーを分離するために、増幅のためのテンプレートとして機能し得るか、またはＤＮＡセグメントのさらなる付加および操作のための基板として使用され得る核酸分子を提供するために、あるいいは、インビトロ転写／および翻訳のような系において、およびプローブ生成のためのテンプレートとして利用され得る。図１３に模式的に示される、１つのこのような局面において、標的ＤＮＡは、少なくとも１つの組換え部位を含むトランスポゾンと反応される。本発明のこの局面の１つの好ましい実施形態において、標的ＤＮＡおよびトランスポゾンは線状であるが、これらの分子の他の構成および構造（例えば、円形、スーパーコイル状、ヘアピンなど）がまた、使用され得る。組換え部位を含むトランスポゾンのランダムな（または指向された）組込みは、組換え部位を各々含む分子の集団を生成する。この集団は、さらに、固体基板上に固定された組換え部位と反応され得、その結果、組換え反応が、標的ＤＮＡと固定化組換え部位との共有結合を生成する。固定化基板の各々の特徴は、それによって、集団のメンバーを含む。
【０１３１】
このような固定化集団について、多くの適用が存在する：例えば、個々の特徴が、さらに、トランスポゾンおよび標的ＤＮＡの末端に相補的なオリゴヌクレオチドを使用する増幅のための基板として使用され得る。可動プライマー部位としてトランスポゾンを使用する集団からのいくつかのメンバーを配列決定することによって、大きなＤＮＡセグメントの全体が決定され得る。同様に、特徴上のメンバーから生成されるアプリコンが、プローブの生成、タンパク質のセグメントの発現、ドメイン（ＤＮＡまたはタンパク質）の局在化などのために、使用され得る。所望ならば、各集団のメンバーが、組換え部位および標的ＤＮＡの末端と適合性の末端を含むベクターを使用して、クローニングされ得るか、または増幅に続いてクローニングされ得ることに注意すべきである。
【０１３２】
理解の明確さの目的のための図および実施例によって、いくらか詳細に本発明を記載してきたが、本発明の範囲またはその任意の特定の実施形態に影響することなく、条件、処方および他のパラメータの広範および等価な範囲内で、本発明を改変および変更することによって、本発明が実施され得、そしてこのような化異変または変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることが、当業者に明らかである。
【０１３３】
本明細書中に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示し、そして個々の各刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されることが、具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の組換え反応の模式図である。
【図２】 図２は、標的核酸分子および／またはベクター核酸分子へのトランスポゾンの挿入の模式図である。
【図３】 図３は、本発明を使用して、転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）反応を行った後に組換えクローニング工程を行うことによって、挿入配列を含む標的核酸分子について選択し得る方法の模式図である。
【図４Ａ】 図４Ａは、組換え部位を含むトランスポゾンを用いたゲノムＤＮＡのクローニングの模式図である。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、生成性および非生成性の組換え反応を可能にするように配向された組換え部位を含むトランスポゾンを用いたゲノムＤＮＡのクローニングの模式図である。
【図５】 図５は、組換えによって選択マーカーを転移するように設計したトランスポゾンの模式図である。
【図６】 図６は、毒性遺伝子を含むトランスポゾンを用いたゲノムＤＮＡのクローニングの模式図である。
【図７】 図７は、複製起点を含むトランスポゾンおよび選択マーカーを含むトランスポゾンを用いたゲノムＤＮＡのクローニングの模式図である。
【図８Ａ】 図８Ａは、本発明の組成物および方法を用いた、サブクローンの構築の模式図である。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、本発明の組成物および方法を用いた標的配列の一部の置換の模式図である。
【図９】 図９は、本発明の方法に従った、複製起点を含む挿入配列を用いたサブクローンの構築の模式図である。
【図１０】 図１０は、本発明の組成物および方法を用いたＰＣＲ産物からの遺伝子標的化ベクターの構築の模式図である。
【図１１】 図１１は、本発明の組成物および方法を用いた、標的ＤＮＡ分子における欠失の構築の模式図である。
【図１２】 図１２は、本発明の組成物および方法を用いた、標的分子の欠失部分のクローニングの模式図である。
【図１３】 図１３は、本発明の組成物および方法を用いた、固体支持体に付着した核酸分子の集団の生成の模式図である。
これらの図面において、組換え部位は、ＲＳによって示され、そして組換え部位は、下付の数字によって識別され、選択マーカーはＳＭおよび下付の数字によって示される。２つの適合性の組換え部位の反応生成物は、ＲＳと称され、そして下付数字は、組換えられる２つの部位を示す。

Claims (8)

1. 固体基板に付着された核酸分子の集団を生成するための方法であって、以下：
   （ａ）標的核酸配列とトランスポゾンとを接触させる工程であって、該標的核酸配列に組み込まれて、組換え部位を含む標的核酸配列の集団が生成するように、該トランスポゾンが少なくとも１つの組換え部位を含む、工程、
   （ｂ）組換え部位を含む標的核酸配列の集団と固体支持体上に固定された組換え部位を接触させる工程、および
   （ｃ）標的核酸が固定された組換え部位に共有結合されるように、組換え反応を行なう工程、
   を包含する、方法。
2. トランスポゾンをプライマー部位として使用して標的核酸の配列を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 組換え部位がｌｏｘ部位およびａｔｔ部位を含む群より選択される、請求項１に記載の方法。
4. 組換え部位がａｔｔ部位である、請求項３に記載の方法。
5. トランスポゾンが環状分子である、請求項１に記載の方法。
6. トランスポゾンが線状分子である、請求項１に記載の方法。
7. 標的核酸配列が環状分子である、請求項１に記載の方法。
8. 標的核酸配列が線状分子である、請求項１に記載の方法。

Images