JP2000503534A - アデノウイルスベクターのリコンビナーゼ媒介生成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プラスミドなどのポリヌクレオチドからアデノウイルスベクターを生成する一つの方法であって、ここでアデノウイルスＩＴＲおよびＩＴＲに結合された末端タンパク質のプラスミドへの転移が生じ、かくしてプラスミドにアデノウイルスベクターとして複製可能にする方法。このような方法は選択マーカーおよびスクリーニング手順を使用せずにプラスミドから高力価でアデノウイルスベクターの急速な生成を可能にする。このような方法はアデノウイルスバックボーン遺伝子を欠いたアデノウイルスベクターの急速な生成を可能にする。この方法は更に形質導入細胞を、生体内で細胞の高水準永続的遺伝子修飾をもたらすレトロウイルスベクターを生産する生産者細胞に転換するハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターを生成するために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウイルスベクターのリコンビナーゼ媒介生成 この出願は１９９６年１月５日受理された出願連続番号０８／５８３，７０３ 号を一部継続出願するものであり、その内容はここで引用例としてとり込まれて いる。 この発明はアデノウイルスベクターの生成に関する。より詳細には、この発明 はプラスミドなどのポリヌクレオチド構築物から直接アデノウイルスを生成する ことに関し、それにより部位特異的リコンビナーゼはそこに結合した端末タンパ ク質を持つアデノウイルスＩＴＲのプラスミドへの転移を媒介し、それによりプ ラスミドがあたかもアデノウイルスであるかのようにプラスミドが有効に複製す ることを可能にする。この発明は更に完全にアデノウイルスバックボーン遺伝子 を欠いているアデノウイルスベクターに関し、またｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎ ｖを含むレトロウイルス構築タンパク質に対する遺伝子と同じくレトロウイルス ベクター配列を転移するアデノウイルスベクターに関する。 ここで使用されるように、「アデノウイルスベクター」という用語は適切な細 胞に転移される望ましいＤＮＡ配列をとり込む組換えアデノウイルスＤＮＡを含 むアデノウイルス粒子である遺伝子転移伝達体を意味する。発明の背景 アデノウイルスゲノムは約３６キロベースペア長の線形二本鎖ＤＮＡ分子であ る。ウイルスゲノムの各末端はウイルス複製に必要である逆方向末端反復（すな わちＩＴＲ）として知られる短い配列を持つ。アデノウイルスの十分に特徴付け られた分子遺伝的特徴は遺伝子転移のためにそれに有利なベクターを与える。ア デノウイルスの遺伝子組織の知識はウイルスの大型断片の外部配列への置換を可 能にする。加えて、組換えアデノウイルスは構造的に安定しており、拡張性増幅 後は転位ウイルスは観察されない。 アデノウイルスはかくして望ましい遺伝子を真核細胞に導入する送達伝達体と して使用され、これによりアデノウイルスは細胞受容体を結合し、被覆小胞を経 由して内在化し、エンドソームを分断し、また粒子を細胞質に放出しアデノウイ ルス遺伝プログラムの核転座および分子発現へと続くことによりこのような遺伝 子を真核細胞に送達する。 一般に、異種遺伝子すなわち移植遺伝子を含むアデノウイルスベクターを構築 するために、プラスミドは移植遺伝子発現カセットおよび通常はウイルスの左末 端、あるいは５′末端からのいくつかのアデノウイルス配列を含むように調製さ れる。プラスミドは次いで大抵のアデノウイルス配列を含むＤＮＡと共に同時形 質移入され、また異種組換えが起こり、例えば２９３細胞などのアデノウイルス 生産者細胞上にプラーク（溶菌斑）を産出する。プラークは摘み取られ、増幅さ れ、スクリーンされ、更に増大される。このような工程は数ケ月あるいはそれ以 上かかる場合がある。もし誰かがベクターバックボーンを変え たいと望む場合、工程は更に操作を含むことになる。単一アデノウイルス遺伝子 がアデノウイルスバックボーンから欠失されるべき場合には、最初の段階は遺伝 子をトランスで発現するパッケージング細胞を生成することである。次に新しい プラスミドは生成され、それは欠失されたアデノウイルス遺伝子でアデノウイル スバックボーンの一部をコード化する。このプラスミドはアデノウイルスの残渣 をコード化するＤＮＡで同時形質移入される。異種組換えが次いで生じ、またア デノウイルスプラークが生成され、スクリーンされ、また増大され、かくして変 更されたバックボーンを持つウイルスを生成する。このウイルスは次いで前に記 載したように移植遺伝子コード化プラスミドを用いて相同的組換えにより異種遺 伝子を持つベクターを生成するために使用される。このようなアデノウイルスベ クターの生成は１年あるいはそれ以上かかることもある。発明の要約 この発明はプラークを獲得し、スクリーンし、あるいは増大する必要なしでプ ラスミドなどのポリヌクレオチドから直接アデノウイルスベクターを生成する細 胞およびその方法を提供する。この発明は十分な量の時間を節約し、移植遺伝子 およびもしくはバックボーン遺伝子を持つベクターに変更が行われ非常に急速に 検査されることを可能にする。とりわけ、この発明は共有結合で付加されたアデ ノウイルス末端タンパク質を持つアデノウイルスＩＴＲのプラスミドへのリコン ビナーゼ媒介転移を通じてプラスミドなどのポリヌクレオチドからのアデノウイ ルスベクターの生成を提供する。この発明に従って、高濃度のアデノウイルスベ クターを形質移入細胞から直接得ることができる。 この発明は更にすべてのアデノウイルスバックボーン遺伝子がそれから欠失し ているアデノウイルスベクターの急速な生成に向けられる。このような「中身無 し」（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクターは現在利用できるベクターよりも著しい進歩を 提供するが、それはアデノウイルスバックボーン遺伝子産物の毒性および免疫原 性が避けられるためである。更にこのようなベクターは標準ベクターによりこう むる７，０００塩基対の限界とは対照的に、異種配列の３７，２００塩基対まで をとり込むことができた。 この発明のも一つの見地は、レトロウイルス構築タンパク質の遺伝子と同じよ うに、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含むレトロウイルスベクター配列を転移 できるアデノウイルスベクターの急速な生成に関する。ＨＡＲＶとしても知られ るこのようなハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターは形質導入 細胞をレトロウイルスベクターの生産者に形質転換する。かくしてＨＡＲＶベク ターの単一注射は異種遺伝子を含むレトロウイルスベクターの組織を通じての拡 散をもたらすことができる。レトロウイルスベクター形質導入はベクター配列の 宿主細胞ゲノムＤＮＡへの組み込みを伴うために、ＨＡＲＶベクターの単一投与 は標的組織の広範囲で永続的な遺伝子修飾をもたらすであろう。図面の簡単な説明 この発明はこれから図面との関連で説明されるであろう。ここで、 図１は２９３ｅ Ｃｒｅ細胞に形質移入された２個のＬｏｘ部位を含むプラス ミドの組換えのサザンブロット分析である。 図２はアデノウイルス５Ｅ４プロモーター配列のダイヤグラムおよびヘルパー ウイルスＤＬ３２７Ｌｏｘの概略図である。 図３はプラスミドｐＲＥｌｏｘの地図である。 図４はプラスミドｐＲＡＤの地図である。 図５はプラスミドｐＳ６ＡＮＬａｃＺの地図である。 図６はプラスミドｐＶＮの地図である。 図７はｐＶＮからアデノウイルスベクターを生成する概略図である。 図８はｐＶＮおよびＤＬ３２７Ｌｏｘで形質移入された２９３ｅ Ｃｒｅ細胞 からのウイルス溶菌液と接触した２９３細胞の、ＤＬ３２７Ｌｏｘのみで形質移 入された２９３ｅ Ｃｒｅ細胞からのウイルス溶菌液と接触した２９３細胞の、 およびｐＶＮのみで形質移入された２９３ｅ Ｃｒｅ細胞からのウイルス溶菌液 と接触した２９３細胞のＸ−ｇａｌ染色結果を描く。 図９はプラスミドｐＶＮＬ５の地図である。 図１０はｐＶＮＬ５およびＡｄ ｄ１３２７ｌｏｘからのアデノウイルスベク ターの生成、およびこのようなアデノウイルスベクターのＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細 胞への形質導入の概略図である。 図１１はｐＶＮＬ５およびＡｄ ｄ１３２７ｌｏｘの無細胞 Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えの末端タンパク質での形質移入から生成された粗ウイルス 溶菌液で形質導入されたＸ−ｇａｌ染色ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞を描く。 図１２はｐＶＮＬ５およびＡｄ ｄ１３２７ｌｏｘの間のＣｒｅ媒介組換えの 結果として生成されたアデノウイルスベクターを含む粗ウイルス溶菌液と接触さ れたＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。 図１３はプラスミドｐＶＨ８３０１の地図である。 図１４はプラスミドｐＶＨ８３０２の地図である。 図１５はプラスミドｐＡｖＳ６Ａの地図である。 図１６はプラスミドｐＨＶＳ１の地図である。 図１７はプラスミドｐＶＮＬ６の地図である。 図１８はｐＶＮＬ６およびＬｏｘＨＶ１のパッケージングシグナル領域の概略 図であり、またＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞のアデノウイルスＥ１発現構築物の概略 図である。 図１９は末端タンパク質を持つｐＶＨ８３０２およびＬｏｘＨＶ１の無細胞シ ステムでのＣｒｅリコンビナーゼとの反応、続くＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞の形質 移入の概略図である。 図２０はプラスミドｐＧ１の地図である。 図２１はプラスミドｐＧ１ＳＨ８１０２の地図である。 図２２はプラスミドｐＶＮＬ７の地図である。 図２３はプラスミドｐＨＡＲＶ１Ｈ８１の地図である。 図２４は末端タンパク質を持つｐＨＡＲＶ１Ｈ８１およびＬｏｘＨＶ１の無細 胞システムでのＣｒｅリコンビナーゼとの反応、続くＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞の 形質移入の概略図であ る。発明の詳細な説明 この発明の一つの見地に従って、異種ＤＮＡを発現するアデノウイルスベクタ ーを生産する細胞が提供される。細胞は第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレ オチド、および第三ポリヌクレオチドを含む。それからアデノウイルスが誘導さ れる第一ポリヌクレオチドは発現される異種ＤＮＡ、および１個のアデノウイル スＩＴＲを含む。第一ポリヌクレオチドは更にアデノウイルスパッケージングシ グナル、およびリコンビナーゼ標的部位を含む。一般に、ＩＴＲおよびリコンビ ナーゼ標的部位はアデノウイルスベクターにとり込まれるＤＮＡ配列にそれらが 隣接するように位置を占める。 第二ポリヌクレオチドはＩＴＲに結合する末端タンパク質を含む少くとも１個 のアデノウイルスＩＴＲ、およびリコンビナーゼ標的部位を含む。第二ポリヌク レオチドにあるＩＴＲは、第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを 含む場合には５′ＩＴＲである。第二ポリヌクレオチドにあるＩＴＲは第一ポリ ヌクレオチドがアデノウイルス５′ＩＴＲを含む時はアデノウイルス３′ＩＴＲ である。第三ポリヌクレオチドは部位特異的リコンビナーゼをコード化するＤＮ Ａを含む。細胞は更にそのようなＤＮＡが第一、第二および第三ポリヌクレオチ ドに存在しない範囲でアデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレオチドの複 製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮ Ａを含む。 一つの実施例において、アデノウイルスベクター粒子として第一ポリヌクレオ チドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化 するＤＮＡは第二ポリヌクレオチドに含まれる。も一つの実施例において、アデ ノウイルスベクターとして第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングの ためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡは第一ポリヌクレオチド に含まれる。 更にも一つの実施例において、アデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレ オチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード 化するＤＮＡの一部は第一ポリヌクレオチドに含まれ、またアデノウイルスベク ターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデ ノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡの一部は前記第二ポリヌクレオチド に含まれる。 一つの更なる実施例において、アデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレ オチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード 化するＤＮＡの一部は第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドから独 立しており、すなわちアデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレオチドの複 製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮ Ａのそのような部分は第一、第二、および第三ポリヌクレオチドでの細胞の形質 移入に先立ち細胞により提供され細胞に含まれる。 一つの実施例において第一ポリヌクレオチドはアデノウイルス５′ＩＴＲおよ びアデノウイルスパッケージングシグナルを 含み、また第二ポリヌクレオチドはアデノウイルス３′ＩＴＲに結合した末端タ ンパク質を持つアデノウイルス３′ＩＴＲを含む。も一つの実施例において、第 一ポリヌクレオチドはアデノウイルス３′ＩＴＲおよびアデノウイルスパッケー ジングシグナルを含み、また第二ポリヌクレオチドはアデノウイルス５′ＩＴＲ に結合した末端タンパク質を持つアデノウイルス５′ＩＴＲを含む。 アデノウイルスベクターの生成は細胞を第一、第二、および第三ポリヌクレオ チドで形質移入することにより達成される。選択肢として、部位特異的リコンビ ナーゼをコード化するＤＮＡはプラスミドなどの適切な発現伝達体内にある細胞 に含まれ、あるいは第一および第二ポリヌクレオチドでの細胞の形質移入に先立 ち細胞の染色体に組み込まれる。ポリヌクレオチドでの細胞の形質移入に際して 、細胞により発現されるリコンビナーゼは第一および第二ポリヌクレオチドにあ るリコンビナーゼ標的部位と相互作用する。このようなリコンビナーゼ標的部位 は同じ配向にある。リコンビナーゼのリコンビナーゼ標的部位との相互作用は、 そこに結合されたアデノウイルス末端タンパク質でのＩＴＲの第二ポリヌクレオ チドから第一ポリヌクレオチドへの転移を可能にし、それは第一ポリヌクレオチ ドからアデノウイルスベクターを生成する。第一ポリヌクレオチドがアデノウイ ルス５′ＩＴＲを含む時、アデノウイルス３′ＩＴＲおよびそこに結合された末 端タンパク質は第二ポリヌクレオチドから第一ポリヌクレオチドに転移される。 第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを含む時、アデノウイルス ５′ＩＴＲおよびそこに結合された末端タンパク質は第二ポリヌクレオチドから 第一ポリヌクレオチドに転移される。 第一ポリヌクレオチドがプラスミドである場合には、形質移入に先立ち望まし くはプラスミドは線形化される。かくして一つの実施例において、プラスミドは 線形化に先立ち、プラスミドが５′ＩＴＲを含む時は５′ＩＴＲに対するユニー ク制限部位５′およびリコンビナーゼ標的部位に対する３′を含む。プラスミド が３′ＩＴＲを含む時は、プラスミドは更に一つの実施例において３′ＩＴＲに 対し３′およびリコンビナーゼ標的部位に対して５′であるユニーク制限部位を 含む。ここで使用される「ユニーク制限部位」という用語は、そのような部位が 第一ポリヌクレオチドで１回だけ現れることを意味する。ユニーク制限部位は更 に希有制限酵素部位である。ここで使用される「希有制限酵素部位」という用語 は１０，０００塩基対毎に１回以下の頻度で真核遺伝子に生じる制限部位を意味 する。 一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドはプラスミドであり、それは５ ′から３′方向でユニーク制限部位、アデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイル スパッケージングシグナル、異種ＤＮＡ、およびリコンビナーゼ標的部位を含む 。第二ポリヌクレオチドで少くとも１個のＩＴＲはアデノウイルス３′ＩＴＲで ある。も一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドは細胞への形質移入に先 立ち線形化され、５′から３′方向でユニーク制限部位を除き前記の成分を含み 、また第二ポリヌクレオチドで少くとも１個のＩＴＲはアデノウイルス３′ ＩＴＲである。 更なる実施例において、第一ポリヌクレオチドは更にアデノウイルス３′ＩＴ Ｒを含む。 なおまたも一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドは５′から３′方向 でリコンビナーゼ標的部位、アデノウイルスパッケージングシグナル、異種ＤＮ Ａ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、およびユニーク制限部位を含むプラスミドであ る。第二ポリヌクレオチドで少くとも１個のＩＴＲはアデノウイルス５′ＩＴＲ である。一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドは細胞への形質導入に先 立ち線形化され、また第一ポリヌクレオチドは５′から３′方向でユニーク制限 部位を除き前記の成分を含み、また第二ポリヌクレオチドで少くとも１個のＩＴ Ｒはアデノウイルス５′ＩＴＲである。 更なる実施例において、第一ポリヌクレオチドは更にアデノウイルス５′ＩＴ Ｒを含む。 この発明の範囲はいずれかの理論的類推に限定される意図はないけれども、前 に記載の通りポリヌクレオチドでの細胞の形質移入に際し、第一ポリヌクレオチ ドおよび第二ポリヌクレオチド内でリコンビナーゼ標的部位での細胞により発現 される部位特異的リコンビナーゼの相互作用は、ＩＴＲに結合された末端タンパ ク質を持つアデノウイルスＩＴＲの第二ポリヌクレオチドから一つの実施例では プラスミドの形態にある第一ポリヌクレオチドへの転移をもたらすために十分な 部位特定的分子間組換えを媒介する。そこに結合された末端タンパク質を持つＩ ＴＲはアデノウイルスとしての第一ポリヌクレオチドの複製の 鋳型として役立つ。第二ポリヌクレオチドから第一ポリヌクレオチドへのＩＴＲ および末端タンパク質のこのような転移は今やアデノウイルスとして複製する第 一ポリヌクレオチドの複製を劇的に増進することを出願人は発見した。このよう な複製増進により、望ましければ第一ポリヌクレオチドは選択マーカーを含む必 要はない。第一ポリヌクレオチドが１回の複製後にプラスミドである時には、末 端タンパク質は両ＩＴＲに共有結合で付着され、またＩＴＲおよびＩＴＲ間の配 列はプラスミドから取り除かれアデノウイルスベクターとして効果的に複製を続 ける。プラスミドのように前に記載したポリヌクレオチドからのアデノウイルス ベクターの誘導は形質移入細胞から直接高水準のベクター生産を可能にするのに 十分有効であり、かくして新しいベクターを生成するためにプラークを獲得しス クリーンする必要性を除去する。 リコンビナーゼは細胞により各種の方法で発現される。一つの実施例において 、第三ポリヌクレオチドはリコンビナーゼをコード化するＤＮＡ配列を含むプラ スミドである。このようなプラスミドはエピソーム状に複製でき、あるいは細胞 染色体ＤＮＡに組み込まれる。リコンビナーゼをコード化するＤＮＡは以下の適 切なプロモーター、強力な構成プロモーターなど、ＣＭＶプロモーター、あるい は誘導プロモーターなど、例えばデキサメタゾンにより誘導されるグルココルチ コイド応答要素（ＧＲＥ）プロモーターなどの制御下にある。 も一つの実施例において、部位特異的リコンビナーゼをコード化するＤＮＡ配 列は第一あるいは第二ポリヌクレオチド内に 含まれる。 使用されるリコンビナーゼは必ずしもそれに限定されないが、リコンビナーゼ のＩｎｔ科のものを含み、これはＤＮＡ切断および結合の触媒作用のための一般 化学を反映するものと考えられる４種のアミノ酸（Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｔ ｙｒ）の不変パターンを共有する約３０個のタンパク質よりなる（ランディ、遺 伝学および成長に関する今日の見解 、３巻、６９９−７０７ページ（１９９３） ）。このようなリコンビナーゼの例は必ずしもそれに限定されないがＣｒｅリコ ンビナーゼおよびＦ１ｐリコンビナーゼを含む。 一つの実施例において、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、第一 および第二ポリヌクレオチドに含まれるリコンビナーゼ標的部位はＬｏｘ部位で ある。Ｃｒｅリコンビナーゼおよびそのポリヌクレオチド配列、同じくＬｏｘ部 位はバクテリオファージＰ１で見出され、また更にスターンバーグ、他、分子生 物学ジャーナル 、１８７巻、１９７−２１２ページ（１９８６）；サウアー、他 、分子細胞生物学、７巻、８号、２０８７−２０９６（１９８７．６月）；サウ アー、他、全米科学アカデミー紀要、８５巻、５１６６−５１７０ページ（１９ ８８．７月）；サウアー、他、核酸研究、１７巻、１号、１４７−１６１ページ （１９８９）；またサウアー、酵素化学方法論、２２５巻、８９０−９００（１ ９９３）に記述されている。 も一つの実施例において、リコンビナーゼはＦ１ｐリコンビナーゼであり、リ コンビナーゼ標的部位はｆｒｔ部位である。 Ｆ１ｐリコンビナーゼおよびそのポリヌクレオチド配列、ならびにｆｒｔ部位は オゴーマン、他、サイエンス、２５１巻、１３５１−１３５５ページ（１９９１ ．３．１５）およびゴーリック、他、細胞、５９巻、４９９−５０９ページ（１ ９８９．１１．３）に詳細に記述されている。 望ましい実施例において、第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチド のリコンビナーゼ標的部位は同一の配向にある。 この発明の範囲はそれにより限定されることを意図していないけれども、各種 の望ましい遺伝子の１個もしくはそれ以上を含むベクターを設計するためにプラ スミドである第一ポリヌクレオチドからアデノウイルス配列を除去する可撓性を 最適化するために、リコンビナーゼ標的部位は転移されるべきＩＴＲの近くの第 二ポリヌクレオチドに位置されることが望ましい。かくして、そこに結合された 末端タンパク質を持つ３′ＩＴＲを第二ポリヌクレオチドから第一ポリヌクレオ チドに転移することを望む場合には、一般にリコンビナーゼ標的部位は第二ポリ ヌクレオチドの３′ＩＴＲからの１００塩基５′以下である。 そこに付着された末端タンパク質を持つ５′ＩＴＲを第二ポリヌクレオチドから 第一ポリヌクレオチドに転移することを望む場合には、リコンビナーゼ標的部位 は一般に第二ポリヌクレオチドに位置する５′ＩＴＲに対し１００塩基３′以下 に位置する。 前に述べた通り、望ましい実施例において第一ポリヌクレオチドはプラスミド 形態にある。望ましくは、プラスミドの細胞 への形質移入に先立ち、プラスミドは線形化される。かくしてプラスミドは線形 化に先立ち前に述べた通りＩＴＲおよびリコンビナーゼ標的部位の間に位置する ユニーク制限部位を含む。 一つの実施例において、プラスミドはアデノウイルスタンパク質を発現するＤ ＮＡを欠いており、望ましくは選択マーカーをコード化するＤＮＡも欠いている 。このようなプラスミドはＤＮＡの大型挿入断片（３７，２００個までの塩基対 ）を収容することができ、それは以下に記載の通り治療薬をコード化する１個も しくはそれ以上のＤＮＡ配列を含む。このような実施例において、第二ポリヌク レオチドはアデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウイルスパッケージングシグナル ；アデノウイルスベクター粒子としてプラスミドの複製およびパッケージングの ためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ；リコンビナーゼ標的部 位；およびアデノウイルス３′ＩＴＲを含むヘルパーウイルスである。アデノウ イルス末端タンパク質はヘルパーウイルスからプラスミドに転移されるべき少く とも５′ＩＴＲあるいは３′ＩＴＲに結合されている。プラスミドおよびヘルパ ーウイルスがリコンビナーゼをコード化するＤＮＡ配列を含む第三ポリヌクレオ チドと共に細胞内に形質移入される時、アデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウイ ルスパッケージングシグナル；異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列；およ びアデノウイルス３′ＩＴＲを含む「中身無し」アデノウイルスベクターが生成 される。このベクターはアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡを欠い ておりまた望ましくは選択 マーカーをコード化するＤＮＡを欠いている。更に細胞から生成されるのはヘル パーウイルスである。このような工程において、ヘルパーウイルスはベクター複 製を支持するのに十分な水準、しかもなおこれによりプラスミド誘導ベクターが 増大工程の間に生産されるウイルス調製から希釈されない十分に低い水準に留ま る。プラスミドから生成されるアデノウイルスベクターは、例えば塩化セシウム 勾配で行われる平衡密度遠心分離のような従来の手段により分離もしくは精製さ れる。このような分離を可能にするために、アデノウイルスベクターはヘルパー ウイルスの塩基対とは異なる数多くの塩基対を持つことが望ましい。例えばアデ ノウイルスベクターは多数の塩基対を持つがそれはヘルパーウイルスの塩基対よ り少ない。 一つの実施例において、ヘルパーウイルスは突然変異パッケージングシグナル を含む。ここで使用される「突然変異（された）」という用語はパッケージング シグナルの１個もしくはそれ以上の塩基対が欠失あるいは変更され、これにより ヘルパーウイルスは野生型アデノウイルス以下でしか効果的にパッケージされな いことを意味する。突然変異パッケージングシグナルを持つヘルパーウイルスは （例えばアデノウイルスベクターよりも約１０倍から約１００倍低く）アデノウ イルスベクターより以下でしか効果的にパッケージされない。 望ましくは、パッケージングシグナルはパッケージングシグナルの塩基対が欠 除されるように突然変異される。例えば、ポリヌクレオチドのアデノウイルス成 分がアデノウイルス５（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５）から誘導される時は、少くとも 塩基対２ ６７から３５８はパッケージングシグナルから欠失される。 も一つの実施例では、ヘルパーウイルスはアデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ タンパク質をコード化するＤＮＡを含まず、またアデノウイルスＥ１ａおよびＥ １ｂタンパク質をコード化するＤＮＡは細胞により供給される。 一般に、プラスミドである第一ポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオ チドあるいはプラスミドから成熟アデノウイルスベクターの生成を可能にするの に十分な数の塩基対を含む。一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドある いはプラスミドは少くとも２５，０００塩基対、望ましくは約２５，０００塩基 対から３７，２００塩基対を含む。アデノウイルス５′ＩＴＲあるいは３′ＩＴ Ｒ、パッケージングシグナル、異種タンパク質をコード化する少くとも１個のＤ ＮＡ配列、およびリコンビナーゼ標的部位に加えて、ポリヌクレオチドあるいは プラスミドに含まれるＤＮＡは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイル スＤＮＡ（例えばＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４、およびもしくは主要後期領域など） およびもしくは非機能的「詰めもの」ＤＮＡ配列を含む。一つの実施例において 、異種タンパク質をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列は治療薬をコード化 する。「治療（薬）」という用語は一般的な意味で使用され、処置薬、予防薬、 および補充薬を含む。 それからアデノウイルスが生成される、前に記載したプラスミドなどの第一ポ リヌクレオチドに含まれる治療薬をコード化するＤＮＡ配列は、必ずしもそれに 限定されないが、ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子をコード化す るＤＮＡ 配列；インターフェロン−α，インターフェロン−β、およびインターフェロン −γなどのインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−１β、お よびインターロイキン２から１４などのインターロイキンをコード化する遺伝子 ；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；オルニチントランスカルバミラーゼ、つ まりＯＴＣをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼつまりＡＤＡをコー ド化する遺伝子；リンパ球の成長因子であるリンホカインなどの細胞成長因子を コード化する遺伝子；表皮成長因子（ＥＧＦ）およびケラチノサイト成長因子（ ＫＧＦ）をコード化する遺伝子；可溶ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子VIII； 因子IX；シトクロムｂ；グルコセレブロシダーゼ；Ｔ細胞受容体；ＬＤＬ受容体 、ＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩおよびコレステロール輸送および代謝に伴う 他の遺伝子；アルファ−１抗トリプシン（α１ＡＴ）遺伝子；インスリン遺伝子 ；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；単純性ヘルペスウ イルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ遺伝子 、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などのウイルスチミジ ンキナーゼ遺伝子などの負の選択マーカーあるいは「自殺」遺伝子；抗体の抗原 結合領域のためのＦｅ受容体、Ｂ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製 を阻害するアンチセンス配列のようなウイルス複製を阻害するアンチセンス配列 ；アンチセンスＣ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド；また必ずしもそれに限定されな いが、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）、カタラーゼ、 銅亜鉛スーパーオキシドジムス ターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）、細胞外スーパーオキシドジムスターゼ（Ｅ−Ｃ− ＳＯＤ）、およびグルタチオン還元酵素などの抗酸化剤；組織プラスミノーゲン 活性因子（ｔｐＡ）；尿プラスミノーゲン活性因子（ウロキナーゼ）；ヒルジン ；フェニルアラニン水酸化酵素遺伝子；酸化窒素シンセターゼ；血管作用性ペプ チド；血管形成ペプチド；ドーパミン遺伝子；ジストロフィン遺伝子；β−グロ ビン遺伝子；α−グロビン遺伝子；ＨｂＡ遺伝子；ｒａｓ，ｓｒｃ、およびｂｃ １遺伝子などのプロトオンコジーン；ｐ５３およびＲｂなどの腫瘍抑制遺伝子； ＬＤＬ受容体；乳癌，卵巣癌，胃癌および子宮内膜癌を処置するヘレグリン−α タンパク質遺伝子；Ｔ−細胞抗原受容体のβ鎖内に含まれるエピトープに特異的 なモノクローナル抗体；多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子；リボザイムをコード化する ＤＮＡ配列；アンチセンスポリヌクレオチド；アンギオテンシン転換酵素の、血 管平滑筋カルシウムチャネルの、あるいはアドレナリン受容体の拮抗阻害剤とし て作用する分泌ペプチドをコード化する遺伝子、および中枢神経系内でアミロイ ドプラークを分解する酵素をコード化するＤＮＡ配列を含む。しかしこの発明の 範囲はいずれか特定の治療薬に限定されるべきはではないことは理解されるべき である。 治療薬をコード化するＤＮＡ配列（あるいは移植遺伝子）はゲノムＤＮＡある いはｃＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列はまた天然ＤＮＡ配列あるいはその対立遺 伝子変異株である。ここで使用される「対立遺伝子変異株」という用語は、対立 遺伝子変異株が天然ＤＮＡ配列の代替的形態であり、それがヌクレオチ ドの１個もしくはそれ以上の置換、欠失あるいは追加を有し、それはコード化タ ンパク質あるいはポリペプチドもしくは断片あるいはその誘導体の機能を事実上 変更しないということを意味する。一つの実施例において、ＤＮＡ配列は更にリ ーダー配列あるいはその部分、分泌シグナルあるいはその部分を含み、およびも しくは更にトレーラー配列あるいはその部分を含む。 少くとも１個の治療薬をコード化するＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御 下にある。使用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、ア デノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；あるい はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；ラウ ス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネイ ンプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミン プロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーターを含む。しかしこの発明の範囲は 特異的な外部遺伝子あるいはプロモーターに限定されるべきでないことは理解さ れねばならない。 第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、およびアデノウイルスベクタ ーの複製およびパッケージングのためのタンパク質をコード化するＤＮＡのアデ ノウイルス成分は、必ずしもそれに限定されないがアデノウイルス２，アデノウ イルス３，アデノウイルス４，アデノウイルス５，アデノウイルス１２，アデノ ウイルス４０，アデノウイルス４１およびウシアデノウイルス３を含むいずれか のアデノウイルス血清型から得 ることができる。 一つの実施例において、第一ポリヌクレオチドのアデノウイルス成分はアデノ ウイルス５から得られもしくは誘導され、また第二ポリヌクレオチド、同じくア デノウイルスベクターの複製およびパッケージングに必要なＤＮＡ配列のアデノ ウイルス成分はアデノウイルス５（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５）ゲノムあるいはアデ ノウイルス５ Ｅ３変異株Ａｄ ｄ１３２７から得られもしくは誘導される（ジ ンマッパーヤ、他、細胞、３１巻、５４３ページ（１９８３））。 選択肢として、アデノウイルスベクターは無細胞系での精製リコンビナーゼタ ンパク質の使用により生成される。このような実施例においては、リコンビナー ゼは前に記載の第三ポリヌクレオチドの発現により供給されない。この発明の一 つの見地に従って、前に記載した通り第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌク レオチドは細胞の不在下でリコンビナーゼと反応させられる。第一および第二ポ リヌクレオチドをリコンビナーゼと反応させることにより、リコンビナーゼは第 一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドのリコンビナーゼ標的部位と相 互作用し、これにより（前に記載したものから選択される）リコンビナーゼはＩ ＴＲに結合された末端タンパク質を持つアデノウイルスＩＴＲの第二ポリヌクレ オチドから第一ポリヌクレオチドへの転移をもたらすために十分な部位特異的分 子間組換えを媒介する。そこに結合された末端タンパク質を持つＩＴＲは、前に 記載の通りアデノウイルスとして第一ポリヌクレオチド複製の鋳型として役立つ 。一度ポリヌクレオチドがリコンビ ナーゼと反応されると、ポリヌクレオチドはリコンビナーゼを発現しない細胞に 形質移入される。ポリヌクレオチドの少くとも一部の間で組換えが起こり、それ によりＩＴＲおよび末端タンパク質が前に記載の通り第二ポリヌクレオチドから 第一ポリヌクレオチドに形質移入されるために、アデノウイルスベクター粒子は 第一および第二ポリヌクレオチドの細胞への形質移入に際してきわめて大きい効 率で生産される。 一つの実施例において、アデノウイルスベクター粒子として第一ポリヌクレオ チドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化 するＤＮＡは第二ポリヌクレオチドに含まれる。も一つの実施例において、アデ ノウイルスベクターとして第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングの ためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡは第一ポリヌクレオチド に含まれる。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレオチ ドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化す るＤＮＡの一部は第一ポリヌクレオチドに含まれ、またアデノウイルスベクター として前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウ イルスタンパク質をコード化するＤＮＡの一部は前記第二ポリヌクレオチドに含 まれる。 更にも一つの実施例において、アデノウイルスベクターとして第一ポリヌクレ オチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード 化するＤＮＡの一部は第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドとは無 関係であ り、すなわちアデノウイルスとして第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケー ジングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡのこのような部 分は第一および第二ポリヌクレオチドによる細胞の形質移入に先立ち細胞内に含 まれる。 この発明に従って第一ポリヌクレオチドからのアデノウイルスベクターが一度 例えばプラスミドなどから生成されると、各種の用途を前提とするより多くのア デノウイルスベクターを生産するためにアデノウイルスベクターは適切なアデノ ウイルスパッケージング細胞系を形質移入するために使用される。 この発明のアデノウイルスベクターの用途は遺伝子治療処置の一部としての生 体内 あるいは試験管内での真核細胞の形質導入、および望ましいタンパク質ある いは治療薬の試験管内生産のための試験管内での細胞の形質導入を含む。 一つの実施例において、アデノウイルスベクターは宿主に治療効果を提供する のに有効な量で生体内に投与される。 一つの実施例において、このベクターは１プラーク形成単位から約１０¹⁴プラ ーク形成単位、望ましくは約１０⁶プラーク形成単位から約１０¹³プラーク形成 単位の量で投与される。宿主はヒトあるいは非ヒト霊長類宿主を含む哺乳類宿主 である。 感染性アデノウイルスベクターは肺の疾病あるいは疾患（例えば膵嚢胞性線維 症など）が治療されねばならない時に肺に投与される。このような投与は、例え ばエアロゾル化吸入あるいは気管支鏡点滴注入、もしくは鼻腔内あるいは気管内 点滴注入 によるものである。 も一つの実施例において、感染性アデノウイルスベクターは、例えば静脈内投 与（例えば門静脈注射あるいは末梢静脈注射など）、筋肉内投与、腹腔内投与、 気管内投与、あるいは鼻腔内投与などにより全身投与される。 アデノウイルスベクターは患者への投与に適した薬剤許容担体と併用して投与 される。担体は液体担体（例えば食塩水）、あるいは例えばマイクロキャリアビ ードなどの固形担体である。 感染性アデノウイルスベクターにより感染される細胞は、必ずしもそれに限定 されないが、白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔ−リンパ球 およびＢ−リンパ球を含む）、全能幹細胞、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ 細胞）などの一次有核血球などの一次細胞；骨髄細胞；内皮細胞；活性化内皮細 胞；上皮細胞；肺細胞；ケラチノサイト；幹細胞；肝細胞前駆体細胞を含む肝細 胞；線維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管平滑筋細胞；脳細胞およ び他の神経細胞；腸管エンテロサイト；腸管幹細胞；および筋芽細胞を含む。 感染細胞は必ずしもそれに限定されないが、アデノシンデアミナーゼ欠損、鎌 状赤血球貧血、サラセミア（重症地中海貧血）、血友病Ａ、血友病Ｂ、糖尿病、 α−抗トリプシン欠損、アルツハイマー病などの脳疾患、フェニルケトン尿症お よび他の疾病つまり成長疾患および心臓病、例えばコレステロールが代謝され免 疫系が欠損するような変更により生じるものを含む 各種の疾病の処置に使用される。 一つの実施例において、アデノウイルスベクターは肺細胞を感染するのに使用 され、このようなアデノウイルスベクターは膵嚢胞性線維症の処置に有用である ＣＦＴＲ遺伝子を含む。も一つの実施例において、アデノウイルスベクターはＳ Ｐ−Ａ，ＳＰ−Ｂ、あるいはＳＰ−Ｃなどのような肺界面活性タンパク質をコー ド化する遺伝子を含み、これによりアデノウイルスベクターは肺界面活性タンパ ク質欠損状態を処置するために使用される。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターは肝細胞を感染するのに使 用され、またこのようなアデノウイルスベクターはそれぞれ血友病Ａおよび血友 病Ｂの処置に使用される因子VIIIおよび因子IXなどの凝固因子をコード化する遺 伝子を含む。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターは肝細胞を感染するために 使用され、またこのようなアデノウイルスベクターは肝細胞（肝臓）機能の後天 性あるいは遺伝性欠損の予防および治療に有用なポリペプチドあるいはタンパク 質をコード化する遺伝子を含む。例えばそれらは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ ）受容体の遺伝性欠損、あるいはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損を治療 するために使用することができる。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターは肝細胞を感染するために 使用され、これによりアデノウイルスベクターはウイルス感染から生じる疾病な どの後天性感染症を処置 するのに使用される治療薬をコード化する遺伝子を含む。例えば感染性アデノウ イルスベクターはウイルス性肝炎、とりわけＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎の 処置に使用することができる。例えばアンチセンス遺伝子をコード化する遺伝子 を含む感染性アデノウイルスベクターはウイルス複製を阻害するために肝細胞を 感染するために使用することができる。この場合、逆あるいは反対の配向に構造 肝炎遺伝子を含む感染性アデノウイルスベクターは肝細胞に導入され、感染肝細 胞内に肝炎ウイルスあるいはその転写物を不活性化できるアンチセンス遺伝子の 生産に帰着するであろう。選択肢として、肝細胞は感染性アデノウイルスベクタ ーで感染され、このベクターは肝炎ウイルスに耐性を与える例えばα−インター フェロンなどのタンパク質をコード化する遺伝子を含む。 更にも一つの実施例において、この発明に従ってアデノウイルスベクターは単 純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子などの負の選択マーカー 、あるいは「自殺」遺伝子を含む。このようなベクターは、例えばアデノウイル スベクターの腫瘍への直接注射などによる患者へのアデノウイルスベクターの投 与によりアデノウイルスベクターが腫瘍細胞を形質導入することで癌性および非 悪性腫瘍を含む腫瘍の処置に使用することができる。細胞がアデノウイルスベク ターで形質導入された後、例えばガンシクロビルなどの相互作用薬が患者に投与 され、これにより形質導入腫瘍は殺される。 も一つの実施例において、治療薬をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を 含むアデノウイルスベクターは動物を疾病あ るいは疾患およびその処置を研究するためのモデルとして使用するために、その ような動物に投与される。例えば治療薬をコード化するＤＮＡ配列を含むアデノ ウイルスベクターは、そのような治療薬を欠いている動物に与えられる。治療薬 をコード化するＤＮＡ配列を含むそのようなベクターの投与に続き、動物はその ような治療薬の発現を評価される。このような研究の結果から、次いで治療薬の 欠損と関連する疾病あるいは疾患の処置のためそのようなアデノウイルスベクタ ーがヒト患者に対しどのように投与されるかを決定することができる。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターは試験管内で真核細胞を感 染するために使用される。真核細胞は前に記載の通りのものである。このような 真核細胞は、次いで宿主に治療効果をもたらすのに有効な量で遺伝子治療手順の 一部として宿主に投与される。 選択肢として、望ましいタンパク質あるいは治療薬をコード化する遺伝子を含 むベクターは試験管内で望ましい細胞系を感染するのに使用され、これにより感 染細胞は試験管内で望ましいタンパク質あるいは治療薬を生産する。 この発明はＤＮＡの塩基の数でアデノウイルスベクターに対する最小パッケー ジング要件を決定するために使用される。かくしてプラスミドなどのポリヌクレ オチドはアデノウイルスＩＴＲおよびリコンビナーゼ標的部位の間の各種の長さ のＤＮＡを持つように構築される。このようなプラスミドは、次いでこの発明に 従って第三ポリヌクレオチドで同時形質移入され、これらプラスミドそれぞれか らのアデノウイルスベクターの生成 が次いで決定される。アデノウイルスベクターを生成するためにどのプラスミド が使用されるかを決定することにより、前に記載の成分を含むプラスミドからア デノウイルスベクターを生成するための塩基の最小数を決定することができる。 この発明は各種のアデノウイルスベクター構築物が高力価のアデノウイルスベ クターを産出するかどうかを決定するために使用される。前に記載した通り、ア デノウイルスＩＴＲおよびリコンビナーゼ標的部位を含むプラスミドなどのポリ ヌクレオチド、同じく各種の異種ＤＮＡ配列が構築される。このようなプラスミ ドは前に記載の通り第三ポリヌクレオチドを用いてリコンビナーゼ発現細胞に形 質移入され、各種プラスミドから生成されるアデノウイルス力価が次いで決定さ れる。各種プラスミドから生成されるアデノウイルスの各種力価を測定すること から、どの異種ＤＮＡ配列がアデノウイルスベクターの生産に逆に作用するかし ないかを決定することができる。 この発明は更に各種のアデノウイルスに基づいてカプシド構造に偽類型（ｐｓ ｅｕｄｏｔｙｐｅ）にされうるアデノウイルスベクターを成長させるために使用 される。かくしてヒトが前に存在する抗体を持たない、もしくは殆ど持たない各 種のカプシドを持つアデノウイルスベクターを生成するためにこの発明に従って 生成されたアデノウイルスを使用することができる。 例えばアデノウイルス５から得られるＩＴＲおよびパッケージングシグナル、 またアデノウイルス５ゲノムから得られるアデノウイルス成分を含むヘルパーウ イルスを持つプラスミドか ら、この発明に従ってアデノウイルスベクターが生成される。生成されるウイル スベクターはアデノウイルス５カプシドを持つであろう。しかしアデノウイルス ５は普通のかぜと関連しており、また抗アデノウイルス５抗体は多くのヒトに発 見される。かくしてアデノウイルスベクターに対する免疫応答の発生の可能性を 減少するために、この発明の方法に従って生成されたアデノウイルス５カプシド を持つアデノウイルスベクターはアデノウイルスパッケージング細胞系に形質移 入され、この細胞系はアデノウイルス５以外のアデノウイルス４，アデノウイル ス１２、あるいはウシアデノウイルス３、もしくはそれらの誘導体のウイルスで あるヘルパーウイルスを含む。かくしてアデノウイルス５カプシドではないカプ シドを持つ新しいアデノウイルスベクターが生成され、このようなベクターは免 疫応答により不活性化されることは少ない。選択肢として、ベクターは変更アデ ノウイルス５ヘキソンをコード化するＤＮＡを含むヘルパーウイルスを含むアデ ノウイルスパッケージング細胞系に形質移入され、これにより抗アデノウイルス ５抗体により認識されない変更アデノウイルス５カプシドを持つ新しいアデノウ イルスベクターを生成する。しかしこの実施例がいずれかの特異的な偽類型アデ ノウイルスに限定されるものでないことは理解されるべきである。 この発明はアデノウイルスベクターに基礎をおく発現クローニングシステムを 提供するために使用される。とりわけクローンされるライブラリー配列は前に記 載されたプラスミドに連結される。生成プラスミドは次いでベクター形質導入標 的細胞に あるクローン化配列の高水準の発現を媒介するアデノウイルスクローニングライ ブラリーに急速に転換することができる。この細胞は次いで望ましいタンパク質 の発現のためにスクリーンされ、またベクターは次いでヘルパーウイルスを持つ 細胞から救助することができる。 この発明のも一つの見地において、発現されるべき異種ＤＮＡはアデノウイル スベクター以外のウイルスベクター粒子をコード化するＤＮＡを含む。このよう なＤＮＡはウイルス粒子の生産に必要なＤＮＡ配列（例えば末端反復配列、パッ ケージングシグナル、ウイルス構造タンパク質をコード化するＤＮＡ）、および アデノウイルスならびにアデノウイルス以外のウイルスに対して異種であるタン パク質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む。 ウイルスベクター粒子をコード化するＤＮＡは前に記載された第一ポリヌクレ オチド内に含まれる。 異種ＤＮＡによりコード化されるウイルスベクター粒子は、必ずしもそれに限 定されないが、レトロウイルスベクター粒子（レンチウイルスベクター粒子を含 む）、アデノ関連性ウイルスベクター粒子、およびアルファウイルスベクター粒 子を含む。このようなウイルスベクター粒子は、更に前に記載されたものから選 択される異種タンパク質あるいはポリペプチドをコード化する。 一つの実施例において、ウイルスベクター粒子はレトロウイルスベクター粒子 である。このような実施例において、第一ポリヌクレオチドに含まれる異種ＤＮ Ａはレトロウイルス５′Ｌ ＴＲ、レトロウイルス３′ＬＴＲ、レトロウイルスパッケージングシグナル、お よびアデノウイルスならびにレトロウイルスに異種のタンパク質あるいはポリペ プチドをコード化するＤＮＡ配列を含む。アデノウイルスおよびレトロウイルス に異種のタンパク質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列は５′ＬＴ Ｒおよびパッケージングシグナルならびに３′ＬＴＲに隣接される。第一ポリヌ クレオチドは更にレトロウイルスｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡ、レト ロウイルスｐｏｌタンパク質、およびｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖＤＮＡ配列の 発現を制御するレトロウイルスｅｎｖタンパク質およびプロモーターを含む。プ ロモーターは構成性あるいは天然ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖプロモーターであ り、あるいは組織特異的プロモーター、誘導プロモーター、あるいは抑制性プロ モーターである。ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質、およびそれらのプロ モーターをコード化するポリヌクレオチドはレトロウイルス５′および３′ＬＴ Ｒに隣接されていない。 第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドはリコンビナーゼで反応す る。このような反応は前に記載の無細胞系で、あるいは同じく前に記載の部位特 異的リコンビナーゼをコード化するＤＮＡ配列を含む第三ポリヌクレオチドを含 む細胞で起こる。リコンビナーゼは、ＩＴＲに結合された末端タンパク質を持つ アデノウイルスＩＴＲの第二ポリヌクレオチドから第一ポリヌクレオチドへの転 移をもたらすために第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドにあるリ コンビナーゼ標的部位と相互作用する。そこに結合された末端タンパク質を 持つＩＴＲはアデノウイルスとしての第一ポリヌクレオチドの複製のための鋳型 として役立つ。もし第一および第二ポリヌクレオチドが無細胞系内でリコンビナ ーゼと反応させられると、第一および第二ポリヌクレオチドはリコンビナーゼと の反応の後第一ポリヌクレオチドからハイブリッドアデノウイルス−レトロウイ ルスベクター、つまりＨＡＲＶの生産を可能にする細胞に形質移入される。もし 第一および第二ポリヌクレオチドがリコンビナーゼをコード化するＤＮＡ配列を 含む第三ポリヌクレオチドを含む細胞に形質移入されたなら、ハイブリッドアデ ノウイルス−レトロウイルスベクターは第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌ クレオチドの第三ポリヌクレオチドにより発現されたリコンビナーゼとの反応に 際し第一ポリヌクレオチドからの細胞により生産される。 一般にハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターすなわちＨＡＲ Ｖにおいては、アデノウイルス５′ＩＴＲおよびアデノウイルス３′ＩＴＲは、 アデノウイルスパッケージングシグナル、レトロウイルス５′ＬＴＲ、レトロウ イルスパッケージングシグナル、アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種の タンパク質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡ、レトロウイルス３′Ｌ ＴＲ、レトロウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質 をコード化するＤＮＡ配列、およびレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化 するＤＮＡ配列に隣接する。レトロウイルス５′ＬＴＲおよびレトロウイルス３ ′ＬＴＲはレトロウイルスパッケージングシグナル、およびアデノウイルスなら びにレトロウイルスに異 種のタンパク質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡに隣接する。レトロ ウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化す るＤＮＡ、ならびにレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡはレ トロウイルス５′ＬＴＲおよびレトロウイルス３′ＬＴＲに隣接していない。ア デノウイルスパッケージングシグナルはレトロウイルス５′ＬＴＲおよびレトロ ウイルス３′ＬＴＲに隣接していず、またハイブリッドアデノウイルス−レトロ ウイルスベクターがパッケージされることを可能とするためアデノウイルス５′ ＩＴＲあるいはアデノウイルス３′ＩＴＲの一つに十分近接して位置を占めてい る。 ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクター、すなわちＨＡＲＶは 、第一ポリヌクレオチドからの生成に際して、次いで試験管内あるいは生体内で の細胞を形質導入するために使用される。形質導入細胞は次いで異種タンパク質 あるいはポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベ クターを分泌する。かくして形質導入細胞は事実上レトロウイルス生産者細胞に なる。レトロウイルスベクターは次いですぐ近くの細胞を形質導入し、これによ り異種タンパク質あるいはポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、ハ イブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターが生体内で投与される時に 望ましい組織あるいは器官にある細胞中に広がる。レトロウイルスベクターによ る形質導入は異種タンパク質あるいはポリペプチドをコード化するポリヌクレオ チドの細胞染色体ＤＮＡへの組み込みに帰着する。かくしてハイブ リッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターの単一投与は望ましい細胞、組 織、あるいは器官の効率の高い永続的な修飾に帰着する。 望ましい実施例において、第一ポリヌクレオチドは５′アデノウイルスＩＴＲ およびパッケージングシグナルならびにレトロウイルス５′および３′ＬＴＲを 含むレトロウイルスベクター構築物、レトロウイルスパッケージングシグナル、 および異種ポリペプチドあるいはタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを 含む。３′から３′ＬＴＲまでに位置するものはレトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ およびｅｎｖ遺伝子、それに続くＬｏｘ部位である。プラスミドの形態にある第 一ポリヌクレオチドは線形化され精製ｃｒｅリコンビナーゼとの反応混合物でヘ ルパーウイルス（すなわち第二ポリヌクレオチド）と結合される。ヘルパーウイ ルスＤＮＡはアデノウイルス５から誘導され、ここでアデノウイルスＥ１ ＤＮ Ａ配列が欠失されまたパッケージングシグナルの塩基対２６７から３５８が欠失 されている。ヘルパーウイルスＤＮＡはその３′ＩＴＲから上流にｌｏｘ部位を 持ちまた５′ＩＴＲおよび３′ＩＴＲに付着されたアデノウイルス末端タンパク 質に共有結合で付着している。ｃｒｅリコンビナーゼの付加は第一ポリヌクレオ チドのいくらかを複製可能ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクタ ーに転換するであろう。ｃｒｅリコンビナーゼとの反応の後、第一および第二ポ リヌクレオチドはアデノウイルスＥ１およびＥ２ａ ＤＮＡ配列を発現する細胞 系に同時形質移入される。これはすべてのアデノウイルスバックボーン遺伝子を 欠 いているハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクター、また同じく少 量の不十分にパッケージされたヘルパーウイルス（ヘルパーウイルスにある欠損 パッケージングシグナルによるもの）の生成に帰着する。ハイブリッドアデノウ イルス−レトロウイルスベクターは次いで塩化セシウム内で平衡密度勾配遠心分 離によりヘルパーから精製される。ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイル スベクターは次いで試験管内あるいは生体内で細胞を形質導入するために使用さ れる。形質導入される細胞は前に記載したものである。例えば、ハイブリッドア デノウイルス−レトロウイルスベクターは肝細胞を生体内で形質導入するために 末梢静脈注射により投与される。形質導入細胞は次いで対象となる異種ポリヌク レオチドを含むレトロウイルスベクターの生産を開始し、それは前に記載のよう な治療薬をコード化する。このようなレトロウイルスベクターは次いで隣接した 細胞を形質導入する。 第一ポリヌクレオチドに含まれるレトロウイルスベクター配列は当業者にとっ ては公知のものを含む。異質ポリペプチドは内部プロモーターを経由してＬＴＲ から転写される。この配列は標準レトロウイルスベクターあるいは自己不活性化 すなわちＳＩＮベクターをコード化することができる。レトロウイルス構造遺伝 子は単一近接配列によりコード化され、あるいはｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖの ための個別の配列によりコード化される。ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は 構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、あるいは誘導もしくは抑制性プ ロモーターにより制御することができる。組織特異的プロ モーターの使用は標的組織あるいは器官に対するレトロウイルスベクターの生産 を制約する。誘導あるいは抑制性プロモーターの使用はハイブリッドアデノウイ ルス−レトロウイルスベクターで形質導入された細胞がレトロウイルスベクター を放出する速度に対する抑制を提供する。 レトロウイルス形質導入は細胞分割を必要とするために、ある場合にはハイブ リッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターで形質導入された組織の細胞の 分割を刺激する必要がある。例えば細胞分割は、必ずしもそれに限定されないが 、肝細胞のためのケラチノサイト成長因子、およびインターロイキン−３および インターロイキン−６などのインターロイキン、あるいは骨髄細胞のための幹細 胞因子を含むホルモンあるいはサイトカインなどの細胞分割を剌激する作用薬を 、ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターと共に宿主に投与する ことにより剌激される。選択肢として、そのようなホルモンあるいはサイトカイ ンをコード化するポリヌクレオチドはそれからハイブリッドアデノウイルス−レ トロウイルスベクターを生成される第一ポリヌクレオチドに含まれる。このよう なハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターはレトロウイルスベク ターを分泌し、細胞分割を剌激するホルモンあるいはサイトカインを発現するで あろう。 選択肢として、ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターで最初 に形質導入される細胞で発現されるレトロウイルスパッケージングタンパク質（ すなわちｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）に対するＣＴＬ応答はそのような細胞を 除去する であろう。そのような細胞の除去はレトロウイルスの形質導入を許す細胞の代謝 回転を剌激する。 形質導入細胞が年少期あるいは青年期の動物の器官に含まれる時、このような 細胞は細胞分割の追加の剌激の必要性を不要にする速度で成長を続ける。 ある場合には、例えば腫瘍の処置などでは細胞が分割を続けており細胞分割の 剌激は必要ではない。このような場合には、ハイブリッドアデノウイルス−レト ロウイルスベクターは細胞分割の同時剌激なしで細胞に投与される。 ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターがレンチウイルスから 誘導されたレトロウイルス配列を含む時、レンチウイルスベクターが非分割細胞 を形質導入できるために細胞分割の刺激は必要ではない。 この発明のこの見地の利点は、ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルス ベクターの単一投与で望ましい組織あるいは器官の高い効率で永続的な遺伝子修 飾を得る能力を含む。この発明の見地は更に大型および多重移植遺伝子をコード 化するために「中身無し」アデノウイルスベクターの能力を利用する。これはレ トロウイルスベクター配列およびレトロウイルスパッケージング配列が同一ベク ターに含まれることを可能にする。 この発明のこの見地のも一つの利点は移植遺伝子が組織あるいは器官中に広が ることをそれが可能にすることである。形質導入標的細胞からのレトロウイルス ベクターの絶え間のない分泌は異種遺伝子の拡散を助長する。ハイブリッドアデ ノウイル ス−レトロウイルスベクターはさまざまな種類の標的器官（例えば肝臓など）に ある細胞を形質導入するのに使用することができ、また形質導入は器官を通じて 均一にすることができる。加えて外部細胞の注入はなく、レトロウイルスベクタ ーは宿主動物自身の細胞により生産され、また組織あるいは器官にある細胞の大 部分はレトロウイルスベクター生産者細胞に転換することができる。 更に組織あるいは器官全体にわたってのレトロウイルスベクターの拡散は循環 に入るためのレトロウイルスベクターの必要がなく起こり得る。たとえレトロウ イルスベクターがヒトにある血漿に露出されるとしても、レトロウイルスベクタ ーはヒト細胞内で生産されたためにそれは補足耐性である。 この発明のも一つの見地に従って、細胞へのレトロウイルスベクターの導入は 第一アデノウイルスベクターおよび第二アデノウイルスベクターを用いて達成さ れる。第一アデノウイルスベクターはレトロウイルス５′ＬＴＲ、レトロウイル スパッケージングシグナルをコード化するＤＮＡ、前に記載のものなどの少くと も１個の異種タンパク質あるいはポリペプチド、およびレトロウイルス３′ＬＴ Ｒをコード化するＤＮＡを含む。第二アデノウイルスベクターはレトロウイルス ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡならびにｇａｇ／ ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を制御するプロモータ ーを含む。 第一および第二アデノウイルスベクターそれぞれは前に記載の方法に従って第 一ポリヌクレオチドから生成される。レトロ ウイルスベクターおよびレトロウイルス構造タンパク質配列を含むように修飾さ れる第一および第二アデノウイルスベクターの他の例は、必ずしもそれに限定さ れないが、１９９４年１０月２７日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２３４ ８２、１９９６年６月２０日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／１８４１８、 および合衆国特許番号５，５４３，３２８に記載されたものを含み、その内容は ここで引用例として組み込まれている。 第一および第二アデノウイルスベクターを用いて生体内あるいは試験管内での 細胞の形質導入に際して、細胞は近接細胞を形質導入するレトロウイルスベクタ ーを分泌し、これにより少くとも１個の異種タンパク質あるいはポリペプチドを コード化するポリヌクレオチドを用いてそのような細胞を遺伝子操作する。 実施例 この発明はこれから下記の実施例と関連して記述されるであろう。しかしこの 発明の範囲はそれにより限定されることを意図していない。 実施例１ Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドの生成 プラスミドｐＧＲＥ５−２／ＥＢＶ（オハイオ、クリーブランド、ユナイテッ ド・ステーツ・バイオケミカル）（メイダー、他、全米科学アカデミー紀要、９ ０巻、５６０３−５６ ０７ページ（１９９３））はＧＲＥ５プロモーターの制御下でＣｒｅタンパク質 をコード化するＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築のためのバックボーンプラス ミドとして使用された。Ｃｒｅタンパク質ＤＮＡ配列は、メリーランド、ベセス ダ、ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス、ブライアン・サウアーか ら得たプラスミドｐＢＳ３５３から得られた。Ｃｒｅタンパク質ＤＮＡ配列はＫ ｐｎＩ断片としてプラスミドｐＢＳ３５３から切除され、ＫｐｎＩで開かれたｐ ＧＲＥ５−２／ＥＢＶに挿入された。生成プラスミドｐＧｒｅＣｒｅは、アデノ ウイルス主要後期プロモーターおよび転写物からの長さの短い配列であるデキサ メタゾン誘導ＧＲＥ５プロモーター、イントロン、Ｃｒｅコーディング配列、お よびポリアデニル化シグナルを含んでいた。ｐＧｒｅＣｒｅは更に真核細胞にお けるエピソーム増殖を可能にするためのＥＢＮＡ１およびＯｒｉＰ、同じくヒグ ロマイシン耐性遺伝子を含む。ｐＧｒｅＣｒｅは以下で２９３ｅ細胞として引用 する２９３−ＥＢＮＡ細胞（カリフォルニア、サンディエゴ、インヴァイトロゲ ン・コーポレイション）に形質移入され、細胞は次いでヒグロマイシンで選択さ れた。プラスミドを含むクローンはサザンブロット分析によりプラスミドコピー 数をスクリーンされた。Ｃｒｅタンパク質発現の大きさはエピソームプラスミド コピー数と相関することが予期される。クローン１および２６が更なる実験のた めに選択された。 実施例２ 有効なＣｒｅ媒介組換えが実施例１で言及された２個のク ローンで生じることを実証するために、ブライアン・サウアー博士により提供さ れ２個のＬｏｘ部位を含むｐＢＳ３７５で知られるプラスミドが細胞に形質移入 された。２日後および４日後、ＤＮＡが細胞から得られ、組換え対非組換えプラ スミドの割合がサザンブロット分析により決定された（図１）。４日後、プラス ミドの９０％以上が、各細胞に多くのプラスミドコピーが存在したという事実に も拘らず組換えられ、これはＣｒｅタンパク質媒介組換えが非常に有効であった ことを示した。 実施例３ 右末端にＬｏｘ部位を持つＡｄ−ｄ１３２７誘導ベクターの生成 ウイルスの極右末端の塩基対の殆どすべてがＥ４プロモーターの正常な機能に とり重要であることを従来のアデノウイルス文献が示している。しかし、このプ ロモーターの機能に関係してこなかった右ＩＴＲからのすぐ上流に短い領域があ った。この領域は配列ＴＴＡＡを含んでいた（図２）。一連の構築を通じて、ア デノウイルス（アデノウイルス５）配列の右末端はｐＢＲ３２２プラスミドバッ クボーンに組み込まれ、追加のＴＴＡＡ配列が前に述べたＴＴＡＡ配列のすぐ隣 に挿入された。生成配列ＴＴＡＡＴＴＡＡは右ＩＴＲから約５０塩基対上流のユ ニークＰａｃＩ部位に位置を占めた。３４塩基対Ｌｏｘ部位が次いでこのＰａｃ Ｉ部位に挿入された。更にいくつかの構築を通じて、追加の上流アデノウイルス 配列がプラスミドｐＲＥｌｏｘ（図３）およびプラスミドｐＢＲＡＤ（図４）を 生成するために組み込ました。ｐＲＥｌｏｘはアデノウイルスＤＬ３ ２７Ｌｏｘ（３′ＩＴＲから約５０塩基対上流にＬｏｘ部位を含むＤＬ３２７誘 導体）を生成するために使用され、またｐＢＲＡＤはプラスミドｐＶＮを生成す るために使用された（以下の実施例４を参照のこと）。これら構築物の詳細は以 下の通りである。 １．Ａｄ ｄ１３２７の左末端の１５１塩基対（塩基対３３９０６−３４０５７ ）のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）： 使用されるオリゴマーは １．SZR31-5′GGTTAA-TTA AGA AAA CTA CAA TTC CCA, および ２．MJK2-5′GTGGGATC-CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTTTGG A 〔ＳＺＲ３１およびＭＪＫ２（前記）のハイフンの前にある配列はアデノウイ ルス５配列には存在しない。ＭＪＫ２にあるリーダーはＰＣＲ産物がＢａｍＨＩ で切断されることを可能にする（認識部位−ＧＧＡＴＣＣ）。ＳＺＲ３１にある リーダーはＰＣＲ産物がＰａｃＩで切断されることを可能にする（認識部位−Ｔ ＴＡＡＴＴＡＡ）〕。 ＰＣＲはＡｄ５ ｄ１３２７を基質として用いることで実行され、また１５８ 塩基対産物はＢａｍＨＩで消化されピーブルースクリプトＩＩ ＳＫ（＋）（カ リフォルニア、ラホーラ、ストラータジーンからのもの、以下ｐＢＳとして引用 ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ部位の間にクローンされた。このクローンはｐ ＢＳ３′ ｐｃｒと呼ばれる。 ２．最後の１５１塩基対の上流のＡｄ ｄ１３２７の７６３塩 基対（塩基対３３１４１−３３９０５）のＰＣＲ： 使用されたオリゴマーは １．SZR35-5′TAA GCT CCG GAA CCA CCA CAG および ２．SZR30-5′GGTTAA-TTA AAA TGG GAA GTG ACG TAA CGT G 〔ハイフンの前の配列は産物がＰａｃＩで切断されることを可能にする。〕 ＰＣＲはＡｄ ｄ１３２７を基質として用いることで実行され、また７６３塩 基対産物はＸｍａＩで消化され、生成する４３７塩基対断片はピーブルースクリ プトＩＩ ＳＫ（＋）のＸｍａＩおよびＥｃｏＲＶ部位の間でクローンされた。 このクローンはｐＢＳ５′ｐｃｒと呼ばれる。 ３．ＰａｃＩ部位を用いる２個のＰＣＲ断片の結合。 両方のＰＣＲ断片はプライマ−ＳＺＲ３１およびＳＺＲ３０に存在する余分の 塩基の結果として生成される新規なＰａｃＩ部位を含む。この部位は下記の通り ２個をつなぎ合わせるために使用された：プラスミドｐＢＳ３′ｐｃｒはＢａｍ ＨＩで切断され、クレノウで充填され次いでＰａｃＩで切断された。１５５塩基 対３′ＰＣＲ断片は次いでプラスミドｐＢＳ５′ｐｃｒに連結されそれはＨｉｎ ｄＩＩＩで切断され、クレノウで充填され次いでＰａｃＩで切断された。生成す るプラスミドｐＢＳｐａｃは、ｄ１３２７ゲノムの塩基対＃３３９０５に対応す る部位で４個の追加の塩基（ＴＴＡＡ）の挿入で（Ａｄ ｄ１３２７ゲノムの塩 基対３３４７５に位置する）ＸｍａＩ部位の右側にすべてのＡｄ５配列を含む。 これはこの位置でＰａｃＩ 部位を生成する。 ４．Ａｄ５の右末端からの追加配列のクローニング Ａｄ５ ｄ１３２７がＳｎａＢＩ（塩基対＃２５１７１）およびＡｖｒＩＩ（ 塩基対＃３３５８５）で切断され８４１４塩基対断片がＡｖｒＩＩおよびＳｍａ Ｉで消化されたｐＢＳｐａｃに連結された。このプラスミドはｐＲＥｐａｃと呼 ばれる。 ５．ｐＲＥｐａｃのＰａｃＩ部位へのｌｏｘＰ配列挿入 ２個のオリゴマーＳＺＲ３６（5′-ATA ACT TCG TAT AAT GTATGC TAT ACG AAG TTA TTT AAT）およびＳＺＲ３７（5′-TAA ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TAT)がＰａｃＩ付着末端に隣接するｌｏｘＰ配列を生成するために アニーリングされた。これはＰａｃＩで線形化されたｐＲＥｐａｃに連結された 。（Ｂ．サウアー、酵素学方法論、２２５巻、８９０−９００ページにより定義 されたように、）ｌｏｘＰの挿入の配向が（アデノウイルス配列に関して）左か ら右であった生成プラスミドが選択された。このプラスミド、ｐＲＥｌｏｘ（図 ３）はｌｏｘＰ配列に続く単一ＰａｃＩ部位を有する。）６．ｐＢＲＡｄの構築 −塩基対＃９１７でＣ１ａＩ部位の右側にＡｄ ｄ１３２７配列の３３１４０塩 基対を含みまたｐＲＥｌｏｘの構築で前に記述したように右末端近くにｌｏｘＰ 配列をかくまっているプラスミド。 これは二つの段階で行われた。 （ｉ）ｐＲＥｌｏｘに存在するＡｄ５の右末端がＣ１ａＩおよびＢａｍＨＩを用 いて切除されこの８９４５塩基対断片はそのＡｃｃＩおよびＢａｍＨＩ部位の間 のｐＢＲＬに連結された。 このプラスミドはｐＢＲＥである。（プラスミドｐＢＲＬはテトラサイクリン耐 性遺伝子が除去されクローニングポリリンカーにより置換されたｐＢＲ３２２プ ラスミドの誘導体である。） （ii）プラスミドｐＢＲＥはＳｐｅＩおよびＣ１ａＩで消化され生成９１３３塩 基対断片は同じ２個の酵素で消化されたＡｄ ｄ１３２７から誘導された２６， １６５塩基対断片に連結された。このプラスミドはｐＢＲＡＤである（図４）。 ７．右末端近くにｌｏｘＰ配列を含むＡｄ ｄ１３２７誘導体の構築。 Ａｄ ｄ１３２７ＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断され、生成するウイルスＤＮＡの ２７，３３１塩基対左末端はＥｃｏＲＩで線形化されたｐＲＥｌｏｘ１２に連結 された。連結混合物はリン酸カルシウム法を用いて２９３細胞を形質移入するた めに使用された。１４日後に得られたプラークは摘み取られ増殖された。プラー クはその最右末端にあるＬｏｘ部位を組み込んだＡｄ−ｄ１３２７の存在をスク リーンされた。新しいウイルスＤＬ３２７Ｌｏｘの図形は図２で示されているが 、次いでそれは２９３細胞の大型調製品内に増幅された。末端タンパク質を無傷 で持つＤＮＡは次いでグアニジニウム溶解法を用いてこのウイルス調製物から得 られた。この方法は塩化セシウム内での平衡帯形成によりウイルスを精製され、 また塩化セシウムを除去するために広範囲にわたる透析対ＴＥ（トリス１０ｍＭ 、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ１ｍＭ）を含む（この方法はメリーランド、ボルチモア 、ジョンズ・ホプキンズ・ユニバーシティ、ゲ イリー・ケットナー博士より得られた）。方法は下記の通り実施された。 ＴＥ内でＸｍｌのウイルス量に対して８Ｍ塩酸グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ） Ｘｍｌが加えられ、次いでフェニルメチルフッ化スルホニル（エチルアルコール 内で０．１Ｍ）が１ｍＭまで続けて加えられる。混合物はゆっくり混合され氷上 で５分保温される。４ＭＧｕＨＣｌの４Ｘｍｌ、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）の４ ．５３９Ｍ（７６．４９ｇ／１００ｍｌ）が加えられる。最終ＣｓＣｌ濃度は３ ．０２６Ｍである。混合物はソーバルＴＶ８６５垂直ロータあるいは同等のもの で４５，０００ｒｐｍで一晩回転される。遠心分離管の底部は開口され約０．２ ５ｍｌの分画が収集される。ＤＮＡは各分画のＡ₂₆₀を測定することにより発見 される。ＤＮＡを含む分画はＴＥに対して透析される。この無傷末端タンパク質 を持つＤＮＡは続く実験でヘルパーＤＮＡとして役立った。 実施例４ β−ガラクトシダーゼ遺伝子、左ＩＴＲおよび右Ｌｏｘ部位を含むプラスミドの 生成 この実施例での出発プラスミドは前の実施例３に記載されたｐＢＲＡＤ（図４ ）である。ｐＢＲＡＤおよびＤＬ３２７Ｌｏｘの双方は同一前駆体プラスミド、 ｐＲＥｌｏｘ（図３）から誘導されたために、この２個は３′ＩＴＲの領域およ びＬｏｘ部位に同一の配列を有している。ｐＢＲＡＤの右ＩＴＲはＰａｃＩでの 消化、続く再連結反応により除去された。（ＩＴＲのいずれの側にもＰａｃＩ部 位があった。）次いで、アデノウイ ルス配列の最左１１，０００塩基対がＳｆｕＩおよびＮｓｉＩでの消化により除 去された。それらの場所にシャトルベクターｐＳ６ＡＮＬａｃＺからとられたＩ ＴＲ／β−ガラクトシダーゼ発現配列が挿入された（図５）。 ｐＳ６ＡＮＬａｃＺはｐＡｖＳ６−ｎＬａｃＺから誘導され（これは１９９５ 年４月１３日公開された公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０９６５４に記載されて おり）、ここでアデノウイルス５′三部分リーダー配列の５′にじかに接してい るＡＴＧコドンがＳｆｉＩでの消化、Ｔ４ポリメラーゼでの３′オーバーハング の除去および再連結反応により除去された。ｐＳ６ＡＮＬａｃＺはＩＴＲ／β− ガラクトシダーゼ発現配列を得るためにＮｏｔＩおよびＮｓｉＩで切断される。 ＳｆｕＩリンカーは次いでＮｏｔＩ部位に配置され、ＩＴＲ／β−ガラクトシダ ーゼ発現配列はＳｆｕＩ／ＮｓｉＩ消化ｐＢＲＡＤに連結される。これはｐＶＮ を産出したが（図６）、それはｐＢＲ３２２バックボーン内に、左ＩＴＲ、アデ ノウイルスパッケージング配列、ＲＳＶ促進β−ガラクトシダーゼ発現カセット 、ウイルスの左末端からのアデノウイルス配列の短い配列、（右ＩＴＲのない） アデノウイルス５の右２／３、およびＤＬ３２７ＬｏｘのＬｏｘ部位と同じ配向 にあるＬｏｘ部位を含んでいる。 実施例５ ｐＶＮ誘導ベクターの生成 ｐＶＮからのアデノウイルスベクターの生成の図形が図７で示される。 ＤＬ３２７Ｌｏｘから得た無傷末端タンパク質を持つＤＮＡの６μｇがＳｆｕ Ｉ線形化ｐＶＮプラスミドの６μｇと共に６cm皿で２９３ｅＣｒｅクローン２６ 細胞に同時形質移入された。これらの細胞では、Ｃｒｅタンパク質発現はデキサ メタゾン誘導プロモーターにより制御される。かくしてデキサメタゾンはＣｒｅ タンパク質発現の最大の誘導を保証するために組織培養培地に加えられた。三日 後、ウイルスは単層を通じて広がり細胞変性効果が明らかになった。細胞は採取 され粗ウイルス溶菌液は５回の凍結融解サイクルで調製された。溶菌液は低速遠 心分離で清澄化され、５０μｌあるいは２５０μｌの上澄みが２９３細胞の単層 を感染するために使用された。翌日、細胞変性効果は２９３細胞で明らかになり それはＸ−ｇａｌで染色された。各ケースで細胞の１／３がブルーに染色され、 かくしてもとの形質移入から生じるウイルス粒子のかなりの画分がｐＶＮプラス ミドから誘導されたβ−ガラクトシダーゼを含んでいたことが示された（図８参 照）。このベクターがＥ１およびＥ２β配列、主要後期プロモーター、および主 要後期転写物の５′配列を含むアデノウイルス５の最初の１１，０００塩基対の 殆どを欠いているということは注目に値する。対照形質移入はＤＬ３２７Ｌｏｘ ＤＮＡのみおよびｐＶＮのみで行われた。β−ガラクトシダーゼベクターはい ずれの対照からも得られなかった。 前記の実験から、Ｃｒｅリコンビナーゼの使用はプラークを獲得しスクリーン しおよび拡張する必要なしでアデノウイルスベクターの急速な生成を可能にする と結論づけられる。実施例６ β−ガラクトシダーゼベクターの生産を増大するように設計されたも一つの実 験において、実施例５での形質移入細胞から得られた粗ウイルス溶菌液５００μ ｌが１５cm組織培養皿で２９３細胞に適用された。２日後、細胞変性効果はこれ らの２９３細胞で明らかになった。粗ウイルス溶菌液が５サイクルの凍結融解に より調製され、溶菌液は２０個の１５cm皿の２９３細胞を感染するのに使用され た。１日後、細胞変性効果は明らかになり、一平板のＸ−ｇａｌ染色は１／４の 細胞がプラスミド誘導Ｂ−ｇａｌベクターを含んでいたことを示した。翌日細胞 変性効果は完全になり細胞は採取された。これらの細胞から調製された溶菌液は 標準アデノウイルス調製技術：ＣｓＣｌ段階勾配続いて一晩連続ＣｓＣｌ勾配、 で処理される。連続勾配はＤＬ３２７Ｌｏｘウイルスの強力帯およびＢ−ｇａｌ ベクターのより小さな上部帯を産出する。Ｂ−ｇａｌベクターは遠心分離管から 除去されその力価は翌日２９３細胞の感染およびＸｇａｌを用いる染色により決 定される。Ｂ−ｇａｌベクターは第二増大処理を受け、ここで２９３細胞は約２ の感染多重度でまたＤＬ３２７は約１の感染多重度でＢ−ｇａｌベクターと同時 感染される。これらの細胞の溶菌液から調製されるＢ−ｇａｌベクターは前の通 り遠心分離により精製される。この処理は高力価のプラスミド誘導Ｂ−ｇａｌベ クターを産出する。 実施例７ この実施例においては、アデノウイルスバックボーン遺伝子を完全に欠いてい るベクターを生成するためのＣｒｅリコンビ ナーゼを使用する有効性が実証された。アデノウイルス読み取り枠の残渣はプラ スミドｐＶＮから除去されバクテリアファージラムダからの配列で置換された。 これらの配列はそれらが真核細胞でタンパク質を発現しないものと期待され、ま た長さを提供しそれが有効なベクター生産に必要であると考えられるために選択 された。 いくつかの構築段階が含まれていた。アデノウイルス遺伝子はＡｆ１IIおよび ＡｖｒIIでの消化によりｐＶＮから除去されＮｏｔＩリンカーがＡｆ1II部位に 配置された。塩基対は９９４１からのバクテリオファージラムダから２４３２２ で天然に生じるＡｖｒIIまでの配列がプラスミドｐＶＮＬ３を産出するためにｐ ＶＮバックボーン、ＮｏｔＩからＡｖｒIIまでに連結された。このプラスミドは 左ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、ＲＳＶ促進ベータガラクト シダーゼ遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、（Ａｄ５塩基対３３２８− ３５３３からの）Ａｄ５配列の小さい伸張部、バクテリオファージラムダ配列、 （Ａｄ５塩基対３５４６３−３５７８６の）Ａｄ５の右末端からのＡｄ５配列の ３２４塩基対、およびＰａｃＩ部位からすぐ上流にあるｌｏｘ組換え部位を含む 。このプラスミドは更に線形化に使用されるＩＴＲの上流にＳｆｕＩ部位を含ん でいた。しかしこの部位はユニークではなく、また塩基対１２，７０９に存在し ていた。第二ＳｆｕＩ部位を除去するために、ｐＶＮＬ３は（ＳｆｕＩ部位に隣 接した）ＫｐｎＩで消化され、プラスミドｐＶＮＬ４を産出するために再連結さ れた。次の構築はＮｏｔＩ部位からすぐ上流のアデノウイ ルス配列の小伸張部を除去するように設計することであった。ｐＶＮＬ４はＳａ ｃＩおよびＮｏｔＩで消化され、それはベーターガラクトシダーゼ配列の末端、 ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびアデノウイルス配列を除去した。この 領域は更にｐＶＮＬ４からのものであるＳａｃＩからＢａｍＨＩまでの配列によ りＢａｍＨＩ部位に付加されたＮｏｔＩリンカーと共に置換された。この断片は ベータ−ガラクトシダーゼ配列の末端およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを 含んでいた。プラスミドはｐＶＮＬ５と名付けられ（図９）、それがコード化し た唯一のＡｄ５配列は左ＩＴＲ、パッケージングシグナル、および右末端からの ３２４塩基対であった。このプラスミドはいずれのアデノウイルスタンパク質も コード化しなかった。 Ｃｒｅ媒介組換えがアデノウイルスベクター（またこの場合アデノウイルスバ ックボーン遺伝子を欠いているアデノウイルスベクター）を生成する効率を大幅 に改善したことを実証するために、下記の実験が図１０で図形的に略述された通 り行われた。ＳｆｕＩ線形化ｐＶＮＬ５の６μｇがＤＬ３２７Ｌｏｘから誘導さ れた無傷末端タンパク質を持つＤＮＡ６μｇと混合された。混合物は次いで（Ｃ ｒｅリコンビナーゼを発現する）２９３ｅＣｒｅ細胞に形質移入された。選択肢 として、Ｃｒｅ媒介組換えは無細胞系で行われた。無傷末端タンパク質を持つＤ Ｌ３２７Ｌｏｘ ＤＮＡ２．１μｇと混合された線形化ｐＶＮＬ５、 １．２μ ｇが、反応が加熱で停止されなかったということを別にして、サウアー、酵素学 方法論 、２２５巻、８９０ページ（１９９３）の方法に従って３０μｌの反応混 合物とし て２５倍モル濃度過剰のＣｒｅタンパク質と反応させられた。続いて反応混合物 に関する制限診断は反応物の約１０−２０％が組換えを受けたことを実証した。 反応混合物は次いで（Ｃｒｅを発現しない）２９３ｅ細胞および（Ｃｒｅを発現 する）２９３ｅＣｒｅ細胞に形質移入された。 ７２時間後形質移入細胞が採取され、粗ウイルス溶菌液（ＣＶＬ）が細胞デブ リを除去するために凍結融解５サイクルおよび低速遠心分離により調製された。 各ＣＶＬの１／１０がＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞を形質導入するために使用され（ ゴルツィーリア、他、ウイルス学ジャーナル、７０巻、６号、４１７３−４１７ ８ページ（１９９６、６月）、また次の日細胞はベータ−ガラクトシダーゼ発現 のためにＸ−ｇａｌで染色された。２個のＤＮＡ反応物が細胞間で、無細胞反応 で、あるいはその両方のいずれかでＣｒｅに露出されたそれぞれの場合において 、ＣＶＬは形質導入ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞でベータ−ガラクトシダーゼを発現 したベクターを含んでいた。図１１は無細胞反応でＣｒｅに露出されたＤＮＡで 形質移入された２９３ｅ細胞からのＣＶＬで形質導入されたＸ−ｇａｌ染色細胞 の例である。Ｃｒｅが省略された対照コホートは事実上より少ないブルー染色細 胞を見せた。かくしてＣｒｅ媒介組換えは（いずれのアデノウイルスバックボー ン遺伝子をも欠いている）アデノウイルスが形質移入から誘導される効率を改善 した。 更にアデノウイルスベクターを急速に生成するＣｒｅの効率を計量化しまたベ クターの構造を実証するために、ＣＶＬ形質導入ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞は下記 の通りサザン分析により分 析された。前の各ＣＶＬの１／４がＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞を形質導入するため に使用された。４時間および７２時間後、ゲノムＤＮＡが細胞から調製され、Ｐ ｍｅＩで消化され、サザン分析を受けた。２個のプローブが使用され、その一つ は（ベクターＤＮＡのみを検出する）ベータ−ガラクトシダーゼにのみハイブリ ッド形成され、も一つは（ベクターおよびＤＬ３２７Ｌｏｘ ＤＮＡ双方を検出 する）パッケージングシグナルにハイブリッド形成したものであった。この結果 は図１２で示される。左方パネルは４時間だけＣＶＬで形質導入されたＡＥ１− ２Ａ．Ｓ８細胞からのゲノムＤＮＡで行われたβ−ガラクトシダーゼプローブで のサザン分析である。帯はＣＶＬにありまたＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞を形質導入 したベクターを表す。Ｃｒｅリコンビナーゼが存在した各場合において、強力帯 が見られる。Ｃｒｅが細胞間で使用された場合（レーン２および３）、あるいは 無細胞反応で（レーン５）、もしくはその両方である場合（レーン７）これは真 実である。Ｃｒｅが不在の場合（レーン４および６）には、帯は弱くあるいは検 出できなかった。レーン８−１０は対照レーンでありベーターガラクトシダーゼ プローブの感受性および特異性を実証した。それらはｐＶＮＬ５プラスミド、Ａ ｖ１ＬａｃＺ４（標準ベータ−ガラクトシダーゼアデノウイルスベクター）から 誘導されたＤＮＡ、およびＡｄ ｄ１３２７から誘導されたＤＮＡを含んでいた 。Ｃｒｅが使用されたすべての場合の帯の存在およびＣｒｅが省略されたすべて の場合の帯の不在はアデノウイルスベクター、およびとりわけバックボーン遺伝 子を持たないベクターが生成 され得る有効性をＣｒｅ媒介組換えが劇的に改善することを再び実証する。 前に記載のサザンブロットにおける帯がベータ−ガラクトシダーゼアデノウイ ルスベクターによるＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞の形質導入を表したことを更に実証 するために、ＤＬ３２７Ｌｏｘの存在下でそれが複製できる能力が評価された。 ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞は同じＣＶＬで７２時間形質導入されゲノムＤＮＡがサ ザン分析を受けた（図１２、中央パネル）。前の場合と同じように、Ｃｒｅの使 用がベクター帯と関連づけられた。もっとも重要なことは、２個のサザン分析の 比較は、（帯が対照レーンと比較して）第二サザンでより強力であったことを示 す。従って４時間および７２時間の間で複製が起こった。 ＣＶＬのベータ−ガラクトシダーゼベクターに対するＤＬ３２７Ｌｏｘの比率 を定量化するために、サザンブロット分析がＤＬ３２７Ｌｏｘおよびベクター双 方を検出するプローブを用いて形質導入ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞で行われた。前 のデータで認められたように、Ｃｒｅの使用はベクター帯を検出するために必要 であった。それぞれの場合において、ＤＬ３２７Ｌｏｘ帯はベクター帯よりもよ り強力であった。しかしレーン３および５において、比率は１０対１に過ぎなか った。Ｃｒｅの不在下での形質移入は事実上より高いＤＬ３２７Ｌｏｘ対ベクタ ーの比率に帰着した。単一形質移入からのベクターに対するＤＬ３２７Ｌｏｘの １０対１の比率は形質移入からのベクターの非常に有効な生成を表し、またプラ ークをスクリーンする必要なしでベクターの生産を可能にするであろう。 従って、前に記載した様式で使用される場合に、Ｃｒｅリコンビナーゼがアデ ノウイルスベクターを生成する工程を劇的に改良できることをこの実施例のデー タが実証している。更にこの方法論はすべてのアデノウイルスコーディング領域 を欠いているベクターを有効に精製するために使用することができる。 実施例８ 前に記載した手順により生成されたアデノウイルスベクターが培養で増幅でき た効率を改善するために二つの段階が着手された。この実施例で示されるように 、その第一のものは、最短長が機能的形質導入ベクター粒子の有効な生産に必要 であるとの推論に基づきベクターを伸長することであった。第二のものは実施例 ９で示されるように、パッケージングシグナルを再設計し、ベクターがＤＬ３２ ７Ｌｏｘを優先的にパッケージするようにすることであった。 約２５キロベースの長さを持つベクターを得るために、いくつかの構築物が調 製された。ｐＶＮＬ５から誘導されたベクターの長さは約１７，８００塩基対で あった。３個のより長い構築物が調製されそれはＡｐｏＡＩ遺伝子からの小上流 イントロンを持つアルブミン促進全長因子VIIIｃＤＮＡを組み込んでいた。最初 の２個は両方ともラムダスタッファ配列および因子VIII発現カセットを含んでい た。第三のものは因子VIIIを含んでいたがラムダ配列はなかった。この第三構築 物で約２５キロベースの長さのものが９５０塩基対アルブミンプロモーターを１ ２キロベースアルブミンプロモーター／エンハンサーで置換することにより得ら れた。 いくつかの構築段階が必然的に含まれた。まず全長因子VIIIコーディング領域 が１９９４年１２月２２日公開された公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４７１ で記載されたプラスミドｐＡｖＡＬＡＰＨ８１に挿入されたが、このプラスミド はアルブミン促進Ｂ領域欠失因子VIIIｃＤＮＡおよびＡｐｏＡＩ遺伝子からの小 上流イントロンを含む。Ｂ領域を含む因子VIIIコーディング配列の大部分はＳｐ ｅIからＸｂａIまでの断片としてプラスミドｐＳＰ６４−VIII（ＡＴＣＣ番号３ ９８１２）から除去されｐＡｖＡＬＡＰＨ８１でＢ領域のない類似因子VIII配列 で交換された。全長因子VIIIコーディング領域を持つ生成プラスミドはｐＡｖＦ VIIIと名付けられた。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは次いでｐＡｖＦVIIIか ら除去されプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（カリフォルニア、サンディエゴ、イン ・ヴァイトロゲン・コーポレイション）からのウシ成長ホルモンポリアデニル化 シグナルで置換された。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルはＰＣＲによ り塩基対１，０２３から１，２２１まででｐＣＤＮＡ３．１から移された。Ｃ１ ａＩ部位が上流オリゴヌクレオチドに組み込まれ、またＡｖｒΠおよびＸｈｏＩ 部位は下流オリゴヌクレオチドに含められた。この断片は次いでＣ１ａＩおよび ＸｈｏＩで消化されたｐＡｖＦVIIIに挿入され、これによりＳＶ４０ポリアデニ ル化シグナルおよび大部分の相同組換え領域を置換した。生成プラスミドはｐＡ ｖＨ８３ＧＨと名付けられた。因子VIII発現カセットはＭ１ｕＩ部位に付加され たＮｏｔＩリンカーを持つＭ１ｕＩからＡｖｒIIまでの断片としてｐＡｖＨ８３ ＧＨから除去された。この断片はラムダ配列を置換 するＮｏｔＩからＡｖｒΠまでの断片としてｐＶＮＬ６（図１７、これはパッケ ージングシグナルにおける小さな変化を除きｐＶＮＬ５と同一である。下記図９ 参照のこと）に挿入された。生成プラスミド、ｐＶＨ８３０１（図１３）は左ア デノウイルスＩＴＲ、パッケージングシグナル、ＲＳＶ促進ベータ−ガラクトシ ダーゼ遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、アルブミンプロモーター、Ａ ｐｏＡＩイントロン、全長因子VIIIコーディング領域、ウシ成長ホルモンポリア デニル化シグナル、右末端アデノウイルス５配列の短伸長部およびｌｏｘ部位を 含んでいた。 このプラスミドにより調製されたベクターの長さは約１３，６００塩基対であ ったであろう。これを２５キロベースにまで増加するために、いくつかの構築物 が作られた。ｐＶ１Ｈ８３０１およびｐＶ２Ｈ８３０１と名付けられた最初の２ 個で、ラムダスタッファＤＮＡの１２．９キロベースがＮｏｔＩおよびＡｖｒII リンカーを用いてそれぞれＮｏｔＩあるいはＡｖｒII部位に再挿入された。第三 の構築物はｐＶＨ８３０１から調製され、ここで余分の長さはラムダＤＮＡの挿 入では得られず、因子VIII発現カセットにおいて、ピンカート、他、遺伝子およ び進化 、１巻、２６８−２７６ページ（１９８７）による記載の１２キロベース アルブミンプロモーター／エンハンサー配列の使用により得られた。１２キロベ ースアルブミンプロモーター／エンハンサーはＭ１ｕＩからＢａｍＨＩまでの断 片としてプロモーター／エンハンサーを含むプラスミドから除去された。Ｎｏｔ ＩリンカーはＭ１ｕＩ部位に付加されまたＳａ１Ｉリン カーはＢａｍＨＩ部位に付加された。この１２キロベースアルブミンプロモータ ー／エンハンサー断片は次いでＮｏｔＩおよびＳａ１Ｉで消化されたｐＶＨ８３ ０１に挿入され、これにより９５０塩基対アルブミンプロモーターを置換した。 生成プラスミドはｐＶＨ８３０２と名付けられた（図１４）。 ３個のプラスミド、ｐＶ１Ｈ８３０１、ｐＶ２Ｈ８３０１、およびｐＶＨ８３ ０２は、約２５キロベース長であるアデノウイルスベクターを生成するために実 施例７に記載された方法論で使用される。生成ベクターのそれぞれはすべてのア デノウイルスバックボーン遺伝子を欠いており、ベータ−ガラクトシダーゼおよ びヒト因子VIIIを発現する。 実施例９ 実施例８で言及されたように、アデノウイルスベクターを延長することに加え て、実施例７に記載された手順により生成されるベクターが培養で増幅できる効 率を改善するために第二段階が着手された。この段階はベクターが優先的にＤＬ ３２７Ｌｏｘをパッケージするようにパッケージングシグナルを再設計すること を必然的に含んでいた。いくつかの構築段階が含まれていた。 新しいヘルパーウイルスがＤＬ３２７Ｌｏｘを置換するために生成された。Ｌ ｏｘＨＶ１と名付けられたこのウイルスは左ＩＴＲ、塩基対１０２−４５０を持 つが塩基対２６７および３５８の間の中央部欠失を持つパッケージングシグナル 、Ｅ１およびＥ３の欠失を除くＡｄ５配列の残りの部分、およびＤＬ３２７Ｌｏ ｘのＬｏｘ部位と同一の位置にあるＬｏｘ部位を含 む。かくしてＬｏｘＨＶ１は約１００倍もウイルスパッケージングを減少するパ ッケージング突然変異を持つＥ１、Ｅ３欠失ウイルスである。ＬｏｘＨＶ１を生 成するために、パッケージングシグナル突然変異体を含む断片が、グレイブル、 他、ウイルス学ジャーナル、６４巻、２０４７−２０５６ページ（１９９０）に より記載されたこの突然変異体配列を含むプラスミドからＰＣＲにより取り上げ られた。左オリゴヌクレオチドはＮｏｔＩ部位を含み右オリゴヌクレオチドはＢ ａｍＨＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ生成断片はＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化 されたｐＡｖＳ６Ａに挿入された（図１５）。１９９４年１０月２７日公開され たＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２３５８２に記載されたｐＡｖＳ６Ａは、塩基対８ １３でのＡＴＧがＳｆｉＩでの消化、３′オーバーハングの隣接、および再連結 反応により除去されたことを除き、合衆国特許番号５，５４３，３２８に記載さ れたｐＡｖＳ６と同一である。ｐＨＶＳ１と名付けられた生成プラスミド（図１ ６）は左ＩＴＲ、塩基対４５０まで但し中央欠失部を持つパッケージングシグナ ル、およびアデノウイルス相同組換え領域を含んでいた。ＬｏｘＨＶ１ウイルス は次いでＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞にあるＤＬ３２７Ｌｏｘからの大型Ｃ１ａＩ切 断断片と共にｐＨＶＳ１の同時形質移入により生成された。プラークは摘みとら れ拡張された。正しい構造が制限分析で実証された。 ＬｏｘＨＶ１の生成および成長のためのＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞の使用はきわ めて重要であった。これらの細胞へうまく処理組み込まれたＥ１発現カセットは アデノウイルス５塩基対５ ５２で出発する。かくして細胞系にある配列での組換え事象が野生型パッケージ ングシグナルをＬｏｘＨＶ１に再挿入できることは記していない。それに反して 、アデノウイルス左末端を含む２９３細胞でＬｏｘＨＶ１が成長したなら、組換 えがＥ１と同じく野生型パッケージシグナルをＬｏｘＨＶ１に復帰再挿入するこ とは大いにあり得る。そのパッケージングの利点を持つこの復帰突然変異体はＬ ｏｘＨＶ１を急速に過成長するであろう。 同じ理由で、ｐＶＮＬ６を産出するためにｐＶＮＬ５のパッケージングシグナ ルを修飾することは重要であった。ｐＶＮＬ５のアデノウイルスパッケージング シグナルはアデノウイルス５塩基対３９３に拡張する。かくしてｐＶＮＬ５およ びＬｏｘＨＶ１にあるパッケージングシグナルの間に相同性の３５塩基対が存在 する。ＬｏｘＨＶ１と同じ細胞にあるｐＶＮＬ５から誘導されたベクターの成長 は野生型パッケージングシグナルをＬｏｘＨＶ１に再挿入するベクターとＬｏｘ ＨＶ１の間の相同的組換えに帰着するであろう。これを予防するために、塩基対 ３５８から３９３までの相同性の領域は下記の通りｐＶＮＬ５から除去された。 第一段階は３５塩基対をｐＡｖＳ６Ａから除去することを含んでいた。アデノウ イルス５塩基対１−３５８を含んだ断片はｐＡｖＳ６ＡからＰＣＲ増幅された。 左オリゴヌクレオチドはＮｏｔＩ、ＳｆｕＩ、およびＰｍ１Ｉ部位を含み、また 右オリゴヌクレオチドはＡｓｃＩ部位を含んでいた。この断片は次いでｐＡｖＳ ６Ｂを産出するためにＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化されたｐＡｖＳ６Ａの相同 的領域で取り換え られた。このプラスミドは次いでＩＴＲ、パッケージングシグナル、およびＲＳ Ｖプロモーターを含む断片を得るためにＳｆｕＩおよびＳｐｅＩで消化された。 この断片は次いでプラスミドｐＶＮＬ６を産出するためにＳｆｕＩおよびＳｐｅ Ｉで消化されたｐＶＮＬ５の相同的領域と取り替えられた（図１７）。かくして ｐＶＮＬ６は二つの例外を除いてｐＶＮＬ５と同一である。まずそれは塩基対３ ５８−３９３からのアデノウイルス５配列を含まない。第二に、それはプラスミ ドを線型化するのに使用されるＩＴＲからすぐ上流に追加のユニーク制限部位、 Ｐｍ１Ｉを有している。実施例８で言及されたように、ｐＶＨ８３０１はｐＶＮ Ｌ６で構築された。従ってその誘導体であるｐＶ１Ｈ８３０１、ｐＶ２Ｈ８３０ １、およびｐＶＨ８３０２すべてはＰｍ１Ｉ部位を含みアデノウイルス５塩基対 ３５８−３９３を含まない。 図１８はｐＶＮＬ６およびＬｏｘＨＶ１にあるパッケージングシグナル同じく ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞にあるＥ１発現カセットの図形である。ｐＶＮＬ６誘導 ベクターおよびＬｏｘＨＶ１が一緒にこれらの細胞で成長すると、相同的組換え による野生型パッケージングシグナルのＬｏｘＨＶ１への再挿入は不可能である 。 ３個のプラスミド、ｐＶ１Ｈ８３０１、ｐＶ２Ｈ８３０１、およびｐＶＨ８３ ０２のそれぞれは、アデノウイルスバックボーン遺伝子を含まずベータガラクト シダーゼおよびヒト因子VIIIを発現するアデノウイルスベクターを生成するため に、ＬｏｘＨＶ１およびＣｒｅリコンビナーゼと共に併用される。ベク ター生成は急速でありプラークスクリーニングは必要としない。その工程は下記 の通りでありｐＶＨ８３０２として図形的に示される（図１９）。 無傷末端タンパク質を持つＤＮＡは実施例３で略述された方法によりＬｏｘＨ Ｖ１のウイルス調製物から得られる。プラスミドｐＶＨ８３０２（あるいはｐＶ １Ｈ８３０１もしくはｐＶ２Ｈ８３０１）はＰｍ１Ｉで線形化されるが、何故な らこれまでの実施例で線形化に使用されてきたＳｆｕＩが因子VIIIｃＤＮＡを含 むプラスミドでユニークではないからである。線形化ＤＮＡは次いでフェノール ／クロロホルムおよびクロロホルム、抽出、エタノール沈殿、およびＴＥ（トリ ス１０ｍＭ、ｐＨ８およびＥＤＴＡ１ｍＭ）内での再懸濁により精製される。無 傷末端タンパク質を持つＬｏｘＨＶ１ ＤＮＡ２μｇおよび線形プラスミドの２ μｇが次いで前の実施例７で記載された通りＣｒｅの２５倍モル濃度過剰のもの で反応される。プロメガ（ウィスコンシン、マジソン）リン酸カルシウム形質移 入キットを用いて、反応混合物は次いでＡＥ１−２Ａ・Ｓ８細胞に形質移入され る。細胞は形質移入の２日前に、６cm組織培養皿で平板培養され、デキサメタゾ ンが形質移入１日前に３００μｇ／ｍｌの濃度でそれらの培地に加えられた。デ キサメタゾンはこれらの細胞のＥ１およびＥ２ａの発現を誘導するのに役立つ。 形質移入の時点で、細胞は３０−５０％の密集となる。 形質移入約１６時間後、リン酸カルシウム沈殿物は組織培養皿から洗浄され、 形質移入３日後に細胞は採取される。ＣＶＬは凍結融解５サイクルで調製され、 １０cm皿のデキサメタゾン 誘導ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８細胞上に置かれる。細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示 す時、ＣＶＬが調製され４個の１５cm皿でデキサメタゾン誘導ＡＥ１−２Ａ．Ｓ ８細胞を感染するために使用される。これらの皿からのＣＶＬは次いで４０個の １５cm皿を感染するために使用される。これらの皿からの細胞ペレットは、塩化 セシウム段階勾配続いて塩化セシウム平衡密度勾配を含む標準方法論によりアデ ノウイルス調製物を作るために使用される。この手順によりベクターはＬｏｘＨ Ｖ１から容易に分離される。ベクターはＬｏｘＨＶ１より短いために、それは勾 配でより高く帯状となる。更にベクター帯はＬｏｘＨＶ１ウイルスが不十分にパ ッケージされるためにＬｏｘＨＶ１帯よりも大きくなる。 この手順で調製されるアデノウイルスベクターの完全性はベクターから得られ るＤＮＡの制限分析により実証される。その力価はそのＤＮＡ容量の分光光度測 定から決定されまたベクター形質導入細胞のベータ−ガラクトシダーゼ発現によ り決定される。更に形質導入細胞における因子VIII発現はベクターの潜在能の基 準を提供する。ベクター調製物がＬｏｘＨＶ１で汚染されている範囲は、ベクタ ー調製物から得られるＤＮＡの制限およびＰＣＲ分析により、またヘキソン発現 のためにベクター形質導入ＡＥ１−２Ａ．Ｓ８（あるいは２９３）細胞を染色す ることにより決定される。 実施例１０ これはハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルス（ＨＡＲＶ）ベクターの 調製を可能にするためにここに記載されたベ クターの能力をコード化する大型移植遺伝子を使用する実施例である。このよう なベクターは、アデノウイルスベクターの高い形質導入効率を標的細胞ゲノムを 永続的に修飾するレトロウイルスベクターの能力と結合する。特異的には、ＨＡ ＲＶベクターで形質導入された各細胞はマーカーあるいは治療用移植遺伝子をコ ード化するレトロウイルスベクターを生成するであろう。レトロウイルスベクタ ーは次いで接する細胞に移植遺伝子を拡散しそれを細胞のゲノムＤＮＡに永続的 に組み込むであろう。この実施例で使用される移植遺伝子はＢ領域欠失因子VIII である。 この実施例におけるレトロウイルス構築物は天然の包膜スプライス部位を利用 するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）レトロウイルスバックボーンプ ラスミドｐＧ１の誘導体である（図２０、および１９９１年７月２５日公開のＰ ＣＴ出願番号ＷＯ９１／１０７２８に記載されている）。 ｐＧ１Ｓを調製するために、天然ＭＭＬＶスプライスアクセプターを含む断片 がＰＣＲによりＭＭＬＶから取り上げられる。増幅領域はＭＭＬＶ塩基対５４０ １−５７７６から拡張する。上流オリゴヌクレオチドはＮｏｔＩ部位を含みまた 下流オリゴヌクレオチドはＸｈｏＩ部位を含む。この断片は次いでＮｏｔＩおよ びＸｈｏＩで消化されたｐＧ１に挿入され（図２０）、ｐＧ１Ｓを産出する。Ｂ 領域欠失因子VIIIは次いでＸｈｏＩからＳａ１Ｉまでの断片としてｐＭＴ２ＬＡ （マサチューセッツ、ケンブリッジ、ジェネティック・インスティチュートから 得られ、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４７１に記載され たもの）から因子VIIIコーディング領域を除去しそれをＸｈｏＩで切断されたＧ ｌＳに連結することによりレトロウイルス構築物に挿入される。生成プラスミド はｐＧ１ＳＨ８１０１と名付けられる。ＭＭＬＶスプライスアクセプター領域に あるＰｍ１Ｉ部位はｐＧ１ＳＨ８１０２を産出するためにＰｍ１Ｉでの消化およ びＭ１ｕＩリンカーを横切る再連結反応により除去される（図２１）。因子VIII 含有レトロウイルス構築物は次いでＳａｃIIおよびＢｓｔ１１０７での消化によ りｐＧ１ＳＨ８１０２から除去され、またＮｓｉＩリンカーはＳａｃII部位に付 加される。この断片は次いでｐＶＮＬ７を産出するためにＮｓｉＩおよびＳｎａ ＢＩで切断されたｐＶＮＬ６に連結される（図２２）。レトロウイルスパッケー ジング遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖの発現カセットはＮｈｅＩからＢｓ ｔ１１０７断片としてｐＰＡＭ３から除去され（ミラー、他、バイオテクニクス 、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９））、またＮｈｅＩ部位は平滑化され る。この断片はＰｍｅＩおよびＡｖｒIIで切断されたｐＶＮＬ７に連結され、Ａ ｖｒII部位は平滑化される。ｐＨＡＲＶ１Ｈ８１と名付けられた生成プラスミド は図２３に示される。 ＨＡＲＶベクターの調製は実施例９のベクターの調製と全く類似している。簡 潔にいうと、Ｐｍ１Ｉ線形化ｐＨＡＲＶ１Ｈ８１および無傷末端タンパク質を持 つＬｏｘＨＶ１ ＤＮＡは過剰のＣｒｅタンパク質と反応し、次いでＡＥ１−２ Ａ．Ｓ８細胞に形質移入される（図２４）。３日後ＣＶＬが調製され、調製物は １個の１０cm皿、４個の１５cm皿、および４０個の１ ５cm皿で数回増幅を実現される。ベクターは次いで超遠心により精製され、その 完全性は実施例９で略述された品質管理検定により実証される。 マウスの尾部静脈に注入されると、ＨＡＲＶ１Ｈ８１ベクターは肝細胞に累積 する。約１０⁸粒子の注射用量が約１％の肝細胞を形質導入するために選ばれる 。ＨＡＲＶ１Ｈ８１形質導入細胞はＢ領域欠失ヒト因子VIIIをコード化するレト ロウイルスベクターを分泌する。このレトロウイルスベクターは次いで周囲の肝 細胞を永続的に形質導入し修飾する。年少マウスでは、正常な肝臓の成長はレト ロウイルスベクターでの有効な肝細胞形質導入を可能にし十分な肝細胞細胞分割 に帰着する。成熟動物では、肝細胞増殖はケラチノサイト成長因子などの成長因 子を静脈内に投与することにより達成される。 この明細書で引用されたすべての特許、公開情報（公開特許出願を含む）、お よびデータベースアクセス番号ならびに寄託所アクセス番号の開示は、あたかも それぞれこのような個別の特許、公開情報、およびデータベースアクセス番号、 ならびに寄託所アクセス番号が引用例として組み込まれるように特異的かつ個別 に指示されたかのようにその同じ範囲で全体として引用例によりここで特異的に 組み込まれる。 しかしこの発明の範囲は前に記載の特異的な実施例に限定されるべきでないこ とは理解されるべきである。この発明は特に記載のもの以外に実施することがで き、しかも添付する請求項の範囲内にある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異種ＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターを生産する一つの細胞であっ て、 （ａ）前記異種ＤＮＡ、アデノウイルスＩＴＲ、アデノウイルスパッケージン グシグナル、およびリコンビナーゼ標的部位を含む第一ポリヌクレオチド; （ｂ）前記ＩＴＲに結合した末端タンパク質を含む少くとも１個のアデノウイ ルスＩＴＲ、および前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを含 む時には前記ＩＴＲは５′でありまた前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイル ス５′ＩＴＲを含む時には前記ＩＴＲは３′ＩＴＲであるリコンビナーゼ標的部 位、を含む第二ポリヌクレオチド; （ｃ）部位特異的リコンビナーゼをコード化するＤＮＡを含む第三ポリヌクレ オチド；および （ｄ）ＤＮＡが前記第一、第二、および第三ポリヌクレオチドに存在しない範 囲でアデノウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッ ケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ、 よりなる異種ＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターを生産する細胞。 ２．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここでアデノウイルスベクターとし て前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイル スタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが前記第二ポリヌクレオチドに含まれる 細胞。 ３．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここでアデノウイ ルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのた めにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが前記第一ポリヌクレ オチドに含まれる細胞。 ４．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここでアデノウイルスベクターとし て前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイル スタンパク質をコード化する前記ＤＮＡの一部が前記第一ポリヌクレオチドに含 まれ、またアデノウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およ びパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡ の一部が前記第二ポリヌクレオチドに含まれる細胞。 ５．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここでアデノウイルスベクターとし て前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイル スタンパク質をコード化する前記ＤＮＡの一部が前記細胞により供給される細胞 。 ６．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここで前記部位特異的リコンビナー ゼがＣｒｅリコンビナーゼであり、リコンビナーゼ標的部位がＬｏｘ部位である 細胞。 ７．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチドが プラスミドである細胞。 ８．請求の範囲第７項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチドが プラスミドでありそれが５′から３′の方向にユニーク制限部位、アデノウイル ス５′ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、前記異種ＤＮＡ、およ びリコンビナーゼ標的部位を含み、またここで前記第二ポリヌクレオチ ドにある前記少くとも１個のＩＴＲがアデノウイルス３′ＩＴＲである細胞。 ９．請求の範囲第８項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチドが 前記細胞への形質移入の前に線形化され、また前記第一ポリヌクレオチドが５′ から３′への方向にアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージング シグナル、前記異種ＤＮＡ、およびリコンビナーゼ標的部位を含み、またここで 前記第二ポリヌクレオチドにある前記少くとも１個のＩＴＲがアデノウイルス３ ′ＩＴＲである細胞。 １０．請求の範囲第９項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチド が更にアデノウイルス３′ＩＴＲを含む細胞。 １１．請求の範囲第１項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチド が５′から３′の方向にリコンビナーゼ標的部位、アデノウイルスパッケージン グシグナル、前記異種ＤＮＡ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、およびユニーク制限 部位を含むプラスミドであり、またここで前記第二ポリヌクレオチドにある前記 少くとも１個のＩＴＲがアデノウイルス５′ＩＴＲである細胞。 １２．請求の範囲第１１項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチ ドが前記細胞への形質移入より前に線形化され、また前記第一ポリヌクレオチド が５′から３′の方向にリコンビナーゼ標的部位、アデノウイルスパッケージン グシグナル、前記異種ＤＮＡ、およびアデノウイルス３′ＩＴＲを含み、またこ こで前記第二ポリヌクレオチドにある前記少くとも １個のＩＴＲがアデノウイルス５′ＩＴＲである細胞。 １３．請求の範囲第１２項記載の細胞であって、ここで前記第一ポリヌクレオチ ドが更にアデノウイルス５′ＩＴＲを含む細胞。 １４．請求の範囲第７項記載の細胞であって、ここで前記プラスミドがアデノウ イルスタンパク質をコード化するＤＮＡを欠いており、また選択マーカーをコー ド化するＤＮＡを欠いており、また前記第二ポリヌクレオチドはアデノウイルス ５′ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、アデノウイルスベクター として前記プラスミドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタン パク質をコード化するＤＮＡ、リコンビナーゼ標的部位、およびアデノウイルス ３′ＩＴＲを含むヘルパーウイルスＤＮＡであり、ここでアデノウイルス末端タ ンパク質は少くとも１個のアデノウイルス５′ＩＴＲおよび３′ＩＴＲに結合さ れる細胞。 １５．請求の範囲第１４項記載の細胞であって、ここで前記ヘルパーウイルスが 突然変異パッケージングシグナルを含む細胞。 １６．請求の範囲第１４項記載の細胞であって、ここで前記ヘルパーウイルスが アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質をコード化するＤＮＡを含まず、 またアデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが 前記細胞により供給される細胞。 １７．請求の範囲第１項記載の細胞から生成される一つのアデノウイルスベクタ ー。 １８．一つのアデノウイルスベクターであって、 アデノウイルス５′ＩＴＲ； アデノウイルスパッケージングシグナル； 異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列；および アデノウイルス３′ＩＴＲ、ここで前記ベクターはアデノウイルスタンパ ク質を発現するＤＮＡを欠いておりまた選択マーカーをコード化するＤＮＡを欠 いているアデノウイルス３′ＩＴＲ、 を含むアデノウイルスベクター。 １９．異種ＤＮＡを発現するためのアデノウイルスベクターを生成する一つの方 法であって、 一つの細胞に、 （ａ）異種ＤＮＡ、アデノウイルスＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシ グナル、およびリコンビナーゼ標的部位を含む第一ポリヌクレオチド； （ｂ）前記ＩＴＲに結合された末端タンパク質を含む少くとも１個のアデノウ イルスＩＴＲ、および前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを 含む時は前記ＩＴＲは５′ＩＴＲであり、また前記第一ポリヌクレオチドがアデ ノウイルス５′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは３′ＩＴＲであるリコンビナーゼ 標的部位、を含む第二ポリヌクレオチド； （ｃ）部位特異的リコンビナーゼをコード化するＤＮＡを含む第三ポリヌクレ オチド、ここで前記細胞は、このようなＤＮＡが前記第一、第二、および第三ポ リヌクレオチドに存在しない範囲でアデノウイルスベクターとして前記第一ポリ ヌ クレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコ ード化するＤＮＡを含み、これにより前記細胞の前記第一、第二、および第三ポ リヌクレオチドでの形質移入に際して、前記ＩＴＲに結合した末端タンパク質を 含むアデノウイルスＩＴＲが前記第二ポリヌクレオチドから前記第一ポリヌクレ オチドに転移され、これにより前記第一ポリヌクレオチドからアデノウイルスベ クターを生成する、第三ポリヌクレオチド、 を形質移入する ことよりなる異種ＤＮＡを発現するためのアデノウイルスベクターを生成する方 法。 ２０．請求の範囲第１９項記載の方法に従って生成されるアデノウイルスベクタ ー。 ２１．異種ＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターを生成する一つの方法であ って、 （ａ）部位特異的リコンビナーゼを用いて （ｉ）異種ＤＮＡ、アデノウイルスＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシ グナル、およびリコンビナーゼ標的部位を含む第一ポリヌクレオチド、および （ii）前記ＩＴＲに結合された末端タンパク質を含む少くとも１個のアデノウ イルスＩＴＲ、および前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを 含む時は前記ＩＴＲは５′ＩＴＲであり、また前記第一ポリヌクレオチドがアデ ノウイルス５′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは３′ＩＴＲであり、これにより前 記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポ リヌクレオチドの前記部位特異的リコンビナーゼとの反応に際して、前記ＩＴＲ と結合した末端タンパク質を含むアデノウイルスＩＴＲが前記第二ポリヌクレオ チドから前記第一ポリヌクレオチドに転移されるリコンビナーゼ標的部位を含む 、第二ポリヌクレオチド、 を反応させ、および （ｂ）前記第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドを反応させた後 細胞内に前記第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドを形質移入し、 前記細胞はそのようなＤＮＡが前記第一および第二ポリヌクレオチドに存在しな い範囲でアデノウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製および パッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡを含み 、またこれにより前記細胞の前記第一および第二ポリヌクレオチドでの形質導入 に際しアデノウイルスベクターが前記第一ポリヌクレオチドから生成される ことよりなる異種ＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターを生成する方法。 ２２．異種ＤＮＡを発現するためにアデノウイルスベクターを生成する一つのキ ットであって、 （ａ）部位特異的リコンビナーゼ、 （ｂ）異種ＤＮＡ、アデノウイルスＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシ グナル、およびリコンビナーゼ標的部位を含む第一ポリヌクレオチド、および （ｃ）前記ＩＴＲに結合された末端タンパク質を含む少くと も１個のアデノウイルスＩＴＲ、および、前記第一ポリヌクレオチドがアデノウ イルス３′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは５′ＩＴＲでありまた前記第一ポリヌ クレオチドがアデノウイルス５′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは３′であり、こ れにより前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌクレオチドが、それに より前記ＩＴＲに結合された末端タンパク質を含むアデノウイルスＩＴＲを前記 第二ポリヌクレオチドから前記第一ポリヌクレオチドに転移するために部位特異 的リコンビナーゼと反応することが可能となるリコンビナーゼ標的部位を含む第 二ポリヌクレオチド、および （ｄ）細胞、前記細胞はそのようなＤＮＡが前記第一および第二ポリヌクレオ チドに存在しない範囲でアデノウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチ ドの複製およびパッケージのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤ ＮＡを含み、これによって前記細胞はアデノウイルスベクターを前記第一ポリヌ クレオチドから生産するために前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌ クレオチドの前記部位特異的リコンビナーゼとの反応後に前記第一ポリヌクレオ チドおよび前記第二ポリヌクレオチドで形質導入されることが可能となる細胞、 よりなる異種ＤＮＡを発現するためにアデノウイルスベクターを生成するキット 。 ２３．請求の範囲第２１項記載の方法に従って生成される一つのアデノウイルス ベクター。 ２４．請求の範囲第２３項記載のアデノウイルスベクターで あって、ここで前記異種ＤＮＡが レトロウイルス５′ＬＴＲ； レトロウイルスパッケージングシグナル； アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種のタンパク質をコード化するＤＮ Ａ配列； レトロウイルス３′ＬＴＲ レトロウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコ ード化するＤＮＡ配列；および レトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、ここで前記レト ロウイルス５′ＬＴＲおよび前記レトロウイルス３′ＬＴＲは前記レトロウイル スパッケージングシグナル、ならびにレトロウイルスおよびアデノウイルスに異 種のタンパク質をコード化する前記ＤＮＡ配列に隣接し、またここでレトロウイ ルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化する前 記ＤＮＡ配列ならびにレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化する前記ＤＮ Ａ配列は前記レトロウイルス５′ＬＴＲおよび前記レトロウイルス３′ＬＴＲに 隣接されていないＤＮＡ配列、 を含むアデノウイルスベクター。 ２５．一つのハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターであって アデノウイルス５′ＩＴＲ； アデノウイルスパッケージングシグナル； レトロウイルス５′ＬＴＲ； レトロウイルスパッケージングシグナル； アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種のタンパク質をコード化するＤＮ Ａ配列； レトロウイルス３′ＬＴＲ； レトロウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコ ード化するＤＮＡ配列； レトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡ配列；および アデノウイルス３′ＩＴＲ、ここで（ｉ）前記アデノウイルス５′ＩＴＲおよ び前記アデノウイルス３′ＩＴＲは前記アデノウイルスパッケージングシグナル 、前記レトロウイルス５′ＬＴＲ、前記レトロウイルスパッケージングシグナル 、アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種の前記タンパク質をコード化する 前記ＤＮＡ配列、前記レトロウイルス３′ＬＴＲ、レトロウイルスｇａｇタンパ ク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化する前記ＤＮＡ配列、お よびレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化する前記ＤＮＡ配列に隣接し； （ii）前記レトロウイルス５′ＬＴＲおよび前記レトロウイルス３′ＬＴＲは前 記レトロウイルスパッケージングシグナルならびにアデノウイルスおよびレトロ ウイルスに異種のタンパク質をコード化する前記ＤＮＡに隣接し；（iii）レト ロウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化 する前記ＤＮＡ配列ならびにレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化する前 記ＤＮＡ配列は前記レトロウイルス５′ＬＴＲおよび前記レトロウイルス３′Ｌ ＴＲに隣接せず、；また（iv）前記アデノウイルスパッケージングシグナル は前記レトロウイルス５′ＬＴＲおよび前記レトロウイルス３′ＬＴＲにより隣 接せずまた前記ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターがパッケ ージされることが可能になるように前記アデノウイルス５′ＩＴＲあるいは前記 アデノウイルス３′ＩＴＲの一つに十分近接して配置される、アデノウイルス３ ′ＩＴＲ、 を含むハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクター。 ２６．ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターを生成する一つの 方法であって、 一つの細胞に、 （ａ）レトロウイルス５′ＬＴＲ、レトロウイルスパッケージングシグナル、 アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種の少くとも１個のタンパク質あるい はポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列、レトロウイルス３′ＬＴＲ、レトロ ウイルスｇａｇタンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化す るＤＮＡ配列、レトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、ア デノウイルスＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、およびリコンビ ナーゼ標的部位を含む第一ポリヌクレオチド； （ｂ）前記ＩＴＲに結合した末端タンパク質を含む少くとも１個のアデノウイ ルスＩＴＲ、および、前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲを 含む時は前記ＩＴＲは５′ＩＴＲであり、また前記第一ポリヌクレオチドがアデ ノウイルス５′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは３′ＩＴＲであ るリコンビナーゼ標的部位、を含む第二ポリヌクレオチド； ならびに （ｃ）部位特異的リコンビナーゼをコード化するＤＮＡを含む第三ポリヌクレ オチド、ここで前記細胞はそのようなＤＮＡが前記第一、第二、および第三ポリ ヌクレオチドに存在しない範囲でアデノウイルスベクターとして前記ポリヌクレ オチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード 化するＤＮＡを含み、これにより前記細胞の前記第一、第二、および第三ポリヌ クレオチドでの形質移入に際して、前記ＩＴＲに結合した末端タンパク質を含む アデノウイルスＩＴＲが前記第二ポリヌクレオチドから前記第一ポリヌクレオチ ドに転移され、これにより前記第一ポリヌクレオチドからハイブリッドアデノウ イルス−レトロウイルスベクターを生成する、 これら３個のポリヌクレオチドを形質移入する、 ことよりなるハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターを生成する 方法。 ２７．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここでハイブリッドアデノウイ ルス−レトロウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパ ッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが前 記第二ポリヌクレオチドに含まれる方法。 ２８．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここでハイブリッドアデノウイ ルス−レトロウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパ ッケージングのためにアデ ノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡが前記第一ポリヌクレオチドに含ま れる方法。 ２９．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここでハイブリッドアデノウイ ルス−レトロウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパ ッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが前 記第一ポリヌクレオチドに含まれ、またハイブリッドアデノウイルスベクターと して前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイ ルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡの一部が前記第二ポリヌクレオチドに 含まれる方法。 ３０．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここでハイブリッドアデノウイ ルス−レトロウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパ ッケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡの一 部が前記細胞により供給される方法。 ３１．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここで前記部位特異的リコンビ ナーゼがＣｒｅリコンビナーゼでありリコンビナーゼ標的部位がＬｏｘ部位であ る方法。 ３２．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここで前記第一ポリヌクレオチ ドがプラスミドである方法。 ３３．請求の範囲第３２項記載の方法であって、ここで前記プラスミドがアデノ ウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡを欠いておりまた選択マーカーをコー ド化するＤＮＡを欠いており、更に前記第二ポリヌクレオチドはアデノウイルス ５′ＩＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、ハイブリッドア デノウイルス−レトロウイルスベクターとして前記プラスミドの複製およびパッ ケージングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ、リコンビ ナーゼ標的部位、およびアデノウイルス３′ＩＴＲを含むヘルパーウイルスであ り、ここでアデノウイルス末端タンパク質が少くとも１個のアデノウイルス５′ ＩＴＲおよび３′ＩＴＲに結合される方法。 ３４．請求の範囲第２６項記載の方法に従って生成される一つのハイブリッドア デノウイルス−レトロウイルスベクター。 ３５．ハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターを生成する一つの 方法であって、 （ａ）部位特異的リコンビナーゼで （ｉ）レトロウイルス５′ＬＴＲ、レトロウイルスパッケージングシグナル、 アデノウイルスおよびレトロウイルスに異種のタンパク質あるいはポリペプチド をコード化するＤＮＡ配列、レトロウイルス３′ＬＴＲ、レトロウイルスｇａｇ タンパク質およびレトロウイルスｐｏｌタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、 レトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード化するＤＮＡ配列、アデノウイルスＩ ＴＲ、アデノウイルスパッケージングシグナル、およびリコンビナーゼ標的部位 を含む第一ポリヌクレオチド、および （ii）前記ＩＴＲに結合された末端タンパク質を含む少くとも１個のアデノウ イルスＩＴＲ、および、前記第一ポリヌクレオチドがアデノウイルス３′ＩＴＲ を含む時は前記ＩＴＲは５′ＩＴＲであり、また前記第一ポリヌクレオチドがア デノウイルス５′ＩＴＲを含む時は前記ＩＴＲは３′ＩＴＲで あり、これにより前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌクレオチドの 前記部位特異的リコンビナーゼとの反応に際し、前記ＩＴＲに結合された末端タ ンパク質を含むアデノウイルスＩＴＲは前記第二ポリヌクレオチドから前記第一 ポリヌクレオチドに転移される、第二ポリヌクレオチド、これら２個のポリヌク レオチドを反応させ、また （ｂ）前記第一ポリヌクレオチドおよび前記第二ポリヌクレオチドを反応させ た後、細胞に前記第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドを形質移入 し、前記細胞はそのようなＤＮＡが第一および第二ポリヌクレオチドに存在しな い範囲でハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターとして前記第一 ポリヌクレオチドの複製およびパッケージングのためにアデノウイルスタンパク 質をコード化するＤＮＡを含み、またこれにより前記細胞の前記第一および第二 ポリヌクレオチドでの形質移入に際し、ハイブリッドアデノウイルス−レトロウ イルスベクターが前記第一ポリヌクレオチドから生成される、 ことよりなるハイブリッドアデノウイルス−レトロウイルスベクターを生成する 方法。 ３６．請求の範囲第３５項記載の方法であって、ハイブリッドアデノウイルス− レトロウイルスベクターとして前記第一ポリヌクレオチドの複製およびパッケー ジングのためにアデノウイルスタンパク質をコード化する前記ＤＮＡが前記第二 ポリヌクレオチドに含まれる方法。 ３７．請求の範囲第３５項記載の方法に従って生成される一つ のアデノウイルス−レトロウイルスベクター。