JPH1036272A - 転写因子ａｐ−１の拮抗的阻害剤 - Google Patents
転写因子ａｐ−１の拮抗的阻害剤Info
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- JPH1036272A JPH1036272A JP8196149A JP19614996A JPH1036272A JP H1036272 A JPH1036272 A JP H1036272A JP 8196149 A JP8196149 A JP 8196149A JP 19614996 A JP19614996 A JP 19614996A JP H1036272 A JPH1036272 A JP H1036272A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の発
症に関与するコラゲナーゼ遺伝子の発現を制御する転写
因子AP-1の結合を拮抗的に阻害し、間葉系細胞の増殖阻
害および膠原病の予防・治療に有効な薬剤を提供する。 【解決手段】 コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の
一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその
相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする転写因子AP-1の拮
抗的阻害剤、間葉系細胞の増殖阻害剤および膠原病の治
療・予防剤。
症に関与するコラゲナーゼ遺伝子の発現を制御する転写
因子AP-1の結合を拮抗的に阻害し、間葉系細胞の増殖阻
害および膠原病の予防・治療に有効な薬剤を提供する。 【解決手段】 コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の
一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその
相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする転写因子AP-1の拮
抗的阻害剤、間葉系細胞の増殖阻害剤および膠原病の治
療・予防剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、特定の塩基配列
を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有し、転写因子
AP-1の拮抗的結合阻害、間葉系細胞の増殖阻害、および
慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の治療・予防に
有効な薬剤に関するものである。
を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有し、転写因子
AP-1の拮抗的結合阻害、間葉系細胞の増殖阻害、および
慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の治療・予防に
有効な薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】結合組織の炎症を主病変とする疾患群を
総称する膠原病は、世界的にその病因の解明と治療が困
難な難治性慢性疾患として知られている。この膠原病に
は、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、多発性筋炎、強皮
症および全身性エリテマトーデス等が含まれている。こ
れらの疾患は、世界的に多くの研究が進められている
が、いまだに有効な治療法が発見されていない。たとえ
ば、慢性関節リウマチは、比較的高い罹患率を示す疾患
であるにも関わらず、その治療は、経験的な域を脱して
いない。また、未だ寛解を導くような治療法も開発され
ていない。このような現状は、最先端の病因研究の成果
が正しく理解されていないことに起因している。
総称する膠原病は、世界的にその病因の解明と治療が困
難な難治性慢性疾患として知られている。この膠原病に
は、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、多発性筋炎、強皮
症および全身性エリテマトーデス等が含まれている。こ
れらの疾患は、世界的に多くの研究が進められている
が、いまだに有効な治療法が発見されていない。たとえ
ば、慢性関節リウマチは、比較的高い罹患率を示す疾患
であるにも関わらず、その治療は、経験的な域を脱して
いない。また、未だ寛解を導くような治療法も開発され
ていない。このような現状は、最先端の病因研究の成果
が正しく理解されていないことに起因している。
【０００３】慢性関節リウマチは、各種の炎症性物質に
より関節の滑膜細胞の増殖が異常に亢進して関節が破壊
されることにより発症する。今日までの治療薬の開発研
究は、これらの炎症性物質の活性ならびに産生を抑制す
ることに焦点が当てられているが、これらは対症療法で
あり、本質的な治療法ではない。たとえば、生体膜を構
成するアラキドン酸の代謝物の中には、プロスタグラン
ジン(PG)やロイコトリエン等の炎症性物質が多く含まれ
ており、これらの産生を担う酵素（シクロオキシゲナー
ゼおよびリポキシゲナーゼ等）の阻害剤あるいは細胞膜
上でのこれらの受容体拮抗剤が数多く開発されている。
しかしながら、たとえば、シクロオキシゲナーゼを阻害
し、PG産生を抑制することが知られている非ステロイド
性抗炎症薬は、既に慢性関節リウマチの治療に用いられ
ているが、関節破壊に奏功しないことが知られている。
より関節の滑膜細胞の増殖が異常に亢進して関節が破壊
されることにより発症する。今日までの治療薬の開発研
究は、これらの炎症性物質の活性ならびに産生を抑制す
ることに焦点が当てられているが、これらは対症療法で
あり、本質的な治療法ではない。たとえば、生体膜を構
成するアラキドン酸の代謝物の中には、プロスタグラン
ジン(PG)やロイコトリエン等の炎症性物質が多く含まれ
ており、これらの産生を担う酵素（シクロオキシゲナー
ゼおよびリポキシゲナーゼ等）の阻害剤あるいは細胞膜
上でのこれらの受容体拮抗剤が数多く開発されている。
しかしながら、たとえば、シクロオキシゲナーゼを阻害
し、PG産生を抑制することが知られている非ステロイド
性抗炎症薬は、既に慢性関節リウマチの治療に用いられ
ているが、関節破壊に奏功しないことが知られている。
【０００４】また、炎症性物質として各種のサイトカイ
ンが最近注目されており、実際にインターロイキン−１
(IL-1)やインターロイキン−６ (IL-6)、腫瘍壊死因子
(TNF)等の産生阻害薬や抗サイトカイン抗体およびサイ
トカイン受容体に対する抗体等が世界中で研究されてい
る。しかしながら、慢性関節リウマチの関節破壊は、多
くの炎症性物質の複雑なネットワークの結果として生じ
ると考えられることから、一つの炎症性物質の作用を打
ち消したのみでは、病変の進行は抑えきれない。これ
は、炎症性物質の生理的な作用が相互に補完されてお
り、一種の物質の作用を阻害しても代替的に他の炎症性
物質が作用し、結果として炎症反応が進行することによ
ると考えられる。
ンが最近注目されており、実際にインターロイキン−１
(IL-1)やインターロイキン−６ (IL-6)、腫瘍壊死因子
(TNF)等の産生阻害薬や抗サイトカイン抗体およびサイ
トカイン受容体に対する抗体等が世界中で研究されてい
る。しかしながら、慢性関節リウマチの関節破壊は、多
くの炎症性物質の複雑なネットワークの結果として生じ
ると考えられることから、一つの炎症性物質の作用を打
ち消したのみでは、病変の進行は抑えきれない。これ
は、炎症性物質の生理的な作用が相互に補完されてお
り、一種の物質の作用を阻害しても代替的に他の炎症性
物質が作用し、結果として炎症反応が進行することによ
ると考えられる。
【０００５】一方、慢性関節リウマチの病因に関する最
近の研究から、関節病変の破壊的な進行には滑膜間葉系
細胞が直接関与しており［アナルズ・オブ・リウマティ
ック・ディジーズィーズ(Ann. Rheum. Dis.)、第51巻、
第869-873頁(1992年)］、c-fos遺伝子の過剰発現はこの
滑膜間葉系細胞の増殖を引き起こし、結果的にパンヌス
形成や関節破壊、骨の粗鬆化を引き起こす因子として重
要であることが明らかにされている［ジャーナル・オブ
・イムノロジー(J. Immunol.)、第148巻、第3100-3104
頁(1992年)；ジャーナル・オブ・リウマトロジー(J. Rh
eumatol.)、第20巻、第422-428頁(1993年)］。すなわ
ち、c-fos遺伝子の産物であるc-Fosタンパク質は、核内
タンパク質であるc-Junと二量化し、転写因子c-Fos/AP-
1複合体を構成する。c-Fos/AP-1は、遺伝子プロモータ
ー上にある特定のAP-1結合部位に結合し、下流の遺伝子
の発現を促進する。AP-1結合部位は、関節炎発症におい
て重要な役割を持つIL-1、IL-6およびTNF等のサイトカ
イン遺伝子のプロモーター領域並びに関節破壊を引き起
こすコラゲナーゼおよびストロメライシン等のメタロプ
ロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域等に位置してお
り、特定の塩基配列 TGAGTCAを有している。したがっ
て、滑膜間葉系細胞で過剰に発現しているAP-1の転写活
性（AP-1のプロモーターへの結合）を拮抗的に阻害する
ことが可能になれば、関節破壊に関与する多種の炎症性
物質の発現を防ぐことができ、より病因に近づいた治療
法となると考えられる。このような間葉系細胞の活性化
への着目は、慢性関節リウマチのみでなく、その他の膠
原病や間葉系細胞の増殖が関与する難治性疾患への治療
法提供という観点からも注目される。
近の研究から、関節病変の破壊的な進行には滑膜間葉系
細胞が直接関与しており［アナルズ・オブ・リウマティ
ック・ディジーズィーズ(Ann. Rheum. Dis.)、第51巻、
第869-873頁(1992年)］、c-fos遺伝子の過剰発現はこの
滑膜間葉系細胞の増殖を引き起こし、結果的にパンヌス
形成や関節破壊、骨の粗鬆化を引き起こす因子として重
要であることが明らかにされている［ジャーナル・オブ
・イムノロジー(J. Immunol.)、第148巻、第3100-3104
頁(1992年)；ジャーナル・オブ・リウマトロジー(J. Rh
eumatol.)、第20巻、第422-428頁(1993年)］。すなわ
ち、c-fos遺伝子の産物であるc-Fosタンパク質は、核内
タンパク質であるc-Junと二量化し、転写因子c-Fos/AP-
1複合体を構成する。c-Fos/AP-1は、遺伝子プロモータ
ー上にある特定のAP-1結合部位に結合し、下流の遺伝子
の発現を促進する。AP-1結合部位は、関節炎発症におい
て重要な役割を持つIL-1、IL-6およびTNF等のサイトカ
イン遺伝子のプロモーター領域並びに関節破壊を引き起
こすコラゲナーゼおよびストロメライシン等のメタロプ
ロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域等に位置してお
り、特定の塩基配列 TGAGTCAを有している。したがっ
て、滑膜間葉系細胞で過剰に発現しているAP-1の転写活
性（AP-1のプロモーターへの結合）を拮抗的に阻害する
ことが可能になれば、関節破壊に関与する多種の炎症性
物質の発現を防ぐことができ、より病因に近づいた治療
法となると考えられる。このような間葉系細胞の活性化
への着目は、慢性関節リウマチのみでなく、その他の膠
原病や間葉系細胞の増殖が関与する難治性疾患への治療
法提供という観点からも注目される。
【０００６】このようなc-fos遺伝子の発現によるc-Fos
タンパクの過剰産生と間葉系細胞の活性化の知見に基づ
く治療薬としては、遺伝子発現プロモータ領域に存在す
るAP-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAからなるヌ
クレオチド（以下、AP-1ヌクレオチドと記載する）を含
有する間葉系細胞の増殖阻害剤が知られている（特開平
7-126168号公報。以下、先願発明と記載する）。この先
願発明には、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAからなる
２本鎖AP-1ヌクレオチドがマウスII型コラーゲン関節炎
モデルにおける慢性関節炎を有意に抑制することが記載
されている。
タンパクの過剰産生と間葉系細胞の活性化の知見に基づ
く治療薬としては、遺伝子発現プロモータ領域に存在す
るAP-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAからなるヌ
クレオチド（以下、AP-1ヌクレオチドと記載する）を含
有する間葉系細胞の増殖阻害剤が知られている（特開平
7-126168号公報。以下、先願発明と記載する）。この先
願発明には、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAからなる
２本鎖AP-1ヌクレオチドがマウスII型コラーゲン関節炎
モデルにおける慢性関節炎を有意に抑制することが記載
されている。
【０００７】なお、コラゲナーゼは、コラーゲンを特異
的に分解するプロテアーゼであり、コラーゲンの存在す
るほとんどの組織に存在する。たとえば、マウスのタイ
プIVコラゲナーゼをコードする遺伝子の配列は以下のと
おりである。 上記の遺伝子のプロモーター領域はAP-1結合部位を有し
ており、その遺伝子の発現はc-Fos/AP-1によって調節さ
れている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J. Biol. Chem.)、第268巻、第23460-23468頁(1
993年)］。一方、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破
壊にコラゲナーゼが関与することも知られている（アリ
スリティス・アンド・リウマチズム［Arthritis. Rheu
m.、第34巻、第1085-1093頁、1991年］）。
的に分解するプロテアーゼであり、コラーゲンの存在す
るほとんどの組織に存在する。たとえば、マウスのタイ
プIVコラゲナーゼをコードする遺伝子の配列は以下のと
おりである。 上記の遺伝子のプロモーター領域はAP-1結合部位を有し
ており、その遺伝子の発現はc-Fos/AP-1によって調節さ
れている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J. Biol. Chem.)、第268巻、第23460-23468頁(1
993年)］。一方、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破
壊にコラゲナーゼが関与することも知られている（アリ
スリティス・アンド・リウマチズム［Arthritis. Rheu
m.、第34巻、第1085-1093頁、1991年］）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】先願発明において、AP
-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAの塩基配列を含
むヌクレオチドが間葉系細胞の増殖阻害作用を有するこ
とが示されているが、より強いAP-1結合阻害効果を有
し、間葉系細胞の増殖阻害および膠原病の予防・治療に
有効な薬剤が求められていた。
-1結合部位であるTGAGTCAまたはTGACTCAの塩基配列を含
むヌクレオチドが間葉系細胞の増殖阻害作用を有するこ
とが示されているが、より強いAP-1結合阻害効果を有
し、間葉系細胞の増殖阻害および膠原病の予防・治療に
有効な薬剤が求められていた。
【０００９】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、コラゲナーゼ遺伝子の発現をコ
ントロールする転写因子AP-1の結合部位に高い親和性を
有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有する新規な薬剤
を提供することを目的としている。
なされたものであって、コラゲナーゼ遺伝子の発現をコ
ントロールする転写因子AP-1の結合部位に高い親和性を
有する２本鎖オリゴヌクレオチドを含有する新規な薬剤
を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、コラゲナーゼ遺伝子のプロモー
タ領域の一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAお
よびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オ
リゴヌクレオチドを含有することを特徴とする転写因子
AP-1の拮抗的阻害剤を提供する。
を解決するものとして、コラゲナーゼ遺伝子のプロモー
タ領域の一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAお
よびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オ
リゴヌクレオチドを含有することを特徴とする転写因子
AP-1の拮抗的阻害剤を提供する。
【００１１】また、この発明は、コラゲナーゼ遺伝子の
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、TG
AGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２
本鎖オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする間
葉系細胞増殖阻害剤を提供する。さらにこの発明は、コ
ラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一ま
たは相同であり、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含
む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌクレオチドを含有する
ことを特徴とする膠原病治療・予防剤をも提供する。
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、TG
AGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２
本鎖オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする間
葉系細胞増殖阻害剤を提供する。さらにこの発明は、コ
ラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の一部配列と同一ま
たは相同であり、TGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAを含
む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌクレオチドを含有する
ことを特徴とする膠原病治療・予防剤をも提供する。
【００１２】
【発明を実施するための形態】前記従来の技術として説
明したとおり、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊
にはコラゲナーゼが関与することは明らかであり、コラ
ゲナーゼ遺伝子の発現を抑制することで関節破壊を抑え
ることができると考えられる。この発明は、コラゲナー
ゼ遺伝子のプロモータ領域に外来性の２本鎖オリゴヌク
レオチドを結合させ、これによって転写因子AP-1がプロ
モータ領域へ結合することを拮抗的に阻害することを特
徴としている。その際に、２本鎖オリゴヌクレオチドは
AP-1結合部位とその前後の配列を含むことが重要であ
る。具体的には、任意の動物種のコラゲナーゼ遺伝子の
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、そ
の一部としてAP-1結合部位（TGAGTCAおよびその相補鎖T
GACTCA）を含むことを必須としている。コラゲナーゼ遺
伝子のプロモータ領域としては、たとえば、ヒト・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域またはマウス・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域などの一部が挙げられ
る。具体的には、マウス・コラーゲナーゼ遺伝子のプロ
モータ領域の一部であれば、以下の配列を有する２本鎖
オリゴヌクレオチドである。
明したとおり、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊
にはコラゲナーゼが関与することは明らかであり、コラ
ゲナーゼ遺伝子の発現を抑制することで関節破壊を抑え
ることができると考えられる。この発明は、コラゲナー
ゼ遺伝子のプロモータ領域に外来性の２本鎖オリゴヌク
レオチドを結合させ、これによって転写因子AP-1がプロ
モータ領域へ結合することを拮抗的に阻害することを特
徴としている。その際に、２本鎖オリゴヌクレオチドは
AP-1結合部位とその前後の配列を含むことが重要であ
る。具体的には、任意の動物種のコラゲナーゼ遺伝子の
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、そ
の一部としてAP-1結合部位（TGAGTCAおよびその相補鎖T
GACTCA）を含むことを必須としている。コラゲナーゼ遺
伝子のプロモータ領域としては、たとえば、ヒト・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域またはマウス・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域などの一部が挙げられ
る。具体的には、マウス・コラーゲナーゼ遺伝子のプロ
モータ領域の一部であれば、以下の配列を有する２本鎖
オリゴヌクレオチドである。
【００１３】5'-CAC ACA CGC TGA GTC AGC ATA AGC-3' 3'-TGT GCG ACT CAG TCG TAT TCG GAC-5' この発明の薬剤に含有される２本鎖オリゴヌクレオチド
は、動物のゲノムＤＮＡから単離したものでもよく、ま
た公知の方法によって化学合成したものでもよい。２本
鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともAP-1結合部位であ
るTGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAと共に、その前後に
コラゲナーゼ遺伝子の配列を含む８塩基長以上であるこ
とが必要であるが、好ましくは12〜30塩基長、さらに好
ましくは14〜24塩基長の長さとすることができる。具体
的には、上記に示したような24塩基長からなる２本鎖オ
リゴヌクレオチドである。また、２本鎖オリゴヌクレオ
チドの両端は、上記配列のように3'-あるいは5'-末端が
突出していても(stickyend)よく、または平坦であって
も(blunt end)よい。
は、動物のゲノムＤＮＡから単離したものでもよく、ま
た公知の方法によって化学合成したものでもよい。２本
鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともAP-1結合部位であ
るTGAGTCAおよびその相補鎖TGACTCAと共に、その前後に
コラゲナーゼ遺伝子の配列を含む８塩基長以上であるこ
とが必要であるが、好ましくは12〜30塩基長、さらに好
ましくは14〜24塩基長の長さとすることができる。具体
的には、上記に示したような24塩基長からなる２本鎖オ
リゴヌクレオチドである。また、２本鎖オリゴヌクレオ
チドの両端は、上記配列のように3'-あるいは5'-末端が
突出していても(stickyend)よく、または平坦であって
も(blunt end)よい。
【００１４】この発明の薬剤は、医薬上許容される賦形
剤、担体および希釈剤などの製剤助剤を適宜用いて、常
法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸
剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、坐剤または注射
剤などの製剤とし、経口または非経口で、ヒトをはじめ
とする哺乳動物に投与することができる。注射剤は、皮
下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤および関節内注射剤
等の剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方
法、すなわち２本鎖オリゴヌクレオチドを通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解または懸濁
乳化することによって調整される。また、２本鎖オリゴ
ヌクレオチドをリポソームに包埋したり、あるいはカチ
オン性の脂質と混合して投与することもでき、この場
合、より一層の効果が期待できる。また、投与方法、投
与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に
応じて適宜選択できるが、経口投与の場合、通常成人に
対して１日10μg〜10mgを１回から数回に分割して投与
すればよい。
剤、担体および希釈剤などの製剤助剤を適宜用いて、常
法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸
剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、坐剤または注射
剤などの製剤とし、経口または非経口で、ヒトをはじめ
とする哺乳動物に投与することができる。注射剤は、皮
下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤および関節内注射剤
等の剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方
法、すなわち２本鎖オリゴヌクレオチドを通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解または懸濁
乳化することによって調整される。また、２本鎖オリゴ
ヌクレオチドをリポソームに包埋したり、あるいはカチ
オン性の脂質と混合して投与することもでき、この場
合、より一層の効果が期待できる。また、投与方法、投
与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に
応じて適宜選択できるが、経口投与の場合、通常成人に
対して１日10μg〜10mgを１回から数回に分割して投与
すればよい。
【００１５】
【実施例】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。なお、以下の実施例に使用した２本
鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列およびその構造は、以
下のとおりである。全ての２本鎖オリゴムクレオチドは
下線で示したAP-1結合部位を含んでいる。 ・対照オリゴヌクレオチド 5'-GTG TTA CCC TGA GTC AGA GGA GAA-3' 3'-AAT GGG ACT CAG TCT CCT CTT GGG-5' ・オリゴヌクレオチド１ 5'-CAC ACA CGC TGA GTC AGC ATA AGC-3' 3'-TGT GCG ACT CAG TCG TAT TCG GAC-5' ・オリゴヌクレオチド２ 5'-ACA CAC GCT GAG TCA GCA TAA GCC-3' 3'-TGT GTG CGA CTC AGT CGT ATT CGG-5' ・オリゴヌクレオチド３ 5'-CAC ACA CGC TGA GTC AGC ATA AGC-3' 3'-TGT GTG TGT GCG ACT CAG TCG TAT-5' ・オリゴヌクレオチド４ 5'-CGC TGA GTC AGC AT-3' 3'-ACT CAG TCG TAT TC-5' 実施例１ マウスのコラーゲン関節炎モデルに対するヌクレオチド
の効果を試験した。
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定さ
れるものではない。なお、以下の実施例に使用した２本
鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列およびその構造は、以
下のとおりである。全ての２本鎖オリゴムクレオチドは
下線で示したAP-1結合部位を含んでいる。 ・対照オリゴヌクレオチド 5'-GTG TTA CCC TGA GTC AGA GGA GAA-3' 3'-AAT GGG ACT CAG TCT CCT CTT GGG-5' ・オリゴヌクレオチド１ 5'-CAC ACA CGC TGA GTC AGC ATA AGC-3' 3'-TGT GCG ACT CAG TCG TAT TCG GAC-5' ・オリゴヌクレオチド２ 5'-ACA CAC GCT GAG TCA GCA TAA GCC-3' 3'-TGT GTG CGA CTC AGT CGT ATT CGG-5' ・オリゴヌクレオチド３ 5'-CAC ACA CGC TGA GTC AGC ATA AGC-3' 3'-TGT GTG TGT GCG ACT CAG TCG TAT-5' ・オリゴヌクレオチド４ 5'-CGC TGA GTC AGC AT-3' 3'-ACT CAG TCG TAT TC-5' 実施例１ マウスのコラーゲン関節炎モデルに対するヌクレオチド
の効果を試験した。
【００１６】DBA/1J雄性マウスの皮下にフロインドの完
全アジュバント(FCA)と共に 200μgのII型コラーゲンを
３週間間隔で２回投与し、関節炎を誘発した。初回投与
の２週間後から週２回、１回5μgの対照オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド１を腹腔内に投与し、関
節炎の抑制効果を調べた。なお、コントロール群（陰性
対照）には、生理食塩水を同様に投与した。初回免疫
後、６週に後肢関節の病理組織検査を実施した。
全アジュバント(FCA)と共に 200μgのII型コラーゲンを
３週間間隔で２回投与し、関節炎を誘発した。初回投与
の２週間後から週２回、１回5μgの対照オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド１を腹腔内に投与し、関
節炎の抑制効果を調べた。なお、コントロール群（陰性
対照）には、生理食塩水を同様に投与した。初回免疫
後、６週に後肢関節の病理組織検査を実施した。
【００１７】各検査の結果は、以下の指標に従って数値
化した。 ・関節炎の程度 ０：正常 １：滑膜肥厚と細胞浸潤 ２：パンヌスによる破壊 ３：軟骨・骨の明確な破壊 ４：関節構造の消失または骨性癒合 ・細胞浸潤の程度 ０：浸潤なし １：全視野で50個未満 ２：全視野で50〜200個未満 ３：全視野で200〜500個未満 ４：全視野で500個以上 ・関節破壊の程度 ０：正常 １：関節の２/３以上が正常 ２：関節の１/３以上２/３未満が正常 ３：関節の１/３未満が正常 ４：全関節の破壊 検査結果は、各スコアの平均値として表１に示したとお
りである。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドのAP
-1結合部位以外の配列が、関節炎抑制効果に関与するこ
とを示している。すなわち、マウスのコラーゲナーゼの
プロモータ領域の塩基配列の一部に一致するオリゴヌク
レオチド１は、既知の対照オリゴヌクレオチドに比べ、
関節炎および関節破壊の所見で強い治癒効果を有するこ
とが確認された。
化した。 ・関節炎の程度 ０：正常 １：滑膜肥厚と細胞浸潤 ２：パンヌスによる破壊 ３：軟骨・骨の明確な破壊 ４：関節構造の消失または骨性癒合 ・細胞浸潤の程度 ０：浸潤なし １：全視野で50個未満 ２：全視野で50〜200個未満 ３：全視野で200〜500個未満 ４：全視野で500個以上 ・関節破壊の程度 ０：正常 １：関節の２/３以上が正常 ２：関節の１/３以上２/３未満が正常 ３：関節の１/３未満が正常 ４：全関節の破壊 検査結果は、各スコアの平均値として表１に示したとお
りである。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドのAP
-1結合部位以外の配列が、関節炎抑制効果に関与するこ
とを示している。すなわち、マウスのコラーゲナーゼの
プロモータ領域の塩基配列の一部に一致するオリゴヌク
レオチド１は、既知の対照オリゴヌクレオチドに比べ、
関節炎および関節破壊の所見で強い治癒効果を有するこ
とが確認された。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２ 実施例１と同様にして、オリゴヌクレオチドのマウスの
コラーゲン関節炎に対する効果を観察した。関節炎の評
価は BjorkとKleinauの方法［エージェンツ・アンド・
アクションズ(Agents Actions)、第27巻、第319-321頁
(1989年)］に準じ、四肢の腫脹の程度を初回免疫後、43
日目に肉眼的に観察し、以下の炎症スコアに従って数値
化した。
コラーゲン関節炎に対する効果を観察した。関節炎の評
価は BjorkとKleinauの方法［エージェンツ・アンド・
アクションズ(Agents Actions)、第27巻、第319-321頁
(1989年)］に準じ、四肢の腫脹の程度を初回免疫後、43
日目に肉眼的に観察し、以下の炎症スコアに従って数値
化した。
【００２０】 １：１ヶ所または２ヶ所の関節炎 ２：２ヶ所の関節炎および足蹠の軽度の発赤と腫脹 ３：３ヶ所以上の関節炎と足蹠の重度の発赤と腫脹 結果は表２に炎症スコアの平均値を示したとおりであ
る。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドの両端は、
平坦であっても（blunt end：オリゴヌクレオチド
２）、3'-あるいは5'-末端が突出していても（sticky e
nd：オリゴヌクレオチド１および３）同様の関節炎抑制
作用を有することを示す。さらに、２本鎖オリゴヌクレ
オチドの長さを14塩基としても（オリゴヌクレオチド
４）抑制効果が確認された。
る。この結果は、２本鎖オリゴヌクレオチドの両端は、
平坦であっても（blunt end：オリゴヌクレオチド
２）、3'-あるいは5'-末端が突出していても（sticky e
nd：オリゴヌクレオチド１および３）同様の関節炎抑制
作用を有することを示す。さらに、２本鎖オリゴヌクレ
オチドの長さを14塩基としても（オリゴヌクレオチド
４）抑制効果が確認された。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の発症
に関与するコラゲナーゼ遺伝子の発現を制御する転写因
子AP-1の結合を拮抗的に阻害し、間葉系細胞の増殖阻害
および膠原病の予防・治療に有効な薬剤が提供される。
よって、慢性関節リウマチをはじめとする膠原病の発症
に関与するコラゲナーゼ遺伝子の発現を制御する転写因
子AP-1の結合を拮抗的に阻害し、間葉系細胞の増殖阻害
および膠原病の予防・治療に有効な薬剤が提供される。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年８月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】一方、慢性関節リウマチの病因に関する最
近の研究から、関節病変の破壊的な進行には滑膜間葉系
細胞が直接関与しており［アナルズ・オブ・リウマティ
ック・ディジーズィーズ(Ann. Rheum. Dis.)、第51巻、
第869-873頁(1992年)］、c-fos遺伝子の過剰発現はこの
滑膜間葉系細胞の増殖を引き起こし、結果的にパンヌス
形成や関節破壊、骨の粗鬆化を引き起こす因子として重
要であることが明らかにされている［ジャーナル・オブ
・イムノロジー(J. Immunol.)、第148巻、第3100-3104
頁(1992年)；ジャーナル・オブ・リウマトロジー(J. Rh
eumatol.)、第20巻、第422-428頁(1993年)］。すなわ
ち、c-fos遺伝子の産物であるc-Fosタンパク質は、核内
タンパク質であるc-Junと二量化し、転写因子c-Fos/AP-
1複合体を構成する。c-Fos/AP-1は、遺伝子プロモータ
上にある特定のAP-1結合部位に結合し、下流の遺伝子の
発現を促進する。AP-1結合部位は、関節炎発症において
重要な役割を持つIL-1、IL-6およびTNF等のサイトカイ
ン遺伝子のプロモータ領域並びに関節破壊を引き起こす
コラゲナーゼおよびストロメライシン等のメタロプロテ
アーゼ遺伝子のプロモータ領域等に位置しており、特定
の塩基配列 TGAGTCAを有している。したがって、滑膜間
葉系細胞で過剰に発現しているAP-1の転写活性（AP-1の
プロモータへの結合）を拮抗的に阻害することが可能に
なれば、関節破壊に関与する多種の炎症性物質の発現を
防ぐことができ、より病因に近づいた治療法となると考
えられる。このような間葉系細胞の活性化への着目は、
慢性関節リウマチのみでなく、その他の膠原病や間葉系
細胞の増殖が関与する難治性疾患への治療法提供という
観点からも注目される。
近の研究から、関節病変の破壊的な進行には滑膜間葉系
細胞が直接関与しており［アナルズ・オブ・リウマティ
ック・ディジーズィーズ(Ann. Rheum. Dis.)、第51巻、
第869-873頁(1992年)］、c-fos遺伝子の過剰発現はこの
滑膜間葉系細胞の増殖を引き起こし、結果的にパンヌス
形成や関節破壊、骨の粗鬆化を引き起こす因子として重
要であることが明らかにされている［ジャーナル・オブ
・イムノロジー(J. Immunol.)、第148巻、第3100-3104
頁(1992年)；ジャーナル・オブ・リウマトロジー(J. Rh
eumatol.)、第20巻、第422-428頁(1993年)］。すなわ
ち、c-fos遺伝子の産物であるc-Fosタンパク質は、核内
タンパク質であるc-Junと二量化し、転写因子c-Fos/AP-
1複合体を構成する。c-Fos/AP-1は、遺伝子プロモータ
上にある特定のAP-1結合部位に結合し、下流の遺伝子の
発現を促進する。AP-1結合部位は、関節炎発症において
重要な役割を持つIL-1、IL-6およびTNF等のサイトカイ
ン遺伝子のプロモータ領域並びに関節破壊を引き起こす
コラゲナーゼおよびストロメライシン等のメタロプロテ
アーゼ遺伝子のプロモータ領域等に位置しており、特定
の塩基配列 TGAGTCAを有している。したがって、滑膜間
葉系細胞で過剰に発現しているAP-1の転写活性（AP-1の
プロモータへの結合）を拮抗的に阻害することが可能に
なれば、関節破壊に関与する多種の炎症性物質の発現を
防ぐことができ、より病因に近づいた治療法となると考
えられる。このような間葉系細胞の活性化への着目は、
慢性関節リウマチのみでなく、その他の膠原病や間葉系
細胞の増殖が関与する難治性疾患への治療法提供という
観点からも注目される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】なお、コラゲナーゼは、コラーゲンを特異
的に分解するプロテアーゼであり、コラーゲンの存在す
るほとんどの組織に存在する。たとえば、マウスのタイ
プIVコラゲナーゼをコードする遺伝子のプロモータ領域
の配列は以下のとおりである。 上記の遺伝子のプロモータ領域はAP-1結合部位を有して
おり、その遺伝子の発現はc-Fos/AP-1によって調節され
ている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)、第268巻、第23460-23468頁(199
3年)］。 一方、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節
破壊にコラゲナーゼが関与することも知られている（ア
リスリティス・アンド・リウマチズム［Arthritis. Rhe
um.、第34巻、第1085-1093頁、1991年］）。
的に分解するプロテアーゼであり、コラーゲンの存在す
るほとんどの組織に存在する。たとえば、マウスのタイ
プIVコラゲナーゼをコードする遺伝子のプロモータ領域
の配列は以下のとおりである。 上記の遺伝子のプロモータ領域はAP-1結合部位を有して
おり、その遺伝子の発現はc-Fos/AP-1によって調節され
ている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J. Biol. Chem.)、第268巻、第23460-23468頁(199
3年)］。 一方、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節
破壊にコラゲナーゼが関与することも知られている（ア
リスリティス・アンド・リウマチズム［Arthritis. Rhe
um.、第34巻、第1085-1093頁、1991年］）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】
【発明の実施の形態】前記従来の技術として説明したと
おり、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊にはコラ
ゲナーゼが関与することは明らかであり、コラゲナーゼ
遺伝子の発現を抑制することで関節破壊を抑えることが
できると考えられる。この発明は、コラゲナーゼ遺伝子
のプロモータ領域と同一または相同の塩基配列を有する
２本鎖オリゴヌクレオチドを生体内に投与し、この２本
鎖オリゴヌクレオチドに転写因子AP-1を優先的に結合さ
せることによって、転写因子AP-1がその本来の結合部位
であるプロモータ領域に結合することを拮抗的に阻害
し、これによってコラゲナーゼの発現を抑制することを
特徴としている。その際に、２本鎖オリゴヌクレオチド
はAP-1結合部位とその前後の配列を含むことが重要であ
る。具体的には、任意の動物種のコラゲナーゼ遺伝子の
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、そ
の一部としてAP-1結合部位（TGAGTCAおよびその相補鎖T
GACTCA）を含むことを必須としている。コラゲナーゼ遺
伝子のプロモータ領域としては、たとえば、ヒト・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域またはマウス・コラゲ
ナーゼ遺伝子のプロモータ領域などの一部が挙げられ
る。具体的には、マウス・コラーゲナーゼ遺伝子のプロ
モータ領域の一部であれば、以下の配列を有する２本鎖
オリゴヌクレオチドである。
おり、慢性関節リウマチ等の膠原病の関節破壊にはコラ
ゲナーゼが関与することは明らかであり、コラゲナーゼ
遺伝子の発現を抑制することで関節破壊を抑えることが
できると考えられる。この発明は、コラゲナーゼ遺伝子
のプロモータ領域と同一または相同の塩基配列を有する
２本鎖オリゴヌクレオチドを生体内に投与し、この２本
鎖オリゴヌクレオチドに転写因子AP-1を優先的に結合さ
せることによって、転写因子AP-1がその本来の結合部位
であるプロモータ領域に結合することを拮抗的に阻害
し、これによってコラゲナーゼの発現を抑制することを
特徴としている。その際に、２本鎖オリゴヌクレオチド
はAP-1結合部位とその前後の配列を含むことが重要であ
る。具体的には、任意の動物種のコラゲナーゼ遺伝子の
プロモータ領域の一部配列と同一または相同であり、そ
の一部としてAP-1結合部位（TGAGTCAおよびその相補鎖T
GACTCA）を含むことを必須としている。コラゲナーゼ遺
伝子のプロモータ領域としては、たとえば、ヒト・コラ
ゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域またはマウス・コラゲ
ナーゼ遺伝子のプロモータ領域などの一部が挙げられ
る。具体的には、マウス・コラーゲナーゼ遺伝子のプロ
モータ領域の一部であれば、以下の配列を有する２本鎖
オリゴヌクレオチドである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】この発明の薬剤は、医薬上許容される賦形
剤、担体および希釈剤などの製剤助剤を適宜用いて、常
法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸
剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、坐剤または注射
剤などの製剤とし、経口または非経口で、ヒトをはじめ
とする哺乳動物に投与することができる。注射剤は、皮
下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤および関節内注射剤
等の剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方
法、すなわち２本鎖オリゴヌクレオチドを通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解または懸濁
乳化することによって調製される。また、２本鎖オリゴ
ヌクレオチドをリポソームに包埋したり、あるいはカチ
オン性の脂質と混合して投与することもでき、この場
合、より一層の効果が期待できる。また、投与方法、投
与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に
応じて適宜選択できるが、経口投与の場合、通常成人に
対して１日10μg〜10mgを１回から数回に分割して投与
すればよい。
剤、担体および希釈剤などの製剤助剤を適宜用いて、常
法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸
剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、坐剤または注射
剤などの製剤とし、経口または非経口で、ヒトをはじめ
とする哺乳動物に投与することができる。注射剤は、皮
下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤および関節内注射剤
等の剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方
法、すなわち２本鎖オリゴヌクレオチドを通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解または懸濁
乳化することによって調製される。また、２本鎖オリゴ
ヌクレオチドをリポソームに包埋したり、あるいはカチ
オン性の脂質と混合して投与することもでき、この場
合、より一層の効果が期待できる。また、投与方法、投
与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に
応じて適宜選択できるが、経口投与の場合、通常成人に
対して１日10μg〜10mgを１回から数回に分割して投与
すればよい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (13)
- 【請求項１】 コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の
一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその
相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする転写因子AP-1の拮
抗的阻害剤。 - 【請求項２】 オリゴヌクレオチドが、12〜30塩基長で
ある請求項１の転写因子AP-1の拮抗的阻害剤。 - 【請求項３】 オリゴヌクレオチドが、14〜24塩基長で
ある請求項１の転写因子AP-1の拮抗的阻害剤。 - 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが、24塩基長である
請求項１の転写因子AP-1の拮抗的阻害剤。 - 【請求項５】 コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の
一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその
相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする間葉系細胞増殖阻
害剤。 - 【請求項６】 オリゴヌクレオチドが、12〜30塩基長で
ある請求項５の間葉系細胞増殖阻害剤。 - 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが、14〜24塩基長で
ある請求項５の間葉系細胞増殖阻害剤。 - 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが、24塩基長である
請求項５の間葉系細胞増殖阻害剤。 - 【請求項９】 コラゲナーゼ遺伝子のプロモータ領域の
一部配列と同一または相同であり、TGAGTCAおよびその
相補鎖TGACTCAを含む８塩基長以上の２本鎖オリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする膠原病治療・予防
剤。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドが、12〜30塩基長
である請求項９の膠原病治療・予防剤。 - 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドが、14〜24塩基長
である請求項９の膠原病治療・予防剤。 - 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドが、24塩基長であ
る請求項９の膠原病治療・予防剤。 - 【請求項１３】 膠原病が慢性関節リウマチである請求
項９から１２の膠原病治療・予防剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19614996A JP3953552B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 転写因子ａｐ−１の拮抗的阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19614996A JP3953552B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 転写因子ａｐ−１の拮抗的阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1036272A true JPH1036272A (ja) | 1998-02-10 |
| JP3953552B2 JP3953552B2 (ja) | 2007-08-08 |
Family
ID=16353036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19614996A Expired - Lifetime JP3953552B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 転写因子ａｐ−１の拮抗的阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3953552B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000027792A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Nouveaux composes et leur utilisation medicale |
| US6599741B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Avontec Gmbh | Modulating transcription of genes in vascular cells |
| KR100753473B1 (ko) | 2004-12-10 | 2007-08-31 | 주식회사 엘지생활건강 | 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 주름개선제 |
-
1996
- 1996-07-25 JP JP19614996A patent/JP3953552B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000027792A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Nouveaux composes et leur utilisation medicale |
| US7314888B1 (en) | 1998-11-05 | 2008-01-01 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Compounds and medicinal use thereof |
| US6599741B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Avontec Gmbh | Modulating transcription of genes in vascular cells |
| US7186556B2 (en) | 1999-09-14 | 2007-03-06 | Avontec Gmbh | Modulating transcription of genes in vascular cells |
| KR100753473B1 (ko) | 2004-12-10 | 2007-08-31 | 주식회사 엘지생활건강 | 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 주름개선제 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3953552B2 (ja) | 2007-08-08 |
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