CN108883200B - 用于治疗肌营养不良症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供表达ANO5基因的AAV载体和抗氧化剂疗法以作为诱导肌肉再生的方法和治疗肌营养不良症的方法。

Description

用于治疗肌营养不良症的方法
本申请要求2015年11月12日提交的美国临时专利申请第62/254539号，和2016年11月9日提交的美国临时专利申请第62/419793号的优先权，所述临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明提供表达ANO5基因的AAV载体和抗氧化剂疗法以作为诱导肌肉再生的方法和治疗肌营养不良症的方法。
背景技术
肌肉量和强度对于日常活动，诸如运动和呼吸，以及全身代谢的重要性是毋庸置疑的。肌肉功能缺陷产生肌营养不良症(MD)，其特点是肌肉无力和耗损，并对生活质量产生严重影响。最具特征的MD由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)成员的基因突变导致。这些MD由膜脆性导致，该膜脆性与由DAPC进行肌膜-细胞骨架拴系的缺失相关联。相反，其他MD的亚组被认为是由于肌膜修复缺陷引起的。由于肌纤维膜在收缩期间经历的机械应力，即使是健康的肌肉也始终需要修复机制来修补损伤的膜。肌膜补片修复依赖于膜囊泡在损坏部位的融合，并且假定认为该过程的减弱是dysferlin病变，即由dysferlin突变引起的MD的主要原因。
最近，具有类似于dysferlin病变的特征并且特征在于肌膜病变的新型MD已与ANO5中的隐性突变(TMEM16E)联系起来。ANO5突变产生肢带型肌营养不良症2L型(LGMD2L)和Miyoshi肌病营养不良症3型(MMD3)。与ANO5突变相关的表型是可变的，但通常疾病出现在成年期(20-50岁)，具有近端下肢无力、高血清肌酸激酶水平、不对称肌肉萎缩和无力，并且通常伴有肌膜病变，这类似于dysferlin病变(Bolduc等人，《美国人类遗传学杂志(American journal of human genetics)》86,213-221(2010)；Hicks等人，《大脑：神经病学杂志(Brain:a journal of neurology)》134,171-182(2011)；Bouquet等人，《神经病学评论(Revue neurologique)》168,135-141(2012))。迄今为止，在MD患者中报道了约72种不同的ANO5突变，并且在缺乏其他已知LGMD基因突变的LGMD患者中筛选ANO5突变表明ANO5突变可能是LGMD的更常见原因之一(Bolduc等人，《美国人类遗传学杂志(American journalof human genetics)》86,213-221(2010)；Hicks等人，《大脑：神经病学杂志(Brain:ajournal of neurology)》134,171-182(2011)；Penttila等人，《神经病学(Neurology)》78,897-903(2012))。
Anoctamin/TMEM16家族已在功能上分为两类。创始成员ANO1(TMEM16A)和ANO2(TMEM16B)编码钙激活的氯离子通道，而其他ANO不能传导氯离子电流，并且其在磷脂加扰(PLS)中的作用已被鉴定。然而，尚未发现ANO5表现出这两种活性中的任何一种，这表明了在骨骼肌中的新颖功能。鉴于这种新颖性，尚不清楚ANO5功能缺陷如何引出LGMD表型，以及具体地Ano5突变以在临床上与dysferlin相关MD类似的方式表现的原因。
腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括145个核苷酸反向末端重复序列(ITR)。存在多种AAV血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，如由Ruffing等人，《普通病毒学杂志(J Gen Virol)，75:3385-3392(1994)所修正的Srivastava等人，《病毒学杂志(J Virol)》,45:555-564(1983)中呈现了AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列。作为其他例子，GenBank登录号NC_002077中提供了AAV-1的完整基因组；GenBank登录号NC_1829中提供了AAV-3的完整基因组；GenBank登录号NC_001829中提供了AAV-4的完整基因组；GenBank登录号AF085716中提供了AAV-5基因组；GenBank登录号NC_00 1862中提供了AAV-6的完整基因组；GenBank登录号AX753246和AX753249中分别提供了AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分(关于AAV-8也参见美国专利第7,282,199和7,790,449号)；Gao等人，《病毒学杂志(J Virol)》,78:6381-6388(2004)中提供了AAV-9基因组；《分子治疗(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中提供了AAV-10基因组；并且《病毒学(Virology)》,330(2):375-383(2004)中提供了AAV-11基因组。本文提供了AAV rh.74基因组的序列。引导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR内。三个AAV启动子(针对它们的相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个AAV内含子(例如，在AAV2核苷酸2107和2227处)的差异性剪接结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52以及rep 40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶特性。cap基因由p40启动子表达并编码三种衣壳蛋白VP1、VP2以及VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的95图谱位置上。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka，《微生物学与免疫学的当前课题(Current Topics in Microbiology and Immunology)》,158:97-129(1992)中有所综述。AAV具有独特的特征，这些特征使其具有例如在基因疗法中作为递送外源DNA至细胞的载体的吸引力。培养细胞的AAV感染是非致细胞病变的，并且人类和其他动物的自然感染是隐性的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)而基本上在这些细胞的寿命内存在着。AAV原病毒基因组与质粒中的克隆DNA一样具有感染性，这使得重组基因组的构建行得通。此外，因为指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR内，所以可以用外源DNA，诸如含有启动子、感兴趣的DNA以及聚腺苷酸化信号的基因盒替代内部大约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)中的一些或全部。rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一个显著特征是它是一种极其稳定和旺盛的病毒。它容易承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续几个小时)，使AAV的冷保存变得不那么重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞不能抵抗重复感染。
多个研究已经证明肌肉中的长期(>1.5年)的重组AAV介导蛋白的表达。参见，Clark等人，《人类基因治疗(Hum Gene Ther)》,8:659-669(1997)；Kessler等人，《美国国家科学院院刊(Proc Nat.Acad Sc.USA)》,93:14082-14087(1996)；以及Xiao等人，《病毒学杂志(J Virol)》,70:8098-8108(1996)。还参见Chao等人，《分子治疗(Mol Ther)》,2:619-623(2000)和Chao等人，《分子治疗(Mol Ther)》,4:217-222(2001)。此外，因为肌肉高度血管化，重组AAV转导已导致肌内注射后体循环中转基因产物的出现，如Herzog等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,94:5804-5809(1997)和Murphy等人，《美国国家科学院院刊Proc Natl Acad Sci USA)》,94:13921-13926(1997)中所述。此外，Lewis等人，《病毒学杂志(J Virol)》,76:8769-8775(2002)证明骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠以及分泌所需的细胞因子，这表明肌肉能够稳定表达分泌蛋白治疗剂。
如本文所示，中断小鼠中的Ano5基因产生几种营养不良的肌肉组织病原性特征，即运动不耐受性、肌膜修复的功能障碍以及成肌肉细胞融合缺陷。此外，所提供的数据证明，这些缺陷与由ANO5介导的亚细胞膜和/或膜和/或肌膜动力学的变化有关。本发明涉及在诱导肌肉修复和/或治疗MD的方法中使用表达Ano5基因的AAV载体。
发明内容
本发明涉及包含编码ANO5蛋白或其功能活性片段的核苷酸序列的AAV载体。实施例1至4中描述的实验证明了Ano5在肌肉再生和修复中的重要作用。ANO5的缺失导致小鼠的营养不良表型，使人联想起LGMD2L患者，所述患者具有在肌肉之间变化的轻度组织病理、运动不耐受性、再生受损以及肌酸激酶水平升高。在年轻和年老的Ano5-/-小鼠中观察到线粒体异常。除了通过电子显微成像显示的线粒体的结构缺陷之外，柠檬酸合酶定量测定还证明线粒体具有功能缺陷。柠檬酸合酶的定量酶分析表明存在受损害的线粒体。这些结果表明，线粒体异常可能是由Anoctamin 5蛋白质缺失引起的继发效应。本文描述的实验证明Ano5-/-纤维中肌膜补片修复的减弱由人ANO5的病毒表达挽救，并且发现Ano5的破坏扰乱原代成肌肉细胞的促融质量。
在一个实施方案中，本发明提供了包含含有ANO5核酸序列的多核苷酸的重组AAV病毒。ANO5核酸序列列出为Genbank登录号NM_213599.2(SEQ ID NO:13)。编码AAV载体中的ANO5蛋白的示例性核酸序列列出为SEQ ID NO:1。本发明的重组载体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的核酸具有至少85％同一性的多核苷酸序列，或者包含在严格条件下与SEQID NO:1或SEQ ID NO:13的核苷酸序列杂交的核苷酸，或者包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的编码表现出ANO5活性的蛋白质的核酸片段。在一方面，本发明的重组AAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh.74。
本发明的重组AAV载体包含SEQ ID NO:1的编码包含涉及PLS活性的结构域的蛋白质的片段，并且所述蛋白保留PLS活性。在另一个实施方案中，AAV载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的编码保留ANO5活性的蛋白质的片段。
本发明的重组AAV载体包含例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常地至少90％、91％、92％、93％或94％，并且甚至更通常地至少95％、96％、98％或99％序列同一性的多核苷酸，其中多核苷酸编码保留ANO5活性的蛋白质。
本发明的重组AAV载体包含例如与SEQ ID NO:2具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常地至少90％、91％、92％、93％或94％，并且甚至更通常地至少95％、96％、98％或99％序列同一性的编码ANO5蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸编码保留ANO5活性的蛋白质
本发明的重组AAV载体包含在严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13或其补体的核酸序列杂交的多核苷酸序列，所述片段大于约5个核苷酸，优选7个核苷酸，更优选大于9个核苷酸，并且最优选大于17个核苷酸。涵盖了对本发明的多核苷酸中的任一种具有选择性(即与本发明的任何一种多核苷酸特异性杂交)的例如15、17或20个核苷酸或更多个核苷酸的片段，并且这些片段保留ANO5活性。能够与多核苷酸特异性杂交的探针可以将本发明的NTHi多核苷酸序列与相同基因家族中的其他多核苷酸序列区分开，或者可以将NTHi基因与其他细菌基因区分开，并且优选基于独特的核苷酸序列。
术语“严格”用于指本领域中通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂诸如甲酰胺的浓度决定。杂交和洗涤的严格条件的例子是65-68℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，或42℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。参见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》，第2版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，(冷泉港，纽约(N.Y.)1989)。也可以使用更严格的条件(诸如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)，然而，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)以及60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)下，在6x SSC 0.05％磷酸钠中的洗涤。
出于减少非特异性和/或背景杂交的目的，在杂交和洗涤缓冲液中可以包括其他试剂。实例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、ficoll、Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(或其他非互补DNA)以及硫酸葡聚糖，但是也可以使用其他合适的试剂。这些添加剂的浓度和类型在不明显影响杂交条件的严格性的情况下可以改变。杂交实验通常在pH 6.8至7.4进行，然而，在典型的离子强度条件下，杂交速率几乎与pH无关。参见Anderson等人,《核酸杂交：实践方法(Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach)》，第4章，IRL出版社有限公司(英格兰牛津市(Oxford,England))。本领域技术人员可以调整杂交条件以便适应这些变量并允许不同序列相关性的DNA形成杂交体。
在另一个方面，本发明的重组AAV载体可被可操作地连接至肌肉特异性控制元件。例如，肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF、鼠科肌酸激酶增强子元件(MCK)、MCK的三重拷贝(tMCK)、骨骼快缩肌肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌心肌肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌肌钙蛋白I基因元件、缺氧诱导性核因子、类固醇诱导性元件或糖皮质激素反应元件(GRE)。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产重组AAV载体颗粒的方法，包括培养已转染了本发明的任何重组AAV载体的细胞，并从转染细胞的上清液中回收重组AAV颗粒。本发明还提供了包含本发明的任一种重组AAV载体的病毒颗粒。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗肌营养不良症的方法，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的任何重组AAV载体。在一方面，有需要的受试者在ANO5基因中具有隐性突变。所述方法可以治疗dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病(calpainopathy)、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病(sarcoglycanopathie)或ZASP相关肌病。此外，上述治疗肌营养不良症的方法中的任一种还包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物的步骤。例如，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。特别地，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于有需要的受试者再生肌肉的方法，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的任何重组AAV载体。在一方面，有需要的受试者在ANO5基因中具有隐性突变。在另一方面，有需要的受试者罹患肌营养不良症，诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。此外，上述再生肌肉的方法中的任一种还包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物的步骤。例如，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。特别地，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗慢性肌肉耗损的方法，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的任一种重组AAV载体。在一方面，有需要的受试者在ANO5基因中具有隐性突变。在另一方面，有需要的受试者罹患肌营养不良症，诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型或Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。此外，上述治疗慢性肌肉耗损的方法中的任一种还包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物的步骤。例如，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。特别地，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
本发明还提供了用于治疗有需要的受试者的肌营养不良症或慢性肌肉耗损综合征的包含本发明的任何重组AAV载体的组合物。本发明还提供了使有需要的受试者肌肉再生的包含本发明的任何重组AAV载体的组合物。在一方面，将本发明的组合物给予至在ANO5基因中具有隐性突变的受试者。在另一方面，将本发明的组合物给予至罹患肌营养不良症的受试者，所述肌营养不良症为诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。将本发明的任一种组合物配制用于肌内或静脉内注射。本发明的任一种组合物还包含治疗有效量的抗氧化剂组合物。例如，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。特别地，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的任何重组AAV载体用于制备用以治疗有需要的受试者的肌营养不良症或慢性肌肉耗损综合征的药物的用途。此外，本发明提供了本发明的任一种重组AAV载体用于制备用以使有需要的受试者的肌肉再生的药物的用途。在一方面，将药物给予至在ANO5基因中具有隐性突变的受试者。在另一方面，将药物给予至罹患肌营养不良症的受试者，所述肌营养不良症为诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。将本发明的任一种药物配制用于肌内或静脉内注射。本发明的任一种药物还包含治疗有效量的抗氧化剂组合物。例如，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。特别地，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗肌营养不良症或慢性肌肉耗损的方法，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物。抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。在一些方面，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。在一方面，有需要的受试者在ANO5基因中具有隐性突变。在另一方面，受试者的骨骼肌中的氧化应激反应减少。在另一方面，受试者的骨骼肌功能得到改善。在另一方面，受试者罹患dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。
本发明还提供了用于减缓肌营养不良症或慢性肌肉耗损的进展的方法，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物。抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。在一些方面，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。在一方面，有需要的受试者在ANO5基因中具有隐性突变。在另一方面，受试者的骨骼肌中的氧化应激反应减少。在另一方面，受试者的骨骼肌功能得到改善。在另一方面，受试者罹患dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。
在本发明的任一种方法中，抗氧化剂组合物口服给予。在本发明的任一种方法中，抗氧化剂在相同的组合物给予中，或者抗氧化剂在分开的组合物给予中。抗氧化剂分开但并行地给予。此外，在本发明任一种方法中，抗氧化剂分次或连续地给予。在本发明的任一种方法中，抗氧化剂组合物每日一次、每周一次、每周两次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两个月一次地给予。
本发明还提供了包含治疗有效量的抗氧化剂组合物的组合物。抗氧化剂组合物包含用于治疗有需要的受试者的治疗肌营养不良症或慢性肌肉耗损综合征的辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。
本发明还提供了包含治疗有效量的抗氧化剂组合物的组合物。抗氧化剂组合物包含用于减缓有需要的受试者的肌营养不良症或慢性肌肉耗损的进展的辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。在一些方面，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
在一方面，将本发明的任一种组合物给予至在ANO5基因中具有隐性突变的受试者。在另一方面，在给予组合组之后，受试者的骨骼肌中的氧化应激反应减少。在另一方面，在给予组合组之后，受试者的骨骼肌功能得到改善。在另一方面，将本发明的任一种组合物给予至罹患肌营养不良症的受试者，所述肌营养不良症为诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。将本发明的任一种组合物配制用于肌内或静脉内注射。
在另一个实施方案中，本发明提供了氧化剂组合物用于制备用以治疗有需要的受试者的肌营养不良症或慢性肌肉耗损综合征的药物的用途。本发明的任一种药物中的抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。
此外，本发明提供了抗氧化剂组合物用于制备用以使有需要的受试者肌肉再生的药物的用途。本发明的任一种药物中的抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。在一些方面，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
此外，本发明提供了氧化剂组合物用于制备用以减缓有需要的受试者的肌营养不良症或肌肉耗损综合征的进展的药物的用途。本发明的任一种药物中的抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。在一些方面，抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
将本发明的任一种组合物给予至在ANO5基因中具有隐性突变的受试者。在另一方面，受试者的骨骼肌中的氧化应激反应减少。在另一方面，受试者的骨骼肌功能得到改善。在另一方面，将本发明的任一种药物给予至罹患肌营养不良症的受试者，所述肌营养不良症为诸如dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、dysferlin病变、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。此外，将本发明的任一种药物配制用于肌内或静脉内注射。
在一些实施方案中，抗氧化剂组合物口服给予。在一些方面，抗氧化剂处于相同的组合物中。在其他方面，抗氧化剂处于分开的组合物中。在一些方面，抗氧化剂组合物的抗氧化剂并行给予。在一些方面，抗氧化剂组合物的抗氧化剂分次或连续地给予。在一些实施方案中，抗氧化剂组合物每日一次、每周一次、每周两次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两个月一次地给予。
附图说明
图1A-1D示出了Ano5-/-小鼠模型的生成。图(a)示出了Ano5靶向载体，其包含外源内含子和具有聚腺苷酸化终止信号的编码lacZ的外显子。所得mRNA终止于外显子8。图(b)示出了从同窝出生小鼠的尾剪掉物分离的基因组DNA。泳道1-野生型(WT)小鼠，泳道2Ano5+/-小鼠，泳道3Ano5-/-小鼠，WT等位基因-300bp片段，Ano5等位基因-200bp片段。图(c)显示了来自使用靶向Ano5的两个引物组的RT-PCR的产物，未显示出Ano5-/-组织中Ano5转录物的迹象。泳道1：GAPDH对照；泳道2跨越外显子10至14的e10-14引物；泳道3跨越外显子17至20的e17-20引物。图(d)显示了通过从Ano5-/-小鼠提取的四头肌(QD)、腓肠肌(GAS)和胫骨前肌(TA)肌肉中的qRT-PCR确认了在RNA水平上ANO5的>99％相对表达减少(P<0.001)。
图2A-2F示出了对Ano5-/-缺陷小鼠的表征。图(a)显示了在9个月时Ano5-/-小鼠中血清肌酸激酶显著升高(P<0.05，t检验)。图(b)显示了来自9月龄的Ano5-/-小鼠的膈膜条的特定收缩力与对照相比显著降低(P<0.01，t检验)。图(c)显示了来自9个月Ano5-/-小鼠的EDL和胫骨前肌(TA)肌肉的收缩比力与对照组无显著差异(P>0.05，t检验)。图(d)描绘了苏木精和伊红染色的组织切片，其显示与WT对照相比，Ano5-/-小鼠的TA和GAS中的轻度营养不良病理包括中央核、纤维尺寸可变性和坏死区域。比例尺＝50μm。图(e)提供了肌纤维直径测量值，其显示与WT相比，纤维直径尺寸减小，特别是在GAS肌肉中(P<0.0001，t检验)。图(f)示出了Ano5-/-小鼠进行跑步机疲劳研究时出现频繁的停顿。
图3A-3E提供了Ano5-/-小鼠的生理学特征。图(a)在跑步机跑步之后，与WT对照相比，Ano5-/-小鼠中的乳酸水平轻微降低(P＝0.15)。图(b)肌肉的电生理学特征。在Ano5-/-(45.1±2.2mV)与WT(40.8±2.4mV)之间CMAP幅值没有显著差异(p＝0.22)。Ano5-/-或WT动物均未展示出纤颤电位。图(c-e)在50kHz下肌肉的阻抗特征(分别地，相位；电抗；阻抗)。Ano5-/-(31.0±2.7；248.1±37.8Ω；411.4±34.6Ω)与WT纤维(31.7±3.9；269.0±83.9Ω；424.3±73.9Ω)之间没有差异(相位：p＝0.59；电抗：p＝0.44；电阻：p＝0.59)。在100kHz下在Ano5-/-(36.5±2.4；216.2±27.3Ω；290.7±22.0Ω)与WT纤维(37.0±4.8；228.4±63.9Ω；295.8±36.1Ω)之间没有观察到差异(相位：p＝0.77；电抗：p＝0.55；电阻：p＝0.68)。
图4A-4G提供了Ano5-/-肌肉中的亚细胞组织病理学。图(a)提供了10月龄的Ano5-/-和WT TA肌肉的Gomori三色法染色。Ano5-/-肌肉含有膜聚集体(箭头)。比例尺＝20μm的图(b)提供了在Ano5-/-的TA和GAS肌肉中含有聚集体的纤维数相比于WT的定量(P<0.0001，单因子ANOVA)。图(c、d)提供了电子显微镜图像，其显示Ano5-/-肌肉中存在膜聚集体。聚集体是具有带绒毛的内部小管的松散堆积的互连管状结构(白色箭头)，或者是囊状或管状膜的密集堆积的积聚体(黑色箭头)。比例尺＝500nm。图(e)显示了在Ano5-/-肌肉中很多情况下通过电子显微镜鉴定出线粒体的肌膜下积聚(箭头)和变性的线粒体(星号)。比例尺＝500nm(左)和2μm(右)。图(f)提供10月龄的小鼠Ano5-/-TA肌肉的琥珀酸脱氢酶染色显示出肌膜增厚和WT中不存在的加帽纤维。比例尺＝10μm。图(g)提供来自10月龄的Ano5-/-小鼠的TA肌肉的冷冻切片进行琥珀酸脱氢酶(SDH)染色。箭头指示未进行SDH染色的聚集体(左)。来自10月龄的Ano5-/小鼠的连续切片显示用三色法染色观察到的许多膜聚集体(白色箭头)对SERCA1呈阳性(右)，者表明它们来源于肌浆网。比例尺＝40μm。
图5A-5E显示了膜修复在Ano5-/小鼠中是有缺陷的。图(a)提供了在损伤后5秒和190秒示出的由激光脉冲损害的Ano5-/-和WT肌纤维的图像。红色箭头指示损害位点，其中FM1-43染料相比于WT在Ano5-/-肌肉中快速积累。比例尺＝50μm。图(b)提供了激光诱导损伤后对荧光强度的测量。在损伤后的>100秒的所有时间，Ano5-/-肌肉与WT和AAV.ANO5纤维具有统计学差异(2因子ANOVA，P<0.001)。图(c)示出了注射有5×1010vg AAV.ANO5.FLAG载体的Ano5-/-肌肉中ANO5-FLAG的表达。使用抗FLAG抗体的免疫荧光显示在经处理肌肉(顶部)中细胞表面处的ANO5-FLAG表达，所述表达在未经处理的Ano5-/-肌肉(底部)中不存在。比例尺＝40μm。图(d)显示了从心脏毒素诱导的肌肉损伤的恢复。在注射心脏毒素后1、3、7、14、30和90天，苏木精和伊红染色WT和Ano5-/-TA肌肉组织切片(示出了第3、7、14和30天)。与WT相比，Ano5-/-肌肉遭受更多的损伤并且显示出再生受损。图(e)显示了在心脏毒素注射后30天(心脏毒素D30)和90天(心脏毒素D90)，Ano5-/-肌肉中的肌纤维尺寸与WT相比在统计学上更小(P<0.05，t检验)。
图6显示了用抗氧化剂疗法或安慰剂饮食治疗的Ano5-/-小鼠的自主活动。该图示出了接受抗氧化剂饮食或安慰剂对照12周和16周的Ano5-/-小鼠的自主活动(小鼠在45分钟时间段内中断水平和/或垂直激光束的次数)。用三重抗氧化剂疗法治疗的Ano5-/-小鼠与16周安慰剂治疗的相比具有显著增加的活性。
图7示出了被给予三重抗氧化剂疗法或安慰剂饮食的Ano5-/-和饲喂安慰剂饮食的WT对照小鼠的膈膜上的比力测量。用三重抗氧化剂疗法治疗的Ano5-/-小鼠与16周安慰剂治疗的相比表现出显著增加的膈膜比力。
图8A-8B显示了三重抗氧化剂疗法对线粒体生物发生和功能的效应。使用雄性腓肠肌组织测量三重抗氧化剂喂养的小鼠中的线粒体生物发生标记、线粒体生物发生PGC-1a表达以及柠檬酸合酶活性。图(a)示出了被给予三重抗氧化剂疗法或安慰剂饮食的小鼠的PGC-1a表达。图(b)示出了被给予三重抗氧化剂疗法或安慰剂饮食的雄性和雌性Ano5-/-和WT小鼠的柠檬酸合酶(CS)活性。
具体实施方式
ANO5在肌肉修复中起重要作用，并且本发明提供了用于治疗MD的包含ANO5基因的AAV载体。ANO5的破坏密切地表型模拟了鼠科模型中dysferlin表达的缺失，并且dysferlin突变导致与ANO5肌病类似的MD(肢带型肌营养不良症2B(LGMD2B)和Miyoshi肌病肌营养不良症1(MMD1)相对于肢带型肌营养不良症2L(LGMD2L)和Miyoshi肌病肌营养不良症3(MMD3))。
Ano5-/-小鼠代表用于研究ANO5肌病、肌膜修复和成肌细胞融合的重要模型。以下实施例中提供的实验证据支持作为ANO5-肌病的治疗策略的用于基因替代疗法的方法，其通过经由AAV.ANO5-FLAG治疗Ano5-/-小鼠部分挽救膜修复表型。
AAV
如本文所用，术语“AAV”是腺伴随病毒的标准缩写。腺伴随病毒是一种单链DNA细小病毒，其仅在细胞中生长，其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供。目前有13种AAV血清型已被表征，如下表1所示。AAV的一般信息和综述可见于例如Carter,1989，《细小病毒手册(Handbook of Parvoviruses)》，第1卷，第169-228页，和Berns,1990，《病毒学(Virology)》，第1743-1764页，乌鸦出版社(Raven Press)，(纽约)。然而，完全预期到这些相同的原则将适用于另外的AAV血清型，因为众所周知，即使在遗传水平上，各种血清型在结构和功能上都很密切相关。(参见，例如Blacklowe,1988，第165-174页《小病毒和人类疾病(Parvoviruses and Human Disease)》,J.R.Pattison编辑；和Rose，《综合病毒学(Comprehensive Virology)》3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型明显表现出非常类似的由同源rep基因介导的复制特性；并且全部携带三种相关的衣壳蛋白，例如在AAV2中表达的那些。通过异源双链体分析进一步表明了相关程度，所述分析揭示沿着基因组长度血清型之间的广泛交叉杂交；以及在末端存在对应于“反向末端重复序列”(ITR)的类似自退火段。类似的感染性模式也表明每种血清型中的复制功能处于类似的调控控制下。
如本文所用，“AAV载体”是指包含侧接AAV末端重复序列(ITRS)的一个或多个感兴趣的多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，此类AAV载体可以复制并包装到感染性病毒颗粒中。
“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，诸如有待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，以使得载体被包含在AAV载体颗粒内。
AAV载体可以是单链或双链核酸，所述核酸具有侧接蛋白质编码序列的AAV 5'反向末端重复序列(ITR)和AAV 3'ITR，和任选的插入在蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子，所述蛋白质编码序列可操作地连接至转录调控元件，即一个或多个启动子和/或增强子，以及聚腺苷酸化序列。单链AAV载体是指存在于AAV病毒颗粒基因组中的核酸，并且可以是本文公开的核酸序列的有义链或反义链。此类单链核酸的大小以碱基提供。双链AAV载体是指存在于质粒(例如pUC19)的DNA中的核酸，或用于表达或转移AAV载体核酸的双链病毒(例如杆状病毒)的基因组。此类双链核酸的大小以碱基对(bp)提供。
如本文所用，术语“反向末端重复序列(ITR)”是指在AAV基因组的5'和3'末端处发现的、以顺式方式充当DNA复制起点并且充当用于病毒基因组的包装信号的本领域公认区域。AAV ITR与AAV rep编码区一起提供了对插置在两个侧翼ITR之间的核苷酸序列的高效切除和挽救，以及将所述核苷酸序列向宿主细胞基因组中的整合。某些AAV相关ITR的序列通过Yan等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》79(1):364-379(2005)公开，所述文献通过引用整体并入本文。
“转录控制元件”是指涉及调控基因转录的基因的核苷酸序列，包括启动子，加上反应元件，用于结合转录因子以帮助RNA聚合酶结合并且促进表达的激活因子和增强子序列，以及结合阻遏蛋白质以阻断RNA聚合酶连接并阻止表达的操纵子或沉默子序列。
AAV“rep”和“cap”基因分别是编码复制蛋白和衣壳化蛋白的基因。在迄今为止研究的所有AAV血清型中已经发现AAV rep和cap基因，并且在本文和所引用的参考文献中对其进行了描述。在野生型AAV中，通常在病毒基因组中发现rep和cap基因彼此相邻(即，它们“偶合”在一起作为邻接或重叠的转录单元)，并且通常，它们在AAV血清型中是保守的。AAVrep和cap基因也被单独地和共同地称为“AAV包装基因”。根据本发明的AAV cap基因编码Cap蛋白，所述Cap蛋白能够在rep和腺病毒辅助子存在下包装AAV载体，并且能够结合靶细胞受体。在一些实施方案中，AAV cap基因编码具有衍生自特定AAV血清型的氨基酸序列的衣壳蛋白，所述AAV血清型例如表1中示出的血清型和AAV rh.74(参见美国专利9,434,928)。也考虑其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如Marsic等人，《分子治疗(Mol Ther)》,22(11):1900-1909(2014)。
表1.AAV血清型
AAV血清型 基因库登录号
AAV-1 NC_002077.1
AAV-2 NC_001401.2
AAV-3 NC_001729.1
AAV-3B AF028705.1
AAV-4 NC_001829.1
AAV-5 NC_006152.1
AAV-6 AF028704.1
AAV-7 NC_006260.1
AAV-8 NC_006261.1
AAV-9 AX753250.1
AAV-10 AY631965.1
AAV-11 AY631966.1
AAV-12 DQ813647.1
AAV-13 EU285562.1
生产AAV所采用的AAV序列可以衍生自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供类似的一组遗传功能，产生在物理和功能上基本上等同的病毒体，并通过实际上相同的机制进行复制和组装。对于AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的讨论参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》71:6823-33(1997)；Srivastava等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》45:555-64(1983)；Chlorini等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》73:1309-1319(1999)；Rutledge等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》72:309-319(1998)；以及Wu等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》74:8635-47(2000)。
所有已知AAV血清型的基因组组织非常类似。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特的编码核苷酸序列。VP蛋白形成衣壳。末端的145nt是自补的并且经过组织以使得可以形成在能量上稳定的分子内双链体，所述双链体形成T形发夹结构。这些发夹结构充当病毒DNA复制的起点，从而用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。Rep基因编码Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52以及Rep40。Rep78和Rep68从p5启动子转录，并且Rep52和Rep40从p19启动子转录。cap基因编码VP蛋白，即VP1、VP2以及VP3。cap基因从p40启动子转录。
在一些实施方案中，编码AAV衣壳蛋白的核酸序列可操作地连接至表达控制序列，以便在特定的细胞类型，诸如Sf9或HEK细胞中表达。本领域技术人员已知用于在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实践本发明。用于在昆虫细胞中分子工程化和表达多肽的方法描述于例如以下文献中：Summers和Smith.1986.《用于杆状病毒载体和昆虫培养程序的方法手册(A Manual of Methods for Baculovirus Vectorsand Insect Culture Procedures)》，德克萨斯州农业实验站(Texas AgriculturalExperimental Station)公告号(Bull.No.)7555，德克萨斯州大学城(College Station,Tex.)；Luckow.1991.《具有杆状病毒载体的昆虫细胞中异源基因的克隆和表达(Cloningand Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with BaculovirusVectors)，在Prokop等人《重组DNA技术和应用(Recombinant DNA Technology andApplications)》中,97-152；King,L.A.和R.D.Possee,1992，《杆状病毒表达系统(Thebaculovirus expression system)》，查普曼和霍尔出版公司(Chapman and Hall)，英国；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,1992，《杆状病毒表达载体：实验室手册(Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual)》，纽约；W.H.Freeman和Richardson,C.D.,1995，《杆状病毒表达方案(Baculovirus Expression Protocols)》，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》，第39卷；美国专利第4,745,051号；US2003148506；以及WO 03/074714。用于转录编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的特别合适的启动子是例如多角体启动子。然而，其他在昆虫细胞中具有活性的启动子在本领域中是已知的，例如p10、p35或IE-1，并且也考虑在上述参考文献中描述的其他启动子。
使用昆虫细胞来表达异源蛋白质是有据可查的，将核酸诸如载体，例如昆虫细胞相容性载体引入到此类细胞中的方法以及在培养物中维持此类细胞的方法也是如此。参见例如，《分子生物学方法(METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)》，Richard编辑，胡马纳出版社(Humana Press)，纽约(1995)；O'Reilly等人，《杆状病毒表达载体：实验室手册(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL)》，牛津大学出版社(OxfordUniv.Press)(1994)；Samulski等人，《病毒学杂志(J.Vir.)63:3822-8(1989)；Kajigaya等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:4646-50(1991)；Ruffing等人，《病毒学杂志(J.Vir.)》66:6922-30(1992)；Kirnbauer等人，《病毒学(Vir.)》219:37-44(1996)；Zhao等人，《病毒学(Vir.)》272:382-93(2000)；以及Samulski等人，美国专利第6,204,059号。在一些实施方案中，昆虫细胞中编码AAV的核酸构建体是昆虫细胞相容性载体。如本文所用，“昆虫细胞相容性载体”或“载体”是指能够多产转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。可以利用任何载体，只要它是昆虫细胞相容的即可。载体可以整合到昆虫细胞基因组中，但是载体在昆虫细胞中的存在不需要是永久性的，并且也包括瞬时游离型载体。载体可以通过任何已知方式引入，例如通过化学处理细胞、电穿孔或感染。在一些实施方案中，载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在更优选的实施方案中，载体是杆状病毒，即构建体是杆状病毒载体。杆状病毒载体和它们的使用方法描述于上文引用的关于昆虫细胞的分子工程化的参考文献中。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，其中两个成员是用于在细胞培养物中产生重组蛋白的公知的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，所述基因组可以被工程化以允许向特定的细胞递送大的基因组含量。被用作载体的病毒通常是(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)或家蚕(Bombyx mori)(Bm)NPV)(Kato等人，2010)。
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。特别地，可以实现异源基因在昆虫中的表达，如例如以下文献中所述：美国专利第4,745,051号；Friesen等人(1986)；EP127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；以及Martin等人(1988)。可以用于产生蛋白质的许多杆状病毒株和变体以及对应的容许的昆虫宿主细胞描述于Luckow等人(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)；以及McKenna(1989)中。
在一方面，本发明提供了rAAV基因组。rAAV基因组包含侧接编码ANO5蛋白的多核苷酸序列的一个或多个AAV ITR。如果多核苷酸编码ANO5蛋白，则多核苷酸可操作地连接至转录控制DNA，特别地在靶细胞(例如肌肉细胞)中起作用的启动子DNA和聚腺苷酸化信号序列DNA以形成基因盒。基因盒还可以包含内含子序列以当在哺乳动物细胞中表达时促进对RNA转录物的加工。例如，AAV基因组包含侧接ANO5基因的一个或多个外显子，诸如ANO5基因的外显子8和外显子9的一个或多个AAV ITR。AAV基因组还可以包含以下中的一种或多种：内含子、报道基因诸如Lac-Zβ-半乳糖苷酶或新霉素抗性基因、CRE-Lox重组位点诸如LoxP，以及内部核糖体进入位点(IRE S)。
用于产生重组AAV的方法
本公开提供了用于在昆虫细胞或哺乳动物细胞中产生重组AAV的材料和方法。在一些实施方案中，病毒构建体还包含启动子和启动子下游的限制性酶切位点以允许插入编码所感兴趣的一种或多种蛋白质的多核苷酸，其中启动子和限制性酶切位点位于5'AAVITR的下游和3'AAV ITR的上游。在一些实施方案中，病毒构建体还包含处于限制性酶切位点下游和3'AAV ITR上游的转录后调控元件。在一些实施方案中，病毒构建体还包含插入在限制性酶切位点处并且与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含所感兴趣的蛋白质的编码区。如本领域技术人员应了解的那样，本申请中所公开的任一种AAV载体可以作为病毒构建体用于所述方法中以产生重组AAV。DNA质粒被转移至可允许用AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染，以便将rAAV基因组组装到感染性病毒颗粒中的细胞。用于产生将有待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供至细胞的rAAV颗粒的技术是本领域中标准的技术。产生rAAV需要在单个细胞(在本文中指示为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因以及辅助病毒功能。
在一些实施方案中，辅助功能是由包含腺病毒或杆状病毒辅助基因的一种或多种辅助质粒或辅助病毒提供的。腺病毒或杆状病毒辅助基因的非限制性实例包括但不限于E1A、E1B、E2A、E4以及VA，它们可以为AAV包装提供辅助功能。
AAV的辅助病毒是本领域已知的，并且包括例如来自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV的辅助病毒的实例包括但不限于美国公开第20110201088号(其公开内容通过引用并入本文)中所述的SAdV-13辅助病毒和SAdV-13样辅助病毒、辅助载体pHELP(Applied Viromics公司)。本领域技术人员应了解，可以为AAV提供足够辅助功能的AAV的任何辅助病毒或辅助质粒均可以用于本文。
在一些实施方案中，AAV cap基因存在于质粒中。质粒还可以包含AAV rep基因。来自任何AAV血清型(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV rh.74以及其任何变体)的cap基因和/或rep基因可以用于本文中以产生重组AAV。在一些实施方案中，AAV cap基因编码来自血清1型、血清2型、血清4型、血清5型、血清6型、血清7型、血清8型、血清9型、血清10型、血清11型、血清12型、血清13型或其变体的衣壳。
在一些实施方案中，可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助质粒或辅助病毒、编码AAV cap基因的病毒构建体和质粒转染；并且可以在共转染之后的各个时间点收集重组AAV病毒。例如，可以在共转染之后的约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、或这些时间点中的任何两个之间的时间收集重组AAV病毒。
还可以使用本领域已知的适用于产生感染性重组AAV的任何常规方法来产生重组AAV。在一些情况下，可以通过使用稳定表达AAV颗粒产生所必需的的组分中的一些的昆虫细胞或哺乳动物细胞来产生重组AAV。例如，包含AAV rep基因和cap基因以及选择性标记，诸如新霉素抗性基因的质粒(或多个质粒)可以被整合到细胞的基因组中。然后可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助病毒(例如提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒)以及包含5'AAVITR和3'AAV ITR(以及编码异源蛋白质的核苷酸序列，如果需要的话)的病毒载体共感染。这种方法的优势在于所述细胞是可选择的并且适用于大规模产生重组AAV。作为另一个非限制性实例，可以使用腺病毒或杆状病毒，而不是使用质粒来将rep基因和cap基因引入到包装细胞中。作为又另一个非限制性实例，含有5'AAV LTR和3'AAV LTR的病毒载体以及含有rep-cap基因的病毒载体这两者可以被稳定整合到生产细胞的DNA中，并且辅助功能可以由野生型腺病毒提供以产生重组AAV。
生成包装细胞的方法是产生稳定表达AAV颗粒生产所必需的组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因以及选择性标记诸如新霉素抗性基因的质粒(或多个质粒)整合到细胞基因组中。通过诸如GC加尾(Samulski等人，1982，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶裂解位点的合成接头(Laughlin等人，1983，《基因(Gene)》,23:65-73)或通过直接的平端连接(Senapathy&Carter,1984,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)的程序将AAV基因组引入到细菌质粒中。然后用辅助病毒诸如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优势在于所述细胞是可选择的并且适用于大规模产生rAAV。合适方法的其他实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV产生的一般原则综述在以下文献中：例如Carter,1992,《生物技术当前述评(Current Opinions in Biotechnology)》,1533-539；和Muzyczka,1992,《微生物学和免疫学的当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》,158:97-129)。各种方法描述于以下文献中：Ratschin等人，《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,81:6466(1984)；Tratschin等人，《分子细胞生物学(Mo1.Cell.Biol.)》5:3251(1985)；McLaughlin等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》,7:349(1988).Samulski等人(1989,《病毒学杂志(J.Virol.)》,63:3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和对应的美国专利第5,658.776号；WO95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO99/11764；Perrin等人(1995)《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》4:609-615；Clark等人(1996)《基因治疗(Gene Therapy)》3:1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利第6,258,595号。上述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调文献中的与rAAV产生相关的那些部分。
因此，本发明提供了产生感染性的rAAV的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，诸如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施方案中，包装细胞是不转化癌细胞的细胞，诸如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胚肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)以及FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
rAAV可通过本领域的标准方法，诸如通过柱色谱法或氯化铯梯度法纯化。用于从辅助病毒纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括在以下文献中公开的方法：例如Clark等人，《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark，《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》,69 427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657。
用于产生AAV的细胞类型
包含本发明的AAV载体的病毒颗粒可以使用允许产生AAV或生物产物并且可以在培养物中维持的任何无脊椎动物细胞类型来产生。例如，所使用的昆虫细胞系可以来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，诸如SF9、SF21、SF900+；果蝇细胞系；蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系；家蚕细胞系，例如家蚕(Bombyxmori)细胞系；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系，诸如High Five细胞；或鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，诸如黑色女巫蛾(Ascalapha odorata)细胞系。优选的昆虫细胞是来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5以及Ao38。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，其中两个成员是用于在细胞培养物中产生重组蛋白的公知的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，所述基因组可以被工程化以允许向特定的细胞递送大的基因组含量。被用作载体的病毒通常是苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)或家蚕(Bombyx mori)(BmNPV)(Kato等人，2010)。
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。具体地，可以实现异源基因在昆虫中的表达，如例如以下文献中所述：美国专利第4,745,051号；Friesen等人(1986)；EP127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；以及Martin等人(1988)。可以用于产生蛋白质的许多杆状病毒株和变体以及对应的容许的昆虫宿主细胞描述于Luckow等人(1988)；Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)；以及McKenna(1989)中。
在本发明的另一个方面，还可使用允许AAV复制或生物产物产生并且可以在培养物中维持的任何哺乳动物细胞类型来进行本发明的方法。所使用的优选的哺乳动物细胞可以是HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19以及MRC-5细胞。
组合物
在另一个实施方案中，本发明涵盖包含本发明的rAAV和/或抗氧化剂的组合物。这些组合物可用于再生、增强或修复肌肉和/或改善肌肉功能。
本发明的组合物包含在药学上可接受的载体中的rAAV。所述组合物还可以包含其他成分，诸如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的，并且优选在所用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂；低分子量多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如吐温、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。
本发明涵盖在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括给予包括向有需要的动物(包括人类患者)给予有效剂量或有效多剂量的包含本发明rAAV的组合物的步骤。给受试者的包含本公开rAAV的组合物的组合的有效剂量或有效多剂量是预防与所治疗的疾病相关联的肌肉病理、减缓所述肌肉病理的进展或改善(消除或减少)所述肌肉病理的剂量。对肌肉病理的影响可以通过本领域中一种或多种测量标准的改善来展示，所述测量标准诸如：绝对肌肉比力；离心性肌收缩期间的力减缩量；血清CK水平；血清心肌肌钙蛋白水平；血清MMP9水平；握力；肢体力矩；肢体活动性或灵活性；走动性；6分钟步行测试；膝屈肌或伸肌力量；最大自主等长肌肉收缩；北极星移动评价量表；肌肉量、脂肪减少量或根据肢体T2加权MRI测量的水肿；肌肉挛缩；四肢关节角；心脏功能(心率、心输出量、缩短分数百分比、心搏量)；呼吸(包括呼吸速率、血氧、补充氧气需要)；肌肉坏死；肌肉再生；肌肉萎缩；肌肉炎症；肌肉钙化；肌肉中心成核；肌肉尺寸或肌纤维尺寸；寿命；以及肌营养不良蛋白或层粘连蛋白α2替代蛋白表达(肌营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)、网蛋白1、层粘连蛋白α5、集聚蛋白)。参见，例如Forbes等人，《放射学(Radiology)》,269(1):198-207(2013)；Govoni等人，《细胞分子生命科学(Cell Mol.Life Sci.)》,70(23):4585-4602(2013)；以及Chandrasekharan和Martin，《酶学方法(Methods Enzymol.)》,479:291-322(2010)。如果在疾病发展之前给予剂量，则所述给予是预防性的。如果在疾病发展后给予剂量，则所述给予是治疗性的。因此，通过本文所述的方法对受试者的治疗涵盖了预防所治疗疾病、减缓或防止所治疗疾病的进展、减轻所治疗疾病的程度，从而使所治疗疾病得到缓解(部分或全部)和/或延长从所治疗疾病的存活期。
本发明还考虑了组合疗法。本文所用的组合包括同时治疗或依序治疗。具体地考虑了本发明方法与标准药物治疗(例如用于肌营养不良症的皮质类固醇)的组合，像与新颖疗法的组合一样。在这方面，可以设想诱导ANO5的表达以减少或抑制肌肉损伤、增强肌肉或诱导肌肉修复，然后提供二次治疗。用于肌营养不良症的此类二次治疗可以包括使用抗氧化剂(例如，硫辛酸、辅酶Q10和α-生育酚)、IGF-1、干扰RNA途径、外显子跳跃、钙蛋白酶抑制、肌营养不良蛋白上调以及肌营养不良蛋白聚糖表达。此外，可以添加ANO5的表达以增强肌肉助力作用。例如，可以进行IGF-1或其他营养因子或肌肉前体注射的添加。
本文公开的方法中待给予的rAAV剂量将取决于例如特定rAAV、给予方式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型，并且可通过本领域的标准方法确定。给予的每种rAAV的滴度范围可以为每ml约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013、约1×1014个至约1×1015个或更多个DNA酶耐受性颗粒(DRP)。剂量还可以表达为病毒基因组单位(vg)(即，分别地1×107vg、1×108vg、1×109vg、1×1010vg、1×1011vg、1×1012vg、1×1013vg、1×1014vg、1×1015)。用于滴定AAV的方法描述于Clark等人，《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》,10:1031-1039(1999)中。
组合物的有效剂量的给予可通过本领域的标准途径进行，所述途径包括但不限于，肌内、肠胃外、静脉内、口服、口腔、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到所治疗的疾病状态和表达ANO5蛋白质的靶细胞/组织，本领域技术人员可以选择和/或匹配给予途径和本发明的rAAV的AAV组分(特别地AAV ITR和衣壳蛋白)的血清型。在一些实施方案中，途径是对患者的四头肌的一次或多次肌内注射。在一些实施方案中，途径是对患者四头肌的三个主肌群的每个的一次或多次肌内注射。
特别地，本发明的rAAV的实际给予可以通过使用将rAAV重组载体运输到动物靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明的给予包括但不限于注射到肌肉、血流中和/或直接注射到肝脏中。已经证实简单地将rAAV重悬于磷酸盐缓冲盐水中足以提供可用于肌肉组织表达的载体，并且对可以与rAAV共给予的载体或其他组分没有已知的限制(但是以正常方式使用rAAV时，应当避免降解DNA的组合物)。rAAV的衣壳蛋白可以被修饰以使得rAAV靶向所感兴趣的特定靶组织诸如肌肉。参见例如WO 02/053703，其公开内容通过引用并入本文。药物组合物可制备成可注射制剂或局部制剂以通过透皮运输递送至肌肉。先前已开发了许多用于肌内注射和透皮运输的制剂，并且所述制剂可用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用以便于给予和处理。
对于肌内注射的目的，可以采用在佐剂诸如芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，此类水溶液可以被缓冲，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。呈游离酸的rAAV(DNA含有酸性磷酸基团)或药理学上可接受的盐的溶液可以在适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合的水中制备。rAAV的分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就这一点而言，采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体性达到可易于注射性的程度。在制造和储存条件下，所述组合物必须稳定且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散状况下维持所需粒子大小，并且通过使用表面活性剂来维持。对微生物作用的防止可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来使可注射组合物的吸收延长。
无菌可注射溶液是通过将适当溶剂中所需量的rAAV与以上列举的各种其他成分(根据需要)合并，随后进行过滤灭菌来制备。通常，通过将灭菌活性成分合并到包含基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。
用rAAV的转导也可以在体外进行。在一个实施方案中，将所需的靶肌肉细胞从受试者中取出、用rAAV转导并重新导入受试者。可替代地，可以使用同系或异种肌肉细胞，其中那些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于转导和将转导的细胞重新导入到受试者中的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，可以通过以下方式来体外转导细胞：将rAAV与肌肉细胞例如在合适的培养基中组合，并且使用常规技术诸如Southern印迹和/或PCR，或通过使用选择性标记筛选具有所感兴趣的DNA的那些细胞。然后可以将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术诸如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，或通过使用例如导管注射到光滑肌和心肌中将组合物引入到受试者中。
用本发明rAAV转导细胞导致在ANO5蛋白的持续表达。因此，本发明提供了向动物，优选人类给予/递送表达ANO5的rAAV的方法。这些方法包括用本发明的一种或多种rAAV转导组织(包括但不限于组织诸如肌肉、器官诸如肝脏和脑，以及腺体诸如唾液腺)。转导可以用包含组织特异性控制元件的基因盒进行。例如，本发明的一个实施方案提供了由肌肉特异性调控元件指导的转导肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述肌肉特异性调控元件包括但不限于衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的肌动蛋白和肌球蛋白家族，诸如来自myoD基因家族的那些[参见Weintraub等人，《科学(Science)》,251:761-766(1991)]、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》11:4854-4862(1991)]、衍生自人骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人，《分子细胞生物学(Mol CellBiol)》,7:4089-4099(1987)]、心肌肌动蛋白基因的控制元件、肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》,9:3393-3399(1989)]和鼠科肌酸激酶增强子(mCK)元件，诸如MCK7或tMCK(其是小鼠mCK的三重拷贝)、衍生自骨骼快缩肌肌钙蛋白C基因、慢速颤搐心肌肌钙蛋白C基因和慢速颤搐肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导型核因子(Semenza等人，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》,88:5680-5684(1991))、类固醇诱导型元件和启动子，包括糖皮质激素应答元素(GRE)[参见Mader和White，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》90:5603-5607(1993)]以及其他控制元件。
肌肉组织是用于体内基因递送和基因疗法的有吸引力的靶标，因为它不是生命器官，并且易于接近。本发明考虑了由转导的肌纤维持续表达生物活性ANO5蛋白。
“肌肉细胞”或“肌肉组织”意指衍生自任何种类的肌肉(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，诸如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和心成肌细胞。因为肌肉组织易于接近循环系统，所以肌肉细胞和组织在体内产生并分泌的蛋白质在逻辑上将进入血流用于全身递送，从而从肌肉提供持续的、治疗水平的蛋白质分泌。
术语“转导”是用于指在体内或体外经由本发明的复制缺陷型rAAV将ANO5DNA给予/递送到受体细胞，从而导致受体细胞表达功能性ANO5蛋白。
抗氧化剂组合物
骨骼肌收缩过程中产生活性氧簇是公认的。在长时间运动过程中，这些氧化剂的量增加造成对蛋白质和脂质的损害，并导致激活多重应激应答信号传导途径(Powers等人,《自由基生物医学(Free Radic Biol Med)》51:942-50(2011))。因此，若干个研究已经考察了使用长期抗氧化剂补充作为缓解骨骼肌中的氧化应激的手段。最近的一项研究报道，补充到雌性小鼠的饮食中的三种抗氧化剂(维生素E、α-硫辛酸和辅酶Q10)的配方改善了跑步性能以及线粒体功能的标记(Abadi等人，《公共科学图书馆：综合(PLoS One.)》8:e60722(2013))。然而，其他人已经报道了类似修改的饮食(维生素E+α-硫辛酸)减少大鼠中的线粒体生物发生(Strobel等人，《运动训练医学和科学(Med Sci Sports Exerc.)》43:1017-24(2011))。目前，本领域尚未达成长期抗氧化剂补充对骨骼肌健康影响的共识，并且对因疾病而减弱的肌肉的关注很少。然而，本发明提供了抗氧化剂饮食对Ano5-/-小鼠的骨骼肌提供有益作用的证据。
抗氧化剂
本发明提供了抗氧化剂组合物的给予，以改善罹患肌营养不良症的受试者的肌肉生理学和功能。本文公开的抗氧化剂组合物利用至少一种抗氧化剂。此外，本发明提供了包含至少两种或至少三种抗氧化剂的抗氧化剂组合物，并且在这些组合物中，抗氧化剂将具有不同的细胞功能。优选的抗氧化剂是已经显示出特别地逆转作为衰老产物的线粒体损害的抗氧化剂。例如，本发明提供了抗氧化剂组合物，其包含以下中的至少一种：辅酶Q10、α硫辛酸、类胡萝卜素(α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、虾青素、角黄素以及玉米黄质)、维生素诸如维生素A(视黄醇、3,4-二脱氢视黄醇和3-羟基视黄醇)、维生素C(抗坏血酸)和维生素E(α-生育酚)、维生素辅因子、多酚和类黄酮(白藜芦醇、姜酚、姜黄素)或矿物质(铁、镁、硒、铜、锌、锰、碘化物)。在优选的实施方案中，这些抗氧化剂是辅酶Q10、维生素E、α-硫辛酸。
辅酶Q10(也称为Q10、维生素Q10、泛醌、泛癸利酮或辅酶Q)是脂溶性物质。辅酶Q10是一种电子穿梭化合物，对电子传递链(ETC)至关重要。ETC驱动ATP合成，这是细胞能量的重要来源。维生素E，也被称为α-生育酚，是膜(包括线粒体膜)的重要组分，并具有清除脂质自由基的功能。
α-硫辛酸，也称为硫辛酸(thioctic acid)，是从辛酸衍生的有机硫化合物，其是线粒体脱氢酶诸如丙酮酸脱氢酶使克雷布斯(Krebs)循环功能正常而最终导致ATP产生的必需辅因子。α-硫辛酸还通过激活AMPK，即细胞中经由PGC1α调控线粒体生物发生的能量传感器也具有直接的骨骼肌作用。
多酚包括酚酸和类黄酮。例如酚酸包括原儿茶酸、没食子酸、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸诸如咖啡酸、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、花青素诸如矢车菊素、花葵素、芍药素、飞燕草素和锦葵色素。示例性类黄酮包括黄酮醇诸如槲皮素、山奈酚、杨梅素、黄酮诸如芹菜素和木犀草素、黄烷酮诸如橙皮素、柚皮素和圣草酚、异黄酮诸如黄豆苷元、染料木黄酮和黄豆黄素以及单体黄酮醇诸如儿茶素和表儿茶素。
给予和给药
本公开提供了用于使用至少一种抗氧化剂治疗肌营养不良症和慢性肌肉耗损的材料和方法。治疗肌营养不良症的示例性组合物和方法包括给予至少一种抗氧化剂或给予至少两种抗氧化剂或给予至少三种抗氧化剂。例如，本发明提供了包含α-硫辛酸、辅酶Q10和α-生育酚(也称为维生素E)的抗氧化剂组合物。在一些实施方案中，本文公开的抗氧化剂组合物可以单独给予或与包含编码ANO5蛋白或其功能活性片段的核苷酸序列的AAV载体组合给予。
本公开的方法使用直接或间接地将药剂给予至哺乳动物受试者中的任何医学上接受手段进行，所述手段包括但不限于：注射、口服摄取、鼻内、局部、透皮、肠胃外、吸入喷雾、阴道或直肠给予。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、脑池内注射以及导管或输注技术。也涵盖通过皮内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或在特定部位手术植入进行给予。
在一个实施方案中，给予是通过直接注射到位点或经由可以在内部递送制剂的持续递送或持续释放机构而在需要治疗的受影响组织(例如肌肉)处进行。例如，能够持续递送组合物(例如，可溶性多肽、抗体或小分子)的可生物降解的微球体或胶囊或其他可生物降解的聚合物构型可以被包含在植入受影响组织处或附近的本公开制剂中。
在一些实施方案中，抗氧化剂和包含ANO5的AAV载体的并行给予不需要药剂同时或通过相同途径给予，只要在药剂发挥其治疗效果期间存在时间段上的重叠即可。考虑同时或依序给药，如在不同的天或周给予。
在一些实施方案中，抗氧化剂和/或AAV载体组合物也可以在多个位点递送至患者。可同时给予多次给予，或者可以在一段时间内进行多次给予。在某些情况下，提供治疗组合物的连续流动是有益的。附加疗法可以基于时间段，例如每小时、每天、每隔一天、每周两次、每周三次、每周、每2周、每3周、每月地或以较长间隔给予。
可以考虑本公开的药剂可以在同一制剂中同时给予。进一步考虑到，药剂以单独的制剂给予并且并行给予，其中并行是指药剂在彼此的30分钟内给予。
因此，本发明提供了向有需要的患者给予有效剂量(基本上同时给予的剂量或以一定间隔给予的剂量)的编码例如ANO5的rAAV和/或抗氧化剂的方法。
在给定剂量中的抗氧化剂组合物的量可以根据待给予疗法的个体大小，以及所治疗的病症的特征而变化。在示例性治疗中，可能需要给予包含约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％硫辛酸、约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％辅酶Q10以及约10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000IU的抗氧化剂饮食。这些浓度可以作为单一剂型或多剂量给予。标准剂量反应研究，首先在动物模型中，然后在临床测试中，揭示了特定疾病状态和患者群体的最佳剂量。
同样将显而易见的是，如果传统的治疗剂与本公开的治疗剂组合给予，则给药可以进行修改。
实施例
实施例1
Ano5-/-小鼠模型的分离和生成
使用靶向来自外显子8至外显子9的Ano5的载体生成Ano5敲除模型以产生如图1A所述的截短转录物。靶向构建体被设计为“敲除第一”条件就绪构建体，以便通过剪接生成至lacZ捕获元件的无效等位基因，如Tesla等人描述的(《创世纪(Genesis)》38,151-158(2004)。这种lacZ标记的突变体等位基因Ano5:tm1a(KOMP)Wtsi靶向载体获自UC DavisKOMP库(PG00097_Z_1_G0；Karnes.《自然(Nature)》474,337-342(2011)。如果注意到胚胎致死性，则将靶向盒插入在外显子8之后，所述外显子8侧接存在的FRT和loxP位点以生成条件性等位基因。
在靶向和转移胚胎干细胞之后，通过基因组PCR验证基因型(图1b)。通过RT-PCR使用跨越外显子1-6(E1-6)或外显子17-20(e17-20)的以下引物组筛选克隆，所述RT-PCR从内源性Ano5基因座产生300bp扩增子，并且从Ano5基因盒插入基因座产生200bp扩增子，如图1c所示：
基因分型F 5'-AGTCCTTTTCAGCACAGTCTTTG-3'(SEQ ID NO:3)
基因分型R 5'-TGAGGCAGTGTGGAGTGAGTA-3'(SEQ ID NO:4)
DF38700 5'-GCCAATCATATGGTCTCAGT-3'(SEQ ID NO:5)
LR-loxp R 5'-ACTGATGGCGAGCTCAGACC-3'(SEQ ID NO:6)
然后将成功靶向的ES细胞注射到C57BL/6小鼠的囊胚，并且将胚胎转移以生成用于种系传递的嵌合体。转基因杂合体通过基因分型验证，并且将其与C57BL/6野生型回交4次，之后培育为纯合子。将Ano5-/-和C57BL/6小鼠的种群在RINCH动物园中，于标准化条件下培育并维持为纯合型动物。以Teklad全球啮齿动物饮食(3.8％纤维，18.8％蛋白质，5％脂肪食物)饲喂它们，具有12:12h的黑:暗循环。
定量PCR在快速实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))上进行和分析。对于Ano5(Mm00624629_m1,Mm01335981_m1)、Ano6(Mm00614693_m1)以及Gapdh(Mm99999915_g1)用应用生物系统公司(Applied Biosystems)引物-FAM探针混合物运行反应，对于每个样品一式三份。使用ΔΔCt方法来计算Ano5-/-肌肉中的Ano5和Ano6mRNA相比于野生型的归一化倍数变化减少量。根据制造商方案，使用Trizol(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carslbad,CA)将总RNA从新鲜冷冻肌肉薄片中分离。然后使用RNAEasy方法(加利福尼亚州瓦伦西亚市的凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA))对RNA进行柱纯化，并使用NanoDropLite(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA))通过分光光度法进行定量。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，使用每个反应等量的样品RNA(200-500ng)生成cDNA。对于半定量PCR，将等体积的cDNA进行30个PCR循环，然后进行琼脂糖凝胶电泳。使用的引物是：
mβACt-rt-5' CCTGGCCGTCAGGCAGAT(SEQ ID NO:7)
mβAct-rt-3' GACATGGAGAAGATCTGGCACC(SEQ ID NO:8)
mAno5-rt-F1 CCAACAGAATGAGAACCT(SEQ ID NO:9)
mAno5-rt-R1 GACAGGGGTGGGTACTTTGG(SEQ ID NO:10)
mAno5-rt-F3 CGTTGGCAGCAAGATCAT(SEQ ID NO:11)
mAno5-rt-R3 GGGTACCTATAATCTCTGTACCTGC(SEQ ID NO:12)
定量RT-PCR展示出在所有测试的肌肉中盒前转录物的约80％的减少和盒后ANO5转录物的>99％的减少(图1d)。没有注意到胚胎致死性或培育困难。因为Ano5与Ano6共享显著的序列同源性，并且已知Ano6在一些条件下表达于骨骼肌中，所以进行RT-PCR以测量Ano5-/-小鼠肌肉的ANO6cDNA的相对表达。定量RT-PCR展示出Ano5缺陷型肌肉中Ano6转录物的适度但在统计学上不显著的升高。
实施例2
Ano5-/-小鼠的临床和组织病理学评价
Ano5-/-小鼠表现出人ANO5肌病所特有的特征，包括血清肌酸激酶水平升高、肌肉中可变性无力、改变的肌纤维直径以及运动不耐性。Ano5-/-小鼠中血清肌酸激酶升高约2倍(图2a)。
从10月龄小鼠的趾长伸肌(EDL)(n＝6只小鼠/品系)、4月龄小鼠的胫骨前肌(TA)(n＝5只小鼠/品系)，以及10月龄Ano5-/-和WT小鼠的膈膜肌肉(n＝4只小鼠/品系)获得强直性力测量。将EDL在肌腱上切下并进行生理学方案以评估功能，如由Rodino-Klapac等人(《转化医学杂志(J.Transl.Med.)》5:45,2007)和Liu等人(《分子治疗(Mol.Ther.)》11:245-256,2005)先前所述那样，并进行了修改。在离心收缩方案期间，在500与700ms之间执行5％拉伸-再拉长程序(在100ms内拉伸5％，然后在100ms内返回到最佳长度)。在强直性收缩和偏心收缩方案后，使小鼠安乐死，并将肌肉切下、湿法称重、使用黄蓍胶固定在吸盘上，然后冷冻在用液氮冷却的甲基丁烷中。进行TA中的力测量，如通过Hakim等人(《应用物理学杂志(J.Appl.Physiol.)》110:1656-1663,2011)和Wein等人(《自然医学(Nat.Med.)》20:992-1000,2014)所述的那样。
对于膈膜力的测量，使小鼠安乐死并且在肋骨附着物和中心腱完整的情况下切下膈膜，并将其放置在Krebs-Henselet(KH)缓冲液中，如由Beastrom等人(《美国病理学(Am.J.Pathol.)179:2464-2474,2011)、Rafeal-Fortney等人《循环(Circ.)》124:582-588,2011)以及Grose等人(《临床和转化神经病学纪事(Ann.Clin.Trans.Neurol.)》1:34-44,2014)先前所述的那样。分离了膈膜的2-4mm宽的切片。用编织外科丝线(6/0；宾夕法尼亚州雷丁的外科专用器械公司(Surgical Specialties,Reading,PA))将膈膜条牢固地系接在中心腱处，并且穿过附连到条远端的肋骨部分缝合。将每个肌肉转移到填充有保持在37℃的含氧K-H溶液的水浴中。将肌肉水平对齐，并直接系接在固定针与双模态力换能器-伺服电机(305C；加拿大安大略湖奥罗拉的Aurora Scientific公司(Aurora Scientific,Aurora,Ontario,Canada)之间。将两个铂片电极放置在器官浴中，以便在肌肉长度的侧面。将肌肉拉伸至1g的最佳张力，然后在开始强直性方案之前使其静息10分钟。一旦肌肉稳定下来，使肌肉经受准备活动，所述准备活动由每30秒一次的三次1Hz颤搐，然后每分钟一次的三次150Hz颤搐组成。在3分钟静息期后，以20、50、80、120、150、180Hz刺激膈膜，在每次刺激之间允许2分钟的静息期，每次刺激的持续时间为250ms，以确定最大强直性力。测量肌肉长度和重量。将力针对肌肉重量和长度进行归一化(CSA：肌肉量(mg)/{Lf(mm)×肌肉密度(1.06mg/mm3)})。统计学显著性对于比力使用未配对的学生T检验评估并且对于对离心收缩方案的耐受性使用伴有重复测量的2因子ANOVA评估。
肌肉收缩的比力在Ano5-/-小鼠的膈膜中显著降低约15％(图2b)，但在趾长伸肌(EDL)和胫骨前肌(TA)肌肉中基本上不受影响(图2c)。肌肉之间的这种可变性是ANO5肌病的所特有的，并且也在不同肌肉的组织学分析中观察到。相对于野生型(WT)，平均肌纤维直径在Ano5-/-小鼠的腓肠肌(GAS)肌肉中显著更小(Ano5-/-35.8±8.3μm，WT：41.8±11.0μm，P<0.001)，并且在TA肌肉中稍小(Ano5-/-38.1±11.8μm，WT：44.3±12.2μm，P<0.001)(图2d、e)。Ano5-/-肌肉表现出轻度的组织病理，包括中心核和偶尔的坏死纤维(图2d、e)。
为了评价运动耐受性，使7.5月龄的匹配Ano5-/-和WT小鼠进行运动方案，每周1小时，持续2个月。使每只小鼠以-10°斜面每周跑步一次，速度为15米/分钟，并且每分钟增加1米，直到达到疲劳(n＝3只小鼠/品系)。当小鼠停留在设置为20V电刺激的电击板(哥伦布仪器公司(Columbus Instruments))上超过10秒的而不尝试进行运动时，将每个单独的测试都停止。间歇时间定义为在跑步机带返回至电击板时小鼠停止跑步并休息的时间。虽然WT对照小鼠以一致的速度跑步而没有中断，但是Ano5-/-小鼠在跑步机上倾向于频繁间歇(14次停顿/分钟)，其中它们停止跑步直到跑步机带返回到电击板(图2f)。
对6-8月龄的Ano5-/-和对照肌肉进行电生理学，使用的方法类似于Arnold等人(《临床和转化神经病学纪事(Ann.Clin.Trans.Neurol.)》1:34-44,2014)中所述的那些方法。使用吸入的异氟烷麻醉小鼠，并将其以卧姿放置，其中后肢伸出距离动物身体以45o。在突变体小鼠(n＝6只动物，12只后肢)和对照(n＝7只动物，14只后肢)小鼠中，在超大坐骨神经刺激后，从双侧小腿三头肌肌肉测量复合肌肉动作电位(CMAP)幅值。在右侧GAS肌肉中进行针式肌电描记术以评估是否存在纤颤电位。使用Skulpt公司EIM1103系统(加利福尼亚州旧金山(San Francisco,Ca))以1000Hz-10MHz的频率在双侧GAS肌肉中进行局部阻抗测量或电阻抗肌动描记术(EIM)，使用的方法类似于先前在肌萎缩性侧索硬化症和肌营养不良症的模型中报道的那些方法(Li等人《公共科学图书馆：综合(PLoS One)》8:e65976,2013；Li等人《肌肉和神经学(Muscle&Nerve)》49:829-835,2014)。使用具有隔开1mm的四个26规格绝缘肌电描记术针电极(威斯康星州米德尔顿的纳图斯公司(Natus,Middleton,WI)的固定电极阵列代替表面电极。将电极阵列以相对于肌纤维方向的纵向构型插入到双侧腓肠肌的肌腹中，并且在每个肌肉中获得两次试验的阻抗测量并对每个肢体的单个值取平均值(对于每组n＝6只动物，12只后肢)。使用先前公布的EIM研究的惯例并且为了简单起见，以两种电流频率(50kHz和100kHz)分析电抗、电阻和相位。使用双尾t检验比较CMAP幅值和阻抗特性。在Ano5-/-和WT小鼠的后肢中进行针式肌电描记术、诱发的复合肌肉动作电位记录和肌动描记术，但没有显示出显著变化，这类似于人疾病(图3)。
人ANO5肌病的另一个特有特征是存在过多数量的具有肌内沉积物的肌纤维。从6月龄的Ano5-/-和WT品系对照小鼠的TA和腓肠肌(GAS)肌肉测定肌肉横截面纤维直径(n＝3只小鼠/品系)。将肌肉切片并用苏木精和伊红(H&E)染色。用Zeiss AxioCam MRC5相机获取每只动物每个切片的4张随机20x图像。使用Zeiss Axiovision LE4软件通过测量穿过肌纤维的最短距离来确定纤维直径。纤维直径直方图由每个TA平均500-600个纤维和每个GAS600-700个纤维生成。使用不成对的t检验来测试Ano5-/-和WT纤维尺寸之间的显著差异(****p<0.0001)。
对肌肉内聚集体进行定量。使用Gomori三色法对10月龄的Ano5-/-和WT小鼠(n＝3只小鼠/组织和品系)的TA和GAS肌肉的肌肉切片进行染色。获取四张20X图像，并使用ImageJ软件对具有一个或多个聚集体的纤维进行计数，并将其表示为纤维总数的百分比。使用GraphPad Prism，使用单因子ANOVA来测试Ano5-/-与WT纤维之间的显著性(****p<0.0001)。
此外，对聚集体和肌肉进行琥珀酸脱氢酶染色(SDH)：将胫骨前肌(TA)和四头肌以18μm切片并用由溶解在0.1M琥珀酸中的0.2％的硝基四氮唑蓝(NBT)和pH为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液组成的SDH溶液染色，并且在37℃温育3小时。温育后，将载玻片用水冲洗并在系列醇中脱水，然后用二甲苯澄清化。将载玻片在Zeiss AxioCam MRC5相机上成像。
将4个月龄和10月龄的Ano5-/-和对照小鼠的TA肌肉节段切除，在木制压舌板上拉伸至其原位长度并浸入于pH为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中的3％戊二醛中，持续4小时。将肌肉切成2mm长的组织块，在pH为7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中储存过夜，随后在1％四氧化锇中后固定2小时并在梯度乙醇溶液中脱水，之后进行塑料包埋。用甲苯胺蓝染色1μm厚的横截面，通过光学显微镜检查，并且利用先进显微镜技术公司(Advanced MicroscopyTechniques)相机和软件在Hitachi H-7650TEM电子显微镜下检查选定块的组织切片。
在Ano5-/-小鼠肌肉中，这些结构表现为边界清楚的，用改进的三色法染色染红的轮廓不规则区域，如在Pavlocicova等人(《普通生理学和生物物理学(Gen.Physiol.Biophysics)》22:425-440,2003)中所述。细胞质聚集体在9个月大时开始明显并随时间增加(图4a)。因为在正常老龄小鼠中已经注意到类似外观的聚集体，所以对聚集体出现进行定量。大约25％的Ano5-/-纤维在三色法染色时显示轮廓不规则的红色区域，而<0.02％的对照纤维具有这些聚集体(图4b)。电子显微镜(EM)揭示这些聚集体由膜质材料组成。许多Ano5-/-肌纤维表现出囊状或管状膜的密集堆积的积聚体，或具有带绒毛的内部小管的随意取向且松散堆积的互连管状结构，它们对应于光学显微镜中观察到的聚集体(图4c、d)。ANO5-/-小鼠显示出与确诊的ANO5患者类似的病理发现。具有对于ANO5基因编码区中的两个突变[c.155A>G(p.Asn52Ser)]+[c.191dupA(p.Asn64Lysfs*15)]杂合的化合物的患者肌肉电子显微镜检查揭示出许多聚集体和显示变性线粒体区域的多个位点。Ano5-/-肌肉中的聚集体对SERCA1染色呈阳性，但对琥珀酸脱氢酶(SDH)活性染色不呈阳性，这表明它们衍生自肌浆网而非线粒体(图4g)。然而，除了这些膜聚集体之外，Ano5-/-小鼠确实表现出变性线粒体和肌膜下线粒体积聚(图4e)。通过针对SDH的冰冻切片进行染色确认了线粒体的肌膜下积聚，所述SDH局部存在于肌纤维表面附近的致密补片中(图4f)。为了鉴定观察到的线粒体变性是否具有功能重要性，将柠檬酸合酶活性定量为完整线粒体的量度，并且证实与WT对照相比，Ano5-/-肌肉提取物显著降低
实施例3
Ano5促进膜修复
在健康个体中，正常运动导致质膜中的小病变，这些小病变通过两个过程愈合：(i)小的撕裂通过新质膜的组装重新密封；(ⅱ)更严重破坏的位点通过卫星细胞修复，所述卫星细胞分化为成肌细胞样细胞并融合以再生多核肌纤维。为了测试ANO5表达丧失对膜修复的影响，检查了由传递至分离的趾短屈肌(FDB)肌纤维的强激光脉冲产生的膜损害效应。将12μm冷冻切片置于Fisher Superfrost显微镜载玻片上，并在室温下用10％山羊血清和0.1％吐温20的PBS溶液封闭1小时。将载玻片在室温下在一抗(抗-FLAG F7425西格马阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)，1:175)、Serca1CaF2-5D2(发育研究杂交瘤库(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank)，1:50)中温育1小时。然后在室温下用PBS将载玻片漂洗3次，持续1小时，随后进行30分钟的封闭。将与Alexa Fluor 594(A21125，生命技术公司)缀合的山羊抗小鼠或与Alexa Fluor 568(A11011，生命技术公司)二级抗体缀合的山羊抗兔在封闭溶液中以1:250稀释并温育45分钟，随后进行3次PBS冲洗，持续1小时。这些切片用Vectashield(加利福尼亚州伯灵格姆的矢量实验室(Vector Labs,Burlingame,CA)介质固定，并使用Cy5滤光片(激发，578nm-590nm；发射603nm-671nm)(纽约州索恩伍德的蔡司(Zeiss,Thornwood,NY)通过Zeiss Axioskop 2显微镜分析。针对每种抗体，每天使用阳性对照对图像暴露时间进行标准化。使用Axiovision 4.5软件获取图像。
膜损害通过FM1-43即膜不渗透性苯乙烯基阳离子染料的积聚评估，所述染料在水性溶液中不具荧光性，但在脂质环境中发明亮的荧光并已被广泛用于研究膜修复。激光损伤后立即在WT和Ano5-/-纤维的损害部位检测到小面积的荧光(图5a)。与WT纤维相比，Ano5-/-肌纤维中的荧光增加较大并且以约2倍快的初始速率发生。虽然WT中荧光在190秒时似乎趋于呈平稳状态，但Ano5-/-纤维中的荧光在整个实验期间持续增加(图5b)。
为了测试膜修复缺陷是否直接与ANO5表达相关，使用Ano5-/-肌肉中的腺相关病毒(AAV)表达人ANO5cDNA(图4b、c)。使用MHCK7启动子与聚腺苷酸化信号之间的Not1限制性位点将人ANO5cDNA(SEQ ID NO:1)克隆到AAV2ITR质粒中。通过修改的交叉包装方法产生rAAV载体，由此可将AAV 2型ITR包装到多种AAV衣壳血清型中，如Rabinowitz等人(《病毒学杂志(J.Virol.)》76:791-801,200)所述。使用HEK293细胞通过标准的3质粒DNA CaPO4沉淀法实现产生。将HEK293细胞维持在补充有10％加强型小牛血清(CCS，Hyclone)的DMEM中。产生质粒是：(i)pAAV.MHCK7.ANO5、(ii)编码cap血清型8样分离物rh.74的rep2-cap8修饰的AAV辅助质粒，以及(iii)表达腺病毒E2A、E4ORF6和VA I/II RNA基因的腺病毒5型辅助质粒(pAdhelper)。通过依序碘克沙醇梯度纯化和使用线性NaCl盐梯度的阴离子交换柱色谱法从澄清的HEK293细胞裂解物中纯化载体，如先前Clark等人(《人类基因治疗(Human GeneTher.)》10:1031-10398,1999)中所述。使用基于定量PCR的滴定方法测定衣壳载体基因组(vg)滴度，利用了Prism 7500Taqman检测器系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems,Carlsbad,CA))。
AAV载体通过肌肉注射递送到小鼠肌肉。通过将1×1011vgrAAVrh.74.MHCK7.huANO5.FLAG肌内注射到TA(n＝4)或FDB(n＝4)肌肉中治疗4-5周龄的Ano5-/-小鼠。注射后4周收获TA肌肉并对其进行组织学和免疫荧光检查。
处理后10周收获趾短屈肌(FDB)肌纤维并对其进行激光诱导损伤。在Ano5-/-(n＝4)和年龄匹配的C57BL6(n＝4)小鼠的左右FDB肌肉上进行膜修复测定，如Sondergaard等人(《临床和转化神经病学纪事(Ann.Clin.Trans.Neurol.)》2:256-270,2015)中所述。简言之，使用悬浮于DMEM中的含有2％w/v I型胶原酶的溶液分离FDB纤维。解离肌肉后，将纤维置于装有于补充有1.5mM Ca 2+的Dulbecco’s PBS(无Ca/Mg)中的2.5μM FM1-43染料的玻璃底皿中。使用
Figure BDA0001728628250000321
FV1000双光子共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯株式会社(Olympus))对纤维进行激光损伤。以20％的功率用4.479mm的850nm激光引导斑点使纤维受损，并且每5秒成像一次，持续190秒以可视化FM1-43染料吸收。每只小鼠每个肌肉成像平均7-10根纤维(总共为WT30根，Ano5-/-39根，AAV-ANO5挽救的Ano5Ano5-/-纤维30根)。用ImageJ软件通过测量限定区域内像素强度的积分密度来分析膜上损害部位周围的染料渗入的荧光强度。为此，在ImageJ上的2倍变焦的设置下，绘制0.75像素×1.00像素的矩形框，并且将所述矩形框用于测量该区域中染料的强度。在分析中，将在各个时间点测量的荧光强度归一化至t＝-5s(损伤前)测量的初始强度。当分析荧光强度时，将来自每个品系的所有纤维的值一起平均。进行2因子ANOVA以确定在每个时间点处理纤维与未处理纤维之间的统计学显著性(p<0.001)。为了定量荧光的变化，使用Origin Pro 9.1将数据点拟合至Hill方程。所有曲线均符合调整的R2>0.998。Ano5-/-纤维、WT纤维和AAV.ANO5处理的no5-/-纤维在损伤后100秒开始显著不同。AAV.ANO5部分恢复了Ano5-/-肌肉中的膜再密封(图5a、b、c)。
实施例4
Ano5KO小鼠中的受损再生
通过检查肌肉从由心脏毒素注射产生的损伤中恢复的能力，对Ano5-/-小鼠中的肌肉再生是否也是缺陷的进行调查(图5d)。将小鼠用吸入的异氟醚麻醉，并且每两周注射心脏毒素(用无菌生理盐水稀释至10μM)，总共3轮。将30μL和50μL心脏毒素分别注射到8周龄Ano5-/-小鼠和年龄匹配的对照的左侧TA和左侧GAS肌肉中。将无菌盐水注射到作为模拟对照的对侧肌肉中。在最后一次心脏毒素注射后1、3、7和14、30和90天，将小鼠安乐死并收获其肌肉(n＝3只小鼠/品系/时间点)。在最后一次心脏毒素注射后1和3个月，使用AxioVision 4.8对H&E染色的冷冻切片成像四张20X图像/TA，并测量纤维直径。测量平均500-600根肌纤维并进行不成对的t检验(GraphPad Prism)以确定损伤的Ano5-/-小鼠和损伤的对照小鼠的肌纤维尺寸之间的统计学显著性(****p<0.0001)。
为了跟踪坏死和再生的时间变化，将8周龄小鼠的TA和GAS肌肉用心脏毒素注射3次，间隔为2周。在最后一次注射后1、3、7、14、30和90天收获组织(图5d)。将对侧用作生理盐水对照。心脏毒素处理后，WT肌肉再生，因此到1个月，除了新的再生纤维中的中心核外，肌肉基本上表现正常。然而，在Ano5-/-小鼠中，存在广泛的再生延迟和长期坏死。3个月后，与WT相比，Ano5-/-肌肉的平均纤维直径仍显著减少，并且许多纤维表现出中心核(图5d、e)。
实施例5
评估抗氧化剂疗法的作用
为了检查三重抗氧化剂饮食对Anoctamin 5缺陷型(Ano5-/-)小鼠的骨骼肌的潜在益处，向2月龄的野生型(WT)BL6小鼠和Ano5-/-小鼠的组群喂养正常小鼠食物或补充有三重抗氧化剂组合物的饮食，所述三重抗氧化剂组合物包含1000IU维生素E、0.1％α-硫辛酸和0.25％辅酶Q10(以还原的泛醇形式)。使小鼠跑步至疲劳，每4周进行连续的3天，持续16周的时间，并且将小鼠处死以检查与肌肉健康(活性和膈膜力)和氧化应激(柠檬酸合酶活性和PGC1α表达)相关联的功能性结果测量值。
激光监测旷场笼活动
根据先前描述的方案(Kobayashi等人，《自然(Nature)》456:511-5(2008)；Beastrom等人，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》179:2464-74(2011))，使用旷场活动室来确定实验小鼠的总体活性，并进行了一些修改。在接近小鼠最活跃的夜间周期结束的凌晨，在每天的相同时间对所有小鼠进行测试。所有小鼠都在隔离房间中于暗光下进行测试，并且每次使用相同的处理器。此外，正如在先前的报告中所做的那样，为了减少焦虑并保持行为变量最小化(这些可能会影响小鼠的正常活动并因此影响测定结果)，我们测试了非单独饲养的小鼠(Voikar等人，《基因、大脑和行为(Genes Brain Behav)》4:240-52(2005))。使用光束活动系统(Photobeam Activity System)(San Diego Instruments，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))对小鼠进行活动监测。该系统使用不可见的红外光束的网格，这些光束横穿动物室前后以及左右以监视小鼠在XYZ平面内的位置和移动。以5分钟间隔记录活动，持续1小时循环。开始数据采集前数天，使小鼠适应活动测试室，持续初始的1小时时段。将小鼠分4个组在单独室中进行测试。在每次使用之间对测试设备进行清洁以减少可能改变结果的小鼠反应行为变量。将收集的数据转换为Microsoft Excel工作表，并且所有计算均在Excel程序中完成。将在X和Y平面中移动的单个光束中断数累加以表示总走动量，并且将在Z平面中的光束中断数累加以获得在1小时的时间间隔内的垂直活动。
在第12和16周结束时，将来自各组的两只小鼠置于活动笼中以监测自主活动。将小鼠总活动测量为小鼠在跑步机疲劳后45分钟内中断水平和/或垂直激光束的次数(图6)。发现接受抗氧化饮食的Ano5-/-小鼠在第16周时比标准(安慰剂)饮食的那些小鼠更活跃，这表明抗氧化剂对疲劳后的自主活动具有积极作用。
用于功能评估的膈膜强直性收缩
虽然行为分析均表明了一些治疗效果，但是这些结果测量值受到与饮食无关的若干个变量的影响。为了检查抗氧化剂补充对骨骼肌功能的影响，在小鼠Ano5-/-和WT小鼠的膈膜上进行力测量(图7)。选择膈膜是因为之前已经证实Ano5-/-小鼠的膈膜力不足，但在肢体肌肉中并非如此(Griffin等人，《人类分子遗传学(Hum Mol Genet)》25:1900-1911(2016))。
使小鼠安乐死并且在肋骨附着物和中心腱完整的情况下切下膈膜，并如先前所述那样将其放置在K-H缓冲液中(Beastrom等人，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》179:2464-74(2011)；Rafael-Fortney等人，《循环(Circulation)》124:582-8(2011)；Moorwood等人，《《可视化实验杂志(Journal of Visualized Experiments)》71:e50036(2013))。分离了膈膜的2-4mm宽的切片。用编织外科丝线(6/0；宾夕法尼亚州雷丁的外科专用器械公司)将膈膜条牢固地系接在中心腱处，并且穿过附连到条远端的肋骨部分缝合。将每个肌肉转移到填充有维持在37℃的含氧K-H溶液的水浴中。将肌肉水平对齐，并直接系接在固定针与双模态力换能器-伺服电机(305C；加拿大安大略湖奥罗拉的Aurora Scientific公司)之间。将两个铂片电极放置在器官浴中以便在肌肉长度的侧面。将肌肉拉伸至最佳长度以便测量颤搐收缩，然后在开始强直性方案之前使其静息10分钟。一旦肌肉稳定下来，将肌肉设定至1g的最佳长度，并且使肌肉经受准备活动，所述准备活动由每30秒一次的三次1Hz颤搐，然后每分钟一次的三次150Hz颤搐组成。在3分钟静息期后，以20、50、80、120、150、180Hz刺激膈膜，在每次刺激之间允许2分钟的静息期，每次刺激的持续时间为250毫秒，以确定最大强直性力。测量肌肉长度和重量。针对肌肉重量和长度将力归一化。与安慰剂治疗的ano5-/-小鼠相比，在三重抗氧化剂治疗的ano5-/-小鼠中观察到膈膜比力的显著改善(图7)。
线粒体生物发生
在建立重抗氧化剂疗法和氧化纤维含量的联系的情况下，分析了线粒体生物发生和功能。先前研究表明运动可以刺激导致线粒体生物发生的途径，而抗氧化剂疗法减少这种信号传导。对雄性腓肠肌组织的结果确认了抗氧化剂治疗降低线粒体生物发生PGC-1a的关键调控因子的表达(图8a)。有趣的是，在所有基因型-性别组合中，发现抗氧化剂喂养的小鼠中柠檬酸合酶活性更高(图8b)。对此的一个简单解释是，线粒体含量高的氧化纤维比例的增加掩盖了每根纤维线粒体生物发生的任何减少。
总之，发现三重抗氧化剂疗法对肌肉生理学和功能的一些测量值具有影响，所述测量值包括自主活动、膈膜强度、纤维尺寸、纤维型组成以及线粒体酶活性。在某些情况下，这些结果被发现是性别特异的。LGMD2L具有性别特异性，其中雄性受到的影响更为严重。
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Claims (12)

1.一种重组AAV载体用于制备用以治疗有需要的受试者的肌营养不良症的药物的用途，所述重组AAV载体包含可操作地连接至核苷酸序列的肌肉特异性控制元件，其中所述核苷酸序列是1）SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或2）编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质保留ANO5活性，其中所述受试者在ANO5基因中具有隐性突变。
2.一种重组AAV载体用于制备用以使有需要的受试者肌肉再生的药物的用途，所述重组AAV载体包含可操作地连接至核苷酸序列的肌肉特异性控制元件，其中所述核苷酸序列是1）SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或2）编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质保留ANO5活性，其中所述受试者在ANO5基因中具有隐性突变。
3.一种重组AAV载体用于制备用以治疗有需要的受试者的慢性肌肉耗损综合征的药物的用途，所述重组AAV载体包含可操作地连接至核苷酸序列的肌肉特异性控制元件，其中所述核苷酸序列是1）SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或2）编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质保留ANO5活性，其中所述受试者在ANO5基因中具有隐性突变。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述重组AAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh.74。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF元件、鼠科肌酸激酶增强子元件、MHCK7启动子、tMCK启动子、骨骼快缩肌钙蛋白C基因元件、慢缩心肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌钙蛋白I基因元件、缺氧诱导性核因子结合元件、类固醇诱导性元件或糖皮质激素反应元件（GRE）。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述受试者罹患肌营养不良症。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述受试者罹患dysferlin相关肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2L型、Miyoshi肌病3型、Bethlem肌病、远端肌病、结蛋白肌病、肌原纤维肌病、肌聚糖病或ZASP相关肌病。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述受试者罹患dysferlin病变。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于肌内或静脉内注射。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，还包括向有需要的受试者给予治疗有效量的抗氧化剂组合物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸、维生素、类胡萝卜素、维生素辅因子、矿物质、多酚或类黄酮中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述抗氧化剂组合物包含辅酶Q10、硫辛酸和维生素E。
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