JP7307121B2 - 筋ジストロフィーの治療方法 - Google Patents

Description

本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１１月１２日出願の
米国仮特許出願第６２／２５４５３９号及び２０１６年１１月９日出願の米国仮特許出願
第６２／４１９７９３号に対する優先権を主張するものである。

発明の分野
本発明は、ＡＮＯ５遺伝子を発現するＡＡＶベクター、ならびに筋肉再生を誘導する方
法及び筋ジストロフィーを治療する方法としての抗酸化剤療法を提供する。

移動運動及び呼吸等の日常活動ならびに全身代謝のための筋肉量及び筋力の重要性は明
白である。筋肉機能の欠損により、筋肉衰弱及び消耗を特徴とする筋ジストロフィー（Ｍ
Ｄ）が引き起こされ、生活の質に深刻な影響を与える。最も良く特徴付けられたＭＤは、
ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子におけ
る変異に起因する。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格繋留の損失に関連し
た膜脆弱性に起因する。対照的に、他のＭＤのサブセットは、筋鞘修復の欠陥によって引
き起こされると考えられる。収縮中に筋鞘が受ける機械的ストレスのため、健常な筋肉で
さえも、損傷した膜をパッチするための修復機構を常に必要としている。筋鞘パッチ修復
は、損傷部位における膜小胞の融合に依存し、このプロセスの減衰は、ジスフェルリンに
おける変異によって引き起こされるＭＤであるジスフェルリノパチーの主な原因と推定的
に考えられる。

近年、ジスフェルリノパチーと同様の特徴を有し、かつ筋鞘病変を特徴とする新たなＭ
Ｄが、ＡＮＯ５（ＴＭＥＭ１６Ｅ）における劣性変異に関係している。ＡＮＯ５変異によ
り、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）及び三好型ミオパチージストロフィー
３（ＭＭＤ３）が引き起こされる。ＡＮＯ５変異に関連する表現型は可変であるが、典型
的には、この疾患は、近位下肢衰弱、高血清中クレアチンキナーゼレベル、非対称筋萎縮
及び衰弱を伴って成人（２０～５０歳）に現れ、典型的には、ジスフェルリノパチーに類
似した筋鞘病変を伴う（Ｂｏｌｄｕｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８６，２１３－２２１（２０１０））、Ｈｉ
ｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ
１３４，１７１－１８２（２０１１）、Ｂｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ ｎ
ｅｕｒｏｌｏｇｉｑｕｅ １６８，１３５－１４１（２０１２））。現在までに、約７２
の異なるＡＮＯ５変異がＭＤ患者において報告されており、他の既知のＬＧＭＤ遺伝子に
おける変異を欠くＬＧＭＤ患者におけるＡＮＯ５変異についてのスクリーニングは、ＡＮ
Ｏ５変異がＬＧＭＤのより一般的な原因のうちの１つであり得ることを示す（Ｂｏｌｄｕ
ｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ８６，２１３－２２１（２０１０））、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ
：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３４，１７１－１８２（２０１１
）、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７８，８９７－９０３（２
０１２））。

アノクタミン／ＴＭＥＭ１６ファミリーは、２つのカテゴリに機能的に分けられている
。創立メンバーであるＡＮＯ１（ＴＭＥＭ１６Ａ）及びＡＮＯ２（ＴＭＥＭ１６Ｂ）がカ
ルシウム活性化クロライドチャネルをコードする一方で、他のＡＮＯは、クロライド電流
を伝導することができず、リン脂質スクランブリング（ＰＬＳ）におけるそれらの役割に
ついて特定されている。しかしながら、ＡＮＯ５は、骨格筋における新規の機能を提案す
るこれらの２つの活性のいずれかを呈することが見出されていない。この新規性を考慮し
て、ＡＮＯ５機能の欠損がＬＧＭＤ表現型をどのように誘発するか、具体的には、Ａｎｏ
５変異が臨床的に同様の方法でスフェルリン関連ＭＤになぜ現れるかは不明のままである
。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡ
ゲノムは、１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。
ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知であ
る。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔ
ａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）（Ｒｕｆｆ
ｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４
）により修正）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１完全ゲノムは、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－３完全ゲノムは、ＧｅｎＢ
ａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４完全ゲノムは、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎ
ｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎ
ｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７ゲノム及びＡＡＶ－８ゲノ
ムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７
５３２４９に提供されており（ＡＡＶ－８に関して、米国特許第７，２８２，１９９号及
び同第７，７９０，４４９号も参照のこと）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡ
Ｖ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供さ
れており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（
２００４）に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、本明細書に提供され
る。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色
体組込みを指示するＣｉｓ作用配列が、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター
（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅ
ｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現
を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオ
チド２１０７及び２２２７において）により連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５
及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８
、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイ
ルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモー
ターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする
。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパ
ク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ
位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１
５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクター
として魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であ
り、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは
、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可
能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的
に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存
続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミ
ド内のクローニングされたＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプ
シド形成、及び組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、内
部およそ４．３ｋｂのゲノム（複製タンパク質及び構造カプシドタンパク質をコードする
もの、ｒｅｐ－ｃａｐ）のいくらかは全てが、プロモーター、目的とするＤＮＡ、及びポ
リアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット等の外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ｒｅｐ
及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが
極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化す
るために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の
重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染
に耐性を示さない。

複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実
証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６
６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ
．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。さらに、
筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（
１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後
に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体
グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌
タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
本明細書に示されるように、マウスにおけるＡｎｏ５遺伝子の破壊により、いくつかの
ジストロフィー筋組織病理学的特徴、運動不耐性、筋鞘修復不全、及び筋芽細胞融合欠陥
が引き起こされる。加えて、提供されるデータは、これらの欠陥が、ＡＮＯ５によって媒
介される細胞内膜及び／または膜及び／または筋鞘膜動態の変化に関連することを実証す
る。本発明は、筋肉修復を誘導する方法及び／またはＭＤを治療する方法におけるＡｎｏ
５遺伝子を発現するＡＡＶベクターの使用に関する。

Ｂｏｌｄｕｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８６，２１３－２２１（２０１０） Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３４，１７１－１８２（２０１１） Ｂｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｕｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｑｕｅ １６８，１３５－１４１（２０１２） Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７８，８９７－９０３（２０１２） Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３） Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４） Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４） Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４） Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２） Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７） Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６） Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６） Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００） Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１） Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７） Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７） Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）

本発明は、ＡＮＯ５タンパク質またはその機能的に活性な断片をコードするヌクレオチ
ド配列を含むＡＡＶベクターを対象とする。実施例１～４に記載の実験は、筋肉再生及び
修復におけるＡｎｏ５の重要な役割を実証する。ＡＮＯ５の損失は、ＬＧＭＤ２Ｌ患者を
連想させるマウスにおけるジストロフィー表現型を引き起こし、筋肉、運動不耐性、再生
障害、及びクレアチンキナーゼレベルの上昇によって変化する軽度の組織病理を伴う。ミ
トコンドリア異常が、若齢及び高齢Ａｎｏ５^－／－マウスの両方で観察された。電子顕微
鏡撮像により表示されるミトコンドリアの構造的欠陥に加えて、クエン酸シンターゼ定量
アッセイは、ミトコンドリアが機能欠損を有することも実証した。クエン酸シンターゼの
定量的酵素分析は、損傷したミトコンドリアの存在を示唆する。これらの結果は、ミトコ
ンドリア異常が、アノクタミン５タンパク質の損失によって引き起こされる二次的影響で
あり得ることを示唆する。本明細書に記載の実験は、ヒトＡＮＯ５のウイルス発現によっ
てレスキューされるＡｎｏ５^－／－線維における筋鞘パッチ修復の減衰を実証し、Ａｎｏ
５の破壊が初代筋芽細胞の融合誘導性質を混乱させることを見出す。

一実施形態では、本発明は、ＡＮＯ５核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＡ
ＡＶベクターを提供する。ＡＮＯ５核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿２１３５
９９．２（配列番号１３）として示される。ＡＡＶベクター中のＡＮＯ５タンパク質をコ
ードする例示の核酸配列は、配列番号１として示される。本発明の組換えベクターは、配
列番号１または配列番号１３の核酸と少なくとも少なくとも８５％同一のポリヌクレオチ
ド配列を含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号１３のヌ
クレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含むか、またはＡＮＯ５活性を呈す
るタンパク質をコードする配列番号１または配列番号１３の核酸の断片を含む。一態様で
は、本発明の組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、Ａ
ＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、また
はＡＡＶ ｒｈ．７４である。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＰＬＳ活性に関与するドメインを含むタンパク質を
コードする配列番号１の断片を含み、このタンパク質は、ＰＬＳ活性を保持する。別の実
施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質をコードする配列番
号１または配列番号１３の断片を含む。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、例えば、配列番号１または配列番号１３と少なくと
も６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、
８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少
なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少な
くとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のポリヌクレオチド
配列を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質をコードする
。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、例えば、配列番号２と少なくとも少なくとも６５％
、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、
８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９
５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のＡＮＯ５をコードするポリ
ヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチドは、ＡＮＯ５活性を保持するタンパク質
をコードする。

本発明の組換えＡＡＶベクターは、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列
番号１３の核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列またはその補体を含み、
この断片は、約５個を超えるヌクレオチド、好ましくは７個のヌクレオチド、より好まし
くは９個を超えるヌクレオチド、最も好ましくは１７個を超えるヌクレオチドである。例
えば、選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つに特異的に
ハイブリダイズする）１５個、１７個、または２０個以上のヌクレオチドの断片が企図さ
れ、これらの断片は、ＡＮＯ５活性を保持する。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダ
イズすることができるプローブは、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチド配列を同じ遺伝子
ファミリー内の他のポリヌクレオチド配列と区別することができるか、またはＮＴＨｉ遺
伝子を他の細菌遺伝子と区別することができ、好ましくは、固有のヌクレオチド配列に基
づく。

「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において
一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシ
ーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される
。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５
Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０
１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホ
ルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、よ
り低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤等）も使用され得るが、ハ
イブリダイゼーションの速度に影響が及ぼされるであろう。デオキシオリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーションが懸念される例では、追加の例示のストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）
、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ ０．０５
％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。

非特異的及び／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のため
に、他の薬剤がハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に含まれ得る。例には、０．１
％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウ
ム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デ
ンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキス
トランがあるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種
類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことな
く変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、６．８～７．４で行
われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ
無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブ
リダイゼーション条件は、これらの可変物を適応し、かつ異なる配列関連性を有するＤＮ
Ａがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。

別の態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、筋肉特異的制御要素に作動可能に連
結され得る。例えば、筋肉特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチ
ン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエ
ンハンサー要素（ＭＣＫ）、ＭＣＫの三重コピー（ｔＭＣＫ）、骨格速筋トロポニンＣ遺
伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導
性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である
。

別の実施形態では、本発明は、本発明の任意の組換えＡＡＶベクターでトランスフェク
トされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒
子を回収することとを含む、組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本発
明は、本発明の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかを含むウイルス粒子も提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明のいずれの組換えＡＡＶベクターの治療有効量を
、それを必要とする対象に投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法を提供
する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。本方法
は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパ
チー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノ
パチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーを
治療することができる。加えて、筋ジストロフィーを治療するための前述の方法のうちの
いずれかが、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップ
をさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノ
イド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも
１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを
含む。

さらなる実施形態では、本発明は、本発明のいずれの組換えＡＡＶベクターの治療有効
量を、それを必要とする対象に投与することを含む、必要としている対象における筋肉を
再生する方法を提供する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変
異を有する。別の態様では、必要としている対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィ
ー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイ
ノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグ
リカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している。加
えて、筋肉を再生する前述の方法のうちのいずれかは、抗酸化剤組成物の治療有効量を、
それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補
酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール
、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、
補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えＡＡＶベクターのうちのいずれかの治療
有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性筋肉消耗を治療する方法を
提供する。一態様では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別
の態様では、必要としている対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジ
ストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー
、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパ
チー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している。加えて、慢
性筋肉消耗を治療するための前述の方法のうちのいずれかは、抗酸化剤組成物の治療有効
量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物
は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェ
ノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成
物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

本発明は、必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の
治療のための、本発明のいずれかの組換えＡＡＶを含む組成物も提供する。本発明は、必
要としている対象における筋肉の再生のための、本発明のいずれかの組換えＡＡＶを含む
組成物も提供する。一態様では、本発明の組成物は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する
対象に投与される。別の態様では、本発明の組成物は、ジスフェルリン関連筋ジストロフ
ィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパ
イノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコ
グリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対
象に投与される。本発明の組成物のうちのいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤
化される。本発明の組成物のうちのいずれかが、抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含
む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタ
ミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む
。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療を必
要とする対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製
のための本発明のいずれかの組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。加えて、本発明は
、筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製のための本発明の組換
えＡＡＶベクターのうちのいずれかの使用を提供する。一態様では、薬剤は、ＡＮＯ５遺
伝子に劣性変異を有する対象に投与される。別の態様では、本発明の薬剤は、ジスフェル
リン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレ
ムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線
維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフ
ィーに罹患している対象に投与される。本発明の薬剤のうちのいずれかが、筋肉内または
静脈内注入用に製剤化される。本発明の薬剤のうちのいずれかが、抗酸化剤組成物の治療
有効量をさらに含む。例えば、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カ
ロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少な
くとも１つを含む。具体的には、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミ
ンＥを含む。

別の実施形態では、本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象
に投与することを含む、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗を治療する方法を提供する
。抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子
、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつか
の態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。一態様
では、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、酸化
ストレスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能が改善
される。別の態様では、対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジスト
ロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミン
ミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、また
はＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している。

本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含
む、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗の進行を遅延させるための方法も提供する。抗
酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱
物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態
様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。一態様では
、必要としている対象は、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する。別の態様では、酸化スト
レスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、対象の骨格筋機能が改善され
る。別の態様では、対象は、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフ
ィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオ
パチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺ
ＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している。

本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤組成物は、経口投与される。本発明の方
法のうちのいずれかでは、抗酸化剤は、同じ組成物中で投与されるか、または抗酸化剤は
、別個の組成物中で投与される。抗酸化剤が同時ではなく別個に投与される場合。加えて
、本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤は、別個の時点で、または連続して投与
される。本発明の方法のうちのいずれかでは、抗酸化剤組成物は、１日１回、１週間に１
回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投
与される。

本発明は、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物も提供する。抗酸化剤組成物は、
必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群を治療するため
に、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェ
ノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。

本発明は、治療有効量、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物も提供する。抗酸化
剤組成物は、必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗の進行を
遅延させるために、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、
鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの
態様では、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

一態様では、本発明の組成物のいずれかが、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に
投与される。別の態様では、酸化ストレスは、組成物の投与後に対象の骨格筋において低
減される。別の態様では、対象の骨格筋機能は、組成物の投与後に改善される。別の態様
では、本発明の組成物のうちのいずれかが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯
型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー
、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパ
チー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジストロフィーに罹患している対象に投与さ
れる。本発明の組成物のうちのいずれかが、筋肉内または静脈内注入用に製剤化される。

別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療を必
要とする対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製
のための抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸
化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物
、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。

加えて、本発明は、筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製の
ための抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸化
剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、
ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様で
は、抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

加えて、本発明は、筋ジストロフィーまたは筋肉消耗症候群の進行の遅延を必要とする
対象における筋ジストロフィーまたは筋肉消耗症候群の進行の遅延用の薬剤の調製のため
の抗酸化剤組成物の使用を提供する。本発明の薬剤のうちのいずれかにおける抗酸化剤組
成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリ
フェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、
抗酸化剤組成物は、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む。

本発明の薬剤のうちのいずれかが、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する対象に投与され
る。別の態様では、酸化ストレスは、対象の骨格筋において低減される。別の態様では、
対象の骨格筋機能が改善される。別の態様では、本発明の薬剤のうちのいずれかが、ジス
フェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、三好型ミオパチー３、
ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、
筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチー等の筋ジス
トロフィーに罹患している対象に投与される。加えて、本発明の薬剤のいずれかが、筋肉
内または静脈内注入用に製剤化される。

いくつかの実施形態では、抗酸化剤組成物は、経口投与される。いくつかの態様では、
抗酸化剤は、同じ組成物中にある。他の態様では、抗酸化剤は、別個の組成物中にある。
いくつかの態様では、抗酸化剤組成物の抗酸化剤は、同時に投与される。いくつかの態様
では、抗酸化剤組成物の抗酸化剤は、別個の時点で、または連続して投与される。いくつ
かの実施形態では、抗酸化剤組成物は、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間
に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
筋ジストロフィーを治療する方法であって、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
必要としている対象における筋肉を再生する方法であって、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターを、筋肉を再生するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３）
慢性筋肉消耗を治療する方法であって、１）配列番号１と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目４）
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目２～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉内または静脈内注射により投与される、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
筋ジストロフィーを治療する方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１６）
慢性筋肉消耗を治療する方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１７）
筋ジストロフィーの進行を遅延させる方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１８）
慢性筋肉消耗の進行を遅延させる方法であって、抗酸化剤組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１９）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、項目１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、項目１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記対象の骨格筋機能が改善される、項目１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗酸化剤組成物が経口投与される、項目１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記抗酸化剤が、同じ組成物中にある、項目１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記抗酸化剤が、別個の組成物中にある、項目１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が同時に投与される、項目１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が、別個の時点で、または連続して投与される、項目１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、項目１２～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療のための、組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
（項目３２）
必要としている対象における筋肉の再生のための、組換えＡＡＶベクターを含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性をそれを必要とする対象に呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
（項目３３）
必要としている対象における慢性筋肉消耗の治療のための、組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む組成物であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、組成物。
（項目３４）
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、項目３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、項目３１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、項目３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目３１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
前記筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、項目３１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目３１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
筋肉内または静脈内注射用に製剤化される、項目３１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む、項目３１～４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目４２または４３に記載の組成物。
（項目４５）
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
（項目４６）
必要としている対象における慢性筋肉消耗の治療のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
（項目４７）
必要としている対象における筋ジストロフィーの進行の遅延のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
（項目４８）
必要としている対象における慢性筋肉消耗の進行の遅延のための、抗酸化剤組成物の治療有効量を含む組成物。
（項目４９）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目４５～４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目４５～４９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５１）
筋ジストロフィーが、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーである、項目４５～５０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５２）
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、項目４５～５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
前記対象の骨格筋機能が改善される、項目４５～５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目４５～５１のいずれか一項に
記載の組成物。
（項目５５）
経口投与用に製剤化される、項目４２～５４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５６）
前記薬剤が、同じ組成物中にある、項目４２～５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記薬剤が、別個の組成物中にある、項目４２～５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５８）
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が同時に投与される、項目４２～５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５９）
前記抗酸化剤組成物の前記抗酸化剤が、別個の時点で、または連続して投与される、項目４２～５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、項目４５～５９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６１）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
（項目６２）
筋肉の再生を必要とする対象における筋肉の再生用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
（項目６３）
慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための組換えＡＡＶベクターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む、使用。
（項目６４）
前記組換えＡＡＶが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、項目６１～６３のいずれか一項に記載の使用。
（項目６５）
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、項目６１～６３のいずれか一項に記載の使用。
（項目６６）
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、項目６１～６５のいずれか一項に記載の使用。
（項目６７）
前記筋肉特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である、項目６６に記載の使用。
（項目６８）
前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、項目６１～６７に記載の使用。
（項目６９）
前記対象が、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している、項目６１～６８のいずれか一項に記載の使用。
（項目７０）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目６１～６９のいずれか一項に記載の使用。
（項目７１）
前記薬剤が、筋肉内または静脈内注射用に製剤化される、項目６１～７０のいずれか一項に記載の使用。
（項目７２）
抗酸化剤組成物の治療有効量を必要とする対象に対する、抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む、項目６１～７１のいずれか一項に記載の使用。
（項目７３）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目７２に記載の使用。
（項目７４）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目７２または７３に記載の使用。
（項目７５）
必要としている対象における筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
（項目７６）
慢性筋肉消耗症候群の治療用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
（項目７７）
必要としている対象における筋ジストロフィーの進行の遅延用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
（項目７８）
必要としている対象における慢性筋肉消耗症候群の進行の遅延用の薬剤の調製のための、抗酸化剤組成物の治療有効量の使用。
（項目７９）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目７５～７８のいずれか一項に記載の使用。
（項目８０）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目７５～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記対象が、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している、項目７５～８０のいずれか一項に記載の使用。
（項目８２）
酸化ストレスが、前記対象の骨格筋において低減される、項目７５～８１のいずれか一項に記載の使用。
（項目８３）
前記対象の骨格筋機能が改善される、項目７５～８１のいずれか一項に記載の使用。
（項目８４）
前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、項目７５～８１のいずれか一項に記載の使用。
（項目８５）
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、項目５５～８４のいずれか一項に記載の使用。
（項目８６）
１）配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％同一の核酸配列、２）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド、または３）ＡＮＯ５活性を呈するタンパク質をコードする配列番号１の核酸の断片を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を、それを必要とする対象に、抗酸化剤組成物の治療有効量と組み合わせて投与することをさらに含む、項目１５～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、ビタミン、カロテノイド、ビタミン補因子、鉱物、ポリフェノール、またはフラボノイドのうちの少なくとも１つを含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記抗酸化剤組成物が、補酵素Ｑ１０、リポ酸、及びビタミンＥを含む、項目８６または８７に記載の方法。
（項目８９）
前記組換えＡＡＶベクターが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、項目８６～８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶ ｒｈ．７４である、項目８６～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉内または静脈内注射により投与される、項目８６～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記抗酸化剤組成物が経口投与される、項目８６～９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、同じ組成物中にある、項目８６～９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、別個の組成物中にある、項目８６～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が同時に投与される、項目８６～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、別個の時点で、または連続して投与される、項目８６～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記組換えＡＡＶベクター及び前記抗酸化剤組成物が、１日１回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回投与される、項目８６～９６のいずれか一項に記載の方法。

図１Ａ～１Ｄは、Ａｎｏ５^－／－マウスモデルの生成を例証する。パネル（ａ）は、ポリアデニル化終結シグナルを有する外因性イントロン及びｌａｃＺコードエクソンを含むＡｎｏ５標的ベクターを示す。結果として得られたｍＲＮＡは、エクソン８で終結する。パネル（ｂ）は、同腹子の尾部クリッピングから単離されたゲノムＤＮＡを示す。レーン１は、野生型（ＷＴ）マウスであり、レーン２は、Ａｎｏ５^＋／－マウスであり、レーン３は、Ａｎｏ５^－／－マウスであり、ＷＴ対立遺伝子は、３００ｂｐの断片であり、Ａｎｏ５対立遺伝子は、２００ｂｐの断片である。パネル（ｃ）は、Ａｎｏ５を標的とする２つのプライマーセットを使用したＡｎｏ５^－／－筋肉組織におけるＡｎｏ５転写物の証拠を示さないＲＴ－ＰＣＲ由来の産物を示す。レーン１：ＧＡＰＤＨ対照、レーン２：エクソン１０～１４に及ぶｅ１０～１４プライマー、レーン３：エクソン１７～２０に及ぶｅ１７～２０プライマー。パネル（ｄ）は、ＲＮＡレベルでのＡＮＯ５の９９％超の相対発現低減が、Ａｎｏ５^－／－マウス（Ｐ＜０．００１）から抽出した大腿四頭（ＱＤ）筋、腓腹（ＧＡＳ）筋、及び前脛骨（ＴＡ）筋におけるｑＲＴ－ＰＣＲにより確認されたことを示す。 図２Ａ～２Ｆは、Ａｎｏ５－／－欠損マウスの特徴付けを例証する。パネル（ａ）は、血清中クレアチンキナーゼが９ヶ月齢のＡｎｏ５－／－マウス（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）において著しく上昇することを示す。パネル（ｂ）は、９ヶ月齢のＡｎｏ５－／－マウス由来の横隔膜条片の比収縮力が対照（Ｐ＜０．０１、ｔ検定）と比較して著しく低減したことを示す。パネル（ｃ）は、９ヶ月齢のＡｎｏ５－／－マウス由来のＥＤＬ筋及び前脛骨（ＴＡ）筋の比収縮力が対照（Ｐ＞０．０５、ｔ検定）とは著しく異ならなかったことを示す。パネル（ｄ）は、ＷＴ対照と比較した、Ａｎｏ５－／－マウスのＴＡ及びＧＡＳにおける中心核、線維サイズ変動性、及び壊死面積を含む、軽度のジストロフィー病理を示すヘマトキシリン及びエオシン染色組織切片を示す。尺度バー＝５０μｍ。パネル（ｅ）は、特にＧＡＳ筋（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）におけるＷＴと比較して線維径サイズの低減を示す筋線維径測定結果を提供する。パネル（ｆ）は、Ａｎｏ５－／－マウスがトレッドミル疲労研究を行ったときに頻繁な休止を示したことを示す。 図３Ａ～３Ｅは、Ａｎｏ５^－／－マウスの生理学的特徴付けを提供する。パネル（ａ）：乳酸レベルは、トレッドミル走行後にＷＴ対照と比較してＡｎｏ５－／－マウスにおいてわずかに低減した（Ｐ＝０．１５）。パネル（ｂ）：筋肉の電気生理学的特性。電気生理学的振幅は、Ａｎｏ５^－／－（４５．１±２．２ｍＶ）とＷＴ（４０．８±２．４ｍＶ）（ｐ＝０．２２）との間に有意差はなかった。Ａｎｏ５－／－動物もＷＴ動物も、線維自発電位を示さなかった。パネル（ｃ～ｅ）：５０ｋＨｚでの筋肉のインピーダンス特性（それぞれ、位相、リアクタンス、抵抗）。Ａｎｏ５－／－（３１．０±２．７、２４８．１±３７．８Ω、４１１．４±３４．６Ω）とＷＴ線維（３１．７±３．９、２６９．０±８３．９Ω、４２４．３±７３．９Ω）との間に差はなかった（位相：ｐ＝０．５９、リアクタンス：ｐ＝０．４４、抵抗：ｐ＝０．５９）。１００ｋＨｚで、Ａｎｏ５－／－（３６．５±２．４、２１６．２±２７．３Ω、２９０．７±２２．０Ω）とＷＴ線維（３７．０±４．８、２２８．４±６３．９Ω、２９５．８±３６．１Ω）との間に差は観察されなかった（位相：ｐ＝０．７７、リアクタンス：ｐ＝０．５５、抵抗：ｐ＝０．６８）。 図４Ａ～４Ｇは、Ａｎｏ５^－／－筋肉における細胞内組織病理学を提供する。パネル（ａ）は、１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－ＴＡ筋及びＷＴ ＴＡ筋のゴモリトリクローム染色を提供する。Ａｎｏ５^－／－筋肉は、膜凝集体（矢印）を含む。尺度バー＝２０μｍ。パネル（ｂ）は、ＷＴ（ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析）と比較したＡｎｏ５^－／－のＴＡ筋及びＧＡＳ筋中に凝集体を含む線維の数の定量化を提供する。パネル（ｃ、ｄ）は、Ａｎｏ５^－／－筋肉中の膜凝集体の存在を示す電子顕微鏡像を提供する。凝集体は、けば状の内部小管を有する緩く密集した相互接続管形成（白色の矢印）であるか、小胞膜もしくは管膜の密に密集した蓄積（黒色の矢印）であった。尺度バー＝５００ｎｍ。パネル（ｅ）は、ミトコンドリア（矢印）及び変性ミトコンドリア（星印）の筋鞘下蓄積がＡｎｏ５^－／－筋肉において電子顕微鏡法により頻繁に特定されたことを示す。尺度バー＝５００ｎｍ（左）及び２μｍ（右）。パネル（ｆ）は、ＷＴには存在しなかった筋鞘肥厚及び被膜線維を示した１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－ＴＡ筋のコハク酸デヒドロゲナーゼ染色を提供する。尺度バー＝１０μｍ。パネル（ｇ）は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）染色した１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウスのＴＡ筋の凍結切片を提供する。矢印は、ＳＤＨ（左）を染色しない凝集体を示す。１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウス由来の連続切片は、トリクローム染色で観察された多くの膜凝集体（白色の矢印）がＳＥＲＣＡ１（右）に対して陽性であることを示し、それらが筋小胞体に由来することを示唆する。尺度バー＝４０μｍ。 図５Ａ～５Ｅは、Ａｎｏ５^－／－マウスにおける膜修復が欠損していることを示す。パネル（ａ）は、損傷５秒後及び１９０秒後に示されたレーザーパルスによって損傷を受けたＡｎｏ５^－／－筋線維及びＷＴ筋線維の画像を提供する。赤色の矢印は、ＦＭ１－４３色素がＷＴと比較してＡｎｏ５^－／－筋肉中に素早く蓄積する損傷部位を示す。尺度バー＝５０μｍ。パネル（ｂ）は、蛍光強度のレーザー誘起損傷後の蛍光強度の測定結果を提供する。Ａｎｏ５^－／－筋肉は、損傷１００秒超後常に、ＷＴ及びＡＡＶ．ＡＮＯ５線維とは統計的に異なる（二元配置分散分析、Ｐ＜０．００１）。パネル（ｃ）は、５×１０^１０ｖｇ ＡＡＶ．ＡＮＯ５．ＦＬＡＧベクターを注入したＡｎｏ５^－／－筋肉におけるＡＮＯ５－ＦＬＡＧの発現を示す。抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫蛍光法は、処置された筋肉（上）における細胞表面で、処置されたＡｎｏ５^－／－筋肉（下）には不在であったＡＮＯ５－ＦＬＡＧ発現を示した。尺度バー＝４０μｍ。パネル（ｄ）は、心臓毒誘導筋肉損傷からの回復を示す。心臓毒注入１、３、７、１４、３０、及び９０日後に、ＷＴ及びＡｎｏ５^－／－ＴＡ筋の組織切片をヘマトキシリン及びエオシン染色した（３日目、７日目、１４日目、及び３０日目を示す）。Ａｎｏ５^－／－筋肉は、ＷＴと比較してより損傷を受けており、再生の障害を示した。パネル（ｅ）は、Ａｎｏ５^－／－筋肉の筋線維サイズが、心臓毒注入後３０日目（心臓毒Ｄ３０）及び９０日目（心臓毒Ｄ９０）のＷＴと比較して統計的により小さいままである（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）。 図６は、抗酸化剤またはプラセボ食餌で処置したＡｎｏ５^－／－マウスの自発的活動を示す。このグラフは、抗酸化剤食餌またはプラセボ対照を１２週間及び１６週間受けたＡｎｏ５^－／－マウスの自発的活動（４５分間以内にマウスが水平及び／または垂直レーザー光線を遮断した回数）を示す。三重抗酸化剤療法で処置したＡｎｏ５^－／－マウスは、１６週時点でプラセボ処置と比較して著しく増加した活動を有する。 図７は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えたＡｎｏ５^－／－マウス及びプラセボ食餌を与えたＷＴ対照マウスの横隔膜への比力の測定結果を示す。三重抗酸化剤療法で処置したＡｎｏ５^－／－マウスは、１６週時点でプラセボ処置と比較して著しく増加した横隔膜比力を呈した。 図８Ａ～８Ｂは、三重抗酸化剤処置のミトコンドリア新生及び機能への影響を示す。雄腓腹筋組織を使用して、三重抗酸化剤を与えたマウスにおけるミトコンドリア新生マーカー、ミトコンドリア新生ＰＧＣ－１ａ発現、及びクエン酸シンターゼ活性を測定した。パネル（ａ）は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えたマウスのＰＧＣ－１ａ発現を示す。パネル（ｂ）は、三重抗酸化剤療法またはプラセボ食餌のいずれかを与えた雄及び雌Ａｎｏ５^－／－マウス及びＷＴマウスのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性を示す。

ＡＮＯ５は、筋肉修復に極めて重要な役割を果たし、本発明は、ＭＤの治療のためのＡ
ＮＯ５遺伝子を含むＡＡＶベクターを提供する。ＡＮＯ５の破壊は、マウスモデルにおけ
るジスフェルリン発現の損失を密に表現型模写し、ジスフェルリン変異により、ＡＮＯ５
ミオパチーに類似したＭＤ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好型ミ
オパチージストロフィー１（ＭＭＤ１）対肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）
及び三好型ミオパチージストロフィー３（ＭＭＤ３））が引き起こされる。

Ａｎｏ５^－／－マウスは、ＡＮＯ５－ミオパチー、筋鞘修復、及び筋原細胞融合の研究
用の重要なモデルを表す。以下の実施例に提供される実験的証拠は、Ａｎｏ５^－／－マウ
スのＡＡＶ．ＡＮＯ５－ＦＬＡＧ処置により膜修復表現型を部分的に救助することによる
ＡＮＯ５－ミオパチーの治療戦略としての遺伝子置換療法のための方法を支持する。
ＡＡＶ

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な
略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによっ
て提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、以下の表
１に示されるように、特徴付けられているＡＡＶの血清型が１３存在する。ＡＡＶの一般
的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａ
ｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０
，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえ
も構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、こ
れらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例え
ば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及
びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４
）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介され
る非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等
の関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間
の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応す
る末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分
析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類
似の調節制御下にあることも示唆する。

本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接
している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かか
るＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトラ
ンスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製及びパッケー
ジングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは
、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチド
ＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、
哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド
）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクタ
ー」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため
、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。

ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ５´逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、転写調節要素、す
なわち、１つ以上のプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結されたタン
パク質コード配列に隣接するＡＡＶ ３´ＩＴＲと、ポリアデニル化配列と、任意に、タ
ンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロンとを有する一本鎖核
酸または二本鎖核酸のいずれかであり得る。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒
子のゲノム中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖またはア
ンチセンス鎖のいずれかであり得る。かかる一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供され
る。二本鎖ＡＡＶベクターは、プラスミドのＤＮＡ中に存在する核酸、例えば、ｐＵＣ１
９、または二本鎖ウイルスのゲノム、例えば、ＡＡＶベクター核酸を発現または輸送する
ために使用されるバキュロウイルスを指す。かかる二本鎖核酸のサイズは、塩基対（ｂｐ
）単位で提供される。

本明細書で使用される「逆方向末端反復（ＩＴＲ）」という用語は、ＤＮＡ複製の起源
及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスで機能するＡＡＶゲノムの５´
及び３´末端に見られる当該技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、
ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲノムからの効率的な切除及びレス
キュー、ならびに２つの隣接するＩＴＲ間に置かれたヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノム
への組み込みを提供する。ある特定のＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、参照により全体が本明
細書に組み込まれる、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４－３
７９（２００５）に開示されている。

「転写制御要素」とは、プロモーターを含む遺伝子転写の調節に関与するゲノムのヌク
レオチド配列、ならびに応答要素、ＲＮＡポリメラーゼ結合を支援し、かつ発現を促進す
るための活性化因子及びエンハンサー配列、及びリプレッサータンパク質がＲＮＡポリメ
ラーゼ結合を遮断し、かつ発現を阻止するために結合するオペレーターまたはサイレンサ
ー配列を指す。

ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子とは、それぞれ、複製及びカプシド形成タンパ
ク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、現在までに試験さ
れた全てのＡＡＶ血清型に見つけられており、本明細書及び引用される参考文献に記載さ
れている。野生型ＡＡＶにおいて、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、概して、ウイルスゲノム
内で互いに隣接した状態で見られ（すなわち、それらは、隣接しているか、または重複し
ている転写単位として一緒に「カップリング」されており）、それらは、一般に、ＡＡＶ
血清型間で保存される。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、個別にかつ集合的に、「Ａ
ＡＶパッケージング遺伝子」とも称される。本発明によるＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ｒｅ
ｐ及びアデノヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターをパッケージングすることができ、
かつ標的細胞受容体に結合することができるＣａｐタンパク質をコードする。いくつかの
実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、特定のＡＡＶ血清型、例えば、表１に示される
血清型及びＡＡＶ ｒｈ．７４（米国特許第９，４３４，９２８号を参照のこと）に由来
するアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質をコードする。他のタイプのｒＡＡＶ変異
体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照さ
れたい。

ＡＡＶの産生に用いられるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。
概して、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、
同様の組の遺伝機能を提供し、本質的に物理的及び機能的に同等であるビリオンを産生し
、実質的に同一の機構によって複製及び組み立てられる。ＡＡＶ血清型のゲノム配列及び
ゲノム類似性の考察については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９７９０、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ受入番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：
６８２３－３３（１９９７）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．４５
：５５５－６４（１９８３）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１
３０９－１３１９（１９９９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：
３０９－３１９（１９９８）、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５－
４７（２０００）を参照されたい。

全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム編成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、約
５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の直鎖一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復
（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の固有のコ
ードクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質は、カプシドを形成する。末端１４
５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二
本鎖を形成するように編成されている。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラー
ゼ複合体のプライマーとしての機能を果たすウイルスＤＮＡ複製の起源として機能する。
Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ
４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅ
ｐ ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ
タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモ
ーターから転写される。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Ｓｆ９
またはＨＥＫ細胞等の特定の細胞型での発現のために発現制御配列に動作可能に連結して
いる。昆虫宿主細胞または哺乳類宿主細胞で外来遺伝子を発現するための当業者に既知の
手技を使用して、本発明を実施することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子
工学及び発現のための方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ．１９８
６．Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａ
ｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ
．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．、Ｌｕｃｋｏｗ．１９９
１．Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ
ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ´ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮ
Ａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７－１５２、Ｋｉｎ
ｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｏ´Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ
．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ． Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３９、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｕ
Ｓ２００３１４８５０６、及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。ＡＡＶカプシ
ドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に好適なプロモーターは、例えば
、多角体プロモーターである。しかしながら、昆虫細胞で活性の他のプロモーター、例え
ば、ｐ１０、ｐ３５、またはＩＥ－１プロモーターが当該技術分野で既知であり、上記の
参考文献に記載されるさらなるプロモーターも企図される。

異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば、昆虫細胞適合性
ベクター等の核酸をかかる細胞に導入する方法及びかかる細胞を培養中に維持する方法と
して十分に立証されている。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩ
ＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）、Ｏ
´Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥ
ＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒ
ｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－
８（１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８： ４６４６－５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｖｉｒ．２１９：３７－４４（１９９６）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２
：３８２－９３（２０００）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２
０４，０５９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、昆虫細胞中のＡＡＶをコード
する核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。本明細書で使用される「昆虫細胞適
合性ベクター」または「ベクター」とは、昆虫または昆虫細胞の増殖性形質転換またはト
ランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示の生物学的ベクターとしては、プラス
ミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。昆虫細胞適合性である限り、い
ずれのベクターも使用され得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫
細胞中のベクターの存在は、恒久的である必要はなく、一時的なエピソームベクターも含
まれる。ベクターは、任意の既知の手段によって、例えば、細胞の化学的処理、電気穿孔
法、または感染によって導入され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロ
ウイルス、ウイルスベクター、またはプラスミドである。より好ましい実施形態では、ベ
クターは、バキュロウイルスであり、すなわち、構築物は、バキュロウイルスベクターで
ある。バキュロウイルスベクター及びそれらを使用するための方法は、昆虫細胞の分子工
学に関する上記で引用された参考文献に記載されている。

バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、この２つのメン
バーは、細胞培養物中に組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。
バキュロウイルスは、大きなゲノム含有量の特定の細胞への送達を可能にするように操作
され得る環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用される
ウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチカプシド核
多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）ＮＰＶ）であ
る（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のために昆虫細胞の感染に一般的に使用
される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５
，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５
５，４７６、Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８
）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５
）、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ
ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ ｅ
ｔ ａｌ（１９８８）に記載されるように達成され得る。タンパク質産生に使用され得る
多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏ
ｗ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ ｅ
ｔ ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。

一態様では、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。ｒＡＡＶゲノムは、ＡＮＯ５タン
パク質をコードするポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。
ポリヌクレオチドがＡＮＯ５タンパク質をコードする場合、ポリヌクレオチドは、転写制
御ＤＮＡ、具体的には、遺伝子カセットを形成するために標的細胞、例えば、筋肉細胞内
で機能的なプロモーターＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに動作可能に連結
される。遺伝子カセットは、哺乳類細胞で発現された場合にＲＮＡ転写物の処理を促進す
るためのイントロン配列も含み得る。例えば、ＡＡＶゲノムは、ＡＮＯ５遺伝子のエクソ
ン８及びエクソン９等のＡＮＯ５遺伝子の１つ以上のエクソンに隣接する１つ以上のＡＡ
Ｖ ＩＴＲを含む。ＡＡＶゲノムは、イントロン、レポート遺伝子（Ｌａｃ－Ｚ β－ガ
ラクトシダーゼまたはネオマイシン耐性遺伝子等）、ＣＲＥ－Ｌｏｘ組換え部位（Ｌｏｘ
Ｐ等）、及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥ Ｓ）のうちの１つ以上を含む。
組換えＡＡＶを産生するための方法

本開示は、昆虫または哺乳類細胞において組換えＡＡＶを産生するための材料及び方法
を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、目的とする１つ以上のタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするためのプロモーター及びそのプロ
モーターの下流の制限部位をさらに含み、プロモーター及び制限部位は、５´ＡＡＶ Ｉ
ＴＲの下流及び３´ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。いくつかの実施形態では、ウイル
ス構築物は、制限部位の下流及び３´ＡＡＶ ＩＴＲの上流に転写後節要素をさらに含む
。いくつかの実施形態では、ウイルス構築物は、制限部位に挿入され、かつプロモーター
に作動可能に連結されたポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドは、目的とす
るタンパク質のコード領域を含む。当業者が認識するように、本出願に開示されるＡＡＶ
ベクターのうちのいずれか１つが、ウイルス構築物として組換えＡＡＶを産生するための
方法で使用され得る。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組
込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウ
イルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。ＡＡＶゲノム
がパッケージングされるｒＡＡＶ粒子、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイ
ルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技法は、当該技術分野において標準
である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した
（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパー
ウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在するこ
とを必要とする。

いくつかの実施形態では、ヘルパー機能は、アデノウイルスまたはバキュロウイルスヘ
ルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供
される。アデノウイルスまたはバキュロウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例としては
、ヘルパー機能をＡＡＶパッケージングに提供することができるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ
、Ｅ４、及びＶＡが挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当該技術分野で既知であり、例えば、アデノウイルス科
ファミリー及びヘルペスウイルス科ファミリーからのウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘル
パーウイルスの例としては、米国公開第２０１１０２０１０８８号（この開示は、参照に
より本明細書に組み込まれる）に記載のＳＡｄＶ－１３ヘルパーウイルス及びＳＡｄＶ－
１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉ
ｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、適切なヘルパー機能を
ＡＡＶに提供することができるＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミ
ドが本明細書で使用され得ることを理解する。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、プラスミド中に存在する。プラス
ミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含み得る。任意のＡＡＶ血清型由来のｃａｐ遺伝
子及び／またはｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、Ａ
ＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡ
Ｖ ｒｈ．７４、及びそれらの任意の変異形を含むが、これらに限定されない）を本明細
書で使用して、組換えＡＡＶを産生することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ
ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血
清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、またはそれらの
変異形由来のカプシドをコードする。

いくつかの実施形態では、昆虫または哺乳類細胞は、ヘルパープラスミドまたはヘルパ
ーウイルスでトランスフェクトされ得、ウイルス構築物及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコー
ドするプラスミドは、共トランスフェクション後の様々な時点で収集され得る。例えば、
組換えＡＡＶウイルスは、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時
間、約９６時間、約１２０時間、またはこれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時点
で収集され得る。

組換えＡＡＶは、感染性組換えＡＡＶの産生に好適な当該技術分野で既知の任意の従来
の方法を使用して産生され得る。いくつかの例では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子産生に
必要な成分のうちのいくつかを安定的に発現する昆虫または哺乳類細胞を使用することに
よって産生され得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン
耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細
胞のゲノム内に組み込まれ得る。その後、昆虫または哺乳類細胞は、ヘルパーウイルス（
例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルスまたはバキュロウイルス）、ならびに５
´及び３´ＡＡＶ ＩＴＲ（ならびに所望の場合、異種タンパク質をコードするヌクレオ
チド配列）を含むウイルスベクターに同時感染させられ得る。この方法の利点は、細胞が
選択可能であり、組換えＡＡＶの大規模産生に好適であることである。別の非限定的な例
として、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒｅｐ
及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入することができる。さらに別の非限定的な
例として、５´及び３´ＡＡＶ ＬＴＲを含有するウイルスベクターもｒｅｐ－ｃａｐ遺
伝子もいずれも、産生細胞のＤＮＡに安定して組み込まれ得、ヘルパー機能は、組換えＡ
ＡＶを産生するために野生型アデノウイルスによって提供され得る。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な成分を全て安定して
発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く
ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネ
オマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミ
ド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓ
ｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：
２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌ
ａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接
平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）等の手法によって細菌プラスミドに導
入されている。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルス
に感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に
好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ
及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイ
ルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ
ｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙ
ｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａ
ｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）
、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９
８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５
，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６
号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、Ｗ
Ｏ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ
／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、
ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅ
ｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａ
ｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－
６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２
４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及
び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれら
の全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一
実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細
胞（同種２９３株）等の安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、
パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞
（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児
線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、
及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー
または塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスか
ら精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ
．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓ
ｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７
－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に
開示されている方法が含まれる。

ＡＡＶ産生で使用される細胞型
本発明のＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶまたは生物学的産物の産生を可
能にし、かつ培養中に維持され得る任意の無脊椎動物細胞型を使用して導入され得る。例
えば、使用される昆虫細胞株は、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋等のＳｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄ
ｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞株、ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｓｉｌｋｗｏｒｍ細胞株
、例えば、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞株、例え
ば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞株、例えば、Ａｓｃａ
ｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株由来であり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆ
ｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００
＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－
Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８を含む、バキュロウイルス感染にかかりや
すい昆虫種由来の細胞である。

バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、この２つのメン
バーは、細胞培養物中に組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。
バキュロウイルスは、大きなゲノム含有量の特定の細胞への送達を可能にするように操作
され得る環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有する。ベクターとして使用される
ウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｆｏｒｉｃｉｎｅマルチカプシ
ド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ ＮＰＶ）
である（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のために昆虫細胞の感染に一般的に使用
される。具体的には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５
，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５
５，４７６、Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８
）、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５
）、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ
ａｌ（１９８５）、Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）、及びＭａｒｔｉｎ ｅ
ｔ ａｌ（１９８８）に記載されるように達成され得る。タンパク質産生に使用され得る
多数のバキュロウイルス株及び変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏ
ｗ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）、Ｍａｅｄａ ｅ
ｔ ａｌ（１９８５）、及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。

本発明の別の態様では、本発明の方法は、ＡＡＶの複製または生物学的産物の産生を可
能にし、かつ培養中に維持され得る任意の哺乳類細胞型を用いても実行される。使用され
る好ましい哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥ
Ｒ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ
－１９、及びＭＲＣ－５細胞であり得る。

組成物
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶ及び／または抗酸化剤を含む組成物を
企図する。これらの組成物を使用して、筋肉を再生、強化、もしくは修復し、かつ／また
は筋肉機能を改善することができる。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤
及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバント
は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であ
り、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；抗酸化剤；低分子量ポリペプチ
ド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピ
ロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もし
くはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖
、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトー
ル等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プ
ルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含
まれる。

インビボまたはインビトロでのｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本発明によ
って企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効
複数回用量を、それを必要とする動物（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。対
象への本開示のｒＡＡＶを含む組成物の組み合わせの有効用量または有効複数回用量は、
治療される疾患に関連する筋肉病理を予防するか、その進行を遅延させるか、または改善
する用量である。筋肉病理への影響は、例えば、絶対筋比力、伸張性筋肉収縮中の力減衰
、血清ＣＫレベル、血清心臓トロポニンレベル、血清ＭＭＰ９レベル、握力、四肢トルク
、四肢可動性または柔軟性、歩行、６分間歩行試験、膝屈筋または伸筋力、最大自発的等
尺性筋肉収縮、Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ歩行評価、筋肉量、脂肪減少、または四肢Ｔ２加重
ＭＲＩ測定による浮腫、筋拘縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、短縮率パーセ
ント、１回拍出量）、呼吸（呼吸速度、血液酸素化、酸素補給の必要性を含む）、筋壊死
、筋肉再生、筋肉消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中心核化、筋肉サイズまたは筋原線
維サイズ、寿命、及びジストロフィンまたはラミニンアルファ２代理タンパク質発現（ユ
ートロフィン、プレクチン１、ラミニンアルファ５、アグリン）等の当該技術分野で標準
の１つ以上の評価基準の改善によって実証され得る。例えば、Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ
．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２６９（１）：１９８－２０７（２０１３）、Ｇｏｖｏｎｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，７０（２３）：４５８５－４６
０２（２０１３）、及びＣｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７９：２９１－３２２（２０１０）を参照されたい。
用量が疾患の発症前に投与される場合、投与は、予防的である。用量が疾患の発症後に投
与される場合、投与は、治療的である。したがって、治療される疾患を予防し、その進行
を遅延もしくは予防し、その程度を弱め、その（部分的もしくは全体的な）寛解をもたら
し、かつ／またはその生存期間を延長するための本明細書に記載の方法による対象の治療
が企図される。

併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療ま
たは連続治療を含む。新規の療法との併用等の本発明の方法と標準の医療処置（例えば、
筋ジストロフィーのためのコルチコステロイド）との併用が特に企図される。この点にお
いて、筋肉損傷を軽減または抑制するか、筋肉を強化するか、または筋肉修復を誘導する
ためにＡＮＯ５の発現を誘導することができ、その後、二次治療を提供することができる
。筋ジストロフィーのかかる二次治療は、抗酸化剤（例えば、リポ酸、補酵素Ｑ１０、及
びα－トコフェロール）、ＩＧＦ－１、干渉ＲＮＡアプローチ、エクソンスキッピング、
カルパイン阻害、ジストロフィン上方調節、及びジストログリカン発現の使用を含み得る
。さらに、筋肉増強効果を強化するために、ＡＮＯ５の発現が追加され得る。例えば、Ｉ
ＧＦ－１もしくは他の栄養因子の添加または筋肉前駆体注入が行われ得る。

本発明に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投
与様式、治療目標、治療される個体及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野
で標準の方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、ＤＮａｓｅ耐性粒
子（ＤＲＰ）１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、
約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、
または約１×１０^１５以上の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）
でも表され得る（すなわち、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖ
ｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×
１０^１４ｖｇ、１×１０^１５）。ＡＡＶを滴定するための方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載さ
れている。

本組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋
内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準
の経路により得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカ
プシドタンパク質）の投与経路及び血清型（複数可）は、治療される病状ＡＮＯ５タンパ
ク質を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択及び／または
適合され得る。いくつかの実施形態では、経路は、患者の大腿四頭筋への１回以上の筋肉
内注射である。いくつかの実施形態では、経路は、患者の大腿四頭筋の３つの主要筋肉群
の各々への１回以上の筋肉内注射である。

具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的
組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投
与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられ
るが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させるこ
とが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、
ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡ
を分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプ
シドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修
飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０
３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋
肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多
数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投
与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。

筋肉内注射の目的のために、例えば、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中
の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る
。かかる水溶液は、所望の場合、緩衝され、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグル
コースで等張性にする。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する
）または薬理学的に許容される塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好
適に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶ分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレ
ングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保管及び
使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。こ
れに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準の技法によって容易
に得ることが可能である。

注射可能な使用に好適な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散剤、及び注射可能
な滅菌溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。あらゆる場合におい
て、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂ
ｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下
で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されなけ
ればならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び
植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等
のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活
性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブ
タノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によ
ってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むこと
が好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステ
アリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、必要量のｒＡＡＶを、上に列挙される様々な他
の成分を有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。
一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要
な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌
溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その以前
に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフ
リーズドライ技法である。

ｒＡＡＶでの形質導入もインビトロで行われ得る。一実施形態では、所望の標的筋肉細
胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同
系または異種筋肉細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異
種筋肉細胞が使用され得る。

対象への形質導入細胞の形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既
知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合
わせ、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技法を使用して目的とするＤＮＡを
持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用す
ることによってインビトロで形質導入され得る。その後、形質導入された細胞は、薬学的
組成物に製剤化され得、この組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射等の様々
な技法によって、または例えばカテーテルを使用して、平滑心筋に注射することによって
対象に導入される。

本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、ＡＮＯ５タンパク質の持続発現をもたらす。
したがって、本発明は、ＡＮＯ５を動物、好ましくはヒトに発現するｒＡＡＶを投与／送
達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織
（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の臓器、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定さ
れない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。
例えば、本発明の一実施形態は、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来する制御
要素、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来する制御要素［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照のこと］、筋
細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，
Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アク
チン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋肉クレアチンキ
ナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３
３９３－３３９９（１９８９）を参照のこと］及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサ
ー（ｍＣＫ）要素、例えば、マウスｍＣＫの三重コピーであるＭＣＫ７またはｔＭＣＫ、
骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝
子に由来する制御要素、低酸素誘導核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、グル
ココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導要素及びプロモーター［Ｍａｄ
ｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５
６０３－５６０７（１９９３）］、ならびに他の制御要素を含むが、これらに限定されな
い筋肉特異的制御要素によって誘導される筋肉細胞及び筋肉組織を形質導入する方法を提
供する

筋肉組織は、重要な臓器ではなく、アクセスが容易であるため、インビボ遺伝子送達及
び遺伝子療法のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来の生物学的
に活性なＡＮＯ５タンパク質の持続発現を企図する。

「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血
管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞または細胞群を
意味する。かかる筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の
分化または未分化のものであり得る。筋肉組織が循環系に容易にアクセス可能であるため
、インビボで筋肉細胞及び組織によって産生及び分泌されたタンパク質は、全身送達のた
めに論理的に血流に入り、それにより、筋肉からの治療レベルのタンパク質分泌の持続を
提供する。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による機能的ＡＮＯ５タンパク質の発現
をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかで
のＡＮＯ５ ＤＮＡのレシピエント細胞への投与／送達を指すために使用される。

抗酸化剤組成物
骨格筋収縮中の反応性酸素種の産生が十分に確立されている。長期間の運動中、これら
の酸化体の量の増加は、タンパク質及び脂質に損傷を与え、複数のストレス応答シグナル
伝達経路の活性化につながる（Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂ
ｉｏｌ Ｍｅｄ ５１： ９４２－５０（２０１１））。結果として、いくつかの研究は
、骨格筋における酸化ストレスを緩和する手段としての長期抗酸化剤補給の使用を調査し
ている。最近の一研究は、雌マウスの食餌に補給された３つの抗酸化剤（ビタミンＥ、α
－リポ酸、及び補酵素Ｑ１０）の製剤が、走行性能、ならびにミトコンドリア機能のマー
カーを改善したことを報告した（Ａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８：ｅ
６０７２２（２０１３））。しかしながら、他の研究は、同様に修正された食餌（ビタミ
ンＥ＋α－リポ酸）が、ラットにおけるミトコンドリア新生を低減したことを報告した（
Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｓｐｏｒｔｓ Ｅｘｅｒｃ．４３：１
０１７－２４（２０１１））。現在、長期抗酸化剤補給の骨格筋健康への影響における共
通認識が当該技術分野に存在せず、疾患によって衰弱した筋肉にはほとんど注意が払われ
ていない。しかしながら、本発明は、抗酸化剤食餌がＡｎｏ５^－／－マウスの骨格筋に有
益な影響を与えるという証拠を提供する。

抗酸化剤
本発明は、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋肉生理学及び機能を改善す
るための抗酸化剤組成物の投与を提供する。本明細書に開示される抗酸化剤組成物は、少
なくとも１つの抗酸化剤を利用する。加えて、本発明は、少なくとも２つまたは少なくと
も３つの抗酸化剤を含む抗酸化剤組成物を提供し、これらの組成物において、抗酸化剤は
、異なる細胞機能を有する。好ましい抗酸化剤は、経年劣化の産物としてミトコンドリア
損傷を特異的に逆転させることが示されているものである。例えば、本発明は、補酵素Ｑ
１０、α－リポ酸、カロテノイド（α－カロチン、β－カロチン、リコピン、ルテイン、
アスタキサンチン、カンタキサンチン、及びゼアキサンチン）、ビタミンＡ（レチノール
、３，４－ジデヒドロレチノール、及び３－ヒドロキシレチノール）、ビタミンＣ（アス
コルビン酸）、及びビタミンＥ（α－トコフェロール）等のビタミン、ビタミン補因子、
ポリフェノール及びフラボノイド（レスベラトロル、ジンジェロール、クルクミン）、ま
たは鉱物（鉄、マグネシウム、セレン、銅、亜鉛、マンガン、ヨウ化物）のうちの少なく
とも１つを含む抗酸化剤組成物を提供する。好ましい実施形態では、これらの抗酸化剤は
、補酵素Ｑ１０、ビタミンＥ、α－リポ酸である。

補酵素Ｑ１０（別名、Ｑ１０、ビタミンＱ１０、ユビキノン、ユビデカレノン、または
補酵素Ｑ）は、脂溶性物質である。補酵素Ｑ１０は、電子伝達鎖（ＥＴＣ）に不可欠な電
子シャトル化合物である。ＥＴＣは、細胞へのエネルギーの重要な源であるＡＴＰ合成を
駆動する。ビタミンＥ（別名、α－トコフェロール）は、膜（ミトコンドリア膜を含む）
の重要な成分であり、脂質フリーラジカルを除去する機能を果たす。

α－リポ酸（別名、チオクト酸）は、最終的にＡＴＰ産生をもたらすＫｒｅｂｓサイク
ルの適切な機能のためのピルビン酸デヒドロゲナーゼ等のミトコンドリアデヒドロゲナー
ゼの必須補因子であるオクタン酸に由来する有機硫黄化合物である。α－リポ酸はまた、
ＰＧＣ１αを介してミトコンドリア新生を調節する細胞中のエネルギーセンサーであるＡ
ＭＰＫを活性化することによって骨格筋に直接影響する。

ポリフェノールとしては、フェノール酸及びフラボノイドが挙げられる。例えば、フェ
ノール酸としては、プロトカテク酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ桂皮酸
、例えば、コーヒー酸、クロロゲン酸、クマル酸、フェルラ酸、シナピン酸、アントシア
ニン、例えば、シアニジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、デルフィニジン、及びマルビ
ジンが挙げられる。例示のフラボノイドとしては、フラボノール、例えば、ケルセチン、
ケンペロール、ミリセチン、フラボン、例えば、アピゲニン及びルテオリン、グラバオノ
ン（ｇｌａｖａｏｎｏｎｅ）、例えば、ヘスペレチン、ナリンゲニン、及びエリオジクチ
オール、イソフラボン、例えば、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン、ならび
に単量体フラボノール、例えば、カテキン及びエピカテキンが挙げられる。

投与及び投薬
本開示は、少なくとも１つの抗酸化剤を使用して筋ジストロフィー及び慢性筋肉消耗を
治療するための材料及び方法を提供する。少なくとも１つの抗酸化剤を投与すること、ま
たは少なくとも２つの抗酸化剤を投与すること、または少なくとも３つの抗酸化剤を投与
することを含む、筋ジストロフィーを治療する例示の組成物及び方法。例えば、本発明は
、α－リポ酸、補酵素Ｑ１０、及びα－トコフェロール（別名、ビタミンＥ）を含む抗酸
化剤組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗酸化剤組成物
は、単独で、またはＡＮＯ５タンパク質もしくはその機能的に活性な断片をコードするヌ
クレオチド配列を含むＡＡＶベクターと組み合わせて投与され得る。

本開示の方法は、注射、経口摂取、鼻腔内、局所、経皮、非経口、吸入噴霧、膣内、ま
たは直腸投与を含むが、これらに限定されない、薬剤を哺乳類対象に直接または間接的に
投与するための任意の医学的に許容されている手段を使用して行われる。本明細書で使用
される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、及び嚢内注射、ならびにカテーテル
または注入技法を含む。皮内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射による投与、及びまたは
特定の部位における外科的移植も企図される。

一実施形態では、投与は、部位への直接注射による治療または持続送達もしくは持続放
出機構を介する治療を必要とする罹患組織（例えば、筋肉）で行われ、製剤を内部に送達
することができる。例えば、組成物の持続送達が可能な生分解性微小球もしくはカプセル
または他の生分解性ポリマー構成（例えば、溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）が
、罹患組織の近くに、または罹患組織に埋め込まれる本開示の製剤に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、抗酸化剤及びＡＮＯ５を含むＡＡＶベクターの同時投与は、
薬剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、薬剤が同時にまたは同じ経路
により投与されることを必要としない。異なる日または週の投与としての同時または連続
投与が企図される。

いくつかの実施形態では、抗酸化剤及び／またはＡＡＶベクター組成物は、患者の複数
の部位にも送達され得る。複数回投与は、同時に行われるか、またはある期間にわたって
投与され得る。ある特定の場合、治療用組成物の連続流動を提供することが有益である。
付加療法は、ある期間に基づいて、例えば、１時間に１回、１日１回、２日に１回、週２
回、週３回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、月１回、またはより長い間隔で投与
され得る。

本開示の薬剤が同じ製剤で同時に与えられ得ることが企図される。薬剤が別個の製剤で
投与され、かつ同時に投与されることがさらに企図され、同時とは、互いに３０分以内に
与えられることを指す。

したがって、本発明は、例えば、ＡＮＯ５をコードするｒＡＡＶ及び／または抗酸化剤
の有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）
を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。

所与の投薬量中の抗酸化剤組成物の量は、療法が投与される個体のサイズ、ならびに治
療される障害の特徴に従って異なり得る。例示の治療では、約０．１％、０．２％、０．
３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％のリポ
酸、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．
８％、０．９％、１．０％の補酵素Ｑ１０、及び約１０、１００、２００、３００、４０
０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４００
０、５０００ＩＵのα－トコフェロールまたはビタミンＥを含む抗酸化剤食餌の投与が必
要であり得る。これらの濃度は、単一剤形として、または複数回用量として投与され得る
。最初に動物モデル、その後に臨床試験における標準の用量応答研究により、特定の病状
及び患者集団の最適な投薬量が明らかになる。

従来の治療薬が本開示の治療薬と組み合わせて投与される場合、投薬が修正されてもよ
いことも明らかであろう。

実施例１
Ａｎｏ５－／－マウスモデルの単離及び生成
Ａｎｏ５ノックアウトマウスを、エクソン８からエクソン９までＡｎｏ５を標的とする
ベクターを使用して生成して、図１Ａに示される切断転写物を産生した。標的構築物を、
ヌル対立遺伝子がＴｅｓｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓｉｓ ３８，１５１－１５８（
２００４）に記載されるようにｌａｃＺ捕捉要素へのスプライシングにより生成されるよ
うに、「ノックアウトファースト」条件付き準備（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｅａｄｙ
）構築物として設計した。このｌａｃＺタグ付き変異対立遺伝子Ａｎｏ５：ｔｍ１ａ（Ｋ
ＯＭＰ）Ｗｔｓｉ標的ベクターを、ＵＣ Ｄａｖｉｓ ＫＯＭＰ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ
（ＰＧ０００９７＿Ｚ＿１＿Ｇ０、Ｋａｒｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４７４，３３７－３４
２（２０１１）から入手した。標的カセットを、隣接ＦＲＴ及びｌｏｘＰ部位が存在する
エクソン８の後に挿入して、胚致死が顕著であった場合に、条件付き対立遺伝子を生成し
た。

胚幹細胞標的及び移植後、遺伝子型をゲノムＰＣＲによって検証した（図１ｂ）。クロ
ーンを、エクソン１～６（ｅ１～６）またはエクソン１７～２０（ｅ１７～２０）に及ぶ
以下のプライマーセットを使用してＲＴ－ＰＣＲによってスクリーニングし、それらは、
図１ｃに示されるように、内因性Ａｎｏ５遺伝子座から３００ｂｐのアンプリコン及びＡ
ｎｏ５カセット挿入遺伝子座から２００ｂｐのアンプリコンを産生した：
遺伝子型決定Ｆ ５´－ＡＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧ－３´
（配列番号３）
遺伝子型決定Ｒ ５´－ＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＴＡ－３´（配
列番号４）
ＤＦ３８７００ ５´－ＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＴ－３´（配列
番号５）
ＬＲ－ｌｏｘｐ Ｒ ５´－ＡＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣ－３´（
配列番号６）

その後、うまく標的とされたＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入し、胚
を移植して、生殖細胞系列伝達のためにキメラを生成した。トランスジェニックヘテロ接
合体を遺伝子型決定によって検証し、Ｃ５７ＢＬ／６野生型に４回戻し交配した後に繁殖
させてホモ接合性にした。Ａｎｏ５^－／－マウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの種族を繁殖
させ、ＲＩＮＣＨの動物飼育施設内でホモ接合性動物として標準条件下で維持した。それ
らを、１２時間：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏ
ｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８％食物繊維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持
した。

定量ＰＣＲを行い、Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒ
ｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分析した。反応物を、試料毎に三連で
、Ａｎｏ５（Ｍｍ００６２４６２９＿ｍ１、Ｍｍ０１３３５９８１＿ｍ１）、Ａｎｏ６（
Ｍｍ００６１４６９３＿ｍ１）、及びＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）のＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプライマー－ＦＡＭプローブカクテルを用いて泳動さ
せた。△△Ｃｔ法を使用して、野生型と比較したＡｎｏ５^－／－筋肉中のＡｎｏ５及びＡ
ｎｏ６ ｍＲＮＡの正規化された倍数変化減少を計算した。全ＲＮＡを、製造業者のプロ
トコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｌｂａ
ｄ，ＣＡ）を使用して新鮮凍結筋肉シェービングから単離した。その後、ＲＮＡを、ＲＮ
ＡＥａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してカラム精製し、Ｎａ
ｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔ
ｈａｍ，ＭＡ）を使用して分光測光によって定量した。ｃＤＮＡを、１反応当たり等量（
２００～５００ｎｇ）の試料ＲＮＡを使用して、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｔｉｙ ｃＤＮＡ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で生成した。半定量ＰＣＲの場合、等体積のｃＤＮＡを３０回
のＰＣＲサイクルに供し、続いて、アガロースゲル電気泳動を行った。使用したプライマ
ーは、以下の通りであった。
ｍβＡＣｔ－ｒｔ－５´ ＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号７）
ｍβＡｃｔ－ｒｔ－３´ ＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣ（配列
番号８）
ｍＡｎｏ５－ｒｔ－Ｆ１ ＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴ（配列番号９）
ｍＡｎｏ５－ｒｔ－Ｒ１ ＧＡＣＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧ（配列番号
１０）
ｍＡｎｏ５－ｒｔ－Ｆ３ ＣＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴ（配列番号１１
）
ｍＡｎｏ５－ｒｔ－Ｒ３ ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣ
（配列番号１２）

定量ＲＴ－ＰＣＲは、試験した全ての筋肉において、カセット前転写物の約８０％の低
減及びカセット後ＡＮＯ５転写物の９９％超の低減を示した（図１ｄ）。胚致死も繁殖困
難も顕著ではなかった。Ａｎｏ５がＡｎｏ６に著しい配列相同性を共有し、かつＡｎｏ６
がいくつかの条件下で骨格筋において発現されることが既知であるため、ＲＴ－ＰＣＲを
行って、Ａｎｏ５^－／－マウス筋肉のＡＮＯ６ ｃＤＮＡの相対発現を測定した。定量Ｒ
Ｔ－ＰＣＲは、Ａｎｏ５欠損筋肉におけるＡｎｏ６転写物の適度であるが、統計的に有意
ではない上昇を示す。

実施例２
Ａｎｏ５^－／－マウスの臨床及び組織病理学的評価
Ａｎｏ５^－／－マウスは、増加したクレアチンキナーゼレベル、筋肉間での可変衰弱、
筋線維径の変化、及び運動不耐性を含む、ヒトＡＮＯ５ミオパチーの特性を示す多くの特
徴を呈した。血清クレアチンキナーゼは、Ａｎｏ５^－／－マウスにおいておよそ２倍上昇
する（図２ａ）。

強縮力測定結果を、１０ヶ月齢のマウス（１系統当たりｎ＝６匹のマウス）の指伸長筋
（ＥＤＬ）、４ヶ月齢のマウス（１系統当たりｎ＝５匹のマウス）の前脛骨筋（ＴＡ）、
及び１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウス及びＷＴマウス（１系統当たりｎ＝４匹のマウス
）の横隔膜筋から得た。ＥＤＬを腱で切除し、生理学プロトコルに供して、Ｒｏｄｉｎｏ
－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：４５，２００７）及び
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２４５－２５６，２００５）によって
以前に説明されたように、修正を加えて機能を評価した。伸張性収縮プロトコル中、５％
伸長再長期化手順を５００～７００ミリ秒間実行した（１００ミリ秒にわたって５％伸長
し、続いて、１００ミリ秒後に最適な長さに戻す）。強縮及び伸張性収縮プロトコル後、
マウスを安楽死させ、筋肉を切除し、湿潤秤量し、トラガカントガムを使用してチャック
上に取り付け、その後、液体窒素中で冷却したメチル－ブタン中で凍結した。ＴＡにおけ
る力測定を、Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：１６
５６－１６６３，２０１１）及びＷｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０：９９
２－１０００，２０１４）によって説明されるように行った。

横隔膜力測定の場合、マウスを安楽死させ、横隔膜を、肋骨が付いた状態で、かつ腱中
心を無傷の状態で切除し、Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．
１７９：２４６４－２４７４，２０１１）、Ｒａｆｅａｌ－Ｆｏｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ
．Ｃｉｒｃ．１２４：５８２－５８８，２０１１）、及びＧｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ａ
ｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌ．１：３４－４４，２０１４）によって以前
に説明されたように、クレブス－ヘンゼライト（Ｋ－Ｈ）緩衝液中に置いた。２～４ｍｍ
幅の横隔膜切片を単離した。横隔膜条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉ
ｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片
の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した
酸素化Ｋ－Ｈ溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアル
モード力変換器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕ
ｒｏｒａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金プレート電
極を、筋肉の長さに隣接するように臓器浴内に位置付けた。筋肉を１ｇの最適な張力に伸
長させ、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、
筋肉を、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなる
ウォームアップに供した。３分間の休止期間後、横隔膜を、各刺激間に２分間の休止期間
を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激し
て、最大強縮力を決定した。筋肉の長さ及び重量を測定した。強縮力を、筋肉の重量及び
長さに対して正規化した（ＣＳＡ：筋肉量（ｍｇ）／｛Ｌｆ（ｍｍ）×筋肉密度（１．０
６ｍｇ／ｍｍ^３）｝）。統計的有意性を、比力についての対応のないスチューデントｔ検
定及び伸張性収縮プロトコルに対する耐性の繰り返し測定を伴う二元配置分散分析を使用
して評価した。

筋肉収縮の比力は、横隔膜で約１５％著しく減少した（図２ｂ）が、Ａｎｏ５^－／－マ
ウスの指伸長（ＥＤＬ）筋及び前脛骨（ＴＡ）筋には本質的に影響を及ぼさなかった（図
２ｃ）。筋肉間のこのばらつきは、ＡＮＯ５ミオパチーの特徴であり、異なる筋肉の組織
学的分析においても観察された。野生型（ＷＴ）と比較して、平均筋線維径は、Ａｎｏ５
^－／－マウス由来の腓腹（ＧＡＳ）筋において著しく小さく（Ａｎｏ５^－／－：３５．８
±８．３μｍ、ＷＴ：４１．８±１１．０μｍ、Ｐ＜０．００１）、ＴＡ筋においてより
小さい程度に小さかった（Ａｎｏ５^－／－：３８．１±１１．８μｍ、ＷＴ：４４．３±
１２．２μｍ、Ｐ＜０．００１）（図２ｄ、ｅ）。Ａｎｏ５^－／－筋肉は、中心核及び偶
発的な壊死線維を含む軽度の組織病理学を呈した（図２ｄ、ｅ）。

運動耐性を評価するために、７．５ヶ月齢一致のＡｎｏ５^－／－マウス及びＷＴマウス
を、毎週１時間の運動レジメンに２ヶ月間供した。各マウスを、１５ｍ／分の速度で－１
０°下降で週に１回走らせ、疲労に達するまで毎分１ｍ増加させた（１系統当たりｎ＝３
匹のマウス）。マウスが電気刺激を２０Ｖに設定した衝撃板（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に運動を試みることなく１０秒超にわたって留まったときに、各個
々の試験を止めた。中断を、マウスが走行を止め、トレッドミルベルトが衝撃板に戻って
いる間に休憩した時間と定義する。ＷＴ対照マウスが中断なしに一貫した速度で走行した
一方で、Ａｎｏ５^－／－マウスは、トレッドミルベルトが衝撃板に戻るまで走行を止めた
トレッドミル上での頻繁な中断の傾向があった（図２ｆ）。

電気生理学を、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．１：３４－４４，２０１４）に記載の方法と同様の方法を使用して、６～８ヶ月
齢のＡｎｏ５^－／－筋肉及び対照筋肉上で行った。マウスを、吸入イソフルランを使用し
て麻酔し、後肢をマウスの身体から離して４５^ｏで伸長させた状態で腹臥位に置いた。複
合筋活動電位（ＣＭＡＰ）振幅を、変異マウス（ｎ＝６匹の動物、１２の後肢）及び対照
マウス（ｎ＝７匹の動物、１４の後肢）における最大上坐骨神経刺激後に両側下腿三頭筋
から測定した。針筋電図法を右側ＧＡＳ筋肉で行い、線維自発電位の存在または不在につ
いて評価した。局所インピーダンス測定または電気インピーダンス筋運動記録法（ＥＩＭ
）を、筋萎縮性側索硬化症及び筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて以前に報告され
た方法と同様の方法（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６５９７６，２０１
３、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ ４９：８２９－８３５，２０１
４）を用いて、Ｓｋｕｌｐｔ Ｉｎｃ ＥＩＭ１１０３システム（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉ
ｓｃｏ，ＣＡ）を使用して１０００Ｈｚ～１０ＭＨｚの周波数で両側ＧＡＳ筋に行った。
１ｍｍ離間した４つの２６ゲージ絶縁筋電図針電極（Ｎａｔｕｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，
ＷＩ）を有する固定電極アレイを表面電極の代わりに使用した。電極アレイを、筋線維方
向に関して長手方向構成で両側腓腹筋の腹部に挿入し、各筋肉におけるインピーダンス測
定の２回の試行結果を得て、各肢における単一値について平均した（各群ｎ＝６匹の動物
、１２の後肢）。以前に公開されたＥＩＭ研究慣習を使用して、かつ単純化のために、リ
アクタンス、抵抗、及び位相を、２つの電流周波数５０ｋＨｚ及び１００ｋＨｚで分析し
た。ＣＭＡＰ振幅及びインピーダンス特性を、両側ｔ検定を使用して比較した。針筋電図
法、誘発複合筋活動電位記録、及び電気インピーダンス筋運動記録法を、Ａｎｏ５^－／－
マウス及びＷＴマウスの後肢に行ったが、ヒト疾患と同様に、有意な変化を示さなかった
（図３）。

ヒトＡＮＯ５ミオパチーの別の特性的特徴は、筋肉内堆積物を有する過剰な数の筋線維
の存在である。断面筋線維径を、６ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウス及びＷＴ系統対照マウ
ス（１系統当たりｎ＝３匹のマウス）由来のＴＡ筋及び腓腹（ＧＡＳ）筋から決定した。
筋肉を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。１動物当たり４つ
のランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。線維
径を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを使用して筋線維にわた
って最も短い距離を測定することによって決定した。線維径ヒストグラムを、１ＴＡ当た
り５００～６００個の線維及び１ＧＡＳ当たり６００～７００個の線維の平均から生成し
た。対応のないｔ検定を使用して、Ａｎｏ５^－／－線維サイズとＷＴ線維サイズとの間の
有意差を試験した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

筋肉内の凝集体を定量化した。１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウス及びＷＴマウス（１
組織及び１系統当たりｎ＝３匹のマウス）のＴＡ筋及びＧＡＳ筋からの筋肉切片を、Ｇｏ
ｍｏｒｉ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した。４つの２０倍画像を撮影し、１つ以上の凝集
体を有する線維の数を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して計数し、総線維数のパー
センテージとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、一元配置分散分析
を、Ａｎｏ５^－／－線維とＷＴ線維との間の有意性を試験するために使用した（＊＊＊＊
ｐ＜０．０００１）。

加えて、コハク酸デヒドロゲナーゼ染色（ＳＤＨ）を、凝集体及び筋肉で行った。前脛
骨（ＴＡ）筋及び大腿四頭筋を１８μｍで切片化し、０．１Ｍコハク酸及び０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した０．２％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）か
らなるＳＤＨ溶液で染色し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、ス
ライドを水ですすぎ、連続アルコール中で脱水し、その後、キシレンで透徹した。スライ
ドをＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラ上で撮像した。

４ヶ月齢及び１０ヶ月齢のＡｎｏ５^－／－マウス及び対照マウス由来のＴＡ筋区分を除
去し、木製舌圧子にわたってそれらの生体長に伸長させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）中３％グルタルアルデヒド中に４時間浸漬した。筋肉を長さ２ｍｍの組織ブロック
に切除し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に一晩保管し、続いて、１％四酸化オ
スミウム中に２時間にわたって後固定し、段階的エタノール溶液中で脱水した後、プラス
チック包埋した。厚さ１μｍの断面をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡法によって
試験し、選択されたブロック由来の組織切片を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓカメラ及びソフトウェアを利用してＨｉｔａｃｈｉ Ｈ－７６
５０ ＴＥＭ電子顕微鏡下で試験した。

Ａｎｏ５－／－マウス筋肉において、これらの構造は、Ｐａｖｌｏｃｉｃｏｖａ ｅｔ
ａｌ．（Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：４２５－４４０，２
００３）に記載されるように、修正トリクローム染色で赤色に染まる、厳密に規定され、
不規則に輪郭形成された領域として現れる。細胞質凝集体は、９ヶ月齢の初めに明らかで
あり、経時的に増加した（図４ａ）。同様の外観の凝集体が正常な老化マウスにおいて顕
著であったため、凝集体出現を定量化した。Ａｎｏ５^－／－線維のおよそ２５％がトリク
ローム染色時に不規則に輪郭形成された赤色領域を示した一方で、対照線維の０．０２％
未満しかこれらの凝集体を有しなかった（図４ｂ）。電子顕微鏡法（ＥＭ）は、これらの
凝集体が膜質材料から成ることを明らかにした。多くのＡｎｏ５^－／－筋線維は、小胞膜
もしくは管膜の密に密集した凝集体、または光学顕微鏡法で見られる凝集体に対応するけ
ば状の内部小管を有する偶然に配向されて緩く密集した相互接続管形成を呈した（図４ｃ
、ｄ）。ＡＮＯ５^－／－マウスは、診断されたＡＮＯ５患者の病理学的所見と一致する同
様の病理学的所見を示した。ＡＮＯ５遺伝子のコード領域における２つの変異に複合ヘテ
ロ接合性の患者筋肉の電子顕微鏡法［ｃ．１５５Ａ＞Ｇ（ｐ．Ａｓｎ５２Ｓｅｒ）］＋［
ｃ．１９１ｄｕｐＡ（ｐ．Ａｓｎ６４Ｌｙｓｆｓ×１５）］は、多数の凝集体及び変性ミ
トコンドリア領域を示す多数の部位を明らかにした。Ａｎｏ５^－／－筋肉中の凝集体は、
ＳＥＲＣＡ１に対して陽性に染色したが、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性に対
しては陽性に染色せず、それらがミトコンドリアではなく筋小胞体に由来することを示唆
した（図４ｇ）。しかしながら、Ａｎｏ５^－／－マウスは、膜凝集体に加えて変性ミトコ
ンドリア及び筋鞘下ミトコンドリア蓄積を呈した（図４ｅ）。ミトコンドリアの筋鞘下蓄
積を、ＳＤＨに対して凍結切片を染色することによって確認し、それは、筋線維の表面近
くの密集パッチに局在した（図４ｆ）。観察されたミトコンドリア変性が機能的意義を有
したかを特定するために、クエン酸シンターゼ活性を無傷のミトコンドリアの尺度として
定量化し、ＷＴ対照と比較してＡｎｏ５^－／－筋肉抽出物の著しい減少があったことを示
した。

実施例３
Ａｎｏ５が膜修復を促進する
健常個体において、通常の運動は、（ｉ）小さい裂け目が新たな原形質膜の組立によっ
て再封止される、（ｉｉ）より重度の破壊を有する部位が、筋芽細胞様細胞に分化し、融
合して、多核筋線維を再生する衛星細胞によって修復されるという２つのプロセスによっ
て治癒される小さい病変を原形質膜にもたらす。ＡＮＯ５発現の損失の膜修復への影響を
試験するために、単離された短趾屈（ＦＤＢ）筋線維に送達される高強度レーザーパルス
によってもたらされた膜損傷の影響を試験した。１２μｍの凍結切片をＦｉｓｈｅｒ Ｓ
ｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド上に置き、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清及び０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ－２０で、室温で１時間ブロックした。スライドを一次抗体中で、室温で１時間イ
ンキュベートした（Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｆ７４２５ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１
：１７５）、Ｓｅｒｃａ１ ＣａＦ２－５Ｄ２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄ
ｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、１：５０）。その後、スライドを室温で１時間
にわたってＰＢＳで３回すすぎ、続いて、３０分間ブロックした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ
ｒ ５９４にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（Ａ２１１２５、Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８にコンジュゲートしたヤ
ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ａ１１０１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：２
５０でブロッキング溶液中に希釈し、４５分間インキュベートし、続いて、１時間にわた
ってＰＢＳで３回すすいだ。切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）マウンティング培地にマウントし、Ｃｙ５フィルター（励
起５７８ｎｍ～５９０ｎｍ、発光６０３ｎｍ～６７１ｎｍ）（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗ
ｏｏｄ，ＮＹ）を使用してＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２顕微鏡で分析した。画像露
光時間を、各抗体の陽性対照を使用して毎日標準化した。画像を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ
４．５ソフトウェアを使用して撮影した。

膜損傷を、水溶液中では蛍光性ではないが、脂質環境下では明るく蛍光を発し、かつ膜
修復の研究に広く使用されている膜非透過性スチリルカチオン染料であるＦＭ１－４３の
蓄積によって評価した。小さい蛍光領域が、レーザー損傷直後にＷＴ線維及びＡｎｏ５^－
／－線維における損傷部位で検出された（図５ａ）。蛍光の増加は、ＷＴ線維よりもＡｎ
ｏ５^－／－筋線維で大きく、約２倍速い初速度で生じた。ＷＴの蛍光が１９０秒時点で水
平になるように見えた一方で、Ａｎｏ５^－／－線維の蛍光は、本実験の期間中、増加し続
けた（図５ｂ）。

膜修復の欠陥がＡＮＯ５発現に直接関連するかを試験するために、ヒトＡＮＯ５ ｃＤ
ＮＡを、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してＡｎｏ５^－／－筋肉で発現させた（図
４ｂ、ｃ）。ヒトＡＮＯ５ ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ＭＨＣＫ７プロモーターとポリ
アデニル化シグナルとの間のＮｏｔ１制限部位を使用してＡＡＶ２ ＩＴＲプラスミドに
クローニングした。ｒＡＡＶベクターを改変クロスパッケージングアプローチによって産
生し、これにより、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９
１－８０１，２００）に記載されるように、ＡＡＶ２型ＩＴＲを複数のＡＡＶカプシド血
清型にパッケージングすることができる。産生を、ＨＥＫ２９３細胞を使用した標準の３
プラスミドＤＮＡ ＣａＰＯ_４沈降法を使用して達成した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％
コスミック仔ウシ血清（ＣＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。産
生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ＡＮＯ５、（ｉｉ）ｃａｐ血清型８様単
離ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２－ｃａｐ８改変ＡＡＶヘルパープラスミド、及び（ｉ
ｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、及びＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発
現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。ベクタ
ーを、（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１０３１－１０３９８，１９９９）に
以前に記載されているように、線形ＮａＣｌ塩勾配を使用して、連続イオジキサノール勾
配精製及びアニオン交換カラムクロマトグラフィーによって浄化ＨＥＫ２９３細胞溶解物
から精製した。定量ＰＣＲベースの滴定法を、Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出
器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
を利用してカプシド形成ベクターゲノム（ｖｇ）力価を決定するために使用した。

マウス筋肉への筋肉内注射によるＡＡＶベクターの送達。４５週齢のＡｎｏ５^－／－マ
ウスを、ＴＡ（ｎ＝４）筋またはＦＤＢ（ｎ＝４）筋への１×１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒ
ｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈｕＡＮＯ５．ＦＬＡＧの筋肉内注射により処置した。ＴＡ筋を
注射４週間後に採取し、組織学的試験及び免疫蛍光試験のために処理した。

短趾屈（ＦＤＢ）筋線維を１０週間後に採取し、レーザー誘起損傷に供した。膜修復ア
ッセイを、Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎ
ｅｕｒｏｌ．２：２５６－２７０，２０１５）によって説明されるように、Ａｎｏ５－／
－マウス（ｎ＝４）及び週齢一致Ｃ５７ＢＬ６（ｎ＝４）マウスの左側及び右側ＦＤＢ筋
に行った。簡潔に言えば、ＦＤＢ線維を、ＤＭＥＭ中に懸濁した２ｗ／ｖ％のコラゲナー
ゼＩ型を含有する溶液を使用して単離した。筋肉を解離した後、線維を、１．５ｍＭのＣ
ａ２＋中に懸濁したダルベッコＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇなし）中の２．５μＭのＦＭ１－４３
色素を保持するガラス底皿に置いた。線維を、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（登録商標）ＦＶ１００
０二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用してレーザー損傷に供した
。線維を２０％電力で４．４７９ｍｍの８５０ｎｍレーザー誘導スポットで損傷し、１９
０秒間にわたって５秒毎に撮像して、ＦＭ１－４３色素取り込みを可視化した。１匹のマ
ウスの１つの筋肉当たり平均７～１０個の線維を撮像した（合計３１個のＷＴ線維、３９
個のＡｎｏ５－／－線維、及び３０個のＡＡＶ－ＡＮＯ５レスキューＡｎｏ５－／－線維
）。膜上の損傷部位を取り囲む色素浸潤の蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用
いて、規定された領域内の画素強度の積分密度を測定することによって分析した。これを
行うために、ＩｍａｇｅＪの２倍ズーム設定下で、０．７５画素×１．００画素の大きさ
の矩形の箱を描き、これを使用して、その領域内の色素の強度を測定した。本分析におい
て、個々の時点で測定された蛍光強度を、ｔ＝－５秒（損傷前）で測定した初期強度に正
規化した。蛍光強度を分析したときに、各系統由来の全ての線維からの値を一緒に平均化
した。二元配置分散分析を行って、各時点での処置した線維と処置していない線維との間
の統計的有意性を決定した（ｐ＜０．００１）。蛍光の変化を定量化するために、データ
点を、Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ９．１を使用してＨｉｌｌ等式に当てはめた。全ての曲線
が調整されたＲ２＞０．９９８と適合した。Ａｎｏ５－／－線維、ＷＴ線維、及びＡＡＶ
．ＡＮＯ５処置Ａｎｏ５－／－線維は、損傷後１００秒時点で著しく異なった。ＡＡＶ．
ＡＮＯ５は、Ａｎｏ５－／－筋肉における膜再封止を部分的に修復した（図５ａ、ｂ、ｃ
）。

実施例４
Ａｎｏ５ ＫＯマウスにおける再生障害
筋肉再生もＡｎｏ５^－／－マウスにおいて欠損していたかの調査を、心臓毒注射によっ
てもたらされた損傷から回復する筋肉の能力を試験することによって行った（図５ｄ）。
マウスを吸入イソフルレンで麻酔し、心臓毒を２週間に１回、合計３ラウンドにわたって
注射した（滅菌生理食塩水で１０μＭに希釈）。３０μＬ及び５０μＬの心臓毒を、それ
ぞれ、８週齢のＡｎｏ５^－／－マウス及び週齢一致対照の左側ＴＡ筋及び左側ＧＡＳ筋に
注射した。滅菌生理食塩水を、偽対象として対側筋肉に注射した。マウス群を安楽死させ
、マウスの筋肉を、心臓毒の最終注射後１、３、７及び１４、３０、及び９０日時点で採
取した（１時点当たり１系統当たりｎ＝３匹のマウス）。１ＴＡ当たり４つの２０倍画像
を撮像し、線維径を、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ ４．８を使用して、心臓毒の最終注入の
１ヶ月及び３ヶ月後にＨ＆Ｅ染色凍結切片上で測定した。平均５００～６００個の筋線維
を測定し、対応のないｔ検定を行って（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）、損傷Ａｎｏ５
^－／－マウス及び損傷対照マウスとの間の筋線維サイズの統計的有意性を決定した（＊＊
＊＊ｐ＜０．０００１）。

壊死及び再生の経時的変化を追跡するために、８週齢のマウスのＴＡ筋及びＧＡＳ筋に
、心臓毒を２週間間隔で３回注射した。組織を最終注射の１、３、７、１４、３０、及び
９０日後に採取した（図５ｄ）。対側を生理食塩水のみ対照として使用した。ＷＴ筋肉が
心臓毒処置後に再生したため、１ヶ月までに、ＷＴ筋肉が新たに再生された線維における
中心核を除いて大部分は正常であるように見えた。しかしながら、Ａｎｏ５^－／－マウス
において、再生の大幅な遅延及び長期にわたる壊死が存在した。３ヶ月後、Ａｎｏ５^－／
－筋肉の平均繊維径は、ＷＴと比較して著しく減少したままであり、多くの線維が中心核
を呈した（図５ｄ、ｅ）。

実施例５
抗酸化剤療法の影響の評価
アノクタミン５欠損（Ａｎｏ５－／－）マウスの骨格筋に対する三重抗酸化剤食餌の潜
在的利益を試験するために、２ヶ月齢の野生型（ＷＴ）ＢＬ６マウス及びＡｎｏ５－／－
マウスのコホートに、通常のマウス飼料、または１０００ＩＵのビタミンＥ、０．１％α
－リポ酸、及び０．２５％補酵素Ｑ１０（還元ユビキノール形態）を含む三重抗酸化剤組
成物を補充した食餌のいずれかを与えた。マウスを、１６週間の期間にわたって４週間毎
に３日間連続疲労するまで走行させ、屠殺して、筋肉健康（活動及び横隔膜力）ならびに
酸化ストレス（クエン酸シンターゼ活性及びｐｇｃ１α発現）に関連する機能的結果評価
基準を試験した。

オープンフィールドケージ活動のレーザー監視
オープンフィールド活動チャンバを使用して、いくつかの修正を加えて以前に説明され
たプロトコル（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５１１－５
（２００８）、Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７９：２
４６４－７４（２０１１））に従って、実験マウスの全体活動を決定した。全てのマウス
を、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間
に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験
した。また、不安を軽減し、マウスの通常の行動、ひいてはアッセイの結果に影響を与え
る可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために以前の報告で行われたように、我
々は、個別に収容されていないマウスを試験した（Ｖｏｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ ４：２４０－５２（２００５））。マウスの行動を、Ｐ
ｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して監視した。このシステムは、動物
チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、Ｘ－Ｙ－Ｚ平
面内のマウスの位置及び動きを監視する。活動を、５分間間隔の１時間サイクルで記録し
た。マウスを、データ取得開始の数日前に１時間セッションで活動試験室に順応させた。
マウスを、４匹１組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、我
々の結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。収集したデータをＭｉ
ｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、全ての計算をＥｘｃｅｌプログラム
内で行った。各マウスのＸ平面及びＹ平面における動きの個々の光線中断を加算して、合
計歩行を表し、Ｚ平面における光線中断を加算して、１時間間隔内での垂直活動を得た。

１２週及び１６週の終わりに、各群から２匹のマウスを活動ケージ内に置いて、自発的
活動を監視した。全マウス活動を、マウスがトレッドミル疲労後４５分間以内に水平及び
／または垂直レーザー光線を中断した回数として測定した（図６）。抗酸化剤食餌を与え
たＡｎｏ５^－／－マウスが１６週時点で標準の（プラセボ）食餌を与えたマウスよりも活
動的であったことが見出され、抗酸化剤が疲労後の自発的活動にプラスの影響を与えるこ
とを示唆する。

機能的評価のための横隔膜強縮性収縮
行動アッセイがいくらかの処置効果を示唆したが、これらの結果評価基準は、食餌とは
無関係のいくつかの可変物の影響を受けやすい。抗酸化剤補給の骨格筋機能への影響を試
験するために、力測定をＡｎｏ５－／－マウス及びＷＴマウスの横隔膜で行った（図７）
。Ａｎｏ５－／－マウスが横隔膜力を欠損しているが、肢筋では欠損していないことが以
前に実証された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２５：
１９００－１９１１（２０１６））ため、横隔膜を選択した。

マウスを安楽死させ、横隔膜を、肋骨が付いた状態で、かつ腱中心を無傷の状態で切除
し、以前に説明されたように、Ｋ－Ｈ緩衝液中に置いた（Ｂｅａｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ
．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７９：２４６４－７４（２０１１）、Ｒａｆａｅｌ－Ｆ
ｏｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２４：５８２－８（２０１１
）、Ｍｏｏｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ７１：ｅ５００３６（２０１３））。２～４ｍｍ幅の横隔膜切
片を単離した。横隔膜条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐ
ｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取
り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した酸素化Ｋ－Ｈ
溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換
器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏ
ｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金プレート電極を、筋肉の
長さに隣接するように臓器浴内に位置付けた。筋肉を攣縮収縮の測定のために最適な長さ
に伸長させ、その後、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定
した時点で、筋肉を１ｇの最適な長さに設定し、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、
１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなるウォームアップに供した。３分間の休止期間後、
横隔膜を、各刺激間に２分間の休止期間を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、
１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さ及び重量
を測定した。力を、筋肉の重量及び長さに対して正規化した。プラセボ処置ａｎｏ５^－／
－マウスと比較して、三重抗酸化剤処置ａｎｏ５^－／－マウスにおいて横隔膜比力の著し
い改善が観察された（図７）。

ミトコンドリア新生
三重抗酸化剤療法と酸化線維含有量との関係を確立して、ミトコンドリア新生及び機能
を分析した。以前の研究は、経路を刺激する運動がミトコンドリア新生をもたらす一方で
、抗酸化剤療法がこのシグナル伝達を減少させることを示している。雄腓腹筋組織の結果
により、抗酸化剤処置がミトコンドリア新生の主要調節因子であるＰＧＣ－１ａの発現を
減少させたことが確認された（図８ａ）。興味深いことに、クエン酸シンターゼ活性が、
全ての遺伝子型－性組み合わせのうちで、抗酸化剤を与えたマウスにおいてより高いこと
が見出された（図８ｂ）。これに対する１つの単純な説明は、ミトコンドリア含有量の高
い酸化線維の割合の増加が、１線維当たりのミトコンドリア新生のいずれの減少も隠すこ
とである。

要約すれば、三重抗酸化剤療法が、自発的活動、横隔膜強度、線維サイズ、線維型組成
、及びミトコンドリア酵素活性を含む筋肉生理学及び機能のいくつかの評価基準に著しい
影響を与えることが見出された。これらの結果は、ある特定の場合、性特異的であること
が見出された。ＬＧＭＤ２Ｌは、より大きな影響を受けた雄で性特異的である。

Claims (9)

1. 必要としている対象における筋ジストロフィーまたは慢性筋肉消耗を治療するための製剤化された組成物であって、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えＡＡＶベクターを含み、前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、組成物。
2. 必要としている対象における筋肉を再生するための製剤化された組成物であって、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えＡＡＶベクターを含み、前記対象が、ＡＮＯ５遺伝子に劣性変異を有する、組成物。
3. 前記組換えＡＡＶベクターが、筋肉特異的制御要素に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 筋肉内または静脈内注射用に製剤化される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 抗酸化剤組成物の治療有効量をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記対象が、ジスフェルリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ、または三好型ミオパチー３、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ジスフェルリノパチー、筋細線維ミオパチー、サルコグリカノパチー、またはＺＡＳＰ関連ミオパチーに罹患している、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記組成物の投与が、前記対象の骨格筋における酸化ストレスを低減した、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記組成物の投与が、前記対象の骨格筋機能を改善する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

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