BR102020023425A2 - Vetor biológico para tratamento de doenças neurodegenerativas com base em terapia gênica - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao vetor biológico de vírus adeno-associado contendo o gene de interesse, Max (humano), associado a elementos genéticos específicos, como as sequencias operacionais promotora e terminadora da transcrição, sendo capaz de expressar altos níveis da proteína derivada do gene Max humano nas células transduzidas pelo vetor. Esse vetor biológico pode ser usado como fármaco baseado em terapia gênica aplicado a terapêutica médica e veterinária no tratamento de doenças neurodegenerativas.

Description

VETOR BIOLÓGICO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS COM BASE EM TERAPIA GÊNICA Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao vetor biológico de vírus adeno-associado contendo o gene de interesse, Max (humano), associado a elementos genéticos específicos, como as sequencias operacionais promotora e terminadora da transcrição, sendo capaz de expressar altos níveis da proteína derivada do gene Max humano nas células transduzidas pelo vetor. Esse vetor biológico pode ser usado como fármaco destinado a terapia gênica aplicado a terapêutica médica e veterinária no tratamento de doenças neurodegenerativas.

Antecedentes da Invenção Vetores biológicos

[002] Vetores biológicos são empregados como veículo para transferência e expressão de material genético, como DNA ou RNA. Esses vetores entram nas células, tanto in vitro quanto in vivo, e promovem a expressão do material genético exógeno devido a sequências reguladoras neles contidas. Tanto o material genético exógeno como as sequências reguladoras podem ser manipuladas para melhor aplicabilidade do vetor biológico, como por exemplo, o uso de uma sequência reguladoras da expressão que restrinja a expressão do material genético exógeno em um tipo celular específico, as células alvo. Os vetores biológicos também são conhecidos como vetores de transporte ou transferência.

[003] Os primeiros vetores biológicos de DNA recombinante eram na forma de “plasmídeos”, que se referem a loops de DNA de fita dupla circular que, em sua forma de vetor, não estão ligados a cromossomo, e são classificados como vetores não virais. Como estratégia para aumentar a eficiência de transferência de material genético exógeno para células alvo, plasmídeos podem ser conjugados com vesículas lipídicas ou lipossomos, conjugados a proteínas recombinantes e polímeros com características catiônicas, isto é, positivos, os quais interagem facilmente com DNA ou RNA exógeno devido a suas cargas negativas permanentes. Esses conjugados favorecem a entrega no material genético exógeno (para revisão: Expert Opin Drug Deliv. 2016 Oct; 13(10): 1433-1445). No âmbito patentário podemos citar: BR1020160302315A2, BR1020160185068A2, BR1020160177120A2, WO2005065721A2). A introdução de material genético exógeno nas células alvo por vetores não virais é baseada em métodos físicos, como entrega de material genético exógeno com o uso de ultrassom, e métodos bioquímicos, como o uso de nanopartículas poliméricas, entre outros. Vetores biológicos também podem ser construções obtidas a partir de vírus, devido ao fato desses microrganismos possuírem naturalmente a capacidade de infectar células vivas, e nesse caso são denominados vetores virais.

[004] Não existe um vetor biológico ideal, ambos os tipos, virais e não virais, têm suas vantagens e desvantagens quanto à entrega e expressão de material genético exógeno, e também quanto a promover resposta imune em animais e humanos. Recentemente, a combinação de vetores virais com não virais tem apresentado resultados sinergístico na entrega do material genético exógeno com diminuição de resposta imune do organismo, e pode ser vantajosa a combinação dependendo do órgão alvo.

[005] Vetores biológicos são utilizados em terapia gênica. O termo terapia gênica designa o uso de material genético exógeno, que será incorporado a célula alvo através de vetores biológicos, para tratamento de doenças hereditárias ou adquiridas. A correção de um defeito genético no caso de uma doença hereditária, através da introdução de material genético exógeno igual ou semelhante ao gene defeituoso e que restaure a função adequada nas células alvo, já foi demonstrada ser um conceito clinicamente viável [Rosenberg et al. (1990) New Eng. J. Med. 323, 570] .

[006] No âmbito patentário, muitos documentos descrevem construções de vetores biológicos para terapias genéticas. O documento US6521225 descreve a construção de vetores virais especificamente para a entrega de material genético exógeno terapêutico no fígado. O documento WO0182973 descreve vetores virais e não-virais como veículos para entrega de material genético exógeno para o tratamento de doenças ósseas. Mais exemplos são descritos nos documentos US5399346A, WO1993009239A1, WO1997046263A1, US5707618A, WO2017144080A1, WO2017144611A1, US20150232953A1, entre outros.

Doenças neurodegenerativas

[007] Doenças neurodegenerativas se manifestam através da ocorrência ou do aumento nas taxas de morte celular em populações celulares do tecido nervoso que podem ser do cérebro, medula, nervos periféricos ou da retina. Sua patogênese pode incluir mutações, como na doença de Huntington; alterações agudas ou intermitentes no aporte de oxigênio ou nutrientes, como nas doenças cerebrovasculares; ou em consequência a distúrbios sistêmicos, como a apneia obstrutiva; ou um complexo balanço de componentes genéticos e distúrbios funcionais, como na doença de Alzheimer, Parkinson, glaucoma, entre outras.

[008] Nos últimos anos, avanços significativos têm sido feitos no sentido de esclarecer aspectos genéticos e mecanismos celulares e moleculares de algumas dessas doenças neurodegenerativas. Basicamente, as linhas de pesquisa nesse campo visam identificar novos alvos terapêuticos, como no caso da presente invenção, para desenvolvimento de tratamentos inovadores que possam ser testados em modelos experimentais e, subsequentemente, em pacientes.

[009] Os tratamentos de doenças degenerativas em geral, e em particular das neurodegenerativas, são frequentemente frustrados pela multiplicidade de fatores que afetam a sensibilidade das células, levando-as à morte, e degeneração do tecido. Diferentemente das doenças hereditárias monogênicas, causadas por defeitos em um único gene, no caso das doenças neurodegenerativas em geral não há um alvo terapêutico único sensível a fármacos e, por conseguinte, as formas de terapia são muito limitadas, com resultados frequentemente insignificantes, o que representa um campo importante para novas descobertas de fármacos. Atualmente não há tratamentos curativos, ou mesmo paliativos eficazes, para a maioria das doenças neurodegenerativas. O fato da morte celular ser o ponto comum causador da neurodegeneração para patologias multifatoriais, sem etiologia determinada, sugere que uma abordagem terapêutica promissora pode ser baseada na modulação do estado de resistência à morte celular. A pesquisa nesta área é muito intensa em todo o mundo e concentra-se, por um lado, no estudo dos mecanismos de morte celular e de citoproteção e, por outro lado, na formulação de estratégias experimentais de recuperação ou preservação funcional de órgãos ou tecidos, visando reduzir o estresse celular e a probabilidade de morte das células.

Terapias neuroprotetoras

[010] A alternativa mais promissora para combater múltiplos fatores determinantes de patologias neurodegenerativas é o desenvolvimento de terapias neuroprotetoras, isto é, as que diminuem, de forma genérica, a sensibilidade das células do sistema nervoso à morte celular. Métodos farmacológicos baseados em fatores neurotróficos (uma classe de fatores de crescimento com ação no sistema nervoso) ou outras moléculas neuroprotetoras têm se mostrado pouco eficazes, pois é necessária a administração repetitiva dos fármacos. Isto significa injeções repetidas ou infusão contínua diretamente no tecido nervoso ou no líquido cerebrorraquidiano, para ultrapassar a barreira hematoencefálica que dificulta ou impede a distribuição de fármacos do sangue para o tecido nervoso. A solução para evitar o risco associado com a manipulação repetitiva do tecido cerebral se encontra no desenvolvimento de terapias baseadas em um número reduzido de intervenções, idealmente uma única, com resultado permanente.

[011] Tal propósito poderia ser atingido através do desenvolvimento de terapia gênica baseada na descoberta de genes-alvo capazes de proteger o tecido nervoso contra múltiplos fatores determinantes da morte celular. Entretanto, a identificação de possíveis genes alvo para terapia gênica contra neurodegenerações não é trivial. Em muitas doenças neurodegenerativas a causa da doença não é um defeito genético, que poderia ser obviamente corrigido.

[012] Vários artigos científicos apresentam propostas de terapia gênicas neuroprotetora como para doenças neurodegenerativas como a de Parkinson, com vetores biológicos contendo diferentes matérias genéticos exógenos, como genes Parkin, GBA-1, Beclin-1, PCG-1alfa, Neurturin, GDNF, CDNF, BDNF, XMP1s, GRP78/BIP e alguns RNAs de interferência, todos apresentado efeitos neuroprotetores em modelos experimentais animais. Algumas dessas propostas avançaram à estudos clínicos e geração de novos fármacos.

[013] No âmbito patentário, encontra-se uso de vetores virais para entrega de material genético exógeno para células do sistema nervoso, WO1995028493A1, bem como modulação da expressão de material genético para neuroproteção: US20050209179A1, US6635642B1, WO1999026657A1, EP1162887A1, WO2002081628A2, WO2001089583A2, US7588757B2, US20050119212A1, US20050182009A1, WO2003018821A2 entre outras. Ainda no âmbito patentário, terapia gênica para doenças neurodegenerativas hereditárias, devido a mutações gênicas, e que levam a neurodegeneração como manifestação clínica são exemplificadas por US6331523B1, WO2014011210A1, US7091005B2. No caso da doença de Parkinson, doença neurodegenerativas multifatorial que não é devida a mutação em um único gene, pesquisas em roedores demostraram que a neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos poderia ser revertida por exemplo pela expressão de glicocerebrosídeos, o que gerou uma patente de terapia gênica (WO2016179497A1), entre outras (BRPI0707590A2, WO2006119458A1, WO2005039643A2, US6800281B2). Entretanto, nenhum dos documentos descritos se sobrepõe à presente invenção

Gene Max

[014] O gene max codifica duas isoformas da proteína Max, uma com massa molecular de 21kDa e outra ide 22 kDa. Entende-se por isoforma uma proteína muito semelhante a outra, estruturalmente oriunda do splicing alternativo de um mesmo gene. Não se sabe muito sobre diferenças funcionais entre as duas isoformas. Ambas as proteínas Max, 21 e 22KDa, funcionam no controle da transcrição gênica. Para tal, Max pode se ligar a outras proteínas conhecidas como pertencente à família Myc-Max, que compreende Myc, Mnt, Mad1, Mad2, Mad3, Mad4, formando heterodímeros que se ligam ao DNA e controlam a transcrição gênica. Max também pode se ligar a ele mesmo, formando homodímeros Max-Max, que também controlam a transcrição gênica. Esse conjunto de heterodímeros formados por Max ligado a outra proteína membro da família Myc-Max, e homodímeros formados pela ligação Max-Max, tem efeitos antagônicos, nos quais Max-Max antagoniza os efeitos oncogênicos dos heterodímeros da família Myc-Max.

[015] No âmbito patentário, alguns documentos descrevem o gene max. O documento US 5,693,487 descreve sequências nucleotídicas codificando o gene max, que resultam em uma proteína hélice-volta-hélice que forma um complexo de ligação com Myc ou Mad, capaz de se ligar a DNA de forma sequência-específica. Esse documento se refere a moléculas de ácido nucléico que são capazes de hibridizar sob determinadas condições a determinadas sequências nucleotídicas de cDNAs de max ou a sequências nucleotídicas de cDNAs de mad. O polipeptídio Max, quando associado aos polipeptídios Myc ou Mad é capaz de se ligar ao DNA em sequências contendo CACGTG. O documento US 5,302,519 descreve uma sequência nucleotídica que codifica o polipeptídio Mad, capaz de se ligar ao polipeptídio Max e inibir a ligação de Max à sequência nucleotídica CACGTG.

[016] Nenhum dos documentos descritos se sobrepõem à presente invenção pois os mesmos tratam da interação de sequências nucleotídicas específicas do gene max e referem-se à expressão da proteína Max relativa à sua interação com outras proteínas e seus efeitos sobre ligação a uma sequência específica de DNA e sem efeito terapêutico.

Descrição das figuras

[017] Figura 1 é a representação esquemática do plasmídeo principal, pTR-CMV/CBA-GFP, usado para clonagem da SEQ ID NO 2 e posteriormente para produção dos vetores de vírus adeno associado recombinante (rAAV), que contêm a SEQ ID NO 1.

[018] Figura 2 é a representação esquemática do plasmídeo principal agora contendo a SEQ ID NO 2 no lugar do gene GFP e que foram usados para produção dos vetores de rAAV.

[019] Figura 3 é a representação esquemática do genoma do vetor biológico que foi empacotado formando o vetor de rAAV usado nos experimentos que geram a presente invenção. Nesse genoma há componentes do cassete de expressão como a sequência acentuadora de citomegalovírus, o promotor de actina beta de galinha, um íntron quimérico, uma sequência Kozak, todos compreendidos na SEQ ID NO 3, o gene max21, compreendido na SEQ ID NO 2, e um sinal de poli A de vírus símio-40, compreendido na SEQ ID NO 4. Todo esse cassete de expressão está flanqueado pelas sequencias de repetições terminais invertidas do genoma do vetor viral de rAAV, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, as quais são reconhecidas para encapsulamento e formação das partículas virais pelas proteínas do seu capsídeo. Todo esse conjunto, de SEQ ID NO 2 a 6, compreendem a SEQ ID NO 1 contida no vetor biológico de rAAV e que é objeto dessa patente.

[020] Figura 4 mostra o aumento da expressão da proteína Max codificada a partir da SEQ ID NO 1 contida no vetor biológico de rAAV, objeto dessa patente, que foi introduzido na células da camada ganglionar da retina por injeção intraocular do vetor biológico. A expressão aumentada de Max foi confirmada por imunohistoquímica. Vetor de rAAV contendo o transgene para a expressão da proteína verde fluorescente (GFP) foi usado como controle experimental e a expressão de GFP foi confirmada pela fluorescência intrínseca dessa proteína.

[021] Figura 5 mostra gráfico da neuroproteção in vitro por rAAV-Max21 após transecção do nervo óptico. Ratos neonatos (no primeiro dia pós-natal) receberam injeções de vetor rAAV-Max21 em um dos olhos e rAAV-GFP (controle) no outro olho. Após 14 dias, explantes de tecido retiniano foram mantidos por 30 horas in vitro. A taxa de morte celular na camada de células ganglionares da retina foi estimada pela percentagem de perfis condensados, indicativos de morte celular, em relação ao número total de células na área de amostragem (dados individuais no inserto, médias e erros padrão da média no histograma principal). Os explantes de retina que receberam rAAV-Max21 tiveram taxas de morte celular aproximadamente 50% menores que os explantes que receberam o rAAV-GFP controle, mostrando neuroproteção.

[022] Figura 6 mostra neuroproteção das células ganglionares in vivo por rAAV-Max21 após esmagamento do nervo óptico. Ratos foram distribuídos em 4 grupos experimentais conforme o esquema. As células ganglionares, identificadas pela marcação fluorescente vermelha de microesferas, e núcleos totais na camada de células ganglionares, marcados com o intercalante de DNA, Sytox Green, foram quantificadas por contagens em fotomicrografias confocais. Essas contagens foram transformadas em densidades de núcleos (células) e os resultados apresentados na forma de médias e erros padrão da média. As retinas que receberam rAAV-Max21 mostraram neuroproteção frente ao dano no nervo óptico.

Descrição detalhada da Invenção

[023] A invenção se refere a vetor biológico rAAVMax21 de SEQ ID 1 que promove a superexpressão da proteína Max, e assim tendo efeito neuroprotetor, apresentando atividade inventiva e sendo passível de produção e expressão em células adequadas. O vetor biológico rAAVMax21 de SEQ ID 1, contido em uma solução carreadora adequada, pode ser usado como agente farmacêutico baseado em terapia gênica com função neuroprotetora para doenças neurodegenerativas, aplicada a terapêutica médica e veterinária.

[024] O vetor biológico caracterizado pela sequência SEQ ID NO 1 compreende a sequência nucleotídica do gene Max21 definida pela SEQ ID NO 2, operacionalmente ligada às sequências promotora, SEQ ID NO 3, e terminadora, SEQ ID NO 4, da transcrição. Todo esse cassete de expressão, compreendendo as SEQ ID NO 2, 3 e 4, está flanqueado pelas sequencias de repetições terminais invertidas do genoma do vírus de AAV, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, as quais são reconhecidas para encapsulamento e formação das partículas de vetores virais pelas proteínas do seu capsídeo. Dessa forma vetores biológicos, compreendendo a SEQ ID 1 são empregados como veículo do material genético exógeno. Os vetores também são empregados para expressão do transgene terapêutico, definido pelas SEQ ID NO 2, por estar associado a elementos genéticos específico que são as sequências regulatórias promotora, SEQ ID NO 3, e terminadora, SEQ ID NO 4, da transcrição.

[025] No contexto da presente invenção, entende-se por terapia gênica neuroprotetora o tratamento de doenças neurodegenerativas por um fármaco que consiste em vetor biológico caracterizado pela SEQ ID NO 1, para transportar e promover a expressão, na célula alvo, do material genético exógeno, terapêutico, e para isso esse vetor biológico, caracterizados pela SEQ ID NO 1, contém as SEQ ID NO 2, 3, 4, 5 e 6. Entende-se por doenças neurodegenerativas todas as doenças que levam à degeneração e morte celular no sistema nervoso, comprometendo seu funcionamento.

[026] Conforme aqui usado, o termo solução carreadora que contém o vetor biológico envolve qualquer dos veículos farmacêuticos padrões, tais como uma solução de salina tamponada com fosfato, água, e emulsões, tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes de umedecimento. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes, e qualquer dos veículos acima notados, com a provisão adicional que eles sejam aceitáveis para uso in vivo. Para exemplo de veículos, estabilizadores e adjuvantes, ver Martin REMINGTON'S PHARM. SCL, 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) e Williams & Williams, (1995), e em "PHYSlClAN'S DESK REFERENCE", 52“ed, Medical Economics, Montvale, N. J. (1998). Os veículos podem também compreender fluido cerebrospinal artificial, adequado para uso em pacientes. Vale ressaltar que a solução carreadora não é objeto dessa patente.

[027] Como aqui usado, o termo vetor biológico é entendido como um veículo para transferência e expressão de material genético exógeno compreendido na SEQ ID NO 1 na célula alvo. O vetor biológico pode ser viral, não viral ou mistura dos mesmo desde que transfira o material genético para células alvo e promova sua expressão de forma eficiente. Para a presente invenção o vetor biológico é o rAAV e por isso contém sequencias de repetições terminais invertidas do genoma do vírus AAV, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, as quais são reconhecidas para encapsulamento e formação das partículas virais pelas proteínas do seu capsídeo.

[028] Vetores biológico incluem em seu genoma elementos operativos que permitem a expressão do transgene terapêutico, que compreende a SEQ ID NO 2. Esses elementos operacionais compreendem sequências promotoras, acentuadoras, terminadoras e reguladoras heterólogas que comandam a expressão do transgene e para a presente patente estão contidos nas SEQ ID NO 3 e 4.

[029] Entende-se por célula alvo a célula que receberá o vetor o qual compreende SEQ ID NO 1 e que, devido aos elementos operativos reguladores da expressão do transgene, contidos nas SEQ ID NO 3 e 4, transcreverá a SEQ ID NO 2 em RNA mensageiro que então será traduzido na proteína Max de 21 KDa de SEQ ID NO 7.

[030] A SEQ ID NO 2 é a sequência codificadora, isto é, a sequência de nucleotídeo que uma vez transcrita em RNAm e traduzida em proteína, essa corresponderá a sequência de aminoácidos da proteína Max de 21 KDa (Seq. ID NO 7).

[031] A presente invenção tem base na constatação de que a administração intraocular do vetor de rAAV que compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO 1, que por sua vez compreende a sequência nucleotídica do gene Max21 definida pela SEQ ID NO 2, operacionalmente ligada às sequências promotora, SEQ ID NO 3, terminadora da transcrição, SEQ ID NO 4, e flanqueado pelas sequencias de repetições terminais invertidas do genoma do vírus de AAV, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, promoveu a superexpressão da proteína Max 21 KDa nas células na camada de células ganglionares da retina e resultou em uma redução da sensibilidade destas células ganglionares à morte celular após transecção dos seus axônios em experimentos in vitro e in vivo.

[032] Nos resultados apresentados nessa patente foi utilizado o vetor viral recombinante derivado de vírus adeno-associado (rAAV). O vetor de rAAV é muito adequado para estratégias de terapia gênica, por ser derivado de um vírus não patogênico, gerando pouca resposta imune do organismo. Principalmente no tecido nervoso, como por exemplo na retina, as células em contato com o rAAV são facilmente infectadas, levando à expressão do material genético exógeno ou transgene. No entanto, para a presente patente o vetor biológico pode ser substituído por qualquer outro de transferência gênica, sendo viral ou não viral ou mistura dos dois, que promova entrega e expressão da sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO 1. Além disso vetores virais e não virais são constantemente aprimorados, por exemplo para aumentar a afinidade com o tecido ou célula alvo e por isso não consideramos o objeto da patente como sendo vetor específico/dependente.

[033] As sequências operacionais, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, compreendias na sequência nucleotídica SEQ ID NO 1, estavam presentes no vetor de rAAVmax21 que foi usado nos experimentos base para essa invenção. A sequência operacional SEQ ID NO 3 representa sequências promotoras da expressão gênica, todos a montante do transgene compreendido na SEQ ID NO 2. A jusante do transgene compreendido na SEQ ID NO 2, há uma sequência operacional de terminação transcricional, que é de poliA do vírus Símio-40, compreendido SEQ ID NO 4. Elementos reguladores da expressão estão constantemente sendo aprimorados, de forma que outras sequências reguladoras podem ser usadas em um vetor biológico que compreenda a SEQ ID NO 1 da presente invenção. Sequências reguladoras adicionais podem ser selecionadas por um técnico no assunto com base no conhecimento geral comum.

Construção do plasmídeo contendo SEQ ID NO 1

[034] Para gerar vetor plasmidial base contendo a SEQ ID NO 1, foram inicialmente desenhados 2 primers (SEQ ID NO 8 e SEQ ID NO 9), para a região inicial (FW) e terminal (REV) do cDNA de max21. Vale ressaltar que foi incorporada uma sequência kozak a montante do códon de iniciação da SEQ ID NO 2, fazendo parte da sequência reguladora da expressão gênica, SEQ ID NO 3. Essa sequência kozak é encontrada naturalmente em alguns RNA mensageiro eucariotos e tem a função de aprimorar o processo de tradução do RNA mensageiro para proteína. A sequência kozak não está naturalmente presente à frente do RNA mensageiro de Max, porém foi incorporada a montante da SEQ ID NO 2 para melhorar sua tradução. Ambos os primers foram flanqueados pelas sequências-alvo da enzima de restrição NotI, que é posteriormente usada como sítio de clonagem. Essa enzima de restrição pode ser substituída por qualquer outra enzima de restrição de acordo com as características do sítio de restrição inserido para clonagem de cada vetor biológico.

[035] O cDNA para max21 foi gentilmente cedidos por Robert N. Eisenman (Fred Hutchinson Cancer Research Center - Seatle, Washington). Com uma polimerase comercial (pfu 1,5U/ 50μl de reação - Stratagene) foi feita uma PCR (reação em cadeia de polimerase) junto com os primers descritos acima do cDNA de max21. A sequência de DNA gerada foi inserida no plasmídeo-ponte comercial TOPO, seguindo o protocolo e os reagentes do kit TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), o que permite efetuar clonagem diretamente a partir do produto de PCR. Os plasmídeos contendo o inserto foram digeridos com a enzima de restrição NotI (Promega). Os fragmentos gerados foram purificados a partir de gel de agarose com o kit DNA cleaner (Invitrogen).

Produção do plasmídeo principal para produção dos vetores de rAAV contendo SEQ ID NO 1

[036] Os plasmídeos principais de rAAV são construídos com base no plasmídeo pTR-CMV/CBA-GFP, que foi gentilmente cedido por William Hauswirth (Universidade da Florida) (Figura 1). Esse plasmídeo contém o transgene de green fluorescente protein (GFP) flanqueado pela enzima de restrição NotI. Entende-se por transgene uma sequência polinucleotídicas de DNA exógena à célula alvo, que será introduzida na célula alvo pelo vetor biológico de transferência gênica e terá sua transcrição promovida pelas sequências reguladoras da expressão contidas nesse vetor biológico.

[037] Esse plasmídeo principal (pTR-CMV/CBA-GFP) é incubado com a enzima de restrição NotI, que cliva a sequência NotI que flanqueia o transgene GFP, gerando 2 fragmentos, o do transgene e o do plasmídeo linearizado e sem o transgene GFP. Esse plasmídeo clivado em NotI é então desfosforilado com enzima comercial, seguido de uma reação de ligação com o fragmento de PCR descrito acima. Essa reação de ligação gera o novo plasmídeo principal (pTR-CMV/CBA-max21 - Figura 2) para produzir o vetor viral de rAAV, objeto dessa patente e que compreende a SEQ ID NO 1. Vale ressaltar que esse plasmídeo principal possui SEQ ID 2, 3 e 4 flanqueadas por sequências LTRs (long terminal repeat) SEQ ID NO 5 e 6, que são sequências repetitivas e as únicas sequências do genoma do AAV necessária para produção do vetor viral. Esse novo plasmídeo principal contendo a SEQ ID NO 1 é amplificado em larga escala usando bactéria comercial (Stratagen), segundo protocolos clássicos de amplificação. Os plasmídeos produzidos são purificados usando kit comercial, seguindo seu protocolo (Qiagen Maxi-prep kit). Esses plasmídeos são então utilizados para produção do vetor viral de AAV.

Produção dos vetores virais de rAAV

[038] O vetor viral de vírus adeno associado (rAAV) de acordo com a presente invenção, pode ser preparado por um método padrão de técnica conhecida. Como exemplo, citamos a patente US número 5.858.351 e a referência: Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, Ed. Machida, Human Press, 2003. Ressalte-se que o método de produção do vetor de rAAV não é objeto dessa patente. Resumidamente, os vetores são produzidos em células de rim de embrião humano (HEK-293) mantidas em meio DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Gibco) complementado com 10% de soro fetal bovino (FBS -Gibco), 100 U/ml penicilina G (Gibco) e 100 mg/ml streptomicina (Gibco). As células HEK-293 são transfectadas com emprego de fosfato de cálcio, com 2 plasmídeos: o principal construído conforme descrito acima (pTR-CMV/CBA-max21) e o plasmídeo auxiliar (pDG), que contém as sequencias necessárias para formação da partícula viral e que foi gentilmente cedido pelo Prof. William Hauswirth (Universidade da Flórida). Após 3 dias de transfecção os vetores são purificados por centrifugação e colunas de FPLC e em seguida são dosados por PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais. Todos esses métodos seguem os protocolos padrões de produção, purificação e quantificação das partículas virais de rAAV conforme WO2008021140A2 e referência Conway, J.E., C.M.J, ap Rhys, I. Zolotukhin, S. Zolotukhin, N. Muzyczka, G.S. Hayward, and B.J. Byrne. 1999. High-titer recombinant adeno-associated virus production utilizing a recombinant herpes simplex virus type I vector expressing AAV-2 Rep and Cap. Gene Ther. 6:973-985. O genoma do vetor de rAAV que compreende a SEQ ID NO 1 está ilustrado na Figura 3.

Demonstração de eficiência de transdução do tecido retiniano pelo vetor de rAAV-Max21, que compreende a SEQ ID NO 1

[039] Entende-se por transdução a capacidade do vetor biológico entregar o transgene para a célula alvo e promover a expressão do transgene, como resultado das sequências regulatórias de expressão gênica contidas no vetor. Para a presente patente o transgene compreende a SEQ ID NO 2, e está compreendido na SEQ ID 1.

[040] Ratos com 30 dias pós natal receberam injeção intraocular de 109 partículas de vetores de rAAV-Max21, compreendendo a SEQ ID NO 1 ou rAAV-GFP, como controle. Após 14 dias, os animais foram anestesiados terminalmente, os olhos foram removidos e fixados por imersão em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato. As retinas foram dissecadas em montagem plana. A expressão do transgene Max21, compreendido na SEQ ID NO 2, foi detectada pela reatividade à proteína Max em reação com um anticorpo específico comercial (Santa Cruz), seguido de revelação com anticorpo secundário fluorescente (vermelho). A proteína GFP foi confirmada pela fluorescência intrínseca dessa proteína. Em fotomicrografias obtidas por microscopia confocal a laser pode ser visualizado aumento do conteúdo da proteína Max nas células ganglionares da retina transduzidas pelo vetor de rAAV-Max21, que compreende a SEQ ID NO 1 (Figura 4)

Demonstração da neuroproteção in vitro do tecido retiniano pelo vetor de rAAV-Max21, que compreende a SEQ ID NO 1

[041] Ratos com 1 dias pós natal receberam injeção intraocular de 109 partículas de vetores de rAAV-Max21. Após 14 dias, os animais foram anestesiados terminalmente, os olhos removidos e as retinas dissecadas. Fragmentos de retina, denominados explantes, foram cortados e mantidos em meio de cultura com 5% de soro fetal bovino por 30 horas, seguido de fixação em paraformaldeído 4%. A taxa de morte celular na camada de células ganglionares da retina foi estimada pela percentagem de núcleos condensados, indicativos de morte celular, em relação ao número total de células na área de amostragem (dados individuais no inserto, médias e erros padrão da média no histograma principal). Os explantes da retina transduzidas com vetor de rAAV-Max21 tiveram taxas de morte celular aproximadamente 50% menores que os explantes de retinas transduzidas com rAAV controle, que contém como transgene o GFP (green fluorescente protein) (Figura 5). A expressão aumentada de Max foi confirmada por imunohistoquímica, enquanto a expressão de GFP foi confirmada pela fluorescência intrínseca dessa proteína controle.

Demonstração da neuroproteção in vivo do tecido retiniano pelo vetor de rAAV-Max21 que compreende a SEQ ID NO 1

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Ratos foram distribuídos em 4 grupos experimentais conforme o esquema da figura 6. Todos os animais receberam no quarto dia pós-natal injeções múltiplas nos colículos superiores (alvos de projeção dos axônios das células ganglionares da retina) de uma suspensão de microesferas fluorescentes (vermelhas), que são transportadas ao longo dos axônios até o corpo celular dessas células. Este procedimento serve para identificar positivamente as células ganglionares da retina. A perda específica de neurônios caracteriza um modelo de neurodegeneração no sistema nervoso central. Dois grupos receberam injeção intraocular, em um dos olhos, de 109 partículas virais em 3 μl de solução de rAAV-Max21 ou rAAV-GFP.Três grupos receberam lesões do nervo óptico (crush) no 60° dia pós-natal (do lado injetado quando foi o caso) e todos os 4 grupos foram sacrificados por anestesia terminal no 74° dia pós-natal. Após fixação com paraformaldeído 4%, os olhos foram removidos e as retinas inteiras foram dissecadas e preparadas como montagens planas em lâminas de vidro gelatinizadas para adesão do tecido fixado. As células ganglionares da retina foram identificadas pela marcação fluorescente vermelha com as microesferas, enquanto todos os núcleos de células da camada de células ganglionares foram marcados com o intercalante de DNA, Sytox Green. As células ganglionares foram quantificadas por contagens em fotomicrografias obtidas por microscopia confocal. As contagens foram transformadas em densidades de células ganglionares e os resultados apresentados na forma de médias e erros padrão da média. A transdução das células ganglionares da retina pelo vetor de rAAV-Max21, que compreende a SEQ ID NO 1, produziu neuroproteção.

Claims (4)

1. Vetor biológico de rAAV caracterizado por compreender a SEQ ID NO1.
2. Vetor biológico de rAAV de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pela SEQ ID NO1 conter a SEQ ID NO 2 de expressão do gene terapêutico max21, a SEQ ID NO 3 operacional promotora, a SEQ ID NO 4 terminadora da transcrição e as SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6 de repetições terminais invertidas do genoma do vetor viral de rAAV.
3. Vetor biológico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser para transferência e expressão do gene Max humano.
4. Vetor biológico, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser usado na preparação de um fármaco de terapia gênica para tratar doenças neurodegenerativas.

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