WO2000044389A2 - Procede de preparation de vesicules membranaires - Google Patents

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WO2000044389A2
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dendritic cells
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Olivier Dhellin
Sebastian Amigorena
Philippe Rameau
Joël Crouzet
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Ap Cells Inc.
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Institut Curie
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    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the preparation (in particular the isolation and / or purification) of membrane vesicles.
  • the invention also relates to the membrane vesicles thus prepared, as well as their biological and medical uses, for example.
  • the membrane vesicles are vesicles, with a diameter generally less than 100 nm, composed of a lipid bilayer containing a cytosolic fraction.
  • Specific membrane vesicles are more specifically derived from intracellular compartments, by fusion with the plasma membrane of a cell, leading to their release into biological fluids or into the supernatant of cells in culture.
  • Such vesicles are generally designated by the term exosome.
  • Exosomes generally have a diameter of between approximately 50 and 90 nm, more particularly between approximately 60 and 80 nm, and advantageously carry membrane proteins (in particular proteins of the major histocompatibility complex) which are in the same orientation as in the membrane. the cells from which they are derived.
  • the exosomes contain membrane proteins such as CD40, CD80, HSP70 and are devoid of endoplasmic reticulum and golgi apparatus.
  • exosomes have been demonstrated from different cell types, in various physiological contexts.
  • B lymphocytes release exosomes carrying molecules of the major histocompatibility class II complex, which play a role in antigen presentation (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161).
  • dendritic cells produce exosomes (also called dexosomes), having particular structural and functional characteristics, and playing a role in mediating the immune response, in particular in stimulating cytotoxic T lymphocytes. (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594).
  • tumor cells secrete, in a regulated manner, specific exosomes (also designated texosomes), carriers of tumor antigens and capable of presenting these antigens or of transmitting them to the antigen-presenting cells (patent application No. WO99 / 03499). It is also known that mast cell cells accumulate molecules in the intracellular vesicular compartments, which can be secreted under the effect of signals (Smith and Weis, Immunology Today 17 (1996) 60).
  • the purity levels of the exosomes are satisfactory insofar as such preparations have made it possible to demonstrate the biological activity and the anti-tumor properties in animal models.
  • these previous methods of preparation by centrifugation do not allow fine separation of the membrane vesicles (e.g., exosomes) from cellular proteins or certain macromolecular components (DNA, RNA) or macromolecular complexes. These methods therefore do not exclude the presence of unidentified contaminating biological agents which are incompatible with therapeutic use in humans.
  • these stages are difficult to extrapolate on an industrial scale, in particular when large volumes have to be treated, or for autologous ex vivo applications (i.e., patient by patient), where the process must generally be implemented in a confined system.
  • the present invention now provides a solution to this problem.
  • the invention indeed describes new methods allowing the preparation (that is to say the isolation and / or purification) of membrane vesicles under conditions compatible with industrial use and pharmacological applications.
  • the methods of the invention can be applied both for individualized preparations of autologous exosomes, and for preparations of exosomes obtained from established cell lines, for experimental, biological uses or for the purposes of Prophylactic or therapeutic vaccinations, for example.
  • the present invention is based more particularly on the use of separation methods by chromatography for the preparation of membrane vesicles, and in particular for separating the membrane vesicles from possible contaminating biological entities.
  • a first object of the invention resides in a process for the preparation of membrane vesicles from a biological sample characterized in that it comprises at least one step of treatment of the sample by anion exchange chromatography .
  • the membrane vesicles in particular the exosomes, can be purified by anion exchange chromatography.
  • the exosomes are resolved into a homogeneous peak after anion exchange chromatography. This result is completely unexpected insofar as the exosomes are complex supramolecular objects composed inter alia of a membrane surrounding an internal volume comprising inter alia soluble proteins.
  • exosomes contain membrane proteins.
  • a more particular object of the invention therefore relates to a process for the preparation, in particular for the purification of membrane vesicles from a biological sample, comprising at least one step of anion exchange chromatography.
  • the chromatography is carried out under pressure. It can thus be more particularly a high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Different types of supports can be used for carrying out anion exchange chromatography. Mention may more preferably be made of cellulose, poly (styrene-divinylbenzene), agarose, dextran, acrylamide, silica, the ethylene glycol-methacrylate copolymer, or mixtures, for example agarose-dextran mixtures.
  • the invention therefore relates to a process for the preparation of membrane vesicles from a biological sample, comprising at least one step during which the biological sample is treated by exchange chromatography.
  • anions on a support chosen from cellulose, poly (styrene-divinylbenzene), silica, acrylamide, agarose, dextran, ethylene glycol-methacrylate copolymer, alone or in mixtures, optionally functionalized.
  • supports in the form of beads.
  • these are beads having a homogeneous and calibrated diameter, and having a sufficiently high porosity to allow the penetration of the objects to be chromatographed (Le., Exosomes).
  • the diameter of the exosomes generally between 50 and 100 nm
  • gels of high porosity in particular between approximately 10 nm and 5 ⁇ m, more preferably between approximately 20 nm and approximately 2 ⁇ m, even more preferably between approximately 100 nm and approximately 1 ⁇ m.
  • the support used must be functionalized by means of a group capable of interacting with an anionic molecule.
  • this group consists of an amine which can be ternary or quaternary which respectively defines a weak or strong anion exchanger.
  • a strong anion exchanger In the context of the present invention, it is particularly advantageous to use a strong anion exchanger.
  • a chromatography support as indicated above, functionalized with quaternary amines.
  • the anion exchange chromatography is therefore carried out on a support functionalized with a quaternary amine.
  • it is a support chosen from poly (styrene-divinylbenzene), acrylamide, agarose, dextran and silica, alone or in mixtures, functionalized with a quaternary amine.
  • examples include Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ and Poros QE gels, Fractogel TMAE type gels, and Toyopearl Super Q gels.
  • a particularly preferred support for carrying out anion exchange chromatography comprises poly (styrene-divinylbenzene).
  • An example of this type of gel which can be used in the context of the invention is the Source Q gel, in particular Source 15 Q (Pharmacia).
  • This support has the advantage of very large internal pores, thus offering little resistance to the circulation of liquid through the gel, while allowing rapid diffusion of the exosomes towards the functional groups, parameters which are particularly important in the case of the exosomes given their cut.
  • the elution of the biological compounds retained on the column can be done in different ways, and in particular by means of the passage of an increasing concentration gradient of a saline solution, for example from 0 to 2 M. It is possible in particular to use a sodium chloride solution, in concentrations ranging from 0 to 2M, for example. Detection of different fractions as well purified is done by measuring their optical density (OD) at the column outlet by means of a continuous spectrophotometric reading. As an indication, under the conditions used in the examples, the fractions comprising the membrane vesicles were eluted at an ionic strength of between 350 and 700 mM approximately, depending on the types of vesicles.
  • Different types of columns can be used to carry out this chromatographic step, depending on the needs and the volumes to be treated.
  • a column of approximately 100 ⁇ l up to 10 ml or more it is possible to use a column of approximately 100 ⁇ l up to 10 ml or more.
  • the supports available have a capacity which can reach, for example, 25 mg of proteins / ml.
  • a 100 ⁇ l column has a capacity of the order of 2.5 mg of proteins which, taking into account the samples considered, can make it possible to treat culture supernatants of approximately 2 1 (which, after concentration of (a factor 10 to 20 for example, represent volumes of 100 to 200 ml per preparation). It is understood that higher volumes can also be treated, by increasing the volume of the column for example.
  • a gel permeation chromatography step is added to the anion exchange step, either before or after the exchange chromatography step of 'anions.
  • the permeation chromatography step takes place after the anion exchange step.
  • the anion exchange chromatography step is replaced by the gel permeation chromatography step.
  • a support preferably chosen from silica, acrylamide, agarose, dextran, ethylene glycol-methacrylate copolymer, or mixtures, for example mixtures, is preferably used.
  • agarose-dextran By way of illustration, for gel permeation chromatography, a support such as Superdex 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) or even Sephacryl S (Pharmacia) is advantageously used.
  • the method of the invention can be implemented from different biological samples.
  • it may be a biological fluid originating from a subject (bone marrow, peripheral blood, etc.), a culture supernatant, a cell lysate, a prepurified solution, or any other composition comprising membrane vesicles.
  • the biological sample is a culture supernatant of cells producing membrane vesicles.
  • the biological sample is treated, prior to the chromatographic step, to be enriched in membrane vesicles (enrichment step).
  • the present invention relates to a process for the preparation of membrane vesicles from a biological sample characterized in that it comprises at least: b) a step of enriching the sample with vesicles membranes, and, c) a step of processing the sample by anion exchange chromatography and / or by gel permeation chromatography.
  • the biological sample is a culture supernatant treated so as to be enriched in membrane vesicles.
  • the biological sample can consist of a prepurified solution obtained from a culture supernatant from a population of cells producing membrane vesicles or from a biological fluid by treatments such as centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration and / or affinity chromatography, in particular by clarification and / or ultrafiltration and / or affinity chromatography.
  • a preferred process for the preparation of membrane vesicles within the meaning of the present invention therefore more particularly comprises the following steps: a) culturing a population of cells producing membrane vesicles (eg of exosomes) under conditions allowing the release of the vesicles , b) a step of enriching the sample with membrane vesicles, and, c) a step of treating the sample by anion exchange chromatography and / or by gel permeation chromatography.
  • the step for enriching the sample may comprise one or more steps of centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration and / or affinity chromatography of the supernatant.
  • the enrichment step comprises (i) a step of eliminating cells and / or cellular debris (clarification step), optionally followed by (ii) a concentration step and / or affinity chromatography.
  • the enrichment step comprises a step of affinity chromatography, optionally preceded by a step of elimination of cells and / or cellular debris (clarification step).
  • a preferred enrichment phase according to the invention comprises (i) a step of eliminating cells and / or cellular debris, (ii) a concentration and (iii) an affinity chromatography.
  • the removal of cells and / or cellular debris can be carried out for example by centrifuging the sample at a low speed, preferably less than 1000 g, for example between 100 and 700 g.
  • Preferred centrifugation conditions during this step are approximately 300g or 600g, for a period of between 1 and 15 minutes for example.
  • the elimination of cells and / or cellular debris can also be carried out by filtration of the sample, possibly in combination with the centrifugation described above.
  • Filtration can be carried out in particular by successive filtrations by means of filters having a decreasing porosity.
  • filters with a porosity greater than 0.2 ⁇ m are preferably used, for example between 0.2 and 10 ⁇ m. It is possible in particular to use a succession of filters having a porosity of 10 ⁇ m, 1 ⁇ m, 0.5 ⁇ m then 0.22 ⁇ m.
  • a concentration step can also be carried out, so as to reduce the volumes of sample to be treated during the chromatographic steps.
  • the concentration can be obtained by centrifugation of the sample at high speeds, for example between 10,000 and 100,000 g, so as to pellet the membrane vesicles. In this regard, it can be a series of differential centrifugations, with the last centrifugation carried out around 70,000 g approximately.
  • the membrane vesicles thus pelletized can then be taken up in a smaller volume and in an appropriate buffer for the subsequent stages of the process.
  • the concentration step can also be carried out by ultrafiltration.
  • This ultrafiltration makes it possible both to concentrate the supernatant and to carry out a first purification of the vesicles.
  • the biological sample for example the supernatant
  • Tangential ultrafiltration consists of concentrating and dividing a solution between two compartments (filtrate and retentate), separated by membranes of determined cutoff thresholds. The separation is carried out by application of a flow in the retentate compartment and of a transmembrane pressure between this compartment and the filtrate compartment.
  • membranes with a cutoff threshold of less than 1000 kDa, preferably between 300 kDa and 1000 kDa, even more preferably between 300 kDa and 500 kDa, are used.
  • the affinity chromatography step can be carried out in different ways, on different chromatographic materials and supports. It is advantageously a non-specific affinity chromatography, intended to retain certain contaminants present in the solution, without retaining the objects of interest (ie, the exosomes). It is therefore a negative selection. It is preferably a dye chromatography, making it possible to remove (ie, retain) contaminants such as proteins and enzymes, for example albumin, kinases, dehydrogenases, coagulation factors, interferons or lipoproteins , or co-factors, etc.
  • the support used for this chromatography is a support as used for the ion exchange chromatography, functionalized with a dye.
  • the dye can be chosen from Blue Sepharose (Pharmacia), Yellow 86, Green 5 and Brown 10 (Sigma).
  • the support is more preferably agarose. It is understood that any other support and / or dye or reactive group making it possible to retain certain contaminants of the biological sample treated can be used within the framework of the present invention.
  • the biological sample is obtained by treatment of a culture supernatant of cells producing membrane vesicles, by at least one filtration step.
  • the biological sample is obtained by treatment of a culture supernatant of cells producing membrane vesicles, by at least one centrifugation step.
  • the biological sample is obtained by treatment of a culture supernatant of cells producing membrane vesicles, by at least one ultrafiltration step.
  • the biological sample is obtained by treatment of a culture supernatant of cells producing membrane vesicles, by at least one affinity chromatography step.
  • a preferred method of more specific preparation of membrane vesicles within the meaning of the present invention comprises the following steps: a) culturing a population of cells producing membrane vesicles (eg of exosomes) under conditions allowing the release of the vesicles, b) the treatment of the culture supernatant to produce a biological sample enriched in membrane vesicles (eg in exosomes) by at least one step of ultrafiltration or affinity chromatography, and c) a step of processing the biological sample by anion exchange chromatography and / or gel permeation.
  • step b) above comprises filtration of the culture supernatant, followed by ultrafiltration, preferably tangential.
  • step b) above comprises a clarification followed by affinity chromatography on dye, in particular on Blue Sepharose.
  • the harvested material can, if necessary, be subjected to one or more additional steps d) of treatment and / or filtration, in particular for the purpose of sterilization.
  • filters preferably having a diameter less than or equal to 0.3 ⁇ m, even more preferably less than or equal to 0.25 ⁇ m, are preferably used.
  • filters are for example filters with a diameter of 0.22 ⁇ m.
  • the material obtained is for example distributed in suitable devices such as vials, tubes, bags, syringes, etc., in an appropriate storage medium.
  • suitable devices such as vials, tubes, bags, syringes, etc.
  • the purified vesicles thus obtained can be stored in the cold, frozen, or used extemporaneously.
  • a particular preparation process within the meaning of the invention therefore comprises at least the following steps: c) a step of treatment of the biological sample by anion exchange chromatography and / or gel permeation and, d) a filtration step, in particular sterilizing filtration, of the material harvested after step c).
  • the method of the invention comprises: c) a step of processing the biological sample by anion exchange chromatography, and, d) a step of filtration, in particular sterilizing filtration, of the material harvested after step c).
  • the method of the invention comprises: c) a step of processing the biological sample by gel permeation chromatography, and, d) a step of filtration, in particular of sterilizing filtration, of the collected material after step c).
  • the method of the invention comprises: c) a step of processing the biological sample by anion exchange chromatography followed or preceded by gel permeation chromatography, and, d) a filtration step, in particular sterilizing filtration, of the material harvested after step c).
  • the membrane vesicles produced from dendritic cells (dexosomes) or certain texosomes are eluted at an ionic strength of between 500 and 700 mM approximately, and the vesicles of mast cells around 350 mM.
  • the results presented in the examples also show that the method of the invention makes it possible to detect any contamination of the preparation with proteins predominant in the culture medium such as bovine serum albumin. Indeed, the chromatography of a standard bovine serum albumin solution under the preceding conditions shows that this gives rise to an eluted peak at a saline concentration distinct from that of the exosomes (FIG. N ° 3).
  • the method of the invention therefore makes it possible (i) to purify membrane vesicles under conditions of quality and quantity compatible with pharmacological use, and (ii) to reveal the existence of distinct and contaminating biological entities within the biological sample processed.
  • the process of the invention can be applied to the preparation of membrane vesicles of various origins.
  • it may in particular be exosomes produced by cells presenting antigens, or by tumor cells, in particular.
  • they may be primary cells, for example in culture, or also established lines, for example immortalized lines of cells producing membrane vesicles.
  • They may be cells of mammalian origin, in particular of murine or human origin.
  • the membrane vesicles are vesicles produced by cells presenting antigens, in particular dendritic cells, B lymphocytes, macrophages and mast cells, optionally after sensitization of these to one or more selected antigens.
  • a particularly preferred application of the present invention lies in the preparation of membrane vesicles produced by dendritic cells.
  • dendritic cells it may be human or animal dendritic cells, in particular human or murine.
  • These cells can be primary cells, harvested from starting from a biological fluids of a subject or produced ex vivo from precursor cells, or also cells of established lines, for example immortalized with an oncogene (EP 701 604).
  • a particular object of the present invention resides in a process for the preparation of membrane vesicles (dexosomes), characterized in that it comprises the following stages: a) obtaining a population of dendritic cells, b) culturing the cells dendritics under conditions allowing the production of membrane vesicles (dexosomes) and, c) purification of the membrane vesicles (dexosomes) by a process comprising at least one step of anion exchange chromatography, under the conditions defined above.
  • a more preferred embodiment resides in a process for the preparation of dexosomes, characterized in that it comprises the following steps a) obtaining a population of dendritic cells, b) culturing the dendritic cells under conditions allowing the production of dexosomes, c) treatment of the culture supernatant to produce a biological sample enriched in dexosomes, in particular by at least an ultrafiltration or affinity chromatography step, and, d) purification of the dexosomes by a process comprising at least at least one step of anion exchange chromatography and / or gel permeation, under the conditions defined above.
  • the dendritic cells are preferably obtained from a biological sample originating from a subject, for example from bone marrow or peripheral blood.
  • a biological sample originating from a subject
  • the techniques for producing dendritic cells have been described in the prior art and can be implemented by a person skilled in the art (see in particular the techniques described in application WO99 / 03499, incorporated herein by reference ).
  • Dendritic cells can thus be prepared from stem cells of the immune system, from monocyte precursors or even isolated directly in differentiated form (Review by Hart, Blood 90 (1997) 3245).
  • a preferred methodology in the context of the present invention is based on the production of dendritic cells from monocyte or bone marrow precursors. More particularly, it is preferred to use in the context of the present invention dendritic cells obtained by treatment of monocyte precursors (contained in blood or marrow) in the presence of a combination GM-CSF + IL4 or GM-CSF + IL-13 .
  • a population of dendritic cells comprising immature dendritic cells.
  • a population of dendritic cells is used which is composed mainly (i.e., at least 60%, preferably 70%) of immature dendritic cells.
  • the step of obtaining dendritic cells can therefore advantageously comprise the preparation of a population of dendritic cells comprising immature dendritic cells, in particular of human origin, in particular from monocyte precursors, more particularly by treatment with a combination of cytokines such as GM-CSF + IL-4 or GM-CSF + IL-13.
  • cytokines such as GM-CSF + IL-4 or GM-CSF + IL-13.
  • immortalized dendritic cell populations can be immortalized dendritic cell lines (Dl line for example, or any other line produced for example by introduction of the myc oncogene into dendritic cells). It can also be dendritic cells prepared and then immortalized in vitro.
  • the interest of immortalized dendritic cells lies in the constitution of banks of cells sensitized to groups of given antigens, which can be used industrially to prepare dexosomes capable of being administered to entire families of patients.
  • the dendritic cells can be simply cultured under conventional conditions known to those skilled in the art.
  • these cells are cultured under conditions which stimulate the production of dexosomes, in particular in the presence of factors capable of stimulating the production of dexosomes, in particular of a cytokine such as gamma interferon, interleukin-10 or l 'interleukin-12 (see for example application WO99 / 03499).
  • the dendritic cells are therefore cultured, during step b) above, under conditions stimulating the production of membrane vesicles.
  • the dendritic cells are sensitized to an antigen, prior to the production of the membrane vesicles.
  • This embodiment thus makes it possible to charge the dendritic cells with particular antigen (s), so as to produce dexosomes having a given immunogenic character.
  • Sensitization can be carried out by various techniques known per se, including, for example, bringing cells into contact with antigenic peptides, antigens, protein complexes, cells or membranes of cells expressing antigens, apoptotic bodies, membrane vesicles.
  • sensitization is carried out by incubation with peptides, antigens, RNA or nucleic acids. It is understood that the present application is not limited to techniques for sensitizing or producing dendritic cells.
  • Another particularly advantageous application of the present invention lies in the preparation of membrane vesicles produced by tumor cells, in particular human cells. It can in particular be any cell originating from a solid or liquid tumor as well as cells transformed or immortalized in vitro. Mention may more preferably be made of solid, hematopoietic or ascites tumors.
  • a particular application of the present invention also lies in the preparation of membrane vesicles comprising one or more heterologous molecules, in particular recombinant molecules.
  • membrane vesicles comprising one or more heterologous molecules, in particular recombinant molecules.
  • the present invention can also make it possible to purify such modified vesicles.
  • the invention can be applied to the preparation of membrane vesicles produced by any cell type, in particular exosome type vesicles, preferably having a diameter of less than about 100 nm. They may in particular be cells of macrophages, mast cells, reticulocytes, etc.
  • exosome preparations from (i) cell lines such as tumor cell lines (TS / A), murine dendritic cell lines (Dl), mast cell line (RBL) and (ii) human dendritic cells derived from monocytes.
  • TS / A tumor cell lines
  • Dl murine dendritic cell lines
  • RBL mast cell line
  • human dendritic cells derived from monocytes The results obtained can be directly transposed to other primary cultures such as tumor cells, human dendritic cells, B lymphocytes, etc., cultivable under industrially acceptable conditions.
  • the method of the invention can thus be implemented as a step of purifying exosomes in the context of their use in human therapy.
  • the membrane vesicles thus obtained constitute, depending on their origin, tools for studying cancers or for regulating the immune system, for transferring molecules, for producing antibodies, for labeling, for diagnosis, for building up banks, principles vaccine or medication, etc.
  • the process of the invention can also be used as a method for quality control on the possible presence of contaminants (in particular of contaminating proteins) in the culture medium or in preparations of membrane vesicles.
  • the present invention can therefore be implemented both in a preparative method of membrane vesicles and in an analytical system making it possible to control the quality of a preparation of membrane vesicles, whatever their method of preparation.
  • the present invention therefore also relates to a process for controlling the presence of contaminants, in particular of protein or nucleic origin, in a preparation of membrane vesicles, in particular of exosomes, comprising the treatment of a fraction of said preparation by a step at less anion exchange chromatography, and the detection of the presence of contaminants.
  • the invention also relates, in general, to the use of anion exchange chromatography, in particular of the high performance liquid type, for the preparation or the purification of membrane vesicles. She relates to the use of affinity chromatography for the preparation or purification of membrane vesicles.
  • a subject of the invention is also the membrane vesicles prepared by the process of the invention, as well as any composition comprising such vesicles.
  • Figure 1 Elution profile after anion exchange chromatography of a sample of exosomes prepared by differential centrifugation.
  • Figure 2 Analysis of the protein profile of the different elution fractions of an exosome preparation by electrophoresis in SDS PAGE then staining with Coomassie blue.
  • Figure 3 Elution profile after anion exchange chromatography of a standard bovine serum albumin solution.
  • Figure 4 Diagram of treatment of a biological sample comprising membrane vesicles by tangential ultrafiltration.
  • Figure 5 General profile of the Blue sepharose 6 fast flow step after centrifugation at 600 and 10,000 g of a dexosome supernatant.
  • Figure n ° 6 Western blot directed against the MHC II molecules of the exosomes, in the non-adsorbed fraction and in the eluate, from the Blue sepharose 6 fast flow step.
  • Figure n ° 7 General profile of the 15Q source stage after a Blue sepharose fast flow stage.
  • Figure 8 Details of the elution gradient on the 15Q source after a Blue sepharose 6 fast flow step (enlargement of the rectangular area at the bottom right in Figure 7).
  • Figure 9 Example of a purification profile of exosomes produced from the RBL DR + line (equivalent to 53 ⁇ g of proteins) by a Source 15Q column after treatment with DNase and RNase.
  • Figure n ° 10 Separation of exosomes by a discontinuous NaCl gradient on a Source 15Q support.
  • the TS / A cell line is a murine cell line established from a spontaneous mammary carcinoma. This line is cultivated at 37 ° C. in the presence of 5% of CO 2 in RPMI medium in the presence of 10% of fetal calf serum (Dominique Dutcher).
  • the dendritic cell lines are maintained in an IMDM medium containing 10% of inactivated fetal bovine serum, 2 mM of L-glutamine, 50 ⁇ M of 2- ⁇ ME, 100 IU / ml of penicillin, and 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • This example illustrates how an anion exchange chromatography step can be used to separate impurities from an exosome preparation.
  • the starting material consists of a concentrate of exosomes prepared by differential centrifugation from a culture supernatant of TS / A cells making it possible to separate the exosomes from the cells or cellular debris present in the culture medium.
  • the first centrifugation is carried out at low speed (300 g for 5 min) in order to pellet the cells in suspension present in the culture supernatant.
  • Two other centrifugations (1200g for 20 minutes then 10,000g for 30 minutes) allow the cellular debris to be pelleted.
  • the supernatant thus clarified is then subjected to a high speed ultracentrifugation of 70,000 g for 1 hour making it possible to pellet the exosomes.
  • This preparation is then washed in a large volume of saline solution to be recentrifuged under the previous conditions. The pellet is then taken up in a volume of approximately 100 ⁇ l of saline solution and constitutes a concentrated solution of exosomes. The amount of protein is measured by the Bradford technique (Biorad, Ivry, France). This concentrate has a total protein content of between 500 and 1000 ⁇ g / ml. 40 ⁇ g of this preparation of exosomes diluted in 500 ⁇ l of Tris / HCL 50 mM pH buffer are injected into a column containing Source Q 15 gel (Pharmacia) balanced in a Tris / HCL solution 50 mM pH 8.
  • the adsorbed species are eluted on 30 column volumes with a linear NaCl gradient from 0 to 500 mM, then with a 2M NaCl solution.
  • the elution fractions are analyzed by spectrophotometry at 260 and 280 nm.
  • the elution fractions are grouped into five major fractions (from FI to F5) in order to be able to analyze their respective protein profile.
  • the proteins of each fraction are precipitated by 1/10 by volume of a 100% trichloroacetic acid solution and then rinsed with an acetone solution.
  • the protein pellets are taken up in 20 ⁇ l of Laemmli solution, and are deposited on an SDS PAGE acrylamide gel which is then colored with Coomassie blue.
  • the elution profiles at 260 and 280 nm are shown in FIG. 1.
  • the profiles show the presence of 3 distinct symmetrical peaks, eluted at the respective saline concentrations of 105 mM, 400 mM and 2 M NaCl.
  • the peak eluted (fraction F2) at 105 mM NaCl presents a different protein profile showing only two distinct bands.
  • the absorbance measurements at 260 and 280 nm give a ratio of 1.6 suggesting the presence of a combination of nucleic acids and proteins.
  • fraction F5 eluted at 2 molar of NaCl corresponds to the biological compounds strongly associated with the column. It is therefore possible to separate the exosomes from impurities by an anion exchange step.
  • This anion exchange chromatography technique also makes it possible to evaluate the degree of contamination of an exosome preparation by the proteins present in the culture medium.
  • chromatographing 10 ⁇ g of a bovine serum albumin solution corresponding to the majority protein of the culture medium, that this is eluted at 205 mM NaCl in the form of a narrow peak distinguishable from the peaks previously described. in the case of exosomes.
  • Ultrafiltration can therefore be used in a process for purifying exosomes in order to separate them from contaminating proteins.
  • the first buffer is a 100 mM Bis-Tris-Propane (BTP) solution (Sigma, 99%> purity), buffered at pH 6, this buffer is connected to channel A of the chromatograph (BioCad Sprint, Perkin-Elmer) .
  • the second buffer is a 100 mM Bis-Tris-Propane solution, buffered to pH 9, this buffer is connected to channel B of the chromatograph.
  • Water is produced on resin by a Milli-Q system with a resistance of 18 M ⁇ cm. the water is connected to channel C.
  • a solution of sodium chloride (NaCl, Prolabo, 99.5%) purity) is connected to channel C. 3 M.
  • Soda solution is connected to channel F NaOH, Prolabo, 98% minimum purity) 0.1 M.
  • Lane E is used to load the culture supernatants on the columns. All buffers are made from water produced by the Milli-Q system, the buffers are not degassed.
  • the first step is carried out with a column of Blue Sepharose 6 fast flow
  • the matrix is agarose coupled with Blue sepharose 6 fast flow
  • Blue 3 G (7%>).
  • the particle size is between 45 and 165 ⁇ m.
  • the maximum linear flow is 750 cm / hr.
  • the gel is stable at pH between 4 and 12, at extreme pH 2 and 14, the gel can be damaged, which leads to a decrease in the fixing capacity (decoupling of Blue sepharose 6 fast flow) and an increase in pressure. (formation of fines).
  • Blue Sepharose 6 fast flow is specific for components like albumin, kinases, dehydrogenases and other enzymes containing cofactors like NAD + , coagulation factors, interferons and lipoproteins.
  • the column volume used is approximately 5.5 ml of gel (Cl 0/10, Pharmacia), ie a theoretical capacity of 80 to 110 mg of albumin serum.
  • the flow rate used is 2 ml / min (150 cm / hr) on the BioCad Sprint and 3.5 ml / min (260 cm / hr) with a Pharmacia detection system.
  • the pressure does not exceed 2.5 bars and is mainly due to the DO measurement cells
  • the second step is carried out with a Source 15Q column (pharmacia), a strong anion exchanger.
  • the matrix is polystyrene crosslinked with divinylbenzene.
  • the size of the beads is 15 ⁇ m and is homogeneous.
  • the beads are traversed by a network of pores with a size varying from 20 to 1000 nm.
  • These gels are very resistant to pressure and accept high linear flow rates (1800 cm / hr and more) while keeping a satisfactory resolution and capacity. This is made possible thanks to the homogeneity of the beads and their porosity which increase the molecules' access to the functional groups.
  • the gel is stable at pH between 2 and 12 beyond the gel may suffer significant damage which reduces its capacity.
  • the theoretical binding capacity of this exchanger is approximately 25 mg of proteins per ml of gel.
  • a 0.8 ml column is used (PEEK column 4.6 mm ID / 50 mm L, Perkin-Elmer), ie a maximum capacity of 20 mg of proteins.
  • the actual capacity, which allows good resolution to be maintained, is around 10%) of this maximum capacity, ie 2 mg of protein.
  • the flow rate used is 5 ml / min (1880 cm hr) and allows rapid separations.
  • the column is packaged with the Poros selfPack system at 15ml / min at 150 bars.
  • the BioCad is an HPLC system (High Performance Liquid Chromatography) which allows to work at high pressures (maximum 204 bars) and at flow rates ranging from 0.2 to 60 ml / min. You can connect up to 6 buffers (the 6 channels are currently used), and the system can be treated with 0.1 M sodium hydroxide (pH 12) for the depyrogenization of the tubing and the column.
  • HPLC system High Performance Liquid Chromatography
  • the separations can be carried out at ambient temperature or at 4 ° C.
  • the samples are loaded either by one of the accessible routes or by injection loops for small volumes (from 100 ⁇ l to 5 ml).
  • the detection system uses a double-channel UV cell: from 190 to 450 nm for UV and from 366 to 700 nm for the visible. Conventionally, detection at 254 nm is used for nucleic acids and detection at 280 nm for proteins (those are amino acids with a benzene ring such as tyrosines, tryptophanes and phenylalanines which absorb).
  • the system is fully computer controlled (software developed by Perspective biosystem). For each separation, all the parameters (pressure, flow, conductivity, optical density, pH, etc.) can be checked. Finally, the separate sample is either recovered in a 50 ml Falcon tube or collected in silicone eppendorf tubes (Advantec SF-2120 collector) to minimize non-specific interactions.
  • dendritic cells are obtained from monocytic precursors of peripheral blood.
  • the isolated monocytes are cultured in the presence of a combination of GM-CSF and IL-13 or IL-4 (see the techniques described in application WO99 / 03499).
  • GM-CSF GM-CSF
  • IL-13 IL-4
  • IL-4 see the techniques described in application WO99 / 03499.
  • exosomes it is preferable to use a population of immature dendritic cells.
  • the culture supernatants are centrifuged twice at 600 g and once at 10,000 g before being loaded onto the column of Blue Sepharose 6 fast flow.
  • a 5.5 ml column is used, the flow rate is 2 ml / min (linear flow rate of 150 cm / h, contact time of 2.7 min), the pressure is around 2.5 bars ( fig 5).
  • the column is equilibrated in 12 mM BTP buffer, 150 mM NaCl and pH 7. After equilibration, the supernatant is loaded onto the column and then this is washed with the same equilibration buffer until the DO goes down again Elution fixed proteins are produced in 12 mM BTP, 1.5 M NaCl and pH 7 (in 3 to 4 column volumes).
  • the column is regenerated by passing water (2 to 3 column volumes), then 2 volumes of 0.1 M sodium hydroxide (pH 12) are passed, finally, the column is rebalanced in 12 mM BTP, 150 mM NaCl and pH 7. Quantitative and qualitative aspect of the Blue sepharose 6 fast flow stage:
  • the Blue sepharose 6 fast flow step is specific for proteins such as albumin, which is a major contaminant of the culture supernatant.
  • the protein concentration of each fraction of the Blue sepharose 6 fast flow step is measured by a Biorad technique (measurement of an OD at 600 nm). The results are collated in Table 1.
  • the non-adsorbed fraction represents only 7 to 10% of the total proteins loaded on the column of Blue Sepharose 6 fast flow.
  • the step is specific for major contaminants of the supernatant.
  • each fraction is deposited on an SDS-PAGE gel in a reducing condition and stained with silver nitrate.
  • the overload of the column 50 ml of supernatant loaded on a column of Blue sepharose 6 fast flow of 5.5 ml
  • the percentage of the non-adsorbed fraction increases from 7 to more than 30% of the amount of protein loaded.
  • This value is between 16 and 18 mg of protein per ml of Blue Sepharose 6 fast flow gel.
  • 1 ml of Blue Sepharose 6 fast flow gel makes it possible to purify approximately 5 to 6 ml of culture supernatant (AIMV 2.5%> of HSA). This value becomes important for the study of scale up since it determines the size of the column to be used and therefore the cost of this step.
  • the major contaminant of the culture supernatants is albumin. This contaminant is found, after fixing on the Blue Sepharose 6 fast flow, in the eluate and regeneration fractions. In addition to this contaminant, there are many other low and high molecular weight contaminants.
  • the Blue sepharose 6 fast flow stage allows the elimination of approximately 90 to 95%> of the contaminants from the culture supernatant.
  • the exosomes are in the non-adsorbed fraction of Blue sepharose 6 fast flow (fig. 6).
  • Anion exchanger stage source 15Q (Pharmacia). Using a 0.8 ml 15Q source column with a flow rate of 5 ml / min (linear flow rate of 1880 cm / h, contact time 0.1 min) with a pressure of the order of 50 bars. The non-adsorbed fraction of Blue Sepharose 6 fast flow is directly loaded on the 15Q source (fig. 7) without changes in the saline concentration (NaCl) or the pH.
  • the column is washed in 12 mM BTP buffer, 280 mM NaCl at pH 7 (35 column volumes) until the DO drops to values close to 0.
  • a second washing step is carried out. at a saline concentration of 150 mM NaCl (10 column volumes) to reinforce the interactions of the exosomes with the support.
  • a first gradient of 150 to 420 mM NaCl is produced in 7 column volumes (FIG. 8) then the gradient is stopped for 9 column volumes.
  • the second gradient starts from 420 mM NaCl to 1 M NaCl in 25 column volumes.
  • the exosomes are eluted in this second gradient in two peaks at 550 and 700 mM NaCl (fig. 8).
  • the column is regenerated by passing 10 volumes of water column then by 10 volumes of 0.1 M sodium hydroxide column (pH 12) and finally by passing 10 column volumes of 3M NaCl.
  • the column is then equilibrated in 12 mM BTP buffer, 150 mM NaCl, pH 7.
  • Source 15Q is capable of fixing approximately 25 mg of protein (manufacturer's data), i.e. for the 0.8 ml, 20 mg of protein. It is clear that we are very far from the maximum of the column and from 5 to 10% in agreement with good resolution, since these values are between 1 and 2 mg of proteins.
  • each elution peak is ultracentrifuged (100,000 g for 1 hour) and pooled to be observed by electron microscopy.
  • the first peak eluted between 150 and 420 mM NaCl
  • the second peak eluted at 550 mM NaCl
  • shows a lower background noise a much larger number of vesicles marked with an anti MHC II antibody, there is also heterogeneity in the size of the vesicles.
  • the third peak (eluted at 700 mM NaCl) no longer exhibits background noise, the vesicles are practically all marked with an anti-MHC II antibody and are much more homogeneous in size.
  • exosomes produced from the RBL (Rat Basophilic Leukemia) line Purification by HPLC of exosomes produced from the RBL (Rat Basophilic Leukemia) line.
  • the exosomes are produced from a RBL line (Rat Basophilic Leukemia) transfected in a stable manner to express, on the exosome membrane, molecules of the human MHC II (PCT / FR99 / 02691). After induction, by an ionophore (iomicyne), the cells degranulate and release exosomes in a protein-free medium (RPMI). After removal of cells by centrifugation at
  • the treated supernatants are then centrifuged at 10,000 g at 37 ° C, 30 min, then at
  • the column is equilibrated in 12 mM Bis-Tris-Propane (BTP) buffer, 150 mM NaCl and pH 7. After loading the sample, the column is washed with 15 to 20 column volumes of the same equilibration buffer. Elution is carried out with 25 column volume by varying the salt concentration from 150 mM to 1 M NaCl, the pH is kept constant (FIG. 9). The medium is very little contaminated with proteins since the cells are washed in PBS and the induction as well as the release of the exosomes is done in RPMI alone. This is confirmed by the low absorption observed (280 and 254 nm) in the non-adsorbed fraction of Source 15Q.
  • BTP Bis-Tris-Propane
  • peak 1 which has a signal intensity, in proteins, 7 to 8 times less than peak 2 has a western blot signal equivalent to that of peak 2. This may reflect a higher purity of peak 1
  • the peaks were ultracentrifuged and observed by electron microscopy.
  • Peak 1 is very rich in exosomes labeled with an anti-human MHC II antibody, there is little or no background noise.
  • the exosomes are heterogeneous in size, there does not seem to be any separation of the exosomes not by their size but by a specific mechanism of competition between the eluent (NaCl) and the exosomes.
  • NaCl eluent
  • the fractions between the two peaks were analyzed by electron microscopy. There are few exosomes there with a higher background noise than in peak 1.
  • Peak 2 is very similar to the fractions between the two peaks, there are few exosomes and greater background noise.
  • Source 15Q is capable of retaining exosomes and separating them from possible contaminants (fig. 9).
  • the vast majority of exosomes are eluted in the same peak at 350 mM NaCl.
  • the heterogeneity of the size of the exosomes seems to indicate that the separation is based on ionic exchanges and not on sieving.
  • Source 15Q can therefore be used as a purification step for RBL exosomes.

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel. L'invention est utilisée pour la préparation de vésicules d'origines et de natures variées, notamment à partir de cellules présentatrices d'antigènes ou de cellules tumorales. L'invention concerne aussi les vésicules ainsi obtenues et leurs utilisations.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE VESICULES MEMBRANAIRES
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la préparation (en particulier l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires. L'invention concerne également les vésicules membranaires ainsi préparées, ainsi que leurs utilisations biologiques et médicales, par exemple.
Les vésicules membranaires sont des vésicules, d'un diamètre généralement inférieur à 100 nm, composées d'une bicouche lipidique renfermant une fraction cytosolique. Des vésicules membranaires particulières sont plus spécifiquement issues de compartiments intracellulaires, par fusion avec la membrane plasmique d'une cellule, conduisant à leur libération dans les fluides biologiques ou dans le surnageant de cellules en culture. De telles vésicules sont désignées de manière générale par le terme exosome. Les exosomes possèdent généralement un diamètre compris entre environ 50 et 90 nm, plus particulièrement entre environ 60 et 80 nm, et portent avantageusement des protéines membranaires (notamment des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité) qui sont dans la même orientation que dans la membrane plasmique des cellules dont ils sont issus. Par ailleurs, selon leur origine, les exosomes comportent des protéines membranaires telles que CD40, CD80, HSP70 et sont dépourvus de réticulum endoplasmique et d'appareil de golgi.
La libération d'exosomes a été mise en évidence à partir de différents types cellulaires, dans des contextes physiologiques variés. Ainsi, il a été montré que les lymphocytes B libèrent des exosomes porteurs de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, qui jouent un rôle dans la présentation antigénique (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161). De même, il a été montré que les cellules dendritiques produisent des exosomes (également désignés dexosomes), ayant des caractéristiques structurales et fonctionnelles particulières, et jouant un rôle dans la médiation de la réponse im-mune, notamment dans la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594). Il a aussi été montré que les cellules tumorales sécrètent, de manière régulée, des exosomes particuliers (désignés également texosomes), porteurs d'antigènes tumoraux et capables de présenter ces antigènes ou de les transmettre aux cellules présentatrices d'antigènes (demande de brevet n° WO99/03499). Il est également connu que les cellules de mastocytes accumulent les molécules dans les compartiments vésiculaires intracellulaires, qui peuvent être sécrétés sous l'effet de signaux (Smith et Weis, Immunology Today 17 (1996) 60). D'une manière générale, il semble donc que les cellules émettent des signaux et communiquent entre elles par l'intermédiaire de vésicules membranaires qu'elles libèrent, qui peuvent être porteuses de motifs antigéniques, de molécules du CMH, ou de tout autre signal (cytokine, facteur de croissance, etc.), qui présentent des caractéristiques structurales et fonctionnelles spécifiques, et sont produites dans des situations physiologiques différentes. Ces vésicules, et en particulier les exosomes, représentent donc un produit particulièrement intéressant pour des applications diagnostiques, vaccinales, thérapeutiques ou pour véhiculer des molécules d'intérêt. Il serait donc particulièrement intéressant de disposer d'une méthode efficace et utilisable à l'échelle industrielle, pour préparer des vésicules membranaires compatibles avec un usage biologique, notamment un usage pharmacologique.
Les méthodes classiques de préparation des vésicules membranaires (e.g., des exosomes) mettent en oeuvre une série d'étapes de centrifugation différentielle permettant de séparer les vésicules des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. Ainsi, les documents cités ci-avant décrivent essentiellement la préparation de vésicules par une série de centrifugations à 300g, 10 000g et 70 000 ou 100 000g, le culot obtenu étant alors repris dans une solution saline, pour constituer une solution concentrée d'exosomes. Cette préparation peut être analysée par des techniques biochimiques classiques permettant d'évaluer la composition protéique des exosomes. Une technique biochimique préférée consiste en une électrophorèse en milieu dénaturant associée à une coloration des protéines totales ou à la détection de protéines spécifiques à l'aide d'anticorps selon la technique de western blot. La détection des exosomes dans la préparation finale peut être réalisée de façon directe par microscopie électronique après fixation de la préparation par une solution de glutaraldéhyde à 4%.
Selon ce procédé, les niveaux de pureté des exosomes sont satisfaisants dans la mesure ou de telles préparations ont permis de mettre en évidence l'activité biologique et les propriétés antitumorales dans des modèles animaux. Néanmoins ces procédés antérieurs de préparation par centrifugation ne permettent pas de séparer finement les vésicules membranaires (e.g., exosomes) des protéines cellulaires ou de certains composants macromoléculaires (ADN, ARN) ou complexes macromoléculaires. Ces procédés n'excluent donc pas la présence d'agents biologiques contaminants non identifiés, incompatibles avec une utilisation thérapeutique chez l'homme. De plus ces étapes sont difficilement extrapolables à l'échelle industrielle, notamment lorsque des volumes importants doivent être traités, ou pour des applications ex vivo autologues (i.e., patient par patient), où le procédé doit généralement être mis en oeuvre en système confiné.
La présente invention apporte à présent une solution à ce problème. L'invention décrit en effet de nouveaux procédés permettant la préparation (c'est-à- dire l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires dans des conditions compatibles avec une utilisation industrielle et des applications pharmacologiques. Ainsi, les procédés de l'invention peuvent être appliqués aussi bien pour des préparations individualisées d'exosomes autologues, que pour des préparations d'exosomes obtenus à partir de lignées cellulaires établies, en vue d'utilisations expérimentales, biologiques ou à des fins de vaccinations prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple. La présente invention repose plus particulièrement sur l'utilisation de méthodes separatives par chromatographie pour la préparation de vésicules membranaires, et notamment pour séparer les vésicules membranaires d'éventuelles entités biologiques contaminantes.
Plus particulièrement un premier objet de l'invention réside dans un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions.
En effet, la demanderesse a maintenant montré que les vésicules membranaires, notamment les exosomes, pouvaient être purifiés par chromatographie d'échange d'anions. Ainsi, de manière inattendue, il est montré dans la présente demande que les exosomes sont résolus en un pic homogène après chromatographie par échange d'anions. Ce résultat est tout à fait inattendu dans la mesure où les exosomes sont des objets supramoléculaires complexes composés entre autre d'une membrane entourant un volume interne comportant entre autre des protéines solubles. De plus les exosomes contiennent des protéines membranaires.
Un objet plus particulier de l'invention concerne donc un procédé de préparation, en particulier de purification de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il peut s'agir d'un échange d'anions fort ou faible, préférentiellement fort. Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en oeuvre, la chromatographie est réalisée sous pression. Il peut ainsi s'agir plus particulièrement d'une chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Différents types de supports peuvent être employés pour la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions. On peut citer plus préférentiellement la cellulose, le poly(styrène-divinylbenzène), l'agarose, le dextran, l'acrylamide, la silice, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, ou des mélanges, par exemple des mélanges agarose-dextran. A cet égard, on peut mentionner à titre illustratif différents matériels de chromatographie composés de supports tels qu'énoncés ci- dessus, et notamment les gels Source, Poros, Sepharose, sephadex, Trisacryl, TSK- gel SW ou PW, Superdex, Toyopearl HW et sephacryl, par exemple, qui conviennent pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, l'invention concerne donc un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape au cours de laquelle l'échantillon biologique est traité par chromatographie d'échange d'anions sur un support choisi parmi la cellulose, le poly(styrène-divinylbenzène), la silice, l'acrylamide, l'agarose, le dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, seuls ou en mélanges, éventuellement fonctionnalisés.
Par ailleurs, pour améliorer la résolution chromatographique, il est préférable dans le cadre de l'invention d'utiliser des supports sous forme de billes. Idéalement, il s'agit de billes présentant un diamètre homogène et calibré, et possédant une porosité suffisamment élevée pour permettre la pénétration des objets à chromatographier (Le., les exosomes). Ainsi, étant donné le diamètre des exosomes (généralement compris entre 50 et 100 nm) il est préférable pour la mise en oeuvre de l'invention d'utiliser des gels de porosité élevée, en particulier comprise entre environ 10 nm et 5 μm, plus préférentiellement entre environ 20 nm et environ 2 μm, encore plus préférentiellement entre environ 100 nm et environ 1 μm.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, le support utilisé doit être fonctionnalisé au moyen d'un groupement capable d'interagir avec une molécule anionique. Généralement, ce groupement est constitué d'une aminé pouvant être ternaire ou quaternaire ce qui définit respectivement un échangeur d'anions faible ou fort.
Dans le cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi on utilise préférentiellement selon l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé par des aminés quaternaires. Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, la chromatographie d'échange d'anions est donc réalisée sur un support fonctionnalisé par une aminé quaternaire. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'un support choisi parmi le poly(styrène-divinylbenzène), l'acrylamide, l'agarose, le dextran et la silice, seuls ou en mélanges, fonctionnalisé par une aminé quaternaire.
Parmi les supports fonctionnalisés par une aminé quaternaire, on peut citer comme exemples les gels Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les gels de type Fractogel TMAE, et les gels Toyopearl Super Q.
Un support particulièrement préféré pour la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions comprend du poly(styrène-divinylbenzène). Un exemple de ce type de gel utilisable dans le cadre de l'invention est le gel Source Q, notamment Source 15 Q (Pharmacia). Ce support présente l'avantage de pores internes très larges offrant ainsi peu de résistance à la circulation de liquide à travers le gel, tout en permettant une diffusion rapide des exosomes vers les groupements fonctionnels, paramètres particulièrement importants dans le cas des exosomes étant donné leur taille.
L'élution des composés biologiques retenus sur la colonne peut se faire de différentes manières, et en particulier au moyen du passage d'un gradient de concentration croissant d'une solution saline, par exemple de 0 à 2 M. On peut employer notamment une solution de chlorure de sodium, dans des concentrations variant de 0 à 2M, par exemple. La détection des différentes fractions ainsi purifiées se fait par mesure de leur densité optique (DO) en sortie de colonne au moyen d'une lecture spectro-photométrique en continu. A titre indicatif, dans les conditions utilisées dans les exemples, les fractions comprenant les vésicules membranaires ont été éluées à une force ionique comprise entre 350 et 700 mM environ, selon les types de vésicules.
Différents types de colonnes peuvent être utilisés pour réaliser cette étape chromatographique, selon les besoins et les volumes à traiter. Par exemple, selon les préparations, il est possible d'utiliser une colonne de lOOμl environ jusqu'à 10 ml ou plus. Ainsi, les supports disponibles ont une capacité pouvant atteindre par exemple 25 mg de protéines/ml. De ce fait, une colonne de 100 μl possède une capacité de l'ordre de 2,5 mg de protéines ce qui, compte tenu des échantillons considérés, peut permettre de traiter des surnageants de culture de 2 1 environ (qui, après concentration d'un facteur 10 à 20 par exemple, représentent des volumes de 100 à 200 ml par préparation). Il est bien entendu que des volumes supérieurs peuvent également être traités, en augmentant le volume de la colonne par exemple.
Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est également possible de combiner l'étape de chromatographie d'échange d'anions avec une étape de chromatographie de permeation de gel. Ainsi, selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, une étape de chromatographie de permeation de gel est ajoutée à l'étape d'échange d'anions, soit avant, soit après l'étape de chromatographie d'échange d'anions. De préférence, dans ce mode de mise en oeuvre, l'étape de chromatographie de permeation a lieu après l'étape d'échange d'anions. En outre, dans une variante particulière de réalisation, l'étape de chromatographie d'échange d'anions est remplacée par l'étape de chromatographie de permeation de gel. La présente demande montre en effet que les vésicules membranaires peuvent être aussi purifiées en utilisant la chromatographie liquide par permeation de gel, en particulier lorsque cette étape est combinée à une chromatographie d'échange d'anions ou à d'autre(s) étape(s) de traitement de l'échantillon biologique, comme il sera décrit en détails plus loin.
Pour la réalisation de l'étape chromatographique de permeation de gel, on utilise de préférence un support choisi parmi la silice, l'acrylamide, l'agarose, le dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, ou des mélanges, par exemple des mélanges agarose-dextran. A titre illustratif, pour la chromatographie de permeation de gel, on utilise avantageusement un support tel que le Superdex 200HR (Pharmacia), le TSK G6000 (TosoHaas) ou encore un Séphacryl S (Pharmacia).
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à partir de différents échantillons biologiques. En particulier, il peut s'agir d'un fluide biologique provenant d'un sujet (moelle osseuse, sang périphérique, etc.), d'un surnageant de culture, d'un lysat cellulaire, d'une solution prépurifiée, ou de tout autre composition comprenant des vésicules membranaires.
A cet égard, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon biologique est un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires.
Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, l'échantillon biologique est traité, préalablement à l'étape chromatographique, pour être enrichi en vésicules membranaires (étape d'enrichissement). Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins : b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de permeation de gel.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'échantillon biologique est un surnageant de culture traité de manière à être enrichi en vésicules membranaires. En particulier, l'échantillon biologique peut être constitué d'une solution prépurifiée obtenue à partir d'un surnageant de culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires ou d'un fluide biologique par des traitements tels que centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie d'affinité, en particulier par clarification et/ou ultrafiltration et/ou chromatographie d'affinité.
Un procédé préféré de préparation de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend donc plus particulièrement les étapes suivantes: a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de permeation de gel.
Comme indiqué ci-avant, l'étape d'enrichissement de l'échantillon (e.g., du surnageant) peut comprendre une ou plusieurs étapes de centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie d'affinité du surnageant. Dans un premier mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend (i) une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification), éventuellement suivie de (ii) une étape de concentration et/ou de chromatographie d'affinité. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend une étape de chromatographie d'affinité, éventuellement précédée d'une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification). Une phase d'enrichissement préférée selon l'invention comprend (i) une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires, (ii) une concentration et (iii) une chromatographie d'affinité. L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut être réalisée par exemple par centrifugation de l'échantillon à une vitesse faible, de préférence inférieure à 1000g, par exemple comprise entre 100 et 700g. Des conditions préférées de centrifugation lors de cette étape sont de 300g ou 600g environ, pendant une période comprise entre 1 et 15 minutes par exemple.
L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut également être réalisée par filtration de l'échantillon, éventuellement en combinaison avec la centrifugation décrite ci-dessus. La filtration peut être réalisée en particulier par des filtrations successives au moyen de filtres ayant un porosité décroissante. A cet égard, on utilise préférentiellement des filtres ayant une porosité supérieure à 0,2 μm, par exemple comprise entre 0,2 et lOμm. On peut utiliser en particulier une succession de filtres ayant une porosité de 10 μm, 1 μm, 0,5 μm puis 0,22μm.
Une étape de concentration peut également être réalisée, de manière à diminuer les volumes d'échantillon à traiter lors des étapes chromatographiques. Ainsi, la concentration peut être obtenue par centrifugation de l'échantillon à des vitesses élevées, par exemple comprises entre 10 000 et 100 000g, de manière à culotter les vésicules membranaires. A cet égard, il peut s'agir d'une série de centrifugations différentielles, avec la dernière centrifugation effectuée autour de 70 000g environ. Les vésicules membranaires ainsi culottées peuvent ensuite être reprises dans un volume plus faible et dans un tampon approprié pour les étapes ultérieures du procédé.
L'étape de concentration peut également être réalisée par ultrafiltration. Cette ultrafiltration permet en fait à la fois de concentrer le surnageant et d'effectuer une première purification des vésicules. Selon un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique (par exemple le surnageant) est soumis à une ultrafiltration, de préférence une ultrafiltration tangentielle. L'ultrafiltration tangentielle consiste à concentrer et fractionner une solution entre deux compartiments (filtrat et rétentat), séparés par des membranes de seuils de coupure déterminés. La séparation est réalisée par application d'un flux dans le compartiment rétentat et d'une pression transmembranaire entre ce compartiment et le compartiment filtrat. Différents systèmes peuvent être utilisés pour réaliser l'ultrafiltration, comme par exemple des membranes spirales (Millipore, Amicon), membranes planes ou fibres creuses (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention des membranes ayant un seuil de coupure inférieur à 1000 kDa, de préférence compris entre 300 kDa et 1000 kDa, encore plus préférentiellement entre 300 kDa et 500 kDa.
L'étape de chromatographie d'affinité peut être réalisée de différentes façons, sur différents matériels et supports chromatographiques. Il s'agit avantageusement d'une chromatographie d'affinité non-spécifique, destinée à retenir certains contaminants présents dans la solution, sans retenir les objets d'intérêt (i.e., les exosomes). Il s'agit donc d'une sélection négative. Il s'agit de préférence d'une chromatographie par colorant, permettant d'éliminer (i.e., de retenir) des contaminants tels que les protéines et enzymes, par exemple l'albumine, des kinases, déshydrogénases, facteurs de coagulation, interférons ou lipoprotéines, ou encore des co-facteurs, etc. Préférentiellement, le support utilisé pour cette chromatograpgie est un support tel qu'utilisé pour la chromatographie d'échange d'ions, fonctionnalisé avec un colorant. A titre d'exemple spécifique, le colorant peut être choisi parmi le Blue Sepharose (Pharmacia), le Yellow 86, le Green 5 et le Brown 10 (Sigma). Le support est plus préférentiellement de l'agarose. Il est entendu que tout autre support et/ou colorant ou groupe réactif permettant de retenir certains contaminants de l'échantillon biologique traité peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de filtration au moins.
Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de centrifugation au moins. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape d'ultrafiltration au moins. Dans un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de chromatographie d'affinité au moins.
Un procédé préféré de préparation plus particulier de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de permeation de gel. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une filtration du surnageant de culture, suivie d'une ultrafiltration, de préférence tangentielle. Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une clarification suivie d'une chromatographie d'affinité sur colorant, notamment sur Blue Sepharose..
Par ailleurs, après l'étape c), le matériel récolté peut, le cas échéant, être soumis à une ou plusieurs étapes supplémentaires d) de traitement et/ou filtration, notamment dans un but de stérilisation. Pour cette étape de traitement par filtration, on utilise préférentiellement des filtres ayant un diamètre inférieur ou égal à 0,3 μm, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,25 μm. De tels filtres sont par exemple des filtres d'un diamètre 0,22 μm.
Après l'étape d), le matériel obtenu est par exemple distribué dans des dispositifs appropriés tels que flacons, tubes, poches, seringues, etc., dans un milieu approprié de conservation. Les vésicules purifiées ainsi obtenues peuvent être conservées au froid, congelées, ou utilisées extemporanément.
Un procédé de préparation particulier au sens de l'invention comprend donc au moins les étapes suivantes : c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de permeation de gel et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Dans une première variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend : c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c). Dans une autre variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend : c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie de permeation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Selon une troisième variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend : c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anion suivie ou précédée d'une chromatographie de permeation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'injection d'une préparation d'exosomes dans la colonne de chromatographie permet d'obtenir des pics d'absorption symétriques, qui sont parfaitement résolus (Fig. n°l). Les différentes fractions ainsi isolées sont analysables par des techniques classiques d'électrophorèse des protéines en gel dénaturant suivies de techniques de coloration par du bleu de Coumassie ou de techniques de détection de protéines spécifiques à l'aide d'anticorps. Il est ainsi possible de montrer, pour des texosomes, que le pic élue en chromatographie d'échange d'anions par une solution saline de 400 mM possède un profil protéique identique à celui d'une préparation d'exosomes classiquement préparée (Fig. n°2). Ceci permet de facto de caractériser les pics élues à des concentrations salines plus faibles ou plus fortes comme relatifs à des entités biologiques distinctes, contaminantes. Dans une autre expérience, les vésicules membranaires produites à partir de cellules dendritiques (dexosomes) ou certaines texosomes sont éluées à une force ionique comprise entre 500 et 700mM environ, et les vésicules de mastocytes aux environs de 350 mM. En outre, les résultats présentés dans les exemples montrent également que la méthode de l'invention permet de détecter l'éventuelle contamination de la préparation par des protéines majoritaires du milieu de culture telles que la sérum- albumine bovine. En effet, la chromatographie d'une solution étalon de sérum- albumine bovine dans les conditions précédentes montre que celle-ci donne lieu à un pic élue à une concentration saline distincte de celle des exosomes (Fig. n°3).
Le procédé de l'invention permet donc (i) de purifier des vésicules membranaires dans des conditions de qualité et de quantité compatibles avec un usage pharmacologique, et (ii) de révéler l'existence d'entités biologiques distinctes et contaminantes au sein de l'échantillon biologique traité.
Le procédé de l'invention peut être appliqué à la préparation de vésicules membranaires d'origines variées. Ainsi, il peut s'agir en particulier d'exosomes produits par des cellules présentatrices d'antigènes, ou par des cellules tumorales, notamment. En outre, il peut s'agir de cellules primaires, par exemple en culture, ou également de lignées établies, par exemple de lignées immortalisées de cellules productrices de vésicules membranaires. Il peut s'agir de cellules d'origine mammifère, en particulier d'origine murine ou humaine.
Dans un mode particulier de l'invention, les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages et des mastocytes, éventuellement après sensibilisation de celles-ci à un ou plusieurs antigènes choisis. Une application particulièrement préférée de la présente invention réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules dendritiques. A cet égard, il peut s'agir de cellules dendritiques humaines ou animales, notamment humaines ou murines. Ces cellules peuvent être des cellules primaires, récoltées à partir de fluides biologiques d'un sujet ou produites ex vivo à partir de cellules précurseur, ou également des cellules de lignées établies, par exemple immortalisées avec un oncogène (EP 701 604).
Un objet particulier de la présente invention réside dans un procédé de préparation de vésicules membranaires (dexosomes), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires (dexosomes) et, c) la purification des vésicules membranaires (dexosomes) par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions, dans les conditions définies ci-avant.
Un mode de réalisation plus préféré réside dans un procédé de préparation de dexosomes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de dexosomes, c) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en dexosomes, notamment par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et, d) la purification des dexosomes par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et/ou de permeation de gel, dans les conditions définies ci-avant.
Plus particulièrement, pour la mise en oeuvre de cette variante de l'invention, les cellules dendritiques sont préférentiellement obtenues à partir d'un échantillon biologique provenant d'un sujet, par exemple de moelle osseuse ou de sang périphérique. A cet égard, les techniques de production de cellules dendritiques ont été décrites dans l'art antérieur et peuvent être mises en oeuvre par l'homme du métier (voir notamment les techniques décrites dans la demande WO99/03499, incorporée à la présente par référence). Les cellules dendritiques peuvent ainsi être préparées à partir de cellules souches du système immunitaire, à partir de précurseurs monocytes ou encore isolées directement sous forme différenciée (Revue par Hart, Blood 90 (1997) 3245).
Une méthodologie privilégiée dans le cadre de la présente invention repose sur la production de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse. Plus particulièrement, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des cellules dendritiques obtenues par traitement de précurseurs monocytes (contenus dans le sang ou la moelle) en présence d'une combinaison GM-CSF+IL4 ou GM-CSF+IL-13.
Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures. Avantageusement, on utilise une population de cellules dendritiques composée principalement (i.e., au moins 60%, de préférence 70%) de cellules dendritiques immatures.
L'étape d'obtention des cellules dendritiques peut donc comprendre avantageusement la préparation d'une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures, en particulier d'origine humaine, notamment à partir de précurseurs monocytes, plus particulièrement par traitement avec une combinaison de cytokines telle que GM-CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13.
Par ailleurs, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la présente invention des populations de cellules dendritiques immortalisées. Il peut s'agir de lignées de cellules dendritiques immortalisées (lignée Dl par exemple, ou tout autre lignée produite par exemple par introduction de l'oncogène myc dans les cellules dendritiques). Il peut également s'agir de cellules dendritiques préparées puis immortalisées in vitro. L'intérêt de cellules dendritiques immortalisées réside dans la constitution de banques de cellules sensibilisées à des groupes d'antigènes donnés, utilisables industriellement pour préparer des dexosomes susceptibles d'être administrés à des familles entières de patients.
Pour produire les vésicules membranaires (dexosomes), les cellules dendritiques peuvent être simplement cultivées dans des conditions conventionnelles connues de l'homme du métier. Avantageusement, néanmoins, ces cellules sont cultivées dans des conditions stimulant la production des dexosomes, en particulier en présence de facteurs capables de stimuler la production des dexosomes, notamment d'une cytokine telle que l'interféron gamma, l'interleukine- 10 ou l'interleukine-12 (voir par exemple la demande WO99/03499). Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, les cellules dendritiques sont donc cultivées, au cours de l'étape b) ci-dessus, dans des conditions stimulant la production des vésicules membranaires.
D'autre part, dans une variante particulière de réalisation, les cellules dendritiques sont sensibilisées à un antigène, préalablement à la production des vésicules membranaires. Ce mode de réalisation permet ainsi de charger les cellules dendritiques en antigène(s) particulier(s), de manière à produire des dexosomes ayant un caractère immunogène donné. La sensibilisation peut être réalisée par différentes techniques connues en soi, comprenant par exemple la mise en contact des cellules avec des peptides antigéniques, des antigènes, des complexes protéiques, des cellules ou membranes de cellules exprimant des antigènes, des corps apoptotiques, des vésicules membranaires, des liposomes, des ARN tumoraux ou tout acide nucléique codant pour un ou plusieurs antigènes, déterminants antigéniques ou épitopes (éventuellement véhiculés par un vecteur viral ou non viral), etc (voir par exemple la demande WO99/03499). Dans un mode préféré, la sensibilisation est réalisée par incubation avec des peptides, antigènes, ARN ou acides nucléiques. Il est entendu que la présente demande n'est pas limitée à des techniques de sensibilisation ou de production des cellules dendritiques.
Une autre application particulièrement avantageuse de la présente invention réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules tumorales, notamment humaines. Il peut s'agir en particulier de toute cellule provenant d'une tumeur solide ou liquide ainsi que de cellules transformées ou immortalisées in vitro. On peut mentionner plus préférentiellement les tumeurs solides, hématopoiétiques ou ascitiques.
Une application particulière de la présente invention réside également dans la préparation de vésicules membranaires comprenant une ou plusieurs molécules hétérologues, en particulier recombinantes. Ainsi, il est en effet possible, par exemple, de modifier génétiquement des cellules productrices de vésicules membranaires (par exemple des lignées de mastocytes) pour faire exprimer, dans ou à la surface des vésicules qu'elles produisent, des molécules d'intérêt (PCT/FR99/02691). La présente invention peut également permettre de purifier de telles vésicules modifiées.
De manière plus générale, l'invention peut être appliquée à la préparation de vésicules membranaires produites par tout type cellulaire, en particulier de vésicules de type exosome, ayant de préférence un diamètre inférieur à environ 100 nm. Il peut s'agir notamment de cellules de macrophages, mastocytes, réticulocytes, etc. Dans la section expérimentale, nous avons utilisé des préparations d'exosomes provenant (i) de lignées cellulaires telles que des lignées de cellules tumorales (TS/A), des lignées de cellules dendritiques murines (Dl), une lignée de mastocytes (RBL) et (ii) de cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes. Les résultats obtenus sont directement transposables à d'autres cultures primaires telles que des cellules tumorales, des cellules dendritiques humaines, des lymphocytes B, etc., cultivables dans des conditions industriellement acceptables. Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre comme étape de purification des exosomes dans le cadre de leur utilisation en thérapeutique humaine.
Les vésicules membranaires ainsi obtenues constituent, selon leur origine, des outils d'étude des cancers ou de la régulation du système immunitaire, de transfert de molécules, de production d'anticorps, de marquage, de diagnostique, de constitution de banques, des principes de vaccin ou de médicament, etc.
En outre le procédé de l'invention peut également être utilisé comme méthode pour un contrôle de qualité sur la présence éventuelle de contaminants (notamment de protéines contaminantes) dans le milieu de culture ou dans des préparations de vésicules membranaires.
A cet égard, la présente invention peut donc être mise en oeuvre aussi bien dans une méthode préparative de vésicules membranaires que dans un système analytique permettant de contrôler la qualité d'une préparation de vésicules membranaires, quelle que soit leur méthode de préparation.
La présente invention concerne donc également un procédé de contrôle de la présence de contaminants, notamment d'origine protéique ou nucléique, dans une préparation de vésicules membranaires, notamment d'exosomes, comprenant le traitement d'une fraction de ladite préparation par une étape au moins de chromatographie d'échange d'anions, et la mise en évidence de la présence de contaminants.
L'invention concerne aussi, de manière générale, l'utilisation de la chromatographie d'échange d'anions, en particulier de type liquide à haute performance, pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires. Elle concerne l'utilisation de la chromatographie d'affinité pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
L'invention a encore pour objet les vésicules membranaires préparées par le procédé de l'invention, ainsi que toute composition comprenant de telles vésicules.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure no 1 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'un échantillon d'exosomes préparés par centrifugation différentielle.
Figure no 2 : Analyse du profil protéique des différentes fractions d'élution d'une préparation d'exosomes par electrophorese en SDS PAGE puis coloration par du bleu de Coomassie.
Figure no 3 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de sérum-albumine bovine.
Figure no 4 : Schéma de traitement d'un échantillon biologique comprenant des vésicules membranaires par ultrafiltration tangentielle. Figure n° 5 : Profil général de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow après les centrifugations à 600 et 10 000 g d'un surnageant de dexosomes.
Figure n° 6 : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II des exosomes, dans la fraction non adsorbée et dans l'éluat, de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow. Figure n° 7 : Profil général de l'étape source 15Q après une étape de Blue sepharose fast flow.
Figure n° 8 : Détails du gradient d'élution sur la source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow (agrandissement de la zone rectangulaire en bas à droite dans la figure 7). Figure n°9 : Exemple de profil de purification d'exosomes produits à partir de la lignée RBL DR+ (équivalent de 53 μg de protéines) par une colonne de Source 15Q après traitement par la DNase et la RNase.
Figure n°10 : Séparation des exosomes par un gradient discontinu en NaCl sur un support Source 15Q.
Figure n°l l : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II humain de chaque pic séparé par CLHP et ultracentrifugé. Témoin positif : Cellules dendritiques humaines exprimant les molécules du CMH II. Témoin négatif : milieu ultracentrifugé et représentant le bruit de fond. MW= poids moléculaire ; NA= fraction non adsorbé.
Techniques générales de culture cellulaire et de biologie moléculaire
1) Cultures cellulaires
La lignée de cellules TS/A est une lignée de cellules murines établie à partir d'un carcinome mammaire spontané. Cette lignée est cultivée à 37°C en présence de 5% de C02 en milieu RPMI en présence de 10% de sérum de veau foetal (Dominique Dutcher).
Les lignées de cellules dendritiques sont maintenues dans un milieu IMDM contenant 10% de sérum bovin foetal inactivé, 2 mM de L-glutamine, 50 μM de 2- βME, 100 Ul/ml de pénicilline, et 100 μg/ml de streptomycine.
2) Analyse des protéines par SDS PAGE
20μl d'échantillon est dilué dans le tampon de Laemmli (Nature 227 (1970) p680-685) puis soumis à une dénaturation thermique à 95°C pendant 10 mn puis chargé sur des gels d'acrylamide 10%> (Novex 1 mmxl 0 puits). Après migration, les gels sont colorés au bleu de Coomassie.
Exemples
1) Chromatographie par échange d'anions d'une préparation d'exosomes produits par des cellules tumorales (lignée TS/A) : analyse par SDS PAGE du profil protéique des différentes fractions éluées.
Cet exemple illustre comment une étape de chromatographie d'échange d'anions peut permettre de séparer des impuretés d'une préparation d'exosomes.
1. 1) Protocole
Dans cette expérience le matériel de départ est constitué d'un concentrât d'exosomes préparés par centrifugation différentielle à partir d'un surnageant de culture de cellules TS/A permettant de séparer les exosomes des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. La première centrifugation est réalisée à basse vitesse (300g pendant 5 mn) afin de culotter les cellules en suspension présentes dans le surnageant de culture. Deux autres centrifugations (1200g pendant 20 mn puis 10 000g pendant 30 mn) permettent de culotter les débris cellulaires. Le surnageant ainsi clarifié est alors soumis à une ultracentrifugation à haute vitesse de 70 000g pendant 1 heure permettant de culotter les exosomes. Cette préparation est alors lavée dans un grand volume de solution saline pour être recentrifugée dans les conditions précédentes. Le culot est alors repris dans un volume d'environ 100 μl de solution saline et constitue une solution concentrée d'exosomes. La quantité de protéines est mesurée par la technique de Bradford (Biorad, lvry, France). Ce concentrât présente une teneur en protéines totales comprise entre 500 et 1000 μg/ml. 40 μg de cette préparation d'exosomes dilués dans 500 μl de tampon Tris/HCL 50 mM pH sont injectés sur une colonne contenant du gel Source Q 15 (Pharmacia) équilibré dans une solution Tris/HCL 50 mM pH 8. Après rinçage, les espèces adsorbées sont éluées sur 30 volumes de colonne par un gradient linéaire de NaCl de 0 à 500 mM, puis par une solution de NaCl 2M. Les fractions d'élution sont analysées par spectrophotométrie à 260 et 280 nm. Les fractions d'élution sont regroupées en 5 cinq fractions majeures (de FI à F5) afin de pouvoir analyser leur profil protéique respectif. Les protéines de chaque fraction sont précipitées par 1/10 de volume, d'une solution d'acide trichloroacétique à 100 % puis rincées par une solution d'acétone. Les culots proteiques sont repris dans 20 μl de solution de Laemmli, et sont déposés sur un gel d'acrylamide SDS PAGE qui est alors coloré par du bleu de Coomassie.
1.2) Résultats
Les profils d'élution à 260 et 280 nm sont représentés sur la figure 1. Les profils montrent la présence de 3 pics symétriques distincts, élues aux concentrations salines respectives de 105 mM, 400 mM et 2 M de NaCl.
L'analyse du profil protéique des fractions correspondant aux différents pics montre que le pic élue à 400 mM de NaCl possède un profil protéique identique à celui d'une préparation d'exosomes préparée classiquement par centrifugation
(Figure N° 2). Le rapport entre les absorptions à 260 et 280 nm mesuré à une valeur de 0.8 est compatible avec celui décrit dans le cas des protéines.
Le pic élue (fraction F2) à 105 mM de NaCl présente en revanche un profil protéique différent montrant seulement deux bandes distinctes. Les mesures d'absorbance à 260 et 280 nm donnent un rapport de 1.6 suggérant la présence d'une association d'acides nucléiques et de protéines.
La fraction F5 éluée à 2 molaire de NaCl correspond aux composés biologiques fortement associés à la colonne. Il est donc possible de séparer les exosomes d'impuretés par une étape d'échange d'anions.
2) Chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de sérum-albumine bovine :
Cette technique de chromatographie par échange d'anions permet également d'évaluer le degré de contamination d'une préparation d'exosomes par les protéines présentes dans le milieu de culture. Ainsi, nous montrons en chromatographiant 10 μg d'une solution de sérum albumine bovine, correspondant à la protéine majoritaire du milieu de culture, que celle-ci est éluée à 205 mM de NaCl sous forme d'un pic étroit distinguable des pics précédemment décrits dans le cas des exosomes.
3) Traitement d'un surnageant de culture contenant des exosomes par ultrafiltration.
Cet exemple montre qu'il est possible de concentrer les exosomes pa ultrafiltration. De plus, la préparation exosomale est appauvrie en protéine contaminantes telle que les BSA.
3.1) Protocole : (Figure N° 4)
150 ml d'un surnageant de culture de cellules obtenu après centrifugation à 300 g de cellules TSA, sont soumis à une filtration sur un filtre de porosité de 0.22 μm (Millipore). Le filtrat est dilué de moitié dans du PBS. Les 300 ml résultants sont filtrés tangentiellement avec une cassette de filtration (10cm2 de membrane) d'un seuil de coupure de 300 000 D (Sartorius).
3.2) Résultats 7 ml de rétentat sont obtenus après 1 heure de filtration. Le rétentat a été soumis une ultracentrifugation (79 000) pour culotter et analyser les exosomes. Une analyse par SDS-PAGE suivie de coloration au bleu de Coomassie a révélé que l'échantillon contenait significativement moins de BSA que la solution qui a été ultrafiltrée. De plus, des bandes proteiques spécifiques des exosomes produits à partir de TSA sont observées.
L'ultrafiltration peut donc être utilisée dans un procédé de purification d'exosomes afin de séparer ceux-ci de protéines contaminantes.
4) Purification par CLHP d'exosomes humains, produits par des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MDDC).
4.1) Matériels et Méthodes
. Tampons et solutions mères.
On travaille à partir de solutions mères filtrées 0,22 μm à l'exception de l'eau et de la solution de soude. Le premier tampon est une solution de Bis-Tris-Propane (BTP) 100 mM (Sigma, 99%> de pureté), tamponnée à pH 6, ce tampon est branché sur la voie A du chromatographe (BioCad Sprint, Perkin-Elmer). Le second tampon est une solution de Bis-Tris-Propane 100 mM, tamponnée à pH 9, ce tampon est branché sur la voie B du chromatographe. L'eau est produite sur résine par un système Milli-Q à une résistance de 18 MΩcm. l'eau est branchée sur la voie C. Sur la voie D est branchée une solution mère de chlorure de sodium (NaCl, Prolabo, 99,5%) de pureté) 3 M. Sur la voie F est branchée une solution de soude (NaOH, Prolabo, 98% de pureté minimum) 0,1 M. La voie E est utilisée pour charger les surnageants de culture sur les colonnes. Tous les tampons sont réalisés à partir de l'eau produite par le système Milli-Q, les tampons ne sont pas dégazés.
. Colonnes
Blue Sepharose 6 fast flow (pharmacia):
La première étape est réalisée avec une colonne de Blue Sepharose 6 fast flow
(Pharmacia). La matrice est de l'agarose couplé avec du Blue sepharose 6 fast flow
Blue 3 G (7%>). La taille des particules se situe entre 45 et 165 μm. Le débit linéaire maximum est de 750 cm/hr. Le gel est stable aux pH compris entre 4 et 12, aux pH extrêmes, 2 et 14, le gel peut être endommagé ce qui entraîne une diminution de la capacité de fixation (découplage du Blue sepharose 6 fast flow) et une augmentation de la pression (formation de fines).
Le Blue sepharose 6 fast flow est spécifique de composants comme l'albumine, les kinases, les déshydrogénases et d'autres enzymes contenant des cofacteurs comme le NAD+, des facteurs de coagulation, des interférons et de lipoprotéines.
La capacité théorique de fixation du Blue sepharose 6 fast flow est d'environ 15 à
20 mg de sérum albumine par ml de gel.
Le volume de colonne utilisé est d'environ 5,5 ml de gel (Cl 0/10, Pharmacia) soit une capacité théorique de 80 à 110 mg de sérum albumine. Le débit utilisé est de 2 ml/min (150 cm/hr) sur le BioCad Sprint et de 3,5 ml/min (260 cm/hr) avec un système de détection Pharmacia. La pression n'excède pas 2.5 bars et est essentiellement due aux cellules de mesure de DO
Source 15Q :
La deuxième étape est réalisée avec une colonne de Source 15Q (pharmacia), échangeur d'anions fort. La matrice est du polystyrène réticulé avec du divinylbenzène. La taille des billes est de 15 μm et est homogène. Les billes sont parcourues par un réseau de pores avec une taille variant de 20 à 1000 nm. Ces gels sont très résistant à la pression et acceptent des débits linéaires important (1800 cm/hr et plus) tout en gardant une résolution et une capacité satisfaisante. Cela est rendu possible grâce à l'homogénéité des billes et à leur porosité qui augmentent l'accès des molécules aux groupements fonctionnels. Le gel est stable aux pH compris entre 2 et 12 au delà le gel risque de subir d'important dommages qui diminuent ses capacités.
La capacité théorique de fixation de cet échangeur est d'environ 25 mg de protéines par ml de gel. On utilise une colonne de 0,8 ml (PEEK column 4,6 mm ID/50 mm L, Perkin-Elmer), soit une capacité maximum de 20 mg de protéines. La capacité réelle, qui permet de garder une bonne résolution, est de l'ordre de 10%) de cette capacité maximum soit 2 mg de protéines. Le débit utilisé est de 5 ml/min (1880 cm hr) et permet des séparations rapides. La colonne est packeé avec le système Poros selfPack à 15ml/min à 150 bars.
. Chromatographe (BioCad Sprint)
Le BioCad est un système CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) qui permet de travailler à des hautes pressions (maximum 204 bars) et à des débits s 'étalant de 0,2 à 60 ml/min. On peut brancher jusqu'à 6 tampons (les 6 voies sont utilisées actuellement), et le système peut être traité par la soude 0.1 M (pH 12) pour la dépyrogènéisation des tubulures et de la colonne.
Les séparations peuvent être réalisées à température ambiante ou à 4°C. Les échantillons sont chargés soit par une des voies accessibles ou par des boucles d'injection pour les petits volumes (de 100 μl à 5 ml). Le système de détection utilise une cellule UV double voie : de 190 à 450 nm pour UV et de 366 à 700 nm pour le visible. Classiquement on utilise une détection à 254 nm pour les acides nucléiques et une détection à 280 nm pour les protéines (ceux sont les acides aminés avec un cycle benzène tels les tyrosines, tryptophanes et phénylalanines qui absorbent). Le système est entièrement contrôlé par informatique (logiciel développé par Perspective biosystem). Pour chaque séparation, tous les paramètres (pression, débit, conductivité, densité optique, pH, etc.) peuvent être contrôlés. Enfin, l'échantillon séparé est soit récupéré en tube Falcon 50 ml ou collecté en tubes eppendorf siliconés (collecteur Advantec SF-2120) pour minimiser les interactions non spécifiques.
. Production des exosomes à partir de cellules dendritiques.
De façon première, les cellules dendritiques sont obtenues à partir de précurseurs monocytaires du sang périphérique. Les monocytes isolés sont cultivés en présence d'une combinaison de GM-CSF et d'IL-13 ou d'IL-4 (voir les techniques décrites dans la demande WO99/03499). Pour la production d'exosomes il est préférable d'utiliser une population de cellules dendritiques immatures.
4.2) Etape de Blue Sepharose 6 fast flow.
Les surnageants de culture sont centrifugés deux fois à 600 g et une fois à 10 000 g avant d'être chargés sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow. On utilise une colonne de 5,5 ml, le débit est de 2 ml/min (débit linéaire de 150 cm/h, temps de contact de 2,7 min), la pression est de l'ordre de 2,5 bars (fig 5). La colonne est équilibrée en tampon BTP 12 mM, 150 mM NaCl et pH 7. Après équilibration, le surnageant est chargé sur la colonne puis celle ci est lavée avec le même tampon d'équilibration jusqu'à la redescente de la D.O. L'élution des protéines fixées est réalisée en BTP 12 mM, NaCl 1,5 M et pH 7 (en 3 à 4 volumes de colonne). La colonne est régénérée par passage d'eau (2 à 3 volumes de colonne), puis on passe 2 volumes de soude 0,1 M (pH 12), enfin, la colonne est rééquilibrée en BTP 12 mM, 150 mM NaCl et pH 7. Aspect quantitatif et qualitatif de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow :
Comme décrit avant, l'étape de Blue sepharose 6 fast flow est spécifique des protéines comme l'albumine qui est un contaminant majeur du surnageant de culture. On mesure la concentration protéique de chaque fraction de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow par une technique Biorad (mesure d'une DO à 600 nm). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1.
Tableau 1. Concentrations proteiques dans chaque fraction de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow.
Figure imgf000032_0001
La majeure partie des protéines se retrouve soit dans l'éluat (72%) ou dans la régénération (32%). La fraction non adsorbée ne représente que 7 à 10% du total des protéines chargées sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow. L'étape est spécifique des contaminants majeurs du surnageant. Pour vérifier cette spécificité du Blue sepharose 6 fast flow, chaque fraction est déposée sur un gel SDS-PAGE en condition réductrice et coloré en nitrate d'argent. La surcharge de la colonne (50 ml de surnageant chargés sur une colonne de Blue sepharose 6 fast flow de 5.5 ml) a permis de calculer la quantité maximum de protéines, du surnageant de culture, qu'il est possible de charger sur la colonne par ml de gel (tableau 2). Dans ce cas le pourcentage de la fraction non adsorbée passe de 7 à plus de 30% de la quantité de protéine chargée. Cette valeur est comprise entre 16 et 18 mg de protéines par ml de gel Blue sepharose 6 fast flow. En conclusion 1 ml de gel de Blue sepharose 6 fast flow permet de purifier environ 5 à 6 ml de surnageant de culture (AIMV 2.5%> de HSA). Cette valeur prend toute son importance pour l'étude du scale up puisqu'il détermine la taille de la colonne à utiliser et par conséquent le coût de cette étape.
Tableau 2. Etude de la surchage du support Blue sepharose 6 fast flow en première étape.
Figure imgf000033_0001
Comme attendu, le contaminant majeur des surnageants de culture, après les centrifugations à 600 et 10 000 g, est l'albumine. Ce contaminant est retrouvé, après fixation sur le Blue sepharose 6 fast flow, dans les fractions eluat et régénération. En plus de ce contaminant, on retrouve de nombreux autres contaminants de bas poids et hauts poids moléculaires.
L'étape de Blue sepharose 6 fast flow permet l'élimination d'environ 90 à 95%> des contaminants du surnageant de culture. Les exosomes sont dans la fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow (fig.6).
4.3) Etape d'échangeur d'anions: source 15Q (Pharmacia). On utilise une colonne de source 15Q de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min (débit linéaire de 1880 cm/h, temps de contact 0,1 min) avec une pression de l'ordre de 50 bars. La fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow est directement chargée sur la source 15Q (fig. 7) sans modifications de la concentration saline (NaCl) ou du pH.
Après l'étape de fixation la colonne est lavée en tampon BTP 12 mM, 280 mM NaCl à pH 7 (35 volumes de colonne) jusqu'à la redescente de la DO à des valeurs proches de 0. On fait une seconde étape de lavage à une concentration saline de 150 mM NaCl (10 volumes de colonne) pour renforcer les interactions des exosomes avec le support.
On réalise un premier gradient de 150 à 420 mM NaCl en 7 volumes de colonne (fig.8) puis le gradient est stoppé pendant 9 volumes de colonne. Le second gradient démarre de 420 mM NaCl jusqu'à 1 M NaCl en 25 volumes de colonne. Les exosomes sont élues dans ce second gradient dans deux pics à 550 et 700 mM NaCl (fig.8). La colonne est régénérée par passage de 10 volumes de colonne d'eau puis par 10 volumes de colonne de soude 0.1 M (pH 12) et enfin par passage de 10 volumes de colonne de NaCl 3M. La colonne est ensuite équilibrée en tampon BTP 12 mM, 150 mM NaCl, pH 7.
Aspects quantitatifs et qualitatifs de l'étape de source 15Q.
Comme on peut le voir sur la figure 6 la majeur partie des protéines, de la fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow, ne sont pas retenues par la colonne. Les concentrations proteiques ont été mesurées par un test Biorad (absorption de la DO à 600 nm) et sont résumées dans le tableau 3. Tableau 3. aspects quantitatifs de l'étape de Source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow.
Figure imgf000035_0001
95%) des protéines chargées sur la colonne Source 15Q ne sont pas retenues. Les fractions poolées 4 à 6 et les fractions poolées 19 à 23 représentent environ 1.5%. La régénération n'a pas été dosée. Le rendement est très proche de 100%> : l'ensemble des protéines et des vésicules chargées sont éluées de la colonne. En terme de charge protéique de la colonne, la Source 15Q est capable de fixer environ 25 mg de protéines (données constructeur), soit pour les 0.8 ml, 20 mg de protéines. II est clair que l'on est très loin du maximum de la colonne et des 5 à 10% en accord avec une bonne résolution, puisque ces valeurs se situent entre 1 et 2 mg de protéines. Dans ces conditions on peut purifier, avec une colonne de 0.8 ml de Source 15Q, entre 200 et 400 ml de surnageant de culture. Chaque pic d'élution est ultracentrifugé (100 000 g pendant 1 heure) et poolé pour être observé en microscopie électronique. Le premier pic (elué entre 150 et 420 mM NaCl) contient essentiellement des protéines, des débris cellulaires et quelques vésicules marquées par un anticorps anti CMH IL Le second pic (élue à 550 mM NaCl), traité de la même façon, montre un bruit de fond moins important, un nombre beaucoup plus grand de vésicules marquées par un anticorps anti CMH II, il existe également une hétérogénéité dans la taille des vésicules. Le troisième pic (élue à 700 m-M NaCl) ne présente plus de bruit de fond, les vésicules sont pratiquement toutes marquées par un anticorps anti CMH II et sont beaucoup plus homogènes en taille.
Ces deux fractions (pic 2 et 3) sont à comparer à ce que l'on obtient par le procédé classique de purification par ultracentrifugation. Dans ce cas on observe un bruit de fond important et une grande hétérogénéité des vésicules comparé aux deux pics de chromatographie. De plus, il semble qu'il existe une séparation entre les débris et les exosomes purifiés par CLHP ce qui n'est pas le cas avec l'ultracentrifugation.
4.4) Conclusions
En deux étapes de chromatographie, la première faisant appel à une sélection négative (étape de Blue sepharose 6 fast flow) des exosomes la seconde faisant appel à une sélection positive et à une élution sélective des exosomes (étape de Source 15Q), on enlève environ entre 99 et 99.5%> des protéines du surnageant de culture tout en gardant les exosomes. Le procédé conserve l'intégrité des exosomes par microscopie électronique. Ce procédé est donc spécifique pour la purification des exosomes.
A titre d'exemple, d'autres colonnes retenant les protéines du sérum peuvent être utilisées. Par ailleurs, des colonnes macroporeuses cationiques peuvent être utilisées à la place de la Source 15Q.
5) Purification par CLHP d'exosomes produits à partir de la lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia). Les exosomes sont produits à partir d'une lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia) transfectée de façon stable pour exprimer, à la membrane des exosomes, des molécules du CMH II humain (PCT/FR99/02691). Après induction, par un ionophore (iomicyne), les cellules dégranulent et relarguent des exosomes dans un milieu sans protéines (RPMI). Après élimination des cellules par centrifugation à
600 g 10 min les surnageants sont récupérés et traités avec une DNase (Sigma) et une R ase (Sigma).
Les surnageants traités sont ensuite centrifugés à 10 000 g à 37°C, 30 min, puis à
100 000 g pendant 1 heure. Le culot d'ultracentrifugation est chargé sur une colonne d'échange d'ions, Source
15Q, Pharmacia (fig.9). On utilise une colonne de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min
(débit linéaire 1880 cm/h, temps de contact 0.1 min).
La colonne est équilibrée en tampon Bis-Tris-Propane (BTP) 12 mM, 150 mM NaCl et pH 7. Après chargement de l'échantillon la colonne est lavée avec 15 à 20 volumes de colonne du même tampon d'équilibration. L'élution est réalisée avec 25 volume de colonne en faisant varier la concentration saline de 150 mM à 1 M NaCl, le pH est maintenu constant (fig.9). Le milieu est très peux contaminé par des protéines puisque les cellules sont lavées dans du PBS et l'induction ainsi que le relargage des exosomes se fait dans du RPMI seul. Ceci est confirmé par la faible absorption observée (280 et 254 nm) dans la fraction non adsorbée de la Source 15Q. La présence des exosomes est confirmée par un western blot dirigé contre les molécules du CMH II (fig 11) après séparation des pics par des steps en NaCl (fig. 10) et ultracentrifugation de chacun des pics. On observe 3 pics, plus une fraction non adsorbée : un premier pic élue à 350 mM NaCl, un deuxième pic élue à 700 mM NaCl et enfin un troisième pic élue à 1.5 M NaCl. Le pic à 700 mM est majoritaire. En western blot dirigé contre les molécules du CMH II humain on retrouve un signal dans les pics 1 (350 mM NaCl) et dans le pic 2 (700 mM NaCl). Il est à noter que le pic 1 qui a une intensité de signal, en protéines, 7 à 8 fois moindre que le pic 2 présente un signal en western blot équivalent à celui du pic 2. Ceci peut traduire une plus grande pureté du pic 1. Pour confirmer ce fait, les pics ont été ultracentrifugés et observés en microscopie électronique. Le pic 1 est très riche en exosomes marquées par un anticorps anti CMH II humain, il y a peu ou pas de bruit de fond. Les exosomes sont hétérogènes en taille, il ne semble pas y avoir de séparation des exosomes pas leur taille mais par un mécanisme spécifique de compétition entre l'éluant (NaCl) et les exosomes. Les fractions comprises entre les deux pics ont été analysées par microscopie électronique. On y trouve peu d'exosomes avec un bruit de fond plus important que dans le pic 1.
Le pic 2 est très semblable aux fractions comprises entre les deux pics, on retrouve peu d'exosomes et bruit de fond plus important.
Conclusions
La Source 15Q est capable de retenir les exosomes et de les séparer de contaminants éventuels (fig.9). La très grande majorité des exosomes est éluée dans un même pic à 350 mM NaCl. En microscopie électronique les exosomes apparaissent «normaux» avec un marquage spécifique des molécules du CMH II humain. L'hétérogénéité de la taille des exosomes (pic 1) semble indiquer que la séparation est basée sur des échanges ioniques et non sur un tamisage. Le Source 15Q peut donc être utilisé comme étape de purification des exosomes de RBL.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions fort.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et de permeation de gel.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un fluide biologique, un surnageant de culture, un lysat cellulaire ou une solution prépurifiée.
5. Procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins: b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de permeation de gel.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de permeation de gel.
7. Procédé selon les revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de clarification, éventuellement suivie d'une étape de concentration.
8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de chromatographie d'affinité, de préférence sur colorant.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de centrifugation à faible vitesse et/ou une filtration.
10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend au moins une étape d'ultrafiltration, notamment tangentielle.
11. Procédé de préparation de vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de permeation de gel.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d) de filtration du matériel récolté.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les vésicules membranaires possèdent un diamètre compris entre 60 et 90 nm environ.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages ou des mastocytes.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules dendritiques, notamment humaines.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules tumorales, notamment humaines.
17. Procédé de préparation de vésicules membranaires caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires et, c) la purification des vésicules membranaires par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
18. Procédé de préparation de vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires, c) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires, notamment par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et, d) la purification des vésicules membranaires par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et/ou de permeation de gel.
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont obtenues à partir d'un échantillon biologique provenant d'un sujet, par exemple de moelle osseuse ou de sang périphérique.
20. Procédé selon les revendications 17 à 19, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont immatures.
21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont sensibilisées à un antigène, préalablement à la production des vésicules membranaires.
22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que, au cours de l'étape b), les cellules dendritiques sont cultivées dans des conditions stimulant la production des vésicules membranaires.
23. Utilisation de la chromatographie d'échange d'anions pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
24. Utilisation de la chromatographie d'affinité pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
25. Composition comprenant des vésicules membranaires préparées par le procédé selon l'une des revendications 1 à 22.
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