KR102212465B1 - 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 목표 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달하여 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 손쉽게 대량 생산할 수 있고, 세포 종류에 구애받지 않고 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있으며, 세포에 전달되는 전령 RNA 나노입자의 농도를 조절하여 제조된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있고, 세포의 표면을 개질한 후 전령 RNA 나노입자를 전달하여 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 얻을 수 있으며, 추가적인 담지 과정 없이 목표 단백질뿐만 아니라 세포내에 기전달된 목표 DNA 또는 RNA를 담지하는 소포체를 얻을 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체에 대한 것이다.

Description

알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체{Method for preparing vesicles by delivery of RNA nanoparticles and vesicles prepared therefrom}
본 발명은 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 목표 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달하여 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 손쉽게 대량 생산할 수 있고, 세포 종류에 구애받지 않고 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있으며, 세포에 전달되는 전령 RNA 나노입자의 농도를 조절하여 제조된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있고, 세포의 표면을 개질한 후 전령 RNA 나노입자를 전달하여 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 얻을 수 있으며, 추가적인 담지 과정 없이 목표 단백질뿐만 아니라 세포내에 기전달된 목표 DNA 또는 RNA를 담지하는 소포체를 얻을 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체에 대한 것이다.
세포 유래 소포체(extracellular vesicle; EV)는 세포가 외부 환경으로 방출하는 인지질 이중층으로 둘러싸인 구조로서, 생성 방식에 따라 엑소좀(exosoome), 마이크로베지클(microvesicle), 사멸체(apoptotic body) 등이 있으며, 이 중 엑소좀은 50 ~ 200 nm, 마이크로베지클은 백 나노미터에서 수 마이크로미터 수준의 크기를 가진다. 상기 세포 유래 소포체는 핵구, 혈소판, 내피세포를 비롯한 암 세포 등 진핵 생물의 다양한 세포에서 자연적으로 분비되며, 분비 세포의 막 조성과 동일 또는 유사한 막 조성을 가지며 모체가 되는 세포의 세포질 부분을 포함한다. 따라서, 세포 유래 소포체에는 miRNA 등 다양한 유전 물질과 단백질 등의 요소가 포함되어 있고 이들을 세포 신호 물질 전달체, 약물 전달체 또는 면역치료제로서 활용하기 위해 소포체를 제작하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
상기 세포 유래 소포체는 얻는 방법 중 하나는 자연적으로 분비되는 소포체를 모으는 방법인데, 이는 수율이 매우 낮으며 내부에 포함된 물질을 조절할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 하기의 특허문헌처럼 형질전환세포를 물리적, 화학적으로 처리하여 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생산하는 방법이 개발되고 있다.
<특허문헌>
특허 제10-1733971호(2017. 05. 01. 등록) "목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법"
하지만, 종래의 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생산하는 방법은 형질전환세포를 이용하고 물리적, 화학적으로 세포를 처리하여야 하여, 그 과정이 복잡하고 소포체 생산 효율이 떨어지는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 목표 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달하여 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써, 목표 단백질을 포함하는 소포체를 손쉽게 대량 생산할 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포 종류에 구애받지 않고 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포에 전달되는 전령 RNA 나노입자의 농도를 조절하여, 제조된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 제조된 소포체가 세포의 표면 특성을 그대로 가지고 있으므로, 세포의 표면을 개질한 후 전령 RNA 나노입자를 전달하여 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 얻을 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 추가적인 담지 과정 없이 목표 단백질뿐만 아니라 세포내에 기전달된 목표 DNA 또는 RNA를 담지하는 소포체를 얻을 수 있는 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법은 소포체생산용 RNA 나노입자를 세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 소포체생산용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생성하는 배양단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법에 있어서 상기 소포체생산용 RNA 나노입자는 목표 단백질 발현을 위한 반복되는 전령 RNA를 포함하여, 상기 배양단계에서는 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법에 있어서 상기 전달단계에서 세포에 전달되는 소포체생산용 RNA 나노입자의 양을 조절함으로써, 생성된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법에 있어서 상기 소포체생산용 RNA 나노입자는 구의 형태를 가지고 50 내지 200 nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법은 상기 전달단계 전에 세포의 표면을 개질하는 표면개질단계를 추가로 포함하며, 상기 배양단계를 거쳐 생성된 소포체는 세포의 표면 특성을 그대로 가지고 있으므로, 상기 전달단계에서 상기 표면개질단계를 통해 표면이 개질된 세포를 이용하는 경우, 상기 배양단계에서 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법에 있어서 상기 전달단계는 리포솜 또는 양전하 고분자를 이용한 방법이 이용되며, 상기 리포솜을 이용한 전달법은 RNA 나노입자를 지질 기반 복합체 형성 용액에 첨가한 후 복합체를 형성하여 세포에 처리함으로써 수행되고, 상기 양전하 고분자를 이용하는 방법은 세포를 배양 접시에 분주하고 성장배지를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, RNA 나노입자를 양전하 고분자와 혼합하여 형성한 복합체를 성장배지에 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법은 상기 배양단계에서 생성된 소포체를 분리하는 분리단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 소포체의 제조방법에 있어서 상기 분리단계는 원리분리 방법을 통해 세포 배양 배지로부터 목표 단백질을 포함하는 소포체를 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 목표 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달하여 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써, 목표 단백질을 포함하는 소포체를 손쉽게 대량 생산할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 세포 종류에 구애받지 않고 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 세포에 전달되는 전령 RNA 나노입자의 농도를 조절하여, 제조된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 제조된 소포체가 세포의 표면 특성을 그대로 가지고 있으므로, 세포의 표면을 개질한 후 전령 RNA 나노입자를 전달하여 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 얻을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 추가적인 담지 과정 없이 목표 단백질뿐만 아니라 세포내에 기전달된 목표 DNA 도는 RNA를 담지하는 소포체를 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 전령 RNA 나노입자의 원자현미경 및 전자주사현미경 이미지와, 동적빛산란 분석 결과를 나타내는 도표.
도 2는 PC-3 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지 및 사이토메트리 분석 결과를 나타내는 도표.
도 3은 PC-3 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지.
도 4는 PC-3 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지 및 ImageJ 소프트웨어로 분석한 결과를 나타내는 도표.
도 5는 PC-3 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 시간에 따른 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 6은 HeLa 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 시간에 따른 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 7은 HeLa 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 형성된 소포체의 형광현미경 이미지.
도 8은 HeLa 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 형성된 소포체가 HeLa 세포로부터 유래되었음을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 9는 HeLa 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 형성된 소포체가 HeLa 세포로부터 유래되었음을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지.
도 10은 HeLa 세포에 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지 및 사이토메트리 분석 결과를 나타내는 도표.
도 11은 HeLa 세포에 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 시간에 따른 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 12는 MDA-MB-231 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지 및 SEM 기반 EDX 분석 결과를 나타내는 도표.
도 13은 HDF 세포에 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지.
도 14는 HDF 세포에 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 형성을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 15는 처리되는 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 농도에 따라 소포체 생산량 조절이 가능함을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 16은 처리되는 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 농도에 따라 소포체 생산량 조절이 가능함을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지.
도 17은 처리되는 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 농도에 따라 소포체 생산량 조절이 가능함을 확인하기 위한 EDX 분석 결과를 나타내는 도표.
도 18은 처리되는 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 농도에 따라 소포체 생산량 조절이 가능함을 확인하기 위한 전자주사현미경 이미지.
도 19는 세포의 표면개질을 통한 소포체의 기능 부여가 가능함을 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
도 20은 세포 유래 소포체를 목포 단백질 전달체로 사용 가능함의 확인하기 위한 형광현미경 이미지.
이하에서는 본 발명에 따른 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체를 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법을 도 1 내지 20을 참조하여 설명하면, 상기 소포체의 제조방법은 소포체생산용 RNA 나노입자를 제조하는 입자제조단계와, 상기 입자제조단계에서 제조된 소포체생산용 RNA 나노입자를 세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 소포체생산용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생성하는 배양단계와, 상기 배양단계에서 생성된 소포체를 분리하는 분리단계 등을 포함한다.
상기 입자제조단계는 소포체생산용 RNA 나노입자를 제조하는 단계로, 목표 단백질 발현을 위한 반복되는 전령 RNA를 포함하는 전령 RNA 나노입자가 제조되게 된다. 상기 소포체생산용 RNA 나노입자는 일정한 형태와 크기를 가지나 바람직하게는 전체적으로 구의 형태를 가지고 50 내지 200 nm의 직경을 가지며, 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉키면서 형성되게 되며, 생체물질로만 이루어져 체내 독성이 없으며, 체내 환경에서 안정하여 오랫동안 지속적으로 mRNA를 방출할 수 있다.
상기 입자제조단계는 목표 단백질의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열과 상보적인 염기서열, RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열 및 T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열을 포함하며, termination 염기서열이 제거된 원형의 이중 가닥 플라스미드 DNA를 생성하는 pDNA생성단계와, 상기 플라스미드 DNA와 RNA 중합효소 등을 포함하는 반응 용액을 일정 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이팅하여, RNA 중합효소를 이용하여 상기 플라스미드 DNA를 롤링 서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)시켜 목표 단백질 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 긴 단일 가닥의 전령 RNA를 생성하고, 생성된 단일 가닥의 전령 RNA가 서로 꼬이고 엉기면서 자가 조립을 통해 전령 RNA 나노입자를 형성하는 입자형성단계를 등을 포함한다. 상기 플라스미드 DNA는 termination 염기서열이 제거되어 있으므로, 상기 입자형성단계에서 RNA 중합효소가 지속적으로 원형의 플라스미드 DNA 위에서 RNA를 생산할 수 있게 되며 이를 통해 한 가닥의 RNA 위에 mRNA 염기서열이 여러번 반복적으로 들어갈 수 있게 된다.
상기 전달단계는 상기 입자제조단계에서 제조된 소포체생산용 RNA 나노입자를 세포에 전달하는 단계로, 예컨대 리포솜 또는 양전하 고분자를 이용하여 소포체생산용 RNA 나노입자를 세포에 전달할 수 있다. 상기 전달단계에서 세포에 전달되는 소포체생산용 RNA 나노입자의 양을 조절함으로써, 제조된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있게 된다.
상기 리포솜을 이용한 전달법은 RNA 나노입자와 지질 기반 복합체 형성용액(Stemfect RNA Transfection Kit, Stemgent)과 혼합하여 복합체를 생성하고 이를 세포 배양 배지에 첨가하여 수행될 수 있으며, 상기 양전하 고분자를 이용하는 방법은 세포를 배양 접시에 분주하고 성장배지를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, RNA 나노입자를 양전하 고분자인 기반 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System, Mirus)와 혼합하여 복합체를 생성시키고 이를 세포 배양 배지에 첨가하여 수행될 수 있다.
상기 배양단계는 상기 전달단계 후 소포체생산용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 일정 온도에서 일정 시간 배양함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생성하는 단계이다. 상기 배양단계에서는 목표 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달하여 세포 내에서 국부적으로 단백질을 과발현시켜 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써, 목표 단백질을 포함하는 소포체를 손쉽게 대량 생산할 수 있게 된다. 또한, 상기 소포체의 제조방법은 입자제조단계를 통해 다양한 목표 단백질 발현을 위한 소포체생산용 RNA 나노입자를 제조할 수 있고, 전달단계에서 다양한 세포에 소포체생산용 RNA 나노입자를 전달하는 것이 가능하여, 목표 단백질을 세포 종류에 구애받지 않고 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있게 된다.
상기 분리단계는 상기 배양단계에서 생성된 소포체를 분리하는 단계로, 예컨대 원리분리 등의 방법을 통해 세포 배양 배지로부터 목표 단백질을 포함하는 소포체를 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 상기 입자제조단계와 전달단계 사이에 메타볼릭 엔지니어링(metabolic engineering)을 통해 세포의 표면을 개질하는 표면개질단계를 추가로 포함하며, 소포체의 표면에 표적 인식과 같은 새로운 기능을 부여할 수 있다. 상기 소포체 제조방법에 의해 제조된 소포체가 세포의 표면 특성을 그대로 가지고 있으므로, 세포의 표면을 개질한 후 소포체생산용 RNA 나노입자를 전달하여 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 얻을 수 있게 된다. 또한, 마이크로베지클은 다른 종류의 extracellular vesicle과는 다르게 세포질로부터 바로 budding이 일어나며, 이로 인해 목표 단백질을 발현하고 해당 단백질이 마이크로베지클에 담지되는 과정에서 세포질 내에 포함된 RNA, DNA도 자연적으로 함께 담지될 수 있으므로, 소포체생산용 RNA 나노입자의 제조시 RNA 및 DNA를 함께 포함시키는 경우 목표단백질, DNA 및 RNA를 모두 포함하는 마이크로베지클을 생성하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 소포체의 제조방법에 의해 제조된 목표 단백질을 포함하는 소포체를 포함한다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 소포체 생산용 전령 RNA 나노입자의 제조
1. T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열(서열번호:1), RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열(Kozak 염기서열)(서열번호:2) 및 목표 단백질인 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열(서열번호:3)을 포함하며, termination 염기서열이 제거된 플라스미드 DNA(CCCGTGTAAAACGACGGCCAGTTTATCTAGTCAGCTTGATTCTAGCTGATCGTGGACCGGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCTGAGGCTCGTCCTGAATGATATGCGACCGCCGGAGGGTTGCGTTTGAGACGGGCGACAGATCGACACTGCTCGATCCGCTCGCACC-TAATACGACTCACTATAGG(서열번호:1)-GAT-GCCACCATGG(서열번호:2)-
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(서열번호:3)
GGATCGACGAGAGCAGCGCGACTGGATCAGTTCTGGACGAGCGAGCTGTCGTCCGACCCGTGATCTTACGGCATTATACGTATGATCGGTCCACGATCAGCTAGATTATCTAGTCAGCTTGATGTCATAGCTGTTTCCTGAGGCTCAATACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTACGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTCACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGGCAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGATCACTTCTGCGCTCGGCCCTCCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGCATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTTGAGGACCTAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCA)를 설계하였다. 상기 플라스미드 DNA 1 nM, ribonucleotide solution mix (New England Biolabs) 1 mM, Reaction buffer (8 mM Tris-HCl, 0.4 mM spermidine, 1.2 mM MgCl2, and 2 mM dithiothreitol), T7 RNA polymerase(1 ml당 50 unit, England BioLabs)를 튜브에 넣어 혼합하고, 상기 튜브를 인큐베이터에 넣고 37℃에서 20시간 반응시켜 소포체 생산용 전령 RNA 나노입자(mRNA-NP)를 제조하였다.
2. T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터 염기서열(서열번호:1), RNA로부터 단백질이 번역될 때 필수적인 요소인 리보솜 결합 염기서열(IRES 염기서열)(서열번호:4) 및 적색 형광 단백질(RFP(DsRed-Express2))의 발현을 위한 전령 RNA 염기서열(서열번호:5)을 포함하는 플라스미드 DNA(TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAAATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCATCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCAACGCGATGACGATGGATAGCGATTCATCGATGAGCTGACCCGATCGCCGCCGCCGGAGGGTTGCGTTTGAGACGGGCGACAGATGAGGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGC-TAATACGACTCACTATAGG(서열번호:1)-
GAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCG-CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCAACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAA(서열번호:4)-T-
ATGGATAGCACTGAGAACGTCATCAAGCCCTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGCAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACCTTCATCTACCACGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTCTGGGCTGGGAGCCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCGCTGAAGCTGAAGGGCGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCAATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGAAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAGCGCGCCGAGGCCCGCCACCACCTGTTCCAGTAG(서열번호:5)-
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTGAGGGTCTAGAACTAGTGTCGACGCAAATCAGTTCTGGACCAGCGAGCTGTGCTGCGACTCGTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGTCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTACCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC)를 사용한 것을 제외하고는, 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여 소포체 생산용 전령 RNA 나노입자(mRNA-NP)를 제조하였다. 상기 녹색 형광 단백질과 적색 형광 단백질은 생성된 단백질을 손쉽게 확인하기 위해 선정되었다.
<실시예 2> 소포체 생산용 전령 RNA 나노입자의 크기, 형태 및 분포 확인
실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 원자현미경 및 투과전자현미경(내부)으로 측정한 결과를 도 1의 (a)에 나타내었고, 동적빛산란 (Dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 분석한 결과를 도 1의 (b)에 나타내었다. 도 1로부터, 구형의 형태를 가지며 대략 100 nm의 직경을 가지는 나노입자를 확인할 수 있다.
<실시예 3> 전령 RNA 나노입자의 전달을 통한 목적 단백질을 포함하는 소포체의 대량 생산의 확인
1. PC-3 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 생산
(1) 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), PC-3 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 2의 (a)에 나타내었고, 사이토메트리(cytometry)로 세포의 GFP의 발현을 확인한 결과를 도 2의 (b)에 나타내었으며, 주사전자현미경을 측정한 결과를 도 3에 나타내었고, 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과 및 형광 현미경 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 분석한 결과를 그림 4의 (a)에 나타내었으며, ImageJ 소프트웨어로 분석한 결과 중 소포체의 크기 분포를 도표화하여 도 4의 (b)에 나타내었다. 또한, 위 반응의 시작 시점으로부터 2, 6, 18, 24 및 48시간이 지난 후 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
(2) 도 2의 (a)를 보면 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포(mRNA-NP treated)로부터 마이크로 크기의 소포체(GFP 포함)가 다량으로 생성되는 것을 확인할 수 있는데 반해 미처리 세포(Untreated)에서는 소포체가 확인되지 않으며, 도 2의 (b)를 보면 GFP 발현을 위한 전령RNA 나노입자를 처리한 세포에서 미처리 세포보다 녹색형광의 세기가 현저히 높아지는 것을 통해 전령RNA 나노입자를 처리한 세포에 다량의 GFP가 발현되었음을 알 수 있고, 도 3을 보면 미처리 세포의 경우에는 비교적 매끄러운 표면을 갖는데 반해 전령 RNA 나노입자의 전달을 통해 단백질을 발현시켜 준 세포의 경우에는 수백 나노미터 내지는 수 마이크로미터 크기의 소포체가 세포 표면에서 다량 관찰되었고, 도 4의 (a)를 보면 세포당 최소한 4개 이상의 마이크로베지클(MV)이 분비되고 상기 마이크로베지클은 강한 녹색 형광을 띄어 GFP 단백질을 다량 함유하고 있음을 알 수 있으며, 도 4의 (b)를 보면 마이크로베지클은 평균적으로 수백 나노미터 내지는 2 마이크로미터 정도의 크기를 가지는 것을 알 수 있고, 도 5를 보면 18시간이 지난 지점부터는 GFP가 비교적 강하게 발현되며 이후 시간이 지남에 따라 GFP의 발현 및 소포체의 분비가 증가하는 경향을 확인할 수 있어, GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 전달을 통해 발현된 과량의 단백질이 PC-3 세포의 소포체 분비에 큰 영향을 미침을 알 수 있다.
2. HeLa 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 생산
(1) 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HeLa 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 3, 6, 7, 9 및 12시간이 지난 후 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 6에 나타내었고, 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후 원심분리를 통해 얻은 복수 개의 소포체를 형광 현미경으로 촬영하여 도 7에 나타내었다(Inset scale bar = 5μm).
(2) 세포막을 붉은 색 형광물질로 염색하는 시약인 CellVue Claret으로 염색한 HeLa 세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3의 2의 (1)과 동일하게 실험을 진행하고, 24시간이 지난 후 원심분리를 통해 얻은 소포체를 형광 현미경으로 측정하여 도 8에 나타내었다. 또한, 인지질 이중층 부분의 전자 밀도를 높게 하여 투과전자현미경의 이미지에서 인지질 이중층을 관찰할 수 있도록 Osmium tetroxide로 염색된 HeLa 세포를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3의 2의 (1)과 동일하게 실험을 진행하고, 24시간이 지난 후 투과전자현미경으로 측정하여 도 9에 나타내었다(도 9의 (a)는 세포로부터 분비 중인 소포체를 나타내며, 도 9의 (b)는 분비된 소포체를 나타내고, 도 9의 (c)는 도 9의 (b)의 점선 부분을 확대한 이미지임).
(3) 도 6을 보면 시간이 지남에 따라 GFP의 발현 및 소포체의 분비가 증가하는 경향을 확인할 수 있고, 도 7을 보면 소포체는 1~2 μm의 크기를 가지며 발현된 GFP를 포함하고 있기 때문에 소포체가 녹색형광 신호를 방출하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 8을 보면 GFP를 포함하는 소포체가 CellVue Claret의 적색 형광 신호를 발산함을 확인할 수 있어 소포체의 표면에 인지질 이중층이 존재함을 알 수 있으며, 도 9를 보면 소포체가 세포에서 유래했으며 생성된 소포체의 표면에는 세포의 막과 동일하게 9 nm 정도의 두께를 갖는 인지질 이중층이 존재함을 확인할 수 있고 세포의 내부 및 소포체의 내부가 모두 주변 지역보다 어둡게 관찰되는 것을 통해 세포 내부와 마찬가지로 소포체의 내부 역시 단백질이 풍부하게 존재한다는 것을 알 수 있다(osmium tetroxide는 단백질에 결합하여 단백질을 안정화시키고 단백질이 존재하는 부분의 전자 밀도를 높게 하여 투과전자현미경으로 관찰하였을 때 명암을 주는 역할을 함). 따라서, GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 전달을 통해 발현된 과량의 단백질이 HeLa 세포의 소포체 분비에 큰 영향을 미침을 알 수 있다.
3. HeLa 세포에 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 생산
(1) 실시예 1의 2에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HeLa 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg을 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 10의 (a)에 나타내었고, 사이토메트리(cytometry)로 세포의 RFP의 발현을 확인한 결과를 도 10의 (b)에 나타내었다. 또한, 위 반응의 시작 시점으로부터 0, 4, 12, 24 및 48시간이 지난 후 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 11에 나타내었다.
(2) 도 10의 (a)를 보면 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포(mRNA-NP treated)로부터 마이크로 크기의 소포체(RFP 포함)가 다량으로 생성되는 것을 확인할 수 있는데 반해 미처리 세포(Untreated)에서는 소포체가 확인되지 않으며, 도 10의 (b)를 보면 RFP 발현을 위한 전령RNA 나노입자를 처리한 세포에서 미처리 세포보다 적색형광의 세기가 현저히 높아지는 것을 통해 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포에 다량의 RFP가 발현되었음을 알 수 있고, 도 11을 보면 12시간이 지난 지점부터는 소포제의 분비가 뚜렷하게 관찰되고 이후 시간이 지남에 따라 RFP의 발현 및 소포체의 분비가 현저하게 증가하는 경향을 확인할 수 있어, RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 전달을 통해 발현된 과량의 단백질이 HeLa 세포의 소포체 분비에 영향을 큰 미침을 알 수 있다.
4. MDA-MB-231 세포에 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 생산
(1) 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), MDA-MB-231 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg을 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 세포를 osmium tetroxide로 염색한 후 주사전자현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 12의 (a)에 나타내었고, SEM 기반 EDX(Energy dispersive x-ray) 분석을 통해 세포 및 소포체를 구성하는 있는 원소들의 weight%를 분석한 결과를 도 12의 (b)에 나타내었다.
(2) 도 12의 (a)를 보면, GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포(mRNA-NP treated)로부터 마이크로 크기의 소포체가 다량으로 생성되는 것을 확인할 수 있는데 반해 미처리 세포(Untreated)에서는 소포체가 확인되지 않으며, 도 12의 (b)를 보면 미처리 세포의 표면 및 소포체의 표면에서 오스뮴(오스뮴(Os)은 세포를 주사전자현미경으로 관찰하기 위해 second fixative로서 사용된 osmium tetroxide의 처리로 인해 관찰되는 것으로 세포막 인지질의 head 부분에 결합하는 특성을 갖음)이 관찰되어 세포와 소포체 모두 인지질 이중층으로 둘러싸인 구조를 가짐을 알 수 있고 인(P)이 관찰되어 인지질 이중층의 존재를 추가적으로 증명하는 것이 가능하여 소포체가 세포에서 유래하였음을 알 수 있어, GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자의 전달을 통해 발현된 과량의 단백질이 MDA-MB-231 세포의 소포체 분비에 큰 영향을 미침을 알 수 있다.
5. HDF 세포에 GFP 또는 RFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 전달하여 소포체의 생산
(1) 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), Human dermal fibroblast(HDF) 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg을 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 주사전자현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 13에 나타내었다. 또한, 실시예 1의 1 및 2에서 제조된 녹색 형광 단백질 및 적색 형광 단백질 발현용 전령 RNA 나노입자 각각을 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery system)와 혼합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체들, 전령 RNA 나노입자를 포함하지 않는 transfection reagent를 각각 HDF 세포 배양 배지(OPTI MEMI)에 첨가하여 반응시키고, 24시간이 지난 후 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 14에 나타내었다.
(2) 도 13을 보면 GFP 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포(mRNA-NP treated)로부터 마이크로 크기의 소포체가 다량으로 생성되는 것을 확인할 수 있는데 반해 미처리 세포(Untreated)에서는 소포체가 확인되지 않으며, 도 14를 보면 녹색 형광 단백질과 적색 형광 단백질이 각각 소포체 내에 담지된 것처럼, 전령 RNA 나노입자의 종류에 따라 발현되는 단백질이 결정되고 발현된 단백질이 소포체 내에 포함되는 것을 확인할 수 있으며, 전령 RNA 나노입자를 세포에 전달 시 사용되었던 transfection reagent는 그 자체로는 세포에서의 단백질 발현 및 소포체 분비에 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있어, 전령 RNA 나노입자의 전달로 단백질을 과발현시키는 것이 HDF 세포가 단백질을 포함하는 소포체를 분비하는 데에 큰 영향을 끼침을 알 수 있다.
6. 실험 결과의 평가
위의 실험 결과를 통해, 세포에 특정 단백질 발현을 위한 전령 RNA 나노입자를 처리하여 얻은 소포체는 상기 세포로부터 유래하였음을 알 수 있고, 표적 단백질을 포함하는 소포체를 다양한 세포 종으로부터 대량 생산할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4> 소포체 생산량 조절이 가능함의 확인
1. 실시예 1의 2에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HeLa 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 0.2, 1.5, 6μg을 각각 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 형광 현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 15에 나타내었고, 전자주사현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 16에 나타내었으며, SEM 기반 EDX(Energy dispersive x-ray) 분석을 통해 세포 및 소포체를 구성하는 있는 원소들의 weight%를 분석한 결과를 도 17에 나타내었다.
2. 또한, 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HDF 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 0.5, 1.5, 3, 6μg을 각각 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 전자주사현미경을 이용하여 측정한 결과를 도 18에 나타내었다.
3. 도 15를 보면, 처리된 전령 RNA 나노입자의 양에 따라 분비되는 소포체의 양이 결정되며, 전령 RNA 나노입자의 양과는 무관하게 생성되는 소포체에 포함된 발현 단백질의 양은 유사한 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 16 및 18을 보면, 1 ml 당 1.5 μg의 전령 RNA 나노입자를 처리해주었을 때에는 세포의 모양을 그대로 유지하면서 RFP를 포함하는 소포체가 분비되는 것을 확인할 수 있었지만, 4배(6.0μg ml-1)의 전령 RNA 나노입자를 처리하였을 경우에는 세포의 전체적인 모양이 변화하며 세포 전체가 소포체로 뒤덮이는 현상을 확인할 수 있다. 또한, 도 17을 보면, 소포체의 형태, 크기와는 무관하게 모체가 되는 세포와 유사한 원소 함량을 갖는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 전령 RNA 나노입자의 처리 농도가 증가할수록 세포로부터 분비되는 소포체의 크기는 유사하지만 그 양이 증가함을 알 수 있고, 일정 농도 이상의 전령 RNA 나노입자를 처리하는 경우 단시간에 다량의 소포체를 얻을 수 있지만 세포의 세포질 대부분이 소포체로서 방출되어 세포에 손상을 가하는 것을 알 수 있어, 처리하는 전령 RNA 나노입자의 농도 조절을 통해 단시간에 다량의 소포체를 생산하거나 지속적으로 소포체를 생산하는 것을 제어할 수 있게 된다.
<실시예 5> 세포의 표면개질을 통한 소포체의 기능 부여가 가능함을 확인
1. HeLa 세포이 배양배지에 Ac3ManNAz (N-Azidoacetyl-D-mannosamine, triacetylated)를 포함시켜 metabolic engineering을 통해 세포의 표면에 azide를 발현시킨 HeLa 세포를 준비하고, 실시예 1의 1에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HeLa 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg을 처리함). 위 반응의 시작 시점으로부터 24시간이 지난 후, 세포 표면에 존재하는 azide group과 click chemistry를 통해 결합할 수 있는 DBCO-cy5(Cyanine 5:적색형광물질)를 반응시켰다. 그 다음 세포의 핵을 DAPI로 염색하여 준비하고, 형광현미경을 이용하여 측정하여 그 결과를 도 19에 나타내었다.
2. 도 19를 보면, 전령 RNA 나노입자를 처리한 세포의 경우 발현된 GFP를 포함하는 소포체가 형성되었으며 소포체의 표면에도 세포의 표면과 동일하게 DBCO-cy5가 라벨링 된 것을 확인할 수 있어, 전령 RNA 나노입자의 전달로 표적단백질이 포함된 소포체의 분비를 유도하는 과정에서 세포막이 배향을 유지하며 그대로 소포체가 형성된다는 알 수 있다. 따라서, metabolic engineering을 통해 세포의 표면 개질을 하여, 소포체의 표면에 표적 인식과 같은 새로운 기능을 부여할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> 세포 유래 소포체를 목포 단백질 전달체로 사용 가능함의 확인
1. 실시예 1의 2에서 제조된 전령 RNA 나노입자를 OPTI-MEM I에 희석한 뒤 transfection reagent (TransIT-X2 Dynamic Delivery System)와 혼합하여 복합체를 형성하고(전령 RNA 나노입자:Reagent:OPTI MEM I 의 비율은 7 μg: 15 μl: 50 μl임), HeLa 세포 배양 배지(cm2당 20000개 세포 분주)에 첨가하여 반응시켰다(세포 배양 배지 1ml당 복합체 1.5μg을 처리함). 24시간 후 PBS에 세포 및 MV를 포함하는 용액을 부유시킨 뒤, 300 RCF 조건에서 10분 간 원심분리한 후, 이로부터 얻은 통해 상측액을 2000 RCF 조건에서 10분 동안 원심분리 후, 이로부터 얻은 상측액을 최종적으로 10,000 RCF 조건에서 30분 동안 원심분리하여 RFP를 함유하는 소포체(MV-RFP)를 얻었다.
2. 녹색 형광 단백질을 세포질에 발현되도록 형질 변형이 되어 있는 HeLa-GFP세포를 준비하였다. 녹색을 띄고있는 HeLa-GFP세포의 사용은, 목표 단백질인 적색 형광 단백질을 담지한 세포 유래 소포체가 전달되었을 시 이에 대한 확인을 용이하게 하기 위함이다.
3. 상기 녹색 형광 단백질이 세포질에 고르게 포함되도록 형질 변형이 되어있는 HeLa-GFP세포의 배양 배지에 RFP를 함유하는 소포체(MV-RFP)를 첨가하여 반응시킨 후, 세포의 핵을 DAPI로 염색한 후 형광현미경을 이용하여 측정하여 그 결과를 도 20에 나타내었다.
4. 도 20을 보면, 소포체를 이용하여 전달한 목표 단백질인 RFP가 소포체를 수용한 HeLa-GFP 세포의 내부에 성공적으로 전달된 것을 확인할 수 있어, 상기 소포체가 약물 전달체로서 활용 가능함을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (8)

  1. 소포체생산용 RNA 나노입자를 세포에 전달하는 전달단계와, 상기 전달단계 후 소포체생산용 RNA 나노입자가 전달된 세포를 배양함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생성하는 배양단계를 포함하며,
    상기 소포체생산용 RNA 나노입자는 목표 단백질 발현을 위한 반복되는 전령 RNA 염기서열을 포함하는 전령 RNA로 이루어져 상기 배양단계에서는 세포 내에서 국부적으로 단백질이 과발현되어, 과발현된 단백질이 소포체를 통하여 세포 외부로 나오게 함으로써 목표 단백질을 포함하는 소포체를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전달단계에서 세포에 전달되는 소포체생산용 RNA 나노입자의 양을 조절함으로써, 생성된 소포체의 양과 소포체의 제조시간을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소포체생산용 RNA 나노입자는
    구의 형태를 가지고 50 내지 200 nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 소포체의 제조방법은 상기 전달단계 전에 세포의 표면을 개질하는 표면개질단계를 추가로 포함하며,
    상기 배양단계를 거쳐 생성된 소포체는 세포의 표면 특성을 그대로 가지고 있으므로, 상기 전달단계에서 상기 표면개질단계를 통해 표면이 개질된 세포를 이용하여, 상기 배양단계에서 목표 단백질을 담지하면서도 특정 기능의 표면 특성을 가지는 소포체를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전달단계는 리포솜 또는 양전하 고분자를 이용한 방법이 이용되며,
    상기 리포솜을 이용한 전달법은 RNA 나노입자를 지질 기반 복합체 형성 용액에 첨가한 후 복합체를 형성하여 세포에 처리함으로써 수행되고,
    상기 양전하 고분자를 이용하는 방법은 세포를 배양 접시에 분주하고 성장배지를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, RNA 나노입자를 양전하 고분자와 혼합하여 형성한 복합체를 성장배지에 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 소포체의 제조방법은 상기 배양단계에서 생성된 소포체를 분리하는 분리단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 분리단계는 원심분리 방법을 통해 세포 배양 배지로부터 목표 단백질을 포함하는 소포체를 분리하는 것을 특징으로 하는 소포체의 제조방법.
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