CA2360752A1 - Procede de preparation de vesicules membranaires - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel. L'invention est utilisée pour la préparation de vésicules d'origines et de natures variées, notamment à partir de cellules présentatrices d'antigènes ou de cellules tumorales. L'invention concerne aussi les vésicules ainsi obtenues et leurs utilisations.
Description
PROCEDE DE PREPARATION DE VESICULES MEMBRANAIRES
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la préparation (en particulier l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires.
L'invention s concerne également les vésicules membranaires ainsi préparées, ainsi que leurs utilisations biologiques et médicales, par exemple.
Les vésicules membranaires sont des vésicules, d'un diamètre généralement inférieur à 100 nm, composées d'une bicouche lipidique renfermant une fraction lo cytosolique. Des vésicules membranaires particulières sont plus spécifiquement issues de compartiments intracellulaires, par fusion avec la membrane plasmique d'une cellule, conduisant à leur libération dans les fluides biologiques ou dans le surnageant de cellules en culture. De telles vésicules sont désignées de manière générale par le terme exosome. Les exosomes possèdent généralement un diamètre Is compris entre environ 50 et 90 nm, plus particulièrement entre environ 60 et 80 nm, et portent avantageusement des protéines membranaires (notamment des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité) qui sont dans la même orientation que dans la membrane plasmique des cellules dont ils sont issus. Par ailleurs, selon leur origine, les exosomes comportent des protéines membranaires telles que CD40, 2o CD80, HSP70 et sont dépourvus de réticulum endoplasmique et d'appareil de golgi.
La libération d'exosomes a été mise en évidence à partir de différents types cellulaires, dans des contextes physiologiques variés. Ainsi, il a été montré
que les lymphocytes B libèrent des exosomes porteurs de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, qui jouent un rôle dans la présentation antigénique 2s (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161). De même, il a été montré que les cellules dendritiques produisent des exosomes (également désignés dexosomes), ayant des caractéristiques structurales et fonctionnelles particulières, et jouant un rôle dans la médiation de la réponse immune, notamment dans la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594). Il a
La présente invention concerne un nouveau procédé pour la préparation (en particulier l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires.
L'invention s concerne également les vésicules membranaires ainsi préparées, ainsi que leurs utilisations biologiques et médicales, par exemple.
Les vésicules membranaires sont des vésicules, d'un diamètre généralement inférieur à 100 nm, composées d'une bicouche lipidique renfermant une fraction lo cytosolique. Des vésicules membranaires particulières sont plus spécifiquement issues de compartiments intracellulaires, par fusion avec la membrane plasmique d'une cellule, conduisant à leur libération dans les fluides biologiques ou dans le surnageant de cellules en culture. De telles vésicules sont désignées de manière générale par le terme exosome. Les exosomes possèdent généralement un diamètre Is compris entre environ 50 et 90 nm, plus particulièrement entre environ 60 et 80 nm, et portent avantageusement des protéines membranaires (notamment des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité) qui sont dans la même orientation que dans la membrane plasmique des cellules dont ils sont issus. Par ailleurs, selon leur origine, les exosomes comportent des protéines membranaires telles que CD40, 2o CD80, HSP70 et sont dépourvus de réticulum endoplasmique et d'appareil de golgi.
La libération d'exosomes a été mise en évidence à partir de différents types cellulaires, dans des contextes physiologiques variés. Ainsi, il a été montré
que les lymphocytes B libèrent des exosomes porteurs de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, qui jouent un rôle dans la présentation antigénique 2s (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161). De même, il a été montré que les cellules dendritiques produisent des exosomes (également désignés dexosomes), ayant des caractéristiques structurales et fonctionnelles particulières, et jouant un rôle dans la médiation de la réponse immune, notamment dans la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594). Il a
2 PCT/FR00/00105 aussi été montré que les cellules tumorales sécrètent, de manière régulée, des exosomes particuliers (désignés également texosomes), porteurs d'antigènes tumoraux et capables de présenter ces antigènes ou de les transmettre aux cellules présentatrices d'antigènes (demande de brevet n° W099/03499). Il est également s connu que les cellules de mastocytes accumulent les molécules dans les compartiments vésiculaires intracellulaires, qui peuvent être sécrétés sous l'effet de signaux (Smith et Weis, Immunology Today 17 (1996) 60). D'une manière générale, il semble donc que les cellules émettent des signaux et communiquent entre elles par l'intermédiaire de vésicules membranaires qu'elles libèrent, qui Io peuvent être porteuses de motifs antigéniques, de molécules du CMH, ou de tout autre signal (cytokine, facteur de croissance, etc.), qui présentent des caractéristiques structurales et fonctionnelles spécifiques, et sont produites dans des situations physiologiques différentes. Ces vésicules, et en particulier les exosomes, représentent donc un produit particulièrement intéressant pour des applications ts diagnostiques, vaccinales, thérapeutiques ou pour véhiculer des molécules d'intérêt.
Il serait donc particulièrement intéressant de disposer d'une méthode efficace et utilisable à l'échelle industrielle, pour préparer des vésicules membranaires compatibles avec un usage biologique, notamment un usage pharmacologique.
2o Les méthodes classiques de préparation des vésicules membranaires (e.g., des exosomes) mettent en oeuvre une série d'étapes de centrifugation différentielle permettant de séparer les vésicules des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. Ainsi, les documents cités ci-avant décrivent essentiellement la préparation de vésicules par une série de centrifugations à
300g, 2s 10 OOOg et 70 000 ou 100 OOOg, le culot obtenu étant alors repris dans une solution saline, pour constituer une solution concentrée d'exosomes. Cette préparation peut être analysée par des techniques biochimiques classiques permettant d'évaluer la composition protéique des exosomes. Une technique biochimique préférée consiste en une électrophorèse en milieu dénaturant associée à une coloration des protéines
Il serait donc particulièrement intéressant de disposer d'une méthode efficace et utilisable à l'échelle industrielle, pour préparer des vésicules membranaires compatibles avec un usage biologique, notamment un usage pharmacologique.
2o Les méthodes classiques de préparation des vésicules membranaires (e.g., des exosomes) mettent en oeuvre une série d'étapes de centrifugation différentielle permettant de séparer les vésicules des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. Ainsi, les documents cités ci-avant décrivent essentiellement la préparation de vésicules par une série de centrifugations à
300g, 2s 10 OOOg et 70 000 ou 100 OOOg, le culot obtenu étant alors repris dans une solution saline, pour constituer une solution concentrée d'exosomes. Cette préparation peut être analysée par des techniques biochimiques classiques permettant d'évaluer la composition protéique des exosomes. Une technique biochimique préférée consiste en une électrophorèse en milieu dénaturant associée à une coloration des protéines
3 PCT/FR00/00105 totales ou à la détection de protéines spécifiques à l'aide d'anticorps selon la technique de western blot. La détection des exosomes dans la préparation finale peut être réalisée de façon directe par microscopie électronique après fixation de la préparation par une solution de glutaraldéhyde à 4%.
s Selon ce procédé, les niveaux de pureté des exosomes sont satisfaisants dans la mesure ou de telles préparations ont permis de mettre en évidence l'activité
biologique et les propriétés antitumorales dans des modèles animaux. Néanmoins ces procédés antérieurs de préparation par centrifugation ne permettent pas de lo séparer finement les vésicules membranaires (e.g., exosomes) des protéines cellulaires ou de certains composants macromoléculaires (ADN, ARN) ou complexes macromoléculaires. Ces procédés n'excluent donc pas la présence d'agents biologiques contaminants non identifiés, incompatibles avec une utilisation thérapeutique chez l'homme. De plus ces étapes sont difficilement extrapolables à
Is l'échelle industrielle, notamment lorsque des volumes importants doivent être traités, ou pour des applications ex vivo autologues (i.e., patient par patient), où le procédé doit généralement être mis en oeuvre en système confiné.
La présente invention apporte à présent une solution à ce problème.
2o L'invention décrit en effet de nouveaux procédés permettant la préparation (c'est-à-dire l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires dans des conditions compatibles avec une utilisation industrielle et des applications pharmacologiques.
Ainsi, les procédés de l'invention peuvent être appliqués aussi bien pour des préparations individualisées d'exosomes autologues, que pour des préparations 2s d'exosomes obtenus à partir de lignées cellulaires établies, en vue d'utilisations expérimentales, biologiques ou à des fins de vaccinations prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple.
s Selon ce procédé, les niveaux de pureté des exosomes sont satisfaisants dans la mesure ou de telles préparations ont permis de mettre en évidence l'activité
biologique et les propriétés antitumorales dans des modèles animaux. Néanmoins ces procédés antérieurs de préparation par centrifugation ne permettent pas de lo séparer finement les vésicules membranaires (e.g., exosomes) des protéines cellulaires ou de certains composants macromoléculaires (ADN, ARN) ou complexes macromoléculaires. Ces procédés n'excluent donc pas la présence d'agents biologiques contaminants non identifiés, incompatibles avec une utilisation thérapeutique chez l'homme. De plus ces étapes sont difficilement extrapolables à
Is l'échelle industrielle, notamment lorsque des volumes importants doivent être traités, ou pour des applications ex vivo autologues (i.e., patient par patient), où le procédé doit généralement être mis en oeuvre en système confiné.
La présente invention apporte à présent une solution à ce problème.
2o L'invention décrit en effet de nouveaux procédés permettant la préparation (c'est-à-dire l'isolement et/ou la purification) de vésicules membranaires dans des conditions compatibles avec une utilisation industrielle et des applications pharmacologiques.
Ainsi, les procédés de l'invention peuvent être appliqués aussi bien pour des préparations individualisées d'exosomes autologues, que pour des préparations 2s d'exosomes obtenus à partir de lignées cellulaires établies, en vue d'utilisations expérimentales, biologiques ou à des fins de vaccinations prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple.
4 PCT/FR00/00105 La présente invention repose plus particulièrement sur l'utilisation de méthodes séparatives par chromatographie pour la préparation de vésicules membranaires, et notamment pour séparer les vésicules membranaires d'éventuelles entités biologiques contaminantes.
s Plus particulièrement un premier objet de l'invention réside dans un procédé
de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions.
Io En effet, la demanderesse a maintenant montré que les vésicules membranaires, notamment les exosomes, pouvaient être purifiés par chromatographie d'échange d'anions. Ainsi, de manière inattendue, il est montré
dans la présente demande que les exosomes sont résolus en un pic homogène après Is chromatographie par échange d'anions. Ce résultat est tout à fait inattendu dans la mesure où les exosomes sont des obj ets supramoléculaires complexes composés entre autre d'une membrane entourant un volume interne comportant entre autre des protéines solubles. De plus les exosomes contiennent des protéines membranaires.
2o Un objet plus particulier de l'invention concerne donc un procédé de préparation, en particulier de purification de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
2s Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il peut s'agir d'un échange d'anions fort ou faible, préférentiellement fort. Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en oeuvre, la chromatographie est réalisée sous pression.
Il peut ainsi s'agir plus particulièrement d'une chromatographie liquide à haute performance (CLHP).
s Plus particulièrement un premier objet de l'invention réside dans un procédé
de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions.
Io En effet, la demanderesse a maintenant montré que les vésicules membranaires, notamment les exosomes, pouvaient être purifiés par chromatographie d'échange d'anions. Ainsi, de manière inattendue, il est montré
dans la présente demande que les exosomes sont résolus en un pic homogène après Is chromatographie par échange d'anions. Ce résultat est tout à fait inattendu dans la mesure où les exosomes sont des obj ets supramoléculaires complexes composés entre autre d'une membrane entourant un volume interne comportant entre autre des protéines solubles. De plus les exosomes contiennent des protéines membranaires.
2o Un objet plus particulier de l'invention concerne donc un procédé de préparation, en particulier de purification de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
2s Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il peut s'agir d'un échange d'anions fort ou faible, préférentiellement fort. Par ailleurs, dans un mode particulier de mise en oeuvre, la chromatographie est réalisée sous pression.
Il peut ainsi s'agir plus particulièrement d'une chromatographie liquide à haute performance (CLHP).
5 PCT/FR00/00105 Différents types de supports peuvent être employés pour la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions. On peut citer plus préférentiellement la cellulose, le polystyrène-divinylbenzène), fagarose, le dextran, facrylamide, la s silice, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, ou des mélanges, par exemple des mélanges agarose-dextran. A cet égard, on peut mentionner à titre illustratif différents matériels de chromatographie composés de supports tels qu'énoncés ci-dessus, et notamment les gels Source, Poros, Sepharose, sephadex, Trisacryl, TSK-gel SW ou PW, Superdex, Toyopearl HW et sephacryl, par exemple, qui lo conviennent pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, l'invention concerne donc un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape au cours de laquelle l'échantillon biologique est traité par chromatographie d'échange d'anions sur un support choisi Is parmi la cellulose, le polystyrène-divinylbenzène), la silice, facrylamide, fagarose, le dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, seuls ou en mélanges, éventuellement fonctionnalisés.
Par ailleurs, pour améliorer la résolution chromatographique, il est préférable dans le cadre de l'invention d'utiliser des supports sous forme de billes.
Idéalement, 2o il s'agit de billes présentant un diamètre homogène et calibré, et possédant une porosité suffisamment élevée pour permettre la pénétration des objets à
chromatographier (i.e., les exosomes). Ainsi, étant donné le diamètre des exosomes (généralement compris entre 50 et 100 nm) il est préférable pour la mise en oeuvre de l'invention d'utiliser des gels de porosité élevée, en particulier comprise entre 2s environ 10 nm et 5 gym, plus préférentiellement entre environ 20 nm et environ 2 ~.m, encore plus préférentiellement entre environ 100 nm et environ 1 ~,m.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, le support utilisé doit être fonctionnalisé au moyen d'un groupement capable d'interagir avec une molécule anionique. Généralement, ce groupement est constitué d'une amine pouvant être
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, l'invention concerne donc un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique, comprenant au moins une étape au cours de laquelle l'échantillon biologique est traité par chromatographie d'échange d'anions sur un support choisi Is parmi la cellulose, le polystyrène-divinylbenzène), la silice, facrylamide, fagarose, le dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, seuls ou en mélanges, éventuellement fonctionnalisés.
Par ailleurs, pour améliorer la résolution chromatographique, il est préférable dans le cadre de l'invention d'utiliser des supports sous forme de billes.
Idéalement, 2o il s'agit de billes présentant un diamètre homogène et calibré, et possédant une porosité suffisamment élevée pour permettre la pénétration des objets à
chromatographier (i.e., les exosomes). Ainsi, étant donné le diamètre des exosomes (généralement compris entre 50 et 100 nm) il est préférable pour la mise en oeuvre de l'invention d'utiliser des gels de porosité élevée, en particulier comprise entre 2s environ 10 nm et 5 gym, plus préférentiellement entre environ 20 nm et environ 2 ~.m, encore plus préférentiellement entre environ 100 nm et environ 1 ~,m.
Pour la chromatographie d'échange d'anions, le support utilisé doit être fonctionnalisé au moyen d'un groupement capable d'interagir avec une molécule anionique. Généralement, ce groupement est constitué d'une amine pouvant être
6 PCT/FR00/00105 ternaire ou quaternaire ce qui définit respectivement un échangeur d'anions faible ou fort.
Dans le cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi on utilise préférentiellement selon s l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé
par des amines quaternaires. Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, la chromatographie d'échange d'anions est donc réalisée sur un support fonctionnalisé par une amine quaternaire. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'un support choisi parmi le polystyrène-divinylbenzène), l'acrylamide, fagarose, le dextran et la silice, seuls ou en mélanges, fonctionnalisé par une amine quaternaire.
Parmi les supports fonctionnalisés par une amine quaternaire, on peut citer comme exemples les gels Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les gels de type Fractogel TMAE, et les gels Toyopearl Super Q.
is Un support particulièrement préféré pour la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions comprend du polystyrène-divinylbenzène). Un exemple de ce type de gel utilisable dans le cadre de l'invention est le gel Source Q, notamment Source 15 Q (Pharmacia). Ce support présente l'avantage de pores internes très 20 larges offrant ainsi peu de résistance à la circulation de liquide à
travers le gel, tout en permettant une diffusion rapide des exosomes vers les groupements fonctionnels, paramètres particulièrement importants dans le cas des exosomes étant donné
leur taille.
2s L'élution des composés biologiques retenus sur la colonne peut se faire de différentes manières, et en particulier au moyen du passage d'un gradient de concentration croissant d'une solution saline, par exemple de 0 à 2 M. On peut employer notamment une solution de chlorure de sodium, dans des concentrations variant de 0 à 2M, par exempté. La détection des différentes fractions ainsi WO 00/44389 ~ PCT/FR00/00105 purifiées se fait par mesure de leur densité optique (DO) en sortie de colonne au moyen d'une lecture spectro-photométrique en continu. A titre indicatif, dans les conditions utilisées dans les exemples, les fractions comprenant les vésicules membranaires ont été éluées à une force ionique comprise entre 350 et 700 mM
s environ, selon les types de vésicules.
Différents types de colonnes peuvent être utilisés pour réaliser cette étape chromatographique, selon les besoins et les volumes à traiter. Par exemple, selon les préparations, il est possible d'utiliser une colonne de 10081 environ jusqu'à 10 ml lo ou plus. Ainsi, les supports disponibles ont une capacité pouvant atteindre par exemple 25 mg de protéines/ml. De ce fait, une colonne de 100 ~l possède une capacité de l'ordre de 2,5 mg de protéines ce qui, compte tenu des échantillons considérés, peut permettre de traiter des surnageants de culture de 2 1 environ (qui, après concentration d'un facteur 10 à 20 par exemple, représentent des volumes de ~s 100 à 200 ml par préparation). Il est bien entendu que des volumes supérieurs peuvent également être traités, en augmentant le volume de la colonne par exemple.
Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est également possible de combiner l'étape de chromatographie d'échange d'anions avec une étape de chromatographie de perméation de gel. Ainsi, selon un mode de mise en oeuvre 2o particulier de l'invention, une étape de chromatographie de perméation de gel est ajoutée à l'étape d'échange d'anions, soit avant, soit après l'étape de chromatographie d'échange d'anions. De préférence, dans ce mode de mise en oeuvre, l'étape de chromatographie de perméation a lieu après l'étape d'échange d'anions. En outre, dans une variante particulière de réalisation, l'étape de chromatographie d'échange 2s d'anions est remplacée par l'étape de chromatographie de perméation de gel.
La présente demande montre en effet que les vésicules membranaires peuvent être aussi purifiées en utilisant la chromatographie liquide par perméation de gel, en particulier lorsque cette étape est combinée à une chromatographie d'échange WO 00/44389 g PCT/FR00/00105 d'anions ou à d'autre(s) étapes) de traitement de l'échantillon biologique, comme il sera décrit en détails plus loin.
Pour la réalisation de l'étape chromatographique de perméation de gel, on utilise de préférence un support choisi parmi la silice, l'acrylamide, l'agarose, le s dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, ou des mélanges, par exemple des mélanges agarose-dextran. A titre illustratif, pour la chromatographie de perméation de gel, on utilise avantageusement un support tel que le Superdex 200HR (Pharmacia), le TSK 66000 (TosoHaas) ou encore un Séphacryl S
(Pharmacia).
io Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à partir de différents échantillons biologiques. En particulier, il peut s'agir d'un fluide biologique provenant d'un sujet (moelle osseuse, sang périphérique, etc.), d'un surnageant de culture, d'un lysat cellulaire, d'une solution prépurifiée, ou de tout autre composition I s comprenant des vésicules membranaires.
A cet égard, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon biologique est un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires.
Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, 20 l'échantillon biologique est traité, préalablement à l'étape chromatographique, pour être enrichi en vésicules membranaires (étape d'enrichissement). Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 2s b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'échantillon biologique est un surnageant de culture traité de manière à être enrichi en vésicules membranaires. En particulier, l'échantillon biologique peut être constitué d'une solution prépurifiée obtenue à partir d'un surnageant de culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires ou d'un fluide biologique par des traitements tels que centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie s d'affinité, en particulier par clarification et/ou ultrafiltration et/ou chromatographie d' affinité.
Un procédé préféré de préparation de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend donc plus particulièrement les étapes suivantes:
a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
~s Comme indiqué ci-avant, l'étape d'enrichissement de l'échantillon (e.g., du surnageant) peut comprendre une ou plusieurs étapes de centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie d'affinité du surnageant. Dans un premier mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend (i) 2o une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification), éventuellement suivie de (ü) une étape de concentration et/ou de chromatographie d'affinité. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend une étape de chromatographie d'affinité, éventuellement précédée d'une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification). Une 2s phase d'enrichissement préférée selon l'invention comprend (i) une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires, (ü) une concentration et (iii) une chromatographie d'affinité.
WO 00/44389 1~ PCT/FR00/00105 L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut être réalisée par exemple par centrifugation de l'échantillon à une vitesse faible, de préférence inférieure à 1000g, par exemple comprise entre 100 et 700g. Des conditions préférées de centrifugation lors de cette étape sont de 300g ou 600g environ, s pendant une période comprise entre 1 et 15 minutes par exemple.
L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut également être réalisée par filtration de l'échantillon, éventuellement en combinaison avec la centrifugation décrite ci-dessus. La filtration peut être réalisée en particulier par des filtrations ~o successives au moyen de filtres ayant un porosité décroissante. A cet égard, on utilise préférentiellement des filtres ayant une porosité supérieure à 0,2 gym, par exemple comprise entre 0,2 et lOgm. On peut utiliser en particulier une succession de filtres ayant une porosité de 10 gym, 1 gm, O,S~m puis 0,22~m.
ls Une étape de concentration peut également être réalisée, de manière à
diminuer les volumes d'échantillon à traiter lors des étapes chromatographiques.
Ainsi, la concentration peut être obtenue par centrifugation de l'échantillon à des vitesses élevées, par exemple comprises entre 10 000 et 100 OOOg, de manière à
culotter les vésicules membranaires. A cet égard, il peut s'agir d'une série de 2o centrifugations différentielles, avec la dernière centrifugation effectuée autour de 70 OOOg environ. Les vésicules membranaires ainsi culottées peuvent ensuite être reprises dans un volume plus faible et dans un tampon approprié pour les étapes ultérieures du procédé.
2s L'étape de concentration peut également être réalisée par ultrafiltration.
Cette ultrafiltration permet en fait à la fois de concentrer le surnageant et d'effectuer une première purification des vésicules. Selon un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique (par exemple le surnageant) est soumis à une ultrafiltration, de préférence une ultrafiltration tangentielle. L'ultrafiltration tangentielle consiste à
concentrer et fractionner une solution entre deux compartiments (filtrat et rétentat), séparés par des membranes de seuils de coupure déterminés. La séparation est réalisée par application d'un flux dans le compartiment retentat et d'une pression transmembranaire entre ce compartiment et le compartiment filtrat. Différents s systèmes peuvent être utilisés pour réaliser l'ultrafiltration, comme par exemple des membranes spirales (Millipore, Amicon), membranes planes ou fibres creuses (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention des membranes ayant un seuil de coupure inférieur à
1000 kDa, de préférence compris entre 300 kDa et 1000 kDa, encore plus lo préférentiellement entre 300 kDa et 500 kDa.
L'étape de chromatographie d'affinité peut être réalisée de différentes façons, sur différents matériels et supports chromatographiques. Il s'agit avantageusement d'une chromatographie d'affinité non-spécifique, destinée à retenir certains is contaminants présents dans la solution, sans retenir les objets d'intérêt (i.e., les exosomes). Il s'agit donc d'une sélection négative. Il s'agit de préférence d'une chromatographie par colorant, permettant d'éliminer (i.e., de retenir) des contaminants tels que les protéines et enzymes, par exemple l'albumine, des kinases, déshydrogénases, facteurs de coagulation, interférons ou lipoprotéines, ou 2o encore des co-facteurs, etc. Préférentiellement, le support utilisé pour cette chromatograpgie est un support tel qu'utilisé pour la chromatographie d'échange d'ions, fonctionnalisé avec un colorant. A titre d'exemple spécifique, le colorant peut être choisi parmi le Blue Sepharose (Pharmacie), le Yellow 86, le Green 5 et le Brown 10 (Sigma). Le support est plus préférentiellement de l'agarose. Il est 2s entendu que tout autre support et/ou colorant ou groupe réactif permettant de retenir certains contaminants de l'échantillon biologique traité peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de filtration au moins.
Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon s biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de centrifugation au moins.
Dans un mode préféré de réalisation de (invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape d'ultrafiltration au moins.
Dans un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de chromatographie d'affinité au moins.
~s Un procédé préféré de préparation plus particulier de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend les étapes suivantes a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, 2o b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméatîon de gel.
2s Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une filtration du surnageant de culture, suivie d'une ultrafiltration, de préférence tangentielle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une clarification suivie d'une chromatographie d'affinité sur colorant, notamment sur Blue Sepharose..
s Par ailleurs, après l'étape c), le matériel récolté peut, le cas échéant, être soumis à une ou plusieurs étapes supplémentaires d) de traitement et/ou filtration, notamment dans un but de stérilisation. Pour cette étape de traitement par filtration, on utilise préférentiellement des filtres ayant un diamètre inférieur ou égal à 0,3 ~,m, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,25 gm. De tels lo filtres sont par exemple des filtres d'un diamètre 0,22~,m.
Après l'étape d), le matériel obtenu est par exemple distribué dans des dispositifs appropriés tels que flacons, tubes, poches, seringues, etc., dans un milieu approprié de conservation. Les vésicules purifiées ainsi obtenues peuvent être conservées au froid, congelées, ou utilisées extemporanément.
Un procédé de préparation particulier au sens de l'invention comprend donc au moins les étapes suivantes c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel et, 2o d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Dans une première variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend 2s c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Dans une autre variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie de perméation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel s récolté après l'étape c).
Selon une troisième variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anion suivie ou précédée d'une chromatographie de perméation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
ls Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'injection d'une préparation d'exosomes dans la colonne de chromatographie permet d'obtenir des pics d'absorption symétriques, qui sont parfaitement résolus (Fig.
n°1). Les différentes fractions ainsi isolées sont analysables par des techniques classiques d'électrophorèse des protéines en gel dénaturant suivies de techniques de coloration 2o par du bleu de Coumassie ou de techniques de détection de protéines spécifiques à
l'aide d'anticorps. Il est ainsi possible de montrer, pour des texosomes, que le pic élué en chromatographie d'échange d'anions par une solution saline de 400 mM
possède un profil protéique identique à celui d'une préparation d'exosomes classiquement préparée (Fig. n°2). Ceci permet de facto de caractériser les pics 2s élués à des concentrations salines plus faibles ou plus fortes comme relatifs à des entités biologiques distinctes, contaminantes. Dans une autre expérience, les vésicules membranaires produites à partir de cellules dendritiques (dexosomes) ou certaines texosomes sont éluées à une force ionique comprise entre 500 et 700mM
environ, et les vésicules de mastocytes aux environs de 350 mM.
En outre, les résultats présentés dans les exemples montrent également que la méthode de l'invention permet de détecter l'éventuelle contamination de la préparation par des protéines majoritaires du milieu de culture telles que la sérum-s albumine bovine. En effet, la chromatographie d'une solution étalon de sérum-albumine bovine dans les conditions précédentes montre que celle-ci donne lieu à un pic élué à une concentration saline distincte de celle des exosomes (Fig.
n°3).
Le procédé de l'invention permet donc (i) de purifier des vésicules membranaires dans des conditions de qualité et de quantité compatibles avec un usage pharmacologique, et (ü) de révéler l'existence d'entités biologiques distinctes et contaminantes au sein de l'échantillon biologique traité.
Le procédé de l'invention peut être appliqué à la préparation de vésicules Is membranaires d'origines variées. Ainsi, il peut s'agir en particulier d'exosomes produits par des cellules présentatrices d'antigènes, ou par des cellules tumorales, notamment. En outre, il peut s'agir de cellules primaires, par exemple en culture, ou également de lignées établies, par exemple de lignées immortalisées de cellules productrices de vésicules membranaires. Il peut s'agir de cellules d'origine 2o mammifère, en particulier d'origine mucine ou humaine.
Dans un mode particulier de l'invention, les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages et des mastocytes, 2s éventuellement après sensibilisation de celles-ci à un ou plusieurs antigènes choisis.
Une application particulièrement préférée de la présente invention réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules dendritiques.
A
cet égard, il peut s'agir de cellules dendritiques humaines ou animales, notamment humaines ou mucines. Ces cellules peuvent être des cellules primaires, récoltées à
partir de fluides biologiques d'un sujet ou produites ex vivo à partir de cellules précurseur, ou également des cellules de lignées établies, par exemple immortalisées avec un oncogène (EP 701 604).
Un objet particulier de la présente invention réside dans un procédé de s préparation de vésicules membranaires (dexosomes), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires (dexosomes) et, c) la purification des vésicules membranaires (dexosomes) par un procédé
comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions, dans les conditions définies ci-avant.
Un mode de réalisation plus préféré réside dans un procédé de préparation de dexosomes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes ls a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de dexosomes, c) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en dexosomes, notamment par une étape d'ultrafiltration ou de 2o chromatographie d' affinité au moins, et, d) la purification des dexosomes par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel, dans les conditions définies ci-avant.
2s Plus particulièrement, pour la mise en oeuvre de cette variante de l'invention, les cellules dendritiques sont préférentiellement obtenues à partir d'un échantillon biologique provenant d'un sujet, par exemple de moelle osseuse ou de sang périphérique.
WO 00/44389 1~ PCT/FR00/00105 A cet égard, les techniques de production de cellules dendritiques ont été
décrites dans l'art antérieur et peuvent être mises en oeuvre par l'homme du métier (voir notamment les techniques décrites dans la demande W099/03499, incorporée à la présente par référence). Les cellules dendritiques peuvent ainsi être préparées à
s partir de cellules souches du système immunitaire, à partir de précurseurs monocytes ou encore isolées directement sous forme différenciée (Revue par Hart, Blood 90 (1997) 3245).
Une méthodologie privilégiée dans le cadre de la présente invention repose sur Io la production de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse. Plus particulièrement, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des cellules dendritiques obtenues par traitement de précurseurs monocytes (contenus dans le sang ou la moelle) en présence d'une combinaison GM-CSF+IL4 ou GM-CSF+IL-13.
1s Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures. Avantageusement, on utilise une population de cellules dendritiques composée principalement (i.e., au moins 60%, 2o de préférence 70%) de cellules dendritiques immatures.
L'étape d'obtention des cellules dendritiques peut donc comprendre avantageusement la préparation d'une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures, en particulier d'origine humaine, 2s notamment à partir de précurseurs monocytes, plus particulièrement par traitement avec une combinaison de cytokines telle que GM-CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13.
Par ailleurs, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la présente ïnvention des populations de cellules dendritiques immortalisées. Il peut s'agir de lignées de cellules dendritiques immortalisées (lignée Dl par exemple, ou tout autre WO 00/44389 1 g PCT/FR00/00105 lignée produite par exemple par introduction de l'oncogène myc dans les cellules dendritiques). Il peut également s'agir de cellules dendritiques préparées puis immortalisées in vitro. L'intérêt de cellules dendritiques immortalisées réside dans la constitution de banques de cellules sensibilisées à des groupes d'antigènes donnés, s utilisables industriellement pour préparer des dexosomes susceptibles d'être administrés à des familles entières de patients.
Pour produire les vésicules membranaires (dexosomes), les cellules dendritiques peuvent être simplement cultivées dans des conditions conventionnelles connues de l'homme du métier. Avantageusement, néanmoins, ces cellules sont cultivées dans des conditions stimulant la production des dexosomes, en particulier en présence de facteurs capables de stimuler la production des dexosomes, notamment d'une cytokine telle que l'interféron gamma, l'interleukine-ou finterleukine-12 (voir par exemple la demande W099/03499). Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de (invention, les cellules dendritiques sont i 5 donc cultivées, au cours de l'étape b) ci-dessus, dans des conditions stimulant la production des vésicules membranaires.
D'autre part, dans une variante particulière de réalisation, les cellules dendritiques sont sensibilisées à un antigène, préalablement à la production des vésicules membranaires. Ce mode de réalisation permet ainsi de charger les cellules 2o dendritiques en antigènes) particulier(s), de manière à produire des dexosomes ayant un caractère immunogène donné. La sensibilisation peut être réalisée par différentes techniques connues en soi, comprenant par exemple la mise en contact des cellules avec des peptides antigéniques, des antigènes, des complexes protéiques, des cellules ou membranes de cellules exprimant des antigènes, des 25 corps apoptotiques, des vésicules membranaires, des liposomes, des ARN
tumoraux ou tout acide nucléique codant pour un ou plusieurs antigènes, déterminants antigéniques ou épitopes (éventuellement véhiculés par un vecteur viral ou non viral), etc (voir par exemple la demande W099/03499). Dans un mode préféré, la sensibilisation est réalisée par incubation avec des peptides, antigènes, ARN
ou acides nucléiques. Il est entendu que la présente demande n'est pas limitée à
des techniques de sensibilisation ou de production des cellules dendritiques.
Une autre application particulièrement avantageuse de la présente invention s réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules tumorales, notamment humaines. Il peut s'agir en particulier de toute cellule provenant d'une tumeur solide ou liquide ainsi que de cellules transformées ou immortalisées in vitro. On peut mentionner plus préférentiellement les tumeurs solides, hématopoiétiques ou ascitiques.
Une application particulière de la présente invention réside également dans la préparation de vésicules membranaires comprenant une ou plusieurs molécules hétérologues, en particulier recombinantes. Ainsi, il est en effet possible, par exemple, de modifier génétiquement des cellules productrices de vésicules 1 s membranaires (par exemple des lignées de mastocytes) pour faire exprimer, dans ou à la surface des vésicules qu'elles produisent, des molécules d'intérêt (PCT/FR99/02691 ). La présente invention peut également permettre de purifier de telles vésicules modifiées.
2o De manière plus générale, l'invention peut être appliquée à la préparation de vésicules membranaires produites par tout type cellulaire, en particulier de vésicules de type exosome, ayant de préférence un diamètre inférieur à environ 100 nm.
Il peut s'agir notamment de cellules de macrophages, mastocytes, réticulocytes, etc.
Dans la section expérimentale, nous avons utilisé des préparations d'exosomes 2s provenant (i) de lignées cellulaires telles que des lignées de cellules tumorales (TS/A), des lignées de cellules dendritiques murines (Dl), une lignée de mastocytes (RBL) et (ü) de cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes. Les résultats obtenus sont directement transposables à d'autres cultures primaires telles que des cellules tumorales, des cellules dendritiques humaines, des lymphocytes B, etc., WO 00/44389 2~ PCT/FR00/00105 cultivables dans des conditions industriellement acceptables. Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre comme étape de purification des exosomes dans le cadre de leur utilisation en thérapeutique humaine.
s Les vésicules membranaires ainsi obtenues constituent, selon leur origine, des outils d'étude des cancers ou de la régulation du système immunitaire, de transfert de molécules, de production d'anticorps, de marquage, de diagnostique, de constitution de banques, des principes de vaccin ou de médicament, etc.
En outre le procédé de l'invention peut également être utilisé comme méthode pour un contrôle de qualité sur la présence éventuelle de contaminants (notamment de protéines contaminantes) dans le milieu de culture ou dans des préparations de vésicules membranaires.
1s A cet égard, la présente invention peut donc être mise en oeuvre aussi bien dans une méthode préparative de vésicules membranaires que dans un système analytique permettant de contrôler la qualité d'une préparation de vésicules membranaires, quelle que soit leur méthode de préparation.
2o La présente invention concerne donc également un procédé de contrôle de la présence de contaminants, notamment d'origine protéique ou nucléique, dans une préparation de vésicules membranaires, notamment d'exosomes, comprenant le traitement d'une fraction de ladite préparation par une étape au moins de chromatographie d'échange d'anions, et la mise en évidence de la présence de 25 contaminants.
L'invention concerne aussi, de manière générale, l'utilisation de la chromatographie d'échange d'anions, en particulier de type liquide à haute performance, pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
Elle concerne l'utilisation de la chromatographie d'affinité pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
L'invention a encore pour objet les vésicules membranaires préparées par le procédé de l'invention, ainsi que toute composition comprenant de telles vésicules.
s La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure no 1 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'un échantillon d'exosomes préparés par centrifugation différentielle.
Figure no 2 : Analyse du profil protéique des différentes fractions d'élution d'une préparation d'exosomes par électrophorèse en SDS PAGE puis coloration par is du bleu de Coomassie.
Figure no 3 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de sérum-albumine bovine.
Figure no 4 : Schéma de traitement d'un échantillon biologique comprenant des vésicules membranaires par ultrafiltration tangentielle.
2o Figure n° 5 : Profil général de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow après les centrifugations à 600 et 10 000 g d'un surnageant de dexosomes.
Figure n° 6 : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II
des exosomes, dans la fraction non adsorbée et dans l'éluat, de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow.
2s Figure n° 7 : Profil général de l'étape source 15Q après une étape de Blue sepharose fast flow.
Figure n° 8 : Détails du gradient d'élution sur la source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow (agrandissement de la zone rectangulaire en bas à
droite dans la figure 7).
Figure n°9 : Exemple de profil de purification d'exosomes produits à
partir de la lignée RBL DR+ (équivalent de 53 ~g de protéines) par une colonne de Source 15Q après traitement par la DNase et la RNase.
Figure n° 10 : Séparation des exosomes par un gradient discontinu en NaCI sur s un support Source 15Q.
Figure n° 11 : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II
humain de chaque pic séparé par CLHP et ultracentrifugé. Témoin positif : Cellules dendritiques humaines exprimant les molécules du CMH II. Témoin négatif :
milieu ultracentrifugé et représentant le bruit de fond. MW= poids moléculaire ; NA=
fraction non adsorbé.
Techniques générales de culture cellulaire et de biologie moléculaire 1) Cultures cellulaires ~s La lignée de cellules TS/A est une lignée de cellules murines établie à partir d'un carcinome mammaire spontané. Cette lignée est cultivée à 37°C en présence de S% de C02 en milieu RPMI en présence de 10% de sérum de veau foetal (Dominique Dutcher).
Les lignées de cellules dendritiques sont maintenues dans un milieu IMDM
contenant 10% de sérum bovin foetal inactivé, 2 mM de L-glutamine, 50 ~.M de 2-~iME, 100 UI/ml de pénicilline, et 100 ~,g/ml de streptomycine.
2s 2) Analyse des protéines par SDS PAGE
20.1 d'échantillon est dilué dans le tampon de Laemmli (Nature 227 (1970) p680-685) puis soumis à une dénaturation thermique à 95°C pendant 10 mn puis chargé sur des gels d'acrylamide 10% (Novex 1 mmxl 0 puits). Après migration, les gels sont colorés au bleu de Coomassie.
Exemples s 1) Chromatographie par échange d'anions d'une préparation d'exosomes produits par des cellules tumorales (lignée TS/A) : analyse par SDS
PAGE du profil protéique des différentes fractions éluées.
Cet exemple illustre comment une étape de chromatographie d'échange d'anions peut permettre de séparer des impuretés d'une préparation d'exosomes.
1. 1) Protocole is Dans cette expérience le matériel de départ est constitué d'un concentrat d'exosomes préparés par centrifugation différentielle à partir d'un surnageant de culture de cellules TS/A permettant de séparer les exosomes des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. La première centrifugation est réalisée à basse vitesse (300g pendant 5 mn) afin de culotter les cellules en 2o suspension présentes dans le surnageant de culture. Deux autres centrifugations (1200g pendant 20 mn puis 10 OOOg pendant 30 mn) permettent de culotter les débris cellulaires. Le surnageant ainsi clarifié est alors soumis à une ultracentrifugation à haute vitesse de 70 OOOg pendant 1 heure permettant de culotter les exosomes. Cette préparation est alors lavée dans un grand volume de solution 2s saline pour être recentrifugée dans les conditions précédentes. Le culot est alors repris dans un volume d'environ 100 ~1 de solution saline et constitue une solution concentrée d'exosomes. La quantité de protéines est mesurée par la technique de Bradford (Biorad, lvry, France). Ce concentrat présente une teneur en protéines totales comprise entre 500 et 1000 ~.g/ml.
40 gg de cette préparation d'exosomes dilués dans 500 ~l de tampon Tris/HCL
50 mM pH sont injectés sur une colonne contenant du gel Source Q 15 (Pharmacia) équilibré dans une solution Tris/HCL 50 mM pH 8. Après rinçage, les espèces adsorbées sont éluées sur 30 volumes de colonne par un gradient linéaire de NaCI de s 0 à 500 mM, puis par une solution de NaCI 2M. Les fractions d'élution sont analysées par spectrophotométrie à 260 et 280 nm. Les fractions d'élution sont regroupées en 5 cinq fractions majeures (de Fl à FS) afin de pouvoir analyser leur profil protéique respectif. Les protéines de chaque fraction sont précipitées par 1/10 de volume, d'une solution d'acide trichloroacétique à 100 % puis rincées par une lo solution d'acétone. Les culots protéiques sont repris dans 20 ~,1 de solution de Laemmli, et sont déposés sur un gel d'acrylamide SDS PAGE qui est alors coloré
par du bleu de Coomassie.
1.2) Résultats ~s Les profils d'élution à 260 et 280 nm sont représentés sur la figure 1. Les profils montrent la présence de 3 pics symétriques distincts, élués aux concentrations salines respectives de 105 mM, 400 mM et 2 M de NaCI.
L'analyse du profil protéique des fractions correspondant aux différents pics 2o montre que le pic élué à 400 mM de NaCI possède un profil protéique identique à
celui d'une préparation d'exosomes préparée classiquement par centrifugation (Figure N° 2). Le rapport entre les absorptions à 260 et 280 nm mesuré
à une valeur de 0.8 est compatible avec celui décrit dans le cas des protéines.
Le pic élué (fraction F2) à 105 mM de NaCI présente en revanche un profil 2s protéique différent montrant seulement deux bandes distinctes. Les mesures d'absorbance à 260 et 280 nm donnent un rapport de 1.6 suggérant la présence d'une association d'acides nucléiques et de protéines.
La fraction FS éluée à 2 molaire de NaCI correspond aux composés biologiques fortement associés à la colonne.
Il est donc possible de séparer les exosomes d'impuretés par une étape d'échange d'anions.
2) Chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de s sérum-albumine bovine Cette technique de chromatographie par échange d'anions permet également d'évaluer le degré de contamination d'une préparation d'exosomes par les protéines présentes dans le milieu de culture. Ainsi, nous montrons en chromatographiant lo pg d'une solution de sérum albumine bovine, correspondant à la protéine majoritaire du milieu de culture, que celle-ci est éluée à 205 mM de NaCI sous forme d'un pic étroit distinguable des pics précédemment décrits dans le cas des exosomes.
3) Traitement d'un surnageant de culture contenant des exosomes par 1 s ultrafiltration.
Cet exemple montre qu'il est possible de concentrer les exosomes pa ultrafiltration. De plus, la préparation exosomale est appauvrie en protéine contaminantes telle que les B SA.
3.1) Protocole : (Figure N° 4) 150 ml d'un surnageant de culture de cellules obtenu après centrifugation à
g de cellules TSA, sont soumis à une filtration sur un filtre de porosité de 0.22 ~m 2s (Millipore). Le filtrat est dilué de moitié dans du PBS. Les 300 ml résultants sont filtrés tangentiellement avec une cassette de filtration ( 1 Ocm2 de membrane) d'un seuil de coupure de 300 000 D (Sartorius).
3.2) Résultats
Dans le cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi on utilise préférentiellement selon s l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé
par des amines quaternaires. Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, la chromatographie d'échange d'anions est donc réalisée sur un support fonctionnalisé par une amine quaternaire. Encore plus préférentiellement, il s'agit d'un support choisi parmi le polystyrène-divinylbenzène), l'acrylamide, fagarose, le dextran et la silice, seuls ou en mélanges, fonctionnalisé par une amine quaternaire.
Parmi les supports fonctionnalisés par une amine quaternaire, on peut citer comme exemples les gels Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ et Poros QE, les gels de type Fractogel TMAE, et les gels Toyopearl Super Q.
is Un support particulièrement préféré pour la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions comprend du polystyrène-divinylbenzène). Un exemple de ce type de gel utilisable dans le cadre de l'invention est le gel Source Q, notamment Source 15 Q (Pharmacia). Ce support présente l'avantage de pores internes très 20 larges offrant ainsi peu de résistance à la circulation de liquide à
travers le gel, tout en permettant une diffusion rapide des exosomes vers les groupements fonctionnels, paramètres particulièrement importants dans le cas des exosomes étant donné
leur taille.
2s L'élution des composés biologiques retenus sur la colonne peut se faire de différentes manières, et en particulier au moyen du passage d'un gradient de concentration croissant d'une solution saline, par exemple de 0 à 2 M. On peut employer notamment une solution de chlorure de sodium, dans des concentrations variant de 0 à 2M, par exempté. La détection des différentes fractions ainsi WO 00/44389 ~ PCT/FR00/00105 purifiées se fait par mesure de leur densité optique (DO) en sortie de colonne au moyen d'une lecture spectro-photométrique en continu. A titre indicatif, dans les conditions utilisées dans les exemples, les fractions comprenant les vésicules membranaires ont été éluées à une force ionique comprise entre 350 et 700 mM
s environ, selon les types de vésicules.
Différents types de colonnes peuvent être utilisés pour réaliser cette étape chromatographique, selon les besoins et les volumes à traiter. Par exemple, selon les préparations, il est possible d'utiliser une colonne de 10081 environ jusqu'à 10 ml lo ou plus. Ainsi, les supports disponibles ont une capacité pouvant atteindre par exemple 25 mg de protéines/ml. De ce fait, une colonne de 100 ~l possède une capacité de l'ordre de 2,5 mg de protéines ce qui, compte tenu des échantillons considérés, peut permettre de traiter des surnageants de culture de 2 1 environ (qui, après concentration d'un facteur 10 à 20 par exemple, représentent des volumes de ~s 100 à 200 ml par préparation). Il est bien entendu que des volumes supérieurs peuvent également être traités, en augmentant le volume de la colonne par exemple.
Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est également possible de combiner l'étape de chromatographie d'échange d'anions avec une étape de chromatographie de perméation de gel. Ainsi, selon un mode de mise en oeuvre 2o particulier de l'invention, une étape de chromatographie de perméation de gel est ajoutée à l'étape d'échange d'anions, soit avant, soit après l'étape de chromatographie d'échange d'anions. De préférence, dans ce mode de mise en oeuvre, l'étape de chromatographie de perméation a lieu après l'étape d'échange d'anions. En outre, dans une variante particulière de réalisation, l'étape de chromatographie d'échange 2s d'anions est remplacée par l'étape de chromatographie de perméation de gel.
La présente demande montre en effet que les vésicules membranaires peuvent être aussi purifiées en utilisant la chromatographie liquide par perméation de gel, en particulier lorsque cette étape est combinée à une chromatographie d'échange WO 00/44389 g PCT/FR00/00105 d'anions ou à d'autre(s) étapes) de traitement de l'échantillon biologique, comme il sera décrit en détails plus loin.
Pour la réalisation de l'étape chromatographique de perméation de gel, on utilise de préférence un support choisi parmi la silice, l'acrylamide, l'agarose, le s dextran, le copolymère éthylène glycol-méthacrylate, ou des mélanges, par exemple des mélanges agarose-dextran. A titre illustratif, pour la chromatographie de perméation de gel, on utilise avantageusement un support tel que le Superdex 200HR (Pharmacia), le TSK 66000 (TosoHaas) ou encore un Séphacryl S
(Pharmacia).
io Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre à partir de différents échantillons biologiques. En particulier, il peut s'agir d'un fluide biologique provenant d'un sujet (moelle osseuse, sang périphérique, etc.), d'un surnageant de culture, d'un lysat cellulaire, d'une solution prépurifiée, ou de tout autre composition I s comprenant des vésicules membranaires.
A cet égard, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon biologique est un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires.
Par ailleurs, selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, 20 l'échantillon biologique est traité, préalablement à l'étape chromatographique, pour être enrichi en vésicules membranaires (étape d'enrichissement). Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 2s b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'échantillon biologique est un surnageant de culture traité de manière à être enrichi en vésicules membranaires. En particulier, l'échantillon biologique peut être constitué d'une solution prépurifiée obtenue à partir d'un surnageant de culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires ou d'un fluide biologique par des traitements tels que centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie s d'affinité, en particulier par clarification et/ou ultrafiltration et/ou chromatographie d' affinité.
Un procédé préféré de préparation de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend donc plus particulièrement les étapes suivantes:
a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
~s Comme indiqué ci-avant, l'étape d'enrichissement de l'échantillon (e.g., du surnageant) peut comprendre une ou plusieurs étapes de centrifugation, clarification, ultrafiltration, nanofiltration et/ou chromatographie d'affinité du surnageant. Dans un premier mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend (i) 2o une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification), éventuellement suivie de (ü) une étape de concentration et/ou de chromatographie d'affinité. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'étape d'enrichissement comprend une étape de chromatographie d'affinité, éventuellement précédée d'une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires (étape de clarification). Une 2s phase d'enrichissement préférée selon l'invention comprend (i) une étape d'élimination des cellules et/ou débris cellulaires, (ü) une concentration et (iii) une chromatographie d'affinité.
WO 00/44389 1~ PCT/FR00/00105 L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut être réalisée par exemple par centrifugation de l'échantillon à une vitesse faible, de préférence inférieure à 1000g, par exemple comprise entre 100 et 700g. Des conditions préférées de centrifugation lors de cette étape sont de 300g ou 600g environ, s pendant une période comprise entre 1 et 15 minutes par exemple.
L'élimination des cellules et/ou débris cellulaires peut également être réalisée par filtration de l'échantillon, éventuellement en combinaison avec la centrifugation décrite ci-dessus. La filtration peut être réalisée en particulier par des filtrations ~o successives au moyen de filtres ayant un porosité décroissante. A cet égard, on utilise préférentiellement des filtres ayant une porosité supérieure à 0,2 gym, par exemple comprise entre 0,2 et lOgm. On peut utiliser en particulier une succession de filtres ayant une porosité de 10 gym, 1 gm, O,S~m puis 0,22~m.
ls Une étape de concentration peut également être réalisée, de manière à
diminuer les volumes d'échantillon à traiter lors des étapes chromatographiques.
Ainsi, la concentration peut être obtenue par centrifugation de l'échantillon à des vitesses élevées, par exemple comprises entre 10 000 et 100 OOOg, de manière à
culotter les vésicules membranaires. A cet égard, il peut s'agir d'une série de 2o centrifugations différentielles, avec la dernière centrifugation effectuée autour de 70 OOOg environ. Les vésicules membranaires ainsi culottées peuvent ensuite être reprises dans un volume plus faible et dans un tampon approprié pour les étapes ultérieures du procédé.
2s L'étape de concentration peut également être réalisée par ultrafiltration.
Cette ultrafiltration permet en fait à la fois de concentrer le surnageant et d'effectuer une première purification des vésicules. Selon un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique (par exemple le surnageant) est soumis à une ultrafiltration, de préférence une ultrafiltration tangentielle. L'ultrafiltration tangentielle consiste à
concentrer et fractionner une solution entre deux compartiments (filtrat et rétentat), séparés par des membranes de seuils de coupure déterminés. La séparation est réalisée par application d'un flux dans le compartiment retentat et d'une pression transmembranaire entre ce compartiment et le compartiment filtrat. Différents s systèmes peuvent être utilisés pour réaliser l'ultrafiltration, comme par exemple des membranes spirales (Millipore, Amicon), membranes planes ou fibres creuses (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). On utilise avantageusement dans le cadre de l'invention des membranes ayant un seuil de coupure inférieur à
1000 kDa, de préférence compris entre 300 kDa et 1000 kDa, encore plus lo préférentiellement entre 300 kDa et 500 kDa.
L'étape de chromatographie d'affinité peut être réalisée de différentes façons, sur différents matériels et supports chromatographiques. Il s'agit avantageusement d'une chromatographie d'affinité non-spécifique, destinée à retenir certains is contaminants présents dans la solution, sans retenir les objets d'intérêt (i.e., les exosomes). Il s'agit donc d'une sélection négative. Il s'agit de préférence d'une chromatographie par colorant, permettant d'éliminer (i.e., de retenir) des contaminants tels que les protéines et enzymes, par exemple l'albumine, des kinases, déshydrogénases, facteurs de coagulation, interférons ou lipoprotéines, ou 2o encore des co-facteurs, etc. Préférentiellement, le support utilisé pour cette chromatograpgie est un support tel qu'utilisé pour la chromatographie d'échange d'ions, fonctionnalisé avec un colorant. A titre d'exemple spécifique, le colorant peut être choisi parmi le Blue Sepharose (Pharmacie), le Yellow 86, le Green 5 et le Brown 10 (Sigma). Le support est plus préférentiellement de l'agarose. Il est 2s entendu que tout autre support et/ou colorant ou groupe réactif permettant de retenir certains contaminants de l'échantillon biologique traité peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de filtration au moins.
Dans un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon s biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de centrifugation au moins.
Dans un mode préféré de réalisation de (invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape d'ultrafiltration au moins.
Dans un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est obtenu par traitement d'un surnageant de culture de cellules productrices de vésicules membranaires, par une étape de chromatographie d'affinité au moins.
~s Un procédé préféré de préparation plus particulier de vésicules membranaires au sens de la présente invention comprend les étapes suivantes a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, 2o b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméatîon de gel.
2s Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une filtration du surnageant de culture, suivie d'une ultrafiltration, de préférence tangentielle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre, l'étape b) ci-dessus comprend une clarification suivie d'une chromatographie d'affinité sur colorant, notamment sur Blue Sepharose..
s Par ailleurs, après l'étape c), le matériel récolté peut, le cas échéant, être soumis à une ou plusieurs étapes supplémentaires d) de traitement et/ou filtration, notamment dans un but de stérilisation. Pour cette étape de traitement par filtration, on utilise préférentiellement des filtres ayant un diamètre inférieur ou égal à 0,3 ~,m, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,25 gm. De tels lo filtres sont par exemple des filtres d'un diamètre 0,22~,m.
Après l'étape d), le matériel obtenu est par exemple distribué dans des dispositifs appropriés tels que flacons, tubes, poches, seringues, etc., dans un milieu approprié de conservation. Les vésicules purifiées ainsi obtenues peuvent être conservées au froid, congelées, ou utilisées extemporanément.
Un procédé de préparation particulier au sens de l'invention comprend donc au moins les étapes suivantes c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel et, 2o d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Dans une première variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend 2s c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
Dans une autre variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie de perméation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel s récolté après l'étape c).
Selon une troisième variante de réalisation, le procédé de l'invention comprend c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anion suivie ou précédée d'une chromatographie de perméation de gel, et, d) une étape de filtration, notamment de filtration stérilisante, du matériel récolté après l'étape c).
ls Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'injection d'une préparation d'exosomes dans la colonne de chromatographie permet d'obtenir des pics d'absorption symétriques, qui sont parfaitement résolus (Fig.
n°1). Les différentes fractions ainsi isolées sont analysables par des techniques classiques d'électrophorèse des protéines en gel dénaturant suivies de techniques de coloration 2o par du bleu de Coumassie ou de techniques de détection de protéines spécifiques à
l'aide d'anticorps. Il est ainsi possible de montrer, pour des texosomes, que le pic élué en chromatographie d'échange d'anions par une solution saline de 400 mM
possède un profil protéique identique à celui d'une préparation d'exosomes classiquement préparée (Fig. n°2). Ceci permet de facto de caractériser les pics 2s élués à des concentrations salines plus faibles ou plus fortes comme relatifs à des entités biologiques distinctes, contaminantes. Dans une autre expérience, les vésicules membranaires produites à partir de cellules dendritiques (dexosomes) ou certaines texosomes sont éluées à une force ionique comprise entre 500 et 700mM
environ, et les vésicules de mastocytes aux environs de 350 mM.
En outre, les résultats présentés dans les exemples montrent également que la méthode de l'invention permet de détecter l'éventuelle contamination de la préparation par des protéines majoritaires du milieu de culture telles que la sérum-s albumine bovine. En effet, la chromatographie d'une solution étalon de sérum-albumine bovine dans les conditions précédentes montre que celle-ci donne lieu à un pic élué à une concentration saline distincte de celle des exosomes (Fig.
n°3).
Le procédé de l'invention permet donc (i) de purifier des vésicules membranaires dans des conditions de qualité et de quantité compatibles avec un usage pharmacologique, et (ü) de révéler l'existence d'entités biologiques distinctes et contaminantes au sein de l'échantillon biologique traité.
Le procédé de l'invention peut être appliqué à la préparation de vésicules Is membranaires d'origines variées. Ainsi, il peut s'agir en particulier d'exosomes produits par des cellules présentatrices d'antigènes, ou par des cellules tumorales, notamment. En outre, il peut s'agir de cellules primaires, par exemple en culture, ou également de lignées établies, par exemple de lignées immortalisées de cellules productrices de vésicules membranaires. Il peut s'agir de cellules d'origine 2o mammifère, en particulier d'origine mucine ou humaine.
Dans un mode particulier de l'invention, les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages et des mastocytes, 2s éventuellement après sensibilisation de celles-ci à un ou plusieurs antigènes choisis.
Une application particulièrement préférée de la présente invention réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules dendritiques.
A
cet égard, il peut s'agir de cellules dendritiques humaines ou animales, notamment humaines ou mucines. Ces cellules peuvent être des cellules primaires, récoltées à
partir de fluides biologiques d'un sujet ou produites ex vivo à partir de cellules précurseur, ou également des cellules de lignées établies, par exemple immortalisées avec un oncogène (EP 701 604).
Un objet particulier de la présente invention réside dans un procédé de s préparation de vésicules membranaires (dexosomes), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires (dexosomes) et, c) la purification des vésicules membranaires (dexosomes) par un procédé
comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions, dans les conditions définies ci-avant.
Un mode de réalisation plus préféré réside dans un procédé de préparation de dexosomes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes ls a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de dexosomes, c) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en dexosomes, notamment par une étape d'ultrafiltration ou de 2o chromatographie d' affinité au moins, et, d) la purification des dexosomes par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel, dans les conditions définies ci-avant.
2s Plus particulièrement, pour la mise en oeuvre de cette variante de l'invention, les cellules dendritiques sont préférentiellement obtenues à partir d'un échantillon biologique provenant d'un sujet, par exemple de moelle osseuse ou de sang périphérique.
WO 00/44389 1~ PCT/FR00/00105 A cet égard, les techniques de production de cellules dendritiques ont été
décrites dans l'art antérieur et peuvent être mises en oeuvre par l'homme du métier (voir notamment les techniques décrites dans la demande W099/03499, incorporée à la présente par référence). Les cellules dendritiques peuvent ainsi être préparées à
s partir de cellules souches du système immunitaire, à partir de précurseurs monocytes ou encore isolées directement sous forme différenciée (Revue par Hart, Blood 90 (1997) 3245).
Une méthodologie privilégiée dans le cadre de la présente invention repose sur Io la production de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse. Plus particulièrement, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des cellules dendritiques obtenues par traitement de précurseurs monocytes (contenus dans le sang ou la moelle) en présence d'une combinaison GM-CSF+IL4 ou GM-CSF+IL-13.
1s Par ailleurs, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures. Avantageusement, on utilise une population de cellules dendritiques composée principalement (i.e., au moins 60%, 2o de préférence 70%) de cellules dendritiques immatures.
L'étape d'obtention des cellules dendritiques peut donc comprendre avantageusement la préparation d'une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures, en particulier d'origine humaine, 2s notamment à partir de précurseurs monocytes, plus particulièrement par traitement avec une combinaison de cytokines telle que GM-CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13.
Par ailleurs, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la présente ïnvention des populations de cellules dendritiques immortalisées. Il peut s'agir de lignées de cellules dendritiques immortalisées (lignée Dl par exemple, ou tout autre WO 00/44389 1 g PCT/FR00/00105 lignée produite par exemple par introduction de l'oncogène myc dans les cellules dendritiques). Il peut également s'agir de cellules dendritiques préparées puis immortalisées in vitro. L'intérêt de cellules dendritiques immortalisées réside dans la constitution de banques de cellules sensibilisées à des groupes d'antigènes donnés, s utilisables industriellement pour préparer des dexosomes susceptibles d'être administrés à des familles entières de patients.
Pour produire les vésicules membranaires (dexosomes), les cellules dendritiques peuvent être simplement cultivées dans des conditions conventionnelles connues de l'homme du métier. Avantageusement, néanmoins, ces cellules sont cultivées dans des conditions stimulant la production des dexosomes, en particulier en présence de facteurs capables de stimuler la production des dexosomes, notamment d'une cytokine telle que l'interféron gamma, l'interleukine-ou finterleukine-12 (voir par exemple la demande W099/03499). Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de (invention, les cellules dendritiques sont i 5 donc cultivées, au cours de l'étape b) ci-dessus, dans des conditions stimulant la production des vésicules membranaires.
D'autre part, dans une variante particulière de réalisation, les cellules dendritiques sont sensibilisées à un antigène, préalablement à la production des vésicules membranaires. Ce mode de réalisation permet ainsi de charger les cellules 2o dendritiques en antigènes) particulier(s), de manière à produire des dexosomes ayant un caractère immunogène donné. La sensibilisation peut être réalisée par différentes techniques connues en soi, comprenant par exemple la mise en contact des cellules avec des peptides antigéniques, des antigènes, des complexes protéiques, des cellules ou membranes de cellules exprimant des antigènes, des 25 corps apoptotiques, des vésicules membranaires, des liposomes, des ARN
tumoraux ou tout acide nucléique codant pour un ou plusieurs antigènes, déterminants antigéniques ou épitopes (éventuellement véhiculés par un vecteur viral ou non viral), etc (voir par exemple la demande W099/03499). Dans un mode préféré, la sensibilisation est réalisée par incubation avec des peptides, antigènes, ARN
ou acides nucléiques. Il est entendu que la présente demande n'est pas limitée à
des techniques de sensibilisation ou de production des cellules dendritiques.
Une autre application particulièrement avantageuse de la présente invention s réside dans la préparation de vésicules membranaires produites par des cellules tumorales, notamment humaines. Il peut s'agir en particulier de toute cellule provenant d'une tumeur solide ou liquide ainsi que de cellules transformées ou immortalisées in vitro. On peut mentionner plus préférentiellement les tumeurs solides, hématopoiétiques ou ascitiques.
Une application particulière de la présente invention réside également dans la préparation de vésicules membranaires comprenant une ou plusieurs molécules hétérologues, en particulier recombinantes. Ainsi, il est en effet possible, par exemple, de modifier génétiquement des cellules productrices de vésicules 1 s membranaires (par exemple des lignées de mastocytes) pour faire exprimer, dans ou à la surface des vésicules qu'elles produisent, des molécules d'intérêt (PCT/FR99/02691 ). La présente invention peut également permettre de purifier de telles vésicules modifiées.
2o De manière plus générale, l'invention peut être appliquée à la préparation de vésicules membranaires produites par tout type cellulaire, en particulier de vésicules de type exosome, ayant de préférence un diamètre inférieur à environ 100 nm.
Il peut s'agir notamment de cellules de macrophages, mastocytes, réticulocytes, etc.
Dans la section expérimentale, nous avons utilisé des préparations d'exosomes 2s provenant (i) de lignées cellulaires telles que des lignées de cellules tumorales (TS/A), des lignées de cellules dendritiques murines (Dl), une lignée de mastocytes (RBL) et (ü) de cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes. Les résultats obtenus sont directement transposables à d'autres cultures primaires telles que des cellules tumorales, des cellules dendritiques humaines, des lymphocytes B, etc., WO 00/44389 2~ PCT/FR00/00105 cultivables dans des conditions industriellement acceptables. Le procédé de l'invention peut ainsi être mis en oeuvre comme étape de purification des exosomes dans le cadre de leur utilisation en thérapeutique humaine.
s Les vésicules membranaires ainsi obtenues constituent, selon leur origine, des outils d'étude des cancers ou de la régulation du système immunitaire, de transfert de molécules, de production d'anticorps, de marquage, de diagnostique, de constitution de banques, des principes de vaccin ou de médicament, etc.
En outre le procédé de l'invention peut également être utilisé comme méthode pour un contrôle de qualité sur la présence éventuelle de contaminants (notamment de protéines contaminantes) dans le milieu de culture ou dans des préparations de vésicules membranaires.
1s A cet égard, la présente invention peut donc être mise en oeuvre aussi bien dans une méthode préparative de vésicules membranaires que dans un système analytique permettant de contrôler la qualité d'une préparation de vésicules membranaires, quelle que soit leur méthode de préparation.
2o La présente invention concerne donc également un procédé de contrôle de la présence de contaminants, notamment d'origine protéique ou nucléique, dans une préparation de vésicules membranaires, notamment d'exosomes, comprenant le traitement d'une fraction de ladite préparation par une étape au moins de chromatographie d'échange d'anions, et la mise en évidence de la présence de 25 contaminants.
L'invention concerne aussi, de manière générale, l'utilisation de la chromatographie d'échange d'anions, en particulier de type liquide à haute performance, pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
Elle concerne l'utilisation de la chromatographie d'affinité pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
L'invention a encore pour objet les vésicules membranaires préparées par le procédé de l'invention, ainsi que toute composition comprenant de telles vésicules.
s La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure no 1 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'un échantillon d'exosomes préparés par centrifugation différentielle.
Figure no 2 : Analyse du profil protéique des différentes fractions d'élution d'une préparation d'exosomes par électrophorèse en SDS PAGE puis coloration par is du bleu de Coomassie.
Figure no 3 : Profil d'élution après chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de sérum-albumine bovine.
Figure no 4 : Schéma de traitement d'un échantillon biologique comprenant des vésicules membranaires par ultrafiltration tangentielle.
2o Figure n° 5 : Profil général de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow après les centrifugations à 600 et 10 000 g d'un surnageant de dexosomes.
Figure n° 6 : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II
des exosomes, dans la fraction non adsorbée et dans l'éluat, de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow.
2s Figure n° 7 : Profil général de l'étape source 15Q après une étape de Blue sepharose fast flow.
Figure n° 8 : Détails du gradient d'élution sur la source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow (agrandissement de la zone rectangulaire en bas à
droite dans la figure 7).
Figure n°9 : Exemple de profil de purification d'exosomes produits à
partir de la lignée RBL DR+ (équivalent de 53 ~g de protéines) par une colonne de Source 15Q après traitement par la DNase et la RNase.
Figure n° 10 : Séparation des exosomes par un gradient discontinu en NaCI sur s un support Source 15Q.
Figure n° 11 : Western blot dirigé contre les molécules du CMH II
humain de chaque pic séparé par CLHP et ultracentrifugé. Témoin positif : Cellules dendritiques humaines exprimant les molécules du CMH II. Témoin négatif :
milieu ultracentrifugé et représentant le bruit de fond. MW= poids moléculaire ; NA=
fraction non adsorbé.
Techniques générales de culture cellulaire et de biologie moléculaire 1) Cultures cellulaires ~s La lignée de cellules TS/A est une lignée de cellules murines établie à partir d'un carcinome mammaire spontané. Cette lignée est cultivée à 37°C en présence de S% de C02 en milieu RPMI en présence de 10% de sérum de veau foetal (Dominique Dutcher).
Les lignées de cellules dendritiques sont maintenues dans un milieu IMDM
contenant 10% de sérum bovin foetal inactivé, 2 mM de L-glutamine, 50 ~.M de 2-~iME, 100 UI/ml de pénicilline, et 100 ~,g/ml de streptomycine.
2s 2) Analyse des protéines par SDS PAGE
20.1 d'échantillon est dilué dans le tampon de Laemmli (Nature 227 (1970) p680-685) puis soumis à une dénaturation thermique à 95°C pendant 10 mn puis chargé sur des gels d'acrylamide 10% (Novex 1 mmxl 0 puits). Après migration, les gels sont colorés au bleu de Coomassie.
Exemples s 1) Chromatographie par échange d'anions d'une préparation d'exosomes produits par des cellules tumorales (lignée TS/A) : analyse par SDS
PAGE du profil protéique des différentes fractions éluées.
Cet exemple illustre comment une étape de chromatographie d'échange d'anions peut permettre de séparer des impuretés d'une préparation d'exosomes.
1. 1) Protocole is Dans cette expérience le matériel de départ est constitué d'un concentrat d'exosomes préparés par centrifugation différentielle à partir d'un surnageant de culture de cellules TS/A permettant de séparer les exosomes des cellules ou des débris cellulaires présents dans le milieu de culture. La première centrifugation est réalisée à basse vitesse (300g pendant 5 mn) afin de culotter les cellules en 2o suspension présentes dans le surnageant de culture. Deux autres centrifugations (1200g pendant 20 mn puis 10 OOOg pendant 30 mn) permettent de culotter les débris cellulaires. Le surnageant ainsi clarifié est alors soumis à une ultracentrifugation à haute vitesse de 70 OOOg pendant 1 heure permettant de culotter les exosomes. Cette préparation est alors lavée dans un grand volume de solution 2s saline pour être recentrifugée dans les conditions précédentes. Le culot est alors repris dans un volume d'environ 100 ~1 de solution saline et constitue une solution concentrée d'exosomes. La quantité de protéines est mesurée par la technique de Bradford (Biorad, lvry, France). Ce concentrat présente une teneur en protéines totales comprise entre 500 et 1000 ~.g/ml.
40 gg de cette préparation d'exosomes dilués dans 500 ~l de tampon Tris/HCL
50 mM pH sont injectés sur une colonne contenant du gel Source Q 15 (Pharmacia) équilibré dans une solution Tris/HCL 50 mM pH 8. Après rinçage, les espèces adsorbées sont éluées sur 30 volumes de colonne par un gradient linéaire de NaCI de s 0 à 500 mM, puis par une solution de NaCI 2M. Les fractions d'élution sont analysées par spectrophotométrie à 260 et 280 nm. Les fractions d'élution sont regroupées en 5 cinq fractions majeures (de Fl à FS) afin de pouvoir analyser leur profil protéique respectif. Les protéines de chaque fraction sont précipitées par 1/10 de volume, d'une solution d'acide trichloroacétique à 100 % puis rincées par une lo solution d'acétone. Les culots protéiques sont repris dans 20 ~,1 de solution de Laemmli, et sont déposés sur un gel d'acrylamide SDS PAGE qui est alors coloré
par du bleu de Coomassie.
1.2) Résultats ~s Les profils d'élution à 260 et 280 nm sont représentés sur la figure 1. Les profils montrent la présence de 3 pics symétriques distincts, élués aux concentrations salines respectives de 105 mM, 400 mM et 2 M de NaCI.
L'analyse du profil protéique des fractions correspondant aux différents pics 2o montre que le pic élué à 400 mM de NaCI possède un profil protéique identique à
celui d'une préparation d'exosomes préparée classiquement par centrifugation (Figure N° 2). Le rapport entre les absorptions à 260 et 280 nm mesuré
à une valeur de 0.8 est compatible avec celui décrit dans le cas des protéines.
Le pic élué (fraction F2) à 105 mM de NaCI présente en revanche un profil 2s protéique différent montrant seulement deux bandes distinctes. Les mesures d'absorbance à 260 et 280 nm donnent un rapport de 1.6 suggérant la présence d'une association d'acides nucléiques et de protéines.
La fraction FS éluée à 2 molaire de NaCI correspond aux composés biologiques fortement associés à la colonne.
Il est donc possible de séparer les exosomes d'impuretés par une étape d'échange d'anions.
2) Chromatographie par échange d'anions d'une solution étalon de s sérum-albumine bovine Cette technique de chromatographie par échange d'anions permet également d'évaluer le degré de contamination d'une préparation d'exosomes par les protéines présentes dans le milieu de culture. Ainsi, nous montrons en chromatographiant lo pg d'une solution de sérum albumine bovine, correspondant à la protéine majoritaire du milieu de culture, que celle-ci est éluée à 205 mM de NaCI sous forme d'un pic étroit distinguable des pics précédemment décrits dans le cas des exosomes.
3) Traitement d'un surnageant de culture contenant des exosomes par 1 s ultrafiltration.
Cet exemple montre qu'il est possible de concentrer les exosomes pa ultrafiltration. De plus, la préparation exosomale est appauvrie en protéine contaminantes telle que les B SA.
3.1) Protocole : (Figure N° 4) 150 ml d'un surnageant de culture de cellules obtenu après centrifugation à
g de cellules TSA, sont soumis à une filtration sur un filtre de porosité de 0.22 ~m 2s (Millipore). Le filtrat est dilué de moitié dans du PBS. Les 300 ml résultants sont filtrés tangentiellement avec une cassette de filtration ( 1 Ocm2 de membrane) d'un seuil de coupure de 300 000 D (Sartorius).
3.2) Résultats
7 ml de rétentat sont obtenus après 1 heure de filtration. Le rétentat a été
soumis une ultracentrifugation (79 000) pour culotter et analyser les exosomes. Une analyse par SDS-PAGE suivie de coloration au bleu de Coomassie a révélé que s l'échantillon contenait significativement moins de BSA que la solution qui a été
ultrafiltrée. De plus, des bandes protéiques spécifiques des exosomes produits à
partir de TSA sont observées.
L'ultrafiltration peut donc être utilisée dans un procédé de purification d'exosomes afin de séparer ceux-ci de protéines contaminantes.
io 4) Purification par CLHP d'exosomes humains, produits par des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MDDC).
4.1) Matériels et Méthodes 1s . Tampons et solutions mères.
On travaille à partir de solutions mères filtrées 0,22 ~m à l'exception de l'eau et de la solution de soude. Le premier tampon est une solution de Bis-Tris-Propane (BTP) 20 100 mM (Sigma, 99% de pureté), tamponnée à pH 6, ce tampon est branché sur la voie A du chromatographe (BioCad Sprint, Perkin-Elmer). Le second tampon est une solution de Bis-Tris-Propane 100 mM, tamponnée à pH 9, ce tampon est branché sur la voie B du chromatographe. L'eau est produite sur résine par un système Milli-Q à une résistance de 18 MS2cm. l'eau est branchée sur la voie C. Sur 2s la voie D est branchée une solution mère de chlorure de sodium (NaCI, Prolabo, 99,5% de pureté) 3 M. Sur la voie F est branchée une solution de soude (NaOH, Prolabo, 98% de pureté minimum) 0,1 M. La voie E est utilisée pour charger les surnageants de culture sur les colonnes.
WO 00/44389 2~ PCT/FR00/00105 Tous les tampons sont réalisés à partir de l'eau produite par le système Milli-Q, les tampons ne sont pas dégazés.
Colonnes s Blue Sepharose 6 fast flow (pharmacia):
La première étape est réalisée avec une colonne de Blue Sepharose 6 fast flow (Pharmacia). La matrice est de l'agarose couplé avec du Blue sepharose 6 fast flow Blue 3G (7%). La taille des particules se situe entre 45 et 165 gym. Le débit linéaire io maximum est de 750 cm/hr. Le gel est stable aux pH compris entre 4 et 12, aux pH
extrêmes, 2 et 14, le gel peut être endommagé ce qui entraîne une diminution de la capacité de fixation (découplage du Blue sepharose 6 fast flow) et une augmentation de la pression (formation de fines).
Le Blue sepharose 6 fast flow est spécifique de composants comme l'albumine, les Is kinases, les déshydrogénases et d'autres enzymes contenant des cofacteurs comme le NAD+, des facteurs de coagulation, des interférons et de lipoprotéines.
La capacité théorique de fixation du Blue sepharose 6 fast flow est d'environ 15 à
20 mg de sérum albumine par ml de gel.
Le volume de colonne utilisé est d'environ S,S ml de gel (C10/10, Pharmacia) soit 2o une capacité théorique de 80 à 110 mg de sérum albumine. Le débit utilisé
est de 2 ml/min (150 cm/hr) sur le BioCad Sprint et de 3,5 ml/min (260 cm/hr) avec un système de détection Pharmacia. La pression n'excède pas 2.5 bars et est essentiellement due aux cellules de mesure de DO
25 Source 15Q
La deuxième étape est réalisée avec une colonne de Source 15Q (pharmacia), échangeur d'anions fort. La matrice est du polystyrène réticulé avec du divinylbenzène. La taille des billes est de 15 qm et est homogène. Les billes sont parcourues par un réseau de pores avec une taille variant de 20 à 1000 nm. Ces gels WO 00/44389 2g PCT/FR00/00105 sont très résistant à la pression et acceptent des débits linéaires important ( 1800 cm/hr et plus) tout en gardant une résolution et une capacité satisfaisante.
Cela est rendu possible grâce à l'homogénéité des billes et à leur porosité qui augmentent l'accès des molécules aux groupements fonctionnels.
s Le gel est stable aux pH compris entre 2 et 12 au delà le gel risque de subir d'important dommages qui diminuent ses capacités.
La capacité théorique de fixation de cet échangeur est d'environ 25 mg de protéines par ml de gel. On utilise une colonne de 0,8 ml (PEEK column 4,6 mm ID/50 mm L, Perkin-Elmer), soit une capacité maximum de 20 mg de protéines. La capacité
~o réelle, qui permet de garder une bonne résolution, est de l'ordre de 10% de cette capacité maximum soit 2 mg de protéines. Le débit utilisé est de 5 ml/min (1880 cm/hr) et permet des séparations rapides. La colonne est packeé avec le système Poros selfPack à 15m1/min à 150 bars.
Is . Chromatographe (BioCad Sprint) Le BioCad est un système CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) qui permet de travailler à des hautes pressions (maximum 204 bars) et à des débits s'étalant de 0,2 à 60 ml/min. On peut brancher jusqu'à 6 tampons (les 6 voies sont 2o utilisées actuellement), et le système peut être traité par la soude 0.1 M
(pH 12) pour la dépyrogènéisation des tubulures et de la colonne.
Les séparations peuvent être réalisées à température ambiante ou à
4°C. Les échantillons sont chargés soit par une des voies accessibles ou par des boucles d'injection pour les petits volumes (de 100 ~l à 5 ml). Le système de détection 2s utilise une cellule UV double voie : de 190 à 450 nm pour UV et de 366 à
700 nm pour le visible. Classiquement on utilise une détection à 254 nm pour les acides nucléiques et une détection à 280 nm pour les protéines (ceux sont les acides aminés avec un cycle benzène tels les tyrosines, tryptophanes et phénylalanines qui absorbent). Le système est entièrement contrôlé par informatique (logiciel développé par Perspective biosystem). Pour chaque séparation, tous les paramètres (pression, débit, conductivité, densité optique, pH, etc.) peuvent être contrôlés.
Enfin, l'échantillon séparé est soit récupéré en tube Falcon 50 ml ou collecté
en tubes eppendorf siliconés (collecteur Advantec SF-2120) pour minimiser les s interactions non spécifiques.
. Production des exosomes à partir de cellules dendritiques.
De façon première, les cellules dendritiques sont obtenues à partir de lo précurseurs monocytaires du sang périphérique. Les monocytes isolés sont cultivés en présence d'une combinaison de GM-CSF et d'IL-13 ou d'IL-4 (voir les techniques décrites dans la demande W099/03499). Pour la production d'exosomes il est préférable d'utiliser une population de cellules dendritiques immatures.
~s 4.2) Etape de Blue Sepharose 6 fast flow.
Les surnageants de culture sont centrifugés deux fois à 600 g et une fois à 10 000 g avant d'être chargés sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow.
2o On utilise une colonne de 5,5 ml, le débit est de 2 ml/min (débit linéaire de 150 cm/h, temps de contact de 2,7 min), la pression est de l'ordre de 2,5 bars (fig 5). La colonne est équilibrée en tampon BTP 12 mM, 150 mM NaCI et pH 7. Après équilibration, le surnageant est chargé sur la colonne puis celle ci est lavée avec le même tampon d'équilibration jusqu'à la redescente de la D.O. L'élution des 2s protéines fixées est réalisée en BTP 12 mM, NaCI 1,5 M et pH 7 (en 3 à 4 volumes de colonne). La colonne est régénérée par passage d'eau (2 à 3 volumes de colonne), puis on passe 2 volumes de soude 0,1 M (pH 12), enfin, la colonne est rééquilibrée en BTP 12 mM, 150 mM NaCI et pH 7.
WO 00/44389 3~ PCT/FR00/00105 Aspect quantitatif et qualitatif de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow Comme décrit avant, l'étape de Blue sepharose 6 fast flow est spécifique des protéines comme l'albumine qui est un contaminant majeur du surnageant de s culture. On mesure la concentration protéique de chaque fraction de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow par une technique Biorad (mesure d'une DO à 600 nm). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1.
Tableau 1. Concentrations protéiques dans chaque fraction de l'étape de Blue lo sepharose 6 fast flow.
surnageantNon adsorb Pic Pic rgnration d' lution Concentration 3.69 0.18 3.32 1.48 protique (mg/ml) Volume (ml) 25 37.5 20 20 quantit totale92.2 6.7 66.4 29.6 de protines(mg) Rendements 100 7.3 72 32.1 (%) La majeure partie des protéines se retrouve soit dans l'éluat (72%) ou dans la régénération (32%). La fraction non adsorbée ne représente que 7 à 10% du total des protéines chargées sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow. L'étape est ~s spécifique des contaminants majeurs du surnageant. Pour vérifier cette spécificité du Blue sepharose 6 fast flow, chaque fraction est déposée sur un gel SDS-PAGE en condition réductrice et coloré en nitrate d'argent. La surcharge de la colonne (50 ml de surnageant chargés sur une colonne de Blue sepharose 6 fast flow de 5.5 ml) a permis de calculer la quantité maximum de protéines, du surnageant de culture, qu'il 2o est possible de charger sur la colonne par ml de gel (tableau 2). Dans ce cas le pourcentage de la fraction non adsorbée passe de 7 à plus de 30% de la quantité de protéine chargée. Cette valeur est comprise entre 16 et 18 mg de protéines par ml de gel Blue sepharose 6 fast flow. En conclusion 1 ml de gel de Blue sepharose 6 fast flow permet de purifier environ 5 à 6 ml de surnageant de culture (AIMV 2.5%
de s HSA). Cette valeur prend toute son importance pour l'étude du scale up puisqu'il détermine la taille de la colonne à utiliser et par conséquent le coût de cette étape.
Tableau 2. Etude de la surchage du support Blue sepharose 6 fast flow en première étape.
surnageantNon adsorb Pic Pic rgnration d' lution Concentration3.02 0.87 3 1.56 protique (mg/ml) Volume (ml) 50 60 20 20 quantit totale151 52.2 60 31.2 de protines(mg) Rendements 100 34.6 39.7 20.6 (%) Comme attendu, le contaminant majeur des surnageants de culture, après les centrifugations à 600 et 10 000 g, est l'albumine. Ce contaminant est retrouvé, après fixation sur le Blue sepharose 6 fast flow, dans les fractions eluat et régénération. En plus de ce contaminant, on retrouve de nombreux autres 1 s contaminants de bas poids et hauts poids moléculaires.
L'étape de Blue sepharose 6 fast flow permet l'élimination d'environ 90 à 95%
des contaminants du surnageant de culture. Les exosomes sont dans la fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow (fig.6).
20 4.3) Etape d'échangeur d'anions: source 15Q (Pharmacie).
On utilise une colonne de source 15Q de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min (débit linéaire de 1880 cm/h, temps de contact 0,1 min) avec une pression de l'ordre de 50 bars. La fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow est s directement chargée sur la source 15Q (fig. 7) sans modificatiôns de la concentration saline (NaCI) ou du pH.
Après l'étape de fixation la colonne est lavée en tampon BTP 12 mM, 280 mM
NaCI à pH 7 (35 volumes de colonne) jusqu'à la redescente de la DO à des valeurs lo proches de 0. On fait une seconde étape de lavage à une concentration saline de 150 mM NaCI ( 10 volumes de colonne) pour renforcer les interactions des exosomes avec le support.
On réalise un premier gradient de 150 à 420 mM NaCI en 7 volumes de colonne (fig.8) puis le gradient est stoppé pendant 9 volumes de colonne. Le second gradient is démarre de 420 mM NaCI jusqu'à 1 M NaCI en 25 volumes de colonne. Les exosomes sont élués dans ce second gradient dans deux pics à 550 et 700 mM
NaCI
(fig.8). La colonne est régénérée par passage de 10 volumes de colonne d'eau puis par 10 volumes de colonne de soude 0.1 M (pH 12) et enfin par passage de 10 volumes de colonne de NaCI 3M. La colonne est ensuite équilibrée en tampon BTP
20 12 mM, 150 mM NaCI, pH 7.
Aspects quantitatifs et qualitatifs de l'étape de source 15Q.
Comme on peut le voir sur la figure 6 la majeur partie des protéines, de la fraction 2s non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow, ne sont pas retenues par la colonne. Les concentrations protéiques ont été mesurées par un test Biorad (absorption de la DO
à 600 nm) et sont résumées dans le tableau 3.
Tableau 3. aspects quantitatifs de l'étape de Source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow.
Dpart (non Non adsorb Eluat fractionsEluat fractions adsorb Blue source 15Q 4 6 19 23 sepharose 6 fast flow) Protines 0.17 0.14 0.01 0.02 (mg/ml) Volume (ml) 85 98 3 5 Protines 14.45 13.72 0.03 0.10 totales (mg) Rendements 100 94.9 0.2 0.8 (%) 95% des protéines chargées sur la colonne Source 15Q ne sont pas retenues. Les s fractions poolées 4 à 6 et les fractions poolées 19 à 23 représentent environ 1.5%.
La régénération n' a pas été dosée. Le rendement est très proche de 100%
l'ensemble des protéines et des vésicules chargées sont éluées de la colonne.
En terme de charge protéique de la colonne, la Source 1 SQ est capable de fixer environ 25 mg de protéines (données constructeur), soit pour les 0.8 ml, 20 mg de protéines.
io Il est clair que l'on est très loin du maximum de la colonne et des 5 à 10%
en accord avec une bonne résolution, puisque ces valeurs se situent entre 1 et 2 mg de protéines. Dans ces conditions on peut purifier, avec une colonne de 0.8 ml de Source 15Q, entre 200 et 400 ml de surnageant de culture.
Chaque pic d'élution est ultracentrifugé (100 000 g pendant 1 heure) et poolé
pour Is être observé en microscopie électronique. Le premier pic (elué entre 150 et 420 mM
NaCI) contient essentiellement des protéines, des débris cellulaires et quelques vésicules marquées par un anticorps anti CMH II.
Le second pic (élué à 550 mM NaCI), traité de la même façon, montre un bruit de fond moins important, un nombre beaucoup plus grand de vésicules marquées par un anticorps anti CMH II, il existe également une hétérogénéité dans la taille des vésicules.
s Le troisième pic (élué à 700 mM NaCI) ne présente plus de bruit de fond, les vésicules sont pratiquement toutes marquées par un anticorps anti CMH II et sont beaucoup plus homogènes en taille.
Ces deux fractions (pic 2 et 3) sont à comparer à ce que l'on obtient par le procédé
classique de purification par ultracentrifugation. Dans ce cas on observe un bruit de fond important et une grande hétérogénéité des vésicules comparé aux deux pics de chromatographie. De plus, il semble qu'il existe une séparation entre les débris et les exosomes purifiés par CLHP ce qui n'est pas le cas avec l'ultracentrifugation.
4.4) Conclusions Is En deux étapes de chromatographie, la première faisant appel à une sélection négative (étape de Blue sepharose 6 fast flow) des exosomes la seconde faisant appel à une sélection positive et à une élution sélective des exosomes (étape de Source 15Q), on enlève environ entre 99 et 99.5% des protéines du surnageant de 2o culture tout en gardant les exosomes. Le procédé conserve l'intégrité des exosomes par microscopie électronique. Ce procédé est donc spécifique pour la purification des exosomes.
A titre d'exemple, d'autres colonnes retenant les protéines du sérum peuvent être utilisées. Par ailleurs, des colonnes macroporeuses cationiques peuvent être utilisées zs à la place de la Source 1 SQ.
5) Purification par CLHP d'exosomes produits à partir de la lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia).
Les exosomes sont produits à partir d'une lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia) transfectée de façon stable pour exprimer, à la membrane des exosomes, des molécules du CMH II humain (PCT/FR99/02691 ). Après induction, par un ionophore (iomicyne), les cellules dégranulent et relarguent des exosomes dans un s milieu sans protéines (RPMI). Après élimination des cellules par centrifugation à
600 g 10 min les surnageants sont récupérés et traités avec une DNase (Sigma) et une RNase (Sigma).
Les surnageants traités sont ensuite centrifugés à 10 000 g à 37°C, 30 min, puis à
100 000 g pendant 1 heure.
~o Le culot d'ultracentrifugation est chargé sur une colonne d'échange d'ions, Source 15Q, Pharmacia (fig.9). On utilise une colonne de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min (débit linéaire 1880 cm/h, temps de contact 0.1 min).
La colonne est équilibrée en tampon Bis-Tris-Propane (BTP) 12 mM, 150 mM NaCI
is et pH 7. Après chargement de l'échantillon la colonne est lavée avec 15 à
volumes de colonne du même tampon d'équilibration. L'élution est réalisée avec volume de colonne en faisant varier la concentration saline de 150 mM à 1 M
NaCI, le pH est maintenu constant (fig.9). Le milieu est très peux contaminé par des protéines puisque les cellules sont lavées dans du PBS et l'induction ainsi que le 2o relargage des exosomes se fait dans du RPMI seul. Ceci est confirmé par la faible absorption observée (280 et 254 nm) dans la fraction non adsorbée de la SourcelSQ.
La présence des exosomes est confirmée par un western blot dirigé contre les molécules du CMH II (fig 11 ) après séparation des pics par des steps en NaCI
(fig.
10) et ultracentrifugation de chacun des pics.
2s On observe 3 pics, plus une fraction non adsorbée : un premier pic élué à
350 mM
NaCI, un deuxième pic élué à 700 mM NaCI et enfin un troisième pic élué à 1.5 M
NaCI. Le pic à 700 mM est majoritaire. En western blot dirigé contre les molécules du CMH II humain on retrouve un signal dans les pics 1 (350 mM NaCI) et dans le pic 2 (700 mM NaCI).
Il est à noter que le pic 1 qui a une intensité de signal, en protéines, 7 à 8 fois moindre que le pic 2 présente un signal en western blot équivalent à celui du pic 2.
Ceci peut traduire une plus grande pureté du pic 1. Pour confirmer ce fait, les pics ont été ultracentrifugés et observés en microscopie électronique.
Le pic 1 est très riche en exosomes marquées par un anticorps anti CMH II
humain, il y a peu ou pas de bruit de fond. Les exosomes sont hétérogènes en taille, il ne semble pas y avoir de séparation des exosomes pas leur taille mais par un mécanisme spécifique de compétition entre l'éluant (NaCI) et les exosomes.
Les fractions comprises entre les deux pics ont été analysées par microscopie électronique. On y trouve peu d' exosomes avec un bruit de fond plus important que dans le pic 1.
Le pic 2 est très semblable aux fractions comprises entre les deux pics, on retrouve peu d'exosomes et bruit de fond plus important.
~s Conclusions La Source 15Q est capable de retenir les exosomes et de les séparer de contaminants éventuels (fig.9). La très grande majorité des exosomes est éluée dans un même pic à 350 mM NaCI. En microscopie électronique les exosomes apparaissent 20 «normaux» avec un marquage spécifique des molécules du CMH II humain.
L'hétérogénéité de la taille des exosomes (pic 1) semble indiquer que la séparation est basée sur des échanges ioniques et non sur un tamisage. Le Source 15Q peut donc être utilisé comme étape de purification des exosomes de RBL.
soumis une ultracentrifugation (79 000) pour culotter et analyser les exosomes. Une analyse par SDS-PAGE suivie de coloration au bleu de Coomassie a révélé que s l'échantillon contenait significativement moins de BSA que la solution qui a été
ultrafiltrée. De plus, des bandes protéiques spécifiques des exosomes produits à
partir de TSA sont observées.
L'ultrafiltration peut donc être utilisée dans un procédé de purification d'exosomes afin de séparer ceux-ci de protéines contaminantes.
io 4) Purification par CLHP d'exosomes humains, produits par des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (MDDC).
4.1) Matériels et Méthodes 1s . Tampons et solutions mères.
On travaille à partir de solutions mères filtrées 0,22 ~m à l'exception de l'eau et de la solution de soude. Le premier tampon est une solution de Bis-Tris-Propane (BTP) 20 100 mM (Sigma, 99% de pureté), tamponnée à pH 6, ce tampon est branché sur la voie A du chromatographe (BioCad Sprint, Perkin-Elmer). Le second tampon est une solution de Bis-Tris-Propane 100 mM, tamponnée à pH 9, ce tampon est branché sur la voie B du chromatographe. L'eau est produite sur résine par un système Milli-Q à une résistance de 18 MS2cm. l'eau est branchée sur la voie C. Sur 2s la voie D est branchée une solution mère de chlorure de sodium (NaCI, Prolabo, 99,5% de pureté) 3 M. Sur la voie F est branchée une solution de soude (NaOH, Prolabo, 98% de pureté minimum) 0,1 M. La voie E est utilisée pour charger les surnageants de culture sur les colonnes.
WO 00/44389 2~ PCT/FR00/00105 Tous les tampons sont réalisés à partir de l'eau produite par le système Milli-Q, les tampons ne sont pas dégazés.
Colonnes s Blue Sepharose 6 fast flow (pharmacia):
La première étape est réalisée avec une colonne de Blue Sepharose 6 fast flow (Pharmacia). La matrice est de l'agarose couplé avec du Blue sepharose 6 fast flow Blue 3G (7%). La taille des particules se situe entre 45 et 165 gym. Le débit linéaire io maximum est de 750 cm/hr. Le gel est stable aux pH compris entre 4 et 12, aux pH
extrêmes, 2 et 14, le gel peut être endommagé ce qui entraîne une diminution de la capacité de fixation (découplage du Blue sepharose 6 fast flow) et une augmentation de la pression (formation de fines).
Le Blue sepharose 6 fast flow est spécifique de composants comme l'albumine, les Is kinases, les déshydrogénases et d'autres enzymes contenant des cofacteurs comme le NAD+, des facteurs de coagulation, des interférons et de lipoprotéines.
La capacité théorique de fixation du Blue sepharose 6 fast flow est d'environ 15 à
20 mg de sérum albumine par ml de gel.
Le volume de colonne utilisé est d'environ S,S ml de gel (C10/10, Pharmacia) soit 2o une capacité théorique de 80 à 110 mg de sérum albumine. Le débit utilisé
est de 2 ml/min (150 cm/hr) sur le BioCad Sprint et de 3,5 ml/min (260 cm/hr) avec un système de détection Pharmacia. La pression n'excède pas 2.5 bars et est essentiellement due aux cellules de mesure de DO
25 Source 15Q
La deuxième étape est réalisée avec une colonne de Source 15Q (pharmacia), échangeur d'anions fort. La matrice est du polystyrène réticulé avec du divinylbenzène. La taille des billes est de 15 qm et est homogène. Les billes sont parcourues par un réseau de pores avec une taille variant de 20 à 1000 nm. Ces gels WO 00/44389 2g PCT/FR00/00105 sont très résistant à la pression et acceptent des débits linéaires important ( 1800 cm/hr et plus) tout en gardant une résolution et une capacité satisfaisante.
Cela est rendu possible grâce à l'homogénéité des billes et à leur porosité qui augmentent l'accès des molécules aux groupements fonctionnels.
s Le gel est stable aux pH compris entre 2 et 12 au delà le gel risque de subir d'important dommages qui diminuent ses capacités.
La capacité théorique de fixation de cet échangeur est d'environ 25 mg de protéines par ml de gel. On utilise une colonne de 0,8 ml (PEEK column 4,6 mm ID/50 mm L, Perkin-Elmer), soit une capacité maximum de 20 mg de protéines. La capacité
~o réelle, qui permet de garder une bonne résolution, est de l'ordre de 10% de cette capacité maximum soit 2 mg de protéines. Le débit utilisé est de 5 ml/min (1880 cm/hr) et permet des séparations rapides. La colonne est packeé avec le système Poros selfPack à 15m1/min à 150 bars.
Is . Chromatographe (BioCad Sprint) Le BioCad est un système CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) qui permet de travailler à des hautes pressions (maximum 204 bars) et à des débits s'étalant de 0,2 à 60 ml/min. On peut brancher jusqu'à 6 tampons (les 6 voies sont 2o utilisées actuellement), et le système peut être traité par la soude 0.1 M
(pH 12) pour la dépyrogènéisation des tubulures et de la colonne.
Les séparations peuvent être réalisées à température ambiante ou à
4°C. Les échantillons sont chargés soit par une des voies accessibles ou par des boucles d'injection pour les petits volumes (de 100 ~l à 5 ml). Le système de détection 2s utilise une cellule UV double voie : de 190 à 450 nm pour UV et de 366 à
700 nm pour le visible. Classiquement on utilise une détection à 254 nm pour les acides nucléiques et une détection à 280 nm pour les protéines (ceux sont les acides aminés avec un cycle benzène tels les tyrosines, tryptophanes et phénylalanines qui absorbent). Le système est entièrement contrôlé par informatique (logiciel développé par Perspective biosystem). Pour chaque séparation, tous les paramètres (pression, débit, conductivité, densité optique, pH, etc.) peuvent être contrôlés.
Enfin, l'échantillon séparé est soit récupéré en tube Falcon 50 ml ou collecté
en tubes eppendorf siliconés (collecteur Advantec SF-2120) pour minimiser les s interactions non spécifiques.
. Production des exosomes à partir de cellules dendritiques.
De façon première, les cellules dendritiques sont obtenues à partir de lo précurseurs monocytaires du sang périphérique. Les monocytes isolés sont cultivés en présence d'une combinaison de GM-CSF et d'IL-13 ou d'IL-4 (voir les techniques décrites dans la demande W099/03499). Pour la production d'exosomes il est préférable d'utiliser une population de cellules dendritiques immatures.
~s 4.2) Etape de Blue Sepharose 6 fast flow.
Les surnageants de culture sont centrifugés deux fois à 600 g et une fois à 10 000 g avant d'être chargés sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow.
2o On utilise une colonne de 5,5 ml, le débit est de 2 ml/min (débit linéaire de 150 cm/h, temps de contact de 2,7 min), la pression est de l'ordre de 2,5 bars (fig 5). La colonne est équilibrée en tampon BTP 12 mM, 150 mM NaCI et pH 7. Après équilibration, le surnageant est chargé sur la colonne puis celle ci est lavée avec le même tampon d'équilibration jusqu'à la redescente de la D.O. L'élution des 2s protéines fixées est réalisée en BTP 12 mM, NaCI 1,5 M et pH 7 (en 3 à 4 volumes de colonne). La colonne est régénérée par passage d'eau (2 à 3 volumes de colonne), puis on passe 2 volumes de soude 0,1 M (pH 12), enfin, la colonne est rééquilibrée en BTP 12 mM, 150 mM NaCI et pH 7.
WO 00/44389 3~ PCT/FR00/00105 Aspect quantitatif et qualitatif de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow Comme décrit avant, l'étape de Blue sepharose 6 fast flow est spécifique des protéines comme l'albumine qui est un contaminant majeur du surnageant de s culture. On mesure la concentration protéique de chaque fraction de l'étape de Blue sepharose 6 fast flow par une technique Biorad (mesure d'une DO à 600 nm). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1.
Tableau 1. Concentrations protéiques dans chaque fraction de l'étape de Blue lo sepharose 6 fast flow.
surnageantNon adsorb Pic Pic rgnration d' lution Concentration 3.69 0.18 3.32 1.48 protique (mg/ml) Volume (ml) 25 37.5 20 20 quantit totale92.2 6.7 66.4 29.6 de protines(mg) Rendements 100 7.3 72 32.1 (%) La majeure partie des protéines se retrouve soit dans l'éluat (72%) ou dans la régénération (32%). La fraction non adsorbée ne représente que 7 à 10% du total des protéines chargées sur la colonne de Blue sepharose 6 fast flow. L'étape est ~s spécifique des contaminants majeurs du surnageant. Pour vérifier cette spécificité du Blue sepharose 6 fast flow, chaque fraction est déposée sur un gel SDS-PAGE en condition réductrice et coloré en nitrate d'argent. La surcharge de la colonne (50 ml de surnageant chargés sur une colonne de Blue sepharose 6 fast flow de 5.5 ml) a permis de calculer la quantité maximum de protéines, du surnageant de culture, qu'il 2o est possible de charger sur la colonne par ml de gel (tableau 2). Dans ce cas le pourcentage de la fraction non adsorbée passe de 7 à plus de 30% de la quantité de protéine chargée. Cette valeur est comprise entre 16 et 18 mg de protéines par ml de gel Blue sepharose 6 fast flow. En conclusion 1 ml de gel de Blue sepharose 6 fast flow permet de purifier environ 5 à 6 ml de surnageant de culture (AIMV 2.5%
de s HSA). Cette valeur prend toute son importance pour l'étude du scale up puisqu'il détermine la taille de la colonne à utiliser et par conséquent le coût de cette étape.
Tableau 2. Etude de la surchage du support Blue sepharose 6 fast flow en première étape.
surnageantNon adsorb Pic Pic rgnration d' lution Concentration3.02 0.87 3 1.56 protique (mg/ml) Volume (ml) 50 60 20 20 quantit totale151 52.2 60 31.2 de protines(mg) Rendements 100 34.6 39.7 20.6 (%) Comme attendu, le contaminant majeur des surnageants de culture, après les centrifugations à 600 et 10 000 g, est l'albumine. Ce contaminant est retrouvé, après fixation sur le Blue sepharose 6 fast flow, dans les fractions eluat et régénération. En plus de ce contaminant, on retrouve de nombreux autres 1 s contaminants de bas poids et hauts poids moléculaires.
L'étape de Blue sepharose 6 fast flow permet l'élimination d'environ 90 à 95%
des contaminants du surnageant de culture. Les exosomes sont dans la fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow (fig.6).
20 4.3) Etape d'échangeur d'anions: source 15Q (Pharmacie).
On utilise une colonne de source 15Q de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min (débit linéaire de 1880 cm/h, temps de contact 0,1 min) avec une pression de l'ordre de 50 bars. La fraction non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow est s directement chargée sur la source 15Q (fig. 7) sans modificatiôns de la concentration saline (NaCI) ou du pH.
Après l'étape de fixation la colonne est lavée en tampon BTP 12 mM, 280 mM
NaCI à pH 7 (35 volumes de colonne) jusqu'à la redescente de la DO à des valeurs lo proches de 0. On fait une seconde étape de lavage à une concentration saline de 150 mM NaCI ( 10 volumes de colonne) pour renforcer les interactions des exosomes avec le support.
On réalise un premier gradient de 150 à 420 mM NaCI en 7 volumes de colonne (fig.8) puis le gradient est stoppé pendant 9 volumes de colonne. Le second gradient is démarre de 420 mM NaCI jusqu'à 1 M NaCI en 25 volumes de colonne. Les exosomes sont élués dans ce second gradient dans deux pics à 550 et 700 mM
NaCI
(fig.8). La colonne est régénérée par passage de 10 volumes de colonne d'eau puis par 10 volumes de colonne de soude 0.1 M (pH 12) et enfin par passage de 10 volumes de colonne de NaCI 3M. La colonne est ensuite équilibrée en tampon BTP
20 12 mM, 150 mM NaCI, pH 7.
Aspects quantitatifs et qualitatifs de l'étape de source 15Q.
Comme on peut le voir sur la figure 6 la majeur partie des protéines, de la fraction 2s non adsorbée du Blue sepharose 6 fast flow, ne sont pas retenues par la colonne. Les concentrations protéiques ont été mesurées par un test Biorad (absorption de la DO
à 600 nm) et sont résumées dans le tableau 3.
Tableau 3. aspects quantitatifs de l'étape de Source 15Q après une étape de Blue sepharose 6 fast flow.
Dpart (non Non adsorb Eluat fractionsEluat fractions adsorb Blue source 15Q 4 6 19 23 sepharose 6 fast flow) Protines 0.17 0.14 0.01 0.02 (mg/ml) Volume (ml) 85 98 3 5 Protines 14.45 13.72 0.03 0.10 totales (mg) Rendements 100 94.9 0.2 0.8 (%) 95% des protéines chargées sur la colonne Source 15Q ne sont pas retenues. Les s fractions poolées 4 à 6 et les fractions poolées 19 à 23 représentent environ 1.5%.
La régénération n' a pas été dosée. Le rendement est très proche de 100%
l'ensemble des protéines et des vésicules chargées sont éluées de la colonne.
En terme de charge protéique de la colonne, la Source 1 SQ est capable de fixer environ 25 mg de protéines (données constructeur), soit pour les 0.8 ml, 20 mg de protéines.
io Il est clair que l'on est très loin du maximum de la colonne et des 5 à 10%
en accord avec une bonne résolution, puisque ces valeurs se situent entre 1 et 2 mg de protéines. Dans ces conditions on peut purifier, avec une colonne de 0.8 ml de Source 15Q, entre 200 et 400 ml de surnageant de culture.
Chaque pic d'élution est ultracentrifugé (100 000 g pendant 1 heure) et poolé
pour Is être observé en microscopie électronique. Le premier pic (elué entre 150 et 420 mM
NaCI) contient essentiellement des protéines, des débris cellulaires et quelques vésicules marquées par un anticorps anti CMH II.
Le second pic (élué à 550 mM NaCI), traité de la même façon, montre un bruit de fond moins important, un nombre beaucoup plus grand de vésicules marquées par un anticorps anti CMH II, il existe également une hétérogénéité dans la taille des vésicules.
s Le troisième pic (élué à 700 mM NaCI) ne présente plus de bruit de fond, les vésicules sont pratiquement toutes marquées par un anticorps anti CMH II et sont beaucoup plus homogènes en taille.
Ces deux fractions (pic 2 et 3) sont à comparer à ce que l'on obtient par le procédé
classique de purification par ultracentrifugation. Dans ce cas on observe un bruit de fond important et une grande hétérogénéité des vésicules comparé aux deux pics de chromatographie. De plus, il semble qu'il existe une séparation entre les débris et les exosomes purifiés par CLHP ce qui n'est pas le cas avec l'ultracentrifugation.
4.4) Conclusions Is En deux étapes de chromatographie, la première faisant appel à une sélection négative (étape de Blue sepharose 6 fast flow) des exosomes la seconde faisant appel à une sélection positive et à une élution sélective des exosomes (étape de Source 15Q), on enlève environ entre 99 et 99.5% des protéines du surnageant de 2o culture tout en gardant les exosomes. Le procédé conserve l'intégrité des exosomes par microscopie électronique. Ce procédé est donc spécifique pour la purification des exosomes.
A titre d'exemple, d'autres colonnes retenant les protéines du sérum peuvent être utilisées. Par ailleurs, des colonnes macroporeuses cationiques peuvent être utilisées zs à la place de la Source 1 SQ.
5) Purification par CLHP d'exosomes produits à partir de la lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia).
Les exosomes sont produits à partir d'une lignée RBL (Rat Basophilic Leukemia) transfectée de façon stable pour exprimer, à la membrane des exosomes, des molécules du CMH II humain (PCT/FR99/02691 ). Après induction, par un ionophore (iomicyne), les cellules dégranulent et relarguent des exosomes dans un s milieu sans protéines (RPMI). Après élimination des cellules par centrifugation à
600 g 10 min les surnageants sont récupérés et traités avec une DNase (Sigma) et une RNase (Sigma).
Les surnageants traités sont ensuite centrifugés à 10 000 g à 37°C, 30 min, puis à
100 000 g pendant 1 heure.
~o Le culot d'ultracentrifugation est chargé sur une colonne d'échange d'ions, Source 15Q, Pharmacia (fig.9). On utilise une colonne de 0.8 ml avec un débit de 5 ml/min (débit linéaire 1880 cm/h, temps de contact 0.1 min).
La colonne est équilibrée en tampon Bis-Tris-Propane (BTP) 12 mM, 150 mM NaCI
is et pH 7. Après chargement de l'échantillon la colonne est lavée avec 15 à
volumes de colonne du même tampon d'équilibration. L'élution est réalisée avec volume de colonne en faisant varier la concentration saline de 150 mM à 1 M
NaCI, le pH est maintenu constant (fig.9). Le milieu est très peux contaminé par des protéines puisque les cellules sont lavées dans du PBS et l'induction ainsi que le 2o relargage des exosomes se fait dans du RPMI seul. Ceci est confirmé par la faible absorption observée (280 et 254 nm) dans la fraction non adsorbée de la SourcelSQ.
La présence des exosomes est confirmée par un western blot dirigé contre les molécules du CMH II (fig 11 ) après séparation des pics par des steps en NaCI
(fig.
10) et ultracentrifugation de chacun des pics.
2s On observe 3 pics, plus une fraction non adsorbée : un premier pic élué à
350 mM
NaCI, un deuxième pic élué à 700 mM NaCI et enfin un troisième pic élué à 1.5 M
NaCI. Le pic à 700 mM est majoritaire. En western blot dirigé contre les molécules du CMH II humain on retrouve un signal dans les pics 1 (350 mM NaCI) et dans le pic 2 (700 mM NaCI).
Il est à noter que le pic 1 qui a une intensité de signal, en protéines, 7 à 8 fois moindre que le pic 2 présente un signal en western blot équivalent à celui du pic 2.
Ceci peut traduire une plus grande pureté du pic 1. Pour confirmer ce fait, les pics ont été ultracentrifugés et observés en microscopie électronique.
Le pic 1 est très riche en exosomes marquées par un anticorps anti CMH II
humain, il y a peu ou pas de bruit de fond. Les exosomes sont hétérogènes en taille, il ne semble pas y avoir de séparation des exosomes pas leur taille mais par un mécanisme spécifique de compétition entre l'éluant (NaCI) et les exosomes.
Les fractions comprises entre les deux pics ont été analysées par microscopie électronique. On y trouve peu d' exosomes avec un bruit de fond plus important que dans le pic 1.
Le pic 2 est très semblable aux fractions comprises entre les deux pics, on retrouve peu d'exosomes et bruit de fond plus important.
~s Conclusions La Source 15Q est capable de retenir les exosomes et de les séparer de contaminants éventuels (fig.9). La très grande majorité des exosomes est éluée dans un même pic à 350 mM NaCI. En microscopie électronique les exosomes apparaissent 20 «normaux» avec un marquage spécifique des molécules du CMH II humain.
L'hétérogénéité de la taille des exosomes (pic 1) semble indiquer que la séparation est basée sur des échanges ioniques et non sur un tamisage. Le Source 15Q peut donc être utilisé comme étape de purification des exosomes de RBL.
Claims (25)
1. Procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions fort.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et de perméation de gel.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un fluide biologique, un surnageant de culture, un lysat cellulaire ou une solution prépurifiée.
5. Procédé de préparation de vésicules membranaires à partir d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins:
b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) une étape d'enrichissement de l'échantillon en vésicules membranaires, et, c) une étape de traitement de l'échantillon par chromatographie d'échange d'anions et/ou par chromatographie de perméation de gel.
7. Procédé selon les revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de clarification, éventuellement suivie d'une étape de concentration.
8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de chromatographie d'affinité, de préférence sur colorant.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend une étape de centrifugation à faible vitesse et/ou une filtration.
10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement comprend au moins une étape d'ultrafiltration, notamment tangentielle.
11. Procédé de préparation de vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel.
a) la culture d'une population de cellules productrices de vésicules membranaires (e.g. d'exosomes) dans des conditions permettant la libération des vésicules, b) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires (e.g. en exosomes) par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et c) une étape de traitement de l'échantillon biologique par chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d) de filtration du matériel récolté.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce que les vésicules membranaires possèdent un diamètre compris entre 60 et 90 nm environ.
en ce que les vésicules membranaires possèdent un diamètre compris entre 60 et 90 nm environ.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages ou des mastocytes.
en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes B, des macrophages ou des mastocytes.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules dendritiques, notamment humaines.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les vésicules membranaires sont des vésicules produites par des cellules tumorales, notamment humaines.
17. Procédé de préparation de vésicules membranaires caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires et, c) la purification des vésicules membranaires par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires et, c) la purification des vésicules membranaires par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions.
18. Procédé de préparation de vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'obtention d'une population de cellules dendritiques, b) la culture des cellules dendritiques dans des conditions permettant la production de vésicules membranaires, c) le traitement du surnageant de culture pour produire un échantillon biologique enrichi en vésicules membranaires, notamment par une étape d'ultrafiltration ou de chromatographie d'affinité au moins, et, d) la purification des vésicules membranaires par un procédé comprenant au moins une étape de chromatographie d'échange d'anions et/ou de perméation de gel.
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont obtenues à partir d'un échantillon biologique provenant d'un sujet, par exemple de moelle osseuse ou de sang périphérique.
20. Procédé selon les revendications 17 à 19, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont immatures.
21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont sensibilisées à un antigène, préalablement à la production des vésicules membranaires.
22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que, au cours de l'étape b), les cellules dendritiques sont cultivées dans des conditions stimulant la production des vésicules membranaires.
23. Utilisation de la chromatographie d'échange d'anions pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
24. Utilisation de la chromatographie d'affinité pour la préparation ou la purification de vésicules membranaires.
25. Composition comprenant des vésicules membranaires préparées par le procédé
selon l'une des revendications 1 à 22.
selon l'une des revendications 1 à 22.
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