BRPI0806436A2

BRPI0806436A2 - modificação de componentes exossomais para uso como uma vacina

Info

Publication number: BRPI0806436A2
Application number: BRPI0806436-9A
Authority: BR
Inventors: D Douglas; Cicek Gercel-Taylor
Original assignee: Univ Lousville Res Foundation Inc
Priority date: 2007-01-26
Filing date: 2008-01-28
Publication date: 2011-09-06
Also published as: US8455188B2; AU2008207735A1; ZA200905005B; AU2008207735B2; CN101641010A; WO2008092153A3; EP2117305A2; CA2676143A1; JP2010516786A; US20100092524A1; IL200027A0; WO2008092153A2; EP2117305A4

Abstract

MODIFICAçãO DE COMPONENTES EXOSSOMAIS PARA USO COMO UMA VACINA. O assunto aqui revelado provê exossomas derivados de células modificadas substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores. O assunto revelado aqui provê ainda métodos de produção de exossomas modificados e métodos para uso de exossomas modificados para tratamento de cânceres.

Description

"MODIFICAÇAO DE COMPONENTES EXOSSOMAIS PARA USO COMO UMA VACINA"

DESCRIÇÃO

PEDIDOS RELACIONADOS

O assunto revelado aqui reivindica o beneficio do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Número de Série 60/897.645, depositado em 26 de janeiro de 2007; a revelação do qual está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

INTERESSE GOVERNAMENTAL

Este assunto revelado aqui foi desenvolvido parcialmente com o suporte do Governo Norte-Americano sob a Concessão Número HD042674 concedida ao "National Institute for Child Health and Health Development (NIH)". Dessa maneira, o Governo Norte-Americano tem certos direitos no assunto revelado aqui.

CAMPO TÉCNICO

O assunto revelado aqui se refere a exossomas modificados para uso como vacinas. Em especial, o assunto revelado aqui se refere à utilização de exossomas produzidos de células modificados para substancialmente não terem um ou mais polipeptideos imunossupressores e a métodos para produção e uso dos exossomas como vacinas e tratamentos de distúrbios, incluindo cânceres.

HISTÓRICO

O câncer é a segunda maior causa de morte nos Estados Unidos (EUA). Em 1999 ocorreram 563.100 mortes por câncer e cada ano aproximadamente 1.222.000 novos casos de câncer são diagnosticados. Entre estes, cânceres de tumores sólidos tais como cânceres do pulmão, mamas, próstata e cânceres colorretais são os mais comuns. Por exemplo, câncer ovariano permanece a quarta maior causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres, resultando em mais que 26.700 novos casos e 14.800 mortes anualmente nos Estados Unidos da América.

Apesar das respostas iniciais antitumor encorajadoras, quimioterapia citotóxica convencional falha na cura da maioria dos pacientes com câncer ovariano em estágio avançado. Com a emergência da resistência ao medicamento em tumores refratários, estratégias de tratamento imunológico foram exploradas.

Anticorpos monoclonais foram desenvolvidos para tipos específicos de cânceres. HERCEPTIN® (Trastuzumab), RITUXAN® (rituximab), e CAMPATH® (alemtuzumabe) foram sucessos clínico e comercial. Mas estes medicamentos provêem apenas tratamento passivo sem recrutamento de participação construtiva do sistema imunológico hospedeiro. Eles também excluem o que pode ser o mecanismo efetor imunológico mais potente para causar regressão de tumor: o compartimento de linfócito T citotóxico (CTL).

Esforço considerável está em andamento em laboratórios em todo o mundo para encontrar uma vacina ativa que supere a tolerância natural dos auto-antígenos, e incluam uma resposta antitumor forte.

Vacinas de peptídeo foram desenvolvidas com base em antígenos associados a tumor como antígeno carcinoembriônico (CEA) ou gplOO, algumas vezes com intensificação de epítopo para intensificar a imunogenicidade (S.A.Rosenberg et al. , Nat. Med. 4:321, 1998). Citocinas, quimiocinas, ou moléculas co- estimuladoras foram usadas como adjuvantes potenciais (J.A. Berzofsky et al., Nat. Rev. liamunol. 1:209, 2001; J.D. Ahlers et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 99:13020, 2002). Resposta imunológica ativa a antigeno de tumor foi também obtida em pacientes de câncer usando anticorpos anti-idiotipos, feitos para imitar o antigeno alvo enquanto propiciam imunogenicidade adicional (Patentes Norte-Americanas Números 5.612.030 e 6.235.280). Vetores de ácido nucléico baseados em adenovirus, vacinia, e avipox codificando estes como CEA ou antigeno especifico da próstata (PSA) estão também em testes clínicos (J.L. Marshall et al., J. Clin. Oncol. 18:3964, 2000; M.Z.Zhu et al. , Clin. Câncer Res. 6:24, 2000; I.M. Belyakov et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:4512, 1999).

Vacinas de células de tumor foram também baseadas em células de tumor extraídas tanto do paciente sob tratamento, ou de uma fonte autóloga que tenha um perfil similar de antígenos de tumor. Elas são geneticamente modificadas para expressar uma citocina como GM-CSF ou IL-4 que é considerada para recrutar o sistema imunológico do hospedeiro (J.W. Simons et al, Câncer Res. 59:5160, 1999; R. Soiffer et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13141, 1998; E. M. Jaffee et al. , J. Clin. Oncol. 19:145, 2001; R. Salgia et al., J. Clin. Oncol. 21:624, 2003). Vacinas de célula de tumor transfectadas estão em ensaios clínicos de último-estágio para câncer da próstata, câncer do pulmão, câncer pancreático, e leucemia (R. Salgia et al. , J. Clin. Oncol. 21:624, 2003; K.M. Hege et al. , Lung Câncer 41:S103, 2003).

Uma versão melhorada desta abordagem é isolar as células de tumor do próprio paciente, e combiná-las com uma linha de célula transfectada para expressão de uma citocina como GM-CSF na forma de membranas (Patente Norte-Americana Número 6.277.368). As células transfectadas recrutam o sistema imunológico do hospedeiro, que, então, inicia uma resposta CTL contra as células do tumor como espectadoras. Um outro tipo de vacina celular compreende as células de tumor de um paciente combinadas com linfócitos T aloativados, que novamente têm o papel de recrutar o sistema imunológico hospedeiro (Patentes Norte-Americanas Números 6.136.306; 6.203.787; e 6.207.147).

Devido ao fato das células dendriticas terem um papel central na apresentação do antigeno de tumor para preparar o compartimento CTL, existe um interesse considerável na pesquisa de células dendriticas autólogas como uma vacina de tumor (G. Schuler et al. , Curr. Opin. Immunol. 15:138, 2003; J.A. Berzofsky et al. , J. Clin. Invest. 113:1515, 2004). Testes clínicos foram baseados nas células dendriticas de duas origens: a) precursores DC purificados de sangue periférico (L. Fong & E. G. Engleman, Annu. Rev. Immunol. 15:138, 2003); e b) diferenciação ex-vivo de DCs de monócitos de sangue periférico (F. Sallusto et al., J. Exp. Med. 179, 1109, 1994) ou células progenitoras hematopoiéticas CD34+ (J. Banchereau et al., Câncer Res. 61:6451, 2001; A. Makensen et al., Int. J. Câncer 86:385, 2000).

D. Boczkowski et al. (J. Exp. Med. 184:465, 1996) relataram que células dendriticas pulsadas com RNA podem agir como células apresentando antigeno in vitro e in vivo. S. K. Nair et al. (Eur. J. Immunol. 27:589, 1997) relataram que células apresentando antígenos pulsadas com peptídeos derivados de tumor não fracionados podem agir como vacinas de tumor. F. 0. Nestle et al. (Nat. Med. 4:328, 1998) relataram vacinação de pacientes de melanoma com células dendriticas pulsadas de peptideo ou lisato de tumor. B. Thurner et al. (J. Exp. Med. 190:16169, 1999) relataram vacinação com células dendriticas pulsadas com peptideo mage-3Al em melanoma de Estágio IV. L. Fong et al. (J. Immunol. 167:7150, 2001) descreveram vacinação de xenoantigeno baseado em célula dendritica para imunoterapia de câncer da próstata.

A. Heiser et al. (Câncer Res. 61:338, 2001; J. Immunol. 166:2953, 2001) relataram que células dendriticas humanas transfectadas com RNA de tumor renal estimulam respostas de célula T policlonais contra antigenos expressos por tumores primários e metastáticos. C. Milazzo et al. (Blood 101:977, 2002) relataram a indução de células T citotóxicas especificas para mieloma usando células dendriticas transfectadas com RNA derivado de tumor. Z. Su et al. , (Câncer Res. 63:2127, 2003) relataram respostas imunológicas e clinicas em pacientes de câncer renal metastático vacinados com células dendriticas transfectadas com RNA de tumor.

Imunoterapia baseada em exossoma tem, também, atraído recentemente muita atenção, visto que exossomas derivados de tumor são fontes ricas de antigenos de rejeição de tumor partilhados para preparação (xPriming') cruzada de CTL. Para imunoterapia, exossomas de tumor são usualmente carregados em células dendriticas antes da administração in vivo. Novas abordagens para desviar carga de antigeno no DC tanto in vivo quanto in vitro têm sido investigadas; entretanto, até o momento, não existem relatórios com referência a modificação dos próprios exossomas para melhorar o efeito antitumor de imunoterapia baseado em exossoma. Embora exossomas de tumor pareçam ser enriquecidos em alvos antigênicos potenciais, eles também expressam atividades imunossupressoras e apoptogênicas. Como um resultado, imunoterapia baseada em exossoma para cânceres humanos sólidos tem exibido, no máximo, sucesso estatístico marginal.

Infelizmente, poucos tratamentos imunológicos explorados até agora atingiram uma freqüência elevada de remissões completadas confirmadas patologicamente, devido, em grande parte, à presença de um microambiente de tumor imunossupressor. Como tal, embora imunoterapias tenham o potencial para especificamente atingir e eliminar tecidos doentes, incluindo cânceres, existe ainda uma necessidade não obtida na técnica para novas imunoterapias que possam superar as defesas imunossupressoras de tecidos alvos.

SUMÁRIO

Este Sumário lista várias configurações do assunto presentemente revelado, e em muitos casos lista variações e permutações destas configurações. Este Sumário é meramente exemplificativo das numerosas e variadas configurações. A menção de uma ou mais características representativas de uma configuração dada é similarmente exemplificativa. Esta configuração pode tipicamente existir com ou sem a(s) característica(s) mencionada(s); similarmente, aquelas características podem ser aplicadas a outras configurações do assunto presentemente revelado, se listadas neste Sumário ou não. Para evitar excessiva repetição, este Sumário não lista ou sugere todas as combinações possíveis destas características.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um exossoma isolado de uma célula. O exossoma compreende um ou mais antigenos e substancialmente não tem a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores normalmente encontrados no exossoma. Em algumas configurações, a célula foi modificada para inibir a expressão do referido um ou mais polipeptideos imunossupressores. Em algumas configurações, o exossoma compreende ainda um ou mais antigenos exógenos.

Em algumas configurações, a célula foi modificada para compreender um ou mias polinucleotideos inibidores que especificamente inibem a expressão do referido um ou mais polipeptideos imunossupressores. Em algumas configurações, o referido um ou mais polinucleotideos inibidores compreende polinucleotideos siRNA.

Em algumas configurações, a célula é uma célula cultivada. Em algumas configurações, a célula é uma célula cancerígena, tal como, por exemplo, uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula de câncer pancreático. Em algumas configurações, a célula é uma célula UL-1, uma célula UL- 2, uma célula UL-3, ou uma célula UL-6.

Em algumas configurações, o referido um ou mais antigenos são antigenos de célula cancerígena. Em algumas configurações, o antígeno de célula de câncer pode ser p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1, cerB/HER2, NY-ESO-1, SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-I ou c-myc. Em algumas configurações, o referido um ou mais polipeptídeos imunossupressores são selecionados do grupo consistindo de FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7-H3, B7-H4, e combinações destes.

Em algumas configurações, o referido um ou mais antigenos exógenos compreendem superantigenos. Em algumas configurações, os superantigenos podem ser enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da síndrome de choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-I), uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), ou um superantígeno estreptocócico (SSA).

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provida uma célula que produz os exossomas revelados aqui.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provida uma composição compreendendo um exossoma revelado aqui e um veiculo farmacêutico.

Adicionalmente, o assunto presentemente revelado provê, em algumas configurações, um método de produção de um exossoma revelado aqui substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores. Em algumas configurações, o método compreende prover uma célula que pode produzir exossomas; inibindo a expressão pela célula de um ou mais polipeptídeos imunossupressores; e isolando exossomas produzidos pela célula, onde os exossomas substancialmente não têm a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores. Em algumas configurações, o método compreende ainda decorar os exossomas com um ou mais antigenos exógenos. Em algumas configurações do método, o isolamento dos exossomas compreende a colheita em um meio, no qual as células são cultivadas.

Ainda adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método de tratamento de câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma revelado aqui, que é produzido por uma célula de câncer, a um indivíduo em necessidade deste. 0 exossoma pode compreender um ou mais antígenos de câncer e substancialmente não têm a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores. Em algumas configurações, o câncer tratado é um tumor sólido. Em algumas configurações, o câncer tratado é uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula de câncer pancreático. Em algumas configurações, o exossoma é administrado intravenosamente, intratumoralmente, subcutaneamente, transdermicamente, ou intraperitonealmente. Em algumas configurações, o exossoma compreende um ou mais antígenos exógenos, tais como, por exemplo, superantígenos. Em algumas configurações, o indivíduo é um mamífero.

Ainda adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, um método de estimulação de uma resposta imunológica em um indivíduo contra um ou mais antígenos é provido. Em algumas configurações, o método compreende a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma revelado aqui, que é produzido por uma célula e compreendendo um ou mais antígenos a um indivíduo em necessidade deste. Em algumas configurações, o exossoma substancialmente não tem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores.

Consequentemente, é um objetivo do assunto presentemente revelado, prover exossomas modificados e métodos para usar os exossomas modificados para tratar distúrbios, incluindo cânceres. Este objetivo é atingido total ou parcialmente pelo assunto presentemente revelado.

O objetivo do assunto presentemente revelado que foi apresentado aqui acima,' e que é atingido total ou parcialmente pelo presente assunto revelado, outros objetivos e vantagens se tornarão evidentes aos técnicos no assunto após um estudo da descrição a seguir do assunto presentemente revelado, figuras, e exemplos não limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma fotografia mostrando a expressão de ligante Fas (FasL) por quatro (4) linhas de célula de tumor ovariano (UL1, UL2, UL3, e UL6) . As linhas de célula foram tanto tratadas com siRNA falso ou tratadas com primers de siRNA específicos para FasL. A expressão de FasL foi também analisada na expressão de FasL em exossomas derivados de tumor de células tratadas com siRNA. Os níveis de fosfatase alcalina placentária (PLAP) foram determinados como um controle para proteínas não afetadas. Os géis definem a expressão por imunomácula ocidental.

A Figura 2 é um par de fotografias de géis mostrando as conseqüências de exossomas derivados de tumor co- incubados com células T na expressão das proteínas de transdução de sinal de ativação essenciais, CD3zeta e JAK3. Os géis definem a expressão das moléculas de sinalização por imunomácula ocidental.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os detalhes de uma ou mais configurações do assunto presentemente revelado são definidos na descrição abaixo. Outras características, objetivos, e vantagens do assunto presentemente revelado ficarão aparentes a partir da descrição detalhada, figuras e reivindicações. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Algumas das seqüências de polinucleotídeo e polipeptídeo reveladas aqui são relacionadas de forma cruzada aos números de acesso GENBANK®. As seqüências relacionadas de forma cruzada ao banco de dados GENBANK® são expressamente incorporadas por referência, visto que são seqüências equivalentes e relacionadas presentes no GENBANK® ou em outros bancos de dados públicos. Também, expressamente incorporadas aqui por referência estão todas as anotações presentes no banco de dados GENBANK® associadas com as seqüências reveladas aqui. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá.

De acordo com a convenção da lei de patentes já de longa data, os termos "um", e "o" significam "um ou mais" quando usados neste pedido, incluindo nas reivindicações.

A menos que mencionado de forma contrária, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante, usados na especificação e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "aproximadamente". Consequentemente, a menos que indicado o contrário, os parâmetros numéricos definidos nesta especificação e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas pelo assunto presentemente revelado.

Conforme usado aqui, o termo "aproximadamente", quando se refere a um valor ou a uma quantidade de massa, peso, tempo, volume, concentração ou porcentagem, objetiva abranger variações, em algumas configurações, de ±20%, em algumas configurações ±10%, em algumas configurações, ±5%, em algumas configurações ±1%, em algumas configurações ±0,5%, e em algumas configurações ±0,1 da quantidade especificada, visto que estas variações são apropriadas para aplicar o método revelado.

A menos que definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido para os técnicos no assunto à qual o assunto presentemente revelado pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos, e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste do assunto presentemente revelado, métodos, dispositivos, e materiais representativos são agora descritos.

Uma característica geral de tipos de célula ativados, incluindo linfócitos, células dendríticas, e células embriônicas, é sua capacidade para liberar material de membrana vesicular (denominado microvesícuias ou exossomas). A liberação de exossomas parece ser uma característica importante de comunicação intercelular. Exossomas de células imunológicas ativadas modulam funções de linfócito e célula dendrítica pelo surgimento de "morte de célula induzida por ativação" (AICD). Linfócitos e células dendríticas parecem liberar exossomas após ativação e estes parecem ter um papel essencial na regulagem imunológica, impedindo respostas imunológicas excessivas, e o desenvolvimento de auto- imunidade. Células cancerígenas têm também demonstrado a liberação de exossomas. Entretanto, em contraste com exossomas de célula imune, exossomas de célula cancerígena podem constituir um fac- símile do caminho do exossoma de célula imune que pode realmente circundar a investigação imunológica e o reconhecimento do tumor pelo sistema imunológico através da inclusão de polipeptídeos imunossupressores nos exossomas de célula de câncer. A produção de exossomas pelas células de câncer pode ajudar a explicar porque muitas imunoterapias direcionadas para cânceres não foram tão terapeuticamente efetivas quanto desejado. Em especial, a presença de polipeptídeos imunossupressores dentro de exossomas derivados de câncer pode inibir o uso efetivo de tratamentos de câncer de exossoma imunoterapêutico por meio de amortecimento das respostas imunológicas desejadas em indivíduos em necessidade de tratamento.

O assunto presentemente revelado provê pelo menos duas abordagens inovadoras para melhorar exossomas para uso em um sistema de administração de antígeno de tumor terapêutico. Primeiramente, um ou mais polipeptídeos imunossupressores podem ser suprimidos de expressão e/ou removidos de exossomas derivados das células, por exemplo, células de câncer. Em algumas configurações, supressão de siRNA é utilizada para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais polipeptídeos imunossupressores derivados de tumor. Em segundo lugar, exossomas do assunto presentemente revelado podem ser modificados para compreender um ou mais antígenos exógenos (por exemplo, "superantígenos") para intensificar a atividade de estimulação de célula T dos exossomas. Em algumas configurações, técnicas de transferência de proteína podem ser utilizadas para introduzir os antígenos exógenos nos exossomas.

O uso de supressão de siRNA provê a supressão seletiva de polipeptídeos imunossupressores, enquanto mantém natureza de antigeno de tumor enriquecido de exossomas de tumor. Para intensificar adicionalmente o caráter imunogênico de exossomas de tumor, transferência de proteína pode ser usada para expressar proteínas alvo (por exemplo, superantígenos) na superfície da célula. Por exemplo, enterotoxina estafilocócica A (SEA) é um superantígeno com atividade de estimulação de célula T potente, que forma complexos com moléculas DC MHC de classe II. Estudos anteriores demonstraram que células de tumor ancoradas por SEA podem induzir uma resposta imunológica antitumor. Visto que exossomas são microvesículas enriquecidas com antigeno de tumor, exossomas são alvos ideais para transferência de proteína.

Os exossomas terapêuticos novos revelados aqui combinam ancoragem de proteína alvo para direcionamento de sistema imunológico intensificado e redução ou eliminação de uma ou mais moléculas imunossupressoras, tais como polipeptídeos imunossupressores (por exemplo, por técnicas de supressão de siRNA), normalmente encontradas nas exossomas produzidas naturalmente. Estes exossomas imunoterapêuticos novos provêem ferramentas ideais para induzir regressão de tumores estabelecidos, assim como para a prevenção de desenvolvimento inicial de tumor. Ambas as células T CD4+ e CD8+ demonstraram proliferar em resposta a SEA, resultando na produção aumentada de citocinas tais como IFN-y e IL-2. O uso de exossomas ricos em antigeno de câncer provê ainda a especificidade necessária de uma terapia eficiente. Os exossomas derivados de tumor revelados presentemente superficialmente ancorados com superantigenos exógenos e modificados para não terem polipeptideos imunossupressores podem induzir resposta Thl e CTL especifica a tumor mais eficientemente que qualquer abordagem atual.

Como tal, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, um exossoma isolado de uma célula que produz o exossoma é provido. Em algumas configurações, o exossoma compreende um ou mais antigenos de interesse e substancialmente sem a presença de uma ou mais moléculas imunossupressoras que, por outro lado, seriam encontradas no exossoma, incluindo na superfície do exossoma, quando produzido pela célula. Em algumas configurações, a molécula imunossupressora é um miRNA ou um polipeptideo.

O termo "isolado", quando usado no contexto de uma molécula de DNA isolada ou um polipeptideo isolado, é uma molécula de DNA ou polipeptideo que, pelas mãos do homem, existe independentemente de seu ambiente nativo e não é, portanto, um produto da natureza. Uma molécula de DNA isolada ou polipeptideo pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira transgênica.

Os termos "polipeptideo", "proteína", e "peptídeo", que são usados de forma intercambiável aqui, se referem a um polímero de 20 aminoácidos de proteínas, ou análogos de aminoácidos, independentemente de seu tamanho ou função. Embora "proteína" seja freqüentemente usada em referência a polipeptideos relativamente grandes, e "peptídeo" seja freqüentemente usado em referência à polipeptideos pequenos, o uso destes termos na técnica se sobrepõe e varia. 0 termo "polipeptídeo" conforme usado aqui se refere a peptideos, polipeptideos, e proteínas, a menos que mencionado o contrário. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados de forma intercambiável aqui quando se refere a um produto de gene. Dessa maneira, polipeptideos exemplificativos incluem produtos de gene, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, e análogos dos anteriores.

Exossomas são vesículas de origem endossomal que são secretadas no meio extracelular após fusão de corpos multivesiculares endossomais tardios com a membrana plasmática. Células de vários tipos de tecido demonstraram secretar exossomas, tais como células dendríticas, linfócitos B, células de tumor e mastócitos, por exemplo. Exossomas de diferentes origens exibem conjuntos discretos de proteínas e porções de lipídeo. Eles notavelmente contêm proteínas envolvidas na apresentação de antígeno e imunomodulação, sugerindo que exossomas têm um papel na comunicação entre as células que conduz à modulação de respostas imunológicas. Na verdade, exossomas de células dendríticas (CD) pulsadas com peptideos derivados de antígenos de tumor fazem surgir respostas antitumor em modelos de animal usando o tumor correspondente. Entretanto, exossomas derivados de células de câncer compreendendo antígenos de câncer demonstraram compreender polipeptideos imunossupressores, tornando exossomas derivados de tumor não modificados indesejáveis e potencialmente inseguros para uso direto em vacinas. Os exossomas do assunto presentemente revelado são bem adequados para a produção de antígenos que podem estimular respostas imunológicas desejáveis em indivíduos devido ao fato de serem produzidos por células, ao invés de sintetizados artificialmente e, portanto, proverem antigenos que são "naturais". Isto é, os antigenos produzidos pelas células e encontrados no exossoma podem ser peptideos de comprimento total que são processados (por exemplo, glicosilados, etc.) e dobrados pela célula até uma extensão similar aos antigenos experimentados pelas células imunológicas em um indivíduo. Como tal, os antígenos de exossoma podem ser utilizados em vacinas ou tratamentos contra, por exemplo, cânceres. Em algumas configurações, portanto, o referido um ou mais antígenos podem, cada um, compreender um antígeno de célula de câncer. Como exemplos não limitativos, o antígeno de célula de câncer pode ser fosfatase alcalina do tipo placentário, p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1, cerB/HER2, NY-ESO-1, SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-1, e c-myc.

Conforme observado, em algumas configurações, os exossomas são modificados de modo que eles substancialmente não têm a presença de uma ou mais moléculas imunossupressoras, tais como miRNAs ou polipeptídeos imunossupressores. Um "polipeptídeo imunossupressor" é um polipeptídeo que reduz uma reação imunológica normal por um sistema imunológico de um indivíduo a um antígeno específico. Por exemplo, foi demonstrado que exossomas liberados por células de tumor podem suprimir respostas imunológicas em um indivíduo e podem induzir apoptose em linfócitos devido à presença de moléculas imunossupressoras nos exossomas, incluindo polipeptideos imunossupressores. Vide Taylor & Gercel-Taylor (British Journal of Câncer (2005) 92:305-311, incorporado aqui por referência em sua totalidade). "Moléculas imunossupressoras" exemplificativas incluem, mas não se limitam a microRNAs e polipeptideos imunossupressores, tais como, por exemplo, FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7-H3, B7-H4, e combinações destes.

O termo "substancialmente sem a presença", conforme usado aqui e com relação a moléculas imunossupressoras, se refere à remoção seletiva de substancialmente todas ou pelo menos de uma proporção significativa de uma ou mais moléculas imunossupressoras resultando em um exossoma que apresente uma redução significativa ou substancialmente não tenha a presença de uma ou mais moléculas imunossupressoras selecionadas. 0 termo "significativamente reduzido" se refere a um resultado que é reduzido em mais que a margem de erro inerente à técnica de medição, quando comparando o exossoma modificado com um exossoma similar produzido por uma célula comparável sob condições, por outro lado, comparáveis. Em algumas configurações, uma diminuição na presença no exossoma modificado de uma molécula imunossupressora selecionada especifica em aproximadamente 10% ou mais em relação à presença na linha de base. Em algumas configurações uma diminuição na ativação ou atividade de aproximadamente 20% ou maior, em algumas configurações uma diminuição na ativação ou atividade de aproximadamente 25% ou maior, e em algumas configurações uma diminuição na ativação ou atividade de aproximadamente 50% ou maior é uma presença significativamente reduzida da molécula imunossupressora. Em algumas configurações, um exossoma que substancialmente não tenha a presença de uma ou mais moléculas imunossupressoras selecionadas exibe capacidade imunossupressora mensuravelmente reduzida (se comparado com a capacidade imunossupressora de um exossoma não modificado comparável) ou capacidade ausente para suprimir um ou mais componentes de um sistema imunológico de animal. A capacidade imunossupressora de exossomas pode ser medida usando qualquer um dos vários ensaios in vitro e in vivo, geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, e conforme descrito em detalhe nos Exemplos, a expressão de proteínas específicas associadas com a ativação da célula T pode ser medida e correlacionada com atividade imunossupressora (ou falta desta) em exossomas co-incubados com as células T.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, o exossoma compreende ainda um ou mais antígenos exógenos. Um "antígeno exógeno", como o termo é usado aqui, se refere a um polipeptídeo antigênico que não é tipicamente codificado e/ou expresso na célula de produção do exossoma, e, portanto, não é um polipeptídeo nativo da célula ou exossoma e, assim, tipicamente não é encontrado nos exossomas produzidos pela célula. 0 termo "nativo" se refere a um polipeptídeo que é codificado por um gene nativo de um genoma de célula não transformada e está, portanto, naturalmente presente na célula quando expressa.

Polipeptídeos exógenos podem ser incluídos nos exossomas por uma variedade de métodos conhecidas na técnica. Por exemplo, polipeptídeos exógenos podem ser decorados na superfície dos exossomas após eles serem excretados pelas células usando técnicas de transferência de proteína geralmente conhecidas daqueles com especialização na técnica. Vide, por exemplo, Nagarajan S, Selvaraj P., "Glycolipid-anchored IL-12 expressed on tumor cell surface induces antitumor immune response". Câncer Res. 2002; 62:2869-74; McHugh RS, Nagarajan S, Wang Y, Sell KW, Selvaraj P, "Protein transfer of glycosyl-phosphatidylinositol-B7- 1 into tumor cell membranes: a novel approach to tumor immunotherapy", Câncer Res. 1999; 59: 2433-7; e Huang C, Yu H, Wang Q, Yang G, Ma W, Xia D, Chen X, Yi P, Shen F, Zheng H, Cao X. "A novel antitumor approach: SEA-anchored tumor cells expressing heat shock protein 70 onto the surface elicit strong antitumor efficacy", Immunol. Lett. 2005; 101:71-80.

Adicionalmente, polipeptídeos exógenos podem ser incorporados em exossomas usando técnicas de expressão recombinante. Exossomas recombinantes foram descritos na técnica, que derivam de células transfectadas com plasmídeos codificando os polipeptídeos recombinantes. Estes exossomas recombinantes contêm o peptídeo recombinante codificado por plasmídeo (vide, por exemplo, Pedido PCT Publicado Número WO 00/28001, incorporado aqui por referência).

Polipeptídeos exógenos que podem ser incorporados em exossomas do presente assunto são polipeptídeos que podem prover funcionalidade adicional desejada para os exossomas, tal como, por exemplo, polipeptídeos, que provêem propriedades imunogênicas aumentadas ao exossomas. Por exemplo, em algumas configurações, "superantígenos" (SAgs) podem ser incorporados nos exossomas. SAgs podem compreender um grupo de proteínas bacterianas e virais que são extremamente eficientes na ativação de uma grande fração da população de célula T. SAgs podem se ligar diretamente ao principal complexo de histocompatibilidade (MHC) sem serem processados. Na verdade, SAgs podem se ligar não processados fora do entalhe de ligação de antigeno nas moléculas MHC de classe II, portanto evitando a maioria do poliformismo no local de ligação de peptídeo convencional. 0 mecanismo de ligação depende da ligação de SAgs ao receptor da célula T (TCR) na cadeia νβ, ao invés de ligação às alças hipervariáveis do receptor de célula T (TCR).

Exemplos de superantígenos que podem ser incorporados nos exossomas como polipeptídeos exógenos incluem, mas não se limitam a enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da síndrome de choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-I), uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), e um superantígeno estreptocócico (SSA) . SEs são um grupo homólogo de superantígenos, com relação tanto à estrutura quanto à função. Em configurações específicas, o polipeptídeo exógeno é enterotoxina estafilocócica A (SEA) ou enterotoxina estafilocócica E (SEE). Vide, por exemplo, números de Acesso do GENBANK® AY291443 a AY291450 e BR Singh e MJ Betley. "Comparative structural analysis of staphylococcal enterotoxins A and E". J. Biol. Chem., 264, 4404-4411, 1989), e a tabela a seguir. <table>table see original document page 23</column></row><table>

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provida uma célula que produz os exossomas revelados aqui. Em algumas configurações, a célula é uma célula cultivada, isto é, uma célula propagada ex vivo em meio de cultura. A célula de cultura pode ser imortalizada para facilitar propagação continua. Em algumas configurações, a célula é uma célula cancerígena, tal como, por exemplo, uma célula de câncer originalmente isolada de um tumor e, então, propagada na cultura, como é geralmente conhecido na técnica. Em algumas configurações, a célula de câncer pode ser uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula de câncer pancreático. Em configurações específicas, a célula é uma linha de célula cultivada selecionada do grupo consistindo de uma célula UL-I, uma célula UL-2, uma célula UL-3, e uma célula UL-6. Todas estas linhas de célula de tumor ovariano humano primário foram estabelecidas em nosso laboratório, de mulheres com adenocarcinoma de cisto Estágio IIIc do ovário (designado UL-I, UL-2, UL-3, e UL- 6). UL-2 e UL-3 foram derivados de câncer ovariano hereditário, enquanto UL-1 e UL-6 foram derivados de cânceres espontâneos. Células UL-1 foram derivadas de uma mulher de 63 anos de idade, as células UL-2 foram derivadas de uma mulher de 34 anos, as células UL-3 foram derivadas de uma mulher de 42 anos, e as células UL-6 foram derivadas de um paciente do sexo feminino de 72 anos. Estas linhas de célula são tumorigênicas em camundongos pelados, fazendo surgir tumores que são consistentes com adenocarcinomas de cisto. Estas linhas de célula são todas positivas para EpCAM, PLAP, FasL PD-Ll e MHC classe II. Para revelação adicional destas linhas de célula exemplificativas, vide Gibb, R.K., et al. "Apoptosis as a measure of chemosensitivity to cisplatin and Taxol therapy in ovarian câncer cell lines". Gynecologic Oncology, 65:13-22, 1997; Chinni et al. "Cathepsin D and glucose-regulated protein 78 recognized by the humoral response of ovarian câncer patients". Clinicai Câncer Research, 3:1557-1564, 1997; Bazzett et al. "Modulation of proliferation and chemosensitivity by procathepsin D in ovarian câncer". Gynecologic Oncology, 74:181-187, 1999; e Makhija et al. "Regulation of Chemotherapy induced apoptosis in ovarian câncer cell spheroids". International Journal of Oncology, 14:515-521, 1999; cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, uma composição farmacêutica é provida compreendendo um exossoma revelado aqui e um veiculo farmacêutico. Em algumas configurações, a composição farmacêutica é farmaceuticamente aceitável em humanos. A composição farmacêutica pode ser formulada como uma composição terapêutica para administração a um indivíduo em algumas configurações. Uma composição farmacêutica conforme descrito aqui preferivelmente compreende uma composição que inclui veiculo farmacêutico tal como soluções para injeção não-aquosas e aquosas estéreis que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, antibióticos bactericidas e solutos que tornam a formulação isotônica com os fluidos corporais do recipiente pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis, que podem incluir agentes em suspensão e agentes espessantes.

As composições farmacêuticas usadas podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.

As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenados em uma condição de congelamento ou seca por congelamento (Iiofilizada) que requer apenas a adição do veiculo liquido estéril imediatamente antes do uso.

Preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Estas preparações líquidas podem ser preparadas por técnicas convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas) ; agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etilico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampão, aromatizantes, corantes e agentes adoçantes conforme apropriado. Preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para prover liberação controlada do composto ativo. Para administração oral, as composições podem tomar a forma de cápsulas, tabletes ou losangos formulados da maneira convencional.

As composições podem também ser formuladas como uma preparação para implantação ou injeção. Dessa maneira, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados limitadamente solúveis (por exemplo, como um sal pouco solúvel).

Os compostos podem também ser formulados em composições retais (por exemplo, supositórios ou enemas de retenção contendo bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicerideos), cremes ou loções, ou adesivos transdérmicos.

Além dos exossomas compreendendo um ou mais antigenos e peptideos exógenos dentro dos exossomas, outros componentes, tais como um veiculo para administração de exossoma e substâncias imunoestimulatórias adicionais dentro do veiculo designadas para intensificar a imunogenicidade do polipeptideo podem ser incluídos na composição farmacêutica. As composições imunogênicas e vacinas de acordo com o assunto presentemente revelado podem, ainda, compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados para uso na prática do presente assunto incluem, mas não se limitam a (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maléico e polímeros derivados de alquenila, (2) seqüências imunoestimulantes (ISS) , tais como seqüências de oligodesoxirribonucleotídeo tendo uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; W098/16247), (3) um óleo em emulsão de água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lipídeos de cátion contendo um sal de quaternário de amônio, (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou (7) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência a este presente pedido, ou (8) quaisquer combinações ou misturas destes.

A emulsão de óleo em água (3) pode ser baseada em: óleo de parafina líquido leve (Tipo Farmacopéia Européia) , óleo isoprenóide tal como esqualano, esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alquenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou álcoois tendo grupo alquila de cadeia reta, tais como óleos vegetais, oleato de etila, propilenoglicol, di(caprilato/caprato), glicerol tri(caprilato/caprato) e dioleato de propilenoglicol, ou ésteres de álcoois ou ácidos graxos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico. 0 óleo pode ser usado em combinação com emulsificantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser surfactantes não iônicos, tais como: ésteres de, por um lado, sorbitan, mannide (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidos oléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, os ésteres sendo opcionalmente etoxilados, ou blocos de copolimero de polioxipropileno / polioxietileno, tais como Pluronic, por exemplo, L121.

Entre os polímeros adjuvantes do tipo (1), é dada preferência aos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico reticulados, especialmente reticulados por éteres de polialquenila de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o nome de carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, número 2, junho de 1996). Um técnico no assunto pode também consultar a Patente Norte- Americana Número 2.909.462, que provê estes polímeros acrílicos reticulados por um composto de poliidroxila tendo pelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não mais que oito destes grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tais como metila. Produtos comercializados sob o nome CARBOPOL™ (BF Goodrich, Ohio, EUA) podem ser adequados. Eles são reticulados por alil sacarose ou por alil pentaeritritol. Entre eles, é feito referência a CARBOPOL™ 974P, 934P e 971P.

Quanto aos copolímeros derivados de anidrido maléico - alquenila, EiVIA (Monsanto, St. Louis, Missouri, EUA) pode ser utilizado, que são copolímeros de etileno-anidrido maléico reticulados e são, por exemplo, reticulados por éter divinílico. É também feito referência a J. Fields et al, Nature 186:778-780, 4 de junho de 1960.

O assunto presentemente revelado provê ainda métodos para uso dos exossomas revelados aqui. Em algumas configurações, é provido um método para produção de um exossoma substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores. Em algumas configurações, o método compreende prover uma célula, tal como as células reveladas aqui acima, que pode produzir exossomas; inibindo a expressão pela célula de um ou mais polipeptideos imunossupressores; e isolando exossomas produzidos pela célula, onde os exossomas substancialmente não têm a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores.

Em algumas configurações, o método pode compreender ainda estimulação da célula para produzir os exossomas. Entretanto, nas células de câncer e outros tipos de célula que naturalmente produzem exossomas, estimulação geralmente não é requerida.

Em algumas configurações, o método compreende ainda decorar os exossomas (por exemplo, por transferência de proteína ou por expressão recombinante nas células produzindo os exossomas, conforme revelado aqui e como é geralmente conhecido na técnica) com um ou mais antígenos exógenos (por exemplo, superantigenos).

Em algumas configurações, "isolar os exossomas" compreende colher em um meio, no qual as células são cultivadas e seletivamente remover os exossomas do meio, tal como, por exemplo, por centrifugação.

Em algumas configurações do método, inibir a expressão pela célula do referido um ou mais polipeptideos imunossupressores compreende introduzir na célula um ou mais polinucleotideos inibidores que especificamente inibem a expressão de um ou mais polipeptideos imunossupressores. Em algumas configurações, o referido um ou mais polinucleotideos inibidores compreendem polinucleotideos de RNA de pequena interferência (siRNA).

Os termos "ácido nucléico" e "ácido polinucléico" se referem aos desoxirribonucleotideos ou ribonucleotideos e polímeros destes tanto na forma de fita única quanto de fita dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucléicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucléico de referência e são metabolizados de uma maneira similar a nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que indicado diferentemente, uma seqüência de ácido nucléico específica também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas desta (por exemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares e, também, a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser atingidas pela geração de seqüências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260:2605-2608; Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98). Os termos "ácido nucléico", "polinucleotídeo", ou "seqüência de ácido nucléico" podem também ser usados de forma intercambiável com gene, moldura de leitura aberta (ORF), cDNA, e mRNA codificado por um gene.

Os termos "RNA de pequena interferência", "RNA de curta interferência", "RNA de pequeno grampo ("hairpin"), "siRNA", e "shRNA" são usados de forma intercambiável e se referem a qualquer molécula de ácido nucléico capaz de mediar interferência de RNA (RNAi) ou silenciamento de gene. Vide, por exemplo, Bass, Nature 411:428-429, 2001; Elbashir et al, Nature 411:494-498, 2001a; e Publicações Internacionais PCT Números WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409, e WO 00/44914, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Em uma configuração, o siRNA compreende uma molécula de polinucleotideo de dupla fita compreendendo regiões de sentido e anti-sentido complementares, onde a região de anti-sentido compreende uma seqüência complementar a uma região de uma molécula de ácido nucléico alvo codificando um polipeptideo imunossupressor. Em uma outra configuração, o siRNA compreende um polinucleotideo de fita única tendo regiões de sentido e anti- sentido auto-complementares, onde a região de anti-sentido compreende uma seqüência complementar a uma região da molécula de ácido nucléico alvo. Em uma outra configuração, o siRNA compreende um polinucleotideo de fita única tendo uma ou mais estruturas de alça e um tronco compreendendo regiões de sentido e anti-sentido auto-complementares, onde a região de anti-sentido compreende uma seqüência complementar a uma região da molécula de ácido nucléico alvo, e onde o polinucleotideo pode ser processado tanto in vivo como in vitro para gerar um siRNA ativo capaz de mediar RNAi. Conforme usado aqui, moléculas siRNA não necessitam ser limitadas àquelas moléculas contendo apenas RNA, mas abrange ainda nucleotídeos quimicamente modificados e não nucleotideos.

O assunto presentemente revelado se aproveita da capacidade de moléculas de RNA curtas, de fita dupla para causar regulação para baixo de genes celulares, um processo referido como interferência de RNA. Conforme usado aqui, "interferência de RNA" (RNAi) se refere a um processo de silenciamento de gene de pós- transcrição especifico à seqüência mediado por um RNA de pequena interferência (siRNA) . Vide geralmente, Fire et al. , Nature 391:806-811, 1998. O processo de silenciamento de gene pós- transcricional é considerado ser um mecanismo de defesa celular evolucionariamente conservado que evoluiu para impedir a expressão de genes estrangeiros (Fire, Trends Genet 15:358-363, 1999).

RNAi pode ter evoluído para proteger células e organismos contra a produção de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) resultando de infecção por certos vírus (especificamente os vírus de RNA de fita dupla ou aqueles vírus para os quais o ciclo de vida inclui um intermediário de RNA de fita dupla) ou a integração aleatória de elementos de transposons no genoma hospedeiro por meio de um mecanismo que especificamente degrada RNA de fita única ou RNA genômico viral homólogo nas espécies de RNA de fita dupla.

A presença de dsRNAs longos nas células estimula a atividade da enzima Dicer, uma ribonuclease III. Dicer catalisa a degradação de dsRNA em estiramentos curtos de dsRNA referidos como RNAS de pequena interferência (siRNA) (Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001). Os RNAs de pequena interferência que resultam de degradação mediada por Dicer têm tipicamente de aproximadamente 21-23 nucleotídeos de comprimento e contêm aproximadamente 19 pares de base duplos. Após degradação, o siRNA é incorporado em um complexo de endonuclease referido como complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O RISC é capaz de mediar clivagem de RNA de fita única presente dentro da célula que é complementar à fita de anti-sentido do siRNA duplo. De acordo com Elbashir et al, clivagem do RNA alvo ocorre próximo do meio da região do RNA de fita única que é complementar à fita de anti-sentido do siRNA duplo (Elbashir et al., Genes Dev 15:188- 200, 2001b).

RNAi foi descrito em vários tipos de célula e organismos. Fire et al. , 1998 descreveram RNAi em C. elegans, Wianny & Zernicka-Goetz, Nature Cell Biol 2:70-75, 1999 revelam RNAi mediado por dsRNA em embriões de camundongo. Hammond et al., Nature 404:293-296, 2000 foram capazes de induzir RNAi em células de Drosófila por transfecção de dsRNA nestas células. Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001 demonstraram a presença de RNAi em células de mamífero cultivado incluindo rins embriônicos humanos e células HeLa pela introdução de duples de RNAs de 21 nucleotídeos sintéticos.

Outros estudos indicaram que um 5'-fosfato na fita complementar de alvo de um siRNA duplo facilita atividade de siRNA e que ATP é utilizado para manter a porção 5'-fosfato no siRNA (Nykanen et al., Cell 107:309-321, 2001). Outras modificações que podem ser toleradas quando introduzidas em uma molécula siRNA incluem modificações da estrutura de açúcar-fosfato ou a substituição do nucleosídeo com pelo menos um dentre um heteroátomo de nitrogênio ou enxofre (Publicações Internacionais PCT Números WO 00/44914 e WO 01/68836) e certas modificações de nucleotídeo que podem inibir a ativação de cinase de proteína dependente de RNA de fita dupla (PKR), especificamente 2'-amino ou 2'-0-metil nucleotídeos, e nucleotideos contendo uma ponte de 2'-0 ou 4'-C metileno (Pedido de Patente Canadense Número 2.359.180).

Outras referências que revelam o uso de dsRNA e RNAi incluem as Publicações Internacionais PCT Números WO 01/75164 (sistema RNAi in vitro usando células de Drosófila e o uso de moléculas siRNA específicas para certas aplicações genômicas funcionais e certas aplicações terapêuticas); WO 01/36646 (métodos para inibir a expressão de genes específicos em células de mamíferos usando moléculas dsRNA); WO 99/32619 (métodos para introduzir moléculas dsRNA em células para uso na inibição de expressão de gene); WO 01/92513 (métodos para mediar supressão de gene pelo uso de fatores que intensificam RNAi) ; WO 02/44321 (construtos de siRNA sintéticos); WO 00/63364 e WO 01/04313 (métodos e composições para inibir a função de seqüências de polinucleotídeos); e WO 02/055692 e WO 02/055693 (métodos para inibir expressão de gene usando RNAi); cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

Em algumas configurações, o assunto presentemente revelado utiliza RNAi para inibir pelo menos parcialmente a expressão de um ou mais polipeptídeos imunossupressores de interesse, por exemplo, mas não limitado a FasL, lígante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7-H3, B7-H4, ou combinações destes. Em algumas configurações, a inibição é pelo menos aproximadamente 10% das quantidades normais de expressão. Em algumas configurações, o método compreende a introdução de um RNA a uma célula alvo em uma quantidade suficiente para inibir a expressão do referido um ou mais polipeptideos imunossupressores, onde o RNA compreende uma seqüência de ribonucleotideo que corresponde a uma fita de codificação de um gene de interesse.

O RNA pode ter uma região de fita dupla compreendendo uma primeira fita que compreende uma seqüência de ribonucleotideo que corresponde à fita de codificação do gene codificando o polipeptideo imunossupressor alvo e uma segunda fita compreendendo uma seqüência de ribonucleotideo que é complementar à primeira fita. A primeira fita e a segunda fita hibridizam entre si para formar a molécula de fita dupla. A região de fita dupla pode ser de pelo menos 15 pares de base de comprimento, e em algumas configurações, entre 15 e 50 pares de base de comprimento, e em algumas configurações a região de fita dupla está entre 15 e 30 pares de base de comprimento.

Em algumas configurações, o RNA compreende uma fita que forma uma região de fita dupla por auto-hibridização intramolecular, que é preferivelmente complementar a pelos menos 19 bases. Em algumas configurações, o RNA compreende duas fitas separadas que formam uma região de fita dupla por hibridização intermolecular que é complementar a pelo menos 19 bases.

Um técnico no assunto reconhecerá que qualquer número de técnicas comuns adequadas pode ser usado para introduzir os RNAs em uma célula alvo. Em algumas configurações, um vetor codificando o RNA é introduzido na célula alvo. Por exemplo, o vetor codificando o RNA pode ser transfectado na célula alvo e o RNA é, então, transcrito pelas polimerases celulares. Vide, por exemplo, Koyanagi et ai. "Long-Term exposure to superantigen induces p27Kipl e Bcl-2 expression in effector memory CD4+ T cells". Cellular Immunology, 248 (2) :77-85, Agosto de 2007; e Tritto et al. "The acquired immune response to the mucosal adjuvant LTK63 imprints the mouse Iung with a protective signature." Journal of Immunology, 179 (8) :5346-57, 15 de outubro de 2007, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Em algumas configurações, um vírus recombinante compreendendo ácido nucléico codificando o RNA pode ser produzido. Introduzindo o RNA em uma célula alvo, então, compreende infectar a célula alvo com o vírus recombinante. Polimerases celulares transcrevem o RNA resultante na expressão do RNA dentro da célula alvo. A engenharia de vírus recombinantes é bem conhecida dso técnicos no assunto. Vide, por exemplo, Tritto et al. , "The acquired immune response to the mucosal adjuvant LTK63 imprints the mouse Iung with a protective signature." Journal of Immunology, 179 (8) :5346-57, 15 de outubro de 2007, incorporado aqui por referência. Um especialista prontamente observaria os múltiplos fatores envolvidos na seleção dos componentes apropriados de vírus e de vetor necessários para otimizar a produção de vírus recombinante para uso com o assunto presentemente revelado sem a necessidade de discussão detalhada adicional aqui.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, um método de tratamento de câncer em um indivíduo é provido. Em algumas configurações, o método compreende a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma produzido por uma célula de câncer, tal como células de câncer e exossomas revelados aqui, a um indivíduo em necessidade destes, onde o exossoma compreende um ou mais antígenos de câncer e é substancialmente isento de um ou mais polipeptideos imunossupressores. 0 exossoma administrado pode agir como uma "vacina" com relação aos antigenos providos nos exossomas e, portanto, promover uma resposta imunológica contra os antigenos pelo sistema imunológico do indivíduo. Entretanto, deve ser observado que o termo "vacina" conforme usado aqui não objetiva limitar o presente assunto a métodos para apenas prevenir distúrbios, mas inclui terapias para tratamento de distúrbios já presentes em um indivíduo.

O sistema imunológico estimulado é, então, capaz de montar uma resposta contra células compreendendo os antigenos, incluindo, por exemplo, células de câncer. Como tal, o assunto presentemente revelado provê ainda, em algumas configurações, um método para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo contra um ou mais antigenos, compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma produzido por uma célula e compreendendo um ou mais antigenos, a um indivíduo em necessidade deste, onde o exossoma substancialmente não tem a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores.

Conforme usados aqui, os termos "tratamento" ou "tratar" se referem a qualquer tratamento de uma condição de interesse (por exemplo, um câncer), incluindo, mas não limitado a tratamento profilático e tratamento terapêutico. Como tal, os termos "tratamento" ou "tratar" incluem, mas não se limitam a: prevenir uma condição de interesse ou o desenvolvimento de uma condição de interesse; inibir o progresso de uma condição de interesse; interromper ou prevenir o desenvolvimento de uma condição de interesse; reduzir a gravidade de uma condição de interesse; melhorar ou aliviar os sintomas associados com uma condição de interesse; e causar uma regressão da condição de interesse ou de um ou mais dos sintomas associados com a condição de interesse.

O termo "câncer" se refere a todos os tipos de

câncer, neoplasmas ou tumores malignos encontrados em animais, incluindo leucemias, carcinomas e sarcomas.

Por "leucemia" entendem-se doenças amplamente progressivas, malignas dos órgãos formadores de sangue e é geralmente caracterizada por uma proliferação e desenvolvimento distorcidos de leucócitos e seus precursores no sangue e medula óssea. Doenças da leucemia incluem, por exemplo, leucemia não linfocitica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia granulocitica aguda, leucemia granulocitica crônica, leucemia promielocitica aguda, leucemia de célula T adulta, leucemia aleucêmica, leucemia leucocitêmica, leucemia basofilica, leucemia de blastoma, leucemia bovina, leucemia mielocitica crônica, leucemia cutânea, leucemia embrionária, leucemia eosinofilica, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocitica, leucemia da célula-tronco, leucemia monocitica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocitica, leucemia linfógena, leucemia linfóide, leucemia de células linfossarcomatosas, leucemia de mastócitos, leucemia megacariocitica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocitica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocitica, leucemia granulocitica mielóide, leucemia mielomonocitica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacitica, leucemia promielocitica, leucemia da célula Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de célula-tronco, leucemia subleucêmica, e leucemia de célula indiferenciada.

O termo "carcinoma" se refere a um novo crescimento maligno constituído de células epiteliais que tendem a infiltrar nos tecidos próximos e fazer surgir metástases. Carcinomas exemplificativos incluem, por exemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocistico, carcinoma adenóide cístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de célula alveolar, carcinoma de célula basal, carcinoma basocelular, carcinoma basalóide, carcinoma de célula basoescamosa, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma colóide, carcinoma comedo, carcinoma corpus, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de célula cilíndrica, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefalóide, carcinoma "epiennoid", carcinoma epitelial adenóides, carcinoma exofítico, carcinoma ex úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatinoforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gigante, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de célula granulosa, carcinoma de matriz do pelo, carcinoma hematóide, carcinoma hepatocelular, carcinoma da célula de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefróide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intra- epidérmico, carcinoma intra-epitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma da célula de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatoso, carcinoma nasofaringeo, carcinoma em células de grãos de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteóide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma de célula espinhosa, carcinoma pultáceo, carcinoma celular renal dos rins, carcinoma de célula reserva, carcinoma sarcomatoso, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma de célula em anel de sinete, carcinoma simples, carcinoma microcelular, carcinoma solanóide, carcinoma de célula fusiforme, carcinoma de célula esferoidal, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de "string", carcinoma telangiectásico, carcinoma de telangiectasia, carcinoma de célula de transição, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso, e carcinoma viloso.

O termo "sarcoma" geralmente se refere a um tumor que é constituído de uma substância como o tecido conectivo embriônico e é, de forma geral, composto de células proximamente empacotadas embutidas em uma substância fibrilar ou homogênea. Sarcomas incluem, por exemplo, condrossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrióide, sarcoma cloroma, cório carcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma do tumor de Wiln, sarcoma endometrial, sarcoma do estroma endometrial, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de célula gigante, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma idiopático múltiplo pigmentado hemorrágico, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma das células de Kupffer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocitico, sarcoma de Rous, sarcoma sorocistico, sarcoma sinovial, e sarcoma telangiectásico.

O termo "melanoma" é usado para significar um tumor originário do sistema melanocitico da pele e outros órgãos. Melanomas incluem, por exemplo, melanoma lentiginoso das extremidades, melanoma amelanótico, melanoma benigno juvenil, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentiginoso maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal, e melanoma superficial disseminante.

Cânceres adicionais incluem, por exemplo, Doença de Hodgkin, Linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer da mama, câncer ovariano, câncer do pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pequenas células do pulmão, tumores cerebrais primários, câncer do estômago, câncer do cólon, insulanoma pancreático maligno, carcinóide maligno, lesões pré-malignas da pele, câncer testicular, linfomas, câncer da tiróide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato geniturinário, hipercalcemia maligna, câncer cervical, câncer endometrial, e câncer adrenal cortical. Em algumas configurações específicas, o câncer tratado é um tumor sólido. Em algumas configurações, o câncer tratado é uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, células de melanoma, ou uma célula de câncer pancreático.

O termo "quantidade efetiva" é usado aqui para se referir a uma quantidade da composição terapêutica (por exemplo, uma composição compreendendo um exossoma revelado aqui) suficiente para produzir uma resposta biológica mensurável (por exemplo, uma resposta imunológica (por exemplo, produção de anticorpo e/ou ativação de células T) pelo indivíduo contra antígenos contidos no exossoma e/ou uma diminuição mensurável no tamanho do tumor, atividade, etc.). Níveis de dosagem reais de ingredientes ativos em uma composição terapêutica do assunto presentemente revelado podem ser variados, de modo a administrar uma quantidade do(s) composto (s) ativo (s) que seja efetiva para atingir a resposta terapêutica desejada para um indivíduo e/ou aplicação específicos. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade da composição terapêutica, formulação, a rota de administração, combinação com outros medicamentos ou tratamentos, gravidade da condição tratada, e a condição física e histórico médico anterior do indivíduo tratado. Preferivelmente, uma dose mínima é administrada, e a dose é escalonada na ausência de toxicidade limitando a dosagem até uma quantidade minimamente efetiva. Determinação e ajuste de uma dose terapeuticamente efetiva, assim como a avaliação de quando e como realizar estes ajustes, são conhecidos dos técnicos em medicina.

Para administração de uma composição terapêutica conforme revelado aqui, métodos convencionais de extrapolação da dosagem humana com base em doses administradas a um modelo animal murino podem ser aplicados usando o fator de conversão para converter a dosagem do camundongo para uma dosagem humana: Dose Humana por Kg = Dose Camundongo por Kg x 12 (Freireich et al. , (1966) Câncer Chemother Rep. 50:219-244). Doses de medicamento podem também ser providas em miligramas por metro quadrado de áreas superficiais corporais, pelo fato deste método atingir uma boa correlação com certas funções metabólicas e de excreção, ao invés de com o peso corporal. Além do mais, a área superficial corporal pode ser usada como um denominador comum para dosagem do medicamento em adultos e crianças, assim como em diferentes espécies animais, conforme descrito por Freireich et al. (Freireich et al. , (1966) Câncer Chemother Rep. 50:219-244). Brevemente, para expressar uma dose em mg/kg em qualquer espécie dada como a dose equivalente mg/metro quadrado, multiplicar a dose pelo fator de km apropriado. Em um adulto humano, 100 mg/kg é equivalente a 100 mg/kgx37 kg/m2 = 3700 mg/m2.

A administração pode ser, por exemplo, intravenosamente, intratumoralmente, subcutaneamente, transdermicamente, ou intraperitonealmente.

Para administração parenteral, os exossomas podem ser empregados em uma quantidade variando de aproximadamente 0,005. mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg, preferivelmente aproximadamente 10 a 50 ou 10 a 70 mg/kg, e mais preferivelmente, de aproximadamente 10 mg/kg até aproximadamente 30 mg/kg. Para instrução adicional com relação à formulação e dose, vide as Patentes Norte-Americanas Números 5.326.902; 5.234.933; Publicação Internacional PCT Número WO 93/25521; Berkow et al. , (1997) The Merck Manual of Medicai Information, Home ed. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, New Jersey; Goodman et al. , (1996) Goodman & Gilmanf s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed. McGraw-Hill Health Professions Division, New York; Ebadi, (1998) CRC Desk Reference of Clinicai Pharmacology. CRC Press, Boca Raton, Florida; Katzung (2001) Basic & Clinicai Pharmacology, 8th ed. Lange Medicai Books/McGraw-Hill Medicai Pub. Division, New York; Remington et al., (1975) RemingtonfS Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Mack Pub. Co., Easton Pennsylvania; e Speight et al. , (1997) AveryfS Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choice, Therapeutic Use and Eeonomic Value of Drugs in Disease Management, 4th ed. Adis International, Auckland/Philadelphia; Duch et al., (1998) Toxicol. Lett. 100- 101:255-263.

Métodos adequados para administração a um indivíduo de uma composição compreendendo exossomas revelados aqui, de acordo com os métodos do presente assunto, incluem, mas não estão limitados à administração sistêmica, administração intravenosa, administração intratumoral, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitoneal, administração subcutãnea, inalação, instalação intratraqueal, implantação cirúrgica, administração transdérmica, injeção no local, e injeção/bombardeamento de hipervelocidade. Onde aplicável, infusão contínua pode intensificar acúmulo de medicamento em um local alvo, se desejado (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana Número 6.180.082).

O modo especifico de administração de medicamento usado de acordo com os métodos do presente assunto depende de vários fatores, incluindo, mas não limitado à composição de exossoma especifica (por exemplo, características e concentração de antígeno, presença de moléculas antigênicas adicionais tais como SAgs, etc.), veículo empregado, a gravidade da condição a ser tratada, e mecanismos para metabolismo ou remoção do medicamento após administração.

Adicionalmente, com relação aos métodos terapêuticos do assunto presentemente revelado, um indivíduo preferido é um indivíduo vertebrado. Um vertebrado preferido é de sangue quente; um vertebrado de sangue quente preferido é um mamífero. Um mamífero preferido é mais preferivelmente um ser humano. Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" inclui tanto indivíduos humanos quanto animais. Dessa maneira, usos terapêuticos veterinários são providos de acordo com o assunto presentemente revelado.

Como tal, o assunto presentemente revelado provê o tratamento de mamíferos tais como humanos, assim como aqueles mamíferos de importância devido ao fator de estarem ameaçados, tais como tigres Siberianos; de importância econômica, tais como animais criados em fazendas para consumo por humanos; e/ou animais de importância social para os seres humanos, tais como animais de estimação ou mantidos em zoológicos. Exemplos destes animais incluem, mas não se limitam a: carnívoros tais como gatos e cães; suínos, incluindo porcos, capados, e porcos do mato; ruminantes e/ou ungulados tais como gado, boi, ovelha, girafas, veado, cabras, bisão, e camelos; e cavalos. É também provido o tratamento de pássaros, incluindo o tratamento daquelas espécies de pássaros que estão ameaçados e/ou mantidos em zoológicos, assim como aves comestíveis, e mais especificamente aves domesticadas, isto é, aves domésticas, tais como perus, frangos, patos, gansos, galinha d'angola, e similares, visto que são, também de importância econômica para os seres humanos. Dessa maneira, também é provido o tratamento de gado, incluindo, mas não limitado a, suínos domesticados, ruminantes, ungulados, cavalos (incluindo cavalos de corrida), aves comestíveis, e similares.

Será entendido que vários detalhes do assunto presentemente revelado podem ser alterados sem se afastar o escopo do presente assunto. Adicionalmente, a descrição a seguir tem apenas objetivo ilustrativo, e não objetivo limitativo.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir foram incluídos para ilustrar modos do assunto presentemente revelado. À luz da presente revelação e do nível geral de especialização na técnica, os técnicos no assunto observarão que os Exemplos a seguir objetivam apenas serem exemplificativos e que várias alterações, modificações, e mudanças podem ser empregadas sem se afastar do escopo do assunto presentemente revelado.

EXEMPLO 1

SUPRESSÃO DE EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS IMUNOSSUPRESSORES EM CÉLULAS DE TUMOR USANDO siRNA

siRNA específicos foram usados com culturas de célula derivadas de tumor, que neste Exemplo eram células de câncer ovariano, para suprimir a expressão de polipeptídeos imunossupressores normalmente expressos pelas células cultivadas nos exossomas produzidos pelas células. Como um exemplo das capacidades do presente sistema, nós investimos o Ligante Fas (FasL), que é conhecido por estar associado com exossomas derivados de tumor. Entretanto, a presente metodologia pode funcionar igualmente bem na supressão de um ou mais polipeptideos imunossupressores diferentes encontrados nos exossomas derivados de tumor, incluindo, mas não limitado a ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7-H3, e B7-H4.

Brevemente, células derivadas de tumor (2xl05 células/poço) foram laminadas em lâminas de cultura de tecido de seis poços em meio "Roswell Park Memorial Institute (RPMI)" isento de antibiótico de 2 ml, suplementado com FBS ultracentrifugado. As culturas de célula subconfluentes, a solução siRNA dupla (2-8 μΐ de siRNA duplo: 0,25-1 μg de siRNA em 100 μΐ de meio de transfecção de siRNA™ (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, cat. número sc-368 68) foi adicionada diretamente a Reagente de Transfecção diluído (Santa Cruz Biotechnology, Inc., cat. número sc-29528). As células foram incubadas durante 18 horas, o meio foi removido e substituído com meio completo com 10% de FBS ultracentrifugado e IX antibióticos. Após 72 horas, o meio condicionado foi removido e os exossomas foram isolados.

Pares de anticorpo e siRNA estão comercialmente disponíveis para os polipeptideos imunossupressores conhecidos. Por exemplo, o anticorpo e siRNAs exemplificativos utilizados nos presentes exemplos foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, e são como segue: Proteína siRNA Anticorpo

FasL sc-29313 sc-56099

PD-Ll sc-39699 sc-19090

PD-L2 sc-39701 sc-80285

Exossomas foram isolados do meio condicionado de células de tumor tratadas com siRNA. Meios condicionados de linhas de célula de câncer ovariano foram usados para isolar os exossomas. O material >500kD foi concentrado por ultrafiltração e aplicado a uma coluna SEPHAROSΕ® 2B (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA). O material >5xl0"7 Da foi submetido à flutuação em um gradiente de sacarose descontínuo e a quantidade de exossomas isolados foi determinada pelo método de microensaio de Bradford (Bradford, "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding", Anal Biochemr 72, 248-254 (1976)).

EXEMPLO 2

ISOLAMENTO E ANÁLISE DE EXOSSOMAS MODIFICADOS DE CÉLULAS TRATADAS COM siRNA

Para confirmar que a abordagem com siRNA suprime a expressão da(s) proteína(s) específica(s) de interesse dentro da célula e sua presença nos exossomas liberados por estas células, foram realizadas análises de imunomácula ocidental das células e exossomas isolados (Figura 1). As manchas foram examinadas durante uma noite a 4°C com o anticorpo específico para o componente de proteína específico modificado, e complexos ligados foram visualizados por ECL e quantificados por densitometria. A análise de imunomácula ocidental das células tratadas com siRNA confirmou a eliminação da expressão FasL dentro das células de tumor originais e a ausência de FasL associada com exossomas derivados destas células tratadas.

EXEMPLO 3

PERDA CORRELACIONADA DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS COM SUPRESSÃO DE ATIVIDADES IMUNOSSUPRESSORAS DE EXOSSOMAS

Os efeitos de exossomas modificados com siRNA em células T e células dendriticas (CD) foram analisados usando os exossomas não modificados. Células Jurkat E-61, um linfoma de célula T humana com um complexo TcR/CD3 funcional capaz de sintetizar IL-2 foi obtido da "American Type Culture Collection (Rockville, MD)". Estas células foram utilizadas como um ensaio in vitro quanto à modulação de linfócito por MF derivado de ascites. Estas linhas de célula T foram desenvolvidas em meio RPMI 1640 suplementado com 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 200 mM de L-glutamato, 100 μg/ml de estreptomicina e 100 Ul/ml de penicilina em uma câmara de 5% de CO2 umedecida a 37°C. A viabilidade da célula foi avaliada por exclusão de azul de tripano. Todas as culturas utilizadas para este estudo foram >95% viáveis.

Para bioensaio de expressões de CD3-zeta e JAK3, células Jurkat viáveis (IO6 células/ml) foram incubadas em um meio suplementado com 400 μg/ml de exossomas isolados, modificados com siRNA ou não modificados, durante 4 dias e foram comparadas com células Jurkat não expostas ou células Jurkat expostas a frações cromatográf icas análogas de soro de controle. Após 4 dias, as células foram centrifugadas, a conta de célula foi lavada, e usada tanto para análise de proteína quanto de mRNA. Para avaliar proteína CD3-zeta, a conta de célula foi lisada usando 50 mM de HEPES, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 mM de ortovanadato de sódio, 2,5% de Triton X-100, 200 μg/ml de inibidor tripsina/quimotripsina, 200 μ9/πι1 de quimostatina e 2 mM PMSF. O lisato da célula foi analisado quanto à proteína pelo ensaio de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . A modulação de CD3-zeta foi analisada por imunomácula ocidental usando um gel 15% SDS-PAGE, conforme descrito acima com anticorpos anti-CD3-zeta monoclonal de camundongo e anti-JAK3 policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) como o anticorpo primário (Figura 2).

Exossomas derivados de culturas de célula de tumor tratados com siRNA para FasL e, assim, não expressando FasL falharam em inibir as expressões de CD3-zeta ou JAK3 dentro das culturas de célula T. Visto que a supressão de CD3-zeta e JK3 foi correlacionada com a presença de câncer ovariano, a extensão da doença, e sobrevivência geral do paciente, a reversão desta supressão derivada de exossoma pode resultar em respostas aumentadas de célula T do paciente e sobrevivência aumentada do paciente.

EXEMPLO 4

TRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNA DE SEA-TM EM EXOSSOMAS

E SUA CONFIRMAÇÃO

Para incorporação de SEA à superfície do exossoma, exossomas podem ser isolados de células B16-F10, que suprimirão a ativação de célula Τ. A expressão FasLl exossomal pode ser modificada pelo tratamento das células B16-F10 com siRNA de FasL. Os exossomas modificados podem ser rotulados com SEA.

Brevemente, 100 μl de SEA (50 μg/ml) podem ser adicionados aos 100 μg de exossomas modificados isolados em 100 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Esta solução pode ser incubada durante 20 minutos a 37°C e, então, PBS até um volume final de 1 ml. SEA não incorporado pode ser removido por cromatografia em Sepharose 2B.

EXEMPLO 5

IMUNIZAÇÕES E DESAFIO DE TUMOR

Camundongos C57BL/6 podem ser imunizados sc (subcutaneamente) com 10 μg de complexo de exossoma/SEA, três vezes em intervalos de 7 dias. Células B16-F10 (1x105) podem, então, ser injetadas sc 1 semana após a última injeção. Os tamanhos do tumor podem ser medidos a cada 2 dias, e a sobrevivência de longo termo foi observada diariamente até 90 dias. Os camundongos podem sofrer eutanásia quando os tumores atingirem 3 cm de diâmetro. Cada grupo pode conter 10 camundongos, por exemplo.

EXEMPLO 6

PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA T E SECREÇÃO DE CITOCINA

IN VITRO

Para definir a atividade dos exossomas modificados, 1 semana após a última imunização, as células T esplênicas podem ser isoladas usando contas magnéticas pan-célula- T até 95% de pureza conforme confirmado por citometria de fluxo. Estas células T CD3+, 1x105, obtidas de camundongos tratados podem ser co-incubadas com 2x104 células B16-F10 desativadas (desativadas pelo tratamento com 50 μg/ml de mitomicina C) em lâminas de 96 poços durante 5 dias. A proliferação de célula T pode ser determinada após 72 horas usando o ensaio de proliferação de célula "CellTiter Aqueous" (Promega).

EXEMPLO 7

ENSAIO ELISPOT PARA IFN-y

Para avaliar a atividade imunológica, a produção de IFN-y pode ser definida. Para ensaio de local imunológico ligado a enzima IFN-y (ELISPOT), 7 dias após a última imunização, esplenócitos podem ser isolados e analisados a 5xl06/ml. Os linfócitos podem ser estimulados com 10 μg/ml dos exossomas rotulados, modificados, em relação aos exossomas não rotulados, não modificados ou 5 μg/ml de Concanavalina A durante 3 dias. Os linfócitos tratados serão transferidos para a lâmina ELISPOT, e as colônias secretando IFN-y específicos serão contadas usando um microscópio de dissecção.

Será entendido que vários detalhes do assunto presentemente revelado podem ser alterados sem se afastar do escopo do assunto presentemente revelado. Além do mais, a descrição anterior tem apenas objetivo ilustrativo, e não objetiva ser limitativa.

Claims

1. Exossoma isolado de uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais antigenos e substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores normalmente encontrados no exossoma.

2. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula foi modificada para inibir a expressão do um ou mais polipeptideos imunossupressores.

3. Exossoma, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula foi modificada para compreender um ou mais polinucleotideos inibidores que especificamente inibem a expressão do um ou mais polipeptideos imunossupressores.

4. Exossoma, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polinucleotideos inibidores compreendem polinucleotideos siRNA.

5. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada..

6. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

7. Exossoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cancerígena ovariana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

8. Exossoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-I, uma célula UL-2, uma célula UL-3, ou uma célula UL-6.

9. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antigenos, cada um, compreendem um antigeno de célula cancerígena.

10. Exossoma, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o antigeno de célula cancerígena é selecionado do grupo consistindo de p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1, cerB/HER2, NY- ESO-1, SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-1, e c-myc.

11. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos imunossupressores são selecionados do grupo consistindo de FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7- H3, B7-H4, e combinações dos mesmos.

12. Exossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais antigenos exógenos.

13. Exossoma, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antigenos exógenos compreendem superantígenos.

14. Exossoma, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o superantígeno compreende enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da síndrome de choque tóxico Staphylococcus aureus (TSST-1), uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), ou um superantigeno estreptocócico (SSA).

15. Célula caracterizada pelo fato de que que produz uma exossoma da reivindicação 1.

16. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

17. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

18. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cancerígena ovariana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

19. Célula, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula UL-3, UL-2 ou uma célula UL-6.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um exossoma compreendendo um ou mais antígenos e substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores; e (b) um veículo farmacêutico.

21. Método de produção de um exossoma substancialmente sem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) prover uma célula que possa produzir exossomas; (b) inibir a expressão pela célula de um ou mais polipeptideos imunossupressores; e (c) isolar exossomas produzidos pela célula, onde os exossomas substancialmente não têm a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende decorar as exossomas com um ou mais antigenos exógenos.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antigenos exógenos compreendem superantigenos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o superantigeno compreende enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da sindrome de choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-I), uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), ou um superantigeno estreptocócico (SSA)

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o isolamento dos exossomas compreende a colheita em um meio no qual as células são cultivadas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cancerígena ovaríana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-I, UL-2, uma célula UL-3, e UL-6.

30. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a expressão de supressão pela célula do um ou mais polipeptídeos imunossupressores compreende a introdução na célula de um ou mais polinucleotídeos inibidores que especificamente inibem a expressão do um ou mais polipeptídeos imunossupressores.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polinucleotídeos inibidores compreendem polinucleotídeos siRNA.

32. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos imunossupressores são selecionados do grupo consistindo de FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7- H3, B7-H4, e combinações dos mesmos.

33. Método de tratamento de câncer em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma produzido por uma célula cancerígena a um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o exossoma compreende um ou mais antígenos de câncer e substancialmente não tem a presença de um ou mais polipeptideos imunossupressores.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o câncer tratado é um tumor sólido.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o câncer tratado é uma célula cancerígena ovariana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

36. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o exossoma é administrado intravenosamente, intratumoralmente, subcutaneamente, transdermicamente, ou intraperitonealmente.

37. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o exossoma compreende um ou mais antígenos exógenos.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antígenos exógenos compreendem superantígenos.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o superantígeno compreende enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da síndrome de choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-I), uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), ou um superantígeno estreptocócico (SSA).

40. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena foi modificada para inibir a expressão do um ou mais polipeptídeos imunossupressores.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena foi modificada para compreender um ou mais polinucleotídeos inibidores que especificamente inibem a expressão do um ou mais polipeptídeos imunossupressores.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polinucleotídeos inibidores compreendem polinucleotídeos siRNA.

43. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cultivada.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cancerígena ovariana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-1, UL-2, uma célula UL-3, ou uma célula UL-6.

46. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que cada um dentre o um ou mais antígenos de célula cancerígena é selecionado do grupo consistindo de p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-I, cerB/HER2, NY-ES0-1, SCPl, SSX-I, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, ΗοχΑ7, ΗοχΒ7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-1, e c-myc.

47. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

48. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos imunossupressores são selecionados do grupo consistindo de FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7- H3, B7-H4, e combinações dos mesmos.

49. Método de estimulação de uma resposta imunológica em um indivíduo contra um ou mais antígenos, compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de um exossoma produzido por uma célula e compreendendo um ou mais antígenos a um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que o exossoma substancialmente não tem a presença de um ou mais polipeptídeos imunossupressores.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o exossoma é administrado intravenosaraente, intratumoralmente, subcutaneamente, transdermicamente, ou intraperitonealmente.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o exossoma compreende um ou mais antígenos exógenos.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antígenos exógenos compreendem superantígenos.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o superantigeno compreende enterotoxinas estafilocócicas (SEs), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da sindrome de choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-I) , uma exotoxina estreptocócica mitogênica (SME), ou um superantigeno estreptocócico (SSA)

54. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a célula foi modificada para inibir a expressão do um ou mais polipeptideos imunossupressores.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena foi modificada para compreender um ou mais polinucleotídeos inibidores que especificamente inibem a expressão do um ou mais polipeptideos imunossupressores.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polinucleotídeos inibidores compreendem polinucleotídeos siRNA.

57. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

58. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula cancerígena ovariana, uma célula cancerígena cervical, uma célula cancerígena da mama, uma célula cancerígena endometrial, uma célula cancerígena do cólon, uma célula cancerígena da próstata, uma célula cancerígena do pulmão, uma célula de melanoma, ou uma célula cancerígena pancreática.

60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-1, UL-2, uma célula UL-3, ou uma célula UL-6.

61. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o um ou mais antigenos, cada um, compreende um antigeno de célula cancerígena.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o antigeno de célula cancerígena é selecionado do grupo consistindo de p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1, cerB/HER2, NY- ESO-1, SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, mesotelina, survivina, EGFK, MUC-1, e c-myc.

63. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

64. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polipeptídeos imunossupressores são selecionados do grupo consistindo de FasL, ligante-1 de morte programada, ligante-2 de morte programada, B7- H3, B7-H4, e combinações dos mesmos.