CN1283660C - 朊病毒的色谱分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含有朊病毒和至少一种其它的生物分子的溶液中分离朊病毒的方法，该方法包括将该溶液经过阴离子交换色谱柱并在形成梯度的条件下洗脱，其中的朊病毒被与该至少一种生物分子相分离，使所述的生物分子被收集在与含有朊病毒的洗脱组分不同的洗脱组分中。在一个实施方案中，所述的梯度使pH梯度，例如分步梯度。朊病毒可以是病原体，例如，海绵状脑病的病原体，如皮质-纹状体-脊髓变性症、脑顶枕叶综合症、羊痢疾、牛海绵状脑病等的病原体。

Description

朊病毒的色谱分离方法
技术领域
本发明涉及一种从包括有朊病毒和血红蛋白的溶液中去除朊病毒的方法，该方法包括的步骤是将该溶液在造成pH梯度洗脱的条件下通过阴离子交换色谱柱，其中，所述的阴离子交换介质包含用阳离子基团衍生的硅胶，从而将所述的朊病毒收集在一个洗脱组分中，该洗脱部分从pH在6.5到8.3的阴离子交换色谱柱中洗脱出来，由此，使得该朊病毒与该收集的蛋白分开。
背景技术
海绵状脑病是哺乳动物的中枢神经系统的疾病，其造成过早痴呆，而且一般都是致命性的。这种脑病中的一些是涉及人类的，例如，皮质-纹状体-脊髓变性症、库鲁病、脑顶枕叶综合症、羊痢疾、牛海绵状脑病等。虽然有很强的证据表明这些疾病都是由共同的病原体或一些紧密相关的病原体所引起的，但是，对这些病原体的本质的了解还很少[Prusiner，Science 252：1515-1522(1991)]。不断增长的证据建议，转译后修饰的抗蛋白酶形式的宿主细胞蛋白在致病性方面起着重要的作用，但是，尚不清楚的是，是否这种被修饰的蛋白自身就是病原体或它仅仅是病原体的必要组成部分。这种蛋白已经被定名为朊病毒蛋白(此后简称为“PrP”)，而海绵状脑病的致病物被称为朊病毒。
一般而言，虽然它们不是传染性的，但是，已经有证据表明，在某些条件下，有一些海绵状脑病可以从一个动物个体传递到另一个动物个体，而且，在一些病例中，可以发生物种之间的传递。例如，在七十年代报道的一系列皮质-纹状体-脊髓变性症的病例中，那些患病个体都经过从收集的垂体提取的人生长激素的治疗[Brown et al.，N.Eng.J.Med.313：728-731(1985)]。据信，第一例牛海绵状脑病是因为污染的食物将羊痢疾传染给小牛而引发的。另外，将被污染的羊的组织颅内注射给小鼠后，已经建立了羊痢疾的鼠模型。
对组织中或其它的生物产品中的朊病毒的鉴定方法，目前仍然依靠用被怀疑的物质的提取物对小鼠或仓鼠进行感染后的检测。但是，由于对这些疾病的培养的时间可以长达一年甚至更长，因此，这些鉴定方法是即费时，又昂贵的。
与朊病毒有关的疾病的普遍发生以及可能发生物种间的传染都对生物工业带来了严重的影响，因为生物工业从哺乳动物的组织中获取众多的产品[Di Martino，Biologicals 21：61-66(1993)]。对这些产品的安全性的关注导致了对朊病毒的灭活的众多研究。这些研究表明，朊病毒比更为常规的病原体如病毒和细菌等都更具有对灭活的抵抗性。因此，对于含有朊病毒的生物材料的净化就需要更为猛烈的条件。目前所知道的对含有高效价朊病毒的生物材料的消毒方法仅有长时间的在130℃或更高温度下的蒸煮消毒和用高浓度的氢氧化钠溶液进行处理。这些方法已经被推荐为常规的朊病毒灭活方法[Department of Health and Social SecurityCircular 84：16(1989)]。还被报道过的是，以100kD为限的超滤并结合用6M的脲的处理也得到了对含有朊病毒的制剂的消毒结果[Pocchiari et al.，Arch.Virol.98：131-135(1988)]。其它的降低朊病毒活性的方法包括用有机溶剂、清洁剂、蛋白变性剂、离液序列高的盐和酚来进行处理[Millson et al.，in Prusiner and Hadlow，eds.Slow Transmissible Diseases of the Nervous System，vol.II.New York：Academic Press 409-424(1979)；Prusiner et al.，PNAS78：4606-4610(1981)；Kimberlin et al.，J.Neurol.Sci.59：390-392(1983)；Walker et al.，Am.J.Public Health 73：661-665(1983)；Brown et al.，J.Infect.Dis.153：1145-1148(1986)]。
去除朊病毒的传染性所需要的极端化条件一般都与保存生物分子的有用活性的方法不相容，结果造成众多生物分子变性和基本上破坏了它们的活性。因此，就需要有能够在不使所需要的生物活性受到损害的条件下对朊病毒进行灭活或将其从生物材料中分离出来的方法。
发明内容
在本发明涉及将朊病毒从含有朊病毒和至少一种其它的生物分子的溶液中分离出来的方法。
本发明的方法包括的步骤有，在造成梯度洗脱的条件下将溶液通过阴离子交换色谱柱，将朊病毒与该至少一种的另外的生物分子分离，使所述的生物分子被收集在与含有朊病毒的洗脱组分不相同的洗脱组分中。
在另一个实施方案中，本发明提供了从含有朊病毒和血红蛋白的溶液中去除朊病毒的方法。该方法包括的步骤有，在造成梯度洗脱的条件下将溶液通过阴离子交换色谱柱。将朊病毒与血红蛋白分离，洗脱的朊病毒所在的组分不同于含有血红蛋白的组分。
本发明的方法可以在温和条件下进行，不用加热、强碱或氧化剂。因此，本发明能够在有其它的生物分子存在并且不显著地影响这些生物分子的活性的条件下，将朊病毒从中分离出来。
本发明方法的特征和其它的细节都将在下面给以更为详细的描述，并且在权利要求书中给予指明。应该理解的是，本发明的实施方案都是以说明本发明来进行的，而不是对本发明的限制。在不违背本发明的精神和不离开本发明的范围的条件下，本发明的主要特征都可以用在各种不同的实施方案中。
本发明是基于发现了对加有朊病毒的小牛血红蛋白溶液以阴离子交换柱进行色谱可以将令人惊奇高水平的朊病毒感染性从洗脱的血红蛋白组分中去除掉。本发明的将朊病毒从包括朊病毒和至少一种其它的生物分子的溶液中去除的方法包括将该溶液在形成pH梯度洗脱的条件下通过阴离子交换色谱柱。这样，朊病毒就被与至少一种生物分子相分离，也就是说，至少一种生物分子从色谱柱上洗脱在与含有朊病毒的组分不同的组分中。
在本文中，术语“朊病毒”指的是作为引起中枢神经系统疾病的致病剂的蛋白质。术语“致病剂”指的是引起疾病的物质或是引起疾病的体系中的必要成分。与朊病毒有关的疾病包括各种海绵状脑病，例如，人的皮质-纹状体-脊髓变性症、库鲁病、脑顶枕叶综合症、羊痢疾、牛海绵状脑病、以及可传染的猴类脑病等。朊病毒可以是蛋白质，例如，转录后修饰的PrP蛋白质，也可以是带有信息分子如聚核苷酸的蛋白质复合物，例如，聚脱氧核苷酸与转录后修饰的PrP蛋白质的复合物。
在本文中，术语“生物分子”指的是任何生物来源的分子，包括蛋白质，如酶、抗体、结构蛋白和转运蛋白、多肽，荷尔蒙如生长激素、胰岛素和类固醇激素，聚核苷酸，糖，和脂肪等。在本文中，优选的生物分子是具有已经证实了的用途或具有潜在用途的蛋白质、多肽、以及聚核苷酸等。
可以用于对阴离子交换色谱柱进行洗脱的适宜的pH梯度包括，如连续pH梯度，其中的洗脱液的pH是时间的函数而连续变化的。连续pH梯度的例子有线性pH梯度，其中的pH的变化是时间的线性函数。建立连续pH梯度时，可以将两种或两种以上的具有不同pH值的缓冲液混合后形成洗脱液。在洗脱液中各种缓冲液的比率以及所实现的洗脱液的pH值都可以作为时间的函数而连续变化。一般采用流量控制器来对缓冲液的混合过程进行控制，具体根据所需要的pH梯度而确定。
在本发明的另一个实施方案中，pH梯度可以是分阶式的pH梯度，其中的pH对时间的变化是不连续的，造成一阶或更多个阶，或者在不同的时间点发生pH值的突然变化。具体的方法是用具有不同的pH值的第二种缓冲液取代第一种缓冲液而作为洗脱液。在本发明方法的优选实施方案中，使用的是分阶式pH梯度。
在一种具体进行分阶式pH梯度洗脱的方法中，具有不同的pH值的一系列缓冲液被逐一按顺序地加入到色谱柱中。优选的是，缓冲液是经过了过滤的，例如通过10,000道尔顿的脱热源膜过滤。使用的缓冲液应该是离子强度低的一价缓冲液，这样，对溶液中的成分的洗脱将依据pH值来进行，而不是主要依据离子强度来进行。通常，离子强度为50mM或更低的缓冲液是适宜的。
适用于本发明方法的阴离子交换介质的例子有，二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、交联葡聚糖、琼脂、衍生的聚合物或共聚物，例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、以及苯乙烯-二乙烯苯等，它们被阳离子功能团如二乙基氨乙基或四氨乙基基团所修饰了。
在本发明的优选的实施方案中，阴离子交换介质是硅胶为基础的。该介质是用对硅胶进行水热处理来加大孔径，随后将该硅胶暴露于(γ-甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷来形成活性的表面环氧基团。然后，将这种被衍生的硅胶用叔胺处理，如用HOCH2CH2N(CH3)2处理来形成表面季胺基团。
阴离子交换色谱柱可以是重力柱，即流动相在柱中的运动是由重力造成的。流动相还可以受到柱的入口和出口之间的压力差别的作用，例如，在将样品装入柱内后再把加压的流体送入柱的进口。在优选的实施方案中，阴离子交换色谱柱是高效液相色谱柱。
在一个实施方案中，溶液包括朊病毒和血红蛋白，例如小牛血红蛋白。在该实施方案中，用第一缓冲液将溶液加入到色谱柱内的介质上并促进血红蛋白与介质的结合。然后，用第二缓冲液来调节介质的pH，洗脱非血红蛋白的各种成分，如朊病毒。然后用第三缓冲液洗脱血红蛋白，此时的血红蛋白基本不含有朊病毒。含有血红蛋白的洗脱组分的最开始和最后的部分可以被丢弃，例如，丢弃最开始的3-4％和最后的3-4％的部分，从而保证血红蛋白的纯度。
优选地，第一缓冲液是三-羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(浓度为约20mM，pH范围在约8.4-9.4之间)。第二缓冲液是第一缓冲液和第三缓冲液的混合物，其中的第二缓冲液的pH在约8.2-8.6的范围内。第三缓冲液是Tris溶液(浓度为约50mM，pH在约6.5-7.5之间)。第四缓冲液是NaCl/Tris溶液(约1.0MNaCl和约20mM Tris；pH范围是约8.4-9.4，优选约8.9-9.1)。特别优选的是，第二缓冲液的pH范围在8.2-8.4之间。
一般所使用的缓冲液的温度范围是约0℃-50℃。使用时的优选的温度范围是约12.4±1.0℃。此外，一般将缓冲液保存在约9℃-11℃的温度下。
在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括将溶液用超滤膜过滤。这一步骤可以在阴离子交换色谱之前或之后进行。在优选的实施方案中，溶液在加入到阴离子交换色谱柱之前，先经过超滤膜如100,000道尔顿超滤膜过滤。适用于本发明方法的超滤膜包括可以从Millipore公司(Bedford，MA catalog No.CDUF050 H1)和A/G Technology公司(Needham，MA，Model No.UFP100E55)购买的100,000道尔顿超滤膜。
在一个实施方案中，溶液包括属于牛海绵状脑病的致病剂的朊病毒和第二种牛的蛋白质。该第二种牛的蛋白质可以是牛血红蛋白、牛生长激素、牛免疫球蛋白、牛胰岛素、牛血清球蛋白、牛抑肽酶、牛转铁球蛋白、牛血清、牛凝血酶、和牛纤维蛋白原等。在优选的实施方案中，第二种牛的蛋白时牛血红蛋白。
在另一个实施方案中，溶液包括作为海绵状脑病的致病剂的朊病毒，如作为皮质-纹状体-脊髓变性症、库鲁病、脑顶枕叶综合症、羊痢疾等致病剂的朊病毒，以及一种或一种以上的来源于人或其它的动物的生物分子，例如，蛋白质或荷尔蒙。适宜的生物分子包括血红蛋白、胰岛素、生长激素、促性腺激素、髓磷脂、胶原、弹力蛋白、血清、血清蛋白、乳清蛋白、抗体和抗血清、因子VIII、因子IX、前凝血酶和凝血酶、红细胞生成素、组织纤维蛋白溶酶原激活子、血小板激活因子、蛋白酶、蛋白酶抑制因子、干扰素、白细胞介素、以及细胞因子等。
现在将用以下的实施例进一步具体描述本发明。
具体实施方式
实施例1采用阴离子交换色谱对牛血红蛋白的纯化
牛血红蛋白溶液的制备
牛血红蛋白溶液的制备按照在美国专利申请第08/473,497号中所描述的方法来进行。首先，收集牛全血的样品，与抗凝固剂柠檬酸钠混合形成柠檬酸化的血溶液，然后，分析其内毒素水平。收集到血溶液的样品后，将其保存在2℃的温度下，然后将其用600目的筛子过滤去除大的凝集块和颗粒。
然后将柠檬酸化的血溶液按顺序通过800μm和50μm的聚丙烯过滤器来去除血溶液中大的碎片。
然后对红血细胞进行清洗，从红血细胞中分离出细胞外血浆蛋白质，例如BSA或IgG。在清洗红血细胞时，先将血溶液放在透析过滤容器内，然后用等体积的已经被10,000道尔顿超滤膜(从Millipore公司购买，Bedford，MA catalog No.CDUF 050G1)过滤的等渗溶液稀释。该等渗溶液包括6.0g/L二水合柠檬酸钠和8.0g/L存在与注射用水中的氯化钠。
然后，用0.2μm的空心纤维透析过滤器(Microgon Krosflo II微过滤芯，Spectrum/Microgon，Laguna Hills，CA)将被稀释的血溶液浓缩回原来的体积。同时，连续地将已经过滤了的等渗溶液作为补充以相等于过滤的损失率的速率加入进去。在透析过滤中，明显地小于红血细胞的血液成分或溶于溶液中的成分如血浆溶质等，都通过了含有过滤介质的透析过滤器的外壁。稀释的血溶液中的红血细胞、血小板、和个体比较大的成分如白细胞等就被保留在连续加入的等渗溶液中而形成透析的血溶液。
清洗红血细胞时，将被稀释的血溶液保持在大约10-25℃的温度下，在透析过滤器入口处的液体压力为约25-30psi以提高效率。
当被透析过滤出的液体达到用等渗溶液稀释前的血溶液体积的约600％时终止对红血细胞的清洗。
然后将透析过的血溶液以每分钟约4升的速率泵入安装有28号环封的离心机(Sharples Super Centrifuge Model No.AS-16，Sharples Division of Alfa-Laval Separation，Inc.)内。离心的同时，加入被透析的血溶液，将红血细胞与白细胞和血小板分离开来。进行离心的时候，转速要足以使血液被分离为重的红血细胞部分和轻的白细胞部分，一般为15,000rpm。在离心的过程中，不断地将红血细胞部分与白细胞部分相分离，并从离心机中排放出来。
分离完成后，对红血细胞进行溶胞，得到含有血红蛋白的溶液。当红血细胞被从离心机中释放出来的时候，由于红血细胞相的液体流与排放它们的管道之间的一定角度所造成的相互冲击力，所以大部分的红血细胞的细胞壁都已经被机械地溶胞了，并将血红蛋白从红血细胞中释放到该红血细胞相中。
被溶胞了的红血细胞相通过其排放管道进入静电混合器(Kenics 1/2英寸，六片扇叶Chemineer，Inc.)。与此同时，将等体积的WFI加入到该静电混合器中使WFI与红血细胞相发生混合。红血细胞相以及WFI进入静电混合器的流速各自都是约每分钟0.25升。
将红血细胞相与WFI在静电混合器中的混合产生溶胞了的红血细胞胶体。然后，将该胶体转移到Sharples Super离心机(型号为AS-16)中，该离心机适合于将血红蛋白与其它的非血红蛋白的红细胞成分互相分开。离心时的转速要足以使溶胞了的红血细胞胶体被分离为轻血红蛋白相和重血红蛋白相。轻血红蛋白相包括血红蛋白和密度低于重血红蛋白非血红蛋白成分。
将血红蛋白相从离心机中释放出来，通过0.45μm的PelliconCassette微过滤器(Millipore Corporation，cat.no.HVLP 000 C5)进入存放容器以用于血红蛋白的提纯。然后，将细胞质同离心机中的滞留物一起进入存放容器。在微过滤中，存放容器的温度保持在10℃或更低的温度。为了提高效率，当把在微过滤器入口处的流体的压力从开始的约10psi提高到约25psi时，微过滤完成。经过微过滤后的血红蛋白被转移到微过滤物的存放容器内。此时，将微过滤物分为样品A和样品B两部分。样品A在此时不进行进一步的提纯。
将样品B用泵送入100,000道尔顿的超滤器(MilliporeCorporation，cat.No.CDUF 050 H1)。在微过滤物中的大部分血红蛋白和水都通过超滤器而形成超滤物，而比较大的微过滤成分如分子量大于约100,000道尔顿的蛋白质等就被超滤出来并循环回到微过滤物存放容器内。与此同时，WFI被连续地加入到微过滤物的存放容器内来补足超滤中损失的水分。继续进行超滤，直到在微过滤物存放容器内的血红蛋白的浓度低于8克/升。在超滤中，微过滤物存放容器内的温度保持在约10℃。
然后，将血红蛋白的超滤物转移到超滤物存放容器内，循环通过30,000道尔顿的超滤器(Millipore Corporation，cat.No.CDUF 050 T1)来去除小的细胞成分，例如，电解质、代谢的中间产物、水、和分子量低于30,000道尔顿的蛋白质。这样，就得到浓缩了的血红蛋白溶液，其含有约每升100克的血红蛋白。在此时，终止对样品B的初始纯化。
阴离子交换色谱介质的制备
用70℃的存在于水中的(γ-甘油脱氧丙基)三甲氧硅烷来处理硅胶，得到带有表面环氧基团的衍生硅胶。然后，将该衍生的硅胶用N，N-二甲基乙醇胺(OHCH2CH2)N(CH3)2处理，得到带有表面季胺基团的衍生硅胶。
用羊痢疾致病剂对样品的感染
在本研究中使用的羊痢疾致病剂(scrapie agent)是从Instituteof Animal Health，Edinburgh，Scotland被许可来的小鼠适应ME-7的品系。其原始的来源是天然的对Suffolk羊的感染性痢疾。将这些被感染了的羊的脑子提取物经过对Moredun随机培育的小鼠的两代传递、经过C57BL/6N的九代传递、经过C3H小鼠的一代传递、以及对C57BL/6N的另一代传递。在本研究中使用的感染材料是经过了13代传递的。
样品A(180mL)用20mL体积的羊痢疾致病物感染，得到样品A’。样品A’的等份试样被保留下来进行“证实感染”的检测，其余的就按照上述对样品B的方式进行100,000道尔顿的超滤。得到的超滤物被称为样品A”，对其按照实施例2进行羊痢疾感染性的检测。
对20mL样品B的等份试样用2mL的羊痢疾致病物进行感染，得到样品B’。样品B’的等份试样被保留下来进行“证实感染”的对照检测。其余的被感染的样品进行阴离子交换色谱。将被感染的样品B’通过色谱柱内的介质，通过阴离子交换的高效液相色谱对血红蛋白进行纯化。色谱柱的内径为8英寸，长度为24英寸。色谱柱内的介质是上述的硅胶介质。
对该色谱柱用促进血红蛋白结合的缓冲液进行预处理。然后，按照每分钟1.78升的速率将样品B’加入到色谱柱内。然后，将三种不同的缓冲液通过该色谱柱来在色谱柱内产生pH梯度，对血红蛋白进行洗脱。每一种所用的缓冲液的温度都是约12.4℃。在将各缓冲液加入到色谱柱内之前，先让它们通过10,000道尔顿的超滤膜(Millipore Corporation，cat.No.CDUF 050 G1)。每一种缓冲液的流速是每分钟3.56升。
第一种缓冲液是20mM的三-羟甲基胺甲烷(Tris，pH范围是约8.4-9.4)，它将被浓缩的血红蛋白溶液加入到色谱柱内的阴离子交换介质上。第二种缓冲液是pH为约8.3的由第一种缓冲液和第三种缓冲液组成的混合物，它对色谱柱内的pH进行调整，使感染成分被洗脱，而血红蛋白被保留。用第二种缓冲液连续平衡约30分钟。第二种缓冲液所洗脱下来的部分被作为废物丢弃掉。第三种缓冲液是50mM的Tris(pH范围是约6.5-7.5)，它将血红蛋白从色谱柱上洗脱下来。最开始的3％和最后的4％血红蛋白洗脱部分被作为废物丢弃掉。其余的血红蛋白洗脱部分，即现在称为样品B”的洗脱部分，按照实施例2所述进行羊痢疾感染活性的检测。
实施例2从牛血红蛋白制剂中去除朊病毒的方法的确认
对上述的去除方法的确认是在专门登记的设施中进行的，所遵循的程序符合美国食物和药品管理局的实验室操作规定(21CFR 58)、英国GLP规定的程序、和日本GLP的规定和OECD实验室操作规定原则[U.S.Food and Drug Administration GoodLaboratory Practice Regulation(21 CFR 58)，the United KingdomGLP Compliance Programme，the Japanese GLP Standard and theOECD Principles of Good Laboratory Practice]。
通过活体内检测来评价羊痢疾感染性的各种溶液是：1)用来对血红蛋白溶液进行感染的羊痢疾致病物溶液；2)样品A’；3)样品A”；4)样品B’；5)样品B”。
体内检测
对羊痢疾感染性的检测是由Microbiological Associates，Rockville，MD，按照公开的方法[Chesebro，SpongiformEncephalopathies：the Trasmissible Agents，in Virology，Fields，Knipe，et al.，eds.Raven Press LTD.：New York，Chapter 81，pp.2325-2336(1990)]进行的。该方法涉及用被测试的溶液的等份试样接种小鼠，监视小鼠的羊痢疾感染的临床特征，并确定一年内的存活率。
对下述溶液检测了它们的羊痢疾感染性：感染材料、样品A’(澄清的和未澄清的)、样品A”、样品B’、以及样品B”。对这些溶液的一系列的稀释如下：感染材料，稀释因子1(未稀释)、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、以及10-8；未澄清的样品A’，稀释因子1；澄清的样品A’，稀释因子1、10-1；样品A”，稀释因子1、10-1、10-2、10-3、10-4、以及10-5；样品B’，稀释因子1、10-1；样品B”，稀释因子1、10-1、10-2、10-3、10-4、以及10-5。
雌性C57BL/6小鼠被分为10只或15只一组。对15只对照组小鼠不接种，而另一组15只的载体对照组的小鼠仅用0.020mL的载体接种。其余各组的小鼠分别用0.02mL的实验溶液的各种稀释度的等份试样接种。
在365天内监视羊痢疾感染的临床特征。羊痢疾最终疾病特征包括对大的噪音的敏感、排尿不规则、毛发粗糙、行动异常、目光呆滞等。对死亡的小鼠和杀死的小鼠的脑组织进行组织学鉴定，确认羊痢疾的感染，脑组织内存在的中空结构证实了对羊痢疾的感染的诊断。
结果
对牛血红蛋白的纯化方法的总体描述见美国专利申请号08/473,479，该篇文献的内容通过在此引述而全部合并于本文。按照该方法的要求制备了两种牛血红蛋白溶液，如实施例1所述，但是，在每一次的纯化中，在不同的地方终止纯化程序。样品A进行到微过滤(0.45μm孔径)为止，而对样品B进行到透析过滤(100,000道尔顿分子量的截取)为止。
采用确认程序检验100,000道尔顿超滤步骤和阴离子交换色谱对样品的感染性的效果，这些样品是被小鼠适应的ME-7羊痢疾致病物感染的小鼠的脑匀浆物。羊痢疾致病物被用于引起牛海绵状脑病的致病剂的模型。所使用的方法是小鼠体内检测法，这是目前仅有的对朊病毒感染性的检测方法。提纯目标物之前的两种感染物的样品作为对照进行感染性检测，它们都在365天内造成了对照小鼠的100％死亡率，并且极大部分的小鼠都表现了与羊痢疾感染相吻合的脑组织形态的改变。与此相对，经过100,000道尔顿超滤膜或阴离子交换色谱所纯化的感染样品在体内检测中没有羊痢疾感染的症状出现。
体内检测的结果总结于下表中。该表中的结果表明了对每一组测试小鼠的在365天研究中的存活数、表现了羊痢疾临床特征的小鼠数、在该研究期间死亡的小鼠数和杀死的小鼠数、以及通过组织病理学确认羊痢疾感染的死亡小鼠数。
表中的数据显示，用稀释因子为10-4或更高的感染材料接种的20只小鼠中有19只表现了羊痢疾感染的临床特征，组织病理学的检查确认了羊痢疾的感染。在该组中唯一存活的小鼠可能是由接种误差造成的。
用未澄清的、未稀释的样品A’处理的小鼠全部死亡，但是，没有表现出羊痢疾的临床特征。死亡的原因是这种异源性混合物中固体物质的毒性引起的。用澄清的样品A’处理的10只小鼠在表现出羊痢疾临床特征后都死亡了，用组织病理学检查确认了其中的9只的羊痢疾感染，另外的一只因为发生了显著的自溶胞而无法用组织病理学来鉴定羊痢疾的感染。与此相对，用稀释的样品A”处理的90只小鼠中，86只在研究结束的时候依然存活，没有任何一只表现了羊痢疾感染的临床特征，对死亡的4只小鼠的脑组织的组织病理学检查结果为正常。
用样品B’接种的5只小鼠全部死亡，其中的4只显示了临床和组织病理学的羊痢疾特征。样品B”的稀释物被接种于90只小鼠，其中的84只在研究结束的时候依然存活，而死亡的小鼠也没有表现出羊痢疾感染的临床或组织病理学特征。
这些结果清楚地表明，被羊痢疾致病物感染的血红蛋白溶液可以在温和的条件下被消除污染。通过100,000道尔顿的超滤或阴离子交换色谱和pH梯度洗脱，所得到的溶液中的羊痢疾感染性被降低到体内检测的可探察水平之下。
表：去除羊痢疾致病物的确认研究的结果
样品 稀释 存活/接种   表现临床特征的个体数/死亡数或杀死数   病理学确认羊痢疾的数/被评价的数
  感染材料   10-8   9/10   0/1   0/1
  感染材料   10-7   9/10   0/1   0/1
  感染材料   10-6   9/10   1/1   1/1
  感染材料   10-5   8/10   2/2   2/2
  感染材料   10-4   0/10   10/10   10/10
  感染材料   10-3   1/10   9/9   9/9
  对照   无   12/15   0/3   0/3
  载体对照   无   15/15   0/0   0/0
  A’   未稀释   0/5   1/5   1/1
  A’   澄清的未稀释   0/5   5/5   5/5
  A’   澄清的1∶10   0/5   5/5   4/5
  A”   10-5   14/15   0/1   0/1
  A”   10-4   14/15   0/1   0/1
  A”   10-3   14/15   0/1   0/1
  A”   10-2   14/15   0/1   0/1
  A”   10-1   15/15   0/0   0/0
  A”   未稀释   15/15   0/0   0/0
  B’   未稀释   0/5   4/5   4/5
  B”   10-5   13/15   0/2   0/2
  B”   10-4   13/15   0/2   0/2
  B”   10-3   15/15   0/0   0/0
  B”   10-2   14/15   0/1   0/1
  B”   10-1   14/15   0/1   0/1
  B”   未稀释   15/15   0/0   0/0

Claims (10)

1.一种从包括有朊病毒和血红蛋白的溶液中去除朊病毒的方法，该方法包括的步骤是将该溶液在造成pH梯度洗脱的条件下通过阴离子交换色谱柱，其中，所述的阴离子交换介质包含用阳离子基团衍生的硅胶，从而将所述的朊病毒收集在一个洗脱组分中，该洗脱部分从pH在6.5到8.3的阴离子交换色谱柱中洗脱出来，由此，使得该朊病毒与该收集的蛋白分开。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的pH梯度是连续梯度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的pH梯度是分阶梯度。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的阳离子基团是季铵基团。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用超滤膜对溶液进行过滤的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的超滤膜截取的分子量为100,000道尔顿。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白来自于哺乳动物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的哺乳动物是人、牛、猪、羊、或鼠类。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的朊病毒是海绵状脑病的致病物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的海绵状脑病是羊痢疾、皮质-纹状体-脊髓变性症、库鲁病、脑顶枕叶综合症或牛海绵状脑病。
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