CN113717281A - 一种去除静注人免疫球蛋白中抗a、抗a血凝素的亲和层析用缓冲液及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种去除静注人免疫球蛋白中抗A、抗A血凝素的亲和层析用缓冲液及其用途，属于血液制品领域。该亲和层析用缓冲液包含平衡缓冲液，该平衡缓冲液由50～200mM的醋酸盐水溶液组成。利用发明的亲和层析用缓冲液配合本发明的制备方法，得到的静注人免疫球蛋白中抗A、抗B血凝素滴度低，纯度高，分子大小分布高。本发明的亲和层析用缓冲液和制备方法能够同时有效去除静注人免疫球蛋白中的抗A和抗B血凝素，不会引起免疫球蛋白聚集，具有良好的工业应用前景。

Description

一种去除静注人免疫球蛋白中抗A、抗A血凝素的亲和层析用 缓冲液及其用途

技术领域

本发明属于血液制品领域，具体涉及一种去除静注人免疫球蛋白中抗A、抗A血凝素的亲和层析用缓冲液及其用途。

背景技术

静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)是由B淋巴细胞合成、分泌的一种糖蛋白，为血液制品的主要产品之一，它通常是从健康人血浆中分离得到的。静注人免疫球蛋白中含有多种免疫球蛋白，静脉输注后能迅速提高患者血液免疫球蛋白水平，从而增强机体的抗感染(病毒、细菌和其它病原体)能力和免疫球蛋白水平，增强机体的免疫调节功能，临床上主要将其用于治疗原发性和继发性免疫球蛋白缺陷病及自身免疫性疾病。

免疫球蛋白生产工艺是由美国哈佛大学医学院Cohn教授研究开发的一种低温乙醇蛋白分离工艺，该技术通过多步调节低温乙醇法的五大要素：离子强度、pH值、温度、乙醇浓度和蛋白质含量来实现分离组分I+II+III沉淀中的组分II，再经进一步提纯得到静注人免疫球蛋白。这种传统的生产工艺采用两步法提取静注人免疫球蛋白，其最大的缺陷是生产的静注人免疫球蛋白纯度偏低，多聚体等含量偏高，容易引起输注后的不良反应。随着研究的深入，静注人免疫球蛋白的治疗范围在不断增加，如皮肤病、器官移植、肿瘤、白血病等，有的病人需要长期使用或单次大剂量输注，使用低纯度静注人免疫球蛋白的风险就会大大增加。

有研究表明，静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素(又称抗A血型抗体)、抗B血凝素(又称抗B血型抗体)是引起大剂量输注后溶血反应的主要原因，因此对静注人免疫球蛋白中抗A、抗B血凝素的滴度控制十分重要。

文献(亲和层析法去除静注人免疫球蛋白中的血型抗体，国际生物制品学杂志，2017年2月第40卷第1期)报道了一种利用亲和层析法去除静注人免疫球蛋白中的抗A/B血型抗体的方法，该方法包括以下操作：将Glycosorb A凝胶或Glycosorb B凝胶装柱；平衡：10个柱体积(CV)的注射用水(pH＝4.2)，线速度90cm/h；上样：样品线速度90cm/h，收集流穿液；冲洗：2个CV的注射用水(pH＝4.2)；柱洗脱：0.1mol/L Gly-HC1(pH＝2.7)；柱处理：2个CV的注射用水，5个CV的0.3mol/L NaOH，2个CV的注射用水，20％乙醇保存。依据中国药典2015年版四部通则3425的“抗A、抗B血凝素”，分别对Glycosorb A或GlycosorbB亲和层析前后的IVIG制品进行检测发现，该方法利用Glycosorb A层析能使样品的抗A血型抗体效价降低2个稀释倍数，而抗B血型抗体效价不受影响；利用Glycosorb B层析能使样品的抗B血型抗体效价降低2个稀释倍数，而抗A血型抗体效价不受影响。也就是说，该方法无法同时降低静注人免疫球蛋白中的抗A、抗B血凝素效价。

因此，开发出一种能够同时有效降低静注人免疫球蛋白成品中抗A、抗B血凝素滴度的方法对制备高纯度的静注人免疫球蛋白和降低临床不良反应风险具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时有效去除静注人免疫球蛋白中的抗A和抗B血凝素的亲和层析用缓冲液，以及利用该亲和层析用缓冲液来制备高纯度静注人免疫球蛋白的方法。

本发明提供了一种去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素和/或抗B血凝素的亲和层析用缓冲液，所述亲和层析用缓冲液包含平衡缓冲液，该平衡缓冲液由50～200mM的醋酸盐水溶液组成。

进一步地，所述亲和层析用缓冲液由以下两个组分组成：

组分1：预平衡缓冲液，该预平衡缓冲液由300～500mM的醋酸盐水溶液组成，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0；

组分2：平衡缓冲液。

进一步地，预平衡缓冲液中，所述醋酸盐的浓度为300～500mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0，所述醋酸盐为醋酸钠；优选的，所述醋酸盐的浓度为400mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为5.5。

进一步地，平衡缓冲液中，所述醋酸盐水溶液中醋酸盐的浓度为50～200mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0；优选的，平衡缓冲液中，所述醋酸盐水溶液中醋酸盐的浓度为100mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为5.5；和/或，所述醋酸盐为醋酸钠。

本发明还提供了上述的亲和层析用缓冲液在去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素和/或抗B血凝素中的用途。

本发明还提供了一种制备静注人免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)、取血浆，分离出组分I+II+III，对组分I+II+III进行预纯化，然后用两步离子交换层析法提纯，得亲和层析待上柱样品；

(2)、采用上述的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，将步骤(1)得到的亲和层析待上柱样品上亲和层析柱，收集流穿液。

进一步地，所述方法还包括以下步骤：(3)、将步骤(2)得到的流穿液经低pH孵放、纳米过滤、超滤，即得。

进一步地，步骤(1)中，所述组分I+II+III是通过低温乙醇法分离获得的；所述预纯化的方法为：向组分I+II+III中加水溶解，加入辛酸钠进行沉淀，过滤，保留液体；所述两步离子交换层析法提纯的操作为：将预纯化所得液体经第一步阴离子交换层析，收集第一步流穿液，再将第一步流穿液经第二步阴离子交换层析，收集第二步流穿液，即得亲和层析待上柱样品；所述第一步阴离子交换层析的填料为Q基团凝胶，所述第二步阴离子交换层析的填料为Q基团凝胶；

步骤(1)与步骤(2)之间，还包括以下步骤：采用上述的预平衡缓冲液洗亲和层析柱；所述预平衡缓冲液的用量为3倍柱体积以上，预平衡缓冲液的流速为50～300cm/h；

步骤(2)中，所述亲和层析柱的填料为

P anti-A和

Panti-B凝胶；所述平衡缓冲液的用量为5倍柱体积以上，平衡缓冲液的流速为50～300cm/h；所述待上柱样品的流速为20～300cm/h。

进一步地，所述

P anti-A和

P anti-B凝胶的质量比为1：1；所述预平衡缓冲液的用量为3倍柱体积，预平衡缓冲液的流速为200cm/h；所述平衡缓冲液的流速为200cm/h，待上柱样品的流速为200cm/h。

进一步地，步骤(3)中，所述低pH孵放的条件为：在24±1℃下孵放21～24天；所述纳米过滤的孔径为：20nm；所述超滤的截留分子量为30～50KD，透膜压力不超过0.3Mpa。

本发明还提供了上述方法制得的静注人免疫球蛋白。

层析流穿液指：经层析后从层析柱流出的液体。

亲和层析也称为亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和层析在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和层析可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

1、现有的亲和层析法有的采用磷酸盐缓冲液作为亲和层析用缓冲液，磷酸盐缓冲液可能会引起免疫球蛋白的聚合，难以彻底去除，从而增加临床不良反应的风险。而采用本发明的醋酸盐缓冲体系作为亲和层析用缓冲液不会引起免疫球蛋白聚集。

2.现有的亲和层析法有的只能去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素或抗B血凝素中的一种，但是，采用本发明的醋酸盐缓冲体系作为亲和层析用缓冲液可以同时有效去除静注人免疫球蛋白中的抗A和抗B血凝素，效果理想。

3.使用本发明的亲和层析用缓冲液，按照本发明的方法制备的静注人免疫球蛋白制品具有优良的长期保存稳定性。

4.使用本发明的亲和层析用缓冲液，按照本发明的方法制备的静注人免疫球蛋白成品的纯度高，分子大小分布高，抗A血凝素、抗B血凝素滴度低，临床副反应少。特别的，当控制亲和层析用平衡缓冲液中醋酸盐的浓度为50mM，pH为5.5时，所得静注人免疫球蛋白产品最佳，其中抗A血凝素滴度为1:4，抗B血凝素滴度为1:4，纯度为100.0％，分子大小分布为99.6％。

5.本发明的亲和层析用缓冲液配方简单、成本低廉，具有良好的工业应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明静注人免疫球蛋白的制备流程示意图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实验试剂：醋酸钠，

P anti-A和

P anti-B凝胶均为市售品。

实施例1：本发明静注人免疫球蛋白的制备

本发明静注人免疫球蛋白的制备流程见图1。制备方法具体如下：

Ⅰ、亲和层析前处理

(1)以健康人血浆为原料，采用Kistler-Nitschmann低温乙醇法分离获得组分I+II+III，组分I+II+III用注射用水溶解后，加入30wt.％辛酸钠进行沉淀，过滤分离后，收集滤液；

(2)将滤液作为上柱样品进行第一步阴离子离子交换层析，以Q基团凝胶为填料，醋酸钠缓冲液冲洗，收集第一步层析流穿液；将第一步层析流穿液作为上柱样品进行第二步阴离子离子交换层析，以Q基团凝胶为填料，醋酸钠缓冲液冲洗，收集第二步层析流穿液，作为亲和层析待上柱样品。

Ⅱ、亲和层析

(1)配制缓冲液

亲和层析用预平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：400mM醋酸钠，调pH为5.5；

亲和层析用平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：100mM醋酸钠，调pH为5.5；

(2)以

P anti-A和

P anti-B凝胶(其中

Panti-A和

P anti-B质量比为1：1)为层析柱填料，先用3倍柱体积的亲和层析用预平衡缓冲液冲洗层析柱，线流速为200cm/h；再用5倍柱体积的亲和层析用平衡缓冲液冲洗层析柱，线流速为200cm/h；然后将步骤Ⅰ得到的亲和层析待上柱样品上层析柱，线流速为200cm/h，收集流穿液。

III、静注人免疫球蛋白的制备

(1)低pH孵放：将步骤II所得流穿液于24±1℃、低pH孵放22天。

(2)纳米过滤：将步骤(1)所得制品经纳米滤膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格20nm。

(3)超滤配制：将步骤(2)所得制品经过超滤处理，超滤膜的截留分子量为40KD，透膜压力0.3Mpa；然后按成品规格，将所得制品浓缩至100g/L，加入辅料甘氨酸(20g/L)，除菌分装即得静注人免疫球蛋白成品。

经检测，得到的静注人免疫球蛋白成品中抗A血凝素滴度为1:4，抗B血凝素滴度为1:4，静注人免疫球蛋白纯度为100.0％，分子大小分布99.6％，符合药典规定。

实施例2：本发明静注人免疫球蛋白的制备

制备方法具体如下：

Ⅰ、层析前处理

同实施例1的步骤I。

Ⅱ、亲和层析

(1)配制缓冲液

亲和层析用预平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：400mM醋酸钠，调pH＝5.5；

亲和层析用平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：50mM醋酸钠，调pH为4.0；

(2)同实施例1步骤II中的步骤(2)。

III、静注人免疫球蛋白(层析法)成品的制备

同实施例1的步骤III。

经检测，得到的静注人免疫球蛋白成品中抗A血凝素滴度为1:8，抗B血凝素滴度为1:8，静注人免疫球蛋白纯度为99.5％，分子大小分布为99.1％，符合药典规定。

实施例3：本发明静注人免疫球蛋白的制备

制备方法具体如下：

Ⅰ、层析前处理

同实施例1的步骤I。

Ⅱ、亲和层析

(1)配制缓冲液

亲和层析用预平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：400mM醋酸钠，调pH为5.5；

亲和层析用平衡缓冲液为醋酸钠缓冲液：200mM醋酸钠，调pH为8.0；

(2)同实施例1步骤II中的步骤(2)。

III、静注人免疫球蛋白(层析法)成品的制备

同实施例1的步骤III。

经检测，得到的静注人免疫球蛋白成品中抗A血凝素滴度为1:4，抗B血凝素滴度为1:8，静注人免疫球蛋白纯度为99.9％，分子大小分布98.6％，符合药典规定。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1：本发明亲和层析用平衡缓冲液的筛选试验

一、各静注人免疫球蛋白成品的制备方法

除步骤II中缓冲液配方以外，其它步骤均同实施例1的制备方法，制得3组静注人免疫球蛋白成品。按照表1所示配方分别配制各亲和层析用预平衡缓冲液和亲和层析用平衡缓冲液：

表1各亲和层析用预平衡缓冲液和亲和层析用平衡缓冲液

二、检测方法

判断静注人免疫球蛋白产品优劣，采用的指标为抗A血凝素、抗B血凝素。按照《中国药典》2015版的记载，检测3组静注人免疫球蛋白成品中抗A血凝素、抗B血凝素滴度，静注人免疫球蛋白纯度，分子大小分布。

三、检测结果

对使用不同亲和层析用平衡缓冲液制得的静注人免疫球蛋白成品进行考察，产品抗A血凝素、抗B血凝素、纯度、分子大小分布结果见表2。

表2静注人免疫球蛋白成品检测结果

配方	抗A血凝素	抗B血凝素	纯度	分子大小分布
					1(n＝4)	1:16	1:16	99.5％	98.5％
2(n＝3)	1:8	1:16	99.8％	98.3％
					3(n＝3)	1:4	1:4	100.0％	99.6％

由表2可见，使用本发明配方3的亲和层析用平衡缓冲液制备得到的静注人免疫球蛋白成品抗A血凝素滴度为1:4，抗B血凝素滴度为1:4，纯度为100.0％，分子大小分布为99.6％。使用本发明配方1的亲和层析用平衡缓冲液制备得到的静注人免疫球蛋白成品抗A血凝素滴度为1:16，抗B血凝素滴度为1:16，纯度为99.5％，分子大小分布为98.5％；该与配方3得到的静注人免疫球蛋白成品相比，其血凝素含量增高，分子大小分布降低，临床不良反应风险增高。使用本发明配方2的亲和层析用平衡缓冲液制备得到的静注人免疫球蛋白成品抗A血凝素滴度为1:8，抗B血凝素滴度为1:16，纯度为99.8％，分子大小分布为98.3％；与配方3得到的静注人免疫球蛋白成品相比，其血凝素含量增高，分子大小分布降低，临床不良反应风险增高。

上述实验结果表明，采用本发明的亲和层析用平衡缓冲液，可以有效去除静注人免疫球蛋白成品中的抗A、抗B血凝素，提高产品纯度和分子大小分布，所得静注人免疫球蛋白成品符合药典要求。此外，使用本发明配方3所示特定的亲和层析用平衡缓冲液制得的静注人免疫球蛋白成品抗A血凝素滴度为1:4，抗B血凝素滴度为1:4，纯度为100.0％，分子大小分布为99.6％，有效降低了产品的临床不良反应风险。

试验例2：本发明制备的静注人免疫球蛋白成品的保存稳定性

一、试验方法

取实施例1制备的静注人免疫球蛋白成品，分别考察其在2-8℃(常规保存条件)和25℃(加速稳定性)保存条件下的稳定性。

抗A血凝素滴度、抗B血凝素滴度、纯度、分子大小分布的检测方法同试验例1。结果见表3和表4。

二、试验结果

表3 2-8℃稳定性试验结果(n＝3)

起始

3月

6月

9月

12月

18月

24月

抗A血凝素

1:4

1:4

1:8

1:4

1:4

1:4

1:4

抗B血凝素

1:4

1:4

1:4

1:4

1:8

1:4

1:4

纯度(％)

100

100

99.9

100

99.9

100

100

分子大小分布(％)

99.6

99.7

99.5

99.7

99.6

99.2

99.3

由表3可见，2-8℃条件下，本发明静注人免疫球蛋白成品保存24个月内，抗A血凝素滴度、抗B血凝素滴度、纯度、分子大小分布均无明显变化，较小波动为检测允许误差。

表4 25℃加速稳定性试验结果(n＝3)

	起始	1月	2月	3月	6月
						抗A血凝素	1:4	1:4	1:4	1:8	1:4
抗B血凝素	1:4	1:4	1:8	1:4	1:4
						纯度(％)	100	100	100	100	99.9
分子大小分布(％)	99.6	99.7	99.2	99.5	99.3

由表4可见，25℃条件下，本发明静注人免疫球蛋白成品保存6个月内，抗A血凝素滴度、抗B血凝素滴度、纯度、分子大小分布均无明显变化，较小波动为检测允许误差。

上述实验结果表明，使用本发明的亲和层析用平衡缓冲液，按照本发明的方法制备的静注人免疫球蛋白制品不仅抗A血凝素、抗B血凝素滴度低，纯度高，分子大小分布高，而且还具有优良的长期保存稳定性。

综上，本发明提供了一种去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素和抗B血凝素的亲和层析用缓冲液，以及利用该亲和层析用缓冲液制备高纯度静注人免疫球蛋白的方法。利用发明的亲和层析用缓冲液配合本发明的制备方法，得到的静注人免疫球蛋白抗A、抗B血凝素滴度低，纯度高，分子大小分布高。本发明的亲和层析用缓冲液和制备方法能够同时有效去除静注人免疫球蛋白中的抗A和抗B血凝素，不会引起免疫球蛋白聚集，具有良好的工业应用前景。

Claims (10)

1.一种去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素和/或抗B血凝素的亲和层析用缓冲液，其特征在于：所述亲和层析用缓冲液包含平衡缓冲液，该平衡缓冲液由50～200mM的醋酸盐水溶液组成。

2.根据权利要求1所述的亲和层析用缓冲液，其特征在于：所述亲和层析用缓冲液由以下两个组分组成：

组分1：预平衡缓冲液，该预平衡缓冲液由300～500mM的醋酸盐水溶液组成，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0；

组分2：平衡缓冲液。

3.根据权利要求2所述的亲和层析用缓冲液，其特征在于：预平衡缓冲液中，所述醋酸盐的浓度为300～500mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0，所述醋酸盐为醋酸钠。

4.根据权利要求1～3任一项所述的亲和层析用缓冲液，其特征在于：平衡缓冲液中，所述醋酸盐水溶液中醋酸盐的浓度为50～200mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为4.0～8.0；优选的，平衡缓冲液中，所述醋酸盐水溶液中醋酸盐的浓度为100mM，所述醋酸盐水溶液的pH值为5.5；和/或，所述醋酸盐为醋酸钠。

5.权利要求1～4任一项所述的亲和层析用缓冲液在去除静注人免疫球蛋白中的抗A血凝素和/或抗B血凝素中的用途。

6.一种制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)、取血浆，分离出组分I+II+III，对组分I+II+III进行预纯化，然后用两步离子交换层析法提纯，得亲和层析待上柱样品；

(2)、采用权利要求1～5任一项中所述的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，将步骤(1)得到的亲和层析待上柱样品上亲和层析柱，收集流穿液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：(3)、将步骤(2)得到的流穿液经低pH孵放、纳米过滤、超滤，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述组分I+II+III是通过低温乙醇法分离获得的；所述预纯化的方法为：向组分I+II+III中加水溶解，加入辛酸钠进行沉淀，过滤，保留液体；所述两步离子交换层析法提纯的操作为：将预纯化所得液体经第一步阴离子交换层析，收集第一步流穿液，再将第一步流穿液经第二步阴离子交换层析，收集第二步流穿液，即得亲和层析待上柱样品；所述第一步阴离子交换层析的填料为Q基团凝胶，所述第二步阴离子交换层析的填料为Q基团凝胶；

步骤(1)与步骤(2)之间，还包括以下步骤：采用权利要求2～5任一项中所述的预平衡缓冲液洗亲和层析柱；所述预平衡缓冲液的用量为3倍柱体积以上，预平衡缓冲液的流速为50～300cm/h；

步骤(2)中，所述亲和层析柱的填料为

P anti-A和

P anti-B凝胶；所述平衡缓冲液的用量为5倍柱体积以上，平衡缓冲液的流速为50～300cm/h；所述待上柱样品的流速为20～300cm/h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述

P anti-A和

P anti-B凝胶的质量比为1：1；所述预平衡缓冲液的用量为3倍柱体积，预平衡缓冲液的流速为200cm/h；所述平衡缓冲液的流速为200cm/h，待上柱样品的流速为200cm/h。

10.权利要求6～9任一项所述方法制得的静注人免疫球蛋白。

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