CN112111004A

CN112111004A - 一种兔免疫球蛋白的生产工艺

Info

Publication number: CN112111004A
Application number: CN202010882180.6A
Authority: CN
Inventors: 刘兰军; 武志强; 容新宗; 李春阳; 李佳林
Original assignee: CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112111004B

Abstract

本发明公开了一种免疫球蛋白的生产工艺，属于生物制品领域，尤其涉及免疫球蛋白的生产工艺领域。其是用SPF兔血清灭活补体后，经辛酸沉淀过滤得到澄清液；并将澄清液依次通过以下层析：亲和层析、阴离子交换层析、抗A/抗B层析，能最终获得收率和纯度均较高的免疫球蛋白产品。

Description

一种兔免疫球蛋白的生产工艺

技术领域

本发明属于生物制品领域，尤其涉及免疫球蛋白的生产工艺领域。

背景技术

免疫球蛋白是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，可分为分泌型和膜型。前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能；后者构成B细胞膜上的抗原受体。生物制品领域中，免疫球蛋白通常指的是分泌型免疫球蛋白。

免疫球蛋白对机体免疫极其重要，其不仅能中和毒素、阻断病原体入侵，还能在结合特异性抗原(通常是病原体)后，通过激活补体及与靶细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)、介导超敏反应等作用。免疫球蛋白因此常用于提高病人的免疫力。

兔免疫球蛋白是从兔血清中制备得到的免疫球蛋白产品。其制备过程中需要用辛酸-硫酸铵盐析纯化，再用人源吸附材料(人红细胞、人血小板、人胎盘组织、人血浆等)吸附杂抗体，再用DEAE-Sephadex A-50色谱纯化制备(《中国药典》2015版，第三部)。

硫酸铵是环保限制用化学品，会产生不可忽视的环保压力；人源吸附材料可能携带外源病毒，增加产品的使用风险。但省略硫酸铵沉淀或人源吸附材料则难以保证产品质量，例如导致：纯度不高，IgG单体和二聚体的总的(IgG单体+二聚体)比例不高，A/B血凝素抗体效价超过药典要求标准等。

目前，市售兔免疫球蛋白产品中免疫球蛋白纯度为90％～95％，IgG单体+二聚体比例仅为90％左右。质量有待进一步提高。

兔免疫球蛋白的生产工艺需要改进。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种方法环保、产品安全且高质量的兔免疫球蛋白的生产工艺。

本发明的技术方案如下：

一种兔免疫球蛋白的生产工艺，包括以下步骤：

1)取兔血清，辛酸沉淀，过滤，取滤过液；

2)亲和层析：用pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液稀释至蛋白含量不高于5g/L，上亲和层析柱，用pH 3.5-4.0的醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱组分；

3)阴离子交换层析：调节步骤2)洗脱组分的pH至5.0-5.5，过离子交换柱，加pH5.5的醋酸钠缓冲液洗涤，收集流穿洗涤混合液；

4)抗A/抗B层析：按(1-2)∶(2-3)比例混合Eshmuno PAnti-A和Eshmuno PAnti-B亲和凝胶作为层析填料，阴离子交换层析流穿洗涤混合液用含50-80mM NaCl的、pH为4.8-5.2的柠檬酸缓冲液超滤浓缩至蛋白含量25-35g/L，调pH至4.8-5.2，上样，收集流穿组分。

如前述的生产工艺，所述工艺还包括如下步骤：

5a)混合液超滤浓缩至蛋白含量为35-45g/L，用磷酸调pH至3.4-4.0，再纳米膜过滤，pH 3.4-4.0下孵放2h；或，

5b)混合液超滤浓缩至蛋白含量为35-45g/L，用磷酸调pH至3.4-4.0，孵放2h，再经纳米膜过滤。

如前述的生产工艺，步骤2)为：用7.4的磷酸盐缓冲液稀释至蛋白含量1g/L，上亲和层析柱，用pH 3.5的醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱组分。

如前述的生产工艺，步骤2)的磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度为20mM；和/或，所述醋酸钠缓冲液中醋酸钠的浓度是50mM。

如前述的生产工艺，步骤3)为：调节步骤2)洗脱组分的pH至5.0，过离子交换柱，加pH5.5的醋酸钠缓冲液洗涤，收集流穿洗涤混合液。

如前述的生产工艺，步骤3)所述醋酸钠缓冲液中醋酸钠的浓度为20mM。

如前述的生产工艺，步骤4)中Eshmuno PAnti-A和Eshmuno PAnti-B亲和凝胶的比例为1∶1。

如前述的生产工艺，步骤4)中柠檬酸缓冲液中NaCl含量为80mM。

如前述的生产工艺，步骤4)中调pH至5.0。

前述生产工艺制备得到的兔免疫球蛋白。

本发明的有益效果如下：

1)收率高。本发明的工艺可实现80％以上的总收率。

2)纯度高。纯度高达95％，比市售兔免疫球蛋白纯度显著提高。

3)单体比例高。抗A/抗B层析后，免疫球蛋白IgG单体比例高达99.39％，显著高于《中国药典》(2015版)的标准(IgG单体和二聚体≥90％)和市售兔免疫球蛋白。

4)A、B血凝素抗体效价低。抗A/抗B层析后，免疫球蛋白抗A、抗B血凝效价均为1∶8，远低于《中国药典》(2015版)标准(1∶64)。

5)摩尔渗透压浓度适宜。本发明的工艺制备得到的产品，摩尔渗透压浓度不高于308mOsmol/kg。

6)未使用人源或动物源吸附材料，降低了病原体引入风险。

7)未使用硫酸铵沉淀，更加环保。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明工艺流程图。

图2：层析收集液SDS-PAGE图。泳道1，亲和层析收集液；泳道2，蛋白分子量标准；泳道3，抗A/抗B层析收集液；泳道4，市售产品1；泳道5，市售产品2；泳道6，蛋白分子量标准。

图3：三步层析收集液SEC-HPLC图。A，亲和层析收集液；B，离子交换层析收集液；C，抗A/抗B层析收集液；D，市售品1；E，市售品2。

具体实施方式

实施例1一种兔免疫球蛋白的生产工艺

本发明的生产工艺主要包括如下所述的步骤：

(1)血清分离：采集SPF兔全血，37℃放置1-2h(或4℃过夜)，血液凝集后，2000rpm离心15min，收集血清(如血细胞残留较多，可进行第二次离心)。

(2)辛酸沉淀：60mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)与血清按比例(如1∶1、2∶1、3∶1或4∶1)混合，再添加一定量正辛酸(如10μl/ml-50μl/ml)，剧烈震荡或搅拌(如1000rpm)一定时间(如30min-2h)。再加入助滤剂(如硅藻土)充分混合后，过12-5.0μm孔径滤板，收集滤过液。

(3)亲和层析：将(2)得到的滤过液用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至蛋白含量1g/L，按20倍填料体积上样，流速60cm/h，上样。用50mM醋酸钠缓冲液(pH3.5)洗脱，收集洗脱组分。所用的亲和层析填料可以是Protein A或Protein G配基亲和填料，优选为ProteinA配基亲和填料。

(4)阴离子交换层析：用0.5M NaOH调节亲和洗脱液pH至5.0过离子交换柱。柱平衡缓冲液为：20mM醋酸钠缓冲液(pH5.5)，流速60cm/h。收集流穿组分。

(5)抗A/抗B层析：EshmunoPAnti-A和EshmunoPAnti-B亲和凝胶按1∶1的比例混装，离子交换流穿洗涤混合液用含80mM NaCl、pH为5.0的柠檬酸缓冲液超滤浓缩至蛋白含量为30g/L，然后调pH至5.0，以同样缓冲液平衡层析柱，以线速度70cm/h平衡、上样。收集流穿组分。

(6)配制：将流穿组分超滤浓缩至蛋白含量为40g/L，用磷酸调pH至3.7，然后通过纳米膜过滤，过滤量为70g/24h，将纳滤后的溶液经合并、除菌后于25±2℃下进行低pH值(pH 3.7±0.3)孵放不少于2h，孵放后溶液经混合、配制、除菌后分装，得到SPF兔IgG浓缩液。

与《中国药典》(2015版)相比，本发明的工艺所得产品在纯度、IgG单体和二聚体比例、硫酸铵残留、人源外源因子引入方面均有优势。如表1所示。

表1本发明所得产品与《中国药典》(2015版)比较

指标	《中国药典》(2015版)标准	本发明标准
			纯度	≥90％	≥95％
分子大小分布	IgG单体+二聚体≥90％	IgG单体+二聚体≥95％
			硫酸铵残留量	≤0.5g/L	无
抗A、抗B血凝素	≤1∶64	≤1∶64(通常为1∶8)
			人源外源因子引入	有	无

以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1纯度测定

使用SDS-PAGE分析(具体见《中国药典》(2015版)通则0541第五法)实施例1的亲和层析收集液、抗A/抗B层析收集液中蛋白分子量，并以市售兔免疫球蛋白产品(市售产品1、市售产品2)为对照。

结果显示：实施例1的亲和层析收集液和抗A/抗B层析收集液中蛋白条带清晰、浓厚，无明显杂带，而市售产品1和2出现了40kDa附近低分子量杂带和50～70kDa附近的模糊信号(图2)。

通过灰度分析，可知实施例1的亲和层析收集液、抗A/抗B层析收集液的主要条带比例均大于95％，表明纯度在95％以上；市售产品1和市售产品2的纯度均大于90％，但显著小于95％。

实验例2分子大小分布测定

根据《中国药典》(2015版)通则3122，检测实施例1的亲和、离子交换和抗A/抗B三步收集液IgG分子大小分布，以及兔免疫球蛋白进口市售品(分别以“市售品1”、“市售品2”表示)的IgG分子大小分布。

结果如图3和表2所示。可见IgG单体的比例很高，在亲和层析步骤已经达到98.64％，离子交换层析后达到99％以上，显著高于《中国药典》(2015版)的标准(IgG单体和二聚体≥90％)以及进口市售品。

表2三步层析收集液中分子大小分布

层析步骤	多聚体比例(％)	二聚体比例(％)	单体比例(％)
				亲和层析	0.47	0.73	98.64
离子交换层析	0	0.41	99.37
				抗A/抗B层析	0	0.22	99.39
市售品1	0.37	8.96	90.44
				市售品2	0	5.38	92.27

实验例3抗A、抗B血凝素测定

根据《中国药典》(2015版)通则3425，测实施例1的免疫兔血清深滤液、亲和层析洗脱收集液和抗A/抗B层析流穿收集液的A/B血凝素抗体效价。

检测结果如表3所示。可见经过3步层析后，纯化产物的A/B血凝素抗体效价均为1∶8，远低于《中国药典》标准(1∶64)。

表3抗A、B血凝素效价

样品名称	A血凝素抗体效价	B血凝素抗体效价
			免疫兔血清深滤液	＞1∶128	＞1∶128
Protein A洗脱收集液	＞1∶128	＞1∶128
			抗A/抗B层析流穿收集液	1∶8	1∶8

综上，本发明的工艺可生产得到纯度高、IgG单体和二聚体比例高(其中IgG单体比例尤其高)、A/B血凝素抗体效价低的兔免疫球蛋白，工艺未引入硫酸铵和人源外源物质，应用前景良好。

Claims

1.一种兔免疫球蛋白的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1)兔血清，辛酸沉淀，过滤，取滤过液；

4)抗A/抗B层析：按(1-2):(2-3)比例混合Eshmuno PAnti-A和Eshmuno PAnti-B亲和凝胶作为层析填料，阴离子交换层析流穿洗涤混合液用含50-80mM NaCl的、pH为4.8-5.2的柠檬酸缓冲液超滤浓缩至蛋白含量25-35g/L，调pH至4.8-5.2，上样，收集流穿组分。

2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：

所述工艺还包括如下步骤：

5a)混合液超滤浓缩至蛋白含量为35-45g/L，用磷酸调pH至3.4-4.0，再纳米膜过滤，pH3.4-4.0下孵放2h；或，

3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：步骤2)为：用7.4的磷酸盐缓冲液稀释至蛋白含量1g/L，上亲和层析柱，用pH 3.5的醋酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱组分。

4.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤2)的磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度为20mM；和/或，所述醋酸钠缓冲液中醋酸钠的浓度是50mM。

5.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤3)为：调节步骤2)洗脱组分的pH至5.0，过离子交换柱，加pH5.5的醋酸钠缓冲液洗涤，收集流穿洗涤混合液。

6.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤3)所述醋酸钠缓冲液中醋酸钠的浓度为20mM。

7.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤4)中Eshmuno PAnti-A和Eshmuno PAnti-B亲和凝胶的比例为1：1。

8.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤4)中柠檬酸缓冲液中NaCl含量为80mM。

9.如权利要求1～3任一所述的生产工艺，其特征在于：步骤4)中调pH至5.0。

10.权利要求1～9任一所述的生产工艺制备得到的免疫球蛋白。