CN117625558A - 一种流感病毒裂解疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1.流感病毒株接种鸡胚，经培养后收获病毒液；S2.病毒灭活；S3.超滤浓缩；S4.病毒纯化；S5.病毒液裂解；S6.超滤去除大分子杂质：使用截留分子量为300KD或500KD的超滤膜包进行超滤，收集透过液B；S7.超滤去除小分子杂质：使用截留分子量为30KD或50KD的超滤膜包进行超滤，收集回流液C；S8.除菌过滤：使用0.45+0.2μm的除菌滤器进行除菌过滤，得到流感病毒裂解原液D。本申请改变了超滤浓缩这一操作步骤的顺序，在步骤S5.病毒液裂解之后进行S6.超滤去除大分子杂质的操作，同时增加了S7.超滤去除小分子杂质这一步骤，选取合适截留分子量的超滤膜包，使得最终获得的原液具有较高的纯度，减低流感疫苗注射的不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及流感病毒疫苗技术领域，特别涉及一种流感病毒裂解疫苗的制备方法。
背景技术
流感是导致人类生病和死亡的一个重要原因，并可能会在世界范围内产生重大的社会和经济影响。流感大流行时许多人需要医生治疗或者住院。流感大流行往往导致很高的死亡率，受影响的绝大多数是老年人。目前很多国家随着人口老龄化，老人所占国家人口比例也在快速增高，流感大流行对国家所造成的影响可想而知。现在，通常可用的预防流感的唯一方法是疫苗接种。流感病毒裂解疫苗是在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，以去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的生产工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成的。
尽管疫苗可及，受种者却因缺乏对疫苗安全性、有效性，以及对所防疾病的认知，而导致延迟接种或拒绝接种疫苗，从而使自身暴露于本可以预防的疾病风险之下，导致“疫苗犹豫”。对疫苗安全性的担忧主要是接种存在不良反应。在流感病毒疫苗的制备工艺中，通常需要去除疫苗中的杂蛋白和杂质，仅保留HA和NA抗原成分，提高疫苗纯度，从而降低不良反应，提升疫苗安全性。但是目前国内生产的流感病毒裂解疫苗在经过裂解及纯化后，还有部分非必要成分尚未去除，容易引发接种后的不良反应，并带来一定的安全隐患。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，以解决流感病毒裂解疫苗制备时杂蛋白不能完全去除、疫苗纯度较低的问题。
以为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1.流感病毒株接种鸡胚，经培养后收获病毒液；
S2.病毒灭活；
S3.超滤浓缩；
S4.病毒纯化；
S5.病毒液裂解；
S6.超滤去除大分子杂质；
使用截留分子量为300KD或500KD的超滤膜包对所述步骤S5获得的病毒裂解液A进行超滤，收集透过液B；
S7.超滤去除小分子杂质；
使用截留分子量为30KD或50KD的超滤膜包对所述透过液B进行超滤，收集回流液C；
S8.除菌过滤；
使用0.45+0.2μm的除菌滤器对所述回流液C进行除菌过滤，得到流感病毒裂解原液D。
进一步的，所述步骤S6中，在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa。
进一步的，所述步骤S6中，超滤使用溶液为0.01mol/L pH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为10～20倍。
进一步的，所述步骤S7中，超滤使用溶液为0.01mol/L pH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为5～10倍。
进一步的，所述步骤S7中，在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa。
进一步的，所述步骤S7中，浓缩倍数为20～40倍。
进一步的，所述步骤S2中，收获的含有病毒的尿囊液加入100～200μg/mL、终浓度为0.01％～0.02％的甲醛，置于2～8℃灭活120～240h。
进一步的，所述步骤S3中，灭活后的尿囊液经澄清处理后，用截留分子量为300KD或750KD的超滤膜包超滤浓缩不超过20倍。
进一步的，所述步骤S5中，使用终浓度为0.5％的TritonX-100对步骤S4获得的初步浓缩纯化的病毒液进行裂解，裂解时间为1.5～2h，得到病毒裂解液A。
相对于现有技术，本发明所述的一种流感病毒裂解疫苗的制备方法具有以下优势：在保留抗原的基础上，进一步去除流感病毒裂解原液中更多的蛋白质，提高流感病毒裂解疫苗的纯度，可有效降低疫苗接种后的不良反应发生率。同时操作更简单便捷，适合工业化大规模生产。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例1的批次1制备的原液和对比例2的批次1制备的原液的电泳对比图；
图2为实施例1的批次2制备的原液和对比例2的批次2制备的原液的电泳对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。首先应说明的是，下述实验例中的数据是由发明人通过大量实验获得，限于篇幅，在说明书中只展示其中的一部分，且本领域普通技术人员可以在此数据下理解并实施本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些改动或修改同样落于本申请所保护的范围。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
本发明的一种流感病毒裂解疫苗的制备方法包括如下步骤：
S1.流感病毒株接种鸡胚，经培养后收获病毒液；
具体的，将用PBS缓冲液稀释后的流感病毒接种于鸡胚尿囊腔内，每胚0.2mL。接种后置于32～35℃条件下培养48～72h。筛选出活鸡胚置于2～8℃冷胚12～16h，吸取外观澄清的尿囊液于无菌容器中，取样进行尿囊收获液检定。关于流感病毒接种、培养及收获可参考现有技术。
S2.病毒灭活；
具体的，收获的含有病毒的尿囊液加入100～200μg/mL、终浓度为0.01％～0.02％的甲醛，置于2～8℃灭活120～240h；灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定。关于病毒灭活可参考现有技术。
S3.超滤浓缩；
具体的，灭活后的尿囊液经澄清处理后，用截留分子量为300KD或750KD的超滤膜包超滤浓缩不超过20倍。关于超滤浓缩可参考现有技术。
S4.病毒纯化；
具体的，病毒纯化包括连续流蔗糖密度梯度离心和分子筛层析纯化。所述连续流蔗糖密度梯度离心是采用KII超高速离心机或CC40NX超高速离心机在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入体积比为50～60％蔗糖溶液，同时调节机器转速至30000～35000rpm，连续泵入浓缩后的病毒液，待进样完毕后，泵入5～15L缓冲液后，开始制动，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰。所述分子筛层析纯化是采用分子筛凝胶介质sepharose4FF，层析设备APPS Process或AKTAprocess层析系统进行层析纯化，缓冲液为0.01mol/LpH为7.2的PBS缓冲溶液。离心后的病毒液经澄清处理后上样，上样流速为30～60cm/h。平衡1.4-3个柱体积后，按照5％～15％的柱体积上样，进行分子筛层析纯化，洗脱流速30～60cm/h，收集得到初步浓缩纯化的病毒液，蛋白质含量为450～1000μg/mL。通过分子筛层析纯化可以去除大部分的蔗糖和部分的杂质。
S5.病毒液裂解；
具体的，使用终浓度为0.5％的Triton X-100对所述初步浓缩纯化的病毒液进行裂解，裂解时间为1.5～2h，得到病毒裂解液A。关于病毒液裂解，可参考现有技术。
S6.超滤去除大分子杂质；
具体的，使用截留分子量为300KD或500KD的超滤膜包对所述病毒裂解液A进行超滤，收集透过液B。在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa，超滤使用溶液为0.01mol/LpH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为10～20倍。收集得到的透过液B中蛋白分子量不高于300KD。通过步骤S6可以去除大分子杂质，并且对裂解液进行稀释。
S7.超滤去除小分子杂质；
具体的，使用截留分子量为30KD或50KD的超滤膜包对所述透过液B进行超滤，浓缩倍数为20～40倍，收集回流液C。在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa，超滤使用溶液为0.01mol/L pH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为5～10倍。收集得到的回流液C中蛋白质含量为300～1000μg/mL。通过步骤S7可以去除小分子杂质，并进一步去除裂解剂。
S8.除菌过滤。
具体的，使用0.45+0.2μm的除菌滤器对所述回流液C进行除菌过滤，得到流感病毒裂解原液D。
对比例1
采用CN115992101B一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法制备得到的流感病毒裂解原液。
对比例2
S1.流感病毒株接种鸡胚，经培养后收获病毒液；
S2.病毒灭活；
S3.超滤浓缩；
S4.病毒纯化；
S5.病毒液裂解得到裂解液A；
对比例2中步骤S1～S5的具体操作同本申请的实施例1。
S6.超滤去除杂质及裂解液：使用截留分子量为100KD的超滤膜包对步骤S5得到的裂解液A进行洗滤浓缩，收集回流液E。
S7.除菌过滤：使用0.45+0.2μm的除菌滤器对所述回流液E进行除菌过滤，得到流感病毒裂解原液。
将采用本申请实施例1、对比例1及对比例2方法分别获得的六个批次流感病毒裂解原液进行纯度的检测，具体结果如表1所示。纯度＝蛋白质含量/血凝素含量。血凝素为目标物，纯度值越小表明杂蛋白越少。
表1
| 批号 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 |
| 批次1 | 1.5 | 1.94 | 2.7 |
| 批次2 | 1.6 | 1.87 | 2.8 |
| 批次3 | 1.7 | 1.90 | 3.0 |
| 批次4 | 1.6 | 1.89 | 2.7 |
| 批次5 | 1.4 | 1.93 | 2.5 |
| 批次6 | 1.6 | 1.94 | 2.5 |
通过表1可知，采用本申请方法制备的原液纯度高于对比例，能有效提高产品的纯度，降低流感病毒裂解疫苗接种后的不良发生率。现有技术流感病毒裂解疫苗的制备过程中，例如对比例1，通常是在蔗糖离心纯化之后、裂解液裂解之前，采用超滤浓缩的方法去除蔗糖和杂质，而且在病毒液裂解以后还需要额外的步骤去除裂解剂。尽管在裂解之后也采用了纯化的方法，但是最终获得的原液纯度不好，仍然存在一定的杂蛋白，可能会引起流感疫苗注射的不良反应。而本申请改变了超滤浓缩这一操作步骤的顺序，在步骤S5.病毒液裂解之后进行S6.超滤去除大分子杂质的操作，同时增加了S7.超滤去除小分子杂质这一步骤，并在步骤S6和步骤S7中选取合适截留分子量的超滤膜包，使得最终获得的原液具有较高的纯度，减低流感疫苗注射的不良反应。相比于实施例1的多步纯化(超滤去除大分子杂质、超滤去除小分子杂质、除菌过滤)，对比例2减少了超滤去除杂质的步骤，最终获得的原液纯度较低。
将实施例1和对比例2制备的原液进行电泳，鉴于篇幅原因，仅展示实施例1的批次1制备的原液和对比例2的批次1制备的原液的电泳对比图如图1所示，以及实施例1的批次2制备的原液和对比例2的批次2制备的原液的电泳对比图如图2所示。通过图1～2可知，实施例1制备的原液电泳色带在保留有效成分(HA、HA1、HA2)的前提下，条带数量远远少于对比例2的条带，表明采用本申请方法制备的原液杂蛋白种类及含量均明显减少。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.流感病毒株接种鸡胚，经培养后收获病毒液；
S2.病毒灭活；
S3.超滤浓缩；
S4.病毒纯化；
S5.病毒液裂解；
S6.超滤去除大分子杂质；
使用截留分子量为300KD或500KD的超滤膜包对所述步骤S5获得的病毒裂解液A进行超滤，收集透过液B；
S7.超滤去除小分子杂质；
使用截留分子量为30KD或50KD的超滤膜包对所述透过液B进行超滤，收集回流液C；
S8.除菌过滤；
使用0.45+0.2μm的除菌滤器对所述回流液C进行除菌过滤，得到流感病毒裂解原液D。
2.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa。
3.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，超滤使用溶液为0.01mol/LpH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为10～20倍。
4.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，超滤使用溶液为0.01mol/LpH为7.2的PBS缓冲溶液，洗滤倍数为5～10倍。
5.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，在超滤期间，保持膜包进液压力不高于0.15Mpa，回流压力不高于0.06Mpa。
6.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，浓缩倍数为20～40倍。
7.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，收获的含有病毒的尿囊液加入100～200μg/mL、终浓度为0.01％～0.02％的甲醛，置于2～8℃灭活120～240h。
8.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，灭活后的尿囊液经澄清处理后，用截留分子量为300KD或750KD的超滤膜包超滤浓缩不超过20倍。
9.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，使用终浓度为0.5％的Triton X-100对步骤S4获得的初步浓缩纯化的病毒液进行裂解，裂解时间为1.5～2h，得到病毒裂解液A。
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