JP4031833B2 - プリオンのクロマトグラフィー除去方法 - Google Patents
プリオンのクロマトグラフィー除去方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4031833B2 JP4031833B2 JP50429698A JP50429698A JP4031833B2 JP 4031833 B2 JP4031833 B2 JP 4031833B2 JP 50429698 A JP50429698 A JP 50429698A JP 50429698 A JP50429698 A JP 50429698A JP 4031833 B2 JP4031833 B2 JP 4031833B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- prion
- solution
- scrapie
- anion exchange
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
Description
海綿状脳症は初老期痴呆をもたらし、典型的に致死的である中枢神経系の哺乳類の疾病である。これらの中にはヒト疾病クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー及びゲルストマン−ストラウスラー(Straussler)−シェインケン(Scheinken)症候群、ヒツジ疾病スクレピー並びにウシ海綿状脳症がある。これらの疾病が共通の病原体(agent)または一組の近縁の病原体により引き起こされるという強力な証拠があるが、現在、これらの病原体の性質は十分に特定されていない(Prusiner、Science 252:1515−1522(1991))。一連の増大する証拠から、宿主細胞タンパク質のプロテアーゼ耐性翻訳後修飾型が原因となる役割を果たすことが示唆されているが、この改変されたタンパク質だけが原因病原体であるかどうか、またはそれが原因病原体の必要な成分であるかどうかは知られていない。このタンパク質はプリオンタンパク質(以下、「PrP」と称する)として示されており、海綿状脳症の感染性病原体はプリオンと呼ばれる。
それらは一般的に感染性ではないが、ある条件下で少なくともある海綿状脳症を動物から動物へ伝達することができ、そしてある場合には種から種へと渡すことができる証拠がある。例えば、1970年代にクロイツフェルト−ヤコブ病の一連の事例が、プールされた下垂体から精製されたヒト成長ホルモンでの処置を受けた個体で報告された(Brown等、N.Eng.J.Med.313:728−731(1985))。ウシ海綿状脳症の最初の出現は汚染された飼料を介してヒツジスクレピーのウシへの伝達から生じたと考えられる。また、汚染されたヒツジ組織のマウスへの頭蓋内注入によりスクレピーのネズミモデルも開発されている。
組織または他の生物学的生成物中のプリオンの測定は、現在、当該生物学的材料の抽出物でのマウスまたはハムスターの感染を測定するアッセイによる。これらの疾病のインキュベーション期間は1年またはそれより長いことがあるので、そのような研究は実施するのが非常に長く且つ費用がかかる。
プリオン関連疾患の広範囲にわたる発生及び種間伝達の可能性は、哺乳類の組織から製品の多くを得るバイオテクノロジー産業にとって重大な意味を持つ(Di Martino、Biologicals 21:61−66(1993))。そのような製品の安全性についての懸念はプリオンの不活性化に関する研究につながっている。これらの研究からプリオンがウイルスまたはバクテリアのようなより一般的な病原体より不活性化に対して抵抗性であることが示される。従って、プリオンを含有する生物学的材料の汚染を除くためには比較的厳しい条件が必要とされる。高いプリオン力価の生物学的調製物を滅菌するために現在知られている唯一の方法は130℃またはそれ以上での長いオートクレーブ処理及び濃水酸化ナトリウム溶液での処理である。これらの方法はプリオンの日常的な不活性化のために推奨されている(Department of Health and Social Security Circular 84:16(1989))。また、6M尿素での処理と組み合わせた100kDカットオフの限外濾過がプリオン含有調製物の除染をもたらすことも報告されている(Pocchiari等、Arch.Virol.98:131−135(1988))。プリオン活性を下げることができる他の方法は有機溶媒、洗剤、タンパク質変性剤、カオトロピック塩及びフェノールでの処理を含む(Millson等、Prusiner及びHadlow、編集 Slow Transmissible Diseases of the Nervous System、第II巻中、New York:Academic Press 409−424(1979);Prusiner等、PNAS 78:4606−4610(1981);Kimberlin等、J.Neurol.Sci.59:390−392(1983);Walker等、Am.J.Public Health 73:661−665(1983);Brown等、J.Infect.Dis.153:1145−1148(1986))。
プリオン感染力を除くために必要な非常に厳しい条件は、有用な活性を有する生体分子を保護することを意図する方法と典型的に両立せず、多くの生体分子の変性をもたらし、それによりそれらの活性を本質的に破壊する。従って、望ましい生体分子の活性を弱めない条件下で生物学的材料からプリオンを除去するかまたはプリオンを不活性化するための方法が必要とされている。
発明の要約
本発明はプリオン及び少なくとも1種のさらなる生体分子を含有する溶液からプリオンを除くための方法に関する。
この方法は勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それにより生体分子の少なくとも1種からプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該生体分子が集められるようにする工程を含む。
別の態様として、本発明はプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法を提供する。この方法は勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通す工程を含んでなる。これはプリオンをヘモグロビンから分離し、プリオンはヘモグロビンを含有する画分と異なる画分に溶出する。
熱、強アルカリまたは酸化剤を使用せずに、穏やかな条件下で本発明の方法を実施することができる。従って、本発明は他の生体分子の活性を著しく変えずに、様々な他の生体分子の存在下でプリオンを含有する溶液の除染を可能にする。
発明の詳細な説明
ここで、本発明の方法の特徴及び他の詳細をより具体的に記述し、請求の範囲に示す。本発明の特定の態様は例示として示され、本発明の限定としてではないことが理解される。本発明の原理特徴を本発明の範囲からそれずに各種態様に用いることができる。
本発明はプリオンをスパイクしたウシヘモグロビン溶液を陰イオン交換カラムでクロマトグラフィー分離することにより、溶出されるヘモグロビン画分から意外にも高レベルのプリオン感染力が除かれるという発見に基づく。プリオン及び少なくとも1種の他の生体分子を含んでなる溶液からプリオンを除くための本発明の方法は、pH勾配溶出をもたらす条件下で溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通すことを含んでなる。このようにしてプリオンは生体分子の少なくとも1種から分離され、すなわち、生体分子の少なくとも1種はプリオンを含有する画分と異なる画分にカラムから溶出する。
本発明の目的のために、「プリオン」という用語は中枢神経系疾患の原因病原体であるタンパク質をさす。「原因病原体」という用語は当該疾患を引き起こすかまたは疾患を生じる系の必要な成分である病原体をさすと考えられる。プリオン関連疾患はヒト疾病クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー及びゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン症候群、ヒツジ疾病スクレピー、ウシ海綿状脳症並びに伝達できるミンク脳症のような各種海綿状脳症を含む。プリオンは例えば翻訳後に修飾されたPrPタンパク質のようなタンパク質であってもよく、またはそれはポリヌクレオチドのような情報分子と複合体を形成したタンパク質、例えば、翻訳後に修飾されたPrPタンパク質と複合体を形成したポリデオキシ−リボヌクレオチドであってもよい。
本発明の目的のために、「生体分子」という用語は酵素、抗体、構造タンパク質及び輸送タンパク質のようなタンパク質、ポリペプチド、成長ホルモン、インシュリン及びステロイドホルモンのようなホルモン、ポリヌクレオチド、糖並びに脂質を初めとする生物学的起源のあらゆる分子をさす。本発明の目的のために、好ましい生体分子は実現されるかまたは可能性のある有用性を有するタンパク質、ポリペプチド及びポリヌクレオチドである。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを溶離に用いることができる好適なpH勾配は、例えば、溶離剤のpHを時間の関数として連続的に変える連続的pH勾配を含む。連続的pH勾配の例は、pHの変化が時間の一次関数である直線pH勾配である。溶離剤を作るために一緒に混合する異なるpHの2種またはそれ以上のバッファーを利用することにより連続的pH勾配を樹立することができる。溶離剤内のバッファーの比率、従って溶離剤のpHを時間の関数としてこのように連続的に変えることができる。バッファー混合工程の制御は典型的に流量調節器により制御され、それは適切なpH勾配が生じるようにプログラムされる。
別の態様としてpH勾配は、pHの変化が時間に関して連続せず、1もしくはそれ以上の段階またはpHが急な変化を受ける時点を形成する段階的pH勾配であってもよい。溶離剤として最初のバッファーを異なるpHの第二のバッファーで単に置き換えることによりこれを達成することができる。本方法の好ましい態様として用いる勾配は段階的pH勾配である。
段階的pH勾配溶出を実施するための一つの方法として、異なるpH値を有する一連のバッファーの各々を順次クロマトグラフィーカラムにかける。これらのバッファーを10,000ダルトンの脱パイロジェン化(depyrogenation)膜を通すように濾過することが好ましい。溶液成分の溶出が一般的にpHにより決まり、イオン強度に著しく依存しないように、用いるバッファーは低イオン強度を有する1価のバッファーであるべきである。典型的に、約50mMまたはそれ未満のイオン強度を有するバッファーは好適に低イオン強度を有する。
本方法のために好適な陰イオン交換媒質の例は、ジエチルアミノエチルまたは第四級アミノエチル基のような陽イオン官能基で誘導化されている、シリカ、アルミナ、チタニア、架橋デキストラン、アガロースまたはポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチル−メタクリレートもしくはスチレンジビニルベンゼンのような誘導化重合体もしくは共重合体を含む。
好ましい態様として、陰イオン交換媒質はシリカゲルに基づく。この媒質はシリカゲルを熱水で処理して孔径を増し、次にゲルを(γ−グリシドキシ−プロピル)トリメトキシシランにさらして活性表面エポキシド基を生じることにより形成される。次に、誘導化シリカをHOCH2CH2N(CH3)2のような第三級アミンで処理して表面第四級アンモニウム基を形成する。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは例えば重力カラム、すなわち、移動相が重力の力の下で流れるカラムであってもよい。また、サンプルをカラム上に添加した後にカラムの入口に加圧した液体を入れることによるように、移動相をカラムの入口と出口の間の圧力差にさらしてもよい。好ましい態様として、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは高速液体クロマトグラフィーカラムである。
一つの態様として、溶液はプリオン及びウシヘモグロビンのようなヘモグロビンを含んでなる。この態様において、第一のバッファーは溶液をクロマトグラフィーカラムの媒質中に運び、媒質へのヘモグロビンの結合を促進する。次に、第二のバッファーはプリオンのような非ヘモグロビン成分を溶出するように媒質内のpHを調整する。次に、第三のバッファーはプリオンを実質的に含まないヘモグロビンを溶出する。ヘモグロビンの純度を保証するためにヘモグロビンを含有する溶離剤の最初と最後の部分、例えば最初の3%ないし4%及び最後の3%ないし4%を捨ててもよい。
好ましくは、第一バッファーはトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)溶液(濃度約20mM、約8.4ないし約9.4の間の範囲のpHを有する)である。第二バッファーは第一バッファーと第三バッファーの混合物であり、第二バッファーは約8.2から約8.6までの範囲のpHを有する。第三バッファーはTris溶液(濃度約50mM、約6.5ないし約7.5の間の範囲のpHを有する)である。第四バッファーはNaCl/Tris溶液(濃度約1.0M NaCl及び約20mM Tris;約8.4ないし約9.4、好ましくは約8.9から約9.1までの範囲のpHを有する)である。第二バッファーのpHが約8.2ないし8.4の間であることが特に好ましい。
用いるバッファーは典型的に約0℃から約50℃までの範囲の温度である。好ましくは、バッファー温度は使用中約12.4±1.0℃である。さらに、バッファーは典型的に約9℃ないし約11℃の温度で保存される。
別の態様として、本方法は溶液を限外濾過膜に通すことをさらに含んでなる。この工程を陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前または後に実施することができる。好ましい態様として、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、溶液を100,000ダルトン膜のような限外濾過膜に圧力下で通す。この方法のために好適な限外濾過膜の例はMillipore Corporation(Bedford、MA、カタログ番号CDUF 050 H1)及びA/G Technology(Needham、MA、モデル番号UFP100E55)から入手できる100,000ダルトン膜を含む。
一つの態様として、溶液はウシ海綿状脳症の原因病原体であるプリオン及びもう一つのウシタンパク質を含んでなる。第二のウシタンパク質は例えば、ウシヘモグロビン、ウシ成長ホルモン、ウシ免疫グロブリン、ウシインシュリン、ウシ血清アルブミン、ウシアプロチニン、ウシトランスフェリン、ウシ血清、ウシトロンビンまたはウシフィブリノーゲンであってもよい。好ましい態様として、第二のウシタンパク質はウシヘモグロビンである。
別の態様として、溶液はスクレピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン病のような海綿状脳症の原因病原体であるプリオン及びタンパク質またはホルモンのようなヒトまたは他の哺乳類の組織から得られた1種またはそれ以上のさらなる生体分子を含んでなる。好適なさらなる生体分子の例はヘモグロビン、インシュリン、成長ホルモン、ゴナドトロピン、ミエリン、コラーゲン、エラスチン、血清、血清アルブミン、ラクトアルブミン、抗体及び抗血清、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン及びトロンビン、エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血小板活性化因子、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、インターフェロン、インターロイキン並びにサイトカインを含む。
ここで、本発明は以下の実施例にさらに具体的に記述される。
実施例
実施例1 陰イオン交換クロマトグラフィーによるウシヘモグロビン溶液の精製
ウシヘモグロビン溶液の調製
米国特許出願番号第08/473,497号に記述された方法に従ってウシヘモグロビン溶液を調製した。全ウシ血液のサンプルを集め、クエン酸ナトリウム抗凝血剤と混合してクエン酸血溶液を形成し、次に内毒素レベルに関して分析した。血液溶液サンプルを採取後約2℃の温度で保ち、次に大きな集合物及び粒子を除くために600メッシュスクリーンで濾過した。
次に、大きな血液溶液屑を除くためにクエン血溶液を800μm及び50μmのポリプロピレンフィルターに順次通した。
次に、赤血球からBSAまたはIgGのような細胞外血漿タンパク質を分離するために赤血球を洗浄した。赤血球を洗浄するために、血液溶液をダイアフィルトレーションタンク中に置き、次に10kDの限外濾過膜(Millipore Corporationから市販されている、カタログ番号CDUF 050 G1)を通して濾過した等容量の等張溶液で希釈した。等張溶液は注射用水(WFI)中6.0g/Lのクエン酸ナトリウム2水和物及び8.0g/Lの塩化ナトリウムからなった。
希釈された血液溶液を次に0.2μmの中空繊維(Microgon Krosflo IIミクロフィルトレーションカートリッジ、Spectrum/Microgon、Laguna Hills、CA)ダイアフィルターを通したダイアフィルトレーションによりその最初の容量まで濃縮して戻した。同時に、濾過した等張溶液をダイアフィルターを通して濾過液が失われる速度に等しい速度で補充として連続的に添加した。ダイアフィルトレーション中、血漿溶質のような、溶液中の赤血球より著しく小さい血液成分は濾過液と共にダイアフィルターの壁を通過した。赤血球、血小板、及び白血球のような希釈された血液溶液のより大きい物体は連続的に添加された等張溶液で保持されて透析された血液溶液を形成した。
赤血球の洗浄中、希釈された血液溶液は処理効率を向上するために約25psiないし約30psiの間のダイアフィルターの入口の液体圧で約10℃ないし25℃の間の温度で保たれた。
ダイアフィルトレーション液の容量が等張溶液で希釈する前の血液溶液の容量の約600%に等しくなった時に赤血球洗浄を終了した。
次に、透析された血液溶液を番号28リングダム(ringdam)を取り付けた、Sharples Super遠心機(モデル番号AS−16、Sharples Division of Alfa−Laval Separation,Inc.)に1分当たり約4リットルの速度で連続的にポンプで入れた。透析された血液溶液を同時に入れながら遠心機は作動して赤血球を白血球及び血小板から分離した。作動中、遠心機は血液を重い赤血球相と軽い白血球相に分離するために十分な速度、典型的に約15,000rpmで回転した。赤血球相及び白血球相の画分を作動中に遠心機から別々に連続的に抜き取った。
分離後に、赤血球を溶解してヘモグロビンを含有する溶液を生じた。遠心機からの赤血球相の流れに斜めの赤血球相排出ラインの壁に対する細胞の衝突のために、遠心機からの抜き取り時に赤血球のかなりの部分は機械的に溶解され、それにより赤血球から赤血球相中にヘモグロビンを放出した。
溶解された赤血球相は次に赤血球相排出ラインを通って固定ミキサー(6素子(elements)でKenics 1/2インチ、Chemineer,Inc.)中へ流れた。赤血球相の固定ミキサーへの移動と同時に等容量のWFIも固定ミキサー中に注入し、そこでWFIを赤血球相と混合した。固定ミキサーへの赤血球相及びWFIの流速は各々1分当たり約0.25リットルである。
固定ミキサーで赤血球相をWFIと混合することにより溶解赤血球コロイドが生じた。次に、これを非ヘモグロビン赤血球成分からヘモグロビンを分離するために適しているSharples Super遠心機(モデル番号AS−16)に移した。溶解赤血球コロイドを軽いヘモグロビン相と重い相に分離するために十分な速度で遠心機を回転させた。軽い相はヘモグロビンからなり、ヘモグロビンの密度にほぼ等しいかまたはそれ未満の密度を有する非ヘモグロビン成分も含んだ。
ヘモグロビン相を0.45μmペリコンカセット(Pellicon Cassette)ミクロフィルター(Millipore Corporation、カタログ番号HVLP 000 C5)を通して遠心機からヘモグロビン精製の調製物として保持タンク中に連続的に排出した。次に、細胞ストロマを残留物(retentate)と共にミクロフィルターから保持タンクへ戻した。ミクロフィルトレーション中、保持タンクの温度を10℃またはそれ未満に保った。効率を向上するために、ミクロフィルター入口の液体圧が約10psiないし約25psiの初期圧力から増加した時にミクロ濾過を終了した。ヘモグロビンミクロフィルトレーション液をミクロフィルターからミクロフィルトレーションタンクへ移した。ミクロフィルトレーション液をこの段階で2つのサンプル、サンプルA及びBに分けた。この時点でサンプルAをさらに精製しなかった。
サンプルBを次に100kD限外フィルター(Millipore Corporation、カタログ番号CDUF 050 H1)にポンプで通した。ミクロフィルトレーション液に含まれるヘモグロビンのかなりの部分及び水は限外フィルターを通過してヘモグロビン限外濾過液を形成し、一方、約100kDより大きい分子量のタンパク質のようなより大きいミクロフィルトレーション液成分は保持され、ミクロフィルトレーションタンクへ再循環して戻った。同時に、限外濾過液で失われた水の補充としてWFIをミクロフィルトレーション液タンクへ連続的に添加した。ミクロフィルトレーション液タンク中のヘモグロビンの濃度が8グラム/リットル未満になるまで限外濾過を続けた。限外濾過工程中、ミクロフィルトレーション液タンクの内部温度を約10℃に保った。
次に、ヘモグロビン限外濾過液を限外濾過タンクへ移し、30kDの限外フィルター(Millipore Corporation、カタログ番号CDUF 050 T1)を通して再循環させて電解質、代謝中間体、水及び約30kD未満の分子量のタンパク質のようなより小さい細胞成分を除いた。これにより1リットル当たり約100グラムのヘモグロビンを含有する濃縮されたヘモグロビン溶液が生じた。サンプルBの初期精製をこの時点で終了した。
陰イオン交換クロマトグラフィー媒質の調製
シリカゲルを70℃で水中で(γ−グリシドキシ−プロピル)トリメトキシシランで処理し、表面エポキシド基で誘導化されたシリカを生じた。この誘導化シリカゲルを次にN,N−ジメチルエタノールアミン(OHCH2CH2)N(CH3)2で処理し、表面第四級アンモニウム基で誘導化されたシリカゲルを生じた。
スクレピー病原体でのサンプルのスパイク
本明細書に記述される研究に用いられるスクレピー病原体はInstitute of Animal Health、Edinburgh、Scotlandから認可された、ネズミに順応させたME−7株であった。この病原体の最初の供給源はサフォーク(Suffolk)種のヒツジの天然のスクレピー感染であった。これらのヒツジからの脳抽出物はMoredun任意交配マウスを通して2継代接種、C57BL/6Nを通して9継代接種、C3Hマウスを通して1継代接種及びC57BL/6Nマウスを通してさらに1継代接種を受けた。この研究に用いたスパイク材料は継代接種レベル13であった。
サンプルA(180mL)を20mL容量のスクレピー病原体でスパイクしてサンプルA’を生ぜしめた。サンプルA’のアリコートを「スパイク分析」アッセイでの使用のために保持し、残りをサンプルBに対して上に記述したように100kD限外フィルターを通した限外濾過に供した。今度はサンプルA”と称する得られた限外濾過液を実施例2に記述するようにスクレピー感染力に関してアッセイした。
サンプルBの20mLアリコートを2mLのスクレピー病原体でスパイクしてサンプルB’を生ぜしめた。サンプルB’のアリコートをコントロール「スパイク分析」アッセイでの使用のために保持した。スパイクされたサンプルの残りを陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによりヘモグロビンを精製するために、スパイクされたサンプルB’をクロマトグラフィーカラムに含まれる媒質上に添加した。カラムは8インチの内径及び24インチの長さであった。カラム内の陰イオン交換媒質は上記のシリカに基づく媒質であった。
媒質へのヘモグロビン結合を促進するバッファーでカラムを前処理した。次に、サンプルB’を1分当たり1.78リットルの流速でカラム中に注入した。次に、カラム内にpH勾配を作ることにより、ヘモグロビン溶離剤を生じるように3種の異なるバッファーをカラムに連続して通すことでカラムを洗浄した。使用中の各バッファーの温度は約12.4℃であった。カラムへの注入前にバッファーを10kD限外濾過膜(Millipore Corporation、カタログ番号CDUF 050 G1)を通して前以て濾過した。カラムを通る各バッファーの流速は1分当たり3.56リットルであった。
第一バッファー、20mMトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン(Tris、約8.4から約9.4までの範囲のpH)は濃縮されたヘモグロビン溶液をカラム内の陰イオン交換媒質中に運んだ。次に、第一バッファーと第三バッファーの混合物で約8.3のpHを有する第二バッファーは、ヘモグロビンを保持しながら混入成分を溶出するようにカラム内のpHを調整した。第二バッファーでの平衡化は約30分間続いた。第二バッファーからの溶離剤を廃液に捨てた。次に、第三バッファー、50mM Tris(約6.5から約7.5までの範囲のpH)はカラムからヘモグロビンを溶出した。ヘモグロビン溶離剤の最初と最後の3%ないし4%を捨てた。今度はサンプルB”と称する残りのヘモグロビン溶離剤を実施例2に記述するようにスクレピー感染力に関してアッセイした。
実施例2 ウシヘモグロビン調製物におけるプリオン除去方法の確認
方法確認を米国食品医薬品局グッドラボラトリープラクティス規定(Good Laboratory practice Regulations)(21 CFR 58)、英国GLPコンプライアンスプログラム(Compliance Programme)、日本GLP基準及びグッドラボラトリープラクティスのOECD指針に従った方法により登録施設で実施した。
スクレピー感染力に関するインビボアッセイにより評価される溶液は1.ヘモグロビン溶液をスパイクするために用いたスクレピー病原体溶液、2.サンプルA’、3.サンプルA”、4.サンプルB’及び5.サンプルB”であった。
インビボアッセイ
スクレピー感染力のインビボアッセイを公表された方法(Chesebro、Spongiform Encephalopathies:the Transmissible Agents、Virology中、Fields、Knipe、等、編集、Raven Press LTD.:New York、第81章、pp.2325−2336(1990))に従ってMicrobiological Associates、Rockville、MDで実施した。この方法は目的の溶液のアリコートをマウスに頭蓋内接種し、スクレピー感染の臨床徴候に関してマウスを調べ、1年の間にわたって生存率を測定することを含む。
スクレピー感染力を以下の溶液:スパイク材料、サンプルA’(清澄化及び非清澄化)、サンプルA”、サンプルB’及びサンプルB”に関してアッセイした。これらの溶液の各々の一連の希釈物を示すように調製した:スパイク材料、希釈倍率1(未希釈)、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7及び10-8;サンプルA’、非清澄化:希釈倍率1、清澄化:希釈倍率1、10-1;サンプルA”、希釈倍率1、10-1、10-2、10-3、10-4及び10-5;サンプルB’、希釈倍率1及び10-1;サンプルB”、希釈倍率1、10-1、10-2、10-3、10-4及び10-5。
メスのC57BL/6マウスを10または15匹のマウスの組に分けた。一組の15匹のコントロールマウスには接種せず、一方、一組の15匹のビヒクルコントロールマウスには各々0.020mLのビヒクルのみを接種した。残りの組の各々のマウスには各々研究下の溶液のいずれかの単一の希釈の0.02mLアリコートを接種した。
マウスをスクレピー感染の臨床徴候に関して365日間調べた。スクレピーの末期疾病段階の徴候は大きな音への感受性、尿失禁、荒れた毛、足取りの異常及び目の鈍さを含む。死亡または屠殺したマウスの脳組織の組織病理学的試験によりスクレピー感染を確認し、その場合、脳組織中の小腔の存在はスクレピーの診断を裏付けた。
結果
ウシヘモグロビンの全体的な精製方法は米国特許出願番号第08/473,479号に開示されており、その中身は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。実施例1に記述したように、この方法の一部に従って2種のウシヘモグロビン溶液を調製したが、各場合で精製を全体の工程の異なる時点で停止した。サンプルAをミクロフィルトレーション(0.45μmの孔径)工程を通して精製し、一方、サンプルBをダイアフィルトレーション工程(100kDの公称分子量カットオフ)を通して精製した。
確認方法は感染したマウスの脳ホモジネート中に存在するネズミに順応させたME−7スクレピー病原体でスパイクされたサンプルの感染力に対する100kD限外濾過工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程の効果を調べた。スクレピー病原体をウシ海綿状脳症の原因病原体のモデルとして用いた。用いた方法は現在プリオン感染力に対して利用できるアッセイの唯一の型であるマウスにおけるインビボアッセイであった。目的の精製工程前の2種のスパイクされたサンプルの感染力をコントロールとしてアッセイし、両方の場合で365日以内にコントロールマウスの100%の死亡率をもたらし、かなり大部分のマウスはスクレピー感染と一致する脳形態の変化を示した。対照的に、続いて100kD限外濾過または陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を受けたスパイクされたサンプルは、インビボアッセイにおいてスクレピー感染力の何の徴候も示さなかった。
インビボアッセイの結果を表に要約し、それは各試験群のマウスに対して、365日の研究で生存したマウスの数、研究中にスクレピーの臨床徴候を示したマウスの数、研究中に死亡するかまたは屠殺された数及び組織病理学的に確認されたスクレピーにかかった死亡マウスの数を示す。
データから10-4の希釈倍率またはそれより多いスパイク材料を接種された20匹のマウスのうち19匹が、組織病理学により確認されたスクレピーにかかってスクレピーの臨床徴候を表したことが示される。おそらく接種エラーによりこの群の1匹の生存するマウスが説明される。
清澄化していない未希釈のサンプルA’で処理された全てのマウスは死亡したが、スクレピーの徴候は示さなかった。これらの死亡はこの不均一混合物内の固形物質の有毒作用に起因すると考えられる。清澄化したサンプルA’で処理された10匹のマウスの各々はスクレピーの臨床徴候を示した後に死亡し、これらのうち9匹で、組織病理学によりスクレピーが確認された。この群の1匹のマウスでは、かなりの自己分解によりスクレピーの組織病理学的確認が妨げられた。対照的に、サンプルA”の希釈物を接種された90匹のマウスのうち86匹が研究で生存し、いずれもスクレピーの臨床徴候を示さず、死亡した4匹のマウスの脳は正常な組織病理を示した。
サンプルB’を接種された5匹のマウスのうちいずれも研究で生存せず、これらのうち4匹はスクレピーの臨床及び組織病理の両方の徴候を示した。サンプルB”の希釈物を90匹のマウスに投与した。これらのうち84匹は研究で生存し、死亡したマウスのいずれもスクレピーの臨床または組織病理徴候を示さなかった。
これらの結果はスクレピー病原体でスパイクしたヘモグロビン溶液を穏やかな条件下で除染できることを明確に示す。100kD限外濾過またはpH勾配溶出での陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、得られる溶液中のスクレピー感染力をインビボアッセイの検出限界以下に下げた。
以下に、本発明の主要な態様は次のとおりである。
1. pH勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びさらなるタンパク質を含んでなる溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりさらなるタンパク質からプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該タンパク質を集めるようにする工程を含んでなる、プリオン及びさらなるタンパク質を含んでなる溶液からプリオンを除くための方法。
2. pH勾配が連続的勾配である前記1記載の方法。
3. pH勾配が段階的勾配である前記1記載の方法。
4. 陰イオン交換クロマトグラフィー媒質が陰イオン基で誘導されたシリカ、アルミナ、チタニナ、架橋デキストラン、アガロースまたは重合体よりなる群から選択される少なくとも1種の成分を含んでなる前記1記載の方法。
5. 重合体がポリアクリルアミド、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)またはポリ(スチレン−コ−ジビニルベンゼン)である前記4記載の方法。
6. 陽イオン基が第四級アンモニウム基である前記4記載の方法。
7. 限外濾過膜を通して溶液を濾過する工程をさらに含んでなる前記1記載の方法。
8. 限外濾過膜が約100Kdの分子量カットオフを有する前記1記載の方法。
9. タンパク質が哺乳類から得られる前記1記載の方法。
10. 哺乳類がヒトもしくはウシ、ブタ、ヒツジまたはネズミ科の動物である前記9記載の方法。
11. タンパク質がヘモグロビンである前記10記載の方法。
12. プリオンが海綿状脳症の原因病原体である前記10記載の方法。
13. 海綿状脳症がスクレピー、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインケン症候群またはウシ海綿状脳症である前記12記載の方法。
14. 勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりヘモグロビンからプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該ヘモグロビンを集めるようにする工程を含んでなる、プリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法。
15. ヘモグロビンがウシヘモグロビンである前記14記載の方法。
16. プリオンがウシ海綿状脳症の原因病原体である前記15記載の方法。
17. 陰イオン交換クロマトグラフィー媒質がシリカを含んでなる前記14記載の方法。
18. シリカが陽イオン基で機能化されている前記17記載の方法。
19. 陽イオン基が第四級アンモニウム基である前記18記載の方法。
Claims (5)
- 勾配溶出をもたらす条件下でプリオン及びヘモグロビンを含有する溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、それによりヘモグロビンからプリオンを分離し、それによりプリオンを含有する溶出液画分と異なる溶出液画分に該ヘモグロビンを集めるようにする工程を含んでなり、ここで、ヘモグロビンを含有する溶出液画分がpH約6.5〜約8.3において該陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出されることを特徴とする、プリオン及びヘモグロビンを含有する溶液からプリオンを除くための方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィーカラムが陽イオン基で誘導されたシリカ、アルミナ、チタニナ、架橋デキストラン、アガロースおよび重合体よりなる群から選択される少なくとも1種の成分を含んでなる請求項1記載の方法。
- 陽イオン基が第四級アンモニウム基である請求項2記載の方法。
- 限外濾過膜を通して溶液を濾過する工程をさらに含んでなる請求項1記載の方法。
- ヘモグロビンが哺乳類から得られる請求項1-4のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/673,147 US5808011A (en) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | Method for chromatographic removal of prions |
US08/673,147 | 1996-07-01 | ||
PCT/US1997/011149 WO1998000441A1 (en) | 1996-07-01 | 1997-06-26 | A method for chromatographic removal of prions |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000513377A JP2000513377A (ja) | 2000-10-10 |
JP2000513377A5 JP2000513377A5 (ja) | 2004-11-18 |
JP4031833B2 true JP4031833B2 (ja) | 2008-01-09 |
Family
ID=24701495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50429698A Expired - Fee Related JP4031833B2 (ja) | 1996-07-01 | 1997-06-26 | プリオンのクロマトグラフィー除去方法 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5808011A (ja) |
EP (1) | EP0954528B2 (ja) |
JP (1) | JP4031833B2 (ja) |
CN (2) | CN1283660C (ja) |
AT (1) | ATE267212T1 (ja) |
AU (1) | AU718557B2 (ja) |
BR (1) | BR9710035A (ja) |
CA (1) | CA2259632C (ja) |
DE (1) | DE69729217T3 (ja) |
ES (1) | ES2221957T5 (ja) |
HK (1) | HK1019151A1 (ja) |
TW (1) | TW390887B (ja) |
WO (1) | WO1998000441A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040053208A1 (en) * | 1995-08-29 | 2004-03-18 | V. I. TECHNOLOGIES, Inc. | Methods to selectively inactivate parasites in biological compositions |
US6719988B2 (en) | 1997-02-21 | 2004-04-13 | The Regents Of The University Of California | Antiseptic compositions for inactivating prions |
US20060008494A1 (en) * | 1997-02-21 | 2006-01-12 | The Regents Of The University Of California | Complete inactivation of infectious proteins |
US6620629B1 (en) | 1997-02-21 | 2003-09-16 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting prions |
US6617119B2 (en) | 1997-02-21 | 2003-09-09 | The Regents Of The University Of California | Assay for specific strains of multiple disease related conformations of a protein |
US6221614B1 (en) | 1997-02-21 | 2001-04-24 | The Regents Of The University Of California | Removal of prions from blood, plasma and other liquids |
US6720355B2 (en) | 1997-02-21 | 2004-04-13 | The Regents Of The University Of California | Sodium dodecyl sulfate compositions for inactivating prions |
ATE233275T1 (de) * | 1998-02-11 | 2003-03-15 | Zlb Bioplasma Ag | Verfahren zur entfernung von erregern übertragbarer spongiformer encephalophatien aus proteinlösungen |
US6139878A (en) * | 1998-04-27 | 2000-10-31 | Aventis Behring, Llc | Method for preparing a diafiltered stabilized blood product |
US6150172A (en) * | 1999-01-08 | 2000-11-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Method and kit for extracting prion protein |
US6605445B1 (en) * | 1999-02-22 | 2003-08-12 | Bayer Corporation | Rapid method of determining clearance of prion protein |
US6166187A (en) | 1999-03-05 | 2000-12-26 | The Regents Of The University Of California | Method of concentrating prion proteins in blood samples |
US6437102B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-08-20 | Bayer Corporation | Method of separating prions from biological materials |
EP1272509A2 (en) * | 2000-04-05 | 2003-01-08 | V.I. Technologies, Inc. | Prion-binding peptidic ligands and methods of using same |
US20030050276A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-03-13 | Cunanan Crystal M. | Treatment of tissue, instruments and work surfaces to remove infectious agents |
US20040140265A1 (en) * | 2000-12-29 | 2004-07-22 | Lihme Allan Otto Fog | Extracorporeal capturing of specific bio-macromolecular entities from extracellular body fluids |
US20020131958A1 (en) * | 2001-01-22 | 2002-09-19 | John Chapman | Method for purifying a biological composition |
US7577577B2 (en) * | 2001-01-31 | 2009-08-18 | Dell Products L.P. | Pull to customer order demand fulfillment system and method |
US6518010B2 (en) | 2001-02-28 | 2003-02-11 | Biopure Corporation | Use of defibrinated blood for manufacture of a hemoglobin-based oxygen carrier |
US6613505B2 (en) | 2001-04-12 | 2003-09-02 | Bioresource International, Inc. | Composition and method for destruction of infetious prion proteins |
CA2517579A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Zetacon Corporation | Predictive control system and method |
US7001715B2 (en) * | 2002-02-28 | 2006-02-21 | Biopure Corporation | Purification of red blood cells by separation and diafiltration |
EP1478931B2 (en) * | 2002-02-28 | 2018-11-07 | Microsens Biophage Limited | Binding of pathological forms of prion proteins |
GB0214007D0 (en) * | 2002-06-18 | 2002-07-31 | Common Services Agency | Removal of prion infectivity |
EP2317317B1 (en) | 2002-12-03 | 2014-11-26 | North Carolina State University | Prion protein ligands and methods of use |
PL1615992T3 (pl) | 2003-04-04 | 2014-03-31 | Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc | Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania |
US7510848B2 (en) * | 2003-04-04 | 2009-03-31 | North Carolina State University | Prion protein binding materials and methods of use |
US20050054003A1 (en) * | 2003-09-10 | 2005-03-10 | Stenland Christopher J. | Prion clearance using particulate metal oxides |
BRPI0508096B8 (pt) | 2004-02-27 | 2021-05-25 | Octapharma Ag | método de preparação de um preparado de anticorpo seguro purificado contra vírus e vírus inativado |
GB0416699D0 (en) * | 2004-07-27 | 2004-09-01 | Prometic Biosciences Ltd | Prion protein ligands and methods of use |
EP1865993A2 (en) * | 2005-04-05 | 2007-12-19 | Biopure Corporation | Oxygenated polymerized hemoglobin solutions and their uses for tissue visualization |
BRPI0611811A2 (pt) * | 2005-06-10 | 2008-12-09 | Prometic Biosciences Ltd | ligantes de ligaÇço À proteÍna |
US20070128693A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-07 | Advantek Serum Laboratories Limited3/F | Method for the inactivation and removal of dengue virus from biological samples |
KR101170212B1 (ko) * | 2006-07-12 | 2012-07-31 | 아사히 가세이 메디컬 가부시키가이샤 | 혈액 제제로부터 이상 프리온을 제거하는 방법 |
WO2008083236A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Texas Tech University | Orthogonal method for the removal of transmissible spongiform encephalopathy agents from biological fluids |
EP2027875A1 (en) * | 2007-08-23 | 2009-02-25 | Octapharma AG | A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC) |
US10172949B2 (en) | 2009-06-09 | 2019-01-08 | Prolong Pharmaceuticals, LLC | Hemoglobin compositions |
NZ597022A (en) | 2009-06-09 | 2014-05-30 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Hemoglobin compositions |
US10172950B2 (en) | 2009-06-09 | 2019-01-08 | Prolong Pharmaceuticals, LLC | Hemoglobin compositions |
CN102675414A (zh) * | 2011-03-08 | 2012-09-19 | 上海天伟生物制药有限公司 | 糖蛋白中去除/灭活朊病毒的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU605901B2 (en) * | 1987-09-11 | 1991-01-24 | Ares Trading S.A. | Purification process |
ATE121418T1 (de) * | 1987-10-23 | 1995-05-15 | Schering Corp | Verfahren zur proteinreinigung. |
CA2169191C (en) * | 1993-08-26 | 2008-01-15 | Elizabeth A. Wang | Neural regeneration using human bone morphogenetic proteins |
DE4429558A1 (de) * | 1994-08-19 | 1996-02-22 | Sanorell Pharma Gmbh & Co | Verfahren zur Herstellung von infektionsfreien pharmazeutischen Präparaten und/oder Nahrungsmitteln aus infektiösem Material |
-
1996
- 1996-07-01 US US08/673,147 patent/US5808011A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-06-26 ES ES97932311T patent/ES2221957T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-26 AT AT97932311T patent/ATE267212T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-06-26 DE DE69729217T patent/DE69729217T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-26 CA CA002259632A patent/CA2259632C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-26 CN CNB971953430A patent/CN1283660C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-26 AU AU35802/97A patent/AU718557B2/en not_active Ceased
- 1997-06-26 EP EP97932311A patent/EP0954528B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-26 BR BR9710035A patent/BR9710035A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-26 JP JP50429698A patent/JP4031833B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-26 TW TW086108949A patent/TW390887B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-06-26 CN CNA2005100039089A patent/CN1743340A/zh active Pending
- 1997-06-26 WO PCT/US1997/011149 patent/WO1998000441A1/en active IP Right Grant
-
1999
- 1999-10-05 HK HK99104337A patent/HK1019151A1/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2000513377A (ja) | 2000-10-10 |
BR9710035A (pt) | 1999-08-10 |
DE69729217D1 (de) | 2004-06-24 |
HK1019151A1 (en) | 2000-01-14 |
WO1998000441A1 (en) | 1998-01-08 |
ES2221957T5 (es) | 2012-01-27 |
ATE267212T1 (de) | 2004-06-15 |
US5808011A (en) | 1998-09-15 |
DE69729217T3 (de) | 2012-03-15 |
EP0954528B1 (en) | 2004-05-19 |
DE69729217T2 (de) | 2005-05-04 |
CA2259632A1 (en) | 1998-01-08 |
ES2221957T3 (es) | 2005-01-16 |
CA2259632C (en) | 2008-04-08 |
EP0954528A1 (en) | 1999-11-10 |
AU718557B2 (en) | 2000-04-13 |
CN1743340A (zh) | 2006-03-08 |
EP0954528B2 (en) | 2011-09-07 |
CN1283660C (zh) | 2006-11-08 |
TW390887B (en) | 2000-05-21 |
CN1221425A (zh) | 1999-06-30 |
AU3580297A (en) | 1998-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4031833B2 (ja) | プリオンのクロマトグラフィー除去方法 | |
AU621148B2 (en) | Removal of process chemicals from labile biological mixtures by hydrophobic interaction chromatography | |
EP1928915B1 (en) | An ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
WO1990015613A1 (en) | Methods for the inactivation of viruses in viral-contaminated pharmaceutical compositions | |
CA2621025A1 (en) | An ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
US4199450A (en) | Process of separating from an aqueous medium a protein or a morphologically organized unit by liquid exclusion chromatography | |
CN107163138A (zh) | 一种人血浆蛋白α1‑抗胰蛋白酶的分离纯化方法 | |
US8293242B2 (en) | Ultra-high yield of alpha-1-anti-trypsin | |
JP2002503672A (ja) | タンパク質溶液から伝ぱん性海綿状エンセファロパシーの原因物質を除去する方法 | |
JPH02102A (ja) | 精製方法 | |
JP2002540912A (ja) | 生物学的混入物の除去 | |
US20220380439A1 (en) | Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption | |
US20060223988A1 (en) | High Resolution Methods and Precipitating Reagents for Isolating Proteins from Proteinaceous Material | |
CN110804578A (zh) | 一种牛血清去除IgG的生产方法 | |
US20110097746A1 (en) | Orthogonal Method for the Removal of Transmissible Spongiform Encephalopathy Agents from Biological Fluids | |
JP2000319294A (ja) | 生物由来高分子溶液精製方法 | |
US20030019763A1 (en) | Apparatus and method for separation of biological contaminants | |
US20050224355A1 (en) | Removal of biological contaminants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040116 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060815 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061108 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070215 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070410 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070709 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070731 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20070913 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071002 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071022 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101026 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111026 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121026 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121026 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |