CN105177043A

CN105177043A - 一种h7n9假病毒的制备方法及该h7n9假病毒的应用

Info

Publication number: CN105177043A
Application number: CN201510594872.XA
Authority: CN
Inventors: 吴艳玲; 张文; 申立文
Original assignee: Hangzhou Qingzhenghong Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Qingzhenghong Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105177043B

Abstract

一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用，属于生物医药技术领域。它是将H7N9禽流感病毒的HA，NA基因序列克隆至哺乳动物表达载体pVAX-1，然后用pVAX-HA，逆转录病毒载体pNL-4.3.luc.E-R-等质粒共转染293T细胞产生H7N9假病毒颗粒。利用H7N9假病毒及假病毒细胞模型筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂和神经氨酸酶抑制剂，利用H7N9假病毒进行流感病毒中和抗体的研究，利用H7N9假病毒作为抗流感免疫制剂预防和治疗流感病毒感染。

Description

一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用。

背景技术

流感一直是人类健康的主要威胁之一。1918年的西班牙流感，2009年H1N1流感疫情，和禽流感A/H5N1带来了很大的灾害或损失人类。自2013以来，在中国东部地区暴发的A/H7N9禽流感疫情已造成超过45人死亡。其风险和流行潜力吸引了全世界的关注。H7N9禽流感虽然属于低致病性禽流感病毒，但鉴于其感染后的高死亡率，目前，与H7N9禽流感病毒相关的研究工作仍需在三级生物安全实验室开展，这在很大程度上限制了H7N9禽流感相关研究的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用的技术方案。

所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-HA；

2）重组载体pVAX-HA和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：3比例共转染293T细胞，5h后更换Opti-DMEM培养液，并添加0.5μg的外源性细菌神经氨酸酶，48h后收集上清，即得。

2）将H7N9禽流感病毒的NA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-NA；

3）重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：1：3比例共转染293T细胞，5h后更换Opti-DMEM培养液，48h后收集上清，即得。

2）将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-TMPRSS2；

3）重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-TMPRSS2和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：0.012：3比例共转染293T细胞，5h后更换含10%FBS的DMEM培养液，并添加0.5μg的外源性细菌神经氨酸酶，48h后收集上清，即得。

3）将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-TMPRSS2；

4）pNL-4.3.luc.E-R-质粒、重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和重组载体pVAX-TMPRSS2按质量比1：1：0.012：3比例共转染293T细胞，5h后更换含10%FBS的DMEM培养液，48h后收集上清，即得。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在进行H7N9流感病毒中和抗体中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在制备预防和治疗流感病毒感染的免疫制剂中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在假病毒细胞模型在筛选神经氨酸酶抑制剂中的应用。

所述的一种假病毒细胞模型，其特征在于将权利要求1、2、3或4制得的假病毒感染狗肾细胞MDCK。

所述的一种假病毒细胞模型在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

本发明的有益效果：

1）本发明为高通量筛选H7N9禽流感病毒进入抑制剂，神经氨酸酶抑制剂提供了一种简单高效的方法；

2）本发明为筛选、评价H7N9禽流感病毒中和抗体提供了一种快速高效的方法；采用该方法筛选相关抗流感药物可在二级生物安全实验室进行，无需三级生物安全实验室；

3）采用该方法筛选相关抗流感药物，评价抗体中和效价均可在普通二级生物安全实验室进行，无需三级生物安全实验室；

4）本发明提供了一种潜在的预防和治疗H7N9禽流感病毒感染的免疫制剂。

附图说明

图1为H7N9禽流感病毒的HA和NA基因片段电泳图，图中：泳道1：DNAmarkerDL2000，泳道2：H7N9/A/Anhui/1/2013HA基因片段，泳道3：H7N9/A/Anhui/1/2013NA基因片段。

图2为重组载体pVAX-HA验证图，图中：泳道1：DNAmarkerDL10000，泳道2：pVAX-1空载体，泳道3：HA，泳道4：pVAX-HA,泳道5：BamHI和HindIII双酶切pVAX-HA。

图3为重组载体pVAX-NA验证图，图中：泳道1：DNAmarkerDL10000，泳道2：pVAX-1空载体，泳道3：NA，泳道4：pVAX-NA，泳道5：BamHI和HindIII双酶切pVAX-NA。

图4为重组载体pVAX-TMPRSS2验证图，图中：泳道1：DNAmarkerDL10000，泳道2：pVAX-TMPRSS2。

图5为H7N9假病毒luc基因的RT-PCR验证图，图中：泳道1：DNAmarkerDL2000，泳道2：H7N9假病毒luc基因。

图6为westernblot验证H7N9假病毒HA的表达图。

图7为westernblot验证H7N9假病毒p24的表达图。

图8为不同包装方案包装所得假病毒感染MDCK的效果图。

图9为H7N9禽流感病毒中和抗体对H7N9禽流感假病毒及VSVG假病毒感染抑制效果图。

具体实施方式

实施例1：pVAX-HA，pVAX-NA载体构建

1、从GISAID获取H7N9/A/Anhui/1/2013(EPI_ISL_138739)株的HA(439507)，NA(439509)基因的核苷酸序列；

2、按照哺乳动物细胞密码子优化原则对HA，NA基因序列进行优化，并在序列的5’和3’分别添加HindIII和BamHI限制性内切酶酶切位点，经过优化的序列由金斯瑞合成；其中H7N9血凝素蛋白基因（HA）哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQIDNO.1所示，H7N9神经氨酸酶基因（NA）哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQIDNO.2所示。

3、BamHI和HindIII双酶切pVAX-1载体，回收载体片段；

4、将HA，NA片段分别与线性化载体按1:5摩尔比混合，用T4连接酶16℃连接12h

5、转化DH5α感受态，并涂布含卡那霉素的平板；

6、挑取单菌落进行PCR及测序验证；

7、挑取阳性菌落接种至200mL液体LB培养液中，37℃，250rpm,震荡培养12h；

8、用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒pVAX-HA和pVAX-NA，载体鉴定如图（1），图（2），图（3）所示。

实施例2：pVAX-TMPRSS2载体构建

1、从NCBI获取TMPRSS2（BC_051839）基因的核苷酸序列；

2、根据TMPRSS2基因序列设计引物，在上下游引物的5’端分别添加一段pVAX-1载体的同源序列；

注：划线部分为载体同源序列

3、从Calu-3细胞中提取RNA，反转录获得cDNA；

4、通过PCR扩增TMPRSS2，PCR反应条件为：94℃，2min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min；

5、BamHI和HindIII双酶切pVAX-1载体，回收载体片段；

6、将PCR产物20ng和线性化载体pVAX-160ng,2×SeamLessMasterMix混匀，加水补足到10μL，50℃反应连接15min，置于冰上；

7、取5μL连接液加入50μL刚刚融化的DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰浴2-30min；

8、42℃热激30s；

9、立即放置于冰上2min；

10、加入500μL不含抗生素的SOC或LB培养液，37℃，250rpm震荡培养1h；

11、涂布含30ng/mL卡那霉素的平板，37℃培养过夜；

12、挑取菌落做PCR鉴定，阳性菌落测序验证，构建完成的pVAX-TMPRSS2载体鉴定如图（4）所示。

实施例3：H7N9假病毒包装方案一

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-和pVAX-HA按照3：1（单位：μg）混合，加入64μLsolutionB(转染试剂组分，转染试剂由深圳盎然生物公司提供)混匀得solution1；

3、将128μLsolutionB与64μLsolutionA(转染试剂组分，转染试剂由圳盎然生物公司提供)混匀得solution2；

4、将solution2滴加到solution1中，轻柔吹打混匀，室温静置30min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5μg/ml来源的细菌的神经氨酸酶的Opti-DMEM培养液；

7、继续培养48h，收获上清液，1000×g离心10min去除细胞碎片，0.45μm滤器过滤后保存于-80℃。

实施例4：H7N9假病毒包装方案二

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA按照3：1：1（单位：μg）混合，加入64μLsolutionB混匀得solution1；

3、将128μLsolutionB与64μLsolutionA混匀得solution2；

6、5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的Opti-DMEM培养液；

实施例5：H7N9假病毒包装方案三

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：0.012（单位：μg）混合，加入64μLsolutionB混匀得solution1；

3、将128μLsolutionB与64μLsolutionA混匀得solution2；

6、5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5μg/ml来源的细菌的神经氨酸酶和10%FBS的DMEM培养液；

实施例6：H7N9假病毒包装方案四

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：1：0.012（单位：μg）混合，加入64μLsolutionA混匀得solution1；

3、将128μLsolutionB与64μLsolutionA混匀得solution2；

6、5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养液；

实施例7：H7N9假病毒感染MDCK细胞

1、在96孔板中接种MDCK细胞，接种数量为5000cell/孔；

2、从-80℃取出H7N9假病毒，37℃水浴融化；

3、若为方案一或方案二制备的H7N9假病毒，则应加入500μg/mL的TPCK胰酶，37℃水浴30min，然后添加1mg/ml的大豆胰酶抑制剂；若为方案三或方案四制备的假病毒，则无需添加TPCK胰酶和大豆胰酶抑制剂；

4、取步骤3中少量假病毒采用RT-PCR及westernblot验证假病毒是否包装成功，图5为RT-PCR验证Luciferase，图6、7分别用westernblot验证假病毒HA，p24蛋白表达；

扩增Luciferase引物如下表

5、将假病毒液50μl和50μl新鲜DMEM培养基混匀，并添加适量polybrene母液至终浓度为12μg/ml；

6、弃去培养孔中上清，将假病毒悬液加入，37℃培养；

7、6-8h后，弃上清，PBS清洗细胞一遍，更换100μl新鲜的DMEM培养液

8、48h后，往培养孔中加入100μlBright-Gloluciferase检测试剂,室温裂解10min；

9、上机检测，检测结果如图（8）所示。

实施例8：利用H7N9假病毒包装和假病毒细胞模型筛选神经氨酸酶抑制剂

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-和pVAX-HA按照3:1（单位：μg）混合，加入64μLsolutionB混匀得solution1；

3、将128μLsolutionB与64μLsolutionA混匀得solution2；

7、培养液中添加不同浓度的神经氨酸酶抑制剂（如10μM，1μM，100nM，10nM，1nM的达菲）；

8、继续培养48h，收获上清液，1000×g离心10min去除细胞碎片，0.45μm滤器过滤后收集假病毒液；

9、假病毒感染MDCK细胞，具体操作如实施例7所述。

实施例9：利用H7N9假病毒细胞模型筛选流感病毒进入抑制剂

1、在96孔板中接种MDCK细胞，接种数量为5000cell/孔；

2、从-80℃取出H7N9假病毒，37℃水浴融化；

3、若为方案一或方案二制备的H7N9假病毒，则应加入500μg/mL的TPCK胰酶，37℃水浴30min,然后添加1mg/ml的大豆胰酶抑制剂。若为方案三或方案四制备的假病毒，则无需添加TPCK胰酶和大豆胰酶抑制剂；

4、向50μl假病毒液添加待筛选的小分子流感病毒进入抑制剂至不同的浓度（如10μM，1μM，100nM，10nM，1nM的TBHQ）；

5、将假病毒液和50μl新鲜DMEM培养基混匀，并添加适量polybrene母液至终浓度为12μg/ml；

6、弃去培养孔中上清，将假病毒悬液加入，37℃培养；

7、6-8h后，弃上清，PBS清洗细胞一遍，更换100ul新鲜的DMEM培养液

48h后，往培养孔中加入100μlBright-Gloluciferase检测试剂，室温裂解10min；

8、上机检测发光值。

实施例10：H7N9假病毒作为免疫制剂在预防和治疗流感病毒感染中的应用

1、将病毒液用20%蔗糖垫底，SW28，20000rpm，4℃离心2.5h沉淀假病毒颗粒；

2、用少量PBS重悬假病毒沉淀；

3、假病毒悬液用25–65%蔗糖密度梯度离心纯化，离心条件为SW41，25000rpm，16h，4℃；

4、穿刺取出假病毒蛋白条带；

5、用50kD的透析袋过夜透析；

6、收集假病毒液，冻存于-80℃；

7、给6-8周BALB/c小鼠注射0.5μg的假病毒（可联合pVAX-HA载体使用），PBS组作为阴性对照；

8、2天后给小鼠注射50μlH7N9禽流感病毒；

9、将实验组与对照组分开饲养；

10、记录小鼠体重体温等生理指标，记录实验组与对照组小鼠的死亡率。

实施例11：H7N9假病毒在体外中和抗体研究中的应用

1、将MDCK细胞接种于24孔板,每孔细胞数2×10⁴个，37℃，5%CO2培养过夜；

2、使用PBS将H7N9禽流感病毒感染患者血清从1：10开始进行2倍梯度稀释，共12个梯度，然后分别按血清和病毒1：1的体积比与200μl的H7N9假病毒混合，并以与40μl的VSVG假病毒作为阴性对照，37℃孵育2h；

3、将混合物加入到MDCK细胞中，37℃吸附2h后吸弃混合物，加入DMEM继续培养48h；

4、按照检测发光值；

5、以无血清阻断的细胞孔的RLA作为空白对照值，按照以下公式计算血清对假病毒的感染抑制率。感染抑制率=（空白对照孔RLA-阻断孔RLA）/空白对照孔RLA×100%

6、结果如图9所示，可见H7N9中和抗体在体外能够显著抑制H7N9禽流感假病毒感染，并且明显高于对照组VSVG假病毒的抑制效率。

SEQUENCELISTING

<110>杭州庆正鸿科技有限公司

<120>一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用

<130>11

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1686

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

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<210>2

<211>1401

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

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<210>3

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<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

aagctggctagcgtttaaacttaagcttgccaccatggctttgaactcagggtcac56

<210>4

<211>49

<212>DNA

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<400>4

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<210>5

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<212>DNA

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<400>5

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<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tcgcggttgttacttgactg20

Claims

1.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

4.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.如权利要求1、2、3或4所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在进行H7N9流感病毒中和抗体中的应用。

6.如权利要求1、2、3或4所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

7.如权利要求1、2、3或4所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在制备预防和治疗流感病毒感染的免疫制剂中的应用。

8.如权利要求2所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在假病毒细胞模型在筛选神经氨酸酶抑制剂中的应用。

9.一种假病毒细胞模型，其特征在于将权利要求1、2、3或4制得的假病毒感染狗肾细胞MDCK。

10.如权利要求9所述的一种假病毒细胞模型在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。