CN105177043B - 一种h7n9假病毒的制备方法及该h7n9假病毒的应用 - Google Patents

Abstract

一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用，属于生物医药技术领域。它是将H7N9禽流感病毒的HA，NA基因序列克隆至哺乳动物表达载体pVAX‑1，然后用pVAX‑HA，逆转录病毒载体pNL‑4.3.luc.E‑R‑等质粒共转染293T细胞产生H7N9假病毒颗粒。利用H7N9假病毒及假病毒细胞模型筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂和神经氨酸酶抑制剂，利用H7N9假病毒进行流感病毒中和抗体的研究，利用H7N9假病毒作为抗流感免疫制剂预防和治疗流感病毒感染。

Description

一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用。

背景技术

流感一直是人类健康的主要威胁之一。1918年的西班牙流感， 2009年H1N1流感疫情，和禽流感A/H5N1带来了很大的灾害或损失人类。自2013以来，在中国东部地区暴发的A/H7N9禽流感疫情已造成超过45人死亡。其风险和流行潜力吸引了全世界的关注。H7N9禽流感虽然属于低致病性禽流感病毒，但鉴于其感染后的高死亡率，目前，与H7N9禽流感病毒相关的研究工作仍需在三级生物安全实验室开展，这在很大程度上限制了H7N9禽流感相关研究的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用的技术方案。

所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-HA；

2）重组载体pVAX-HA和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：3比例共转染293T细胞，5 h 后更换Opti-DMEM培养液，并添加0.5 μg的外源性细菌神经氨酸酶， 48 h后收集上清，即得。

所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-HA；

2）将H7N9禽流感病毒的NA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-NA；

3）重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：1：3比例共转染293T细胞，5 h 后更换Opti-DMEM培养液，48 h后收集上清，即得。

所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-HA；

2）将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-TMPRSS2；

3）重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-TMPRSS2和pNL-4.3.luc.E-R-质粒按质量比1：0.012：3比例共转染293T细胞，5 h 后更换含10% FBS的DMEM培养液，并添加0.5 μg的外源性细菌神经氨酸酶，48 h后收集上清，即得。

所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-HA；

2）将H7N9禽流感病毒的NA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-NA；

3）将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体pVAX-TMPRSS2；

4）pNL-4.3.luc.E-R-质粒、重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和重组载体pVAX-TMPRSS2按质量比1：1：0.012：3比例共转染293T细胞，5 h 后更换含10% FBS的DMEM培养液，48h后收集上清，即得。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在进行H7N9流感病毒中和抗体中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在制备预防和治疗流感病毒感染的免疫制剂中的应用。

所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在假病毒细胞模型在筛选神经氨酸酶抑制剂中的应用。

所述的一种假病毒细胞模型，其特征在于将权利要求1、2、3或4制得的假病毒感染狗肾细胞MDCK。

所述的一种假病毒细胞模型在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

本发明的有益效果：

1）本发明为高通量筛选H7N9禽流感病毒进入抑制剂，神经氨酸酶抑制剂提供了一种简单高效的方法；

2）本发明为筛选、评价H7N9禽流感病毒中和抗体提供了一种快速高效的方法；采用该方法筛选相关抗流感药物可在二级生物安全实验室进行，无需三级生物安全实验室；

3）采用该方法筛选相关抗流感药物，评价抗体中和效价均可在普通二级生物安全实验室进行，无需三级生物安全实验室；

4）本发明提供了一种潜在的预防和治疗H7N9禽流感病毒感染的免疫制剂。

附图说明

图1为H7N9禽流感病毒的HA和NA基因片段电泳图，图中：泳道1 ：DNA markerDL2000，泳道 2：H7N9/A/Anhui/1/2013 HA基因片段，泳道3：H7N9/A/Anhui/1/2013 NA基因片段。

图2为重组载体pVAX-HA验证图，图中：泳道1 ：DNA marker DL10000，泳道 2：pVAX-1空载体，泳道3：HA，泳道4：pVAX-HA, 泳道5：Bam HI 和 Hind III 双酶切pVAX-HA。

图3为重组载体pVAX-NA验证图，图中：泳道1 ：DNA marker DL10000，泳道 2：pVAX-1空载体，泳道3：NA，泳道4：pVAX-NA，泳道5：Bam HI 和 Hind III 双酶切pVAX-NA。

图4为重组载体pVAX-TMPRSS2验证图，图中：泳道1 ：DNA marker DL10000，泳道2：pVAX-TMPRSS2。

图5为H7N9假病毒luc基因的RT-PCR验证图，图中：泳道1 ：DNA marker DL2000，泳道 2：H7N9假病毒luc基因。

图6为westernblot验证H7N9假病毒HA的表达图。

图7 为westernblot验证H7N9假病毒p24的表达图。

图8 为不同包装方案包装所得假病毒感染MDCK的效果图。

图9为H7N9禽流感病毒中和抗体对H7N9禽流感假病毒及VSVG假病毒感染抑制效果图。

具体实施方式

实施例1：pVAX-HA，pVAX-NA载体构建

1、从GISAID获取H7N9/A/Anhui/1/2013(EPI_ISL_138739)株的HA(439507)，NA(439509)基因的核苷酸序列；

2、按照哺乳动物细胞密码子优化原则对HA，NA基因序列进行优化，并在序列的5’和3’分别添加Hind III和Bam HI限制性内切酶酶切位点，经过优化的序列由金斯瑞合成；其中H7N9血凝素蛋白基因（HA）哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQ ID NO.1所示，H7N9神经氨酸酶基因（NA）哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQ ID NO.2所示。

3、Bam HI和Hind III双酶切pVAX-1载体，回收载体片段；

4、将HA，NA片段分别与线性化载体按1:5摩尔比混合，用T4连接酶16℃连接12 h

5、转化DH5α感受态，并涂布含卡那霉素的平板；

6、挑取单菌落进行PCR及测序验证；

7、挑取阳性菌落接种至200 mL液体LB培养液中，37℃，250 rpm,震荡培养12 h；

8、用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒pVAX-HA和pVAX-NA，载体鉴定如图（1），图（2），图（3）所示。

实施例2：pVAX-TMPRSS2载体构建

1、从NCBI获取TMPRSS2（BC_051839）基因的核苷酸序列；

2、根据TMPRSS2基因序列设计引物，在上下游引物的5’端分别添加一段pVAX-1载体的同源序列；

注：划线部分为载体同源序列

3、从Calu-3细胞中提取RNA，反转录获得cDNA；

4、通过PCR扩增TMPRSS2，PCR反应条件为：94℃，2 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72℃，2 min，35个循环；72℃，10 min；

5、Bam HI和Hind III双酶切pVAX-1载体，回收载体片段；

6、将PCR产物20 ng和线性化载体pVAX-1 60 ng, 2×SeamLess Master Mix混匀，加水补足到10 μL，50℃反应连接15 min，置于冰上；

7、取5 μL连接液加入50 μL刚刚融化的DH5α感受态细胞，轻柔混匀，冰浴2-30min；

8、42℃热激30 s；

9、立即放置于冰上2 min；

10、加入500 μL不含抗生素的SOC或LB培养液，37℃，250 rpm震荡培养1 h；

11、涂布含30 ng/mL卡那霉素的平板，37℃培养过夜；

12、挑取菌落做PCR鉴定，阳性菌落测序验证，构建完成的pVAX-TMPRSS2载体鉴定如图（4）所示。

实施例3：H7N9假病毒包装方案一

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-和pVAX-HA按照3：1（单位：μg）混合，加入64 μLsolution B(转染试剂组分，转染试剂由深圳盎然生物公司提供) 混匀得solution 1；

3、将128 μL solution B与64μL solution A(转染试剂组分，转染试剂由圳盎然生物公司提供) 混匀得solution 2；

4、将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混匀，室温静置30 min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5 μg/ml来源的细菌的神经氨酸酶的Opti-DMEM培养液；

7、继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

实施例4：H7N9假病毒包装方案二

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA按照3：1：1（单位：μg）混合，加入64μL solution B 混匀得solution 1；

3、将128 μL solution B与64 μL solution A 混匀得solution 2；

4、将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混匀，室温静置30 min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的Opti-DMEM培养液；

7、继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

实施例5：H7N9假病毒包装方案三

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：0.012（单位：μg）混合，加入64 μL solution B 混匀得solution 1；

3、将128 μL solution B与64 μL solution A 混匀得solution 2；

4、将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混匀，室温静置30 min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5 μg/ml来源的细菌的神经氨酸酶和10% FBS 的DMEM培养液；

7、继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

实施例6：H7N9假病毒包装方案四

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：1：0.012（单位：μg）混合，加入64 μL solution A 混匀得solution 1；

3、将128 μL solution B与64 μL solution A 混匀得solution 2；

4、将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混匀，室温静置30 min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含10% FBS的DMEM培养液；

7、继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

实施例7：H7N9假病毒感染MDCK细胞

1、在96孔板中接种MDCK细胞，接种数量为5000 cell/孔；

2、从-80℃取出H7N9假病毒，37℃水浴融化；

3、若为方案一或方案二制备的H7N9假病毒，则应加入500 μg/mL的TPCK胰酶，37℃水浴30 min，然后添加1 mg/ml的大豆胰酶抑制剂；若为方案三或方案四制备的假病毒，则无需添加TPCK胰酶和大豆胰酶抑制剂；

4、取步骤3中少量假病毒采用RT-PCR及westernblot验证假病毒是否包装成功，图5为RT-PCR验证Luciferase，图6、7分别用westernblot验证假病毒HA，p24蛋白表达；

扩增Luciferase引物如下表

5、将假病毒液50 μl和50 μl新鲜DMEM培养基混匀，并添加适量polybrene母液至终浓度为12 μg/ml；

6、弃去培养孔中上清，将假病毒悬液加入，37℃培养；

7、6-8 h后，弃上清，PBS清洗细胞一遍，更换100 μl新鲜的 DMEM培养液

8、48 h 后，往培养孔中加入100 μl Bright-Glo luciferase 检测试剂, 室温裂解10 min；

9、上机检测，检测结果如图（8）所示。

实施例8：利用H7N9假病毒包装和假病毒细胞模型筛选神经氨酸酶抑制剂

1、在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2、将质粒pNL-4.3.luc.E-R-和pVAX-HA按照3:1（单位：μg）混合，加入64 μLsolution B 混匀得solution 1；

3、将128 μL solution B与64μL solution A 混匀得solution 2；

4、将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混匀，室温静置30 min；

5、将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

6、5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5 μg/ml来源的细菌的神经氨酸酶的Opti-DMEM培养液；

7、培养液中添加不同浓度的神经氨酸酶抑制剂（如10 μM，1 μM，100 nM，10 nM，1nM的达菲）；

8、继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后收集假病毒液；

9、假病毒感染MDCK细胞，具体操作如实施例7所述。

实施例9：利用H7N9假病毒细胞模型筛选流感病毒进入抑制剂

1、在96孔板中接种MDCK细胞，接种数量为5000cell/孔；

2、从-80℃取出H7N9假病毒，37℃水浴融化；

3、若为方案一或方案二制备的H7N9假病毒，则应加入500 μg/mL的TPCK胰酶，37℃水浴30 min,然后添加1 mg/ml的大豆胰酶抑制剂。若为方案三或方案四制备的假病毒，则无需添加TPCK胰酶和大豆胰酶抑制剂；

4、向50 μl假病毒液添加待筛选的小分子流感病毒进入抑制剂至不同的浓度（如10 μM，1 μM，100 nM，10 nM，1 nM的TBHQ）；

5、将假病毒液和50 μl新鲜DMEM培养基混匀，并添加适量polybrene母液至终浓度为12 μg/ml；

6、弃去培养孔中上清，将假病毒悬液加入，37℃培养；

7、6-8 h后，弃上清，PBS清洗细胞一遍，更换100ul新鲜的 DMEM培养液

48 h 后，往培养孔中加入100 μl Bright-Glo luciferase 检测试剂， 室温裂解10 min；

8、上机检测发光值。

实施例10：H7N9假病毒作为免疫制剂在预防和治疗流感病毒感染中的应用

1、将病毒液用20% 蔗糖垫底，SW28，20000 rpm，4℃离心2.5 h沉淀假病毒颗粒；

2、用少量PBS重悬假病毒沉淀；

3、假病毒悬液用25–65% 蔗糖密度梯度离心纯化，离心条件为SW41，25000 rpm，16h，4℃；

4、穿刺取出假病毒蛋白条带；

5、用50kD 的透析袋过夜透析；

6、收集假病毒液，冻存于-80℃；

7、给6-8周BALB/c小鼠注射0.5 μg的假病毒（可联合pVAX-HA载体使用），PBS组作为阴性对照；

8、2天后给小鼠注射50 μl H7N9禽流感病毒；

9、将实验组与对照组分开饲养；

10、记录小鼠体重体温等生理指标，记录实验组与对照组小鼠的死亡率。

实施例11：H7N9假病毒在体外中和抗体研究中的应用

1、将MDCK细胞接种于24孔板,每孔细胞数2×10⁴个，37℃，5% CO2培养过夜；

2、使用PBS将H7N9禽流感病毒感染患者血清从1：10开始进行2倍梯度稀释，共12个梯度，然后分别按血清和病毒1：1的体积比与200 μl的H7N9假病毒混合，并以与40 μl的VSVG假病毒作为阴性对照，37℃孵育2 h；

3、将混合物加入到MDCK细胞中，37℃吸附2h后吸弃混合物，加入DMEM继续培养48h；

4、按照检测发光值；

5、以无血清阻断的细胞孔的RLA作为空白对照值，按照以下公式计算血清对假病毒的感染抑制率。感染抑制率=（空白对照孔RLA-阻断孔RLA）/空白对照孔RLA×100%

6、结果如图9所示，可见H7N9中和抗体在体外能够显著抑制H7N9禽流感假病毒感染，并且明显高于对照组VSVG假病毒的抑制效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州庆正鸿科技有限公司

<120> 一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9假病毒的应用

<130> 11

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggatccatga atactcagat cctggtgttc gcactgatcg ccattatccc tactaacgcc 60

gacaagattt gcctgggcca tcacgccgtc tccaacggga ccaaagtgaa taccctgaca 120

gagcgaggag tcgaagtggt caacgccact gagaccgtgg aacgaactaa tatcccccgg 180

atttgcagca agggcaaacg gaccgtggat ctgggccagt gtgggctgct gggaacaatc 240

actgggcccc ctcagtgcga tcagttcctg gagttttccg ccgacctgat cattgagcgg 300

agagaaggat ctgatgtgtg ttaccctggc aagttcgtca acgaggaagc tctgaggcag 360

atcctgcgag agagcggagg aattgacaaa gaagcaatgg gcttcaccta ctccggcatc 420

agaactaatg gagcaacctc agcttgcagg cgaagcggaa gctccttcta tgccgagatg 480

aagtggctgc tgtccaacac agacaatgcc gcttttcccc agatgactaa gtcttataaa 540

aacaccagga aaagtcctgc actgatcgtg tggggcattc accattccgt ctctacagcc 600

gaacagacta agctgtacgg gtctggaaac aaactggtga ccgtcggatc tagtaattat 660

cagcagagct tcgtgccatc cccaggagca aggccacagg tcaacggact gagcgggcgc 720

atcgattttc actggctgat gctgaaccct aatgacaccg tgacattcag ttttaatggc 780

gcattcatcg ccccagatag agcctcattt ctgaggggca agtccatggg gattcagtct 840

ggagtgcagg tcgatgctaa ctgcgagggc gactgttacc atagtggagg cactatcatt 900

tcaaacctgc cattccagaa tatcgactct cgcgcagtgg ggaagtgtcc ccgctatgtc 960

aaacagcgaa gtctgctgct ggccacagga atgaagaatg tgcctgagat cccaaaaggc 1020

agagggctgt tcggcgctat cgcagggttt attgagaacg gatgggaagg cctgattgat 1080

gggtggtacg gcttccggca ccagaatgcc cagggagagg gcacagcagc cgattataag 1140

agtactcagt cagctatcga ccagattacc ggcaagctga accgcctgat cgaaaaaaca 1200

aatcagcagt tcgagctgat tgataacgag ttcaacgagg tggaaaagca gatcggcaac 1260

gtcattaatt ggacccggga cagcatcaca gaagtgtggt cctacaacgc tgagctgctg 1320

gtcgcaatgg aaaatcagca taccattgat ctggcagaca gcgagatgga taagctgtat 1380

gaacgagtga aacggcagct gagagagaac gctgaggaag acgggacagg atgtttcgaa 1440

atctttcaca agtgcgacga tgactgtatg gcttcaattc ggaacaatac ttacgaccat 1500

agcaaatatc gggaggaagc aatgcagaat agaatccaga ttgatcctgt gaagctgtca 1560

agcggctaca aagacgtgat cctgtggttc tcttttgggg ccagttgctt catcctgctg 1620

gctattgtga tgggactggt ctttatctgt gtgaaaaacg ggaacatgcg atgcactatc 1680

tgtatc 1686

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aagcttatga accctaacca gaaaatcctg tgtacttccg ctaccgccat tattatcggg 60

gctatcgctg tcctgatcgg catcgccaac ctggggctga acatcggact gcacctgaag 120

cctagctgca attgttccca ttctcagcca gaaaccacaa acacatccca gactatcatt 180

aacaactact acaacgagac caacatcaca aacattcaga tggaggaacg aacctctcgg 240

aacttcaaca atctgacaaa aggcctgtgc actatcaaca gctggcacat ctacggcaag 300

gacaatgccg tgaggatcgg ggagagctcc gatgtgctgg tcacccgcga accctacgtc 360

tcctgcgacc ctgatgagtg tcgattttat gccctgtcac aggggactac catccgcgga 420

aaacacagca atggcacaat tcatgacaga agccagtaca gggctctgat ctcctggcca 480

ctgtctagtc cccctacagt gtataactcc agggtcgaat gcattgggtg gtcaagcact 540

tcttgtcacg atggaaagtc acgcatgagc atctgcattt ctggccccaa caataacgcc 600

agtgctgtgg tctggtataa tcggagacct gtggctgaga tcaacacctg ggcacgcaat 660

attctgcgaa cacaggagtc tgaatgcgtg tgtcataacg gggtctgtcc agtggtcttc 720

accgacggaa gcgcaacagg accagcagat actaggatct actattttaa ggagggcaaa 780

attctgaagt gggaaagtct gacagggact gcaaaacaca tcgaggaatg ctcatgttac 840

ggagagcgga caggcattac ctgcacctgt aaggacaact ggcagggcag caatagacca 900

gtgatccaga ttgatcccgt cgctatgact cataccagtc agtatatctg ctcacctgtg 960

ctgactgaca atccacgccc caacgatcca aatattggaa aatgtaacga cccttaccca 1020

ggcaataaca ataacggcgt gaaggggttc tcttatctgg atggggcaaa tacctggctg 1080

ggacggacta tcagtaccgc cagtagatca gggtacgaaa tgctgaaagt gcccaatgct 1140

ctgactgacg atcggagcaa gcctatccag ggacagacca ttgtgctgaa cgcagactgg 1200

tccggataca gcggctcctt catggactat tgggccgagg gagattgcta cagagcttgt 1260

ttttatgtgg agctgatcag gggccgccct aaagaagata aagtgtggtg gacctctaac 1320

agtattgtct ccatgtgctc tagcaccgag tttctgggac agtggaattg gcctgatgga 1380

gcaaagattg agtattttct g 1401

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttgc caccatggct ttgaactcag ggtcac 56

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aattccacca cactggacta gtggatcctt agccgtctgc cctcatttg 49

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acaccccaac atcttcgac 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcgcggttgt tacttgactg 20

Claims (8)

1.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2）将质粒pNL-4.3.luc.E-R-和pVAX-HA按照3：1混合，加入脂质体转染试剂，得到DNA-脂质体复合物；

3）将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

4）5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5 μg/ml细菌来源的神经氨酸酶的Opti-DMEM培养液；

5）继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

2.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2）将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：0.012混合，加入脂质体转染试剂，得到DNA-脂质体复合物；

3）将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

4）5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0.5 μg/ml细菌来源的神经氨酸酶和10% FBS 的DMEM培养液；

5）继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

3.一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在6孔板中接种4×10⁵个293T细胞，培养至80%铺满；

2）将质粒pNL-4.3.luc.E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA和pVAX-TMPRSS2按照3：1：1：0.012混合，加入脂质体转染试剂，得到DNA-脂质体复合物；

3）将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37℃培养；

4）5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含10% FBS的DMEM培养液；

5）继续培养48 h，收获上清液，1000×g离心10min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤后保存于-80℃。

4.如权利要求1、2或3任一所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在进行H7N9流感病毒中和抗体实验中的应用。

5.如权利要求1、2或3任一所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。

6.如权利要求1、2或3任一所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在制备预防和治疗流感病毒感染的免疫制剂中的应用。

7.一种假病毒细胞模型，其特征在于将权利要求1、2或3任一制得的假病毒感染狗肾细胞MDCK。

8.如权利要求7所述的一种假病毒细胞模型在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应用。