CN116144612A - 重组乙型流感病毒及其制备方法与应用 - Google Patents

重组乙型流感病毒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种重组乙型流感病毒及其制备方法与应用，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白。该重组乙型流感病毒可自主生长复制，能同时表达两种谱系乙型流感病毒株的HA蛋白，且插入的外源HA融合基因具有良好的遗传稳定性。本申请获得的重组乙型流感病毒可作为乙型流感二价疫苗的候选毒株，具有重要的应用价值。

Description

重组乙型流感病毒及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种重组乙型流感病毒及其制备方法与应用。
背景技术
季节性流感是由甲型流感病毒和乙型流感病毒共同引起的。其中，乙型流感病毒感染的病例占每年所有流感病例的25％。乙型流感病毒感染能够诱发儿童、老人、免疫力低下的成年人出现严重并发症甚至死亡，严重威胁人类健康。
与甲型流感病毒相同，乙型流感病毒主要依靠病毒粒子表面的糖蛋白，特别是血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)抗原特性的改变，来逃避机体已有的免疫保护，从而导致流感持续流行。乙型流感病毒根据血凝素的抗原性和HA1区域核苷酸序列的不同，可分为两大谱系：以Victoria/2/87样病毒为代表的Victoria谱系和以B/Yamagata/16/88样病毒为代表的Yamagata谱系。研究表明，这两个谱系至少在1983年就开始在世界范围内同时流行。
疫苗接种是预防和控制流感的有效措施。目前已上市获批的季节性流感疫苗包含有裂解疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等不同类型的三价或四价疫苗。最初，季节性流感疫苗为三价疫苗，包括甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Victoria谱系或Yamagata谱系毒株。由于很难准确地预测哪一谱系的乙型流感病毒将会在下一个流行季中占主导地位，所以经常出现三价流感疫苗中的乙型流感疫苗毒株与当季流行毒株错配的现象，从而导致三价疫苗的有效性降低。自2013年起，季节性流感疫苗的研发增加了四价疫苗，即同时包含了Victoria和Yamagata两种谱系的乙型流感疫苗株。虽然已有研究表明，四价流感疫苗具有良好的安全性和非劣等的免疫原性，且可以为机体提供更全面的保护。但是，四价疫苗株较三价疫苗增加了一种疫苗组成成分，其制备过程中需要额外增加一种谱系乙型流感疫苗株的生产与配伍，从而导致四价流感疫苗的成本升高、产能降低，同时也增加了流感疫苗的生产负担和经济成本，限制了其在全球范围内的普及使用。因此，迫切需要研制新型疫苗株来同时预防两种谱系乙型流感病毒的感染。
发明内容
基于此，本申请提供了一种能够同时表达Victoria谱系和Yamagata谱系血凝素蛋白的重组乙型流感病毒及其制备方法与应用。
本申请解决上述技术问题的技术方案如下。
根据本申请的一个方面，提供了一种重组乙型流感病毒，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白；
所述重组血凝素蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
所述重组非结构蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中，编码所述重组血凝素蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，和/或，编码所述重组非结构蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。
在其中一个实施例中，所述重组乙型流感病毒具有如下特征中的一个或多个：
(1)具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸；和
(2)编码如SEQ ID NO.6所示的蛋白。
在其中一个实施例中，所述重组非结构蛋白来自Victoria谱系乙型流感病毒；所述重组血凝素蛋白来自Yamagata谱系乙型流感病毒。
在其中一个实施例中，所述Victoria谱系乙型流感病毒为B/Brisbane/60/2008；和/或，所述Yamagata谱系乙型流感病毒为B/Phuket/3073/2013。
本申请还提供了一种上述的重组乙型流感病毒的制备方法，包括以下步骤：
合成包含编码所述重组非结构蛋白以及所述重组血凝素蛋白的基因片段；
构建携带所述基因片段的重组pM质粒；
将所述质粒与携带编码乙型流感病毒PB1、PB2、PA、NP、HA、M和NA基因的pM重组质粒共同转染细胞，拯救所述重组乙型流感病毒；和
收集所述转染的上清液，接种于鸡胚中扩增，制备所述重组乙型流感病毒。
本申请还提供了分离的核酸，选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.5中的一种或多种。
本申请还提供了一种流感疫苗，包括上述的重组乙型流感病毒。
在其中一个实施例中，所述疫苗为全病毒灭活疫苗。
本申请还提供了一种中和抗体，使用上述的重组乙型流感病毒制备。
有益效果：
本申请构建了一种重组乙型流感病毒，该重组乙型流感病毒可稳定地同时表达乙型流感Victoria谱系病毒的表面抗原血凝素HA蛋白全长，以及Yamagata谱系流感病毒的表面蛋白血凝素HA1、跨膜区(TM)和胞浆尾(CT)的融合蛋白。所构建的重组乙型流感病毒能够自主生长复制，但其体外复制能力低于野生背景毒株。用该重组病毒制备灭活疫苗株免疫小鼠，可有效保护致死剂量的Victoria和Yamagata两谱系乙型流感病毒对小鼠的攻击。本申请获得的重组乙型流感病毒可作为预防两谱系乙型流感病毒的二价候选疫苗株，对简化四价流感疫苗的生产过程、降低其生产成本具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为实施例1中基因设计和技术路线示意图，其中A为Yamagata谱系乙型流感病毒HA1基因与跨膜区(TM)、胞浆尾(CT)融合基因的结构模拟图；B为Victoria谱系乙型流感病毒NS基因改造后的结构模拟图；C重组乙型流感病毒拯救流程图；
图2为实施例2中pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT质粒图谱；
图3为实施例3中pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT质粒凝胶电泳与质粒PCR鉴定凝胶电泳图：其中A为pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT重组质粒电泳；B为重组质粒PCR鉴定凝胶电泳；
图4为实施例4中拯救获得的重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT的RT-PCR鉴定凝胶电泳图；
图5为实施例5中重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT与乙型流感背景毒株B/Brisbane/60/2008在MDCK细胞上的噬斑形态；
图6为实施例5中重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT与乙型流感背景毒株B/Brisbane/60/2008在MDCK细胞上的生长曲线；
图7为实施例6中重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT的HA蛋白免疫印迹图：其中A为抗Victoria谱系病毒血凝素蛋白免疫多克隆抗体检测；B为抗Yamagata谱系病毒血凝素蛋白免疫多克隆抗体检测；
图8为实施例7中灭活重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT免疫接种后，Victoria谱系病毒致死剂量攻毒后实验动物体重变化和存活率；
图9为实施例7中灭活重组乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT免疫接种后，Yamagata谱系病毒致死剂量攻毒后实验动物体重变化和存活率。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。如无特别说明，本申请中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本申请中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本申请中的试剂、材料、试验动物、细胞、质粒和载体等均可从市场上或其它公开渠道获得。除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本申请中术语“乙型流感病毒”是指单股、负链、分节段的RNA病毒，含有大小不同的8个RNA片段，根据电泳迁移率，分为：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。
根据血凝素(HA)抗原特性和HA1基因序列不同，乙型流感病毒划分为两种不同的谱系：B/Yamagata/16/88样谱系(Yamagata谱系)和B/Victoria/2/87样谱系(Victoria谱系)。两谱系乙型流感病毒在流行季中共同流行。血凝素HA蛋白是病毒粒子表面重要的糖蛋白，在病毒复制和诱导宿主免疫应答中发挥着重要作用，是流感疫苗研发的主要靶抗原。HA属于典型的I型跨膜糖蛋白，约由562～566个氨基酸组成，其一级结构含有4个结构域：信号肽(signal peptide，SP)、胞外域(extracellular domain，ED)、跨膜域(transmembranedomain，TM)和胞浆尾(Cytoplasm tail，CT)。自然状态下，HA蛋白由三个单体蛋白组成同源三聚体。三聚体的球状头部，由部分HA1组成，含有唾液酸结合位点及多个抗原表位，是诱导抗体产生的主要靶标。
非结构蛋白NS主要由基因片段8所编码，是病毒基因组中最小片段，并具有两个不同的编码框，分别编码NS1和NS2(NEP)两种蛋白。NS1蛋白以二聚体蛋白形式存在，在病毒有效生长和拮抗宿主干扰素诱导方面起重要作用；NEP是NS基因片段编码的mRNA经过剪接后翻译而来，出现于晚期感染并分布于胞浆中，在病毒的基因组复制与转录、病毒vRNP复合物的细胞核输出、病毒粒子的组装、出芽等多个环节发挥着重要作用。
本申请的一些实施方式提供了一种重组乙型流感病毒，该重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，该重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白；
重组血凝素蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
重组非结构蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
具体地，SEQ ID NO.2：
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEKIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKIGFFATMAWAVPKDNYKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKSLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGDFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEEYGGLNKSKPYYTGKHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICL
SEQ ID NO.4：
MANNNMTTTQIEVGPGATNATINFEAGILECYERLSWQRALDYPGQDRLNRLKRKLESRIKTHNKSEPESKRMSLEERKAIGVKMMKVLLFMNPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCTKYNWTDYPSTPERCLDDIEEEPEDVDGPTEKEQLFQSNMERKELHNTVMDLRGNMANNNMTTTQIEWRMKKMAIGSSTHSSSVLMKDIQSQFEQLKLRWESYPNLVKSTDYHQKRETIRLVTEELYLLSKRIDDNILFHKTVIANSSIIADMVVSLSLLETLYEMKDVVEVYSRQCL
在其中一些实施方式中，编码上述重组血凝素蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，和/或，编码上述重组非结构蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。
具体地，SEQ ID NO.1：
ATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACATCCAACGCAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTGGTCAAAACAGCTACTCAAGGGGAGGTCAATGTGACTGGCGTGATACCACTGACAACAACACCAACAAAATCTTATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAGGACCAGAGGGAAACTATGCCCGGACTGTCTCAACTGTACAGATCTGGATGTGGCCTTGGGCAGGCCAATGTGTGTGGGGACCACACCTTCTGCTAAAGCTTCAATACTCCATGAGGTCAGACCTGTTACATCCGGGTGCTTTCCTATAATGCACGACAGAACAAAAATCAGGCAACTACCCAATCTTCTCAGAGGATATGAAAAGATCAGGTTATCAACCCAAAACGTTATCGATGCAGAAAAAGCACCAGGAGGACCCTACAGACTTGGAACCTCAGGATCTTGCCCTAACGCTACCAGTAAAATCGGATTTTTTGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCAAAGGACAACTACAAAAATGCAACGAACCCACTAACAGTGGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCATTCGGATGACAAAACCCAAATGAAGAGCCTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCATCTGCTAATGGAGTAACCACGCATTATGTTTCTCAGATTGGCGACTTCCCAGATCAAACAGAAGACGGAGGACTACCACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGATGCAAAAACCTGGGAAAACAGGAACAATTGTCTATCAAAGGGGTGTTTTGTTGCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCGAGTGGCAGGAGCAAAGTAATAAAAGGGTCATTGCCTTTAATTGGTGAAGCAGATTGCCTTCATGAAGAATACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGAAAACATGCAAAAGCCATAGGAAATTGCCCAATATGGGTAAAAACACCTTTGAAGCTTGCCAATGGAACCAAATATAGACCTCCTGCAAAACTATTGAAGGAACATACTATACTGCTCTATTACTCAACTGCTGCTTCTAGTTTGGCTGTAACATTAATGCTAGCTATTTTTATTGTTTATATGGTCTCCAGAGACAACGTTTCATGCTCCATCTGTCTA
SEQ ID NO.3：
ATGGCGAACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGGTGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCACCATAAACTTTGAAGCAGGAATTCTAGAGTGCTATGAAAGGCTTTCATGGCAAAGAGCCCTTGACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAGAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTGAAAGTAAAAGGATGTCCCTTGAAGAGAGAAAAGCAATTGGAGTAAAAATGATGAAAGTACTCCTATTTATGAATCCGTCTGCTGGAATTGAAGGGTTTGAGCCATACTGTATGAAAAGTTCCTCAAATAGCAACTGTACGAAATACAATTGGACTGATTACCCTTCAACACCAGAGAGGTGCCTTGATGACATAGAGGAAGAACCAGAGGATGTTGATGGCCCAACTGAAAAAGAGCAGCTCTTCCAGTCGAACATGGAGCGCAAAGAGCTGCACAACACGGTCATGGACCTGCGCGGCAACATGGCGAACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAATTAGACTGGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAAAGAATTGATGATAACATACTATTCCACAAAACAGTAATAGCTAACAGCTCCATAATAGCTGACATGGTTGTATCATTATCATTATTAGAAACATTGTATGAAATGAAGGATGTGGTTGAAGTGTACAGCAGGCAGTGCTTGTGA
在一些具体示例中，重组血凝素蛋白编码基因的5’端连接有完整的NEP编码框序列与NS基因5’端非编码区序列。
在一些具体示例中，在编码上述重组血凝素蛋白的核苷酸序列的3’端，连接有编码异源谱系乙型流感病毒非结构蛋白的重组NS1核苷酸序列；上述重组NS1核苷酸序列包括非结构蛋白NS基因3’端非编码区、NS1截短片段和黑腹果蝇Ncd蛋白序列(Dmd)，其中，NS1截短片段包含N端145个氨基酸和突变的SA-剪接受体位点。
具体地，重组NS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；
在一些具体示例中，重组血凝素蛋白与NS1-Dmd融合基因之间通过口蹄疫病毒2A肽(FMDV-2A)基因相连接；重组血凝素蛋白与NEP编码基因之间通过猪捷申病毒1(PTV1)2A肽(PTV1-2A)基因相连接。
在其中一些实施方式中，上述重组乙型流感病毒具有如下特征中的一个或多个：
(1)具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸；和
(2)编码如SEQ ID NO.6所示的蛋白。
SEQ ID NO.5：
AGCAGAAGCAGAGGATTTGTTTAGTCACTGGCAAACAGGGAAAAATGGCGAACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGGTGGGTCCGGGAGCAACCAATGCCACCATAAACTTTGAAGCAGGAATTCTAGAGTGCTATGAAAGGCTTTCATGGCAAAGAGCCCTTGACTACCCTGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAGAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTGAAAGTAAAAGGATGTCCCTTGAAGAGAGAAAAGCAATTGGAGTAAAAATGATGAAAGTACTCCTATTTATGAATCCGTCTGCTGGAATTGAAGGGTTTGAGCCATACTGTATGAAAAGTTCCTCAAATAGCAACTGTACGAAATACAATTGGACTGATTACCCTTCAACACCAGAGAGGTGCCTTGATGACATAGAGGAAGAACCAGAGGATGTTGATGGCCCAACTGAAAAAGAGCAGCTCTTCCAGTCGAACATGGAGCGCAAAGAGCTGCACAACACGGTCATGGACCTGCGCGGCAACGGCAGCGGCGGCCAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACATCCAACGCAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTGGTCAAAACAGCTACTCAAGGGGAGGTCAATGTGACTGGCGTGATACCACTGACAACAACACCAACAAAATCTTATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAGGACCAGAGGGAAACTATGCCCGGACTGTCTCAACTGTACAGATCTGGATGTGGCCTTGGGCAGGCCAATGTGTGTGGGGACCACACCTTCTGCTAAAGCTTCAATACTCCATGAGGTCAGACCTGTTACATCCGGGTGCTTTCCTATAATGCACGACAGAACAAAAATCAGGCAACTACCCAATCTTCTCAGAGGATATGAAAAGATCAGGTTATCAACCCAAAACGTTATCGATGCAGAAAAAGCACCAGGAGGACCCTACAGACTTGGAACCTCAGGATCTTGCCCTAACGCTACCAGTAAAATCGGATTTTTTGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCAAAGGACAACTACAAAAATGCAACGAACCCACTAACAGTGGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCATTCGGATGACAAAACCCAAATGAAGAGCCTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCATCTGCTAATGGAGTAACCACGCATTATGTTTCTCAGATTGGCGACTTCCCAGATCAAACAGAAGACGGAGGACTACCACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGATGCAAAAACCTGGGAAAACAGGAACAATTGTCTATCAAAGGGGTGTTTTGTTGCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCGAGTGGCAGGAGCAAAGTAATAAAAGGGTCATTGCCTTTAATTGGTGAAGCAGATTGCCTTCATGAAGAATACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGAAAACATGCAAAAGCCATAGGAAATTGCCCAATATGGGTAAAAACACCTTTGAAGCTTGCCAATGGAACCAAATATAGACCTCCTGCAAAACTATTGAAGGAACATACTATACTGCTCTATTACTCAACTGCTGCTTCTAGTTTGGCTGTAACATTAATGCTAGCTATTTTTATTGTTTATATGGTCTCCAGAGACAACGTTTCATGCTCCATCTGTCTAGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGGCGAACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGTCTTAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAATTAGACTGGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAAAGAATTGATGATAACATACTATTCCACAAAACAGTAATAGCTAACAGCTCCATAATAGCTGACATGGTTGTATCATTATCATTATTAGAAACATTGTATGAAATGAAGGATGTGGTTGAAGTGTACAGCAGGCAGTGCTTGTGAATTTAAAATAAAAATCCTCTTGTTACTACT
SEQ ID NO.6：
MANNNMTTTQIEVGPGATNATINFEAGILECYERLSWQRALDYPGQDRLNRLKRKLESRIKTHNKSEPESKRMSLEERKAIGVKMMKVLLFMNPSAGIEGFEPYCMKSSSNSNCTKYNWTDYPSTPERCLDDIEEEPEDVDGPTEKEQLFQSNMERKELHNTVMDLRGNGSGGQLLNFDLLKLAGDVESNPGPMKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEKIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKIGFFATMAWAVPKDNYKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKSLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGDFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEEYGGLNKSKPYYTGKHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICLGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMANNNMTTTQIEWRMKKMAIGSSTHSSSVLMKDIQSQFEQLKLRWESYPNLVKSTDYHQKRETIRLVTEELYLLSKRIDDNILFHKTVIANSSIIADMVVSLSLLETLYEMKDVVEVYSRQCL
在其中一些实施方式中，上述重组非结构蛋白来自Victoria谱系乙型流感病毒，上述重组血凝素蛋白来自Yamagata谱系乙型流感病毒。
可以理解的是，上述重组非结构蛋白也可以来自Yamagata谱系乙型流感病毒，重组血凝素蛋白来自Victoria谱系乙型流感病毒。
上述重组乙型流感病毒至少具有如下优点：能够同时表达Victoria谱系和Yamagata谱系流感病毒的血凝素蛋白，并诱导机体产生针对两种谱系的乙型流感病毒株血凝素的保护性抗体；并且该重组的流感病毒能够在体内自主复制、在体外的复制能力减弱。
本申请的一些实施方式还提供了一种上述重组乙型流感病毒的制备方法。
在其中一些实施方式中，上述制备方法包括以下步骤：
合成包含编码重组非结构蛋白以及重组血凝素蛋白的基因片段并构建pM重组质粒；
将上述质粒与携带编码乙型流感病毒PB1、PB2、PA、NP、HA、M和NA基因的pM重组质粒共同转染宿主细胞，拯救重组乙型流感病毒；和
收集转染的上清液，接种于鸡胚中扩增，制备重组乙型流感病毒。
在一些具体示例中，宿主细胞选自293H细胞和MDCK细胞中的一种或多种。
在一个具体示例中，上述制备方法包括步骤S10～S30。
步骤S10：合成包含有Victoria谱系乙型流感病毒非结构蛋白NS1(1～145aa)、黑腹果蝇Ncd蛋白基因(Dmd)、口蹄疫病毒2A肽(FMDV-2A)基因、Yamagata谱系乙型流感病毒血凝素HA1与跨膜区(TM)和胞浆尾(CT)的融合基因、猪捷申病毒1(PTV1)2A肽(PTV1-2A)基因、Victoria谱系乙型流感病毒非结构蛋白NEP基因、Victoria谱系乙型流感病毒非结构基因NS片段3’端非编码区和5’端非编码区(NCR)的DNA片段，将合成的DNA片段连接到双向表达载体质粒pM上，构建成重组质粒pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT；
步骤S20：将S10中构建的重组质粒pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT与用于表达Victoria谱系乙型流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M七个基因序列的pM载体重组质粒(pM-PB2、pM-PB1、pM-PA、pM-HA、pM-NP、pM-NA和pM-M)共同转染293T与MDCK混合细胞，拯救重组乙型流感病毒；
步骤S30：转染上清接种鸡胚，扩增拯救出的重组乙型流感病毒B/Bris-NS1145-PhuHA1+TM+CT。
上述的重组流感病毒的制备方法工艺简单、生产成本低，适于全面推广使用。
本申请的一些实施方式还提供了分离的核酸，选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.5中的一种或多种。
本申请的一些实施方式还提供了一种包括上述重组乙型流感病毒的流感疫苗。
在其中一些实施方式中，上述疫苗为全病毒灭活疫苗。
可以理解的是，在其中一些实施方式中，上述疫苗也可以为减毒活疫苗。
本申请的一些实施方式还提供了一种使用上述重组乙型流感病毒制备的中和抗体。
下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。
实施例1携带异源HA融合蛋白的NS重组基因的设计改造
如图1A所示，首先以Yamagata谱系乙型流感疫苗株B/Phuket/3073/2013病毒为模型，对血凝素HA基因进行改造设计，保留HA1，去除HA2的大部分基因序列仅保留跨膜区(TM)和胞浆尾(CT)编码基因，将编码HA1、TM和CT的基因进行融合；融合后的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一方面，通过去除HA2来减少外源插入基因片段的长度，使其在重组病毒基因组内更加稳定；另一方面，通过保留跨膜区和胞浆尾提高HA三聚体的膜定位的结构稳定性。
接着，如图1B所示，以Victoria谱系乙型流感疫苗株B/Brisbane/60/2008病毒为模型，对非结构蛋白NS基因进行改造设计，包括截短NS1基因长度(仅保留N端145个氨基酸)、融合黑腹果蝇Ncd蛋白(Dmd)基因序列、突变SA-剪接受体位点、NEP重排为连续完整阅读编码框，重组后的非结构蛋白NS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。其中，NS1截短是为了提高NS基因对外源插入基因长度的承载能力；融合黑腹果蝇Ncd蛋白序列(Dmd)，有利于截短后的NS1基因形成二聚体；SA-剪接位点突变是为了避免NS1截短部分序列提前剪切终止外源基因的表达。
此外，利用2A肽的“自我剪切”功能对NS1145-Dmd、HA融合蛋白和NPE蛋白进行自剪切分离。其中，口蹄疫病毒2A肽(FMDV-2A)插入到NS1145-Dmd和HA融合蛋白之间，而猪捷申病毒1(PTV1)2A肽(PTV1-2A)插入到HA融合蛋白和NEP之间，合成BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。
实施例2构建pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT重组质粒
将设计好的携带异源HA融合蛋白的NS重组基因送往生物技术公司，通过人工合成获得基因双链DNA。以合成基因为模板，以NS-F和NS-R为引物(序列信息如表1所示)，PCR扩增得到含有pM载体末端同源序列的重组NS基因扩增产物，做胶回收纯化；PCR扩增条件：95℃，4min；98℃，10s；60℃，5s；72℃，40s；30个循环72℃，5min；4℃保存。
以pM-F和pM-R为引物(序列信息如表1所示)，通过反向PCR扩增制备线性化pM载体，用DpnI酶处理后，胶回收纯化。PCR条件：95℃，4min；98℃，10s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，5min；4℃保存。
将重组NS基因片段与线性化pM载体片段用Exnase酶进行同源重组，转化Trans10感受态细胞，接种至携带Amp抗性LB固体培养基，得到克隆质粒pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT；重组质粒图谱如图2所示。
表1引物信息
Figure BDA0003988279680000161
实施例3提取重组质粒pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT与PCR鉴定
用质粒小提试剂盒进行质粒的抽取，将提取的质粒进行DNA凝胶电泳，验证质粒的大小，电泳检测结果如图3A所示；用引物T7-F和BGH-R(序列信息如表2所示)对重组质粒进行PCR鉴定，电泳检测结果如图3B所示。
PCR条件：95℃，4min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，40s；30个循环；72℃，5min；4℃保存。
表2引物信息
名称 编号 序列(5’-3’)
T7-F SEQ ID NO.11 TAATACGACTCACTATAGGGA
BGH-R SEQ ID NO.12 TAGAAGGCACAGTCGAGG
实施例4重组病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT的拯救与RT-PCR鉴定
将测序正确的pM-B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT质粒同B/Brisbane病毒其余7个基因片段的pM质粒(pM-PB2、p M-PB1、pM-PA、pM-HA、pM-NP、pM-NA和pM-M)共同转染293H和MDCK混合培养细胞。具体实验步骤参照Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂说明书。转染后48h，收取转染上清，接种7日龄的鸡胚。接种后，鸡胚于33℃孵箱培72h后，放置于4℃冰箱过夜，收取鸡胚尿囊液，血凝实验测定血凝活性。收获血凝测定阳性的鸡胚尿囊液，提取总RNA，使用如表3所示的引物对RT-PCR扩增病毒基因组，PCR条件：95℃，4min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，40s；30个循环；72℃，5min；4℃保存，电泳检测结果如图4所示，并测序验证拯救的病毒。鉴定正确的重组流感病毒命名为B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT。
表3引物信息
名称 编号 序列(5’-3’)
NS-ORF-F SEQ ID NO.13 ATGGCGAACAACAACATGACCACAAC
NS-ORF-R SEQ ID NO.14 TCACAAGCACTGCCTGCTGTACACTTG
实施例5重组病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT在MDCK细胞中的生长复制特性
1)重组病毒在MDCK细胞中的噬斑形态：
将B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT和背景病毒B/Brisbane/60/2008分别感染6孔板中的单层MDCK细胞。病毒吸附细胞后，吸弃病毒感染液，PBS洗细胞2次后，细胞上层铺琼脂糖凝胶(0.8％琼脂糖，0.3％ BSA，1ug/mL TPCK-trypsin)，37℃培养72h；除去细胞培养板中的上层凝胶，用4％多聚甲醛固定细胞后，加入小鼠抗乙型流感NP蛋白抗体(anti-NP)孵育；一抗孵育后，加入山羊抗小鼠二抗。最后用AEC显色试剂盒显色，观察病毒噬斑形态；重组病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT在细胞中能够自主复制，形成噬斑。如图5所示，相比背景病毒株B/Brisbane/60/2008，重组病毒株的噬斑形态略小。
2)重组病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT病毒在MDCK细胞中生长曲线的测定：
将B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT和背景病毒B/Brisbane/60/2008分别感染MDCK细胞(MOI＝0.001)，于感染后0～96h每隔12h收取培养上清；待全部样品收集后，统一通过TCID50测定病毒滴度，绘制生长曲线；如图6所示，B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT病毒在MDCK细胞中能够自主复制，在感染后72h可达到复制最高点，此时病毒滴度约为106TCID50/mL，其复制水平略低于背景病毒B/Brisbane/60/2008。
综上，本实施例成功拯救了携带重组NS基因的乙型流感病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT，该重组病毒能够自主复制达到较高滴度。
实施例6重组病毒B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT的双谱系HA/HA1蛋白表达鉴定
将重组乙型流感病毒B/Bris-NS1145-B/PhuHA1+TM+CT以0.001MOI感染MDCK细胞，感染48h后将细胞裂解液裂解进行Western-blot实验；样品一式二份，一份孵育抗Victoria谱系多克隆抗体，一份孵育抗Yamagata谱系多克隆抗体。结果如图7所示，图7A为孵育抗Victoria谱系HA多克隆抗体，图7B为孵育抗Yamagata谱系HA多克隆抗体；表明重组乙型流感病毒可同时表达Victoria谱系乙型流感病毒B/Brisbane/60/2008的HA0和HA1蛋白，以及Yamagata谱系乙型流感病毒的HA1蛋白。
实施例7动物免疫保护实验
将6～8周龄BALB/c雌性小鼠进行随机分组，共分6组，每组16只；用7日龄鸡胚大量扩增B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT重组病毒，收获扩增病毒，并用0.1％甲醛对纯化病毒进行灭活处理；通过30％～60％蔗糖密度梯度离心，浓缩纯化B/BrisNS1145-PhuHA1+TM+CT重组病毒，制备灭活疫苗；通过SDS-PAGE和BSA标准品，定量纯化病毒中的HA1蛋白浓度；将灭活的重组病毒采用肌肉注射方式免疫小鼠，每只小鼠的免疫剂量为3μg HA1(含氢氧化铝佐剂)，且免疫3周后以相同的方式和剂量进行加强免疫；BALB/c小鼠加强免疫3后周，以2MLD50剂量B/Guangdong/2015/2012(Victoria谱系)和剂量4MLD50剂量的B/Florida/04/2008(Yamagata谱系)分别感染不同组别小鼠，每日观察并记录小鼠体重变化和死亡数，连续观察14天，体重变化曲线和生存率曲线。
B/Guangdong/0215/2012感染后，如图8所示，PBS组小鼠体重在第3天急剧下降，且在感染后第9天全部死亡；而B/Bris-NS1145-PhuHA1+TM+CT免疫组小鼠在病毒感染后体重基本维持不变，该组小鼠100％存活。
B/Florida/04/2008感染后，如图9所示，PBS组小鼠体重在感染第1天开始下降，在第8天全部死亡；而B/Bris-NS1145-PhuHA1+TM+CT免疫组小鼠在感染后体重基本维持不变，且免疫组小鼠全部存活，存活率为100％。
上述结果表明，本申请的B/Bris-NS1145-PhuHA1+TM+CT重组病毒制备的灭活疫苗免疫可为小鼠提供两种不同谱系乙型流感病毒致死剂量的攻击。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组乙型流感病毒携带一谱系乙型流感病毒的重组非结构蛋白，所述重组非结构蛋白嵌合有另一谱系乙型流感病毒的重组血凝素蛋白；
所述重组血凝素蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
所述重组非结构蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，编码所述重组血凝素蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，和/或，编码所述重组非结构蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组乙型流感病毒具有如下特征中的一个或多个：
(1)具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸；和
(2)编码如SEQ ID NO.6所示的蛋白。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述重组非结构蛋白来自Victoria谱系乙型流感病毒；所述重组血凝素蛋白来自Yamagata谱系乙型流感病毒。
5.根据权利要求4所述的重组乙型流感病毒，其特征在于，所述Victoria谱系乙型流感病毒为B/Brisbane/60/2008；和/或，所述Yamagata谱系乙型流感病毒为B/Phuket/3073/2013。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成包含编码所述重组非结构蛋白以及所述重组血凝素蛋白的基因片段；
构建携带所述基因片段的重组pM质粒；
将所述质粒与携带编码乙型流感病毒PB1、PB2、PA、NP、HA、M和NA基因的pM重组质粒共同转染细胞，拯救所述重组乙型流感病毒；和
收集所述转染的上清液，接种于鸡胚中扩增，制备所述重组乙型流感病毒。
7.分离的核酸，选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5中的一种或多种。
8.一种流感疫苗，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒。
9.根据权利要求8所述的流感疫苗，其特征在于，所述疫苗为全病毒灭活疫苗。
10.一种中和抗体，其特征在于，使用权利要求1～5任一项所述的重组乙型流感病毒制备。
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