KR20230116801A - 고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산 - Google Patents

고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산 Download PDF

Info

Publication number
KR20230116801A
KR20230116801A KR1020237018436A KR20237018436A KR20230116801A KR 20230116801 A KR20230116801 A KR 20230116801A KR 1020237018436 A KR1020237018436 A KR 1020237018436A KR 20237018436 A KR20237018436 A KR 20237018436A KR 20230116801 A KR20230116801 A KR 20230116801A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
nucleic acid
plasmid
vector
gene
Prior art date
Application number
KR1020237018436A
Other languages
English (en)
Inventor
슌스케 사이토
šœ스케 사이토
켄지 츠게
Original Assignee
가부시키가이샤 신프로젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 신프로젠 filed Critical 가부시키가이샤 신프로젠
Publication of KR20230116801A publication Critical patent/KR20230116801A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 개시는, 고초균에서 바이러스 벡터 플라스미드를 생산한다. 하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 고초균은 외부로부터 도입한 핵산으로 플라스미드를 형성하는 능력을 가질 수 있으므로, 이 방법에 있어서, 도입하는 핵산은 플라스미드가 아니어도 된다.

Description

고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산
본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시는, 또한 그렇게 생산된 바이러스 벡터 플라스미드 및 이것을 포함하는 제제를 제공한다. 본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드를 포함하는 고초균도 제공한다. 또한, 본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드로부터 생산된 바이러스 벡터를 제공한다.
유전자 치료 및 백신 요법 등을 위하여 아데노 바이러스 벡터(특허문헌 1) 등 다양한 바이러스 벡터가 개발되어 있다.
바이러스 벡터의 제조를 위해서는, 통상 프로듀서 세포에 바이러스 벡터 플라스미드를 도입할 필요가 있다. 그 때문에, 바이러스 벡터 플라스미드의 합성·구축이 필요하다. 설계된 바이러스 벡터 플라스미드는, 대장균 등에 있어서 합성·구축되는 경우가 많고, 고초균에 있어서 합성·구축된 적은 없었다.
국제 공개 제2001/090392호
본 발명자들은, 고초균에서 바이러스 벡터 플라스미드를 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 발견에 기초하여, 본 개시는, 고초균에서 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법 및 이와 같이 제작된 바이러스 벡터 플라스미드를 제공한다. 또한, 본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드를 포함하는 고초균 및 바이러스 벡터 플라스미드로부터 생산된 바이러스 벡터도 제공한다.
따라서, 본 발명은 이하를 제공한다.
(항목 A1)
바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법이며,
A) 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에 있어서 플라스미드를 형성시키는 단계와,
B) 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법.
(항목 A2)
고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법이며,
고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
(항목 A3)
고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법이며,
상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법.
(항목 A4)
상기 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계는, 컴피턴트한 상기 숙주 세포를 상기 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A5)
상기 핵산이 탠덤 리피트한 핵산 서열을 갖는 비환상 핵산인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A6)
상기 핵산 또는 플라스미드가 목적으로 하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A7)
2 내지 120개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A8)
5 내지 80개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A9)
10 내지 60개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A10)
상기 바이러스가, 알파 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 코로나 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레오 바이러스, 콕사키 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A11)
상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 또는 센다이 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A12)
상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스 또는 렌티 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A13)
상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A14)
상기 플라스미드가, 상기 바이러스의 전체 게놈 중 적어도 일부의 유전자 서열을 포함하지 않는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A15)
상기 플라스미드가,
고초균에서 플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열과,
바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열
을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A16)
상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이, 약 10kb 이상인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A17)
상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이, 상기 바이러스의 2개의 말단 반복 서열 및 그 밖의 부분을 포함하고, 상기 그 밖의 부분이, 상기 2개의 말단 반복 서열에 샌드위치된 영역의 밖에 있는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A18)
상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이
상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열과,
상기 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열과,
상기 바이러스의 2개의 말단 반복 서열과,
헬퍼 유전자
를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A19)
상기 말단 반복 서열이, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체의 어느 하나에서 유래하는 말단 역위 반복 서열(ITR)인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A20)
5'ITR 및 3'ITR의 사이에 상류로부터 프로모터, 목적으로 하는 유전자 및 터미네이터를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A21)
상기 헬퍼 유전자가, E1A, E1B, E2A, E4 및 VA 중의 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A22)
상기 헬퍼 유전자가, E2A, E4 및 VA를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A23)
상기 헬퍼 유전자의 각각이, 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A24)
상기 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열이, rep를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A25)
상기 rep가, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A26)
상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열이, cap를 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A27)
상기 cap가, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A28)
상기 플라스미드가, 상기 플라스미드 단독을 도입한 프로듀서 세포에서 바이러스 벡터의 생산을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A29)
증폭된 상기 플라스미드를 정제하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A30)
상기 숙주 세포는, 대장균, 고초균 및 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생물의 세포인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A31)
상기 숙주 세포는, 고초균의 세포인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 A32)
상기 숙주 세포는, A) 및 B)에 있어서 상이한 종 또는 동일종의 세포인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A33)
A)의 상기 숙주 세포는, 고초균의 세포인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A34)
A)의 상기 숙주 세포와 B)의 상기 숙주 세포가 다르고, A)에서 생성된 상기 플라스미드를 B)의 상기 숙주 세포에 도입하는 공정을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A35)
A)의 상기 숙주 세포가 고초균의 세포이며, B)의 상기 숙주 세포가 대장균의 세포이며, A)에서 생성된 상기 플라스미드를 B)의 상기 숙주 세포에 도입하는 공정을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A36)
상기 숙주 세포는 다르고, B)에 있어서의 숙주 세포가 고초균의 세포인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A37)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 플라스미드.
(항목 A38)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 플라스미드 함유 조성물.
(항목 A39)
포함되는 엔도톡신이 100EU/mL 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 플라스미드 함유 조성물.
(항목 A40)
플라스미드의 CCC(covalently closed circular) 순도가 80% 이상인, 상기 항목 중 어느 하나의 플라스미드 함유 조성물.
(항목 A41)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 플라스미드를 제작하는 단계와,
상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 형성시키는 단계
를 포함하는, 바이러스 벡터를 제작하는 방법.
(항목 A42)
상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하는 단계가, 단일의 상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A43)
상기 플라스미드에 포함되는 핵산의 적어도 일부가 상기 프로듀서 세포의 염색체에 도입되는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 A44)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터.
(항목 A45)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터 함유 조성물.
(항목 A46)
전체 바이러스 입자 중의 핵산을 탑재하고 있지 않은 바이러스 입자의 비율이 65% 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 바이러스 벡터 함유 조성물.
(항목 A47)
전체 바이러스 벡터 입자 중, 목적으로 하는 핵산 이외의 상기 플라스미드 유래의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자가 2% 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 조성물.
(항목 1)
고초균 내에서 증폭하는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법이며,
고초균 내에서 증폭하는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
(항목 2)
고초균 내에서 증폭하는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 증폭하는 방법이며,
상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법.
(항목 3)
바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법이며,
A) 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계와,
B) 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계
를 포함하는 방법.
(항목 4)
상기 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계는, 컴피턴트한 상기 숙주 세포를 상기 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 5)
상기 핵산이 탠덤 리피트한 핵산 서열을 갖는 비환상 핵산인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 6)
상기 핵산 또는 플라스미드가 목적으로 하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 7)
2 내지 100개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 8)
상기 바이러스가, 알파 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 코로나 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레오 바이러스, 콕사키 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 9)
상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 또는 센다이 바이러스인, 상기 항목 중 어느 하나의 플라스미드.
(항목 10)
상기 플라스미드가,
고초균에서 플라스미드 증폭을 촉진하는 핵산 서열과,
바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열
을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 11)
상기 플라스미드가, 상기 플라스미드 단독을 도입한 프로듀서 세포에서 바이러스 벡터의 생산을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 12)
증폭된 상기 플라스미드를 정제하는 단계를 더 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 13)
상기 숙주 세포는, 대장균, 고초균, 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 14)
상기 숙주 세포는, 고초균인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 15)
상기 숙주 세포는, A) 및 B)에 있어서 상이한 종 또는 동일종인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 16)
상기 숙주 세포는 다르고, B)에 있어서의 숙주 세포가 고초균인, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 17)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 플라스미드.
(항목 18)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 플라스미드 함유 조성물.
(항목 19)
포함되는 엔도톡신이 100EU/mL 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 플라스미드 함유 조성물.
(항목 20)
플라스미드의 CCC(covalently closed circular) 순도가 80% 이상인, 상기 항목 중 어느 하나의 플라스미드 함유 조성물.
(항목 21)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 플라스미드를 제작하는 단계와,
상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 형성시키는 단계
을 포함하는, 바이러스 벡터를 제작하는 방법.
(항목 22)
상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하는 단계가, 단일의 상기 플라스미드를 패키징 세포에 도입하는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 하나의 방법.
(항목 23)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터.
(항목 24)
상기 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터 함유 조성물.
(항목 25)
전체 바이러스 입자 중의 핵산을 탑재하고 있지 않은 바이러스 입자의 비율이 65% 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 바이러스 벡터 함유 조성물.
(항목 26)
전체 바이러스 벡터 입자 중, 목적으로 하는 핵산 이외의 상기 플라스미드 유래의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자가 2% 이하인, 상기 항목 중 어느 하나의 조성물.
본 발명에 있어서, 상기의 1개 또는 복수개의 특징은, 명시된 조합에 더하고, 또한 조합하여 제공될 수 있는 것이 의도된다. 본 발명의 추가의 실시 형태 및 이점은, 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽어서 이해하면, 당업자에게 인식된다.
본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하기 위한 새로운 계를 제공한다. 이 계에 기초하여 엔도톡신의 저감 등의 이익이 얻어질 수 있다.
도 1은 pAAV-CMV 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 2는 pRC2-mi342 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 3은 pHelper 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 4는 pGETS103-AV 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 5는 pGETS103-RC2 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 6은 pGETS103-AAV-RC2 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 7은 pGETS103-AAV-Helper-RC2 플라스미드의 구조를 나타낸다(올인원 구조).
도 8은 pGETS103-AAV 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 9는 pGETS103-Helper 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 10은 pGETS103-AAV-Helper-RC2 플라스미드를 22개의 단편으로부터 OGAB법에 의해 구축하는 개략을 나타낸다. 점선 박스는, AarI 절단에 의해 제거되는 부분을 나타낸다(대문자는 링커 유래 서열을 나타내고, 소문자는 벡터 유래 서열을 나타냄). 제1, 제3 및 제16의 단편은 화학 합성 및 MAP법에 의해 취득하였다. 그 밖의 단편은, PCR에 의해 취득하였다.
도 11은 OGAB법에 의해 구축한 pGETS103-AAV-Helper-RC2 플라스미드의 전기 영동 결과를 나타낸다.
도 12는 플라스미드 pGETS118-AarI의 구조 및 핵산 도입 개소를 나타낸다. 점선 박스 부분은, AarI 절단에 의해 제거되는 부분을 나타낸다.
도 13은 pGETS118-AarI에 도입한 AAV 벡터를 생산하기 위한 추가 7종의 올인원 구조를 나타낸다. 각 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용한 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 14는 추가의 벡터 플라스미드(2 내지 8)를 사용한 경우에 있어서도 pGETS103-AAV-Helper-RC2 플라스미드(1)와 마찬가지로 바이러스 벡터가 생산되는 것을 나타낸다.
도 15는 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위한 올인원 구조를 나타낸다. 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용한 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다. GOI는 목적으로 하는 유전자를 나타낸다.
도 16은 플라스미드 pBET131-AarI의 구조 및 핵산 도입 개소를 나타낸다. 점선 박스 부분은, AarI 절단에 의해 제거되는 부분을 나타낸다.
도 17은 pGETS103-ΔAarI에 기초하는 AAV1의 Rep 및 AAV6의 Cap를 사용한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 18은 pGETS103-ΔAarI에 기초하는 CAG 프로모터, AAV5의 Rep 및 AAV1의 Cap를 사용한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 19는 pGETS103-ΔAarI에 기초하는 EF1α 프로모터, AAV8의 Rep 및 AAV9의 Cap를 사용한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 20은 pGETS103-ΔAarI에 기초하는 Rep, Cap 및 Helper를 상이한 순서로 배치한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. SV40 프로모터를 사용한 예이기도 하다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 21은 pBETS131-AarI에 기초하는 Rep, Cap 및 Helper를 상이한 순서로 배치한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 22는 pBETS103-ΔAarI에 기초하는 Helper 유전자의 요소를 변경한 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 올인원 구조의 아래에 나타내는 백색의 사각은, 구축에 사용하는 단위 DNA의 수 및 대략의 대응 영역을 나타낸다.
도 23은 pGETS103-ΔAarI에 기초하는 AAV1의 Rep 및 AAV6의 Cap를 사용한 코로나 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조를 나타낸다. 구조 단백질 영역에 목적으로 하는 유전자(GOI)을 프로모터와 함께 위치 부여한 예이다.
이하, 본 개시를 최선의 형태를 나타내면서 설명한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐, 단수형의 표현은, 특별히 언급하지 않는 한, 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 단수형의 관사(예를 들어 영어의 경우에는 "a", "an", "the" 등)는 특별히 언급하지 않는 한, 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 분야에서 통상 사용되는 의미로 사용되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는, 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 모순될 경우, 본 명세서(정의를 포함하여)가 우선한다.
이하에 본 명세서에 있어서 특히 사용되는 용어의 정의 및/또는 기본적 기술 내용을 적절히 설명한다.
본 명세서에 있어서 "고초균"이란, 토양이나 식물에 보편적으로 존재하고, 반추 동물이나 인간의 위장관에 존재하는, 호기성의 그람 양성 카탈라아제 양성의 세균이며, 0.7 내지 0.8×2 내지 3㎛의 크기이며, 중온성으로, 최적 생육 온도는 25 내지 40℃이고, 아포를 형성하는 것으로 여겨지고, 학명 Bacillus subtilis 또는 이것과 근연인 Bacillus속 세균인 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus 등을 포함하는, 병원성을 갖지 않으며, 자연 형질 전환능을 갖는 임의의 세균을 가리킨다. 바람직한 실시 형태에서는, 고초균은, Bacillus subtilis 중에서 높은 자연 형질 전환능을 갖는 주인 Marburg 168주 또는 그 파생주인 RM125주이다. 168주는, 유전적으로 가장 연구된 그람 양성균이며, 그 자체는 인축 무해라는 것, OGAB법이 적응 가능하다는 것이 알려져 있는 것 등으로부터도, 본 개시에 있어서 적합하게 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "고초균 내에서 복제되는 서열"이란, "고초균 내에서 증폭되는 서열"과 동일한 의미로 사용되고, 고초균에 도입되는 상태에 있는 경우에, 복제되는(또는 증폭되는) 핵산 서열을 의미한다. 여기에서는, 이 문맥에 있어서, 증폭은 복제와 동일한 의미로 사용된다. 고초균에 있어서의 핵산(플라스미드)의 복제 기구로서는 롤링 써클형, 세타형(theta type), oriC, 파지에 의한 것 등을 들 수 있고, 고초균 내에서 복제되는 서열로서 어느 기구를 이용하는 것이어도 사용할 수 있다. 롤링 써클형의 복제 기구는, 이중쇄 DNA의 편측의 단일쇄 복제를 행한 후, 다른 한쪽의 쇄의 복제를 행하는 기구이며, 핵산이 단일쇄 DNA로서 존재하는 시간이 길기 때문에 플라스미드가 불안정화가 되는 경향이 있다. 세타형의 복제 기구는, 세균 염색체의 복제의 경우와 동일하게 복제 기점으로부터 2 방향으로 동시에 이중쇄 DNA(플라스미드)의 복제가 개시되는 기구이며, 본 개시와 같이 긴 DNA(예를 들어 10kb이상)의 복제 시에는 바람직하게 사용될 수 있다(Janniere,　L.,　A.　Gruss,　and　S.　D.　Ehrlich.　1993.　Plasmids,　p.　625-644.　InA.　L.　Sonenshein,　J.　A.　Hoch,　and　R.　Losick　(ed.),　Bacillus　subtilis　and　othergram-positive　bacteria:　biochemistry,　physiology　and　molecular　genetics.American　Society　for　Microbiology,　Washington,　D.C.). oriC의 복제 기구는, 숙주 세균(예를 들어 고초균) 염색체의 복제의 경우와 동일하게 작동한다. 고초균 내에서 복제되는 서열로서는, 롤링 써클형, 세타형, oriC, 파지 등에 의한 복제 기구를 작동시키는 것이 공지된, 플라스미드 또는 그 부분 또는 복제 기점 또는 그것들의 개변체 등을 들 수 있다. 롤링 써클형 플라스미드로서, pUB110, pC194, pE194, pT181 등이 공지되어 있고, 세타형 플라스미드로서, pAMβ1, pTB19, pLS32, pLS20 등이 공지되어 있다. 고초균 내에서 복제되는 서열은, 공지된 복제 개시점과 동일하거나 또는 유사한 서열(예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성)을 가질 수 있다. 예를 들어 후보 DNA 단편과, 약제 내성 유전자 등의 고초균에서 유효한 선택 마커 유전자를 연결한 DNA 단편을 고초균에 도입한 후, (약제 등을 첨가하여) 배양한 후에, 이것이 염색체 외에서 복제될 경우, 이 후보 DNA 단편은 고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는 것으로 판정할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "플라스미드"란, 세포 중에서 염색체와는 별개로 존재하거나 또는 세포에 도입한 경우에 염색체와는 별개로 존재하는 환상 DNA를 가리킨다.
본 명세서에 있어서 "플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열"이란, "플라스미드 증폭을 촉진하는 핵산 서열"과 같은 의미로 사용되고, 숙주 세포(예를 들어 고초균)에 도입되었을 때에, 숙주 세포 내에 존재하는 플라스미드의 복제(이 문맥에 있어서는, 증폭과 동일하다.)를 촉진하는 임의의 핵산 서열을 말한다. 바람직하게는, 이 플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열은, 대상이 되는 플라스미드를 코드하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결되어 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열, 대상이 되는 플라스미드, 그것들의 관계 등의 상세는, 본 명세서의 다른 개소에 기재된다. 플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열로서는, 대상이 되는 숙주 세포(예를 들어 고초균)에 있어서 작동하는 복제 기점을 포함하는 핵산 서열 등을 들 수 있다. 플라스미드 증폭을 촉진하는 핵산 서열은, 복제 개시점을 갖는 DNA 단편이며, 염색체 DNA와는 독립적으로 복제 가능한 DNA 단편을 가리킨다. 이들의 DNA 단편이 복제 가능한지 여부는, 이들의 DNA 단편에 약제 내성 유전자 등의 선택 마커 유전자를 연결하고, 약제 등의 선택 조건에서 배양한 후, 플라스미드 DNA를 정제하고, 전기 영동에 의해 그 DNA의 밴드를 관찰하는 등의 방법에 의해 확인할 수 있다. 플라스미드는, 복제 개시점 외에, 복제 개시점에 숙주의 DNA 복제 효소를 유도하는 rep 단백질의 유전자나, 플라스미드의 딸세포로의 분배를 확실하게 행하기 위한 분배 기구 유전자, 선택 마커 유전자 등을 포함해도 된다. rep 단백질의 유전자 내에 복제 개시점이 융합되어 있어도 된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "패키징 세포"란, 벡터 플라스미드를 생산하기 위한 세포를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "벡터 플라스미드" 또는 "바이러스 벡터 플라스미드"란, 바이러스 벡터에 탑재하는 유전자를 포함하는, 프로듀서 세포에 있어서 바이러스 벡터를 생산하기 위한 플라스미드를 가리킨다. 하나의 실시 형태에서는, 벡터 플라스미드는, 2개의 말단 반복 서열 사이에 바이러스 벡터의 표적 세포 내에서 발현시키는 유전자(목적으로 하는 유전자)의 서열을 포함하고, 그 밖에 프로모터를 포함하고, 또 다른 요소(예를 들어 인핸서, 터미네이터 등)를 포함해도 된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "프로듀서 세포"란, 목적으로 하는 바이러스 벡터를 생산할 수 있는 세포를 의미하고, 바이러스 벡터의 생산에 필요한 유전자가, 염색체 및 도입한 플라스미드로부터 발현되는 세포일 수 있다. 프로듀서 세포에 본 개시의 벡터 플라스미드를 도입함으로써 목적으로 하는 바이러스 벡터가 생산될 수 있다. 예를 들어 AAV 바이러스 벡터의 경우, 그 생산에 E1A와 E1B가 필요하지만, HEK293은 이것들을 갖기 때문에, 이것들을 헬퍼 플라스미드로부터 제거할 수 있다. 다른 세포에서도, 이러한 헬퍼 인자를 갖도록 개변하면, 프로듀서 세포로서 기능한다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "바이러스 벡터"란, 바이러스에서 유래하는 구조를 적어도 부분적으로 갖고, 표적 세포에 핵산을 도입할 수 있는 구축물을 가리킨다. 전형적으로는, 바이러스 벡터는, 바이러스의 캡시드 및 이종 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자의 형태이다. 본 명세서에서 사용하는 경우, "기원 바이러스"란, 바이러스 벡터가 갖는 바이러스 유래 구조를 천연적으로 갖는 바이러스를 가리킨다. 바이러스 벡터에 있어서, 캡시드에 포함되는 핵산(탑재 핵산)은 2개의 말단 반복 서열 사이에 바이러스 벡터의 표적 세포 내에서 발현시키는 유전자(목적으로 하는 유전자) 서열을 포함하고, 그 밖에, 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함해도 되고, 기원 바이러스에서 유래하는 유전자를 포함해도 된다.
본 명세서에 있어서, "바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열"이란, 이것을 포함하는 프로듀서 세포가 바이러스 벡터를 생산할 수 있는 핵산 서열(예를 들어 핵산 서열의 조합)을 가리킨다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열과, 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열과, 바이러스의 2개의 말단 반복 서열과, 헬퍼 유전자의 핵산 서열을 포함한다. "헬퍼 유전자의 핵산 서열"이란, 예를 들어 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열, 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열 및 바이러스의 2개의 말단 반복 서열 이외의 임의의 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함할 수 있거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다. 이것들 각각의 핵산 서열은, 바이러스 벡터마다 다를 수 있다. 이것들의 상세는, 본 명세서의 다른 개소에 기재된다. 바람직한 실시 형태에서는, 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, AAV 및 아데노 바이러스에 공통되는 유리한 서열이 이용되고, 보다 바람직하게는 AAV에 유리한 서열이 이용될 수 있다. 이러한 AAV 및 아데노 바이러스에 공통되는 유리한 서열은, 말단 역위 반복 서열(ITR) 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함하고, 헬퍼 유전자, rep, cap 또는 L1, L2, L3, L4, L5를 포함해도 된다는 특징을 가지며, AAV에 유리한 서열은, ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함하고, 헬퍼 유전자, rep, cap를 포함해도 된다. 헬퍼 유전자, rep, cap의 배치는 2개의 ITR의 외측이어도 된다는 특징을 갖는다. 예를 들어 이러한 예로서는, 특정한 헬퍼 유전자 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4의 서열을 들 수 있지만 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질"이란, 바이러스의 게놈을 캡시드에 내포시키는 단백질, 전사하는 단백질, 바이러스의 게놈을 복제하는 단백질, 그 양쪽의 기능을 갖는 단백질을 포함하고, E1A, E1B, E2A, E2B, E4, rep, pol, Ψ, APP, MAAP 및 rev 등을 들 수 있다. 한정을 의도하지 않지만, 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질은 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 또는 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12, 또는 그 개변체(rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80 등)의 어느 것에서 유래하는 것이 이용될 수 있다. 이 단백질은, 천연의 것이어도, 인공적으로 변이를 도입한 것이어도 된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "캡시드"는, 바이러스 또는 바이러스 벡터의 표면에 존재하는(필요에 따라 엔벨로프에 봉입되어 있는) 바이러스가 갖는 유전자로부터 생산되는 단백질을 가리키고, "캡시드 단백질" 이라고도 한다. 캡시드는 세포에 대한 감염성을 담당할 수 있다. 캡시드 단백질에는, L2, L3, cap, VSV-G 및 gag를 들 수 있지만 이것들로 한정되지 않는다. 한정을 의도하지 않지만, 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열은, 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 또는 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12, 또는 그 개변체(rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80 등)의 어느 것에서 유래하는 것이 이용될 수 있다. 캡시드는, 천연의 것이어도, 인공적으로 변이를 도입한 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서 "반복 서열" 또는 "탠덤 리피트(tandem repeat)"(한 핵산 서열)이란, 생물 게놈의 핵산 서열로, 동일한 서열이 반복하여(특히 수 회 이상) 보여지는 것의 총칭이다. 당해 분야에서 사용되는 임의의 반복 서열을 본 개시에 있어서 사용할 수 있다. 전형적으로는, 프로모터 서열이 반복하여 출현한다.
본 명세서에 있어서 "말단 반복 서열"은, 생물 게놈의 핵산 서열로, 동일한 서열이 반복하여(특히 수 회 이상) 보여지는 것 중, 말단에 존재하는 것의 총칭이다. 말단 반복 서열로서는, 말단 역위 반복 서열(ITR) 또는 장쇄 말단 반복 서열(LTR) 등을 들 수 있지만 이것들로 한정되지 않는다. 말단 반복 서열은, 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 또는 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12, 또는 그 개변체(rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80 등)의 어느 것에서 유래하는 것이 이용될 수 있다. 말단 반복 서열로서는, 천연의 것이어도, 인공적으로 변이를 도입한 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서 "헬퍼 유전자"란, 단독으로는 증식할 수 없는 바이러스의 증폭을 지원하는 유전자를 말한다. 본 개시에 있어서, 헬퍼 유전자에는, 예를 들어 그 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열, 그 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및/또는 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열, 그리고 그 바이러스의 2개의 말단 반복 서열 이외의 임의의 바이러스 벡터를 구성, 증식, 활성 향상, 독성 저감하는데 필요한 핵산 서열을 들 수 있지만 이것들로 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 헬퍼 유전자로서는, 예를 들어 E1A, E1B, E2A, E2B, E4, RPE, WRPE, PPT, oPRE, 인핸서, 인슐레이터, 사일런서 서열 등을 들 수 있지만 이것들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "단위 핵산"이란, 집적 핵산의 서열을 구성하는 일부의 서열을 갖는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분을 가리키고, 본 명세서의 다른 개소에 있어서 상세하게 설명되는 바와 같이, 복수 종류의 단위 핵산이 단위 벡터로서 제조되고, 그 후 집적 핵산이 구축된다. 본 개시의 단위 핵산은, DNA이어도, RNA이어도, 그 개변체이어도, 이들의 혼합물이어도 된다. 본 개시의 단위 핵산 또는 그것을 포함하는 조성물의 제조 방법은, 부가 서열이 연결된 복수의 단위 핵산을 해당 단위 핵산의 종류마다 포함하는 용액을 준비하는 공정과, 각각의 용액의 준비 후, 단위 핵산에 부가 서열이 연결된 상태에서, 각각의 용액 중의 단위 핵산의 농도를 측정하고, 그 결과에 기초하여 각각의 용액을 분취하고, 각각의 용액 중의 단위 핵산의 몰수를 서로 동일하게 근접시키는 공정을 갖는다. 본 명세서에 있어서, 단위 핵산"의 종류는, 각각의 염기 서열마다 구별한다. 또한, "단위 핵산"에는, 제한 효소 인식 부위를 부가한 것과, 부가하고 있지 않은 것을 모두 포함하는 것으로 한다. 단위 핵산의 각각의 길이는, 특별히 한정되지 않지만, 단위 핵산의 염기 서열을 확인할 때에 염기 서열 결정의 횟수가 적은 쪽이, 시간적, 금전적 비용을 삭감할 수 있게 되어 바람직하다. 그 때문에, 단위 핵산의 각각의 길이는, 짧은 쪽이 바람직하고, 구체적으로는 1600bp 이하인 것이 바람직하고, 1200bp 이하인 것이 더욱 바람직하다. 특히, 생어법을 사용한 자동 형광 시퀀서에 의해 염기 서열 결정을 할 경우, 1회의 염기 서열 결정으로 연속 800 염기 정도의 길이의 염기 서열을 확인하는 것이 가능하므로, 단위 핵산의 각각의 길이는, 800bp 이하(구체적으로는, 600bp 이하, 500bp 이하, 400bp 이하, 200bp 이하, 100bp 이하 등)인 것이 가장 바람직하다. 이와 같이, 단위 핵산의 각각의 길이가 짧으면, 이것을 후술하는 DNA 연결체의 제작에 사용하는 경우, 다수의 단위 핵산을 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법으로 제조한 단위 핵산을 사용하면, 후술하는 바와 같이, 다수의 단위 핵산의 연결이 가능하다. 또한, 단위 핵산의 각각의 길이가 너무 짧으면, 단위 핵산수가 많아져 작업 효율이 떨어진다. 그 때문에, 단위 핵산의 각각의 길이는, 20bp 이상인 것이 바람직하고, 30bp 이상인 것이 보다 바람직하고, 50bp 이상인 것이 더욱 바람직하다. 벡터 DNA 및 각각의 단위 핵산은, 서로 순서를 유지한 채 반복 연결할 수 있는 구조를 갖는다. 본 명세서에 있어서, "서로 그 순서를 유지한 채 연결하는"이란, 집적 핵산 유닛 상에서 인접하는 서열을 갖는 단위 핵산 또는 벡터 DNA가 그 순서 및 방향을 유지하여 결합하는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서 "엔도톡신"이란, 내독소라고도 하며, 고초균 등의 그람 양성 세균의 세포벽 성분이며 적극적으로는 분비되지 않는 독소를 가리킨다. Pierce LAL Endotoxin Quantitation Kit(Thermo Fisher Scientific, 미국) 등의 키트를 사용하여 정량할 수도 있다. "엔도톡신"은, 그람 음성균에만 존재하고, 그람 양성균에는 존재하지 않는다. "엔도톡신"은, 리포폴리사카라이드(LPS)라고도 하며, 이것은, 그람 음성균의 외막에 존재하고, O 항원-코어 다당-리피드 A의 구조를 가지며, 이 중에서 생리 활성이 있는 것은 리피드 A이다. 그람 양성균에는, 외막은 존재하지 않기 때문에, 리피드 A도 존재하지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "탑재(loaded) 핵산"이란, 바이러스 벡터에 담지되어 있는 핵산을 의미한다. 탑재 핵산인지의 여부는, 바이러스 벡터 제조물을 DNase 처리하여 캡시드 외의 핵산을 분해한 후, DNase를 불활성화하고, 그 후 캡시드로부터 추출한 핵산을 확인함으로써 확인할 수 있다. 탑재 핵산인지의 여부는, 얻어진 핵산 생성물의 서열(바람직하게는 전체 길이 또는 전체 길이와 가까운 길이의 것)을 조사함으로써 확인할 수도 있다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "숙주 세포"란, 외래성의 핵산 또는 단백질 또는 바이러스 또는 바이러스 벡터가 도입된 세포(그러한 세포의 자손을 포함함)를 가리킨다.
본 명세서에 있어서 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 동일한 의미로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산 폴리머를 말한다. 이 폴리머는, 직쇄이어도 분지되어 있어도 되고 환상이어도 된다. 아미노산은, 천연의 것이어도 비천연의 것이어도 되며, 개변된 아미노산이어도 된다. 이 용어는 또한, 천연 또는 인공적으로 개변된 폴리머도 포함한다. 그러한 개변으로서는, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 개변(예를 들어 표지 성분과의 결합체화)이 포함된다.
본 명세서에 있어서 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 동일한 의미로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드 폴리머를 말한다. 핵산의 예로서 DNA, RNA, cDNA, mRNA, rRNA, tRNA, 마이크로 RNA(miRNA), lncRNA를 들 수 있다. 이 용어는 또한, "폴리뉴클레오티드 유도체"를 포함한다. "폴리뉴클레오티드 유도체"란, 뉴클레오티드 유도체를 포함하거나 또는 뉴클레오티드간 결합이 통상과는 다른 폴리뉴클레오티드를 말한다. "뉴클레오티드 유도체"란, 천연의 DNA 또는 RNA에 있어서 사용되는 통상의 뉴클레오티드와는 다른 구조를 갖는 뉴클레오티드를 말하고, 예를 들어 잠금 핵산(LNA), 2'-0,4'-C-에틸렌 가교 핵산(2'-0,4'-C-ethylene bridged nucleic acid, ENA) 등의 에틸렌 핵산, 그 밖의 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA), 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid, HNA), 아미드 가교 핵산(Amido-bridged nucleic acid, AmNA), 모르폴리노 핵산, 트리시클로-DNA(tcDNA), 폴리에테르 핵산(예를 들어 미국 특허 제5,908,845호 참조), 시클로헥센 핵산(CeNA) 등을 들 수 있다. 뉴클레오티드간 결합이 통상과는 다른 예로서, 예를 들어 인산 디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드간 결합, 인산 디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포로아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드간 결합, 리보오스와 인산 디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드간 결합 등을 들 수 있다.
달리 그렇지 않다고 표시되지 않으면, 특정한 핵산 서열은 또한, 명시적으로 나타내어진 서열과 마찬가지로, 그 보존적으로 개변된 개변체(예를 들어 축중 코돈 치환체) 및 상보 서열을 포함하는 것이 의도된다. 구체적으로는, 축중 코돈 치환체는, 1 또는 그 이상의 선택된(또는, 모든) 코돈의 3번째의 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 제작함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 및 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 등 구체적인 야생형 서열에 기초하는 개변체에는, 공지된 개변체(예를 들어 rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80 등) 이외에도, 기본이 되는 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산도 포함된다.
본 명세서에 있어서 "유전자"란, 일정한 생물학적 기능을 하는 핵산 부분을 가리킨다. 이 생물학적 기능으로서, 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 것, 단백질 비코드 기능성 RNA(rRNA, tRNA, 마이크로 RNA(miRNA), lncRNA 등)를 코드하는 것, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 비코드 기능성 RNA의 생산을 제어하는 것, 특정한 단백질에 특이적으로 결합되는 것, 핵산의 절단 또는 복제를 제어하는 것을 들 수 있다. 그 때문에, 본 명세서에 있어서의 유전자에는, 단백질 또는 단백질 비코드 기능성 RNA를 코드하는 핵산 부분 이외에도, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 인슐레이터, 사일런서, 복제 기점, 내부 리보솜 침입 부위 등의 전사 번역 조절 서열 및 바이러스 입자에 대한 패키징에 필요한 핵산 부분이 포함된다. 본 명세서에 있어서 "유전자 산물"이란, 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 비코드 기능성 RNA를 가리킬 수 있다.
본 명세서에 있어서 2개의 유전자가 시스라는 것은, 동일한 핵산 분자 또는 상보쇄(이중쇄 핵산의 경우)의 핵산 분자 상에 그것들의 유전자가 존재하는 것을 가리킨다. 또한, 본 명세서에 있어서 2개의 유전자가 트랜스라는 것은, (어떤 생물에 있어서의) 어떤 세포에 있어서, 이들의 유전자가, 동일한 핵산 분자 또는 상보쇄(이중쇄 핵산의 경우)의 핵산 분자 상에 존재하지 않는 것을 가리킨다. 예를 들어 게놈 상에 존재하는 유전자와, 바이러스 벡터에서 도입된 핵산 상의 유전자는 트랜스일 수 있다. 필요에 따라, 2개의 유전자가 트랜스인지의 여부는 2개의 유전자가 세포에 동시에 존재하게 된(예를 들어 세포에 대한 핵산의 도입) 시점에 있어서의 상태에서 판단될 수 있다.
본 명세서에 있어서 유전자의 수에 대하여 언급하는 경우, 1개의 유전자는, 어떤 생물의 게놈 상에 통상(가장 높은 빈도 또는 50% 이상의 확률) 존재하는 형태에 있어서 연속 서열을 갖는 유전자를 가리킨다. 예를 들어 어떤 단백질을 코드하는 2개의 엑손은 2개의 유전자일 수 있다. 예를 들어 프로모터 서열과 단백질을 코드하는 서열이 연속 서열을 형성하고 있는 경우, 프로모터 서열 및 단백질을 코드하는 서열을 포함하는 핵산 부분은, 1개의 유전자일 수 있다. 예를 들어 절단됨으로써 기능적이 되는 단백질이 게놈 상에서 연속 서열에 의해 코드되는 경우, 이 단백질은, 1개의 유전자로 코드될 수 있다. 기능의 측면에서 유전자를 언급하는 경우, 핵산 서열은 연속 서열일 필요는 없고, 예를 들어 어느 단백질을 코드하는 복수의 엑손은 집합적으로 그 단백질의 유전자로서 언급된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 유전자를 "결손한다"란, 핵산이 그 유전자를 포함하지 않거나, 또는 그 유전자가 정상적인 기능(예를 들어 기능적인 단백질을 생산하는 기능)을 발휘하지 않도록 개변된 유전자를 포함하는 것을 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "작동 가능하게 연결된(되는)"이란, 목적으로 하는 서열의 발현(작동)이 어느 전사 번역 조절 서열(예를 들어 프로모터, 인핸서 등) 또는 번역 조절 서열의 제어 하에 배치되는 것을 말한다. 프로모터가 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서는, 통상 그 유전자의 바로 상류에 프로모터가 배치되지만, 반드시 인접하여 배치될 필요는 없다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "전사 번역 조절 서열"은, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 인핸서, IRES 등을 총칭하고, 그것들이 협동하고, 레시피언트 세포에서 코드 서열의 복제, 전사 및 번역을 가능하게 한다. 선택되는 코드 서열의 복제, 전사 및 번역이 적당한 숙주 세포에 있어서 가능한 한, 이들의 전사 번역 조절 서열의 모두가 반드시 존재할 필요가 있는 것은 아니다. 당업자는, 공개 정보로부터 조절 핵산 서열을 용이하게 동정할 수 있다. 또한, 당업자는, 예를 들어 in vivo, ex vivo 또는 in vitro에서, 사용 목적에 적용할 수 있는 전사 번역 조절 서열을 동정할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "프로모터"는, 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 제어하는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다. 프로모터는, RNA 폴리메라아제에 의한 인식, 결합 및 전사 개시를 위하여 충분한 특정한 서열을 포함한다. 프로모터는, RNA 폴리메라아제의 인식, 결합 또는 전사 개시를 조절하는 서열을 포함해도 된다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "인핸서"는, 목적 유전자의 발현 효율을 높이는 기능을 갖는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "사일런서"는, 인핸서와는 반대로 목적 유전자의 발현 효율을 저하시키는 기능을 갖는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "인슐레이터"는, DNA의 서열상의 이격된 위치에 있는 유전자의 발현 조절을 행하는 시스 조절의 기능을 갖는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "터미네이터"는, 단백질을 코드하는 영역의 하류에 위치하고, 핵산이 mRNA에 전사될 때의 전사 종결에 관여하는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "복제 기점"은, 그 핵산 서열을 인식하는 단백질(예를 들어 이니시에이터 DnaA 단백질 등)이 결합하는 것이나, RNA가 합성됨으로서 부분적으로 DNA 이중 나선이 풀려, 복제가 개시되는 핵산 서열의 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 내부 리보솜 침입 부위("IRES")는 그 하류의 핵산 서열의 번역 시, 리보솜의 침입 또는 유지를 촉진하는 핵산 세그먼트를 가리킨다.
본 명세서에 있어서 핵산의 "상동성"이란, 2 이상의 핵산 서열의, 서로에 대한 동일성의 정도를 말하고, 일반적으로 "상동성"을 갖는다라는 것은, 동일성 또는 유사성의 정도가 높은 것을 말한다. 따라서, 어느 2개의 핵산의 상동성이 높을수록, 그것들의 서열의 동일성 또는 유사성은 높다. "유사성"은, 동일성에 더하여 유사한 염기에 대해서도 계산에 넣은 수치이며, 여기에서 유사한 염기란, 혼합 염기(예를 들어 R=A+G, M=A+C, W=A+T, S=C+G, Y=C+T, K=G+T, H=A+T+C, B=G+T+C, D=G+A+T, V=A+C+G, N=A+C+G+T)에 있어서, 일부가 일치하는 경우를 말한다. 2종류의 핵산이 상동성을 갖는지의 여부는, 서열의 직접의 비교, 또는 엄격한 조건 하에서의 하이브리다이제이션법에 의해 조사될 수 있다. 2개의 핵산 서열을 직접 비교하는 경우, 그 핵산 서열간에서, 대표적으로는 적어도 50% 동일한 경우, 바람직하게는 적어도 70% 동일한 경우, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경우, 그것들의 유전자는 상동성을 갖는다. 아미노산은, 그 일반적으로 공지된 3문자 기호나 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장되는 1문자 기호 중 어느 것에 의해, 본 명세서 중에서 언급될 수 있다. 뉴클레오티드도 마찬가지로, 일반적으로 인지된 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다. 본 명세서에서는, 아미노산 서열 및 염기 서열의 유사성, 동일성 및 상동성의 비교는, 서열 분석용 툴인 BLAST를 사용하여 디폴트 파라미터를 사용하여 산출된다. 동일성의 검색은 예를 들어 NCBI의 BLAST 2.10.1+(2020.6.18 발행)을 사용하여 행할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 동일성의 값은 통상적으로는 상기 BLAST를 사용하고, 디폴트의 조건에서 얼라인했을 때의 값을 말한다. 단, 파라미터의 변경에 의해, 더 높은 값이 나올 경우에는, 가장 높은 값을 동일성의 값으로 한다. 복수의 영역에서 동일성이 평가될 경우에는 그 중 가장 높은 값을 동일성의 값으로 한다. 유사성은, 동일성에 더하여 유사한 아미노산에 대해서도 계산에 넣은 수치이다.
본 명세서에 있어서, 특별히 언급하지 않는 한, 어느 생물학적 물질(예를 들어 단백질, 핵산, 유전자)에 관한 언급은, 그 생물학적 물질의 생물학적 기능과 유사한 기능(동일한 정도가 아니어도 됨)을 발휘하는 그 생물학적 물질의 변이체(예를 들어 아미노산 서열에 수식을 갖는 변이체)에 관한 언급이기도 한 것이 이해된다. 이러한 변이체에는, 원래의 분자의 프래그먼트, 동일 사이즈의 원래의 생물학적 물질의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 걸쳐 또는 당해 분야에서 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 얼라인먼트를 행하여 얼라인되는 원래의 분자의 서열과 비교했을 때, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 분자가 포함될 수 있다. 변이체에는, 개변된 아미노산(예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화 또는 인산화에 의한 개변) 또는 개변된 뉴클레오티드(예를 들어 메틸화에 의한 개변)을 갖는 분자가 포함될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "엄격한 조건"이란, 당해 분야에서 관용되는 주지의 조건을 말한다. 엄격한 조건은, 예를 들어 이하의 조건을 채용할 수 있다. (1) 세정을 위하여 저이온 강도 및 고온도를 사용한다(예를 들어 50℃에서, 0.015M의 염화 나트륨/0.0015M의 시트르산 나트륨/0.1%의 도데실 황산 나트륨), (2) 하이브리다이제이션 중에 포름아미드 등의 변성제를 사용한다(예를 들어 42℃에서, 50% (v/v)포름아미드와 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1%의 폴리비닐피롤리돈/50mM의 pH6.5의 인산 나트륨 버퍼 및 750mM의 염화 나트륨, 75mM 시트르산 나트륨) 또는 (3) 20% 포름아미드, 5×SSC, 50mM 인산 나트륨(pH7.6), 5×덴하르트액, 10% 황산 덱스트란 및 20mg/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서, 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 다음으로 약 37-50℃에서 1×SSC로 필터를 세정한다. 또한, 포름아미드 농도는 50% 또는 그것 이상이어도 된다. 세정 시간은, 5, 15, 30, 60, 또는 120분, 또는 그것들 이상이어도 된다. 하이브리다이제이션 반응의 엄격함에 영향을 미치는 요소로서는 온도, 염 농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 상세하게는 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)를 참조할 수 있다. "고도로 엄격한 조건"의 예는, 0.0015M 염화 나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨, 65 내지 68℃ 또는 0.015M 염화 나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨 및 50% 포름아미드, 42℃이다. 하이브리다이제이션, Molecular　Cloning　2nd　ed.,Current　Protocols　in　Molecular　Biology,　Supplement　1-38,　DNA　Cloning　1:Core　Techniques,　A　Practical　Approach,　Second　Edition,　Oxford　University　Press(1995) 등의 실험서에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 여기서, 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열에서는, 바람직하게는 A 서열만 또는 T 서열만을 포함하는 서열이 제외된다. 중간 정도의 엄격한 조건은, 예를 들어 DNA의 길이에 기초하여, 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있고, Sambrook들, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 제3번, Vol.1, 7.42-7.45 Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press，2001에 개시되고, 그리고 니트로셀룰로오스 필터에 관하여, 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH8.0)의 전세정 용액, 약 40-50℃에서의, 약 50% 포름아미드, 2×SSC-6×SSC(또는 약 42℃에서의 약 50% 포름아미드 중의, 스타크 용액(Stark's solution) 등의 다른 유사한 하이브리다이제이션 용액)의 하이브리다이제이션 조건 및 약 60℃, 0.5×SSC, 0.1% SDS의 세정 조건의 사용이 포함된다. 따라서, 본 개시에 있어서 사용되는 폴리펩티드에는, 본 개시에서 특별히 기재된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자에 대하여 고도 또는 중간 정도로 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자에 의해 코드되는 폴리펩티드도 포함된다.
본 명세서에 있어서 "대응하는" 아미노산 또는 핵산이란, 어느 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자에 있어서, 비교의 기준이 되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 있어서의 소정의 아미노산 또는 뉴클레오티드와 마찬가지의 작용을 갖거나, 또는 갖는 것이 예측되는 아미노산 또는 뉴클레오티드를 말하고, 특히 효소 분자에 있어서는, 활성 부위 중의 유사한 위치에 존재하고, 촉매 활성에 유사한 기여를 하는 아미노산을 말한다. 예를 들어 안티센스 분자라면, 그 안티센스 분자의 특정한 부분에 대응하는 오르토로그에 있어서의 유사한 부분일 수 있다. 대응하는 아미노산은, 예를 들어 시스테인화, 글루타티온화, S-S 결합 형성, 산화(예를 들어 메티오닌 측쇄의 산화), 포르밀화, 아세틸화, 인산화, 당쇄 부가, 미리스틸화 등이 되는 특정한 아미노산일 수 있다. 또는, 대응하는 아미노산은, 2량체화를 담당하는 아미노산일 수 있다. 이러한 "대응하는" 아미노산 또는 핵산은, 일정 범위에 걸치는 영역 또는 도메인이어도 된다. 따라서, 그러한 경우, 본 명세서에 있어서 "대응하는" 영역 또는 도메인이라고 한다.
본 명세서에 있어서 "대응하는" 유전자(예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열 또는 분자)란, 어느 종에 있어서, 비교의 기준이 되는 종에 있어서의 소정의 유전자와 유사한 작용을 갖거나, 또는 갖는 것이 예측되는 유전자(예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열 또는 분자)를 말하고, 그러한 작용을 갖는 유전자가 복수개 존재하는 경우, 진화학적으로 동일한 기원을 갖는 것을 말한다. 따라서, 어느 유전자에 대응하는 유전자는, 그 유전자의 오르토로그일 수 있다. 예를 들어 혈청형 1의 AAV의 cap는 혈청형 2의 AAV의 cap에 대응할 수 있다. 예를 들어 어느 바이러스에 있어서의 대응하는 유전자는, 대응하는 유전자의 기준이 되는 바이러스의 유전자 서열을 쿼리 서열로서 사용하여 그 바이러스의 서열 데이터베이스를 검색함으로써 발견할 수 있다.
본 발명에 따라, 용어 "활성"은, 본 명세서에 있어서, 가장 넓은 의미에서의 분자의 기능을 가리킨다. 활성은, 한정을 의도하는 것은 아니지만, 대체로, 분자의 생물학적 기능, 생화학적 기능, 물리적 기능 또는 화학적 기능을 포함한다. 활성은, 예를 들어 효소 활성, 다른 분자와 상호 작용하는 능력 및 다른 분자 기능을 활성화하거나, 촉진하거나, 안정화하거나, 저해하거나, 억제하거나 또는 불안정화하는 능력, 안정성, 특정한 세포 내 위치에 국재하는 능력을 포함한다. 적용 가능한 경우, 이 용어는 또한, 가장 넓은 의미에서의 단백질 복합체의 기능에도 관한 것이다.
본 명세서에 있어서 "생물학적 기능"이란, 어느 유전자 또는 그것에 관한 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 대하여 언급할 때, 그 유전자, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 생체 내에 있어서 가질 수 있는 특정한 기능을 말하고, 여기에는, 예를 들어 특이적인 세포 표면 구조 인식능, 효소 활성, 특정한 단백질과의 결합능 등을 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다. 본 개시에 있어서는 예를 들어, 어느 프로모터가 특정 숙주 세포에서 인식되는 기능 등을 들 수 있으나 그것들로 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서, 생물학적 기능은, "생물학적 활성"에 의해 발휘될 수 있다. 본 명세서에 있어서 "생물학적 활성"이란, 어느 인자(예를 들어 폴리뉴클레오티드, 단백질 등)가 생체 내에 있어서 가질 수 있는 활성을 말하고, 여러 가지 기능(예를 들어 전사 촉진 활성)을 발휘하는 활성이 포함되고, 예를 들어 어느 분자와의 상호 작용에 의해 다른 분자가 활성화 또는 불활성화되는 활성도 포함된다. 예를 들어 어느 인자가 효소인 경우, 그 생물학적 활성은, 그 효소 활성을 포함한다. 다른 예에서는, 어느 인자가 리간드일 경우, 그 리간드가 대응하는 리셉터에 대한 결합을 포함한다. 그러한 생물학적 활성은, 당해 분야에 있어서 주지의 기술에 의해 측정할 수 있다. 따라서, "활성"은, 결합(직접적 또는 간접적 중 어느 것)을 나타내거나 또는 드러내거나; 응답에 영향을 미치는(즉, 다소의 노출 또는 자극에 응답하는 측정 가능한 영향을 갖는), 여러 가지 측정 가능한 지표를 말하고, 예를 들어 숙주 세포에 있어서의 상류 또는 하류의 단백질의 양 또는 다른 유사한 기능의 척도를 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 경우, 바이러스 또는 바이러스 벡터의 "감염성"이란, 바이러스 또는 바이러스 벡터의 세포에 대한 접착 또는 막 융합에 의해, 바이러스 또는 바이러스 벡터 내의 핵산을 세포 내에 도입하는 능력을 가리킨다. 센다이 바이러스 벡터는, 야생형 벡터와 동일한 복제 능력을 가져도 되고, 또한 유전자 변이에 의해 약해져도 된다. 바이러스 또는 바이러스 벡터의 "복제 능력"이란, 감염 세포 내에서 감염성의 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터 입자를 생산하는 능력을 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 "형질 전환", "형질 도입" 및 "형질 감염"은, 특별히 언급하지 않는 한 호환 가능하게 사용되고, 숙주 세포로의 핵산의 도입(필요에 따라 바이러스 또는 바이러스 벡터를 개재한)을 의미한다. 형질 전환 방법으로서는, 숙주 세포에 핵산을 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어 컴피턴트화 세포의 사용, 일렉트로포레이션법, 입자 총(유전자 총)을 사용하는 방법, 인산 칼슘법 등의 다양한 주지의 기술을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 "정제된" 물질 또는 생물학적 인자(예를 들어 핵산 또는 단백질 등)란, 그 생물학적 인자에 천연적으로 수반하는 인자의 적어도 일부가 제거된 것을 말한다. 따라서, 통상 정제된 생물학적 인자에 있어서의 그 생물학적 인자의 순도는, 그 생물학적 인자가 통상 존재하는 상태보다도 높다(즉 농축되어 있음). 본 명세서 중에서 사용되는 용어 "정제된"은, 바람직하게는 적어도 75중량%, 보다 바람직하게는 적어도 85중량%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95중량%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 98중량%의, 동형의 생물학적 인자가 존재하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 물질은, 바람직하게는 "정제된" 물질이다.
본 명세서에 있어서 "의약 성분"이란, 의약을 구성할 수 있는 임의의 성분을 의미하고, 예를 들어 유효 성분(그 자체가 약효를 나타내는 것), 첨가 성분(그 자체는, 약효를 기대하지 않지만, 의약으로서 포함되는 경우 일정한 역할(예를 들어 부형제, 활택제, 계면 활성제 등)을 하는 것이 기대되는 성분) 등을 예시할 수 있다. 의약 성분은, 단독의 물질이어도 되고, 복수의 물질이나 제제의 조합이어도 된다. 유효 성분과 첨가 성분의 조합, 아쥬반트와 유효 성분의 조합 등의 임의의 조합도 포함될 수 있다.
본 명세서에서는, "유효 성분"은, 의도되는 약효를 발휘하는 성분을 말하고, 단독 또는 복수의 성분이 해당할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "첨가 성분"이란, 약효를 기대하지 않지만, 의약으로서 포함되는 경우 일정 역할을 하는 임의의 성분을 말하고, 예를 들어 약학적으로 수용 가능한 캐리어, 안정화제, (보)조제, 용해도 개선제, 가용화제, 희석제, 부형제, 완충제, 결합제, 희석제, 향미료, 윤활제를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 "약제", "제" 또는 "인자"(모두 영어에서는 agent에 상당함)는 광의로는, 교환 가능하게 사용되고, 의도하는 목적을 달성할 수 있는 한 어떤 물질 또는 다른 요소(예를 들어 광, 방사능, 열, 전기 등의 에너지)이어도 된다. 그러한 물질로서는, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 핵산(예를 들어 cDNA, 게놈 DNA와 같은 DNA, mRNA와 같은 RNA를 포함함), 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 지질, 유기 저분자(예를 들어 호르몬, 리간드, 정보 전달 물질, 유기 저분자, 조합 화학으로 합성된 분자, 의약품으로서 이용될 수 있는 저분자(예를 들어 저분자 리간드 등)), 이러한 복합 분자 및 이러한 혼합물을 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 경우, "복합체" 또는 "복합 분자"란, 2 이상의 부분을 포함하는 임의의 구성체를 의미한다. 예를 들어 한쪽 부분이 폴리펩티드일 경우에는, 다른 쪽 부분은, 폴리펩티드이어도 되고, 그 이외의 물질(예를 들어 기재, 당, 지질, 핵산, 다른 탄화수소 등)이어도 된다. 본 명세서에 있어서 복합체를 구성하는 2 이상의 부분은, 공유 결합으로 결합되어 있어도 되고 그 이외의 결합(예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호 작용, 반데르발스힘 등)으로 결합되어 있어도 된다.
본 명세서에 있어서 "표지"란, 목적으로 하는 분자 또는 물질을 기타로부터 식별하기 위한 존재(예를 들어 물질, 에너지, 전자파 등)를 말한다. 그러한 표지 방법으로서는, RI(방사성 동위 원소)법, 형광법, 비오틴법, 화학 발광법 등을 들 수 있다. 표적 단백질 또는 그것을 포착하는 인자 또는 수단을 복수, 형광법에 의해 표지할 경우에는, 형광 발광 극대 파장이 서로 다른 형광 물질에 의해 표지를 행한다. 형광 발광 극대 파장의 차는, 10nm 이상인 것이 바람직하다. 기능에 영향을 주지 않는 임의의 표지를 사용할 수 있지만, 형광 물질로서는, Alexa™Fluor를 들 수 있다. Alexa™Fluor는, 쿠마린, 로다민, 플루오레세인, 시아닌 등을 수식하여 얻어진 수용성의 형광 색소이며, 광범위한 형광 파장에 대응한 시리즈이며, 다른 해당 파장의 형광 색소에 비해, 매우 안정되고, 밝고, 또한 pH 감수성이 낮다. 형광 극대 파장이 10nm 이상인 형광 색소의 조합으로서는, Alexa™555와 Alexa™633의 조합, Alexa™488과 Alexa™555의 조합 등을 들 수 있다. 다른 형광 표지로서, 시아닌 색소(예를 들어 CyDye™ 시리즈의 Cy3, Cy5 등), 로다민 6G 시약, N-아세톡시-N2-아세틸아미노플루오렌(AAF), AAIF(AAF의 요오드 유도체) 등을 들 수 있다. 본 개시에서는, 이러한 표지를 이용하여, 사용되는 검출 수단으로 검출될 수 있도록 목적으로 하는 대상을 개변할 수 있다. 그러한 개변은, 당해 분야에 있어서 공지되어 있고, 당업자는 표지에 따라서 그리고 목적으로 하는 대상에 따라서 적절히 그러한 방법을 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "키트"란, 통상 2개 이상의 구획으로 나누고, 제공되어야 할 부분(예를 들어 바이러스 벡터, 설명서 등)이 제공되는 유닛을 말한다. 안정성 등을 위하여, 혼합되어 제공되어서는 안되고, 사용 직전에 혼합하여 사용하는 것이 바람직한 조성물의 제공을 목적으로 할 때에, 이 키트의 형태는 바람직하다. 그러한 키트는, 바람직하게는 제공되는 부분을 어떻게 사용하는지, 또는, 시약을 어떻게 처리하는지를 기재하는 지시서 또는 설명서를 구비하고 있는 것이 유리하다. 본 명세서에 있어서 키트가 시약 키트로서 사용될 경우, 키트에는, 통상 바이러스 벡터 등의 사용 방법 등을 기재한 지시서 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서 "지시서"는, 본 개시를 사용하는 방법을 의사 또는 다른 사용자에게 대한 설명을 기재한 것이다. 이 지시서는, 본 개시의 의약 등을 투여하는 것을 지시하는 문언이 기재되어 있다. 또한, 지시서에는, 투여 형태를 지시하는 문언이 기재되어 있어도 된다. 이 지시서는, 본 개시가 실시되는 국가의 감독 관청(예를 들어 일본이라면 후생노동성, 미국이라면 식품의약품국(FDA) 등)이 규정한 양식에 따라 제작되고, 그 감독 관청에 의해 승인을 받았다는 것이 명기된다. 지시서는, 소위 첨부 문서(package insert)이며, 통상은 종이 매체로 제공되지만, 그것으로 한정되지 않으며, 예를 들어 전자 매체(예를 들어 인터넷으로 제공되는 홈페이지, 전자 메일)와 같은 형태로도 제공될 수 있다.
용어 "약"은, 표시된 값 플러스 또는 마이너스 10%를 가리킨다. "약"이, 온도에 대하여 사용될 경우, 표시된 온도 플러스 또는 마이너스 5℃를 가리키고, "약"이, pH에 대하여 사용될 경우, 표시된 pH 플러스 또는 마이너스 0.5를 가리킨다.
(바람직한 실시 형태)
이하에 본 개시의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 이하에 제공되는 실시 형태는, 본 개시의 보다 좋은 이해를 위하여 제공되는 것이며, 본 개시의 범위는 이하의 기재로 한정되어야 하지 않는 것이 이해된다. 따라서, 당업자는, 본 명세서 중의 기재를 참작하여, 본 개시의 범위 내에서 적절히 개변을 행할 수 있다는 것은 명확하다. 또한, 이하의 실시 형태는 단독으로도 사용되거나 또는 그것들을 조합하여 사용할 수 있다는 것이 이해된다.
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드의 제작을 제공한다. 이것을 달성하기 위한 임의의 수단이 본 개시의 범위로 의도된다. 예를 들어 명시적인 기재가 없고, 어느 성분을 사용하는 방법의 기재는, 동 성분을 포함하는 조성물, 동 성분의 사용 및 동 방법에 사용하기 위한 동 성분 등, 다른 수단을 반영한 실시 형태도 동시에 의도하는 것이다. 본 명세서에서는, 주로 방법의 실시 형태에 있어서 본 개시를 설명하지만, 어떤 요소의 어떤 사용을 위한 방법에 관한 기재는, 동 요소를 포함하는 동 사용을 위한 조성물 및 동 요소의 동 사용 등, 다른 수단을 반영한 실시 형태도 동시에 의도하는 것이다.
(고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드의 제작)
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 있어서, 고초균이란, Bacillus subtilis 또는 이것과 근연인 Bacillus속 세균인 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus 등을 포함하는, 병원성을 갖지 않고, 자연 형질 전환능을 갖는 임의의 세균을 가리키고, 0.7 내지 0.8×2 내지 3㎛의 크기의 호기성의 그람 양성 간균이며, 고온 또는 자외선 등의 스트레스에 내성이 있는 아포를 형성하는 능력이 있다. 하나의 실시 형태에서는 본 개시는, Bacillus subtilis 내에서 복제하는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서는, 고초균은, Bacillus subtilis 중에서 높은 자연 형질 전환능을 갖는 주인 Marburg 168주 또는 그 파생주인 RM125주이다. 168주는, 유전적으로 가장 연구된 그람 양성균이며, RM125주와 함께 ATCC(American Type Culture Collection) 등으로부터 입수 가능하다. 그 자체는 인축무해한 것, OGAB법이 적응 가능한 것으로 알려져 있는 것 등으로부터도, 본 개시에 있어서 적합하게 사용될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 고초균은 외부로부터 도입한 핵산으로 플라스미드를 형성하는 능력을 가질 수 있으므로, 이 방법에 있어서, 도입하는 핵산은 플라스미드가 아니어도 된다. 예를 들어 고초균은, 핵산(예를 들어 탠덤 리피트한 핵산 서열을 갖는 비환상 핵산)과 접촉하면, 이 핵산을 도입하고, 고초균 내에서 플라스미드를 형성할 수 있다(예를 들어 본 명세서에 기재된 OGAB법을 참조할 것).
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 고초균 내에서 복제하는 서열을 갖는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 플라스미드를 증폭하는 방법을 제공하고, 이 방법은, 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함한다. 하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법을 제공하고, 이 방법은, A) 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 고초균에서 플라스미드를 형성시키는 단계와, B) 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은, 고초균을 패키징 세포로서 사용하는 방법이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 숙주 세포는, 대장균, 고초균 및 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생물의 세포이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 숙주 세포는, A) 및 B)에 있어서 상이한 종 또는 동일종의 세포이다. 하나의 실시 형태에 있어서, A)의 숙주 세포는, 고초균의 세포이다. 하나의 실시 형태에 있어서, A)의 숙주 세포와 B)의 숙주 세포가 다르고, A)에서 생성된 상기 플라스미드를 B)의 숙주 세포에 도입하는 공정이 포함된다. 하나의 실시 형태에 있어서, A)의 숙주 세포가 고초균의 세포이며, B)의 숙주 세포가 대장균의 세포이며, A)에서 생성된 플라스미드를 B)의 숙주 세포에 도입하는 공정이 포함된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 플라스미드가 증식하는 조건은, 플라스미드를 도입한 세포를 증식하는 조건일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 플라스미드가 증식하는 조건은, (예를 들어 세포 증식 후에) IPTG을 첨가하는 조건일 수 있고, 결손이 없는 플라스미드가 대량으로 취득될 수 있다. 이러한 방법에 대해서, 대장균의 계에서는, 아라비노오스 유도계로서 보고가 있다(Wild　J,　Hradecna　Z,　Szybalski　W.　Conditionally　Amplifiable　BACs:　Switching　From　Single-Copy　to　High-Copy　Vectors　and　Genomic　Clones.　Genome　Res.　2002;　2002-12:1434-1444.). 예를 들어 실시예에서 사용되고 있는 pGETS118의 플라스미드의 카피 수 제어 기구는 일본 특허 제4479199호 등에 기재되어 있고, 플라스미드의 복제를 담당하는 repA라고 하는 유전자의 발현량을 변화시키는 방법이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 고초균에 핵산을 도입하는 방법은, 임의의 방법일 수 있지만, 예를 들어 컴피턴트한 고초균의 사용, 일렉트로포레이션법, 입자 총(유전자 총)을 사용하는 방법, 인산 칼슘법 등을 들 수 있다. "컴피턴트(competent)"란, 세포가 외래성의 물질(예를 들어 핵산)에 대하여 보다 투과성이 된 상태를 가리킨다. 고초균을 컴피턴트하게 하기 위해서는, 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있지만, 예를 들어 Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746(1961)에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 고초균에서 제작되고, 그대로 동일한 고초균에서 증폭되어도 된다.
고초균에 핵산을 도입하여, 이 핵산과는 상이한 구조의 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 경우, 도입하는 핵산은, 이하에서 상세하게 설명하는 바이러스 벡터 플라스미드의 각 요소를 포함할 수 있다.
(벡터 플라스미드)
하나의 실시 형태에 있어서, 고초균에서 제작하는 벡터 플라스미드는, 고초균에서 작동하는 복제 기점, 예를 들어 oriC 및 pTB19(Imanaka, T.,et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399-1408.(1984))나 pLS32(Tanaka, Tand Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998)), pAMβ1(Swinfield, T. J., et al. Gene 87, 79-90. (1990)) 등의 플라스미드에 포함되는 복제 기점을 가질 수 있다. 고초균 내에서 복제되는 서열로서는, 롤링 써클형, 세타형, oriC, 파지 등에 의한 복제 기구를 작동시키는 것이 공지되어 있는, 플라스미드 또는 그 부분 또는 복제 기점 또는 그것들의 개변체 등을 들 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 고초균 내에서 복제되는 서열은, 공지된 복제 개시점과 동일하거나 또는 유사한 서열(예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상의 서열 동일성)을 가질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 벡터 플라스미드는, 고초균에서 작동하는 프로모터 및/또는 인핸서를 가질 수 있다. 예를 들어 고초균의 프로모터로서, IPTG(isopropyl s-D-thiogalactopyranoside)에서 발현 제어 가능한 Pspac(Yansura, D. and Henner, D. J. Pro. Natl. Acad. Sci, USA 81, 439-443.(1984.)), 또는 Pr 프로모터(Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604. (1999)) 등을 들 수 있다. 고초균에서 작동하는 핵산 엘리먼트는 고초균으로부터 유래할 필요는 없고, 고효율로 작동하는 것 등이 선택될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 벡터 플라스미드 중의 고초균에서 작동하는 복제 기점, 프로모터 및/또는 인핸서는, 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 게놈(개변을 포함해도 된다) 또는 그 일부를 코드하는 영역의 외측에 위치될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 고초균 이외의 생물의 세포에서 제작 또는 사용될 수 있으므로, 그 생물에서 작동하는 복제 기점, 프로모터, 전사 종결 서열 등의 전사 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 생물마다의 전사 번역 조절 서열은, 공지되어 있으며, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 대장균, 효모 등에 있어서 제작 또는 복제될 수 있으므로, 이들 미생물에서 작동하는 전사 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 프로듀서 세포에 도입될 수 있으므로, 프로듀서 세포에서 작동하는 전사 번역 조절 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 유전자, 바이러스 벡터에 패키징되기 위해 필요한 유전자 및 목적으로 하는 유전자 중 적어도 하나를 포함한다. 종양 용해성의 바이러스 벡터를 생산하는 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자를 포함하지 않아도 된다. 종양 용해성의 바이러스 벡터를 생산하는 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 사이토카인(예를 들어 면역 활성화)을 코드하는 유전자를 포함하도록 개변되어도 된다. 종양 용해성의 바이러스 벡터를 생산하는 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터의 기원 바이러스가 증식하기 위하여 필요한 유전자를 모두 포함하고, 그렇게 함으로써 생산되는 바이러스 벡터가 증식능을 구비해도 된다. 종양 용해성의 바이러스 벡터를 생산하는 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 프로모터 유전자가 피험체가 특정한 세포(암 세포 등)에서만 작동하도록 치환되어 있어도 된다. 목적으로 하는 유전자를 피험체에 송달하기 위한 바이러스 벡터를 생산하는 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터의 기원 바이러스가 증식하기 위하여 필요한 유전자를 모두 포함하지는 않고, 그렇게 함으로써 생산되는 바이러스 벡터가 증식능을 구비하지 않도록 구성되어도 된다. 본 개시의 벡터 플라스미드에 포함시켜야 할 바이러스 유전자 및 바이러스 벡터에 패키징되기 위하여 필요한 유전자는 제작하는 바이러스 벡터마다 다를 수 있다. 이것들의 상세는, 본 명세서의 다른 개소에 기재된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 제작하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스에 의해 작동되는 전사 번역 조절 서열(예를 들어 프로모터)을 포함할 수 있다. 이러한 프로모터로서, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, CAG 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 등이 알려져 있다. 어느 바이러스에 의해 작동되는 핵산 엘리먼트는 그 바이러스에서 유래할 필요는 없고, 그 때문에, 제작하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스와는 다른 생물(예를 들어 바이러스)의 전사 번역 조절 서열이 선택될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스의 전체 게놈 중 적어도 일부의 유전자의 서열을 포함하지 않는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 벡터 플라스미드 상의 종합된 영역에 배치된다. 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 핵산 단편을 원래의 플라스미드에 도입함으로써 이러한 구조의 벡터 플라스미드가 형성될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 벡터 플라스미드의 전체 염기 길이의 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하 또는 약 5% 이하의 염기 길이의 연속 영역 내에 존재한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 고초균 내에서 복제되는 서열은, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이 존재하는 연속 영역 내에 배치되어도 되고, 이 연속 영역 외에 배치되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열의 말단 반복 서열 이외의 요소(예를 들어 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열, 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열 및 헬퍼 유전자 중 1개 또는 복수)는 각각, 2개의 말단 반복 서열의 사이에 배치되어도 되고, 외측에 배치되어도 된다. 본 개시의 벡터 플라스미드에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열의 각 요소는, 임의의 순서 및 위치로 배치해도 되고, 도면 등에 있어서 구체적으로 나타낸 배치 이외의 다양한 배치의 것을 사용할 수 있다고 이해된다. 헬퍼 유전자 등 특정한 기능으로 기재되는 핵산 서열이 복수의 요소를 포함하는 경우, 특별히 기재하지 않는 한, 벡터 플라스미드에 있어서의 각 요소의 순서 및 위치는 임의일 수 있지만, 임의의 요소(예를 들어 VA, E2A, E4)끼리를 연속하여(사이에 다른 유전자를 두지 않고) 배치해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 약 5kb 이상, 약 10kb 이상, 약 20kb 이상, 약 30kb 이상, 약 40kb 이상, 약 50kb 이상, 약 70kb 이상 또는 약 100kb 이상일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 바이러스의 2개의 말단 반복 서열 및 그 밖의 부분을 포함하고, 그 밖의 부분은, 상기 2개의 말단 반복 서열 사이에 있는 영역의 밖에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열(예를 들어 cap, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 또는 그 개변체 중 어느 하나에서 유래할 수 있음)과, 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열(예를 들어 rep, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 또는 그 개변체 중 어느 하나에서 유래할 수 있음)과, 바이러스에 2개의 말단 반복 서열(예를 들어 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 또는 그 개변체 중 어느 하나에서 유래함)과, 헬퍼 유전자(예를 들어 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA 중 적어도 하나, 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 또는 그 개변체 중 어느 하나에서 유래할 수 있음)를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 상류로부터 프로모터, 목적으로 하는 유전자 및 터미네이터를 포함한다. 특히, 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열은, 야생형 서열(예를 들어 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12)의 개변체이어도 된다는 것이 의도된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드에 있어서의 목적으로 하는 유전자는, 최종적으로 바이러스 벡터의 탑재 핵산에 포함될 수 있다. 이러한 목적으로 하는 유전자는, 치료용 단백질이 코드되어 있어도 되고, 유전자 치료용 유전자가 코드되어 있어도 되고, CART 요법 등 유전자 세포 치료용 유전자가 코드되어 있어도 되고, 단백질 비코드 기능성 RNA(rRNA, tRNA, 마이크로 RNA(miRNA), lncRNA 등)을 코드하고 있어도 되고, 이것들과 조합하여 또는 독립적으로 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 인슐레이터, 사일런서, 복제 기점 등의 전사 번역 조절 서열을 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, CAG 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 등의 바이러스 프로모터를 포함한다(필요에 따라, 단백질 코드 유전자의 상류에). 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, IRES를 포함한다(필요에 따라, 단백질 코드 유전자의 상류에). 이러한 목적으로 하는 유전자는, 상기의 유전자와 조합하여 또는 독립적으로 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 인슐레이터, 사일런서, 복제 기점 등의 전사 번역 조절 서열을 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 바이러스 벡터를 투여하는 피험체의 염색체에 도입될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 치료용 세포(예를 들어 염색체)에 도입될 수 있다(예를 들어 체외에서의 바이러스 벡터에 의한 세포의 처리를 통하여). 이 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 피험체가 원래 갖는 유전자의 발현을 제어하는 기능을 가져도 되고, 장기간에 걸치는 단백질 발현을 초래해도 된다. 예를 들어 아데노 수반 바이러스, 알파 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스, 광견병 바이러스 등에 기초하는 바이러스 벡터는, 피험체의 염색체에 도입될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드에 있어서의 목적으로 하는 유전자는, 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 2 내지 100, 예를 들어 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 7 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상 또는 50 이상, 또한 100 이하, 90 이하, 80 이하, 70 이하, 60 이하, 50 이하, 40 이하, 35 이하, 30 이상, 25 이하, 20 이하, 17 이하, 15 이하, 12 이하 또는 10 이하의 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드에 있어서의 목적으로 하는 유전자는, 약 0.1 내지 1000kbp, 예를 들어 약 0.1kbp 이상, 약 0.3kbp 이상, 약 1kbp 이상, 약 2kbp 이상, 약 5kbp 이상, 약 7kbp 이상, 약 10kbp 이상, 약 20kbp 이상, 약 50kbp 이상 또는 약 100kbp 이상, 또한 약 1000kbp 이하, 약 700kbp이하, 약 500kbp 이하, 약 200kbp 이하, 약 100kbp 이하, 약 70kbp 이하, 약 50kbp 이하, 약 20kbp 이하 또는 약 10kbp 이하의 염기 길이를 포함할 수 있다. 본 개시의 벡터 플라스미드는, OGAB법에 의해 복수의 유전자를 포함하는 복잡한 구조로 구축될 수 있으므로, 목적으로 하는 유전자도 복잡한 구조로 구축될 수 있다. 바이러스 벡터의 종류에 따라 탑재 핵산의 사이즈는 제한될 수 있으므로, 목적으로 하는 유전자의 사이즈에 따라 바이러스 벡터의 종류가 선택되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자가 복수의 유전자를 포함함으로써 피험체의 조직(예를 들어 암 조직) 특이적 또는 시기 특이적인 프로모터와 이것에 작동 가능하게 연결된 치료용 유전자(치료용 단백질 코드 서열, 유전자 치료용 유전자, 유전자 세포 치료용 유전자 등)와의 조합, 대사 캐스케이드를 제어하는 일련의 효소의 협조 발현이 가능하도록 일련의 효소를 코드하는 서열 등, 고도한 기능성을 갖는 핵산을 피험체에 송달 가능할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드에 있어서의 목적으로 하는 유전자에 코드되는 단백질로서는, 치료용 폴리펩티드(예를 들어 보충 요법), 면역원성 폴리펩티드(예를 들어 병원체 폴리펩티드, 암 항원 폴리펩티드) 등을 들 수 있다. 치료용 폴리펩티드로서는, 낭포성 섬유증 막관통 제어 단백질(CFTR), 디스트로핀(미니디스트로핀 및 마이크로 디스트로핀, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 II 형 가용성 수용체, IGF-1, 항염증성 폴리펩티드, 사르코스판, 유트로핀, 미니유트로핀, 응고 인자(예를 들어 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제, 슈퍼옥시드 디스무타아제, 렙틴, LDL 수용체, 리포단백질 리파아제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α1-안티트립신, 아데노신 데아미나아제, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제, β-글루코세레브로시다아제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다아제 A, 분지쇄 케토산 탈수소 효소, RP65 단백질, 사이토카인(예를 들어 α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 림포톡신 등), 펩티드 증식 인자, 신경 영양 인자 및 호르몬(예를 들어 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린양 증식 인자 1 및 2, 혈소판 유래 증식 인자, 상피 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자, 신경 증식 인자, 신경 영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경 영양 인자, 골형태 형성 단백질, 글리아 유래 증식 인자, 형질 전환 증식 인자 -α 및 -β 등), 리소좀 산 α-글루코시다제, α-갈락토시다아제 A, 종양 괴사 증식 인자 α 가용성 수용체, S100A1, 파브알부민, 아데닐시클라아제 6형, 항염증성 인자, 항미오스타틴 단백질, 아스파토아실라제, 자살 유전자 산물(예를 들어 티미딘 키나아제, 사이토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 종양 괴사 인자), 종양 억제 유전자 산물(예를 들어 p53, Rb, Wt-1), TRAIL, FAS-리간드 등을 들 수 있다.
병원체 폴리펩티드로서는, 세균, 진균, 기생충 등의 병원 생물의 세포 표면 단백질 및 바이러스의 표면에 발현하는 단백질(예를 들어 스파이크 단백질, 엔벨로프 단백질, 캡시드 단백질 등)을 들 수 있다. 병원체 폴리펩티드의 구체예로서는, 오르토믹소 바이러스 면역원(예를 들어 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 핵 단백질), 렌티 바이러스 면역원(예를 들어 HIV 또는 SIV의 엔벨로프 GP160 단백질, 매트릭스/캡시드 단백질, gag, pol, env 유전자 산물), 아레나 바이러스 면역원(예를 들어 라사열 바이러스 핵캡시드 단백질, 엔벨로프 당단백질), 폭스 바이러스 면역원(예를 들어 백시니아 L1 또는 L8 유전자 산물), 플라비 바이러스 면역원(예를 들어 황열병 바이러스 또는 일본 뇌염 바이러스 면역원), 필로 바이러스 면역원(예를 들어 NP 및 GP 유전자 산물 등의 에볼라 바이러스 또는 마버그 바이러스 면역원), 부니아 바이러스 면역원(예를 들어 RVFV, CCHF, SFS 바이러스 면역원), 코로나 바이러스 면역원(예를 들어 인간 코로나 바이러스 엔벨로프 당단백질 등의 인간 코로나 바이러스 면역원), 폴리오 면역원, 헤르페스 바이러스 면역원(예를 들어 CMV, EBV, HSV 면역원), 멈프스 바이러스 면역원, 홍역 바이러스 면역원, 풍진 바이러스 면역원, 디프테리아 독소 또는 다른 디프테리아 면역원, 백일해 항원 및 간염(예를 들어 A형 간염, B형 간염, C형 간염 등) 면역원 등을 들 수 있다.
암 항원 폴리펩티드로서, BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gp100, 티로시나아제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파아제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, 멜라노마 종양 항원, MART-1, gp100 MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, 티로시나아제, HER-2/neu 유전자 산물, CA125, LK26, FB5(엔도시알린), TAG72, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN(시알릴 Tn 항원), c-erbB-2 단백질, PSA, L-CanAg, 에스트로겐 수용체, 유지방 글로불린, p53 종양 억제 인자 단백질, 뮤신 항원, 텔로머라아제, 핵매트릭스 단백질, 전립선 산성 포스파타아제, 파필로마 바이러스 항원 등을 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, 특정한 질환을 치료하기 위한 유전자(예를 들어 유전자 치료 유전자)일 수 있다. 특정한 질환에 대하여 선택해야 할 유전자는 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 이러한 질환으로서, 예를 들어 각종 병원체에 의한 감염증, 낭포성 섬유증, 혈우병 A, 혈우병 B, 탈라세미아(thalassemia), 빈혈, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 간질, 암(흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암 등), 당뇨병, 근디스트로피, 고셔병, 헐러병, 아데노신데아미나아제 결핍증, 당원 저장 질환, 선천성 폐기종, 레쉬·니한 증후군, 니만·픽병, 테이·삭스병, 엔젤만 증후군, 메이플 시럽 요증, 노인성 황반 변성, 흑내장, 당뇨병성 망막증, 망막변성 질환, 성상 세포종, 교아종, 심부전, 말초 동맥 질환, 관절염, 관절 장애, 내막 과형성, AIDS, 근소모, 신장 결손증, 간염, LDL 수용체 결핍증, 고암모니아혈증, 크라베병, 배튼병, 척수성 대뇌성 운동 실조증, 페닐케톤 요증, 자기 면역 질환, 아미노산 대사 이상증, 유기산 대사 이상증, 지방산 대사 이상증, 미토콘드리아병, 당질 대사 이상증, 라이소좀병, 퍼옥시좀병, 금속 대사 이상증, 퓨린피리미딘 대사 이상증, 비타민 대사 이상증, 신경 전달 물질 이상증, 지질 대사 이상증, 결합 조직 이상증, 선천성 포르피린증, α1-안티트립신 결손증, 리소좀 축적증, 무코 다당증 장애, 파브리병, 카나반병, 리씨병(Leigh disease), 레프섬병, 뚜렛 증후군, 원발성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 피크병, 근디스트로피, 중증 근무력증, 빈스방거병, 뇌경색, 기분 장애, 우울증, 양극성 감정 장애, 지속성 감정 장애, 2차적 기분 장애, 통합 실조증, 약물 의존성, 불안증, 강박 장애, 신체표현성 장애, 해리성 장애, 비탄, 산후 우울증, 환각, 망상, 인지증, 파라노이아, 자폐증 스펙트럼 장애, 주의 결함 장애, 정신성적 장애, 수면 장애, 동통성 장애, 섭식 장애, 체중 장애, 비만증, 악액질, 신경성 식욕 부진증, 과식증 등을 들 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, CART 요법 등에서 사용하는 치료용 세포(예를 들어 염색체)에 도입될 수 있다(예를 들어 체외에서의 바이러스 벡터에 의한 세포의 처리를 통하여).
(바이러스 벡터)
본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터를 생산하기 위하여 사용된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 본 개시의 방법에 의해 벡터 플라스미드를 제작하는 단계과, 상기 벡터 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 형성시키는 단계를 포함하는, 바이러스 벡터를 제작하는 방법을 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 이와 같이 제작된 바이러스 벡터 함유 조성물 또는 바이러스 벡터를 제공한다. 바이러스 벡터로서는, 알파 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 코로나 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 수반 바이러스 또는 아데노 바이러스에 기초하는 바이러스 벡터를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 프로듀서 세포에 도입되어 바이러스 벡터를 생산한다. 프로듀서 세포의 예로서, 예를 들어 911 세포, PER.C6 세포, E1 형질 전환 양막 세포, E1 형질 전환 A549 세포, GH329: HeLa 세포, HEK293 세포, IT293SF 세포, HEK293T, HEK293F, Vero 세포, CHO 세포, Sf9 세포, Freestyle(상표) 293-F, Expi293-F(상표), Expi293 inducible, Expi293 NGT-Viral Production Cells 1.0, Viral Production Cells 2.0, AAVpro(등록 상표) 293T Cell Line, Lenti-X(상표) 293T Cell Line, FreeStyle(상표) CHO-S cells, ExpiCHO-S(상표) 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 생산하는 바이러스 벡터의 종류에 따라, 임의의 공지된 적합한 프로듀서 세포가 선택될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 유전자 중 소수(예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)를 결손하고, 다른 모든 유전자를 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터를 생산하기 위하여 필요한 유전자 세트 중의 일부를 결손하고 있고, 유전자 세트 중의 벡터 플라스미드가 결손되어 있는 유전자는, 벡터 플라스미드와는 트랜스로 프로듀서 세포에 공급된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 그 밖의 플라스미드와 조합하지 않고 단독으로 프로듀서 세포에 도입함으로써 바이러스 벡터 생산을 가능하게 할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터를 생산하기 위하여 필요한 유전자 세트 중 벡터 플라스미드가 결손된 유전자 모두를 발현하는 프로듀서 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어 AAV의 cap 및 rep, 그리고 아데노 바이러스의 E2A, E4 및 VA를 포함하는 본 개시의 벡터 플라스미드는 단독으로, 아데노 바이러스의 E1A 및 E1B를 발현하는 HEK293 세포에 도입함으로써 바이러스 벡터를 생산할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 바이러스 벡터를 생산하기 위하여 필요한 유전자 세트 중 벡터 플라스미드가 결손된 유전자를 포함하는 다른 핵산 또는 그 유전자의 산물(예를 들어 바이러스 입자)과 함께 프로듀서 세포에 도입될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스 벡터는, 벡터 플라스미드를, 바이러스 벡터의 기원 바이러스를 감염시킨 프로듀서 세포 중에 도입하고, 그 세포 중에서 상동 재조합을 발생시킴으로써 제작할 수 있다. 이 실시 형태에 있어서 사용하는 바이러스 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자 및 기원 바이러스의 게놈의 어느 영역(예를 들어 유전자간의 영역)에 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 벡터 플라스미드는, 생산하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 게놈의 어느 유전자 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함하는 구조를 가질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 벡터 플라스미드에 포함되는 핵산의 적어도 일부가 프로듀서 세포의 염색체에 도입된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 생산하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 탑재 핵산 잘라내기를 위한 세그먼트(레트로 바이러스에 있어서의 LTR, AAV 바이러스에 있어서의 ITR 등)를 포함하고, 하나의 실시 형태에 있어서, 이 세그먼트의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 이 세그먼트의 사이에 목적으로 하는 유전자 그리고 이것에 작동 가능하게 연결한 프로모터 및/또는 터미네이터(예를 들어 바이러스 벡터가 표적으로 하는 대상에 있어서 작동 가능한 것)를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 이 세그먼트의 사이에 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 복제를 위하여 필요한 유전자를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 생산하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 패키징 시그널을 포함한다.
생산되는 바이러스 벡터는 캡시드를 가지며, 캡시드는 조직 또는 세포와의 결합에 관여할 수 있다. 그 때문에, 캡시드를 개변하여 조직 또는 세포(또는 그 표면 구조)와의 결합성을 개변함으로써 바이러스 벡터의 조직 또는 세포에 대한 표적화를 조정할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 캡시드를 코드하는 유전자를 가져도 되고, 이 캡시드는 개변되어 있어도 된다. 예를 들어 조직 또는 세포 표적화를 조정하는 캡시드 개변으로서, 다른 단백질(다른 바이러스 캡시드(예를 들어 다른 혈청형의 바이러스 캡시드, VSV-G), 항체의 항원 결합 영역, 피험체 생물의 리간드 단백질(암 항원에 대한 리간드) 등)과의 치환 또는 융합을 들 수 있다. 또한, 엔벨로프를 갖는 바이러스 벡터는, 프로듀서 세포의 세포막 성분을 엔벨로프에 포함할 수 있다. 그 때문에, 프로듀서 세포의 세포막 성분을 개변함으로써 엔벨로프를 갖는 바이러스 벡터의 조직 또는 세포에 대한 표적화를 조정할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스 벡터는, 신경 세포(말초 신경계 또는 중추 신경계의 세포, 뉴런 및 올리고덴드로사이트 등의 뇌세포 등), 폐 세포, 눈의 세포(망막 세포, 망막 색소 상피, 각막 세포 등), 상피 세포(예를 들어 장 또는 호흡기의 상피 세포), 근육 세포(예를 들어 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 횡격막 근육 세포), 수지상 세포, 췌장 세포(섬 세포 등), 간 세포, 심근 세포, 골 세포(예를 들어 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포, 암 세포 등을 표적으로 하도록 설계되어도 된다. 각각의 세포에 특이적인 표면 구조(수용체 등)는 공지되어 있고, 당업자는, 그 표면 구조에 강력하게 또는 특이적으로 결합하는 단백질을 적절히 선택할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, 생산하는 바이러스 벡터의 기원 바이러스의 단백질을 약독화한 단백질을 코드하는 유전자를 포함해도 된다. 본 개시의 벡터 플라스미드는, 임의의 공지된 약독화 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 포함할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 본 개시의 벡터 플라스미드의 집단을 포함하는 플라스미드 함유 조성물을 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 플라스미드 함유 조성물은, 포함되는 엔도톡신이, 약 1000EU/mL 이하, 약 700EU/mL 이하, 약 500EU/mL 이하, 약 400EU/mL 이하, 약 300EU/mL 이하, 약 200EU/mL 이하, 약 100EU/mL 이하, 약 70EU/mL 이하, 약 50EU/mL 이하, 약 40EU/mL이하, 약 30EU/mL 이하, 약 20EU/mL 이하, 약 10EU/mL 이하, 약 7EU/mL 이하 또는 약 5EU/mL 이하일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 플라스미드 함유 조성물은, 플라스미드의 CCC(covalently closed circular) 순도가, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상일 수 있다.
·아데노 바이러스 벡터
아데노 바이러스는, 아데노 바이러스과 마스트아데노 바이러스속의 바이러스이며, 바이러스 입자는, 뉴클레오 캡시드 및 이중쇄 선상 DNA 게놈으로 구성되고, 90 내지 100m의 정20면체의 구조를 갖는다. 아데노 바이러스의 감염은 세포 표면의 coxackie-adenovirus receptor(CAR)에 바이러스 캡시드가 흡착함으로써 개시되고, 이어서 세포 표면의 인테그린을 개재하여 바이러스는 세포 내에 침입할 수 있다. 그 후, 라이소좀으로부터 탈출한 바이러스 게놈은 핵 내에 도달하여 바이러스 게놈의 복제를 초래할 수 있다. 바이러스 복제는, 먼저 E1A 단백질이 발현하고, 다른 초기 단백질인 E1B, E2, E3, E4의 발현을 활성화함으로써 개시된다. 바이러스 게놈은, E2로부터 발현한 말단 단백질(TP)과 데옥시시티딘이 공유 결합하고, 이것에 추가로 폴리메라아제가 결합한 복합체가 형성되어 복제가 개시된다. 게놈은 또한, 펜톤(L2), 헥손(L3), 골격 단백질(L4) 및 섬유 단백질(L5)을 포함하는 구조 단백질을 코드하고, 단일 프로모터의 제어 하에 있는, 5개의 후기 전사 단위(L1, L2, L3, L4 및 L5)도 포함한다. 게놈의 양단은, 바이러스의 복제에 필요한 역방향 말단 서열(inverted terminal repeat:ITR)을 포함한다. 바이러스의 구조 단백질은 세포질에서 번역된 후, 핵 내에 이행하여 바이러스 입자를 구성하고, 바이러스 게놈의 패키징 시그널(Ψ)을 인식하여 게놈을 패키징한다. 또한, 아데노 바이러스는, 단백질 비코드 VA RNA를 생산하고, 이것은, VA 유전자로 코드되어 있다. 아데노 바이러스 입자는, L2 및 L3의 캡시드를 가질 수 있다.
현재까지 52개의 인간 아데노 바이러스 항원형이 동정되고, 그것은 혈구 응집 반응의 성질과 서열 상동성에 기초하여 6개의 서브 그룹: 서브 그룹 A(예를 들어 혈청형 12, 18 및 31), 서브 그룹 B(예를 들어 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 및 50), 서브 그룹 C(예를 들어 혈청형 1, 2, 5 및 6), 서브 그룹 D(예를 들어 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22 내지 30, 32, 33, 36 내지 39 및 42 내지 48), 서브 그룹 E(예를 들어 혈청형 4), 서브 그룹 F(예를 들어 혈청형 40 및 41) 및 미분류된 혈청형군(예를 들어 혈청형 49 및 51)으로 분류되어 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 예를 들어 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자는, 프로듀서 세포의 염색체에 코드되어 있어도 되고, 프로듀서 세포에 도입되는 다른 핵산 분자(예를 들어 플라스미드)에 코드되어 있어도 되고, 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자의 유전자 산물(바이러스 입자의 형태이어도 된다)이 프로듀서 세포에 도입되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로듀서 세포에 도입되는 본 개시의 벡터 플라스미드와는 다른 핵산 분자는, 5'ITR, 패키징 시그널(Ψ) 및 3'ITR 중의 1개 또는 복수개를 결손하고 있어도 되고, 탑재 핵산이 이 핵산 유래의 핵산을 포함하는 것이 회피될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, IX, IVa2를 코드하는 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, E3 이외의 아데노 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, E3 이외의 아데노 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, VA, E1A, E1B, E2A, E2B, E4 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다. 특정한 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, E1A 및 E1B를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, E1A를 결손하고 있고, 이 결손 개소에 목적으로 하는 유전자가 삽입되어 있어도 된다. VA RNA는, 인간에 있어서 엑스포틴, RISK, Dicer 등과 상호 작용하는 것이 알려져 있고, 아데노 바이러스 벡터 플라스미드로부터 VA를 결손시킴으로써 아데노 바이러스 벡터 감염 세포에 대한 부작용이 저감될 수 있다. E1A, E1B, E2A, E2B, E4는, 아데노 바이러스의 복제에 필요한 유전자일 수 있으므로, 이것들을 결손시킨 아데노 바이러스 벡터 플라스미드는, 감염 세포에 있어서의 복제 능력이 저감될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 아데노 바이러스 벡터는 인간의 서브 그룹 C, 예를 들어 혈청형 2 또는 혈청형 5 유래일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 아데노 바이러스 벡터는 혈청형 12(서브 그룹 A), 혈청형 7 또는 혈청형 35(서브 그룹 B), 혈청형 30 또는 혈청형 36(서브 그룹 D),혈청형 4(서브 그룹 E), 또는 혈청형 41(서브 그룹 F)유래일 수 있다. 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela, Sf9 등의 세포를 들 수 있다.
·아데노 수반 바이러스 벡터
아데노 수반 바이러스(AAV)는 파르보 바이러스과 디펜도 바이러스속의 선상 단일쇄 DNA 바이러스이며, 바이러스 입자는 직경 20 내지 26nm이다. AAV의 증식에는 아데노 바이러스 엘리먼트가 필요하다. AAV 게놈의 양 말단에는 ITR(inverted terminal repeat)이라고 하는 T자형의 헤어핀 구조가 존재한다. 이 ITR의 부분이 복제의 개시점이 되고, 프라이머의 역할을 한다. 또한, 바이러스 입자로의 패키징이나 숙주 세포의 염색체 DNA로의 도입에도 이 ITR이 필요하다. 게놈의 좌측 절반에 비구조 단백질, 즉 복제나 전사를 담당하는 조절 단백질(Rep78, Rep68, Rep52, Rep40)을 코드하는 rep 유전자가 존재하고, 게놈의 우측 절반에 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)의 세개의 캡시드 단백질을 코드하는 cap 유전자가 존재한다.
AAV의 생활환은 잠복 감염과 용해 감염으로 나뉜다. 전자는 단독으로 감염된 경우이며, 숙주 세포의 제19번 염색체 장완의 AAVS1 영역(19q13.3-qter)에 도입되는 것이 특징적이다. 이 도입은 비상동 재조합에 의한 것이며 Rep가 관여하고 있다. AAVS1 영역과 ITR의 Rep 결합 영역에 공통적으로 존재하는 염기 서열(GAGC 반복 서열)에 Rep78/Rep68이 결합된다는 것이 보고되어 있다. 따라서, 야생형 AAV가 표적 세포에 감염되었을 때에는, Rep가 AAV의 ITR 및 AAVS1와 결합하고, Rep가개재함으로써 AAV 게놈의 제19번 염색체로의 부위 특이적 도입이 일어나는 것이라고 생각되고 있다. 아데노 바이러스 등의 헬퍼 바이러스가 동시에 감염된 경우, AAV가 잠복 감염되어 있는 세포에 다시 헬퍼 바이러스가 중복 감염된 경우에 AAV의 복제가 일어나고, 세포 파괴에 의해 대량의 바이러스가 방출된다(용해 감염).
하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 예를 들어 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자는, 프로듀서 세포의 염색체에 코드되어 있어도 되고, 프로듀서 세포에 도입되는 다른 핵산 분자(예를 들어 플라스미드)에 코드되어 있어도 되고, 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자의 유전자 산물(바이러스 입자의 형태이어도 된다)이 프로듀서 세포에 도입되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로듀서 세포에 도입되는 본 개시의 벡터 플라스미드와는 다른 핵산 분자는, 5'ITR 및 3'ITR 중의 1개 또는 복수개를 결손하고 있어도 되고, 탑재 핵산이 이 핵산 유래의 핵산을 포함하는 것이 회피될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, AAV의 5'ITR, rep, cap, AAP(어셈블리 활성화 단백질), MAAP(막회합 악세서리 단백질) 및 3'ITR, 그리고 아데노 바이러스의 E1A, E1B, E2A, VA 및 E4일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, AAV의 5'ITR, rep, cap 및 3'ITR, 그리고 아데노 바이러스의 E1A, E1B, E2A, VA 및 E4일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터 플라스미드는, rep, cap, VA, E1A, E1B, E2A, E4 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, AAV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다.
AAV는, 캡시드에 기초하여 1 내지 12 형까지의 혈청형이 보고되어 있다. 또한, rh10, DJ, DJ/8, PHP.eB, PHP.S, AAV2-retro, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8, AAV6.2, rh.74, AAV2.5, AAV-TT, Anc80의 혈청형도 보고되어 있다. 본 개시의 AAV 벡터는, 표적 조직에 따라서 적합한 혈청형의 AAV에 기초하여 제작되어도 된다. 예를 들어 (혈청형):(표적 조직)의 관계는 이하와 같이 선택되어도 된다; (AAV1):(근육, 간장, 기도, 신경 세포), (AAV2):(근육, 간장, 신경 세포), (AAV3):(근육, 간장, 신경 세포), (AAV4):(근육, 뇌실 상의 세포(ventricular ependymal cell)), (AAV5):(근육, 간장, 신경 세포, 글리아 세포, 기도), (AAV6):(근육, 간장, 기도, 신경 세포), (AAV7):(근육, 간장), (AAV8):(근육, 간장), (AAV9):(근육, 간장, 기도). AAV 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela, Sf9 등의 세포를 들 수 있다. AAV의 캡시드로서, 야생형 이외에, 표적화 변이를 추가한 캡시드(AAV2i8, AAV2.5, AAV-TT, AAV9.HR 등), 랜덤 변이를 추가한 캡시드(AAV-PHP.B 등), 인실리코에서 설계한 캡시드(Anc80 등)를 들 수 있고, 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 AAV 벡터는 이들의 개변 캡시드를 포함해도 되며, 본 개시의 AAV 벡터 플라스미드는 이들의 개변 캡시드를 코드하도록 구축되어도 된다. 본 명세서에 있어서, 핵산 서열이 특정한 혈청형에서 유래한다고 기재하는 경우, 핵산 서열은, 야생형의 캡시드를 코드해도 되고, 야생형의 캡시드에 기초하여 상기와 같은 개변이 실시된 캡시드를 코드해도 되는 것이 의도된다.
·레트로 바이러스 벡터.
본 명세서에 있어서, "레트로 바이러스"는, 일반적으로 RNA 종양 바이러스과의 바이러스를 가리킨다. 레트로 바이러스는, 주로 게놈을 RNA로부터 DNA로 역전사하는 능력을 특징으로 하는 이중쇄 RNA 엔벨로프 바이러스이다. 비리온의 길이는 직경 약 100 내지 120nm이며, 뉴클레오캡시드 단백질과 복합체를 형성한 동일한 플러스 RNA쇄의 2량체 게놈을 함유한다. 게놈은, 바이러스 감염에 필요한 효소 단백질, 즉 역전사 효소, 인테그라아제 및 프로테아제를 함유하는 캡시드에 봉입되어 있다. 매트릭스 단백질이, 바이러스 핵 입자의 둘레를 둘러싸는, 숙주 세포막에서 유래하는 지질 이중층인 엔벨로프와 상호 작용하는 캡시드 코어의 외측의 층을 형성한다. 이 이중층에는, 숙주 세포 상의 특이적 수용체를 인식하고, 감염 프로세스를 개시시키는 바이러스 엔벨로프 당단백질이 고정되어 있다. 엔벨로프 단백질은, 단백질을 지질막 내에 고정시키는 막관통(TM)과 세포 수용체에 결합하는 표면(SU)의 2개의 서브 유닛에 의해 형성된다.
레트로 바이러스로서, 마우스 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역 부전 바이러스(HIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 아우스(Rous) 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 마우스 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니(Moloney) 마우스 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손(Abelson) 마우스 백혈병 바이러스(A-MLV), 새 골수 세포종증 바이러스 29(MC29) 및 새 적아구증 바이러스(AEV) 및 렌티 바이러스를 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 렌티 바이러스는, "영장류" 및 "비영장류"로 나눌 수 있다. 영장류 렌티 바이러스의 예로서는, 인간 후천성 면역 부전 증후군(AIDS)의 원인 물질인 인간 면역 부전 바이러스(HIV) 및 원숭이 면역 부전 바이러스(SIV)를 들 수 있다. 비영장류 렌티 바이러스 군에는, 프로토 타입 "지발성 바이러스"의 비스나/마에디 바이러스(VMV), 그리고 관련되는 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 보다 최근에 기술된 고양이 면역 부전 바이러스(FIV) 및 소 면역 부전 바이러스(BIV)가 포함된다.
감염 프로세스 동안, 레트로 바이러스는 처음에 특정한 세포 표면 수용체에 부착된다. 감수성의 숙주 세포에 침입하면, 레트로 바이러스 RNA 게놈은, 역전사 효소에 의해 DNA에 카피된다. 이 DNA는 숙주 세포핵에 수송되고, 이어서 숙주 게놈에 도입되고, 이 상태는 프로 바이러스라고 불린다. 프로 바이러스는, 세포 분열 중인 숙주 염색체에 있어서 안정적이고, 다른 세포 단백질과 유사하게 전사된다. 프로 바이러스는, 보다 많은 바이러스를 제작하기 위하여 필요한 단백질 및 패키징 기구를 코드하고, 출아하여 세포로부터 떨어질 수 있다. 레트로 바이러스가 숙주 세포로부터 출아하면, 그것들은 숙주 세포 지질막을 포함한다. 이와 같이 하여, 숙주 세포 유래 막단백질이 레트로 바이러스 입자의 일부가 된다.
레트로 바이러스의 게놈은, gag(군 특이적 항원), pro(프로테아제), pol(폴리메라아제) 및 env(엔벨로프)의 4개의 유전자를 포함한다. gag 서열은, 매트릭스 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질 및 캡시드 단백질의 3개의 주요한 구조 단백질을 코드한다. pro 서열은, 입자의 집합, 출아 및 성숙의 사이에 Gag 및 Gag-Pol을 절단하는 역할을 담당하는 프로테아제를 코드한다. pol 서열은, 역전사 효소 및 인테그라아제의 효소를 코드하고, 전자는, 감염 프로세스의 사이에 바이러스 게놈의 RNA로부터 DNA로의 역전사를 촉매하고, 후자는 LTR을 프로세싱하고, 프로 바이러스 DNA를 숙주 세포 게놈에 도입시키는 역할을 담당한다. env 서열은, 엔벨로프 당단백질의 SU 및 TM 서브 유닛의 양쪽을 코드한다. 레트로 바이러스가 특이적인 세포 표면 수용체를 사용하여 그 표적 숙주 세포에 결합하는 능력은 Env 단백질의 표면 성분(SU)에 의해 부여되지만, 레트로 바이러스가 막융합을 통하여 세포에 진입하는 능력은, 막 앵커형 막관통 성분(TM)에 의해 부여될 수 있다. 레트로 바이러스 게놈은, 유전자 발현, 역전사 및 숙주 세포 염색체로의 도입을 촉진하기 위하여 필요한 요소를 함유하고, 이 요소로서, 2개의 LTR(긴 말단 반복), 새롭게 형성하는 비리온으로의 바이러스 RNA의 특이적 패키징에 필요한 패키징 시그널(Ψ) 서열 및 역전사의 사이에 플러스쇄 DNA 합성을 개시하는 부위로서 기능하는 폴리퓨린 트랙트(polypurine tract; PPT)와 같은 비코딩 시스 작용성 서열을 들 수 있다. 장쇄 말단 반복(LTR)은 약 600nt의 길이이며, 그중 U3 영역이 450, R 서열이 100, U5 영역이 약 70nt의 길이이다.
렌티 바이러스 등의 복합 레트로 바이러스의 게놈은, gag, pro, pol 및 env에 더하여 바이러스 유전자 발현, 감염성 입자의 집합을 조절하고, 감염 세포에 있어서의 바이러스 복제를 모듈레이트하는 악세서리 유전자를 포함할 수 있다. 대표적인 렌티 바이러스는 HIV-1이다. 렌티 바이러스는 2개의 제어 유전자, tat 및 rev를 포함할 수 있다. 예를 들어 HIV-1은 vif, vpr, vpu 및 nef를 더 포함한다. 그 밖에도 vpx 등의 악세서리 유전자가 존재한다. 이러한 악세서리 유전자는, 바이러스 RNA의 합성 및 프로세싱 그리고 다른 복제 기능의 제어에 관여하고 있다. 특히, HIV는 그 밖에도 구조적 랜드마크(TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, INS) 등을 포함한다. 렌티 바이러스 입자는, p24의 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 목적으로 하는 유전자의 사이에 primer binding site(PBS) 및/또는 폴리퓨린 트랙트(PPT)를 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자 및 3'LTR의 사이에 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트(WPRE)를 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 예를 들어 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자는, 프로듀서 세포의 염색체에 코드되어 있어도 되고, 프로듀서 세포에 도입되는 다른 핵산 분자(예를 들어 플라스미드)에 코드되어 있어도 되고, 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자의 유전자 산물(바이러스 입자의 형태이어도 된다)이 프로듀서 세포에 도입되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로듀서 세포에 도입되는 본 개시의 벡터 플라스미드와는 다른 핵산 분자는, 5'LTR, 패키징 시그널(ψ) 서열 및 3'LTR 중의 1개 또는 복수개를 결손하고 있어도 되고, 탑재 핵산이 이 핵산 유래의 핵산을 포함하는 것이 회피될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터의 구축 시에, env를 VSV-G(수포성 구내염 바이러스(VSV)의 당단백질 G)를 코드하는 유전자와 교환해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터(렌티 바이러스를 포함함) 플라스미드는, VSV-G 유전자를 추가로 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터(렌티 바이러스를 포함함)의 구축 시에, env에 더하여 또는 이것과 치환하여 광견병 바이러스의 당단백질 유전자(RV-G) 또는 RV-G의 세포 내 도메인을 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G)의 것으로 치환한 융합 당단백질(FuG-B)을 사용해도 되고, 레트로 바이러스 벡터(렌티 바이러스를 포함함) 플라스미드는, 이것들의 유전자를 포함해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 5'LTR, 패키징 시그널(Ψ) 서열, gag, pro, pol, env 및 3'LTR일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, gag, pro, pol, env 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다. pol은, 레트로 바이러스의 복제에 필요한 유전자일 수 있으므로, 이것을 결손시킨 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 감염 세포에 있어서의 복제 능력이 저감될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 레트로 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 목적으로 하는 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, LTR의 U3 영역이 결손하도록 개변되어 있어도 된다. 레트로 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, HEK293T 등의 세포를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 5'LTR, 패키징 시그널(Ψ) 서열, rev, gag, pro, pol, env 및 3'LTR일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, rev, gag, pro, pol, env 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 pro)를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다. pol 및 rev는, 렌티 바이러스의 복제에 필요한 유전자일 수 있으므로, 이것들을 결손시킨 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, 감염 세포에 있어서의 복제 능력이 저감될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, tat, vif, vpr, vpu, nef, vpx, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, INS, APP, MAAP, RPE, PPT, PRE, WRPE, oPRE 중의 1개 또는 복수개를 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 렌티 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)를 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'LTR 및 3'LTR의 사이에 목적으로 하는 유전자, 프로모터, 터미네이터 및 WPRE를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 렌티바이러스 벡터 플라스미드는, LTR의 U3 영역, TAT가 결손하도록 개변되어 있어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, LTR의 U3 영역이 결손하도록 개변되어 있어도 된다. 렌티 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, HEK293T, HEK293, Hela 등의 세포를 들 수 있다.
·단순 헤르페스 바이러스 벡터
단순 헤르페스 바이러스(HSV)는 헤르페스 바이러스과, 알파 헤르페스 바이러스아과, 심플렉스 바이러스속의 바이러스이다. HSV 입자는 직경 약 100nm이며, 정20면체의 캡시드가 엔벨로프로 덮인 구조를 갖는다. 캡시드의 내부에는, 약 150kbp의 직쇄상의 2중쇄 DNA가 패키징되어 있고, 바이러스 DNA 게놈에는 적어도 74종의 바이러스 단백질이 코드되어 있다. 이것들 바이러스 단백질을 코드하는 유전자는 발현 시기에 따라서 3군(α,β,γ)으로 분류되고, 각각의 발현은 캐스케이드상으로 제어되고 있다. α 유전자군에는 α0, α4, α22, α27, α47이 포함되고,α0, α4, α22, α27은 다른 바이러스 유전자의 발현 제어를 행하는 단백질을 코드하고 있다. α 유전자가 발현되면, 이것들 유전자 산물이 β 유전자군의 발현을 활성화한다. β 유전자군은 DNA 폴리메라아제 복합체, DNA 프리마아제/헬리카아제 복합체 등의 바이러스 DNA 복제에 필수적인 단백질이나 티미딘키나아제 (TK), 리보뉴클레오티드 환원 효소 등의 데옥시리보뉴클레오티드 대사에 관계되는 효소군을 주로 코드한다. 그 후, 바이러스 입자의 구조 단백질을 코드하는 γ 유전자군이 발현되어, 새로운 감염성 바이러스가 생산된다.
지각 신경 종말로부터 침입한 바이러스 입자는 축색 내를 상향하고, 신경 세포의 핵에 도달하고, 거기에서 증식을 개시 또는 잠복한다. 지각 신경절에 잠복 중인 HSV는 감염성 바이러스를 생산하지 않고, 바이러스 게놈으로부터는 LAT(latency associated transcript)라고 불리는 전사물이 유일하게 항상적으로 발현된다. LAT의 프로모터인 LAP(latency active promoter)는 신경 세포에 있어서 영속적인 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터이며, 이것은 신경 세포를 표적으로 한 유전자 치료에서 유용할 수 있다. 잠복 감염되어 있는 신경 세포 HSV는, 재활성화되어 축색 내에서 원심성으로 수송되어 피부, 점막에 회귀 발증을 일으킬 수 있다.
HSV 벡터의 이점으로서는, (1) 숙주 영역이 넓어 대부분의 배양 세포에 감염되어 증식한다, (2) 분열·비 분열 세포의 양쪽에 감염이 가능하다, (3) 외래성 유전자를 탑재할 수 있는 허용량이 크다, (4) 자가 TK를 보유하고 있기 때문에, 항바이러스제 아시클로버나 간시클로버가 유효하고, 설령 예기치 못한 증식이 일어나도 치료가 가능하다, (5) 신경 세포 내에서는 에피솜으로서 안정적으로 존재하고, 프로모터에 따라서는 장기간에 걸쳐 유전자 발현을 지속할 수 있다, (6) 마우스에 대하여 인간과 동일한 병원성을 나타내고, 모델 동물로서 이용할 수 있다는 것 등을 들 수 있다. 또한, 세포 상해성이 강한 것은 종양의 치료를 위하여 유익할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자의 상류에 DNA 복제 개시 기점(ori)을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, LAP를 포함할 수 있고(예를 들어 ori와 목적으로 하는 유전자와의 사이에), 그렇게 함으로써 HSV 벡터의 숙주 세포에 있어서 도입한 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 예를 들어 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자는, 프로듀서 세포의 염색체에 코드되어 있어도 되고, 프로듀서 세포에 도입되는 다른 핵산 분자(예를 들어 플라스미드)에 코드되어 있어도 되고, 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자의 유전자 산물(바이러스 입자의 형태이어도 된다)이 프로듀서 세포에 도입되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로듀서 세포에 도입되는 본 개시의 벡터 플라스미드와는 다른 핵산 분자는, pac 및 DNA 복제 개시 기점(ori) 중의 1개 또는 복수개를 결손하고 있어도 되고, 탑재 핵산이 이 핵산 유래의 핵산을 포함하는 것이 회피될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, HSV의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, UL9, UL19, UL26, UL35, US6, US7, US11을 코드하는 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, α0, α22, α47 중의 1개 또는 복수개 이외의 HSV의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, α22 이외의 HSV의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, α0, α4, α22, α27, α47 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, α4 및 α27 유전자 중의 한쪽 또는 양쪽을 결손한다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, ICP6을 결손한다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, α4, α22 및 α27을 결손한다.
하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터는 약독화하도록 개변될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, 티미딘키나아제(TK), 리보뉴클레오티드 환원 효소(RR), 디옥시유리딘트리포스파타아제(dUTPase), γ34.5 중의 1개 또는 복수개를 결손하도록 개변될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, HSV 벡터 플라스미드는, γ34.5 결손 개소에 사이토카인(면역 활성화 사이토카인 등)을 코드하는 유전자를 도입하도록 개변될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 이러한 유전자를 결손하는 HSV 벡터 플라스미드를 포함하는 프로듀서 세포에 이러한 유전자를 공급하지 않고 HSV 벡터를 생산시킴으로써, 이것들을 결손하는 HSV 벡터가 얻어질 수 있다. 예를 들어 TK는 암 세포에 있어서 고도로 발현할 수 있으므로, TK 결손 HSV 벡터는, 암 세포 선택적으로 기능할 수 있다. HSV 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, Hela, Vero 등의 세포를 들 수 있다.
·센다이 바이러스 벡터
센다이 바이러스(SeV)는 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae) 레스피로 바이러스속(Respirovirus)으로 분류되는 마이너스쇄 RNA 바이러스이다. 센다이 바이러스는 뉴런을 포함하는 비분열 세포에도 감염될 수 있다. 센다이 바이러스의 감염 후, 바이러스 게놈은 숙주 세포의 염색체에 도입되지 않고 RNA의 상태로 세포질에 머무른다.
센다이 바이러스의 단백질을 코드하는 유전자로서는, N, P, M, F, HN 및 L 유전자를 들 수 있다. N, P, M, F, HN 및 L 유전자는, 각각 뉴클레오캡시드, 포스포, 매트릭스, 퓨전, 헤마글루티닌·뉴라미니다아제 및 라지 단백질을 코드한다. 일반적으로 야생형 센다이 바이러스의 게놈 상에는, 3'의 짧은 리더 영역(LE)에 이어서 N(뉴클레오캡시드 단백질), P(포스포 단백질), M(매트릭스 단백질), F(퓨전 단백질), HN(헤마글루티닌·뉴라미니다아제) 및 L(라지 단백질)을 코드하는 6개의 유전자가 나란히 배치되어 있고, 다른 단부에 짧은 5' 트레일러 영역(TR)이 존재한다. P 유전자의 영역으로부터는 C 및 V라고 불리우는 악세서리 단백질도 번역된다.
센다이 바이러스는, 숙주 세포의 세포질에 있어서의 튜불린 및 센다이 바이러스의 RNA 폴리메라아제(L 단백질)의 양쪽에 의해 유전자를 발현한다. 센다이 바이러스는, 숙주 세포의 게놈과 상호 작용하지 않고, 인간에 대하여 병원성이 아니다. 센다이 바이러스의 이러한 특징은, 센다이 바이러스 벡터의 인간에게 대한 안전성을 시사한다. M 단백질, F 단백질 및 HN 단백질은, 센다이 바이러스의 바이러스 입자의 형성 및 바이러스 감염을 담당할 수 있다. N 단백질, P 단백질 및 L 단백질은, 바이러스 게놈의 발현 및 복제를 담당할 수 있다.
하나의 실시 형태에서는, 프로듀서 세포에서 센다이 바이러스 벡터 플라스미드로부터 전사된 핵산은, 센다이 바이러스 벡터의 탑재 핵산이 된다. 그 때문에, 이하의 센다이 바이러스 벡터 플라스미드에 관한 특징은, 센다이 바이러스 벡터의 탑재 핵산의 특징일 수도 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에서는, 목적으로 하는 유전자는, 센다이 바이러스 유전자(N, P, M, F, HN 및 L 유전자) 중 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에서는, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자의 상류 또는 하류에 EIS 서열(전사 종결(E) 서열-개재(I) 서열-전사 개시(S) 서열)을 포함할 수 있고, 그렇게 함으로써 목적으로 하는 유전자의 상류 또는 하류의 유전자 발현이 촉진될 수 있다. 하나의 실시 형태에서는, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 6의 배수 염기수를 갖는 서열(예를 들어 목적으로 하는 유전자를 포함하는 서열)을 삽입하도록 개변될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 센다이 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, LE 및 TR의 사이에 센다이 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, N, P, V, C, M, F, HN, L의 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, M, F 및 HN 중의 1개 또는 복수개 이외의 센다이 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. M, F 및 HN 유전자 중의 1개 또는 복수개를 결손하는 센다이 바이러스 벡터 플라스미드를 사용하는 경우, 탑재 핵산은 숙주에 있어서의 전파성을 상실할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, M, F 및 HN 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 박테리오파지 T7의 RNA 폴리메라아제를 코드하는 유전자를 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 자기 절단 리보자임 Rbz를 포함해도 된다.
하나의 실시 형태에서는, 센다이 바이러스 단백질의 항원성을 저하시키기 위하여 또는 RNA의 전사 효율 및 복제 효율을 높이기 위해서, 센다이 바이러스 유전자를 개변해도 된다. 하나의 실시 형태에서는, 전사 또는 복제의 기능을 증강시키기 위해서, 복제 인자인 N 유전자, P 유전자 및 L 유전자의 1개 또는 복수개를 개변해도 된다. 하나의 실시 형태에서는, 구조 단백질인 HN 단백질을 개변해도 되고, 그렇게 함으로써 헤마글루티닌 활성 및/또는 뉴라미니다아제 활성이 변화할 수 있고, 헤마글루티닌 활성을 약화시킴으로서 혈중의 바이러스의 안정성이 향상될 수 있고, 뉴라미니다아제 활성이 변화함으로써 바이러스 감염성이 변화할 수 있다. 하나의 실시 형태에서는, 막 융합에 관계되는 F 단백질을 개변해도 된다. 하나의 실시 형태에서는, 악세서리 유전자인 V 유전자를 결손 시키도록 개변해도 된다. 센다이 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, BHK/T7 등의 세포를 들 수 있다.
·홍역 바이러스 벡터
홍역 바이러스는, 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae) 모르빌리 바이러스속으로 분류되는 RNA 바이러스이다. 홍역 바이러스는, 센다이 바이러스와 마찬가지로, N, P, M, F, H 및 L 유전자를 갖는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 홍역 바이러스 벡터 플라스미드는, 홍역 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에서는, 목적으로 하는 유전자는, 홍역 바이러스 유전자의 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 센다이 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 홍역 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 홍역 바이러스의 모든 유전자일 수 있다.
·알파 바이러스 벡터
본 명세서에 있어서, "알파 바이러스"란, 토가 바이러스과 알파 바이러스속의 바이러스를 가리킨다. 알파 바이러스는, 엔벨로프를 갖는 RNA 바이러스이며, DNA의 중간체를 거치지 않고 세포질에서 증식하고, 라미닌 수용체 등을 통하여 여러 가지 세포에 감염시킬 수 있다. 알파 바이러스의 게놈은, 단일쇄의 메신저 센스 RNA이며, 5'말단에 있어서 메틸화 캡으로 수식되고 있고, 3'말단에 있어서 여러 가지 길이의 폴리(A)쇄로 수식되어 있다. 바이러스 입자는, 20면체의 뉴클레오캡시드 중에 RNA 게놈을 포함하는 구조를 갖는다. 알파 바이러스의 게놈은, nsp1, nsp2, nsp3 및 nsp4의 비구조 단백질을 코드하는 유전자, 그리고 캡시드(C) 단백질, E1 당단백질 및 E2 당단백질의 구조 단백질을 코드하는 유전자를 포함한다. 알파 바이러스로서, 베네수엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 신드비스 바이러스, 로스리버 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, S.A.AR86, 에버글레이즈 바이러스, 무캄보 바이러스, 버마 삼림 바이러스, 미들버그 바이러스, 픽스나 바이러스, 오뇽뇽 바이러스, 게타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 우나 바이러스, 아우라 바이러스, 와타로아 바이러스, 바반키 바이러스, 키질라가체(kyzylagach) 바이러스, 하이랜드 J 바이러스, 포트·모건 바이러스, 엔두무(Ndumu) 바이러스, 부기·크릭(Buggy Creek)바이러스 등을 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터 플라스미드는, 알파 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, nsp1, nsp2, nsp3, nsp4의 어느 것의 사이에 배치되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 알파 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 예를 들어 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자는, 프로듀서 세포의 염색체에 코드되어 있어도 되고, 프로듀서 세포에 도입되는 다른 핵산 분자(예를 들어 플라스미드)에 코드되어 있어도 되고, 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자의 유전자 산물(바이러스 입자의 형태이어도 된다)이 프로듀서 세포에 도입되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로듀서 세포에 도입되는 본 개시의 벡터 플라스미드와는 다른 핵산 분자는, 5'알파 바이러스 복제 인식 서열자 및 3'알파 바이러스 복제 인식 서열 중의 1개 또는 복수개를 결손하고 있어도 되고, 탑재 핵산이 이 핵산 유래의 핵산을 포함하는 것이 회피될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 알파 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'알파 바이러스 복제 인식 서열, nsp1, nsp2, nsp3, nsp4 및 3' 알파 바이러스 복제 인식 서열 이외의 알파 바이러스 유전자 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 알파 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다.
·광견병 바이러스 벡터
광견병 바이러스는, 랍도 바이러스과 리사 바이러스속의 마이너스쇄의 단일쇄 RNA 바이러스이며, 바이러스 입자는 탄환과 같은 형상을 한 원통형이다. 원통의 길이는 약 180nm, 직경 약 75mm이다. L(라지 단백질), G(당단백질), N(뉴클레오 단백질), P(포스포 단백질), M(매트릭스 단백질)을 코드하는 5개의 유전자를 갖는다. 이 중 G 단백질이 감염성에 관련될 수 있다. 광견병 바이러스의 게놈은, 리더 부위로부터 N, P, M, G, L의 순으로 유전자가 나열되어 있다. Leader 부위와 가까운 유전자일수록 발현량이 증대할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 광견병 바이러스 벡터 플라스미드는, 광견병 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, N, P, M, G, L 유전자 중 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 광견병 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 광견병 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에 있어서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 광견병 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 광견병 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 광견병 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 광견병 바이러스 벡터 플라스미드는 N, P, M, G, L 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 된다.
·수포성 구내염 바이러스 벡터
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 랍도 바이러스과 베시쿨로 바이러스속의 RNA 바이러스이고, 약 11kb로 이루어지는 마이너스 단일쇄 RNA 게놈을 유지하고 있다. 수포성 구내염 바이러스(VSV)는 광견병 바이러스와 마찬가지로 L(라지 단백질), G(당단백질), N (뉴클레오 단백질), P(포스포 단백질), M(매트릭스 단백질)을 코드하는 5개의 유전자를 갖는다.
하나의 실시 형태에 있어서, VSV 벡터 플라스미드는, VSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, N, P, M, G, L 유전자 중 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, VSV 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 VSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, VSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, VSV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, VSV의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, VSV 벡터 플라스미드는, N, P, M, G, L 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 된다.
. 코로나 바이러스 벡터
코로나 바이러스(CoV)과의 바이러스의 바이러스 입자는, 직경 약 80 내지 100nm의 원형(구형)을 나타내고, 뉴클레오캡시드를 감싸는 엔벨로프에는, 스파이크(S) 단백질, 막 내재성(M) 단백질, 엔벨로프(E) 단백질이 존재한다. CoV의 게놈에는, 약 30kb의 (+)쇄 RNA이며, 5'측에서 1a 및 1b의 비구조 단백질을 코드하는 유전자, 그 하류의 구조 유전자인 S, E, M, N 유전자가 존재하는데, S 유전자의 바로 아래 영역에도 몇 개의 비구조 단백질의 유전자가 존재한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터 플라스미드는, 코로나 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터 플라스미드는, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 코로나 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 코로나 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 코로나 바이러스 벡터 플라스미드는, 1a, 1b 이외의 코로나 바이러스 유전자 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 아데노 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은 이것들을 포함한다.
·인플루엔자 바이러스 벡터
인플루엔자 바이러스는, 오르토믹소 바이러스과에 속하는 마이너스쇄 RNA 게놈을 갖는 엔벨로프 바이러스이다. A형 인플루엔자 바이러스의 게놈은, 8개로 분절화되어 있고, 11종의 단백질(PB1, PB2, PA, HA, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP, NP)이 코드된다. 인플루엔자 바이러스 RNA의 5'말단 비번역 영역, 3'말단 비번역 영역 및 번역 영역의 양단이 패키징 서열일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 인플루엔자 바이러스 벡터 플라스미드는, 분절화된 인플루엔자 바이러스 RNA의 5'말단 비번역 영역, 번역 영역의 5' 단부, 목적으로 하는 유전자, 번역 영역의 3' 단부 및 3'말단 비번역 영역을 포함할 수 있다. 여기서, 인플루엔자 바이러스의 유전자는 제거해도 되고, 유지해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레트로 바이러스 벡터 플라스미드는, 인플루엔자 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 인플루엔자 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, PB1, PB2, PA, HA, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP 및 NP일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 인플루엔자 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 인플루엔자 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 인플루엔자 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다.
·백시니아 바이러스 벡터
백시니아 바이러스는, 폭스 바이러스과에 속하고, 약 190Kbp의 직쇄 이중쇄 DNA 게놈을 갖는 엔벨로프 바이러스이다. 백시니아 바이러스는, 숙주 세포의 세포질에서만 복제된다. 바이러스 DNA 복제 중에, 백시니아 바이러스는, 외막이 다른 몇 종류의 감염형: 세포 내 성숙 비리온(IMV), 세포 내 엔벨로프 비리온(IEV), 세포 결합성 엔벨로프 비리온(CEV) 및 세포 외 엔벨로프 비리온(EEV)을 생산한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터 플라스미드는, 백시니아 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, D1R, D2L, D3R, D4R, D5R, D6R, D7R, D8L, D11L, D13L 유전자를 코드할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터 플라스미드는, 티미딘 키나아제를 코드하는 유전자가 결손되어 있어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터는, 벡터 플라스미드를, 백시니아 바이러스를 감염시킨 프로듀서 세포 중에 도입하고, 그 세포 중에서 상동 재조합을 발생시킴으로써 제작할 수 있다. 이 실시 형태에 있어서 사용하는 백시니아 바이러스 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자 및 백시니아 바이러스의 게놈의 어느 영역에 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터 플라스미드는, 백시니아 바이러스 게놈 및 백시니아 바이러스 유전자의 어느 것 사이의 목적으로 하는 유전자를 포함할 수 있다.
·레오 바이러스 벡터
레오 바이러스과의 바이러스는, 직경 약 60 내지 80nm의 정20면체 구조의 비리온을 가지며, 10 내지 12개의 선상의 이중쇄 RNA의 게놈을 가지며, 엔벨로프를 갖지 않는 RNA 바이러스이다. 레오 바이러스과의 바이러스에는, 로타 바이러스, 포유류 오르토레오 바이러스(MRV) 등이 포함된다. MRV는 4개의 혈청형, MRV-1, MRV-2, MRV-3, MRV-4형으로 분류된다. 10개의 분절 dsRNA 게놈은, 8개의 구조 단백질, λ1(L3 유전자), λ2(L2 유전자), λ3(L1 유전자), μl(M2 유전자), μ2(M1 유전자), σ1(S1 유전자), σ2(S2 유전자), σ3(S4 유전자)및 4개의 비구조 단백질, μNS(M3 유전자), μNSC(M3 유전자), σNS(S3 유전자), σ1s(S1 유전자)를 코드한다. MRV는 2층 구조의 캡시드로 구성되고, 외각은 μl, σ3, σ1로 구성되고어, 내각(코어 구조)은 λ1, λ2, σ2로 구성된다. 코어 입자 내에는 10개의 분절 게놈에 더하여, RNA 의존성 RNA 폴리메라아제인 λ3 및 폴리메라아제 코팩터가 되는 μ2가 포함된다. 비구조 단백질 μNS는, 복제의 장소인 VF의 형성에 중심적인 역할을 담당하고 있고, 여러 가지 MRV 단백질과 결합하여 VF 내에 리크루트한다. μNSC는 배양 세포에서의 복제에는 필수적이지 않을 가능성이 있다. σNS는, μNS와 상호 작용하고, 단일쇄 RNA에 높은 결합능을 갖고, 플러스쇄 바이러스 RNA의 VF 내로의 리크루트에 관여할 수 있다. σ1s는 바이러스의 복제에 필수는 아니지만, 병원성에 관여할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터 플라스미드는, 레오 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터 플라스미드는, L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터 플라스미드는, μNSC 및 σ1s 중 적어도 하나를 코드하지 않아도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 레오 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 레오 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 레오 바이러스 벡터 플라스미드는, L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S3, S4 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 된다. 레오 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, L929 등의 세포를 들 수 있다.
·콕사키 바이러스 벡터
콕사키 바이러스는, 피코루나 바이러스과 엔테로 바이러스속에 속하는, 엔벨로프를 갖지 않는 직쇄의 단일쇄 플러스쇄 RNA 바이러스이다. 엔테로 바이러스인 콕사키 바이러스는, 5'부터 3'에 걸쳐서, VP0(VP4 및 VP2), VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D의 유전자로 구성되고, VP 유전자가 캡시드를 코드하고, 그 밖의 유전자는 비구조 단백질을 코드한다. VP4는, VP2의 아미노 말단과 같은 거동을 나타낸다.
하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터 플라스미드는, 콕사키 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, VPO, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D 유전자 중 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 콕사키 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 콕사키 바이러스의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D, VP1, VP2, VP3, VP4일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 콕사키 바이러스 벡터 플라스미드는, VPO, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 된다. 콕사키 바이러스 벡터를 생산하기 위한 프로듀서 세포로서, H1299, HeLa 등의 세포를 들 수 있다.
·뉴캐슬병 바이러스 벡터
뉴캐슬병 바이러스(NDV)은 파라믹소 바이러스과로 분류되고, 엔벨로프를 갖는 선상의 마이너스 단일쇄의 RNA 바이러스이다. NDV의 게놈 RNA는, 3'부터 5'에 걸쳐서, 뉴클레오캡시드 단백질(NP), 포스포 단백질(P), 매트릭스 단백질(M), 융합 단백질(F), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN), 라지 단백질(L)의 유전자를 포함한다. 게놈 RNA는, 3'말단에 리더 서열도 포함한다. 융합 단백질(F)은 내재성 막단백질이며, 활성화되어 바이러스 엔벨로프와 숙주 세포막의 융합을 촉진한다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스 구축에 관여하고, 바이러스막 및 뉴클레오캡시드 단백질과 상호 작용한다. 뉴클레오캡시드 단백질(NP)은 뉴클레오캡시드의 주요한 단백질이며, 포스포 단백질(P) 및 라지 단백질(L)과 회합한다. 포스포 단백질(P)은 인산화 처리되어, 전사 조절이나 메틸화, 인산화 및 폴리아데닐화에 관여할 수 있다. 라지 단백질(L) 유전자는, RNA 의존성 RNA 폴리메라아제를 코드하고, P 단백질과 함께 바이러스 RNA 합성에 필요하다.
하나의 실시 형태에 있어서, NDV 벡터 플라스미드는, NDV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중의 적어도 1개 및 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 목적으로 하는 유전자는, NP, P, M, F, HN, L 유전자 중 어느 것의 상류 및/또는 하류에 위치될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, NDV 벡터 플라스미드는, 벡터 플라스미드 및 프로듀서 세포가 NDV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열을 포함하는 프로듀서 세포에서 기능하도록 구성된다. 하나의 실시 형태에 있어서, NDV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열 중 벡터 플라스미드에 포함되지 않는 유전자 또는 그 유전자 산물 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 모두)는 벡터 플라스미드와 트랜스로 프로듀서 세포에 공급될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, NDV 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열은, NDV의 모든 유전자일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, NDV 벡터 플라스미드는, NP, P, M, F, HN, L 중의 1개 또는 복수개를 포함하지 않아도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 본 개시의 바이러스 벡터의 집단을 포함하는 바이러스 벡터 함유 조성물을 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 바이러스 벡터 함유 조성물은, 전체 바이러스 벡터 입자 중 핵산을 포함하지 않는 바이러스 벡터 입자가, 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하 또는 약 50% 이하일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 바이러스 벡터 함유 조성물은, 전체 바이러스 벡터 입자 중, 목적으로 하는 핵산 이외의 본 개시의 플라스미드 유래의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자가, 약 10% 이하, 약 7% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하일 수 있다.
(OGAB법)
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드는, OGAB법에 의해 제작될 수 있다. OGAB(Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis)법은, 집적 핵산을 형질 전환 생물에 도입시킴으로써 이 생물에 있어서 환상의 플라스미드를 생성하는 방법이다. OGAB법은, 반드시 고초균(Bacillussubtilis)을 사용할 필요는 없고, 비환상의 장쇄 핵산을 도입하고, 플라스미드를 생성할 수 있는 임의의 생물을 사용할 수 있고, 이러한 생물을 본 명세서에서는 "형질 전환 생물"이라고 칭한다. OGAB법으로는, 큰 사이즈의 핵산을 포함하는 플라스미드가 간편하게 제조될 수 있다. 형질 전환 생물에 도입시키는 핵산을 본 명세서에서는 "집적 핵산"이라고 칭하고, 전형적으로는, 집적 핵산은, 동일한 방향으로 플라스미드의 1단위와, 1세트의 단위 핵산이 반복하여 나타나는 탠덤 리피트상의 구조를 갖고, 이러한 구조의 집적 핵산을 사용함으로써 형질 전환 생물에 있어서의 플라스미드의 생성이 촉진될 수 있다.
이하에서, 형질 전환 생물에 도입시키기 위한 집적 핵산의 제작 절차를 설명한다.
·단위 핵산의 제조
집적 핵산에 도입하기 위한 단위 핵산을 제조한다. 단위 핵산은 임의의 공지된 방법에 의해 제작할 수 있고, 예를 들어 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)이나 화학 합성에 의해 제작할 수 있다. 단위 핵산은, 목적으로 하는 단백질(치료용 단백질, 바이러스 벡터를 구성하는 단백질 등)을 코드하는 서열 또는 그 부분, 유전자를 제어하는 서열(프로모터, 인핸서 등), 핵산을 조작하기 위한 서열(제한 효소 인식 서열 등) 등 임의의 목적으로 하는 서열을 가질 수 있다. 집적 핵산에 도입했을 때에, 복수 종류의 단위 핵산이 특정한 순번 및/또는 특성의 방향으로 나란하도록 각각의 단위 핵산의 말단은, 특정한 돌출 서열을 발생시키도록 구성될 수 있다.
최종적으로 플라스미드 상에 다수의 단위 핵산이 집적될 수 있으므로, 1개 또는 복수개의 단위 핵산은 염기 길이가 긴 1개 또는 복수개의 유전자를 코드하도록 설계되어도 된다. 염기 길이가 긴 유전자로서는, 예를 들어 일련의 대사 경로를 구성하는 유전자군 등을 들 수 있다.
·단위 벡터의 제조
단위 핵산과, 그것과는 다른 부가 핵산을 연결함으로써 단위 벡터를 제조할 수 있다. 단위 벡터를 사용함으로써 단위 핵산을 보다 용이하게 취급하는 것이 가능해질 수 있다.
부가 핵산은, 직쇄상 핵산이어도 되고, 환상의 플라스미드이어도 된다. 환상의 플라스미드를 부가 핵산으로서 사용하는 경우, 단위 벡터도 환상 구조를 가질 수 있기 때문에, 예를 들어 대장균 등의 형질 전환에 사용할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 도입된 숙주 중에서 단위 벡터가 복제되도록, 부가 핵산은 복제 개시점을 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 어떤 집적 핵산을 구축하기 위한 모든 단위 핵산은, 동일 종류의 부가 핵산에 연결해도 되고, 그렇게 함으로써 단위 벡터간의 사이즈 차이를 작게 하여, 복수 종류의 단위 벡터의 취급이 용이해질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 어떤 집적 핵산을 구축하기 위한 단위 핵산은, 다른 종류의 부가 핵산에 연결해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 어떤 집적 핵산을 구축하기 위한 1개 또는 복수개의 단위 핵산에 대해서, (단위 핵산의 염기 길이)/(단위 벡터의 염기 길이)의 비율 또는 그 평균은, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 7% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 1.5% 이하, 1% 이하 또는 0.5% 이하일 수 있다. 부가 핵산의 사이즈가 단위 핵산보다 클수록, 다른 종류의 단위 벡터의 보다 균일한 취급이 가능해질 수 있다. 단위 핵산과 부가 핵산의 연결은, 예를 들어 DNA 리가아제를 사용한 라이게이션, TA 클로닝법 등 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 어떤 집적 핵산을 구축하기 위한 1개 또는 복수개의 단위 핵산에 대해서, (단위 핵산의 염기 길이)/(단위 벡터의 염기 길이)의 비율 또는 그 평균은, 1% 이상, 0.3% 이상, 0.1% 이상, 0.03% 이상, 0.01% 이상, 0.003% 이상 또는 0.001% 이상일 수 있고, 단위 벡터의 조작이 용이해질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산의 길이는, 10bp 이상, 20bp 이상, 50bp 이상, 70bp 이상, 100bp이상, 200bp 이상, 500bp 이상, 700bp 이상, 1000bp 이상 또는 1500bp 이상, 또한 5000bp 이하, 5000bp이하, 2000bp 이하, 1500bp 이하, 1200bp 이하, 1000bp 이하, 700bp 이하 또는 500bp 이하일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 집적 핵산은, 2종 이상, 4종 이상, 6종 이상, 8종 이상, 10종 이상, 15종 이상, 20종 이상, 30종 이상, 40종 이상, 50종 이상, 60종 이상, 70종 이상, 80종 이상, 90종 이상 또는 100종 이상, 또한 1000종 이하, 700종 이하, 500종 이하, 200종 이하, 120종 이하, 100종 이하, 80종 이하, 70종 이하, 60종 이하 또는 50종 이하의 단위 핵산으로 구축될 수 있다. 각각의 단위 핵산(또는 단위 벡터)의 몰수가 거의 동일해지도록 조정함으로써 탠덤 리피트상의 구조를 갖는 목적으로 하는 집적 핵산이 효율적으로 제작될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산은, 집적 핵산에 있어서의 1세트의 반복 서열을 단위 핵산의 수로 거의 등분한 염기 길이를 가져도 된다. 그렇게 함으로써 각각의 단위 핵산(또는 단위 벡터)의 몰수를 정렬시키는 조작이 용이해질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산은, 집적 핵산에 있어서의 1세트의 반복 서열을 단위 핵산의 수로 거의 등분한 염기 길이로부터 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 7% 이하 또는 5% 이하의 증대 또는 감소된 염기 길이를 가질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산은, 단위 핵산의 단부에 비회문 서열 (팔린드롬 서열이 아닌 서열)을 갖도록 설계될 수 있다. 이렇게 설계된 단위 핵산은, 그 비회문 서열을 돌출 서열로 했을 경우, 집적 핵산에 있어서 단위 핵산이 서로 순서를 유지한 채 연결한 구조를 용이하게 부여할 수 있다.
·집적 핵산의 제작
집적 핵산은, 단위 핵산을 서로 연결함으로써 구축될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산은, 단위 벡터로부터 제한 효소 등에 의해 잘라냄으로써 제조될 수 있다. 집적 핵산은, 반복 서열의 세트를 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 포함할 수 있다. 집적 핵산에 있어서의 반복 서열은, 단위 핵산의 서열 및 필요에 따라 집적 벡터 핵산의 서열을 포함할 수 있다. 집적 핵산은, 형질 전환 생물에 있어서 핵산의 복제를 가능하게 하는 서열을 가질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 형질 전환 생물에 있어서 핵산의 복제를 가능하게 하는 서열은, 형질 전환 생물(예를 들어 Bacillus속 세균(고초균)) 중에서 유효한 복제 개시점을 포함할 수 있다. 고초균 중에서 유효한 복제 개시점의 서열은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 θ형의 복제 기구를 갖는 것으로서는, pTB19(Imanaka, T., et al. J.Gen.Microbioi. 130, 1399-1408.(1984))나 pLS32(Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246.(1998)), pAMβ1(Swinfield, T.J., et al. Gene 87, 79-90.(1990)) 등의 플라스미드에 포함되는 복제 개시점 등의 서열을 들 수 있다.
집적 핵산은, 단위 핵산의 이외에도, 필요에 따라 추가의 염기 서열을 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 집적 핵산은, 프로모터, 오퍼레이터, 액티베이터, 터미네이터 등의 전사 번역을 제어하는 염기 서열을 포함해도 된다. 고초균을 숙주로 했을 경우의 프로모터로서는, 구체적으로는, IPTG(isopropyl s-D-thiogalactopyranoside)에서 발현 제어 가능한 Pspac(Yansura, D. and Henner, D.J. Pro. Natl. Acad. Sci, USA 81, 439-443.(1984.)), 또는 Pr 프로모터(Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604.(1999)) 등을 들 수 있다.
단위 핵산은, 집적 핵산에 있어서 일정한 순서 및 방향을 유지한 반복 구조를 형성할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 벡터로부터 잘라내어진 단위 핵산의 돌출 말단의 염기 서열이 서로 상보적이 되도록 단위 핵산을 구축 함으로써 집적 핵산에 있어서의 일정한 순서 및 방향을 유지한 반복 구조의 형성이 가능해질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 다른 단위 핵산마다 돌출 말단의 구조를 유니크하게 함으로써 효율적으로 일정한 순서 및 방향을 유지한 반복 구조를 형성할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 돌출 말단은, 비회문 서열을 가져도 되고, 5'말단 돌출 또는 3'말단 돌출 중 어느 것이어도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 제한 효소를 사용하여 단위 벡터로부터 돌출 말단을 갖는 단위 핵산이 잘라내어질 수 있다. 이 실시 형태에 있어서, 단위 벡터는, 1개 또는 복수개의 제한 효소 인식 서열을 가질 수 있다. 단위 벡터가 복수의 제한 효소 인식 서열을 갖는 경우, 각각의 제한 효소 인식 서열은 동일한 제한 효소에 의해 인식되어도 되고, 다른 제한 효소에 의해 인식되어도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 벡터는, 동일한 제한 효소에 의해 인식되는 한 쌍의 영역을, 완전한 단위 핵산 영역이 이것들의 영역 사이에 포함되도록 포함할 수 있다. 사용되는 제한 효소는, 특별히 한정되지않지만, 타입 II 제한 효소, 예를 들어 AarI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, FokI, SfaNI 등의 타입 IIS 제한 효소를 사용할 수 있고, 이들 제한 효소는, 인식 서열의 외측의 인식 서열로부터 일정 거리 떨어진 부위에 돌출 말단을 창출 가능할 수 있다. (예를 들어 단독의) 타입 IIS 제한 효소를 사용하면, 잘라낸 단위 핵산의 돌출 말단의 서열이 단위 핵산마다 다를 수 있으므로, 복수의 단위 핵산을 일정한 순서 및 방향으로 집적시키는데도 유리할 수 있다. 타입 IIS 제한 효소를 사용하는 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 벡터는 단위 핵산 영역에 그 타입 IIS 제한 효소가 인식하는 영역을 포함하지 않는다. 인식 영역을 절단하는 제한 효소를 사용하는 실시 형태에 있어서, 단위 벡터는 단위 핵산 영역의 말단에 그 제한 효소가 인식하는 영역을 포함할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 복수의 단위 벡터로부터 단위 핵산을 잘라내기 위하여 동일한 종류의 제한 효소를 사용하는 경우, 이 복수의 단위 벡터를 포함하는 용액 중에서 제한 효소 처리를 행할 수 있어 작업의 효율이 향상될 수 있다. 어떤 집적 핵산을 제작하기 위하여 사용하는 제한 효소의 종류는, 예를 들어 5종 이하, 4종 이하, 3종 이하, 2종 이하 또는 1종일 수 있고, 적은 종류의 제한 효소를 사용함으로써 단위 핵산간의 몰수의 변동이 저감될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 벡터로부터 잘라내어진 단위 핵산은, 아가로오스 겔 전기 영동 등 임의의 공지된 분획법에 의해 용이하게 정제될 수 있다.
단위 핵산 및 필요에 따라 집적 벡터 핵산은, DNA 리가아제 등을 사용하여 서로 연결(라이게이션)할 수 있다. 이에 따라, 집적 핵산을 제작할 수 있다. 예를 들어 단위 핵산 및 필요에 따라 집적 벡터 핵산의 연결은, 폴리에틸렌글리콜(예를 들어 PEG2000, PEG4000, PEG6000, PEG8000 등) 및 염(예를 들어 1가의 알칼리 금속, 염화 나트륨 등) 등의 성분의 존재 하에서 실시할 수 있다. 라이게이션 반응액 중의 각 단위 핵산의 농도는, 특별히 한정되지 않고 1fmol/μl 이상 등일 수 있다. 라이게이션의 반응 온도 및 시간은, 특별히 한정되지 않고 37℃에서 30분 이상 등이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단위 핵산 및 필요에 따라 집적 벡터 핵산을 연결시키기 전에, 단위 핵산 및 필요에 따라 집적 벡터 핵산을 포함하는 조성물을 제한 효소를 실활시키는 임의의 조건으로 제공해도 된다(예를 들어 페놀·클로로포름 처리).
단위 핵산은, WO2015/111248에 기재되는 방법 등을 사용하고, 거의 동일한 몰수로 조정할 수 있다. 단위 핵산을 거의 동일한 몰수로 조정함으로써 탠덤 리피트상의 구조를 갖는 목적으로 하는 집적 핵산이 효율적으로 제작될 수 있다. 단위 벡터 또는 단위 핵산의 농도를 측정함으로써 단위 핵산의 몰수를 조정할 수 있다.
·집적 핵산으로부터의 플라스미드의 제작.
집적 핵산을 형질 전환 생물과 접촉시킴으로써 형질 전환 생물에 있어서 플라스미드가 형성될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 형질 전환 생물로서, Bacillus속 세균, Streptococcus속 세균, Haemophilus속 세균, Neisseria속 등을 들 수 있다. Bacillus속 세균으로서는, B.subtilis(고초균), B.megaterium(거대균), B.stearothermophilus(중도 고열균) 등을 들 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 형질 전환 생물은 고초균이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 집적 핵산을 도입시키는 형질 전환 생물은, 컴피턴트 상태이며, 능동적으로 핵산을 도입할 수 있다. 예를 들어 컴피턴트 상태의 고초균은, 기질이 되는 2중쇄 핵산을 세포 상에서 절단하고, 2중쇄 중의 어느 것의 단일쇄를 이 절단점으로부터 분해하고, 다른 쪽의 단일쇄를 균체 내에 도입한다. 도입된 단일쇄는, 균체 내에서 환상의 2중쇄 핵산으로 수복될 수 있다. 형질 전환 생물을 컴피턴트 상태로 하기 위해서, 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있지만, 예를 들어 고초균은, Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746(1961)에 기재된 방법을 사용하여 컴피턴트 상태로 만들 수 있다. 형질 전환의 방법은, 각각의 형질 전환 생물에 적합한 공지된 방법을 사용할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 패키징 세포로부터 생산된 벡터 플라스미드를 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 패키징 세포로부터 생산된 벡터 플라스미드는 임의의 공지된 방법을 사용하여 정제할 수 있고, 본 개시는, 이렇게 정제된 벡터 플라스미드도 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 정제한 벡터 플라스미드가 목적으로 하는 핵산 서열을 갖는 것은, 제한 효소 절단에 의해 발생하는 단편의 사이즈 패턴을 조사하는 것, PCR법, 염기 서열 결정법 등에 의해 확인할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드 제작 방법에 의해 제조된 벡터 플라스미드 함유 조성물은, 함유 엔도톡신이 소량일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 벡터 플라스미드를 포함하는 고초균을 제공한다.
(조성물)
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 본 명세서에 기재된 벡터 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
(제형 등)
본 명세서에 기재되는 조성물은, 여러 가지 형태로 제공될 수 있다. 조성물의 형태로서는, 예를 들어 주사제, 캡슐제, 정제, 과립제, 흡입제 등이어도 된다. 주사용의 수용액은, 예를 들어 바이알 또는 스테인리스 용기에서 보존해도 된다. 또한 주사용의 수용액은, 예를 들어 생리 식염수, 당(예를 들어 트레할로오스), NaCl 또는 NaOH 등을 배합해도 된다.
하나의 실시 형태에서는, 본 개시의 조성물은, 약학적으로 허용할 수 있는 캐리어 또는 부형제를 포함한다. 이러한 캐리어는, 무균 액체, 예를 들어 물 및 오일인 것도 가능하고, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것이 포함되고, 한정되는 것은 아니지만, 피넛 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등이 포함된다. 의약을 경구 투여할 경우에는, 물이 바람직한 캐리어이다. 의약 조성물을 정맥 내 투여할 경우에는, 생리 식염수 및 수성 덱스트로오스가 바람직한 캐리어이다. 바람직하게는, 생리 식염수 용액, 그리고 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이, 주사 가능 용액의 액체 캐리어로서 사용된다. 적절한 부형제에는, 경질 무수 규산, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 소맥분, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화 나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올, 카르멜로오스 칼슘, 카르멜로오스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴록사머, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염 등이 포함된다. 조성물은, 바람직한 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 또한 함유하는 것도 가능하다. 이러한 조성물은, 용액, 현탁물, 에멀션, 정제, 필, 캡슐, 분말, 지속 방출 배합물 등의 형태를 취하는 것도 가능하다. 전통적인 결합제 및 캐리어, 예를 들어 트리글리세라이드를 사용하여, 조성물을 좌약으로서 배합하는 것도 가능하다. 경구 배합물은, 의약 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린·나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등의 표준적 캐리어를 포함하는 것도 가능하다. 적절한 캐리어의 예는, E.W.Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)에 기재된다. 이러한 것 이외에, 예를 들어 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하고 있어도 된다. 하나의 실시 형태에서는, 본 개시의 임의의 액체 조성물의 pH는, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 10.5, 약 11 또는 이들의 임의의 2개의 값 사이의 범위일 수 있다.
본 개시의 조성물 임의의 성분은, 약학적으로 허용할 수 있는 염으로서 제공할 수 있고, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래하는 유리형의 카르복실기와 함께 형성되는 염, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래하는 것 등의 유리형의 아민기와 함께 형성되는 염, 그리고 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 및 수산화 제2철과 함께 형성되는 염일 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 공지된 방법에 따라, 인간에게의 투여에 적응시킨 의약 조성물로서, 조성물을 배합할 수 있다. 이러한 조성물은 주사에 의해 투여할 수 있다. 대표적으로는, 주사 투여를 위한 조성물은, 무균 등장 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 진정시키는 리도카인 등의 국소 마취제도 포함하는 것도 가능하다. 일반적으로, 성분을 별개로 공급하거나 또는 단위 투약형 중에서 함께 혼합하여 공급하고, 예를 들어 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉 용기 중, 동결 건조 분말 또는 물 불포함 농축물로서 공급할 수가 있다. 조성물을 주입에 의해 투여하고자 하는 경우, 무균 약제 등급의 물 또는 생리식염수를 함유하는 주입병을 사용하여 분배하는 것도 가능하다. 조성물을 주사에 의해 투여하고자 하는 경우, 투여 전에, 성분을 혼합 가능하도록 주사용의 무균수 또는 생리 식염수의 앰플을 제공하는 것도 가능하다.
(사용·용도)
본 명세서에 기재된 벡터 플라스미드 또는 바이러스 벡터 또는 이것들을 포함하는 조성물은 유전자 치료, 기능적 게놈학, 암 백신 접종 및/또는 항바이러스 백신 접종 등, 다양한 용도에서 사용할 수 있다.
본 개시의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 함유 조성물을 피험체에 적용하는 경우, 피험체는 특별히 한정되지 않고 포유 동물(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 소, 양, 돼지, 원숭이, 인간 등), 조류, 파충류, 양서류, 절지 동물, 어류 등일 수 있다.
본 개시의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 함유 조성물의 양은, 처치 또는 예방하는 장애 또는 상태의 성질에 따라 변동될 수 있지만, 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 표준적 임상 기술에 의해 결정 가능하다. 경우에 따라, in vitro 어세이를 사용하고, 최적 투약량 범위를 동정하는 것을 보조하는 것도 가능하다. 배합물에 사용하고자 하는 정확한 용량은 또한, 투여 경로 및 질환 또는 장애의 중대성에 따라서도 변동될 수 있기 때문에, 담당 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정해야 한다. 본 개시의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 함유 조성물의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1회당 1×105개, 1×106개, 1×107개, 1×108개, 1×109개, 1×1010개, 1×1011개, 1×1012개, 1×1013개, 1×1014개 또는 1×1015개의 개수의 바이러스 벡터이어도 되고, 그것들 어느 2개의 값의 범위 내이어도 된다. 투여 간격은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1, 7, 14, 21 또는 28일당 1 또는 2회 투여해도 되고, 그것들 어느 2개의 값의 범위당 1 또는 2회 투여해도 된다. 투여량, 투여 간격, 투여 방법은, 환자의 연령이나 체중, 증상, 대상 장기 등에 따라 적절히 선택해도 된다.
본 명세서에 기재된 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 함유 조성물의 투여 경로는, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 뇌실질내, 경폐, 비내, 경막외 또는 경구 투여 등이어도 된다. 하나의 실시 형태에서는, 본 개시의 조성물, 여러 가지 송달(딜리버리)계를 모두 사용할 수 있다. 이러한 계에는, 예를 들어 리포솜, 미소 입자 및 미소 캡슐 중의 피포: 수용체가 중개하는 엔도사이토시스의 사용 등이 있다. 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주입에 의해, 볼러스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 피부 점막 라이닝(예를 들어 구강, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해, 의약을 투여하는 것도 가능하고, 필요에 따라 에어로졸화제를 사용하여 흡입기 또는 분무기를 사용할 수 있고, 그리고 다른 약제와 함께 투여하는 것도 가능하다. 투여는 전신성 또는 국소인 것도 가능하다.
본 개시의 조성물은 키트로서 제공할 수 있다. 하나의 실시 형태에서는, 본 개시는, 본 개시의 조성물에 첨가될 수 있는 1 이상의 성분이 충전된, 1 이상의 용기를 포함하는, 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 경우에 따라, 이러한 용기에 부수하여 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로, 정부 기관에 의한, 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 인가를 나타내는 정보를 나타내는 것도 가능하다.
본 개시의 조성물 의약 등으로서의 제제화 절차는, 당해 분야에 있어서 공지되어 있고, 예를 들어 일본 약전, 미국 약전, 다른 나라의 약전 등에 기재되어 있다. 따라서, 당업자는, 본 명세서의 기재가 있으면, 과도한 실험을 행하지 않고, 사용해야 할 양 등의 실시 형태를 결정할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "또는"은, 문장 중에 열거되고 있는 사항의 "적어도 하나 이상"을 채용할 수 있을 때에 사용된다. "혹은"도 마찬가지이다. 본 명세서에 있어서 "2개의 값"의 "범위 내"라고 명기한 경우, 그 범위에는 2개의 값 자체도 포함한다.
본 명세서에 있어서 인용된, 과학 문헌, 특허, 특허 출원 등의 참고 문헌 은, 그 전체가, 각각 구체적으로 기재된 것과 같은 정도로 본 명세서에 있어서 참고로 하여 원용된다.
이상, 본 개시를, 이해의 용이함을 위하여 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명해 왔다. 이하에, 실시예에 기초하여 본 개시를 설명하지만, 상술한 설명 및 이하의 실시예는, 예시의 목적으로만 제공되고, 본 개시를 한정하는 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 개시의 범위는, 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시 형태로도 실시예로도 한정되지 않고, 특허 청구 범위에 의해서만 한정된다.
[실시예]
시약류는 구체적으로는 실시예 중에 기재한 제품을 사용했지만, 타 메이커(Sigma-Aldrich, 와코준야쿠, 나카라이, R&D Systems, USCN Life Science INC 등)의 동등품이어도 대용 가능하다.
(실시예 1: AAV 벡터 플라스미드의 증폭)
이하의 절차에 따라서 AAV 벡터 플라스미드를 제작하고, 대장균 및 고초균에서 증폭하였다.
재료
pAAV-CMV 벡터, pRC2-mi342 벡터, pHelper 벡터의 플라스미드(AAVpro(등록 상표)Helper Free System)는 다카라 바이오(시가현)로부터 구입하였다. 고초균-대장균간 셔틀 플라스미드 벡터인 pGETS103ΔAarI는, 플라스미드 pGETS103(Tsuge, K., Itaya, M. (2001) Recombinational transfer of 100-kilobase genomic DNA to plasmid in Bacillus subtilis 168, Journal of Bacteriology, 183, 5453-5458.)에 있어서의 유일한 제한 효소 AarI 인식 부위(5'-CACCTGC-3')에 점돌연 변이(5'-CACCAGC-3')를 도입함으로써 AarI 인식 부위를 소실시킨 플라스미드이며, 고베 대학에서 양도를 받았다. 대장균 JM109주의 케미컬 컴피턴트 세포는, 다카라 바이오에서 구입하였다. 고초균 BUSY9797주(Tsuge, K., Sato, Y., Kobayashi, Y., Gondo, M., Hasebe, M., Togashi, T., Tomita, M., Itaya, M. (2015) Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments, Scientific Reports, 5, 10655.)는 고베 대학에서 양도를 받았다. TA 클로닝용 벡터인 pMD19-Tv-vector, DNA Ligation Kit <Mighty Mix>는, 다카라 바이오에서 구입하였다. 제한 효소 AarI는, ThermoFisher(미국)으로부터 구입하였다. 그 밖의 제한 효소는 모두 New England Biolab(미국)로부터 구입하였다. TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)은 나카라이테스크(교토)로부터 구입하였다. 카르베니실린 및 테트라사이클린은, 시그마 알드리치(미국)로부터 구입하였다. 저융점 아가로오스로서, 2-히드록시에틸아가로오스(시그마 알드리치)를 사용하였다. 다른 일반적인 전기 영동용 아가로오스 겔은, 인비트로젠(미국)의 UltraPure Agarose를 사용하였다. 페놀 포화 TE는, 나카라이테스크로부터 구입하였다. 플라스미드의 칼럼 정제 키트로서, 퀴아젠(도이치)의 QIA quick miniprep 키트 및 PCR purification Kit를 사용하였다. Bactotryptone, Yeast extract, Bacto Agar는, 벡톤 디킨슨(미국)으로부터 구입하였다. 그 밖의 배지용 시약은, 나카라이테스크로부터 구입하였다. 난백 리소자임, 에티듐 브로마이드는, 시그마 알드리치로부터 구입하였다. 리보뉴클레아제 A는, 나카라이테스로부터 구입하였다. 플라스미드 정제에 사용하는, P1, P2, P3은, 퀴아젠으로부터 구입하였다. 염화 세슘은, 나카라이테스크로부터 구입하였다.
배지
LB 배지는, Bactotryptone 10g, 효모 추출물 5g, 염화 나트륨 5g을 1L의 물에 용해하고, 한천 플레이트를 형성하는 경우에는, 추가로 Bacto Agar 15g을 첨가하고, 오토 클레이브(121℃, 20분)한 것을 사용하였다. 필요에 따라, 카르베니실린(최종 농도 100μg/ml), 또는 테트라사이클린(최종 농도 10μg/ml)을 첨가하였다. 고초균 형질 전환용의 TF-1 배지 및 TF-II 배지는, 이하와 같이 제조하였다. 먼저, 10×Spizizen (IL당, 140g K2HPO4(무수), 60g KH2PO4(무수), 20g (NH4)2SO4), 10g Na3 시트레이트·2H20), 50% 글루코오스, 2% MgSO4·7H20, 2% 카사미노산 및 물을, 각각 오토 클레이브하여 개별적으로 준비하였다. 트립토판, 아르기닌, 류신, 트레오닌의 각 아미노산의 수용액(5mg/ml)은 필터 멸균에 의해 준비하였다. TF-I 배지 500ml의 제조를 위해서는, 10×Spizizen을 50ml, 50% 글루코오스, 2% MgSO4·7H20, 2% 카사미노산, 5mg/ml의 트립토판, 아르기닌, 류신, 트레오닌의 각 아미노산을, 각각 5ml씩 사용하고, 마지막으로 멸균수 415ml를 혼합하고, 필터 여과하고, 사용까지는 4℃에서 보존하였다. TF-II 배지 500ml의 제조에 대해서는, 2% 카사미노산을 2.5ml, 각 아미노산 용액(5mg/ml)을 0.5ml, 멸균수를 435.5ml로 한 것 이외에는, TF-I 배지와 마찬가지의 양을 첨가하여 필터 여과하고, 사용까지 4℃에서 보존하였다.
시험관 내 유전자 조작
다른 일반적인 DNA의 조작에 대해서는, 표준 프로토콜(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989))에 따라 행하였다.
전기 영동 겔로부터의 DNA 단편의 잘라내기 및 정제
증폭한 DNA 단편은, 0.7%의 저융점 아가로오스 겔(2-Hydroxyethyl Agarose Type VII, 시그마 알드리치)에서, 1×TAE 버퍼(Tris-Acetate-EDTA Buffer, 나카라이테스크) 존재 하에서, 범용 아가로오스 겔 전기 영동 장치(i-MyRun. N 핵산용 전기 영동 시스템, 코스모 바이오(도쿄))에 있어서, 100V(약 8V/cm)의 전압을 인가하여, 1시간 영동함으로써 벡터 플라스미드 및 단위 DNA를 분리하였다. 이 영동 겔을, 1μg/ml의 에티듐 브로마이드를 포함하는 1×TAE 버퍼 100ml에 30분간 염색하고, 장파장의 자외선(366mn)을 조사하여 가시화함으로써 목적 사이즈의 PCR 산물을 면도기로 잘라내고 1.5ml 튜브에 회수하였다. 회수한 저융점 아가로오스 겔 (약 300mg 정도)에 1×TAE 버퍼를 첨가하여 전체 체적을 약 700μl로 하고, 이것을 65℃에서 10분간 인큐베이트함으로써 겔을 용해하였다. 그 후, 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 잘 혼합함으로써 제한 효소를 실활시켰다. 원심 분리(20,000×g, 10분간)에 의해 페놀상과 수상으로 분리하고, 수상(약 900μl)을 새로운 1.5ml 튜브에 회수하였다. 여기에 1-부탄올을 500μl 첨가하여 잘 혼합한 후, 원심 분리(20,000×g, 1분간)에 의해 분리하고, 수분이 포화된 1-부탄올상을 제거하는 조작을 수상의 체적이 450μl 이하가 될 때까지 반복함으로써 수상의 체적을 감소시켰다. 여기에, 3M 아세트산 칼륨- 아세트산 완충액(pH5.2) 50μl 및 에탄올 900μl를 첨가하고, 원심 분리(20,000×g, 10분간)함으로써 DNA를 침전시키고, 이것을 70% 에탄올로 린스하고, 20μl의 TE 완충액에 용해하였다. 이 회수 DNA는, 사용까지 -20℃에서 보존하였다.
재조합 플라스미드 구축
pAAV-CMV 플라스미드(도 1), pRC2-mi342 플라스미드(도 2), pHelper 플라스미드(도 3)로부터 제한 효소에 의한 잘라내기 등에 의해 취득한 필요한 단편(pAAV-CMV로부터는 1.8kb의 SbfI 단편, pRC2-mi342로부터는 5.2kb의 EagI-XmaI 단편, pHelper로부터는 9.3kb의 BamHI-BamHI-NdeI 단편)을 집적용의 플라스미드에 연결함으로써 재조합 플라스미드를 구축하였다. pHelper 내의 VA 영역 내에 BamHI 사이트가 존재하고 있다는 점에서, 이 BamHI 사이트와 근방의 NdeI 사이트까지의 0.3kb 의 단편은, PCR로 증폭하여 취득하였다. 이 단편을, 상기의 3개의 단편을 도입 가능하도록, SbfI 사이트, AarI 사이트, EagI-XmaI 사이트를 도입한 프라이머를 사용하여 증폭 함으로써 서열 번호 1에 나타내는 서열을 갖는 PCR 산물을 얻었다.
이 PCR 산물을 플라스미드 pMD19에 클로닝하고, 염기 서열이 올바른 것을 확인 후, 상기 DNA의 말단 부근에 설계된 BsaI로 절단함으로써 단편을 얻었다. 이 단편을, HindIII에 의한 pGETS103ΔAarI의 절단 및 탈인산화 처리를 행하여 취득한 단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드는, pGETS103-VA라 명명하였다(도 4). pGETS103-VA를 EagI 및 XmaI로 절단 후, 전기 영동에 의해 짧은 단편을 제거하고, 플라스미드 pRC2-mi342를 EagI 및 XmaI로 절단 후, 5.2kb의 큰 단편을 겔로부터 잘라내서 정제하고, 이것들을 연결하여 얻어진 플라스미드를 pGETS103-RC2라고 명명하였다(도 5). pGETS103-RC2를 SbfI로 절단 후, 제한 효소 실활을 위하여 페놀 처리 및 에탄올 침전을 하고 정제하여 얻어진 단편에, 플라스미드 pAAV-CMV를 SbfI로 절단하여 얻어진 1.8kb의 단편을 연결하고, 얻어진 플라스미드를 pGETS103-AAV-RC2라고 명명하였다(도 6). 또한 이것을 AarI로 절단하고, 짧은 DNA 단편을 제거하고, 여기에 플라스미드 pHelper의 9.0kb의 BamHI 단편을 연결하고, 사전에 도입한 BamHI-NdeI 영역과의 연결로 VA 영역이 재생하는 방향으로 BamHI 단편이 도입된 것을 선택함으로써 3개의 플라스미드를 1개의 플라스미드에 통합한 올인원의 구조의 pGETS103-AAV-Helper-RC2를 구축하였다(도 7, 서열 번호 2). 또한, 단편을 단독으로 갖는 플라스미드를 구축하였다. 구체적으로는, pGETS103-VA를 SbfI로 절단한 것에 플라스미드 pAAV-CMV를 SbfI로 절단하여 얻어진 1.8kb의 단편을 연결하여 얻어진 플라스미드를 pGETS103-AAV라고 명명하였다(도 8). 또한, pGETS103-VA를 AarI로 절단하고, 짧은 DNA 단편을 제거하고, 여기에 플라스미드 pHelper의 9.0kb의 BamHI 단편을 연결하고, 사전에 도입한 BamHI-NdeI 영역과의 연결로 VA 영역이 재생하는 방향으로 BamHI 단편이 도입된 것을 선택함으로써 pGETS103-Helper를 구축하였다(도 9).
대장균 형질 전환법
용해한 대장균 JM109 컴피턴트 세포 50μl를 빙상에 준비한 1.5ml의 원심 튜브에 옮기고, 여기에 재조합 플라스미드를 최대 5μl이 되도록 첨가하고, 빙상에 15분 정치 후, 42℃의 온욕에서 45초 인큐베이션 후, 빙상으로 되돌려서 2분 경과 후에, 컴피턴트 세포에 부속되어 있는 SOC 배지를 200μl 첨가하고, 회전 배양 장치(RT-50에 시험관용 배양 홀더 SA-1811을 탑재, 다이테크(오사카)에 세트하고, 30rpm의 회전 속도로 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, 이것을, 카르베니실린이 들어간 LB 배지 한천 플레이트에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.
고초균 형질 전환법
Falcon(등록 상표)의 14ml 시험관(2051)에 LB 배지 2ml를 넣고, 거기에, -70℃에서 보존한 글리세롤 스톡의 고초균을 식균하고, 회전 배양 장치에서 회전시키면서, 37℃에서 17시간 배양하였다. 새로운 14ml 시험관(Falcon 2051)에 TF-I 배지를 900μl 분주하고, 25μl의 2% 카사미노산을 첨가하고, 50μl의 상기 배양액을 첨가하고, 회전 배양 장치에서 회전시키면서, 37℃에서 4시간 배양하였다. 그 후, 새로운 14ml 시험관에 TF-II 배지를 900μl 분주하고, 100μl의 TF-I 배양액을 첨가하고, 회전 배양 장치에서 회전시키면서, 37℃에서 1.5시간 배양하였다. 1.5ml의 원심 튜브에 TF-II 배양액을 100μl 넣고, 8μl의 재조합 플라스미드를 첨가하였다. 회전 배양 장치에서 회전시키면서, 37℃에서 30분 배양한 후, LB 배지를 300μl 첨가하고, 추가로 회전 배양 장치에서 회전시키면서, 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, 배양물을, 테트라사이클린 10μg/ml를 포함하는 LB 배지 한천 플레이트 상에 펼치고, 37℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 형질 전환체를 얻었다.
대장균의 플라스미드 소량 제조
대장균 내에서 구축한 재조합 플라스미드의 구조 확인을 위한 소량 정제는, 퀴아젠의 QIAprep Spin Miniprep Kit 및 자동화 장치인 QIA cube를 사용하여 매뉴얼을 따라 행하였다.
고초균 및 대장균으로부터의 플라스미드 대량 제조법
염화 세슘-에티듐 브로마이드 밀도 구배 초원심법에 의해 고순도의 플라스미드 DNA를 조달하였다. 이하는, LB 배지 200ml의 경우의 정제 방법을 나타내지만, 200ml를 초과하는 경우에는, 200ml마다 이하의 조작을 반복하여 행하였다. LB 배지에 항생 물질(테트라사이클린)을 첨가한 것을 200ml 준비하고, 500ml의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣어서, 대장균 또는 고초균 플라스미드 보유주를 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.
배양 종료 후, 50ml씩 50ml 튜브(팔콘 2070) 4개에 분주하고, 5,000×g으로 10분간 원심하였다. 상청을 버리고, 균 펠릿을 볼텍스에 의해 완전히 풀었다. 10mg/ml의 리소자임 및 10mg/ml의 리보뉴클레아제 A 첨가 P1 용액을 준비하고, 균을 넣은 튜브 4개에 각각 5ml씩 첨가하여 잘 혼합하였다. 이것을 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 4개의 튜브에 각각 P2를 5ml씩 첨가하여 천천히 혼합하고, 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 또한, P3을 5ml씩 첨가하고, 백탁 물질이 균등하게 분산될 수 있도록 어느 정도 강한 힘으로 혼합하였다. 5,000×g으로 10분간 원심하고, 상청을 피펫으로 흡입하고, 새로운 4개의 나사 덮개의 50ml 튜브(팔콘 2070)에 옮겼다. 각각의 튜브에 5ml의 페놀 포화 TE를 첨가하고, 격렬하게 혼합하였다. 5,000×g으로 10분간 원심하고, 상청을 피펫으로 흡입하고, 새로운 4개의 나사 덮개의 50ml 튜브(팔콘 2070)에 옮겼다. 100% 에탄올을 각각 20ml 첨가하여 혼합하고, 5,000×g으로 10분간 원심하고, 상청을 제거하였다. 침전에 5.4ml의 TE를 첨가하여 완전히 용해하였다. 이어서, 6.40g의 염화 세슘을 투입하여 완전히 용해하였다. 또한, 1.1g/ml의 염화 세슘 용액(1.1g의 염화 세슘과 1ml의 물을 섞어서 제작한 용액이며, 체적 조정하지 않음)을 2.6ml 첨가하였다. 마지막으로, 10mg/ml의 에티듐 브로마이드 용액을 600μl 첨가하여 잘 혼합하였다. 초원심 튜브(베크만 362181) 1개에 내용물을 옮겼다. 밸런스와의 무게의 차이가 20mg 이내가 되도록, 물, 또는 1.1g/ml 염화 세슘 용액(비중 약 1.5g/ml 정도)을 첨가하여 무게를 미세 조정하였다. 초원심 장치(베크만 콜터)에서 이하의 조건으로 원심을 행하였다. 온도: 18℃, 속도: 50,000rpm, 가속도: Max, 감속도: Max. 15시간 이상 원심하였다.
원심 종료 후, 자외선(365nm) 관찰 하에, 침(21G×5/8”)을 세트한 1ml의 시린지로 ccc형의 플라스미드의 밴드에 꽂아 플라스미드 용액을 회수하고, 15ml 튜브에 옮겼다. 여기에 P3을 500μl 첨가하고, 다음으로, 전체가 3ml가 되도록 물을 첨가하였다. 또한, 9ml의 100% 에탄올을 첨가하였다. 5,000×g으로 10분간 원심하고, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전에 700μl의 TE를 15ml 튜브에 첨가하고, DNA를 용해하였다. 이것을 1.5ml의 튜브에 옮기고, 600μl의 1-부탄올을 첨가하여 혼합하고, 20,000×g으로 10초 정도 원심하여 2층으로 분리하고, 상층의 부탄올층을 버렸다. 새롭게, 600μl의 1-부탄올을 첨가하여 혼합하고, 20,000×g으로 10초 정도 원심하여 2층으로 분리하고, 상층의 부탄올층을 버렸다. 이 조작을, 수층이 200μl 이하가 될 때까지 계속하였다. 수층이 200μl 이하가 되면, 1ml의 PB(퀴아젠)를 첨가하여 잘 혼합하고, QIAprep Spin Miniprep Kit의 스핀 칼럼에, 600μl의 PB 혼합물을 적용하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다. 플로쓰루를 버리고, 나머지의 600μl의 PB 혼합물을 상기 칼럼에 재적용하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다. 플로쓰루를 버리고, 칼럼을 다시 콜렉션 튜브에 세트하고, PE를 700μl 적용하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다(1회째). 다시 플로쓰루를 버리고, 칼럼을 다시 콜렉션 튜브에 세트하고, PE를 700μl 적용하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다(2회째). 플로쓰루를 버리고, 칼럼을 다시 콜렉션 튜브에 세트하고, PE(퀴아젠)을 700μl 적용하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다(3회째). 플로쓰루를 버리고, 칼럼을 다시 콜렉션 튜브에 세트하고, 빈 상태에서, 20,000×g으로 1분간 원심하고, 잔사를 완전히 떨어트렸다. TE를 50μl 적용하고, 실온에서 1분간 인큐베이션 후, 20,000×g으로 1분간 원심하고, 플라스미드를 용출하였다.
NanoDrop에 용출물 1μl를 적용하고, 농도, 순도를 측정하였다. 농도 수십ng/μl, 순도 260/280=1.8 내지 2.0, 260/230=2.0 내지 3.0인 것을 확인하였다. 26.2μl의 샘플을 158μl의 샘플에 용해하고, 8μl씩 이하의 제한 효소로 소화하여 구조를 확인하였다; 절단하지 않고, BamHI-HF, BglII(NEB3.1), EcoRI-HF, EcoRV-HF, HindIII-HF, KpnI-HF, NotI-HF, PstI-HF, PvuII-HF, SacI-HF, SalI-HF, SfiI, SmaI, XbaI(BglII 이외에는, CutSmart buffer).
(실시예 2: 증폭한 벡터 플라스미드로부터의 AAV 벡터의 생산)
대장균 및 고초균에서 증폭한 벡터 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하고, AAV 벡터를 생산시켰다. 이 실시예의 실험은, Signa Gen Laboratories (미국)에 의뢰하여 실시하였다.
대장균 또는 고초균에서 증폭한 pGETS103-AAV-Helper-RC2(1.19x1013 카피), 대장균 또는 고초균에서 증폭한 pGETS103-AAV:pGETS103-Helper:pGETS103-RC2=1:1:1(합계 1.19x1013 카피), 또는 대장균에서 증폭한 pAAV-CMV:pHelper:pRC2-mi342=1:1:1(합계 1.19x1013 카피)을 형질 감염에 사용하였다. 이러한 플라스미드 DNA에 대하여 2.7배(중량비)량의 PolyJet(상표) 시약을 혼합하였다. 제조한 DNA 복합체를, 배양한 2x108 세포의 HEK293 세포(계대수 12)에 형질 감염하고, 추가로 5시간 배양을 계속하였다. 형질 감염한 세포를 회수하고, 3회 동결 융해한 후, 37℃에서 1시간, Benzonaze(등록상표)로 처리하였다. 12500rpm으로 30분간 원심 분리를 행하고, 상청을 회수하였다. 이어서, 28000rpm으로 18시간 염화 세슘 밀도 구배 초원심을 행한 후, rAAV(재조합 아데노 수반 바이러스 벡터 입자)를 회수하고, 0.001% Pluronic(등록 상표) F-68을 포함하는 PBS로 분산시켰다.
제작한 rAAV의 게놈 카피타이터를, 정량 PCR을 사용하여 정량하였다. 각 rAAV를 DNaseI로 처리한 후, 프로테이나제 K를 사용하여 DNaseI를 불활성화하였다. 98℃에서 15분간 가열 처리하고, 캡시드를 변성시켜, 검량선의 범위에 들도록 희석을 행한 후, 정량 PCR로 측정하였다. 타깃은 ITR로 하고, 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'(서열 번호 67) 및 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'(서열 번호 68)의 서열의 프라이머를 사용하였다. 또한, rAAV 분산액에 포함되는 엔도톡신량을, Pierce LAL Endotoxin Quantitation Kit(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 사용하여 정량하였다.
각 플라스미드 조건에 있어서 생산된 rAAV 바이러스 게놈량[VG/mL] 및 엔도톡신량[Unit/mL]을 측정하였다. 모든 조건에 있어서 rAAV 바이러스의 생산이 마찬가지로 확인되었다. 어느 조건에 있어서도 엔도톡신은 검출되지 않았다.
(실시예 3: 생산한 플라스미드에 있어서의 엔도톡신량)
rAAV의 제작에 사용한 플라스미드 DNA 용액에 포함되는 엔도톡신 농도를 Endosafe nexgen-PTS Instrument(Charles River Laboratories, 미국)를 사용하여 정량하였다. 1mol/L 트리스 염산 완충액(pH8.0, 멸균·엔도톡신 시험 완료)을 LAL 시험 용수(Charles River Laboratories)로 희석하고, 0.02mol/L 트리스 염산 완충액을 제조하였다. LAL 시험용 엔도톡신 특이적 버퍼(와코준야쿠)와 0.02mol/L 트리스 염산 완충액을 등량으로 혼합하여 샘플 희석액을 제조하였다.
측정에는, PTS 카트리지 FDA(0.1 내지 10EU/mL) 및 PTS 카트리지 FDA(0.005 내지 0.5EU/mL)를 사용하였다. 플라스미드 DNA 용액을 샘플 희석액으로 40배 또는 250배로 희석한 후, 카트리지에 25μL 주입하고, 각 플라스미드 DNA 용액에 포함되는 엔도톡신량을 정량하였다.
결과를 이하의 표에 나타낸다.
고초균에서 증폭한 플라스미드에서는, 대장균에서 증폭한 플라스미드와 비교하여 훨씬 엔도톡신이 적었다. 고초균에서 증폭한 플라스미드로부터 검출되는 엔도톡신은 매우 낮은 수준이었으므로, 본 개시에 의한 고초균을 사용한 플라스미드 제작은, 엔도톡신 저감을 위한 정제 조작의 부담을 경감시킬 수 있다. 엔도톡신의 혼입은, 의약품의 안전성에 영향을 미치기 때문에 매우 엄격하게 관리가 요구된다. 종래의 방법이라면, 복수회의 칼럼 크로마토그래피에 의해 엔도톡신의 저감이 도모되지만, 이러한 복수회의 정제 공정이 플라스미드 DNA의 제조 비용의 증가 및 제조를 위한 노동 증대로 연결되고 있었다. 본 개시에 의한 방법에 의해, 이온 교환 크로마토그래피 등의 엔도톡신량을 저감하는 칼럼 정제의 횟수를 삭감할 수 있고, 플라스미드 DNA 그리고 DNA를 원료로 하여 제작되는 바이러스 벡터의 제조에 수반되는 노동 및 비용을 저감하고, 의약품 및 의약품 원료로서 품질을 향상시킬 수 있다.
(실시예 4: 구축한 플라스미드 DNA의 CCC 순도)
rAAV의 제작에 사용한 플라스미드 DNA의 CCC(covalently closed circular) 순도를, P/ACE MDQ Plus(SCIEX) 및 dsDNA 1000 kit(AB SCIEX, 도쿄)를 사용하여 정량하였다. 키트에 포함되는 겔 분말에 초순수를 20mL 첨가하여 밤새 교반하였다. 겔이 완전히 용해된 것을 확인하고, 1xTBE electrophoresis buffer(Thermofisher)로 10배 희석하였다. 희석한 겔에, 0.01vol%가 되도록 SYBR Gold nucleic acid gel stain(Thermofisher)을 첨가한 후, 모세관에 겔을 충전하였다. 각 플라스미드 DNA는, 초순수로 10ng/μL로 조정하고, P/ACE MDQ Plus를 사용하여 측정하였다.
측정 샘플은, 0.2psi, 2초만에 모세관에 인젝션하고, 9.0kV에서 20분간 전기 영동을 행하였다. 검출을 위하여 형광(여기 파장: 488nm, 형광 파장: 520nm, Dynamic range: 1000RFU)을 사용하였다. 플라스미드 DNA의 CCC 순도는, CCC 플라스미드 DNA의 피크 면적 값을, 기타 불순물도 포함한 피크 면적값의 합계로 나누어 계산함으로써 산출하였다.
결과를 이하의 표에 나타낸다.
pGETS103-AAV-Helper-RC2 및 pGETS103-RC2의 양쪽 플라스미드에 대해서, 대장균보다도 고초균에 있어서 CCC 순도가 높았다. FDA의 가이던스에 의하면, CCC 순도는 80%를 상회하는 것이 정해져 있지만, 고초균을 사용하여 생산한 플라스미드는, 높은 CCC 순도를 갖는 것이 관찰되었기 때문에, CCC 순도 향상을 위한 정제 조작의 부담 및 제조 비용을 경감시킬 수 있다. CCC 순도는 플라스미드 DNA의 안정성, 기능성, 형질 감염 효율에도 관계되고, 높은 CCC 순도의 플라스미드 DNA는 유용성이 높다.
(실시예 5: 마커 유전자를 포함하는 rAAV의 비율)
SignaGen에서 동결 보존된 각 rAAV를 해동하고, Step One plus(Thermofisher)를 사용하여, rAAV 게놈의 CMV에 대하여 정량 PCR을 행하였다. 250U/mL로 제조한 DNaseI(다카라 바이오)과 제작한 rAAV를 등량 혼합 후, PCR용 써멀 사이클러(Thermofisher)를 사용하여 37℃에서 30분간 가열하였다. 이어서, 0.04M의 EDTA 버퍼(pH8.0, 다카라 바이오)를 첨가하여 2배 희석하고, 55℃에서 30분간 가열하였다. 또한, 뉴클레아제 비함유 수(Promega)로 2.5배 희석하고, 95℃에서 10분간 가열하였다. 마지막으로, TE 버퍼(Promega)를 첨가하여 10배 희석을 행하고, 추출한 rAAV 게놈을 정량 PCR용의 템플릿으로서 사용하였다.
정량 PCR의 반응액은, 플레이트 1웰당, QuantiTect SYBR Green PCR Master mix(QIAgen) 10μL, 0.01mM 프라이머(포워드) 1μL, 0.01mM 프라이머(리버스) 1μL, 물 6μL, 템플릿 2μl를 포함하고, 씰로 플레이트를 밀폐 후, 정량 PCR을 행하였다. 반응액으로서, CMV를 타깃으로 한 프라이머(포워드:5'-CATCAATGGGCGTGGATAGC-3'(서열 번호 69), 리버스: 5'-GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA-3'(서열 번호 70))를 포함하는 반응액을 제조하였다.
PCR 조건은, 95℃에서 15분간 가열한 후, (1) 94℃에서 15초, (2) 60℃에서 30초, (3) 72℃에서 30초의 사이클을 40회 반복하였다. 검량선은, 제한 효소로 pAAV-CMV 직선상으로 만든 DNA를 사용하여 제작하고, 각각의 Ct값으로부터 rAAV 게놈 카피 농도를 산출하였다.
SignaGen에서 동결 보존된 각 rAAV를 해동하고, Step One plus를 사용하여, 플라스미드 백본에 포함되는 Ampr 유전자에 대하여 정량 PCR을 행하였다. 제작한 rAAV에 TE 버퍼를 첨가하여 3배 희석한 후, PCR용 써멀 사이클러를 사용하여 95℃에서 10분간 가열한 액을, 추출한 rAAV 게놈을 정량 PCR용의 템플릿으로서 사용하였다.
정량 PCR의 반응액은, 플레이트 1웰당, QuantiTect SYBR Green PCR Master mix 10μL, 0.01mM 프라이머(포워드: 5'-TTGATCGTTGGGAACCG GAG-3'(서열 번호 71)) 1μL, 0.01mM 프라이머(리버스: 5'-TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG-3'(서열 번호 72)) 1μL, 물 6μL, 템플릿 2μl를 포함하고, 씰로 플레이트를 밀폐한 후, PCR을 행하였다.
PCR 조건은, 95℃에서 15 분간 가열한 후, (1) 94℃에서 15초, (2) 60℃에서 30초, (3) 72℃에서 30초의 사이클을 40회 반복하였다. 검량선은, 제한 효소로 pAAV-CMV를 직선상으로 만든 DNA를 사용하여 제작하고, 각각의 Ct값으로부터 게놈 카피 농도를 산출하였다. 마커 유전자를 포함하는 rAAV의 비율은, Ampr를 타깃으로 하여 산출된 게놈 카피 농도를, CMV를 타깃으로 하여 산출된 rAAV 게놈 카피 수로 나누어 계산함으로써 산출하였다.
결과를 이하의 표에 나타낸다.
rAAV#1(올인원, 고초균) 및 rAAV#4(3종 혼합 플라스미드, 대장균)에 있어서 특히 불순물의 비율이 낮았다. 올인원의 구조의 플라스미드 및 고초균의 조합이 우수하다는 것이 시사되었다.
(실시예 6: 빈 캡시드의 비율)
SignaGen에서 동결 보존된 각 AAV를 해동하고, ARVO X5(퍼킨엘머)를 사용하여, ELIZA법으로 캡시드 입자 농도의 정량을 행하였다. 정량 키트에는, AAV2 Titration ELISA2. OR(PROGEN)을 이용하고, 프로토콜에 기초하여 시험을 실시하였다. 키트에 포함되는 항AAV2 항체가 고정화된 96웰 플레이트에, rAAV 및 표준품(키트에 포함되는 빈 캡시드 시약)을 100μL씩 첨가하였다. 37℃에서 1시간 정치 후, 액을 폐기하고, 200μL의 어세이 버퍼로 3회 세정하였다. 100μL의 비오틴 결합 항AAV2 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치 후, 액을 폐기하고, 200μL의 어세이 버퍼로 3회 세정하였다. 또한, 100μL의 HRP 표지 완료의 스트렙트아비딘을 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치 후, 액을 폐기하고, 200μL의 어세이 버퍼로 3회 세정하였다. 마지막으로, 100μL의 TMB를 첨가하고, 실온에서 15분간 정치 후, 반응 정지 시약을 첨가하고, ARVO X5로 흡광도(450nm, 650nm)를 측정하였다.
빈 캡시드의 비율은, CMV를 타깃으로 하여 산출된 rAAV 게놈 카피 농도(게놈 카피타이터)에 대하여 ELIZA법으로 정량된 캡시드 입자 농도(바이러스 입자 타이터)로 나누어 계산한 값을 1에서 차감함으로써 산출하였다.
결과를 이하의 표에 나타낸다.
rAAV#1(올인원, 고초균)에 있어서 특히 빈 캡시드의 비율이 낮았다. 빈 캡시드는 면역원성일 수 있기 때문에, 저감되는 것이 바람직하다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, rAAV의 취득 시에 염화 세슘 밀도 구배 초원심을 행하고, 이 조작에 의해 부분적으로 빈 캡시드가 제거되어 있을 가능성은 있지만, 빈 캡시드는 본질적으로 제거되어 있지 않다고 생각된다. 칼럼 크로마토그래피를 행해도, 빈 캡시드의 효율적인 제거는 통상 곤란하기 때문에, 상류 공정에서 빈 캡시드의 생성을 저감시키는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 본 개시의 방법으로 제작한 바이러스 벡터에서는, 특히 빈 캡시드의 비율이 낮고, 고효율인 바이러스 벡터의 생산이 가능할 수 있다. 그 때문에, 근소한 밀도의 차이에 기초하는 분리법 등 노동을 요할 수 있는 빈 캡시드의 제거 조작의 부담이 경감될 수 있다.
(실시예 7: OGAB법에 의한 플라스미드 구축)
OGAB법에 의해 pGETS103-AAV-Helper-RC2를 구축하였다(도 10).
OGAB 집적용 벡터 DNA의 구축
플라스미드 pGETS103ΔAarI를 제한 효소 HindIII로 절단하고, TE 포화 페놀 처리, 부탄올 추출, 에탄올 침전으로 정제하고, 여기에 서열 번호 3 및 4로 표시되는 단일쇄 DNA를 어닐링하여 제작한 링커 DNA를 삽입하고, OGAB 집적용 벡터인 pGETS103-ΔAarI-Linker를 제작하였다. 이 플라스미드를 제한 효소 AarI로 절단하고, 저융점 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 사이즈 분리하고, 큰 15kb의 단편을 겔로부터 잘라내고, 정제하여 OGAB 집적용의 벡터 단편을 취득하였다.
OGAB용 집적 단편의 준비
pGETS103-AAV-Helper-RC2의 염기 서열 중, 벡터 부분의 pGETS103의 염기 서열을 제외하는 AAV-Helper-RC2의 영역(도 10)에 대해서, OGAB법에 의한 재구성이 가능한지 여부를 검토하였다. 먼저, 상기 DNA 영역을 도 10에 나타내는 22개의 단편으로 분할하도록 설계하였다. 제3 단편은 AAV 단편과 Helper 단편의 경계 영역을 포함하고, 제16 단편은 Helper 단편과 RC2 단편의 경계 영역을 포함하기 때문에, 제1, 제3 및 제16 단편은, 이하에 기재한 바와 같이 재료의 DNA를 화학 합성 후, MAP법(일본 특허 출원 제2018-93024)에 의해 준비하였다. 구체적으로는, 제1 단편에 대해서는 서열 번호 5 내지 10의, 제3 단편에 대해서는 서열 번호 11 내지 16의, 제16 단편에 대해서는 서열 번호 17 내지 22의, 단일쇄 DNA를 사용하여, MAP법에 의해 조립하여 얻어진 이중쇄 DNA를 사용하였다. 나머지의 영역에 대해서는, 서열 번호 23 내지 66에 나타내는 각 단편의 번호가 붙는 F와 R의 프라이머의 조합을 사용하여, 제2 단편에 대해서는 pAAV-CMV Vector를, 제4 내지 제15 단편은 pHelper Vector를, 제17 내지 제22 단편에 대해서는 pRC2-mi342 Vector를 템플릿으로 하고 이하의 조건에 의해 PCR에 의해 증폭하였다. 1 반응당, 10μl의 2×Prime Star mix(다카라 바이오), 1μl의 템플릿 DNA, 양쪽의 프라이머를 3.2pmol씩 포함하는 1μl의 용액, 8μl의 멸균수를 첨가하고, 96℃ 2분 후, 98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 5초의 사이클을 30사이클 행하였다.
OGAB용 집적 단편의 벡터에 대한 클로닝
DNA 단편을 MAP법, 또는 PCR법에 의해 얻은 후, 이들의 DNA를 MinElute PCR Purification Kit(퀴아젠)를 사용하여 정제하고, 최종적으로 15μl의 TE 완충액(나카라이테스크)에 의해 칼럼으로부터 용출하였다. 얻어진 DNA 용액의 1.4μl에 0.2μl의 10×Ex-Tag buffer(다카라 바이오), 0.2μl의 2mM dNTP(다카라 바이오), 0.2μl의 10xA-attachment mix(TOYOBO)을 첨가하고, 60℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 1μl의 pMD19 simple(다카라 바이오)을 TE 완충액으로 20배로 희석하고, 3μl의 DNA Ligation Kit <Mighty Mix>를 첨가하고, 16℃에서 3시간 라이게이션 반응을 행하고, 대장균 JM109 컴피턴트 세포(다카라 바이오)를 사용하여 형질 전환을 행하였다. 밤새 배양 후, 카르베니실린이 들어간 LB 플레이트에 출현한 콜로니에 대하여 염기 서열을 확인함으로써 각각의 단편에 대하여 올바른 서열의 클론을 취득하였다.
OGAB용 단편의 등몰 혼합물의 조정
이러한 클론을 갖는 대장균을 2ml의 LB 배지에서 증식 후, 그 900μl를 사용하여 QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠)에 의해, 자동화 시스템 QIAcube에 의해 플라스미드를 정제하고, 최종적으로 30μl의 TE 완충액에 용출하였다. 그 중 2.5μg 상당의 플라스미드 DNA를 포함하는 용액을 50μl이 되도록 TE 완충액을 첨가하였다. 또한 거기에, 6μl의 10XPlasmid safe buffer(epicentre), 2.4μl의 25mM ATP, 2μl의 Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase(epicentre)을 첨가하고, 37℃ 1시간 반응 후, 70℃ 30분 실활시킴으로써, 환상 구조 이외의 DNA를 분해하였다. 그 후, 반응액을 MinElute PCR Purification Kit(퀴아젠사)를 사용하여 정제하고, 최종적으로 15μl의 TE 완충액(나카라이테스크)에 의해 칼럼으로부터 용출하였다. 얻어진 DNA 용액을 미량 분광 광도계(Nano drop One, Thermofisher)를 사용하여 측정하고, 100ng/μl이 되도록 TE 완충액을 첨가하여 희석하였다. 그 후, 다시 농도를 측정하여, 정확하게 500ng의 DNA를 분취할 때에 필요한 DNA 체적을 소수점 이하 2자리 μl까지 계산하고, 마이크로피펫에 의해 분취함으로써 각 플라스미드의 등몰 분취를 행하였다. 분취한 DNA 용액은, 그 후에 사용하는 제한 효소의 종류에 따라 2개의 1.5ml의 원심 튜브에 나누어서 풀링하였다. 제1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 17, 19, 21 단편을 클론화하는 플라스미드는, 제한 효소 AarI로 절단하는 튜브에, 제2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 20, 22 단편을 클론화하는 플라스미드는, 제한 효소 BsaI로 절단하는 그룹에 각각 풀링하였다. 그 후, AarI로 절단하는 튜브에는, 각 플라스미드의 용적의 합계를 1체적으로 했을 경우에, 1.94체적의 멸균수, 0.33체적의 10×Buffer AarI(Thermofisher), 0.06체적의 50×올리고뉴클레오티드(0.025mM), 0.17체적의 AarI(Thermofisher)를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 또한, BsaI로 절단하는 튜브에는, 각 플라스미드의 용적의 합계를 1체적으로 했을 경우에, 2체적의 멸균 수, 0.33체적에 10XCutSmart buffer(NEB), 0.17체적의 BsaI-HF v2를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 각각의 튜브에 제한 효소 반응액과 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 잘 혼합함으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 유화된 상태의 페놀과 DNA 용액의 혼합물을 하나의 2ml 원심 튜브에 통합하고, 20,000×g으로 10분간 원심하고, 페놀상과 수상으로 분리하였다. 상층을 새로운 튜브에 옮기고, 거기에 등량에 1-부탄올을 첨가하여 잘 교반하고, 20,000×g으로 1분간 원심하였다. 그 후, 상층을 피펫으로 흡입하여 제거하고, 하층의 체적이 450μl 이하가 될 때까지, 다시 등량의 1-부탄올을 첨가하고, 원심, 상층을 버리는 조작을 반복하였다. 그 후, 50μl의 P3 버퍼를 첨가하고, 900μl의 에탄올을 첨가하고, 20,000×g으로 10분간 원심하였다. 침전을 상실하지 않도록 상청을 버린 후, 900μl의 70% 에탄올로 린스 후, 상청을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 그 후, 다시 원심하고, 남아 있는 상청을 저부에 모으고, 피펫으로 완전히 액체를 제거하였다. 즉시, TE 50μl를 첨가하여 침전을 5분간 탭핑함으로써 완전히 용해하였다. 그 후, 저융점 아가로오스 겔에 의한 전기 영동에 의해 pMD19로부터 잘라낸 약 750bp의 22종류의 단편의 등몰 혼합물을 사이즈 분획하고, 실시예 1에 기재된 전기 영동 겔로부터의 DNA 단편의 잘라내기와 정제 방법에 따라, 22종류의 단편의 혼합물을 정제하였다.
OGAB법에 의한 pGETS103-AAV-Helper-RC2 재구성
그 후, 얻어진 DNA 용액의 1fmol과, AarI로 절단하여 정제한 pGETS103ΔAarI-Linker의 1fmol에 합계 4μl이 되도록 TE 완충액을 추가하고, 거기에 5μl의 2×라이게이션 버퍼(15% 폴리에틸렌글리콜 6000, 500mM NaCl, 132mM Tris·HCl(pH7.6), 13.2mM MgCl2, 20mM DTT, 0.2mM ATP)을 첨가하여 잘 혼합 후, 1μl의 T4 DNA Ligase(다카라 바이오)를 첨가하고, 37℃에서 5시간 인큐베이션하였다. 여기에 고초균 컴피턴트 세포 100μl를 첨가하고, 37℃에서, 30분 덕 로터에 의해 회전배양하였다. 그 후, 300μl의 LB 배지를 첨가하고, 37℃에서 1시간 덕 로터로 회전 배양하고, 그 후, 배양액을 10μg/ml의 테트라사이클린(시그마 알드리치)이 들어간 LB 플레이트에 펼치고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는 94개 얻어졌다.
형질 전환체의 플라스미드 구조 확인
랜덤하게 12주의 콜로니를 선택하고, 2ml의 10μg/ml의 테트라사이클린이 들어간 LB 배지에서 밤새 배양하고, 내부의 플라스미드 카피 수를 증폭하기 위하여 IPTG를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하고 다시 37℃에서 3시간 배양하였다. 얻어진 균체로부터 이하와 같이 소량의 플라스미드 추출을 행하였다. 900μl의 균액을 1.5ml 원심 튜브에 덜고, 6800×g으로 3분 원심하고, 상청을 마이크로피펫으로 제거하였다. 얻어진 균체 펠릿을 잘 현탁 후, 10mg/ml의 난백 리소자임(wako)을 포함하는 P1 버퍼를 100μl 첨가 후, 37℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 거기에, 200μl의 P2 버퍼를 첨가하여 4회 전도 혼화하였다. 그 후, P3을 150μl 첨가하고, 4회 전도 혼화하였다. 이것을 20,000×g으로, 10분간 원심함으로써 흰 침전과 상청으로 분리하였다. 상청을 새로운 1.5ml 원심 튜브에 옮기고, 거기에, 450μl의 TE 포화 페놀(나카라이테스크)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 20,000×g으로, 10분간 원심함으로써 페놀상과 수상으로 분리하고, 수상 320μl를 새로운 튜브에 옮기고, 거기에 900μl의 에탄올을 첨가하고, 20,000×g으로, 10분간 원심하였다. 상청을 마이크로피펫으로 제거하고, 900μl의 70% 에탄올을 첨가하고, 튜브 전체를 린스하였다. 그 후, 70% 에탄올을 마이크로피펫으로 제거하고, 얻어진 침전을 27μl의 TE 완충액으로 용해하였다. 얻어진 플라스미드 용액을 8μl 덜고, 거기에 1μl의 10×3.1 NEB buffer(NEB)와, 1μL의 SmaI를 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 절단 패턴을 확인하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 12개 중 1개(클론 번호 3)가 기대한 절단 패턴을 나타냈다. 이 클론에 대해서, 전체 염기 서열을 결정했더니, pGETS103-AAV-Helper-RC2를 재구성하고 있다는 것을 확인하였다.
프로듀서 세포로의 벡터 플라스미드 도입 시의 형질 감염 시약의 양이나 원심 분리 조작 조건을 변경한 다른 조건에서도 바이러스 벡터의 생산을 확인하였다.
(실시예 7: 여러 가지 AAV 올인원 벡터 플라스미드의 구축)
마찬가지로, AAV 바이러스 벡터를 생산하기 위한 올인원 구조의 7종류의 벡터 플라스미드를, 다른 혈청형의 AAV 게놈 및 아데노 바이러스 게놈으로부터 취득한 구성 요소를 사용하여 구축하였다. pGETS118-AarI(Tsuge,　K.,　Sato,　Y.,　Kobayashi,　Y.,Gondo,M.,　Hasebe,M.,　Togashi,T.,　Tomita,　M.,　and　Itaya,　M.　Method　of　preparing　an　equimolar　DNA　mixture　for　one-step　DNA　assembly　of　over　50　fragments.　Sci　Rep　5,　10655　(2015).)에 기초하여 각 플라스미드를 구축하였다(도 12에 모식도를 나타냄). 벡터 플라스미드의 각각에 있어서 사용한 ITR, Rep, Cap 및 Helper(VA, E2A 및 E4)의 유래가 되는 바이러스 게놈의 혈청형을 이하의 표에 나타낸다(도 13도 참조할 것).
*1의 벡터 플라스미드는, 상기 실시예의 것이다(pGETS103-AAV-Helper-RC2).
AAV: 아데노 수반 바이러스 혈청형
Ad: 아데노 바이러스 혈청형 및 군
상기의 각각의 올인원 핵산(전체 길이 15 내지 16kb)을 설계하고, 그 길이에 따라 18 내지 19개의 단위 DNA 단편(700 내지 900bp)을 포함하는 DNA 단편을 화학 합성하였다. 이러한 DNA 단편을, AarI, BbsI, BsaI, BsmBI 중 어느 것의 제한 효소에 의해 잘라내어 단위 DNA 단편을 제조하였다. 이러한 단위 DNA 단편을 AarI로 절단한 pGETS118과 탠덤 리피트에 연결하고, 그 후, 상기 실시예와 마찬가지로 OGAB법에 의해 고초균에 있어서 환상의 플라스미드를 형성시켰다. 그 결과, 상기의 추가의 7종류의 AAV의 올인원 구조의 벡터 플라스미드의 구축이 확인되었다.
이러한 플라스미드를 배양 세포(프로듀서 세포)에 도입함으로써 각각의 바이러스 벡터가 생산되는 것을 확인하였다(도 14).
(실시예 8: 아데노 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구축)
아데노 바이러스 벡터 Ad5에 대해서, 다카라 바이오사의 pAxCAwtit2에 GIO 유전자를 도입한 전체 길이 약 36kb의 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위한 올인원 구조를 설계했다(도 15). 이것을 40개의 약 800bp로 분할하고, PCR 또는 화학 합성에 의해 단위 DNA 단편을 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. 이러한 DNA 단편을, AarI, BbsI, BsaI, BsmBI 중 어느 것의 제한 효소에 의해 잘라내서 단위 DNA 단편을 제조하였다. 그 후, AarI로 절단한 pGETS118-AarI 또는 pBET131(Tanaka,　T.,　and　M.　Ogura.1998.　A　novel　Bacillus　natto　plasmid　pLS32　capable　of　replication　in　Bacillus　subtilis.　FEBS　Lett.422:243-246)의 BamHI 사이트에 링커 DNA를 도입하여 새로운 AarI 사이트를 2군데 도입한 pBET131-AarI(도 16)를 AarI로 절단하여 얻어지는 2개의 커다란 단편과 탠덤 리피트에 연결하고, 그 후, 상기 실시예와 마찬가지로 OGAB법에 의해 고초균에 있어서 환상의 플라스미드를 형성시켰다. 그 결과, 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위한 올인원 구조를 갖는 클론의 구축이 확인되었다.
(실시예 9: 추가의 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드의 구조예)
도 17 내지 22에 나타내는 AAV 바이러스 올인원 벡터 플라스미드도 기도된다.
·도 17은, pGETS103-ΔAarI에 기초하는 AAV1의 Rep 및 AAV6의 Cap를 사용한 구축예이다.
·도 18은, pGETS103-ΔAarI에 기초하는 CAG 프로모터, AAV5의 Rep 및 AAV1의 Cap를 사용한 구축예이다.
·도 19는, pGETS103-ΔAarI에 기초하는 EF1α 프로모터, AAV8의 Rep 및 AAV9의 Cap를 사용한 구축예이다.
·도 20은, pGETS103-ΔAarI에 기초하는 SV40 프로모터를 사용하고, Rep, Cap 및 Helper를 상이한 순서로 배치한 구축예이다.
·도 21은, pGETS131-AarI에 기초하는 Rep, Cap 및 Helper를 상이한 순서로 배치한 구축예이다.
·도 22는, pBETS103-ΔAarI에 기초하는 Helper 유전자의 요소를 변경한(다른 요소와 분리하여 아데노 바이러스 E1A 및 E1B를 추가한) 구축예이다.
(실시예 10: 여러가지 바이러스에 기초하는 바이러스 벡터 플라스미드의 구축)
바이러스 벡터의 설계는, 대략 이하의 2개로 나뉘고, 이것에 적합한 바이러스 벡터 플라스미드가 설계될 수 있다.
(1) 바이러스 자체의 증식능을 없앤 벡터
·바이러스 벡터에 탑재하는 핵산에는, 바이러스의 증식에 필요한 유전자를 남기지 않는다.
·바이러스 벡터에 탑재하는 핵산은, 질환으로 결손되어 있는 단백질, 항원 단백질을 코드하는 유전자, 그것들의 발현에 필요한 유전자 등을 포함한다.
·바이러스 벡터는, 아데노 수반 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 바이러스 등의 바이러스에 기초한다.
·바이러스 벡터 플라스미드는, 목적으로 하는 유전자를 포함한다(ITR 등의 복제 기점 사이). 바이러스 벡터를 구성하는데 필요한 핵산 서열의 요소는, 바이러스 벡터 플라스미드와는 다른 플라스미드로 공급해도 되고, 바이러스 벡터 플라스미드 내의 탑재 핵산 서열(ITR간의 부분 등)의 외측에 포함되어도 된다.
(2) 바이러스 자체의 증식능을 남기는 벡터
·바이러스 벡터에 탑재하는 핵산은, 바이러스가 증식하기 위하여 필요한 유전자를 포함하고, 특정한 세포(암 세포 등)에서만 바이러스가 복제되도록 프로모터 등의 유전자를 개변한다.
·주로 종양 용해를 목적으로 한다..
·바이러스 벡터가 사이토카인(면역 활성화 사이토카인 등) 등의 유전자를 발현하도록 경변함으로써 효과를 증강시켜도 된다.
·바이러스 벡터는, 주로, 아데노 바이러스, 알파 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 코로나 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병 바이러스, 레오 바이러스, 콕사키 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스에 기초한다.
·바이러스 벡터에 탑재하는 핵산은, 일부의 유전자를 개변한 것 이외에는 바이러스 게놈 전체를 포함한다.
바이러스 벡터 플라스미드는 고초균 중에서의 복제에 필요한 핵산 서열(예를 들어 상기 실시예의 복제 개시점)을 포함하도록 개변된다.
이하, 바이러스 벡터의 종류마다의 예시적인 실시 형태를 기재한다.
·코로나 바이러스 벡터
코로나 바이러스 벡터 플라스미드를, pGETS103-ΔAarI를 베이스로 이하의 핵산 서열을 추가하여 구축한다(도 23).
·비구조 단백질 영역의 ORF1a, 비구조 단백질 영역의 ORF1b 및 구조 단백질 영역을 포함하고, 구조 단백질 영역에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. 구조 단백질 영역의 스파이크 유전자 S, 엔벨로프 유전자 E, 매트릭스 유전자 M, 뉴클레오캡시드 유전자 N 등은 필요에 따라서 결손시켜도 된다.
·아데노 수반 바이러스 벡터
프로듀서 세포 내에서 이하의 단백질이 발현되도록 계를 구축한다: Cap, Rep, AAP, MAAP, E1A, E1B, E2A, E4, VA RNA. 이러한 단백질을 코드하는 핵산은, 바이러스 벡터 플라스미드 중의 2개의 ITR의 외측의 영역 또는 상이한 플라스미드에 배치된다. 바이러스 벡터 플라스미드는, 2개의 ITR 그리고 그 내측에 목적으로 하는 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.
프로듀서 세포로서 HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela 또는 Sf9 등을 사용한다.
·레트로 바이러스 벡터
프로듀서 세포 내에서 이하의 단백질이 발현되도록 계를 구축한다: Gag, Pol, Env. 이러한 단백질을 코드하는 핵산은, 바이러스 벡터 플라스미드 중의 2개의 LTR 외측의 영역 또는 상이한 플라스미드에 배치된다. 바이러스 벡터 플라스미드는, 2개의 LTR 그리고 그 내측에 목적으로 하는 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. LTR의 U3 영역을 결손시켜도 된다(SIN화).
프로듀서 세포로서 HEK293T 등을 사용한다.
·렌티 바이러스 벡터
프로듀서 세포 내에서 이하의 단백질이 발현되도록 계를 구축한다: Gag, Pol, Env, Rev.
이러한 단백질을 코드하는 핵산은, 바이러스 벡터 플라스미드 중의 2개의 LTR의 외측의 영역 또는 상이한 플라스미드에 배치된다. 바이러스 벡터 플라스미드는, 2개의 LTR 내측 그리고 그 내측에 목적으로 하는 유전자, 프로모터, 터미네이터, WPRE를 포함한다. LTR의 U3 영역을 결손시켜도 되고(SIN화), TAT를 결손시켜도 된다. 렌티 바이러스 벡터는, VSV-G를 발현되도록 구축해도 된다.
프로듀서 세포로서 HEK293T, HEK293, HEK293F 또는 Hela 등을 사용한다.
·센다이 바이러스 벡터
프로듀서 세포 내에서 이하의 단백질이 발현되도록 계를 구축한다: N, P, V, C, M, F, HN, L. F 유전자를 결손시켜도 된다. 이러한 단백질을 코드하는 핵산은, 바이러스 벡터 플라스미드 중의 LE 및 TR의 내측 또는 상이한 플라스미드에 배치된다. 바이러스 벡터 플라스미드는, LE 및 TR의 내측에 목적으로 하는 유전자를 포함한다. F 유전자를 결손시킨 부위에 목적으로 하는 유전자를 삽입해도 된다.
프로듀서 세포로서 BHK/T7 등을 사용한다.
·아데노 바이러스 벡터
바이러스 벡터 플라스미드는, E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4, L5, IX, IVa2를 포함한다. E1A를 결손시켜도 되고, 결손시킨 부위에 목적으로 하는 유전자를 삽입해도 된다.
프로듀서 세포로서 HEK293, HEK293T, HEK293F, Hela 또는 Sf9 등을 사용한다.
·단순 헤르페스 바이러스
바이러스 벡터 플라스미드는, UL9, UL19, UL26, UL35, US6, US7, US11을 포함한다. γ34.5, α47, ICP6 중의 1개 또는 복수개를 결손시켜도 되고, γ34.5 결손 개소에 사이토카인(면역 활성화 사이토카인 등) 생산 유전자를 도입해도 된다.
프로듀서 세포로서 Hela 또는 Vero 등을 사용한다.
·백시니아 바이러스
바이러스 벡터 플라스미드는, D1R, D2L, D3R, D4R, D5R, D6R, D7R, D8L, D11L, D13L을 포함한다. 티미딘 키나아제를 결손시켜도 된다.
·레오 바이러스
레오 바이러스 벡터 플라스미드는, L1, L2, L3, M1, M2, M3, S1, S2, S4를 포함한다.
프로듀서 세포로서 L929 등을 사용한다.
·콕사키 바이러스
바이러스 벡터 플라스미드는, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D, VP1, VP2, VP3, VP4를 포함한다.
프로듀서 세포로서 H1299, HeLa 등을 사용한다.
·뉴캐슬병 바이러스
바이러스 벡터 플라스미드는, L, NP, P, HN, F, M을 포함한다.
(실시예 9: 제품 제조예)
HEK293 등의 숙주 세포를 바이오리액터 내에서 배양한 후, PEI 등의 형질 감염 시약을 사용하여 본 개시의 플라스미드를 형질 감염한다. 배양을 계속한 후, 세포를 파쇄함으로써 바이러스 벡터를 회수하고, 필터 여과 또는 원심 분리 처리에 의해 세포 파편을 제거한다. 제조 원료, 숙주 유래 단백질, 핵산 등의 불순물을, 이온 교환 크로마토그래피 그리고 친화성 크로마토그래피로 제거한 후, 탄젠셜 플로 크로마토그래피를 사용하여 버퍼 치환과 농축을 행한다. 마지막으로, 무균 여과 또는 제균 여과를 행하고, 유리 바이알 등의 1차 용기에 충전하여 최종 제품을 제조한다.
(주기)
이상과 같이, 본 개시의 바람직한 실시 형태를 사용하여 본 개시를 예시해 왔지만, 본 개시는, 특허 청구 범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것이라고 이해된다. 본 명세서에 있어서 인용한 특허, 특허 출원 및 문헌은, 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되고 있는 것과 마찬가지로 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 한다는 것이 이해된다.
본 출원은, 2020년 11월 4일에 일본 특허청에 출원된 일본 특허 출원 제2020-184495호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 그 내용 전체가 본 명세서에 참고로서 원용된다.
본 개시는, 새로운 계에 있어서의 벡터 플라스미드의 생산을 제공하고, 이 계에 기초하는 벡터 플라스미드의 공급을 가능하게 할 수 있다.
[서열목록 프리 텍스트]
서열 번호 1: PCR 산물
tagGGTCTCaAGCTtgCCTGCAGGcaGATCatgcgcaggtgcacctgcatgcGATCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAATTTATCCACCAGACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTTTGCACGGTCTAGAGCGTCAACGACTGCGCACGCCTCACCGGCCAGAGCGTCCCGACCATGGAGCACTTTTTGCCGCTGCGCAACATCTGGAACCGCGTCCGCGACTTTCCGCGCGCCTCCACCACCGCCGCCGGCATCACCTGGATGTCCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCatatatCCCGGGAGCTaGAGACCtca
서열 번호 2: pGETS103-AAV-Helper-RC2
(서열목록에 기재된 바와 같음)
서열 번호 3 : 링커 F
AGCTTGCGCAGGTGCACCTGCATGCGG
서열 번호 4 : 링커 R
AGCTCCGCATGCAGGTGCACCTGCGCA
서열 번호 5 : 제1-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCAAGCTTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGG
서열 번호 6 : 제1-2
GGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAAAGCTTGATATCGATAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCT
서열 번호 7 : 제1-3
ATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCAT
서열 번호 8 : 제1-4
GTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGC
서열 번호 9 : 제1-5
GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACT
서열 번호 10 : 제1-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCCTGGGCCCTTAAGGATATCCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAAC
서열 번호 11 : 제3-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTT
서열 번호 12 : 제3-2
AGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGGGAGGCCAAGGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGGAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCCGTCTCTACCAAAAAAACAAAAATTAGCTGAGCCTGGTCATGC
서열 번호 13 : 제3-3
GGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTATCGATAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG
서열 번호 14 : 제3-4
GGAAGCTGTAGAGCTGTTCCTGGTTGCGACGCAGGGTGGGCTGTACCTGGGGACTGTTAAGCATGGAGTTGGGTACCGGATCTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACC
서열 번호 15 : 제3-5
CGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGT
서열 번호 16 : 제3-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCTGTCCCTGCCAGTGGCGCATAGCGATGCGCGGCAGAACCCCTTTGATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGGGGGTAAATAATCACCCGAGAGTGTACAAATAAAAACATTTGCCTTTATTGAAAGTGTCTCCT
서열 번호 17 : 제16-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTAGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGAAGATCAGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTGATCTGCGCAGCCGCC
서열 번호 18 : 제16-2
CAGAATCTGGCGGCAACTCCCATTCCTTCTCGGCCACCCAGTTCACAAAGCTGTCAGAAATGCCGGGCAGATGCTCGTCAAGGTCGCTGGGGACCTTAATCACAATCTCGTAAAACCCCGGCATGGCGGCTGCGCAGATCAGAAGTTCCTATAC
서열 번호 19 : 제16-3
AGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAAT
서열 번호 20 : 제16-4
CCGCGGTAAATTCTCTGAATCAGTTTTTCGCGAATCTGACTCAGGAAACGTCCCAAAACCATGGATTTCACCCCGGTGGTTTCCACGAGCACGTGCATGTGGAAGTAGCTCTCTCCCTTCTCAAATTGCACAAAGAAAAGGGCCTCCGGGGCCT
서열 번호 21 : 제16-5
CGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAG
서열 번호 22 : 제16-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTGCGACACGTGCGTCAGATGCTGCGCCACCAACCGTTTACGCTCCGTGAGATTCAAACAGGCGCTTAAATACTGTTCCATATTAGTCCACGCCCACTGGAGCTCAGGCTGGGTTTTGGGGAGCAAGTAATT
서열 번호 23 : 제1-F
TAGCACCTGCATGCAAGCTTGCCTGCAGGCA
서열 번호 24 : 제1-R
TAGCACCTGCGCATCTGGGCCCTTAAGGATATC
서열 번호 25 : 제2-F
TAGGGTCTCGCCAGCCGGCC
서열 번호 26 : 제2-R
TAGGGTCTCCTTCCCAATAGACCCCGCA
서열 번호 27 : 제3-F
TAGCACCTGCATGCGGAACCAAGCTGGAGTG
서열 번호 28 : 제3-R
TAGCACCTGCGCATTGTCCCTGCCAGTGG
서열 번호 29 : 제4-F
TAGGGTCTCGGACACGTTGCGATACTGGT
서열 번호 30 : 제4-R
TAGGGTCTCCCACGAGCCCACGG
서열 번호 31 : 제5-F
TAGCACCTGCATGCCGTGGTGCTTGTAGGTTAC
서열 번호 32 : 제5-R
TAGCACCTGCGCATGAGCGCGGACGC
서열 번호 33 : 제6-F
TAGGGTCTCGGCTCGGGGGTGGT
서열 번호 34 : 제6-R
TAGGGTCTCCTTGCCGCGCGTTTCTC
서열 번호 35 : 제7-F
TAGCACCTGCATGCGCAAACGCTCTGCAACAAGA
서열 번호 36 : 제7-R
TAGCACCTGCGCATGTCCGCCAGGTGC
서열 번호 37 : 제8-F
TAGGGTCTCGGGACATTATCTTCCCCGAAC
서열 번호 38 : 제8-R
TAGGGTCTCCGTGGCGGCGGC
서열 번호 39 : 제9-F
TAGCACCTGCATGCCCACCCACGGACGA
서열 번호 40 : 제9-R
TAGCACCTGCGCATGAGGGAGCGCAGAGA
서열 번호 41 : 제10-F
TAGGGTCTCGCCTCACCCGCAGCTG
서열 번호 42 : 제10-R
TAGGGTCTCCGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTC
서열 번호 43 : 제11-F
TAGCACCTGCATGCAGTCCTATATATACTCGCTCTGTACT
서열 번호 44 : 제11-R
TAGCACCTGCGCATGGAGCTATGCTAACCAGC
서열 번호 45 : 제12-F
TAGGGTCTCGCTCCGAGTATGCGTGTCA
서열 번호 46 : 제12-R
TAGGGTCTCCGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCA
서열 번호 47 : 제13-F
TAGCACCTGCATGCCTACTACACAGAGCGAGCT
서열 번호 48 : 제13-R
TAGCACCTGCGCATGCACAGCACCACAATATTGTTCA
서열 번호 49 : 제14-F
TAGCACCTGCATGCGTGCTGCAGTTACTGTGCT
서열 번호 50 : 제14-R
TAGCACCTGCGCATTAGCGAGGTAAGCACTTACTCT
서열 번호 51 : 제15-F
TAGGGTCTCGGCTAGTTTCTGTGGATTCACTAGA
서열 번호 52 : 제15-R
TAGGGTCTCCCCTGGACATCCAGGTGA
서열 번호 53 : 제16-F
TAGGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGT
서열 번호 54 : 제16-R
TAGGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTG
서열 번호 55 : 제17-F
TAGCACCTGCATGCGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCC
서열 번호 56 : 제17-R
TAGCACCTGCGCATGGTGAGTTCAAATTTGAACATCCG
서열 번호 57 : 제18-F
TAGGGTCTCGCACCCGCCGTCTG
서열 번호 58 : 제18-R
TAGGGTCTCCCGAGGGCCGCG
서열 번호 59 : 제19-F
TAGCACCTGCATGCCTCGAGCACGACAAAGC
서열 번호 60 : 제19-R
TAGCACCTGCGCATTGACTTGAATGTTAAAGAGCTTGAAGTTGA
서열 번호 61 : 제20-F
TAGGGTCTCGGTCAAAGAGGTCACGCAGA
서열 번호 62 : 제20-R
TAGGGTCTCCTTGGTTGTCCTGATTTCCTCTTC
서열 번호 63 : 제21-F
TAGCACCTGCATGCCCAATCCCGTGGCTAC
서열 번호 64 : 제21-R
TAGCACCTGCGCATGCATATGATACACTTGATGTACTGC
서열 번호 65 : 제22-F
TAGGGTCTCGATGCCAAGTACGCCCCCT
서열 번호 66 : 제22-R
TAGGGTCTCCCTCCCGGGCTGTAGT
서열 번호 67 : ITR 표적 프라이머 (포워드)
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
서열 번호 68 : ITR 표적 프라이머 (리버스)
CGGCCTCAGTGAGCGA
서열 번호 69 : CMV 표적 프라이머 (포워드)
CATCAATGGGCGTGGATAGC
서열 번호 70 : CMV 표적 프라이머 (리버스)
GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA
서열 번호 71 : Ampr 유전자 영역 표적 프라이머(포워드)
TTGATCGTTGGGAACCGGAG
서열 번호 72 : Ampr 유전자 영역 표적 프라이머(리버스)
TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG
SEQUENCE LISTING <110> Synplogen <120> Virus vector plasmid production in Bacillus bacteria <130> SPG006PCT <150> JP 2020-184495 <151> 2020-11-04 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCR product <400> 1 tagggtctca agcttgcctg caggcagatc atgcgcaggt gcacctgcat gcgatccggg 60 gttcgaaccc cggtcgtccg ccatgatacc cttgcgaatt tatccaccag accacggaag 120 agtgcccgct tacaggctct ccttttgcac ggtctagagc gtcaacgact gcgcacgcct 180 caccggccag agcgtcccga ccatggagca ctttttgccg ctgcgcaaca tctggaaccg 240 cgtccgcgac tttccgcgcg cctccaccac cgccgccggc atcacctgga tgtccaggta 300 catctacgga ttacgtcgac gtttaaacca tatgagcggc cgcatatatc ccgggagcta 360 gagacctca 369 <210> 2 <211> 31764 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid <400> 2 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gcttgcctgc aggcagctgc gcgctcgctc 60 gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 120 agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttcctatcg 180 atatcaagct ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 240 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 300 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 360 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 420 tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 480 agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 540 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 600 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 660 aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 720 gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt ggatatcctt aagggcccag 780 ccggcccgaa tcccggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg 840 acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccacaaaaaa tgctttcttc ttttaatata 900 cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag ggcaataatg 960 atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa tttctgggtt 1020 aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta actgatgtaa 1080 gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt tattttatgg 1140 ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat catgttcata 1200 cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac 1260 tttggcaaag aattgggatt cgcgagaatt ctctagagtc gacactagtg cggatccacg 1320 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 1380 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 1440 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 1500 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 1560 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1620 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1680 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1740 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttatcg 1800 atagatctag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 1860 cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 1920 gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggc agatccggta cccaactcca tgcttaacag 1980 tccccaggta cagcccaccc tgcgtcgcaa ccaggaacag ctctacagct tcctggagcg 2040 ccactcgccc tacttccgca gccacagtgc gcagattagg agcgccactt ctttttgtca 2100 cttgaaaaac atgtaaaaat aatgtactag gagacacttt caataaaggc aaatgttttt 2160 atttgtacac tctcgggtga ttatttaccc cccacccttg ccgtctgcgc cgtttaaaaa 2220 tcaaaggggt tctgccgcgc atcgctatgc gccactggca gggacacgtt gcgatactgg 2280 tgtttagtgc tccacttaaa ctcaggcaca accatccgcg gcagctcggt gaagttttca 2340 ctccacaggc tgcgcaccat caccaacgcg tttagcaggt cgggcgccga tatcttgaag 2400 tcgcagttgg ggcctccgcc ctgcgcgcgc gagttgcgat acacagggtt gcagcactgg 2460 aacactatca gcgccgggtg gtgcacgctg gccagcacgc tcttgtcgga gatcagatcc 2520 gcgtccaggt cctccgcgtt gctcagggcg aacggagtca actttggtag ctgccttccc 2580 aaaaagggtg catgcccagg ctttgagttg cactcgcacc gtagtggcat cagaaggtga 2640 ccgtgcccgg tctgggcgtt aggatacagc gcctgcatga aagccttgat ctgcttaaaa 2700 gccacctgag cctttgcgcc ttcagagaag aacatgccgc aagacttgcc ggaaaactga 2760 ttggccggac aggccgcgtc atgcacgcag caccttgcgt cggtgttgga gatctgcacc 2820 acatttcggc cccaccggtt cttcacgatc ttggccttgc tagactgctc cttcagcgcg 2880 cgctgcccgt tttcgctcgt cacatccatt tcaatcacgt gctccttatt tatcataatg 2940 ctcccgtgta gacacttaag ctcgccttcg atctcagcgc agcggtgcag ccacaacgcg 3000 cagcccgtgg gctcgtggtg cttgtaggtt acctctgcaa acgactgcag gtacgcctgc 3060 aggaatcgcc ccatcatcgt cacaaaggtc ttgttgctgg tgaaggtcag ctgcaacccg 3120 cggtgctcct cgtttagcca ggtcttgcat acggccgcca gagcttccac ttggtcaggc 3180 agtagcttga agtttgcctt tagatcgtta tccacgtggt acttgtccat caacgcgcgc 3240 gcagcctcca tgcccttctc ccacgcagac acgatcggca ggctcagcgg gtttatcacc 3300 gtgctttcac tttccgcttc actggactct tccttttcct cttgcgtccg cataccccgc 3360 gccactgggt cgtcttcatt cagccgccgc accgtgcgct tacctccctt gccgtgcttg 3420 attagcaccg gtgggttgct gaaacccacc atttgtagcg ccacatcttc tctttcttcc 3480 tcgctgtcca cgatcacctc tggggatggc gggcgctcgg gcttgggaga ggggcgcttc 3540 tttttctttt tggacgcaat ggccaaatcc gccgtcgagg tcgatggccg cgggctgggt 3600 gtgcgcggca ccagcgcatc ttgtgacgag tcttcttcgt cctcggactc gagacgccgc 3660 ctcagccgct tttttggggg cgcgcgggga ggcggcggcg acggcgacgg ggacgacacg 3720 tcctccatgg ttggtggacg tcgcgccgca ccgcgtccgc gctcgggggt ggtttcgcgc 3780 tgctcctctt cccgactggc catttccttc tcctataggc agaaaaagat catggagtca 3840 gtcgagaagg aggacagcct aaccgccccc tttgagttcg ccaccaccgc ctccaccgat 3900 gccgccaacg cgcctaccac cttccccgtc gaggcacccc cgcttgagga ggaggaagtg 3960 attatcgagc aggacccagg ttttgtaagc gaagacgacg aggatcgctc agtaccaaca 4020 gaggataaaa agcaagacca ggacgacgca gaggcaaacg aggaacaagt cgggcggggg 4080 gaccaaaggc atggcgacta cctagatgtg ggagacgacg tgctgttgaa gcatctgcag 4140 cgccagtgcg ccattatctg cgacgcgttg caagagcgca gcgatgtgcc cctcgccata 4200 gcggatgtca gccttgccta cgaacgccac ctgttctcac cgcgcgtacc ccccaaacgc 4260 caagaaaacg gcacatgcga gcccaacccg cgcctcaact tctaccccgt atttgccgtg 4320 ccagaggtgc ttgccaccta tcacatcttt ttccaaaact gcaagatacc cctatcctgc 4380 cgtgccaacc gcagccgagc ggacaagcag ctggccttgc ggcagggcgc tgtcatacct 4440 gatatcgcct cgctcgacga agtgccaaaa atctttgagg gtcttggacg cgacgagaaa 4500 cgcgcggcaa acgctctgca acaagaaaac agcgaaaatg aaagtcactg tggagtgctg 4560 gtggaacttg agggtgacaa cgcgcgccta gccgtgctga aacgcagcat cgaggtcacc 4620 cactttgcct acccggcact taacctaccc cccaaggtta tgagcacagt catgagcgag 4680 ctgatcgtgc gccgtgcacg acccctggag agggatgcaa acttgcaaga acaaaccgag 4740 gagggcctac ccgcagttgg cgatgagcag ctggcgcgct ggcttgagac gcgcgagcct 4800 gccgacttgg aggagcgacg caagctaatg atggccgcag tgcttgttac cgtggagctt 4860 gagtgcatgc agcggttctt tgctgacccg gagatgcagc gcaagctaga ggaaacgttg 4920 cactacacct ttcgccaggg ctacgtgcgc caggcctgca aaatttccaa cgtggagctc 4980 tgcaacctgg tctcctacct tggaattttg cacgaaaacc gcctcgggca aaacgtgctt 5040 cattccacgc tcaagggcga ggcgcgccgc gactacgtcc gcgactgcgt ttacttattt 5100 ctgtgctaca cctggcaaac ggccatgggc gtgtggcagc aatgcctgga ggagcgcaac 5160 ctaaaggagc tgcagaagct gctaaagcaa aacttgaagg acctatggac ggccttcaac 5220 gagcgctccg tggccgcgca cctggcggac attatcttcc ccgaacgcct gcttaaaacc 5280 ctgcaacagg gtctgccaga cttcaccagt caaagcatgt tgcaaaactt taggaacttt 5340 atcctagagc gttcaggaat tctgcccgcc acctgctgtg cgcttcctag cgactttgtg 5400 cccattaagt accgtgaatg ccctccgccg ctttggggtc actgctacct tctgcagcta 5460 gccaactacc ttgcctacca ctccgacatc atggaagacg tgagcggtga cggcctactg 5520 gagtgtcact gtcgctgcaa cctatgcacc ccgcaccgct ccctggtctg caattcgcaa 5580 ctgcttagcg aaagtcaaat tatcggtacc tttgagctgc agggtccctc gcctgacgaa 5640 aagtccgcgg ctccggggtt gaaactcact ccggggctgt ggacgtcggc ttaccttcgc 5700 aaatttgtac ctgaggacta ccacgcccac gagattaggt tctacgaaga ccaatcccgc 5760 ccgccaaatg cggagcttac cgcctgcgtc attacccagg gccacatcct tggccaattg 5820 caagccatca acaaagcccg ccaagagttt ctgctacgaa agggacgggg ggtttacctg 5880 gacccccagt ccggcgagga gctcaaccca atccccccgc cgccgcagcc ctatcagcag 5940 ccgcgggccc ttgcttccca ggatggcacc caaaaagaag ctgcagctgc cgccgccgcc 6000 acccacggac gaggaggaat actgggacag tcaggcagag gaggttttgg acgaggagga 6060 ggagatgatg gaagactggg acagcctaga cgaagcttcc gaggccgaag aggtgtcaga 6120 cgaaacaccg tcaccctcgg tcgcattccc ctcgccggcg ccccagaaat tggcaaccgt 6180 tcccagcatc gctacaacct ccgctcctca ggcgccgccg gcactgcctg ttcgccgacc 6240 caaccgtaga tgggacacca ctggaaccag ggccggtaag tctaagcagc cgccgccgtt 6300 agcccaagag caacaacagc gccaaggcta ccgctcgtgg cgcgggcaca agaacgccat 6360 agttgcttgc ttgcaagact gtgggggcaa catctccttc gcccgccgct ttcttctcta 6420 ccatcacggc gtggccttcc cccgtaacat cctgcattac taccgtcatc tctacagccc 6480 ctactgcacc ggcggcagcg gcagcggcag caacagcagc ggtcacacag aagcaaaggc 6540 gaccggatag caagactctg acaaagccca agaaatccac agcggcggca gcagcaggag 6600 gaggagcgct gcgtctggcg cccaacgaac ccgtatcgac ccgcgagctt agaaatagga 6660 tttttcccac tctgtatgct atatttcaac aaagcagggg ccaagaacaa gagctgaaaa 6720 taaaaaacag gtctctgcgc tccctcaccc gcagctgcct gtatcacaaa agcgaagatc 6780 agcttcggcg cacgctggaa gacgcggagg ctctcttcag caaatactgc gcgctgactc 6840 ttaaggacta gtttcgcgcc ctttctcaaa tttaagcgcg aaaactacgt catctccagc 6900 ggccacaccc ggcgccagca cctgtcgtca gcgccattat gagcaaggaa attcccacgc 6960 cctacatgtg gagttaccag ccacaaatgg gacttgcggc tggagctgcc caagactact 7020 caacccgaat aaactacatg agcgcgggac cccacatgat atcccgggtc aacggaatcc 7080 gcgcccaccg aaaccgaatt ctcctcgaac aggcggctat taccaccaca cctcgtaata 7140 accttaatcc ccgtagttgg cccgctgccc tggtgtacca ggaaagtccc gctcccacca 7200 ctgtggtact tcccagagac gcccaggccg aagttcagat gactaactca ggggcgcagc 7260 ttgcgggcgg ctttcgtcac agggtgcggt cgcccgggcg ttttagggcg gagtaacttg 7320 catgtattgg gaattgtagt ttttttaaaa tgggaagtga cgtatcgtgg gaaaacggaa 7380 gtgaagattt gaggaagttg tgggtttttt ggctttcgtt tctgggcgta ggttcgcgtg 7440 cggttttctg ggtgtttttt gtggacttta accgttacgt cattttttag tcctatatat 7500 actcgctctg tacttggccc tttttacact gtgactgatt gagctggtgc cgtgtcgagt 7560 ggtgtttttt aataggtttt tttactggta aggctgactg ttatggctgc cgctgtggaa 7620 gcgctgtatg ttgttctgga gcgggagggt gctattttgc ctaggcagga gggtttttca 7680 ggtgtttatg tgtttttctc tcctattaat tttgttatac ctcctatggg ggctgtaatg 7740 ttgtctctac gcctgcgggt atgtattccc ccgggctatt tcggtcgctt tttagcactg 7800 accgatgtta accaacctga tgtgtttacc gagtcttaca ttatgactcc ggacatgacc 7860 gaggaactgt cggtggtgct ttttaatcac ggtgaccagt ttttttacgg tcacgccggc 7920 atggccgtag tccgtcttat gcttataagg gttgtttttc ctgttgtaag acaggcttct 7980 aatgtttaaa tgtttttttt tttgttattt tattttgtgt ttaatgcagg aacccgcaga 8040 catgtttgag agaaaaatgg tgtctttttc tgtggtggtt ccggaactta cctgccttta 8100 tctgcatgag catgactacg atgtgcttgc ttttttgcgc gaggctttgc ctgatttttt 8160 gagcagcacc ttgcatttta tatcgccgcc catgcaacaa gcttacatag gggctacgct 8220 ggttagcata gctccgagta tgcgtgtcat aatcagtgtg ggttcttttg tcatggttcc 8280 tggcggggaa gtggccgcgc tggtccgtgc agacctgcac gattatgttc agctggccct 8340 gcgaagggac ctacgggatc gcggtatttt tgttaatgtt ccgcttttga atcttataca 8400 ggtctgtgag gaacctgaat ttttgcaatc atgattcgct gcttgaggct gaaggtggag 8460 ggcgctctgg agcagatttt tacaatggcc ggacttaata ttcgggattt gcttagagac 8520 atattgataa ggtggcgaga tgaaaattat ttgggcatgg ttgaaggtgc tggaatgttt 8580 atagaggaga ttcaccctga agggtttagc ctttacgtcc acttggacgt gagggcagtt 8640 tgccttttgg aagccattgt gcaacatctt acaaatgcca ttatctgttc tttggctgta 8700 gagtttgacc acgccaccgg aggggagcgc gttcacttaa tagatcttca ttttgaggtt 8760 ttggataatc ttttggaata aaaaaaaaaa aacatggttc ttccagctct tcccgctcct 8820 cccgtgtgtg actcgcagaa cgaatgtgta ggttggctgg gtgtggctta ttctgcggtg 8880 gtggatgtta tcagggcagc ggcgcatgaa ggagtttaca tagaacccga agccaggggg 8940 cgcctggatg ctttgagaga gtggatatac tacaactact acacagagcg agctaagcga 9000 cgagaccgga gacgcagatc tgtttgtcac gcccgcacct ggttttgctt caggaaatat 9060 gactacgtcc ggcgttccat ttggcatgac actacgacca acacgatctc ggttgtctcg 9120 gcgcactccg tacagtaggg atcgcctacc tccttttgag acagagaccc gcgctaccat 9180 actggaggat catccgctgc tgcccgaatg taacactttg acaatgcaca acgtgagtta 9240 cgtgcgaggt cttccctgca gtgtgggatt tacgctgatt caggaatggg ttgttccctg 9300 ggatatggtt ctgacgcggg aggagcttgt aatcctgagg aagtgtatgc acgtgtgcct 9360 gtgttgtgcc aacattgata tcatgacgag catgatgatc catggttacg agtcctgggc 9420 tctccactgt cattgttcca gtcccggttc cctgcagtgc atagccggcg ggcaggtttt 9480 ggccagctgg tttaggatgg tggtggatgg cgccatgttt aatcagaggt ttatatggta 9540 ccgggaggtg gtgaattaca acatgccaaa agaggtaatg tttatgtcca gcgtgtttat 9600 gaggggtcgc cacttaatct acctgcgctt gtggtatgat ggccacgtgg gttctgtggt 9660 ccccgccatg agctttggat acagcgcctt gcactgtggg attttgaaca atattgtggt 9720 gctgtgctgc agttactgtg ctgatttaag tgagatcagg gtgcgctgct gtgcccggag 9780 gacaaggcgt ctcatgctgc gggcggtgcg aatcatcgct gaggagacca ctgccatgtt 9840 gtattcctgc aggacggagc ggcggcggca gcagtttatt cgcgcgctgc tgcagcacca 9900 ccgccctatc ctgatgcacg attatgactc tacccccatg taggcgtgga cttccccttc 9960 gccgcccgtt gagcaaccgc aagttggaca gcagcctgtg gctcagcagc tggacagcga 10020 catgaactta agcgagctgc ccggggagtt tattaatatc actgatgagc gtttggctcg 10080 acaggaaacc gtgtggaata taacacctaa gaatatgtct gttacccatg atatgatgct 10140 ttttaaggcc agccggggag aaaggactgt gtactctgtg tgttgggagg gaggtggcag 10200 gttgaatact agggttctgt gagtttgatt aaggtacggt gatcaatata agctatgtgg 10260 tggtggggct atactactga atgaaaaatg acttgaaatt ttctgcaatt gaaaaataaa 10320 cacgttgaaa cataacatgc aacaggttca cgattcttta ttcctgggca atgtaggaga 10380 aggtgtaaga gttggtagca aaagtttcag tggtgtattt tccactttcc caggaccatg 10440 taaaagacat agagtaagtg cttacctcgc tagtttctgt ggattcacta gaatcgatgt 10500 aggatgttgc ccctcctgac gcggtaggag aaggggaggg tgccctgcat gtctgccgct 10560 gctcttgctc ttgccgctgc tgaggagggg ggcgcatctg ccgcagcacc ggatgcatct 10620 gggaaaagca aaaaaggggc tcgtccctgt ttccggagga atttgcaagc ggggtcttgc 10680 atgacgggga ggcaaacccc cgttcgccgc agtccggccg gcccgagact cgaaccgggg 10740 gtcctgcgac tcaacccttg gaaaataacc ctccggctac agggagcgag ccacttaatg 10800 ctttcgcttt ccagcctaac cgcttacgcc gcgcgcggcc agtggccaaa aaagctagcg 10860 cagcagccgc cgcgcctgga aggaagccaa aaggagcgct cccccgttgt ctgacgtcgc 10920 acacctgggt tcgacacgcg ggcggtaacc gcatggatca cggcggacgg ccggatccgg 10980 ggttcgaacc ccggtcgtcc gccatgatac ccttgcgaat ttatccacca gaccacggaa 11040 gagtgcccgc ttacaggctc tccttttgca cggtctagag cgtcaacgac tgcgcacgcc 11100 tcaccggcca gagcgtcccg accatggagc actttttgcc gctgcgcaac atctggaacc 11160 gcgtccgcga ctttccgcgc gcctccacca ccgccgccgg catcacctgg atgtccaggt 11220 acatctacgg attacgtcga cgtttaaacc atatgagcgg ccgctctaga actagtggat 11280 cccccggaag atcagaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 11340 tctgatctgc gcagccgcca tgccggggtt ttacgagatt gtgattaagg tccccagcga 11400 ccttgacgag catctgcccg gcatttctga cagctttgtg aactgggtgg ccgagaagga 11460 atgggagttg ccgccagatt ctgacatgga tctgaatctg attgagcagg cacccctgac 11520 cgtggccgag aagctgcagc gcgactttct gacggaatgg cgccgtgtga gtaaggcccc 11580 ggaggccctt ttctttgtgc aatttgagaa gggagagagc tacttccaca tgcacgtgct 11640 cgtggaaacc accggggtga aatccatggt tttgggacgt ttcctgagtc agattcgcga 11700 aaaactgatt cagagaattt accgcgggat cgagccgact ttgccaaact ggttcgcggt 11760 cacaaagacc agaaatggcg ccggaggcgg gaacaaggtg gtggatgagt gctacatccc 11820 caattacttg ctccccaaaa cccagcctga gctccagtgg gcgtggacta atatggaaca 11880 gtatttaagc gcctgtttga atctcacgga gcgtaaacgg ttggtggcgc agcatctgac 11940 gcacgtgtcg cagacgcagg agcagaacaa agagaatcag aatcccaatt ctgatgcgcc 12000 ggtgatcaga tcaaaaactt cagccaggta catggagctg gtcgggtggc tcgtggacaa 12060 ggggattacc tcggagaagc agtggatcca ggaggaccag gcctcataca tctccttcaa 12120 tgcggcctcc aactcgcggt cccaaatcaa ggctgccttg gacaatgcgg gaaagattat 12180 gagcctgact aaaaccgccc ccgactacct ggtgggccag cagcccgtgg aggacatttc 12240 cagcaatcgg atttataaaa ttttggaact aaacgggtac gatccccaat atgcggcttc 12300 cgtctttctg ggatgggcca cgaaaaagtt cggcaagagg aacaccatct ggctgtttgg 12360 gcctgcaact accgggaaga ccaacatcgc ggaggccata gcccacactg tgcccttcta 12420 cgggtgcgta aactggacca atgagaactt tcccttcaac gactgtgtcg acaagatggt 12480 gatctggtgg gaggagggga agatgaccgc caaggtcgtg gagtcggcca aagccattct 12540 cggaggaagc aaggtgcgcg tggaccagaa atgcaagtcc tcggcccaga tagacccgac 12600 tcccgtgatc gtcacctcca acaccaacat gtgcgccgtg attgacggga actcaacgac 12660 cttcgaacac cagcagccgt tgcaagaccg gatgttcaaa tttgaactca cccgccgtct 12720 ggatcatgac tttgggaagg tcaccaagca ggaagtcaaa gactttttcc ggtgggcaaa 12780 ggatcacgtg gttgaggtgg agcatgaatt ctacgtcaaa aagggtggag ccaagaaaag 12840 acccgccccc agtgacgcag atataagtga gcccaaacgg gtgcgcgagt cagttgcgca 12900 gccatcgacg tcagacgcgg aagcttcgat caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg 12960 ttctcgtcac gtgggcatga atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa 13020 tcagaattca aatatctgct tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt 13080 gtcagaatct caacccgttt ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca 13140 tcatatcatg ggaaaggtgc cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca atgtggattt 13200 ggatgactgc atctttgaac aataaatgat ttaaatcagg tatggctgcc gatggttatc 13260 ttccagattg gctcgaggac actctctctg aaggaataag acagtggtgg aagctcaaac 13320 ctggcccacc accaccaaag cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg ggtcttgtgc 13380 ttcctgggta caagtacctc ggacccttca acggactcga caagggagag ccggtcaacg 13440 aggcagacgc cgcggccctc gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc gacagcggag 13500 acaacccgta cctcaagtac aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc cttaaagaag 13560 atacgtcttt tgggggcaac ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag agggttcttg 13620 aacctctggg cctggttgag gaacctgtta agacggctcc gggaaaaaag aggccggtag 13680 agcactctcc tgtggagcca gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc cagcagcctg 13740 caagaaaaag attgaatttt ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct gacccccagc 13800 ctctcggaca gccaccagca gccccctctg gtctgggaac taatacgatg gctacaggca 13860 gtggcgcacc aatggcagac aataacgagg gcgccgacgg agtgggtaat tcctcgggaa 13920 attggcattg cgattccaca tggatgggcg acagagtcat caccaccagc acccgaacct 13980 gggccctgcc cacctacaac aaccacctct acaaacaaat ttccagccaa tcaggagcct 14040 cgaacgacaa tcactacttt ggctacagca ccccttgggg gtattttgac ttcaacagat 14100 tccactgcca cttttcacca cgtgactggc aaagactcat caacaacaac tggggattcc 14160 gacccaagag actcaacttc aagctcttta acattcaagt caaagaggtc acgcagaatg 14220 acggtacgac gacgattgcc aataacctta ccagcacggt tcaggtgttt actgactcgg 14280 agtaccagct cccgtacgtc ctcggctcgg cgcatcaagg atgcctcccg ccgttcccag 14340 cagacgtctt catggtgcca cagtatggat acctcaccct gaacaacggg agtcaggcag 14400 taggacgctc ttcattttac tgcctggagt actttccttc tcagatgctg cgtaccggaa 14460 acaactttac cttcagctac acttttgagg acgttccttt ccacagcagc tacgctcaca 14520 gccagagtct ggaccgtctc atgaatcctc tcatcgacca gtacctgtat tacttgagca 14580 gaacaaacac tccaagtgga accaccacgc agtcaaggct tcagttttct caggccggag 14640 cgagtgacat tcgggaccag tctaggaact ggcttcctgg accctgttac cgccagcagc 14700 gagtatcaaa gacatctgcg gataacaaca acagtgaata ctcgtggact ggagctacca 14760 agtaccacct caatggcaga gactctctgg tgaatccggg cccggccatg gcaagccaca 14820 aggacgatga agaaaagttt tttcctcaga gcggggttct catctttggg aagcaaggct 14880 cagagaaaac aaatgtggac attgaaaagg tcatgattac agacgaagag gaaatcagga 14940 caaccaatcc cgtggctacg gagcagtatg gttctgtatc taccaacctc cagagaggca 15000 acagacaagc agctaccgca gatgtcaaca cacaaggcgt tcttccaggc atggtctggc 15060 aggacagaga tgtgtacctt caggggccca tctgggcaaa gattccacac acggacggac 15120 attttcaccc ctctcccctc atgggtggat tcggacttaa acaccctcct ccacagattc 15180 tcatcaagaa caccccggta cctgcgaatc cttcgaccac cttcagtgcg gcaaagtttg 15240 cttccttcat cacacagtac tccacgggac aggtcagcgt ggagatcgag tgggagctgc 15300 agaaggaaaa cagcaaacgc tggaatcccg aaattcagta cacttccaac tacaacaagt 15360 ctgttaatgt ggactttact gtggacacta atggcgtgta ttcagagcct cgccccattg 15420 gcaccagata cctgactcgt aatctgtaat tgcttgttaa tcaataaacc gtttaattcg 15480 tttcagttga actttggtct ctgcgtattt ctttcttatc tagtttccat ggctactaaa 15540 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 15600 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 15660 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 15720 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 15780 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 15840 gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 15900 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 15960 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 16020 cagagctggt ttagtgaacc ggatcctgcc attgcatcct tctctgcaga ctaagatgga 16080 gttcctgaac caagaccgct tgctggccaa cctgtgaaac tgggctcaag gtgaggggtg 16140 ctatctgtga ttgagggaca tggttaatgg aattgtctca cacagaaatc gcacccgtca 16200 ccttggccta cttatcacca ccccaaacag aggaacacgc cttctccagc cacagcctat 16260 ggaagggcct tcagctgctg tggccccgag gtaagcttgg gggaggctaa ctgaaacacg 16320 gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac 16380 gcacggtgtt gggtcgttgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacagcccg 16440 ggagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat 16500 gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat 16560 aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat 16620 cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc 16680 cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact 16740 tggagccact atcgactacg cgatcatggc gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc 16800 cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc 16860 cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg 16920 cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc 16980 accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat 17040 gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag 17100 ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat 17160 catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt 17220 tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct 17280 cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat 17340 cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg 17400 gatggccttc cccattatga ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca 17460 ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc 17520 ggctcttacc agcctaactt cgatcattgg accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc 17580 ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg gattgtaggc gccgccctat accttgtctg 17640 cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg 17700 cggcacctcg ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga 17760 actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc 17820 agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg 17880 ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa 17940 tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca 18000 acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg 18060 ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca 18120 cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc 18180 cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca 18240 tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac 18300 agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg 18360 gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg 18420 gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcaga 18480 gcttctttca attgactttc tttaattcgt tttccatctt ttgttttgtt caaagtttct 18540 tctcggtatt cttcattttg atcaataaca acgcctgaaa aagctaccag cacatctata 18600 tcatcgtagc ctttttcctt aatatacttc ttaaactcat ggaaataacg gactgcatgt 18660 aaacgagaag ctgtgacaac cattgctttt gctttaccgc caattttatg tctagttaca 18720 ttccgaaatt gttcgaccat gatagccgtc ttttgttgta gagtatatgg atgtaatgat 18780 tgataacgct tgatagcttt tactccctgt gttgtcgata attccggatt ctctgatgtg 18840 tttttggcaa tacgataata tgttttgtag gtcatataat tttgtaatac atctaatata 18900 aatccttctt cgatagcttg acgcatactg taaatatgaa aaggtttaaa cgttccatct 18960 ggttgttttg tcccaaacat ttctaatgtc ttttctttag gagtagctgt aaaagcaaag 19020 aaacttaaat ttttatgtct gccatgtgtc agaagttcct gaacgatttc atcttcaaaa 19080 tctaactgct cagcttcgat ttctgcttcc agttctgcat attcccgtaa cgcttcctct 19140 gtatctgcta atgctgcttt taattttttc gcactttttc ctgtctggga ggaatgtgct 19200 tcatctacaa taacggcaaa gcgacttccc ttgttaactt ctacttcttc ataaataaca 19260 ggaaactttt gaagtgtcgt gataataatt cgttttccgt tattaatagc atctcttaaa 19320 tctttggaag tctttttgtc atcaatggtt tctacaagcc ctgttgtatg atcgaaactg 19380 gaaattgttt gttgtaattg ccgatcaagt actgttcgat ctgttaccac gataactgat 19440 gtaaaaatgc tttcattatc ttcattgtgc aaacttgcta aatgatatgc caaccatgct 19500 atgctgttcg actttccaga acctgcgctg tgttggataa gataattttc cccgcttcct 19560 ttttgacgaa catcttcaac aagttttctg accacatcta actgatgata gcgtgggaaa 19620 atcagcttag aacttgtttt gacgctttcc tttccgtttt tgataaactt ttcttttttt 19680 acttctaaat gcatgaatcc tgtaaaggat acggatttta tgaccgatga tgaagaaaag 19740 aatttgaaac gtttgtctga tttggaggaa ggtttacacc gtaaaaggtt aatctcctat 19800 ggtggtttgt taaaagaaat acataaaaaa ttaaaccttg atgacacaga agaaggcgat 19860 ttgattcata cagatgatga cgaaaaagcc gatgaagatg gattttctat tattgcaatg 19920 tggaattggg aacggaaaaa ttattttatt aaagagtagt tcaacaaacg ggccatattg 19980 ttgtataagt gatgaaatac tgaatttaaa acttagttta tatgtggtaa aatgttttaa 20040 tcaagtttag gaggaattaa ttatgaagtg taatgaatgt aacagggttc aattaaaaga 20100 gggaagcgta tcattaaccc tataaactac gtctgccctc attattggag ggtgaaatgt 20160 gaatacatcc tattcacaat cgaatttacg acacaaccaa attttaattt ggctttgcat 20220 tttatctttt tttagcgtat taaatgaaat ggttttgaac gtctcattac ctgatattgc 20280 aaatgatttt aataaaccac cagcgagtac aaactgggtg aacacagcct ttatgttaac 20340 cttttccatt ggaacagctg tatatggaaa gctatctgat caattaggca tcaaaaggtt 20400 actcctattt ggaattataa taaattgttt cgggtcggta attgggtttg ttggccattc 20460 tttcttttcc ttacttatta tggctcgttt tattcaaggg gctggtgcag ctgcatttcc 20520 agcactcgta atggttgtag ttgcgcgcta tattccaaag gaaaataggg gtaaagcatt 20580 tggtcttatt ggatcgatag tagccatggg agaaggagtc ggtccagcga ttggtggaat 20640 gatagcccat tatattcatt ggtcctatct tctactcatt cctatgataa caattatcac 20700 tgttccgttt cttatgaaat tattaaagaa agaagtaagg ataaaaggtc attttgatat 20760 caaaggaatt atactaatgt ctgtaggcat tgtatttttt atgttgttta caacatcata 20820 tagcatttct tttcttatcg ttagcgtgct gtcattcctg atatttgtaa aacatatcag 20880 gaaagtaaca gatccttttg ttgatcccgg attagggaaa aatatacctt ttatgattgg 20940 agttctttgt gggggaatta tatttggaac agtagcaggg tttgtctcta tggttcctta 21000 tatgatgaaa gatgttcacc agctaagtac tgccgaaatc ggaagtgtaa ttattttccc 21060 tggaacaatg agtgtcatta ttttcggcta cattggtggg atacttgttg atagaagagg 21120 tcctttatac gtgttaaaca tcggagttac atttctttct gttagctttt taactgcttc 21180 ctttctttta gaaacaacat catggttcat gacaattata atcgtatttg ttttaggtgg 21240 gctttcgttc accaaaacag ttatatcaac aattgtttca agtagcttga aacagcagga 21300 agctggtgct ggaatgagtt tgcttaactt taccagcttt ttatcagagg gaacaggtat 21360 tgcaattgta ggtggtttat tatccatacc cttacttgat caaaggttgt tacctatgga 21420 agttgatcag tcaacttatc tgtatagtaa tttgttatta cttttttcag gaatcattgt 21480 cattagttgg ctggttacct tgaatgtata taaacattct caaagggatt tctaaatcgt 21540 taagggatca actttgggag agagttcaaa attgatcctt tttttataac aggaattcta 21600 tggtaaaagc attcctgaac ccaatatcct tatttttagt ggacaaggcc ttgttctcat 21660 atggttgctt gagccagtgc cttacaaggc tcttccgctt tggcaggctg ttcaaaatta 21720 tttattagag caactcaagg aactaggcgg agatccaaaa gcaaccgatg cagcacgtgt 21780 ttttcggatt gctgggagcg tcaatagtaa gaatggagcg gaagtaagag cggaatatcg 21840 gcacgattac agatatgagt taaggcagat tcaatttgat taccttccag aactcaatga 21900 ggttattaat cccgctccac aaaagaaaaa acgggggcgt aaaaagaaag tagttcagtt 21960 attcaatacc tacaaactcc attacgctcg cctattggat atagtgaaat tggtggaact 22020 acgaaattat gaggtaactg gatacaggga aatcatttgc tttttatacc gttattggtt 22080 gtgctgttac acgaacgacc ctgtagaggc tttaaatcaa acacagacac ttaatttaca 22140 gttcactgag cctttaccct taaaagaggt tgaaagggct acacggagcg cagaaaaggc 22200 gtgggaagca cgaaataacg aagaggctaa ccggattgca atcgaaaaag gatatcccag 22260 tgctggatac aatattagca ataaaaagtt gattgaatgg ctagatatca caccagaaga 22320 acagaagcat ttacagacga ttatagacgc taatgagaaa cggagaagaa agcgggaaag 22380 ggataggatt tatcaagaac aaaaacgtcg tgagcgggga gatatgaccc gacaggagta 22440 tattaagcaa caacaggata aaacagatga taaattattt aaattgcagg agttattaga 22500 acagaatccc aaaatctcaa aaattaaatt agcaaaaata cttggtgtag ataaatcgca 22560 cttatacaga ctgctgaaac aactataact ggaaaaaatt agtgtctcat ggttcgtcgc 22620 ccttatatta tgggcgttag cctgcttgct aattggatag gtgttattgt catttcaacg 22680 tcggacgttt tggtagatga acgtcggacg ttatttgctt caatagattg ttgatgtatt 22740 aagggttgca gtgaatcgac aagcaaaaag ttatgacgtt gtgaaaaaat tgaatagaaa 22800 attggaaatt acgtcggacg ttctaactta aaaaccctgt tatatcaatg atttaaaagg 22860 aaattaacgt cataaaagac ctttctgcaa caaaagtttt tctggaagag ttgaggttat 22920 tttataggta ttatggactt ttgtagactt tttgtgtact ttttgtggac tccacactcg 22980 ctggtatcgt gttatttttt aattgagata tgaatatgga aattaaacgt tttaggcgtt 23040 ggtttggtga tgacaaaaaa ataagagtac ccgctcacaa cggatactct ttcgagaaat 23100 gtacgaaacg ctataaataa aaaataacta gatacattta cattgtatca cgtttcgtac 23160 atttctccaa taacaaattg attggaggaa tgcaaagtga ataatgaacc agtaaaacgt 23220 ggtaagaaga acagatggga attaaaccta cctataatga cttatgtagt agctgatgat 23280 tggattgata aactaggaca cgaaacgttt actttatggt tgaggttcca tacttgggta 23340 gatagagaag atgaactccg agattatgat cgcataccta gaagttttga gaacatatat 23400 aaaaagacac taggaatctc aaaaagtaag ttttatagat tgataaaacc tttatgggaa 23460 tatggattaa tagacatcat agaatacgaa gaatctaacc gtaattctac taaacctaaa 23520 aatataattg tttatgagta tcctttacac gaaatagaaa gaaagtataa accactagaa 23580 aaattaagag attgggataa agactataat tccgtttcta aagaattagg taaaacaggt 23640 ggtagaccaa ggaaaaaaga tagtgaagaa gaacccgaaa agaaacccga agaagtaact 23700 aaaaagaaac gtaaatataa gttaaaaaga gttatccaca acggtttcaa aaatgaaacg 23760 gtggagggtt tcaaaaatga aacggtggag ggtttcaaaa atgaaacggt gaccgtttca 23820 aaaataaaac ccaataatta ttcaaatatc tttaataact tatcaaatat ttctactaat 23880 gtttcaaata atttattaat tgatgatgat gaggaaatcg aaaatgaacc aactggtcgt 23940 acaataaata ggtcattact tttttcacaa gaagatatta aacaggccta tcaatttatt 24000 aatagatttt cagttataca gttacgtgaa aactttagct ttgataaaca ctttgaagaa 24060 cggttggtat gttatttatg gaaagcaggg atttctactt tttacacgca cgaaatcagt 24120 aaaatgataa aaaaaatagc agactatgaa aaatctaaaa aaggtagatt aaacccaata 24180 cgtgaccgag ccttatatat ggtaaatggt cttgtaatga atagagcttc ttcccaaagt 24240 gaacatgcta cttataaact aaaccaatat aaaaaacaga aggaacagga aaaacaacaa 24300 caggagcaac aaagatcaag agtaccgttc tataattggt tggaggaaag agaagaacaa 24360 accgaaggtc aactacccac cacttaaagc ctaacggctt ttgaagtggg gcttgtaaaa 24420 agccctagtt gactacccca agtctttcga ggactacgtt ggaaaggtca tgacacctac 24480 aaatgctcct ctagttcgta gccactgtcg ttgatggtta aaagtcctga tgggtaggga 24540 cggtgctgtc aacatcacaa gcccttccaa catgggggaa gaggaagaac actccgagaa 24600 aggagggggc tgtcgtacac gccttgttcg tgtacgtgat ttttaacact tttatctcta 24660 atataatctc tccttgagtt agcagagact aagaataaaa cacattagga ttttttatct 24720 acataaggag gttcaataca tgcctactat ttcgtttaag ggaaagtctt ttgtacaaaa 24780 tcatcacttg actgtaaaat atcatgaatt gatcccagaa ccagaaaaaa gtctgaccga 24840 taaagttagt cttcatgaca atcttatcat tcatggggac aatttaaagg cgttgaaagc 24900 tctactacct acatatgctg gtaagataga ttgcatctat attgacccac catacaatac 24960 tggaactgaa aaatggattt ataatgataa tgtcaactcc ccaatgatta gggaatggct 25020 tggaaaagtg gtagacaaag aagacttatc ccgacatgat aagtggcttt gtatgatgat 25080 gccgaggtta aaactgttga aagagttgtt gtcagaagac ggagtgatat ttgtaagcat 25140 tgactacaat gaaatacacc atcttacgtg ccttatgaac gaaatattcg gtgaggagaa 25200 ttttcgtgac gctattatca ttcgtagagg agtaaaaaat gttcaagcgc aatttgacac 25260 aattgattct ctttcaaatg gttatgagtc tattttggtt tacactaaac agccatctcg 25320 acgatttaat aaggtttatg aagatgtaga agaaaagcct ggtagttgga ataatcattg 25380 gagaggtaca gaccgtaaaa ctatgagata tgaattattt ggggttactc cgacagaagg 25440 tcaatggaga tgggggaaag aacgtagtct ccaggctatt gaaaactatc aaatgatgtt 25500 agatgaactt agacaaaaag gcattactaa tccaactcaa gaggatattg ataaatggta 25560 tcttgaatat gtagaaaata atggggaaga tattgacttg ttacgacaaa atgataatgg 25620 cacgattgag cactttgttc caccgactag caaaaagttg ttaagtaatg cctggtttga 25680 cttaaaaccc aacggttcta gtcaattaaa gaagatattt ggaaggaagg ttttcgataa 25740 ccctaaatca attgatttgg taaaaagact aatacaattt gcgactgaaa acaaagaagc 25800 gattgtactt gactcatttg cagggagtgg cactactgct catgcagtat tatcgcttaa 25860 caaacaagat ggagggaatc gtcgtttcat ccttattgag atggaagaat atgcacatga 25920 gattaccgca gaacgcgtaa gaagggttat caaagggatt ccaaaagcaa aggatgaaga 25980 attaaaacag ggattgaagg gcactttttc tttcttccgt ttaggagatc caattgagat 26040 ggaggcaatt ttgaaaggtg aaaatcttcc ttcctatgaa gatttagcac gttatctttt 26100 ctttactgca acaggtgaat tgtttgatcc atcagtggta gattatgaac atcattttat 26160 cggatcaagt agggattatg atgtgttctt gttttacaag cctgacttag aatatcttaa 26220 aacaaccgca cttacgcttg aaaaagcaga agaaattacg agaattacta taggtagtag 26280 taagaaacgc cttgtatttg caccgatgca gttcttggac caagactatt tggacaagta 26340 ccgtattgat tttgttcaac ttccttacga aatttatcgc atgaaaggct gatggaacga 26400 tggaactaaa acaataccaa cagcaaacat tggccaagat tcaagcatat cttcaagcat 26460 tagcgaaatt caaagaaaag cgagataaac ttcttgctat tgatgctgat ttagccaaaa 26520 ctatcaatcc accgaaagca gcgtgggatg aagtagttgg cgaggggatc acctaccaca 26580 taaaaaagaa tggcataaat gaagatttgc caaactttaa tatcaaagta ccaactggtg 26640 gggggaaaac cctcctagcg gtgcacacta tagacttaat caatactcat tacctcaaga 26700 aaaaaacggg atttgtactt tggattgtgc cgtcgaatca aatataccgt caaaccttgt 26760 ctgctttacg aaatcgtgag catccatacc ggcaagtatt ggatttatca agtggcggtc 26820 ggacggaaat cctcgaaaaa atggatcggt ttacacccca agacgtacaa gagaaattac 26880 ttgtgatgtt gctcatgttg ccatcagcca atcgtcaaac gaaagaaaca ttgaaaatct 26940 tccgtgatgc gggtggatac gaatcatttt ttcctaagga agaccattat ctagagcatg 27000 aagcactact tgaaaaatat ccaaatttgg attacttcgg tggggaagac cttgggctat 27060 ttggatatca gccaaagcaa gtcaagacgt cacttgggaa cgttcttcgt attctgcagc 27120 ctattgtcat tgtcgatgaa ggacaaaagg catattcagc aggggcacag gaaacgatcc 27180 gagggtttaa tcctagcatc gtggtagaat tatcagcaac tccggcgaaa ggggctaata 27240 gtctcgtaga aataaaaggt cgtgatctag accgtgaaga gatgattaaa ctcgatctgc 27300 acgttacgaa taaatcaagc ggggattgga gggacacgtt aaacgcaagt gttgaaaaac 27360 gtgaggagtt agagcggatt gcgctcgatt atgaagccca aagcggacga ttaattcgtc 27420 ccatttgtct tattcaagta gaacggacgg ggaaggatca acgtggtaaa ggatacattc 27480 actccgaaga cgtgagagaa tatctcatca aagagtgtgg tatccctcca gagcatatag 27540 cggtcaaatc ttctgaaaag gatgacattg aggggattga tttatactct aaggaatgcc 27600 cgattcgtta tatcatcaca aaacaagcat tacaggaagg gtgggactgt tcatttgctt 27660 acgtcctcac gattttaacg aatccgtcgt cgaagaacgg tattacacaa ttagttggac 27720 ggattctgcg tcagccgtgg gcccgtaaaa caaagataaa agccttagac gaatcgtacg 27780 tgttctgctt ccagcaaaac gcaaataacc ttctcaaaga cattaaaaag ggacttgaag 27840 gtgaaggact tggagacttg acttcaagga ttgtcggtgg tgaaccagat gatgaaggta 27900 aatcgggcaa tgaacgtgaa attaatgtca aaattcggaa taagttcaag tgtttcgagg 27960 gaaagattta ccttccatta ttcctctttc aagaagccga acatggttgg cgagaagtta 28020 gttatgagat ggatatttta agtcgcattg attggtcgca agtgtctttg gacggcttag 28080 aacacttggt cttgtcctcg caacaaaagg aagacatcga aataagttta ggactaagcg 28140 ataatacaga agaatttctt gagacacata gaaaaacaac agtaaaaagt tcggttaata 28200 ttgatttagt gatgatcact cgtcatattg gtaatcttat tccgaatcca tggattgccc 28260 atgaattagc ggaaaagacg attgagattc tcaaggtacg ttattcggaa gatgaaatcg 28320 cagctaacca agcatttatc attgaggaat tgaaaaagtg gttagatcgt gagcgtgacc 28380 gcctagctga acaggtattt aaacagttga ttgatgaagg gaaaattcaa ttccttctgg 28440 aagagaaaca aggacggatt cctaaaacag ttcgcaaagt caaacaaaaa gcaaagaagt 28500 tacgtcatga caacgatgaa ccggttgaaa aaagccttgt agaaccagtt cttgatgagg 28560 aattgatctt catggctggt cattaataaa taaactgaga taaacataag aataaaagga 28620 tagtttcatt cacgtctcaa ttccttatat acttctttcg ctacagcctc cattactgca 28680 ttataaaagg atcgatcctc aaacaattta gaataagcgt tcatttgttc catatacagt 28740 tcttgggcga ctttttcaaa cacgtcagga aagatacttt tattaaacat ttcttcatca 28800 ttgtttctgg caaatctcct taatttttcg ttgcctttaa cagttttttt gtaaattcct 28860 tctacgatga cccgatcagc ttctgtaaat ttgccttcaa atcttttgtt tactcgttga 28920 ataatatttt ctaataagtc ttgatcatct ggaggtttta tgcctgtatc aacattatct 28980 gaatttttga gtacattttc tgggctgttt gattctaatg tgatggtccc tttaaatgtt 29040 tcttctaact tgtaatactc taatttaact ttgtcttcga tattgatttt ttctgcacta 29100 tttttcggaa taaacttaat taaatacgat gtgaaaatgt actcttcatg caactctttg 29160 tcaaacattc tgacgagttg tgttatatat gaataccatt tattaaagtt acgaaccgta 29220 acccgaaatt tatattgtgt ttcttcatca agttcttcat agcgtttaat aattggaatt 29280 aagtggctgg ctatttttcc taagtccttt tctgtttgtt tccctttttt aaaataaatt 29340 ctcgttagtt tctttatgtc ttgatcattg taaattttaa agtttctcag ctttgttctc 29400 gtatcatata tgagatttac atcaatctct ttatccagtt cggttacttc ataataaggc 29460 tggaaagctc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 29520 cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 29580 cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 29640 cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 29700 atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 29760 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 29820 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 29880 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 29940 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 30000 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 30060 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 30120 gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 30180 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 30240 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 30300 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 30360 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 30420 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 30480 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 30540 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 30600 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 30660 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 30720 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 30780 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 30840 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 30900 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 30960 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc 31020 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 31080 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 31140 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 31200 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 31260 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat 31320 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 31380 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 31440 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 31500 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 31560 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 31620 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 31680 ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 31740 acgaggccct ttcgtcttca agaa 31764 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> linker(F) <400> 3 agcttgcgca ggtgcacctg catgcgg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> linker(R) <400> 4 agctccgcat gcaggtgcac ctgcgca 27 <210> 5 <211> 180 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-1 <400> 5 tagaggcaag ggttgttttt attgactaca cctgcgatca agcttgcctg caggcagctg 60 cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt 120 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 180 <210> 6 <211> 155 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-2 <400> 6 ggtcgttggg cggtcagcca ggcgggccat ttaccgtaag ttatgtaacg cggaactcca 60 tatatgggct atgaactaat gaccccgtaa ttgattacta ttaaagcttg atatcgatag 120 gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctct 155 <210> 7 <211> 155 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-3 <400> 7 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 60 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 120 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcat 155 <210> 8 <211> 155 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-4 <400> 8 gtaatagcga tgactaatac gtagatgtac tgccaagtag gaaagtccca taaggtcatg 60 tactgggcat aatgccaggc gggccattta ccgtcattga cgtcaatagg gggcgtactt 120 ggcatatgat acacttgatg tactgccaag tgggc 155 <210> 9 <211> 155 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-5 <400> 9 gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 60 tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 120 tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggact 155 <210> 10 <211> 177 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 1-6 <400> 10 tactggttgg aagaaagacc tctatcacct gcgatcctgg gcccttaagg atatccacta 60 aaccagctct gcttatatag acctcccacc gtacacgcct accgcccatt tgcgtcaatg 120 gggcggagtt gttacgacat tttggaaagt cccgttgatt ttggtgccaa aacaaac 177 <210> 11 <211> 177 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-1 <400> 11 tagaggcaag ggttgttttt attgactaca cctgcgatcg gaaccaagct ggagtgcagt 60 ggcacaatct tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca 120 gcctcccgag ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat ttttgtt 177 <210> 12 <211> 150 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-2 <400> 12 agggagcagt ggttcacgcc tgtaatccca gcaatttggg aggccaaggt gggtagatca 60 cctgagatta ggagttggag accagcctgg ccaatatggt gaaaccccgt ctctaccaaa 120 aaaacaaaaa ttagctgagc ctggtcatgc 150 <210> 13 <211> 152 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-3 <400> 13 ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctta tcgatagatc taggaacccc 60 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 120 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gg 152 <210> 14 <211> 152 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-4 <400> 14 ggaagctgta gagctgttcc tggttgcgac gcagggtggg ctgtacctgg ggactgttaa 60 gcatggagtt gggtaccgga tctgcctgca ggcagctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 120 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cc 152 <210> 15 <211> 151 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-5 <400> 15 cgcaaccagg aacagctcta cagcttcctg gagcgccact cgccctactt ccgcagccac 60 agtgcgcaga ttaggagcgc cacttctttt tgtcacttga aaaacatgta aaaataatgt 120 actaggagac actttcaata aaggcaaatg t 151 <210> 16 <211> 174 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 3-6 <400> 16 tactggttgg aagaaagacc tctatcacct gcgatctgtc cctgccagtg gcgcatagcg 60 atgcgcggca gaaccccttt gatttttaaa cggcgcagac ggcaagggtg gggggtaaat 120 aatcacccga gagtgtacaa ataaaaacat ttgcctttat tgaaagtgtc tcct 174 <210> 17 <211> 179 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-1 <400> 17 tagaggcaag ggttgttttt attgactagg tctcgcaggt acatctacgg attacgtcga 60 cgtttaaacc atatgagcgg ccgctctaga actagtggat cccccggaag atcagaagtt 120 cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tctgatctgc gcagccgcc 179 <210> 18 <211> 154 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-2 <400> 18 cagaatctgg cggcaactcc cattccttct cggccaccca gttcacaaag ctgtcagaaa 60 tgccgggcag atgctcgtca aggtcgctgg ggaccttaat cacaatctcg taaaaccccg 120 gcatggcggc tgcgcagatc agaagttcct atac 154 <210> 19 <211> 150 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-3 <400> 19 agaaggaatg ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt gagcaggcac 60 ccctgaccgt ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc cgtgtgagta 120 aggccccgga ggcccttttc tttgtgcaat 150 <210> 20 <211> 154 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-4 <400> 20 ccgcggtaaa ttctctgaat cagtttttcg cgaatctgac tcaggaaacg tcccaaaacc 60 atggatttca ccccggtggt ttccacgagc acgtgcatgt ggaagtagct ctctcccttc 120 tcaaattgca caaagaaaag ggcctccggg gcct 154 <210> 21 <211> 154 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-5 <400> 21 cgaaaaactg attcagagaa tttaccgcgg gatcgagccg actttgccaa actggttcgc 60 ggtcacaaag accagaaatg gcgccggagg cgggaacaag gtggtggatg agtgctacat 120 ccccaattac ttgctcccca aaacccagcc tgag 154 <210> 22 <211> 176 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> segment 16-6 <400> 22 tactggttgg aagaaagacc tctatggtct ccctgctcct gcgtctgcga cacgtgcgtc 60 agatgctgcg ccaccaaccg tttacgctcc gtgagattca aacaggcgct taaatactgt 120 tccatattag tccacgccca ctggagctca ggctgggttt tggggagcaa gtaatt 176 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 1-F <400> 23 tagcacctgc atgcaagctt gcctgcaggc a 31 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 1-R <400> 24 tagcacctgc gcatctgggc ccttaaggat atc 33 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 2-F <400> 25 tagggtctcg ccagccggcc 20 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 2-R <400> 26 tagggtctcc ttcccaatag accccgca 28 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 3-F <400> 27 tagcacctgc atgcggaacc aagctggagt g 31 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 3-R <400> 28 tagcacctgc gcattgtccc tgccagtgg 29 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 4-F <400> 29 tagggtctcg gacacgttgc gatactggt 29 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 4-R <400> 30 tagggtctcc cacgagccca cgg 23 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 5-F <400> 31 tagcacctgc atgccgtggt gcttgtaggt tac 33 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 5-R <400> 32 tagcacctgc gcatgagcgc ggacgc 26 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 6-F <400> 33 tagggtctcg gctcgggggt ggt 23 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 6-R <400> 34 tagggtctcc ttgccgcgcg tttctc 26 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 7-F <400> 35 tagcacctgc atgcgcaaac gctctgcaac aaga 34 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 7-R <400> 36 tagcacctgc gcatgtccgc caggtgc 27 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 8-F <400> 37 tagggtctcg ggacattatc ttccccgaac 30 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 8-R <400> 38 tagggtctcc gtggcggcgg c 21 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 9-F <400> 39 tagcacctgc atgcccaccc acggacga 28 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 9-R <400> 40 tagcacctgc gcatgaggga gcgcagaga 29 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 10-F <400> 41 tagggtctcg cctcacccgc agctg 25 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 10-R <400> 42 tagggtctcc gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtc 39 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 11-F <400> 43 tagcacctgc atgcagtcct atatatactc gctctgtact 40 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 11-R <400> 44 tagcacctgc gcatggagct atgctaacca gc 32 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 12-F <400> 45 tagggtctcg ctccgagtat gcgtgtca 28 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 12-R <400> 46 tagggtctcc gtagttgtag tatatccact ctctca 36 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 13-F <400> 47 tagcacctgc atgcctacta cacagagcga gct 33 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 13-R <400> 48 tagcacctgc gcatgcacag caccacaata ttgttca 37 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 14-F <400> 49 tagcacctgc atgcgtgctg cagttactgt gct 33 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 14-R <400> 50 tagcacctgc gcattagcga ggtaagcact tactct 36 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 15-F <400> 51 tagggtctcg gctagtttct gtggattcac taga 34 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 15-R <400> 52 tagggtctcc cctggacatc caggtga 27 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 16-F <400> 53 tagggtctcg caggtacatc tacggattac gt 32 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 16-R <400> 54 tagggtctcc ctgctcctgc gtctg 25 <210> 55 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 17-F <400> 55 tagcacctgc atgcgcagaa caaagagaat cagaatcc 38 <210> 56 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 17-R <400> 56 tagcacctgc gcatggtgag ttcaaatttg aacatccg 38 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 18-F <400> 57 tagggtctcg cacccgccgt ctg 23 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 18-R <400> 58 tagggtctcc cgagggccgc g 21 <210> 59 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 19-F <400> 59 tagcacctgc atgcctcgag cacgacaaag c 31 <210> 60 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 19-R <400> 60 tagcacctgc gcattgactt gaatgttaaa gagcttgaag ttga 44 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 20-F <400> 61 tagggtctcg gtcaaagagg tcacgcaga 29 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 20-R <400> 62 tagggtctcc ttggttgtcc tgatttcctc ttc 33 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 21-F <400> 63 tagcacctgc atgcccaatc ccgtggctac 30 <210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 21-R <400> 64 tagcacctgc gcatgcatat gatacacttg atgtactgc 39 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 22-F <400> 65 tagggtctcg atgccaagta cgccccct 28 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer 22-R <400> 66 tagggtctcc ctcccgggct gtagt 25 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer ITR-F <400> 67 ggaaccccta gtgatggagt t 21 <210> 68 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer ITR-R <400> 68 cggcctcagt gagcga 16 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer CMV-F <400> 69 catcaatggg cgtggatagc 20 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer CMV-R <400> 70 ggagttgtta cgacattttg gaaa 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer Ampr-F <400> 71 ttgatcgttg ggaaccggag 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer Ampr-R <400> 72 ttgttgccgg gaagctagag 20

Claims (47)

  1. 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법으로서,
    A) 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에 있어서 플라스미드를 형성시키는 단계와,
    B) 상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법으로서,
    고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 핵산 서열을 포함하는 핵산을 숙주 세포에 도입하여, 상기 숙주 세포에서 플라스미드를 형성시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 고초균 내에서 복제되는 서열을 갖는 바이러스 벡터 플라스미드를 제작하는 방법으로서,
    상기 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 플라스미드가 증폭하는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계는, 컴피턴트한 상기 숙주 세포를 상기 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 핵산이 탠덤 리피트한 핵산 서열을 갖는 비환상 핵산인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 또는 플라스미드가 목적으로 하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2 내지 120개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 5 내지 80개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 10 내지 60개의 단위 핵산을 집적하여 상기 핵산을 제작하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가, 알파 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 코로나 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 광견병 바이러스, 센다이 바이러스, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레오 바이러스, 콕사키 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 또는 센다이 바이러스인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스 또는 렌티 바이러스인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 바이러스가, 아데노 수반 바이러스인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드가, 상기 바이러스의 전체 게놈 중 적어도 일부의 유전자 서열을 포함하지 않는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드가,
    고초균에서 플라스미드 복제를 촉진하는 핵산 서열과,
    바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열,
    을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이, 약 10kb 이상인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이, 상기 바이러스의 2개의 말단 반복 서열 및 그 밖의 부분을 포함하고, 상기 그 밖의 부분이, 상기 2개의 말단 반복 서열에 샌드위치된 영역의 밖에 있는, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스를 구성하는데 필요한 핵산 서열이,
    상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열과,
    상기 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열과,
    상기 바이러스의 2개의 말단 반복 서열과,
    헬퍼 유전자
    를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 말단 반복 서열이, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는 말단 역위 반복 서열(ITR)인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 5'ITR 및 3'ITR의 사이에 상류로부터 프로모터, 목적으로 하는 유전자 및 터미네이터를 포함하는 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자가, E1A, E1B, E2A, E4 및 VA 중의 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자가, E2A, E4 및 VA를 포함하는, 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 유전자의 각각이, 아데노 바이러스의 혈청형 1 내지 52 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 게놈을 패키징, 전사 및 복제하는 단백질을 코드하는 핵산 서열이, rep를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 rep가, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 핵산 서열이, cap를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 cap가, 아데노 수반 바이러스의 혈청형 1 내지 12 및 그 개변체 중 어느 하나에서 유래하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드가, 상기 플라스미드 단독을 도입한 프로듀서 세포에서 바이러스 벡터의 생산을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 상기 플라스미드를 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는, 대장균, 고초균 및 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생물의 세포인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는, 고초균의 세포인, 방법.
  32. 제1항, 제4항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는, A) 및 B)에 있어서 상이한 종 또는 동일종의 세포인, 방법.
  33. 제1항, 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, A)의 상기 숙주 세포는, 고초균의 세포인, 방법.
  34. 제1항, 제4항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, A)의 상기 숙주 세포와 B)의 상기 숙주 세포가 상이하고, A)에서 생성된 상기 플라스미드를 B)의 상기 숙주 세포에 도입하는 공정을 포함하는, 방법.
  35. 제1항, 제4항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, A)의 상기 숙주 세포가 고초균의 세포이며, B)의 상기 숙주 세포가 대장균의 세포이며, A)에서 생성된 상기 플라스미드를 B)의 상기 숙주 세포에 도입하는 공정을 포함하는, 방법.
  36. 제1항, 제4항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상이하고, B)에 있어서의 숙주 세포가 고초균의 세포인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생산되는 플라스미드.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생산되는 플라스미드 함유 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 포함되는 엔도톡신이 100EU/mL 이하인, 플라스미드 함유 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 플라스미드의 CCC(covalently closed circular) 순도가 80% 이상인, 플라스미드 함유 조성물.
  41. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 플라스미드를 제작하는 단계와,
    상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 형성시키는 단계
    를 포함하는, 바이러스 벡터를 제작하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하는 단계가, 단일의 상기 플라스미드를 프로듀서 세포에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 플라스미드에 포함되는 핵산의 적어도 일부가 상기 프로듀서 세포의 염색체에 도입되는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터 함유 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 전체 바이러스 입자 중의 핵산을 탑재하고 있지 않은 바이러스 입자의 비율이 65% 이하인, 바이러스 벡터 함유 조성물.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 전체 바이러스 벡터 입자 중, 목적으로 하는 핵산 이외의 상기 플라스미드 유래의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 입자가 2% 이하인, 조성물.
KR1020237018436A 2020-11-04 2021-11-02 고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산 KR20230116801A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2020-184495 2020-11-04
JP2020184495 2020-11-04
PCT/JP2021/040410 WO2022097646A1 (ja) 2020-11-04 2021-11-02 枯草菌におけるウイルスベクタープラスミド生産

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230116801A true KR20230116801A (ko) 2023-08-04

Family

ID=81457257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237018436A KR20230116801A (ko) 2020-11-04 2021-11-02 고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4242310A1 (ko)
JP (2) JP7104263B1 (ko)
KR (1) KR20230116801A (ko)
CN (1) CN116438310A (ko)
AU (1) AU2021374174A1 (ko)
CA (1) CA3200833A1 (ko)
IL (1) IL302578A (ko)
WO (1) WO2022097646A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023214578A1 (ja) * 2022-05-02 2023-11-09 株式会社シンプロジェン ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよびその構築
WO2023214579A1 (ja) * 2022-05-02 2023-11-09 株式会社シンプロジェン ウイルス由来構築物プラスミド

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090392A1 (fr) 2000-05-26 2001-11-29 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Nouveau vecteur d'adenovirus recombinant a effets secondaires reduits

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5908845A (en) 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
WO2000005415A1 (en) * 1998-07-22 2000-02-03 Immusol Incorporated Substantially complete ribozyme libraries
JP4479199B2 (ja) 2002-09-19 2010-06-09 三菱化学株式会社 挿入ｄｎａユニットを含むプラスミドの製造方法
JP5945168B2 (ja) * 2012-06-08 2016-07-05 花王株式会社 組換え微生物及びそれを用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造方法
DK3098310T3 (en) 2014-01-21 2019-04-23 Synplogen Co Ltd METHOD OF PREPARING DNA UNIT COMPOSITION AND PROCEDURE FOR PRODUCING CONCATENAT DNA
WO2016163466A1 (ja) * 2015-04-07 2016-10-13 国立大学法人東京工業大学 形質転換細胞の製造方法
CN106544325B (zh) * 2015-09-23 2018-09-07 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种重组杆状病毒及其应用
JP6731232B2 (ja) * 2015-10-28 2020-07-29 花王株式会社 タンパク質又はポリペプチドの製造方法
JP6566927B2 (ja) 2016-12-01 2019-08-28 三菱電機株式会社 半導体装置および電力変換装置
CN110246286B (zh) 2019-04-26 2020-03-20 温州兴升环保科技有限公司 一种夜跑灯

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001090392A1 (fr) 2000-05-26 2001-11-29 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Nouveau vecteur d'adenovirus recombinant a effets secondaires reduits

Also Published As

Publication number Publication date
EP4242310A1 (en) 2023-09-13
JP2022155588A (ja) 2022-10-13
CA3200833A1 (en) 2022-05-12
AU2021374174A1 (en) 2023-06-15
JP7104263B1 (ja) 2022-07-20
JPWO2022097646A1 (ko) 2022-05-12
CN116438310A (zh) 2023-07-14
WO2022097646A1 (ja) 2022-05-12
IL302578A (en) 2023-07-01
EP4242310A9 (en) 2023-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6683691B2 (ja) 高効率ゲノム編集のためのアデノ随伴ウイルスベクターバリアント及びその方法
US8628966B2 (en) CD34-derived recombinant adeno-associated vectors for stem cell transduction and systemic therapeutic gene transfer
TWI791433B (zh) 治療ａ型血友病之基因治療
JPH11507835A (ja) 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物
JP2018535682A (ja) 臨床使用に適した無血清懸濁細胞培養システムにおいて組換えアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを産生するスケーラブルな方法
JPH10507061A (ja) アデノウイルス中にパッケージされたプラスミドｄｎａを用いる遺伝子送達ベクターおよびパッケージング細胞株
JPH09509578A (ja) 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用
KR20230116801A (ko) 고초균에 있어서의 바이러스 벡터 플라스미드 생산
JP2022544004A (ja) 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
KR20220155981A (ko) 미성숙 종결 코돈-매개 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR20240025507A (ko) 미성숙 종결 코돈-매개 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2023214578A1 (ja) ウイルス由来構築物プラスミドライブラリーおよびその構築
CA3165681A1 (en) Dna amplification method
KR20220007601A (ko) 치료제 투여를 위한 조성물 및 방법
KR20230116802A (ko) 통합형 플라스미드
CA3168840A1 (en) Compositions and methods for circular rna expression
EP3792367A1 (en) Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest
US20200157567A1 (en) Viral Vector
JP6153205B2 (ja) Ｖａ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクター
WO2024143429A1 (ja) ヘルパー遺伝子制御
Medina et al. Generation of Replication Deficient Human Adenovirus 5 (Ad5) Vectored FMD Vaccines
KR20220076497A (ko) 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도
WO2023215947A1 (en) Adeno-associated virus capsids
CN115244181A (zh) 阿司匹林化合物在增加核酸表达中的新型用途
EP4396201A1 (en) Aav capsid compositions and methods for delivery