JP7232531B2 - 高忠実度cas9バリアントおよびそれらの利用 - Google Patents
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Description
本発明によるSpCas9バリアントは、まずそのREC1-IIドメインのランダム変異誘発によって得られ、工学的に操作された2つのゲノム標的に対するオンおよびオフターゲット活性を同時に評価することを可能にするイーストベースのアッセイによってオン/オフ比が増加したヒットの同定のためにスクリーニングされた。哺乳動物細胞におけるさらなる検証後、本発明によるCas9バリアントが生成された。驚くべきことに、本発明による改変SpCas9は、野生型SpCas9と比較した場合に、著しく減少したオフターゲット活性を示し、以前に報告された合理的に設計されたバリアントとの比較分析により本発明のSpCas9バリアントの忠実度の著しい改善を実証した。さらに、本発明による、および転写活性化ドメイン(VP64)と融合したさらなるD10AおよびH840A変異を有する改変SpCas9は、D10AおよびH840A変異を含有する野生型Cas9バリアントと比較した場合、著しく減少したオフターゲット活性を示した。
K377、E387、D397、R400、Q402、R403、F405、D406、N407、A421、L423、R424、Q426、Y430、K442、P449、Y450、V452、A456、R457、W464、M465、K468、E470、T472、I473、T474、P475、W476、F478、K484、S487、A488、M495、T496、N497、F498、L502、N504、K506、P509、Y515、F518、N522、E523、L540、S541、I548、D550、F553、V561、K562、E573、A589、L598、D605、L607、N609、N612、E617、D618、D628、R629、R635、K637、L651、K652、R654、T657、G658、W659、R661、L666、K673、S675、I679、L680、L683、N690、R691、N692、F693、Q695、H698、S701、F704、Q712、G715、Q716、H721、H723、I724、L727、A728、I733、L738、Q739
からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する1つまたは複数のさらなる変異を含む。
K377E、E387V、D397E、R400H、Q402R、R403H、F405L、D406Y、D406V、N407P、N407H、A421V、L423P、R424G、Q426R、Y430C、K442N、P449S、Y450A、Y450S、Y450H、Y450N、V452I、A456T、R457P、R457Q、W464L、M465R、K468N、E470D、T472A、I473F、I473V、T474A、P475H、W476R、F478Y、F478V、K484M、S487Y、A488V、M495V、M495T、T496A、N497A、F498I、F498Y、L502P、N504S、K506N、P509L、Y515N、F518L、F518I、N522K、N522I、E523K、E523D、L540Q、S541P、I548V、D550N、F553L、V561M、V561A、K562E、E573D、A589T、L598P、D605V、L607P、N609D、N609S、N612Y、N612K、E617K、D618N、D628G、R629G、R635G、K637N、L651P、L651H、K652E、R654H、T657A、G658E、W659R、R661A、R661W、R661L、R661Q、R661S、L666P、K673M、S675C、I679V、L680P、L683P、N690I、R691Q、R691L、N692I、F693Y、Q695A、Q695H、Q695L、H698Q、H698P、S701F、F704S、Q712R、G715S、Q716H、H721R、H723L、I724V、L727H、A728G、A728T、I733V、L738P、Q739E、Q739PおよびQ739K
からなる群から選択される。
D406Y、W464L、T474A、K526E、N612K、L683Pからなる群から選択される1ヵ所変異;または
R400H+Y450S、D406V+E523K、A421V+R661W、R424G+Q739P、W476R+L738P、P449S+F704S、N522K+G658E、E523D+E617K、L540Q+L607P、W659R+R661W、S675C+Q695LおよびI679V+H723Lからなる群から選択される2重変異;または
K377E+L598P+L651H、D397E+Y430C+L666P、Q402R+V561M+Q695L、N407P+F498I+P509L、N407H+K637N+N690I、Y450H+F553L+Q716H、Y450N+H698P+Q739K、T472A+P475H+A488V、I473F+D550N+Q739E、F478Y+N522I+L727H、K484M+Q695H+Q712R、S487Y+N504S+E573D、T496A+N609D+A728G、R654H+R691Q+H698QおよびR691L+H721R+I733Vからなる群から選択される3重変異;
F405L+F518L+L651P+I724V、L423P+M465R+Y515N+K673M、R457P+K468N+R661W+G715S、E470D+I548V+A589T+Q695H、A488V+D605V+R629G+T657AおよびM495V+K526N+S541P+K562Eからなる群から選択される4重変異;または
R403H+N612Y+L651P+K652E+G715Sからなる群から選択される5ヵ所変異;
E387V+V561A+D618N+D628G+L680P+S701F、R403H+K526E+N612Y+L651P+K652E+G715S、R403H+M495T+N612Y+L651P+K652E+G715S、R403H+L502P+N612Y+L651P+K652E+G715S、R403H+K506N+N612Y+L651P+K652E+G715S、R403H+N612Y+L651P+K652E+N692I+G715Sからなる群から選択される6ヵ所変異;または
R403H+A456T+N612Y+L651P+K652E+G715S+G728T、R403H+F498Y+N612Y+L651P+K652E+R661L+G715S、R403H+Q426R+F478V+N612Y+L651P+K652E+G715Sからなる群から選択される7ヵ所変異;または
R403H+R442N+V452I+N609S+N612Y+R635G+L651P+K652E+F693Y+G715Sからなる群から選択される8ヵ所変異;または
R403H+R457Q+F518I+N612Y+R635G+L651P+K652E+F693Y+G715Sからなる群から選択される9ヵ所変異
を含む改変Cas9ポリペプチドに関する。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)を、指向進化スクリーニングを開発するための実験モデルとして使用し、高特異性SpCas9バリアントを単離した。イーストベースのアッセイプラットフォームを使用する利点は、一面では、速い倍化速度、単一のクローンを容易に単離する能力および迅速かつ信頼性のあるトランスフォーメーションプロトコールの利用可能性などの、イーストがバクテリアと共有する類似性にあり、別の面ではイーストのDNA編成および代謝が高等真核細胞のものと類似していることにある。したがって、イーストモデルは、スクリーニング結果の頑強性を増大する哺乳動物システムとの類似性と合わせたハイスループットスクリーニングのためのフレキシブルなプラットフォームを提供する。最初は、Cas9オン対オフターゲット活性の同時測定のための栄養要求性レポーターイースト株を生成する戦略が設計された。この手法は、2つのイーストゲノム遺伝子座:TRP1(染色体IV)およびADE2(染色体XV)の改変の試験からなる。delitto perfetto手法を使用することにより、2つの遺伝子座の野生型コード配列は、TRP1遺伝子座の場合にはオンターゲットsgRNAにマッチする特異的標的配列によって分けられ、またはADE2遺伝子座の場合には異なるオフターゲット配列によって分けられた2等分に分割された(図1に図式化する)。各オフターゲット(ADE2オフ1~オフ4、添付資料の表4)は、PAM配列からの距離が増加した位置で単一のミスマッチを含有した。100bpの重複を標的配列(TRP1またはADE2)の両側に追加し、終止コドンは、2つの相同領域の間のすぐ上流に配置されて、翻訳の早期中断を確実にした(図1)。レポーターカセット挿入によるTRP1およびADE2遺伝子のノックアウトは、トリプトファンおよびアデニン代謝経路の欠損をもたらし、トリプトファンの非存在下での増殖を抑制し、細胞が低濃度のアデニンで増殖する場合、アデニン生合成の中間産物の細胞液胞における蓄積をもたらし、よってアガープレート上のコロニーに特徴的な赤色の着色を与えた。Cas9によって誘導される二本鎖切断の形成後、各遺伝子座は、2つの隣接している相同領域の存在のおかげで一本鎖アニーリング修復経路を使用してイースト細胞によって効果的に修復され、2つの栄養素の原栄養性への復帰を得ることができる。2つの遺伝子座のそれぞれにおける成功裏の編集イベントは、次に、トリプトファンを欠いた、アデニンを低濃度でのみ含有する適切なレポータープレートを使用して可視化できる(SDluta5、図1)。アッセイの完全な読み出しは、2ステッププロセスからなる。最初のステップは、SDluta5レポータープレートで得られたコロニー数を形質転換体の総数(SDluプレート)のみを選択する場合に得られたものと比較するステップによるオンターゲット切断効率の評価からなる。第2のステップは、オンターゲット活性対オフターゲット活性の評価のためのレポータープレート上で、オンターゲット切断に対応する赤色コロニー(TRP1+/ADE2-)およびオフターゲット遺伝子座が編集された白色コロニー(TRP1+/ADE2+)の数を数えるステップからなる。4つの潜在的なオフターゲット部位(ADE2オフ1~オフ4)を含有する4つのイースト株が生成され、yACMO-オフ1/オフ4と名付けた。次に、異なるyACMO株のADE2遺伝子座およびTRP1遺伝子座の自然発生的な復帰の割合を見積り、アッセイの読み出しにおける複雑化させる任意の変数の加入を回避した。TRP1遺伝子座の復帰は、実際には、擬陽性クローンの単離をもたらし得るが、ADE2遺伝子の自然発生的な組換えは偽陰性コロニーを生成し得る。本発明者らのアッセイ中に使用した実験条件を近づけるため、4つの株のそれぞれが別々にSpCas9をコードするプラスミドによってトランスフォームされ;選択培地中での24時間インキュベーション後、細胞を選択プレート上に広げ、形質転換体の総数を測定し、1000倍多くの細胞をトリプトファンまたはアデニンを欠損した選択プレート上にプレートし、各遺伝子座の復帰変異体の数を数えた。異なる選択条件下で得られたコロニーの数を比較することにより、TRP1遺伝子座とADE2遺伝子座との両方に関しておよそ1~1.5×10-5の平均復帰頻度を見積もることができ、したがって自然発生的な復帰が無視できることを示した。
レポーターアッセイの機能性は、野生型SpCas9と組み合わせて4つのレポーター株(yACMO-オフ1/オフ4)を試験することによって検証した。全体的な有効性を最大にするため、SpCas9によるチャレンジの前に、それぞれの株を、TRP1遺伝子座においてオンターゲット配列に完全にマッチングするsgRNA-オンを発現するプラスミドによって安定にトランスフォームした。4つの株は、次いで、ガラクトース誘導性プロモーターによって制御される野生型SpCas9の発現のためのプラスミドによってトランスフォームされ、4時間の回復インキュベーション後、ガラクトース含有培地中で一晩誘導して、SDluおよびレポーターSDluta5プレートにプレーティングした。これらの実験条件で、本発明者らは100%のオンターゲット切断に一貫して達した。また、オフターゲット活性は、レポータープレート上の白色コロニー(TRP1+/ADE2+)のパーセンテージとして測定して、予測した通り、PAM配列からのミスマッチ塩基の距離にしたがって増加した(図2)。最もPAM遠位の2つのオフターゲット(オフ3およびオフ4)については、SpCas9は、マッチング配列と2つのミスマッチ配列との間を区別することが全くできなかった(図2)。
公表された研究(Slaymaker IM et al., Science. 2016, 351(6268):84-8; Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5)とは異なり、本発明者らは、バイアスなしの手法は、高忠実度のSpCas9バリアントを得る見込みを増加する重要なアミノ酸置換の単離をもたらし得ると考えた。ランダム変異誘発に好適な標的を見出すため、利用可能な構造データを分析し、どのSpCas9ドメインがそのような種類の相互作用の形成に、より関与し得るか同定した。Cas9のヌクレアーゼローブは、切断活性を維持するために保存されなければならない触媒部位を2つ含有するため、この分析から除外された。Rec1、Rec2および架橋ヘリックスドメインを含有する認識ローブは、gRNA:DNA二量体とのいくつかの接触を生じることが報告されている。さらに、認識ローブは、全体として、II型CRISPRシステムに属する3つのCas9ファミリー全てにわたって最小限の保存領域の1つであり、高い配列可変性を示す。対照的に、架橋ヘリックスは異なるCas9オルソログ中の最も保存された領域の1つであり、その配列はヌクレアーゼ機能に特に重要であることを示唆している。Rec1-Rec2領域は、600アミノ酸超のランダム変異導入に適さない範囲にわたるが、相互作用する残基の大部分はRec1-IIドメインの最後の部分、およそ400~700残基の間に位置する(図3)。エラープローンPCRによって分子あたりおよそ4~5個の変異を含有するように生成されたREC1-IIバリアントのライブラリーは、変異誘発されたREC1-II断片(適切な相同アームを含有するもの)と、ガラクトース誘導性SpCas9を発現するプラスミド(同領域が事前に除去されたもの)との間の相同組換えを利用して、yACMO-オフ4レポーターのイースト株において直接構築された。全体的なスクリーニングワークフローを図4aに図式化した。コトランスフォーメーションおよびSDlu培地中での終夜の回復インキュベーションにより相同組換えによるCas9コードプラスミドの修復およびトランスフォームした細胞の選択を可能にした後、培養物はガラクトースを用いて5時間誘導されてSpCas9を発現し、次いでいくつかのSDluta5レポータープレート上にプレートされた。本発明者らは野生型SpCas9がこの制限された時間間隔でオンターゲット配列を完全に切断できることを観察したため(データは示さない)、誘導時間は、以前の実験に対して短くされ、高オンターゲット活性を維持するバリアントを得た。2日後、複数のコロニーが得られ、赤色コロニーをデキストロースの代わりにガラクトースを含有する新しいレポータープレートにストリークして、SpCas9発現を再活性化し、その発現をオンにしたまま一定に維持して、任意のオフターゲット効果を悪化させた。48時間後、最も赤いストリークからプラスミドを回収し、バクテリア中での増幅後、サンガー法配列決定を行い、REC1-IIドメインに導入された変異を同定した。いくつかのアミノ酸置換が同定され、そのいくつかは、異なる変異の群と組み合わせた変異体のプール中で1回より多く存在した。注目すべきことに、バリエーション尾同じセットを含有する変異体は、回復インキュベーション中に複製した同起源の細胞から誘導されたクローンを表すようである。しかしながら、得られた置換の多様性を考慮すると、この現象はスクリーニングの結果に影響しなかった。次いで、各単離したバリアントを含むyACMO-オフ4株において再チャレンジ実験を実施して、より正確にその切断活性を測定し、野生型SpCas9と比較してそれらの標的を効果的に切断しなかったものを除去して、残りのものを、それらのパラメーターおよびオフターゲット部位を区別するそれらの能力にしたがってランク付けした(図4b)。スクリーニングの結果をさらに検証するため、得られたバリアントの1つ(C13バリアント)の特異性を、4つのyACMOレポーター株全てをチャレンジするステップにより、より詳細に評価した。Cas9発現の24時間後、レポータープレート上の白色コロニーおよび赤色コロニーの定量によって、野生型SpCas9と比較した場合にオフターゲット活性が著しく低減されたことが示された(図4cおよび図2を比較)。
オンターゲット切断効率および非特異的活性の減少の両方によるイーストのスクリーニングから単離した優良バリアントに属する置換のプールを選択した。同定した変異体に対して著しく増加した忠実度を得るために、ランダムに生成された各バリアントにおけるいくつかの置換が中間的または有害であり得たと予想されたので、これらの変異の階層的な組合せを企図した。利用可能な構造データによる各置換およびsgRNA:DNA二量体の相対位置を最初のフィルタリング基準として用い、変異の最初のサブセットを同定した。さらに、標的DNA配列のよりPAM遠位の部分(nt.17~20)と接触するREC1-IIドメインの末端に位置する置換の立体構造クラスターが注目を集めた。したがって、このクラスターに属する変異は、これまでにsgRNA:DNA二量体との相互作用が報告されていなかったとしても選択された。特に、K562E変異体から出発して変異を順次追加することが決定され、これをイーストアッセイにおいて特によく実施した(図4c)。とりわけ、K562E変異は、上述のREC1-IIドメインに含まれる(図3)。
次いで、上記の発見を、内因性遺伝子座を標的化することによってさらに検証した。以前に試験したゲノム標的部位の群は、各遺伝子座におけるevoCas9の切断活性を野生型SpCas9の切断活性と比較するために選択された。さらに、SpCas9-HF1もまた、さらなるベンチマークとして比較に導入された。異なる遺伝子座を標的化するsgRNAと一緒に各SpCas9バリアントによる293T細胞のトランスフェクション後、インデル形成が、各標的部位に対してサンガー法配列決定したアンプリコンについて、トラッキング-オブ-インデル-バイ-デコンポジッション(TIDE)ソフトウェアパッケージを使用することにより分析された(Brinkman EK et al., Nucleic Acids Res. 2014, 42(22):e168)。大部分の遺伝子座に関して、本発明者らは、野生型SpCas9とevoCas9との間の標的化効率の大きな違いは観察せず、evoCas9は概ねわずかに低い活性であり、全体的な平均活性が野生型タンパク質の平均活性の80%であった(図7aおよび図7b)。本発明者らは、一つの標的部位であるZSCAN2遺伝子座に関して、非常に弱い切断効率を観察したが、その挙動に関する理解しやすい説明はない(図7a)。SpCas9-HF1バリアントは、野生型と比較して60%の全体的な平均活性であり、全体的に低い切断効率を示した(図7aおよび図7b)。これは、以前に公表された観察(Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5)とは一致せず、この不一致は異なる実験手順によるものであり得ると推測できる。これらのデータは、evoCas9が、試験した実験条件下で、内因性遺伝子座のパネルに対してほぼ野生型レベルのオンターゲット活性を維持し、以前に報告されたSpCas9-HF1バリアントに勝ることを実証するものである。
オンターゲット部位に対する活性と併せて、evoCas9の特異性を、2つの遺伝子座:FANCF部位2およびCCR5 sp11における編集と関連する以前に検証した2つのオフターゲット部位における編集率を確かめることによって測定した。これらの遺伝子座のCas9編集は興味深いものである。なぜなら、FANCF部位2関連オフターゲットは、SpCas9-HF1が特異的なオンターゲット部位と区別できない数少ない非反復性部位の1つであり、一方、CCR5sp11遺伝子座は、AIDS処置におけるその治療利用に価値があるものであり、相同性が高いCCR2遺伝子のオフターゲット切断と相関するためである。293T細胞の一過性トランスフェクション後、これら2つのオフターゲット遺伝子座におけるインデル形成はTIDEを使用して測定され、野生型SpCas9をトランスフェクトした細胞と比較した場合、evoCas9を発現する細胞における切断が著しく減少したことが明らかにされた(図8a)。さらに、野生型SpCas9、evoCas9およびSpCas9-HF1のオン/オフターゲット比の算出によって、本発明のバリアントがこれら2つの遺伝子座においてその競合物に勝り得ることが確認された(図8b)。CCR5sp11遺伝子座とCCR2遺伝子中のオフターゲットとの協調的切断により、およそ16キロベースの染色体欠失が生成される(図8cに図式化した)。この染色体再配置の頻度は、野生型SpCas9、evoCas9またはSpCas9-HF1を、CCR5遺伝子座を標的化するsgRNAと一緒にトランスフェクトした細胞における半定量的PCRによって測定された。特に野生型SpCas9によって編集された細胞において転座イベントが明らかであり、一方、SpCas9-HF1存在下およびevoCas9存在下の両方では欠失がわずかに検出可能なレベルの量まで大きく低減されたことが観察され、evoCas9は、SpCas9-HF1に対して測定される欠失をほぼ2分の1までさらに減少させた(図8c)。
evoCas9オフターゲット活性のゲノムワイドなレベルでの分析を、以前に確率されたGUIDEシーケンス技術を使用して拡張した(Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97)。この手法は、Cas9によって切断された部位に34bpのオリゴヌクレオチドタグを挿入してそれらの捕捉をライブラリー調製および次世代シーケンシングのために可能にすることに基づく。このように、Cas9によって非特異的に標的化される特定のガイドRNAと関連する新規のゲノム部位のコレクションを、公平な様式で同定することが可能である。GUIDEシーケンス分析を実施して、高度に反復性であり、細胞ゲノムに多くの望ましくない切断を生成することが示されているVEGFA部位2遺伝子座の編集と関連するオフターゲット部位を分析した。さらに、過去の報告(Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5)は、いくつかの検出されたオフターゲットが依然として高忠実度SpCas9-HF1バリアントによって切断されたことを示した。従って、GUIDEシーケンスライブラリーを、野生型SpCas9またはevoCas9のいずれかをVEGFA部位2sgRNAおよびベイト二本鎖オリゴヌクレオチドと一緒にトランスフェクトした293T細胞のゲノムDNAから調製した。配列決定データを、オープンソースソフトウェアのパイプライン(Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2016, 34(5):483)を使用して分析し、野生型SpCas9の600の異なるオフターゲット部位が、オンターゲット配列との7つ以下のミスマッチによって特徴づけられることを明らかにした(図10aおよび図10b)。注目すべきことに、各特定の部位での実際の切断活性の良い代わりとなることが報告されている(Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97)GUIDEシーケンス分析後に得たリードの数によると、およそ100のこれらのオフターゲット配列は、オンターゲット部位よりもより効果的に編集されていた(図10a)。evoCas9試料について同じ分析を実施した場合、全部で10個の部位のみが検出され、その大部分がオンターゲットと高い類似性を共有し、VEGFA部位2遺伝子座と5未満のミスマッチによって特徴づけられた(図10a)。evoCas9による高頻度切断を示す分析(オンターゲットより多い)から、1つのオフターゲットのみが明らかになった。これは、おそらくは、その配列が意図した標的から2つのヌクレオチドのみ異なり、各ミスマッチのレベルでシトシンの2つの連続したストレッチを含有し(図10a)、バルジ部位を形成して非マッチングヌクレオチドに対応可能にしたという、その配列の特定の性質に起因したのであろう。全体的に、上記のGUIDEシーケンス分析は、evoCas9が、細胞ゲノムへの複数のオフターゲットによって特徴づけられる反復性標的配列を使用して試験した場合でさえも、ゲノムワイドなレベルでの非常に高い特異性を保持することを実証した。
Cas9の代替の利用は、そのヌクレアーゼ活性とは独立して、触媒的に不活性なバージョンのCas9(dCas9)を、転写を刺激できる様々なタンパク質ドメインに融合することによって、RNAガイド型転写活性化因子を生成することである。evoCas9の触媒的に不活性な変異体を使用してVP64ベースの転写活性化因子(evo-dCas9)を工学的に作製し、野生型dCas9-VP64活性化因子と並べて試験した。転写活性化は、最小CMVプロモーター内に組み込まれたTetオペレーターエレメントを通してTetRベースのトランス活性化因子によって制御される誘導性EGFP発現ベクターに基づくレポーターシステムを使用することによって試験した。Tetトランス活性化因子は、反復Tetオペレーター配列を標的化するsgRNAによってガイドされるCas9ベースの転写活性化因子で置換した(図11a)。余分な5’-Gヌクレオチドの存在または不在のみが異なる2つの異なるオンターゲットsgRNAが、レポータープラスミドのTetオペレーター遺伝子座に対して設計され、さらに、1つまたは2つのいずれかの変異をスペーサー配列に沿って異なる位置に有する、同じオンターゲット配列に基づく3つの追加のミスマッチガイドも設計した。マッチングガイドRNAおよびミスマッチガイドRNAの両方に対して、dCas9-VP64と比較してevo-dCas9-VP64を用いると、EGFP発現のより低い絶対レベルが観察された。このことは、野生型dCas9が標的DNAにより強く結合したことを示唆している(図11b)。しかしながら、野生型dCas9およびevo-dCas9の両方に関して、コントロールsgRNAに対するオンターゲットの活性化倍率は、evo-dCas9で観察された低いバックグラウンド活性化に起因して、類似していた。この結果は、evo-Cas9の非特異的にDNAに結合する傾向がより低いことに起因する可能性がある(図11c)。興味深いことに、evo-dCas9-VP64によって示された特異性の増加は、dCas9-VP64と比較した場合に控えめであった。このことは、evoCas9が、効率がより低くともミスマッチ標的に結合するが、その場合、切断反応を完了できないことを示唆する(図11c)。全体的に、これらの結果は、evoCas9が、絶対活性化能力がより低いもののより低いバックグラウンド活性化、およびわずかに増加した活性化忠実度によって特徴づけられる転写制御因子を構築するために利用され得ることを示す。
細胞へのCas9の持続的な発現は、オフターゲット活性の増加と関連しているため、調べなければならない重要な問題は、細胞へのevoCas9の長期挙動であった。この点を解決するため、野生型SpCas9、evoCas9またはSpCas9-HF1を、目的のsgRNAと一緒に安定発現させ得るように、レンチウイルス粒子を生成した。高特異性バリアントをスクリーニングするために以前に用いられたものに類似の細胞のEGFPノックアウトモデルを用いるために、EGFPコード配列に対するsgRNAであって、標的遺伝子座に完全にマッチングするsgRNA、またはスペーサー配列の異なる位置に1つまたは複数のミスマッチを含有することによって代用のオフターゲットとして作用するsgRNAのいずれかのsgRNAの同じセットを使用して実験を行った。レポーター細胞株は、等量の異なるレンチウイルスベクターを用いて形質導入された。その培養物を実験の全期間にわたり選択して、形質導入された集団を単離し、編集される細胞の消失または形質導入細胞の適合の減少によって時間内に生じる、編集イベントが希釈化される可能性を回避した。一過性のトランスフェクション実験で観察されたものと同様に、異なる時点でのEGFP蛍光の消失は、野生型SpCas9が、完全にマッチングするsgRNAまたはミスマッチsgRNAのいずれかを用いる場合と類似の有効性で標的配列を切断することを明らかにした(図12aおよび図5c参照)。反対に、evoCas9とSpCas9-HF1の両方は、sgGFP1314およびsgGF1819sgRNA(両方とも2重のミスマッチを含有する)を使用すると、EGFPを効果的に切断しなかった(図12b~c)。注目すべきことに、evoCas9試料に関して蛍光の消失は全ての時点でバックグラウンドレベルであり、一方、SpCas9-HF1発現ベクターによって形質導入された培養物ではEGFP陰性細胞の測定可能な数は経時的に一定のまま存在した(図12c)。さらに、PAM遠位に単一のミスマッチを含有する最強の代用オフターゲット、sgGFP18を検討する場合、2つのバリアントの挙動は著しく異なった:SpCas9-HF1は、マッチングsgRNAとミスマッチsgRNAとの間を正確に区別することはできず、類似の効率で標的遺伝子座を切断したが、evoCas9は蛍光細胞の消失の増加傾向を示し、形質導入後40日目でのオンターゲットノックアウトの半分より少ないレベルに達した(図12b~c)。これらのデータは、ガイドRNAの注意深い選択により、本発明の高特異性Cas9バリアントevoCas9が、細胞ゲノム中の切断が制限されヌクレアーゼまたは望まない切断がないヌクレアーゼの長期の発現を可能にすることを示唆する。
プラスミドおよび構築物。プラスミドp415-GalL-Cas9-CYC1tを使用して、イーストでCas9を発現させた(Addgeneから取得した、♯43804)(Di Carlo JE, et al., Nucleic Acids Res. 2013, 41(7):4336-43)。制限酵素消化によるREC1-IIドメインの正確な除去を可能にするため、それぞれREC1-IIドメインの上流および下流に、2つの制限部位、NcoIおよびNheIを導入するためにPCRを通して同義の変異を生成した(プライマーについては添付資料の表2参照)。sgRNAの発現カセットは、p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4tプラスミドから取得した(Addgeneから取得した、♯43803)(Di Carlo JE, et al., Nucleic Acids Res. 2013, 41(7):4336-43)。オリジナルのスペーサー配列を所望の標的と交換するため、アセンブリー-PCRベース戦略を利用した。sgRNA発現カセットの5’部分を、T3フォワードプライマー(SNR52プロモーターの前にアニーリングする)およびスペーサー配列のすぐ上流にアニーリングし、所望のオンターゲット配列に対応する5’オーバーハングを含有するリバースプライマーを使用してPCR増幅した(添付資料の表2参照)。同じことを、プライマーT7リバースプライマーおよびスペーサー配列のすぐ後にアニーリングし、先に述べたものに逆平行の5’オーバーハングを含有するフォワードプライマーを使用して、sgRNAの3’断片に対して行った。gRNAカセットを得るためのアセンブリー反応は、両方のPCRアンプリコンを混合して、変性、アニーリングおよび伸長の単回ステップその後にT3およびT7の外側プライマーのみを使用する指数的増幅を実施することによって調製した。次いで、得られた断片を、ゲル精製して、SacII/XhoIによって予備消化および平滑末端化したpRS316(ATCC)(URA3イースト選択可能マーカーを有する低コピー数のセントロメアプラスミド(centromeric plasmid))に平滑末端クローニングして、pRS316-SNR52p-gRNA.ON-SUP4tプラスミドを生成した。
添付資料
Claims (30)
- K526EまたはK526Nの変異を含み、配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、改変Cas9タンパク質であって、ここで、前記変異の位置は、配列番号1に記載の非改変の成熟ストレプトコッカス・ピオゲネス(streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)におけるアミノ酸番号付けを参照して同定されるものであり、配列番号1に記載の非改変の成熟SpCas9と比較して忠実度が増加している、改変Cas9タンパク質。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の改変Cas9タンパク質。
- K526位における前記変異がK526Eである、請求項1または2に記載の改変Cas9タンパク質。
- K526位における前記変異がK526Nである、請求項1または2に記載の改変Cas9タンパク質。
- K377、E387、D397、R400、Q402、R403、F405、D406、N407、A421、L423、R424、Q426、Y430、K442、P449、Y450、V452、A456、R457、W464、M465、K468、E470、T472、I473、T474、P475、W476、F478、K484、S487、A488、M495、T496、N497、F498、L502、N504、K506、P509、Y515、F518、N522、E523、L540、S541、I548、D550、F553、V561、K562、E573、A589、L598、D605、L607、N609、N612、E617、D618、D628、R629、R635、K637、L651、K652、R654、T657、G658、W659、R661、L666、K673、S675、I679、L680、L683、N690、R691、N692、F693、Q695、H698、S701、F704、Q712、G715、Q716、H721、H723、I724、L727、A728、I733、L738、およびQ739から選択される1つ以上のアミノ酸残基位置に位置する1つ以上のさらなる変異をさらに含み、ここで、前記1つ以上のさらなる変異の位置は、配列番号1におけるアミノ酸番号付けを参照して同定される、請求項1~4のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質。
- 前記1つ以上のさらなる変異が、
K377E、E387V、D397E、R400H、Q402R、R403H、F405L、D406Y、D406V、N407P、N407H、A421V、L423P、R424G、Q426R、Y430C、K442N、P449S、Y450A、Y450S、Y450H、Y450N、V452I、A456T、R457P、R457Q、W464L、M465R、K468N、E470D、T472A、I473F、I473V、T474A、P475H、W476R、F478Y、F478V、K484M、S487Y、A488V、M495V、M495T、T496A、N497A、F498I、F498Y、L502P、N504S、K506N、P509L、Y515N、F518L、F518I、N522K、N522I、E523K、E523D、L540Q、S541P、I548V、D550N、F553L、V561M、V561A、K562E、E573D、A589T、L598P、D605V、L607P、N609D、N609S、N612Y、N612K、E617K、D618N、D628G、R629G、R635G、K637N、L651P、L651H、K652E、R654H、T657A、G658E、W659R、R661A、R661W、R661L、R661Q、R661S、L666P、K673M、S675C、I679V、L680P、L683P、N690I、R691Q、R691L、N692I、F693Y、Q695A、Q695H、Q695L、H698Q、H698P、S701F、F704S、Q712R、G715S、Q716H、H721R、H723L、I724V、L727H、A728G、A728T、I733V、L738P、Q739E、Q739PおよびQ739Kから選択される、請求項5に記載の改変Cas9タンパク質。 - 前記1つ以上のさらなる変異が、Y450、M495、Y515、R661、N690、R691、Q695、およびH698から選択される1つ以上の位置にある、請求項5に記載の改変Cas9タンパク質。
- 前記1つ以上のさらなる変異が、Y450S、M495V、Y515N、R661X、N690I、R691Q、Q695H、およびH698Qから選択され、XがL、QまたはSである、請求項7に記載の改変Cas9タンパク質。
- (a) K526E+Y450Sの変異;
(b) K526E+M495Vの変異;
(c) K526E+Y515Nの変異;
(d) K526E+R661Lの変異;
(e) K526E+N690Iの変異;
(f) K526E+R691Qの変異;
(g) K526E+Q695Hの変異;
(h) K526E+H698Qの変異;
(i) K526E+Y515N+R661Xの変異;
(j) K526E+R661L+H698Qの変異;
(k) K526E+M495V+Y515Nの変異;
(l) K526E+M495V+R661Lの変異;
(m) K526E+M495V+R661X+H698Qの変異;
(n) K526E+M495V+Y515N+R661Xの変異;または
(o) K526E+R403H+N612Y+L651P+K652E+G715Sの変異
を含み、XがL、QまたはSである、請求項7に記載の改変Cas9タンパク質。 - (p) K526E+Y515N+R661Lの変異;
(q) K526E+Y515N+R661Qの変異;
(r) K526E+Y515N+R661Sの変異;
(s) K526E+M495V+R661L+H698Qの変異;
(t) K526E+M495V+R661Q+H698Qの変異;
(u) K526E+M495V+R661S+H698Qの変異;
(v) K526E+M495V+Y515N+R661Lの変異;
(w) K526E+M495V+Y515N+R661Qの変異;または
(x) K526E+M495V+Y515N+R661Sの変異
を含む、請求項9に記載の改変Cas9タンパク質。 - K526E+M495V+Y515N+R661Qの変異を含む、請求項10に記載の改変Cas9タンパク質。
- K526E+M495V+Y515N+R661Sの変異を含む、請求項10に記載の改変Cas9タンパク質。
- K377E、E387V、D397E、R400H、Q402R、R403H、F405L、D406Y、D406V、N407P、N407H、A421V、L423P、R424G、Q426R、Y430C、K442N、P449S、Y450S、Y450H、Y450N、V452I、A456T、R457P、R457Q、W464L、M465R、K468N、E470D、T472A、I473F、I473V、T474A、P475H、W476R、F478Y、F478V、K484M、S487Y、A488V、M495V、M495T、T496A、F498I、F498Y、L502P、N504S、K506N、P509L、Y515N、F518L、F518I、N522K、N522I、E523K、E523D、L540Q、S541P、I548V、D550N、F553L、V561M、V561A、K562E、E573D、A589T、L598P、D605V、L607P、N609D、N609S、N612Y、N612K、E617K、D618N、D628G、R629G、R635G、K637N、L651P、L651H、K652E、R654H、T657A、G658E、W659R、R661W、R661L、R661Q、R661S、L666P、K673M、S675C、I679V、L680P、L683P、N690I、R691Q、R691L、N692I、F693Y、Q695H、Q695L、H698Q、H698P、S701F、F704S、Q712R、G715S、Q716H、H721R、H723L、I724V、L727H、A728G、A728T、I733V、L738P、Q739E、Q739PおよびQ739Kから選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1に記載の改変Cas9タンパク質。
- (a)M495V+K526N+S541P+K562Eの変異;または
(b)R403H+K526E+N612Y+L651P+K652E+G715Sの変異
を含み、前記変異の位置は配列番号1に記載の非改変の成熟ストレプトコッカス・ピオゲネス(streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)におけるアミノ酸番号付けを参照して同定される、請求項1または2に記載の改変Cas9タンパク質。 - D10、E762、D839、H840、N863、H983およびD986から選択される位置においてヌクレアーゼ活性を減少させる少なくとも1つのさらなる変異をさらに含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質。
- D1135、G1218、R1335、T1337から選択される位置においてPAM認識特異性を変更する少なくとも1つのさらなる変異をさらに含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質。
- ストレプトコッカス・ピオゲネス(S. pyogenes)のCas9タンパク質である、請求項1~16のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質。
- ストレプトコッカス・ピオゲネス(S. pyogenes)のCas9タンパク質のオルソログである、請求項1~16のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質。
- 請求項1~18のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質を生成するインビトロの方法であって、前記改変Cas9タンパク質を1つまたは複数の断片から再構築することを含む、方法。
- 請求項1~18のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質を含有する、タンパク質複合体、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体、混合タンパク質リボヌクレオタンパク質複合体、または脂質複合体。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質を含む融合タンパク質。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質をコードする核酸。
- 請求項22に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の改変Cas9タンパク質を生成するインビトロの方法であって、前記改変Cas9タンパク質を請求項22に記載の核酸によって発現することを含む、方法。
- 請求項22に記載の核酸または請求項23に記載のベクターを含む細胞、非ヒト動物または植物。
- 遺伝子治療の医薬としての使用のための、請求項22に記載の核酸または請求項23に記載のベクター。
- 請求項1~18のいずれか1項に記載の改変Cas9タンパク質、請求項20に記載のタンパク質複合体、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体、混合タンパク質リボヌクレオタンパク質複合体、または脂質複合体、請求項21に記載の融合タンパク質、請求項22に記載の核酸、または請求項23に記載のベクター、および少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現または他のバイオテクノロジー利用のための、 (i)ガイドRNA(gRNA)と一緒の請求項1~18のいずれか1項に記載の組換え改変Cas9タンパク質、(ii)請求項22に記載の核酸、または(iii)請求項23に記載のベクターの、インビトロでの使用。
- (i)gRNAと一緒の請求項1~18のいずれか1項に記載の組換え改変Cas9タンパク質、(ii)請求項22に記載の核酸、または(iii)請求項23に記載のベクターを含む、キットオブパーツ。
- 細胞のゲノムを変更するインビトロでの方法であって、特定のゲノム配列を標的化するガイドRNAと一緒に、請求項1~18のいずれか1項に記載の改変Cas9タンパク質を細胞内で発現させることを含む、方法。
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