JP6745391B2 - 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents

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Description

優先権の主張
本出願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）のもと、２０１５年８月２８日に出願された米国
特許出願第６２／２１１，５５３号明細書；２０１５年９月９日に出願された同第６２／
２１６，０３３号明細書；２０１５年１１月２０日に出願された同第６２／２５８，２８
０号明細書；２０１５年１２月２８日に出願された同第６２／２７１，９３８号明細書；
および２０１６年２月４日に出願された米国特許出願公開第１５／０１５，９４７号明細
書に対する優先権を主張する。上記の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる
。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細
書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩ複写物は、２０１６年８月２６日に
作成され、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと命名され、サイズが１２９，９
５５バイトである。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与
された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８、およびＲ０１ＧＭ０８８０４０のもとで政府
支援により作製された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、少なくとも部分的に、変更および改善された標的特異性を有する遺伝子操作
クラスター化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎ
ｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩ
ＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼならびにゲノム遺伝
子操作、エピゲノミック遺伝子操作、ゲノム標的化、ゲノム編集、およびインビトロ診断
におけるその使用に関する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、広範な生物および細胞タイプにおいて効率的
で効率的なゲノム編集を可能とする（Ｓａｎｄｅｒ＆Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ３２，３４７−３５５（２０１４）；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５
７，１２６２−１２７８（２０１４）；Ｄｏｕｄｎａ＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ＆Ｍａｙ，Ｅｘｐ
ｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３１１−３１４（２０１５））。Ｃａｓ
９による標的部位認識は、標的プロトスペーサーに相補的な配列をコードするキメラ単一
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりプログラミングされるが（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２））、短鎖隣接ＰＡＭの認識も要
求する（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３−７
４０（２００９）；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０，８９１−８９９
（２０１３）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３
３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６
−８２１（２０１２）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６
２−６７（２０１４））。
本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９タンパク質は、理論的には、ＤＮＡについてのＣａ
ｓ９の結合親和性を低減させることにより、増加した特異性を示すように遺伝子操作する
ことができる。したがって、野生型タンパク質と比較して増加した特異性を有する（すな
わち、不完全マッチまたはミスマッチＤＮＡ部位において実質的により少ないオフターゲ
ット効果を誘導する）多数のＣａｓ９バリアントおよびそれらを使用する方法が本明細書
に記載される。
第１の態様において、本発明は、以下の位置：Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６
１、Ｑ６９５、Ｑ９２６、および／またはＤ１１３５Ｅの１、２、３、４、５、６、また
は７つ全てにおける突然変異を有し、例えば、以下の位置：Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０、Ｎ４
９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６、Ｄ１１３５Ｅの１、２、３、４、５、６または７
つにおける突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配
列ならびに任意選択的に核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タ
グの１つ以上を含む単離化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。突然変異は、アミノ酸を天然アミ
ノ酸以外のアミノ酸に変更する（例えば、４９７は、Ｎ以外のいずれかである）。好まし
い実施形態において、突然変異は、アミノ酸を天然のもの、アルギニンまたはリジン以外
の任意のアミノ酸に変化させ；一部の実施形態において、アミノ酸は、アラニンである。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｎ４９７、Ｒ
６６１、Ｑ６９５、およびＱ９２６の１、２、３、または４つ全てにおける突然変異、例
えば、以下の突然変異：Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの１、
２、３、または４つ全てを含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｑ６９５および／ま
たはＱ９２６ならびに任意選択的にＬ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、およびＤ
１１３５Ｅの１、２、３、４、または５つ全てにおける突然変異、例えば、例として、限
定されるものではないが、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／
Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２
６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ
４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０
Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／
Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６
Ａ，Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ
４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅを含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｎ１４；Ｓ１５；Ｓ
５５；Ｒ６３；Ｒ７８；Ｈ１６０；Ｋ１６３；Ｒ１６５；Ｌ１６９；Ｒ４０３；Ｎ４０７
；Ｙ４５０；Ｍ４９５；Ｎ４９７；Ｋ５１０；Ｙ５１５；Ｗ６５９；Ｒ６６１；Ｍ６９４
；Ｑ６９５；Ｈ６９８；Ａ７２８；Ｓ７３０；Ｋ７７５；Ｓ７７７；Ｒ７７８；Ｒ７８０
；Ｋ７８２；Ｒ７８３；Ｋ７８９；Ｋ７９７；Ｑ８０５；Ｎ８０８；Ｋ８１０；Ｒ８３２
；Ｑ８４４；Ｓ８４５；Ｋ８４８；Ｓ８５１；Ｋ８５５；Ｒ８５９；Ｋ８６２；Ｋ８９０
；Ｑ９２０；Ｑ９２６；Ｋ９６１；Ｓ９６４；Ｋ９６８；Ｋ９７４；Ｒ９７６；Ｎ９８０
；Ｈ９８２；Ｋ１００３；Ｋ１０１４；Ｓ１０４０；Ｎ１０４１；Ｎ１０４４；Ｋ１０４
７；Ｋ１０５９；Ｒ１０６０；Ｋ１１０７；Ｅ１１０８；Ｓ１１０９；Ｋ１１１３；Ｒ１
１１４；Ｓ１１１６；Ｋ１１１８；Ｄ１１３５；Ｓ１１３６；Ｋ１１５３；Ｋ１１５５；
Ｋ１１５８；Ｋ１２００；Ｑ１２２１；Ｈ１２４１；Ｑ１２５４；Ｑ１２５６；Ｋ１２８
９；Ｋ１２９６；Ｋ１２９７；Ｒ１２９８；Ｋ１３００；Ｈ１３１１；Ｋ１３２５；Ｋ１
３３４；Ｔ１３３７および／またはＳ１２１６における突然変異を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｎ
１４Ａ；Ｓ１５Ａ；Ｓ５５Ａ；Ｒ６３Ａ；Ｒ７８Ａ；Ｒ１６５Ａ；Ｒ４０３Ａ；Ｎ４０７
Ａ；Ｎ４９７Ａ；Ｙ４５０Ａ；Ｋ５１０Ａ；Ｙ５１５Ａ；Ｒ６６１Ａ；Ｑ６９５Ａ；Ｓ７
３０Ａ；Ｋ７７５Ａ；Ｓ７７７Ａ；Ｒ７７８Ａ；Ｒ７８０Ａ；Ｋ７８２Ａ；Ｒ７８３Ａ；
Ｋ７８９Ａ；Ｋ７９７Ａ；Ｑ８０５Ａ；Ｎ８０８Ａ；Ｋ８１０Ａ；Ｒ８３２Ａ；Ｑ８４４
Ａ；Ｓ８４５Ａ；Ｋ８４８Ａ；Ｓ８５１Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｒ８５９Ａ；Ｋ８６２Ａ；Ｋ８
９０Ａ；Ｑ９２０Ａ；Ｑ９２６Ａ；Ｋ９６１Ａ；Ｓ９６４Ａ；Ｋ９６８Ａ；Ｋ９７４Ａ；
Ｒ９７６Ａ；Ｎ９８０Ａ；Ｈ９８２Ａ；Ｋ１００３Ａ；Ｋ１０１４Ａ；Ｓ１０４０Ａ；Ｎ
１０４１Ａ；Ｎ１０４４Ａ；Ｋ１０４７Ａ；Ｋ１０５９Ａ；Ｒ１０６０Ａ；Ｋ１１０７Ａ
；Ｅ１１０８Ａ；Ｓ１１０９Ａ；Ｋ１１１３Ａ；Ｒ１１１４Ａ；Ｓ１１１６Ａ；Ｋ１１１
８Ａ；Ｄ１１３５Ａ；Ｓ１１３６Ａ；Ｋ１１５３Ａ；Ｋ１１５５Ａ；Ｋ１１５８Ａ；Ｋ１
２００Ａ；Ｑ１２２１Ａ；Ｈ１２４１Ａ；Ｑ１２５４Ａ；Ｑ１２５６Ａ；Ｋ１２８９Ａ；
Ｋ１２９６Ａ；Ｋ１２９７Ａ；Ｒ１２９８Ａ；Ｋ１３００Ａ；Ｈ１３１１Ａ；Ｋ１３２５
Ａ；Ｋ１３３４Ａ；Ｔ１３３７Ａおよび／またはＳ１２１６Ａの１つ以上も含む。一部の
実施形態において、バリアントタンパク質は、ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ）＋Ｋ８１０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８５５Ａ、ＨＦ１＋
Ｈ９８２Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、
ＨＦ１＋Ｋ８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８５５Ａ／Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｈ９
８２Ａ／Ｋ１００３Ａ、ＨＦ１＋Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ１００３Ａ／Ｒ
１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／
Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａを含む。一部の実施形態において、バリアントタンパク質は
、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ
８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８５５Ａ／Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ１００３Ａ／
Ｒ１０６０Ａ、ＨＦ１＋Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａを含む。一部の実施形
態において、バリアントタンパク質は、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ７８０Ａ、Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ９７６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ
／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｈ９８
２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ
／Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６
９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ
／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ
９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０
６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａを含む。一部の実施形態にお
いて、バリアントは、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ、
Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１
Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｒ７８０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ、
Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１
Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ
９２６Ａ／Ｋ１０１４Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０４
７Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／
Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１
Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６
９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ
／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ
／Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８
５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ
／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｋ１
００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｋ１００３
Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ
４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９
７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ
、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１
０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ７８０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ
、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ８３２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ
９２６Ａ／Ｒ９７６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ
／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０１４Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ
１０４７Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４
８Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ９７６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ
９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ
／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０
Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ８３２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ
９６８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／
Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２
６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｋ１００３Ａ
、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１
００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０
６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｋ１０４７Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ
／Ｒ８３２Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、またはＱ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８
Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａを含む。
アラニン以外のアミノ酸の突然変異も含まれ、本方法および組成物においてそれを作製
および使用することができる。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の追加の突然変
異：Ｒ６３Ａ、Ｒ６６Ａ、Ｒ６９Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ７１Ａ、Ｙ７２Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｒ７５
Ａ、Ｋ７６Ａ、Ｎ７７Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ１１５Ａ、Ｈ１６０Ａ、Ｋ１６３Ａ、Ｒ１６５Ａ
、Ｌ１６９Ａ、Ｒ４０３Ａ、Ｔ４０４Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｎ４０７Ａ、Ｒ４４７Ａ、Ｎ４９
７Ａ、Ｉ４４８Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｓ４６０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｋ５１０Ａ、Ｙ５１５Ａ、Ｒ
６６１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｙ１０１３Ａ、Ｖ１０１５Ａ、Ｒ１１
２２Ａ、Ｋ１１２３Ａ、Ｋ１１２４Ａ、Ｋ１１５８Ａ、Ｋ１１８５Ａ、Ｋ１２００Ａ、Ｓ
１２１６Ａ、Ｑ１２２１Ａ、Ｋ１２８９Ａ、Ｒ１２９８Ａ、Ｋ１３００Ａ、Ｋ１３２５Ａ
、Ｒ１３３３Ａ、Ｋ１３３４Ａ、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ａの１つ以上を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、複数の置換突然変異
：Ｎ４９７／Ｒ６６１／Ｑ６９５／Ｑ９２６（四重バリアント突然変異体）；Ｑ６９５／
Ｑ９２６（二重突然変異体）；Ｒ６６１／Ｑ６９５／Ｑ９２６およびＮ４９７／Ｑ６９５
／Ｑ９２６（三重突然変異体）を含む。一部の実施形態において、Ｌ１６９、Ｙ４５０お
よび／またはＤ１１３５における追加の置換突然変異をそれらの二重、三重、および四重
突然変異体に追加することができ、またはＱ６９５もしくはＱ９２６における置換を担持
する単一突然変異体に追加することができる。一部の実施形態において、突然変異体は、
野生型アミノ酸に代えてアラニンを有する。一部の実施形態において、突然変異体は、ア
ルギニンまたはリジン（または天然アミノ酸）以外の任意のアミノ酸を有する。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、
Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異
からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異も含む。
一部の実施形態において、突然変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ）
Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙである。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異のセット：Ｄ１
１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３
５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ
／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３
５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つも含み得る。
本明細書において、以下の位置：Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｙ６５１、またはＲ６５４の１、２、３、４、５、６つ以上における突然変異を有し、例えば、以下の位置：Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｙ６５１、またはＲ６５４の１、２、３、４、もしくは５、または６つにおける突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列ならびに任意選択的に核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質も提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｙ６５１および／またはＲ６５４の１、２、３、４、５、６つ以上における突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントは、以下の突然変異：Ｙ２１１Ａ、Ｙ２１２Ａ、Ｗ２２９、Ｙ２３０Ａ、Ｒ２４５Ａ、Ｔ３９２Ａ、Ｎ４１９Ａ、Ｙ６５１、および／またはＲ６５４Ａの１つ以上を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｎ４１９および／ま
たはＲ６５４における突然変異ならびに任意選択的に追加の突然変異Ｙ２１１、Ｙ２１２
、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５およびＴ３９２の１、２、３、４つ以上、好ましくは、
Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ、Ｙ２１１
Ａ／Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｒ２
４５Ａ、Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｗ２２９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／
Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／Ｙ６５１
Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２
１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／
Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０
Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６
５１Ａ、Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、
Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｒ２４５Ａ／Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４
Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｗ２２９Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４
１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、
またはＹ２１１Ａ／Ｗ２２９Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａを含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｙ２１１；Ｙ２１２
；Ｗ２２９；Ｙ２３０；Ｒ２４５；Ｔ３９２；Ｎ４１９；Ｌ４４６；Ｑ４８８；Ｎ４９２
；Ｑ４９５；Ｒ４９７；Ｎ４９８；Ｒ４９９；Ｑ５００；Ｋ５１８；Ｋ５２３；Ｋ５２５
；Ｈ５５７；Ｒ５６１；Ｋ５７２；Ｒ６３４；Ｙ６５１；Ｒ６５４；Ｇ６５５；Ｎ６５８
；Ｓ６６２；Ｎ６６７；Ｒ６８６；Ｋ６９２；Ｒ６９４；Ｈ７００；Ｋ７５１；Ｄ７８６
；Ｔ７８７；Ｙ７８９；Ｔ８８２；Ｋ８８６；Ｎ８８８；８８９；Ｌ９０９；Ｎ９８５；
Ｎ９８６；Ｒ９９１；Ｒ１０１５；Ｎ４４；Ｒ４５；Ｒ５１；Ｒ５５；Ｒ５９；Ｒ６０；
Ｒ１１６；Ｒ１６５；Ｎ１６９；Ｒ２０８；Ｒ２０９；Ｙ２１１；Ｔ２３８；Ｙ２３９；
Ｋ２４８；Ｙ２５６；Ｒ３１４；Ｎ３９４；Ｑ４１４；Ｋ５７；Ｒ６１；Ｈ１１１；Ｋ１
１４；Ｖ１６４；Ｒ１６５；Ｌ７８８；Ｓ７９０；Ｒ７９２；Ｎ８０４；Ｙ８６８；Ｋ８
７０；Ｋ８７８；Ｋ８７９；Ｋ８８１；Ｙ８９７；Ｒ９０１；および／またはＫ９０６に
おける突然変異を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｙ
２１１Ａ；Ｙ２１２Ａ；Ｗ２２９Ａ；Ｙ２３０Ａ；Ｒ２４５Ａ；Ｔ３９２Ａ；Ｎ４１９Ａ
；Ｌ４４６Ａ；Ｑ４８８Ａ；Ｎ４９２Ａ；Ｑ４９５Ａ；Ｒ４９７Ａ；Ｎ４９８Ａ；Ｒ４９
９Ａ；Ｑ５００Ａ；Ｋ５１８Ａ；Ｋ５２３Ａ；Ｋ５２５Ａ；Ｈ５５７Ａ；Ｒ５６１Ａ；Ｋ
５７２Ａ；Ｒ６３４Ａ；Ｙ６５１Ａ；Ｒ６５４Ａ；Ｇ６５５Ａ；Ｎ６５８Ａ；Ｓ６６２Ａ
；Ｎ６６７Ａ；Ｒ６８６Ａ；Ｋ６９２Ａ；Ｒ６９４Ａ；Ｈ７００Ａ；Ｋ７５１Ａ；Ｄ７８
６Ａ；Ｔ７８７Ａ；Ｙ７８９Ａ；Ｔ８８２Ａ；Ｋ８８６Ａ；Ｎ８８８Ａ；Ａ８８９Ａ；Ｌ
９０９Ａ；Ｎ９８５Ａ；Ｎ９８６Ａ；Ｒ９９１Ａ；Ｒ１０１５Ａ；Ｎ４４Ａ；Ｒ４５Ａ；
Ｒ５１Ａ；Ｒ５５Ａ；Ｒ５９Ａ；Ｒ６０Ａ；Ｒ１１６Ａ；Ｒ１６５Ａ；Ｎ１６９Ａ；Ｒ２
０８Ａ；Ｒ２０９Ａ；Ｔ２３８Ａ；Ｙ２３９Ａ；Ｋ２４８Ａ；Ｙ２５６Ａ；Ｒ３１４Ａ；
Ｎ３９４Ａ；Ｑ４１４Ａ；Ｋ５７Ａ；Ｒ６１Ａ；Ｈ１１１Ａ；Ｋ１１４Ａ；Ｖ１６４Ａ；
Ｒ１６５Ａ；Ｌ７８８Ａ；Ｓ７９０Ａ；Ｒ７９２Ａ；Ｎ８０４Ａ；Ｙ８６８Ａ；Ｋ８７０
Ａ；Ｋ８７８Ａ；Ｋ８７９Ａ；Ｋ８８１Ａ；Ｙ８９７Ａ；Ｒ９０１Ａ；Ｋ９０６Ａの１つ
以上を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の追加の突然変
異：Ｙ２１１Ａ、Ｗ２２９Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｒ２４５Ａ、Ｔ３９２Ａ、Ｎ４１９Ａ、Ｌ４
４６Ａ、Ｙ６５１Ａ、Ｒ６５４Ａ、Ｄ７８６Ａ、Ｔ７８７Ａ、Ｙ７８９Ａ、Ｔ８８２Ａ、
Ｋ８８６Ａ、Ｎ８８８Ａ、Ａ８８９Ａ、Ｌ９０９Ａ、Ｎ９８５Ａ、Ｎ９８６Ａ、Ｒ９９１
Ａ、Ｒ１０１５Ａ、Ｎ４４Ａ、Ｒ４５Ａ、Ｒ５１Ａ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５９Ａ、Ｒ６０Ａ、Ｒ
１１６Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｎ１６９Ａ、Ｒ２０８Ａ、Ｒ２０９Ａ、Ｔ２３８Ａ、Ｙ２３９Ａ
、Ｋ２４８Ａ、Ｙ２５６Ａ、Ｒ３１４Ａ、Ｎ３９４Ａ、Ｑ４１４Ａ、Ｋ５７Ａ、Ｒ６１Ａ
、Ｈ１１１Ａ、Ｋ１１４Ａ、Ｖ１６４Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｌ７８８Ａ、Ｓ７９０Ａ、Ｒ７９
２Ａ、Ｎ８０４Ａ、Ｙ８６８Ａ、Ｋ８７０Ａ、Ｋ８７８Ａ、Ｋ８７９Ａ、Ｋ８８１Ａ、Ｙ
８９７Ａ、Ｒ９０１Ａ、Ｋ９０６Ａの１つ以上を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、複数の置換突然変異
：Ｒ２４５／Ｔ３９２／Ｎ４１９／Ｒ６５４およびＹ２２１／Ｒ２４５／Ｎ４１９／Ｒ６
５４（四重バリアント突然変異体）；Ｎ４１９／Ｒ６５４、Ｒ２４５／Ｒ６５４、Ｙ２２
１／Ｒ６５４、およびＹ２２１／Ｎ４１９（二重突然変異体）；Ｒ２４５／Ｎ４１９／Ｒ
６５４、Ｙ２１１／Ｎ４１９／Ｒ６５４、およびＴ３９２／Ｎ４１９／Ｒ６５４（三重突
然変異体）を含む。一部の実施形態において、突然変異体は、野生型アミノ酸に代えてア
ラニンを含有する。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ４７７、
Ｄ５５６、Ｈ７０１、またはＤ７０４；およびＨ５５７またはＮ５８０における突然変異
からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異も含む。
一部の実施形態において、突然変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、（ｉｉ）Ｈ５
５７Ａ、Ｈ５５７Ｎ、もしくはＨ５５７Ｙ、（ｉｉｉ）Ｎ５８０Ａ、および／または（ｉ
ｖ）Ｄ５５６Ａである。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｅ
７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、またはＲ１０１５Ｈの１つ以上を含む。具体的には
、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９
Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／
Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）である。
一部の実施形態において、バリアントＣａｓ９タンパク質は、特異性を増加させるため
の以下の領域の１つ以上の突然変異を含む。
本明細書において、任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合している本
明細書に記載の単離バリアントＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、リン
カーが融合タンパク質の活性を妨害しない融合タンパク質も提供される。一部の実施形態
において、異種機能ドメインは、ＤＮＡまたはタンパク質、例えば、クロマチンに対して
作用する。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写活性化ドメインである。一
部の実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からの
ものである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写サイレンサーまたは転写
抑制ドメインである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関連ボ
ックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ
３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。一部の実施形態において、転写サイレンサーは
ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βである。一
部の実施形態において、異種機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素であ
る。一部の実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素は、ＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質の全体もしくはジオキシゲナーゼ
ドメイン、例えば、システインリッチ伸長部および７つの高度に保存されるエキソンによ
りコードされる２ＯＧＦｅＤＯドメイン、例えば、アミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴ
ｅｔ１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２およびアミノ酸９６６
〜１６７８を含むＴｅｔ３を含む触媒モジュールである。一部の実施形態において、ＴＥ
Ｔタンパク質またはＴＥＴ由来ジオキシゲナーゼドメインは、ＴＥＴ１からのものである
。一部の実施形態において、異種機能ドメインは、ヒストンサブユニットを改変する酵素
である。一部の実施形態において、ヒストンサブユニットを改変する酵素は、ヒストンア
セチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストン
メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである。一部の実施
形態において、異種機能ドメインは生物学的係留物である。一部の実施形態において、生
物学的係留物はＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である。一部の実施形態にお
いて、異種機能ドメインはＦｏｋＩである。
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＣａｓ９タンパク質をコードする核酸
、単離核酸、および任意選択的に本明細書に記載のバリアントＣａｓ９タンパク質の発現
のための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されているその単離核酸を含むベクタ
ーも提供される。本明細書において、本明細書に記載の核酸を含み、かつ任意選択的に本
明細書に記載のバリアントＣａｓ９タンパク質を発現する宿主細胞、例えば細菌、酵母、
昆虫もしく哺乳動物宿主細胞またはトランスジェニック動物（例えばマウス）も提供され
る。
本明細書において、Ｃａｓ９バリアントをコードする単離核酸および任意選択的にその
バリアントの発現のための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されているその単離
核酸を含むベクターおよびその核酸を含み、かつ任意選択的にそのバリアントタンパク質
を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供される。
本明細書において、細胞中で、本明細書に記載のバリアントＣａｓ９タンパク質または
融合タンパク質、およびゲノム標的部位における最適なヌクレオチド間隔を有する、細胞
のゲノムの選択部分に相補的な領域を有する少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現させる
ことにより、またはそれらと細胞を接触させることにより、細胞のゲノムまたはエピゲノ
ムを変更する方法も提供される。方法は、細胞を、例えば、単一ベクター中のＣａｓ９タ
ンパク質およびガイドＲＮＡをコードする核酸と接触させること；細胞を、例えば、複数
のベクター中のＣａｓ９タンパク質コードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸
と接触させること；ならびに細胞を、精製Ｃａｓ９タンパク質および合成または精製ｇＲ
ＮＡの複合体と接触させることをとりわけ含み得る。一部の実施形態において、細胞はｇ
ＲＮＡまたはバリアントタンパク質／融合タンパク質の一方または両方を安定的に発現し
、他のエレメントは細胞中に形質移入または導入される。例えば、細胞は本明細書に記載
のバリアントタンパク質または融合タンパク質を安定的に発現し得、方法は、細胞を、合
成ｇＲＮＡ、精製組換え産生ｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸と接触させるこ
とを含み得る。一部の実施形態において、バリアントタンパク質または融合タンパク質は
、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む。
本明細書において、ｄｓＤＮＡを、本明細書に記載の精製バリアントタンパク質または
融合タンパク質およびｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと
接触させることにより、インビトロで単離ｄｓＤＮＡ分子を変更する、例えば、選択的に
変更する方法も提供される。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。方法お
よび材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において公知
の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説
明のためのものにすぎず、限定するものではない。本明細書に挙げられる全ての刊行物、
特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、参照により全
体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が定義を含めて優先される。
本発明の他の特徴部および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の
範囲から明らかである。
図１Ａ：非特異的ＤＮＡ接触を形成する残基中の突然変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントの同定および特徴付けである。ＰＤＢ ４ＯＯＧおよび４ＵＮ３（出典、それぞれ参照文献３１および３２）に基づく標的ＤＮＡ：ｓｇＲＮＡ二本鎖の野生型ＳｐＣａｓ９認識を示す概略図である。 図１Ｂ：非特異的ＤＮＡ接触を形成する残基中の突然変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントの同定および特徴付けである。ＤＮＡ骨格への水素結合を形成する位置におけるアラニン置換を含有するＳｐＣａｓ９バリアントの特徴付けである。完全マッチｓｇＲＮＡまたは標的部位に対するミスマッチをコードする４つの他のｓｇＲＮＡを用いてプログラミングしたヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ使用して野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントを評価した。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色点線により表す（このパネルおよびパネルＣについて）。 図１Ｃ：非特異的ＤＮＡ接触を形成する残基中の突然変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントの同定および特徴付けである。ＥＧＦＰ崩壊アッセイにより評価された２４個の部位にわたる野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性である。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図１Ｄ：非特異的ＤＮＡ接触を形成する残基中の突然変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントの同定および特徴付けである。Ｔ７Ｅ１アッセイにより評価された１３個の内在性部位にわたる野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性である。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図１Ｅ：非特異的ＤＮＡ接触を形成する残基中の突然変異を担持するＳｐＣａｓ９バリアントの同定および特徴付けである。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性と、野生型ＳｐＣａｓ９のオンターゲット活性との比（パネルＣおよびＤからのもの）である。 図２Ａ：標準的な標的部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより決定された、内在性ヒト遺伝子に標的化される８つのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオフターゲット部位である。リードカウントは、所与の部位における開裂頻度の尺度を表し；スペーサーまたはＰＡＭ内のミスマッチ位置を着色して強調する。 図２Ｂ：標準的な標的部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。パネルＡにおいて使用された８つのｓｇＲＮＡからの野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１についてのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたゲノムワイドオフターゲット部位の総数のまとめである。 図２Ｃ：標準的な標的部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。オンターゲット活性に対するミスマッチ（プロトスペーサーおよびＰＡＭ内）の総数に従ってビン化された、８つのｓｇＲＮＡについての野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１について同定されたオフターゲット部位である。 図３Ａ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたオフターゲット部位の標的化ディープシーケンシングによるＳｐＣａｓ９−ＨＦ１特異性改善のバリデーションである。図２からの６つのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１についてのディープシーケンシングにより決定された平均オンターゲット改変パーセントである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図３Ｂ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたオフターゲット部位の標的化ディープシーケンシングによるＳｐＣａｓ９−ＨＦ１特異性改善のバリデーションである。インデル突然変異を含有するディープシーケンシングされたオンターゲット部位およびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ検出されたオフターゲット部位の割合である。トリプリケート実験を、野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および対照条件についてプロットする。ｘ軸下方の黒丸は、挿入突然変異も欠失突然変異も観察されなかったレプリケートを表す。ＰＣＲにより増幅することができなかったオフターゲット部位を、アスタリスクとともに赤色文字で示す。プールリードカウントを用いる片側検定のフィッシャーの正確確率検定を使用する仮説検定は、ＥＭＸ１−１オフターゲット１およびＦＡＮＣＦ−３オフターゲット１のみにおけるＳｐＣａｓ９−ＨＦ１と対照条件との間の比較についての有意差を見出した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用する多重比較について調整後ｐ＜０．０５）。有意差は、全てのオフターゲット部位における野生型ＳｐＣａｓ９とＳｐＣａｓ９−ＨＦ１との間、およびＲＵＮＸ１−１オフターゲット２を除き全てのオフターゲット部位における野生型ＳｐＣａｓ９と対照条件との間でも見出された。 図３Ｃ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたオフターゲット部位の標的化ディープシーケンシングによるＳｐＣａｓ９−ＨＦ１特異性改善のバリデーションである。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリードカウント（図２Ａからのもの）と、野生型ＳｐＣａｓ９を用いたオンおよびオフターゲット開裂部位におけるディープシーケンシングにより決定された平均改変パーセントとの間の相関の分散プロットである。 図４Ａ：非標準的な反復部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。多数のオフターゲット部位を開裂することが公知の２つのｓｇＲＮＡ（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２−８２６（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））を使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ特異性プロファイルである。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリードカウントは、所与の部位における開裂効率の尺度を表し；スペーサーまたはＰＡＭ内のミスマッチ位置を着色して強調し；赤色丸は、ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ界面において、示されるバルジ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４））を有する可能性が高い部位を示し；青色丸は、示されるものに対する代替ギャップありアラインメントを有し得る部位を示す（図８参照）。 図４Ｂ：非標準的な反復部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。パネルＡにおいて使用された２つのｓｇＲＮＡからの野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１についてのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより同定されたゲノムワイドオフターゲット部位の総数のまとめである。 図４Ｃ：非標準的な反復部位についてのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性である。オンターゲット部位に対するミスマッチ（プロトスペーサーおよびＰＡＭ内）の総数に従ってビン化された、ＶＥＧＦＡ部位２および３についての野生型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて同定されたオフターゲット部位である。パネルＡにおいて赤色丸により標識されるオフターゲット部位は、これらのカウントに含めず；パネルＡにおいて青色丸により標識される部位を、ギャップなしアラインメント中のミスマッチの数とともにカウントする。 図５Ａ：追加の置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。８つのｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体バリアントのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性である。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５、およびＱ９２６Ａ突然変異を保有し；ＨＦ２＝ＨＦ１＋Ｄ１１３５Ｅ；ＨＦ３＝ＨＦ１＋Ｌ１６９Ａ；ＨＦ４＝ＨＦ１＋Ｙ４５０Ａである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色点線により表す。 図５Ｂ：追加の置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。パネルａからの８つのｓｇＲＮＡを用いて野生型ＳｐＣａｓ９と比較したＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントを使用した場合のオンターゲット活性のまとめである。中央値および四分位範囲を示し；野生型活性の＞７０％を示す間隔を緑色で強調する。 図５Ｃ：追加の置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。ＦＡＮＣＦ部位２およびＶＥＧＦＡ部位３オンターゲット部位、ならびにＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の効果に耐性の図２Ａおよび４Ａからのオフターゲット部位におけるＳｐＣａｓ９およびＨＦバリアントによる平均改変パーセントである。改変パーセントはＴ７Ｅ１アッセイにより決定し；全ての実験についてバックグラウンドインデル割合を差し引いた。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図５Ｄ：追加の置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。オンターゲット活性とオフターゲット活性（パネルＣからのもの）との比としてプロットされる、ＦＡＮＣＦ部位２またはＶＥＧＦＡ部位３ｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＨＦバリアントの特異性の比である。 図５Ｅ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の効果に耐性のオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡを用いた、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、−ＨＦ２、および−ＨＦ４のゲノムワイド特異性である。パネルＦにおけるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験についての目的オンターゲット部位における平均ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑタグインテグレーション。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；ＨＦ２＝ＨＦ１＋Ｄ１１３５Ｅ；ＨＦ４＝ＨＦ１＋Ｙ４５０Ａである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図５Ｆ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の効果に耐性のオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡを用いた、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、−ＨＦ２、および−ＨＦ４のゲノムワイド特異性である。ＦＡＮＣＦ部位２またはＶＥＧＦＡ部位３ｓｇＲＮＡのいずれかを用いたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、−ＨＦ２、または−ＨＦ４のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ同定オフターゲット部位である。リードカウントは、所与の部位における開裂頻度の尺度を表し；スペーサーまたはＰＡＭ内のミスマッチ位置を着色して強調する。オフターゲット区別の改善倍率は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦバリアントについてのオフターゲットリードカウントをＳｐＣａｓ９−ＨＦバリアント間の比較前にオンターゲット部位におけるリードカウントに正規化することにより計算した。 図６Ａ：ｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡとのＳｐＣａｓ９相互作用である。ＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体を、ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合とともに説明する概略図である。 図６Ｂ：ｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡとのＳｐＣａｓ９相互作用である。ＰＤＢ：４ＵＮ３（参照文献３２）からの、標的ＤＮＡに結合しているＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の構造表示である。標的鎖ＤＮＡ骨格への水素結合接触を形成する４つの残基を青色で強調し；可視目的のためにＨＮＨドメインを非表示にする。 図７Ａ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験に使用された種々のｓｇＲＮＡを用いた野生型およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性比較である。制限断片長多型アッセイにより定量された、図２Ａに示されるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験についての目的オンターゲット部位における平均ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑタグインテグレーションである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図７Ｂ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験に使用された種々のｓｇＲＮＡを用いた野生型およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性比較である。Ｔ７Ｅ１アッセイにより検出された、図２Ａに示されるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験についての目的オンターゲット部位における平均改変パーセントである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図７Ｃ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験に使用された種々のｓｇＲＮＡを用いた野生型およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性比較である。制限断片長多型アッセイにより定量された、図４Ａに示されるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験についての目的オンターゲット部位における平均ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑタグインテグレーションである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図７Ｄ：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験に使用された種々のｓｇＲＮＡを用いた野生型およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性比較である。Ｔ７Ｅ１アッセイにより検出された、図４Ａに示されるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験についての目的オンターゲット部位における平均改変パーセントである。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 ＶＥＧＦＡ部位２オフターゲット部位についての潜在的代替アラインメントである。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｋｅａｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８，１６４７−１６４９（２０１２））バージョン８．１．６を使用してアラインされた、単一ヌクレオチドギャップを含有するオフターゲット部位として潜在的に認識することができるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（左）により同定された１０個のＶＥＧＦＡ部位２オフターゲット部位（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４）））（右）である。 トランケートｓｇＲＮＡ１４を用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の活性。ＥＧＦＰ中の４つの部位に標的化される全長またはトランケートｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＥＧＦＰ崩壊活性である。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；対照実験におけるバックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色点線により表す。 ５’−ミスマッチグアニン塩基を担持するｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１活性である。４つの異なる部位に標的化されるｓｇＲＮＡを用いた野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＥＧＦＰ崩壊活性である。それぞれの標的部位について、ｓｇＲＮＡは、マッチ非グアニン５’−塩基または意図的にミスマッチさせた５’−グアニンのいずれかを含有する。 野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１発現プラスミドの量のタイトレーションである。変動量の野生型およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１発現プラスミドによる形質移入からのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。全ての形質移入について、ｓｇＲＮＡ含有プラスミドの量を２５０ｎｇに固定した。別個の部位を標的化する２つのｓｇＲＮＡを使用し；エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；陰性対照におけるバックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色点線により表す。 図１２Ａ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＰＡＭ認識特異性の変更である。Ｔ７Ｅ１アッセイにより定量された、８つのｓｇＲＮＡを使用したＳｐＣａｓ９−ＶＱＲ（参照文献１５）および改善されたＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲによるオンターゲット内在性ヒト部位の平均改変パーセントの比較である。両方のバリアントは、ＮＧＡＮ ＰＡＭを認識するように遺伝子操作されている。エラーバーは、ｎ＝２または３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表す。 図１２Ｂ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＰＡＭ認識特異性の変更である。８つのｓｇＲＮＡを使用したＳｐＣａｓ９−ＶＱＲおよびＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲの、それらの−ＨＦ１相当物と比較したオンターゲットＥＧＦＰ崩壊活性である。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；陰性対照におけるバックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色点線により表す。 図１２Ｃ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＰＡＭ認識特異性の変更である。Ｔ７Ｅ１アッセイにより定量された８つの内在性ヒト遺伝子部位におけるＳｐＣａｓ９−ＶＱＲおよびＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲによる、それらの−ＨＦ１バリアントと比較した平均オンターゲット改変パーセントの比較である。エラーバーは、ｎ＝３についてのｓ．ｅ．ｍ．を表し；ＮＤは、不検出である。 図１２Ｄ：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のＰＡＭ認識特異性の変更である。ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲまたはＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲを使用し、それらの対応する−ＨＦ１バリアント（パネルＢおよびＣからのもの）と比較した場合のオンターゲット活性の変化倍率のまとめである。中央値および四分位範囲を示し；野生型活性の＞７０％を示す間隔を緑色で強調する。 図１３Ａ：野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１つ以上のアラニン置換を担持する野生型ＳｐＣａｓ９誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに１１および１２位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表し；ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９である。 図１３Ｂ：野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１つ以上のアラニン置換を担持する野生型ＳｐＣａｓ９誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに９および１０位（パネルＢ）において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表し；ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９である。 図１４Ａ：野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１つ以上のアラニン置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに１１および１２位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表し；ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９である。 図１４Ｂ：野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１つ以上のアラニン置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに９および１０位（パネルＢ）において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表し；ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９である。 野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、および非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１つ以上のアラニン置換を担持するＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに１１および１２位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表し；ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９であり；Ｄｂｌ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ置換を有するＳｐＣａｓ９である。 マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中のそれぞれ位置における単一ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、およびｅＳｐＣａｓ９−１．１の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡ（「マッチ」）ならびに示される位置において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置である。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ｅＳＰ１．１＝Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。 図１７Ａ：マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中の種々の位置における単一ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントの活性である。アラニン置換（標的または非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置に指向される）の組合せを含有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの活性を、ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡ（「マッチ」）ならびに示されるスペーサー位置において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；ｍｍ＝ミスマッチである。ＷＴ＝野生型であり、Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、１．０＝Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａであり、１．１＝Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。 図１７Ｂ：マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中の種々の位置における単一ミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントの活性である。マッチオンターゲット部位について残りの全ての考えられる単一ミスマッチのｓｇＲＮＡを使用して、（ａ）からのこれらのヌクレアーゼのサブセットを試験した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；ｍｍ＝ミスマッチである。ＷＴ＝野生型であり、Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、１．０＝Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａであり、１．１＝Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。 マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中の種々の個々の位置におけるミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントの活性である。アラニン置換（標的または非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置に指向される）の組合せを含有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの活性を、ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡ（「マッチ」）ならびに示される位置において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して評価した。Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａである。 図１９Ａ：マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中の種々の個々の位置におけるミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントの活性である。アラニン置換（標的または非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置を対象とする）の組合せを含有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのオンターゲット活性を、ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチする２つのｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して評価した。Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａである。 図１９Ｂ：マッチｓｇＲＮＡおよびスペーサー中の種々の個々の位置におけるミスマッチを有するｓｇＲＮＡを使用した野生型ＳｐＣａｓ９およびバリアントの活性である。スペーサー配列中の（ｓｇＲＮＡ「部位１」の）１２、１４、１６、または１８位におけるミスマッチを含有するｓｇＲＮＡを用いて（ａ）からのこれらのヌクレアーゼのサブセットを試験して、それらの置換によりミスマッチの不寛容性が付与されたか否かを決定した。Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａであり、ＨＦ１＝Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａである。 四重突然変異体構築物中の突然変異の位置間の類似性を説明するＳｐＣａｓ９（上段）およびＳａＣａｓ９（下段）の構造比較（黄色球状表示で示される）である。ＤＮＡ骨格に接触する他の残基も桃色球状表示で示す。 図２１Ａ：野生型ＳａＣａｓ９および１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。ＳａＣａｓ９置換は、標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置を対象とした。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに１１および１２位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表す。 図２１Ｂ：野生型ＳａＣａｓ９および１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。ＳａＣａｓ９置換は、ＰＡＭ特異性に既に影響することが示されている位置を対象とした。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡならびに１１および１２位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；赤色点線は、ＥＧＦＰ崩壊のバックグラウンドレベルを表す。 図２２Ａ：野生型（ＷＴ）ＳａＣａｓ９および標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る残基における１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡ（「マッチ」）ならびに１９および２０位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置である。 図２２Ｂ：野生型（ＷＴ）ＳａＣａｓ９および標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る残基における１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に完全にマッチするｓｇＲＮＡ（「マッチ」）ならびに１９および２０位において意図的にミスマッチさせたｓｇＲＮＡを用いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。ミスマッチ位置に番号付与し、２０位は最もＰＡＭから遠位の位置である。 野生型（ＷＴ）ＳａＣａｓ９および標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る残基におけるアラニン置換の三重組合せを担持するＳａＣａｓ９バリアントの活性である。ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してヌクレアーゼを評価した。４つの異なるｓｇＲＮＡを使用し（マッチ＃１〜４）、さらに野生型ＳａＣａｓ９により効率的に使用されることが公知のミスマッチｓｇＲＮＡを用いて４つの標的部位のそれぞれを試験した。それぞれの部位についてのミスマッチｓｇＲＮＡを、それぞれのマッチｓｇＲＮＡの右側に示す（例えば、マッチ部位３についての唯一のミスマッチｓｇＲＮＡは、ｍｍ１１および１２である）。ミスマッチ位置に番号付与し、２１位は最もＰＡＭから遠位の位置であり；ｍｍは、ミスマッチである。 図２４Ａ：野生型（ＷＴ）ＳａＣａｓ９および標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る残基における１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。二重組合せ置換を担持するＳａＣａｓ９バリアントを、マッチおよび単一ミスマッチ内在性ヒト遺伝子標的部位に対してＴ７Ｅ１アッセイを使用して評価した。マッチ「オンターゲット」部位を、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５からのそれらの遺伝子標的部位のｓｇＲＮＡ番号に従って命名する。ミスマッチｓｇＲＮＡに番号付与し、ミスマッチは最もＰＡＭから遠位の位置の２１位において生じ；ミスマッチｓｇＲＮＡは、ミスマッチｓｇＲＮＡの左側に列記されるマッチオンターゲット部位に由来する。 図２４Ｂ：野生型（ＷＴ）ＳａＣａｓ９および標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る残基における１つ以上のアラニン置換を担持するＳａＣａｓ９誘導体の活性である。三重組合せ置換を担持するＳａＣａｓ９バリアントを、マッチおよび単一ミスマッチ内在性ヒト遺伝子標的部位に対してＴ７Ｅ１アッセイを使用して評価した。マッチ「オンターゲット」部位を、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５からのそれらの遺伝子標的部位のｓｇＲＮＡ番号に従って命名する。ミスマッチｓｇＲＮＡに番号付与し、ミスマッチは最もＰＡＭから遠位の位置の２１位において生じ；ミスマッチｓｇＲＮＡは、ミスマッチｓｇＲＮＡの左側に列記されるマッチオンターゲット部位に由来する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼの制限は、不完全にマッチする標的部位における
不所望な「オフターゲット」突然変異を誘導するそれらの潜在性であり（例えば、Ｔｓａ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５参照）、ある場合には頻度
が目的オンターゲット部位において観察されるものと同等である（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用
いる従来の研究は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と標的部位のスペーサー領域との間の配列
特異的相互作用の数を低減させることにより、ヒト細胞中の開裂のオフターゲット部位に
おける突然変異効果を低減させ得ることを示唆している（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４）。
これは、ｇＲＮＡをその５’末端において２または３ｎｔだけトランケートすることに
より早期に達成され、この増加した特異性の機序は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の相互作
用エネルギーの減少であり、その結果、それはオンターゲット部位を開裂するためにちょ
うど十分なエネルギーとバランスを取り、それにより標的ＤＮＡ部位中のミスマッチに起
因するエネルギーペナルティーが存在すると想定されるオフターゲット部位を開裂するた
めに十分なエネルギーを有する可能性が低くなることが仮定された（国際公開第２０１５
／０９９８５０号パンフレット）。
ＳｐＣａｓ９のオフターゲット効果（ガイドＲＮＡのための目的標的部位を有する不完
全マッチまたはミスマッチのＤＮＡ部位におけるもの）は、その標的ＤＮＡ部位との非特
異的相互作用を減少させることにより最小化し得ることが仮定された。ＳｐＣａｓ９−ｓ
ｇＲＮＡ複合体は、ＮＧＧ ＰＡＭ配列（ＳｐＣａｓ９により認識される）（Ｄｅｌｔｃ
ｈｅｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２−６０７（２０１１）；Ｊｉ
ｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｊｉ
ａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（
２０１３）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６
２−６７（２０１４））および隣接２０ｂｐプロトスペーサー配列（ｓｇＲＮＡの５’末
端に相補的である）（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−
８２１（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４７１（２
０１３）；Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２
０１３）；Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３（２
０１３））から構成される標的部位を開裂する。ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、そ
の目的標的ＤＮＡ部位の認識に必要とされるよりも大きいエネルギーを有し得、それによ
り、ミスマッチオフターゲット部位の開裂が可能となることが既に理論付けられた（Ｆｕ
，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１
４））。この特性は、適応細菌免疫におけるＣａｓ９の目的の役割に有利であり得ること
が想定することができ、突然変異し得る外来配列を開裂する能力をそれに付与する。この
過剰なエネルギーモデルは、ＳｐＣａｓ９濃度を減少させることにより（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ
．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）；Ｐ
ａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３９−
８４３（２０１３））、またはｓｇＲＮＡの相補性長さを低減させることにより（Ｆｕ，
Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４
）、オフターゲット効果を低減させることができる（しかし、排除することはできない）
ことを実証する従来の研究によっても支持されているが、この効果についての他の解釈も
提案されている（Ｊｏｓｅｐｈｓ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ４３，８９２４−８９４１（２０１５）；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２７，１１０−１１３（２０１５）；Ｋｉａｎｉ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，１０５１−１０５４（２０１５）））。構造デー
タは、ＳｐＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を、４つのＳｐＣａｓ９残基（Ｎ４
９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６）により作製される、標的ＤＮＡ鎖のリン酸骨格へ
の直接的な水素結合を含むいくつかのＳｐＣａｓ９媒介ＤＮＡ接触により安定化し得るこ
とを示唆する（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４
９（２０１４）；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５
７３（２０１４））（図１ａならびに図６ａおよび６ｂ）。本発明者らは、これらの接触
の１つ以上の崩壊が、ロバストなオンターゲット活性を保持するためにちょうど十分であ
るが、ミスマッチオフターゲット部位を開裂する能力が縮小するレベルにおいてＳｐＣａ
ｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体のエネルギー的なバランスを取り得ることを想定した。
本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９タンパク質は、理論的には、ＤＮＡについてのＣａ
ｓ９の結合親和性を低減させることにより、増加した特異性を示すように遺伝子操作する
ことができる。広く使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のいくつかのバリアントは、構造情報、細菌選択ベ
ース指向進化、およびコンビナトリアル設計を使用してＤＮＡ骨格上のリン酸と相互作用
することが予測することができるＳｐＣａｓ９中の種々の残基中に個々のアラニン置換を
導入することにより遺伝子操作された。ロバストな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベーススクリ
ーニングアッセイを使用してバリアントを細胞活性についてさらに試験してそれらのバリ
アントの細胞活性を評価し；この細菌系において、細胞生存率は、毒性ギラーゼ毒素ｃｃ
ｄＢについての遺伝子ならびにｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９により標的化される２３塩基
対配列を含有する選択プラスミドの開裂および後続の崩壊に依存し、活性の保持または損
失と関連する残基の同定をもたらした。さらに、ヒト細胞中で改善された標的特異性を示
す別のＳｐＣａｓ９バリアントを同定および特徴付けした。
さらに、細菌細胞ベース系において評価されたＳｐＣａｓ９の単一アラニン置換突然変
異体の活性は、５０〜１００％の生存割合が通常ロバストな開裂を示す一方、０％の生存
率は、酵素が機能的に減衰したことを示すことを示した。次いで、Ｒ６３Ａ、Ｒ６６Ａ、
Ｒ６９Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ７１Ａ、Ｙ７２Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｒ７５Ａ、Ｋ７６Ａ、Ｎ７７Ａ、
Ｒ７８Ａ、Ｒ１１５Ａ、Ｈ１６０Ａ、Ｋ１６３Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｌ１６９Ａ、Ｒ４０３Ａ
，Ｔ４０４Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｎ４０７Ａ、Ｒ４４７Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｉ４４８Ａ、Ｙ４５
０Ａ、Ｓ４６０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｋ５１０Ａ、Ｙ５１５Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ
６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｙ１０１３Ａ、Ｖ１０１５Ａ、Ｒ１１２２Ａ、Ｋ１１２３Ａ、Ｋ
１１２４Ａ、Ｋ１１５８Ａ、Ｋ１１８５Ａ、Ｋ１２００Ａ、Ｓ１２１６Ａ、Ｑ１２２１Ａ
、Ｋ１２８９Ａ、Ｒ１２９８Ａ、Ｋ１３００Ａ、Ｋ１３２５Ａ、Ｒ１３３３Ａ、Ｋ１３３
４Ａ、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ａを含むＳｐＣａｓ９の追加の突然変異を細菌中
でアッセイした。細菌中で＜５％の生存率を有する２つの突然変異体（Ｒ６９ＡおよびＦ
４０５Ａ）を除き、それらの追加の単一突然変異の全てがＳｐＣａｓ９のオンターゲット
活性に対する効果をほとんど有さないと考えられた（細菌スクリーンにおいて＞７０％の
生存率）。
細菌スクリーンにおいて同定されたＣａｓ９のバリアントがヒト細胞中で効率的に機能
したか否かをさらに決定するため、ヒトＵ２ＯＳ細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用
して種々のアラニン置換Ｃａｓ９突然変異体を試験した。このアッセイにおいて、単一の
インテグレートされた構成的に発現されるＥＧＦＰ遺伝子のコード配列中の標的部位の良
好な開裂は、フローサイトメトリーにより定量的に評価されたインデル突然変異の誘導お
よびＥＧＦＰ活性の崩壊をもたらした（例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５参照）。
これらの実験は、細菌細胞ベースアッセイにおいて得られた結果が、ヒト細胞中でヌク
レアーゼ活性と十分に相関することを示し、それらの遺伝子操作方針を他の種および異な
る細胞からのＣａｓ９に拡張し得ることを示唆する。したがって、これらの知見は、本明
細書において「バリアント」または「そのバリアント」と集合的に称されるＳｐＣａｓ９
およびＳａＣａｓ９バリアントについての支持を提供する。
本明細書に記載のバリアントの全ては、例えば、単純な部位特異的突然変異誘発により
既存の広く使用されるベクター中に急速に取り込むことができ、それらは少数の突然変異
を要求するにすぎないため、バリアントは、ＳｐＣａｓ９プラットフォームの既に記載さ
れた他の改善（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））、ニッカーゼ突然変異（
Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３−８３８（２０
１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，１３８０−１３８９（２０１３））
、ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９融合（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ ３２，５７７−５８２（２０１４）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５６９−５７６（２０１４）；国際公開第２０１４１４４２
８８号パンフレット）；および変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａ
ｓ９ヌクレアーゼ（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５
Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１−５）とともに機能するはずである。
したがって、本明細書において、Ｃａｓ９バリアント、例として、ＳｐＣａｓ９バリア
ントが提供される。ＳｐＣａｓ９野生型配列は、以下のとおりである。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６
９５、Ｑ９２６（またはそれらと類似する位置）の１つ以上における突然変異（すなわち
、天然アミノ酸の、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリンとの置
き換え）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｓｐ
Ｃａｓ９は、本明細書に記載の突然変位に加えて、配列番号１のアミノ酸配列と少なくと
も８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であり、例えば、保存
的突然変異により置き換えられている、例えば、配列番号１の残基の最大５％、１０％、
１５％、または２０％における差異を有する。好ましい実施形態において、バリアントは
、親の所望の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親がニッカーゼまたはデッドＣａｓ９で
ある場合を除外する）、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ）と相互作用す
る能力を保持する。
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適な比較目的のために配列をア
ラインする（例えば、最適なアラインメントのため、ギャップを第１および第２のアミノ
酸または核酸配列の一方または両方の中に導入することができ、比較目的のために、非相
同配列を無視することができる）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、
参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％
または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置における
ヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同
一のヌクレオチドにより占有される場合、その分子はその位置において同一である（本明
細書において使用される核酸「同一性」は、核酸「相同性」に相当する）。２つの配列間
の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一位置の数の関数であり、それ
ら２つの配列の最適なアラインメントのために導入が必要とされるギャップの数、および
それぞれのギャップの長さを考慮する。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パ
ーセントは、当技術分野の技能の範囲内の種々の手段で、例えば、公的に入手可能なコン
ピュータソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（
Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれ
た“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、Ｓｃｈ
ｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ，ｐｐ ３
５３−３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．
（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡ
ＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬ
ＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア
を使用して決定する。さらに、当業者は、アラインメントを計測するための適切なパラメ
ータ、例として、比較される配列の長さにわたり最大アラインメントを達成するために必
要される任意のアルゴリズムを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸に
ついて、比較の長さは、全長以下の任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％
、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり
得る。本組成物および方法の目的のため、配列の全長の少なくとも８０％がアラインされ
る。
本発明の目的のため、２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、Ｂ
ｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列をギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルテ
ィ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で使用して達成することができる。
保存的置換としては、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイ
シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、
トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げら
れる。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異のセット：Ｎ４
９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５／Ｑ９２６Ａ（四重アラニン突然変異体）；Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ（二重アラニン突然変異体）；Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６ＡおよびＮ
４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ（三重アラニン突然変異体）の１つを含む。一部の実
施形態において、Ｌ１６９および／またはＹ４５０における追加の置換突然変異をそれら
の二重、三重、および四重突然変異体に追加することができ、またはＱ６９５もしくはＱ
９２６における置換を担持する単一突然変異体に追加することができる。一部の実施形態
において、突然変異体は、野生型アミノ酸に代えてアラニンを有する。一部の実施形態に
おいて、突然変異体は、アルギニンまたはリジン（または天然アミノ酸）以外の任意のア
ミノ酸を有する。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、タンパク質のヌクレアーゼ部分
を触媒的に不活性にするため、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させ、または破壊する
以下の突然変異：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４
０またはＮ８６３の１つ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／
Ｈ８４０Ｙも含み；それらの位置における置換は、アラニン（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ａｌ
．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４９（２０１４）におけるとおり）、または他の残基
、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、またはアスパラギン酸、例え
ば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３Ｓ、また
はＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット参照）。一
部の実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ（一本鎖ニッカーゼを
作出する）における突然変異、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ（ヌクレアーゼ活性を解
消する；この突然変異体は、デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）におけ
る突然変異を含む。
ＳｐＣａｓ９Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｒ９２６Ａ突然変異は、黄色ブド
ウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）中の
類似残基を有し；例えば、図２０を参照されたい。ＤＮＡまたはＲＮＡ骨格に接触する残
基の突然変異は、ＳｐＣａｓ９について観察されたとおり、ＳａＣａｓ９の特異性を増加
させると予測される。したがって、本明細書においてＳａＣａｓ９バリアントも提供され
る。
ＳａＣａｓ９野生型配列は、以下のとおりである。
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｙ２１１、Ｗ２２９、Ｒ２
４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、および／またはＲ６５４の１、２、３、４、５、または６つ
全てにおける突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列を含み、例えば、以下の位置：
Ｙ２１１、Ｗ２２９、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、および／またはＲ６５４の１、２
、３、４、５または６つにおける突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列と少なくと
も８０％同一である配列を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｙ
２１１Ａ；Ｗ２２９Ａ；Ｙ２３０Ａ；Ｒ２４５Ａ；Ｔ３９２Ａ；Ｎ４１９Ａ；Ｌ４４６Ａ
；Ｙ６５１Ａ；Ｒ６５４Ａ；Ｄ７８６Ａ；Ｔ７８７Ａ；Ｙ７８９Ａ；Ｔ８８２Ａ；Ｋ８８
６Ａ；Ｎ８８８Ａ；Ａ８８９Ａ；Ｌ９０９Ａ；Ｎ９８５Ａ；Ｎ９８６Ａ；Ｒ９９１Ａ；Ｒ
１０１５Ａ；Ｎ４４Ａ；Ｒ４５Ａ；Ｒ５１Ａ；Ｒ５５Ａ；Ｒ５９Ａ；Ｒ６０Ａ；Ｒ１１６
Ａ；Ｒ１６５Ａ；Ｎ１６９Ａ；Ｒ２０８Ａ；Ｒ２０９Ａ；Ｙ２１１Ａ；Ｔ２３８Ａ；Ｙ２
３９Ａ；Ｋ２４８Ａ；Ｙ２５６Ａ；Ｒ３１４Ａ；Ｎ３９４Ａ；Ｑ４１４Ａ；Ｋ５７Ａ；Ｒ
６１Ａ；Ｈ１１１Ａ；Ｋ１１４Ａ；Ｖ１６４Ａ；Ｒ１６５Ａ；Ｌ７８８Ａ；Ｓ７９０Ａ；
Ｒ７９２Ａ；Ｎ８０４Ａ；Ｙ８６８Ａ；Ｋ８７０Ａ；Ｋ８７８Ａ；Ｋ８７９Ａ；Ｋ８８１
Ａ；Ｙ８９７Ａ；Ｒ９０１Ａ；Ｋ９０６Ａの１つ以上も含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の追加の突然変
異：Ｙ２１１Ａ、Ｗ２２９Ａ、Ｙ２３０Ａ、Ｒ２４５Ａ、Ｔ３９２Ａ、Ｎ４１９Ａ、Ｌ４
４６Ａ、Ｙ６５１Ａ、Ｒ６５４Ａ、Ｄ７８６Ａ、Ｔ７８７Ａ、Ｙ７８９Ａ、Ｔ８８２Ａ、
Ｋ８８６Ａ、Ｎ８８８Ａ、Ａ８８９Ａ、Ｌ９０９Ａ、Ｎ９８５Ａ、Ｎ９８６Ａ、Ｒ９９１
Ａ、Ｒ１０１５Ａ、Ｎ４４Ａ、Ｒ４５Ａ、Ｒ５１Ａ、Ｒ５５Ａ、Ｒ５９Ａ、Ｒ６０Ａ、Ｒ
１１６Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｎ１６９Ａ、Ｒ２０８Ａ、Ｒ２０９Ａ、Ｙ２１１Ａ、Ｔ２３８Ａ
、Ｙ２３９Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｙ２５６Ａ、Ｒ３１４Ａ、Ｎ３９４Ａ、Ｑ４１４Ａ、Ｋ５７
Ａ、Ｒ６１Ａ、Ｈ１１１Ａ、Ｋ１１４Ａ、Ｖ１６４Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｌ７８８Ａ、Ｓ７９
０Ａ、Ｒ７９２Ａ、Ｎ８０４Ａ、Ｙ８６８Ａ、Ｋ８７０Ａ、Ｋ８７８Ａ、Ｋ８７９Ａ、Ｋ
８８１Ａ、Ｙ８９７Ａ、Ｒ９０１Ａ、Ｋ９０６Ａの１つ以上を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、複数の置換突然変異
：Ｒ２４５／Ｔ３９２／Ｎ４１９／Ｒ６５４およびＹ２２１／Ｒ２４５／Ｎ４１９／Ｒ６
５４（四重バリアント突然変異体）；Ｎ４１９／Ｒ６５４、Ｒ２４５／Ｒ６５４、Ｙ２２
１／Ｒ６５４、およびＹ２２１／Ｎ４１９（二重突然変異体）；Ｒ２４５／Ｎ４１９／Ｒ
６５４、Ｙ２１１／Ｎ４１９／Ｒ６５４、およびＴ３９２／Ｎ４１９／Ｒ６５４（三重突
然変異体）を含む。一部の実施形態において、突然変異体は、野生型アミノ酸に代えてア
ラニンを含有する。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｅ７８２Ｋ、Ｋ９２
９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、および／またはＲ１０１５Ｈにおける突然変異も含む。例えば、ＫＫ
Ｈバリアント（Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ）、ＫＲＨバリアント（Ｅ７８２
Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ）、またはＫＲＫＨバリアント（Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ
／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ）］である。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ４７７、
Ｄ５５６、Ｈ７０１、またはＤ７０４；およびＨ５５７またはＮ５８０における突然変異
からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異も含む。
一部の実施形態において、突然変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、（ｉｉ）Ｈ
５５７Ａ、Ｈ５５７Ｎ、またはＨ５５７Ｙ、（ｉｉｉ）Ｎ５８０Ａ、および／または（ｉ
ｖ）Ｄ５５６Ａである。
本明細書において、任意選択的に、バリアントタンパク質の発現のための１つ以上の調
節ドメインに作動可能に結合されているＣａｓ９バリアントをコードする単離核酸、単離
核酸を含むベクター、ならびにその核酸を含み、および任意選択的にバリアントタンパク
質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供される。
本明細書に記載のバリアントは、細胞のゲノムを変更するために使用することができ；
本方法は、一般に、細胞中でバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択部分に相補的
な領域を有するガイドＲＮＡとともに発現させることを含む。細胞のゲノムを選択的に変
更する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，２３３
号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３
，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０
１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット
；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフ
レット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９
９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第
２０１６００２４５２９号明細書；米国特許出願公開第２０１６００２４５２４号明細書
；米国特許出願公開第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許出願公開第２０１６０
０２４５１０号明細書；米国特許出願公開第２０１６００１７３６６号明細書；米国特許
出願公開第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３７６６５
２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許出願公開第
２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２９１９６５号明細書
；米国特許出願公開第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許出願公開第２０１５０
２４７１５０号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２３２８８３号明細書；米国特許
出願公開第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０２０３８７
２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許出願公開第
２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１７６０６４号明細書
；米国特許出願公開第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許出願公開第２０１５０
１６６９６９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０１５９１７５号明細書；米国特許
出願公開第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５００９３４７
３号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許出願公開第
２０１５００６７９２２号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５６６２９号明細書
；米国特許出願公開第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許出願公開第２０１５０
０２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１５００２４４９９号明細書；米国特許
出願公開第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３５６８６
７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号明細書
；米国特許出願公開第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０
１８９８９６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１１３３７６号明細書；米国特許
出願公開第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許出願公開第２０１３０３３０７７
８号明細書；米国特許出願公開第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許出願公開第
２０１２００８８６７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０３００５３８号明細書
；米国特許出願公開第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許出願公開第２０１１０
２１７７３９号明細書；米国特許出願公開第２０１１０００２８８９号明細書；米国特許
出願公開第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０１８９７７
６号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第
２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書
；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５０
０５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００４５５４６号明細書；米国特許
出願公開第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許出願公開第２０１５００２４５０
０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０３５７５３０号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；
国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５
号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１
３／１７６７７２号パンフレット；国際公開第２０１５００７１８９９号パンフレット；
米国特許出願公開第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３
３５６２０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許出
願公開第２０１４０３１５９８５号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０
号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許出願公開第２
０１４０３０９４８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０４８５３号明細書；
米国特許出願公開第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２
９５５５６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許出
願公開第２０１４０２８７９３８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４
号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許出願公開第２
０１４０２７３２３１号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３０号明細書；
米国特許出願公開第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２
５６０４６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許出
願公開第２０１４０２４２７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７００
号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許出願公開第２
０１４０２４２６６４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２３４９７２号明細書；
米国特許出願公開第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２
１２８６９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許出
願公開第２０１４０１９９７６７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６
号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許出願公開第２
０１４０１８６９１９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号明細書；
米国特許出願公開第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１
７９００６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号明細書；Ｍａｋａｒ
ｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ”９（６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４６７−４７７（１−２３）（Ｊｕｎ．２０１
１）；Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａ
ｅａ”４８２ Ｎａｔｕｒｅ ３３１−３３８（Ｆｅｂ．１６，２０１２）；Ｇａｓｉｕ
ｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ
ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”１０９（３９
）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ Ｅ２５７９−Ｅ２５８６（Ｓｅｐ．４，２０１２）；Ｊｉｎ
ｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅ
ｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”３３７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８１６−８２１（Ａｕｇ．１７，２０１
２）；Ｃａｒｒｏｌｌ，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ”２０（９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６５８−１６６０
（Ｓｅｐ．２０１２）；２０１２年５月２５日に出願された米国特許出願第６１／６５２
，０８６号明細書；Ａｌ−Ａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌ
ａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａ
ｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）：Ｔｈｅ Ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ａｎ Ｉｎｇｅｎｉｏｕｓ
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｋａｒｙｏ
ｔｅｓ，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１１）ｖｏｌ．３９２，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐｐ．２
７７−２８９；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎ
ｄ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ Ｔｈａｔ Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ ＲＡＭＰ Ｍｏｄｕｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ
ｔｏ Ｃｌｅａｖｅ ＲＮＡｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，（２０１２）ｖｏｌ．
４５，Ｉｓｓｕｅ ３，２９２−３０２を参照されたい。
本明細書に記載のバリアントタンパク質は、上記参照文献に記載のＣａｓ９タンパク質
のいずれかに代えてもしくはそれらに加えて、またはそれらに記載の突然変異との組合せ
で使用することができる。さらに、本明細書に記載のバリアントは、当技術分野において
公知の野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９突然変異（例えば、上記のｄＣａｓ９またはＣ
ａｓ９ニッカーゼ）に代えて融合タンパク質、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号
明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，
６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１
４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；
国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレ
ット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９
８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２
０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号明細
書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；米国特許出願公開第２０１
３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際
公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パ
ンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／
１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５００５０６９９号明細書；米
国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書、および国際公開第２０１４／１２４
２８４号パンフレットに記載の異種機能ドメインを有する融合タンパク質中で使用するこ
とができる。例えば、バリアント、好ましくは、１つ以上のヌクレアーゼ低減、変更また
は殺傷突然変異を含むバリアントをＣａｓ９のＮまたはＣ末端上で、転写活性化ドメイン
または他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、
ＳＩＤなど、例えば、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲ
Ｄ）のアミノ酸４７３〜５３０、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１〜９７、また
はＭａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６；Ｂｅｅｒｌｉ
ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：１４６２８−１４６３３（１９９８）参照）ま
たはサイレンサー、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても
公知）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１β；固定ＲＮＡ結合配列に融合している長鎖非コ
ードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートし得るタンパク質またはペプチド、例えば、Ｍ
Ｓ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質に
より結合されるものに融合させることができ；当技術分野において公知のＤＮＡのメチル
化状態を改変する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴ
ＥＴタンパク質）；またはヒストンサブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメ
チルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）また
はヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため））
を使用することもできる。多数のこのようなドメインの配列、例えば、ＤＮＡ中のメチル
化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインが当技術分野において公知である。例示
的なタンパク質としては、テンイレブントランスロケーション（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ−
Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＥＴ）１〜３ファミリー、ＤＮＡ中の５−メチルシト
シン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）に変換する酵素が挙げ
られる。
ヒトＴＥＴ１〜３配列は当技術分野において公知であり、それを以下の表に示す。
一部の実施形態において、触媒ドメインの全長配列の全部または一部、例えば、システ
インリッチ伸長部および７つの高度に保存されるエキソンによりコードされる２ＯＧＦｅ
ＤＯドメイン、例えば、アミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミ
ノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２、およびアミノ酸９６６〜１６７８を含むＴｅｔ
３を含む触媒モジュールを含めることができる。３つ全てのＴｅｔタンパク質中のキー触
媒残基を説明するアラインメント、および全長配列についてのその補助材料について（ｆ
ｔｐサイトｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ａｒａｖｉｎｄ／ＤＯＮＳ／ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ＿ｍａｔｅｒｉａｌ＿ＤＯＮＳ．ｈｔｍｌで入手可能）は、例
えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．２００９ Ｊｕｎ １；８（１
１）：１６９８−７１０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２７の図１を参照されたい（例
えば、ｓｅｑ ２ｃ参照）；一部の実施形態において、配列は、Ｔｅｔ１のアミノ酸１４
１８〜２１３６またはＴｅｔ２／３中の対応領域を含む。
他の触媒モジュールは、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９において同定されたタンパ
ク質からのものであり得る。
一部の実施形態において、異種機能ドメインは、生物学的係留物であり、ＭＳ２コート
タンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質の全部または
一部（例えば、それからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は、特異的
ステム−ループ構造を含有するＲＮＡ分子をｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列により規定
される場所にリクルートするための使用することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパ
ク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮに融合しているｄＣａｓ９バリ
アントは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮ結合配列に結合している長鎖非コードＲＮＡ
（ｌｎｃＲＮＡ）、例えば、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲをリクルートするために使用す
ることができる；例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ １００：１２５−１３８（２００８）を参照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ
２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ
ａｌ．，前掲に記載のとおり、別のタンパク質に結合させることができ、本明細書に記載
の方法および組成物を使用してタンパク質をｄＣａｓ９バリアント結合部位に標的化させ
ることができる。一部の実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性である。一部の
実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリアントは、米国特
許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９５８号明細書
；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフ
レット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４
４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４
／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国
際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細
書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第２０１
１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明細書；
米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１０８９
８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２
０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレッ
ト；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５０
０５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００７１８９９号明細書、および国
際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のとおり、ＦｏｋＩに融合してい
る。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９バリアントおよび異種機能ド
メイン間のリンカーを含む。これらの融合タンパク質中（または連結構造の融合タンパク
質間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配
列を含み得る。好ましい実施形態において、リンカーは、短鎖であり、例えば、２〜２０
アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、高い自由度を有するアミ
ノ酸、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンを含む）。一部の実施形態において、
リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４）からなる１つ以上
の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６）単位の２、３
、４つ、またはそれより多いリピートを含む。他のリンカー配列を使用することもできる
。
一部の実施形態において、バリアントタンパク質は、細胞内空間への送達を容易にする
細胞浸透ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポ
ータン、またはｈＣＴ由来細胞浸透ペプチドを含み、例えば、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．
，（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐ
ｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ ２００２）；Ｅｌ−
Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．１
１（２８）：３５９７−６１１；およびＤｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）
Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９を参照されたい。
細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過する細胞質または他の細胞小器官、例え
ば、ミトコンドリアおよび核中への広範な生体分子の移動を容易にする短鎖ペプチドであ
る。ＣＰＰにより送達することができる分子の例としては、治療薬、プラスミドＤＮＡ、
オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナ
ノ粒子、およびリポソームが挙げられる。ＣＰＰは、一般に、３０アミノ酸以下であり、
天然または非天然存在タンパク質またはキメラ配列に由来し、高い相対存在量の正荷電ア
ミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性および非極性ア
ミノ酸を含有する。当技術分野において一般に使用されるＣＰＰとしては、Ｔａｔ（Ｆｒ
ａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ．５５：１１８９−１１９３，Ｖｉｖ
ｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６
０１７）、ペネトラチン（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０）、ポリアルギニンペプチド配列（Ｗｅｎｄ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
７：１３００３−１３００８，Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７６：５８３６−５８４０）、およびトランスポータン（Ｐｏｏｇａ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８５７−８６１）が挙
げられる。
ＣＰＰは、共有または非共有結合方針を介してその積み荷と結合させることができる。
ＣＰＰおよびその積み荷を共有結合させる方法は当技術分野において公知であり、例えば
、化学的架橋（Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．６５：４９００−４９０９，Ｇａｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．
Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．６０：８４４−８５３）または融合タンパク質のクローニング（Ｎａ
ｇａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−１４５３）
である。積み荷と、極性および非極性ドメインを含む短鎖両親媒性ＣＰＰとの間の非共有
カップリングは、静電および疎水性相互作用を介して確立される。
ＣＰＰは、潜在的に治療的な生体分子を細胞中に送達するために当技術分野において利
用されている。例としては、免疫抑制のためのポリアルギニンに結合しているシクロスポ
リン（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
６（１１）：１２５３−１２５７）、腫瘍発生の阻害のためのＭＰＧと呼ばれるＣＰＰ
に結合しているサイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｃｒｏｍｂｅｚ ｅｔ ａｌ．，（
２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：４４−４６）、癌細胞成長を低
減させるためのＣＰＰに結合している腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Ｔａｋｅｎｏｂｕ
ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１（１２）：１０４３−
１０４９，Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２：Ｅ３６
）、および喘息を治療するためのＴａｔに融合しているＲａｓまたはホスホイノシトール
３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のドミナントネガティブ型（Ｍｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，（２００
３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４３９９−４４０５）が挙げられる。
ＣＰＰは、当技術分野において、造影およびバイオセンシング用途のために造影剤を細
胞中に輸送するために利用されている。例えば、Ｔａｔに付着している緑色蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）が、癌細胞を標識するために使用されている（Ｓｈｏｋｏｌｅｎｋｏ ｅｔ
ａｌ．，（２００５）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ４（４）：５１１−５１８）。量子ドッ
トにコンジュゲートしているＴａｔが、ラット脳の可視化のために血液脳関門を良好に通
過させるために使用されている（Ｓａｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｈｅｍ．
Ｃｏｍｍｕｎ．３１４４−３１４６）。ＣＰＰは、細胞画像化のために磁気共鳴画像化技
術と組み合わせることもできる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．
ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３４７（１）：１３３−１４０）。Ｒａｍ
ｓｅｙ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５ Ｊｕｌ ２２
．ｐｉｉ：Ｓ０１６３−７２５８（１５）００１４１−２も参照されたい。
代替的にまたはさらに、バリアントタンパク質は、核局在化配列、例えば、ＳＶ４０ラ
ージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号７））およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（
ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号８））を含み得る。他のＮＬＳは、当技術
分野において公知であり；例えば、Ｃｏｋｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２０
００ Ｎｏｖ １５；１（５）：４１１−４１５；Ｆｒｅｉｔａｓ ａｎｄ Ｃｕｎｈａ
，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９ Ｄｅｃ；１０（８）：５５０−５５７を参照
されたい。
一部の実施形態において、バリアントは、リガンドについての高い親和性を有する部分
、例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。このような親和性タグ
は、組換えバリアントタンパク質の精製を容易にし得る。
バリアントタンパク質を細胞に送達する方法について、当技術分野において公知の任意
の方法を使用して、例えば、バリアントタンパク質コードする核酸からのインビトロ翻訳
、または好適な宿主細胞中の発現により、タンパク質を産生することができ；タンパク質
産生についての当技術分野において多数の方法が公知である。例えば、タンパク質は、酵
母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞系、植物、トランスジェニック動物、または培養
哺乳動物細胞中で産生し、それから精製することができ；例えば、Ｐａｌｏｍａｒｅｓ
ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ．２００４；２６７：１５−５２を参照されたい。さらに、バリアントタンパ
ク質は、任意選択的に、タンパク質が細胞内に存在すると開裂されるリンカーを用いて細
胞中への移動を容易にする部分、例えば、脂質ナノ粒子に結合させることができる。例え
ば、ＬａＦｏｕｎｔａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ａｕ
ｇ １３；４９４（１）：１８０−１９４を参照されたい。
発現系
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するため、それらをコードする核酸からそ
れらを発現させることが望ましいことがある。これは、種々の手段で実施することができ
る。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸を、複製および／または発現のための
原核または真核細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングすることがで
きる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためのＣａｓ９バリア
ントをコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド
、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコード
する核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細
胞、細菌細胞、または原虫細胞への投与のための発現ベクター中にクローニングすること
もできる。
発現を得るため、Ｃａｓ９バリアントをコードする配列は、典型的には、転写を指向す
るためのプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。好適な細菌お
よび真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９
０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。遺
伝子操作タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２２
：２２９−２３５）。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細
胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も、当技術分野において周知であり、
それらも市販されている。
核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例え
ば、強力な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製に使用
される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントを遺伝子調節のためにインビボ投与すべき場合、
Ｃａｓ９バリアントの特定の使用に応じて構成的または誘導性プロモーターのいずれかを
使用することができる。さらに、Ｃａｓ９バリアントの投与に好ましいプロモーターは、
弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を有するプロモーターであり
得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性であるエレメント、例えば、低酸素症応
答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに
小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系も含み得る（例え
ば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：
１１４７−５５；およびＲｅｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１参照）。
プロモーターに加え、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれ
であれ、宿主細胞中の核酸の発現に要求される全ての追加のエレメントを含有する転写単
位または発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａ
ｓ９バリアントをコードする核酸配列に作動可能に結合されているプロモーター、および
例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳
終結に要求される任意のシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントとしては、例
えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げることができ
る。
遺伝子情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、Ｃａｓ９バリ
アントの目的の使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物中などでの発現に関し
て選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、
ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば、Ｇ
ＳＴおよびＬａｃＺが挙げられる。
真核発現ベクターでは、真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクタ
ー、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バ
ーウイルス由来のベクターを使用することが多い。他の例示的な真核生物ベクターとして
は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュ
ロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイ
ルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞中での発現に有効であるこ
とが示されている他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能とする他の任意の
ベクターが挙げられる。
Ｃａｓ９バリアントを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲ
ＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み
得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミド形質移入後に哺乳動物細胞中でのＣａｓ
９バリアントの発現を可能とする。
一部の発現系は、安定的に形質移入された細胞系を選択するためのマーカー、例えばチ
ミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レ
ダクターゼを有する。高収率の発現系、例えば、バキュロウイルスベクターを昆虫細胞中
で、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下
でｇＲＮＡコード配列とともに使用するものも好適である。
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で
機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性
をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領
域中のユニーク制限部位も挙げられる。
標準的な形質移入法を使用して大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母また
は昆虫の細胞系を産生し、次いで標準的な技術を用いてそのタンパク質を精製する（例え
ば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７
６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，
ｅｄ．，１９９０）参照）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実
施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４
９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３
参照）。
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入する公知の手順のいずれかを使用することが
できる。このような方法としては、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラ
スト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロイン
ジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム
型および組込み型の両方）およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が
挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲参照）。唯一必要なことは
、使用される特定の遺伝子操作手順が、Ｃａｓ９バリアントを発現し得る宿主細胞内に少
なくとも１つの遺伝子を良好に導入し得ることである。
本方法は、精製Ｃａｓ９タンパク質をｇＲＮＡと細胞中にリボ核タンパク質（ＲＮＰ）
複合体として導入することにより、およびｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質をコードするｍ
ＲＮＡを導入することによりｇＤＮＡを改変することも含み得る。ｇＲＮＡは、合成ｇＲ
ＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸（例えば、発現ベクター中）であり得る。
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞も含む。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらの実施例は特許請求の範囲に
記載の本発明の範囲を限定するものではない。
方法
ＳｐＣａｓ９バリアントを進化させるための細菌ベース陽性選択アッセイ
陽性選択プラスミド（標的部位が埋め込まれた）を含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡコードプラスミドに
より形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール（非
選択）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース（選択）のいずれかを含有
するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。
ゲノムワイド標的特異性について重要であり得る追加の位置を同定するため、ホーミン
グエンドヌクレアーゼの特性を研究するために既に使用されている細菌選択系（以下、陽
性選択と称される）（Ｃｈｅｎ＆Ｚｈａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３
，ｅ１５４（２００５）；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １
２８，２４７７−２４８４（２００６））を適合させた。
この系の本適合において、誘導性毒性遺伝子をコードする陽性選択プラスミドのＣａｓ
９媒介開裂は、線形化プラスミドの後続の分解および損失に起因する細胞生存を可能とす
る。ＳｐＣａｓ９が陽性選択系中で機能し得ることを確立した後、野生型およびバリアン
トの両方を、公知のヒトゲノムから選択される標的部位を保有する選択プラスミドを開裂
するそれらの能力について試験した。標的部位を含有する陽性選択プラスミドを有する細
菌中にこれらのバリアントを導入し、選択培地上でプレーティングした。陽性選択プラス
ミドの開裂は、生存頻度：選択プレート上のコロニー／非選択プレート上のコロニーを計
算することにより推定した（図１，５〜６参照）。
ヒト細胞培養および形質移入
構成的に発現されるＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子１５の単一インテグレートコ
ピーを保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４
００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補給されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃において５％ＣＯ２を用いて培養した。Ｌｏｎｚ
ａ ４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ−１００プログラムを製造業者のプロトコル
に従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラ
スミド（特に注釈のない限り）により、細胞を同時形質移入した。空のＵ６プロモーター
プラスミドと一緒に形質移入されるＣａｓ９プラスミドを全てのヒト細胞実験についての
陰性対照として使用した（図２、７〜１０参照）。
ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊実験を既に記載のとおり実施した１６。ＥＧＦＰ発現について、形質移入
された細胞を形質移入の約５２時間後にＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。バックグラウンドＥＧＦＰ損失を全ての
実験について約２．５％においてゲーティングした（図２、７参照）。
ヌクレアーゼ誘導突然変異率を定量するためのＴ７Ｅ１アッセイ、標的化ディープシーケ
ンシング、およびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ
Ｔ７Ｅ１アッセイを、ヒト細胞について既に記載のとおり（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，
Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１−４８５（２０１５））実施した
。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰヒト細胞について、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇ
ｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して形質移入の約７２時間後にゲノムＤＮＡを形質移入細胞
から抽出した。約２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性させ、アニーリングし、Ｔ７Ｅ１（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により消化した。ヒト細胞について既に記載
のとおり（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１−４
８５（２０１５）；Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ，．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，
４６０−４６５（２０１２））、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動機器（ＱＩａｇｅ
ｎ）を使用して突然変異誘発頻度を定量した。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））。簡潔に述べると、
リン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を上
記のとおりＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドとともにＣａｓ９ヌクレアーゼとと
もにＵ２ＯＳ細胞中に形質移入した。ｄｓＯＤＮ特異的増幅、ハイスループットシーケン
シング、およびマッピングを実施してＤＳＢ活性を含有するゲノム間隔を同定した。野生
型対二重または四重変異体バリアント実験のため、オフターゲットリードカウントをオン
ターゲットリードカウントに正規化して、試料間のシーケンシング深度の差を補正した。
次いで、野生型およびバリアントＳｐＣａｓ９についての正規化比を比較してオフターゲ
ット部位における活性の変化倍率を計算した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑについての野生型およ
びバリアント試料が、設定標的部位における類似のオリゴタグインテグレーション率を有
するか否かを決定するため、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（上記のとおり単離）からＰｈｕ
ｓｉｏｎ Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘにより設定標的遺伝子座を増幅することにより
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイを実施した。ほぼ１５０ｎｇのＰＣＲ産物を２０Ｕ
のＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により３７℃において３時間消
化してから、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰキットを使用してクリーンアップ
した。Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用してＲＦＬＰ結
果を定量してオリゴタグインテグレーション率を推定した。Ｔ７Ｅ１アッセイを上記のと
おり同様の目的のために実施した。
実施例１
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＲＮＡガイド遺伝子編集の標的化特異性に対処するための１つ
の潜在的な解決法は、新規突然変異を有するＣａｓ９バリアントを遺伝子操作することで
ある。
これらの従来の結果に基づき、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼの特異性は、ＤＮ
Ａ上のリン酸基への結合により媒介されるＤＮＡについてのＣａｓ９の非特異的結合親和
性またはＤＮＡとの疎水性もしくは塩基スタッキング相互作用を低減させることにより有
意に増加させ得ることが仮定された（理論により拘束されるものではない）。このアプロ
ーチは、既に記載されたトランケートｇＲＮＡアプローチのようなｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複
合体により認識される標的部位の長さを減少させないという利点を有する。ＤＮＡについ
てのＣａｓ９の非特異的結合親和性は、標的ＤＮＡ上のリン酸基に接触するアミノ酸残基
を突然変異させることにより低減させ得ることが推定された。
非Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮのバリアントを作出するための類似のア
プローチが使用されている（例えば、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ．１１：４２９（２０１４）参照）。
この仮定の最初の試験において、本発明者らは、ＤＮＡ骨格上のリン酸と相互作用する
ことが予測することができるＳｐＣａｓ９中の種々の残基中に個々のアラニン置換を導入
することにより、広く使用される化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（Ｓ
ｐＣａｓ９）の親和性低減バリアントを遺伝子操作することを試行した。大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ベーススクリーニングアッセイを使用してこれらのバリアントの活性を評価した
（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５
２３（７５６１）：４８１−５）。この細菌系において、細胞生存率は、毒性ギラーゼ毒
素ｃｃｄＢについての遺伝子ならびにｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９により標的化される２
３塩基対配列を含有する選択プラスミドの開裂（および後続の崩壊）に依存した。この実
験の結果は、活性を保持または損失する残基を同定した（表１）。
５０〜１００％の生存割合は通常ロバストな開裂を示す一方、０％の生存率は酵素が機
能的に減衰したことを示した。細菌中でアッセイした（しかし、上記表に示されない）追
加の突然変異としては、Ｒ６９Ａ、Ｒ７１Ａ、Ｙ７２Ａ、Ｒ７５Ａ、Ｋ７６Ａ、Ｎ７７Ａ
、Ｒ１１５Ａ、Ｈ１６０Ａ、Ｋ１６３Ａ、Ｌ１６９Ａ、Ｔ４０４Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｒ４４
７Ａ、Ｉ４４８Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｓ４６０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｙ
１０１３Ａ、Ｖ１０１５Ａ、Ｒ１１２２Ａ、Ｋ１１２３Ａ、およびＫ１１２４Ａが挙げら
れる。Ｒ６９ＡおよびＦ４０５Ａ（細菌中の＜５％の生存率を有した）を除き、それらの
追加の単一突然変異の全ては、ＳｐＣａｓ９のオンターゲット活性に対する効果をほとん
ど有さないと考えられた（細菌スクリーンにおいて＞７０％の生存率）。
Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａ突然変異の全ての考えられる
単一、二重、三重および四重組合せを担持する１５個の異なるＳｐＣａｓ９バリアントを
構築して、それらの残基により作製される接触がオンターゲット活性について欠失可能で
あり得るか否かを試験した（図１ｂ）。これらの実験について、単一インテグレートＥＧ
ＦＰレポーター遺伝子内の開裂および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復による挿入ま
たは欠失突然変異（インデル）の誘導が細胞蛍光の損失をもたらす既に記載されたヒト細
胞ベースアッセイを使用した（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．３０，４６０−４６５，２０１２）。野生型ＳｐＣａｓ９と対合させた場合、ヒ
ト細胞中でＥＧＦＰ発現を効率的に崩壊することが既に示されているＥＧＦＰ標的化ｓｇ
ＲＮＡを使用すると（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，
８２２−８２６（２０１３）、１５個全てのＳｐＣａｓ９バリアントは野生型ＳｐＣａｓ
９のものと同等のＥＧＦＰ崩壊活性を有した（図１ｂ、灰色バー）。したがって、これら
の残基の１つまたは全ての置換は、このＥＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡを用いたＳｐＣａｓ９
のオンターゲット開裂効率を低減させなかった。
次に、ミスマッチ標的部位における１５個全てのＳｐＣａｓ９バリアントの相対活性を
評価するための実験を実施した。これを行うため、１３および１４、１５および１６、１
７および１８、ならびに１８および１９位（最もＰＡＭから近位の塩基について１から出
発し、最もＰＡＭから遠位の塩基について２０で終わる番号付与；図１ｂ）における置換
塩基のペアを含有する先の実験において使用されたＥＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡの誘導体を
用いてＥＧＦＰ崩壊アッセイを繰り返した。この分析により、三重突然変異体の１つ（Ｒ
６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）および四重突然変異体（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）の両方が、ミスマッチｓｇＲＮＡの４つ全てを用いてバックグ
ラウンドのものと同等のＥＧＦＰ崩壊のレベルを示すことが明らかになった（図１ｂ、着
色バー）。特に、１５個のバリアントのうち、ミスマッチｓｇＲＮＡを用いて最低活性を
有するものは、全て、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａ突然変異を保有した。これらの結果お
よび別のＥＧＦＰ標的部位についてのｓｇＲＮＡを使用した実験からの類似データに基づ
き、四重突然変異体（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を追加の分析
のために選択し、それをＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（高フィデリティバリアント＃１について
）と命名した。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性
より多数のオンターゲット部位においていかにロバストにＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が機能
するかを決定するため、追加のｓｇＲＮＡを使用してこのバリアントと野生型ＳｐＣａｓ
９との間の直接比較を実施した。合計で３７個の異なるｓｇＲＮＡを試験した：２４個は
ＥＧＦＰに標的化され（ＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いてアッセイする）１３個は内在性ヒ
ト遺伝子標的に標的化される（Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）ミスマッチアッセ
イを使用してアッセイする）。ＥＧＦＰ崩壊アッセイを用いて試験した２４個のｓｇＲＮ
Ａの２０個（図１ｃ）および内在性ヒト遺伝子部位に対して試験された１３個のｓｇＲＮ
Ａの１２個（図１ｄ）は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて、同一のｓｇＲＮＡを用いて野
生型ＳｐＣａｓ９の活性の少なくとも７０％である活性を示した（図１ｅ）。実際、Ｓｐ
Ｃａｓ９−ＨＦ１は、大部分のｓｇＲＮＡを用いて野生型ＳｐＣａｓ９と高度に同等の活
性（９０〜１４０％）を示した（図１ｅ）。試験した３７個のｓｇＲＮＡの３つは、Ｓｐ
Ｃａｓ９−ＨＦ１を用いて本質的に活性を示さず、それらの標的部位の試験は、高い活性
が見られたものと比較してそれらの配列の特徴のいかなる明らかな差も示唆しなかった（
表３）。概して、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、試験したｓｇＲＮＡの８６％（３２個／３７
個）について同等の活性を有した（野生型ＳｐＣａｓ９活性の７０％超）。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１がヒト細胞中で低減したオフターゲット効果を示したか否かを試
験するため、シーケンシング（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）方法により可能となる二本鎖分解の
ゲノムワイドの偏りのない同定を使用した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑは、隣接ゲノム配列の増
幅およびシーケンシングを可能とするための二本鎖分解への短鎖二本鎖オリゴデオキシヌ
クレオチド（ｄｓＯＤＮ）タグのインテグレーションを使用し、任意の所与の部位におけ
るタグインテグレーションの数は、開裂効率の定量的尺度を提供する（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ
．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５））。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを使用して内在性ヒトＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＲＵＮＸ１、およびＺ
ＳＣＡＮ２遺伝子中の種々の部位に標的化される８つの異なるｓｇＲＮＡを使用して野生
型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１により誘導されるオフターゲット効果の範囲
を比較した。これらのｓｇＲＮＡにより標的化される配列はユニークであり、参照ヒトゲ
ノム中の長さが様々な予測ミスマッチ部位を有する（表２）。８つのｓｇＲＮＡについて
のオンターゲットｄｓＯＤＮタグインテグレーションの評価（制限断片長多型（ＲＦＬＰ
）アッセイによる）およびインデル形成（Ｔ７ＥＩアッセイによる）により、野生型Ｓｐ
Ｃａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いた同等のオンターゲット活性が明らかになっ
た（それぞれ図７ａおよび７ｂ）。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験は、８つのｓｇＲＮＡの７つ
が、野生型ＳｐＣａｓ９を用いて複数のゲノムワイドオフターゲット部位（ｓｇＲＮＡ当
たり２〜２５の範囲）における開裂を誘導する一方、８番目のｓｇＲＮＡ（ＦＡＮＣＦ部
位４について）は、いかなる検出可能なオフターゲット部位も産生しないことを示した（
図２ａおよび２ｂ）。しかしながら、野生型ＳｐＣａｓ９を用いてインデルを誘導した７
つのｓｇＲＮＡの６つは、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ検出可能オ
フターゲットイベントの顕著に完全な不存在を示し（図２ａおよび２ｂ）；残りの７番目
のｓｇＲＮＡ（ＦＡＮＣＦ部位２について）は、プロトスペーサーシード配列内の１つの
ミスマッチを保有する部位における単一の検出可能なゲノムワイドオフターゲット開裂イ
ベントのみを誘導した（図２ａ）。合計で、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を使用した場合に検出
されなかったオフターゲット部位は、プロトスペーサーおよび／またはＰＡＭ配列中の１
〜６つのミスマッチを保有した（図２ｃ）。野生型ＳｐＣａｓ９に関して、８つのｓｇＲ
ＮＡ（ＦＡＮＣＦ部位４について）は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて試験した場合にい
かなる検出可能なオフターゲット開裂イベントも生じさせなかった（図２ａ）。
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの知見を確認するため、標的化アンプリコンシーケンシングを使用
して野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１により誘導されるＮＨＥＪ媒介イン
デル突然変異の頻度をより直接的に計測した。これらの実験のため、ヒト細胞にｓｇＲＮ
Ａ−およびＣａｓ９コードプラスミドのみ（すなわち、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑタグを用いな
い）を形質移入した。次いで、次世代シーケンシングを使用してＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験
において６つのｓｇＲＮＡについて野生型ＳｐＣａｓ９を用いて同定された４０個のオフ
ターゲット部位の３６個を試験した（４０個の部位の４つは、それらをゲノムＤＮＡから
特異的に増幅させることができなかったため、試験することができなかった）。これらの
ディープシーケンシング実験は、（１）野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１
が６つのｓｇＲＮＡオンターゲット部位のそれぞれにおける同等の頻度のインデルを誘導
すること（図３ａおよび３ｂ）；（２）野生型ＳｐＣａｓ９が、予測されるとおり、同一
部位についてのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリードカウントと十分に相関する頻度における３６個
のオフターゲット部位（図３ｂ）の３５個におけるインデル突然変異の統計的に有意な証
拠を示すこと（図３ｃ）；および（３）３６個のオフターゲット部位の３４個におけるＳ
ｐＣａｓ９−ＨＦ１により誘導されるインデルの頻度は、対照形質移入からの試料中で観
察されるインデルのバックグラウンドレベルと区別不能であることを示した（図３ｂ）。
陰性対照に対してＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて統計的に有意な突然変異頻度を有するこ
とが考えられる２つのオフターゲット部位について、インデルの平均頻度は０．０４９％
および０．０３７％であり、そのレベルにおいてそれらがシーケンシング／ＰＣＲエラー
に起因するか、正規のヌクレアーゼ誘導インデルであるかを決定することは困難である。
これらの結果に基づき、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、野生型ＳｐＣａｓ９を用いて異なる頻
度の範囲にわたり生じるオフターゲット突然変異を、検出不能なレベルに完全にまたはほ
ぼ完全に低減させ得ることが結論付けられた。
次に、非典型のホモポリマーまたは反復配列を標的化するｓｇＲＮＡのゲノムワイドオ
フターゲット効果を低減させるＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の能力を評価した。目下のところ、
多くがゲノムに対する直交性の相対的欠落に起因するの特徴を有するオンターゲット部位
を回避しようと試行するが、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１がそれらの困難な標的についてもオフ
ターゲットインデルを低減させ得るか否かを調査することが望ましいことがあった。した
がって、ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子中のシトシンリッチホモポリマー配列または複数のＴＧリ
ピートを含有する配列（それぞれＶＥＧＦＡ部位２およびＶＥＧＦＡ部位３）のいずれか
を標的化する、既に特徴付けされたｓｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ ３３，１８７−１９７（２０１５）を使用した（表２）。対照実験において、これ
らのｓｇＲＮＡのそれぞれは、野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の両方を
用いて同等のレベルのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｄｓＯＤＮタグ取り込み（図７ｃ）およびイ
ンデル突然変異（図７ｄ）を誘導し、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１はそれらのｓｇＲＮＡのいず
れかを用いてオンターゲット活性が害されないことを実証した。重要なことに、ＧＵＩＤ
Ｅ−ｓｅｑ実験により、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が、それらのｓｇＲＮＡのオフターゲット
部位の低減において高度に有効であることが明らかになり、ＶＥＧＦＡ部位２についての
１２３個／１４４個の部位およびＶＥＧＦＡ部位３についての３１個／３２個の部位が検
出されなかった（図４ａおよび４ｂ）。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて検出されなかった
これらのオフターゲット部位の試験は、それらがそれぞれ、それらのプロトスペーサーお
よびＰＡＭ配列内の一連の総ミスマッチ：ＶＥＧＦＡ部位２ｓｇＲＮＡについての２〜７
つのミスマッチおよびＶＥＧＦＡ部位３ｓｇＲＮＡについての１〜４つのミスマッチを有
することを示し（図４ｃ）；さらに、ＶＥＧＦＡ部位２についてのそれらのオフターゲッ
トの９つは、ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ界面における潜在的なバルジ塩基（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ
ａｌ，．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４）
を有し得る（図４ａおよび図８）。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて検出されなかった部位
は、ＶＥＧＦＡ部位２ｓｇＲＮＡについての２〜６つのミスマッチおよびＶＥＧＦＡ部位
３ｓｇＲＮＡについての単一部位中の２つのミスマッチを有し（図４ｃ）、ＶＥＧＦＡ部
位２ｓｇＲＮＡについての３つのオフターゲット部位はここでも潜在的バルジを有した（
図８）。まとめると、これらの結果は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が、単純リピート配列に標
的化されるｓｇＲＮＡのオフターゲット効果の低減において高度に有効であり得、ホモポ
リマー配列に標的化されるｓｇＲＮＡへのかなりの影響も有し得ることを実証した。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の特異性の改良
既に記載された方法、例えば、トランケートｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９−２８４（２０１４））およびＳｐＣａｓ９−
Ｄ１１３５Ｅバリアント（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ５２３，４８１−４８５（２０１５））は、ＳｐＣａｓ９オフターゲット効果を部分
的に低減させ得、本発明者らは、それらをＳｐＣａｓ９−ＨＦ１と組み合わせてそのゲノ
ムワイド特異性をさらに改善することができるか否かを考慮した。ヒト細胞ベースＥＧＦ
Ｐ崩壊アッセイにおける４つの部位に標的化されるマッチ全長およびトランケートｓｇＲ
ＮＡを用いたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の試験により、ｓｇＲＮＡ相補性長さの短縮が、オン
ターゲット活性を実質的に害することが明らかになった（図９）。対照的に、追加のＤ１
１３５Ｅ突然変異を有するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（本明細書においてＳｐＣａｓ９−ＨＦ
２と称されるバリアント）は、ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して試験した
８つのｓｇＲＮＡの６つを用いて野生型ＳｐＣａｓ９の７０％以上の活性を保持した（図
５ａおよび５ｂ）。側鎖が標的ＤＮＡとのそのＰＡＭ近位末端上での疎水性非特異的相互
作用を媒介する位置におけるそれぞれＬ１６９ＡまたはＹ４５０Ａ突然変異を保有するＳ
ｐＣａｓ９−ＨＦ３およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ４バリアントも作出した（Ｎｉｓｈｉｍａ
ｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４９（２０１４）；Ｊｉａｎｇ
，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１４７７−１４８１（２０１５））。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ４は、８つのＥＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡ
のうちの同一の６つを用いて野生型ＳｐＣａｓ９を用いて観察された活性の７０％以上を
保持した（図５ａおよび５ｂ）。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、−ＨＦ３、および−ＨＦ４が、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に耐性で
ある２つのオフターゲット部位（ＦＡＮＣＦ部位２およびＶＥＧＦＡ部位３ｓｇＲＮＡに
ついて）におけるインデル頻度を低減させ得るか否かを決定するため、さらなる実験を実
施した。プロトスペーサーのシード配列中の単一ミスマッチを担持するＦＡＮＣＦ部位２
オフターゲットについて、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４は、Ｔ７ＥＩアッセイにより判断される
とおり、インデル突然変異頻度をほぼバックグラウンドレベルに低減させた一方、オンタ
ーゲット活性も有益に増加させ（図５ｃ）、３つのバリアント間の特異性の最大増加をも
たらした（図５ｄ）。２つのプロトスペーサーミスマッチ（シード配列中に１つ、および
ＰＡＭ配列から最も遠位のヌクレオチドにおいて１つ）を担持するＶＥＧＦＡ部位３オフ
ターゲット部位について、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２はインデル形成の最大低減を示した一方
、オンターゲット突然変異頻度に対してわずかな効果のみを示し（図５ｃ）、試験した３
つのバリアント間の特異性の最大増加をもたらした（図５ｄ）。まとめると、これらの結
果は、非特異的ＤＮＡ接触を媒介し、またはＰＡＭ認識を変更し得る他の残基における追
加の突然変異を導入することにより、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に耐性であるオフターゲット
効果の低減についての潜在性を実証する。
ＦＡＮＣＦ部位２およびＶＥＧＦＡ部位３ｓｇＲＮＡのオフターゲットに対してそれぞ
れ、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ２がＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に対して
改善された区別を有することを示す上記のＴ７Ｅ１アッセイの知見を一般化するため、Ｇ
ＵＩＤＥ−ｓｅｑを使用してそれらのバリアントのゲノムワイド特異性を試験した。ＲＦ
ＬＰアッセイを使用して、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ２は、ＧＵＩ
ＤＥ−ｓｅｑタグインテグレーション率によりアッセイされたとおり、ＳｐＣａｓ９−Ｈ
Ｆ１と類似のオンターゲット活性を有することが決定された（図５Ｅ）。ＧＵＩＤＥ−ｓ
ｅｑデータを分析した場合、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ４について
新たなオフターゲット部位は同定されなかった（図５Ｆ）。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１と比較
して、全ての部位におけるオフターゲット活性はＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより検出不能にな
り、または実質的に減少した。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に対して、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４は
、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の特異性の改善に抵抗性のままである単一のＦＡＮＣＦ部位２オ
フターゲット部位に対してほぼ２６倍良好な特異性を有した（図５Ｆ）。ＳｐＣａｓ９−
ＨＦ２は、高頻度ＶＥＧＦＡ部位３オフターゲットについてＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に対し
てほぼ４倍改善された特異性を有した一方、他の低頻度オフターゲット部位におけるＧＵ
ＩＤＥ−ｓｅｑ検出可能イベントも大幅に低減し（＞３８倍）、または排除した。注目す
べきことに、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１について同定されたそれらの低頻度部位の３つのゲノ
ム位置は、既に特徴付けされたバックグラウンドＵ２ＯＳ細胞切断点ホットスポットに隣
接する。まとめると、これらの結果はＳｐＣａｓ９−ＨＦ２およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ４
バリアントがＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のゲノムワイド特異性を改善し得ることを示唆する。
標準的な非反復標的配列に対して設計されたｓｇＲＮＡを使用した場合、ＳｐＣａｓ９
−ＨＦ１はオフターゲット突然変異をロバストに一貫して低減させた。ＳｐＣａｓ９−Ｈ
Ｆ１に最も耐性であった２つのオフターゲット部位は、プロトスペーサー中の１および２
つのミスマッチのみを有する。まとめると、これらの観察は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を使
用し、ゲノム中のいずれかの場所で１または２つのミスマッチを担持する密接に関連する
部位を有さない非反復配列を標的化することにより（既存の公的に利用可能なソフトウェ
アプログラム（Ｂａｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，１４
７３−１４７５（２０１４）を使用して容易に達成することができるもの）、オフターゲ
ット突然変異を検出不能なレベルに最小化させ得ることを示唆する。使用者が留意すべき
１つのパラメータは、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が、プロトスペーサー配列にミスマッチする
ｇＲＮＡの５’末端におけるＧを使用する一般的手法と適合性であり得ないことである。
標的部位に対してミスマッチする５’Ｇを担持する４つのｓｇＲＮＡの試験は、４つのう
ちの３つが野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて縮小した活性を
示し（図１０）、部分的にマッチする部位をより良好に区別するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の
能力を反映する可能性がある。
さらなる生化学的試験は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１その高いゲノムワイド特異性を達成す
る正確な機序を確認または明確化し得る。導入される４つの突然変異が細胞中のＳｐＣａ
ｓ９の安定性または定常状態発現レベルを変更することは明らかでない。それというのも
、減少濃度の発現プラスミドを用いるタイトレーション実験は、野生型ＳｐＣａｓ９およ
びＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が、それらの濃度が低下するにつれて同等に挙動することを示唆
した（図１１）。その代わり、最も簡易な機序的説明は、それらの突然変異が、オンター
ゲット活性を保持するためにちょうど十分であるがオフターゲット部位開裂を非効率また
は不存在にするほど低いレベルにおける複合体のエネルギーでＣａｓ９−ｓｇＲＮＡと標
的ＤＮＡとの間の相互作用のエネルギーを減少させたことである。この機序は、構造デー
タ中の突然変異残基と標的ＤＮＡリン酸骨格との間で観察された非特異的相互作用と一致
する（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５−９４９（２
０１４）；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ ｅｔ．Ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９−５７３（
２０１４））。いくらか類似の機序は、正荷電残基における置換を担持する転写アクチベ
ーター様エフェクターヌクレアーゼの増加した特異性を説明するために提案されている（
Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，４２９−
４３５（２０１４））。
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、Ｃａｓ９機能を変更することが示された他の突然変異と組み
合わせることもできることが可能であった。例えば、３つのアミノ酸置換を担持するＳｐ
Ｃａｓ９突然変異体（Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ、ＳｐＣａｓ９−ＶＱ
Ｒバリアントとしても公知）は、ＮＧＡＮ ＰＡＭ（ＮＧＡＧ＞ＮＧＡＴ＝ＮＧＡＡ＞Ｎ
ＧＡＣについての相対効率を有する）を有する部位を認識し（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，
Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１−４８５（２０１５））、近年同定
された四重ＳｐＣａｓ９突然変異体（Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１
３３７Ｒ、ＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲバリアントと称される）は、ＮＧＡＨ（Ｈ＝Ａ、Ｃ、
またはＴ）ＰＡＭを有する部位に対してＶＱＲバリアントに対して改善された活性を有す
る（図１２ａ）。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１からＳｐＣａｓ９−ＶＱＲおよびＳｐＣａｓ９−
ＶＲＱＲ中への４つの突然変異（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）の
導入は、それぞれＳｐＣａｓ９−ＶＱＲ−ＨＦ１およびＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲ−ＨＦ１
を作出した。これらのヌクレアーゼのＨＦバージョンの両方は、ＥＧＦＰレポーター遺伝
子に標的化される８つのｓｇＲＮＡの５つを用いて、および内在性ヒト遺伝子部位に標的
化される８つのｓｇＲＮＡの７つを用いてそれらの非ＨＦ相当物と同等（すなわち、７０
％以上）のオンターゲット活性を示した（図１２ｂ〜１２ｄ）。
より広く考慮すると、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼの追加の高フィ
デリティバリアントの遺伝子操作のための一般的方針を説明する。非特異的ＤＮＡ接触残
基における追加の突然変異を追加することは、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を用いて存続する極
めて少数の残留オフターゲット部位の一部をさらに低減させた。したがって、バリアント
、例えば、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４などは
、オフターゲット配列の性質に応じて特注様式で利用することができる。さらに、ＳｐＣ
ａｓ９の高フィデリティバリアントの遺伝子操作を用いた成功は、非特異的ＤＮＡ接触を
突然変異させるアプローチが他の天然存在および遺伝子操作Ｃａｓ９オルソログ（Ｒａｎ
，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６−１９１（２０１５），Ｅｓｖ
ｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６−１１２１（
２０１３）；Ｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ ４２，２５７７−２５９０（２０１４）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１５）ならびに増加した頻度で発見および
特徴付けされているより新たなＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３，７５９−７７１（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５−３９７）に拡張し得ること
を示唆する。
実施例２
標的鎖ＤＮＡに接触する残基中のアラニン置換、例として、Ｎ４９７Ａ、Ｑ６９５Ａ、
Ｒ６６１Ａ、およびＱ９２６Ａを有するＳｐＣａｓ９バリアントが本明細書に記載される
。これらの残基の他、本発明者らは、それらのバリアント、例えば、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ
１バリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）の特異性を、非標的
ＤＮＡ鎖に接触すると考えられる正荷電ＳｐＣａｓ９残基：Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｒ８３
２、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ９６８、Ｒ９７６、Ｈ９８２、Ｋ１００３、Ｋ１０１４、Ｋ
１０４７、および／またはＲ１０６０（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ．２０１６ Ｊａｎ １；３５１（６２６８）：８４−８参照）中の置換を追加する
ことにより、さらに改善することができるか否かを決定することを追求した。
これらの位置における単一アラニン置換およびそれらの組合せを担持する野生型ＳｐＣ
ａｓ９誘導体の活性を、ＥＧＦＰ遺伝子中の部位に対して設計された完全マッチｓｇＲＮ
Ａ（オンターゲット活性を評価するため）ならびに１１および１２位（１位は、最もＰＡ
Ｍから近位の塩基である）における意図的なミスマッチを担持する同一のｓｇＲＮＡ（オ
フターゲット部位において見出されるミスマッチ部位における活性を評価するため）を用
いるＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して最初に試験した（図１３Ａ）。（三重置換Ｋ８１０
Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０ＡまたはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａを担持
する誘導体は、それぞれｅＳｐＣａｓ９（１．０）およびｅＳｐＣａｓ９（１．１）とし
て公知の近年記載されたバリアントと同一であることに留意されたい；参照文献１参照）
。予測されるとおり、野生型ＳｐＣａｓ９は、ロバストなオンターゲットおよびミスマッ
チ標的活性を有した。対照として、この実験においてＳｐＣａｓ９−ＨＦ１も試験し、そ
れが予測されるとおりオンターゲット活性を維持する一方、ミスマッチ標的活性を低減さ
せることを見出した（図１３Ａ）。非標的ＤＮＡ鎖に潜在的に接触し得る位置における１
つ以上のアラニン置換を担持する野生型ＳｐＣａｓ９誘導体の全ては、野生型ＳｐＣａｓ
９と同等のオンターゲット活性を示した（図１３Ａ）。興味深いことに、これらの誘導体
の一部は、野生型ＳｐＣａｓ９を用いて観察された活性に対して、ミスマッチ１１／１２
ｓｇＲＮＡを用いて低減した開裂も示し、それらの誘導体中の置換のサブセットが、野生
型ＳｐＣａｓ９に対してこのミスマッチ部位に対する向上した特異性を付与することを示
唆した（図１３Ａ）。しかしながら、これらの単一置換も置換の組合せも１１／１２ミス
マッチｓｇＲＮＡを用いて観察された活性を完全に排除するために十分でなかった。９お
よび１０位におけるミスマッチを担持する追加のｓｇＲＮＡを使用して野生型ＳｐＣａｓ
９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、およびそれらの同一の野生型ＳｐＣａｓ９誘導体を試験した
場合（図１３Ｂ）、ほとんどの誘導体についてミスマッチ標的活性の最小の変化のみが観
察された。ここでも、これは、これらの潜在的な非標的鎖接触残基における単一、二重、
またはさらには三重置換（既に記載されたｅＳｐＣａｓ９（１．０）および（１．１）バ
リアントと等価である）が不完全マッチＤＮＡ部位における活性を排除するには不十分で
あることを実証した。まとめると、これらのデータは、野生型ＳｐＣａｓ９バリアントが
マッチｓｇＲＮＡを用いてオンターゲット活性を保持すること、および（野生型ＳｐＣａ
ｓ９に関して）それら自体でそれらの誘導体中に含有される置換が２つの異なるミスマッ
チＤＮＡ部位に対するヌクレアーゼ活性を排除するために十分でないことを実証する（図
１３Ａおよび１３Ｂ）。
これらの結果を考慮すると、非標的ＤＮＡ鎖に接触し得る残基における１つ以上の追加
のアミノ酸置換を担持するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体が、親ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タン
パク質に対して特異性をさらに改善し得ることが仮定された。したがって、単一、二重、
または三重アラニン置換の組合せを担持する種々のＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体を、完全
マッチｓｇＲＮＡ（オンターゲット活性を試験するため）ならびに１１および１２位にお
けるミスマッチを担持する同一のｓｇＲＮＡ（オフターゲット部位について見出されるミ
スマッチ標的部位における活性を評価するため）を使用するヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊
アッセイにおいて試験した。これらのｓｇＲＮＡは、図１３Ａ〜Ｂに使用された同一のも
のである。この実験により、試験したＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体バリアントのほとんど
が、野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の両方を用いて観察されたものと同
等のオンターゲット活性を示すことが明らかになった（図１４Ａ）。１１／１２ミスマッ
チｓｇＲＮＡを用いると、試験したＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体の一部（例えば、ＳｐＣ
ａｓ９−ＨＦ１＋Ｒ８３２ＡおよびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１＋Ｋ１０１４Ａ）は、ミスマッ
チｓｇＲＮＡを用いて開裂の認識可能な変化を示さなかった。しかしながら、重要なこと
にＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体のほとんどが、１１／１２ミスマッチｓｇＲＮＡを用いて
ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、またはｅＳｐＣａｓ９（１．１）を
用いて観察されたものよりもかなり低い活性を有し、それらの新たなバリアントのある組
合せが、低減したミスマッチ標的活性およびしたがって改善された特異性を有することを
示唆した（図１４Ａ）。１１／１２ミスマッチｓｇＲＮＡを用いてミスマッチ標的活性を
ほぼバックグラウンドレベルに低減させた１６個のＳｐＣａｓ９−ＨＦ１誘導体のうち、
９つが、オンターゲット活性に対する最小の効果のみを有すると考えられた（完全マッチ
ｓｇＲＮＡを使用して評価した；図１４Ａ）。９および１０位において意図的にミスマッ
チさせたｓｇＲＮＡを使用したＥＧＦＰ崩壊アッセイにおけるこれらのＳｐＣａｓ９−Ｈ
Ｆ１誘導体のサブセットの追加の試験（図１４Ｂ）により、それらのバリアントがこのミ
スマッチｓｇＲＮＡを用いて、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（図１４ｂ）、ｅＳｐＣａｓ９（１
．１）（図１３Ａ）、または野生型ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼに追加された同一置換（図
１３Ｂ）のいずれかを用いて観察されたものよりも低い活性を有することも明らかになっ
た。重要なことに、５つのバリアントは、９／１０ミスマッチｓｇＲＮＡを用いたこのア
ッセイにおいてバックグラウンドレベルのオフターゲット活性を示した。
次に、非標的鎖のこれらのアラニン置換を、本発明者らのＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリア
ントからのＱ６９５ＡおよびＱ９２６Ａ置換のみを含有するＳｐＣａｓ９バリアント（こ
こでは、「二重」バリアント）と組み合わせることができるか否かを試験した。上記の試
験ＨＦ１誘導体の多くがオンターゲット活性の観察可能（および不所望）な減少を示した
ため、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１からの２つの最も重要な置換のみ（Ｑ６９５ＡおよびＱ９２
６Ａ；図１Ｂ参照）を、１つ以上の非標的鎖接触置換と組み合わせることはオンターゲッ
ト活性をレスキューし得るが、それらの置換をＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントに追加し
た場合に観察された特異性の増加を依然として維持することが仮定された。したがって、
潜在的な非標的ＤＮＡ鎖相互作用位置における単一、二重、または三重アラニン置換の組
合せを担持する種々のＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）誘導体を、図１３Ａ〜Ｂ
に使用された上記のＥＧＦＰに標的化される同一の完全マッチｓｇＲＮＡ（オンターゲッ
ト活性を試験するため）ならびに１１および１２位におけるミスマッチを担持する同一の
ｓｇＲＮＡ（オフターゲット部位について見出されるミスマッチ標的部位における活性を
評価するため）を使用するヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて試験した。この
実験により、試験したＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）誘導体バリアントのほと
んどが野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の両方を用いて観察されたものと
同等のオンターゲット活性を示すことが明らかになった（図１５）。重要なことに、Ｓｐ
Ｃａｓ９−ＨＦ１誘導体の多くは、１１／１２ミスマッチｓｇＲＮＡを用いて、ＳｐＣａ
ｓ９−ＨＦ１、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）、またはｅＳｐＣａｓ９（１．１）を用いて観
察されたものと比較してかなり低い活性を有し、それらの新たなバリアントのある組合せ
が、低減したミスマッチ標的活性およびしたがって改善された特異性を有することを示唆
した（図１５）。１１／１２ミスマッチｓｇＲＮＡを用いてミスマッチ標的活性を、ほぼ
バックグラウンドレベルに低減させた１３個のＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）
誘導体のうち、１つのみがオンターゲット活性に対するかなりの効果を有すると考えられ
た（完全マッチｓｇＲＮＡを使用して評価した；図１５）。
概して、これらのデータは、非標的ＤＮＡ鎖に接触し得る位置におけるＳｐＣａｓ９−
ＨＦ１またはＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）への１、２、または３つのアラニ
ン置換の追加は、（それらの親クローンまたは近年記載されたｅＳｐＣａｓ９（１．０）
または（１．１）に対して）ミスマッチオフターゲット部位を区別する改善された能力を
有する新たなバリアントをもたらし得ることを実証する。重要なことに、野生型ＳｐＣａ
ｓ９に関するにそれらの同一の置換は、いかなる実質的な特異性利益も提供することが考
えられない。
ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ相補性界面におけるミスマッチに対するＳｐＣａｓ９−ＨＦ１
およびｅＳｐＣａｓ９−１．１の寛容性をより良好に定義および比較するため、スペーサ
ー相補性領域中の全ての考えられる位置における単一ミスマッチを含有するｓｇＲＮＡを
使用してそれらの活性を試験した。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１およびｅＳＰＣａｓ９−１．１
バリアントの両方が野生型ＳｐＣａｓ９と比較してほとんどの単一ミスマッチｓｇＲＮＡ
に対する類似の活性を有し、いくつかの例外でＳｐＣａｓ９−ＨＦ１がｅＳｐＣａｓ９−
１．１を上回った（図１６）。
次に、二重突然変異体（Ｄｂ＝Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Ｎ
４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９−１．０（１．０＝
Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）、またはｅＳｐＣａｓ９−１．１（１．１＝
Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）のいずれかからのアミノ酸置換と、標的鎖Ｄ
ＮＡに接触し、または非標的鎖ＤＮＡに潜在的に接触する残基中の追加のアラニン置換と
の組合せを含有する一部のバリアントの単一ヌクレオチドミスマッチ寛容性を試験した（
図１７Ａ〜Ｂ）。完全マッチｓｇＲＮＡを使用してオンターゲット活性を評価した一方、
スペーサー配列中の４、８、１２、または１６位におけるそのようなミスマッチを担持す
るｓｇＲＮＡを使用して単一ヌクレオチドミスマッチ寛容性を評価した（図１７Ａ）。多
数のこれらのバリアントはオンターゲット活性を維持し、ミスマッチｓｇＲＮＡを用いて
観察された活性はかなり低減した。これらのバリアントの３つ（Ｑ６９５Ａ／Ｋ８４８Ａ
／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｋ
８５５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ１０６０Ａ、およびＮ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ
９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ）を、残りの単一ミスマッチｓｇＲＮＡ（１〜３、
５〜７、９〜１１、１３〜１５、および１７〜２０位におけるミスマッチを含有する）を
用いてさらに試験した。これらのバリアントは、ｅＳｐＣａｓ９−１．１と比較してｓｇ
ＲＮＡ中の単一ヌクレオチド置換に対するロバストな不寛容性を実証し、それらの新たな
バリアントの改善された特異性プロファイルを実証した（図１７Ｂ）。アミノ酸置換の代
替組合せを含有する追加のバリアントヌクレアーゼを、スペーサー中の５、７、および９
位におけるミスマッチを含有するｓｇＲＮＡを使用して試験した（従来のバリアントがそ
れらの位置におけるミスマッチを寛容すると考えられたため、それらの特定のミスマッチ
ｓｇＲＮＡを使用した）（図１８）。多数のこれらのヌクレアーゼはミスマッチ部位に対
する改善された特異性を有し、オンターゲット活性はわずかに低減したにすぎなかった（
図１８）。
突然変異の追加の組合せが、特異性の改善を付与し得るか否かをさらに決定するため、
２つの追加のマッチｓｇＲＮＡを用いるヌクレアーゼバリアントの大幅に拡張されたパネ
ルを試験して本発明者らのＥＧＦＰ崩壊活性におけるオンターゲット活性を試験した（図
１９Ａ）。多数のこれらのバリアントはロバストなオンターゲット活性を維持し、それら
が特異性に対するさらなる改善の生成に有用であり得ることを示唆した（図１９Ｂ）。多
数のこれらのバリアントを、１２、１４、１６、または１８位における単一置換を含有す
るｓｇＲＮＡを用いて試験して特異性の改善が観察されたか否かを決定し、それらの位置
における単一ヌクレオチドミスマッチに対するより大きい不寛容性を示すことが見出され
た（図１９Ｂ）。
実施例３
ＳｐＣａｓ９を用いて行ったものと類似する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）を用いる方針を採用することにより
、標的ＤＮＡ鎖に接触することが公知の残基（図２０および２１Ａ）、非標的ＤＮＡに接
触し得る残基（進行中の実験）、およびＰＡＭ特異性に影響し得ると本発明者らが既に示
した残基（図２１Ｂ）中のアラニン置換を導入することによりＳａＣａｓ９の特異性を改
善するための実験を実施した。標的鎖ＤＮＡ骨格に接触し得る残基としては、Ｙ２１１、
Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｌ４４６、Ｙ６５１、
およびＲ６５４が挙げられ；非標的鎖ＤＮＡに接触し得る残基としては、Ｑ８４８、Ｎ４
９２、Ｑ４９５、Ｒ４９７、Ｎ４９８、Ｒ４９９、Ｑ５００、Ｋ５１８、Ｋ５２３、Ｋ５
２５、Ｈ５５７、Ｒ５６１、Ｋ５７２、Ｒ６３４、Ｒ６５４、Ｇ６５５、Ｎ６５８、Ｓ６
６２、Ｎ６６８、Ｒ６８６、Ｋ６９２、Ｒ６９４、Ｈ７００、Ｋ７５１が挙げられ；ＰＡ
Ｍに接触する残基としては、Ｅ７８２、Ｄ７８６、Ｔ７８７、Ｙ７８９、Ｔ８８２、Ｋ８
８６、Ｎ８８８、Ａ８８９、Ｌ９０９、Ｋ９２９、Ｎ９８５、Ｎ９８６、Ｒ９９１、およ
びＲ１０１５が挙げられる。予備実験において、標的鎖ＤＮＡ接触残基またはＰＡＭ接触
残基（それぞれ図２１ＡおよびＢ）中の単一アラニン置換（またはそれらの一部の組合せ
）は、オンターゲットＥＧＦＰ崩壊活性に対する可変効果を有し（完全マッチｓｇＲＮＡ
を使用）、オフターゲット開裂を排除し得なかった（１１および１２位においてミスマッ
チするｓｇＲＮＡを使用した場合）。興味深いことに、ＨＦ１中のＳｐＣａｓ９突然変異
は、類似ミスマッチ標的／ｓｇＲＮＡペアを用いてオフターゲット活性を完全に停止させ
得ず、（ＳｐＣａｓ９を用いて観察されたとおり）標的鎖／非標的鎖置換の組合せを含有
するバリアントがそのような部位における特異性を改善するために必要であり得ることを
示唆した。
潜在的な標的鎖ＤＮＡ接触を突然変異させてＳａＣａｓ９特異性を改善する方針をさら
に評価するため、ｓｇＲＮＡ中の１９および２０位におけるミスマッチを寛容する突然変
異の単一、二重、三重、および四重組合せの潜在性を試験した（図２２ＡおよびＢ）。こ
れらの組合せにより、Ｙ２３０およびＲ２４５におけるアラニン置換が、他の置換と組み
合わせた場合、ミスマッチ部位をより良好に区別する能力により判断されるとおり、特異
性を増加させ得ることが明らかになった。
次に、これらの三重アラニン置換バリアントの２つ（Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４
５ＡおよびＹ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ）のオンターゲット遺伝子崩壊活性を、
ＥＧＦＰ中の４つのオンターゲット部位で試験した（マッチ部位＃１〜４；図２３）。こ
れらのバリアントは、マッチ部位１および２についてロバストなオンターゲット活性を維
持したが、部位３および４を用いてオンターゲット活性の約６０〜７０％の損失を示した
。これらの三重アラニン置換バリアントの両方は、標的部位１〜４のスペーサー中の種々
の位置における二重ミスマッチを担持するｓｇＲＮＡを使用することにより判断されると
おり、野生型ＳａＣａｓ９に対して特異性を大幅に改善した（図２３）。
これらのアラニン置換の二重および三重組合せ（それぞれ図２４ＡおよびＢ）を担持す
るＳａＣａｓ９バリアントをオンターゲット活性について６つの内在性部位に対して試験
し、２１位（最もＰＡＭから遠位の位置は、区別が困難なミスマッチであると予測される
）における単一ミスマッチを含有するｓｇＲＮＡを使用して特異性の改善を評価した。一
部の例において、マッチｓｇＲＮＡを用いるオンターゲット活性はバリアントを用いて維
持した一方、２１位においてミスマッチするｓｇＲＮＡを用いて「オフターゲット」活性
を排除した（図２４ＡおよびＢ）。他の場合、マッチｓｇＲＮＡを用いて活性のわずかな
損失から完全な損失が観察された。
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配列
配列番号２７１ − ＪＤＳ２４６：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＦ
ＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、Ｎ
ＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７２ − ＶＰ１２：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ
、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７３ − ＭＳＰ２１３５：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＨＦ２（Ｎ４
９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７４ − ＭＳＰ２１３３：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＨＦ４（Ｙ４
５０Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７５ − ＭＳＰ４６９：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＶＱＲ（Ｄ１１
３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７Ｒ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７６ − ＭＳＰ２４４０：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＶＱＲ−ＨＦ
１（Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、
Ｔ１３３７Ｒ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７７ − ＢＰＫ２７９７：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲ（Ｄ
１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７Ｒ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７８ − ＭＳＰ２４４３：ＣＭＶ−Ｔ７−ヒトＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲ−Ｈ
Ｆ１（Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ
、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７Ｒ）−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧ
ヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、通常フォント、改
変コドン、小文字、ＮＬＳ、二重下線、３ｘＦＬＡＧタグ、太字：
配列番号２７９ − ＢＰＫ１５２０：Ｕ６−ＢｓｍＢＩカセット−Ｓｐ−ｓｇＲＮＡ
Ｕ６プロモーター、通常フォント、ＢｓｍＢＩ部位、イタリック、化膿性連鎖球菌（Ｓ．
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｇＲＮＡ、小文字、Ｕ６ターミネーター、二重下線：
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲
の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないこと
を理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内で
ある。

上記の開示に基づく発明の例として、以下のものが挙げられる。
[１] 以下の位置：Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６、および／またはＤ１１３５の１、２、３、４、５、６、または７つ全てにおける突然変異を有し、好ましくは、以下の位置：Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６、Ｄ１１３５の１、２、３、４、５、６、または７つにおける突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列ならびに任意選択的に核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む単離化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
[２] 以下：Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、およびＱ９２６の１、２、３、または４つ全てにおける突然変異、好ましくは、以下の突然変異：Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの１、２、３、または４つ全てを含む、[１]に記載の単離タンパク質。
[３] Ｑ６９５および／またはＱ９２６の一方または両方ならびに任意選択的にＬ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、およびＤ１１３５の１、２、３、４、または５つ全てにおける突然変異、好ましくは、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ，Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、またはＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅを含む、[１]に記載の単離タンパク質。
[４] Ｎ１４；Ｓ１５；Ｓ５５；Ｒ６３；Ｒ７８；Ｈ１６０；Ｋ１６３；Ｒ１６５；Ｌ１６９；Ｒ４０３；Ｎ４０７；Ｙ４５０；Ｍ４９５；Ｎ４９７；Ｋ５１０；Ｙ５１５；Ｗ６５９；Ｒ６６１；Ｍ６９４；Ｑ６９５；Ｈ６９８；Ａ７２８；Ｓ７３０；Ｋ７７５；Ｓ７７７；Ｒ７７８；Ｒ７８０；Ｋ７８２；Ｒ７８３；Ｋ７８９；Ｋ７９７；Ｑ８０５；Ｎ８０８；Ｋ８１０；Ｒ８３２；Ｑ８４４；Ｓ８４５；Ｋ８４８；Ｓ８５１；Ｋ８５５；Ｒ８５９；Ｋ８６２；Ｋ８９０；Ｑ９２０；Ｑ９２６；Ｋ９６１；Ｓ９６４；Ｋ９６８；Ｋ９７４；Ｒ９７６；Ｎ９８０；Ｈ９８２；Ｋ１００３；Ｙ１０１３；Ｋ１０１４；Ｖ１０１５；Ｓ１０４０；Ｎ１０４１；Ｎ１０４４；Ｋ１０４７；Ｋ１０５９；Ｒ１０６０；Ｋ１１０７；Ｅ１１０８；Ｓ１１０９；Ｋ１１１３；Ｒ１１１４；Ｓ１１１６；Ｋ１１１８；Ｒ１１２２；Ｋ１１２３；Ｋ１１２４；Ｄ１１３５；Ｓ１１３６；Ｋ１１５３；Ｋ１１５５；Ｋ１１５８；Ｋ１２００；Ｑ１２２１；Ｈ１２４１；Ｑ１２５４；Ｑ１２５６；Ｋ１２８９；Ｋ１２９６；Ｋ１２９７；Ｒ１２９８；Ｋ１３００；Ｈ１３１１；Ｋ１３２５；Ｋ１３３４；Ｔ１３３７および／またはＳ１２１６における突然変異、好ましくは、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ７８０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０１４Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０４７Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ７８０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ８３２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ９７６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０１４Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１０４７Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ９６８Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ８５５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ８３２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｈ９８２Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８５５Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｋ１００３Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｈ９８２Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｋ１０４７Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ９６８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｒ８３２Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、またはＱ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａをさらに含む、[１]に記載の単離タンパク質。
[５] 以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つ以上をさらに含む、[１]に記載の単離タンパク質。
[６] Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、[１]に記載の単離タンパク質。
[７] ヌクレアーゼ活性を減少させる前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
である、[６に記載の単離タンパク質。
[８] 以下の位置：Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｙ６５１、Ｒ６５４の１、２、３、４、５、６つ以上における突然変異を有し、好ましくは、以下の位置：Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５、Ｔ３９２、Ｎ４１９、Ｙ６５１、Ｒ６５４の１、２、３、４、または５、６つ以上における突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列ならびに任意選択的に核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質。
[９] 以下の突然変異：Ｙ２１１Ａ、Ｙ２１２Ａ、Ｗ２２９、Ｙ２３０Ａ、Ｒ２４５Ａ、Ｔ３９２Ａ、Ｎ４１９Ａ、Ｙ６５１、および／またはＲ６５４Ａの１つ以上を含む、[８]に記載の単離タンパク質。
[１０] Ｎ４１９および／またはＲ６５４における突然変異ならびに任意選択的に追加の突然変異Ｙ２１１、Ｙ２１２、Ｗ２２９、Ｙ２３０、Ｒ２４５およびＴ３９２の１、２、３、４つ以上、好ましくは、Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｗ２２９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２１２Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｙ２３０Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２１２Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｙ２３０Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｙ６５１Ａ、Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｒ２４５Ａ／Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｗ２２９Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、Ｙ２１１Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｔ３９２Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａ、またはＹ２１１Ａ／Ｗ２２９Ａ／Ｒ２４５Ａ／Ｎ４１９Ａ／Ｒ６５４Ａを含む、[８]に記載の単離タンパク質。
[１１] Ｙ２１１；Ｙ２１２；Ｗ２２９；Ｙ２３０；Ｒ２４５；Ｔ３９２；Ｎ４１９；Ｌ４４６；Ｑ４８８Ａ；Ｎ４９２Ａ；Ｑ４９５Ａ；Ｒ４９７Ａ；Ｎ４９８Ａ；Ｒ４９９；Ｑ５００；Ｋ５１８；Ｋ５２３；Ｋ５２５；Ｈ５５７；Ｒ５６１；Ｋ５７２；Ｒ６３４；Ｙ６５１；Ｒ６５４；Ｇ６５５；Ｎ６５８；Ｓ６６２；Ｎ６６７；Ｒ６８６；Ｋ６９２；Ｒ６９４；Ｈ７００；Ｋ７５１；Ｄ７８６；Ｔ７８７；Ｙ７８９；Ｔ８８２；Ｋ８８６；Ｎ８８８；８８９；Ｌ９０９；Ｎ９８５；Ｎ９８６；Ｒ９９１；Ｒ１０１５；Ｎ４４；Ｒ４５；Ｒ５１；Ｒ５５；Ｒ５９；Ｒ６０；Ｒ１１６；Ｒ１６５；Ｎ１６９；Ｒ２０８；Ｒ２０９；Ｙ２１１；Ｔ２３８；Ｙ２３９；Ｋ２４８；Ｙ２５６；Ｒ３１４；Ｎ３９４；Ｑ４１４；Ｋ５７；Ｒ６１；Ｈ１１１；Ｋ１１４；Ｖ１６４；Ｒ１６５；Ｌ７８８；Ｓ７９０；Ｒ７９２；Ｎ８０４；Ｙ８６８；Ｋ８７０；Ｋ８７８；Ｋ８７９；Ｋ８８１；Ｙ８９７；Ｒ９０１；および／またはＫ９０６における突然変異をさらに含む、[８]に記載の単離タンパク質。
[１２] 以下の突然変異：Ｅ７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、またはＲ１０１５Ｈの１つ以上、具体的には、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）をさらに含む、[８]に記載の単離タンパク質。
[１３] Ｄ１０、Ｅ４７７、Ｄ５５６、Ｈ７０１、またはＤ７０４；およびＨ５５７またはＮ５８０における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、[８]に記載の単離タンパク質。
[１４] 前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、および／または
（ｉｉ）Ｈ５５７Ａ、Ｈ５５７Ｎ、もしくはＨ５５７Ｙ、および／または
（ｉｉｉ）Ｎ５８０Ａ、および／または
（ｉｖ）Ｄ５５６Ａ
である、[１３]に記載の単離タンパク質。
[１５] 任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている[１]〜[１４]のいずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
[１６] 前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、[１５]に記載の融合タンパク質。
[１７] 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである、[１６に記載の融合タンパク質。
[１８] 前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、[１５]に記載の融合タンパク質。
[１９] 前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、[１８]に記載の融合タンパク質。
[２０] 前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、好ましくはＨＰ１αまたはＨＰ１βである、[１８]に記載の融合タンパク質。
[２１] 前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、[１５]に記載の融合タンパク質。
[２２] 前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、[２１]に記載の融合タンパク質。
[２３] 前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、[２２]に記載の融合タンパク質。
[２４] 前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、[１５]に記載の融合タンパク質。
[２５] ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、[１５]に記載の融合タンパク質。
[２６] 前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、[１５]に記載の融合タンパク質。
[２７] 前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、[２６]に記載の融合タンパク質。
[２８] 前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、[２６]に記載の融合タンパク質。
[２９] [１]〜[１４]のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
[３０] 任意選択的に、[１]〜[２４]のいずれか一項に記載のタンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、[２９]に記載の単離核酸を含むベクター。
[３１] [２９]に記載の核酸を含み、かつ任意選択的に[１]〜[１４]のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
[３２] 細胞のゲノムまたはエピゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、[１]〜[１４]のいずれか一項に記載の単離タンパク質および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
[３３] [１５]に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
[３４] 任意選択的に、[１５]に記載のタンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、[３３]に記載の単離核酸を含むベクター。
[３５] [３３]に記載の核酸を含み、かつ任意選択的に[１５]に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
[３６] 細胞のゲノムまたはエピゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、[１]〜[１４]のいずれか一項に記載の単離タンパク質および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
[３７] 細胞のゲノムまたはエピゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、[１５]〜[２８]のいずれか一項に記載の単離融合タンパク質および前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触させることを含む方法。
[３８] 前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む、[３６]または[３７]に記載の方法。
[３９] 前記細胞が、幹細胞、好ましくは、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、または胚中に存在する、[３６]または[３７]に記載の方法。
[４０] 二本鎖ＤＮＡ Ｄ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を[１]〜[１４]のいずれか一項に記載の単離タンパク質および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
[４１] 前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、[４０]に記載の方法。
[４２] 二本鎖ＤＮＡ Ｄ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を[１５]に記載の融合タンパク質および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
[４３] 前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、[４２]に記載の方法。

Claims (31)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、Ｑ６９５およびＱ９２６のうちの一方または両方における突然変異を有し、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持し、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して改善されたオフターゲット活性を有する、単離化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列のＱ６９５およびＱ９２６のうちの一方または両方における突然変異を有し、任意選択的に前記ＳｐＣａｓ９タンパク質が核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上と融合されており、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して改善されたオフターゲット活性を有する、単離化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質。
  3. 前記ＳｐＣａｓ９タンパク質が核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上と融合されている、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  4. 以下の突然変異：Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａの全てを含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  5. Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、およびＤ１１３５のうちの１、２、３、４、または５つ全てにおける突然変異をさらに含む、請求項４に記載の単離タンパク質。
  6. Ｑ６９５およびＱ９２６の一方または両方における突然変異を含み、任意選択的にＬ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１およびＤ１１３５のうちの１、２、３、４、または５つ全てにおける突然変異を含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  7. 以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  8. Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１または２に記載の単離タンパク質。
  9. ヌクレアーゼ活性を減少させる前記突然変異が、
    （ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
    （ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
    である、請求項８に記載の単離タンパク質。
  10. 任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１または２に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
  11. 前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ−κＢ ｐ６５からのものである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  14. 前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  16. 前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  17. 前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはテンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）タンパク質である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  20. ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  22. 前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
  23. 前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  24. 請求項１または２に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
  25. 請求項２４に記載の単離核酸を含むベクター。
  26. 請求項２４に記載の単離核酸を含む宿主細胞。
  27. 細胞のゲノムを変更するインビトロの方法であって、前記細胞中で、前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと結合した請求項１または２に記載の単離タンパク質を発現させるか、または前記単離タンパク質と前記細胞とを接触させて、それによって前記細胞の前記ゲノムが変更されることを含む方法。
  28. 前記単離タンパク質が核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグのうちの１つ以上と融合されている、請求項２７に記載のインビトロの方法。
  29. 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更するインビトロの方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと結合した請求項１に記載の単離タンパク質と接触させて、それによって前記ｄｓＤＮＡ分子が変更されることを含む方法。
  30. 細胞のゲノムを変更するインビトロの方法であって、前記細胞中で、前記細胞の前記ゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと結合した請求項１０に記載の融合タンパク質を発現させるか、または前記融合タンパク質と前記細胞とを接触させて、それによって前記細胞の前記ゲノムが変更されることを含む方法。
  31. 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更するインビトロの方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、前記ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと結合した請求項１０に記載の融合タンパク質と接触させて、それによって前記ｄｓＤＮＡ分子が変更されることを含む方法。
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