CN108795989A - SpyCas9的基因编辑活性抑制位点及其抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SpyCas9的基因编辑活性抑制位点，所述基因编辑活性抑制位点在制备基因编辑相关制剂中的用途，以及能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的抑制剂。本发明为开发SpyCas9活性抑制剂与相关技术以及产品提供了基础。

Description

SpyCas9的基因编辑活性抑制位点及其抑制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年4月26日提交的申请号为201710284103.9的中 国专利申请的权益，在此将其全部内容引入作为参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及SpyCas9的基因编辑 活性抑制位点及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是近年来发展起来的一种新的基因编辑技术。在打靶 过程中，CRISPR/Cas9系统通过sgRNA-Cas9体系使间区序列邻近基序 (Protospacer AdjacentMotif,PAM)3’端与sgRNA互补的目标DNA产生双 链断裂(Double-Strand Breaks，DSB)，之后细胞通过非同源末端连接(Non- Homologous End Joining，NHEJ)或者同源介导的双链DNA修复 (Homology-Directed Repair，HDR)对DNA进行修复，以实现对基因组的 改造。

基于对Cas蛋白的识别，CRISPR/Cas9系统可分成I至VI 6种类型与 19种亚型。目前已得到充分表征的SpyCas9系统属于II型CRISPR系统， 其通过PI结构域识别PAM区段而招募靶标双链DNA(dsDNA)。SpyCas9 与sgRNA相组合，已用作基因组编辑和基因调节中的最常见和有力的工具。

然而，目前仍然缺乏控制SpyCas9活性、由此降低由过度SpyCas9活性 导致的编辑脱靶的工具。并且，虽然目前已发现一些抗CRISPR蛋白，例如 由Listeria monocytogenes噬菌体原编码的4种抗CRISPR蛋白，特别是 AcrIIA2和AcrIIA4，可以使Listeriamonocytogenes Cas9(LmoCas9)的II-A CRISPR-Cas9和体内SpyCas9失活，但对于SpyCas9的活性位点以及与其相 关联的抑制剂，仍有待阐释与开发。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明人通过解析AcrIIA4与SpyCas9 的复合物结构，并进行深入表征，发现AcrIIA4直接和SpyCas9PI结构域上 的PAM DNA识别氨基酸结合从而抑制SpyCas9活性，所述PAM DNA识别 氨基酸包括Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333 等，这是SpyCas9基因编辑活性抑制位点的首次发现。

因此，本发明的一个目的是提供SpyCas9的所述基因编辑活性抑制位 点。

本发明的另一个目的是提供该抑制位点的用途，例如针对该位点制备基 因编辑相关制剂。

本发明的又一个目的是提供能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性 的抑制剂。

本发明的还一个目的是提供抑制SpyCas9的基因编辑的方法。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供SpyCas9的基因编辑活性抑制位点，所述活性抑制 位点选自SpyCas9中的Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、 Arg976和Arg1333中的一个或多个。其中SpyCas9参见Jinek,M.et al.A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337,816-821(2012)；Gasiunas,G.,Barrangou,R.,Horvath,P. &Siksnys,V.Cas9-crRNA ribonucleoproteincomplex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity inbacteria.Proc.Natl Acad.Sci.USA 109, 2579-2586(2012)；Anders,C.,Niewoehner,O.,Duerst,A.&Jinek,M.Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition bythe Cas9endonuclease. Nature 513,569-573(2014)；Nishimasu,H.et al.Crystalstructure of Cas9in complex with guide RNA and target DNA.Cell 156,935-949(2014)；Jinek,M.et al.Structures of Cas9endonucleases reveal RNA-mediatedconformational activation.Science 343,1247997(2014)；Jiang,F.et al.A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition.Science 348,1477-1481 (2015)。根据本发明的具体实施方式，本发明的SpyCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供所述基因编辑活性抑制位点在制备基因编辑相关 制剂中的用途。

优选地，所述基因编辑相关制剂为SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的 活性抑制剂。

更优选地，所述基因编辑相关制剂为SpyCas9剪切含PAM基序的 dsDNA的活性抑制剂。

优选地，所述基因编辑相关制剂结合所述SpyCas9的PI结构域。

优选地，所述基因编辑相关制剂通过占据SpyCas9的PI结构域中的 PAM-DNA相互作用位点而抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性。

更优选地，所述基因编辑相关制剂结合SpyCas9的Glu1108、Ser1109、 Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333中的一个或多个。

进一步优选地，所述基因编辑相关制剂通过模拟PAM而阻断SpyCas9 对dsDNA底物的识别和/或结合。

又一方面，本发明一种能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的抑 制剂，所述抑制剂结合所述SpyCas9的PI结构域。

优选地，所述抑制剂通过占据PI结构域中的PAM-DNA相互作用位点 而抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性。

具体而言，所述抑制剂结合所述SpyCas9的Glu1108、Ser1109、Ser1216、 Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333中的一个或多个。

进一步优选地，所述抑制剂通过模拟PAM而阻断SpyCas9对dsDNA底 物的识别和/或结合。

还一方面，一种抑制SpyCas9的基因编辑活性的方法，所述方法包括提 供本发明所述的抑制剂。

并且，实验证明，SpyCas9关键氨基酸残基突变后，其与含PAM基序 的dsDNA结合能力降低，甚至不再具有该结合能力。因此，再一方面，本 发明提供一种SpyCas9突变体(突变蛋白)，所述SpyCas9突变体相对于野 生型SpyCas9在选自第1108、1109、1216、1200、1335、976和1333中的 一个或多个氨基酸位点具有突变。其中，野生型SpyCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的具体实施方式，所述SpyCas9突变体相对于野生型 SpyCas9具有选自以下突变中的一个或多个：S1216T、S1216R、R1333Y、 R1333H、R1335Y、S1109R、K1200Y。

本发明的发明人以AcrIIA4与SpyCas9的复合物结构为基础，首次发现 了SpyCas9中的基因编辑活性抑制位点，为开发其活性抑制剂与相关技术以 及产品提供了基础，并且还可有助于减少基因编辑技术的脱靶效应，提高该 技术与相关产品的安全性和有效性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了测定AcrIIA4与SpyCas9相互作用的凝胶过滤实验结果；

图2显示了测定AcrIIA4与SpyCas9相互作用的GST拉下实验结果；

图3显示了SpyCas9和SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物示意图；

图4显示了在SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物中AcrIIA4与SpyCas9的 界面接触情况；

图5显示了AcrIIA4与SpyCas9的结合位点的进一步分析结果；

图6显示了SpyCas9关键氨基酸突变后与dsDNA的结合能力的检测结 果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些 实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1 AcrIIA4与SpyCas9的结合

合成全长SpyCas9、NmeCas9、AcrIIA2和AcrIIA4的cDNA(SEQ ID NO. 2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)，分别亚克隆到细菌表达 载体pGEX-6P-1(GEHealthcare，具有N-端GST标签)中。在大肠杆菌C43 (DE3)细胞中表达蛋白。重组蛋白的表达由0.3mM IPTG在16℃下诱导，过 夜后，离心收集细胞，将表达有Spycas9或NmeCas9蛋白的细胞重悬于补充 了1mM蛋白酶抑制剂PMSF(Sigma)的缓冲液A(25mM Tris-HCl,pH8.0,1MNaCl,3mM DTT)中。超声裂解细胞，4℃下23708×g离心去除细胞碎片。 裂解物首先使用GS4B珠子(GE Healthcare)纯化，洗涤珠子，在缓冲液B (25mM Tris-HCl,pH8.0,300MNaCl,3mM DTT)中在4℃下使用ppase过夜 剪切结合的蛋白，以去除N-端GST标签。将经剪切的SpyCas9蛋白从GS4B 树脂上洗脱下来，通过肝素琼脂糖凝胶和FPLC离子交换色谱(AKTAPure, GE Healthcare)进一步分离纯化。

将分别表达AcrIIA2和AcrIIA4蛋白的细胞重悬于缓冲液B中，如上纯 化，通过阴离子交换色谱进一步分离纯化。

使用T7聚合酶体外转录分别用于SpyCas9的sgRNA(SpyCas9_sgRNA；SEQ ID NO.6)和用于NmeCas9的sgRNA(NmeCas9_sgRNA；SEQ ID NO. 8)，使用相应浓度的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。两种sgRNA的转录模板 (dsDNA)(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9)通过PCR生成。进行转录反应 的缓冲液含有0.1M HEPES-K pH 7.9,12mM MgCl₂,30mM DTT,2mM亚精胺, 2mMNTP(每种),80μg/mL T7聚合酶和500nM转录模板。反应在37℃下 进行2-6小时，在-80℃下冷冻1小时终止。低温冷冻分别使焦磷酸和DNA 模板沉淀，去除沉淀物之后，通过乙醇沉淀法沉淀sgRNA，-80℃下冷冻1 小时，离心处理后，保留sgRNA沉淀，使用2×TBE-尿素凝胶上样缓冲液重 悬，在变性(8M尿素)聚丙烯酰胺凝胶上电泳纯化。从该凝胶上切下sgRNA 条带，用Elutrap System回收，乙醇沉淀。将sgRNA重悬于DEPC处理水中， -80℃下储存。

(一)凝胶过滤实验

本实验测定在存在或不存在sgRNA时，AcrIIA4是否与SpyCas9相互作 用。制备如下实验组：

SpyCas9+AcrIIA4组：摩尔比1:8

SpyCas9+sgRNA+AcrIIA4组：摩尔比1:2:8

NmeCas9+AcrIIA4组：摩尔比1:8

NmeCas9+sgRNA+AcrIIA4组：摩尔比1:2:8

将各组样品分别在补充有2mM MgCl₂的缓冲液C(10mM Tris-HCl,pH 8.0,150mMNaCl,3mM DTT)中在4℃下孵育1小时，使用尺寸排阻色谱 (Superdex 200increase 10/300GL,GE Healthcare)纯化分离样品，用缓冲液 C平衡。实验参数：流速0.5ml/min，上样体积2ml，每0.5ml样品收集一次。 来自不同收集位置的样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，检测纯化 的蛋白质质量。

结果分别见图1中的图1A和图1B。其中，图1A示出了来自尺寸排阻 色品的UV吸收峰，图1B示出了来自凝胶过滤的各峰级分的SDS-PAGE和 考马斯亮蓝染色结果。由图1可知，AcrIIA4不单独与SpyCas9相互作用， 但是在sgRNA存在下，AcrIIA4与SpyCas9共同迁移，表明三者形成了sgRNA 诱导的复合物。

(二)GST拉下实验

本实验测定在存在或不存在sgRNA时，AcrIIA2或AcrIIA4蛋白是否与 SpyCas9或NmeCas9相互作用。在存在或不存在sgRNA时，使纯化的 GST-SpyCas9或GST-NmeCas9先与GS4B珠子结合，然后将珠子与AcrIIA2 或AcrIIA4蛋白孵育。三者反应摩尔比为GST-SpyCas9或 GST-NmeCas9:sgRNA:AcrIIA2或AcrIIA4蛋白＝1:2.5:4，将GST-SpyCas9蛋 白或GST-NmeCas9与sgRNA以摩尔比1:2.5的比例在室温下在缓冲液C中 混合5分钟，再与AcrIIA2或AcrIIA4在4℃下混合并孵育15分钟。用缓冲 液B洗涤3次。使用SDS-PAGE监测反应混合物，考马斯亮蓝染色。实验 重复三次。

其中GST-SpyCas9或GST-NmeCas9在纯化过程中(同实施例1)不加 ppase过夜酶切，在裂解物结合GS4B珠子后，使用洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,3mMDTT，15mM GSH)洗脱蛋白，通过 肝素琼脂糖凝胶和FPLC离子交换色谱(AKTA Pure,GEHealthcare)进一步 分离纯化。

结果见图2。由图2可知，与图1所示相同，AcrIIA2或AcrIIA4蛋白特 异性地与sgRNA结合的SpyCas9相互作用，即与处于结合sgRNA状态的 SpyCas9结合。

由图1和图2还可看到，AcrIIA2或AcrIIA4蛋白均不与sgRNA结合的 NmeCas9相互作用。

实施例2 AcrIIA4对SpyCas9的DNA酶活性的抑制

在20μl缓冲体系中进行dsDNA体外剪切反应，该缓冲体系含有0.6μg SpyCas9、0.1μg sgRNA和0.3μg dsDNA(SEQ ID NO.10)。为了测试SpyCas9 剪切dsDNA的AcrIIA2或AcrIIA4蛋白介导的抑制作用，使用范围为1:0至 1:8的SpyCas9:AcrIIA摩尔比。剪切反应在37℃下在剪切缓冲液(20mM Hepes-Na,pH 7.5,2mM MgCl₂,100mM KCl,1mM DTT,5％甘油)中进行15 分钟。添加2×TBE-尿素凝胶上样缓冲液并且在95℃下淬灭5分钟来终止反应。剪切产物在6％TBE-尿素变性凝胶上运行，EB染色。实验重复三次。

可知，与sgRNA预孵育的SpyCas9有效剪切含有5′-TGG-3′PAM基序 的靶DNA序列；而AcrIIA2或AcrIIA4则以剂量依赖性的方式抑制SpyCas9 催化的该靶DNA的剪切。因此，综合实施例1的结果，可以得出以下结论： AcrIIA2或AcrIIA4直接且特异性地结合SpyCas9，从而抑制其dsDNA剪切 活性。

实施例3 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物的制备、结晶、表征

SpyCas9蛋白的结构域组成见图3中的图3A。如图所示，SpyCas9蛋白 包含RNA识别叶(REC)、核酸酶(NUC)叶(其含有两个核酸酶结构域 HNH和RuvC)以及PAM相互作用(PI)结构域(进一步分成拓扑异构酶 同源性(TOPO)结构域和C末端结构域(CTD))。BH为螺旋桥。

在室温下将SpyCas9蛋白与sgRNA和AcrIIA4以1:2.5:8的摩尔比在缓 冲液C中孵育5分钟，然后补充2mM MgCl₂在4℃下孵育1小时。将复合 物采用缓冲液C进行尺寸排阻色谱(HiLoad 16/600Superdex200,GE Healthcare)，以去除过量的sgRNA和AcrIIA4。使用SDS–PAGE在纯化各 阶段监测蛋白纯度，考马斯亮蓝染色。使用6％TBE-尿素变性凝胶监测sgRNA，溴化乙锭染色。

将蛋白质复合物与等量的结晶缓冲液(2μl)混合，通过悬滴汽相扩散法产 生SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物的晶体。在20℃下在结晶缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH 6.5,0.2M MgCl₂和14％(w/v)PEG4000)中，晶体在10天内生 长到最大。将晶体转移到冷冻保护缓冲液(含20％(w/v)甘油的该结晶缓冲 液)中，在液氮中闪蒸冷却，然后收集数据。

使用DECTRIS PILATUS3 6M检测器以BL19U光束线收集衍射数据。 晶体空间群：P2₁，每个不对称单元具有一个配合物。使用HKL2000处理数 据。使用具有program PHASER的分子置换(MR)解析 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物的晶体结构。

以3.0A分辨率测定了SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物的晶体结构。图 3中的图3B示出了SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物的整体结构，左图和右 图中SpyCas9各结构域的颜色根据图3A中所示，AcrIIA4和sgRNA分别以 紫色和橙色示出。由图可知，AcrIIA4结合在SpyCas9的CTD、TOPO和RuvC 三个结构域形成的凹槽区域中，并采取了一种新的蛋白折叠构象。与结合 sgRNA的SpyCas9结构(SpyCas9-sgRNA复合物，PDB：4ZT0)相比，发 现AcrIIA4结合并未引起结合sgRNA的SpyCas9的显著构象改变。

AcrIIA4在SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4复合物中的构象见图4中的图4A， 其中白色、蓝色和红色分别指示中性、阳性和阴性表面。研究该复合物中 AcrIIA4与SpyCas9各结构域的界面接触情况。图4B示出AcrIIA4与SpyCas9 的TOPO、CTD和RuvC结构域的相互作用，其中左上图示出AcrIIA4位于 围绕SpyCas9的CTD、TOPO和RuvC结构域的交界处；右上图示出在与 TOPO的界面处，来自AcrIIA4的α1-β1和β1-β2的氨基酸残基Asp14和Asp36 与TOPO的氨基酸残基Glu1108、Ser1109和Ser1136分别形成极性接触；右 下图示出来自CTD的β-发夹的Arg1333和Arg1335由AcrIIA4的α1-α2环 充分识别，与Tyr67、Asp69、Glu70和Asn39形成总计5个氢键，并且来自 AcrIIA4的β1-β2发夹一侧的Asp37和Glu40与Ser1216和Lys1200分别氢 键键合，而来自另一侧的Asn48接触His1311，从而进一步加强了相互作用； 左下图示出AcrIIA4的β1前面突出的环(氨基酸残基Leu19-Gln29)通过 Asp23、Ser24和Asn25与RuvC的Asn767、Thr13、Ala764和Arg976相互 作用，完全覆盖RuvC活性位点(氨基酸残基Asp10、Glu762、His983和 Asp986)的底物入口。这一结构观察结果表明，阻止底物进入RuvC活性位点对于AcrIIA4抑制SpyCas9的酶促活性非常重要。

实施例4 AcrIIA4与SpyCas9相互作用的进一步研究

比较制得的AcrIIA4-SpyCas9-sgRNA复合物和SpyCas9-sgRNA-dsDNA (PDB:4UN3)的结构，发现AcrIIA4在SpyCas9的PI结构域上的结合位点 与含PAM基序的dsDNA在SpyCas9上的结合位点完全重叠，参见图5中的 图5A，其示出了AcrIIA4-SpyCas9-sgRNA和SpyCas9-sgRNA-dsDNA(PDB: 4UN3)的结构叠加结果，其中以红色示出了AcrIIA4和含PAM基序的dsDNA。进一步结构分析表明，AcrIIA4的酸性氨基酸Asp14、Asp37、Glu40、 Asp69和Glu70所处的位置与含PAM基序的dsDNA主链的几个磷酸盐位置 相同，而且AcrIIA4的这些氨基酸残基也与SpyCas9PI结构域的识别PAM 的氨基酸残基Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335和Arg1333 相互作用，具体参见图5中的图5B(上图为PAM:SpyCas9，下图为AcrIIA4:SpyCas9)。这些结构观察结果表明，AcrIIA4通过占据SpyCas9的 PAM结合位点、由此阻断底物识别来抑制SpyCas9。

采用微量热泳动(MST)分析计算AcrIIA2、AcrIIA4和dsDNA对纯化 的SpyCas9-sgRNA复合物(PDB：4ZT0)的亲和力，采用Monolith NT.115 (NanoTemper TechnologiesGmbH,Munich,Germany)进行。将蛋白用 NT-647-NHS荧光染料标记。在室温下将不同浓度(0.15nM至5μM)的三 种底物AcrIIA2、AcrIIA4和dsDNA(双链分别见SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12)分别与20nM标记的SpyCas9-sgRNA在含25mM Tris-HCl(pH 7.5) 和100mM NaCl的缓冲液中孵育15分钟。将样品上样到NanoTemper亲水处 理的毛细管中，在24℃下测量。所有实验重复3次，数据使用NanoTemper 分析软件进行分析，结果见图5中的图5C(误差计算为标准差)，表明与 AcrIIA2或AcrIIA4相比，dsDNA底物与SpyCas9-sgRNA的结合亲和力更低。

进一步进行体外GST拉下实验以证明AcrIIA4与dsDNA底物的竞争关 系。在缓冲液C中，将GST-SpyCas9蛋白与sgRNA在室温下混合5分钟， 然后加入AcrIIA2或AcrIIA4，在4℃下混合并孵育15分钟，再加入含PAM 基序的dsDNA(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)，GST-SpyCas9蛋 白:sgRNA:AcrIIA2或AcrIIA4:dsDNA的摩尔比为1:2.5:4:4。将反应混合物装载到GS4B珠子上并且孵育15分钟。充分洗涤后，添加变性凝胶上样缓冲 液终止反应，使用10％TBE尿素变性凝胶监测反应混合物，溴化乙锭染色。 实验重复三次。结果见图5中的图5D，表明AcrIIA4与dsDNA底物竞争对 SpyCas9-sgRNA的结合。

综合上述实验结果，发现AcrIIA4在SpyCas9PI结构域上的结合位点完 全覆盖SpyCas9的含PAM基序的dsDNA的结合位点，具体地，发现AcrIIA4 氨基酸残基与SpyCas9的识别PAM DNA的氨基酸残基Glu1108、Ser1109、 Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333相互作用。并且结构分析 与其他证明实验表明，AcrIIA4与SpyCas9的相互作用是通过靶向SpyCas9 的PI结构域进行的，而PI结构域是SpyCas9识别dsDNA底物的关键区域。进一步发现，AcrIIA4直接和SpyCas9PI结构域上的识别含PAM基序的 dsDNA的氨基酸残基Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976 和Arg1333结合来抑制SpyCas9的活性。

实施例5 SpyCas9关键氨基酸残基突变后与dsDNA结合能力的检测

按照本领域常规方法制备特定位点突变的突变体SpyCas9。在缓冲液C 中，将突变体SpyCas9与sgRNA在室温下混合5分钟，然后加入含PAM基 序的dsDNA(SEQ ID NO.11和SEQID NO.12)反应15分钟，SpyCas9蛋 白:sgRNA:dsDNA的摩尔比为1:1.5:3。将反应混合物装载到GS4B珠子上并 且孵育15分钟。充分洗涤后，添加变性凝胶上样缓冲液终止反应，使用10％TBE尿素变性凝胶监测反应混合物，溴化乙锭染色。实验重复三次。

结果见图6，SpyCas9蛋白在突变了Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335 和Arg1333氨基酸后，不再具有与含PAM基序的dsDNA的结合能力。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可 以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本 发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学

<120> SpyCas9的基因编辑活性抑制位点及其抑制剂

<130> LC17110029R

<150> CN201710284103.9

<151> 2017-04-26

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> PRT

<213> Spycas9

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 2

<211> 4107

<212> DNA

<213> Spycas9 DNA序列()

<400> 2

atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900

cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgactaa 4107

<210> 3

<211> 3249

<212> DNA

<213> Nmecas9 DNA序列()

<400> 3

atggctgcct tcaaacctaa ttcaatcaac tacatcctcg gcctcgatat cggcatcgca 60

tccgtcggct gggcgatggt agaaattgac gaagaagaaa accccatccg cctgattgat 120

ttgggcgtgc gcgtatttga gcgtgccgaa gtaccgaaaa caggcgactc ccttgccatg 180

gcaaggcgtt tggcgcgcag tgttcgccgc ctgacccgcc gtcgcgccca ccgcctgctt 240

cggacccgcc gcctattgaa acgcgaaggc gtattacaag ccgccaattt tgacgaaaac 300

ggcttgatta aatccttacc gaatacacca tggcaacttc gcgcagccgc attagaccgc 360

aaactgacgc ctttagagtg gtcggcagtc ttgttgcatt taatcaaaca tcgcggctat 420

ttatcgcaac ggaaaaacga gggcgaaact gccgataagg agcttggcgc tttgcttaaa 480

ggcgtagccg gcaatgccca tgccttacag acaggcgatt tccgcacacc ggccgaattg 540

gctttaaata aatttgagaa agaaagcggc catatccgca atcagcgcag cgattattcg 600

catacgttca gccgcaaaga tttacaggcg gagctgattt tgctgtttga aaaacaaaaa 660

gaatttggca atccgcatgt ttcaggcggc cttaaagaag gtattgaaac cctactgatg 720

acgcaacgcc ctgccctgtc cggcgatgcc gttcaaaaaa tgttggggca ttgcaccttc 780

gaaccggcag agccgaaagc cgctaaaaac acctacacag ccgaacgttt catctggctg 840

accaagctga acaacctgcg tattttagag caaggcagcg agcggccatt gaccgatacc 900

gaacgcgcca cgcttatgga cgagccatac agaaaatcca aactgactta cgcacaagcc 960

cgtaagctgc tgggtttaga agataccgcc tttttcaaag gcttgcgcta tggtaaagac 1020

aatgccgaag cctcaacatt gatggaaatg aaggcctacc atgccatcag ccgtgcactg 1080

gaaaaagaag gattgaaaga caaaaaatcc ccattaaacc tttctcccga attacaagac 1140

gaaatcggca cggcattctc cctgttcaaa accgatgaag acattacagg ccgtctgaaa 1200

gaccgtatac agcccgaaat cttagaagcg ctgttgaaac acatcagctt cgataagttc 1260

gtccaaattt ccttgaaagc attgcgccga attgtgcctc taatggaaca aggcaaacgt 1320

tacgatgaag cctgcgccga aatctacgga gaccattacg gcaagaagaa tacggaagaa 1380

aagatttatc tgccgccgat tcccgccgac gaaatccgca accccgtcgt cttgcgcgcc 1440

ttatctcaag cacgtaaggt cattaacggc gtggtacgcc gttacggctc cccagctcgt 1500

atccatattg aaactgcaag ggaagtaggt aaatcgttta aagaccgcaa agaaattgag 1560

aaacgccaag aagaaaaccg caaagaccgg gaaaaagccg ccgccaaatt ccgagagtat 1620

ttccccaatt ttgtcggaga acccaaatcc aaagatattc tgaaactgcg cctgtacgag 1680

caacaacacg gcaaatgcct gtattcgggc aaagaaatca acttaggccg tctgaacgaa 1740

aaaggctatg tcgaaatcga ccatgccctg ccgttctcgc gcacatggga cgacagtttc 1800

aacaataaag tactggtatt gggcagcgaa aaccaaaaca aaggcaatca aaccccttac 1860

gaatacttca acggcaaaga caacagccgc gaatggcagg aatttaaagc gcgtgtcgaa 1920

accagccgtt tcccgcgcag taaaaaacaa cggattctgc tgcaaaaatt cgatgaagac 1980

ggctttaaag aacgcaatct gaacgacacg cgctacgtca accgtttcct gtgtcaattt 2040

gttgccgacc gtatgcggct gacaggtaaa ggcaagaaac gtgtctttgc atccaacgga 2100

caaattacca atctgttgcg cggcttttgg ggattgcgca aagtgcgtgc ggaaaacgac 2160

cgccatcacg ccttggacgc cgtcgtcgtt gcctgctcga ccgttgccat gcagcagaaa 2220

attacccgtt ttgtacgcta taaagagatg aacgcgtttg acggtaaaac catagacaaa 2280

gaaacaggag aagtgctgca tcaaaaaaca cacttcccac aaccttggga atttttcgca 2340

caagaagtca tgattcgcgt cttcggcaaa ccggacggca aacccgaatt cgaagaagcc 2400

gataccctag aaaaactgcg cacgttgctt gccgaaaaat tatcatctcg ccccgaagcc 2460

gtacacgaat acgttacgcc actgtttgtt tcacgcgcgc ccaatcggaa gatgagcggg 2520

caagggcata tggagaccgt caaatccgcc aaacgactgg acgaaggcgt cagcgtgttg 2580

cgcgtaccgc tgacacagtt aaaactgaaa gacttggaaa aaatggtcaa tcgggagcgc 2640

gaacctaagc tatacgaagc actgaaagca cggctggaag cacataaaga cgatcctgcc 2700

aaagcctttg ccgagccgtt ttacaaatac gataaagcag gcaaccgcac ccaacaggta 2760

aaagccgtac gcgtagagca agtacagaaa accggcgtat gggtgcgcaa ccataacggt 2820

attgccgaca acgcaaccat ggtgcgcgta gatgtgtttg agaaaggcga caagtattat 2880

ctggtaccga tttacagttg gcaggtagcg aaagggattt tgccggatag ggctgttgta 2940

caaggaaaag atgaagaaga ttggcaactt attgatgata gtttcaactt taaattctca 3000

ttacacccta atgatttagt cgaggttata acaaaaaaag ctagaatgtt tggttacttt 3060

gccagctgcc atcgaggcac aggtaatatc aatatacgca ttcatgatct tgatcataaa 3120

attggcaaaa atggaatact ggaaggtatc ggcgtcaaaa ccgccctttc attccaaaaa 3180

taccaaattg acgaactggg caaagaaatc agaccatgcc gtctgaaaaa acgcccgcct 3240

gtccgttaa 3249

<210> 4

<211> 372

<212> DNA

<213> AcrIIA2 DNA序列()

<400> 4

atgacattaa caagagcaca aaaaaagtat gcagaagcga tgcacgagtt tataaatatg 60

gtggatgact ttgaagagtc tacaccggat tttgcaaagg aagttctaca tgattctgac 120

tatgtagtta ttacaaaaaa tgaaaaatat gcagtagctc tttgctctct tagcactgat 180

gaatgtgaat atgatactaa cttatactta gatgaaaaat tggttgatta ctcaacagtt 240

gacgtaaacg gtgtgacata ctacatcaac attgttgaaa ctaacgatat cgatgattta 300

gaaatcgcta cggatgaaga tgagatgaaa agtggcaacc aagaaattat tttaaaaagt 360

gagttgaagt aa 372

<210> 5

<211> 264

<212> DNA

<213> AcrIIA4 DNA序列()

<400> 5

atgaatatta atgacttaat tagagaaatc aaaaacaaag attacacagt gaaattgagt 60

ggtacggata gcaatagtat cacacagcta attattcgcg ttaataatga tggcaacgag 120

tatgtaattt ctgaaagtga aaatgaatca atcgttgaaa aattcatctc tgcattcaaa 180

aacggttgga atcaagaata cgaggatgaa gaagaatttt ataatgacat gcaaacaatc 240

accttaaaaa gtgagttgaa ctaa 264

<210> 6

<211> 98

<212> RNA

<213> SpyCas9_sgRNA

<400> 6

ggaaauuagg ugcgcuuggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 98

<210> 7

<211> 118

<212> DNA

<213> SpyCas9_sgRNA的RNA转录模板()

<400> 7

atgtaatacg actcactata ggaaattagg tgcgcttggc gttttagagc tagaaatagc 60

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctt 118

<210> 8

<211> 123

<212> RNA

<213> Nmecas9_sgRNA

<400> 8

gggugcgcgg cgcauuaccu uuacguugua gcucccuuuc ucauuucgga aacgaaauga 60

gaaccguugc uacaauaagg ccgucugaaa agaugugccg caacgcucug ccccuuaaag 120

cuu 123

<210> 9

<211> 143

<212> DNA

<213> Nmecas9_sgRNA的RNA转录模板()

<400> 9

atgtaatacg actcactata gggtgcgcgg cgcattacct ttacgttgta gctccctttc 60

tcatttcgga aacgaaatga gaaccgttgc tacaataagg ccgtctgaaa agatgtgccg 120

caacgctctg ccccttaaag ctt 143

<210> 10

<211> 271

<212> DNA

<213> dsDNA

<400> 10

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 60

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 120

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatcccaat cccagccaag cgcacctaat 180

ttccgaattc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 240

ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa a 271

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> dsDNA(+)

<400> 11

caatcccagc caagcgcacc taatttcc 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> dsDNA(-)

<400> 12

ggaaattagg tgcgcttggc tgggattg 28

Claims (10)

1.SpyCas9的基因编辑活性抑制位点，所述活性抑制位点选自SpyCas9中的Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333中的一个或多个。

2.权利要求1所述的基因编辑活性抑制位点在制备基因编辑相关制剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述基因编辑相关制剂为SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的活性抑制剂；

优选地，所述基因编辑相关制剂为SpyCas9剪切含PAM基序的dsDNA的活性抑制剂。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述基因编辑相关制剂结合SpyCas9的PI结构域；

优选地，所述基因编辑相关制剂通过占据SpyCas9的PI结构域中的PAM-DNA相互作用位点而抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，所述基因编辑相关制剂结合SpyCas9的Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333中的一个或多个；

优选地，所述基因编辑相关制剂通过模拟PAM而阻断SpyCas9对dsDNA底物的识别和/或结合。

6.一种能够抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性的抑制剂，所述抑制剂结合SpyCas9的PI结构域；

优选地，所述抑制剂通过占据PI结构域中的PAM-DNA相互作用位点而抑制SpyCas9的基因编辑/核酸酶活性。

7.根据权利要求6所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂结合SpyCas9的Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335、Arg976和Arg1333中的一个或多个。

8.根据权利要求6或7所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂通过模拟PAM而阻断SpyCas9对dsDNA底物的识别和/或结合。

9.一种抑制SpyCas9的基因编辑活性的方法，所述方法包括提供权利要求6至8中任一项所述的抑制剂。

10.一种SpyCas9突变体，所述SpyCas9突变体相对于野生型SpyCas9在选自第1108、1109、1216、1200、1335、976和1333中的一个或多个氨基酸位点具有突变；

优选地，所述SpyCas9突变体相对于野生型SpyCas9具有选自以下突变中的一个或多个：S1216T、S1216R、R1333Y、R1333H、R1335Y、S1109R、K1200Y。