CN1793374A - 一种t载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T载体及其制备方法。该制备T载体的方法，包括以下步骤：1)构建前T载体；所述前T载体是将两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的互补双链DNA片段插入pBluescriptII KS(－)、pUC18、pUC19、pBR322等质粒的多克隆位点，得到前T载体；所述N＝A或T或C或G。2)用XcmI酶切步骤1)得到的前T载体，得到T载体。该载体可有效进行T－A克隆，连接效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种T载体及其制备方法。
背景技术
在分子生物学及基因工程研究领域中，PCR已经成为一种最常用的技术手段，PCR产物的克隆是进行进一步工作的一个重要环节。在PCR反应过程中，由于Taq DNA聚合酶的特点，PCR产物通常带有3’突出的A(Clark，J.M.1988.Nucleic AcidsRes.16：9677-9686)，因此T-A克隆成了最常用的手段。
目前，T载体的制备主要三种方法：其一是在只含有dTTP的条件下，将线性化的平末端载体与Taq酶温育，在不存在dATP的情况下，Taq酶可在线性片段的平滑末端的3’末端加上T，从而制成T载体(Marchuk，D.et al.1991.Nucleic AcidsRes.19：1154)；其二是在ddTTP的条件下，将平末端线性载体与末端转移酶温育，由于ddTTP缺少3’-OH，末端转移酶只能在3’末端加一个T，因而也可成为T载体(Holton，T.A.& Graham，M.W.1991.Nucleic Acids Res.19：1156)。以上两种方法制备T载体的质量难以控制，通常只有专业的公司进行生产。第三种方法是在载体中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶消化产生一个突出的3’-T的线性载体。可用的内切酶有XcmI(Jo，C.& Jo，S.A.2001.Plasmid 45：37-40)、AhdI(Jeung，J.U.et al.2002.Plasmid 48：160-163)等，相比前两种方法，内切酶法简便易行，无需特殊技术设备，可在普通实验室中制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种T载体及其制备方法。
本发明所提供的制备T载体的方法，包括以下步骤：
1)构建前T载体；所述前T载体是将两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的互补双链DNA片段插入pBluescriptII KS(-)、pUC18、pUC19、pBR322等质粒的多克隆位点，得到前T载体；
所述N为A或T或C或G；
2)用XcmI酶切步骤1)得到的前T载体，得到T载体。
所述两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的DNA片段最小为30bp(两个XcmI识别位点)，最大是质粒可容纳的DNA长度。
所述多克隆位点可为pBluescriptII KS(-)的EcoRV、SmaI、HincII、PstI、XbalI等识别位点。
所述两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的互补双链DNA片段为用正向引物和反向引物PCR扩增得到；所述正向引物的自5′端的第1位至第16位脱氧核苷酸为5′NCCANNNNTNNNNTGG3′；所述反向引物的自5′端的第1位至第15位脱氧核苷酸为5′CCANNNNTNNNNTGG3′；
所述N为A或T或C或G。
所述正向引物的自5′端的第1位至第16位脱氧核苷酸可为序列表中的序列1；所述反向引物的自5′端的第1位至第15位脱氧核苷酸为可序列表中的序列2。
所述正向引物具体可为序列表中的序列3；所述反向引物具体可为序列表中的序列4；所述PCR扩增的模板可为pBI121。
所述T载体可为如图3所示的pBSm-T。
含有本发明所述的T载体、前T载体的细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明采用在克隆载体pBluescriptII KS(-)(Genebank Accession No.X52329)的多克隆位点中引入一对XcmI识别位点，制成前T载体，再通过XcmI完全酶切前T载体的方法，制备可有效进行T-A克隆的T载体，通过T-A克隆连接效率实验表明该载体的连接效率在96％以上。本发明构建的T载体可有效应用于基因工程领域。
附图说明
图1为前T载体的物理图谱
图2为前T载体经XcmI完全酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱
图3为T载体pBSm-T的物理图谱
图4为T载体多克隆位点处的序列图谱
具体实施方式
下述实施例中的方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、T载体的制备
(1)前T载体的构建：
设计一对引物P1：G
CCAAGGATCCAATGGGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAA和P2：CCAACACTCGAGTGGGAAACACGGATGATCTCGC(下划线处为XcmI酶识别位点)，以质粒pBI121(Genebank Accession No.AF485783)为模板，进行PCR扩增反应。PCR程序为：先94℃5分钟；再94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，共30个循环；最后72℃ 10分钟。反应体系为：10×反应buffer 5μl，模板1ng，引物(10μM)各1μl，dNTP(10mM)1μl，Pfu DNA聚合酶2.5U，总体积50μl。扩增得到1097bp的DNA片段，回收后，与经EcoRV完全酶切的pBluescriptII KS(-)片段连接，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基上筛选转化子，提取质粒测序表明得到了含有卡那霉素抗性基因的pBluescriptII KS(-)质粒，将其命名为前T载体(图1)。其特点是在pBluescriptII KS(-)的多克隆位点中间插入了一段两端为XcmI位点的卡那霉素抗性基因(nptII)。
(2)T载体的获得：将前T载体用XcmI(购自NEB公司)完全酶切，反应体系为：5μg前T载体，10U XcmI，5μl 10×buffer2(NEB)，总体积50μl，37℃反应12小时。电泳检测酶切完全后，回收3kb的片段。酶切结果如图2所示，图2中泳道1为1kb分子量标记；泳道2为前T载体经XcmI酶切的电泳结果。回收的3kb片段测序结果表明该片段即为T载体-pBSm-T(图3、图4)。该T载体保留了原克隆载体的基本酶切位点，同时引物设计时在P1的5’端增加了一个碱基(G)，当由于各种原因(如长期保存、反复冻融等)造成T末端缺失，载体自连的情况下，该载体仍保持了半乳糖苷酶基因(lacZ)的阅读框架，可方便地用蓝白斑筛选去掉自连载体。
2、T-A克隆连接效率实验
用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，Fjellstrom RG，Elliott LF.，A rapidone-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses.NucleicAcids Res.1995 Jul 11；23(13)：2569-70.)提取水稻基因组DNA。以水稻基因组DNA为模板，P1：5’-TGGTGGTCAGTAATCAGCCAGTT -3，P2：5’-ATGCATCTAGTATTTATAGTCCTGAGCTTACTTA-3’为引物，用Taq DNA聚合酶进行扩增，得到1.6kb的PCR产物，将回收的200ng的PCR产物与50ng的pBSm-T载体连接，反应体系10μl，含有250U T4DNA ligase(购自Takara公司)，1μl 10×buffer(Takara)。室温放置1hr，然后4℃ 12小时。连接产物按照常规方法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在100mg/L氨苄青霉素的存在下，蓝白斑筛选转化子，挑取白斑提取质粒分析，重复上述步骤三次，通过此三次重复实验计算阳性率，三次重复实验结果如表1所示。
表1 T-A克隆连接效率实验结果
| 重复组号 | 白斑数(阳性) | 蓝斑数 | 阳性率 |
| 1 | 50(49) | 0 | 98％ |
| 2 | 48(48) | 2 | 96％ |
| 3 | 49(48) | 1 | 96％ |
表1表明本发明制备的T载体具有很高的T-A克隆效率。
序列表
<160>4
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(1)
<223>n＝g或a或t或c
<400>1
nccaaggatc caatgg 16
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ccaacactcg agtgg 15
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(1)
<223>n＝g或a或t或c
<400>3
nccaaggatc caatggggta ctaaaacaat tcatccagta a 41
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ccaacactcg agtgggaaac acggatgatc tcgc 34
Claims (10)
1、一种制备T载体的方法，包括以下步骤：
1)构建前T载体；所述前T载体是将两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的互补双链DNA片段插入pBluescriptII KS(-)、pUC18、pUC19或pBR322的多克隆位点，得到前T载体；所述N为A或T或C或G；
2)用XcmI酶切步骤1)得到的前T载体，得到T载体。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的DNA片段长度最少为30bp。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多克隆位点为pBluescriptIIKS(-)的EcoR V、Sma I、Hinc II、Pst I或Xbal I。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述两末端均为反向重复的5′CCANNNNTNNNNTGG3′的互补双链DNA片段为用正向引物和反向引物PCR扩增得到；所述正向引物的自5′端的第1位至第16位脱氧核苷酸为5′NCCANNNNTNNNNTGG3′；所述反向引物的自5′端的第1位至第15位脱氧核苷酸为5′CCANNNNTNNNNTGG3′；所述N为A或T或C或G。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述正向引物的自5′端的第1位至第16位脱氧核苷酸为序列表中的序列1；所述反向引物的自5′端的第1位至第15位脱氧核苷酸为序列表中的序列2。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述正向引物为序列表中的序列3；所述反向引物为序列表中的序列4；所述PCR扩增的模板为pBI121。
7、由权利要求1-6中任一所述的方法制备的T载体。
8、根据权利要求7所述的载体，其特征在于：所述T载体为如图3所示的pBSm-T。
9、由权利要求1-6中任一所述的方法制备的前T载体。
10、含有权利要求7或8所述的T载体、权利要求9所述的前T载体的细胞系和宿主菌。
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| CN106399348A (zh) * | 2016-10-26 | 2017-02-15 | 南京师范大学 | 一种新型基因克隆t‑载体及其构建方法和应用 |
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