CN101948862A - 一种构建t载体的方法 - Google Patents

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本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种构建T载体的方法。该方法以pGEM-T Easy Vector、pBS-T Vector、pSURE-T Vector为出发载体与Xcm I盒连接得到前T载体，然后用Xcm I限制性内切酶酶切前T载体，回收线性化载体，得到T载体，所述Xcm I盒序列包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位点序列和Xcm I酶切位点序列5′端的3个保护碱基。本发明所述构建T载体的方法简单高效，所获得的T载体质量稳定，自身环化率低，克隆效果高，并且可以避免3n+2个核苷酸的cDNA序列在基因表达时发生移码。

Description

一种构建T载体的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种构建T载体的方法。
背景技术
PCR是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增和分离已知或未知的特异性DNA片段。将PCR产物快速有效的克隆到质粒载体上是进行高质量测序、体外转录及体外翻译等实验，实现PCR产物多种用途的前提。通常PCR产物不具有粘端，只能进行平端连接的克隆，由于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，进行PCR扩增时，在PCR产物3′末端会以非模板依赖的方式加上一个腺苷酸残基(A)。T载体作为一种方便的PCR产物克隆载体，因其3′末端带有突出的胸腺核苷酸(T)，可直接与PCR扩增产物3′末端突出的A碱基配对，因此在基因克隆方面应用十分广泛。
目前T载体售价大多偏高，1微克国外公司开发产品的售价大都在700元到800元左右，国内几家公司开发的产品，售价也在200元以上，而且存在连接效率低、连接不稳定等缺陷。因此制备高质量、稳定、价廉的T载体是广大分子生物学研究者关心的问题，也是生物试剂厂商感兴趣的业务之一。
目前T载体的构建方法主要是用产生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)在质粒DNA多克隆位点处切开，利用Taq DNA聚合酶非模板扩增特性在线性质粒两条链的3′端添加dT制成T载体，如Promega和TaKaRa公司的产品，以及国内几家公司的产品。但是由于3′端加T为非优先聚合核苷酸，仅部分的3′端可添加T，或者添加一个以上T，造成载体在克隆过程中自身环化率较高，而且连接不稳定，筛选阳性克隆的难度增加。另外该方法生产的T载体步骤比较繁琐，每次生产T载体产量有限、质量不稳定、批次间质量差异大、不适合大规模生产，并且因价格昂贵，无法进行循环使用，在普及上存在一定困难。
发明内容
本发明目的是提供一种简单高效的构建T载体的方法，利用该法所获得的T载体质量稳定，克隆效果高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位点的基因序列的定向克隆，并且可避免3n+2个核苷酸的cDNA序列克隆表达移码。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种构建T载体的方法，包括：
步骤1：出发载体与Xcm I盒连接，得前T载体；
步骤2：Xcm I限制性内切酶酶切步骤1所得前T载体，回收线性化载体，得到T载体；
其中，所述出发载体为pGEM-T Easy Vector、pBS-T Vector、pSURE-TVector，所述Xcm I盒序列包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位点序列和XcmI酶切位点序列5′端的3个保护碱基。
本发明所述构建T载体的方法是利用限制性酶切法原理，利用限制性内切酶特异性在出发载体质粒的多克隆位点引入Xcm I的酶切位点，然后用XcmI限制性内切酶酶切产生3′端具有单个T突出的线性T载体。
由限制性内切酶酶切产生的T载体具有酶切产量高、质量稳定、易于操作等特点，然而由于Xcm I经常会发生酶切不完全的现象，因此会造成较高背景的假阳性。为了提高克隆效率，减少假阳性，需要把完全酶切的质粒从部分酶切的产物中纯化出来，但是由于完全酶切和部分酶切的质粒在琼脂糖凝胶上的大小相差不大而不容易分开。本发明在出发载体的多克隆位点引入一个足够长的间隔序列，以便能很容易区分完全酶切和部分酶切的片段，所述间隔DNA序列是用两条含有Xcm I酶切位点和Xcm I酶3个保护碱基的引物扩增得到的足够在琼脂糖凝胶上区分完全酶切和部分酶切的片段大小的任意序列。
其中，作为优选，步骤1所述出发载体与Xcm I盒用T4DNA连接酶连接。
作为优选，所述保护碱基为ATC。
作为优选，所述间隔DNA序列为长度为500-2000bp的DNA序列。
更优选地是，所述间隔DNA序列为以pUC19质粒为模板扩增的DNA序列。
作为优选，所述Xcm I盒序列正义链为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
更优选地是，所述Xcm I盒序列为用具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的下游引物扩增的DNA序列。
本发明所述构建T载体的方法，所述附加序列包括Xcm I酶切位点序列和Xcm I酶切位点序列5′端的3个保护碱基，所述Xcm I酶切位点序列为5′-CCANNNNTNNNNTGG-3′，其5′端与Xcm I酶的3个保护碱基相连，N可以为A、T、C、G中的任意一个。当Xcm I盒与出发载体连接时，所述Xcm I盒序列的5′端和3′端分别与出发载体的3′端和5′端连接，形成环状质粒。Xcm I限制性内切酶酶切后，间隔DNA序列和两侧的NNNNTGG序列被切除，Xcm I酶的3个保护碱基和Xcm I酶切位点序列中的CCANNNNT序列仍连接在载体上，形成3′端具有单个T突出的线性T载体。构建的T载体与出发载体相比，3′端增加了Xcm I酶的3个保护碱基和Xcm I酶切位点序列中的CCANNNNT序列，共11bp。当3n+2个核苷酸的cDNA序列与利用本发明所述构建T载体的方法构建的T载体连接时，3′端单个突出T与cDNA序列中的A相连，当构建入表达载体时，因为3n+2个核苷酸的cDNA序列5′端引入了11bp核苷酸，使3n+2个核苷酸的cDNA序列避免移码，基因正常表达。
本发明所述构建T载体的方法简单高效，利用该法所获得的T载体不仅具备出发载体的优点，还包含出发载体的不同多克隆位点，而且质量稳定、自身环化率低、克隆效果高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位点的基因序列的定向克隆，极大地方便了PCR产物的克隆，并且可以避免3n+2个核苷酸的cDNA序列在基因表达时发生移码。
附图说明
图1示含有Xcm I酶切位点的两引物以pUC19质粒为模板进行PCR，所获产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为500bp左右的目的条带，泳道M为DL2000DNA Marker。
图2示用Xcm I酶切所获得的前T载体pGM-T载体和pBS-T载体后进行1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1-3为pGM-T载体酶切结果，泳道4-6为pBS-T载体酶切结果，3.0kb左右的条带即为线性化的载体。
图3示本发明所述构建T载体的方法构建的pGM-T1载体与长度为750bp的目的片段连接后，对转化克隆进行菌落PCR鉴定，所获产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为以含有750bp目的片段的质粒做模板扩增的PCR产物，泳道2-6为随机挑选5个连接有750bp片段的pGM-T1载体的单菌落作为模板扩增的PCR产物。
图4示为含有目的片段的单菌落的质粒用EcoR I进行酶切鉴定的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1、3为含有目的片段的质粒酶切鉴定结果，泳道2为以含有750bp目的片段的质粒做模板扩增的PCR产物。
图5示本发明所述构建T载体的方法构建的pBS-T 1载体和pSURE-T 1载体连接长度为1600bp的目的片段后对目的片段进行菌落PCR鉴定，所获产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。泳道1、9为分别以不含目的片段的空质粒pBS-T 1和pSURE-T 1为模板扩增的结果；泳道2、16为以含有1600bp目的片段的质粒做模板扩增的PCR产物，泳道3-8为随机挑选6个连接有1600bp片段的pBS-T 1载体的单菌落作为模板扩增的PCR产物；泳道10-15为随机挑选6个连接有1600bp片段的pSURE-T 1载体的单菌落作为模板扩增的PCR产物。
图6示本发明所述构建T载体的方法构建的pGEM-T 1载体的图谱。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种构建T载体的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种构建T载体的方法，包括：
步骤1：出发载体与Xcm I盒连接，得前T载体；
步骤2：Xcm I限制性内切酶酶切步骤1所得前T载体，回收线性化载体，得到T载体；
其中，所述出发载体为pGEM-T Easy Vector、pBS-T Vector、pSURE-TVector，所述Xcm I盒序列包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位点序列和XcmI酶切位点序列5′端的3个保护碱基。
其中，作为优选，步骤1所述出发载体与Xcm I盒用T4DNA连接酶连接。
作为优选，所述保护碱基为ATC。
作为优选，所述间隔DNA序列为长度为500-2000bp的DNA序列。
更优选地是，所述间隔DNA序列为以pUC19质粒为模板扩增的DNA序列。
作为优选，所述Xcm I盒序列正义链为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
更优选地是，所述Xcm I盒序列为用具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的下游引物扩增的DNA序列。
本发明所述构建T载体的方法简单高效，利用该法所获得的T载体不仅具备出发载体的优点，还包含出发载体的不同多克隆位点，而且质量稳定、自身环化率低、克隆效果高，不但能用于TA克隆，也可用于引物中含有Xcm I酶切位点的基因序列的定向克隆，极大地方便了PCR产物的克隆，并且可以避免3n+2个核苷酸的cDNA序列在基因表达时发生移码。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的构建T载体的方法进行详细说明。
实施例1：Xcm I盒的制备
以pUC19质粒做模板，用具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的下游引物扩增，进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为：
10×taq buffer(with 1.5mM Mg2+)        5μl
10mM dNTP                              1μl
10μM的上游引物                        1μl
10μM的下游引物                        1μl
pUC 19质粒(20ng/μl)                   1μl
Taq酶(5U/μl)                          0.5μl
加入灭菌蒸馏水补足体系总量50μl。
PCR反应程序为：
94℃预变性                             3min
Figure BSA00000270614200061
72℃延伸                               10min
所得PCR产物取5μl，1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。
实施例2：前T载体的制备
对实施例1所得PCR产物进行纯化回收，回收后的产物分别与pGEM-T Easy Vector(Promega公司)、pBS-T Vector(原平皓生物)、pSURE-T Vector(原平皓生物)在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，转化后的细胞铺在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选。对筛选到的阳性克隆提取质粒，酶切鉴定含有500bp左右目的片段的质粒即为前T载体。
实施例3：T载体的制备
用Xcm I酶切实施例2所得前T载体，结果见图2。载体pGEM-T、pBS-T和pSURE-T大小分别为3037bp、3022bp和2773bp，因此3000bp左右的条带即为线性化的载体。回收线性化的载体，制得T载体pGEM-T 1、pBS-T 1、pSURE-T 1。
实施例4：本发明所述构建T载体的方法构建的T载体的克隆效率检测
为了检测本发明所述构建T载体的方法构建的T载体的克隆效率，用本发明构建的pGM-T 1载体连接长度为750bp的目的片段，连接产物转化TOP10感受态细胞，转化后的细胞铺在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选。然后随机挑选5个阳性单菌落，用扩增750bp目的片段的引物进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图3。对菌落PCR鉴定含有750bp目的片段的菌落用含有氨苄青霉素的液体LB培养基进行摇培，提取质粒，然后用EcoR I进行酶切鉴定，鉴定结果见图4。
由图3可知，本发明所述构建T载体的方法构建的pGM-T 1载体与目的片段连接、转化，随机挑选的5个阳性单菌落经过菌落PCR鉴定都含有750bp大小的目的片段。由图4可知，经过EcoR I酶切鉴定，含有目的片段的菌落的质粒都为阳性克隆，表明本发明所述构建T载体的方法构建的pGM-T 1载体克隆效率高。
实施例5：本发明所述构建T载体的方法构建的T载体的克隆效率检测
为了检测本发明所述构建T载体的方法构建的T载体的克隆效率，用本发明构建的pBS-T 1和pSURE-T 1载体连接长度为1600bp的目的片段，连接产物转化TOP10感受态细胞，转化后的细胞铺在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选。然后分别随机挑选5个阳性单菌落，用扩增1600bp目的片段的引物进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图5。
由图5可知，本发明所述构建T载体的方法构建的pBS-T 1和pSURE-T 1载体与目的片段连接、转化，随机挑选的5个阳性单菌落经过菌落PCR鉴定都含有1600bp大小的目的片段，表明本发明所述构建T载体的方法构建的pBS-T 1和pSURE-T 1载体克隆效率高。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Figure ISA00000270614400011
Figure ISA00000270614400012

Claims (7)

1.一种构建T载体的方法，包括：
步骤1：出发载体与Xcm I盒连接，得前T载体；
步骤2：Xcm I限制性内切酶酶切步骤1所得前T载体，回收线性化载体，得到T载体；
其中，所述出发载体为pGEM-T Easy Vector、pBS-T Vector、pSURE-TVector，所述Xcm I盒序列包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个附加序列，所述附加序列包括Xcm I酶切位点序列和XcmI酶切位点序列5′端的3个保护碱基。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述出发载体与Xcm I盒用T4DNA连接酶连接。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保护碱基为ATC。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述间隔DNA序列为长度为500-2000bp的DNA序列。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述间隔DNA序列为以pUC19质粒为模板扩增的DNA序列。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述Xcm I盒序列正义链为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述Xcm I盒序列为用具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的下游引物扩增的DNA序列。
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