CN1523110A

CN1523110A - 小麦糖原合成酶激酶基因

Info

Publication number: CN1523110A
Application number: CNA031432859A
Authority: CN
Inventors: 沈银柱; 黄占景; 马闻师; 陈桂平; 徐涛
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2003-09-09
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2004-08-25

Abstract

本发明通过利用cDNA－AFLP技术将小麦耐盐突变体盐胁迫下特异表达片段克隆、序列测定Blast检索和RACE方法获得小麦糖原合成酶激酶基因。该基因全长1573bp，其中开放阅读框(ORF)含1143bp，编码381个氨基酸，它编码的蛋白广泛参与了植物对干旱、ABA诱导、光诱导等的应答反应，特别是其参与了盐胁迫信号传导过程，将该基因克隆入原核表达载体，可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为43.6KD的原核表达产物即糖原合成酶激酶蛋白。本发明为进一步研究小麦耐盐机理，提高小麦耐盐性，扩大作物在盐碱地的种植面积奠定了基础。

Description

小麦糖原合成酶激酶基因

技术领域

本发明涉及的是小麦糖原合成酶激酶TaGSK1(Triticum asetivum Glycogen SynthaseKinase1)基因，属于生命科学技术领域。

背景技术

研究表明，影响农作物生长和产量的最主要因素是环境胁迫，其中又以盐胁迫和干旱胁迫最为严重。据统计，1939～1978年间，影响作物产量的各种环境因素中干旱和盐碱造成的减产高达40％以上。我国的盐渍土壤约5亿亩，其中盐渍耕地1亿多亩，还有3亿多亩盐渍荒地有待开垦利用，次生盐碱化土壤面积还在继续扩大，给农业生产造成重大损失。如何减轻盐胁迫对农业生产的影响，从而使大面积的盐碱地、荒漠化土地和丰富的盐水资源可以为农业生产所利用，这是未来农业发展所面临的一个重要课题。早在1980年Embi et al和1990年Woodgett发现酵母甘油合成酶激酶GSK3是一种糖原合成酶激酶以来，1999年Piao.H.L发现GSK3参与了植物的一系列发育过程，他通过功能互补实验从拟南芥的cDNA中克隆了AtGSK1(编码GSK3/shaggy-like蛋白激酶)这一激酶受NaCl和ABA诱导，其活性与盐胁迫呈正相关。之后在植物中发现的蛋白激酶多为信号传导过程中的重要组成部分，其作用也表现在植物生长发育过程的许多方面。大量研究表明蛋白激酶广泛参与了植物对干旱、盐胁迫、ABA诱导、光诱导等的应答反应。2000年Zhu J-K利用拟南芥敏盐突变体，经研究提出盐胁迫下的SOS信号传递途径，指出蛋白激酶参与了盐胁迫信号传导过程，提高了植物的耐盐性。

发明内容

鉴于目前对糖原合成酶激酶的研究证明GSK3与盐胁迫下的信号传导密切相关，本发明的目的在于从小麦耐盐突变体中分离、克隆该基因，为进一步研究小麦耐盐机理，扩大作物在盐碱地的种植面积打下基础。

为了实现本发明的目的，我们从1987年开始利用濮农3665与百农3039杂交后的F₁花药培养，EMS诱变、耐盐性反复筛选，从同一单粒的后代中得到小麦耐盐突变体RH8706-49(耐盐指数≥1.3)和敏盐突变体H8706-34(耐盐指数≤0.5)，已稳定遗传12代。最初我们从小麦耐盐突变体中获得糖原合成酶激酶基因经过如下步骤：

①利用这两个材料，分别在一定条件下水培至二叶一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系分别加入0％的NaCl和1％的NaCl胁迫处理72小时，以每一品系0％NaCl处理为对照，届时分别取4个处理的第二叶迅速液氮冷冻提取总RNA。

②分别用上述4个处理的总RNA反转录得到cDNA第一链，用SMART cDNA LibraryConstruction kit(Clontech，USA)合成cDNA第2条链。

③用PstI/Mse1酶切、加接头预扩增后，将其稀释作为cDNA-AFLP的模板，然后用r³²-dATP标记Pst1引物，经各种不同引物组合(Pst1+3/Mse1+2)PCR扩增，采用6％测序胶分离产物，X光片曝光(图1)，从胶上切取差异表达的基因片段，再用相同的引物进行二次扩增，所得产物克隆到T载体上，转化大肠杆菌(Ecoli)DH5α，提取质粒DNA，经CEQ1000-DNA序列测定仪测序，将测序结果通过Intrnet进行Blast检索，发现第25号片段是小麦耐盐突变体RH8706-49盐胁迫下特异表达的片段，并与玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三叶草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相应部分相比，同源性分别达到80％、72％、72％，见图2所示。

④提取RH8706-49总RNA，然后转膜，用放射性同位素标记的25号片段(TaGSK1)作探针，进行Northern杂交验证。

⑤以上述25号片段为基础，采用5′RACE和3′RACE得到了TaGSK1两端序列，经Northern杂交验证后，据此设计引物

5′端引物I 5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′

3′端引物II 5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′

由北京赛百盛基因技术有限公司合成该特异引物，采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，按照常规方法在美国MJ Research，Inc，PTC-100^TMPCR扩增仪上，以小麦耐盐突变体RH8706-49的双链cDNA为模板进行扩增：94℃预变性3min，而后94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环后，72℃保温10min。经1％Agarose电泳后，将该扩增片段(1.56Kb)回收加A尾，连接重组于P^GEM-T质粒转化大肠杆菌DH5α，通过快速PCR法筛选出阳性克隆，得到重组子p^D-T23，经质粒DNA电泳和酶切电泳鉴定后菌液送往日本TaKaRa生物技术公司测序，结果见图3。

该基因全长1573bp，其中开放阅读框(ORF)含1143bp，编码381个氨基酸，该蛋白的分子量为43.6KD，pI为8.66。我们将其命名为TaGSK1(Triticum asetivum GlycogenSynthase Kinas1)并在Gen Bank进行了登录，登录号为AF525086。说明该基因为小麦中新发现的一个基因。该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如图3所示。

该基因的分离方法如下：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的基因组DNA

(2)根据TaGSK1两端序列设计特异引物

5′端引物I：5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′

3′端引物II：5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′

(3)PCR扩增

采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，以小麦耐盐材料RH8706-49的基因组DNA(用时稀释50×)为模板进行PCR扩增。

①反应体系：(在0.5ml EP管中依次加入以下成份)

SDW(无菌去离子水) 22μl

10×Pfu buffer 5μl

dNTP 4μl

引物I 4μl

引物II 4μl

dscDNA 10μl

Pfu酶 1μl

Total volume 50μl

②轻弹管底混合样品，稍事离心。

③在美国MJ Research，Inc，PTC-100^TMPCR扩增仪上按下列程序进行扩增：94℃预变性3min，[94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s]×30个循环后，72℃保温10min。

(4)将上述50μl PCR产物在1％Agarose/EB胶上电泳，结果见图4。照相后将特异扩增片段(1.56Kb)在紫外灯下切下，产物回收按回收试剂盒提供的步骤进行。

(5)扩增产物的加(A)尾反应：(在0.5mlEP管中依次加入以下成份)

PCR回收产物 6μl

10×buffer(with Mgcl₂) 1μl

dATP 1μl

Taq酶 2μl

Total volume 10μl

将混合物轻弹、混匀后，于70℃水浴15-30min。

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应(见图5)：

Buffer(2×) 5μl

T-vecter 0.8μl

PCR产物(加A尾) 3.2μl

T₄DNA ligase 1μl

Total volume 10μl

混匀后离心，4℃反应过夜。

(7)大肠杆菌感受态细胞的制备(按1989 Sambrook et al.CaCl₂方法制备)

(8)用上述载有特异扩增产物TaGSK1的T载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。

(9)通过兰白斑筛选鉴定转化子(重组子)提取转化子质粒DNA，用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆(见图6)。

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海博亚公司测序，将结果与最初由小麦耐盐突变体RH8706-49双链cDNA中得到的序列进行比较，结果完全一致，既说明实验的可靠性又说明该基因在小麦的DNA中无内含子。

附图说明

图1是典型的cDNA-AFLP选扩结果图。

图2给出的是小麦糖原合成酶激酶基因的部分氨基酸序列与玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三叶草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相应氨基酸序列的比较图。

图3是小麦糖原合成酶激酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列图。

图4是小麦糖原合成酶激酶基因DNA PCR扩增结果图。

图5是小麦糖原合成酶激酶基因的克隆过程图。

图6为重组子的扩增鉴定结果图。

具体实施方式

下列实施例用以说明本发明。

实施例

本发明提供的小麦糖原合成酶激酶基因全长1573bp，其中开放阅读框(ORF)含1143bp，编码381个氨基酸，它编码的蛋白，广泛参与了植物对干旱、盐胁迫、ABA诱导、光诱导等的应答反应，特别是其参与了盐胁迫信号转导过程。将该基因克隆入原核表达载体，可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为43.6KD的原核表达产物即糖原合成酶激酶蛋白。

上述糖原合成酶激酶基因及其表达产物，可由以下步骤获得：

利用濮农3665与百农3039杂交后的F1花药培养，EMS诱变、耐盐性反复筛选从同

一单粒的后代中得到小麦耐盐突变体RH8706-49(耐盐指数≥1.3)和敏盐突变体H8706-34(耐盐指数≤0.5)，经过如下步骤：①利用这两个材料，分别在一定条件下水培至二叶一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系分别取4个处理的第二叶迅速液氮冷冻提取总RNA。

③用PstI/Mse1酶切、加接头预扩增后，将其稀释作为cDNA-AFLP的模板，然后用r³²-dATP标记Pst1引物，经各种不同引物组合(Pst1+3/Mse1+2)PCR扩增，采用6％测序胶分离产物，X光片曝光(见图1)，从胶上切取差异表达的基因片段，再用相同的引物进行二次扩增，所得产物克隆到T载体上，转化大肠杆菌(Ecoli)DH5α，提取质粒DNA，经CEQ1000-DNA序列测定仪测序，将测序结果通过Intrnet进行Blast检索，发现第25号片段是小麦耐盐突变体RH8706-49盐胁迫下特异表达的片段，并与与玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三叶草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相应部分相比，同源性分别达到80％、72％、72％，见图2所示。

⑤以上述25号片段为基础，采用5′RACE和3′RACE得到了TaGSK1两端序列，经Northern验证后，据此设计引物

5′端引物I 5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′

3′端引物II 5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′

由北京赛百盛基因技术有限公司合成该特异引物，采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，按照常规方法在美国MJ Research，Inc，PTC-100^TMPCR扩增仪上，以小麦耐盐突变体974915(RH8706-49)的双链cDNA为模板进行扩增：94℃预变性3min，而后94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环后，72℃保温10min。经1％Agarose电泳后，将该扩增片段(1.56Kb)回收加A尾，连接重组于P^GEM-T质粒转化大肠杆菌DH5α，通过快速PCR法筛选出阳性克隆，得到重组子P^D-T23，经质粒DNA电泳和酶切电泳鉴定后菌液送往日本TaKaRa生物技术公司测序，结果见图3。

上述糖原合成酶激酶基因及其表达产物，还可由以下简单步骤获得：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的基因组DNA

(2)根据TaGSK1两端序列设计特异引物

5′端引物I：5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′

3′端引物II：5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′

(3)PCR扩增

(4)将上述PCR产物在1％Agarose/EB胶上电泳回收完整的扩增产物。

(5)扩增产物的加(A)尾反应：

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应

(7)制备大肠杆菌感受态细胞。

(9)通过兰白斑筛选鉴定转化子(重组子)提取转化子质粒DNA，用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海博亚公司测序，将结果与最初由小麦耐盐突变体RH8706-49双链cDNA中得到的序列进行比较，

Claims

1、一种小麦糖原合成酶激酶基因，其特征是其可以编码糖原合成酶激酶、参与植物盐胁迫信号传导过程的蛋白质的功能，该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如下：

1 GTT GGT GTG GTG CGT CCT TCC TCG CGC TTT CAG AAC GAG ACG AGT ACT AGT GGT GAT GCC 60

61 GAC CGA CTT CCG AAC GAG ATG GGC AAT ATG AGC ATA AGG GAT GAG AGG GAC CCT GAG GAT 120

1 M G N M S I R D D R D P E D 14

121 ATA GTA GTC AAC GGC AAT GGG ACG GAA CCA GGC CAT ATT ATA GTC ACA AGC ATT GAG GGA 180

15 I V V N G N G T E P G H I I V T S I E G 34

181 AGA AAT GGG CAA GCA AAA CAG ACC ATT AGC TAC ATG GCT GAG CGT GTG GTT GGT AAT GGG 240

35 R N G Q A K Q T I S Y M A E R V V G N G 54

241 TCA TTT GGA ACT GTT TTC CAG GCT AAG TGT CTT GAA ACT GGC GAG ACG GTG GCT ATA AAG 300

55 S F G T V F Q A K C L E T G E T V A I K 74

301 AAG GTT CTT CAA GAC AAG AGA TAT AAG AAC CGT GAG CTG CAA ACG ATG CGA GTT CTT GAC 360

75 K V L Q D K R Y K N R E L Q T M R V L D 94

361 CAC CCA AAT GTT GTG GCT TTA AAG CAT TGT TTT TTC TCA AAG ACT GAG AAA GAG GAG CTT 420

95 H P N V V A L K H C F F S K T E K E E L 114

421 TAC CTC AAC CTG GTG CTT GAG TAT GTG CCG GAG ACT GCT CAT CGT GTC ATT AAG CAT TAT 480

115 Y L N L V L E Y V P E T A H R V I K H Y 134

481 AAC AAG ATG AAC CAA CGC ATG CCA TTG ATA TAT GCA AAA CTG TAC ATG TAT CAG ATA TGT 540

135 N K M N Q R M P L I Y A K L Y M Y Q I C 154

541 AGA TCT TTG GCA TAC ATT CAC AAC AGC ATT GGA GTA TGC CAC AGA GAC ATC AAG CCT CAA 600

155 R S L A Y I H N S I G V C H R D I K P Q 174

601 AAT CTT CTG GTG AAT CCA CAT ACG CAC CAA TTG AAA TTA TGT GAC TTC GGA AGT GCG AAA 660

175 N L L V N P H T H Q L K L C D F G S A K 194

661 GTG TTG GTA AAA GGA GAA CCA AAT ATT TCC TAT ATC TGT TCA AGG TAC TAT AGA GCC CCA 720

195 V L V K G E P N I S Y I C S R Y Y R A P 214

721 GAG CTC ATA TTT GGT GCT ACT GAA TAC ACA ACG GCA ATT GAC GTT TGG TCT GCT GGC TGT 780

215 E L I F G A T E Y T T A I D V W S A G C 234

781 GTT CTT GCT GAA CTC CTT CTA GGA CAG CCT ATA TTC CCT GGC GAC AGT GGT GTT GAT CAG 840

235 V L A E L L L G Q P I F P G D S G V D Q 254

841 CTT GTT GAA ATC ATC AAG GTT TTA GGT ACC CCT ACA AGA GAA GAA ATT AAG TGC ATG AAT 900

255 L V E I I K V L G T P T R E E I K C M N 274

901 CCA AAT TAT ACG GAG TTT AAA TTC CCA CAA ATC AAA GCT CAC CCA TGG CAC AAG ATC TTC 960

275 P N Y T E F K F P Q I K A H P W H K I F 294

961 CAT AAA AGA ATG CCT GCT GAA GCA GTA GAT CTT GTC TCC AGA CTC TTG CAA TAT TCA CCA 1020

295 H K R M P A E A V D L V S R L L Q Y S P 314

1021 AGC CTG CGT TCA ACT GCT TTG GAA GCA TTA ATT CAT CCA TTC TTC GAT GAA CTC CGG GAC 1080

315 S L R S T A L E A L I H P F F D E L R D 334

1081 CCA AAC ACC CGT TTG CCG AAC GGC CGT TTT CTT CCT CCC CTC TTT AAC TTT AAG CCC CAT 1140

335 P N T R L P N G R F L P P L F N F K P H 354

1141 GAG TTG AAG GGT GTG CCG ATG GAC ATC CTG GTG AAG CTC ATC CCT GAA CAT GCT CGG AAG 1200

355 E L K G V P M D I L V K L I P E H A R K 374

1201 AAC TGT GCC TTT GTA GGA TGG TGA TCC GCC AGA CGG CTG CTT GAA GTT TAG TTC AGA ACA 1260

375 N C A F V G W * 381

1261 AAT CCA GTT GTT GTC TAC TAG AAA CCC CAG GAG TTT GAG ATT GTC TGC AGC CAC ACG GGA 1320

1321 TAT AGG CGA TGA CAC ATG TGA TTA TTA TTC CTT TTC TCG TCC GAG ACC TCG ATG CCA TGT 1380

1381 ATT CTT TCC CCC TAC TGC CGA TGT AAC AAA CCA CCC ATG ATA CTG TAA GTA GAT GAG AAG 1440

1441 TGT TTC GAC CGT TTT CCC CTG AGC TCA TGT GCT ATG CAA TGA AGG ATG CAC CCT ATG TAC 1500

1501 CGC CAA TAT TTG GTC CAG TAT TTG TTC ATG GAT CGA GGC CCC CAA AAA AAA AAA AAA AAA 1560

1561 AAA AAA AAA AAA A 1573

上述基因全长1573bp，其中开放阅读框含1143bp，编码381个氨基酸，它编码的蛋白分子量为43.6KD，pI为8.66。

2、根据权利要求1所述的糖原合成酶激酶基因，其特征在于是从小麦耐盐突变体中分离得到的与其它植物中该基因序列同源性高于70％的同源基因。

3、含有权利要求1所述的糖原合成酶激酶基因的重组原核表达载体，其特征在于将糖原合成酶激酶基因克隆至原核表达载体后获得的原核表达载体。

4、含有权利要求1所述的糖原合成酶激酶基因编码的蛋白，其特征在于用原核表达载体转化大肠杆菌细胞，经诱导后表达出的糖原合成酶激酶蛋白。

5、根据权利要求1所述的糖原合成酶激酶基因，其特征在于它导入受体可用于耐盐作物品系的培育。

6、一种得到权利要求1所述的糖原合成酶激酶基因、或3所述的原核表达载体、或4所述的糖原合成酶激酶蛋白、或5所述的该基因的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的基因组DNA

(2)根据TaGSK1基因两端序列设计特异引物

5′端引物I：5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′

3′端引物II：5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′

(3)PCR扩增

采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，以小麦耐盐材料RH8706-49的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

(5)扩增产物的加(A)尾反应：

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应

(7)制备大肠杆菌感受态细胞。

(9)通过兰白斑筛选鉴定转化子提取转化子质粒DNA，用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海博亚公司测序，将结果与最初由小麦耐盐突变体RH8706-49双链cDNA中得到的序列进行比较。