CN1807628A - 一种小麦耐盐基因 - Google Patents

Abstract

本发明通过利用cDNA－AFLP技术所获得的G09－94号cDNA序列，在NCBI网站中经EST比对后进行电子克隆、设计引物、进行PCR、序列测定，获得小麦耐盐突变体盐胁迫下特异表达基因：小麦耐盐相关基因TaSC(Triticum asetivum L.Salt－tolerant Correlative)。该基因开放阅读框(ORF)含426bp，编码141个氨基酸，此基因编码的蛋白pI值为3.96，分子量为15.32KDa，有4个跨膜区和1个信号肽区，定位在质膜上，与一未知功能的假定膜蛋白同源性为82.2％，与另一未知功能的蛋白家族(UFP220)同源性达79.8％，其表达产物参与了多条信号转导途径，将上游反应信号转导到下游反应元件。本发明为进一步研究小麦耐盐机理，提高小麦耐盐性，扩大作物在盐碱地的种植面积提供了科学依据。

Description

一种小麦耐盐基因

技术领域

本发明涉及一种小麦耐盐基因TaSC(Triticum asetivum L.Salt-tolerant Correlative)，属于基因科学技术领域。

背景技术

研究表明，影响农作物生长和产量的最主要因素是环境胁迫，其中又以盐胁迫和干旱胁迫最为严重。据统计，1939～1978年间，影响作物产量的各种环境因素中干旱和盐碱造成的减产高达40％以上。我国的盐渍土壤约5亿亩，其中盐渍耕地1亿多亩，还有3亿多亩盐渍荒地有待开垦利用，次生盐碱化土壤面积还在继续扩大，给农业生产造成重大损失。如何减轻盐胁迫对农业生产的影响，从而使大面积的盐碱地、荒漠化土地和丰富的盐水资源可以为农业生产所利用，这是未来农业发展所面临的一个重要课题。

发明内容

鉴于目前对小麦耐盐相关基因的研究证明TaSC基因与盐胁迫下的信号传导密切相关，本发明的目的在于从小麦耐盐突变体中分离、克隆小麦耐盐基因，为进一步研究小麦耐盐机理，扩大作物在盐碱地的种植面积提供科学依据。

为了实现本发明的目的，本发明者从1986年开始利用濮农3665与百农3039杂交后的F1花药培养，EMS诱变、耐盐性反复筛选，从同一单粒的后代中得到小麦耐盐突变体RH8706-49(该两个生物材料保存在中国河北省农林科学院粮油作物研究所，公开文献见《遗传》1997年19卷，第六期，第7-11页，“诱发小麦花药愈伤组织及其再生植株抗盐性变异的研究”，作者：沈银柱等；《电子显微学报》2001年第20卷，第二期，98-101页“近似等位基因系小麦盐胁迫下叶绿体超微结构的比较研究”，作者：秘彩莉、黄占景、沈银柱等)，已稳定遗传15代。最初从小麦耐盐突变体中获得TaSC基因经过如下步骤：

①利用这两个材料，将种子消毒后，分别水培至二叶一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系分别加入0％的NaCl和1％的NaCl胁迫处理72小时，以每一品系0％NaCl处理为对照，届时分别取4个处理的第二叶迅速液氮冷冻提取总RNA；

②分别用上述4个处理的总RNA反转录得到cDNA；

③通过cDNA-AFLP技术获得如下cDNA序列：

tttaatggtcggaaaatctcgcggaagacagacgtaatagtccatacccatgtgtggtcctgtgtaaaaaaatatg

ttcattccagggcgggattacttggtgtccgtgtgtgcatagctgaccgcttcctgaaatggacccctagcatcag

tactacgtacctacgtgcgtgtttatcctaatttgttgtgagcttgtggtgcttggtggctcgagaggctagcatt

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将上述cDNA序列在NCBI网站中通过EST比对进行电子克隆，以获得全长cDNA序列，再以此cDNA序列进行Blastn和Blastx，验证是否具有完整的ORF区；

④根据获得的全长cDNA序列用DNAStar的Primer Select设计特异引物，并由上海生物工程公司合成。为方便后续操作，引物带上酶切位点：

5′端引物I：5′ TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG  3′(下划线为Xba I酶切位点)

3′端引物II：5′ GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下划线为Sac I酶切位点)

由上海生物工程公司合成该特异引物，采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，按照常规方法在PCR扩增仪上，以小麦耐盐突变体RH8706-49的双链cDNA为模板进行扩增：94℃预变性5min，而后94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min，30个循环后，72℃保温10min。经1％ Agarose电泳后，将该扩增片段(591bp)(见附图2)回收加A尾、连接重组于P^GEM-T质粒转化大肠杆菌DH5α，通过快速PCR法筛选出阳性克隆，得到重组子，经质粒DNA电泳和酶切电泳鉴定后菌液送往上海生物工程公司测序，结果见附图4，图5。

⑤提取RH8706-49总RNA，然后转膜，用放射性同位素标记的TaSC作探针，进行Northern杂交验证(见附图3)。

该基因开放阅读框(ORF)含426bp，编码141个氨基酸，该蛋白的分子量为15.32KD，pI为3.96。我们将其命名为TaSC(Triticum asetivum L.Salt-tolerant Correlative)，该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如附图6所示。

该基因的分离方法如下：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的总RNA，反转录为cDNA；

(2)根据TaSC两端序列设计特异引物；

5′端引物I：5′ TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG  3′(下划线为Xba I酶切位点)

3′端引物II：5′ GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下划线为Sac I酶切位点)

(3)PCR扩增

采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，以小麦耐盐突变体RH8706-49的cDNA(用时稀释10×)为模板进行PCR扩增；

①反应体系：(在0.2ml EP管中依次加入以下各成分)

SDW(无菌去离子水)10×Pfu bufferdNTP引物I引物II模板Pfu酶	17.0μl2.5μl2.0μl1.0μl1.0μl1.0μl0.5μl
		Total volume	25.0μl

②轻弹管底混合样品，稍事离心；

③在PCR扩增仪上按下列程序进行扩增：94℃预变性5min，[94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min]×30个循环后，72℃保温10min；

(4)将上述20μl PCR产物在1％Agarose/EB胶上电泳，结果见图2。扫描

后将特异扩增片段(591bp)在紫外灯下切取，产物按回收试剂盒提供的步骤进行回收；

(5)扩增产物的加(A)尾反应：(在0.5ml EP管中依次加入以下成份)

PCR回收产物10×buffer(with MgCl2)dATPTaq酶	7.9μl1.0μl1.0μl0.1μl
		Total volume	10.0μl

将混合物轻弹、混匀后，于70℃水浴15-30min。

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应(附图5)：

Buffer(2×)T-vecterPCR产物(已加A尾)T4DNA ligase	5.0μl0.8μl3.2μl1.0μl
		Total volume	10.0μl

混匀后离心，4℃反应过夜。

(7)大肠杆菌感受态细胞的制备(按1989 Sambrook et al.CaCl₂方法制备)

(8)用上述载有特异扩增产物TaSC的T载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞；

(9)通过兰白斑筛选鉴定转化子(重组子)，提取转化子质粒DNA，电泳检测(见附图3)。用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆(见附图4)；

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海生物工程公司测序，所得序列与最初由EST拼接的cDNA片段用DNAStar进行比较，结果完全一致，既说明实验的可靠性又说明该基因在小麦的DNA中确实存在。

附图说明

图1：一个典型的cDNA-AFLP选扩结果图。

图2：小麦耐盐突变体TaSC基因的PCR结果图。

图3：小麦耐盐突变体TaSC基因的Northern杂交图。

图4：小麦耐盐突变体TaSC基因阳性克隆的鉴定图。

图5：pGEM-T-TaSC载体阳性克隆的PCR检测图。

图6：小麦耐盐突变体TaSC基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列图。

具体实施方式

以下实施例用以说明本发明。

实施例

本发明给出的小麦耐盐基因开放阅读框(ORF)含426bp，编码142个氨基酸，将该基因克隆入原核表达载体，可以在大肠杆菌中表达出一种分子量为15.32KD的原核表达产物即小麦耐盐相关基因蛋白。

上述TaSC基因及其表达产物，可由以下步骤获得：

利用濮农3665与百农3039杂交F₁的花粉培养，EMS诱变、耐盐性反复筛选从同一单粒的后代中得到小麦耐盐突变体RH8706-49(耐盐指数≥1.3)和敏盐突变体H8706-34(耐盐指数≤0.5)，经过如下步骤：

①利用这两个材料，将种子消毒后分别水培至二叶一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系加入0％NaCl和1％NaCl胁迫处理72小时，以每一品系0％NaCl处理为对照，届时分别取4个处理的第二叶迅速液氮冷冻提取总RNA；

②分别用上述4个处理的总RNA反转录得到cDNA；

③通过cDNA-AFLP技术获得如下cDNA序列；

tttaatggtcggaaaatctcgcggaagacagacgtaatagtccatacccatgtgtggtcctgtgtaaaaaaatatg

ttcattccagggcgggattacttggtgtccgtgtgtgcatagctgaccgcttcctgaaatggacccctagcatcag

tactacgtacctacgtgcgtgtttatcctaatttgttgtgagcttgtggtgcttggtggctcgagaggctagcatt

gagattggatcacgagctgcctgcag

将上述cDNA序列在NCBI网站中通过EST比对进行电子克隆，以获得全长cDNA序列。再以此cDNA序列进行Blastn和Blastx，验证是否具有完整的ORF区；

④根据获得的全长cDNA序列用DNAStar的PrimerSelect设计特异引物，并由上海生物工程公司合成。为方便后续操作，引物带上酶切位点：

5′端引物I：5′ TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG  3′(下划线为Xba酶切位点)

3′端引物II：5′ GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下划线为Sac I酶切位点)

由上海生物工程公司合成该特异引物，采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，按照常规方法在PCR扩增仪上，以小麦耐盐突变体RH8706-49的双链cDNA为模板进行扩增：94℃预变性5min，而后94℃ 30s，66℃ 1min，72℃ 1min，30个循环后，72℃保温10min。经1％Agarose电泳后，将该扩增片段(591bp)回收加A尾、连接重组于p^GEM-T质粒转化大肠杆菌DH5α，通过快速PCR法筛选出阳性克隆，得到重组子，经质粒DNA电泳和酶切电泳鉴定后菌液送往上海生物工程公司测序，结果见附图2；

⑤提取小麦耐盐突变体RH8706-49总RNA，然后转膜，用放射性同位素标记的TaSC作探针，进行Northern杂交验证(附图3)；

上述小麦耐盐基因及其表达产物，还可由以下简单步骤获得：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的总RNA，反转录为cDNA；

(2)根据TaSC两端序列设计特异引物；

5′端引物I：5′ TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG  3′(下划线为Xba I酶切位点)

3′端引物II：5′ GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下划线为Sac I酶切位点)

(3)PCR扩增

采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，以小麦耐盐突变体RH8706-49的cDNA为模板进行PCR扩增；

(4)将上述PCR产物在1％Agarose/EB胶上电泳后回收完整的扩增产物；

(5)扩增产物的加(A)尾反应；

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应；

(7)制备大肠干杆菌感受态细胞；

(8)用上述载有特异扩增产物TaSC的T载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞；

(9)通过蓝白斑筛选鉴定转化子(重组子)，提取转化子质粒DNA，用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆(附图4)；

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海生物工程公司测序，所得序列与最初由EST拼接的cDNA片段用DNAStar进行比较，结果完全一致。

Claims (6)

1、一种小麦耐盐基因，其特征在于该基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如下：

                                                                                 T  1

 2  CTA GAG AGG CGA GGG TTT GGT GCG GCC ATG GAG AAC CTG GCG ATG CTG TGG GGG ATC ATC 61

                                    1   M   E   N   L   A   M   L   W   G   I   I   11

62  GGG CCG GGC GTC GCC GGC GCG CTC TTC GGC GCC GGC TGG TGG TTC TGG GTC GAC GCC GTC 121

12  G   P   G   V   A   G   A   L   F   G   A   G   W   W   F   W   V   D   A   V   31

122 GTC TGC AGC GCC GTC CAG GTC TCC TTC ATC CAC TAC CTG CCC GGG ATC TTC GCG TCG CTG 181

32  V   C   S   A   V   Q   V   S   F   I   H   Y   L   P   G   I   F   A   S   L   51

182 GCC GCG CTC ATG TTC AAT TGC GTC GAC AAG GAT GCC ATC GGG AAC GAC TAC TAC TCG TCC 241

52  A   A   L   M   F   N   C   V   D   K   D   A   I   G   N   D   Y   Y   S   S   71

242 TAT GGG GAT GAT TCC GAG TGG AGG GTG AAG CTT TGG CTT TTC GTC GCC TAC GTC GTC TCT 301

72  Y   G   D   D   S   E   W   R   V   K   L   W   L   F   V   A   Y   V   V   S   91

302 TTC GTC TGC CTG GCT GGA TCG GTG GGT TTG TTG GTG CAA GAC GCC CTG ACA GAC AAG GGC 361

92  F   V   C   L   A   G   S   V   G   L   L   V   Q   D   A   L   T   D   K   G   111

362 CCT TCT GTG TGG ACT GGT GTT GCC GGC GTT CTG CAA TGT GTT TTC GTG TTG ATA AGC GGG 421

112 P   S   V   W   T   G   V   A   G   V   L   Q   C   V   F   V   L   I   S   G   131

422 TTG ACA TAC TGG ACG TGC CAC ACC GAG GAT TAA GGG TCA AAA ATC TCG CGA AGA CAG ACG 481

132 L   T   Y   W   T   C   H   T   E   D   .  141

482 TCT AGT CTA TAC CCG TGT GTG GTC CTG TGT AAA AAA ATA TGT TCA TTC CAG GGC GGG ATT 541

542 ACT TGG TGT CCG TGT GTG CAT AGC TGA CCG CTT CCT GAA ATG GAG AGC TC              591

该基因开放阅读框含426p，编码141个氨基酸，它编码的蛋白分子量为15.32KD，pI为3.96。

2、按权利要求1所述的小麦耐盐基因，其特征在于是从小麦耐盐突变体中分离得到的耐盐基因。

3、含有如权利要求1所述的小麦耐盐基因的重组原核表达载体，其特征是将小麦耐盐基因克隆至原核表达载体后获得的原核表达载体。

4、含有如权利要求1所述的小麦耐盐基因编码的蛋白，其特征是用原核表达载体转化大肠杆菌细胞，经诱导后表达出的小麦耐盐基因蛋白。

5、按权利要求1所述的小麦耐盐基因，其特征是它导入受体可用于耐盐作物品系的培育。

6、一种得到如权利要求1所述的小麦耐盐基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)按照常规方法提取小麦耐盐突变体RH8706-49的总RNA，反转录cDNA；

(2)根据TaSC基因两端序列设计特异引物；

引物I：5′ TCTAGAGAGGCGAGGGTTTGGTGCGG  3′(下划线为Xba I酶切位点)

引物II：5′ GAGCTCTCCATTTCAGGAAGCGGTCAG 3′(下划线为SacI酶切位点)

(3)PCR扩增；

采用上海生物工程公司生产的Pfu酶，以小麦耐盐突变体RH8706-49的cDNA为模板进行PCR扩增；

(4)将上述PCR产物在1％Agarose/EB胶上电泳回收完整的扩增产物；

(5)扩增产物的加(A)尾反应；

(6)与T-载体(P^GEM-T)的连接反应；

(7)制备大肠杆菌感受态细胞；

(8)用上述载有特异扩增产物TaSC的T载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞；

(9)通过蓝白斑筛选鉴定转化子提取转化子质粒DNA，用原初设计的特异引物进行PCR鉴定，挑选阳性克隆；

(10)将阳性克隆扩培后的菌液送往上海生物工程公司测序，将结果与最初由拼接的cDNA片段用DNAStar进行比较。

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