KR20010097953A

KR20010097953A - 양쪽 3'끝이 동일하거나 비상보적인 하나의 염기돌출부위를 갖는 벡터, ＥｃｌＨＫＩ 카세트 및 상기벡터와 ＥｃｌＨＫＩ 카세트의 이용방법

Info

Publication number: KR20010097953A
Application number: KR1020000022477A
Authority: KR
Inventors: 배준설; 윤상우; 한윤호; 김기태; 윤태중; 박정문
Original assignee: 황을문; 주식회사 서린바이오사이언스
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2001-11-08
Also published as: KR100453279B1

Abstract

본 발명은 양쪽 3'끝이 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위를 갖는 벡터,EclHKI 카세트 및 상기 벡터와EclHKI 카세트의 이용방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 제작된 4종류의EclHKI 카세트를 사용하여 클로닝 벡터를 준비하면, 종래의 T-벡터의 제조방식과는 달리, 한번의 제한효소반응 및 젤 추출기법(Gel Elution)으로 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 벡터를 제작할 수 있기 때문에 제조 방법상의 손실율을 낮춘다. 나아가, 이러한 벡터들은 다른 기존의 T-벡터 제품이 결합하지 못하는 PCR 결과물과 결합할 수 있게 되어 클로닝 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 준비된 벡터는, PCR 결과물을 포함하지 않은 블루 콜로니(blue colony)의 개수가 낮아지는 결과를 얻는 등 월등한 클로닝 효율을 나타낸다.

Description

양쪽 3'끝이 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위를 갖는 벡터, ＥｃｌＨＫＩ 카세트 및 상기 벡터와 ＥｃｌＨＫＩ 카세트의 이용방법{a vector wherein each of 3' end has a projected base same or noncomplementary to each other, EclHKI cassette, and methods for using them}

본 발명은 양쪽 3'끝이 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위를 갖는벡터,EclHKI 카세트 및 상기 벡터와EclHKI 카세트의 이용방법에 관한 것이다.

최근 특정 유전자를 생명공학 기술로 조작하기 위해 특이 프라이머(primer; 이하 "PCR 증폭용 프라이머"라고 함)를 사용하여 증폭하는 기술이 눈부시게 발전하고 있다. 이러한 기술은 유전자의 폴리머라제 연쇄중합반응(polymerase chain reacrion;이하 "PCR"이라고 함)이라는 기술로서, 유전자 증폭 및 조작에 필수적인 기술로 사용되고 있다. 나아가, 특이 PCR 증폭용 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 한 결과 생성되는 DNA 분자체(이하 "PCR 결과물"이라고 함)를 재조작하고 안전하게 보관할 목적으로, PCR 결과물을 클로닝 벡터(cloning vector)에 클로닝하려는 시도들이 많았다. PCR 반응은 택 DNA 폴리머라제(Taq. DNA polymerase)라는 중합효소에 의해 진행되는데, 택 DNA 폴리머라제는, PCR 결과물의 양쪽 3' 끝부분에 아데닌(dAMP) 핵산 염기를 첨가시키는 특성을 가지고 있다. 따라서, PCR 결과물은 양 끝에 아데닌(dAMP) 핵산잔기를 가지기 때문에 상기 아데닌(dAMP) 염기에 상보적인 결합을 할 수 있는 염기인 티민(dTMP)을 양 3' 끝에 결합시킨 T-벡터를 클로닝 벡터로 현재 사용하고 있다(도 1 및 도 2 참조).

그러나, PCR 증폭용 프라이머의 염기서열 특이성에 따라 택 DNA 폴리머라제가 PCR 결과물의 3' 끝에 아데닌(dAMP) 염기 잔기를 결합시키는 정도는 다양하다는 실험 결과가 최근에 발표되고 있다(Hu, DNA Cell Biol. 12, 763 (1993); Magnuson et al., BioTechniques 21, 700, (1996)). 즉, 증폭된 PCR 결과물의 3'끝에 아데닌(dAMP)이 존재하면, 택 DNA 폴리머라제가 한 개의 아데닌(dAMP) 핵산잔기를결합시키는데 방해를 받는 반면, 다른 핵산잔기들 즉, 구아닌(dGMP), 시토신(dCMP), 티민(dTMP)을 결합시키는 반응이 더 우세하게 일어난다. 또한, PCR 증폭용 프라이머(primer)의 5' 끝부분의 염기 서열에 따라 아데닌(dAMP) 염기의 결합을 선호하는 서열(예를들어, 5'-GTTC..)과 반면 선호하지 않는 서열(예를들어, 5'-TCAG..)이 존재한다. 나아가, 아데닌(dAMP)을 선호하지 않는 염기서열 중 일부는 어떤 핵산 잔기도 결합하지 않은 블런트 말단(blunt end)으로 남거나 프라이머(primer)의 특이 염기 서열에 따라 시토신(dCMP), 구아닌(dGMP), 티민(dTMP)의 염기가 각각 3' 끝부분에 결합된 형태로 나타나게 된다. 즉, PCR 방법으로 증폭된 PCR 결과물들은 3' 끝에 아데닌(dAMP) 염기가 결합되어 있거나 그 외에, 시토신(dCMP), 구아닌(dGMP), 티민(dTMP)의 염기가 결합되어 있다. 따라서, 3'끝에 단지 하나의 티민(dTMP) 핵산 잔기만을 가지는 기존의 T-벡터는, 이렇게 다양한 PCR 결과물에 효율적으로 접합(ligation)될 수 없으므로 클로닝 효율성이 떨어지는 중요한 문제점이 발생하게 된다. 또한, 기존의 T-벡터로는 벡터상 아무 문제가 없는데도, 클로닝이 잘되는 PCR 결과물이 있으며, 잘 안 되는 PCR 결과물이 있음이 실험 데이터로 확인되었다. 이러한 현상은 PCR 증폭용 프라이머의 염기서열이 3' 끝부분의 잔기 부분에 영향을 주어 T-벡터의 클로닝에 영향을 미친다는 사실을 알려준다.

한편, 종래에 사용되고 있는 T-벡터는, 플라스미드를 제한효소로 절단한 후 벡터의 양 3'끝에 한 개의 티민(dTMP) 핵산 잔기를 결합시킨 것이다. 즉, 종래 T-벡터를 제조하려면, 먼저 환형 플라스미드 DNA를EcoRV와 같은 블런트 말단(bluntend)을 생성시키는 제한효소를 처리하여 직선형 DNA만을 정제하는 과정을 거친 후, 이 블런트 말단의 3' 끝부분에 티민(dTMP) 잔기를 터미널 데옥시뉴크레오티딜 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)에 의해 결합시키고 또 한번의 정제과정을 거친다. 따라서, 이러한 T-벡터의 제조 방식은 두 단계의 절단반응 및 접합반응을 거쳐야 하므로, 완제품의 벡터의 손실율이 커지고 회수율이 낮아질 뿐만 아니라, 많은 양의 티민(dTMP) 염기와 두 가지의 효소 즉 제한효소 및 터미널 데옥시뉴크레오티딜 트랜스퍼라아제가 소비되고, 두 번의 정제과정이 요구되므로 높은 제조비용이 요구되는 등의 단점이 있다. 더욱이, 종래의 T-벡터 제조방식에 있어서는, 블런트 말단을 만든 후 티민(dTMP) 잔기를 부착시키기 때문에, 셀프 라이게이션 (self ligation)이 유도되어 PCR 결과물이 삽입되지 않은 경우에도 단백질 번역 프레임 이동(translation reading frame shift)현상을 유발시켜 백색 콜로니(white colony)가 나타나는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명자는 상기 문제점을 해결하면서 PCR 결과물에 대한 클로닝 효율을 향상시키는 고성능 벡터 시스템을 개발하고자 하였다.

본 발명자는 상기 목적을 달성하는 벡터에 대해 연구를 거듭한 결과, 벡터의 3' 끝에 티민(dTMP) 핵산 잔기 뿐만 아니라, 아데닌(dAMP), 구아닌(dGMP), 시토신(dCTP) 핵산 잔기를 각각 가지는 클로닝 벡터를 혼합하여 사용하는 경우 PCR 결과물의 클로닝 효율이 증가됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은, 지금까지 개발된 클로닝 벡터들과 달리 4종류의 핵산 잔기(nucleotide residue)를클로닝 벡터의 양 끝에 각각 결합시키고, 그 결과로 나온 4종류의 클로닝 벡터를 혼합하여 사용함으로서, 3' 끝에 모든 핵산 잔기(A, T, G, C)를 갖을 수 있는 PCR 결과물들이 클로닝 벡터내로 접합(ligation) 될 수 있도록 하였다. 나아가, 본 발명자는, 상기 4종류의 벡터를 용이하게 제조하기 위하여EclHKI 카세트를 고안하였다.

도 1은, 일반적인 T-벡터의 지도이다.

도 1a는 pGEM^R-T 클로닝 벡터이고 도 1b는 pGEM^R-T 이지클로닝 벡터(Easy cloning Vector)이다.

도 2는, 일반적인 T-벡터 및 PCR 결과물의 접합(ligation) 형태를 도식적으로 나타낸 것이다. 도 2에 나타난 벡터 2개는 하나의 연결된 선형으로 이중가닥의 DNA이다.

도 3은,EclHKI의 제한부위(restriction site)를 나타낸 것이다.

여기서, 화살표(↓)는EclHKI의 절단위치이다.

도 4는,EclHKI 카세트의 모식도이다.

도 5a는,EclHKI로 절단되는 부위의 3' 끝에 티민(dTMP) 잔기가 발생하도록 고안된EclHKI 카세트 염기서열 및 제한부위를 나타낸 것이다.

도 5b는,EclHKI 카세트(T)를EclHKI 제한효소로 절단한 후의 단편들을 나타낸 것이다.

도 6은,EclHKI로 절단되는 부위의 3' 끝에 구아닌(dGMP) 잔기가 발생하도록 고안된EclHKI 카세트 염기서열이다.

도 7은,EclHKI로 절단되는 부위의 3' 끝에 시토신(dCMP) 잔기가 발생하도록 고안된EclHKI 카세트 염기서열이다.

도 8은,EclHKI로 절단되는 부위의 3' 끝에 아데닌(dAMP) 잔기가 발생하도록 고안된EclHKI 카세트 염기서열이다.

도 9는, 일직선 이중가닥 DNA 벡터의 3' 끝부분에 비상보성 티민(dTMP), 아데닌(dAMP), 구아닌(dGMP), 시토신(dCTP)의 핵산 잔기를 각각 가지는 4종류의 벡터를 준비하는 과정을 나타낸 것이다. 여기서 N은 티민(dTMP), 아데닌(dAMP), 구아닌(dGMP), 시토신(dCTP)의 핵산 잔기중 하나이다.

도 10은, 일직선 이중가닥 DNA 클로닝 벡터의 3' 끝부분에 비상보성 티민(dTMP), 아데닌(dAMP), 구아닌(dGMP), 시토신(dCTP)의 핵산 잔기를 각각 가지는 4종류의 클로닝 벡터 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 10a는 pSL-T 벡터지도이고, 도 10b는 pSL-G 벡터지도이며, 도 10c는 pSL-C 벡터지도이고, 도 10d는 pSL-A 벡터지도이다.

본 발명은 양쪽 3'끝에 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위 (unpaired single overhang)을 가지는 일직선 이중가닥 DNA 벡터(linearized double strand vector)를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 벡터를 용이하게 제조하기 위한,EclHKI 카세트를 제공한다.

나아가, 본 발명은, 상기 벡터를 이용하여 DNA 분자체를 효율적으로 삽입하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 살펴보고자 한다.

본 발명은, 특정 제한효소의 제한부위(restriction site)를 포함하는 카세트를 고안하여 모체벡터에 결합시키고, 결합된 벡터를 상기 동일한 제한효소로 처리함으로써, 절단된 양쪽의 3' 끝에 돌출된 하나의 염기잔기가 나오도록 하는 카세트를 준비하고자 한다. 이러한 카세트를 준비하기 위해서 제한부위를EclHKI 제한부위로 선택하였다. 그러나, 제한효소 처리시 절단된 양쪽의 3' 끝에 돌출된 하나의 염기잔기가 나올 수 있는 한,EclHKI 제한부위는 다른 제한부위로 대체될 수 있다.

EclHKI의 제한부위의 서열은 다음과 같다(도 3):

5' GACNN N ↓NNGTC 3'

3' CTGNN↓ N NNCAG 5'

상기 제한부위 중 N은 A, C, G, T중 임의로 선택된 핵산 잔기이다. 단, N잔기는 상보적인 염기쌍으로 짝지워져야 한다.

한편,EclHKI의 제한부위는EclHKI으로 처리하면, 화살표(↓)부분이 절단되고 3'쪽에 하나의 잔기(굵은 글자체 및 밑줄로 표시된N)가 돌출된 단편들이 결과물로 나온다. 따라서, 본 발명은 이러한EclHKI의 제한 부위의 특성을 이용하여,EclHKI 제한부위를 포함하는EclHKI 카세트를 준비하고자 한다.EclHKI를 처리하면 원하는 하나의 돌출된 아데닌(dAMP), 시토신(dCMP), 구아닌(dGMP), 또는 티민(dTMP)이 나오도록N의 서열을 고안한다. 그러나,EclHKI 처리시 절단된EclHKI 제한부위 양쪽의 3'끝이 동일하거나 서로 상보성이 없는 염기잔기로 짝지워지기 위해서는,EclHKI 카세트 내에 제한부위를 연속적으로 2개 위치시키는 것이 바람직하다. 이 때, 2개의EclHKI 제한부위 중 왼쪽의EclHKI 제한부위는 상단의N이 그리고 오른쪽의EclHKI 제한부위는 하단의N이 목적하는 핵산 염기가 되도록 고안한다. 한편,EclHKI 제한부위에 있는 그 외 N은 독특한 제한효소 부위를 만들거나, GC 비율을 맞추거나, A와 T, 그리고 G와 C의 비율을 맞출 때 바람직하게 선택할 수 있다.

아래에서는,EclHKI 효소 처리시 절단된 양쪽의 3'끝이 각각 T, G, C, A로 동일한 돌출된 하나의 염기잔기를 가질 수 있는EclHKI 카세트의 구조를 살펴보고자 한다(도 4 참조).

EclHKI 카세트는 상기EclHKI 제한부위의 서열을 연속적으로 두 개 포함한다. 또한, 기존의 벡터에EclHKI 카세트가 삽입될 수 있도록, 두 개의EclHKI 절단부위의 양쪽에EclHKI 제한부위와는 다른 제한부위를 포함하고 있다. 예를 들면, pGEM 벡터, pPUC 벡터, pBluescript 벡터 등과 같은 기존의 클로닝 벡터 모두에EclHKI카세트를 삽입할 수 있도록 하기 위해서, 두 개의EclHKI 제한부위의 양쪽에SacII 또는PstI와 같은 제한부위를 포함하는 것이 바람직하다. 그러나,EclHKI 카세트는,SacII 또는PstI 제한부위는 사용상 용도에 따라HindIII,SphI,ApaI,NdeI 등과 같은 다양한 제한부위로 대체될 수 있다.

또한,EclHKI 카세트는EclHKI 절단 반응의 효율을 높이기 위해 카세트 상 2개의EclHKI 제한부위 사이에 스페이서(spacer) 서열을 첨가할 수 있다.EclHKI 제한효소는, 동일한 절단부위가 붙어서 존재하면 한 제한부위가 짤리고 다른 제한부위가 잘릴 때 제한효소가 제대로 작용하지 않는다는 보고가 있다. 따라서, 이러한 현상을 방지하기 위해 카세트 형성용 프라이머를 고안할 때 제한부위외에 바로 옆에 계속되는 1개 이상의 염기를 더 추가하는 것이 바람직하다. 이때, 이러한 스페이서(spacer)는, 모체벡터나 카세트에 존재하는 제한부위가 발생하지 않는 임의의 염기를 삽입하여 길이를 늘릴 수 있다.

나아가, 3' 끝에 돌출된 하나의 염기잔기가 있는 벡터를 준비하기 위해서는,EclHKI 카세트를 포함하는 벡터를 선별하고, 상기 벡터를EclHKI 제한효소로 처리하고 난 후 PCR 결과물을 삽입할 때 PCR 결과물이 삽입된 벡터를 선별하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명의EclHKI 카세트는, 모체 클로닝 벡터에 일부 존재하는 락 제트(LacZ) 유전자의 단백질 번역 프레임(open reading frame)과 일치하게 고안하여, 락 제트(LacZ) 유전자가 완전하게 발현될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 이는 락 제트(LacZ) 효소가 발현되면 아이 피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-gal)이 처리된 엘비(LB) 플레이트(plate) 배지에서 푸른색 콜로니를 형성하는 것을 이용한 것이다. 예를들면,EclHKI 카세트가 삽입된 벡터들은 온전한 락 제트(Lac Z) 유전자를 형성하여 락 제트(Lac Z) 효소를 발현할 수 있으므로, 상기 벡터로 형질전환된 균주는 아이피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-gal)이 처리된 엘비(LB) 플레이트 배지에서 푸른색 콜로니를 형성한다. 나아가,EclHKI 제한효소에 의해 절단되고 PCR 결과물이 삽입된 벡터로 형질전환된 균주는 흰색 콜로니를 형성한다. 따라서, PCR 결과물이 삽입된 여부를 콜로니의 색으로 선별할 수 있다. 즉, 절단반응이 일어나지 않은 벡터가 PCR 결과물이 삽입된 벡터에 소량이라도 포함되어 있을 경우 푸른색의 콜로니(colony)를 띄게 함으로서 PCR 결과물이 삽입된 벡터에 의해 나타나는 흰색의 클론 콜로니와 쉽게 식별할 수 있다. 한편,EclHK 제한효소에 의해 절단되었으나 PCR 결과물이 삽입되지 않은 직선형 벡터는 균주를 형질전환시키지 못하므로 배지에 나타나지 않는다.

본 발명에 따른EclHKI 카세트는, 락 제트(LacZ) 유전자이외에 보통 스크리닝에 사용되는 다양한 레포트 유전자(reporter gene) 예를들면, GFP(green fluorescence protein)유전자, luc(luciferase) 유전자, 람다 치사유전자(Lambda lethal gene)와 같이 형질전환된 숙주를 파괴할 수 있는 치사유전자에 삽입되어 클로닝 벡터로 적용할 수 있다.

두 개의EclHKI 제한효소부위 및 스페이서(spacer)를 포함하며,EclHKI 효소처리시 절단된 3'끝 양쪽이 돌출된 동일 염기를 생성하고, 원하는 벡터 선별을 위해 락 제트(LacZ) 유전자의 일부를 포함하며, 모체 벡터에 용이하게 삽입시키기 위해SacII 및PstI 제한효소부위를 포함하는EclHKI 카세트는, 서열번호 1 내지 8의 서열들로 고안된 ST-1과 ST-2, ST-3과 ST-4, ST-5와 ST-6, 및 ST-7과 ST-8 프라이머("카세트 형성용 프라이머들")에 의해 구현될 수 있다. 그러나,EclHKI 카세트 형성용 프라이머의 서열은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 여기에 한정되는 것은 아니다.

서열번호 1 및 2의 서열들로 고안된 ST-1 및 ST-2 카세트 형성용 프라이머들을 100℃로 중탕하여 천천히 식히는 방법으로 하이브리드화 반응(Hybridization reaction)을 유도하여EclHKI 카세트를 제작할 수 있다.

[서열번호 1; ST-1]

5'-GGACCGTGAGTCTTTGACAGAGAGTCTGCA-3'

[서열번호 2; ST-2]

5'-GACTCTCTGTCAAAGACTCACGGTCCGC-3'

[EclHKI 카세트(T)](도 5a)

5'-GGACCGTGAGTCTTTGACAGAGAGTCTGCA-3' (ST-1 프라이머)

3'-CGCCTGGCACTCAGAAACTGTCTCTCAG-5' (ST-2 프라이머)

----- -------- ------- ----

SacIIEclHKI(spacer)EclHKIPstI

ST-1 및 ST-2 카세트 형성용 프라이머로 제작된 상기EclHKI 카세트(T)(도 5a)를EclHKI로 처리하면, 안쪽에 위치한 두 개의EclHKI 절단부위는 3' 끝에 하나의 티민 잔기(dTMP)가 돌출된다(도 5b 참조).

5'-GGACCG T (3') GAGTCTTTGACAGA GAGTCTGCA-3'

3'-CGCCTGGC ACTCAGAAACTGTC (3') T CTCAG-5'

따라서, 상기EclHKI 카세트를 클로닝 벡터에 삽입한 후EclHKI으로 자르고 나서, 가운데 잘린 단편을 젤 추출 방법으로 제거하면, 순수하게 3' 끝부분에 하나의 잔기(T)가 돌출된 클로닝 벡터를 획득할 수 있다.

EclHKI를 처리하면 하나의 돌출된 구아닌(dGMP)이 나오도록 고안된 서열번호 3 및 4의 서열들로 구성된 SG-1 및 SG-2 카세트 형성용 프라이머를 상기EclHKI 카세트(T)방식과 동일하게 반응시켜EclHKI 카세트(G)를 제작한다(도 6 참조).

[서열번호 3; SG-1]

5'-GGACCGGGAGTCTTTGACAGCGAGTCTGCA-3'

[서열번호 4; SG-2]

5'-GACTCGCTGTCAAAGACTCCCGGTCCGC-3'

또한,EclHKI을 처리하면 하나의 돌출된 시토신(dCMP)이 나오도록 고안된 서열번호 5 및 6의 서열로 구성된 SC-1 및 SC-2 카세트 형성용 프라이머를 상기EclHKI 카세트(T) 방식과 동일하게 반응하여EclHKI 카세트(C)를 제작한다(도 7 참조).

[서열번호 5; SC-1]

5'-GGACCGCGAGTCTTTGACAGGGAGTCTGCA-3'

[서열번호 6; SC-2]

5'-GACTCCCTGTCAAAGACTCGCGGTCCGC-3'

또한,EclHKI을 처리하면 하나의 돌출된 아데닌(dAMP)이 나오도록 고안된 서열번호 7 및 8의 서열로 구성된 SA-1 및 SA-2 카세트 형성용 프라이머를 상기 EclHKI 카세트(T) 방식과 동일하게 반응시켜EclHKI(A) 카세트를 제작한다(도 8 참조).

[서열번호 7; SA-1]

5'-GGACCGAGAGTCTTTGACAGTGAGTCTGCA-3'

[서열번호 8; SA-2]

5'-GACTCACTGTCAAAGACTCTCGGTCCGC-3'

서열번호 1 내지 서열번호 8에 해당하는 카세트 형성용 프라이머로 제작된 4종류의EclHKI 카세트는 제한효소SacII 와PstI 부위가 양 끝에 존재하도록 고안되었기 때문에SacII 와PstI와 같은 제한효소로 자른 어떤 클로닝 벡터에도 삽입가능하다.

나아가,EclHKI 카세트가 삽입되는 모체 벡터는 pGEM 벡터류(Promega사), pPUC 벡터류(New England Biolabs사), pBluescript 벡터류(New England Biolabs사)등이 있다. 상기 모체 벡터들은 클로닝용 벡터로서, ori 유전자 및 항생제 마크유전자(주로 앰피실린(aphicilin), 테트라사이클린(tetracycline) 저항성 유전자), 유용한 클로닝 사이트 (multi cloning site ; 예를 들면,ApaI,HindIII,NcoI,EcoRI,SacI,BamHI,PstI,NdeI; 도 1 참조: pGEM-T 벡터지도 참조) 등 클로닝에 필요한 유전자들을 포함하고 있다. 또한,EclHKI 카세트가 삽입되는 모체 벡터는 사용목적에 따라, DNA 라이브러리 벡터, 단백질 발현용 벡터로 사용될 수 있다. 단백질 발현용 벡터는 PCR 결과물을 클로닝하여 바로 발현시킬 수 있는 벡터로서, tac 프로모터(promoter) 또는 T7 프로모터(promoter)등의 강력한 발현용 프로모터(promoter)를 갖는 것이 바람직하다.

EclHKI 카세트를 이용하는 클로닝 벡터의 제작방법을 살펴보면 다음과 같다.SacII와PstI으로 자른 pGEM-5zf(Promega사 제품) 벡터에 동일한SacII와PstI으로 자른 본 발명에 따른 4종류의EclHK 카세트를 각각 삽입한 후, 삼브룩 등의 방식(Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989)에 따라 형질전환 및 콜로니 스크리닝의 실험과정을 거쳐 플라스미드 벡터 pSL-Te, pSL-Ae, pSL-Ce, pSL-Ge를 준비한다. 본 발명에 따른 플라스미드 벡터 pSL-Te, pSL-Ae, pSL-Ce, pSL-Ge 각각에 제한효소EclHKI(Promega사 제품)를 처리하여 절단반응을 일으킨 후, 젤 추출(gel elution) 방법을 사용하여 원하는 클로닝 벡터를정제한다(도 9). 여기서, 젤 추출(gel elution) 방법이란,EclHKI 제한효소 반응물을 1% 아가로스 젤(agarose gel)로 전기영동(electophoresis)하여 해당 클로닝벡터 부위만 추출하여 추출키트(Promega사,cat.# A7170)를 사용하여 정제하는 방법으로, 클로닝 벡터를 완성하기까지 공정 및 소요시간이 짧으므로 불순물의 오염의 가능성이 낮고, 순수도(purity)가 높기 때문에 클로닝 벡터의 고활성(high activity)을 계속 유지할 수 있다.

상기 제조 과정을 통해 클로닝 벡터의 양 3' 끝부분에 3'-T, 3'-A, 3'-G, 3'-C 비 상보적 염기가 돌출되어 있는 형태의 벡터 pSL-T, pSL-A, pSL-G, pSL-C 클로닝 벡터를 준비할 수 있다(도 10).

본 발명에 따라 준비된 pSL-T, pSL-A, pSL-G, pSL-C와 같은 클로닝 벡터들은, 비상보성 핵산 잔기 하나가 돌출된 PCR 결과물을 클로닝하는데 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 준비된 상기 클로닝 벡터들은 외래유전자로 형질전환시키는데 응용될 수 있으며, DNA 라이브러리를 준비하는데에도 응용될 수 있다.

나아가,EclHKI 카세트 제작할 때EclHKI 제한부위의N을 적절히 선택한 카세트 형성용 프라이머를 고안함으로서,EclHKI 제한효소처리시 절단된 양쪽의 3'끝이 동일하지 아니하는 하나의 돌출된 염기잔기를 만들 수 있으며, 이러한 특징을 갖는 클로닝 벡터를 준비할 수 있다.

[실시예 1;EclHKI 카세트 제작]

각각 100 pmol의 프라이머 ST-1과 ST-2(서열번호 1 및 2)를 4㎕씩, 10X 올리고뉴크레오타이드 완충액(oligonucleotide buffer; 0.1M NaH₂PO₄) 10㎕, 3차 증류수 82㎕를 첨가하여 100㎕를 만든 후 90℃ 10분간 반응시켰다. 그리고 나서, 스티로폴 박스에서 천천히 상온으로 내려 올 때까지 천천히 식혔다. 최종농도가 10mM이 되도록 100% 에탄올과 함께 MgCl₂를 처리하여 조심스럽게 혼합한 후, 14000g에서 20분간 원심분리시켰다. 그 결과로 나온 반응물을 건조시키고 3차 증류수 10㎕를 사용하여 현탁시켰다. 이로부터, 프라이머 ST-1과 ST-2가 결합된EclHKI 카세트(T)를 준비하였다.

프라이머 ST-1과 ST-2대신에, 프라이머 SG-1과 SG-2(서열번호 3 및 4), SC-1과 SC-2(서열번호 5 및 6), SA-1과 SA-2(서열번호 7 및 8)를 사용하는 것을 제외하고는EclHKI 카세트(T)와 동일한 방법으로EclHKI 카세트(G),EclHKI 카세트(C),EclHKI 카세트(A)를 준비하였다.

[실시예 2; pSL-Te, pSL-Ae, pSL-Ce, pSL-Ge 제작]

실시예 1에서 준비한 각각의EclHKI 카세트들을SacII 및PstI으로 처리하고 정제하였다. 또한, 모체벡터로 pGEM-5zf (Promega사)벡터를SacII 및PstI로 처리하고 정제하였다. 상기 모체벡터 1㎕(50ng)와, 실시예 1에서 어닐링 반응을 통해 "점착력있는 말단(cohesive end)"을 갖는 상기EclHKI 카세트 각각 1㎕에 10X 라이게이즈 완충액(ligase buffer) 1㎕, T4 DNA 라이게이즈 0.5㎕ 그리고 3차 증류수 6.5㎕를 처리하고, 4℃에서 8시간 반응시켰다. 이러한 방법으로, 각각의EclHKI 카세트와 상기 벡터를 라이게이션반응(ligation reaction)을 통해 삽입시켜, 플라스미드 pSL-Te, pSL-Ae, pSL-Ce, pSL-Ge를 제작하였다.

[실시예 3; pSL-Te, pSL-Ae, pSL-Ce, pSL-Ge로 형질전환된 콜로니 선별]

삼브룩의 CaCl₂방식(Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989, p.1.82-1.84)에 의해, 준비된 JM109 컴피던트 균주(competent cell)를 상기 실시예 2의 라이게이션 반응물로 형질전환시켰다. 즉, 준비된 균주 200㎕에 라이게이션 반응물 10㎕를 각각 혼합한 후 얼음에 30분간 반응시키고, 42℃에서 90초간 반응시켰다. 그리고 나서, 얼음에 1∼2분간 반응시킨 후 SOC 배지 800㎕를 첨가하여 37℃상에서 45분간 배양하였다. 이중 20㎕를 아이피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-Gal) 처리된 엘비(LB) 플레이트 배지에 처리한 후 37℃에서 12시간 이상 배양하였다.EclHKI 카세트가 삽입된 플라스미드 벡터들은 온전한 락 제트(LacZ) 유전자를 형성하여 락 제트(LacZ) 효소를 발현할 수 있으므로, 상기 벡터로 형질전환된 균주는 아이피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-Gal) 처리된 엘비(LB) 플레이트배지에서 푸른색 콜로니(blue colony)를 형성한다. 따라서, 배양후 푸른색 콜로니(Blue colony)를 이수씨개로 따서 앰피실린이 들어있는 1ml 엘비(LB) 배지에 접종후 37℃에서 10시간 이상을 배양한 다음, Promega사의 Wizard plus mini-prep. kit를 사용하여 플라스미드 pSL-Ae, pSL-Te, pSL-Ce, pSL-Ge를 추출하였다. 상기 추출물 중 일부를EclHKI 제한효소로 절단 반응을 수행한 후 아가로스 젤로 분석한 결과, 상기 추출물은EclHKI 카세트가 삽입된 벡터라는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 4; pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 클로닝 벡터 준비]

플라스미드 벡터 pSL-Ae, pSL-Te, pSL-Ce, pSL-Ge 20㎕,EclHKI (Promega사) 1㎕, 반응완충액 E (buffer E) 3㎕, 그리고 3차 증류수 6㎕를 처리하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그러면,EclHKI 효소에 의해EclHKI 카세트 내에 존재하는 2개의EclHKI 절단부위가 절단되어,EclHKI 절단부위 사이에 해당하는 단편이 잘려져 나온다. 따라서, 이 결과로 나온 반응물을 1% 아가로스 젤로 분석한 후 효소 반응이 완전히 일어난 DNA 밴드 즉, pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 클로닝 벡터 각각을 칼로 오려내었다. 그리고 나서, Promega사의 Clean-up 키트를 사용하여 젤을 녹임과 동시에 벡터를 특수 레진에 결합시키는 방식으로 추출하였다. 즉, 각 DNA 밴드를 1.5㎖ 실험용 튜브에 위치시킨 후 레진 1㎖을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시켜 젤을 녹였다. 미니 컬럼에 이 반응물을 위치시킨 후 진공펌프를 사용하여 용액을 제거하고 벡터가 결합된 레진은 컬럼에 남긴 후, 80% 이소프로파놀(isopropanol) 2㎖로 세척하였다. 최종적으로 3차 증류수 50㎕를 컬럼에 처리한 후 새 실험용 튜브로 옮겨서 5초 정도의 스핀 원심분리로 깨끗한 클로닝 벡터를 획득하였다. 획득한 클로닝 벡터 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A는 스팩트로메터(WPA사)를 사용하여 정량하였다.

<시험예 1>

본 발명에 따라EclHKI 카세트를 이용하여 제작된 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 클로닝 벡터와 대조군으로서 Promega사의 pGEM-T 벡터(cat # A3600; 3' 양끝이 염기잔기 T인 벡터, 도 1참조)에 있어서, 클로닝 벡터로서의 효율성을 아래와 같은 방법을 통해 비교하였다.

스펙트로메터(Spectrometer, WPA사)를 사용하여 벡터의 농도를 각각 50 ng으로 동일하게 사용하여, 300 bp 길이의 PCR 결과물과 상기 벡터들을 접합시키는 반응(Ligation reaction)을 하였다. 그리고 나서, 삼브룩 등의 방식(Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989)에 따라 형질전환시킨 후, 아이피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-Gal) 처리된 엘비(LB) 배지상에서 37℃ 12시간 배양하였다. 상기 엘비(LB) 배지에 나타난 콜로니 결과는 표 1에 나타내었다.

PCR 결과물이 삽입된 벡터로 형질전환된 균주는 백색 콜로니(white colony)로 나타난다. 따라서, 상기 백색 콜로니 일부를 접종하여 배양시킨 균주로부터 플라스미드를 추출한 후SacII 및PstI으로 절단반응시켰다. 이때, 아가로스 젤 분석결과 300bp 정도 길이의 DNA 부위가 확인되었는데, 이로부터 백색 클로니는 PCR 결과물이 삽입된 것임을 확인할 수 있다.

한편, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 벡터는 기존 제품인 pGEM-T 벡터보다 PCR 결과물이 삽입되지 않은 푸른색 콜로니(Blue colony) 개수가 적었다. 즉,EclHKI 카세트를 사용하여 벡터를 정제하는 방식이 훨씬 뛰어난 것을 알 수 있다.

전체적인 백색 콜로니(PCR 결과물이 삽입된 것)의 개수는 pGEM-T 벡터와 pSL-T 벡터가 비슷한 결과를 얻었다. 그러나, pSL 벡터들을 상호 비교하면, 약 7:4:4:3(pSL-T;-G;-C;-A)의 비율로 PCR 결과물이 클로닝된다는 사실을 관찰할 수 있다. 따라서, 시험예 1에서 사용한 PCR 결과물을 PCR 클로닝 벡터내로 도입시킬 때에는, pSL-T : pSL-G : pSL-C : pSL-A = 7 : 4 : 4 : 3의 비율로 각 4종류의 클로닝 벡터를 혼합하여 준비하면 고효율의 PCR 클로닝 벡터들을 얻을 수 있다. 즉, 혼합된 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 벡터 시스템은, 기존의 T-벡터가 결합할 수 없었던 PCR 결과물의 3'양끝부분이 3'-C, 3'-G, 3'-A인 PCR 결과물까지도 결합할 수 있어서 클로닝 효율성을 극대화시킬 수 있다.

나아가, 특정 PCR 결과물들은 특정 프라이머(primer) 염기서열 특성에 따라 3'끝의 염기잔기에 대한 비율이 달라질 수 있다. 따라서, 특정 PCR 결과물 일부를 견본추출(sampling)하여, 상기와 같은 방법으로 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 클로닝 벡터의 혼합비를 산출한 후, 상기 혼합비로 혼합된 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 벡터 시스템을 이용하여 상기 특정 PCR 결과물을 클로닝하면, 클로닝 효율을 높일 수 있다.

따라서, 상기 결과에 비추어 보건대,EclHKI 카세트를 이용한 4-염기 벡터(four-base vector)는 기존의 벡터보다 훨씬 더 월등한 효과를 보임을 알 수있다.

본 발명에 따라, 4종류의 새로운EclHKI 카세트를 사용하여 클로닝벡터를 준비하면, 종래의 T-벡터의 제조방식과는 달리, 한번의 제한효소반응 및 젤 추출기법(Gel Elution)으로 pSL-T, pSL-G, pSL-C, pSL-A 클로닝 벡터를 제작할 수 있기 때문에 제조 방법상의 손실율을 낮춘다. 나아가, 이러한 벡터들은 다른 기존의 T-벡터 제품이 결합하지 못하는 PCR 결과물과 결합할 수 있게 되어 클로닝 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 준비된 벡터는, PCR 결과물을 포함하지 않은 블루 콜로니가 낮아지는 결과를 얻는 등 월등한 클로닝 효율을 나타낸다.

Claims

DNA 분자체를 벡터에 삽입하는 방법에 있어서,

상기 DNA 분자체는, 일직선 이중가닥으로서 양쪽 3'끝(end)이 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위를 가지며,

상기 벡터는, 일직선 이중가닥 DNA 벡터(linearized double strand vector)로서 양쪽 3'끝에 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위 (unpaired single overhang)을 가지되, 상기 DNA 분자체의 양쪽 3'끝의 하나의 돌출된 염기와 상보적인 염기쌍을 이룰 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 양쪽 3'끝의 돌출된 염기가 각각 아데닌(dAMP), 구아닌(dGMP), 시토신(dCMP), 티민(dTMP)으로 동일한 4종류의 벡터이고, 상기 4종류의 벡터를 최적의 비율로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 PCR 클로닝 벡터, DNA 라이브러리 벡터, 단백질 발현용 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 분자체는 특이 PCR 증폭용 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 한 결과 생성되는 DNA 분자체인 것임을 특징으로 하는 방법.
연속적인 두 개의EclHKI 제한부위 및EclHKI를 제외한 다른 제한부위로 구성되어 있되,EclHKI를 제외한 다른 제한부위는 상기 연속적인 두 개의EclHKI 제한부위 양쪽에 위치해 있고,

EclHKI 제한부위는로서, 왼쪽의EclHKI 제한부위는 상단의 N 이 그리고 오른쪽의EclHKI 제한부위는 하단의 N 이 목적하는 핵산 염기로 선택된 것임을 특징으로 하는EclHKI 카세트.
제 6항에 있어서,EclHKI 카세트의 서열은 삽입될 모체 벡터에 존재하는 일부 레포트 유전자(reporter gene)의 단백질 번역 프레임(open reading frame)과 일치하게 고안된 것임을 특징으로 하는EclHKI 카세트.
제 7항에 있어서, 상기 레포트 유전자(reporter gene)는 락 제트(LacZ)유전자, GFP(green fluorescence protein)유전자, luc(luciferase) 유전자, 치사유전자로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는EclHKI 카세트.
제 6항에 있어서,EclHKI 카세트는, 서열번호 1의 카세트 형성용 프라이머와 서열번호 2의 카세트 형성용프라이머가 하이브리드화된 카세트, 서열번호 3의 카세트 형성용 프라이머와 서열번호 4의 카세트 형성용 프라이머가 하이브리드화된 카세트, 서열번호 5의 카세트 형성용 프라이머와 서열번호 6의 카세트 형성용 프라이머가 하이브리드화된 카세트 및 서열번호 7의 카세트 형성용 프라이머와 서열번호 8의 카세트 형성용 프라이머가 하이브리드화 된 카세트로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는EclHKI 카세트.
상보적인 다른 프라이머와 하이브리드화되면 2중 가닥의 카세트를 형성할 수 있되, 서열번호 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는EclHKI 카세트 형성용 프라이머.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항의EclHKI 카세트가 삽입된 벡터.
제 11항에 있어서, 상기 벡터는EclHKI 카세트가 모체 벡터에 삽입된 것이되, 상기 모체 벡터는 락 제트(LacZ)유전자, GFP(green fluorescence protein)유전자, luc(luciferase) 유전자, 치사유전자로 구성된 군에서 선택된 레포트 유전자(reporter gene)의 일부를 포함하며, 상기EclHK 카세트는 삽입될 모체 벡터에 존재하는 레포트 유전자(reporter gene)의 단백질 번역 프레임(open readingframe)과 일치하게 고안된 것임을 특징으로 하는 벡터.
제 11항에 있어서, 상기 벡터는EclHKI 제한효소에 의해 2개의EclHKI 제한부위가 절단되어 상기 2개의EclHKI 절단부위 사이에 있는 단편이 잘려나간 것임을 특징으로 하는 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 제 13항에 따른 벡터인 것임을 특징으로 하는 방법.
양쪽 3'끝(3'-end)에 동일하거나 비상보적인 하나의 염기 돌출부위를 가지는 일직선 이중가닥 DNA 벡터를 제조하는 방법에 있어서,

제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른EclHKI 카세트 중EclHKI 제한부위 양쪽에 존재하는 다른 제한부위를 해당 제한효소로 절단하고 모체 벡터를 동일한 제한효소로 절단하고 난 후 절단된EclHKI 카세트를 절단된 모체 벡터로 접합반응(ligation reaction)에 의해 삽입하는 제 1단계;

EclHKI 제한효소에 의해 2개의EclHKI 제한부위를 절단하는 제 2단계; 및

선택적으로 상기 2개의EclHKI 절단부위 사이에 있는 단편을 제거하는 제 3단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
제 15항에 있어서,EclHKI 카세트가 모체 벡터에 삽입된 경우 온전한 레포트유전자(reporter gene)가 발현될 수 있도록EclHKI 카세트의 서열을 삽입될 모체 벡터에 일부 존재하는 레포트 유전자의 단백질 번역 프레임(open reading frame)과 일치하게 고안하는 단계를 제 1단계 이전에 수행하고,

EclHKI 카세트가 삽입된 벡터로 균주를 형질전환시키는 단계; 및

온전한 레포트 유전자 산물을 생산하는 콜로니를 선별하는 단계를 제 1단계와 제 2단계 사이에 수행하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 레포트 유전자는 락 제트(LacZ) 유전자이고,

온전한 락 제트(LacZ) 유전자 산물을 생산하는 콜로니는 아이피 티지(IPTG) 및 엑스 갈(X-Gal)이 처리된 엘비(LB) 플레이트(plate) 배지에서 푸른색 콜로니를 형성하고, 온전한 락 제트(LacZ) 유전자 산물을 생산하는 콜로니는 흰색 콜로니를 형성하는 것임을 특징으로 하는 벡터의 제조방법.