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Die vorliegende Erfindung betrifft einen multifunktionalen Kloniervektor, einen
davon abgeleiteten Vektor-Primer und ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA-Bank
unter Verwendung desselben. Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur einfachen
Herstellung einer cDNA, die zur Produktion großer Mengen an Protein verwendet
werden kann, das sich als Arzneimittel eignet.
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Die in unserem Körper Zellen aufbauenden Proteine spielen als Zellgerüst, als
Katalysator für Reaktionen und als Vermittler bei der Weiterleitung von Signalen eine
Hauptrolle zur Erhaltung des Lebens. Daher sind die Entdeckung neuer Proteine und die
Aufklärung ihrer Struktur und Funktion nicht nur wichtig, um das Leben zu erforschen,
sondern auch, um sie als Arzneimittel oder Diagnosereagentien einzusetzen. Obwohl
bereits viele Versuche unternommen wurden, diese in unserem Körper funktionierenden
Proteine als Arzneimittel zu verwenden, sind aufgrund von Schwierigkeiten bei der
Herstellung großer Mengen an Protein nur wenige Proteine verfügbar. Die jüngsten
Fortschritte der Gentechnologie vereinfachten die Auffindung eines Gens, das für ein
nützliches Protein aus menschlichen Zellen kodiert, und dessen Expression in hoher
Ausbeute in Bakterien- oder tierischen Zellen. Unter Anwendung dieses Verfahrens
wurden neuerdings zahlreiche Proteine als Arzneimittel entwickelt.
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Jedes menschliche Protein besitzt eine potentielle Eignung als Arzneimittel, da es
in unserem Körper Funktionen erfüllt. Es ist bekannt, daß viele genetische Erkrankungen
durch das Verschwinden eines Proteins bedingt sind, das eine wichtige Rolle in einer
lebenden Zelle spielt. Daher sind die Produktion großer Mengen an Protein und die
Aufklärung seiner Funktion und des Zusammenhangs mit der Erkrankung wichtige
Schritte zur Entwicklung neuer Arzneimittel. Wenn die Untersuchungen mit der
Reinigung eines Proteins mit einer Targetaktivität begonnen werden, dauert es lange,
eine große Menge an Ausgangsmaterial zu erhalten, und erfordert eine Menge Arbeit.
Um dieses Problem zu vermeiden, wählten die Autoren der vorliegenden Erfindung jene
Vorgangsweise, von einem Gen auszugehen, von dem die Information einer
Aminosäure-Proteinsequenz kodiert wird. Diesem Plan zufolge wird cDNA
(komplementäre DNA) aus jeder mRNA synthetisiert, die vom Genom transkribiert und
zu Protein translatiert wird, wonach jede cDNA am kodierenden Protein charakterisiert
wird.
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Die Anzahl der Gene im menschlichen Genom wird auf ungefähr 10&sup5; geschätzt,
was auch der Anzahl an Proteinen entsprechen kann. In der letzten Zeit wurde die
Bestimmung der vollständigen Sequenz des menschlichen Genoms, das "Human
Genome Project", weltweit diskutiert. Falls dieser Plan realisiert wird, erwartet man die
Aufklärung der Aminosäuresequenz aller Proteine. Es ist jedoch schwierig, die
Aminosäuresequenz ausschließlich aus der Nukleotidsequenz des Genoms zu
bestimmen, da dar Genom aus Exons, die für einen Teil des Proteins kodieren, und aus
Introns besteht, die nicht für Protein kodieren. In der Zelle wird vom Genom
transkribierte mRNA durch Löschung von Introns verarbeitet und die nur Exons
enthaltende, verarbeitete mRNA wird auf Ribosomen zu Proteinen transkribiert. Daher
kann durch Bestimmung der Nukleotidsequenz der verarbeiteten mRNA die Information
der Aminosäuresequenz des von mRNA kodierten Proteins erhalten werden. Die
Fortschritte der Genrekombinationstechnik ermöglichen die Umwandlung von mRNA in
cDNA und deren Einbringung in E.coli. Nach diesem Verfahren kann ein "cDNA-
Vektor", der von einer Art der mRNA stammende cDNA enthält, synthetisiert und jene
cDNA-Sammlung konstruiert werden, die eine Gruppe von cDNA-Vektoren
enthaltenden E.coli ist. Bei Bestimmung der Nukleotidsequenzen der gesamten in der
cDNA-Sammlung enthaltenen cDNA, die den Nukleotidsequenzen der gesamten, in
einer Zelle vorkommenden mRNA entspricht, wird die Aminosäuresequenz aller in
einer Zelle produzierten Proteine erhalten. Die Gruppe der cDNA mit bekannter
Sequenz wird "CDNA-Bank" genannt. Falls der erhaltene Vektor in geeignete tierische
Zellen eingebracht und darin exprimiert wird, kann das Expressionsprndukt für ein
Assayscreenen verwendet werden. Nach obiger Vorgangsweise kann die cDNA-Bank
menschlicher Proteine konstruiert werden, die "homo-Protein"-cDNA-Bank genannt
wird, worin die Aminosäuresequenz jeder cDNA bestimmt wurde und jede cDNA in
Säugetierzellen exprimiert werden kann. Es wird hierin als Beispiel nur der Fall von
menschlichem Protein beschrieben, diese Vorgangsweise kann jedoch auch auf andere
Tier- und Pflanzenzellen angewandt werden, wodurch nützliche Informationen über die
Proteine dieser Zellen erhalten werden können.
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Der Erfolg obiger Verfahrensweise hängt von der Qualität der cDNA-Sammlung
ab. Von diesem Standpunkt aus gibt es zahlreiche Probleme bei den nach bekannten
Verfahren hergestellten cDNA-Sammlungen, beispielsweise daß Subklonieren eines
DNA-Fragments zu einem geeigneten Vektor erforderlich ist, um die cDNA zu
sequenzieren, um mit dieser als Sonde eine cDNA voller Länge zu screenen, oder um
diese in tierischen Zellen zu exprimieren. Es erfordert lange Zeit und viel Mühe,
zahlreiche cDNA-Klone nach diesem Subklonierverfahren zu analysieren. Dieses
Problem wird durch die Entwicklung eines neuen Verfahrens gelöst, wonach alle obigen
Vorgänge an demselben Vektor durchgeführt werden können. Die
Minimalanforderungen an einen cDNA-Vektor, der obigem Verfahren genügt, sind jene,
daß er 1) einen orientierten cDNA-Klon voller Länge enthält, 2) leicht zu sequenzieren
ist, 3) zur Herstellung einer Sonde verwendet werden kann, die sich für verschiedene
Arten des Screenens eignet, und 4) durch in vivo- und in vitro-Systeme exprimiert
werden kann. Der in der Anforderung 1) beschriebene Ausdruck "cDNA-Klon voller
Länge" bedeutet, daß der cDNA-Klon zumindest den vollständigen Kodierbereich des in
dieser Beschreibung von mRNA kodierten Proteins, aber jedenfalls die vollständige
Sequenz einer Schablonen-mRNA vom 5'-Ende bis zum PolyA-Schwanz enthält.
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Das zur Zeit am weitesten verbreitete Verfahren zur Herstellung von cDNA ist
das nachstehend beschriebene Gubler-Hoffman-Verfahren [Gene 25, 263-269 (1983)}.
Der erste cDNA-Strang wird aus einer aus Zellen isolierten Poly(A)&spplus;RNA-Schablone und
einem Oligo-dT-Primer unter Verwendung von Umkehrtranskriptase synthetisiert.
Anschließend wird der RNA-Strang unter Verwendung von E.coli-RNase H, E.coli-DNA-
Polymerase I und E.coli-DNA-Ligase durch den zweiten DNA-Strang ersetzt. Nach dem
Abstumpfen beider Enden der doppelstrangigen cDNA mittels T4-DNA-Polymerase wird
eine geeignete Oligonukleotid-Linker-DNA hinzugefügt. Danach wird die resultierende
cDNA an einen Phagenvektor oder einen Plasmidvektor ligiert und zur Transformation
von E.coli eingesetzt. Es ist schwierig, nach diesem Verfahren eine cDNA voller Länge
zu erhalten, da bei der Synthese eines zweiten Strangs die 5'-terminale Sequenz von als
Primer verwendeter mRNA gelöscht wird; häufig werden beide cDNA-Termini durch
die Exonuklease-Aktivität von DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase gelöscht.
Vektoren, die einen Ursprung und einen Promotor zur Expression in Säugetierzellen,
einen Replikationsursprung eines einzelstrangigen Phagen und einen RNA-Polymerase-
Promotor enthalten, sind bekannt, z.B. pCDM8 [B. Seed, Nature 329, 840-842 (1987)].
Die Verwendung dieses Vektors ermöglicht die Herstellung der RNA-Sonde, die
Synthese von mRNA zur in vitro- oder in vivo-Translation und die Expression in
Säugetierzellen, die cDNA-Einfügung ist jedoch nicht orientiert. Somit erfüllt die nach
dem Gubler-Hoffman-Verfahren hergestellte cDNA-Sammlung die Anforderung 1) nicht.
Außerdem eignet sich der große, 4,8 kb lange Vektor pCDM8 nicht zum Klonieren
eines langen Stücks von cDNA.
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Das Okayama-Berg-Verfahren [Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 (1982)] ist als
Verfahren bekannt, das sehr häufig zu cDNA-Klonen voller Länge führt. Dabei wird der
Vektor-Primer mit dT-Schwanz mittels Umkehrtranskriptase zur Synthese des ersten
cDNA-Strangs aus Poly(A)&spplus;RNA verwendet. Nach der Addition des dC-Schwanzes wird
die dG-Schwanz-Linker-DNA ligiert und anschließend, mittels E.coli-RNaseH, E.coli-
DNA-Polymerase I und E.coli-DNA-Ligase, RNA durch DNA ersetzt. Da die Addition
des dC-Schwanzes am 3'-Ende des ersten, unvollständig erweiterten cDNA-Strangs
selten auftritt, ergibt der dC-Schwanz-Klon bevorzugt cDNA voller Länge. Die
Verwendung eines Vektor-Primers verursacht weiters die orientierte Einfügung von
cDNA. Okayama et al. [Mol. Cell. Biol. 3,280-289 (1983)] entwickelten das
Expressionssystem in Säugetierzellen unter Verwendung von Linker-DNA, die einen
Ursprung und einen Promotor von SV40 enthält. Honjo entwickelte das
Expressionssystem in Xenopus-Oocyten von in vitro-transkribierter mRNA mittels Linker-
DNA, die SP6-Promotor enthält [Jp-A-62-74.291; EP-A-0.218.432]. Die Anwendungen
des Okayama-Berg-Verfahrens sind jedoch beschränkt, da es hochentwickelte Technik
erfordert. Die große Anzahl an dG-Schwänzen am 5'-Terminus macht es häufig
schwierig, vom 5'-Terminus weg zu sequenzieren. Weiters ist es schwierig, nach
diesem Verfahren Sonden herzustellen. Somit entspricht die cDNA-Sammlung gemäß
diesem Verfahren nicht den zuvor beschriebenen Anforderungen 2) und 3).
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Obwohl es auch mehrere verbesserte Verfahren gibt, erfüllt keines davon alle
vier obigen Anforderungen. Da selbst die Nichterfüllung einer Anforderung die
Durchführung obiger Vogangsweise schwierig macht, ist die Entwicklung eines
Verfahrens vonnöten, das alle obigen Anforderungen erfüllt.
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In Anbetracht der obigen Ausführungen ist es wünschenswert, ein Verfahren zur
Konstruktion eines cDNA-Vektors bereitzustellen, der die folgenden vier Anforderungen
erfüllt, nämlich, daß er 1) den orientierten cDNA-Klon voller Länge enthält, 2) leicht zu
sequenzieren ist, 3) zur Herstellung einer RNA-Sonde verwendet werden kann, die zu
einer cDNA voller Länge komplementär ist und zum Screenen verwendet wird, und 4)
in einer Säugetierzelle exprimieren kann. Ein Plasmidvektor und ein davon abgeleiteter
Vektor-Primer sind zur Durchführung des obigen Verfahrens wünschenswert.
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Es gelang den Autoren der vorliegenden Erfindung, einen neuen Vektor zum
Klonieren von DNA und unter dessen Einsatz eine menschliche cDNA-Bank zu
konstruieren. Die Erfindung liefert einen Kloniervektor, umfassend einen in
Säugetierzellen wirksamen Promotor PR1, gefolgt von einer einzigen, in eukaryotischer
DNA selten vorkommenden Restriktions(enzym)stelle RE1 und einem RNA-Polymerase-
Promotor PR2, einer einzigen, einen 3'-abstehenden dN-Schwanz erzeugenden
Restriktions(enzym)stelle RE2, einer einzigen, beliebigen Restriktions(enzym)stelle RE3,
einer einzigen, beliebigen, einen 3'-abstehenden Terminus erzeugenden
Restriktions(enzym)stelle RE4, einer einzigen, in eukaryotischer DNA selten
vorkommenden Restriktions(enzym)stelle RES und einem RNA-Polymerasepromotor
PR3 und zumindest einer Art einer beliebigen, einen 3'-abstehenden Terminus
erzeugenden Restriktions(enzym)stelle RE6, der sich an beliebiger Position vor der
Restriktionsstelle RE1 befinden kann, und weiters, an anderen beliebigen Positionen als
den zuvor beschriebenen Bereichen, einen Ursprung OR1 zur Replikation in
Säugetierzellen, einen Ursprung OR2 zur Replikation eines einzelstrangigen Phagen,
einen Ursprung OR3 zur Replikation in E.coli und einen selektiven Marker.
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Die Erfindung liefert weiters einen Vektor-Primer, der aus einem zuvor
beschriebenen Kloniervektor-Plasmid hergestellt wird. Nach der Spaltung eines
Kloniervektors an einer Restriktionsstelle RE4 wird mittels terminaler
Desoxynukleotidyl-Transferase der dT-Schwanz daran addiert und anschließend an der
Restriktionsstelle RE3 gespalten.
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Die Erfindung liefert weiters ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA-Bank, die
cDNA-Vektoren umfaßt, die jeweils eine sequenzbestimmte cDNA-Einfügung enthalten
und in Säugetierzellen exprimiert werden können. Dieses Verfahren umfaßt: die
Synthese von cDNAS aus Poly(A)&spplus;RNA, die unter Verwendung des zuvor beschriebenen
Vektor-Primers aus Zellen isoliert wurde, das Transformieren von E.coli damit, die
Herstellung einer cDNA-Fleckensammlung durch Infektion eines Helfer-Phagen, und
das Sequenzieren der cDNA vom 5'-terminalen Ende weg unter Verwendung einer
einzelstrangigen DNA, die aus einem einzelstrangigen Phagen-Fleck isoliert wurde.
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Die Erfindung liefert weiters ein Verfahren zur Herstellung einer
sammlungsspezifischen cDNA-Bank, die cDNA-Vektoren umfaßt, die jeweils eine
sequenzbestimmte cDNA-Einfügung enthalten und in Säugetierzellen exprimiert werden
können. Dieses Verfahren umfaßt: die Herstellung von zwei Arten von cDNA-
Sammlungen LA und LB unter Anwendung obigen Verfahrens, die Herstellung von
Sense-RNA-Sonden aus der Sammlung LA mittels RNA-Polymerase, die Herstellung
einer Gruppe von einzelstrangigen Antisense-cDNAS aus der Sammlung LB, das
Erhalten der LA-sammlungsspezifischen cDNA-Klone durch Screenen der Sammlung LA
mittels Sonden, die ein Hybridisierungsgemisch zwischen RNA-Sonden und den zuvor
hergestellten, einzelstrangigen cDNAS enthalten, und deren Sequenzieren vom 5'-
Terminus weg.
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Unter Anwendung der Verfahren als Ausführungsformen der Erfindung kann eine
cDNA voller Länge ohne komplizierte Vorgänge, wie z.B. Subklonieren, Bestimmen
ihrer Nukleotidsequenz, Herstellen einer komplementären Sonde zum Screenen und
deren Exprimieren in Säugetierzellen, kloniert werden. Daher ist dieser Kloniervektor
ein bedeutendes Werkzeug, besonders zur Herstellung einer cDNA-Bank, deren
Ursprung in verschiedenen mRNAs liegt. Die "cDNA-Bank" in dieser Beschreibung
meint jene cDNA-Sammlung, in der die Nukleotidsequenz jedes cDNA-Klons bereits
bestimmt wurde. Es kann möglich sein, die Aminosäuresequenz aller Proteine einer
menschlichen oder einer beliebigen anderen Tier-Zelle in kürzerer Zeit zu bestimmen
als unter Anwendung herkömmlicher Verfahren.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Fig. 1 zeigt die Funktionen eines cDNA-Vektors gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 2 zeigt die Anordnung von Promotoren in einem Kloniervektor gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des Vektors pKA1;
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Fig. 4 zeigt ein Verfahren zur Synthese von cDNA unter Verwendung eines
Vektorplasmids;
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Fig. 5 zeigt das Subtraktionsverfahren unter Verwendung eines cDNA-Systems
gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 6 - 8 zeigen die Vorgänge zur Konstruktion von Vektoren gemäß
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 9 zeigt das Verfahren zur Herstellung eines Vektor-Primers gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
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Fig. 10 zeigt die Ergebnisse von Fleckhybridisierung und Subtraktion nach der
Arbeitsvorschift gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung
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Fig. 1 zeigt die Funktionen eines cDNA-Vektors gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Es werden nun das Konstruktionsverfahren eines
Kloniervektors, das Herstellungsverfahren eines cDNA-Vektors unter Verwendung
desselben und Beispiele beschrieben, die zeigen, daß dieser cDNA-Vektor die obigen
vier Anforderungen erfüllt.
(1) Kloniervektor
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Der charakteristischste Punkt dieser Erfindung ist der zur cDNA-Synthese
eingesetzte Kloniervektor. Der Vektor-Primer enthält den cDNA-Klon voller Länge und
ist vorzugsweise mit den multifuktionalen Eigenschaften ausgestattet, um die
Anforderungen 2), 3) und 4) zu erfüllen. Wie zuvor beschrieben umfaßt der in dieser
Erfindung enthaltene Kloniervektor einen in Säugetierzellen wirksamen Promotor PR1,
gefolgt von einer einzigen, in eukaryotischer DNA selten vorkommenden
Restriktions(enzym)stelle RE1 und einem RNA-Polymerase-Promotor PR2, einer
einzigen, einen 3'-abstehenden dG-Schwanz erzeugenden Restriktions(enzym)stelle
RE2, einer einzigen, beliebigen Restriktions(enzym)stelle RE3, einer einzigen,
beliebigen, einen 3'-abstehenden Terminus erzeugenden Restriktions(enzym)stelle RE4,
einer einzigen, in eukaryotischer DNA selten vorkommenden Restriktions(enzym)stelle
RE5 und einem RNA-PolymerasePromotor PR3 und zumindest einer Art einer
beliebigen, einen 3'-abstehenden Terminus erzeugenden Restriktions(enzym)stelle RE6,
der sich an beliebiger Position vor der Restriktionsstelle RE1 befinden kann, und
weiters, an anderen beliebigen Positionen als den zuvor beschriebenen Bereichen,
einen Ursprung OR1 zur Replikation in Säugetierzellen, einen Ursprung OR2 zur
Replikation eines einzelstrangigen Phagen, einen Ursprung OR3 zur Replikation in
E.coli und einen selektiven Marker.
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Der Ausdruck "einzig" bedeutet in obiger Beschreibung, daß die
Restriktionsstelle auf dem Plasmid nur einmal vorkommt. Fig. 2 zeigt die Anordnung der
Promotoren PR1, PR2 und PR3. Eine Änderung der Reihenfolge von RE1 und RE2,
sowie der Reihenfolge von RES und PR3 ist zulässig. Wünschenswerterweise existiert
zwischen der Restriktionsstelle und dem Promotor keine weitere Nukleotidsequenz. Die
Restriktionsstellen RE2, RE3 und RE4 sind zur Erfüllung von Anforderung 1) notwendig,
OR2 und RE6 für Anforderung 2), PR2, PR3, RE1, RES und OR2 für Anforderung 3) und
OR1 und PR1 für Anforderung 4).
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Ein Promotor zur Expression in Säugetierzellen, PR1, umfaßt Promotoren, wie
z.B. einen frühen oder späten Promotor von SV40, einen späten Promotor von
Adenovirus 2 und eine lange 5'-germinale Wiederholung ("5' long terminal repeat",
LTR) von Retrovirus. Eine einzige, in eukaryotischer DNA selten vorkommende
Restriktions(enzym)stelle, RE1 und RE5, umfaßt Restriktionsstellen, wie z.B. NotI, SnaBI,
SfiI und Spel. Eine einzige, nach der Spaltung 3'-abstehende dG-Oligomer-Schwänze
erzeugende Restriktions(enzym)stelle, RE2, umfaßt Restriktionsstellen, wie z.B. BstXI,
SfiI, DraIII und BglI. Da die Nukleotidsequenz von Spaltstellen in diesen
Restriktions(enzym)stellen durch beliebige Nukleotidpaare ersetzt werden kann, erzeugt
die Spaltung mit diesen Restriktionsenzymen, falls darin das Paar dG-dC als
Nukleotidpaar verwendet wird, einen 3'-abstehenden dG-Terminus. Beispielsweise ist
die Nukleotidsequenz der Restriktionsstelle für BstXI die folgende:
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Falls in der oberen Sequenz N durch G ersetzt wird, erzeugt die Spaltung dieser
Stelle mit BstXI die folgende terminale Sequenz:
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Somit umfaßt RE2 jede beliebige Art von Restriktionsstelle, die nach Spaltung mit
Restriktionsenzym einen 3'-abstehenden Teminus erzeugt, und ist daher nicht auf obige
Beispiele beschränkt.
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RE6, die zumindest eine Art einer beliebigen, einen 3'-abstehenden Terminus
erzeugenden Restriktions(enzym)stelle umfaßt, der sich an beliebiger Position vor der
Restriktionsstelle RE1 befinden kann, umfaßt eine beliebige, einen 3'-abstehenden
Terminus erzeugenden Restriktionsstelle, solange sich diese von RE1, RE2, RE3, RE4
und RE5 unterscheidet und vorzugsweise selten in eukaryotischer DNA vorkommt. Ein
Beispiel dafür ist SfiI, es gibt jedoch noch zahlreiche andere Beispiele.
Wünschenswerterweise enthält RE6 mehr als zwei verschiedene Restriktionsstellen. Es
ist nicht notwendig, daß RE6 eine einzige Stelle darstellt, jedoch daß sie sich stromauf
von RE1 befindet.
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Die RNA-Polymerase-Promotoren PR2 und PR3 umfassen Polymerasen-
Promotoren, wie z.B. T3-RNA-Polymerase, T7-RNA-Polymerase und SP6-RNA-
Polymerase-Promotoren. Der Replikationsursprung für Säugetierzellen, OR1, umfaßt
beispielsweise einen SV40-Ursprung. Der Replikationsursprung für einen
einzelstrangigen Phagen, OR2, umfaßt Ursprünge von f1-Phagen oder M13-Phagen. Der
Replikationsursprung für E.coli, OR3, umfaßt Ursprünge von Plasmiden, wie z.B. der
pBR322- oder pUC-Reihen. Ein selektiver Marker umfaßt Arzneimittelresistenz-Marker,
wie z.B. jene für Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin, und die anderen Marker, wie
z. B. Nährstoffanforderungen oder Temperaturempfindlichkeit. Obwohl ein
Neomycinresistenz-Gen als Arzneimittel resistenz-Marker für ein Säugetierzellsystem in
diesen Vektor eingefügt werden kann, führt dies zum Nachteil, daß der Vektor zu lang
wird. Weiters ist es wünschenswert, zur starken Expression in Säugetierzellen eine
Spleißverbindung und eine PolyA-Additions-Signalsequenz miteinzubeziehen.
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Es wird in orientierter Weise eine cDNA zwischen den Restriktionsstellen RE2
und RE4 eingebracht, in der der 5'-Teminus von mRNA an RE2 angrenzt. Die Richtung
des Replikationsursprungs für einen einzelstrangigen Phagen bestimmt, welcher der
Doppelstränge im Vektorplasmid als einzelner Strang produziert wird. In diesem
Vektorsystem besteht die einzelstrangige DNA aus einem Antisense-Strang für cDNA. In
dieser Beschreibung ist jener Strang, der dieselbe Sequenz aufweist wie
SchablonenmRNA, außer daß U durch T ersetzt ist, als Sense-Strang und die komplementäre
Sequenz als Antisense-Strang definiert.
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Um die Nukleotidsequenz vom 5'-Terminus von cDNA weg zu bestimmen,
kann jedes synthetische Oligonukleotid als Sequenzier-Primer verwendet werden, das
stromauf von RE2 anneliert. Falls der Vektor die Nukleotidsequenzen von Primern zum
Sequenzieren von M13 aufweisen soll, können diese Primer zum Sequenzieren einer
cDNA-Einfügung verwendet werden.
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Ein RNA-Polymerase-Promotor PR2 wird in den Vektor in jener Richtung
eingeführt, daß eine einzelstrangige RNA als Sense-Strang für die mRNA-Schablone
erzeugt wird. Auf dieselbe Weise wird PR3 eingeführt, um einen Antisense-Strang zu
erzeugen. Das oben beschriebene Plasmid kann unter Verwendung von bekannten
Plasmiden und synthetische Oligonukleotiden leicht konstruiert werden. Das
nachstehend als Beispiel beschriebene Plasmid pKA1 verwendet einen frühen Promotor
von SV40 als PR1, SnaBI als RE1, einen T7-Promotor als PR2, BstXI als RE2, EcoRI als
RE3, KpnI als RE4, NotI als RE5, einen T3-Promotor als PR3, SfiI, PstI und SphI als RE6,
einen SV40-Ursprung als OR3, einen Ampillresistenz-Marker (β-Lactamase-Gen) als
Arzneimittelresistenz-Marker und die Nukleotidsequenzen des universellen und
Umkehr-Primers von M13-Phagen als Primerstelle, wo ein Sequenzier-Primer anneliert.
pKA1 umfaßt weiters eine 165-Spleißstelle stromab von einem SV40-Promotor und eine
PolyA-Additions-Signalsequenz stromab von einem T3-Promotor. Die Größe von pKA1
beträgt 3,6 kb; er ist somit kürzer als bekannte, multifunktionale Kloniervektoren, was es
leichter macht, längere cDNA-Klone zu erhalten.
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Das oben beschriebene Plasmid wird an der Restriktionsstelle RE4 gespalten, um
einen 3'-abstehenden Terminus zu erzeugen, wonach unter Verwendung von
terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase der dT-Schwanz an den Terminus addiert
wird. Die gewünschte Anzahl an addiertem dT beträgt 30 - 70, vorzugsweise 50 - 60.
Nach Spaltung an der Restriktionsstelle RE3 wird das längere, einen Vektor enthaltende
DNA-Fragment mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert und als Vektor-Primer
verwendet.
(2) Herstellungsverfahren der cDNA-Sammlung
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Nach bekannten Verfahren aus Zellen isolierte Poly(A)&spplus;RNA wird mit einem
oben beschriebenen Vektor-Primer anneliert, wonach Umkehrtranskriptase verwendet
wird, um den ersten cDNA-Strang zu synthetisieren. Der dC-Schwanz, deren Anzahl
vorzugsweise 4 - 10 beträgt, wird unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-
Transferase an das Ende des ersten cDNA-Strangs addiert. Nach Spaltung an
Restriktionsstelle RE2 erfolgt Selbstligation unter Einsatz von E.coli-DNA-Ligase. Danach
wird der RNA-Strang unter Verwendung von E.coli-RNase, E.coli-DNA-Polymerase I und
E.coli-DNA-Ligase durch den zweiten cDNA-Strang ersetzt. Dieser Vorgang wird in Fig.
4 gezeigt. Das erhaltene Ligationsgemisch, das cDNA-enthaltendes Plasmid enthält,
wird zur Transformation eines E.coli-Wirts mit einem F'-Faktor eingesetzt. Beispiele für
einen E.coli-Strang mit einem F'-Faktor sind Wirte, wie z.B. NM522, JM101, JM103,
JM105, JM109 und DH5αF'. Die eine cDNA-Sammlung bildenden Transformanten
werden in einem geeigneten Medium kultiviert und amplifiziert, wie z.B. L-Kulturbrühe
oder 2xTY, die Ampicillin enthalten, falls der Vektor ein Ampicillinresistenz-Gen
aufweist, und anschließend nach Zugabe von Glycerin oder DMSO in einem
Tiefkühlschrank gelagert. Falls die Kultur der cDNA-Sammlung mit einem Helfer-Phagen
infiziert wird, setzt jede E.coli-Zelle in einem Medium einen Phagen frei, der eine von
einem cDNA-Vektor stammende, einzelstrangige cDNA enthält. Diese einzelstrangige
cDNA besitzt einen Antisense-Strang für die mRNA-Schablone. Nach der Infektion der
cDNA-Sammlung mit dem Helfer-Phagen und Inkubation werden E.coli-Zellen
abgenommen, sorgfältig mit Medium gewaschen, um den Helfer-Phagen zu entfernen,
und mit Medium verdünnt. Diese verdünnte Zellösung wird mit einer Weichagar-oder
Weichagarose-Lösung vermischt, die einen E.coli-Wirt enthält, der keinen cDNA-Vektor
aufweist, und das Gemisch auf Agar-Platten gegossen. Nach der Inkubation sind dort
Flecken zu erkennen, wo cDNA-hältige Zellen existieren. Mit einem Zahnstocher aus
einem einzelnen Fleck entnommene E.coli-Zellen werden in einem flüssigen Medium,
wie z.B. 2xTY, kultiviert. Ein Teil des Kulturmediums wird in einem Tiefkühlschrank
aufbewahrt. Nach dem Zentrifugieren der übrigen Kultur wird das Zellpellet dazu
verwendet, Plasmid zu isolieren, und der Überstand dazu, Phagen zu isolieren, aus
denen nach bekannten Verfahren eine einzelstrangige cDNA isoliert wird.
Günstigerweise wird ein Teil des phagenhältigen Überstands in einem Kühlschrank
aufbewahrt. Ein zuvor verwendeter Helfer-Phage umfaßt Phagen, wie z.B. M13K07 [J.
Vieira und J. Messing, "Methods in Enzymology" 153, 3 (1987)], VCS-M13 und R408
(beide von Stratagene erhältlich).
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Es kann eine alternative Vorgangsweise zum Isolieren einer einzelstrangigen
cDNA gewählt werden, worin vor der Phagen-Infektion eine einzelne Kolonie
entnommen, inkubiert und erst danach mit Helfer-Phagen infiziert wird.
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Nach obigem Verfahren können verschiedene Arten von cDNA-Sammlungen
hergestellt werden, wie z.B. Transformanten, die enthalten: cDNA-Vektoren, deren
Ursprung eine einzige mRNA-Art ist, cDNA-Vektoren als doppelstrangige DNA, cDNA-
Vektoren als einzelstrangige DNA, sowie Phagen, die eine einzelstrangige DNA
enthalten.
(3) Bestimmungsverfahren der Nukleotidsequenz
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Es kann entweder eine einzelstrangige oder eine doppelstrangige DNA
verwendet werden. Einzelstrangige DNA wird bevorzugt, da mehr Nukleotidsequenzen
gelesen werden können. Die Nukleotidsequenz kann nach einem Didesoxyverfahren
bestimmt werden, in dem ein synthetisches Oligonukleotid, 17-Mer bis 20-Mer, das der
Nukleotidsequenz kurz vor der Restriktionsstelle RE2 entspricht, als Sequenzier-Primer,
sowie mit Radioisotopen oder Fluoreszenzfarbstoff markierte Substrate verwendet
werden. Die Sequenzier-Reaktion erfolgt mittels Enzymen, wie z.B. Klenow-Fragment,
Taq-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase und Umkehrtranskriptase. Bei Verwendung
von pKA1 kann ein universeller Primer zur M13-Seguenzierung eingesetzt werden, mit
dem ungefähr 400 Nukleotide vom 5'-Terminus von cDNA weg bestimmt werden
können. Falls die cDNA ein Klon voller Länge ist, kann in der bestimmten Sequenz ein
Initiationscodon, gefolgt von einem offenen Leserahmen gefunden werden. Falls
innerhalb des offenen Leserahmens kein Stopcodon auftritt, ist es notwendig, die
weitere Sequenz zu bestimmen, in welchem Fall zur weiteren Sequenzierung ein neuer
Primer synthetisiert werden sollte, der der Nukleotidsequenz nahe dem 3'-Ende der
bestimmten Sequenz entspricht. Bei Verwendung des Plasmids der vorliegenden
Erfindung können die von einem 5'-Terminus einer cDNA-Einfügung weg gelöschten
Derivate durch Spaltung des die cDNA enthaltenden Plasmids an den Restriktionsstellen
RE1 und RE6 und anschließende Exonuklease-Behandlung nach dem bekannten
Löschungsverfahren hergestellt werden. Diese Derivate können dazu eingesetzt werden,
die Nukleotidseguenz unter Verwendung eines der Nukleotidsequenz kurz vor der
Restriktionsstelle RE6 entsprechenden Primers zu bestimmen, der im Fall des pKA1-
Systems dem Umkehr-Primer für M13 entspricht.
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Da die erhaltene Nukleotidsequenz der Sequenz eines Sense-Strangs entspricht,
die dieselbe ist, wie jene der mRNA, kann diese Sequenz dazu verwendet werden, in
Datenbanken nach Ähnlichkeiten zu bekannten Sequenzen zu suchen: in einer DNA-
Datenbank nach einer Nukleotidsequenz und einer Protein-Datenbank nach einer
Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens. Falls es Ähnlichkeiten zu einer
bekannten Sequenz gibt, können die Funktion und die Eigenschaften des Proteins, für
das die erhaltene cDNA kodiert, abgeschätzt werden.
(4) Screeningverfahren
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Wenn gewünscht wird, die Sequenzen aller in der cDNA-Sammlung enthaltenen
cDNA-Klone zu bestimmen, ist es günstig, die bereits sequenzierten Klone aus der
Sammlung zu entfernen, um überlappendes Sequenzieren desselben Klons zu
vermeiden. Ein Aspekt der Erfindung bietet ein Substraktionsverfahren, das obigen
Ansprüchen gerecht wird. Dieses Verfahren kann auch angewandt werden, um
zellspezifische Klone oder stimulusinduzierte Klone zu erhalten.
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Es wird nun ein Beispiel dafür beschrieben, daß von einer cDNA-Sammlung LA
eine cDNA-Sammlung LB subtrahiert wird. Dieser Fall entspricht jenem, daß eine
Sammlung LA neue oder spezifische Klone enthält und andererseits eine Sammlung LB
Klone mit bereits bestimmter Sequenz oder gemeinsame Klone enthält. Die Sammlung
LA wird kultiviert und amplifiziert und alle Plasmide, die cDNA-Vektoren enthalten,
isoliert, an der Restriktionsstelle RE5 gespalten und anschließend mit der auf eine
Promotor-Stel le PR2 wirkenden RNA-Polymerase umgesetzt. Falls das mit Radioisotopen
oder Fluoreszenzfarbstoff markierte Substratnukleotid dem Reaktionsgemisch zugesetzt
wird, wird die dem Sense-Strang für jede cDNA entsprechende, markierte RNA erhalten.
Andererseits wird die Sammlung LB kultiviert und mit einem Helfer-Phagen infiziert, um
aus dem Überstand eine einzelstrangige DNA zu präparieren. Bei Vermischen und
Hybridisieren der aus der Sammlung LA erzeugten, markierten RNA mit der aus der
Sammlung LB erzeugten, einstrangigen DNA hybridisiert der Sense-RNA-Strang mit der
entsprechenden, einzelstrangigen Antisense-DNA, die aus den gemeinsamen, in beiden
Sammlungen vorkommenden cDNA-Klonen stammt, die von spezifischen cDNA-
Klonen in einer Sammlung LA stammende RNA bleibt jedoch frei. Falls dieses
Hybridisierungsgemisch als Sonde zum Screenen der Sammlung LA mittels
Fleckhybridisierung oder Koloniehybridisierung verwendet wird, können spezifische,
nur in der Sammlung LA vorkommende Klone erhalten werden. Das Prinzip des oben
beschriebenen Subtraktionsverfahrens ist in Fig. 5 dargestellt.
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Da der in dieser Erfindung beschriebene cDNA-Vektor einen Promotor PR3 für
eine RNA-Polymerase nach dem 3'-cDNA-Terminus aufweist, kann durch Spaltung des
cDNA-Vektors an der Restriktionsstelle RE1 und Umsetzung mit einer auf PR3
wirkenden RNA-Polymerase eine RNA-Sonde erzeugt werden, die aus einem Antisense-
Strang für cDNA besteht. Das Produkt kann als Sonde für Nothern-Hybridisierung
eingesetzt werden.
(5) Expression in tierischen Zellen
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Da der in dieser Erfindung beschriebene cDNA-Vektor einen in Säugetierzellen
funktionierenden Replikationsursprung und Promotor aufweist, kann dieser zur
Expression in Säugetierzellen eingesetzt werden, falls das isolierte, cDNA-hältige
Plasmid nach bekannten Verfahren, wie z.B. einem Phosphat-Kalzium-Verfahren oder
einem Elektroporationsverfahren, in Zellen eingebracht wird. Falls die eingebrachte
cDNA für ein Rezeptorprotein oder ein sekretiertes Protein kodiert, kann dieses
Verfahren für ein Expressions-Screenen eingesetzt werden.
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Durch Spaltung an der Restriktionsstelle RE5 und deren Umsetzung mit CAP-
ähnlichem Nukleotidsubstrat, wie z.B. m&sup7;GpppG, und auf PR2 wirkender RNA-
Polymerase kann RNA erhalten werden, die in in vitro- oder Xenopus-Oozyten-
Translationssystemen verfügbar ist.
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Die vorliegende Erfindung wird nun in Form von Beispielen beschrieben; es
können jedoch verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden,
ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Das Grundverfahren der DNA-Rekombination und die Reaktionsbedingungen
entsprachen der Literatur [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
Beispiel 1
Konstruktion von Kloniervektor pKA1
(1) Herstellung von pTZ18RPI (Fig. 6)
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Es wurden 10 ug des Plasmids pTZ18RP1 (erhältlich von Pharmacia) mit 100
Einheiten BamHI und 100 Einheiten EcoRI gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde
mittels Elektrophorese auf 0,8%-igem Agarosegel (AGE) fraktioniert und anschließend
ein 2,9 kb-DNA-Fragment aus dem Gel isoliert. Es wurden 10 pMol der synthetischen
Oligomere L1 und L2, die die Restriktions(enzym)stellen EcoRI, BstXI, EcoRV, KpnI,
NotI und BamHI enthielten, an das obige DNA-Fragment anneliert und ligiert.
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E.coli-HB101 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und aus mehreren
Transformanten Plasmide isoliert. Nachdem die Einfügungsstelle von synthetischem
Oligomer in den Plasmiden unter Verwendung eines reversen Promers zur M13-
Sequenzierung sequenziert wurde, wurde das die gewünschte Sequenz enthaltende
Plasmid mit pTZ18RP1 bezeichnet (Fig. 6).
(2) Herstellung von pTZ18RP2 (Fig. 6)
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Mittels stellengerichteter Mutagenese wurde vor einem T7-Promotor die SnaBI-
Stelle eingeführt. Mit dem unter Abschnitt (1) hergestellten Plasmid pTZ18RP1
transformierte E.coli-CJ236 (BioRad) wurden in 5 ml 2xTY-Medium mit 50 ug/ml
Ampicillin bei 37ºC 1 h lang kultiviert. Anschließend wurde ein Helfer-Phage
M13K07 (Pharmacia) in Lösung zugesetzt und bei 37ºC über Nacht inokuliert. Aus
dem Kulturmedium wurde eine einzelstrangige DNA (ssDNA) isoliert. Die ssDNA,
anneliert mit 10 pMol synthetischem Oligomer L3, worin der 5'-Terminus mittels T4-
Polynukleotidkinase phosphoryliert war, wurde mit 4 Einheiten Klenow-Fragment, 350
Einheiten T4-DNA-Ligase und 0,8 mM dNTPs vermischt und 5 min lang bei 4ºC, 5 min
lang bei Raumtemperatur und schließlich 2 h lang bei 37ºC inkubiert.
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E.coli-JM109 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und aus mehreren
Transformanten Plasmide isoliert. Jenes Plasmid, das mit SnaBI gespalten werden konnte
und die gewünschte Sequenz enthielt, wurde mit pTZ18RP2 bezeichnet.
(3) Herstellung von pTZ18RP3 (Fig. 6)
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Es wurde ein T3-Promotor an der BamHI-Stelle von pTZ18RP2 eingeführt. 10 ug
des unter Abschnitt (2) hergestellten pTZ18RP2 wurden mit 100 Einheiten BamHI
gespalten. Nach Fraktionierung des Reaktionsgemischs mittels 0,8%-AGE wurde ein
DNA-Fragment aus dem Gel isoliert. 10 pMol der synthetischen Oligomere L4 und L5,
die einen T3-Promotor enthielten, wurden an obiges DNA-Fragment anneliert und
ligiert.
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E.coli-NM522 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und aus mehreren
Transformanten Plasmide isoliert. Jenes Plasmid, das die gewünschte Sequenz enthielt,
wurde mit pTZ18RP3 bezeichnet.
(4) Herstellung von pTZ18RP4 (Fig. 6)
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Es wurde die Xhol-Stelle und eine universelle Primersequenz (mit U bezeichnet)
zur M13-Sequenzierung wurde in die SnaBI-Stelle von pTZ18RP3 eingeführt. 10 ug des
unter Abschnitt (3) hergestellten pTZ18RP3 wurden mit 100 Einheiten SnaBI gespalten.
Nach Fraktionierung des Reaktionsgemischs mittels 0,8%-AGE wurde ein DNA-Fragment
aus dem Gel isoliert. 10 pMol der synthetischen Oligomere L6 und L7, die eine Xhol-
Stelle und eine universelle Primersequenz (mit U bezeichnet) zur M13-Sequenzierung
enthielten, wurden an obiges DNA-Fragment anneliert und ligiert.
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E.coli-NM522 (Stratagene) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und
aus mehreren Transformanten Plasmide isoliert. Jenes Plasmid, das die gewünschte
Sequenz enthielt, wurde mit pTZ18RP4 bezeichnet.
(5) Herstellung von pTZ19UD1 (Fig. 7)
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Zwischen den BglI- und den BamHI-Stellen im Plasmid pTZIgU wurde eine
Umkehr-Primersequenz (mit R bezeichnet) eingeführt. 2 ug pTZ19U (Toyobo) wurden
mit 20 Einheiten BglI bei 37ºC 15 min lang partiell gespalten. Nach Fraktionierung
mittels 1,2%-AGE wurde ein an einer Seite gespaltenes 2,8 kb-Fragment aus dem Gel
isoliert. Nach Spaltung dieses Fragments mit 100 Einheiten Bamhl wurde mittels 1,2%-
AGE ein 2,7 kb-Fragment isoliert. 10 pMol der synthetischen Oligomere L8 und L9, die
eine Umkehr-Primersequenz (mit R bezeichnet) zur M13-Sequenzierung enthielten,
wurden an das BamHI-BgII-Fragment von pTZI9U anneliert und ligiert.
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E.coli-JM109 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und aus mehreren
Transformanten Plasmide isoliert. Jenes Plasmid, das die gewünschte Sequenz enthielt,
wurde mit pTZ19UD1 bezeichnet.
(6) Herstellung von pKA0 (Fig. 7)
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10 ug des unter Abschnitt (5) hergestellten pTZ19UD1 wurden mit 100 Einheiten
BglI und 100 Einheiten HindIII gespalten. Nach Fraktionierung mittels 1,2%-AGE wurde
ein 1,4 kb-Fragment, das einen f1-Ursprung enthielt, aus dem Gel isoliert. 10 ug pL1
(Pharmacia) wurden mit 100 Einheiten HindIII und 100 Einheiten BamHI gespalten.
Nach Fraktionierung mittels 1,8%-AGE wurde ein 420 bp-Fragment, das einen Ursprung
und einen frühen Promotor von SV40 enthielt, aus dem Gel isoliert. 10 ug pcDV1
(Pharmacia) wurden mit 100 Einheiten BamHI und 100 Einheiten BGlI gespalten. Nach
Fraktionierung mittels 0,8%-AGE wurde ein 1,6 kb-Fragment, das eine PolyA-Additions-
Signalsequenz enthielt, aus dem Gel isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert und
anschließend E.coli-HB101 mit dem Ligationsgemisch transformiert. Aus mehreren
Transformanten wurden Plasmide isoliert und mit BamHI, BgII und HindIII gespalten,
um zu bestätigen, daß die Restriktionskarte des erhaltenen Plasmids mit jener von pKAO
übereinstimmte.
(7) Herstellung von pKA1a (Fig. 8)
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Nachdem 10 ug des unter Abschnitt (4) hergestellten pTZ18RP4 mit 100
Einheiten BamHI und 100 Einheiten Xhol gespalten wurden, wurde durch
Fraktionierung mittels 1,8%-AGE wurde ein 117 bp-Fragment isoliert. Andererseits
wurde nach der Spaltung von 10 pg des unter Abschnitt (6) hergestellten pKAO mit 100
Einheiten BamHI und 100 Einheiten Xholl durch Fraktionierung mittels 0,8%-AGE ein
3,3 kb-Fragment isoliert. Die beiden Fragmente wurden ligiert und anschließend
E.coli-HB101
mit dem Ligationsgemisch transformiert. Aus mehreren Transformanten wurden
Plasmide isoliert und mit BamHI und Xhol gespalten, um zu bestätigen, daß die
Restriktionskarte des erhaltenen Plasmids mit jener von pKA1a übereinstimmte.
(8) Herstellung von pKA1b (Fig. 8)
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10 ug pL1 wurden mit 100 Einheiten PstI gespalten und die Termini mittels T4-
DNA-Polymerase abgestumpft. Nach der Spaltung dieses Fragments mit HindIII wurde
durch Fraktionierung mittels 1,8%-AGE wurde ein 500 bp-Fragment isoliert, das einen
SV40-Promotor und eine 16S-Spleißstelle enthielt.
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1 ug pKA1a wurde mit 100 Einheiten Xhol gespalten und die Termini mit
Klenow-Fragment abgestumpft. Nach Spaltung dieses Fragments mit HindIII wurde
mittels 0,8%-AGE ein 3 kb-Fragment isoliert.
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Die beiden Fragmente wurden ligiert und anschließend E.coli-HB101 mit dem
Ligationsgemisch transformiert. Aus mehreren Transformanten wurden Plasmide isoliert
und mit HindIII und BamHI gespalten, um zu bestätigen, daß die Restriktionskarte des
erhaltenen Plasmids mit jener von pKA1b übereinstimmte.
(9) Herstellung von pKA1 (Fig. 8)
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Nach der Spaltung von 10 ug pKA1b mit 100 Einheiten HindIII wurde mittels
1,8%-AGE ein 3,6 kb-Fragment isoliert. 10 pMol der synthetischen Oligomere L10 und
L11, die eine SfiI-Restriktionsstelle enthielten, wurden an obiges Fragment anneliert und
igiert.
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E.coli-HB101 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert und aus mehreren
Transformanten Plasmide isoliert. Nach dem Sequenzieren der Oligomer-
Einfügungsstelle unter Verwendung eines Umkehr-Primers zur M13-Sequenzierung
wurde das die gewünschte Sequenz enthaltende Plasmid mit pKA1 bezeichnet. Die
Reihenfolge der Restriktionsstellen darin war Sphl-SfiI-HindIII. Die Details der
Restriktionskarte von pKA1 wurden bereits in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 2
Herstellung der cDNA-Sammlung
(1) Herstellung des Vektor-Primers
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Nach der Spaltung von 100 ug pKA1 mit 200 Einheiten KpnI wurde mittels 1,8%-
AGE ein Fragment isoliert. 70 ug Fragment wurden bei 37ºC 30 min lang im
Reaktionsgemisch inkubiert, das 20 uMol dTTP und 375 Einheiten terminaler
Desoxynukleotidyl-Transferase (Takara Shuzo) enthielt. Die Anzahl der dT-
Schwanzabschnitte wurde auf etwa 60 geschätzt, was aus der Aufnahme des zu einem
Teil des Reaktionsgemisch zugegebenen [α-³²P]dTTP berechnet wurde. Nach Spaltung
mit EcoRV und Fraktionierung mittels 0,8%-AGE wurde ein längeres Fragment isoliert
und als Vektor-Primer eingesetzt.
(2) Herstellung von Poly(A)+RNA
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Unter Anwendung eines Guanidinium/Thiocyanat-Verfahrens wurde die gesamte
mRNA aus der Zellkultur menschlicher Zellinien, wie z.B. HUT-78, HUT-102, U937
und HT-1080, isoliert. Aus dieser mRNA wurde unter Verwendung einer Oligo-dT-Säule
Poly(A)&spplus;RNA gereinigt.
(3) Synthese von cDNA
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Das vollständige Verfahren zur cDNA-Synthese ist in Fig. 4 dargestellt. Es wurden
die in der Vorschrift des Okayama-Berg-Verfahrens beschriebenen
Reaktionsbedingungen eingesetzt. Die Enzyme stammten von Takara Shuzo. Kurz
gesagt wurde nach dem Annelieren von 3 ug der unter Abschnitt (2) hergestellten
Poly(A)&spplus;RNA mit 1,5 ug des unter Abschnitt (1) hergestellten Vektor-Primers Umkehr-
Transkriptase zugesetzt, um den ersten cDNA-Strang zu synthetisieren. Das
Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert und die cDNA anschließend durch
Zugabe von Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde in der Reaktionslösung, die 1
uMol dCTP enthielt, gelöst und mit 15 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyl-
Transferase umgesetzt, um einen dC-Schwanz zu addieren. Nach Phenol-Extraktion und
Ethanol-Fällung des Reaktionsgemischs wurde das Produkt mit 50 Einheiten BstXI (New
England Biolabs) gespalten. Nach Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung des
Reaktionsgemischs wurde das Produkt unter Verwendung von E.coli-DNA-Ligase
anneliert und selbstligiert. Danach wurden durch Zugabe von dNTPs, einschließlich von
dATP, dGTP, dCTP und dTTP, E.coli-DNA-Polymerase und E.coli-RNase H die RNA-
Stränge durch die DNA-Stränge ersetzt.
(4) Herstellung der cDNA-Sammlung
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E.coli-NM522 wurde mit der die unter Abschnitt (3) hergestellten cDNA-
Vektoren enthaltenden Lösung transformiert. Die Transformanten wurden in 2xTY-
Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, suspendiert und bei 37ºC über Nacht
inkubiert. Die Anzahl der in der Sammlung enthaltenen, unabhängigen Klone wurde
durch Zählen der auf der Agarplatte auftretenden Anzahl an Kolonien auf etwa 2 x 10&sup5;-
10&sup6; geschätzt. Ein Teil der Kultur wurde mit Helfer-Phage M13KO7 (Pharmacia) infiziert
und nach Zugabe von 70 ug/ml Kanamycin bei 37ºC über Nacht inkubiert. Ein Teil der
resultierenden Kultur wurde bei -80ºC als 15%-ige Lösung in Glycerin gelagert.
(5) Isolierung des cDNA-Vektorplasmids
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Die aus der unter Abschnitt (4) hergestellten cDNA-Sammlung bestehende E.coli-
Kultur wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das erhaltene Pellet wurde sorgfältig mit
2xTY-Medium gewaschen, mit einer E.coli-NM522-Kultur und einem Weichagar-
Medium vermischt, auf 37ºC warmgehalten und auf 2xTY-Agarplatten gegossen. Nach
Inkubation bei 37ºC über Nacht wurde ein einziger auf den Platten auftretender Fleck
isoliert, in 2xTY-Medium suspendiert und bei 37ºC über Nacht inokuliert. Die Kultur
wurde durch Zentrifugation in Zellpellet und Überstand getrennt. Aus dem Zellpellet
wurde ein doppelstrangiges Plasmid isoliert, aus dem Überstand eine einzelstrangige
DNA. Die gesamten Kulturen wurden bei -80ºC als 15%-ige Lösung in Glycerin, das
doppelstrangiges Plasmid und die einzelstrangige DNA bei -20ºC als TE-Lösung und der
Kulturüberstand bei -4ºC in einem Kühlschrank gelagert.
Beispiel 3
Herstellung der menschlichen cDNA-Bank
(1) Größenbestimmung der menschlichen cDNA-Einfügung
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Die unter Abschnitt (5) aus Beispiel 2 isolierten, doppelstrangigen Plasmide
wurde mit EcoRI und NotI gespalten. Die größe des resultierenden cDNA-Fragments
wurde mittels 0,8%-AGE bestimmt.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz
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Die Bestimmung der Nukleotidsequenz einer in Abschnitt (5) aus Beispiel 2
hergestellten, einzelstrangigen cDNA erfolgte unter Verwendung eines DNA-Sequencers
(Applied Biosystems). Die Sequenzierungsreaktion erfolgte nach dem Didesoxy-
Verfahren unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten, universellen Primers zur
M13-Seguenzierung und von Tag-Polymerase. Durch dieses Verfahren konnte die
Nukleotidsequenz von etwa 400 bp vom 5'-Ende der cDNA weg erhalten werden. Es
wurden die etwa 4 - 10 dG-Schwänze am 5'-Ende der cDNA entdeckt. Die erhaltenen
Nukleotidsequenzen wurde auf Computerdiskette unter dem Titel "Homo-Protein cDNA
database" gespeichert.
(3) Analyse der Nukleotidsequenz
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Die gespeicherten Nukleotidsequenzen wurden mittels Computersoftware,
einschließlich des Analysesystems der genetischen Information ("genetic information
analysis System", GENIAS) und des Analysesystems der Protein-Information ("protein
information analysis System", PRINAS) (beide von Mitsui Knowledge Industry),
analysiert. Zuerst erfolgte die Homologie-Recherche für jede Nukleotidsequenz mittels
der DNA-Datenbank "Genbank ". Danach wurde untersucht, ob in der von der
Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz ein Initiationscodon und ein offener
Leserahmen existierten. Fall ein offener Leserahmen existierte, erfolgte die Homologie-
Recherche der Aminosäuresequenz mittels der Protein-Datenbank "PRINAS".
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Nach obigem Verfahren wurde eine cDNA-Bank konstruiert, d.h. jene Gruppe
von cDNA-Vektoren, von denen die Größe der cDNA-Einfügung, die Nukleotidsequenz
von 5'-Ende und die vom offenen Leserahmen kodierte Aminosäuresequenz bestimmt
wurden. Bisher wiesen 20% der analysierten Klone einen offenen Leserahmen auf,
dessen Sequenz ähnlich zur Aminosäuresequenz eines bekannten Proteins in der
Datenbank ist. Die meisten von ihnen sind Klone voller Länge. Die erhaltenen Klone
umfassen eine breite Vielzahl an Proteinen, wie z.B. Stoffwechselenzyme, Proteine im
Zusammenhang mit DNA-Replikation oder Proteinsynthese, sekretierte Proteine und
eine extrazelluläre Matrix. Tabelle 1 zeigt die Beispiele für Klone, die für Proteine
kodieren, die Ähnlichkeit zu einem bekannten Protein aufweisen.
Beispiel 4
Fleckhybridisierung unter Verwendung einer RNA-Sonde
(1) Herstellung der RNA-Sonde
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Unter Verwendung eines von Stratagene erstandenen Sets wurde eine RNA-
Sonde hergestellt. Kurz gesagt wurde, nachdem das doppelstrangige cDNA-
Vektorplasmid mit NotI gespalten wurde, das Produkt im Reaktionsgemisch umgesetzt,
das 50 uCi [α-³²P]CTP und T7-DNA-Polymerase enthielt, um eine dem Sense-Strang von
cDNA entsprechende RNA-Sonde zu synthetisieren.
(2) Fleckhybridisierung
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Auf Agarplatten wurde unter Anwendung des unter Abschnitt (5) aus Beispiel 2
beschriebenen Verfahrens eine cDNA-Flecksammlung gebildet. Auf die Oberfläche der
Agarplatten wurden Nitrocellulosefilter gelegt, um um die Flecken herum existierende
Phagen zu transferieren Auf dieselbe Weise wurden zwei identische Filter hergestellt.
Die Filter wurden luftgetrocknet und 3 h lang auf 80ºC erhitzt. Die Filter wurden bei
37ºC 2 h lang in der 50% Formamid, 5 x SSC, 10 x Denhardt'sche Lösung und 0,1%
SDS enthaltenden Lösung vorinkubiert. Nach Zugabe der unter Abschnitt (1)
hergestellten RNA-Sonde wurde 16 h lang bei 37ºC weiterinkubiert. Die Filter wurden
mit der 0,2 x SSC und 0,1% SDS enthaltenden Lösung bei 65ºC 1 h lang gewaschen
und luftgetrocknet. Die erhaltenen Filter wurden einer Autoradiografie unterzogen. Fig.
10 (A) zeigt das Ergebnis eines Modellversuchs unter Verwendung eines Plasmidvektors,
der eine Actin-cDNA enthielt. Wo Flecken existieren, sind positive Signale zu erkennen.
(3) Subtraktionsverfahren
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Aus dem eine Actin-cDNA enthaltenden Klon wurde eine RNA-Sonde und eine
einzelstrangige DNA hergestellt und vorhybridisiert. Das erhaltene Gemisch wurde als
Sonde zur Hybridisierung mit einem Filter eingesetzt, das mit Flecken eines Phagen
versehen war, der eine einzelstrangige Actin-cDNA enthielt. In Fig. 10 (B) ist auf dem
Autoradiogramm kein positives Signal zu erkennen. Das bedeutet, daß eine
einzelstrangige DNA die Sondenfunktion einer entsprechenden RNA durch
Vorhybridisierung vollständig inhibieren kann und das in Fig. 5 gezeigte
Subtraktionsverfahren somit anwendbar ist.
Beispiel 5
Bestimmung der gesamten Nukleotidsequenz der cDNA-Einfügung nach dem
Löschungsverfahren
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Das Plasmid pKATNF1 wurde aus dem in Tabelle 1 gezeigten Klon Nr. 16
isoliert, der die für TNF (Tumornekrosefaktor) kodierende cDNA enthielt. 15 ug dieses
Plasmids wurden mit 20 Einheiten Sphl und danach mit 15 Einheiten SnaBI gespalten.
Nach Behandlung mit Exonuklease III bei 37ºC erfolgte Probennahme in Intervallen von
1 min. Diese Proben wurden vermischt, mit Mungobohnen-Nuklease und Klenow-
Fragment behandelt und anschließend selbstligiert, um vom 5'-Terminus der cDNA-
Einfügung weg gelöschte Plasmide zu erhalten. Obige Reaktion erfolgte unter
Verwendung eines von Takara Shuzo erhältlichen Kilo-Löschungs-Set. Die
einzelstrangige DNA wurde nach dem unter Abschnitt (4) und (5) aus Beispiel 2
beschriebenen Verfahren aus jedem gelöschten Klon präpariert und eingesetzt, um nach
dem unter Abschnitt (2) aus Beispiel 3 beschriebenen Verfahren dessen
Nukleotidsequenz zu bestimmen, wobei ein Umkehr-Primer zur M13-Sequenzierung als
Sequenzier-Primer verwendet wurde. Als Folge wurden Plasmide erhalten, denen 150
bp, 300 bp, 600 bp, 850 bp, 1050 bp und 1300 bp vom 5'-Terminus weg fehlten. Die
Sequenzen dieser Klone vom 5'-Terminus weg wurden bestimmt und überlappt, um die
einen ganzen cDNA-Bereich umfassende Sequenz zu erhalten. Die erhaltene Sequenz
stimmte vollständig mit jener für TNF berichteten überein.
Beispiel 6
Expression von cDNA in Säugetierzellen
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Das pKATNF1, dessen Sequenz in Beispiel 5 bestimmt worden war, wurde in
COS7-Zellen (erhalten von ATCC) eingebracht und deren Kulturüberstände
dahingehend untersucht, ob sie TNF-Aktivität zeigten. Das isolierte Plasmid pKATNF1
wurde nach einem Elektroporationsverfahren in 5 x 10&sup6; COS7-Zellen transfiziert. Nach
dem Inokulieren der transfizierten COS7-Zellen in MEM-Medium über 3 d wurde der
Kulturüberstand einem TNF-Assay unter Verwendung von Mäuse-L929-Zellen (von
ATCC) unterzogen. Als Ergebnis zeigte der Überstand eine TNF-Aktivität von 2,9 x 10³
Einheiten/ml. Das bedeutet, daß der SV40-Promotor des Vektors wie erwartet wirkt.
Tabelle 1: Beispiele für Klone in der cDNA-Bank
Klon-Nr.
Bekanntes Protein, das Ähnlichkeiten aufweist
HMG14
HMG17
ribosomales Protein S14
ribosomales Protein S17
ribosomales Phosphoprotein P1
Elongationsfaktor 1α
Initiationsfaktor 2α
Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase
Pyruvat-kinase
β-Actin
Profilin
Hitzeschockprotein 90 kDal
Galactosidase A
Larninin-Bindeprotein
Plasminogenaktivator-Inhibitor 2
TNF (Tumornekrosefaktor)
Mitochondrien-Zytochrom B