KR100331179B1

KR100331179B1 - 티벡터용 플라스미드 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100331179B1
Application number: KR1019990030728A
Authority: KR
Inventors: 조철만; 안상미
Original assignee: 대한민국(관리청:특허청장, 승계청:국립보건원장)
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 2002-04-06
Also published as: KR20010011386A

Abstract

본 발명은 XcmⅠ제한효소 인식사이트를 포함하는 비특이적 프라이머를 사용하여 비특이적 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 유전자를 증폭시켜 이를 티벡터에 클로닝하고, 다시 티벡터로부터 증폭된 유전자만을 대장균용 플라스미드로 서브클로닝함으로써 수득될 수 있는, 티벡터로의 전환 및 재사용이 용이하고, 저장하기에 쉬운 티벡터용 플라스미드 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, XcmI 제한효소 인지사이트의 간격이 300 내지 1000bp 정도 떨어져 있게 됨으로써, 티벡터로의 전환을 위하여 XcmI 전환효소로 절단 시, 절단된 티벡터의 구별이 용이하며, 플라스미드 형태이므로 대장균을 형질전환시키는 방법으로 보관하다가 필요에 따라 분리하여 재사용할 수 있음은 물론, 플라스미드 형태 또는 플라스미드로 형질전환된 대장균 형태로 용이하게 저장시켜 사용할 수 있는 티벡터용 플라스미드를 제조할 수 있으며, 클로닝된 산물을 완전히 잘라낼 수 있는 제한효소 사이트로서 다중 클로닝사이트에 통상되는 1종 내지 3종의 제한효소 인식사이트가 클로닝된 유전자에 인접하여 존재하므로, 목적에 따라 서브클로닝에도 널리 활용될 수 있다.

Description

티벡터용 플라스미드 및 그의 제조방법{T-Vector Convertable Plasmid and Process for Preparing the Same}

본 발명은 티벡터용 플라스미드 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 XcmⅠ제한효소 인식사이트를 포함하는 비특이적 프라이머를 사용하여 비특이적 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 유전자를 증폭시켜 이를 티벡터에 클로닝하고, 다시 티벡터로부터 증폭된 유전자만을 대장균용 플라스미드로 서브클로닝함으로써 수득될 수 있는, 티벡터로의 전환 및 재사용이 용이하고, 저장하기에 쉬운 티벡터용 플라스미드 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

중합효소연쇄반응으로 생성된 유전자 증폭산물은 Taq DNA 중합효소(polymerase)의 말단 전이효소(terminal transferase) 활성에 의해 3' 말단 양끝에 아데닌 염기를 가진 뉴클레오타이드가 하나 더 첨가된다(참조: Clark, J. M., Nucleic Acid Res., 16:9677, 1988). 이러한 증폭된 유전자 산물의 특성으로 인하여, 대장균에 형질전환되어 재생이 가능하고 다중클로닝 사이트를 포함하며 제한효소 처리에 따라 평활말단(blunt end) 또는 점착말단(cohesive end)을 가지게 되어, 외부 유전자를 클로닝하는 방법에 사용되는 플라스미드 벡터에 전기 증폭된 유전자를 클로닝하기는 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 유전자의 양끝 3' 말단에 티민 염기를 가진 뉴클레오타이드가 하나 더 붙어있는 선형의 벡터인 티벡터는 중합효소연쇄반응으로 생성된 유전자 증폭산물이 쉽게 클로닝될 수 있도록 디자인된 벡터이다.

티벡터를 제조하는 방법으로는 첫째, 인위적으로 3' 말단에 티민 염기를 추가시키는 방법으로, pUC 시리즈의 플라스미드와 같은 유전자 클로닝 벡터를 평활 말단으로 만드는 제한 효소로 벡터를 자른 다음, Taq 중합효소(참조: Marchunk, D. et al., Nucleic Acid Res., 19:1154, 1991)를 이용하여 디옥시티미딘 트리포스페이트(deoxythymidine triphosphate, dTTP)를, 또는 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용하여(참조: Holton,T. A. et al., Nucleic Acid Res., 19:1156, 1991) 디디옥시티미딘 트리포스페이트(de-deoxythymidine triphosphate, ddTTP)를 선형의 유전자 3' 말단에 전달함으로써 작제될 수 있다. 그러나, 이 방법은 말단 전이효소의 활성효율에 의존하여 티벡터가 제조되어지므로, 최적 반응조건이 아니거나 비활성화된 효소로 인하여 티미딘 뉴클레오티드가 첨가되지 않은 불완전한 벡터가 제조됨에 따라 클로닝 과정에서 자가결합(self-ligation)으로 유전자 증폭산물이 클로닝되지 않은 티벡터만 형질전환된 대장균이 발견되는 단점을 내포하고 있었다.

제한효소를 이용하여 티벡터를 작제할 수 있는 두번째 방법으로, 제한효소 중 유전자를 절단하였을 때 유전자의 3' 말단에 뉴클레오타이드 하나만을 남길 수 있는 제한효소인 AspEⅠ(참조: Yoshikazu, I. et al., Gene, 130:152, 1993), HphⅠ(참조: David A. M. et al., Bio/Technology, 9:65, 1991), MboⅡ 또는 XcmⅠ를 이용하는 방법이다. 이 방법은 사용될 제한효소의 인식사이트(recognition site) 2개를 나란히 배열하고 제한효소로 절단되었을때 3'말단에 티민염기 하나만을 남기도록 작제된 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 모벡터에 클로닝한 후, 전기 제한효소로 절단하여 티벡터를 작제하는 것으로, 모벡터에 제한효소의 인식사이트가 존재할 시에는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 모벡터로 많이 사용되는 pUC-19을 기준으로 분석해 볼 때, 후보 제한효소 중 HphⅠ 및 MboⅡ는 각각 7곳 및 7곳에 전기 효소의 인식사이트가 존재하고(참조: Mead, D. A. et al., Bio/Technology, 9:65, 1991), 단지 XcmⅠ만이 인식사이트가 존재하지 않으므로, XcmⅠ을 이용한 티벡터 개발에 많은 연구자들의 연구가 집중 보고되고 있다(참조: Kovalic, D. et al.,Nucleic Acid Res., 19:4560, 1991; Cha, J. et al., Gene, 136:369, 1993; Testoris, A. et al., Gene, 143:151, 1994; Harrison, J. et al., Analytical Biochem., 216:235, 1994; Boroskov, A. Y. et al., Biotechniques, 22:812, 1997). 이때, 제한효소로 절단했을 때 분리되는 유전자 조각이 너무 작아, 아가로스젤 전기영동 상에서 불완전하게 절단된 벡터와 완전하게 절단된 벡터와의 이동거리차가가 거의 없으므로 젤추출법으로 티벡터를 순수분리할 때 불완전하게 절단된 벡터가 혼재하게 된다. 그 결과, 제한효소로 잘려지지 않은 일부 벡터가 그대로 유전자 증폭산물을 클로닝하는데 이용됨으로 인하여, 잘려지지 않은 올리고뉴클레오타이드가 그대로 존재하는 원형의 벡터가 형질전환된 대장균에서 높은 비율로 발견되는 단점을 내포하고 있었다.

따라서, 아가로즈젤 전기영동 상에서 절단되어 분리되는 유전자 조각을 뚜렷하게 식별하고, 불완전한 벡터가 제조되어 자가결합으로 유전자 증폭산물이 클로닝되지 않은 티벡터만 형질전환되는 문제를 해결하여, 형질전환시에 원형의 벡터가 발견되는 비율을 낮추기 위한 티벡터를 제조하는 기술을 개발하려는 노력이 계속되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 제한효소를 이용하여 티벡터를 제조하는 방법에서 발생되는 상기 문제점의 해결방안을 확립하고자 예의 노력한 결과, 두 부분의 XcmⅠ 제한효소 인식사이트 거리를 약 300 내지 1,000염기의 거리로 떨어뜨리고, XcmⅠ 제한효소 인식사이트의 상위에 XcmⅠ을 제외한, 통상적인 멀티클로닝 사이트로 사용될 수 있는 1종 내지 3종의 제한효소 인식사이트를 포함시킬 때, 플라스미드로부터 티벡터로의 전환이 확실하게 구별됨은 물론 클로닝에 용이한 티벡터가 작제될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 XcmⅠ 인식사이트간의 거리가 충분하게 길어 티벡터로의 전환이 용이하게 구별되며, 다중클로닝 사이트를 포함함으로써 클로닝이 용이한 티벡터용 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 티벡터용 플라스미드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 티벡터용 플라스미드로 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다.

도 1은 쥐의 뇌로부터 조제한 cDNA와 쥐의 간으로부터 분리한 염색체 유전자를 주형으로 사용하여 비특이적인 중합효소연쇄반응으로 증폭시킨 유전자의 아가로스젤 전기영동 사진이다.

도 2는 증폭된 유전자가 클로닝된 티벡터를 EcoRI으로 절단한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이다.

도 3은 대장균 XL1-blue로부터 분리한 본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드의 아가로스젤 전기영동 사진이다.

도 4는 비특이적인 중합효소연쇄반응을 이용하여 작제된 본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드의 유전자지도를 나타내는 그림이다.

도 5는 본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환시키기 위하여 XcmⅠ제한효소로 pNBE-T 티벡터용 플라스미드를 절단하였을 때 잘려져 나온 유전자 절편이 전개된 아가로스젤 전기영동 사진이다.

도 6은 본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드에 포함된 다중클로닝사이트의 염기서열을 나타내는 그림이다.

도 7은 중합효소연쇄반응으로 증폭시킨 섬모신경영양인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF) 유전자를 전개시킨 아가로스젤 전기영동 사진이다.

도 8은 본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터에 CNTF 유전자를 클로닝하고, NcoⅠ, BamHⅠ 또는 EcoRI으로 절단하여 전개시킨 아가로스젤 전기영동 사진이다.

본 발명의 티벡터용 플라스미드는 XcmⅠ 제한효소 인식사이트를 포함하는 비특이적 프라이머를 사용하여 비특이적 중합효소연쇄반응을 수행하여 증폭된 유전자를 수득하는 단계; 전기 증폭된 유전자를 티벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 작제하고, 전기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 형질전환된 대장균으로부터 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및, 전기 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고, 이를 대장균용 플라스미드의 다중클로닝사이트에클로닝하는 단계를 포함한다.

이하, 본 발명의 티벡터용 플라스미드의 제조방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1단계: 증폭된 유전자의 수득

XcmⅠ 제한효소 인식사이트를 포함하는 비특이적 프라이머를 사용하여 비특이적 중합효소연쇄반응을 수행하여 증폭된 유전자를 수득한다: 이때, 비특이적인 프라이머는 XcmI 제한효소 인식사이트를 반드시 포함하여야 하며, XcmI 이외의 제한효소 인식사이트를 XcmI 제한효소 인식사이트의 상위(upstream)에 추가로 포함시켜 합성할 수 있다. XcmI 이외의 제한효소 인식사이트를 포함시키는 이유는, 대장균용 벡터 또는 플라스미드로의 자유로운 서브클로닝을 위한 것으로, XcmI 이외의 제한효소 인식사이트는 BamHI, HindⅢ, SacI, EcoRI, XbaI, NcoI, KpnI 또는 StuI 인식사이트 등 통상적인 멀티클로닝 사이트에 이용되는 제한효소 인식사이트를 용도에 맞게 포함시킬 수 있으며, 숫자나 종류에 제한 없이 포함시킬 수 있으나 중합효소 연쇄반응의 효율 및 서브클로닝 시의 간편화를 고려하여 1종 내지 3종의 XcmI 이외의 제한효소 인식사이트를 추가로 포함시키는 것이 바람직하다. 한편, 통상적인 티벡터의 경우, 서브클로닝을 위한 제한효소 인식사이트를 대부분 포함하고 있으므로, 비특이적 프라이머의 합성시에 XcmI 이외의 제한효소 인식사이트를 반드시포함시키지 않아도 무방하다.

다음으로, 비특이적 중합효소 연쇄반응을 300bp 길이 이상의 주형으로 사용될 유전자 및 전기 비특이적 프라이머를 이용하여 수행하는데, 증폭된 유전자의 길이가 300 내지 1000bp인 것이 티벡터용 플라스미드에 삽입되었을 때 사용 및 효율이 우수하므로, 주형으로 사용될 유전자는 최소한 300bp 길이 이상이어야 하며, 최대길이에는 제한이 없다. 비특이적 중합효소 연쇄반응이 수행된 다음에는 증폭산물을 아가로스젤 전기영동으로 전개시키고, 이 중 길이 300 내지 1000bp 사이에서 증폭된 주 유전자를 순수분리하여 양 말단에 XcmI 제한효소 인식사이트를 포함하는 300 내지 1000bp 길이의 증폭된 주 유전자를 순수분리하여 수득한다.

제 2단계: 재조합 벡터의 수득

제 1단계에서 증폭된 300 내지 1000 bp길이의 유전자를 티벡터용 플라스미드에 클로닝하여 재조합 벡터를 수득한다: 비특이적인 프라이머 작제시 최상위에 위치한 제한효소로 자른 뒤 바로 대장균용 플라스미드에 클로닝하여 티벡터용 플라스미드를 수득할 수도 있으나, 이 경우 최상위에 위치한 제한효소의 종류에 따라 유전자 말단을 자르는 효율에 차이가 있어 클로닝에 문제가 될 수도 있기 때문에, 증폭된 유전자를 티벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 작제하고, 이 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 형질전환된 대장균으로부터 재조합 벡터를 수득하는 단계를 실시한다. 이때, 티벡터는 당업계에서 통상적으로 사용되며, 상업적으로 입수 가능한 중합효소 연쇄반응에 의한 증폭산물 클로닝용 티벡터를 사용하는데, 유전자의 양끝 3' 말단에 티민 염기를 가진 뉴클레오티드를 하나 포함하며, 유전자 증폭산물을 클로닝할 수 있도록 구성된 것이다. 티벡터에 증폭된 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 작제하는 방법 역시 당업계의 공지된 기술에 의하는 바, DNA 연결효소(ligase)를 티벡터 및 증폭된 유전자와 4℃ 또는 15 내지 20℃에서 2시간 내지 24시간 동안 반응시켜 재조합 벡터를 작제하며, 전기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시키는 방법으로, 증폭된 유전자가 성공적으로 티벡터에 클로닝된 재조합 벡터를 선별하여 수득한다.

제 3단계: 티벡터용 플라스미드의 수득

제 2단계에서 수득한 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고, 이를 대장균용 플라스미드의 다중클로닝사이트에 클로닝하여 티벡터용 플라스미드를 수득한다: 제 2단계에서 수득된 재조합 벡터를 티벡터용 플라스미드로 이용할 수도 있지만, 통상적인 티벡터가 높은 복제수를 내포하고 있지 않으며, 발현 목적으로 사용될 수 없는 등 단점이 많으므로, 티벡터에 클로닝된 증폭 유전자를 용도에 맞는 다른 대장균용 플라스미드에 서브클로닝하는 것이 안정성이나 효율성 면에서 바람직하다. 제한효소로 증폭 유전자의 양 말단에 포함된 XcmI 제한효소 인식사이트를 절단하지 않는 제한효소를 선별하여, 통상적인 반응에 의하여 절단하고, 이를 아가로스젤에 전기영동으로 전개시킨 다음 증폭된 유전자 부분만을 순수분리한다. 다음으로, 이를 대장균용 플라스미드로 옮기는데, 대장균용 플라스미드는 클로닝용 또는 발현용의 플라스미드를 용도에 맞게 선택하여 사용할 수 있으며, 다중클로닝 사이트의 적절한 제한효소 인식사이트에 증폭된 유전자가 삽입될 수 있도록 클로닝하여 티벡터용 플라스미드를 수득한다.

본 발명의 티벡터용 플라스미드는, 티벡터용 플라스미드에 의하여 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하고, 이를 XcmI 제한효소로 절단한 다음, 증폭된 유전자가 제외된 플라스미드 부분을 순수분리함으로써 용이하게 티벡터로 전환시킬 수 있는 바, 저장성이 우수하며, 티벡터로의 전환이 용이함은 물론, 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 클로닝이나 발현용으로 쉽게 적용시킬 수 있는 장점을 내포한다.

본 발명에서는 비특이적 프라이머로서 XcmI 제한효소 인식사이트는 물론, BamHI 및 NcoI 제한효소 인식사이트를 XcmI 제한효소 인식사이트의 상위에 포함하는 서열의 프라이머 5'-GGATCCCCATGGTTGTGATGGG-3'(참조: 서열번호 1)를 합성하였으며, 주형으로서 쥐의 뇌조직으로부터 조제한 1차 cDNA 및 쥐의 간으로부터 분리한 염색체 유전자를 사용하여 비특이적 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자 중에서 약 750bp 의 유전자를 분리하고, 이를 티벡터인 pGEM-티 이지(T easy, Promega, U.S.A.)벡터에 클로닝한 후, 이 재조합 벡터를 EcoRI 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분을 분리하였으며, 이를 다시 대장균 발현 벡터인 pBluescriptSK에 서브클로닝하여 티벡터용 플라스미드를 수득하고, 클로닝된 유전자를 잘라낼 수 있는 제한 효소의 첫 영문자를 따서 'pNBE-T'로 명명하였다. 또한, 본 발명자들은 pNBE-T 티벡터용 플라스미드를 사용하여 대장균(XL1-Blue)을 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였으며, 형질전환된 대장균을 'Escherichia coli(TV-1)'이라 명명하고, 이를 1999년 6월 30일 자로 한국종균협회에 기탁번호 'KFCC-11098'로 기탁하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 비특이적인 중합효소연쇄반응에 의한 유전자의 증폭

실시예 1-1: 쥐의 뇌조직으로부터 1차 cDNA 합성

티벡터의 XcmI 제한효소 인지사이트 사이에 포함될 유전자를 비특이적 중합효소연쇄반응으로 증폭시킴에 있어서 주형으로 사용될 유전자를 확보하기 위하여, 쥐의 뇌조직으로부터 총 RNA를 분리하는 TRI REAGENT(Molecular Research Center, Inc., U.S.A)를 이용하여 총 RNA를 분리한 다음, 이 중 2㎍의 RNA를 주형으로 하여, 40U의 RNase 저해제, 1㎍의 올리고(dT)₁₅및 1mM 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 시약조성에 10U의 조류골수아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus, AMV)로부터 조제된 역전사효소(reverse transcriptase, Promega, U.S.A.)를 첨가하여 1차 cDNA를 합성하였다: 먼저, RNA가 이루는 2차 또는 3차 구조를 제거하기 위하여 역전사효소를 제외한 반응액을 65℃에서 5분간 반응시킨 다음, 바로 얼음에 담그고 역전사 효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 실시하였다. 반응이 끝난 다음, 중합효소연쇄반응의 저해제로 작용할 수 있는 역전사 효소를 불활성화하기 위하여 95℃에서 5분간 가열하였으며, 합성된 1차 cDNA를 비특이적인 중합효소연쇄반응의 주형으로 사용하였다.

실시예 1-2: 쥐의 간으로 염색체 유전자 분리

티벡터의 XcmI 제한효소 인지사이트 사이에 포함될 유전자를 비특이적 중합효소연쇄반응으로 증폭시킴에 있어서 주형으로 사용될 유전자를 확보하기 위하여, 쥐의 간조직으로 부터 염색체 유전자를 분리하였다: 10mg의 간조직에 800mM 구아니딘-염화수소(Guanidine-HCl), 30mM 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 8.0), 30mM EDTA, 5% 트윈 20 및 트리톤 X-100으로 구성된 2ml의 분해용액(lysis buffer) 및 40㎍의 RNase A 용액을 첨가한 다음, 조직분쇄기(homogenizer)로 완전히 분쇄한다. 다음으로, 분쇄용액을 10ml의 뚜껑이 있는 튜브로 옮기고 2㎎의 proteinase K 용액을 첨가하여 50℃ 에서 2시간동안 반응시켜 투명 용액으로 만든 다음, QIAamp Tissue kits(Qiagen, Germany)의 사용방법에 따라 염색체 유전자를 분리하여 비특이적인 중합효소연쇄반응의 주형으로 사용하였다.

실시예 1-3: 비특이적인 중합효소연쇄반응

비특이적인 중합효소연쇄반응을 위하여 제한효소인 BamHI, NcoI 및 XcmI의 인식사이트를 가지는 프라이머로서 5'-GGATCCCCATGGTTGTGATGGG-3'(서열번호 1)을 합성하였다. 유전자 증폭을 위하여 50mM 염화칼륨, 0.1% 트리톤 X-100, 1.5mM 염화마그네슘 및 150μM의 4종의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)를 포함한 10mM 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 9.0)용액 50㎕에 20p㏖의 프라이머 및 2.5U의 Taq DNA 중합효소(Promega, U.S.A.)를 첨가하고, 실시예 1-1에서 수득한 쥐의 뇌로부터 조제한 1차 cDNA 또는 실시예 1-2에서 수득한 쥐의 간으로부터 분리한 염색체 유전자 각 50ng를 주형으로 하여, 중합효소연쇄반응기(GeneAmp 2400, Perkin Elmer, U.S.A.)에서 94℃에서 45초, 48℃에서 45초 및 72℃에서 1분을 단위 온도변화로 하는 30회의 사이클로 중합효소연쇄반응을 수행하고 그 증폭산물을 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다(참조: 도 1). 도 1에서 제 1레인은 람다(λ)파아지 유전자를 제한효소인 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단한 래더(ladder); 제 2레인은 쥐의 뇌조직으로부터 분리한 1차 cDNA를 주형으로하여 합성된 비특이적인 중합효소연쇄반응의 증폭산물; 및, 제 3레인은 쥐의 간으로부터 분리한 염색체 유전자를 주형으로 하여 합성된 비특이적인 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 비특이적인 중합효소연쇄반응에의하여 여러가지 크기의 증폭산물이 얻어지는 바, 그 중에서 750bp 크기의 유전자 증폭산물을 상기한 두 가지의 주형에서 주요한 증폭산물로 얻을 수 있었다. 다음으로, 제 2레인의 주요한 밴드인 750bp 크기의 유전자를 GENECLEAN Ⅱ 키트(BIO101, U.S.A.)를 사용하여 정제하였다: 먼저 에펜도르프 튜브에 들어있는 젤에 500㎕의 요오드화나트륨 용액을 첨가하여 50℃에서 5분간 방치한 후 5㎕의 유리밀크(glassmilk) 용액을 첨가하고 섞었다. 전기 현탁액을 실온에서 5분간 방치한 다음, 작은 원심분리기로 원심분리하여 침전시키고 이를 다시 에탄올이 첨가된 염용액으로 재현탁하여, 이 과정을 3회 반복 후 실온에서 건조시킨 다음, TE 완충액(pH 8.0)에 재현탁하여 티벡터의 일종인 pGEM-티 이지(Promega, U.S.A.) 벡터에 클로닝하는데 사용하였다.

실시예 2: 티벡터에 증폭된 유전자가 클로닝된 재조합 벡터의 작제

실시예 1에서 수득한 증폭된 유전자를 통상적인 티벡터에 클로닝하기 위하여, 순도높게 분리 및 정제한 30ng의 증폭된 유전자와 50ng의 pGEM-티 이지(T easy, Promega, U.S.A.) 벡터를 3U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)를 사용하여 연결반응을 실시하였다: 반응 완충액으로 10mM 염화마그네슘, 10mM DTT 및 1mM 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate)가 포함된 30mM 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 7.8)용액을 사용하였고, 4℃에서 12시간 내지 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 열쇼크방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰는 바, pGEM-T 벡터와 연결반응을 시킨 유전자 용액 10㎕를 염화칼슘으로 처리된 100㎕의 대장균 XL1-Blue 균액에 첨가하여 얼음에서 방치하였다. 30분 후, 42℃에서 2분간 열을 가한 후 얼음에서 1분간 식히고 800㎕의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 45분간 진탕 배양한 다음, 앰피실린이 50μg/ml의 농도로 포함된 맥콩키(MacConkey) 아가 플레이트에 도말하고, 이 플레이트를 37℃에서 12시간 내지 18시간 동안 배양한 후, 생성된 콜로니(colony)들 중 흰색을 띄는 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다.

상술한 방법에 의하여 작제된 재조합 벡터를 제한효소인 EcoRI으로 절단하여 다음의 방법으로 증폭된 유전자가 들어있는지를 확인함은 물론 대장균용 플라스미드로 서브클로닝하기 위하여 정제하였다: 순도높게 분리 및 정제된 재조합 벡터에 1㎍ DNA당 5U의 EcoRI 제한효소를 처리하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 1% 아가로스젤에서 100V로 15분간 전기영동하였다(참조: 도 2). 도 2에서 제 1레인은 람다(λ)파아지 유전자를 제한효소인 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단한 래더(ladder)이며, 제 2레인은 제한효소 EcoRI에 의해 절단되어 분리된 유전자를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 재조합 벡터를 EcoRI으로 절단한 결과, 750bp 크기의 유전자가　아가로스젤　상에　전개됨으로써　티벡터에　클로닝된　것이　확인되었다．　다음으로　전기　750bp 크기의　유전자를 GENECLEAN Ⅱ 키트(BIO101, U.S.A.)를 사용하여 순도높게 정제하였다.

실시예 3: 대장균용 플라스미드에 증폭된 유전자의 클로닝

실시예 2에서 수득된　XcmI 제한효소의 인식부위를 말단에 포함하고 길이 750bp인 유전자를 대장균용 플라스미드에 클로닝하기 위하여, 대장균용 플라스미드로서 pBluescriptSK(Stratagene, U.S.A.)를 선택하였으며, 통상적인 재조합 기술에 의하여 클로닝하였다: pBluescriptSK 플라스미드 1㎍ DNA당 5U의 EcoRI 제한효소를 처리하여 37℃에서 5시간 동안 반응시켰고, 이 반응액을 중합효소연쇄반응 산물을 정제하는 키트인 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, Germany)로 정제한 뒤 실시예 2에서 정제된 유전자와 3U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)를 이용하여 16℃에서 12시간 내지 18시간 동안 반응시킴으로써 연결하였다. 다음으로, 전기 반응액으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰다: 100㎕의 대장균 XL1-Blue 균액에 전기 반응액을 첨가한 다음 얼음에서 방치하였다. 30분 후 42℃에서 2분간 열을 가한 후, 얼음에서 1분간 식히고, 800㎕의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 45분간 진탕 배양한 다음, 앰피실린이 500㎍/ml의 농도로 포함되어 있는 LB 배지 플레이트에 도말하였다. 이 플레이트를 37℃에서 12시간 내지 18시간 동안 배양한 다음 생성된 콜로니(colony)들로부터 사용가능한 플라스미드로 분리하였으며, 이 티벡터용 플라스미드를 'pNBE-T'로 명명하였다. 분리된 pNBE-T 티벡터용 플라스미드를 1% 아가로스젤에서 전기영동한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서, 제 1레인은 람다(λ)파아지의 유전자를 제한효소인 EcoRI 및 HindⅢ로 자른 래더를 나타내고, 제 2레인은 클로닝되어 분리된 pNBE-T 티벡터용 플라스미드를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, pNBE-T 플라스미드가 클로닝되어 분리되었음을 확인하였다. 한편, 도 4는본 발명의 pNBE-T 티벡터용 플라스미드의 유전자지도이다.

실시예 4: 티벡터용 플라스미드의 티벡터로의 전환

실시예 3에서 수득된 XcmI 제한효소의 인식부위를 말단에 포함하고 길이 750bp인 유전자가 클로닝된 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환하기 위하여, 순도높게 분리 및 정제한 pNBE-T 티벡터용 플라스미드에 1㎍ DNA당 5U의 XcmⅠ제한효소를 처리하여 37℃에서 7시간 동안 반응시킨 다음 1%의 아가로스젤 상에 전기영동 하였다(참조: 도 5). 도 5에서, 제 1레인은 람다(λ)파아지 유전자를 제한효소인 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단한 래더(ladder); 제 2레인은 pNBE-T 티벡터용 플라스미드에 제한효소 SalⅠ(1회 절단)을 처리하였을 때 잘려진 플라스미드의 위치; 및, 제 3레인은 XcmⅠ(2회 절단)을 처리하였을 때 잘려진 티벡터와 잘려져 나온 유전자의 위치를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, pNBE-T 티벡터용 플라스미드가 1번 절단되었을 때와 2번 절단되었을 때에 아가로스젤 상에서의 이동거리가 상당한 차이임을 확인하였다. XcmⅠ으로 처리하였을 때 잘려진 티벡터를 GENECLEAN Ⅱ키트(BI0101, U.S.A.)를 사용하여 정제한 다음, 티벡터로 사용하였다. 도 6에는 pNBE-T 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터의 다중클로닝사이트(multi-cloning site)의 유전자 염기서열을 나타내었다.

실시예 5: pNBE-T 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터를 이용한 클로닝

pNBE-T 티벡터용 플라스미드에 제한효소 XcmⅠ을 처리하여 전환된 티벡터의 클로닝 효율을 검증하기 위하여, 섬모신경영양인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF) 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음, 티벡터에 연결하여 클로닝하였다: 우선, CNTF 유전자의 증폭을 위하여 유전자의 염기서열에 특이적인 프라이머로서 5'-ACCTCTGTAGCCGTTCTATC-3'(서열번호 2) 및 5'-GCTCTCAAGTGCTGAGATTC-3'(서열번호 3)을 디자인하였다.

유전자 증폭을 위하여, 50㎕당 10mM 트리스 염화수소(pH9.0), 50mM 염화칼륨, 0.1% 트리톤 X-100, 1.5mM 염화마그네슘 및 150μM의 4종류의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)를 포함하는 시약조성에, 20pmol의 전기 2종의 프라이머 및 2.5U의 Taq DNA 중합효소(Promega, U.S.A.)를 첨가한 다음, 실시예 1-1에서 수득된 쥐의 뇌로부터 조제한 1차 cDNA 50ng을 주형으로 하여, 중합효소연쇄반응기(GeneAmp 2400, Perkin Elmer, U.S.A.)에서 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 45초를 단위 온도 변화로 하는 30회의 사이클로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 유전자 증폭산물을 1% 아가로스젤에서 전기영동하여 확인한 후 유전자 증폭산물을 정제하는 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 정제하였다(참조: 도 7). 도 7에서, 제 1레인은 100bp DNA 래더(Gibco BRL, U.S.A.)를 나타내고, 제 2레인은 증폭된 CNTF 유전자 산물을 나타낸다. 도 7에서 보듯이, 530bp 크기의 CNTF유전자가 증폭된 것이 확인되었다.CNTF의 정제된 30ng의 CNTF 유전자의 증폭산물과 실시예 4에서 작제된 50ng의 티벡터를 3U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)로 연결하여 실시예 3에서와 같은 방법으로 대장균 XL1-Blue을 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 다시 3ml의 LB 배지에 배양한 다음 플라스미드를 분리하고, CNTF 유전자가 클로닝된 콜로니의 수를 세어 CNTF 유전자가 들어 있지 않은 콜로니의 수와 비교한 결과, 총 50개의 콜로니 중 39개의 콜로니가 CNTF 유전자를 가지는 것을 확인하였으며, 이는 78%의 클로닝 효율을 나타내는 것이었다.

실시예 6: 다중클로닝 사이트의 확인

본 발명에 의해 개발된 티벡터가 클로닝된 유전자를 잘라낼 수 있는 제한효소로서 NcoI, BamHI 및 EcoRI 인식사이트가 다중클로닝사이트에 존재하게끔 디자인되어 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 6의 CNTF 유전자가 클로닝된 플라스미드에 제한효소 NcoI, BamHI 또는 EcoRI를 각각 처리한 다음 클로닝된 CNTF 유전자가 플라스미드로부터 절단되어 분리되는지를 시험하였다: 순도높게 분리 및 정제한 CNTF 유전자가 클로닝된 플라스미드를 1㎍ DNA당 5단위의 NcoI, BamHI 또는 EcoRI 제한효소로 각각 절단하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 아가로스젤에 전기영동으로 전개시켰다(참조: 도 8). 도 8에서, 제 1레인은 람다(λ)파아지 유전자를 제한효소인 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단한 래더(ladder); 제 2레인은 CNTF유전자가 클로닝된 플라스미드; 및, 제 3레인, 제 4레인 및 제 5레인은 각각 CNTF유전자가 클로닝된 플라스미드에 NcoI, BamHI 및 EcoRI을 처리하여 절단된 유전자 절편을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, pNBE-T 티벡터용 플라스미드로부터 작제된 티벡터에 클로닝된 유전자가 NcoI, BamHI 또는 EcoRI 제한효소에 의해 완전히 분리되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 티벡터로의 전환 및 재사용이 용이하고, 저장하기가 쉬운 티벡터(T-vector)용 플라스미드 및 그의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, XcmI 제한효소 인지사이트의 간격이 300 내지 1000bp 정도 떨어져 있게 됨으로써, 티벡터로의 전환을 위하여 XcmI 전환효소로 절단 시, 절단된 티벡터의 구별이 용이하며, 플라스미드 형태이므로 대장균을 형질전환시키는 방법으로 보관하다가 필요에 따라 분리하여 재사용할 수 있음은 물론, 플라스미드 형태 또는 플라스미드로 형질전환된 대장균 형태로 용이하게 저장시켜 사용할 수 있는 티벡터용 플라스미드를 제조할 수 있다. 본 발명의 티벡터용 플라스미드는 클로닝된 유전자를 완전히 잘라낼 수 있는 제한효소 사이트로서 다중 클로닝사이트에 통상되는 1종 내지 3종의 제한효소 인식사이트가 클로닝된 유전자에 인접하여 존재하므로, 목적에 따라 서브클로닝에도 널리 활용될 수 있다.

Claims

(ⅰ) XcmⅠ 제한효소 인식사이트를 포함하는 비특이적 프라이머를 사용하고, 비특이적 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 증폭된 유전자를 수득하는 단계;

(ⅱ) 전기 증폭된 유전자를 티벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 작제하고, 전기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 형질전환된 대장균으로부터 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및,

(ⅲ) 전기 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고, 이를 대장균용 플라스미드의 다중클로닝사이트에 클로닝하는 단계를 포함하는 티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

비특이적 프라이머는 서열번호 1에 나타난 서열을 포함하며, XcmI 외의 1내지 3종의 제한효소 인식사이트를 XcmI 제한효소 인식사이트의 상위(upstream)에 포함하는 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

비특이적 중합효소 연쇄반응은 주형으로서 300bp 길이 이상의 유전자를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

증폭된 유전자는 300 내지 1000bp 길이인 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

티벡터는 유전자의 양끝 3' 말단에 티민 염기를 가진 뉴클레오티드를 하나 포함하며, 유전자 증폭산물을 클로닝할 수 있도록 구성된 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

제한효소에 의하여 절단된 유전자는 양 말단에 XcmI 제한효소 인식사이트를 포함하는 300 내지 1000bp 길이의 유전자인 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항에 있어서,

대장균용 플라스미드는 클로닝용 또는 발현용 플라스미드인 것을 특징으로 하는

티벡터용 플라스미드의 제조방법.
제 1항의 방법에 의하여 제조된 티벡터용 플라스미드.
제 1항의 방법에 의하여 제조된 티벡터용 플라스미드 pNBE-T.
제 9항의 티벡터용 플라스미드 pNBE-T에 의하여 형질전환된 대장균 Escherichia coli(TV-1)(KFCC-11098).