JPH07227295A - １３ｃ標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
１３ｃ標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法Info
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- JPH07227295A JPH07227295A JP1966894A JP1966894A JPH07227295A JP H07227295 A JPH07227295 A JP H07227295A JP 1966894 A JP1966894 A JP 1966894A JP 1966894 A JP1966894 A JP 1966894A JP H07227295 A JPH07227295 A JP H07227295A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 13Ｃで標識されたＲＮＡおよび５′リボヌク
レオチドを安価にかつ工業的に容易に生産する方法の提
供を目的としている。 【構成】 13Ｃを炭素源として藻類を培養し、次いで培
養藻体より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比が９５
％以上であるＲＮＡ又はリボヌクレオチドを製造する。
レオチドを安価にかつ工業的に容易に生産する方法の提
供を目的としている。 【構成】 13Ｃを炭素源として藻類を培養し、次いで培
養藻体より全炭素原子に占める13Ｃ原子の存在比が９５
％以上であるＲＮＡ又はリボヌクレオチドを製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は13Ｃや15Ｎなどの安定同
位体で標識された安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボ
ヌクレオチドの製造方法であり、特に標識率の高い13Ｃ
標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良く製造
する技術に関する。
位体で標識された安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボ
ヌクレオチドの製造方法であり、特に標識率の高い13Ｃ
標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを効率良く製造
する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】安定同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌ
クレオチドなどの標識化合物は、最近目ざましい発展を
遂げているＲＮＡの多次元ＮＭＲによる構造解析に不可
欠なものである。すなわち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様
にスピン１／２の原子核を持つために、これらの安定同
位体を有する物質は高分解能ＮＭＲの測定が可能であ
る。これらの標識化合物では1Ｈの化学シフトに加えて
13Ｃと15Ｎの化学シフトが利用できるようになり、多次
元ＮＭＲによる原子のシグナルの帰属の決定が容易とな
る。従ってＲＮＡのような、わずか４種類の類似のヌク
レオチド（シチジル酸、アデニル酸、グアニル酸及びウ
リジル酸）からなり、ＮＭＲシグナルの化学シフトが極
めて狭い範囲に集中している物質の構造決定のために
は、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠な物質である。そし
て安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレ
オチドは、これらの測定に用いる任意の標識ＲＮＡを化
学合成または生物合成するための原料として極めて価値
ある物質である。
クレオチドなどの標識化合物は、最近目ざましい発展を
遂げているＲＮＡの多次元ＮＭＲによる構造解析に不可
欠なものである。すなわち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様
にスピン１／２の原子核を持つために、これらの安定同
位体を有する物質は高分解能ＮＭＲの測定が可能であ
る。これらの標識化合物では1Ｈの化学シフトに加えて
13Ｃと15Ｎの化学シフトが利用できるようになり、多次
元ＮＭＲによる原子のシグナルの帰属の決定が容易とな
る。従ってＲＮＡのような、わずか４種類の類似のヌク
レオチド（シチジル酸、アデニル酸、グアニル酸及びウ
リジル酸）からなり、ＮＭＲシグナルの化学シフトが極
めて狭い範囲に集中している物質の構造決定のために
は、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠な物質である。そし
て安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレ
オチドは、これらの測定に用いる任意の標識ＲＮＡを化
学合成または生物合成するための原料として極めて価値
ある物質である。
【０００３】従来、13Ｃで標識されたＲＮＡおよび５′
リボヌクレオチドの製造方法に関する報告は無かった。
しかし近時、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic
Acids Research）２０巻１７号4507〜4513頁および同号
4515〜4523頁（1992年）に、安定同位体で標識された炭
素源及び窒素源を用いて生育させた細菌の菌体から標識
されたＲＮＡおよび５′ヌクレオチドを製造する方法が
発表されている。これらの発表のうち前者は炭素源とし
て、全ての炭素原子が完全に標識されたグルコース（13
Ｃ6Ｈ12Ｏ6）を用いて大腸菌を培養する方法であり、後
者は炭素源として標識されたメタノールを原料とし、メ
タノール資化性細菌を培養する方法である。一方、藻類
を利用した13Ｃ標識ＲＮＡの製造方法については、トレ
ンズ インバイオテクノロジー（Trends in biotechnolo
gy）第６巻１１月号２７９〜２８２頁（1988）にその可
能性を示唆する記述はあるが、具体的な事実については
述べられていない。
リボヌクレオチドの製造方法に関する報告は無かった。
しかし近時、ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic
Acids Research）２０巻１７号4507〜4513頁および同号
4515〜4523頁（1992年）に、安定同位体で標識された炭
素源及び窒素源を用いて生育させた細菌の菌体から標識
されたＲＮＡおよび５′ヌクレオチドを製造する方法が
発表されている。これらの発表のうち前者は炭素源とし
て、全ての炭素原子が完全に標識されたグルコース（13
Ｃ6Ｈ12Ｏ6）を用いて大腸菌を培養する方法であり、後
者は炭素源として標識されたメタノールを原料とし、メ
タノール資化性細菌を培養する方法である。一方、藻類
を利用した13Ｃ標識ＲＮＡの製造方法については、トレ
ンズ インバイオテクノロジー（Trends in biotechnolo
gy）第６巻１１月号２７９〜２８２頁（1988）にその可
能性を示唆する記述はあるが、具体的な事実については
述べられていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】安定同位体標識された
ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドの製造方法のうち、
前者の方法は炭素源として用いる13Ｃ標識グルコース（
13Ｃ6Ｈ12Ｏ6）が極めて高価であり、必ずしも良い方法
ではない。一方、後者の方法は炭素源のラベル化メタノ
ールは安価であるが、揮発性が高いため通気培養が極め
て困難であり、また生育阻害性が強いため培地中のメタ
ノールの濃度を高めることができず生産性が悪い。
ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドの製造方法のうち、
前者の方法は炭素源として用いる13Ｃ標識グルコース（
13Ｃ6Ｈ12Ｏ6）が極めて高価であり、必ずしも良い方法
ではない。一方、後者の方法は炭素源のラベル化メタノ
ールは安価であるが、揮発性が高いため通気培養が極め
て困難であり、また生育阻害性が強いため培地中のメタ
ノールの濃度を高めることができず生産性が悪い。
【０００５】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、13Ｃで標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチ
ドを安価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を
目的としている。
で、13Ｃで標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオチ
ドを安価に、かつ工業的に容易に生産する方法の提供を
目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の13Ｃ標識ＲＮＡ
の製造方法は、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ
標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上を原料と
して藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素原子に占め
る13Ｃ原子の存在比が９５％以上であるＲＮＡを抽出す
ることを特徴としている。また本発明の13Ｃ標識リボヌ
クレオチドの製造方法は、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩
類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以
上を原料として藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素
原子に占める13Ｃ原子の存在比が９５％以上である５′
リボヌクレオチドを得ることを特徴としている。本発明
の13Ｃ標識ＲＮＡとリボヌクレオチドの製造方法におい
て、好ましい藻類はクロレラ属、スピルリナ属、アグメ
ネルム属のうちから選択される。また本発明の13Ｃ標識
ＲＮＡとリボヌクレオチドの製造方法においては、培養
藻体の細胞を破砕し、次いでその細胞破砕液を遠心分離
して細胞壁画分を沈澱させてリボソーム画分を含む上清
を分取し、次いで該上清を超遠心分離することによって
リボソーム画分を沈澱させ、次いで該リボソームを崩壊
し、除タンパク後の粗ＲＮＡ画分をｐＨ２.０以下の酸
性条件下に置き、沈澱した13Ｃ標識ＲＮＡを採取し、或
いはこの13Ｃ標識ＲＮＡを分解して13Ｃ標識リボヌクレ
オチドを得ることが望ましい。
の製造方法は、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ
標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上を原料と
して藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素原子に占め
る13Ｃ原子の存在比が９５％以上であるＲＮＡを抽出す
ることを特徴としている。また本発明の13Ｃ標識リボヌ
クレオチドの製造方法は、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩
類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以
上を原料として藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素
原子に占める13Ｃ原子の存在比が９５％以上である５′
リボヌクレオチドを得ることを特徴としている。本発明
の13Ｃ標識ＲＮＡとリボヌクレオチドの製造方法におい
て、好ましい藻類はクロレラ属、スピルリナ属、アグメ
ネルム属のうちから選択される。また本発明の13Ｃ標識
ＲＮＡとリボヌクレオチドの製造方法においては、培養
藻体の細胞を破砕し、次いでその細胞破砕液を遠心分離
して細胞壁画分を沈澱させてリボソーム画分を含む上清
を分取し、次いで該上清を超遠心分離することによって
リボソーム画分を沈澱させ、次いで該リボソームを崩壊
し、除タンパク後の粗ＲＮＡ画分をｐＨ２.０以下の酸
性条件下に置き、沈澱した13Ｃ標識ＲＮＡを採取し、或
いはこの13Ｃ標識ＲＮＡを分解して13Ｃ標識リボヌクレ
オチドを得ることが望ましい。
【０００７】
【作用】本発明の13Ｃ標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチド
の製造方法では、炭素源としては最も安価な13ＣＯ2、
13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの
１種または２種以上を原料として藻類を培養し、培養し
た藻体から13Ｃ標識ＲＮＡを抽出し、或いはそのＲＮＡ
を分解、分離精製して13Ｃ標識リボヌクレオチドを生産
することにより、従来の細菌を用いた13Ｃ標識ＲＮＡ及
びリボヌクレオチドの製造方法に比べて、極めて安価な
生産物を提供できる点で優れている。さらに13ＣＯ2、
13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類と、それ
らを資化できる藻類とを用いる利点としては、この炭素
源−利用生物の組み合わせにおいては、高価な13Ｃの利
用率が極めて高いことである。すなわち13ＣＯ2資化能
のない生物は呼吸作用で排出される13ＣＯ2が再び体内
に取り込まれ、再利用される割合が極めて低く、貴重な
13Ｃは無駄に捨てられてしまうことになる。従って使用
した13Ｃに対する13Ｃ標識生産物の収率が低く、13Ｃの
利用率は悪い。一方、本発明の13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭
酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類と、それらを資化でき
る藻類との組み合わせにおいては、呼吸作用で排出され
る13ＣＯ2が再び体内に取り込まれ、再利用されるの
で、貴重な13Ｃが無駄に捨てられることがない。従って
本発明の方法は、使用した13Ｃに対する13Ｃ標識された
生産物の収率が高く、13ＣＯ2などの使用炭素源の安価
なこととあいまって、13Ｃ標識ＲＮＡ及びリボヌクレオ
チドを工業的規模で安価に生産することが可能となる。
の製造方法では、炭素源としては最も安価な13ＣＯ2、
13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの
１種または２種以上を原料として藻類を培養し、培養し
た藻体から13Ｃ標識ＲＮＡを抽出し、或いはそのＲＮＡ
を分解、分離精製して13Ｃ標識リボヌクレオチドを生産
することにより、従来の細菌を用いた13Ｃ標識ＲＮＡ及
びリボヌクレオチドの製造方法に比べて、極めて安価な
生産物を提供できる点で優れている。さらに13ＣＯ2、
13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類と、それ
らを資化できる藻類とを用いる利点としては、この炭素
源−利用生物の組み合わせにおいては、高価な13Ｃの利
用率が極めて高いことである。すなわち13ＣＯ2資化能
のない生物は呼吸作用で排出される13ＣＯ2が再び体内
に取り込まれ、再利用される割合が極めて低く、貴重な
13Ｃは無駄に捨てられてしまうことになる。従って使用
した13Ｃに対する13Ｃ標識生産物の収率が低く、13Ｃの
利用率は悪い。一方、本発明の13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭
酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類と、それらを資化でき
る藻類との組み合わせにおいては、呼吸作用で排出され
る13ＣＯ2が再び体内に取り込まれ、再利用されるの
で、貴重な13Ｃが無駄に捨てられることがない。従って
本発明の方法は、使用した13Ｃに対する13Ｃ標識された
生産物の収率が高く、13ＣＯ2などの使用炭素源の安価
なこととあいまって、13Ｃ標識ＲＮＡ及びリボヌクレオ
チドを工業的規模で安価に生産することが可能となる。
【０００８】以下、本発明の詳細について説明する。本
発明に係る13Ｃ標識ＲＮＡとは、全炭素に占める13Ｃ原
子の存在比（以下13Ｃ標識率という）が９５％以上であ
ることを特徴としている。この安定同位体標識ＲＮＡを
得るには、13Ｃ標識炭素源を用いて、藻類を培養し、そ
の培養藻体からＲＮＡを抽出する。本発明に用いる13Ｃ
標識炭素源としては、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及
び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上で
ある。これら炭酸塩と重炭酸塩としては、ナトリウム
塩、カリウム塩またはアンモニウム塩が好適に用いられ
る。
発明に係る13Ｃ標識ＲＮＡとは、全炭素に占める13Ｃ原
子の存在比（以下13Ｃ標識率という）が９５％以上であ
ることを特徴としている。この安定同位体標識ＲＮＡを
得るには、13Ｃ標識炭素源を用いて、藻類を培養し、そ
の培養藻体からＲＮＡを抽出する。本発明に用いる13Ｃ
標識炭素源としては、13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及
び13Ｃ標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上で
ある。これら炭酸塩と重炭酸塩としては、ナトリウム
塩、カリウム塩またはアンモニウム塩が好適に用いられ
る。
【０００９】本発明に好ましい藻類の性質としては、光
合成能が強い、増殖が速い、培養が容易である、ＲＮＡ
含量が高い等の性質が挙げられる。このような条件を満
足させる藻類としては、例えばクロレラ（Chlorella）
属、スピルリナ（Spirulina）属、アグメネルム（Agmen
ellum）属の藻類が挙げられる。より具体的には、クロ
レラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピ
レノイドサ（Chlorellapyrenoidosa）、スピルリナ・プ
ラテンシス（Spirulina platensis）、アグメネルム・ク
アドルプリカトム（Agmenellum quadruplicatum）等の
種の藻類が挙げられる。
合成能が強い、増殖が速い、培養が容易である、ＲＮＡ
含量が高い等の性質が挙げられる。このような条件を満
足させる藻類としては、例えばクロレラ（Chlorella）
属、スピルリナ（Spirulina）属、アグメネルム（Agmen
ellum）属の藻類が挙げられる。より具体的には、クロ
レラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピ
レノイドサ（Chlorellapyrenoidosa）、スピルリナ・プ
ラテンシス（Spirulina platensis）、アグメネルム・ク
アドルプリカトム（Agmenellum quadruplicatum）等の
種の藻類が挙げられる。
【００１０】これらの藻類の培養に使用する培地組成に
ついては、上述したように本発明においては炭素源とし
て13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸
塩類のうちの１種または２種以上を用いる他は、通常の
藻類の培地組成とした培地を用いて良い。即ち窒素源と
しては、通常のアンモニウム塩、または硝酸塩を使用し
て良い。この際、生成するＲＮＡを13Ｃとともに15Ｎで
標識化する場合には、15Ｎで標識化されたアンモニウム
塩または硝酸塩を使用すれば良い。その他の無機塩類を
主体とする培地成分については、燐酸、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、亜
鉛、銅、硫黄、ホウ素等の栄養成分を適宜含有する既存
の培地を使用して良い。藻類の培養において、培地のｐ
Ｈ、培養温度等は、個々の藻株により異なるので、個々
の藻株に適した条件を用いる必要がある。また光の照射
条件については特に限定されず、通常の蛍光灯を使用し
て良く、好ましくは照度１０００〜１００００Ｌｕｘ程
度とされる。培養時間は藻体量、藻体中のＲＮＡ含有量
等を考慮して決められるが、通常は２日から１５日間程
度とする。培養終了後、藻体を遠心分離して集め、脱塩
水で洗浄し、これをＲＮＡの抽出に用いる。
ついては、上述したように本発明においては炭素源とし
て13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸
塩類のうちの１種または２種以上を用いる他は、通常の
藻類の培地組成とした培地を用いて良い。即ち窒素源と
しては、通常のアンモニウム塩、または硝酸塩を使用し
て良い。この際、生成するＲＮＡを13Ｃとともに15Ｎで
標識化する場合には、15Ｎで標識化されたアンモニウム
塩または硝酸塩を使用すれば良い。その他の無機塩類を
主体とする培地成分については、燐酸、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、亜
鉛、銅、硫黄、ホウ素等の栄養成分を適宜含有する既存
の培地を使用して良い。藻類の培養において、培地のｐ
Ｈ、培養温度等は、個々の藻株により異なるので、個々
の藻株に適した条件を用いる必要がある。また光の照射
条件については特に限定されず、通常の蛍光灯を使用し
て良く、好ましくは照度１０００〜１００００Ｌｕｘ程
度とされる。培養時間は藻体量、藻体中のＲＮＡ含有量
等を考慮して決められるが、通常は２日から１５日間程
度とする。培養終了後、藻体を遠心分離して集め、脱塩
水で洗浄し、これをＲＮＡの抽出に用いる。
【００１１】藻体からＲＮＡを抽出するには、藻体の細
胞壁を超音波、ガラスビーズによる磨砕、セルラーゼ等
の細胞壁溶解酵素等を用いて破壊し、この細胞破砕液を
遠心分離して沈澱した細胞壁画分を捨て上清を集める。
この上清から超遠心分離器を用いてリボソーム画分を集
める。この際の超遠心分離の条件は通常１０万Ｇから２
０万Ｇで２時間から５時間程度とされる。こうして集め
た沈澱に含まれるリボソームから通常ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム（界面活性剤））処理やフェノール処理
によりＲＮＡを分離精製するが、藻類の場合、この画分
には多量の炭水化物が含有され、純度の高いＲＮＡが得
られない。そこで本発明者らは、種々の方法を検討した
結果、ＳＤＳ処理によりリボソームを崩壊し、フェノー
ル処理などにより除タンパクしたこの粗ＲＮＡ画分を酸
性条件下で処理することによりＲＮＡを沈澱せしめ、混
在する炭水化物から分離し、純度の高いＲＮＡを取得で
きることを見出した。ＲＮＡを沈澱させる酸性条件とし
ては通常ｐＨ２以下、好ましくはｐＨ１.５程度であ
り、またここで用いる酸としては、トリクロル酢酸、過
塩素酸、塩酸等が適当である。リボソーム画分をＳＤＳ
処理、フェノール処理をした粗ＲＮＡ画分をこのような
酸性条件下且つ低温下に置き、ＲＮＡを沈澱せしめた
後、遠心分離によりＲＮＡが濃縮された沈澱を集め、エ
タノール等の有機溶媒で沈澱を洗浄して、さらに真空乾
燥してＲＮＡを得る。また、ＲＮＡに共存するＤＮＡを
除く必要がある場合には、細胞壁破壊時にＤＮＡ分解酵
素を作用せしめ、共存するＤＮＡのみを分解しても良
い。
胞壁を超音波、ガラスビーズによる磨砕、セルラーゼ等
の細胞壁溶解酵素等を用いて破壊し、この細胞破砕液を
遠心分離して沈澱した細胞壁画分を捨て上清を集める。
この上清から超遠心分離器を用いてリボソーム画分を集
める。この際の超遠心分離の条件は通常１０万Ｇから２
０万Ｇで２時間から５時間程度とされる。こうして集め
た沈澱に含まれるリボソームから通常ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム（界面活性剤））処理やフェノール処理
によりＲＮＡを分離精製するが、藻類の場合、この画分
には多量の炭水化物が含有され、純度の高いＲＮＡが得
られない。そこで本発明者らは、種々の方法を検討した
結果、ＳＤＳ処理によりリボソームを崩壊し、フェノー
ル処理などにより除タンパクしたこの粗ＲＮＡ画分を酸
性条件下で処理することによりＲＮＡを沈澱せしめ、混
在する炭水化物から分離し、純度の高いＲＮＡを取得で
きることを見出した。ＲＮＡを沈澱させる酸性条件とし
ては通常ｐＨ２以下、好ましくはｐＨ１.５程度であ
り、またここで用いる酸としては、トリクロル酢酸、過
塩素酸、塩酸等が適当である。リボソーム画分をＳＤＳ
処理、フェノール処理をした粗ＲＮＡ画分をこのような
酸性条件下且つ低温下に置き、ＲＮＡを沈澱せしめた
後、遠心分離によりＲＮＡが濃縮された沈澱を集め、エ
タノール等の有機溶媒で沈澱を洗浄して、さらに真空乾
燥してＲＮＡを得る。また、ＲＮＡに共存するＤＮＡを
除く必要がある場合には、細胞壁破壊時にＤＮＡ分解酵
素を作用せしめ、共存するＤＮＡのみを分解しても良
い。
【００１２】抽出精製したＲＮＡより、５′リボヌクレ
オチド、即ち、５′シチジル酸（ＣＭＰと略記する）、
５′アデニル酸（ＡＭＰと略記する）、５′グアニル酸
（ＧＭＰと略記する）及び５′ウリジル酸（ＵＭＰと略
記する）を製造するためには、通常は酵素リボヌクレア
ーゼによる加水分解を行い、精製した４種類の５′リボ
ヌクレオチドをイオン交換樹脂を用いたカラムクロマト
グラフィー等によって分画、分取することにより得られ
る。
オチド、即ち、５′シチジル酸（ＣＭＰと略記する）、
５′アデニル酸（ＡＭＰと略記する）、５′グアニル酸
（ＧＭＰと略記する）及び５′ウリジル酸（ＵＭＰと略
記する）を製造するためには、通常は酵素リボヌクレア
ーゼによる加水分解を行い、精製した４種類の５′リボ
ヌクレオチドをイオン交換樹脂を用いたカラムクロマト
グラフィー等によって分画、分取することにより得られ
る。
【００１３】
（実施例１）下記の組成のＳＯＴの培地を基本とする培
地を用い、スピルリナ・プラテンシス ＩＡＭ Ｍ−１３
５株を培養した。 （ＮａＨＣＯ3 １６.８ｇ／ｌ） Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ ＮａＮＯ3 ２.５ Ｋ2ＳＯ4 １.０ ＮａＣｌ １.０ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０４ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 ０.００８ Ａ−５溶液 １ｍｌ （Ａ−５溶液の組成は、Ｈ3ＢＯ3 ２.８５ｇ／ｌ、Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏ １.８１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
２２ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.０８ｇ／ｌ、Ｍｏ
Ｏ3 ０.０１５ｇ／ｌ） 上記ＳＯＴの培地において13Ｃ標識化重炭酸ナトリウム
（ＮａＨ13ＣＯ3）を用いた前培養培地１００ｍｌを含
む５００ｍｌ培養フラスコで３０℃、１６時間明期−８
時間暗期の光周期条件下で上記藻株を１０日間培養し
た。炭素源を含まないＳＯＴ培地３リットルを、光照射装置
およびマグネチックスターラー付き培養装置（５リットル
容）に入れ、これに前培養液を種母として添加した。本
培養に先立って、培養装置の気相をＮ2で置換した後、
13ＣＯ2を培養装置内に導入し、培地のｐＨを８.８と
し、密閉系で培養を開始した。培地のｐＨは、ｐＨ電極
でモニターし、13ＣＯ2が藻によって資化され、培地の
ｐＨが９.２以上になると電磁弁が開いて、ボンベより
13ＣＯ2が供給され、培地のｐＨが８.８以下になると電
磁弁が閉じ、13ＣＯ2の供給が止まるような13ＣＯ2供給
方式を採用し、１０Ｗ蛍光灯１２本の連続照射条件下
で、３０℃１０日間培養を行った。
地を用い、スピルリナ・プラテンシス ＩＡＭ Ｍ−１３
５株を培養した。 （ＮａＨＣＯ3 １６.８ｇ／ｌ） Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ ＮａＮＯ3 ２.５ Ｋ2ＳＯ4 １.０ ＮａＣｌ １.０ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０４ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 ０.００８ Ａ−５溶液 １ｍｌ （Ａ−５溶液の組成は、Ｈ3ＢＯ3 ２.８５ｇ／ｌ、Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏ １.８１ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
２２ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.０８ｇ／ｌ、Ｍｏ
Ｏ3 ０.０１５ｇ／ｌ） 上記ＳＯＴの培地において13Ｃ標識化重炭酸ナトリウム
（ＮａＨ13ＣＯ3）を用いた前培養培地１００ｍｌを含
む５００ｍｌ培養フラスコで３０℃、１６時間明期−８
時間暗期の光周期条件下で上記藻株を１０日間培養し
た。炭素源を含まないＳＯＴ培地３リットルを、光照射装置
およびマグネチックスターラー付き培養装置（５リットル
容）に入れ、これに前培養液を種母として添加した。本
培養に先立って、培養装置の気相をＮ2で置換した後、
13ＣＯ2を培養装置内に導入し、培地のｐＨを８.８と
し、密閉系で培養を開始した。培地のｐＨは、ｐＨ電極
でモニターし、13ＣＯ2が藻によって資化され、培地の
ｐＨが９.２以上になると電磁弁が開いて、ボンベより
13ＣＯ2が供給され、培地のｐＨが８.８以下になると電
磁弁が閉じ、13ＣＯ2の供給が止まるような13ＣＯ2供給
方式を採用し、１０Ｗ蛍光灯１２本の連続照射条件下
で、３０℃１０日間培養を行った。
【００１４】培養終了後、培養液を５０００Ｇで１５分
間遠心分離し、藻体を集め、これを水で３回洗浄した。
得られた湿潤藻体は４２ｇ（乾燥重量７.５ｇ）であっ
た。なお、この培養で消費された13ＣＯ2は８.２ｇであ
った。次に、この湿潤藻体１２.３ｇを、乾燥重量とし
て４０ｍｇ／ｍｌになるように、５０ｍＭのトリス緩衝
液（ｐＨ７.５，ＫＣｌ ３０ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ，ＮａＮ3 １ｍＭ，グリセロール１０重量％を含む）
に懸濁させた。続いて、β−メルカプトエタノール０.
１重量％を加え、氷冷のもと２０ｋＨｚの超音波で１５
分間処理を行い細胞壁を破壊した。
間遠心分離し、藻体を集め、これを水で３回洗浄した。
得られた湿潤藻体は４２ｇ（乾燥重量７.５ｇ）であっ
た。なお、この培養で消費された13ＣＯ2は８.２ｇであ
った。次に、この湿潤藻体１２.３ｇを、乾燥重量とし
て４０ｍｇ／ｍｌになるように、５０ｍＭのトリス緩衝
液（ｐＨ７.５，ＫＣｌ ３０ｍＭ，ＭｇＣｌ2 １０ｍ
Ｍ，ＮａＮ3 １ｍＭ，グリセロール１０重量％を含む）
に懸濁させた。続いて、β−メルカプトエタノール０.
１重量％を加え、氷冷のもと２０ｋＨｚの超音波で１５
分間処理を行い細胞壁を破壊した。
【００１５】細胞壁破壊後の標識藻の懸濁液を８０００
Ｇにて２０分間遠心分離し、細胞壁画分を沈澱させて除
き、リボソームを含む上清を回収した。回収した上清に
1/3容量の２Ｍ ＫＣｌ溶液を加え、約１０万Ｇにて３時
間、超遠心分離を行い、沈澱（リボソーム画分）を得
た。この沈澱を酢酸緩衝液（ＣＨ3ＣＯＯＮａ ５０ｍ
Ｍ，（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｍｇ１０ｍＭ，ｐＨ７.４）に溶
かし、１／１０容量の５％ＳＤＳを加えて攪拌後、等量
の水飽和フェノールを加えて１時間振とうした。続い
て、約１万Ｇにて２０分間遠心分離し、フェノール層と
水層とに分離し、その水層を回収した。この操作をもう
一度繰り返した後、水層に等量のクロロホルムを加え、
攪拌後３０００Ｇにて１５分間遠心分離し、水層とクロ
ロホルム層に分離した後、水層を回収した。同じ操作を
もう一度繰返し行うことによりフェノールを除去した。
フェノール除去後の水層に1/10容量の１.３Ｍ ＣＨ3Ｃ
ＯＯＫを加えた後、１０％トリクロロ酢酸を等量加えて
氷冷した。氷冷後、約１万Ｇにて１０分間遠心分離し、
標識ＲＮＡを沈澱させた。沈澱した標識ＲＮＡを９９％
エタノールで２回洗浄し、真空乾燥することにより、純
度約６０％の標識ＲＮＡが８０ｍｇ得られた。得られた
ＲＮＡを元素分析計により成分中の炭素分を二酸化炭素
ガスとし、このガスを質量分析計で測定した結果、この
ＲＮＡの13Ｃの標識化率は約９６％であった。
Ｇにて２０分間遠心分離し、細胞壁画分を沈澱させて除
き、リボソームを含む上清を回収した。回収した上清に
1/3容量の２Ｍ ＫＣｌ溶液を加え、約１０万Ｇにて３時
間、超遠心分離を行い、沈澱（リボソーム画分）を得
た。この沈澱を酢酸緩衝液（ＣＨ3ＣＯＯＮａ ５０ｍ
Ｍ，（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｍｇ１０ｍＭ，ｐＨ７.４）に溶
かし、１／１０容量の５％ＳＤＳを加えて攪拌後、等量
の水飽和フェノールを加えて１時間振とうした。続い
て、約１万Ｇにて２０分間遠心分離し、フェノール層と
水層とに分離し、その水層を回収した。この操作をもう
一度繰り返した後、水層に等量のクロロホルムを加え、
攪拌後３０００Ｇにて１５分間遠心分離し、水層とクロ
ロホルム層に分離した後、水層を回収した。同じ操作を
もう一度繰返し行うことによりフェノールを除去した。
フェノール除去後の水層に1/10容量の１.３Ｍ ＣＨ3Ｃ
ＯＯＫを加えた後、１０％トリクロロ酢酸を等量加えて
氷冷した。氷冷後、約１万Ｇにて１０分間遠心分離し、
標識ＲＮＡを沈澱させた。沈澱した標識ＲＮＡを９９％
エタノールで２回洗浄し、真空乾燥することにより、純
度約６０％の標識ＲＮＡが８０ｍｇ得られた。得られた
ＲＮＡを元素分析計により成分中の炭素分を二酸化炭素
ガスとし、このガスを質量分析計で測定した結果、この
ＲＮＡの13Ｃの標識化率は約９６％であった。
【００１６】（実施例２）先の実施例１で得られたＲＮ
Ａ ５０ｍｇを０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５.５）１５ｍｌに溶解し、３７℃に加温
し、ここにリボヌクレアーゼＰ１（生化学工業（株）
製）をＲＮＡｍｇ当り０.３単位となるように添加し
た。この分解反応はＴＬＣでモニターし、２時間後に反
応が完結したら０.５ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、さらに２
分間９０℃に加熱して酵素を失活させた。この反応後の
溶液を２倍に希釈し、１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化させた
陰イオン交換樹脂ＡＧ−１×４（200-400メッシュ；Ｂｉｏ
Ｒａｄ社製）を充填したカラム（2.0×64cm）にかけ、
１０ｍＭ ＨＣｌ ２容と１０ｍＭ ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣ
ｌ１容の濃度勾配溶出法により５′リボヌクレオチドを
溶出し、１５ｍｌ毎に分画し、波長２６０ｎｍで吸光度
をモニターしながら、ＣＭＰ，ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＵＭＰ
画分を分取した。次に、これらの個々の５′リボヌクレ
オチド画分を集め、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５
（Pharmacia社製）カラムを用いて脱塩した。これらの
処理により最終的に取得した５′リボヌクレオチド量
は、ＣＭＰが１２ｍｇ、ＡＭＰが１１ｍｇ、ＧＭＰが１
４ｍｇ、ＵＭＰが８ｍｇであった。得られたＣＭＰを元
素分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、それ
らのガスを質量分析計で測定した結果、ＣＭＰの13Ｃの
標識化率は約９６％であった。
Ａ ５０ｍｇを０.１ｍＭ ＺｎＣｌ2を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５.５）１５ｍｌに溶解し、３７℃に加温
し、ここにリボヌクレアーゼＰ１（生化学工業（株）
製）をＲＮＡｍｇ当り０.３単位となるように添加し
た。この分解反応はＴＬＣでモニターし、２時間後に反
応が完結したら０.５ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、さらに２
分間９０℃に加熱して酵素を失活させた。この反応後の
溶液を２倍に希釈し、１０ｍＭ ＨＣｌで平衡化させた
陰イオン交換樹脂ＡＧ−１×４（200-400メッシュ；Ｂｉｏ
Ｒａｄ社製）を充填したカラム（2.0×64cm）にかけ、
１０ｍＭ ＨＣｌ ２容と１０ｍＭ ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣ
ｌ１容の濃度勾配溶出法により５′リボヌクレオチドを
溶出し、１５ｍｌ毎に分画し、波長２６０ｎｍで吸光度
をモニターしながら、ＣＭＰ，ＡＭＰ，ＧＭＰ，ＵＭＰ
画分を分取した。次に、これらの個々の５′リボヌクレ
オチド画分を集め、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５
（Pharmacia社製）カラムを用いて脱塩した。これらの
処理により最終的に取得した５′リボヌクレオチド量
は、ＣＭＰが１２ｍｇ、ＡＭＰが１１ｍｇ、ＧＭＰが１
４ｍｇ、ＵＭＰが８ｍｇであった。得られたＣＭＰを元
素分析計により炭素分を二酸化炭素ガスに変換し、それ
らのガスを質量分析計で測定した結果、ＣＭＰの13Ｃの
標識化率は約９６％であった。
【００１７】クロレラ・ブルガリス ＩＡＭ Ｃ−５３１
株の培養を下記組成の培地を用いて行った。 Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０.０７５ ＮａＮＯ3 ２.５ Ｋ2ＳＯ4 １.０ ＮａＣｌ １.０ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０４ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 ０.００８ Ａ−５溶液 １ｍｌ 上記無機塩培地５００ｍｌを入れた、光照射装置及びマ
グネチックスターラー付き培養装置（１リットル容）に、密
閉系で13ＣＯ2通気を行い、２５℃で５日間前培養し
た。この前培養液を種母として、３リットルの上記無機塩培
地を含む５リットル容培養装置に接種し、13ＣＯ2の供給に
より培地のｐＨを７.５から８.０の範囲に調節しながら
培養した。２５℃で６日間培養した後、実施例１と同様
に藻体を集め、４４ｇ（乾燥重量７.９ｇ）の藻体を得
た。なお、この培養で消費された13ＣＯ2は８.０ｇであ
った。次に、この湿潤藻体１０ｇを実施例１と同様の組
成の液に懸濁し、次いでβ−メルカプトエタノール１ｇ
／Ｌを加え、冷却下で、細胞破砕装置ダイノ-ミル（Wil
ly A. Bachofen社製、商標名；Dyno-Mill）で藻体を破
砕した。この細胞破砕液から実施例１と同様の方法でＲ
ＮＡ抽出を行い、純度約６０％の標識ＲＮＡ７２ｍｇを
得た。また、得られたＲＮＡの13Ｃ標識化率は約９６％
であった。
株の培養を下記組成の培地を用いて行った。 Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０.０７５ ＮａＮＯ3 ２.５ Ｋ2ＳＯ4 １.０ ＮａＣｌ １.０ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０４ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０１ ＥＤＴＡ・Ｎａ2 ０.００８ Ａ−５溶液 １ｍｌ 上記無機塩培地５００ｍｌを入れた、光照射装置及びマ
グネチックスターラー付き培養装置（１リットル容）に、密
閉系で13ＣＯ2通気を行い、２５℃で５日間前培養し
た。この前培養液を種母として、３リットルの上記無機塩培
地を含む５リットル容培養装置に接種し、13ＣＯ2の供給に
より培地のｐＨを７.５から８.０の範囲に調節しながら
培養した。２５℃で６日間培養した後、実施例１と同様
に藻体を集め、４４ｇ（乾燥重量７.９ｇ）の藻体を得
た。なお、この培養で消費された13ＣＯ2は８.０ｇであ
った。次に、この湿潤藻体１０ｇを実施例１と同様の組
成の液に懸濁し、次いでβ−メルカプトエタノール１ｇ
／Ｌを加え、冷却下で、細胞破砕装置ダイノ-ミル（Wil
ly A. Bachofen社製、商標名；Dyno-Mill）で藻体を破
砕した。この細胞破砕液から実施例１と同様の方法でＲ
ＮＡ抽出を行い、純度約６０％の標識ＲＮＡ７２ｍｇを
得た。また、得られたＲＮＡの13Ｃ標識化率は約９６％
であった。
【００１８】（実施例４）実施例３で得られたＲＮＡ５
０ｍｇを用い、実施例２と同様の方法で、５′リボヌク
レオチドへの酵素分解、および各ヌクレオチドのカラム
クロマトグラフィーによる分離、分取を行った。最終的
に取得した５′リボヌクレオチド量は、ＣＭＰが９ｍ
ｇ、ＡＭＰが１２ｍｇ、ＧＭＰが１３ｍｇ、ＵＭＰが１
１ｍｇであった。得られた５′リボヌクレオチドのうち
ＡＭＰについて元素分析計により炭素分を二酸化炭素ガ
スに変換し、このガスを質量分析計で測定した結果、Ａ
ＭＰの13Ｃ標識化率は約９６％であった。
０ｍｇを用い、実施例２と同様の方法で、５′リボヌク
レオチドへの酵素分解、および各ヌクレオチドのカラム
クロマトグラフィーによる分離、分取を行った。最終的
に取得した５′リボヌクレオチド量は、ＣＭＰが９ｍ
ｇ、ＡＭＰが１２ｍｇ、ＧＭＰが１３ｍｇ、ＵＭＰが１
１ｍｇであった。得られた５′リボヌクレオチドのうち
ＡＭＰについて元素分析計により炭素分を二酸化炭素ガ
スに変換し、このガスを質量分析計で測定した結果、Ａ
ＭＰの13Ｃ標識化率は約９６％であった。
【００１９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の13Ｃ標識
ＲＮＡおよびリボヌクレオチドの製造方法は、13Ｃ
Ｏ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類の
うちの１種または２種以上を炭素源として藻類を培養
し、培養した酵母菌体から13Ｃ標識ＲＮＡを抽出し、或
いはそのＲＮＡを分解、分離精製して13Ｃ標識リボヌク
レオチドを生産することにより、従来の細菌を用いた安
定同位体標識ＲＮＡやリボヌクレオチドの製造方法に比
べ、使用した13Ｃに対する13Ｃ標識された生産物の収率
が高く、13ＣＯ2などの使用炭素源の安価なこととあい
まって、13Ｃ標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを工業的
規模で安価に生産することが可能となる。
ＲＮＡおよびリボヌクレオチドの製造方法は、13Ｃ
Ｏ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ標識化重炭酸塩類の
うちの１種または２種以上を炭素源として藻類を培養
し、培養した酵母菌体から13Ｃ標識ＲＮＡを抽出し、或
いはそのＲＮＡを分解、分離精製して13Ｃ標識リボヌク
レオチドを生産することにより、従来の細菌を用いた安
定同位体標識ＲＮＡやリボヌクレオチドの製造方法に比
べ、使用した13Ｃに対する13Ｃ標識された生産物の収率
が高く、13ＣＯ2などの使用炭素源の安価なこととあい
まって、13Ｃ標識ＲＮＡ及びリボヌクレオチドを工業的
規模で安価に生産することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福田 裕章 茨城県つくば市大久保10 日本酸素株式会 社つくば研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ
標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上を炭素源
として藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素原子に占
める13Ｃ原子の存在比が９５％以上であるＲＮＡを抽出
することを特徴とする13Ｃ標識ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項２】 藻類がクロレラ属、スピルリナ属、アグ
メネルム属のうちから選択されることを特徴とする請求
項１記載の13Ｃ標識ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項３】 培養した藻類からＲＮＡを抽出する工程
が、培養藻体の細胞を破砕し、次いでその細胞破砕液を
遠心分離して細胞壁画分を沈澱させてリボソーム画分を
含む上清を分取し、次いで該上清を超遠心分離すること
によってリボソーム画分を沈澱させ、次いで該リボソー
ムを崩壊し、除タンパクした後の粗ＲＮＡ画分をｐＨ
２.０以下の酸性条件下に置き、沈澱した13Ｃ標識ＲＮ
Ａを採取することを備えたことを特徴とする請求項１又
は２記載の13Ｃ標識ＲＮＡの製造方法。 - 【請求項４】 13ＣＯ2、13Ｃ標識化炭酸塩類及び13Ｃ
標識化重炭酸塩類のうちの１種または２種以上を炭素源
として藻類を培養し、次いで該藻類より全炭素原子に占
める13Ｃ原子の存在比が９５％以上である５′リボヌク
レオチドを得ることを特徴とする13Ｃ標識リボヌクレオ
チドの製造方法。 - 【請求項５】 藻類がクロレラ属、スピルリナ属、アグ
メネルム属のうちから選択されることを特徴とする請求
項４記載の13Ｃ標識リボヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項６】 培養した藻類から５′リボヌクレオチド
を得る工程が、培養藻体の細胞を破砕し、次いでその細
胞破砕液を遠心分離して細胞壁画分を沈澱させてリボソ
ーム画分を含む上清を分取し、次いで該上清を超遠心分
離することによってリボソーム画分を沈澱させ、次いで
該リボソームを崩壊し、除タンパクした後の粗ＲＮＡ画
分をｐＨ２.０以下の酸性条件下に置き、沈澱した13Ｃ
標識ＲＮＡを採取し、次いでこのＲＮＡを分解して13Ｃ
標識リボヌクレオチドを得ることを備えたことを特徴と
する請求項４又は５記載の13Ｃ標識リボヌクレオチドの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1966894A JPH07227295A (ja) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | １３ｃ標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1966894A JPH07227295A (ja) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | １３ｃ標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227295A true JPH07227295A (ja) | 1995-08-29 |
Family
ID=12005627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1966894A Pending JPH07227295A (ja) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | １３ｃ標識ｒｎａおよびリボヌクレオチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07227295A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007135953A1 (ja) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Yamaguchi University | チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質 |
| CN114317521A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-04-12 | 北京擎科生物科技有限公司 | 寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒 |
-
1994
- 1994-02-16 JP JP1966894A patent/JPH07227295A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007135953A1 (ja) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Yamaguchi University | チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質 |
| JP5071740B2 (ja) * | 2006-05-19 | 2012-11-14 | 国立大学法人山口大学 | チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質 |
| CN114317521A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-04-12 | 北京擎科生物科技有限公司 | 寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041026 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050308 |